Karboksylaza propionylo-CoA (PCC) jest mitochondrialnym enzymem zależnym od biotyny, składający się z równej liczby podjednostek alfa i beta, który funkcjonuje w katabolizmie aminokwasów rozgałęzionych i innych metabolitów. Mutacje PCCA (podjednostka alfa) lub PCCB (podjednostka beta) powodują dziedziczną chorobę metaboliczną, kwasicę propionową. chorobę metaboliczną, kwasicę propionową. Zgłaszamy klonowanie pełnej długości cDNA kodującego podjednostkę beta ludzkiego PCC. Otwarta ramka odczytu koduje polipeptyd pre-beta o długości 539 aminokwasów (58 205 Da). CDNA został wprowadzony do wektora ekspresyjnego pRc/CMV i mikroiniekcji do jądra lub, jako rybotranskrypty, do cytoplazmy linii fibroblastów od pacjentów z defektami podjednostki beta. defektami podjednostki beta. Przywrócenie funkcji było monitorowane przez autoradiografię zależnego od PCC [14C] -propionianu wbudowującego się w białko komórkowe. białka. Wyniki te potwierdzają kompletność klonu i wykazują zdolność zdolność podjednostek beta pochodzących z mikroiniekcji cDNA lub RNA do bycia transportowane do mitochondriów i łączone z endogennymi podjednostkami alfa tworząc funkcjonalne PCC. --- Wrodzona choroba metaboliczna kwasica propionowa (PA) może być wynikiem mutacji w jednym z genów PCCA lub PCCB, które kodują odpowiednio podjednostki alfa i beta mitochondrialnego enzymu karboksylazy propionylo-CoA. W tej pracy przeanalizowaliśmy molekularne podstawy defektów genu PCCA, badając poziomy mRNA i identyfikując przypuszczalne mutacje powodujące chorobę. Łącznie zidentyfikowano 10 różnych mutacji, z których żadna nie jest dominująca, jest obecnych w próbce 24 badanych zmutowanych alleli. badanych alleli. Po raz pierwszy opisano pięć nowych mutacji. A neutralny polimorfizm i wariant allelu obecny w populacji ogólnej. również wykryte. Aby zbadać wpływ mutacji punktowej (M348K) obejmującej wysoce konserwowaną resztę wysoce konserwatywnej reszty, przeprowadziliśmy ekspresję in vitro normalnego i cDNA i przeanalizowaliśmy import mitochondrialny i stabilność powstałych białek. powstałych białek. Zarówno białka typu dzikiego, jak i zmutowane były importowane do mitochondriów i przetwarzane do postaci dojrzałej z podobną wydajnością, ale dojrzałe zmutowane białko dojrzałe zmutowane białko M348K rozpadało się szybciej niż typ dziki, co wskazuje na zmniejszoną stabilność, która prawdopodobnie jest mechanizmem powodującym chorobę. --- Mutacje w genach PCCA lub PCCB kodujących podjednostki alfa i beta karboksylazy propionylo-CoA mogą powodować karboksylazy propionylo-CoA mogą powodować kwasicę propionową. Aby zrozumieć molekularne podstawy komplementacji intragenicznej opisanej wcześniej w locus PCCB. PCCB, zbadaliśmy teraz zachowanie komplementacji czterech karboksy-końcowych i 11 amino-końcowych naturalnie występujących zmutowanych alleli zarówno wykorzystując fuzję komórek i rekonstruując zdarzenie komplementacji poprzez transfekcję cDNA w celu wygenerowania multimerycznych białek hybrydowych. Allele niosące p.R410W i p.W531X są zdolne do komplementacji z 10 z 11 mutacji badanych mutacji amino-końcowych. Tylko niestabilne mutanty p.R512C, p.L519P i p.G112D nie dopełniają się. Wyniki analizowane w ramach struktury krystalicznej struktury homologicznej transkarboksylazy 12S z Propionibacterium shermanii pokazują, że wszystkie badane zmutowane allele są zlokalizowane na styku podjednostek beta beta, allele komplementarne na interfejsie między trimerami, gdzie prawdopodobnie zachodzi kataliza kataliza prawdopodobnie zachodzi, a allele niekomplementarne na interfejsie wewnątrz trimeru prawdopodobnie zakłócając tworzenie trimeru. Nasze wyniki pokazują również niezwykły efekt stabilizacji, gdy p.R410W jest kotransfekowany z p.G246V. My proponujemy model komplementacji wewnątrzgenowej wymagający produkcji dwóch podjednostek beta niosących mutacje karboksy- i amino-końcowe, które pozwalają na regenerację funkcjonalnych miejsc aktywnych i w którym efekt stabilizacji między podjednostkami podjednostkami może być istotny dla złagodzenia fenotypu biochemicznego każdej mutacji mutacji oddzielnie. --- Karboksylaza propionylo-CoA (PCC) jest mitochondrialnym, zależnym od biotyny enzymem zaangażowanym w katabolizm aminokwasów, nieparzystołańcuchowych kwasów tłuszczowych i innych metabolitów. metabolitów. PCC składa się z dwóch podjednostek, alfa i beta, kodowanych odpowiednio przez geny PCCA i PCCB. Wrodzony niedobór PCC spowodowany mutacjami w obu genach powoduje kwasicę propionową (PA), chorobę dziedziczoną autosomalnie recesywnie. Co zaskakujące, PA jest wysoce rozpowszechniona wśród Inuitów na Grenlandii. Przeanalizowaliśmy produkty odwrotnej transkryptazy-PCR mRNA podjednostki beta, aby scharakteryzować odpowiedzialne mutacje. odpowiedzialne mutacje. Wstawkę 3-bp, 1540insCCC, znaleziono w postaci homozygotycznej u trzech pacjentów i w złożonej formie heterozygotycznej u jednego pacjenta. Powstały