Badania proteomiczne oparte na odkryciach mają na celu udzielenie odpowiedzi na ważne pytania biologiczne poprzez identyfikację jak największej liczby białek. Aby osiągnąć ten wzniosły cel, należy dołożyć starań, aby określić optymalny przepływ pracy, który maksymalizuje identyfikację białek. W tym badaniu porównaliśmy ekstrakcję białek, trawienie i frakcjonowania dla proteomiki bottom-up przy użyciu linii komórkowej ludzkiego raka okrężnicy ludzkiego raka jelita grubego. Cztery różne bufory do ekstrakcji białek, dwa podejścia do trawienia, a także trzy metody frakcjonowania próbek. w celu określenia dostępnego przepływu pracy, który zapewnia maksymalne identyfikacji białek. Próbki porównujące te przepływy pracy analizowano za pomocą UPLC w połączeniu z tandemowym MS na spektrometrze mas Q-Exactive. Naszym celem jest określenie optymalnego przepływu pracy, aby umożliwić użytkownikom maksymalizację identyfikacji białek. identyfikacji białek. Nasze wyniki pokazują, że zwiększona liczba pewnych identyfikacji białek Identyfikacje białek są osiągane dzięki podejściu trawienia wspomaganego filtrem w porównaniu do trawienia w roztworze. Ogólne frakcjonowanie SDS-PAGE prowadzi do większej liczby liczby identyfikacji niż SCX SpinTip i odwrotna faza naboju platformy. Nowatorskim aspektem tej pracy jest porównanie dwóch łatwo dostępnych dostępnych platform offline do frakcjonowania w odniesieniu do tradycyjnej techniki tradycyjnej techniki, SDS-PAGE. --- Rozszerzające się zastosowanie środków powierzchniowo czynnych do przygotowywania próbek proteomów spowodowało potrzebę systematycznej optymalizacji stosowania i usuwania tych MS przed pomiarami proteomu. Tutaj porównujemy cztery metody oczyszczania detergentem (wytrącanie kwasem trichlorooctowym (TCA), ekstrakcję chloroformem/metanolem/wodą (CMW), komercyjną metodę usuwania detergentów za pomocą kolumny spinowej (DRS) i metodę (DRS) i wspomagane filtrem przygotowanie próbki (FASP)), aby zapewnić w odniesieniu do identyfikacji białek, peptydów i widm w każdym przypadku. w każdym przypadku. Nasze wyniki pokazują, że dla próbek o ograniczonej zawartości białka, FASP przewyższa pozostałe trzy metody oczyszczania, podczas gdy przy dużych ilościach białka, wszystkie metody są porównywalne. Informacje te zostały wykorzystane do zbadania i i porównania opartych na masie cząsteczkowej frakcjonowanych z niefrakcjonowanymi lizatami z trzech coraz bardziej złożonych próbek (Escherichia coli K-12, mieszanina pięciu izolatów drobnoustrojów mieszanina pięciu izolatów drobnoustrojów i próbka naturalnej społeczności drobnoustrojów z wód gruntowych), z których wszystkie które zostały przygotowane metodą SDS-FASP. Dodatkowy etap frakcjonowania zwiększył liczbę identyfikacji białek o 8% do 25% w porównaniu z metodą niefrakcjonowanego podejścia w trzech próbkach. --- Chlorobaculum (Cba.) tepidum to zielona bakteria siarkowa, która utlenia siarczek, siarkę elementarną i tiosiarczan do fotosyntetycznego wzrostu. Aby uzyskać wgląd w metabolizm siarki, proteom komórek Cba. tepidum pobranych w różnych warunkach wzrostu różne warunki wzrostu zostały określone ilościowo przy użyciu szybkiego, bezżelowego, protokół przygotowania próbki wspomagany filtrem (FASP) ze strategią znakowania izotopowego w roztworze. w roztworze. Spośród 2245 białek przewidywanych z genomu Cba. tepidum