Nowe podejście eksperymentalne zostało zaprojektowane w celu przetestowania różnych przewidywań aktualnych modeli architektury jądrowej w odniesieniu do topografii transkrypcji. Skonstruowaliśmy plazmid, nazwany pIndi, który niesie gen reporterowy kodujący czerwone cytoplazmatyczne fluorescencyjne białko reporterowe. Transkrypcja jest regulowana przez indukowalny promotor ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). wirusa niedoboru odporności (HIV) i jest silnie zależna od białka HIV-1 Tat. Ekspresja czerwonego fluorescencyjnego białka reporterowego pozwoliła nam rozróżnić między komórkami z aktywnymi i niemymi genami reporterowymi. Co ważne, przejściowa transfekcja powodowała grupowanie plazmidów, tworząc jeden lub kilka pozachromosomalnych ciał pIndi. Powtarzające się sekwencje operatora lac w pIndi pozwoliły nam na wizualizację tych ciał w żywych komórkach poprzez wiązanie białek LacI znakowanych białkiem fluorescencyjnym. Korzystając z tego modelu, przeanalizowaliśmy trójwymiarową topografię jądrową ciał pIndi z aktywnymi lub cichymi genami reporterowymi. Nasze wyniki są zgodne z przewidywaniami chromosomu modelu przedziału chromosom-interchromatyna (CT-IC). Wykazaliśmy, że ciała pIndi lokalizują się w IC, zarówno w stanie cichym, jak i aktywnym. Aktywacja transkrypcji transkrypcji transgenu skutkowała rekrutacją polimerazy RNA II i NFkappaB i bliższe pozycjonowanie do plamek splicingowych. --- Regulacja ekspresji genów obejmuje elementy sekwencji w kwasach nukleinowych. W promotorach wiele elementów sekwencyjnych współpracuje jako moduły funkcjonalne, które w połączeniu w połączeniu określają ogólną aktywność promotora. Wcześniej opracowaliśmy narzędzia obliczeniowe oparte na tej hierarchicznej strukturze do analizy in silico promotorów. in silico. Tutaj zajmujemy się funkcjonalną organizacją potranskrypcyjnych elementów kontrolnych wykorzystując genom HIV-1 jako model. Liczne badania mutagenezy mutagenezy pokazują, że ekspresja białek strukturalnych HIV jest ograniczona przez sekwencje hamujące (INS) w mRNA HIV pod nieobecność białka HIV-1 Rev. Jednak wcześniejsze próby wykrycia zachowanych wzorców sekwencji HIV-1 INS zakończyły się niepowodzeniem. Zdefiniowaliśmy cztery różne wzory sekwencji dla motywów hamujących (macierze wagowe), które zidentyfikowały 22 z 25 znanych INS, jak również kilka nowych kandydujących regionów INS zawartych w licznych szczepach HIV-1. Zachowanie Zachowanie motywów INS w genomie HIV nie wynikało z ogólnej sekwencji sekwencji. Funkcjonalność dwóch kandydujących regionów INS została przeanalizowana za pomocą który mierzy wpływ niekodujących sekwencji mRNA na produkcję czerwonego fluorescencyjnego białka reporterowego. czerwonego fluorescencyjnego białka reporterowego. Oba nowe regiony INS wykazały aktywność hamującą aktywność hamującą w orientacji sensownej, ale nie antysensownej. Aktywność hamująca wzrosła przez połączenie obu regionów INS w tym samym mRNA. Aktywność hamująca znanych i nowych regionów INS została przezwyciężona przez koekspresję białka HIV-1 Rev białka. --- Cukrzyca typu 1 wynika z selektywnego niszczenia komórek beta produkujących insulinę w wysepkach Langerhansa. w wysepkach Langerhansa, a autoimmunologiczne limfocyty T są uważane za mediatorów tego zniszczenia. mediatorami tego zniszczenia. Komórki T są również odpowiedzialne za allorejekcję po przeszczepieniu wysepek pacjentowi w celu zmniejszenia