TŁO: Nieinwazyjne metody oceny genomu płodu podczas ciąży zapewnią nowe możliwości oferowania kobietom w ciąży bardziej kompleksowej bardziej kompleksową diagnostykę genetyczną ich płodu. Celem tego badania było określenie obecności i częstości występowania komórek płodowych w próbkach śluzu przezszyjkowego (TCC) śluzu od kobiet w ciąży i określenie ich przydatności do wczesnej diagnostyki prenatalnej. diagnostyki prenatalnej. METODY: Syncytiotrofoblasty w aspirowanych próbkach śluzu TCC zostały zidentyfikowane przez za pomocą immunobarwienia przeciwciałem NDOG1 swoistym dla płodu. Analizę genetyczną komórek płodowych przeprowadzono za pomocą mikrodysekcji laserowej i ilościowego fluorescencyjną PCR (QF-PCR). WYNIKI: W 116 z 207 (56%) próbek TCC wykryto liczne syncytiotrofoblasty. syncytiotrofoblastów. Jednakże, gdy próbki TCC zostały podzielone na warstwy pod względem obecności fragmentów kosmówki, syncytiotrofoblasty zidentyfikowano w 85 ze 109 (78%) próbek. (78%) próbek. Znaczącą liczbę syncytiotrofoblastów stwierdzono w próbkach TCC pobranych między 6 a 9 tygodniem ciąży (średnia 741, zakres 25-2884). Analiza QF-PCR pozytywnych syncytiotrofoblastów NDOG1 i pasującego matczynego DNA potwierdziła ich płodowe pochodzenie, a prawidłowe oznaczenie płci komórek płodowych uzyskano w 97% próbek TCC. próbek TCC. Jedna niezgodna diagnoza płci była związana z ciążą bliźniaczą dichorioniczną ciążą bliźniaczą wynikającą z implantacji żeńskiego zarodka T21 zarodka żeńskiego T21 i normalnego zarodka męskiego, gdzie płód żeński T21 obumarł w 6 tygodniu ciąży. 6 tygodniu ciąży i zanikał. WNIOSKI: Syncytiotrofoblasty mogą być z powodzeniem izolowane z próbek TCC i stanowią odpowiednie źródło komórek do analizy genetycznej płodu we wczesnej ciąży. płodu we wczesnej ciąży. Badanie podkreśla znikającego bliźniaka jako potencjalną przyczynę potencjalną przyczyną niezgodnych wyników nieinwazyjnych badań prenatalnych. --- Wstęp: Uzyskanie płodowego DNA lub RNA poprzez pobranie próbki kosmówki (CVS) lub amniopunkcję lub amniopunkcji jest obecnie złotym standardem diagnostyki prenatalnej. Jednakże, te inwazyjne procedury niosą ze sobą ryzyko poronienia. Niezawodna metoda dla nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej (NIPD) od dawna poszukiwano w celu zmniejszenia ryzyka poronienia. poronienia. METODY: Bezkomórkowy płodowy RNA został wyekstrahowany z osocza krwi obwodowej od 121 kobiet w 9-20 tygodniu ciąży. Pięć polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) w genie PLAC4 analizowano metodą multipleksową z odwrotną transkryptazą amplifikację sondy zależną od ligacji (RT-MLPA), a następnie elektroforezę kapilarną. elektroforezę kapilarną. Analiza kariotypu została wykorzystana do potwierdzenia prenatalnej prenatalnej trisomii 21. WYNIKI: Spośród 121 próbek, u 23 zdiagnozowano trisomię 21, u 87 stwierdzono prawidłową ploidią, dziewięć miało wszystkie pięć homozygotycznych loci SNP, a dwie miały jeden heterozygotyczny locus SNP. locus. W porównaniu z analizą kariotypu, czułość i swoistość diagnostyczna czułość diagnostyczna i swoistość RT-MLPA wynosiły odpowiednio 92% i 100%. WNIOSKI: RT-MLPA jest wygodną i niezawodną metodą diagnozowania trisomii 21. trisomii 21. Wykazaliśmy, że metoda ta ma dobrą swoistość, wysoką czułość i wysoką przepustowość, dzięki czemu technika ta ma zastosowanie do NIPD w praktyce klinicznej. praktyce klinicznej. --- WPROWADZENIE: Nieinwazyjna diagnostyka prenatalna (NIPD) zespołu Downa szybko się rozwija. szybko się