genomu, około 970 białek wykryto w nieznakowanych próbkach, podczas gdy około 630-640 białek wykryto w znakowanych próbkach, porównując dwa różne warunki wzrostu. Komórki typu dzikiego rosnące na tiosiarczanie miały zwiększoną obfitość peryplazmatycznego cytochromu c-555 i białek peryplazmatycznego tiosiarczanu peryplazmatycznego układu enzymatycznego SOX utleniającego tiosiarczan w porównaniu z komórkami rosnącymi na siarczku. Mutant dsrM Cba. tepidum, któremu brakuje dysymilacyjnej reduktazy siarczynowej DsrM. reduktazy siarczynowej DsrM i dlatego nie jest w stanie utlenić globulek siarki do siarczynu. do siarczynów. W porównaniu z typem dzikim, komórki komórki dsrM wykazywały zwiększoną obfitość enzymów DSR zaangażowanych w początkowe etapy utleniania globulek siarki (DsrABCL) i zmniejszoną obfitość enzymów rzekomo zaangażowanych w utlenianie siarczynów (Sat-AprAB-QmoABC). Wyniki pokazują, że Cba. tepidum reguluje poziomy komórkowe enzymów zaangażowanych w metabolizm siarki i innych elektrolitów. metabolizm siarki i inne procesy przenoszenia elektronów w odpowiedzi na dostępność zredukowanych związków siarki. --- Zachowany materiał kliniczny jest unikalnym źródłem do badań proteomicznych ludzkich zaburzeń. Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół pozwalający na dużą skalę analizę ilościową tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). Procedura Procedura składa się z czterech odrębnych etapów. Pierwszym z nich jest przygotowanie z materiału FFPE i mikrodysekcja komórek będących przedmiotem zainteresowania. W wyizolowane komórki są poddawane lizie i przetwarzane przy użyciu techniki "przygotowania próbki wspomaganej filtrem" (FASP). przygotowanie próbki" (FASP). Na tym etapie białka są usuwane z odczynników użytych do lizy próbki i są trawione w dwóch etapach przy użyciu endoproteinazy LysC i trypsyny. Po każdym trawieniu peptydy są w oddzielnych frakcjach, a ich zawartość jest określana przy użyciu wysoce czułego pomiaru fluorescencji. Na koniec peptydy są frakcjonowane na mikrokolumnach "pipetowych". Peptydy LysC są rozdzielane na 4 frakcje podczas gdy peptydy tryptyczne są rozdzielane na 2 frakcje. W ten sposób przygotowane próbki pozwalają na analizę proteomów od niewielkich ilości materiału do do głębokości 10 000 białek. Tak więc opisany przepływ pracy jest potężną techniką do badania chorób w całym systemie, a także do identyfikacji potencjalnych biomarkerów i celów dla leków. potencjalnych biomarkerów i celów dla leków. --- Niniejsza praca przedstawia ocenę porównawczą kilku procesów przygotowania próbek opartych na detergentach do analizy proteomów bakteryjnych metodą MS, przeprowadzonej przy użyciu modelowego organizmu Escherichia coli. Początkowo porównano bufory RapiGest i bufory oparte na SDS zostały porównane pod kątem wydajności ekstrakcji białek i jakość wygenerowanych danych MS. W rezultacie SDS wypadł najlepiej pod względem całkowitej wydajności białek i ogólnej liczby identyfikacji MS, głównie ze względu na wyższej wydajności ekstrakcji białek o wysokiej masie cząsteczkowej (MW) i białek błonowych, podczas gdy RapiGest białek, podczas gdy RapiGest doprowadził do wzbogacenia w białka peryplazmatyczne i fimbrialne. białek peryplazmatycznych i fimbrialnych. Następnie ekstrakty SDS poddano pięciu różnym procesom przygotowania próbek MS próbek