Fimbrie typu 1 i wici, dwie organelle powierzchniowe o krytycznym znaczeniu dla kolonizacji dróg moczowych przez uropatogenne Escherichia coli (UPEC), pośredniczą w przeciwstawnych celach cele wirulencji. Fimbrie typu 1 ułatwiają adhezję do komórek błony śluzowej i sprzyjają utrzymywaniu się bakterii w drogach moczowych, podczas gdy wici napędzają przez mocz i wzdłuż warstw śluzowych podczas wznoszenia się do górnych dróg moczowych. dróg moczowych. Wykorzystując ekran transpozonowy mutanta E. coli CFT073 fim locked-ON (L-ON), konstruktu, który konstytutywnie wyraża fimbrie typu 1 i hamuje ruchliwość, zidentyfikowaliśmy sześć i hamuje ruchliwość, zidentyfikowaliśmy sześć mutantów, które wykazywały częściową przywrócenie ruchliwości. Wśród tych sześciu zmutowanych genów był mutS, który koduje składnik składnik systemu naprawy niedopasowania metylowego (MMR). Po uzupełnieniu z mutS in trans, ruchliwość została ponownie zahamowana. Aby ustalić, czy system MMR jest ogólnie zaangażowany w tę wzajemną kontrolę, scharakteryzowaliśmy wpływ delecji genów innych składników MMR na ruchliwość UPEC. Izogeniczne delecje mutS, mutH i mutL zostały skonstruowane zarówno w dzikim typie CFT073, jak i w tle fim L-ON. Wszystkie mutanty MMR wykazały wzrost ruchliwości na tle typu dzikiego, a mutacje ΔmutH i ΔmutS zwiększyły ruchliwość w tle fim L-ON. Cochallenge szczepu typu dzikiego ze szczepem z defektem MMR wykazała subtelną, ale znaczącą przewagę konkurencyjną w pęcherzu moczowym i śledzionie dla szczepu w pęcherzu moczowym i śledzionie dla mutanta MMR przy użyciu mysiego modelu wstępującego zakażenia dróg moczowych po 48 godzinach. Nasze odkrycia pokazują, że system MMR ogólnie wpływa na wzajemną regulację ruchliwości. wpływa na wzajemną regulację ruchliwości i adherencji, a tym samym może przyczyniać się do patogenezy UPEC podczas infekcji dróg moczowych. --- Mutacje wywołane stresem, które występują w nie dzielących się komórkach (mutacje adaptacyjne) zostały silnie zaangażowane w powodowanie zmienności genetycznej, a także w przetrwanie gatunków i procesy ewolucyjne. Uszkodzenia DNA wywołane stresem oksydacyjnym było związane z generowaniem adaptacyjnych His(+) i Met(+), ale nie Leu(+) w szczepie Bacillus subtilis YB955 (hisC952 metB5 leuC427). Tutaj my donoszą, że wzajemne oddziaływanie między MutY i MutSL (system naprawy niedopasowania [MMR]) odgrywa kluczową rolę w produkcji adaptacyjnych revertantów Leu(+). Zasadniczo, genetyczne zakłócenie MutY dramatycznie zmniejszyło rewersję do allelu Leu w tym systemie modelowym. Co więcej, zwiększona częstość adaptacyjnych rewersantów Leu(+) wytwarzanych przez szczep z nokautem MutSL był znacznie zmniejszona po zakłóceniu mutY. Co ciekawe, chociaż ekspresja ekspresja mutY miała miejsce podczas wzrostu i fazy stacjonarnej i nie była pod kontrolą RecA, PerR lub σ(B), mutacja zerowa w operonie mutSL kilkakrotnie zwiększała ekspresję mutY. Tak więc, w głodzonych komórkach, nasycenie systemu MMR może indukować ekspresję mutY, zaburzając równowagę między białkami MutY i MMR. równowagę między białkami MutY i MMR oraz wspomagając produkcję typów mutacji wykrywanych przez rewersję do mutacji wykrywanych przez powrót do prototrofii leucyny. Podsumowując, nasze wyniki potwierdzają koncepcję, że regulacja MMR mutagennych / antymutagennych właściwości MutY promuje mutagenezę w fazie stacjonarnej w komórkach B. subtilis. --- U Escherichia coli i pokrewnych bakterii jelitowych, naprawa niedopasowań zasad-baza jest wykonywana przez dwa nakładające się na siebie procesy biochemiczne, naprawę niedopasowania metylowego (ang. methyl-directed mismatch (MMR) i naprawę bardzo krótkich łatek (VSP). Podczas gdy MMR naprawia błędy replikacji replikacji, naprawa VSP koryguje błędy C*G powstałe w wyniku deaminacji 5-metylocytozyny do T. deaminacji 5-metylocytozyny do T. Wydajność tych dwóch ścieżek zmienia się podczas cyklu życia bakterii. cyklu życiowego bakterii; MMR jest bardziej wydajny podczas wzrostu wykładniczego, a naprawa VSP jest bardziej wydajna podczas fazy stacjonarnej. Naprawa VSP i MMR współdzielą dwa białka, MutS i MutL, i chociaż obie ścieżki naprawy nie są w równym stopniu zależne od tych białek, ich w równym stopniu zależne od tych białek, ich podwójne zastosowanie tworzy konkurencję w komórkach w komórkach między procesami naprawy. Dane strukturalne i