Rak jest wysoce złożoną i heterogeniczną chorobą obejmującą szereg zmian genetycznych (często spowodowanych lub towarzyszących egzogennej traumie) i skutkujące fenotypem molekularnym, który z kolei skutkuje złośliwą specyfikacją. specyfikację. Rozwój nowotworu złośliwego został opisany jako wieloetapowy proces obejmujący obejmujący samowystarczalność w zakresie sygnałów wzrostu, niewrażliwość na sygnały sygnały przeciwwzrostowe, unikanie apoptozy, nieograniczony potencjał replikacyjny, utrzymującą się angiogenezę, a w końcu inwazję tkanek i przerzuty. Analiza analiza ilościowa cząsteczek sieciowych w komórkach może być zastosowana do zrozumienia biologii sygnalizacji tkankowej w stanie natywnym, złożonych działań leków i dysfunkcyjnej sygnalizacji w transformowanych komórkach, czyli w komórkach nowotworowych. Wysokoprzepustowa analiza pojedynczych komórek może prowadzić do biologii systemów i cytomiki. biologii systemów i cytomiki. Zastosowanie cytomiki w badaniach i diagnostyce nowotworów jest bardzo szerokie. i diagnostyce nowotworów jest bardzo szerokie, począwszy od lepszego zrozumienia biologii komórek nowotworowych biologii komórek nowotworowych, identyfikacji resztkowych komórek nowotworowych po leczeniu, aż po odkrywanie leków. odkrywanie leków. Ostatecznym celem jest szczegółowe określenie tych procesów na poziomie poziomie molekularnym, komórkowym i tkankowym. Kompleksowa wiedza na ten temat będzie wymagała analizy tkanek, która jest multipleksowa i funkcjonalna; w związku z tym gromadzone są ogromne ilości danych. ogromne ilości danych są gromadzone z obecnych platform genomicznych i proteomicznych do integracji i interpretacji, a także dla nowych odmian zaktualizowanej technologii cytomiki. technologii cytomiki. Niniejszy przegląd pokrótce podkreśli najważniejsze aspekty tej stale rozwijającej się dziedziny. --- Neuropeptydy są szeroko rozpowszechnionymi cząsteczkami sygnałowymi, które wykazują dużą różnorodność chemiczną i funkcjonalną. funkcjonalną różnorodność. Przewidywania dotyczące rozszczepiania neuropeptydów z białek prekursorowych białka nie zawsze są poprawne, a zatem identyfikacja biochemiczna jest niezbędna. Analiza pojedynczych komórek jest cenna dla identyfikacji peptydów przetwarzanych z pojedynczego prekursora, ale także do określenia koekspresji dalszych neuropeptydów z innych prekursorów. Opracowaliśmy podejście do izolowania pojedynczych zidentyfikowanych neuronów z muszki owocowej Drosophila melanogaster do analizy spektrometrii masowej. analizy spektrometrycznej. Wykorzystując linie promotora Gal4 do sterowania zieloną fluorescencją pod kontrolą UAS, zidentyfikowaliśmy specyficzne neurony peptydergiczne. Te neurony były izolowane pojedynczo pod mikroskopem fluorescencyjnym i poddawane spektrometrii masowej MALDI-TOF. Dwie linie Gal4 zostały wykorzystane do identyfikacji czynnik rozpraszający pigment (PDF) i neurony wyrażające huginę. Odkryliśmy, że neurony duże neurony zegarowe wyrażające PDF dają początek tylko jednemu peptydowi, PDF. The trzy różne klasy neuronów wyrażających huginę wykazują tę samą masę sygnał, identyczny z pirokininą-2. Inny peptyd przewidywany z prekursora hugin hugin gamma, nie został wykryty w żadnej z komórek. Peptydomika pojedynczej komórki peptydomika jest potężnym narzędziem w neurobiologii Drosophila, ponieważ sterowniki Gal4 można