rozwija. Obecnie dwie aplikacje do NIPD zespołu Downa zostały z potencjałem i wykazały pozytywne wyniki; NIPD przy użyciu technologii sekwencjonowania z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nowej generacji oraz NIPD z wykorzystaniem immunoprecypitacji metylowanego DNA (MeDIP) ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR). (qPCR). OBSZARY OBJĘTE: Podejście qPCR w czasie rzeczywistym MeDIP opiera się na identyfikacji różnicowo metylowanych regionów (DMR) i ich wykorzystaniu do rozróżniania przypadków od przypadków zespołu Downa. DMR zostały zidentyfikowane przy użyciu o wysokiej rozdzielczości. Podgrupa DMR została wybrana do dalszych badań. Poprzez równanie dyskryminacyjne, które łączy wyniki uzyskane z różnych DMR. różnych DMR, prawidłowe i nieprawidłowe przypadki zostały poprawnie sklasyfikowane ze wskazaniem 100% czułość i swoistość. OPINIA EKSPERTA: Poprzednie badania również zidentyfikowały DMR między krwią nieciężarnej kobiety a DNA łożyska. kobiecą krwią i DNA łożyska. Jednak metody te były związane z szeregiem ograniczeń, w tym niską czułością i/lub swoistością testów, ograniczoną liczbą zidentyfikowanych testów, ograniczoną liczbą zidentyfikowanych DMR lub miejsc wrażliwych na metylację i SNP zlokalizowanych na DMRs. Ograniczenia te zostały przezwyciężone dzięki opracowaniu metodologii MeDIP opartej na qPCR w czasie rzeczywistym. --- CELE: Wykorzystanie proteomiki do identyfikacji i scharakteryzowania białek w surowicy matki surowicy od pacjentów z wysokim ryzykiem trisomii płodu 21, trisomii 18 i trisomii 13 na podstawie potrójnych testów ultrasonograficznych i surowicy matki. METODY: Przeprowadziliśmy kompleksową analizę proteomiczną na 23 przypadkach trisomii i 85 prawidłowych przypadków we wczesnym drugim trymestrze ciąży. Białko profilowanie wraz z konwencjonalnym żelem poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu elektroforezy / tandemowej spektrometrii mas przeprowadzono w celu scharakteryzować białka związane z każdym stanem trisomii, a następnie zweryfikowane przy użyciu Western blot. WYNIKI: Podejście do profilowania białek przy użyciu powierzchniowo wzmocnionego lasera desorpcji powierzchniowej/jonizacji czasu przelotu masy (SELDI-TOF/MS) zaowocowało w identyfikacji 37 unikalnych hydrofobowych cech proteomicznych dla trzech trisomii. Przy użyciu żelu poliakryloamidowego siarczanu dodecylu sodu elektroforezę, a następnie jonizację z desorpcją laserową wspomaganą matrycą lotu/Time of Flight (MALDI-TOF/TOF) i western blot, białka glikoproteinowe, takie jak takie jak alfa-1-antytrypsyna, apolipoproteina E, apolipoproteina H i białko nośnikowe surowicy transtyretyna zostały zidentyfikowane jako potencjalne markery surowicy matki dla trisomii płodu. Zidentyfikowane białka wykazywały zróżnicowaną ekspresję na poziomie podjednostek. WNIOSKI: Profilowanie białek surowicy matki przy użyciu proteomiki może umożliwić nieinwazyjne testy diagnostyczne dla najczęstszych trisomii i może uzupełniać metody oparte na ultradźwiękach w celu dokładniejszego określenia ciąż z aneuploidiami płodu. płodu. --- Zarówno nienaruszone komórki płodu, jak i bezkomórkowe DNA płodu są obecne w krążeniu matki. w krążeniu matki i można je odzyskać do nieinwazyjnej prenatalnej diagnostyki genetycznej. genetycznej. Chociaż metody wzbogacania i izolacji rzadkich nienaruszonych komórek płodu płodu stanowią wyzwanie, diagnostyka aneuploidii chromosomalnej płodu, w tym trisomii 21 w ciążach w pierwszym i drugim trymestrze ciąży osiągnięto