negatywnych konsekwencji braku insuliny. konsekwencje braku insuliny. Aby lepiej zrozumieć te procesy, opracowaliśmy transgeniczną mysz wyrażającą proinsulinę II znakowaną fluorescencyjnym białkiem reporterowym fluorescencyjnym białkiem reporterowym, Timer. Białko Timer jest wyjątkowe, ponieważ zmienia kolor z zielonego na czerwony w ciągu pierwszych 24 godzin po syntezie. Dzięki temu markerowi, synteza insuliny może być dokładnie monitorowana poprzez fluorescencyjne zmiany w czasie. czasu. Aby uzupełnić to nowe biotechnologiczne narzędzie badawcze, zaprojektowaliśmy okno aby umożliwić obrazowanie in vivo w czasie wysepek przeszczepionych pod torebkę nerkową. pod torebką nerkową. Urządzenie okienkowe, które jest zszywane w celu zastąpienia skóry i ściany ciała nad miejscem przeszczepu wysepek, może być jednocześnie obserwować komórki beta i limfocyty T, które zostały oznakowane fluorochromem odróżnialnym od Timera. Obrazowanie zarówno komórek produkujących insulinę i komórek T może być przeprowadzane wielokrotnie przez tydzień lub lub dłużej, bez potrzeby powtarzania operacji, przy jednoczesnym zachowaniu życia badanego zwierzęcia. zwierzęcia. --- Opracowaliśmy metodę wykrywania wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji białek phox w komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu białek fuzyjnych komplementarnych fragmentów koralowego fluorescencyjnego białka reporterowego (monomerycznego Kusabira-Green). Potwierdziliśmy skuteczność monomerycznego systemu Kusabira-Green wykazując, że domeny PX i PB1 białka p40phox oddziałują ze sobą w nienaruszonych komórkach. komórkach, co sugeruje, że utrzymuje to białko w nieaktywnej zamkniętej konformacji. konformacji. Korzystając z tego systemu, zbadaliśmy również interakcje wewnątrzcząsteczkowe w obrębie p47phox i wykazaliśmy, że domena PX oddziałuje z autoinhibitowanym tandemowymi domenami Src homology 3 utrzymywanymi w kontakcie z regionem autoinhibicji wraz z resztami 341-360. Ponadto wykazaliśmy sekwencyjne interakcje p67phox z fagosomami z udziałem białek adaptorowych, p47phox i p40phox, podczas fagocytozy, w której pośredniczy FcgammaR. Chociaż p67phox nie jest ukierunkowany do fagosomów, p47phox funkcjonuje jako adaptor dla trójskładnikowego kompleksu (p47phox-p67phox-p40phox) we wczesnych etapach fagocytozy przed zamknięciem fagosomu, podczas gdy p40phox zamknięciem fagosomu, podczas gdy p40phox funkcjonuje w późniejszych etapach po zamknięciu fagosomu. Co ciekawe, zmutowana "otwarta" forma p40phox powiązała p47phox z zamkniętymi fagosomami. fagosomami i przedłużała retencję p47phox i p67phox na fagosomach. Te wyniki wskazują, że wiązanie trójskładnikowego kompleksu do fagosomów może być czasowo regulowane przez przełączanie między białkami adaptorowymi, które mają domeny PX o różnej specyficzności wiązania lipidów. --- Fluorescent Timer, lub DsRed1-E5, jest mutantem czerwonego białka fluorescencyjnego, dsRed, w którym fluorescencja zmienia się z czasem z zielonej na czerwoną, gdy białko dojrzewa. Ten zegar molekularny dostarcza czasowych i przestrzennych informacji na temat obrotu białek. obrotu białek. Aby zwizualizować obrót mitochondrialny, skierowaliśmy Timer do macierzy mitochondrialnej za pomocą sekwencji ukierunkowanej na mitochondria (ukutej jako "MitoTimer") i sklonowaliśmy go do konstruktu promotora indukowanego tetracykliną, aby regulować jego ekspresję. Tutaj przedstawiamy charakterystykę