Odkładanie się obfitego presynaptycznego białka mózgowego alfa-synukleiny jako w neuronach lub komórkach glejowych jest charakterystyczną zmianą w podzbiorze zaburzeń neurodegeneracyjnych. zaburzeń neurodegeneracyjnych. Zaburzenia te obejmują chorobę Parkinsona Parkinsona (PD), otępienie z ciałami Lewy'ego (DLB) i zanik wieloukładowy, zwane łącznie określane jako synukleinopatie. Co ważne, identyfikacja mutacji missense mutacji w genie alfa-synukleiny w niektórych rodowodach rodzinnych PD ma alfa-synukleiny w patogenezie PD i innych synukleinopatii. synukleinopatii. Jednakże, specyficzne modyfikacje potranslacyjne, które leżące u podstaw agregacji alfa-synukleiny w dotkniętych mózgach nie zostały jeszcze zidentyfikowane, zidentyfikowane. Tutaj pokazujemy za pomocą analizy spektrometrii masowej i badań z przeciwciałem przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje fosfo-Ser 129 alfa-synukleiny, że ta reszta jest selektywnie i intensywnie fosforylowana w synukleinopatii zmianach. Ponadto, fosforylacja alfa-synukleiny w Ser 129 promowała tworzenie fibryli in vitro. Wyniki te podkreślają znaczenie fosforylacji białek filamentowych w patogenezie zaburzeń neurodegeneracyjnych. zaburzeń neurodegeneracyjnych. --- alfa-synukleina jest głównym składnikiem białkowym odkładającym się w ciałach Lewy'ego i neurytach Lewy'ego. i neurytach Lewy'ego, który jest intensywnie fosforylowany w Ser(129), chociaż jego rola w degeneracji neuronów jest wciąż nieuchwytna. W tym badaniu zbadano kilka szlaków apoptotycznych w komórkach SH-SY5Y z nadekspresją alfa-synukleiny. Po potraktowaniu rotenonem, inhibitorem mitochondrialnego kompleksu I, komórki dzikiego typu komórki z nadekspresją alfa-synukleiny wykazywały wewnątrzkomórkową agregacje, które miały wiele cech wspólnych z ciałami Lewy'ego, chociaż komórki nadeksprymujące mutant S129A, w którym fosforylacja w Ser(129) była zablokowana, wykazywały niewiele agregacji. W komórkach alfa-synukleiny typu dzikiego traktowanych rotenonem, odsetek fosforylowanej alfa-synukleiny był około 1,6 razy wyższy niż w komórkach nieleczonych. Co więcej, indukcja markerów (UPR) była widoczna na kilka godzin przed indukcją uszkodzeniem mitochondriów i aktywacją kaspazy-3. Eukariotyczny czynnik inicjujący 2alfa, członek rodziny szlaków PERK, był znacząco aktywowany we wczesnych fazach. fazach. Z drugiej strony, mutant S129A nie aktywował UPR. Inhibitor kinazy kazeinowej inhibitor kinazy kazeinowej 2, który zmniejszał fosforylację alfa-synukleiny, również zmniejszał aktywację UPR. Agregacje alfa-synukleiny były kolokalizowane z markerem markerem pośredniego przedziału retikulum endoplazmatycznego-Golgiego. Podsumowując razem, wydaje się prawdopodobne, że toksyczność alfa-synukleiny jest zależna od fosforylacji w Ser(129), która indukuje UPR, prawdopodobnie wywołane przez zaburzony ruch retikulum endoplazmatycznego-Golgiego. --- α-synukleina jest przyczyną autosomalnej dominującej rodzinnej choroby Parkinsona i demencji z ciałami Lewy'ego. otępienie z ciałami Lewy'ego, a fosforylacja α-synukleiny przy reszcie Ser-129 jest kluczową modyfikacją potranslacyjną wykrywaną w chorobie Parkinsona Parkinsona/ demencji z ciałami Lewy'ego. Jednak rola fosforylacji Ser-129 w patogenezie choroby Parkinsona / demencji z ciałami Lewy'ego pozostaje niejasna. pozostaje niejasna. Tutaj zbadaliśmy neurotoksyczność podstawionej Ser-129 α-synukleiny w transgenicznym modelu Caenorhabditis elegans (Tg model synukleinopatii. Robaki Tg pan-neuronalnie nadeksprymowały niefosforylowaną (S129A) α-synukleinę wykazywały poważne wady, w tym dysfunkcję ruchową dysfunkcję ruchową, opóźnienie wzrostu i nieprawidłowości