PCC nie ma mierzalnej aktywności, a zmutowana podjednostka beta wydaje się być bardzo niestabilna. Aby przetestować hipotezę, że wspólna mutacja jest odpowiedzialna za za PA w grenlandzkiej populacji Eskimosów, 310 anonimowych próbek DNA pochodzenia eskimoskiego zostały przebadane pod kątem 1540insCCC. Stwierdziliśmy częstotliwość nosicielstwa na poziomie 5%, co jest bardzo wysoka w porównaniu z większością innych chorób autosomalnych recesywnych. Analiza alleli bardzo blisko powiązanego markera, D3S2453, ujawniła wysoki wysoki stopień nierównowagi sprzężeń między jednym specyficznym allelem a 1540insCCC, sugerując, że mutacja ta może być mutacją założycielską. --- Karboksylaza propionylo-CoA (PCC) jest mitochondrialnym, zależnym od biotyny enzymem zaangażowanym w katabolizm aminokwasów rozgałęzionych, kwasów tłuszczowych o nieparzystych łańcuchach, i innych metabolitów. PCC składa się z nieidentycznych podjednostek, alfa i beta, kodowanych odpowiednio przez geny PCCA i PCCB. Wrodzony niedobór PCC spowodowany mutacjami w genie PCCA lub PCCB skutkuje kwasicą propionową (PA), klinicznie kwasicę propionową (PA), klinicznie heterogenne zaburzenie z ciężką, często śmiertelną, noworodków oraz łagodną postacią o późniejszym początku. Aby scharakteryzować mutacje genu PCCA odpowiedzialnych za niedobór PCC, przeanalizowaliśmy produkty RT-PCR uzyskane z hodowanych fibroblastów od hiszpańskich pacjentów z niedoborem PCC-alfa. U trzech pacjentów zaobserwowano mniejsze niż normalne produkty PCR, a analiza sekwencji ujawniła delecję 54-bp eksonu w cDNA. Sekwencjonowanie genomowego DNA od tych trzech pacjentów doprowadziło do identyfikacji trzech nowych mutacji w genie mutacji w genie PCCA, dwóch krótkich delecji i jednej małej insercji, sąsiadujących z krótkimi bezpośrednie powtórzenia, a wszystkie z nich wpływają na konsensusowe miejsca splicingu pominiętego eksonu. pominiętego eksonu. Mutacje te, 1771IVS-2del9, 1824IVS+3del4 i 1824IVS+3insCT, są przyczyną nieprawidłowego splicingu pre-mRNA PCCA i skutkują delecją 54 nukleotydów w ramce. delecją 54 nukleotydów w cDNA, co prawdopodobnie prowadzi do niestabilnej struktury białka, odpowiedzialnej za brak struktury białka, która jest odpowiedzialna za brak aktywności prowadzący do niedoboru PCC u tych pacjentów. --- Niedobór karboksylazy propionylo-CoA (PCC; alfa 4 beta 4) prowadzi do rzadką, autosomalną recesywną chorobę - kwasicę propionową. Eksperymenty fuzji komórek ujawniły dwie grupy komplementacyjne, pccA i pccB, odpowiadające defektom defektom odpowiednio genów PCCA (podjednostka alfa) i PCCB (podjednostka beta). Grupa pccBCC obejmuje podgrupy, pccB i pccC, które uważa się za odzwierciedlenie międzyalleliczną komplementację między niektórymi mutacjami genu PCCB. W tym zidentyfikowaliśmy mutacje w dwóch liniach komórkowych pccB, jednej pccC i dwóch pccBC i wydedukowaliśmy allele uczestniczące w komplementacji międzyallelicznej. komplementacji. Jedna linia pccB była złożoną heterozygotą Pro228Leu i Asn536Asp. Ta ostatnia mutacja została również wykryta w niekomplementarnej linii pccBC linii. Pozostawia to Pro228Leu odpowiedzialną za komplementację w komórkach pccB. Druga linia pccB zawierała duplikację insercyjną, dupKICK140-143 i mutację splicingową IVS + 1. mutację IVS + 1 G-->T, zlokalizowaną po Lys466. Sugerujemy, że mutacja dupKICK jest allelem komplementarnym, ponieważ drugi allel jest niekompatybilny z normalnym splicingiem. z normalnym splicingiem. Badana linia pccC była homozygotyczna dla Arg410Trp, który jest koniecznie allelem komplementarnym w tej linii. Dla drugiej linii pccC, my wcześniej zaproponowaliśmy, że delta Ile408 była allelem dopełniającym. Teraz pokazujemy, że jego drugi allel, "Ins.Del", delecja 14-punktowa zastąpiona insercją 12-punktową zaczynając od kodonu 407, nie uzupełnia się w formie homozygotycznej. My wnioskujemy, że komplementacja międzyalleliczna wynika z mutacji w domenach które mogą wchodzić w interakcje między podjednostkami beta w heteromerze PCC, aby przywrócić funkcji enzymatycznej. Na podstawie homologii sekwencji z transkarboksylazą Propionibacterium shermanii podjednostką 12S transkarboksylazy, sugerujemy, że domena pccC, zdefiniowana przez przez Ile408 i Arg410, może obejmować miejsce wiązania propionylo-CoA. --- 4,5-letnia dziewczynka z dotychczas nie wyróżniającą się historią medyczną zapadła w śpiączkę podczas prostej infekcji. Wykazała ciężką kwasicę metaboliczną bez mleczanu. Poziom aminokwasów rozgałęzionych we krwi był podwyższony. W W moczu wykryto przeciwciała ketonowe, zwiększone wydalanie kwasu 3-OH-izowalerianowego i 3-OH-propionowego. i kwasu 3-OH-propionowego, natomiast nie stwierdzono obecności metylomalonianu. Profil acylokarnityn wykazał zwiększone stężenie propionylokarnityny. Pomimo ograniczenia podaży białka, wysokokalorycznego odżywiania, korekty kwasicy i suplementacji biotyny i karnityny, dziewczynka zmarła 2 dni po przyjęciu z