Zarówno w spermatydach ssaków, jak i Drosophila, struktura chromatyny całkowicie oparta na histonie struktura chromatyny jest reorganizowana do struktury w dużej mierze opartej na protaminie. Podczas tej zamiany histonu na protaminę wyrażane są białka przejściowe, na przykład na przykład TNP1 i TNP2 u ssaków i Tpl94D u Drosophila. Niedawno wykazaliśmy, że w spermatydach Drosophila metylacji H3K79 towarzyszy hiperacetylacji histonu H4 podczas reorganizacji chromatyny. Poprzedzające przejście przejście histonu do protaminy, metylotransferaza H3K79 Grappa jest a dominująca izoforma ma przedłużenie C-końcowe. Tutaj pokazujemy, że izoformy białka równoważnego Grappa u ludzi, szczurów i myszy, czyli DOT1L, mają przedłużenie C-końcowe. U myszy transkrypt tej izoformy został wzbogacony w post-mejotycznych etapach spermatogenezy. W ludzkich i spermatydach ludzkich i mysich, di- i tri-metylowane H3K79 czasowo nakładały się na hiperacetylowanym H4 i w ten sposób towarzyszyły reorganizacji chromatyny. W spermatydach szczura trimetylowany H3K79 bezpośrednio poprzedzał ładowanie białek przejściowych do chromatyny. na chromatynę. Przeanalizowaliśmy wpływ infekcji bakteryjnych na chromatynę plemników przy użyciu uropatogennego modelu szczurzego zapalenia najądrza i jądra wywołanego przez Escherichia coli i wykazały, że infekcje te powodowały nieprawidłową chromatynę spermatyd. Infekcje bakteryjne doprowadziły do przedwczesnego pojawienia się trimetylowanych H3K79 i hiperacetylowanych H4. Trimetylowane H3K79 i hiperacetylowane H4 występowały jednocześnie z białkiem przejściowym TNP1. białkiem przejściowym TNP1, którego nigdy nie zaobserwowano w spermatydach szczurów zakażonych mockami. szczurów. Po zakażeniu bakteryjnym tylko chromatyna spermatydowa oparta na histonach wykazywała nieprawidłowości. nieprawidłowości, podczas gdy chromatyna zagęszczona protaminą wydawała się być nienaruszona. Nasze wyniki wskazują, że metylacja H3K79 jest modyfikacją histonów zachowaną w spermatydach Drosophila, myszy, szczurów i ludzi i może być warunkiem wstępnym dla prawidłowej reorganizacji chromatyny. --- Informacje o autorze: (1)Division of Hematology/Oncology, Children's Hospital Boston, Boston, MA 02115, USA; Department of Pediatrics and the Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nowy Jork, NY 10065, USA. Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nowy Jork, NY 10065, USA. (2)Department of Pediatrics and the Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nowy Jork, NY 10065, USA. (3) Oddział Hematologii/Onkologii, Szpital Dziecięcy w Bostonie, Boston, MA 02115, USA. (4) Laboratorium Biochemii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Rockefellera, Nowy Jork, NY 10065, USA. (5) Molecular Pharmacology and Chemistry Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nowy Jork, NY 10065, USA. Center, Nowy Jork, NY 10065, USA. (6) Department of Medical Oncology, Dana Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA. School, Boston, MA 02115, USA. (7)Department of Pediatrics, University of Colorado Anshutz Medical Campus, Aurora, CO 80045, USA. (8) Oddział Hematologii/Onkologii, Szpital Dziecięcy w Bostonie, Boston, MA 02115, USA; Department of Pediatrics and the Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nowy Jork, NY 10065, USA. Adres elektroniczny: armstros@mskcc.org. --- Metylotransferaza lizyny 79 histonu H3 DOT1L/KMT4 może promować onkogenny wzorzec ekspresji genów poprzez wiązanie kilku partnerów fuzji MLL ekspresji genów poprzez wiązanie z kilkoma partnerami fuzji MLL występującymi w ostrej białaczce. Jednak normalna funkcja DOT1L w regulacji genów ssaków jest słabo poznana. jest słabo poznana. Tutaj