MS, w tym: usuwanie detergentów za pomocą kolumn wirujących, a następnie trawienie (SC), wytrącanie białek, a następnie trawienie w roztworze w wodorowęglanie amonu lub bufor mocznikowy, przygotowanie próbki wspomagane filtrem (FASP) oraz separacja 1DE, a następnie trawienie w żelu. Ogólnie rzecz biorąc, około 1000 białek zidentyfikowano po analizie LC-MS/MS wszystkich preparatów (>1100 z przepływem pracy SC przepływ pracy), przy czym FASP wytwarza więcej zidentyfikowanych peptydów i wyższą średnią pokrycie sekwencji. Każdy protokół wykazywał specyficzne zachowanie pod względem MW, hydrofobowości i rozkładu lokalizacji subkomórkowej zidentyfikowanych białek. białek; przedstawiono ocenę porównawczą różnych wyników. --- Składniki ziarnistości zymogenu (ZG) odgrywają ważną rolę w uszkodzeniach i chorobach trzustki. choroby. W poprzednich badaniach analizy proteomiczne z granulkami zymogenu szczura były rozdzielono za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej lub jednowymiarowej SDS-PAGE, a następnie trawienie tryptyczne w żelu. W celu przezwyciężenia wady trawienie w żelu i przeprowadzenie dalszej dogłębnej analizy proteomicznej granulek zymogenu, w tym badaniu, łącząc metodę przygotowania próbki wspomaganą filtrem i w pełni zautomatyzowaną technikę 2D-LC-MS/MS, 800 białek ZG zostało z co najmniej dwoma unikalnymi peptydami dla każdego białka, z których 75% nie zostało wcześniej opisanych. z których 75% nie zostało wcześniej zgłoszonych. Zidentyfikowane białka ujawniły szeroką różnorodność w tożsamości i funkcji białek. Jest to największy zbiór danych proteomu ZG, a także pierwszy zbiór danych proteomu ZG myszy, który może pomóc w wyjaśnieniu architektury molekularnej ZG i ich funkcji. --- Deamidacja reszt asparaginy i glutaminy jest powszechną modyfikacją potranslacyjną. modyfikacja. Badacze często polegają na technikach proteomicznych opartych na spektrometrii mas. w celu identyfikacji tych miejsc potranslacyjnych. Analiza analiza spektralna deamidowanych peptydów jest skomplikowana i często błędnie przypisywana z powodu nakładania się piku (13)C formy amidowanej z deamidowanym pikiem monoizotopowym monoizotopowym; te dwa piki są oddzielone tylko o 19,34 mDa. Dla właściwego przypisanie, z natury ważne jest użycie spektrometru masowego o wysokiej dokładności pomiaru masy i wysokiej zdolności rozdzielczej. dokładnością pomiaru masy i wysoką zdolnością rozdzielczą. W tym przypadku lizat tkanki mózgowej myszy został przygotowany przy użyciu metody przygotowania próbki wspomaganej filtrem (FASP) i frakcjonowania Stage Tip frakcjonowanie, a następnie analizę na nanoLC połączonym z kwadrupolem orbitrap (Q-Exactive) w celu dokładnej identyfikacji ponad 5400 białek. białek. Dane widma masowego zostały przetworzone przy użyciu MASCOT i ProteoIQ w celu dokładnej identyfikacji peptydów i białek. Wartości wyszukiwania MASCOT dla dla prekursora i tolerancji masy MS/MS i ustalono, że dane że dane przeszukiwane z tolerancją masy prekursora większą niż 5 ppm powodowały błędne przypisanie deamidowanych peptydów. Peptydy, które zostały zidentyfikowane z dokładnością pomiaru masy ±5 ppm zostały prawidłowo przypisane. --- Nowa forma ovomakroglobuliny/ovostatyny (OVOS2) przewidywana na podstawie danych EST została wcześniej zidentyfikowana w modelu raka jajnika kurczaka przy użyciu opartej na