biochemiczne dotyczące endonukleazy, która inicjuje naprawę VSP, Vsr, sugerują, że białko to odgrywa rolę podobną do rolę podobną do MutH (również endonukleazy) w MMR. Badania biochemiczne i genetyczne i genetyczne tych dwóch szlaków naprawczych pomogły wyeliminować niektóre modele MMR i nałożyć ograniczenia na modele, które można opracować w odniesieniu do każdego z procesów naprawy. procesu naprawy. Dokonujemy tutaj przeglądu najnowszych informacji na temat biochemii obu procesów naprawy procesów naprawczych i opisujemy balansowanie wykonywane przez komórki w celu optymalizacji konkurencyjnych procesów w różnych fazach cyklu życiowego bakterii. --- Mechanizm replikacji DNA jest jedną z sił napędowych ewolucji genomu. ewolucji genomu. Bakteryjna polimeraza DNA III, główny kompleks replikacji DNA, składa się z PolC i DnaE. PolC jest konserwowana u bakterii Gram-dodatnich, szczególnie u Firmicutes z niską zawartością GC, podczas gdy DnaE jest szeroko konserwowany w większości bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. PolC zawiera dwie domeny domeny, domenę egzonukleazy 3'-5'i domenę polimerazy, podczas gdy DnaE posiada tylko domenę polimerazy. posiada tylko domenę polimerazy. W związku z tym DnaE nie ma funkcji funkcji korekty; w Escherichia coli inny enzym DnaQ pełni tę funkcję. funkcję. U większości bakterii wierność replikacji DNA jest utrzymywana przez 3'-5' egzonukleazę i system naprawy niedopasowań (MMR). Odkryliśmy jednak, że większość Actinobacteria (grupa bakterii Gram-dodatnich o wysokiej zawartości GC) utraciła system MMR, a chromosomy mogą być replikowane przez polimerazę DNA III typu DnaE z egzonukleazą 3'-5' podobną do DnaQ. Przetestowaliśmy mutacji Bacillus subtilis, który należy do Firmicutes i stwierdziliśmy, że że szczep typu dzikiego jest nastawiony na AT, podczas gdy szczep z delecją mutS jest wyjątkowo nastawiony na GC. Jeśli założymy, że DnaE ma tendencję do popełniania błędów, które zwiększają zawartość GC, wyniki te można wyjaśnić delecją mutS (tj, delecją systemu MMR). Dlatego proponujemy, aby zawartość GC była regulowana przez polimerazę DNA i system MMR, a brak genów polC, które uczestniczą w systemie w systemie MMR, może być przyczyną wzrostu zawartości GC u bakterii Gram-dodatnich, takich jak bakterii Gram-dodatnich, takich jak Actinobacteria. --- U Escherichia coli i pokrewnych bakterii, szlak naprawy bardzo krótkich łatek (VSP) wykorzystuje endonukleazę, Vsr, do korygowania niedopasowań T-G, które wynikają z deaminacji 5-metylocytozyn w DNA do C-G. Produkty mutS i mutL, które są wymagane do naprawy niedopasowań adeninowych ukierunkowanych na metylację (MMR), wzmacniają naprawę VSP. Wielokopijne plazmidy niosące allele mutS, które są dominująco ujemne dla MMR zostały przetestowane pod kątem ich wpływu na naprawę VSP. Niektóre mutacje mutS (klasa I) nie obniżały naprawy VSP na tle mutS(+), a większość mutacji klasy I mutacje klasy I zwiększały naprawę VSP w komórkach mutS bardziej niż plazmidy zawierających mutS(+). Inne mutacje mutS przenoszone przez plazmidy (klasa II) i mutS(+) zmniejszały naprawę VSP na tle mutS(+). Zatem białko MutS pozbawione funkcji wymaganych dla MMR może nadal uczestniczyć w naprawie VSP, a nasze wyniki są zgodne z modelem, w którym MutS wiąże się przejściowo z błędem i a następnie przemieszcza się z dala od mispair, tworząc wyspecjalizowaną strukturę, która zwiększa wiązanie Vsr. --- Niedawno opisaliśmy obecność wysokiego odsetka izolatów Pseudomonas aeruginosa (20%) ze zwiększoną częstotliwością mutacji (mutatory) w płucach pacjentów z mukowiscydozą (CF). płucach pacjentów z mukowiscydozą (CF). W czterech z 11 niezależnych szczepów P. aeruginosa stwierdzono, że wysoka częstotliwość mutacji jest uzupełniana z genem mutS typu dzikiego z P. aeruginosa PAO1. Tutaj przedstawiamy klonowanie i sekwencjonowanie dwóch dodatkowych genów naprawy niedopasowania P. aeruginosa i charakterystykę, poprzez komplementację niedoborowych szczepów, tych dwóch domniemanych genów naprawy niedopasowania P. aeruginosa (mutL i uvrD). Opisujemy również zmiany w genach mutS, mutL i uvrD odpowiedzialne za fenotyp mutatora fenotyp hipermutowalnych szczepów P. aeruginosa izolowanych od pacjentów z mukowiscydozą. Siedem z 11 szczepów mutatorowych okazało się być wadliwych w systemie MMR (cztery mutS, dwa mutL i jeden uvrD). W czterech przypadkach (trzy mutS i jeden mutL), geny zawierały mutacje typu frameshift. Czwarty szczep mutS wykazywał insercję 3,3 kb po 10. nukleotydzie genu mutS i delecję 54 nukleotydów między dwoma bezpośrednimi powtórzeniami ośmiu nukleotydów. Delecja ta, obejmująca domenę II genu MutS, została uznana za główną odpowiedzialną za inaktywację mutS. Drugi szczep mutL prezentował mutację K310M, równoważną K307 w Escherichia coli MutL, reszta znana jako niezbędna dla aktywności ATPazy. Wreszcie, szczep uvrD miał trzy substytucje aminokwasowe w konserwowanym miejscu wiązania ATP wydedukowanego polipeptydu UvrD, wykazując wadliwą aktywność naprawy niedopasowania. Co ciekawe, komórki niosące ten zmutowany allel wykazywały pełną aktywność naprawę za pośrednictwem UvrABC. Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że geny P. aeruginosa mutS, mutL i uvrD są genami mutatorowymi i że ich zmiana skutkuje fenotypem mutatora. --- Prosty system genetyczny został opracowany w celu przetestowania wpływu nadekspresji białek typu dzikiego lub zmutowanego ludzkiego homologu MutL 1 (hMLH1) na naprawę niedopasowania metylowego (MMR) w Escherichia coli. System opiera się na wykrywaniu revertantów Lac(+) przy użyciu szczepów E. coli zdolnych do MMR lub pozbawionych MMR niosących mutację lac +1 z przesunięciem ramki, wyrażających białka hMLH1. My że ekspresja białka hMLH1 typu dzikiego powoduje ok. 19-krotny wzrost częstości mutacji. Fenotyp mutatora był spowodowany zdolnością białka białka hMLH1 do interakcji z bakteryjnymi białkami MutL i MutS, tym samym zakłócając tworzenie kompleksów między białkami MMR i niedopasowanym DNA. DNA. I odwrotnie, ekspresja białek kodowanych przez allele pochodzące od z rodzin dziedzicznego raka jelita grubego bez polipowatości (HNPCC) zmniejsza częstość mutacji, w zależności od konkretnych podstawień aminokwasów. Efekty te są równoległe do MutL i MutS oraz aktywności wiązania ATP/hydrolizy zmutowanych białek. białek. --- MutL jest wymagany do wspomagania białka naprawy niedopasowania MutS podczas inicjacji ukierunkowanej metylowo odpowiedzi naprawy niedopasowania (MMR) w różnych organizmach, od od prokariotów do eukariotów. Pomimo tej konieczności, nieodłączna skłonność MutL do agregacji doprowadziła do znacznych trudności w określeniu jego biologicznego związku z innymi białkami związanymi z MMR. Tutaj przeprowadzamy analizę termostabilnego białka MutL występującego w Thermotoga maritima MSB8 (TmL). Analiza chromatograficzna z wykluczeniem wielkości wskazuje na brak agregacji z wyjątkiem dimerycznego TmL. Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) analiza ujawnia, że struktury roztworu pełnej długości TmL i jego kompleksy z nukleotydami i ssDNA ulegają zmianom konformacyjnym. zmiany konformacyjne. Wyjaśniony model TmL SAXS został nałożony na strukturę krystaliczną C-końcowej domeny MutL Escherichia coli. Ponadto, N-końcowy model SAXS TmL istnieje jako forma monomeryczna, co wskazuje, że TmL ma strukturalnie elastyczną domenę N-końcową. Analiza SAXS TmL może sugerować znaczną możliwość nowego widoku 3D wcześniej nierozwiązanej pełnej długości cząsteczki MutL. --- Addukty O(6)-alkilG są wysoce mutagenne ze względu na ich zdolność do wydajnego tworzenia błędnych par O(6)-alkilG:T podczas replikacji, wyzwalając w ten sposób przejścia G→A. Mutagenezie w dużej mierze zapobiegają strategie naprawcze, takie jak odwrócenie przez alkilotransferazy lub wycięcie przez naprawę przez wycięcie nukleotydów (NER). Ponadto, Ponadto wiadomo, że naprawa niedopasowania ukierunkowana metylowo (MMR) wywołuje wrażliwość na czynniki metylujące poprzez mechanizm, który obejmuje rozpoznawanie przez MutS O(6)-mG:T replikacji. Chcieliśmy zbadać mechanizm w którym MMR kontroluje genotoksyczność istotnych dla środowiska adduktów O(6)-alkiloG tworzonych przez tlenek etylenu i tlenek propylenu. Niedawno odkryto wykazano, że gen podobny do alkilotransferazy ybaZ (eATL) zwiększa naprawę tych nieco większych adduktów O(6)-alkilG przez NER. Przeanalizowaliśmy toksyczność i mutagenezę indukowaną przez te addukty O(6)-alkilG przy użyciu plazmidu z pojedynczym adduktem sond. Wykazaliśmy, że produkt genu eATL zapobiega atakowi O(6)-alkilG za pośrednictwem MMR. O(6)-alkilG:T dla większych grup alkilowych, ale nie dla metylu. metylowych. Dane in vivo są zgodne z występowaniem powtarzających się cykli ataku MMR