wskaźnik wykrywalności na poziomie 50-75% wykrywalności. Podobnie, bezkomórkowe DNA płodu może być niezawodnie odzyskane z osocza matki i oceniane za pomocą ilościowej reakcji PCR w celu wykrycia trisomii płodu 21 i ojcowskich mutacji pojedynczych genów. Testy PCR w czasie rzeczywistym są niezawodne w wykrywania niskich stężeń płodowego DNA, z czułością ok. 95-100% i swoistością bliską 100%. Porównanie nienaruszonych komórek płodowych z bezkomórkowymi metodami DNA płodu do nieinwazyjnych prenatalnych badań przesiewowych w kierunku chromosomalnej aneuploidii płodu aneuploidii płodu pokazuje, że ta ostatnia jest co najmniej czterokrotnie bardziej czuła. Te wstępne wyniki nie potwierdzają związku między częstotliwością nienaruszonych komórek komórek płodu a stężeniem wolnego od komórek DNA płodu. Powyższe wyniki sugerują że stężenie płodowego DNA w osoczu matki może nie zależeć od krążących nienaruszonych komórek płodowych, ale raczej jest produktem wzrostu i obrotu komórkowego podczas obrotu komórkowego podczas rozwoju embrionalnego lub płodowego. --- CEL: Zbadanie, czy kobiety w ciąży chciałyby być informowane, jeśli podczas nieinwazyjnego podejrzewano nieprawidłowości chromosomalne płci (SCA) w nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej (NIFTY). prenatalnej diagnostyki płodowego zespołu Downa (test NIFTY). METODY: Dwieście jeden pacjentek w ciąży pojedynczej poproszono o wykonanie testu NIFTY. o wykonanie testu NIFTY zostało poproszonych o podanie swoich preferencji, jeśli istniało podejrzenie podejrzenie SCA w teście NIFTY. WYNIKI: Ponad 93,5% pacjentek pochodziło z Chin, a ich średni wiek wynosił 36 lat. Wcześniejsze badania przesiewowe był pozytywny u 66 (32,8%). Ponad 50% badanych uważało, że SCA jest niepełnosprawność w porównaniu z zespołem Downa, a tylko 5,2% uznało SCA za gorszy. uznało SCA za gorsze. Jednak większość badanych (198, 98,5%) wskazała, że chciała być informowana o podejrzeniu SCA. Spośród nich 34,8% wykonałoby amniopunkcję w celu potwierdzenia, podczas gdy 57,1% nie było pewnych, wskazując na możliwość zaakceptowania tych warunków. możliwość zaakceptowania tych warunków. WNIOSEK: Oprócz badań przesiewowych w kierunku zespołu Downa metodą NIFTY, większość kobiet w ciąży chciałaby być również informowana o podejrzeniu SCA. Osoby z dodatnim wynikiem badania przesiewowego powinny być konsultowane przez osoby z doświadczeniem w genetyce, aby uniknąć niepotrzebnego przerwania ciąży. niepotrzebnego przerywania ciąży. --- W tym badaniu zbadano różnicę metylacji w AIRE i RASSF1A między matczynym i łożyskowym DNA DNA matczynym i łożyskowym oraz wpływ tej różnicy na identyfikacji wolnego płodowego DNA w osoczu matki oraz w diagnostyce prenatalnej trisomii 21. Próbki osocza matki pobrano z 388 ciąż pojedynczych ciąż pojedynczych, a tkanki łożyska lub kosmówki od 112 z nich. PCR specyficzny dla metylacji (MSP) i wrażliwy na metylację enzym restrykcyjny trawienie, a następnie fluorescencyjny ilościowy PCR (MSRE + PCR) zostały zastosowane do wykryć różnicę metylacji między matką a płodem w AIRE i RASSF1A. Diagnoza trisomii 21 ustalono na podstawie stosunku AIRE specyficznego dla płodu do RASSF1A w osoczu matki. Obie metody potwierdziły, że AIRE i RASSF1A były hipometylowane w komórkach krwi matki, ale hipermetylowane w tkankach łożyska lub kosmówki. tkankach kosmówki. Co więcej, zróżnicowana metylacja dla każdego locus można było zaobserwować przez cały okres ciąży. Dodatnie wskaźniki płodowego AIRE i RASSF1A w osoczu matki wyniosły 