spektrometrii masowej strategii proteomiki shotgun. Ilościowe dane ilościowe z osocza wykazały znaczny wzrost w czasie wraz z spontanicznym początkiem i progresją raka jajnika, co czyni go potencjalnym biomarkerem białkowym do dalszych badań. Dwa inne interesujące białka zidentyfikowane z tego wstępnego badania obejmowały witellogeninę-1 (Vit-1), białko transportu lipidów transportujące lipidy, związane z produkcją komórek jajowych, oraz transtyretyna (TTR), białko transportowe wiążące retinol. białko transportowe wiążące retinol, obecnie stosowane w klinicznym leczeniu raka jajnika. A multipleksową spektrometrię mas z rozcieńczeniem izotopowym (PC-IDMS) do ilościowego oznaczania OVOS został opracowany w celu ilościowego oznaczenia OVOS2, Vit-1 i TTR poprzez wybrane monitorowanie reakcji (SRM). W teście wykorzystano łącznie 6 wzorców peptydowych znakowanych stabilnym izotopem (SIL) w teście z trzema peptydami tryptycznymi z OVOS2, jednym dla Vit-1 i dwoma dla TTR. Test został opracowany do stosowania z surowym osoczem, które nie zostało zubożone, w połączeniu z metodą przygotowania próbki wspomaganą filtrem (FASP), a jego zastosowanie zostało również wykazano również dla dopasowanych próbek tkanki jajnika. Dane PC-IDMS dla dwóch peptydów TTR nie korelowały ze sobą z ponad 10-krotną różnicą w stężeniu dla wszystkich 5 mierzonych punktów czasowych. Dane PC-IDMS z próbek osocza podłużnych próbek osocza dobrze korelowały dla OVOS2 i Vit-1, podczas gdy TTR był niejednoznaczne. Co ciekawe, bezwzględna ilość jednego z peptydów OVOS2 SIL była 2-krotnie mniejsza w porównaniu z pozostałymi dwoma peptydami SIL. Dane te ilustrują sukcesy i wyzwania związane z kwalifikowaniem ilościowych poziomów białek z przygotowania próbki do trawienia w żelu, a następnie LC-MS/MS (GeLC) podejście oparte na odkrywaniu bez etykiet do ukierunkowanego testu ilościowego opartego na SRM w osoczu i tkankach. --- W tej pracy po raz pierwszy zaprojektowano PAMAM sfunkcjonalizowany hydrazydem i zsyntetyzowany w celu wydajnego i selektywnego wzbogacania glikopeptydów N-związanych ze złożonych próbek biologicznych przy użyciu trybu FASP (przygotowanie próbki wspomagane filtrem) tryb. --- Pierwotne próbki tkanek są cennymi zasobami dla badaczy zainteresowanych zrozumieniem choroby. Aby zmaksymalizować zawartość informacji, które można uzyskane z tych cennych próbek, właściwe przechowywanie, obsługa i przygotowanie są niezbędne. Niektóre techniki konserwacji tkanek wykorzystują medium do kriokonserwacji związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Podczas gdy to medium zapewnia korzyści dla tradycyjnych badań molekularnych, niektóre składniki mogą zakłócać z analizami spektrometrii mas. Proteomika oparta na spektrometrii mas jest rozwijającą się dziedziną rozwijającą się dziedziną o wielu zastosowaniach w badaniach nad chorobami. Naszym celem jest określić niezawodną metodę oddzielania białek od zanieczyszczeń w próbkach osadzonych w OCT, dzięki czemu próbki te będą kompatybilne z analizami spektrometrii mas. spektrometrycznych. Nowe zastosowania wytrącania eterowo-metanolowego, wspomagane filtrem przygotowanie próbki (FASP) i SDS-PAGE zapewniają badaczom protokoły usuwania gatunków zanieczyszczających OCT z cennych próbek. Wyniki Wyniki przedstawione w tym badaniu pokazują, że wszystkie trzy metody odtwarzalnie usuwają