Atak MMR półproduktu O(6)-alkilG:T. Ponadto, in vitro białko eATL skutecznie zapobiega wiązaniu MutS do O(6)-alkylG: T mispairs utworzonymi przez większe grupy alkilowe, ale nie przez metyl. Podsumowując, eATL nie tylko nie tylko zwiększa wydajność naprawy tych większych adduktów przez NER, ale także chroni te addukty przed toksycznością, w której pośredniczy MMR. --- Scharakteryzowaliśmy system naprawy niedopasowań (MMR) wysoce odpornego na promieniowanie szczepu Deinococcus radiodurans, ATCC 13939. Pokazujemy że system MMR jest funkcjonalny w tym organizmie, gdzie uczestniczy w zapewnia wierność replikacji i rekombinacji DNA. System opiera się na aktywności dwóch kluczowych białek, MutS1 i MutL, które stanowią konserwatywny rdzeń rdzeń zaangażowany w rozpoznawanie niedopasowań. Inaktywacja MutS1 lub MutL spowodowała siedmiokrotnym wzrostem częstotliwości spontanicznej mutagenezy RifR i dziesięciokrotnym wzrostem skuteczności dziesięciokrotny wzrost wydajności integracji markera mutacji punktowej dawcy podczas transformacji bakteryjnej. Inaktywacja naprawy niedopasowania UvrD zwiększała poziom spontanicznej mutagenezy, ale nie miała wpływu na integrację markera, ale nie miała wpływu na integrację markera - sugerując, że wiązanie białek MutS1 i MutL do niedopasowanego heterodupleksu wystarcza do zahamowania rekombinacji między nieidentycznymi (homeologicznymi) DNA. W przeciwieństwie do tego, inaktywacja MutS2, kodowanego przez drugi gen związany z mutS obecny w D. radiodurans, nie miał wpływu na mutagenezę lub rekombinację. Komórki pozbawione białek MutS1 lub MutL były tak samo odporne na promieniowanie gamma, mitomycynę C i promieniowanie UV jak bakterie typu dzikiego. bakterie, co sugeruje, że system naprawy niedopasowań nie jest niezbędny do odtworzenia funkcjonalnego genomu po uszkodzeniu DNA. --- Naprawa niedopasowań DNA (MMR) i naprawa bardzo krótkich łatek (VSP) to dwie ścieżki zaangażowane w naprawę niedopasowań T:G. Aby dowiedzieć się o konkurencji i i współpracy między tymi dwoma szlakami naprawy, przeanalizowaliśmy fizyczną i funkcjonalną interakcję między MutL i Vsr przy użyciu metod biofizycznych i biochemicznych. metody biochemiczne. Analityczne ultrawirowanie ujawniło zależną od nukleotydów interakcję między Vsr i N-końcową domeną MutL. Używając chemicznego sieciowanie, zmapowaliśmy miejsce interakcji MutL dla Vsr do regionu między N-końcowymi domenami podobnymi do tych opisanych wcześniej dla interakcji między MutL i endonukleazą rozróżniającą nici MutH systemu MMR. Konkurencja między MutH i Vsr o wiązanie z MutL spowodowała zahamowanie aktywacji MutH zależnej od MutS i MutL, co wyjaśnia mutagenne działanie Vsr. wyjaśnia mutagenny efekt nadekspresji Vsr. Współpracę między naprawą MMR i VSP została zademonstrowana przez stymulację endonukleazy Vsr w mutacji MutS-, MutL- i zależnej od hydrolizy ATP, zgodnie z zasadą wzmocnienie naprawy VSP przez MutS i MutL in vivo. Dane te sugerują istnienie mobilnego MutS-MutL w sygnalizacji MMR, który opuszcza niedopasowanie DNA przed, lub w momencie aktywacji cząsteczek efektorowych, takich jak Vsr lub MutH. --- Bakterie zawierają szereg systemów zapobiegania błędom i korekcji błędów, które utrzymują stabilność genomu. Jednak szczepy wykazujące podwyższoną częstotliwość mutacji mutacji zostały ostatnio zgłoszone wśród naturalnych populacji patogennych Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Helicobacter pylori i Streptococcus pneumoniae. Większość Większość naturalnie występujących, silnych mutatorów zawiera defekty w metylowym systemie naprawy niedopasowania (MMR), z dominującymi mutacjami w mutS dominują. Szczepy z niedoborem MMR posiadają lepsze tło genetyczne dla selekcji niektórych mutacji oporności na antybiotyki, ponieważ częstotliwości mutacji mutacji są nawet 1000-krotnie wyższe niż w przypadku normalnych szczepów, a poziomy oporności osiągnięte u mutatorów mogą być większe niż te powstające u gospodarzy niebędących mutatorami. gospodarzy. MMR jest głównym czynnikiem ograniczającym rekombinację międzygatunkową. Usunięcie tej bariery, jak w przypadku mutatorów z defektem MMR, również zwiększa częstotliwość horyzontalnego transferu genów, który jest ważnym mechanizmem nabytej lekooporności u bakterii. Stały status mutatora globalnego jest wiąże się z utratą kondycji, ponieważ mutatory akumulują szkodliwe mutacje