78,1% i 82,1% w przypadku MSP oraz 94,8% i 96,9% przez MSRE + PCR. MSRE + PCR był lepszy od MSP w identyfikacji hipermetylowanych sekwencji specyficznych dla płodu (P<0,05). Na podstawie danych z 266 euploidalnych ciąż, 95% przedział referencyjny płodowego stosunku AIRE/RASSF1A w osoczu matki wynosił 0,33-1,77, co zostało przyjęte jako wartość referencyjna dla określania liczby płodowych chromosomów 21 w 102 ciążach. Dokładność w 98 ciążach z euploidią wyniosła 96,9% (95/98). Trzy z czterech ciąż z trisomią 21 zostały potwierdzone tą metodą. Stwierdzono, że hipermetylowane AIRE i RASSF1A mogą służyć jako markery specyficzne dla płodu do identyfikacji płodowego DNA w osoczu matki i mogą być stosowane do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej trisomii 21. --- Niniejszy raport opisuje pierwszą identyfikację i charakterystykę trzech sekwencji DNA specyficznych dla chromosomu 21 sekwencji DNA (i sekwencji referencyjnych z innych chromosomów), które są różnie metylowane między krwią obwodową a tkanką łożyskową. a tkanką łożyskową, w celu zapewnienia epigenetycznych biomarkerów do kwantyfikacji wolnego od komórek płodowego DNA w osoczu matki. Aby wybrać sekwencje do pod kątem zróżnicowanej metylacji, przyjęto trzy strategie: (i) (i) badanie promotorów genów o wysoce zróżnicowanej ekspresji; (ii) wybór (ii) wybór "losowych" regionów promotorowych; oraz (iii) wybór "losowych" regionów niepromotorowych. Ponad 200 wstępnie wybranych sekwencji DNA zostało przebadanych przy użyciu specyficznego dla metylacji enzymu restrykcyjnego. Różnicowo metylowane sekwencje zlokalizowane w 21q22.3 (geny AIRE, SIM2 i ERG), 1q32.1 (gen CD48 i gen FAIM3), 2p14 (gen ARHGAP25 ) i 12q24 (gen SELPLG). Konwersja bisulfitowa potwierdziła że miejsca CpG w regionie promotora AIRE są wysoce zróżnicowane metylowane, a zoptymalizowane startery specyficzne dla metylacji dla tego regionu, które są wysoce specyficzne dla łożyskowego DNA. Następnie wykazano, że status metylacji status metylacji próbki DNA kosmówki z pierwszego trymestru ciąży ciąży odpowiadał hipermetylowanemu stanowi łożyska terminowego. Tak więc nie ma różnicy w stanie metylacji między wczesną a terminową ciążą dla badanych sekwencji. ciążą dla badanych sekwencji. Zidentyfikowane sekwencje stanowią kandydujące biomarkery do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej zespołu Downa.
Która metoda nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej zespołu Downa jest najbardziej akceptowana?
Obecnie opracowano dwie aplikacje do NIPD zespołu Downa z potencjałem i wykazano pozytywne wyniki; NIPD z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nowej generacji oraz NIPD z wykorzystaniem metylowanej immunoprecypitacji DNA (MeDIP) w czasie rzeczywistym ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). W niniejszym badaniu zbadano różnicę w metylacji AIRE i RASSF1A między DNA matki i łożyska oraz znaczenie tej różnicy w identyfikacji wolnego płodowego DNA w osoczu matki i w diagnostyce prenatalnej trisomii 21. Diagnozę trisomii 21 ustalono na podstawie stosunku AIRE specyficznego dla płodu do RASSF1A w osoczu matki. Obie metody potwierdziły, że AIRE i RASSF1A były hipometylowane w komórkach krwi matki, ale hipermetylowane w tkankach łożyska lub kosmówki. Stwierdzono, że hipermetylowane AIRE i RASSF1A mogą służyć jako markery specyficzne dla płodu do identyfikacji płodowego DNA w osoczu matki i mogą być wykorzystywane do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej trisomii 21.