Interferony (IFN) są cytokinami o silnych właściwościach immunomodulacyjnych i przeciwwirusowych. właściwościach, ale mniej wiadomo o tym, w jaki sposób indukują one śmierć komórek. Tutaj pokazujemy że zarówno IFN typu I (α/β), jak i typu II (γ) indukują gwałtowną śmierć komórek. białko oddziałujące z receptorem (RIP) 1 / RIP3 za pośrednictwem kinazy martwicy, gdy białko adaptorowe Fas-associated death domain (FADD) jest utracone lub wyłączone przez fosforylację lub gdy kaspazy (np. kaspaza 8) są inaktywowane. Indukowana przez IFN nekroza przebiega poprzez stopniowe tworzenie kompleksu "nekrosomu" RIP1-RIP3 który wymaga transkrypcji zależnej od Jak1/STAT1, ale nie wymaga aktywności kinazy RIP1. aktywność kinazy RIP1. Zamiast tego IFN aktywują transkrypcyjnie kinazę białkową PKR reagującą na RNA. kinazę białkową PKR, która następnie wchodzi w interakcję z RIP1, aby zainicjować tworzenie nekrosomu i wywołują nekrozę. Chociaż IFN są silnymi aktywatorami nekrozy, gdy FADD jest nieobecny, cytokiny te prawdopodobnie nie są dominującymi induktorami śmiertelności embrionalnej wywołanej przez kinazę RIP u myszy z niedoborem FADD. My również fosforylację seryny 191 jako mechanizm, który wyłącza FADD i współpracuje z inaktywacją kaspaz, umożliwiając martwicę aktywowaną przez IFN. Łącznie, odkrycia te nakreślają mechanizm indukowanej przez IFN RIP zależnej od kinazy RIP i identyfikują FADD i kaspazy jako negatywne regulatory tego procesu. regulatory tego procesu. --- Białko oddziałujące z receptorem 3 (RIP3) jest kinazą białkową niezbędną do nekroptozy indukowanej przez TNF. Fosforylacja na Ser-227 w ludzkim RIP3 (hRIP3) jest wymagana do jego interakcji z ludzką domeną kinazową o mieszanej linii (MLKL) w nekrosomie, kompleksie sygnalizacyjnym indukowanym przez stymulację TNF. RIP1 i RIP3 pośredniczą w agregacji nekrosomów, prowadząc do tworzenia amyloidopodobnych kompleksów sygnalizacyjnych amyloidu. Stwierdziliśmy, że TNF indukuje fosforylację Thr-231 i Ser-232 w RIP3 (mRIP3) i ta fosforylacja jest wymagana do interakcji mRIP3 z mMLKL. z mMLKL. Ser-232 w mRIP3 odpowiada Ser-227 w hRIP3, podczas gdy Thr-231 nie jest konserwowany w hRIP3. nie jest konserwowany w hRIP3. Chociaż interakcja RIP3-MLKL jest wymagana dla nekroptozy zarówno w komórkach ludzkich, jak i mysich, hRIP3 nie oddziałuje z mMLKL a mRIP3 nie może wiązać się z hMLKL. Specyficzność gatunkowa interakcji RIP3-MLKL jest przede wszystkim determinowana przez różnice w sekwencji miejsc miejscach fosforylacji i sekwencji flankującej wokół miejsc fosforylacji w hRIP3 i mRIP3. Wydaje się, że interakcja RIP3-MLKL została wybrana jako ewolucyjnie konserwowany mechanizm pośredniczący w sygnalizacji nekroptozy pomimo tego, że różne strukturalne i mechanistyczne podstawy tej interakcji pojawiły się jednocześnie u różnych organizmów. Ponadto wykazaliśmy, że że interakcja RIP3 z MLKL zapobiegała masywnej nieprawidłowej agregacji RIP3 a zatem powinna być kluczowa dla tworzenia amyloidowego kompleksu sygnalizacyjnego nekrosomów. nekrosomów. Stwierdziliśmy również, że interakcja między RIP3 i MLKL jest wymagana do translokacji nekrosomów do błon związanych z mitochondriami. Nasze dane pokazują znaczenie interakcji RIP3-MLKL w tworzeniu funkcjonalnych nekrosomów i sugerują, że translokacja nekrosomów do błon związanych z mitochondriami jest niezbędna dla sygnalizacji nekroptozy. dla sygnalizacji nekroptozy. --- Kinazy RIP1 i RIP3 są głównymi graczami w programowanej martwicy indukowanej przez TNF. Tutaj donosimy, że homotypowe motywy interakcji RIP (RHIM) RIP1 i RIP3 pośredniczą w tworzeniu heterodimerycznych struktur filamentowych. Włókna wykazują klasyczne cechy β-amyloidów, jak wykazano przez wiązanie tioflawiny T (ThT) i wiązanie czerwieni Kongo (CR), dichroizm kołowy, spektroskopia w podczerwieni, dyfrakcja rentgenowska dyfrakcja i NMR w stanie stałym. Strukturalne rdzenie amyloidowe są mapowane w RIP1 i