donosimy, że rekrutacja DOT1L jest wszechobecnie sprzężona z aktywną transkrypcją w różnych typach komórek ssaków. DOT1L preferencyjnie zajmuje proksymalny region transkrypcyjny aktywnych genów, korelując ze wzbogaceniem di- i trimetylacji H3K79. Ponadto, zmutowane fibroblasty Dot1l brakowało di- i trimetylacji H3K79 we wszystkich badanych miejscach, wskazując, że DOT1L jest jedynym enzymem odpowiedzialnym za te znaczniki. Co ważne, zidentyfikowaliśmy warunki testu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) niezbędne do niezawodnego wykrywania metylacji H3K79. Tablice kafelkowe ChIP-chip ujawniły, że poziomy wszystkich stopni genowej metylacji H3K79 korelują z mRNA i dynamicznie reagują na zmiany aktywności genów. Konwersja monometylacji H3K79 w di- i trimetylację korelowała z przejściem od przejściem od niskiego do wysokiego poziomu transkrypcji genów. Zaobserwowaliśmy również wzbogacenie monometylacji H3K79 w regionach międzygenowych zajmowanych przez aktywatory transkrypcyjne wiążące DNA. Nasze odkrycia podkreślają kilka podobieństw między wzorcem metylacji H3K4 a wzorcem metylacji H3K79 w chromatynie ssaków, sugerując szeroko rozpowszechniony mechanizm dla równoległej lub sekwencyjnej rekrutacji DOT1L i MLL do genów w ich normalnym stanie "włączonym" stanie. --- Podczas gdy stany mono-, di- i trimetylacji lizyn na histonach zazwyczaj mają określone funkcje, jak dotąd nie przypisano żadnych konkretnych funkcji do różne stany metylacji lizyny 79 histonu H3 (H3K79) generowane przez Dot1. Tutaj pokazujemy, że Dot1, w przeciwieństwie do innych znanych metylotransferaz histonów metylotransferaz histonowych, wprowadza wiele grup metylowych poprzez nieprocesowy mechanizm mechanizm. Mechanizm kinetyczny sugeruje, że stany metylacji H3K79 nie mogą być generowane niezależnie, co sugeruje funkcjonalną redundancję. Rzeczywiście, wyciszanie genów u drożdży, które jest zależne od Dot1, opierało się na globalnych poziomach metylacji H3K79 a nie od jednego konkretnego stanu metylacji. Co więcej, nasze odkrycia sugerują, że ubikwitynacja histonu H2B wpływa na trimetylację H3K79 poprzez zwiększając syntezę wszystkich stanów metylacji H3K79. Nasze wyniki sugerują, że wielokrotna metylacja H3K79 prowadzi do kodu binarnego, co powinno ograniczyć możliwości regulacji przez domniemane demetylazy lub białka wiążące. --- Podczas spermiogenezy haploidalne spermatydy przechodzą rozległą przebudowę chromatyny w których histony są sukcesywnie zastępowane przez bardziej podstawowe protaminy w celu generując wysoce zagęszczoną chromatynę. Tutaj po raz pierwszy pokazujemy, że metylacja H3K79 jest konserwatywną cechą poprzedzającą przejście histonu do protaminy u Drosophila melanogaster i szczura. Podczas spermatogenezy Drosophila, metylotransferaza Dot1-podobna metylotransferaza Grappa (Gpp) ulega ekspresji głównie w jądrach stadium canoe jąder. Odpowiednia metylacja H3K79 jest modyfikacją histonu, która poprzedza przejście histonu do protaminy i koreluje z hiperacetylacją histonu H4 i koreluje z hiperacetylacją histonu H4. Gdy acetylacja została zahamowana w hodowanych jądrach Drosophila, jądra były mniejsze, a chromatyna zwarta, Gpp był mało syntetyzowany, metylacja H3K79 była silnie zredukowana, a protaminy nie były syntetyzowane. Izoforma Gpp Gpp-D ma unikalny C-koniec, a Gpp jest niezbędny dla pełnej płodności. U szczurów metylacja H3K79 koreluje również z hiperacetylacją H4, ale nie z aktywną polimerazą RNA II, co może wskazywać na konserwatywną funkcję w przebudowie chromatyny podczas przejścia histonu do protaminy zarówno u Drosophila i szczura. --- Wzorzec ekspresji genów zróżnicowanych oocytów jest przeprogramowywany do