częściej niż nie-mutatorzy. Ograniczenia sprawności mutatorów mogą być przezwyciężyć po prostu przez wysoką gęstość komórek bakteryjnych, którą można osiągnąć podczas ostrej infekcji lub poprzez przyjęcie przejściowego statusu mutatora. Mutatory są czynnikiem ryzyka podczas leczenia infekcji bakteryjnych, ponieważ wydają się one zwiększają selekcję mutantów wyrażających antybiotykooporność na wysokim i niskim poziomie. i mają zdolność do udoskonalania istniejących determinant oporności zlokalizowanych na plazmidzie. determinanty oporności. --- Metodologia inżynierii rekombinogennej, znana również jako rekombinacja, wykorzystuje homologiczną rekombinację do tworzenia ukierunkowanych zmian w komórkowym DNA z dużą specyficznością i elastycznością. W Escherichia coli system rekombinacji Red z bakteriofaga lambda został z powodzeniem wykorzystany do modyfikacji zarówno plazmidowego, jak i chromosomalnego DNA w wysoce wydajny sposób, przy użyciu liniowego dwuniciowego fragmentu DNA lub syntetycznego jednoniciowego oligonukleotydu (SSO). Obecny model rekombinacji za pośrednictwem Red/SSO obejmuje SSO najpierw annealing do przejściowego, jednoniciowego regionu DNA, zanim zostanie do chromosomu lub docelowego plazmidu. Zostało to zaobserwowane wcześniej, zarówno u eukariontów, jak i prokariontów, że mutacje w dwóch podwójnej helisy DNA są "korygowane" przez komplementarne SSO z różną wydajnością. z różną wydajnością. Tutaj badamy dalsze czynniki, które wpływają na stronniczość nici, jak również ogólną wydajność rekombinacji za pośrednictwem Red/SSO rekombinacji w E.coli. Pokazujemy, że kierunek replikacji DNA i charakter natura niedopasowania zakodowanego przez SSO są głównymi czynnikami dyktującymi rekombinacyjne odchylenie nici. Jednak wpływ, jaki niedopasowanie zakodowane przez SSO na tendencję do rekombinacji nici jest zniesiony w szczepach E.coli które są wadliwe w naprawie niedopasowania (MMR). Odzwierciedla to fakt, że różne błędy zasad są korygowane przez zależny od mutS/H/L szlak MMR z różną wydajnością. Ponadto, nasze dane wskazują, że transkrypcja ma znikomy wpływ na tendencyjność nici. Wyniki te pokazują po raz pierwszy po raz pierwszy, że interakcja między replikacją DNA a MMR ma duży wpływ na wydajność i odchylenie nici rekombinacji za pośrednictwem Red/SSO w E.coli. --- Białko naprawy niedopasowania DNA (MMR) MutS bakterii Escherichia coli występuje w postaci dimerów i tetramerów w roztworze. tetramery w roztworze, a identyfikacja jego funkcjonalnego stanu oligomerycznego była przedmiotem szeroko zakrojonych badań. W niniejszej pracy przeanalizowaliśmy stan oligomeryzacji stan oligomeryzacji MutS z Pseudomonas aeruginosa, gatunku bakterii pozbawionego metylacji Dam i homologa MutH. Analizując natywną MutS i różne zmutowane wersje białka, ustaliliśmy, że P. aeruginosa MutS jest głównie tetrameryczna w roztworze i że jej zdolność do oligomeryzacji jest jak w E. coli, przez C-końcowy region białka. Analiza aktywności wiązania niedopasowanych oligonukleotydów wykazała, że MutS typu dzikiego wiąże się z DNA jako tetramer. DNA jako tetramer. Aktywność wiązania DNA zmniejszyła się, gdy region C-końcowy (MutSDelta798) lub gdy MutS o pełnej długości z defektami tetrameryzacji (MutSR842E). tetrameryzacji (MutSR842E). Aktywność ATPazy MutSDelta798 była podobna do do MutSR842E i zmniejszona w stosunku do białka typu dzikiego. Eksperymenty przeprowadzone na szczepie mutS P. aeruginosa w celu przetestowania wydajności różnych oligomerycznych wersji MutS do funkcjonowania in vivo wykazały, że MutSDelta798 nie jest funkcjonalna i że wersja dimeryczna MutSR842E o pełnej długości nie jest w stanie całkowicie przywrócić aktywność MMR zmutowanego szczepu. Dodatkowe eksperymenty przeprowadzone w warunkach wysokiej szybkości mutacji indukowanej przez analog zasady 2-AP potwierdzają, że dimeryczna wersja MutS nie jest tak wydajna jak tetrameryczne białko typu dzikiego w zapobieganiu mutacjom. Dlatego też że chociaż dimeryczna MutS jest wystarczająca dla aktywności MMR, optymalną aktywność uzyskuje się przy optymalną aktywność uzyskuje się z tetrameryczną wersją białka, a zatem powinna być uważana za aktywną formę MutS u P. aeruginosa. --- Słaby lub poważny deficyt sekwencji GATC w DNA enterobakteriofagów wydaje się być skorelowany z ich niedometylacją podczas wzrostu w bakteriach dam+ (GATC