synaptyczne. W przeciwieństwie do tego, robaki Tg wyrażające mimetyk fosforylacji (S129D) α-synukleiny wykazywały prawie normalne fenotypy. Frakcjonowanie biochemiczne ujawniło, że poziom α-synukleiny związanej z błoną był znacznie zwiększony u robaków S129A-α-synukleiny Tg podczas gdy S129D-, jak również A30P-α-synukleina wykazywały niższe właściwości wiązania błony. właściwości wiązania. Ponadto podwójny mutant α-synukleiny A30P/S129A nie powodował powodował dysfunkcji neuronów i wykazywał niskie właściwości wiązania błonowego. W ludzkim neuroblastoma SH-SY5Y, lokalizacja S129A-α-synukleiny do błon była znacznie zwiększona. znacznie zwiększona. Wreszcie, profilowanie ekspresji genów robaków S129A-Tg ujawnił dramatyczną regulację w górę genów szlaku Daf-16 / FOXO, które prawdopodobnie działają przeciwko dysfunkcji spowodowanej przez S129A-α-synukleinę. Wyniki te sugerują rolę fosforylacji Ser-129 α-synukleiny w osłabianiu działania indukowana α-synukleiną dysfunkcja neuronów i reakcja na stres poprzez obniżenie właściwości wiązania błonowego. --- Kompleksowa, bezstronna inwentaryzacja form synukleiny obecnych w ciałach Lewy'ego od pacjentów z otępieniem z ciałami Lewy'ego przeprowadzono przy użyciu dwuwymiarową analizę immunoblot, nowatorskie testy immunosorbcyjne typu sandwich z przeciwciałami specyficznymi dla modyfikacji synukleiny i spektroskopii masowej. Dominującą modyfikacją alfa-synukleiny w ciałach Lewy'ego jest pojedyncza fosforylacja w Ser-129. fosforylacja na Ser-129. Ponadto istnieje zestaw charakterystycznych charakterystycznych modyfikacji, które są obecne w mniejszym stopniu, w tym ubikwitynacja przy resztach Lys 12, 21 i 21. Lys 12, 21 i 23 oraz specyficzne skrócenia przy Asp-115, Asp-119, Asn-122, Tyr-133 i Asp-135. Żadne inne modyfikacje nie są wykrywalne przez tandemowe tandemowej spektrometrii mas, z wyjątkiem wszechobecnej N-końcowej acetylacji. Niewielkie ilości fosforylowanej Ser-129 i skróconej Asp-119 alfa-synukleiny są obecne w rozpuszczalnej frakcji zarówno normalnych, jak i chorych mózgów, co sugeruje że te formy związane z ciałami Lewy'ego są wytwarzane podczas normalnego metabolizmu alfa-synukleiny. W przeciwieństwie do tego, ubikwitynacja jest wykrywana tylko w ciałach Lewy'ego i jest obecna głównie na fosforylowanej synukleinie; dlatego prawdopodobnie występuje po tym, jak fosforylowana synukleina osadzi się w ciałkach Lewy'ego. Ten niezmienny wzór specyficznej fosforylacji, skrócenia i ubikwitynacji jest również w nierozpuszczalnej w detergentach frakcji mózgu pacjentów z rodzinną chorobą Parkinsona (synukleina Parkinsona (mutacja synukleiny A53T), jak również w zaniku wieloukładowym. atrofią wieloukładową, co sugeruje wspólną ścieżkę patogenetyczną zarówno dla genetycznych, jak i sporadycznych Lewy'ego. Obserwacje te są najbardziej spójne z modelem, w którym preferencyjna akumulacja normalnie produkowanej fosforylowanej Ser-129 alfa-synukleiny jest kluczowym zdarzeniem odpowiedzialnym za powstawanie ciał Lewy'ego w różnych chorobach ciał Lewy'ego. różnych chorobach ciał Lewy'ego.
Która reszta alfa-synukleiny jest fosforylowana w ciałach Lewy'ego?
Alfa-synukleina fosforylowana przy serynie 129 (S129) jest wysoce podwyższona u pacjentów z chorobą Parkinsona, gdzie gromadzi się głównie w ciałach Lewy'ego Około 90% α-synu zdeponowanego w ciałach Lewy'ego jest fosforylowane przy serynie 129 (Ser129). W przeciwieństwie do tego, tylko 4% lub mniej całkowitej α-syn jest fosforylowane przy tej reszcie w normalnym mózgu. Sugeruje to, że akumulacja α-syn fosforylowanych Ser129 prowadzi do powstawania ciał Lewy'ego i neurodegeneracji dopaminergicznej w chorobie Parkinsona