wzorca totipotencjalnych zarodków przedimplantacyjnych przed i/lub po zapłodnieniu. Aby wyjaśnić mechanizmy przeprogramowania genomu, zbadaliśmy dimetylację histonu H3 (H3K79me2) i trimetylację (H3K79me3) w oocytach i zarodkach przedimplantacyjnych. zarodkach preimplantacyjnych za pomocą immunocytochemii. W komórkach somatycznych i oocytach, H3K79me2 obserwowano w całym genomie, podczas gdy H3K79me3 był zlokalizowany w pericentromerycznych regionach heterochromatyny, w których nie ma aktywnych genów. Ponieważ H3K79me2 jest uważany za marker aktywnego genu, metylacja H3K79 wydaje się mieć różne funkcje w zależności od liczby genów. ma różne funkcje w zależności od liczby grup metylowych dodanych do tych samych reszt. tych samych resztach. Zarówno H3K79me2, jak i H3K79me3 zmniejszyły się wkrótce po zapłodnieniu, a stan hipometylacji utrzymywał się w interfazie (przed stadium blastocysty), z wyjątkiem przejściowego stanu blastocystą), z wyjątkiem przejściowego wzrostu H3K79me2 w mitozie (faza M). H3K79me3 nie został wykryty przez cały okres preimplantacji, nawet w fazie M. Aby zbadać zaangażowanie H3K79me2 w przeprogramowanie genomu, jądra somatyczne zostały przeszczepione do enukleowanych oocytów. H3K79me2 w tych jądrach był demetylowane po aktywacji partenogenetycznej. Jednak jądra, które zostały zostały przeszczepione do partenogenetycznych zarodków 7 godzin po aktywacji nie były demetylowane. Sugeruje to, że eliminacja metylacji H3K79 po zapłodnieniu jest zaangażowana w przeprogramowanie genomu. --- Podczas mejozy dokładna segregacja chromosomów zależy od właściwej interakcji między chromosomami homologicznymi, w tym synapsy i rekombinacji. Punkt kontrolny mejotyczny punkt kontrolny rekombinacji jest mechanizmem kontroli jakości, który monitoruje te kluczowe zdarzenia. W odpowiedzi na defekty synapsy i/lub rekombinacji, ten punkt kontrolny blokuje lub opóźnia postęp mejozy, zapobiegając powstawaniu nieprawidłowych gamet. Rekombinacja mejotyczna zachodzi w kontekście chromatyny i modyfikacji histonów, które odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu integralności genomu. integralności genomu. Tutaj ujawniamy rolę zależnej od Dot1 metylacji histonu H3 metylacji lizyny 79 (H3K79me) w tym mechanizmie nadzoru mejotycznego. My wykazujemy, że funkcja mejotycznego punktu kontrolnego Dot1 opiera się na H3K79me ponieważ, podobnie jak delecja dot1, mutacje H3-K79A lub H3-K79R tłumią mejotyczny punkt kontrolny. opóźnienie mejotyczne narzucone przez punkt kontrolny mutanta zip1 z defektem synapsy. Ponadto, poprzez genetyczną manipulację aktywnością katalityczną Dot1, stwierdziliśmy, że status H3K79me moduluje odpowiedź mejotycznego punktu kontrolnego. Definiujemy również zdarzenia fosforylacji obejmujące aktywację efektora mejotycznego punktu kontrolnego kinazy Mek1. Dot1 jest wymagany do autofosforylacji Mek1, ale nie do jego fosforylacji zależnej od Mec1/Tel1. H3K79me zależne od Dot1 promuje również aktywację Hop1 i jego prawidłową dystrybucję wzdłuż chromosomów mejotycznych zip1, przynajmniej częściowo poprzez regulację lokalizacji Pch2. Ponadto, nadekspresja HOP1 omija wymóg Dot1 dla aktywacji punktu kontrolnego. Proponujemy, aby przebudowa chromatyny wynikająca z nienaprawionych mejotycznych DSB i / lub wadliwych interakcje międzyhomologiczne pozwalają Dot1 za pośrednictwem H3K79-me wykluczyć Pch2 z chromosomów chromosomów, napędzając w ten sposób lokalizację Hop1 wzdłuż osi chromosomów i umożliwiając pełną aktywację Mek1 w celu wywołania dalszych reakcji, takich jak mejotyczne zatrzymanie. --- Metylacja lizyny histonów reguluje ekspresję genów i inicjację raka. Analiza bioinformatyczna sugeruje, że