ade-metylaza) bakterii. Obserwacja ta jest potwierdzona przez analizę sekwencji nie wykazując dowodów na mutagenność specyficzną dla miejsca 6meAde. Białko MutH z systemu naprawy niedopasowania ukierunkowanego metylowo rozpoznaje i rozszczepia niedemetylowane sekwencje GATC w trakcie naprawy niedopasowania. Aby dowiedzieć się czy funkcja MutH ukierunkowanego metylowo systemu naprawy niedopasowania uczestniczy w kontrselekcji sekwencji GATC w enterobakteriofagach, zbadaliśmy wydajność zbadaliśmy wydajność bakteriofaga phi X174 zawierającego 0, 1 lub 2 sekwencje sekwencje GATC, w typie dzikim, zaporowym i zmutowanym (H, L, S, U) Escherichia coli. Po transfekcji niemetylowanym DNA zawierającym dwie sekwencje GATC, zaobserwowano zaobserwowano spadek netto wydajności cząstek infekcyjnych we wszystkich szczepach bakteryjnych mutH+ dam-, podczas gdy nie zaobserwowano wykrywalnego spadku u bakterii zakażonych DNA bez sekwencji GATC. Ten efekt funkcji MutH jest maksymalny w bakteriach typu dzikiego oraz mutL i mutS, podczas gdy efekt nie jest znaczący w bakteriach mutU, co sugeruje interakcję helikazy II z białkiem białkiem MutH. Jednak u bakterii dam+ obecność sekwencji GATC prowadzi do zwiększonej wydajności cząstek infekcyjnych. Wpływ sekwencji GATC i jej systemu metylacji Dam na wydajność fagów u bakterii mutH ujawnia, że metylowane sekwencje GATC są korzystne dla faga.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 SŁÓW) --- Naprawa niedopasowania (MMR) zwiększa wierność replikacji DNA poprzez identyfikację i korygowanie błędów replikacji. Zaciski procesowe są istotnymi składnikami replikacji DNA i MMR, jednak mechanizm i zakres, w jakim uczestniczą one w MMR, pozostaje niejasny. w MMR pozostaje niejasny. Zbadaliśmy rolę zacisku procesywnego Bacillus subtilis DnaN i stwierdziliśmy, że służy on jako platforma do wykrywania niedopasowań i łączenia naprawy z replikacją DNA. i sprzężenia naprawy z replikacją DNA. Poprzez wizualizację funkcjonalnych MutS in vivo, stwierdziliśmy, że MutS tworzy ogniska niezależnie od wykrywania niedopasowania w miejscach replikacji. wykrywania niedopasowania w miejscach replikacji (tj. w replikosomie). Te ogniska MutS są kierowane do replikosomu przez strefy zaciskowe DnaN, które wspomagają wykrywanie niedopasowania przez ukierunkowując wyszukiwanie na powstające DNA. Po wykryciu niedopasowania, MutS odłącza się od replikomu, ułatwiając naprawę. Przetestowaliśmy funkcjonalne funkcjonalne znaczenie wykrywania niedopasowania za pośrednictwem DnaN dla MMR i stwierdziliśmy, że odpowiada za 90% naprawy. Ta wysoka zależność od DnaN może być ominięta przez zwiększenie stężenia MutS w komórce, co wskazuje na wtórny sposób wykrywania in vivo, w którym MutS bezpośrednio znajduje niedopasowania bez kojarzenia się z replikosomem. Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki zapewniają nowy wgląd w mechanizm dzięki któremu DnaN łączy rozpoznawanie niedopasowań z replikacją DNA w żywych komórkach. --- Mechanizm ukierunkowanej metylowo naprawy niedopasowania (MMR) był szeroko badany in vitro i in vivo, ale jedną z trudności w określeniu biologicznych między białkami związanymi z MMR jest tendencja MutL do samoagregacji. Zbadano właściwości stabilnego homologu MutL przy użyciu termostabilnego MutL (TmL) z Thermotoga maritima MSB8 i którego rozmiar analizy chromatograficzne i sieciowania były zgodne z dimeryczną formą TmL. dimeryczną formą TmL. TmL ulegała zmianom konformacyjnym w obecności nukleotydów i jednoniciowego DNA (ssDNA) z wiązaniem ATP niewymagającym ssDNA TmL, podczas gdy TmL stymulowana ADPnP wykazywała wysokie powinowactwo do wiązania ssDNA. powinowactwo. Wreszcie, TmL oddziaływał z T. maritima MutS (TmS), zwiększając powinowactwo TmS do ssDNA. powinowactwo TmS do niedopasowanych par zasad DNA i sugerując, że rola TmL w tworzeniu niedopasowanego kompleksu DNA-TmS może być kluczową obserwacją obserwacją dla badania początkowego systemu MMR. [BMB Reports 2009; 42(1): 53-58]. --- Ekspansja normalnie polimorficznych mikrosatelitów CTG w niektórych ludzkich genach została zidentyfikowana jako mutacja powodująca szereg dziedzicznych zaburzeń dziedzicznych zaburzeń neurologicznych, w tym choroby Huntingtona i dystrofii miotonicznej. Tutaj zbadaliśmy wpływ ukierunkowanej metylowo naprawy niedopasowania (MMR) na stabilność powtórzenia (CTG)43 w Escherichia