OCT; jednak wytrącanie i FASP przewyższają SDS-PAGE pod względem wspólnych wskaźników proteomicznych wskaźników proteomicznych. --- Porównano wydajność dwóch metod przygotowania próbek proteomicznych, "pseudoshotgun" (PSG) i wspomagane filtrem przygotowanie próbki (FASP) zostały porównane pod względem liczby zidentyfikowanych białek, reprezentacji kategorii GO (ontologia genów) komponentów komórkowych w uzyskanej liście białek. GO (gene ontology) w uzyskanej liście białek oraz wydajności obu metod w analizie proteomicznej. obu metod w analizie proteomicznej bardzo małej liczby komórek. Obie metody zostały połączone w celu uzyskania profilu proteomicznego krótkoterminowej hodowli (pasaż 3) komórek czerniaka, utworzonych w naszym laboratorium z ludzkiej przerzutowej zmiany czerniaka przerzutowego czerniaka. Dane ujawniły, że w przypadku FASP zidentyfikowano zwykle więcej białek niż w przypadku PSG. białek niż w przypadku PSG podczas analizy większej liczby komórek (≥ 5000/wstrzyknięcie), podczas gdy PSG jest korzystne przy analizie tylko bardzo małej ilości komórek (250-500/wstrzyknięcie). ilość komórek (250-500/iniekcja). PSG i FASP są jednak technikami komplementarnymi, ponieważ połączenie obu techniki, ponieważ połączenie obu metod dodatkowo zwiększa liczbę zidentyfikowanych białek. białek. Co więcej, pokazujemy, że możliwe jest zidentyfikowanie znacznej liczby białek białek z zaledwie 250 komórek/iniekcję, co odpowiada 60 ng białka. białka. --- Zalety analityczne stosowania wielu enzymów do trawienia próbek (MED), przede wszystkim zwiększenie pokrycia sekwencji, zostały zgłoszone w kilku badaniach. Podejście to jest jednak rzadko stosowane, głównie dlatego, że wymaga dodatkowej próbki i czasu pomiaru spektrometrycznego. Wcześniej opisaliśmy wcześniej Filter Aided Sample Preparation (FASP), rodzaj reaktora proteomicznego, w którym próbki rozpuszczone w dodecylosiarczanie sodu (SDS) są trawione w jednostce ultrafiltracyjnej. ultrafiltracji. W FASP, podobnie jak w każdym innym protokole przygotowawczym, część próbki część próbki pozostaje po trawieniu i elucji peptydów. Wykorzystując ten fakt, opracowaliśmy protokół umożliwiający kolejne trawienie próbki dwoma lub trzema enzymami. próbki dwoma lub trzema enzymami. Dzięki zastosowaniu metody FASP, peptydy są uwalniane po każdym etapie trawienia, a pozostały materiał jest następnie rozszczepiany kolejną proteinazą. Zaobserwowaliśmy doskonałą wydajność urządzeń ultrafiltracyjnych w tym trybie, umożliwiając skuteczne oddzielanie ortogonalnych populacji peptydów. ortogonalnych populacji peptydów, co skutkuje wzrostem liczby zidentyfikowanych peptydów i białek. zidentyfikowanych peptydów i białek. Na poziomie niskich mikrogramów stwierdziliśmy, że endoproteinaz LysC i trypsyny umożliwiło identyfikację do 40% więcej białek i fosforylacji. do 40% więcej białek i miejsc fosforylacji w porównaniu do powszechnie stosowanego w porównaniu z powszechnie stosowanym jednoetapowym trawieniem tryptycznym. MED-FASP oferuje wydajną eksplorację wcześniej nieużywanego materiału próbki, zwiększając głębokość analiz proteomicznych i pokrycie sekwencji. sekwencji.
Do czego służy metoda FASP?
Filter Aided Sample Preparation (FASP), rodzaj reaktora proteomicznego, w którym próbki rozpuszczone w dodecylosiarczanie sodu (SDS) są trawione w jednostce ultrafiltracyjnej.