powodu arytmii serca. serca. W fibroblastach skóry aktywność karboksylazy propionylo-koenzymu A (PCC) była znacznie zmniejszona. Analiza mutacji potwierdziła diagnozę kwasicy propionowej (PA) z heterozygotycznością złożoną dla 2 nowych mutacji missense mutacji L417W/Q293E w genie PCCA, przy czym matka była nosicielką mutacji Q293E, a ojciec mutacji L417W. ojciec mutację L417W. PA o późnym początku powinna być uwzględniona w diagnostyce różnicowej w diagnostyce różnicowej niejasnej śpiączki. Oznaczanie acylokarnityn przy użyciu tandemowej spektrometrii mas, a także kwasów organicznych w moczu. --- Kwasica propionowa (PA) jest recesywnym zaburzeniem spowodowanym niedoborem karboksylazy propionylo-CoA (PCC). karboksylazy propionylo-CoA (PCC), dodekamerycznego enzymu składającego się z dwóch różnych białek alfa-PCC i beta-PCC. białek alfa-PCC i beta-PCC, kodowanych jądrowo przez geny PCCA i PCCB, odpowiednio. Mutacje w którymkolwiek z genów powodują PA i do tej pory, do 47 różnych allelicznych w genie PCCB zostało zidentyfikowanych w różnych populacjach. populacjach. W niniejszej pracy opisujemy badania ekspresji 18 zmian sekwencji PCCB w celu wyjaśnienia ich funkcjonalnych konsekwencji. Wykorzystaliśmy wykorzystaliśmy linię komórkową transformowanych fibroblastów z niedoborem PCCB, aby ukierunkować białka typu dzikiego i zmutowanych białek do ich sytuacji fizjologicznej, analizując wpływ mutacji na aktywność PCC i stabilność białka. Spośród 18 zmutowanych białek testowanych pod kątem aktywności, te niosące substytucje L17M i A497V wykazały aktywność podobną do typu dzikiego, co dowodzi, że zmiany te nie mają wpływu na aktywność białka. mają żadnego wpływu na aktywność białka. Pozostałe 16 zmutowanych białek wykazywało dwa różne zachowania funkcjonalne, 3 zachowały znaczną aktywność (K218R, R410W i N536D), a pozostałe 13 białek wykazywało zerową lub bardzo niską aktywność. Analiza Western blot wykazała niestabilność tylko dla zmutowanych białek L519P, R512C i G112D. Udowodniliśmy patogenność mutacji R67S, R165Q i G112D w genie PCCB, wyrażonych po raz pierwszy w tej pracy. Informacje informacje uzyskane z analizy ekspresji zostały omówione w kontekście fenotypu i genotypu w celu poszerzenia wiedzy na temat tej złożonej choroby. --- Kwasica propionowa jest wynikiem mutacji w jednym z dwóch genów, PCCA lub PCCB, które kodują dwie podjednostki karboksylazy propionylo-CoA (PCC). enzymu. W tym badaniu przedstawiamy identyfikację i analizę siedmiu nowych mutacji mutacji splicingowych obejmujących konsensusowe donorowe i akceptorowe miejsca splicingowe. Większość z nich została zidentyfikowana u pacjentów pochodzenia środkowoazjatyckiego, a niektóre z nich występują w kilku allelach, prawdopodobnie odzwierciedlając efekty założycielskie. Funkcjonalne konsekwencje konsekwencje mutacji splicingowych analizowano w fibroblastach pacjentów, a także kwantyfikację transkryptów przy użyciu metod PCR w czasie rzeczywistym. W genie PCCA wykazano, że dwie mutacje wpływają na miejsca splicingowe 5' (c.231+1G>C i c.1209+3A>G) i dwa 3' akceptorowe miejsca splicingu (c.1210delG i c.1430G>T), wszystkie powodujące powodując pomijanie zaangażowanych eksonów, bez wykrywalnych poziomów normalnie normalnie splicowanego transkryptu. W genie PCCB wszystkie trzy mutacje obejmowały 5' miejsca splice miejsca splicingu - dwie wpłynęły na splicing eksonu 1 (c.154_183+17del46 i c.183+2T>C), ta ostatnia aktywuje kryptyczne miejsce splicingu w intronie 1, a pozostałe mutacja (c.1498+2T>C) spowodowała pominięcie eksonu 14. Wyniki podkreślają konieczność konieczność przeprowadzenia analizy transkryptu oprócz sekwencjonowania genomowego DNA aby scharakteryzować wpływ mutacji splicingowych i dodać istotne informacje na temat epidemiologii genetycznej choroby. epidemiologii genetycznej choroby. --- Kwasica propionowa (PA) jest autosomalnym recesywnym wrodzonym błędem w katabolizmie metioniny, izoleucyny, treoniny i waliny. metioniny, izoleucyny, treoniny i waliny, kwasów tłuszczowych o nieparzystej długości łańcucha i cholesterolu. kwasów tłuszczowych i cholesterolu. Objawy kliniczne są bardzo niejednorodne i występują jako ciężka postać noworodkowa lub postać późna. Jest ona spowodowana karboksylazy propionylo-CoA (PCC, EC 6.4.1.3), enzymu zależnego od biotyny, który katalizuje karboksylazę propionylo-CoA. enzymu, który katalizuje karboksylację propionylo-CoA do D-metylomalonylo-CoA. PCC jest heteropolimerycznym enzymem składającym się z podjednostek alfa i beta. Większą heterogeniczność obserwuje się w genie PCCA, podczas gdy w przypadku genu PCCB ograniczona liczba mutacji jest odpowiedzialna za liczba mutacji jest odpowiedzialna za większość alleli scharakteryzowanych w populacjach kaukaskich i orientalnych. Zidentyfikowaliśmy ośmiu koreańskich pacjentów z PA za pomocą analizy kwasów organicznych potwierdzonej u pięciu pacjentów za pomocą enzymu PCC w limfoblastach. Dwóch