tego nowego fluorescencyjnego reportera dynamiki mitochondriów. Komórki Tet-On HEK 293 zostały transfekowano pTRE-tight-MitoTimer, a produkcję indukowano za pomocą doksycykliną (Dox). Dystrybucję mitochondriów wykazano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej mikroskopii fluorescencyjnej i zweryfikowano przez frakcjonowanie subkomórkowe i analizę Western blot. Dodanie Dox przez zaledwie 1 godzinę było wystarczające do wywołania ekspresji MitoTimeru w ciągu 4 godzin, z utrzymywaniem się we frakcji mitochondrialnej przez okres do 6 dni. specyficzna dla koloru konformacja MitoTimer była stabilna po utrwaleniu 4% paraformaldehydem. paraformaldehydem. Ratiometryczna analiza MitoTimer ujawniła zależne od czasu przejście od zielonego do czerwonego w ciągu 48 godzin i była możliwa do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej całych komórek lub izolowanych mitochondriów. mitochondriów. Drugie podanie Dox 48 godzin po początkowej indukcji spowodowało drugą rundę ekspresji zielonego MitoTimer. Zakres nowego inkorporacji białka podczas drugiego impulsu został zwiększony przez podanie mitochondrialnego lub symwastatyny, z których oba wyzwalają mitofagię i biogenezę. biogenezę. MitoTimer to nowe fluorescencyjne białko reporterowe, które może ujawnić nowy wgląd w dynamikę mitochondriów w komórkach. W połączeniu z cytometrią przepływową cytometrią przepływową, oferuje nowe możliwości badania subpopulacji mitochondriów metodą biochemiczną. subpopulacji mitochondriów metodami biochemicznymi lub proteomicznymi. --- Wiele wyniszczających chorób, w tym choroby neurodegeneracyjne, obejmuje apoptozę. Opracowano kilka metod wizualizacji komórek apoptotycznych in vitro lub w utrwalonych tkankach, ale dostępnych jest niewiele narzędzi do wizualizacji komórek apoptotycznych u żywych zwierząt. komórek apoptotycznych u żywych zwierząt. Tutaj opisujemy genetycznie zakodowane fluorescencyjne białko reporterowe, które znakuje komórki apoptotyczne w żywych zarodkach danio pręgowanego. zarodkach danio pręgowanego. Podczas apoptozy, fosfolipid fosfatydyloseryna (PS) jest eksponowany na zewnętrznym płatku błony plazmatycznej. Białko zależne od wapnia Aneksyna V (A5) wiąże PS z wysokim powinowactwem i jest oczyszczana biochemicznie, fluorescencyjnie znakowane sondy A5 były szeroko stosowane do wykrywania apoptozy in vitro. in vitro. Tutaj pokazujemy, że wydzielany A5 połączony z żółtym białkiem fluorescencyjnym specyficznie znakuje komórki apoptotyczne u żywych danio pręgowanego. Używamy tej fluorescencyjnej do scharakteryzowania wzorców apoptozy u żywych larw danio pręgowanego oraz do wizualizacji śmierci komórek neuronalnych w rozdzielczości pojedynczej komórki in vivo. --- Neuronalne połączenia szczelinowe, umożliwiające szybki międzykomórkowy transfer sygnału elektrotonicznego zostały zaangażowane w mechanizmy regulujące procesy uczenia się i pamięci. procesy. Zbadaliśmy myszy z warunkowym neuronalnym (Cx45fl/fl:Nestin-Cre) myszy z niedoborem koneksyny45 pod względem behawioralnym i elektrofizjologicznym korelatów uczenia się i pamięci. Behawioralna habituacja do nowego środowiska i uczenie się motoryczne nie uległy zmianie u tych myszy. Rozpoznawanie nowych obiektów po opóźnieniach do 60 minut było upośledzone u myszy z niedoborem neuronów Cx45. Jednak rozpoznawanie miejsca obiektu nie różniło się znacząco od kontroli. Analiza zwiększonej ekspresji białka reporterowego