RIP3, które są otoczone regionami mobilności. Endogenny kompleks RIP1/RIP3 wyizolowany z komórek nekrotycznych wiąże ThT, jest ultrastabilny i ma strukturę rdzenia fibrylarnego. fibrylarną strukturę rdzenia, podczas gdy nekroza jest częściowo hamowana przez ThT, CR, i inny barwnik amyloidowy, HBX. Mutacje w RHIM RIP1 i RIP3, które są wadliwe w tworzeniu klastrów, aktywacji kinazy i programowanej martwicy in vivo, i zaprogramowaną martwicę in vivo. Obecne badanie zapewnia wgląd w zmiany strukturalne, które zachodzą, gdy kinazy RIP są uruchamiane w celu wykonania różne wyniki sygnalizacyjne i rozszerza sferę amyloidów na tworzenie kompleksów i sygnalizację. tworzenia kompleksów i sygnalizacji. --- Martwica, forma śmierci charakteryzująca się pęknięciem błony komórkowej, jest ściśle powiązana ze stanem jest ściśle powiązana ze stanem zapalnym. Składniki komórkowe uwalniane podczas nekrotycznej śmierci mogą wywołać stan zapalny. I odwrotnie, stan zapalny często prowadzi do uszkodzenie tkanki, a w konsekwencji śmierć komórki. Co występuje pierwsze - martwica czy zapalenie - w określonych sytuacjach in vivo jest obecnie trudne do określenia. A wyjście z tej zagadki "kury i jajka" można znaleźć poprzez niedawne odkrycie że zarówno nekrotyczna śmierć komórki, jak i stan zapalny mogą być inicjowane przez odrębny zestaw białek sygnałowych, "nekrosom", który obejmuje białko oddziałujące z receptorem białko (RIP)1, RIP3 i kaspaza-8. Dalsze wyjaśnienie funkcji tych białek sygnalizacyjnych powinno umożliwić ustalenie, kiedy indukują one zapalenie bezpośrednio, a kiedy stan zapalny bezpośrednio, a kiedy stan zapalny jest spowodowany nekrotyczną śmiercią komórek. --- Glejak wielopostaciowy to najczęstszy i najbardziej śmiertelny nowotwór mózgu pochodzenia pochodzenia astrocytarnego. Są one oporne na wszystkie obecnie stosowane terapie i są związane z wysokim odsetkiem nawrotów. Wcześniej wykazano, że glejaki na terapię fotodynamiczną opartą na kwasie 5-aminolewulinowym (5-ALA), głównie poprzez aktywację (PDT), głównie poprzez aktywację nekrotycznego typu śmierci komórek. Białko białko oddziałujące z receptorem 3 (RIP3) zostało niedawno opisane jako kluczowy mediator tej niezależnej od kaspaz formy zaprogramowanej śmierci komórki. W W niniejszym badaniu przeanalizowaliśmy mechanizm nekrotyczny indukowany przez 5-ALA-PDT w ludzkich komórkach glejaka glioblastoma i zbadaliśmy rolę RIP3 w tym kontekście. Nasze wyniki pokazują, że nekroza indukowana PDT jest zależna od RIP3, który tworzy agregaty i kolokalizuje się z RIP1 po fotouczuleniu. Wykazaliśmy, że PDT jest przyczyną zależnej od RIP3 aktywacji szlaku nekrotycznego. aktywacji szlaku nekrotycznego. Udowodniliśmy również, że PDT indukuje powstawanie nekrotycznego kompleksu zawierającego RIP3 i RIP1, ale pozbawionego kaspazy-8 i FADD, dwóch białek zwykle wchodzących w skład nekrosomu, gdy TNF-α jest stosowany jako bodziec. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że PDT może prowadzić do tworzenia innego nekrosomu, którego składniki, oprócz RIP1 i RIP3, są nadal nieznane. W większości przypadków W większości przypadków glejak charakteryzuje się konstytutywną aktywacją NF-κB. Czynnik ten jest kluczowym regulatorem różnych procesów, takich jak zapalenie, odpowiedź immunologiczna, wzrost komórek czy apoptoza. Wykazano, że jego zahamowanie dodatkowo uwrażliwia komórki glejaka na martwicę indukowaną PDT, jednak nie wykazano różnicy w RIP3 lub agregacji można było zaobserwować, gdy NF-κB był hamowany. --- Komórkowe inhibitory białek apoptozy (cIAP) stały się ważnymi mediatorami mediatorów śmierci komórkowej, szczególnie w nowotworach. Chociaż wiadomo, że są one wyrażane w tkance odpornościowej, ich specyficzna funkcja immunologiczna pozostaje niejasna. Zaobserwowaliśmy zaobserwowaliśmy, że degradacja cIAPs za pomocą mimetyku SMAC (SM) powoduje śmierć pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego. Śmierć