DOT1L, metylotransferaza histonu H3-lizyny79 (H3K79) odgrywa potencjalnie ważną rolę w raku piersi. ZAHAMOWANIE DOT1L selektywnie hamowała proliferację, samoodnowę i potencjał przerzutowy komórek raka piersi oraz indukowała komórek raka piersi i indukowało różnicowanie komórek. Ponadto, inhibitory hydrolazy S-adenozylohomocysteiny (SAHH), takie jak neplanocyna i 3-deazaneplanocyna, również hamowały zarówno metylację H3K79, jak i proliferację komórek raka piersi komórek raka piersi in vitro i in vivo. Aktywność inhibitorów SAHH była wcześniej przypisywano hamowaniu metylotransferazy H3K27 EZH2. Jednakże, hamowanie EZH2 przez specyficzny inhibitor nie przyczyniało się do śmierci komórek. Inhibitory SAHH miały jedynie słabą aktywność przeciwko metylacji H3K27, a ich aktywność aktywność jest zatem głównie spowodowana hamowaniem metylacji DOT1L/H3K79. Podsumowując, wykazaliśmy, że DOT1L jest potencjalnym celem leków na raka piersi. --- Znaki epigenetyczne, takie jak modyfikacje histonów, odgrywają rolę w różnych dynamikach chromosomów w mitozie i mejozie. w mitozie i mejozie. Metylacja histonów H3 w pozycjach K4 i K79 jest zaangażowana w inicjację rekombinacji i punkt kontrolny rekombinacji podczas mejozy u pączkujących drożdży. Set1 promuje metylację metylację H3K4, podczas gdy Dot1 promuje metylację H3K79. W tym badaniu przeprowadziliśmy szczegółowe analizy mejozy w mutantach genów SET1 i DOT1 jak również mutantów z defektem metylacji histonu H3. Potwierdziliśmy rolę metylacji H3K4 zależnej od SET1 w tworzeniu pęknięć dwuniciowych (DSB) w mejozie do inicjacji rekombinacji mejotycznej i wykazaliśmy udział Dot1 (metylacja H3K79) w tworzeniu DSB pod nieobecność metylacji H3K4 zależnej od Set1. Ponadto wykazaliśmy, że mutanty z defektem metylacji histonów H3K4 są wadliwe w wydłużaniu SC, chociaż wydają się mieć umiarkowaną redukcję DSB. mają umiarkowaną redukcję DSB. Sugeruje to, że wysoki poziom DSBs w których pośredniczy metylacja histonu H3K4, promują wydłużanie SC. --- Białko podobne do Dot1 (DOT1L) jest ewolucyjnie konserwowaną metylotransferazą histonów metylotransferazą, która metyluje lizynę 79 histonu H3 (H3K79). Ssak DOT1L uczestniczy w regulacji transkrypcji, rozwoju, erytropoezy, różnicowania i proliferacji prawidłowych komórek. Jednakże rola DOT1L w proliferacji komórek nowotworowych nie została w pełni wyjaśniona. DOT1L transfekowane siRNA komórki raka płuc A549 lub NCI-H1299 wykazywały nieproliferujący wielojądrowy fenotyp. Komórki pozbawione DOT1L wykazywały również nieprawidłowe tworzenie wrzeciona mitotycznego i liczbę centrosomów, co sugeruje, że niedobór DOT1L prowadzi do nieprawidłowej segregacji chromosomów. Ta niestabilność chromosomalna w DOT1L prowadziła do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G(1) i indukowała starzenie, jak określono przez zwiększoną aktywność związanego ze starzeniem β-galaktozydazy. Tymczasem nadekspresja katalitycznie aktywnej DOT1L, a nie nieaktywnego mutanta, przywróciła fenotypy indukowane DOT1L siRNA. Ogólnie, dane te sugerują, że regulacja w dół metylacji H3K79 za pośrednictwem DOT1L zaburza proliferację ludzkich komórek. Ponadto, chociaż metylacja H3K79 jest regulowana w dół w starzejących się tkankach, jest regulowana w górę w liniach komórkowych raka płuc i tkankach nowotworowych pacjentów z rakiem płuc. W związku z tym metylacja H3K79 jest krytyczną modyfikacją histonów, która reguluje proliferację komórek i może być nowym znacznikiem histonowym dla starzenia się i raka.
Jaka jest ogólna funkcja metylacji H3K79?
Tablice ChIP-chip ujawniły, że poziomy wszystkich stopni genowej metylacji H3K79 korelują z obfitością mRNA i dynamicznie reagują na zmiany aktywności genów.