zielonej fluorescencji kontrolowanej przez endogennego mysiego promotora Cx45 w mózgu myszy z niedoborem neuronów Cx45 sugeruje, że Cx45 ulega ekspresji w korze okołokomorowej i podregionie CA3 hipokampa. hipokampa. Myszy z niedoborem neuronów Cx45 zostały również zbadane pod kątem w generowaniu i synchronizacji oscylacji sieciowych w hipokampie. hipokampie. Ogólna pobudliwość, synaptyczna plastyczność krótkotrwała i spontaniczne oscylacje o wysokiej częstotliwości (fale ostre) w hipokampie nie różniły się od kontroli. Jednak stymulacja kąpielowa plasterków hipokampa plasterki z kainianem indukowały znacznie niższe amplitudy oscylacji gamma w CA3, ale nie w podpolu CA1 myszy z niedoborem neuronów Cx45. Dodatkowo, wykazywały one znacznie większą szerokość połowy maksimum rozkładu częstotliwości w podpolu CA1. rozkład częstotliwości w podpolu CA1 w porównaniu z grupą kontrolną. Podsumowując Podsumowując, ukierunkowana na neuron delecja Cx45 upośledzała nowy obiekt w jednej próbie rozpoznawanie i zmienione oscylacje gamma indukowane kainianem, prawdopodobnie poprzez zakłócenie komunikacji między neuronami w hipokampie lub korze okołokomorowej. korze okołokomorowej. --- Badanie nicieni pasożytujących na roślinach, takich jak Meloidogyne spp. i ich interakcji z bakteriami fitopatogennymi i ich interakcje z bakteriami fitopatogenicznymi pozostają niedostatecznie zbadane. Jednym z wyzwań wyzwań w kierunku ustalenia takich interakcji jest zależność od objawów jako miary interakcji. W tym badaniu, mCherry zostało zastosowane jako białko reporterowe białko reporterowe w celu zbadania interakcji między miękką zgnilizną Enterobacteriaceae (SRE) Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis (Pcb) i węzłem korzeniowym (M. incognita). Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis transformowano szczepem pMP7604 generującym Pcb_mCherry. Szczep ten Wykazano, że szczep ten przyczepia się do powłoki powierzchniowej M.incognita J2 w optymalnej temperaturze 28°C. temperaturze 28°C. Sugeruje to, że młode osobniki RKN mogą odgrywać rolę w rozprzestrzenianiu Pcb w glebach, które są silnie porażone Pcb. Obecność Wykazano, że młode osobniki RKN odgrywają rolę we wprowadzaniu Pcb_mCherry do bulw ziemniaka. potencjalnie działając jako źródło utajonych infekcji bulw. --- Fluorescencyjne białka reporterowe oparte na fotosensorach wiążących flawinę zostały niedawno opracowane jako nowa klasa genetycznie kodowanych sond charakteryzujących się małym rozmiar i niezależne od tlenu dojrzewanie fluorescencji. Białka fluorescencyjne oparte na flawinie (FbFP) rozwiązują dwa główne ograniczenia związane z istniejącymi fluorescencyjnymi pochodzącymi z zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), a mianowicie, ogólny duży rozmiar i zależne od tlenu dojrzewanie fluorescencji GFP. Jednak FbFP znajdują się w początkowej fazie rozwoju i zostały wykorzystane w zaledwie kilku badaniach biologicznych. tylko w kilku badaniach biologicznych. Co ważne, pełne zrozumienie wydajności i właściwości FbFP jako praktycznego zestawu sond biologicznych. sond biologicznych. W tej pracy szczegółowo scharakteryzowaliśmy trzy FbFPs wyizolowane z Pseudomonas putida, Bacillus subtilis i Arabidopsis thaliana, przy użyciu badań in vitro do oceny jasności sondy, stanu oligomerycznego, czasu dojrzewania, frakcji fluorescencyjnej holoproteiny, tolerancji pH, wrażliwości na redoks i stabilności