coli przez 140 pokoleń i znaleźliśmy dwa przeciwstawne efekty. W przeciwieństwie do zależnej od orientacji w dzikim typie E. coli i drożdży, nie zaobserwowaliśmy orientacji w komórkach MMR- E. coli i sugerujemy, że dla badanego przez nas powtórzenia zależność od orientacji w komórkach typu dzikiego jest spowodowana głównie przez funkcjonalne geny naprawy niedopasowania. Nasze wyniki sugerują, że struktury poślizgowe są generowane podczas replikacji, powodując ekspansje i skurcze pojedynczych trypletów w komórkach MMR, ponieważ pozostają one nienaprawione. Z drugiej strony stwierdzamy, że naprawa takich poślizgniętych struktur przez system MMR może przebiegać nieprawidłowo, powodując w dużych skurczach. Pokazujemy, że te skurcze zależne od mutS powstają preferencyjnie, gdy sekwencja CTG jest kodowana przez opóźnioną nić. Charakter charakter tej zależności od orientacji przemawia za tym, że małe struktury poślizgowe które są rozpoznawane przez system MMR, powstają głównie na opóźnionej nici widełek replikacyjnych. Sugeruje to również, że w obecności funkcjonalnego systemu MMR, usuwanie struktur o długości 3 bp powoduje powstawanie większych skurczów, które są prawdopodobnie wynikiem skurczów, które są prawdopodobnie wynikiem tworzenia struktury drugorzędowej przez sekwencję przez sekwencję CTG. Racjonalizujemy przeciwstawne efekty MMR na stabilność powtórzonego traktu stabilność za pomocą modelu, który uwzględnia niestabilność powtórzeń CTG i utratę zależności od orientacji w komórkach MMR. Nasza praca rozwiązuje sprzeczność między przeciwstawnymi twierdzeniami w literaturze dotyczącymi zarówno stabilizującego, jak i destabilizującego wpływu MMR na niestabilność powtórzeń CTG w E. coli. --- Scharakteryzowano niektóre molekularne aspekty naprawy niedopasowania ukierunkowanej metylowo u E. coli. zostały scharakteryzowane. Obejmują one: rozpoznawanie niedopasowania przez białko mutS, w którym różne niedopasowania są wiązane z różnym powinowactwem; bezpośrednie zaangażowanie miejsc d(GATC); i rozszczepienie nici przez białko mutH w sekwencjach d(GATC) z selekcją nici opartą na metylacji DNA w tych miejscach. Ponadto, komunikacja na odległość między niedopasowaniem a miejscami d(GATC) została d(GATC). Analiza korekcji niedopasowania w zdefiniowanym systemie (Lahue et al., niepublikowane) powinna zapewnić bezpośrednie środki do dalszych molekularnych aspektów tego procesu. procesu. --- Geny naprawy niedopasowania są zaangażowane w zwiększanie wierności replikacji poprzez specyficzną naprawę błędów inkorporacji polimerazy DNA. U Escherichia coli, najlepiej zbadanym najlepiej zbadanym szlakiem naprawy niedopasowania (MMR) jest ukierunkowany metylowo długi system naprawy w którym pośredniczą trzy produkty genowe: MutS, MutL i MutH. Są one konserwowane u wyższych eukariontów. Mutacje w ludzkich homologach tych wykazano, że są związane z dziedzicznym rakiem jelita grubego niezwiązanym z polipowatością (HNPCC). raka jelita grubego (HNPCC). Zmiany w regionach kodujących genów MMR skutkują fenotypem fenotyp mutatora z wyraźną niestabilnością sekwencji mikrosatelitarnych, wskazującą na niedobór naprawy DNA. --- Jednym z popularnych pomysłów jest to, że spadek ukierunkowanej metylowo naprawy niedopasowania (mismatch repair (MMR) u bakterii pozbawionych węgla może ułatwiać występowanie mutacji fazy stacjonarnej. mutacji w fazie stacjonarnej. Porównaliśmy częstotliwość akumulacji mutacji fazy stacjonarnej mutacji w fazie stacjonarnej w pozbawionych węgla szczepach Pseudomonas putida typu dzikiego i z defektem MMR i stwierdziliśmy, że znokautowanie systemu MMR znacznie zwiększyło pojawienie się podstawień zasad w głodujących szczepach P. putida. Jednocześnie, pojawienie się mutacji mutacji delecyjnych 1-bp było mniej zależne od MMR w tej bakterii. Spektrum mutacji podstawień zasad, które wystąpiły w głodujących populacjach szczepu P. putida typu dzikiego różniło się od spektrum mutacji zidentyfikowanych w szczepach z defektem MMR. szczepach z defektem MMR. Spektrum substytucji zasad różniło się również w tym przypadku. również w tym przypadku, gdy analizowano mutacje powstałe w zagłodzonych populacjach szczepów z defektem MutS lub MutL. były analizowane porównawczo. Na podstawie naszych wyników przypuszczamy, że inne mechanizmy niż nieprawidłowe działanie systemu MMR w komórkach spoczynkowych