noworodków wykazało niewykrywalną aktywność PCC podczas gdy trzy przypadki z resztkową aktywnością enzymu miały stosunkowo późne objawy. objawy. W analizie molekularnej zidentyfikowaliśmy pięć nowych mutacji, Y439C, 1527del3, 1357insT, IVS12-8T-->A i 31del10 oraz jedną znaną mutację, T428I w genie PCCB. Częstotliwość alleliczna T428I u koreańskich pacjentów z PA wynosiła 56,3% w tym badaniu. Dwóch pacjentów w wieku noworodkowym z zerową aktywnością enzymu było homozygotami odpowiednio z 1527del3 i T428I. To odkrycie sugeruje, że że mutacje T428I i 1527del3 mogą być odpowiedzialne za ciężki przebieg kliniczny i zerową aktywność enzymu. przebieg kliniczny i zerową aktywność enzymatyczną. MRNA genu PCCB u homozygot T428I i 1527del3 homozygotach były prawidłowe, ale w analizie Western blot podjednostka betaPCC była nieobecna tylko u pacjenta z homozygotą 1527del3, co sugeruje inną patologię molekularną. patologię molekularną. --- Niedobór karboksylazy propionylo-CoA (PCC) powoduje kwasicę propionową, autosomalną chorobę recesywną charakteryzującą się wystarczająco ciężką kwasicą ketonową. autosomalnym recesywnym zaburzeniem charakteryzującym się kwasicą ketonową wystarczająco ciężką aby spowodować śmierć noworodka. PCC bierze udział w katabolizmie aminokwasów rozgałęzionych, nieparzystołańcuchowych aminokwasów rozgałęzionych, nieparzystołańcuchowych kwasów tłuszczowych i cholesterolu. Enzym jest zależnym od biotyny białkiem mitochondrialnym składającym się z dwóch heterologicznych podjednostek ułożonych w strukturę dodekameryczną alfa(6)beta(6) o masie 800 kDa. Około 60 mutacji zostało zgłoszonych w genach jądrowych PCCA i PCCB, które kodują dwie podjednostki PCC. Zdecydowana większość tych mutacji nie została zbadana na poziomie białkowym. Przedstawiamy wstępną charakterystykę 13 mutacji zlokalizowanych w eksonach 1, 3-7 i 12-14 genu PCCB. Po ekspresji w E. coli, te rekombinowane zmutowane enzymy analizowano pod kątem stabilności, biotynylacji, interakcji podjednostki alfa-beta i aktywności. Nasze wyniki pokazują funkcjonalną dychotomię w tych mutacjach PCCB z niektórymi mutantami (R44P, S106R, G131R, G198D, V205D, I408del i M442T) zdolnymi do różnego stopnia montażu ale tworzące katalitycznie nieaktywne białka PCC. Inne mutanty PCCB (R165W, E168K, D178H, P228L i R410W), które wykazują niedobór PCC w fibroblastach pochodzących od pacjentów. fibroblastów, okazały się zdolne do wyrażania aktywności PCC na poziomie typu dzikiego po zmontowaniu w naszym systemie ekspresji E. coli wspomaganym chaperonem. Wynik ten wskazuje, że mutacje te wywierają swój patogenny wpływ z powodu niezdolności do prawidłowego montażu w komórkach pacjentów. Ten wstępny ekran zidentyfikował zmutowanych białek PCC, które są wystarczająco stabilne do oczyszczenia i następnie wykorzystane do analizy struktura-funkcja w celu dalszego wyjaśnienia złożony związek między genotypem a fenotypem w kwasicy propionowej. --- Mutacje w genach PCCA lub PCCB są odpowiedzialne za kwasicę propionową (PA). kwasicę propionową (PA), jedną z najczęstszych kwasic organicznych dziedziczonych w sposób autosomalny sposób recesywny. Większość wykrytych do tej pory mutacji w obu genach jest missense. W przypadku pacjentów z niedoborem PCCA, duża liczba alleli pozostaje niescharakteryzowana, niektóre z nich podejrzewa się o delecję egzonową. My zastosowaliśmy multipleksową amplifikację sondy ligacyjnej (MLPA) i długie PCR w w niektórych przypadkach w celu zbadania rearanżacji genomowych w genie PCCA u 20 pacjentów u których standardowe techniki wykrywania mutacji nie zakończyły analizy genotypu. analiza genotypu. Znaleziono osiem różnych delecji, odpowiadających częstotliwości 21,3% wszystkich alleli PCCA genotypowanych w naszym ośrodku. Dwie z egzonicznych delecji delecje były częste, jedna obejmowała eksony 3-4, a druga ekson 23, chociaż w pierwszym przypadku w pierwszym przypadku zidentyfikowano dwa różne chromosomalne punkty przerwania. Brak eksonów 3 i 4, co jest również konsekwencją nowej mutacji splicingowej c.231+1g>c obecnej u dwóch pacjentów, przypuszczalnie skutkuje delecją in-frame obejmującą 39 aminokwasów, która uległa ekspresji w układzie eukariotycznym, potwierdzając jej patogenność. jej patogenność. Niniejsza praca po raz pierwszy opisuje wysoką częstotliwość dużych delecji genomowych w genie PCCA, co może wynikać z charakterystyki struktury genu PCCA. charakterystyce struktury genu PCCA i jego obfitości w intronowych elementach repetytywnych. elementów powtarzalnych. Nasze dane podkreślają potrzebę wykorzystania analizy dawkowania genów w celu uzupełnienia rutynowej analizy genetycznej u pacjentów z PCCA. --- Kwasica propionowa jest dziedzicznym zaburzeniem metabolicznym spowodowanym niedoborem karboksylazy propionylo-CoA, dodekamerycznego enzymu składającego się z podjednostek alfa-PCC i beta-PCC (kodowanych przez geny PCCA i PCCB). podjednostek beta-PCC (kodowanych przez geny