być produkowane dla wszystkich znanych genów neuropeptydów, a tym samym dostarczać szczegółowych informacje o uzupełnieniach neuropeptydów w neuronach będących przedmiotem zainteresowania. --- Kompleksowe systemy dwuwymiarowej chromatografii cieczowej i elektroforezy kapilarnej zostały podsumowane w tym rozdziale. Różne kombinacje trybów elektroforezy kapilarnej kapilarnej i chromatografii cieczowej, a także interfejsów i technologii detekcji. i technologie detekcji. Typowy, kompleksowy dwuwymiarowy w połączeniu z chromatografią cieczową w odwróconej fazie z szybką elektroforezą kapilarną i elektroforezą kapilarną i połączony ze spektrometrią mas do analizy proteomicznej. analizy proteomicznej. Dwuwymiarowy system elektroforezy kapilarnej z sprzęgający kapilarną elektroforezę przesiewową z micelarną elektrokinetyczną chromatografią i jego zastosowanie w analizie pojedynczych komórek do profilowania ekspresji białek. profilowania ekspresji białek. --- W celu zbadania indywidualnej i niejednorodnej odpowiedzi komórkowej, np. na bodźce zewnętrzne, analiza pojedynczych komórek jest obowiązkowa i może dostarczyć nowych w proteomice, jak również w innych dziedzinach biologii systemów w przyszłości. przyszłości. Poniżej przedstawiamy nowe architektury chipów do analizy pojedynczych komórek oparte na pełnych chipach mikroprzepływowych ze szkła kwarcowego (chipy QG), które rozszerzają nasze poprzednie badania w chipach polidimetylosiloksanowych (PDMS) i zwiększają czułość wykrywania czułość detekcji natywnej fluorescencji indukowanej laserem UV (UV-LIF). Wykrycie roztworu tryptofanu o stężeniu 10nM przy stosunku S/N wynoszącym 11,9, co daje teoretyczną granicę wykrywalności teoretyczną granicę wykrywalności 2,5 nM (przy S/N=3). Dzięki tym optymalizacji trzy białka alfa-chymotrypsynogen A, albumina jaja kurzego i każde w stężeniu 100 mikrog/ml (równym 4 mikroM, 0,4 mikroM i 2,2 mikroM) zostały wstrzyknięte elektrokinetycznie i mogły być rozdzielone z rozdzielczością z niemal podstawową rozdzielczością. Ponadto, widma fluorescencji (długość fali wzbudzenia długość fali, lambda(ex) = 266 nm) wyraźnie pokazują korzystne właściwości jak bardzo wysoka przezroczystość UV i prawie zanikające tło fluorescencji tła chipów QG w porównaniu do chipów PDMS i PDMS z oknem kwarcowym (PQW). (PQW). Wreszcie, wykorzystujemy zwiększoną czułość dla elektroferogramów pojedynczych komórek komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9). --- Opisujemy mikrochip zaprojektowany do ilościowego określania poziomów tuzina białek cytoplazmatycznych i białek błonowych z pojedynczych komórek. Używamy platformy do oceny interakcji białko-białko związanych ze szlakiem sygnałowym PI3K, w którym pośredniczy receptor EGF szlakiem sygnałowym. Czułość pojedynczej komórki osiąga się poprzez izolację określonej liczby komórek (n = 0-5). określonej liczby komórek (n = 0-5) w komorach o objętości 2 nL, z których każda jest wzorzysta z dwiema kopiami miniaturowej matrycy przeciwciał. Komórki są lizowane na chipie, a poziomy poziomy uwolnionych białek są oznaczane przy użyciu macierzy przeciwciał. My badamy trzy izogeniczne linie komórkowe reprezentujące raka glioblastoma multiforme, na poziomie podstawowym, pod stymulacją EGF i pod erlotynibem oraz stymulacji EGF. Zmierzone obfitości białek są zgodne z wcześniejszymi pracami, a analiza