mogą być wyjaśnić akumulację mutacji w fazie stacjonarnej u P. putida. Aby dokładniej scharakteryzować populacje P. putida głodzone na płytkach selektywnych wybarwiliśmy bakterie zestawem LIVE/DEAD in situ na płytkach agarowych. Stwierdziliśmy że chociaż ogólna liczba jednostek tworzących kolonie (CFU) nie spadła w populacjach długotrwale głodzonych, populacje te były bardzo niejednorodne na płytkach i zawierały wiele martwych komórek. na płytkach i zawierały wiele martwych komórek. Nasze wyniki sugerują, że powolny wzrost subpopulacji komórek kosztem martwych komórek na płytkach selektywnych może być może być ważny dla generowania mutacji w fazie stacjonarnej u P. putida. Dodatkowo, różne wzorce przeżywalności P. putida na tych samych płytkach selektywnych płytkach selektywnych wskazują, że konkurencyjne interakcje zachodzące w warunkach długotrwałego głodu populacji drobnoustrojów na półstałych powierzchniach mogą być bardziej skomplikowane niż wcześniej zakładano. --- System naprawy niedopasowanych zasad (MMR) rozpoznaje i koryguje niedopasowane lub niesparowane zasady zasad spowodowane głównie przez polimerazę DNA i przyczynia się do wierności replikacji DNA w żywych komórkach. replikacji DNA w żywych komórkach. U Escherichia coli system MutHLS jest znany z tego, że w MMR, a homologi MutS i MutL są szeroko konserwowane w prawie wszystkich organizmach. wszystkich organizmach. Jednak endonukleaza MutH nie została znaleziona w większości organizmów. organizmów. Takie organizmy, w tym Thermus thermophilus HB8, często posiadają tak zwane białko MutS2, które jest wysoce homologiczne do MutS, ale zawiera ale zawiera dodatkowy odcinek C-końcowy. Aby wyjaśnić funkcję MutS2, nadeksprymowaliśmy i oczyściliśmy T. thermophilus MutS2 (ttMutS2). ttMutS2 wykazał zdolność do wiązania dwuniciowego białka MutS2. do wiązania dwuniciowego (ds) DNA, ale w przeciwieństwie do ttMutS, ttMutS2 nie wykazywał ttMutS2 nie wykazywał specyficzności dla niedopasowanych dupleksów. i była stymulowana przez dsDNA. Nasze wyniki wykazały również, że ttMutS2 rozcina dsDNA. ttMutS2 tnie nie tylko oligo dsDNA, ale także plazmidowe DNA, co sugeruje, że ttMutS2 posiada aktywność endonukleazy. W niskich stężeniach aktywność aktywność nie została zachowana, ale była promowana przez T. thermophilus MutL. --- Systemy naprawy niedopasowania DNA (MMR) można sklasyfikować jako zależne lub niezależne od MutH. niezależne od MutH. U bakterii przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad MMR zależnym od MutH u Escherichia coli i jej bliskich krewnych. Obraz MutH-zależnego MMR u innych bakterii jest mniej jasny, ponieważ składniki MMR inne niż niż MutS i MutL nie zostały zidentyfikowane u większości bakterii. Bacillus anthracis jest jedną z bakterii Gram(+) nieposiadających MutH w gromadzie Firmicutes. Wykorzystaliśmy brodawkowanie jako narzędzie do poszukiwania nowych szczepów mutatorów B. anthracis. i zidentyfikowaliśmy spontaniczny mutator, który przenosi minitranspozon w locus BAS4289. Częstotliwość mutacji i specyficzność w tym mutancie były porównywalne ze szczepami z niedoborem MMR z nokautami mutL lub mutS. mutL lub mutS. Zachował on podobny profil wrażliwości na promieniowanie UV jak typ typu dzikiego. BAS4289 koduje domniemaną helikazę DNA RecD2, która ma 30% identyczność sekwencji z Deinococcus radiodurans RecD2, dobrze scharakteryzowaną helikazą helikazą z nadrodziny 1B, której homologi są szeroko obecne w kompletnych genomach Firmicutes genomach Firmicutes. Wykazaliśmy, że N-końcowy region RecD2, unikalne rozszerzenie sekwencji używany do odróżnienia RecD2 od RecD1, był ważny dla B. anthracis RecD2, ponieważ mutacje w N-końcowych konserwowanych motywach wpłynęły na jego funkcję naprawy DNA. funkcję naprawy DNA. Jest to pierwsze doniesienie o helikazie RecD2 związanej z MMR. RecD2 i niedawno opisane przez nas białko YycJ są prawdopodobnie dwoma dodatkowymi składnikami niezależnego od MutH systemu MMR B. anthracis.
Które białka tworzą metylowy system naprawy niedopasowania (MMR) u bakterii?
System naprawy niedopasowania (MMR) rozpoznaje i koryguje niedopasowane lub niesparowane zasady spowodowane głównie przez polimerazę DNA i przyczynia się do wierności replikacji DNA w żywych komórkach. U bakterii, system naprawy niedopasowanych zasad (MMR) składa się z białek MutS i MutL, kodowanych przez operon mutS/L.