PCCA i PCCB), które zostały powiązane z szeregiem mutacji odpowiedzialnych za z wieloma mutacjami odpowiedzialnymi za tę chorobę. Aby wyjaśnić efekt molekularny związany ze zmianami genów powodującymi kwasicę propionową, 12 różnych mutacji wpływających na gen PCCB (R67S, S106R, G131R, R165W, R165Q, E168K, G198D, A497V, R512C, L519P, W531X i N536D) przeanalizowano pod kątem ich udziału w heterologii alfa-beta. zaangażowanie w montaż heteromeryczny alfa-beta i homomeryczny beta-beta. Eksperymenty eksperymenty przeprowadzono przy użyciu ssaczego systemu dwuhybrydowego, który był testowano w dwóch różnych temperaturach, aby rozróżnić mutacje bezpośrednio zaangażowane w interakcję i te prawdopodobnie wpływające na fałdowanie polipeptydu, a tym samym pośrednio wpływające na prawidłowy montaż. Mutacje R512C, L519P, W531X i N536D, zlokalizowane na karboksylowo-końcowym końcu genu PCCB, zostały uznane za hamują heteromeryczną interakcję alfa-beta i/lub homomeryczną interakcję beta-beta niezależnie od temperatury hodowli, odzwierciedlając ich podstawowy wpływ na montaż. Dwie mutacje A497V i R165Q nie wpływały ani na heteromeryczne, ani na homomeryczne. Pozostałe mutacje (R67S, S106R, G131D, R165W, E168K, i G198D), zlokalizowane w amino-końcowym regionie beta-polipeptydu, skutkowały normalnymi poziomami interakcji tylko wtedy, gdy były wyrażane w niższej temperaturze temperaturze, co sugeruje, że zmiany te można uznać za defekty fałdowania wady fałdowania. Na podstawie tych wyników i objawów klinicznych związanych z z mutacjami opisanymi powyżej, można ustalić kilka korelacji genotyp-fenotyp. można ustalić kilka korelacji genotyp-fenotyp. Ogólnie rzecz biorąc, mutacje wrażliwe na temperaturę są związane z mniej poważnym, choć zmiennym fenotypem. Może to korelować z niedawną hipotezą, że efekt mutacji fałdowania może być może zależeć od zdolności komórkowego mechanizmu kontroli jakości białek, co dostarcza wskazówek do naszego zrozumienia zmienności objawów klinicznych klinicznych obserwowanych wśród pacjentów z tymi mutacjami. --- W tej pracy analizujemy mutacje splicingowe zidentyfikowane u pacjentów z kwasicą propionową w celu wyjaśnienia ich skutków funkcjonalnych i ich udziału w fenotypie choroby. fenotyp choroby. Dwie mutacje w genie PCCA wykryte u homozygotycznych pacjentów pacjentów i obejmujące konsensusowe sekwencje splicingowe (IVS21+3del4 i IVS22-2A>G) wykazano, że wytwarzają one prawidłowe splicingi w komórkach pacjentów, na bardzo niskim poziomie. poziomach, które zostały określone ilościowo metodami PCR w czasie rzeczywistym i które prawdopodobnie są wystarczające do złagodzenia fenotypu. Przeanalizowaliśmy również wpływ mutacji c.653A>G i IVS10-11del6 w genie PCCB obecnym u heterozygotycznych pacjentów z łagodnym fenotypem. pacjentów z łagodnym fenotypem. Mutacja c.653A>G jest zlokalizowana w ostatnim kodonie eksonu 6 i zakłóca prawidłowy montaż spliceosomalny, aktywując w obrębie eksonu 6, co prowadzi do delecji sześciu nukleotydów w ramce (delV217-K). delecji (delV217-K218). Analiza minigenu i hybrydyzacja specyficzna dla sekwencji przy użyciu metod PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że żaden normalnie splicowany transkrypt nie jest wykrywalny w fibroblastach pacjentów. Mutacja IVS10-11del6 powoduje skrócenie odcinka polipirymidyny w miejscu 3'-splicingu eksonu 11, powodując pominięcie eksonu. pominięcie. Część normalnego transkryptu jest wykrywalna przez sondy hybrydyzacyjne specyficzne dla alleli. sond. Analizy te sugerują, że w niektórych przypadkach regulacja splicingu genów może potencjalnie odgrywać ważną rolę w chorobach człowieka, wpływając na parametry fenotypowe. parametry fenotypowe. --- Kwasica propionowa jest zaburzeniem metabolicznym (OMIM 606054) spowodowanym niedoborem karboksylazy propionylo-koenzymu A (CoA), co następnie skutkuje akumulację kwasu propionowego. Pacjenci mogą początkowo wykazywać karmieniem, wymiotami, utratą apetytu, hipotonią i letargiem. Później większość dzieci dzieci będzie wykazywać różne stopnie opóźnienia motorycznego, społecznego i językowego, a nawet poważniejsze problemy medyczne, w tym zaburzenia pracy serca, drgawki, śpiączkę, i prawdopodobnie śmierć. Dwoje rodzeństwa dotkniętego kwasicą propionową poddano badaniu przesiewowemu pod kątem domniemanych mutacji w genach PCCA i PCCB kodujących podjednostki alfa i beta karboksylazy propionylo-koenzymu A (CoA). Obaj pacjenci mieli łagodną i ciężką postać kwasicy propionowej. Badania przy użyciu PCR, long-PCR, porównawczą hybrydyzację genomową (aCGH) i techniki sekwencjonowania wykazały około 73kb delecji rozciągającej się od intronu 16 do intronu 19 i 18bp na dystalnym końcu delecji w genie PCCA. Dotychczasowa delecja jest największą zmianą brutto opisaną w literaturze dla genu PCCA. --- Kwasica propionowa (PA) jest zaburzeniem metabolicznym, które powoduje upośledzenie umysłowe. i może być śmiertelne, jeśli nie jest