pojedynczych komórek w unikalny sposób ujawnia heterogeniczność oraz różne typy i siłę interakcji białko-białko interakcji białko-białko. Platforma ta pomaga zapewnić kompleksowy obraz zmienionych sieci sieci transdukcji sygnału w komórkach nowotworowych i zapewnia wgląd w efekt terapii celowanych na sieci sygnalizacji białkowej. --- Obrazowanie i profilowanie spektrometrii mas poszczególnych komórek i struktur subkomórkowych zapewniają unikalne możliwości analityczne dla badań biologicznych i biomedycznych i biomedycznych, w tym określanie biochemicznej heterogeniczności populacji komórek i wewnątrzkomórkowej lokalizacji farmaceutyków. komórkowych i wewnątrzkomórkowej lokalizacji farmaceutyków. Dwie technologie spektrometrii mas technologie spektrometrii mas - spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS) i matryca spektrometria mas z desorpcją laserową/jonizacją matrycy (MALDI MS) - są najczęściej najczęściej wykorzystywane w badaniach mikro-bioanalitycznych. Ostatnie postępy w technologii sond jonowych jonowej zwiększyły zakres dynamiczny i czułość wykrywania analitów wykrywania analitów za pomocą SIMS, umożliwiając dwu- i trójwymiarową lokalizację analitów w różnych komórkach. SIMS działający w trybie obrazowania spektrometrii mas (MSI) może rutynowo osiągać rozdzielczość przestrzenną na poziomie submikronowym; dlatego, jest często wykorzystywany w badaniach składu chemicznego struktur subkomórkowych. struktur subkomórkowych. MALDI MS oferuje duży zakres mas i wysoką czułość wykrywania analitów. i wysoką czułość wykrywania analitów. Został z powodzeniem zastosowany w różnych badaniach profilowania pojedynczych komórek i organelli. komórkach i organellach. Innowacyjne oprzyrządowanie, takie jak skanująca MALDI i spektrometry mikroskopu masowego umożliwiają nowe subkomórkowe pomiary MSI pomiary subkomórkowe. Inne podejścia do obrazowania i profilowania chemicznego opartego na MS obejmują te oparte na laserowej ablacji bliskiego pola i indukcyjnie sprzężonej plazmie MS, które oferują komplementarne możliwości subkomórkowego obrazowania i profilowania chemicznego. i profilowania. --- Tradycyjne technologie badania biologii systemów są ograniczone przez wykrywanie parametrów wynikających z uśrednienia dużych populacji komórek. komórek, brakującymi komórkami produkowanymi w małych ilościach i próbą ujednolicenia heterogeniczności. heterogeniczności. Pojawienie się proteomiki i genomiki na poziomie pojedynczej komórki stworzyło podstawę dla wyjątkowej poprawy technologii analitycznej i pozyskiwania danych. i pozyskiwania danych. Wykazano, że heterogeniczność komórkowa jest ściśle związana z licznymi stochastycznymi trans ściśle związana z licznymi stochastycznymi zdarzeniami transkrypcyjnymi prowadzącymi do różnic we wzorcach ekspresji pomiędzy pojedynczymi genetycznie identycznymi komórkami. Technologia nowej generacji analizy pojedynczych komórek jest w stanie lepiej lepiej scharakteryzować populację komórek, identyfikując i różnicując komórki odstające, w celu zapewnienia zarówno eksperymentu na pojedynczej komórce, jak i odpowiadającego mu pomiaru masowego pomiar, poprzez identyfikację, kwantyfikację i charakterystykę wszystkich aspektów biologii systemowej (genomika, transkryptomika, proteomika, metabolomika, degradomika i fluksomika). Przeniesienie omiki do analizy pojedynczej