makrofagów indukowana przez SM następowała poprzez zaprogramowaną nekrozę (nekroptozę), która była zależna od ekspresji receptora TNF ekspresji receptora. Zgodnie z nekroptozą, indukowana przez SM śmierć makrofagów makrofagów została zniesiona przez zahamowanie białka oddziałującego z receptorem 1 (Rip1) (Rip1) lub przez knockdown białka oddziałującego z receptorem 3 (Rip3). Nekroptoza indukowana przez SM była również zależna od hamowania apoptozy indukowanej przez SM z powodu ekspresji endogennego inhibitora kaspaz, xIAP. Stwierdziliśmy, że cIAP ograniczają ekspresję Rip3, a w mniejszym stopniu Rip1, poprzez mechanizmy potranskrypcyjne, prowadzące do zahamowania kompleksu śmierci Rip1-Rip3 (nekrosom). Zmniejszona aktywność cIAP in vivo, poprzez leczenie SM lub specyficzny nokaut któregokolwiek z cIAP, skutkował podwyższoną śmiercią komórek makrofagów i upośledzoną kontrolę wewnątrzkomórkowej bakterii Listeria monocytogenes. Te wyniki pokazują, że cIAP odgrywają ważną rolę w ograniczaniu zaprogramowanej martwicy makrofagów, co ułatwia skuteczną kontrolę patogenu. --- Zaprogramowana nekroza lub nekroptoza jest kontrolowana przez działanie dwóch kinaz kinaz serynowo-treoninowych, RIP1 (receptor-interacting serine/threonine protein kinaza 1; znana również jako RIPK1) i RIP3. Fosforylacja RIP1 i RIP3 jest krytyczna dla montażu nekrosomu, kompleksu podobnego do amyloidu, który inicjuje transmisję sygnału pro-nekrotycznego. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, aby systematycznie badać wpływ domniemanych miejsc miejsc fosfoakceptorowych na RIP1 i RIP3 na indukowaną przez TNF (czynnik martwicy nowotworów) zaprogramowaną martwicę. Stwierdziliśmy, że mutacja poszczególnych reszt serynowych w domenie kinazowej RIP1 miała niewielki wpływ na aktywność kinazy RIP1 i indukowaną przez TNF zaprogramowaną martwicę. Co zaskakujące, substytucja reszty alaninowej na Ser(89) zwiększała aktywność kinazy RIP1 i programowaną martwicę indukowaną przez TNF bez wpływając na tworzenie nekrosomów RIP1-RIP3. Wskazuje to, że Ser(89) jest hamującym miejscem fosfoakceptorowym, które może tłumić pro-nekrotyczną funkcję RIP1. Ponadto wykazaliśmy, że fosfomimetyczny mutant RIP3, S204D, prowadził do zaprogramowana martwica, która była oporna na siRNA RIP1 i niewrażliwa na nekrostatynę-1. Nasze wyniki pokazują, że programowana martwica jest regulowana przez pozytywne i hamujące zdarzenia fosforylacji. --- Czynnik martwicy nowotworów (TNF) jest ważną cytokiną zapalną i indukuje wiele odpowiedzi komórkowych, w tym zapalenie, proliferację komórek, apoptozę i martwicę. Wiadomo, że kinazy białkowe oddziałujące z receptorami (RIP), RIP1 i RIP3, są kluczowymi efektorami martwicy indukowanej przez TNF, ale niewiele wiadomo na temat w jaki sposób te dwie kinazy RIP pośredniczą w tym procesie, chociaż reaktywne formy tlenu (ROS) i aktywacja JNK zostały zasugerowane jako dwa kolejne zdarzenia kinaz RIP. zdarzenia kinaz RIP. Tutaj donosimy o identyfikacji mieszanej kinazy liniowej MLKL, jako kluczowego składnika RIP3 w procesie nekrozy indukowanej przez TNF. Poprzez badanie przesiewowe biblioteki kinaz/fosfataz shRNA w ludzkim gruczolakoraku okrężnicy gruczolakoraka jelita grubego HT-29, odkryliśmy, że knockdown MLKL blokuje martwicę indukowaną przez TNF-a. martwicę. Nasze dane sugerują, że MLKL funkcjonuje za RIP1 i RIP3 oraz jest rekrutowany do nekrosomu poprzez interakcję z RIP3. Wreszcie odkryliśmy, że MLKL jest wymagany do generowania ROS i późnej fazy aktywacji JNK podczas nekrozy indukowanej TNF. Jednakże, ponieważ te dwa zdarzenia nie są zaangażowane w martwicę indukowaną TNF w komórkach HT-29, celem MLKL podczas martwicy indukowanej TNF pozostaje nieuchwytny. Podsumowując, nasze badanie sugeruje że MLKL jest kluczowym składnikiem RIP3 w procesie nekrotycznej śmierci komórek indukowanej przez TNF.
Czy RIP1 (RIP-1) jest częścią nekrosomu?
Tak, RIP1 jest częścią nekrosomu.