leczone. PA jest dziedziczona w sposób autosomalny recesywny mutacji w PCCA lub PCCB kodujących podjednostki alfa i beta karboksylazy propionylo-CoA. karboksylazy propionylo-CoA (PCC). Obecne leczenie opiera się na diecie ograniczeniu aminokwasów substratowych, co łagodzi objawy. Jednakże, pacjenci nadal doświadczają epizodów hiperamonemii, które mogą powodować postępujące uszkodzenia uszkodzenia neurologiczne. W niniejszym artykule przetestowaliśmy metody terapii genowej PA w rygorystycznym mysim modelu niedoboru PCCA, w którym homozygotyczne myszy z nokautem rodzą się, ale umierają w ciągu 36 godzin. W tej pracy dostarczyliśmy pierwszą generację i zależne od pomocnika wektory adenowirusowe serotypu 5 (Ad5) wyrażające ludzkie cDNA PCCA przez wstrzyknięcie dootrzewnowe nowonarodzonym myszom. Niezmodyfikowane wektory Ad5 pośredniczyły w rozległej transdukcji otrzewnej ze słabą transdukcją wątroby jak określono na podstawie obrazowania lucyferazy i ekspresji dsRed. W przeciwieństwie do tego, modyfikacja Ad5 za pomocą glikolu polietylenowego oddzieliła wirusa od otrzewnej i skierowała go do transdukcji w wątrobie. Kiedy wektory wektory wyrażające PCCA zostały wstrzyknięte, zaobserwowano znaczny wzrost długości życia zarówno dla niezmodyfikowanych, jak i zmodyfikowanych glikolem polietylenowym (PEG) wektorów Ad5. Jednak ta poprawa była przejściowa. Podobnie, transdukcja adenowirusem serotypu 8 również powodował jedynie przejściowe działanie ratunkowe. Dane te pokazują pierwszy dowód na zasadę terapii genowej PA i wykazują potencjalną użyteczność PEG do modyfikowania tropizmu wirusów w rzeczywistym zastosowaniu terapii genowej. --- Niedobór karboksylazy propionylo-CoA (PCC), dodekameru podjednostek alfa i beta powoduje dziedziczną kwasicę propionową. Zbadaliśmy, na poziomie molekularnym PCC u 54 pacjentów z 48 rodzin składających się z 96 niezależnych alleli. Pacjenci o różnym pochodzeniu etnicznym pochodzili z ośrodków badawczych i szpitali w Niemczech, Austrii i Szwajcarii. szpitali w Niemczech, Austrii i Szwajcarii. Dokładna charakterystyka kliniczna kliniczna tych pacjentów została opisana w towarzyszącym artykule (Grünert et al. 2012). U wszystkich 54 pacjentów, z których wielu pochodziło z rodzin z rodzin spokrewnionych, cały gen PCCB został zbadany przez sekwencjonowanie genomowego DNA. a u 39 osób zbadano również gen PCCA. U trzech pacjentów znaleźliśmy mutacje w obu genach PCC. Ponadto u wielu pacjentów Analiza RT-PCR RNA limfoblastów, testy enzymatyczne limfoblastów i ekspresja nowych mutacji w E.coli. nowych mutacji w E.coli. Zidentyfikowano osiem nowych i osiem wcześniej mutacji zidentyfikowano w genie PCCA, podczas gdy 15 nowych i 13 wcześniej wykrytych mutacji w genie PCCB. Jedna mutacja missense mutacja, p.V288I w genie PCCB, po ekspresji w E.coli dawała 134% aktywności kontrolnej i w konsekwencji została sklasyfikowana jako mutacja typu missense. aktywności kontrolnej i w konsekwencji została sklasyfikowana jako polimorfizm w regionie kodującym. regionie kodującym. Zidentyfikowano liczne nowe polimorfizmy intronowe w obu genach PCC. Badanie to dodaje znaczną ilość nowych danych molekularnych do badań tej choroby. tej choroby. --- Kwasica propionowa jest autosomalnym zaburzeniem recesywnym spowodowanym niedoborem mitochondrialnego enzymu karboksylazy propionylo-CoA (PCC). enzymu mitochondrialnego karboksylazy propionylo-CoA (PCC). PCC składa się z dwóch podjednostek, alfa i beta, kodowanych odpowiednio przez geny PCCA i PCCB. My analizowaliśmy mutacje genu PCCA przy użyciu fibroblastów pacjentów ze zdiagnozowanym niedoborem podjednostki niedobór podjednostki alfa. Za pomocą RT-PCR, cztery z 12 badanych linii komórkowych wykazywały miały większy transkrypt obecny na poziomie porównywalnym z oczekiwanym normalnym gatunkiem. normalnego gatunku. Sekwencjonowanie większego transkryptu ujawniło insercję 84 bp w nt 1209 sekwencji kodującej. Jego włączenie do transkryptu powoduje zakończenie translacji ze względu na obecność dwóch kodonów stop w ramce. Stwierdzono, że insercja 84 stwierdzono, że insercja 84 bp pochodzi z intronu między nt 1209 i 1210. Konsensusowe miejsca dawcy i akceptora splicingu znaleziono odpowiednio na 3'- i 5'-końcu wstawki. wstawki. Wstawkę znaleziono również w pozostałych ośmiu liniach komórkowych liniach komórkowych, a także w normalnych komórkach, ale na znacznie obniżonym poziomie w porównaniu z sekwencją o normalnej długości. normalnej długości sekwencji. Analiza mutacji czterech linii komórkowych wykazujących pozornie podwyższony poziom sekwencji insercyjnej ujawniła jedną nonsensowną mutację mutację nonsensowną (R288X), dwie delecje z przesunięciem ramki (700del5 i 1115del4) i jedną mutację splice mutacja (1671IVS+5G-->C) jako wyrażone allele. Doszliśmy do wniosku, że wspólną cechą czterech linii komórkowych jest to, że zawierają one mutacje destabilizujące mRNA mutacje, które zmniejszają poziom mRNA