komórki stanowi znaczącą i wyjątkową zmianę. --- Analiza pojedynczych komórek jest niezbędna do zrozumienia procesów różnicowania komórek różnicowania komórek i specjalizacji metabolicznej w rzadkich typach komórek. Ilość pojedynczych białek w pojedynczych komórkach może być tak niska, jak jedna kopia na komórkę i jest dla większości białek w zakresie attomoli lub poniżej; zwykle uważane za niewystarczające do analizy proteomicznej. Rozwój nowoczesnych spektrometrów masowych posiadających o zwiększonej czułości i dokładności masowej w połączeniu z nano-LC-MS/MS umożliwia analizę zawartości pojedynczych komórek. W Arabidopsis thaliana udało nam się z powodzeniem zidentyfikowaliśmy dziewięć unikalnych białek w próbce pojedynczej komórki i 56 białek z puli 15 jednokomórkowych próbek z komórek S bogatych w glukozynolan za pomocą analizy proteomicznej nanoLC-MS/MS, ustanawiając w ten sposób dowód koncepcji dla prawdziwej analizy proteomicznej pojedynczej komórki. Dehydryna (ERD14_ARATH), dwie mirozynazy (BGL37_ARATH i BGL38_ARATH), aneksyna (ANXD1_ARATH), wegetatywne białka magazynujące białka (VSP1_ARATH i VSP2_ARATH) i cztery białka należące do grupy cyklu S-adenozylo-l-metioniny (METE_ARATH, SAHH1_ARATH, METK4_ARATH i METK1/3_ARATH) z powiązaną kinazą adenozynową (ADK1_ARATH), były wśród białek zidentyfikowanych w tych próbkach pojedynczych komórek S. Porównanie funkcjonalnych funkcjonalnych grup białek zidentyfikowanych w komórkach S z komórkami naskórka/korowymi i całą tkanką tkanki zapewniło unikalny wgląd w metabolizm komórek S. Doszliśmy do wniosku że komórki S są aktywne metabolicznie i zawierają maszynerię do biosyntezy de novo biosyntezy metioniny, prekursora najobficiej występującego glukozynolanu glukorafaniny w tych komórkach. Ponadto, ponieważ obfite peptydy TGG2 i TGG1 zostały konsekwentnie znalezione w próbkach pojedynczych komórek S, wcześniej wykazano, że mają wysokie glukozynolanów, sugerujemy, że zarówno mirozynazy, jak i glukozynolany mogą być zlokalizowane w tych samych komórkach, ale w oddzielnych przedziałach subkomórkowych. Złożona struktura błonowa komórek S została odzwierciedlona przez obecność białek zaangażowanych w utrzymanie błony i organizację komórkową. --- Fosforylacja białek ma kluczowe znaczenie w regulacji szlaków sygnałowych, które kontrolują różne reakcje biologiczne. Niedawny postęp w różnorodnych metodologiach do badania fosforylacji białek w złożonych próbkach biologicznych zaowocował szybszymi, bardziej szczegółowymi i ilościowymi analizami sieci sygnalizacyjnych. sieci sygnalizacyjnych. W szczególności, postępy w spektrometrii mas (MS) umożliwiły identyfikację i kwantyfikację tysięcy znanych i nowych miejsc fosforylacji. miejsc fosforylacji. Wstępne informacje oparte na MS można uzupełnić o różnymi niedawno opracowanymi i ulepszonymi technikami fosfoproteomicznymi. Należą do nich obejmują multipleksowane testy mikrokulkowe lub testy aktywności kinaz, cytometrię przepływową opartą na analizie analizę pojedynczych komórek, mikromacierze białkowe i badania interakcji. Połączenie połączenie wielu podejść, w połączeniu z fenotypowymi pomiarami odpowiedzi pomiarami fenotypowymi, modelowaniem obliczeniowym i manipulacjami biochemicznymi. ostatecznie ujawni mechanistyczną regulację sieci sygnalizacyjnych. --- W tym specjalnym wydaniu J. R. Soc. Interface