Migracja komórek wymaga wypukłości błony pseudopodium (lub lamellipodium) za pośrednictwem aktyny/miozyny. pseudopodium (lub lamellipodium) i jego przyczepienia do podłoża. Ten kieruje kierunkiem ruchu komórek poprzez przebudowę cytoszkieletu i jest regulowany przez złożone sieci sygnalizacyjne, które działają przestrzennie za receptorami adhezyjnymi receptorów adhezyjnych integryn. Zrozumienie, w jaki sposób te sieci regulacyjne są w komórkach migrujących jest ważne dla wielu procesów fizjologicznych i patologicznych, w tym procesów fizjologicznych i patologicznych, w tym gojenia się ran, funkcji odpornościowych i przerzutów nowotworowych. przerzutów. Tutaj opisujemy metody oczyszczania metodą immunopowinowactwa fosfotyrozyny (pY) z pseudopodiów, które zostały wyizolowane z komórek migrujących. komórek migrujących. Metody te są kompatybilne z obecnymi technologiami technologie identyfikacji białek oparte na spektrometrii mas i mogą być wykorzystywane do identyfikacji na dużą skalę proteomu pY pseudopodiów w różnych migrujących liniach komórkowych, w tym komórkach pierwotnych i nowotworowych. --- Kierunkowa migracja komórek wymaga utworzenia dominującego pseudopodium w kierunku, w którym kierunku, w którym migruje komórka. Gdy komórka migrująca jest stymulowana chemoatraktantem lub gradientem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), odpowiada ona odpowiada zlokalizowanym wzmocnieniem sygnałów po stronie skierowanej w stronę gradientu. gradientu. Sygnały te pośredniczą w reorganizacji cytoszkieletu aktynowo-miozynowego, prowadząc do morfologicznej polaryzacji komórki i rozszerzenia pseudopodium. Aby zidentyfikować te sygnały, opracowaliśmy podejście do biochemicznej izolacji pseudopodium pseudopodium z ciała komórki przy użyciu porowatych filtrów o średnicy 3,0 mikrometra dla ilościowej analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej na dużą skalę. Tutaj szczegółowo metodologię oczyszczania pseudopodium i analizy proteomicznej. Ten modelowy system powinien mieć szerokie zastosowanie do analizy proteomu pseudopodium proteomu pseudopodium z różnych migrujących linii komórkowych, w tym pierwotnych i linii komórek nowotworowych stymulowanych różnorodnymi chemoatraktantami, białkami ECM białek ECM lub obu. --- Opracowaliśmy nową aplikację do przeprowadzania proteomiki pseudopodia. Pseudopodia są brzusznymi wypukłościami bogatymi w aktynę i odgrywają funkcjonalną rolę w migracji komórek. Identyfikacja białek pseudopodia prowadzi do dalszego zrozumienia złośliwych fenotypów komórek nowotworowych i nowych strategii terapeutycznych. W naszej aplikacji zastosowaniu, komórki nowotworowe zostały umieszczone na porowatej membranie pokrytej fibronektyną, aby tworząc pseudopodia. Zgodnie z potencjałem ruchowym komórek, komórki tworzyły mikroprocesy pseudopodialne w porach. Laser ekscymerowy, który był używany do okulistycznych operacji refrakcyjnych, poziomo ablował komórki na powierzchni błony powierzchni błony, aby usunąć ciało komórki. Obserwacje mikroskopowe i badania badania ekspresji białek sugerowały, że obróbka laserowa nie spowodowała widocznych uszkodzeń pseudopodii. Białka w całych komórkach i frakcjach pseudopodia były indywidualnie solubilizowane, znakowane wysoce czułym barwnikiem fluorescencyjnym i rozdzielone przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Wśród 2508 białek, 211 miało różną intensywność między całymi komórkami i frakcjami pseudopodia frakcjami pseudopodia (ponad czterokrotne różnice i wartość P <0,05). Wzbogacenie Wzbogacenie białek zależało od wielkości porów. Identyfikacja białek metodą spektrometrii masowej ujawniła 46 białek lokalizujących pseudopodia. Lokalizacja nowych białek lokalizujących pseudopodia, takich jak RAB1A, HSP90B, TDRD7 i wimentyna została potwierdzona za pomocą badań immunohistochemicznych. Poprzednie badania wykazały, że te cztery białka mogą funkcjonować w procesie migracji komórek. procesie migracji komórek. Metoda ta zapewni wgląd w molekularne szczegóły pseudopodia i dalsze zrozumienie złośliwych fenotypów komórek nowotworowych i nowych strategii terapeutycznych. --- Przerzutowe komórki nowotworowe wytwarzają inwazyjne wypukłości błony zwane inwadopodia i pseudopodia, które odgrywają kluczową rolę w rozprzestrzenianiu się komórek nowotworowych w organizmie. w organizmie. Komórki nowotworowe wykorzystują te struktury do przyłączania się do białek macierzy zewnątrzkomórkowej i ich degradacji. i degradacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej, generowania siły do przemieszczania się komórek oraz do penetracji naczyń krwionośnych. Ostatnie prace wykorzystujące unikalne frakcjonowanie subkomórkowe w połączeniu z przestrzennym profilowaniem genomicznym, proteomicznym i fosfoproteomicznym profilowanie zapewniło wgląd w inwadopodiome i pseudopodiome które kontrolują wystawanie błon inwazyjnych. Tutaj podkreślić, w jaki sposób te potężne przestrzenne podejścia "omiczne" ujawniają ważne sygnatury przerzutowych komórek nowotworowych i możliwe nowe cele terapeutyczne mające na celu w leczeniu choroby przerzutowej.
Czy możliwe jest oczyszczenie pseudopodiów do analizy proteomicznej?
Pseudopodia mogą być oczyszczane przy użyciu różnych strategii w celu wykorzystania ich w badaniach proteomicznych.