sekwencji o normalnej długości. W konsekwencji niskie poziomy kryptycznych mRNA stają się wykrywalne na poziomie podobnym do poziomu resztkowego mRNA o normalnej długości. Sugerujemy, że badanie przesiewowe pod kątem zwiększonej proporcji insercji 84 bp przez RT-PCR może być jako szybki test dla mutacji destabilizujących RNA. Nasze wyniki sugerują ostrożność w kojarzeniu takich mutacji z nieprawidłowymi gatunkami mRNA, takimi jak kryptyczne produkty splicingu, które zamiast tego mogą być częścią "szumu tła maszynerii splicingowej. --- Kwasica propionowa (PA, MIM 232000 i 232050) jest spowodowana niedoborem mitochondrialnej zależnej od biotyny karboksylazy propionylo-CoA (PCC, EC 6.4.1.3), heteropolimerycznego enzymu składającego się z podjednostek alfa i beta, kodowanych przez heteropolimerycznego enzymu składającego się z podjednostek alfa i beta, które są kodowane przez geny odpowiednio przez geny PCCA i PCCB. Białko PCCA (podjednostka alfa) jest odpowiedzialne za tworzenie karboksybiotyny po hydrolizie ATP i zawiera zawiera C-końcową domenę wiążącą biotynę i domenę karboksylazy biotyny, zdefiniowaną przez homologię z innymi karboksylazami zależnymi od biotyny, niektóre z nich scharakteryzowane strukturalnie. Stwierdzono ponad 24 mutacje w genie PCCA w genie PCCA u pacjentów z PA, w tym 14 mutacji typu missense i jedną delecję in-frame delecji, których dokładny efekt molekularny nie jest znany. W tym badaniu ustaliliśmy patogenność 11 mutacji PCCA (10 missense i delecja w ramce) poprzez badania ekspresji w niedoborowych fibroblastach i w bezkomórkowym systemie in vitro. i przeanalizowaliśmy wpływ każdej mutacji na aktywność PCC, stabilność białka i strukturę domeny. stabilność białka i strukturę domeny. Wyniki pokazują, że większość zmutowanych białek wykazuje zwiększoną rotację i jest funkcjonalnie wadliwa, sugerując, że zmiany strukturalne, które powodują, są niekompatybilne z w celu wytworzenia stabilnego, funkcjonalnego oligomeru PCC. Wyniki te są w kontekście korelacji genotyp-fenotyp u pacjentów z PA z niedoborem PCCA. Pacjenci z PA z niedoborem PCCA. --- Karboksylaza propionylo-CoA (PCC, EC 6.4.1.3) jest mitochondrialnym enzymem zależnym od biotyny. enzymem, który funkcjonuje w katabolizmie aminokwasów rozgałęzionych, kwasów tłuszczowych kwasów tłuszczowych o nieparzystej długości łańcucha i innych metabolitów. Katalizuje ATP-zależną karboksylację propionylo-CoA do d-metylomalonylo-CoA. PCC jest składa się z dwóch typów podjednostek, prawdopodobnie jako alfa4beta4 lub alfa6beta6, przy czym podjednostka alfa zawiera kowalencyjnie związaną grupę protetyczną biotyny. A genetyczny niedobór aktywności PCC powoduje kwasicę propionową, chorobę potencjalnie potencjalnie śmiertelną chorobę, która w ciężkich przypadkach pojawia się w okresie noworodkowym. U pacjentów pacjenci mogą mieć mutacje genu PCCA lub PCCB. W niniejszym badaniu określiliśmy strukturę ludzkiego genu PCCA, który obecnie jest tylko częściowo reprezentowany w bazach danych, jest tylko częściowo reprezentowany w bazach danych. Na podstawie zgłoszonych EST i potwierdzone przez RT-PCR, przedefiniowaliśmy również kodon inicjacji translacji do pozycji pozycję 75 nukleotydów przed obecnie akceptowanym kodonem inicjacji. My pokazujemy rozkład mutacji, w tym trzech zidentyfikowanych w tym badaniu, i przenumerowujemy wszystkie zgłoszone mutacje, aby liczyły się od nowego kodonu inicjującego. Gen gen obejmuje ponad 360 kb i składa się z 24 eksonów o długości od 37 do 335 pz. długości. Introny mają wielkość od 104 bp do 66 kb. Określiliśmy również określiliśmy sekwencję nukleotydową około 1 kb regionu 5'-flanking przed miejscem inicjacji translacji ATG. Proksymalne 400 bp regionu regionu 5'-flankingowego wykazuje wysoką zawartość G + C (67%) i jest częścią domniemanej 1-kb wyspy CpG, która rozciąga się na ekson 1 i część intronu 1. Domniemany promotor przypuszczalny promotor nie posiada pola TATA, ale zawiera dwa miejsca AP-1 i konserwatywnie zdefiniowane konsensusowe pole GC, to ostatnie charakterystyczne dla rdzenia sekwencji wiążącej czynnika transkrypcyjnego Sp1. --- Kwasica propionowa jest wrodzonym błędem metabolizmu spowodowanym niedoborem karboksylazy propionylo-CoA, heteropolimerycznego enzymu mitochondrialnego zaangażowanego w w katabolizm aminokwasów rozgałęzionych, kwasów tłuszczowych o nieparzystej długości łańcucha. kwasów tłuszczowych, cholesterolu i innych metabolitów. Enzym składa się z podjednostek alfa i beta, które są kodowane odpowiednio przez geny PCCA i PCCB. Mutacje w obu genach mogą powodować kwasicę propionową. Identyfikacja odpowiedzialnego genu odpowiedzialnego genu, przed analizą mutacji, można przeprowadzić przez test komplementacji lub, w niektórych przypadkach, można wywnioskować z osobliwości istotnych dla któregokolwiek z genów, w tym uzyskania prawidłowej aktywności enzymu u rodziców rodziców wielu pacjentów z mutacjami PCCB, obserwując połączony