przedstawiamy przegląd sił napędowych stojących za postępem technologicznym w dziedzinie pojedynczych komórek. sił napędowych stojących za postępem technologicznym w dziedzinie analizy pojedynczych komórek analizy pojedynczych komórek. Obejmują one zwiększenie naszego zrozumienia heterogeniczności komórek heterogeniczności komórek, aż po badanie rzadkich komórek, obszarów badań, które nie mogą być skutecznie nie mogą być skutecznie rozwiązywane przy użyciu obecnych wysokowydajnych technik uśredniania populacyjnego. opartych na populacji. --- Analiza pojedynczych komórek (SCA) jest coraz częściej uznawana za kluczową technologię technologia do wyjaśnienia funkcji komórkowych, które nie są dostępne z masowych pomiarów na poziomie populacji. Jak dotąd, SCA została osiągnięta poprzez miniaturyzację ustalonych koncepcji inżynieryjnych, aby dopasować je do wymiarów pojedynczej komórki. SCA wymaga jednak procedur wykraczających poza klasyczne podejście klasycznego podejścia do przetwarzania, fermentacji i dalszego przetwarzania, ponieważ sam system biologiczny określa wymagania techniczne. Niniejszy przegląd scharakteryzowano obecnie dostępne mikroprzepływy i mikroreaktory dla inwazyjnych (tj. chemicznej) i nieinwazyjnej (tj. biologicznej) SCA. Opisujemy najnowsze SCA jako narzędzia biologii systemów i omawiamy rolę SCA w genomice, transkryptomice i biologii biologicznej. genomice, transkryptomice, proteomice, metabolomice i fluksomice. Ponadto, omawiamy zastosowania SCA w biokatalizie i inżynierii metabolicznej, jak również a także jej potencjał w zakresie optymalizacji bioprocesów. Na koniec definiujemy obecne i przyszłe wyzwania dla SCA i proponujemy strategie przezwyciężenia obecnych ograniczeń. ograniczenia. --- Analizy biologiczne tradycyjnie badają zespoły komórek w zakresie 103-106 komórek. komórek, tym samym całkowicie uśredniając istotne odpowiedzi poszczególnych komórek, takie jak różnice w proliferacji komórek, odpowiedzi na bodźce zewnętrzne lub choroby. W ostatnich latach zdano sobie sprawę z tego faktu i wzrosło zainteresowanie zainteresowanie metodami analitycznymi dla pojedynczych komórek, które mogą zapewnić wgląd w genomikę, proteomikę, transkryptomikę i biologię systemów. biologii systemów. Urządzenia mikroprzepływowe lub laboratoryjne na chipie są metodą z wyboru dla narzędzi analitycznych narzędzi analitycznych dla pojedynczych komórek, ponieważ pozwalają one na integrację różnych niezbędnych etapów procesu związanych z analizą pojedynczych komórek, takich jak selekcja, nawigacja, pozycjonowanie lub liza pojedynczych komórek, a także separacja i wykrywanie analitów komórkowych. Wraz z tą korzystną integracją, urządzenia mikroprzepływowe zamykają pojedyncze komórki w przedziałach zbliżonych do ich wewnętrznej objętości, minimalizując w ten sposób efekt objętości, minimalizując w ten sposób efekty rozcieńczenia i zwiększając czułość wykrywania. Niniejszy przegląd zawiera przegląd rozwoju i osiągnięć mikroprzepływowej analizy pojedynczych komórek związków wewnątrzkomórkowych w ciągu ostatnich kilku lat, od urządzeń do zastosowań wykazujących wysokie znaczenie biologiczne. znaczenie.
Czy analiza pojedynczych komórek (SCA) jest możliwa w proteomice?
Nie, nie jest to jeszcze wykonalne, chociaż przeprowadzono mniejsze badania pilotażowe, w których przeanalizowano ograniczoną liczbę białek.