brak podjednostek alfa i beta przez podjednostek alfa i beta metodą Western blot u wielu pacjentów z PCCA, a także konwencjonalny wynik mRNA-minus Northern blot dla genu lub podjednostki beta u pacjentów z PCCB. Mutacje zarówno w genach PCCA, jak i PCCB zostały zidentyfikowane poprzez sekwencjonowanie produktów RT-PCR lub amplifikowanych fragmentów egzonowych, te ostatnie specjalnie dla genu PCCB, dla którego struktura genomowa jest struktura genomu. Do tej pory zgłoszono 24 mutacje w genie PCCA i 29 w genie PCCB. w genie PCCA i 29 w genie PCCB, z których większość to substytucje pojedynczych zasad aminokwasów i różne defekty splicingu. Większą heterogenność obserwuje się obserwuje się w genie PCCA - żadna mutacja nie jest dominująca w badanych populacjach podczas gdy w przypadku genu PCCB ograniczona liczba mutacji jest odpowiedzialna za większość alleli scharakteryzowanych za większość alleli scharakteryzowanych zarówno w populacji kaukaskiej, jak i orientalnej. i orientalnych. Te dwie populacje wykazują różne spektrum mutacji, jedynie z udziałem dinukleotydów CpG, prawdopodobnie jako powtarzające się zdarzenia mutacyjne. mutacyjne. Przyszła analiza zidentyfikowanych mutacji, ich efektu funkcjonalnego i ich znaczenia klinicznego, ujawni potencjalne korelacje genotyp-fenotyp korelacje genotyp-fenotyp dla tego klinicznie heterogennego zaburzenia. --- Kwasica propionowa jest dziedzicznym zaburzeniem metabolizmu kwasów organicznych, które jest spowodowane niedoborem karboksylazy propionylo-CoA (PCC; EC 6.4.1.3). Pacjenci pacjenci należą do dwóch grup komplementacyjnych, pccA i pccBC (podgrupy B, C, i BC), wynikające odpowiednio z niedoboru nieidentycznych podjednostek alfa i beta odpowiednio PCC. Wykryliśmy nietypową insercję/delecję w DNA pacjentów z podgrup pccBC i pccC, która zastępuje 14 nukleotydów w sekwencji kodującej podjednostki sekwencji kodującej podjednostki beta 12 nukleotydami niezwiązanymi z tym regionem genu. regionem genu. Powoduje to eliminację miejsca restrykcyjnego Msp I, a delecję 2 par zasad (bp), przesunięcie ramki i kodon stop w nowej ramce około 100 reszt aminokwasowych proksymalnie do normalnego końca karboksylowego. Wśród 14 niespokrewnionych pacjentów rasy kaukaskiej w grupie komplementarnej pccBC, ta unikalna mutacja unikalną mutację znaleziono w 8 z 28 badanych zmutowanych alleli. Mutant specyficzna dla alleli hybrydyzacja oligonukleotydów do amplifikowanych genomowych DNA ujawniła że wstawione 12 nukleotydów nie pochodzi z około 1000-bp wokół mutacji. W trakcie naszych badań zidentyfikowaliśmy inną mutację w tym samym eksonie: delecję 3-bp w ramce, która eliminuje jeden z dwóch kodonów izoleucyny z dwóch kodonów izoleucyny bezpośrednio poprzedzających miejsce Msp I. Dwóch niespokrewnionych pacjentów było heterozygotami złożonymi dla tej delecji pojedynczego kodonu i dla insercji/delecji opisanej powyżej. Doszliśmy do wniosku, że istnieje skłonność genu podjednostki beta PCC do ulegania tego rodzaju mutacjom w tym miejscu w tej pozycji lub, co bardziej prawdopodobne, mutacje u wszystkich pacjentów rasy kaukaskiej mają wspólne pochodzenie w poprzednich pokoleniach. --- Kwasica propionowa jest wrodzonym błędem metabolizmu wynikającym z niedoboru aktywności karboksylazy propionylo-CoA. aktywności karboksylazy propionylo-CoA. Podjednostki alfa i beta enzymu są kodowane odpowiednio przez geny PCCA i PCCB. są kodowane odpowiednio przez geny PCCA i PCCB. Używając bezpośredniego sekwencjonowanie i testy restrykcyjne amplifikowanych odwrotnych transkryptów i genomowego DNA DNA, zidentyfikowaliśmy dwie mutacje genu PCCB u pacjenta z kwasicą propionową z podgrupy komplementacyjnej pccC (gen PCCB zawiera główną grupę komplementacyjną pccBC i podgrupę pccC). grupę komplementacyjną pccBC oraz podgrupy pccB i pccC). Jeden z alleli zawiera delecję inframe 3-bp odziedziczoną po ojcu, która skutkuje delecją reszty izoleucyny w podjednostce beta enzymu. enzymu. Drugi zmutowany allel, odziedziczony po matce, ma delecję 14-bp i dodanie 12 bp nowej sekwencji w tym samym miejscu, co allel ojca. ojca. Wstawiona sekwencja jest częściową duplikacją sekwencji tuż przed miejscem mutacji. Wynik netto tej mutacji generuje przesunięcie ramki i kodon stop. Badanie mRNA fibroblastów od pacjenta pacjenta wykazało, że składa się on zasadniczo z sekwencji ojca, co czyni go skutecznie jedynym wyrażonym allelem dla białka beta. Badanie dodatkowych linii komórkowych pacjentów ujawniło rearanżację insercji/delecji w trzech dodatkowych pacjentów, dwóch z grupy pccBC i jednego niesklasyfikowanego. Allel delecji Allel delecji 3-bp był unikalny dla probanda. Identyfikacja dwóch różnych alleli występujących w tym samym miejscu w genie PCCB podkreśla znaczenie tego miejsca dla funkcji lub integralności enzymu.
Jakie jest genetyczne podłoże kwasicy propionowej?
Mutacje w genach PCCA lub PCCB, kodujących obie podjednostki karboksylazy propionylo-CoA.