termicznej. stabilność termiczną. Ponadto walidujemy FbFP jako stabilne znaczniki molekularne przy użyciu badań in vivo badania poprzez skonstruowanie serii konstruktów transkrypcyjnych opartych na FbFP do sondowanie aktywności promotora w Escherichia coli. Ogólnie rzecz biorąc, FbFP wykazują kluczowe zalety jako wskaźniki biologiczne o szerokim spektrum, w tym solidną tolerancję pH (4-11), stabilność termiczną (do 60°C) i szybkie dojrzewanie fluorescencji (<3 min.). Ponadto, FbFP pochodzący z Arabidopsis thaliana (iLOV) pojawił się jako stabilny i nieperturbacyjny reporter aktywności promotora w Escherichia coli. Nasze wyniki pokazują, że reportery oparte na FbFP mogą potencjalnie rozwiązać kluczowych ograniczeń związanych ze stosowaniem GFP, takich jak fluorescencja wrażliwa na pH fluorescencja i powolna kinetyka dojrzewania fluorescencji (10-40 minut dla połowy maksymalnego odzysku fluorescencji). Z tego punktu widzenia, FbFP stanowią użyteczny nowy dodatek do palety fluorescencyjnych białek reporterowych, a nasze wyniki stanowią ważne ramy umożliwiające badaczom wdrażanie i dalsze inżynierów ulepszonych reporterów opartych na FbFP o zwiększonej jasności i ściślejszym wiązaniem flawiny, co zmaksymalizuje ich potencjalne korzyści. --- Ozon, główny składnik smogu fotochemicznego i zanieczyszczenia powietrza, może uszkadzać skórę poprzez utlenianie enzymów warstwy rogowej naskórka, lipidów i białek strukturalnych. Opracowaliśmy szybki test przesiewowy w celu określenia zdolności zmiatania wolnych rodników różnych składników aktywnych, które są często stosowane w produktach higieny osobistej. produktach higieny osobistej. Kilka znanych przeciwutleniaczy, w tym witamina C, analog witaminy E Trolox, ekstrakt z nasion orzecha włoskiego, kwas liponowy i sól wewnętrzną ergotioneiny. pod kątem ich zdolności do neutralizowania indukowanego ozonem utleniania beta-fykoerytryny, fluorescencyjnego białka reporterowego pochodzącego z alg. Zdolność zdolności zmiatania wolnych rodników tych przeciwutleniaczy zostały określone ilościowo i porównano. Wyniki pokazują, że test ten jest cennym podstawowym narzędziem narzędzie przesiewowe do identyfikacji aktywności przeciwutleniającej naturalnych lub syntetycznych substratów, które mogą być stosowane w produktach higieny osobistej w celu ochrony najwyższej warstwę naszej skóry przed uszkodzeniami oksydacyjnymi indukowanymi przez O3. --- Dogłębną charakterystykę działania promotora glukoamylazy (glaA) Aspergillus niger przeprowadzono na zdefiniowanym podłożu z wykorzystaniem wielostanowiskowego wysokoprzepustowe badania przesiewowe, a także kontrolowane wsady i bioreaktor wsadowy z GFP jako fluorescencyjnym białkiem reporterowym. Różnorodność metabolizowalne substraty węglowe i niemetabolizowalne analogi zostały zbadane pod kątem ich wpływu na w odniesieniu do ich wpływu na system ekspresji glaA. Wyniki wyraźnie że tylko skrobia i jej produkty hydrolityczne, w tym glukoza, działają jako induktory. jako induktory. Jednakże, indukcja systemu ekspresji glaA przez glukozę jest znacznie niższa w porównaniu ze skrobią i produktami degradacji skrobi o wyższej masie cząsteczkowej. produktów degradacji skrobi o wyższej masie cząsteczkowej. Wszystkie inne 26 substratów węglowych nie indukują, a nawet, jak w przypadku łatwo metabolizowalnego monosacharydu ksylozy, hamują ekspresję genów kontrolowaną przez promotor glaA w obecności obecność indukującego disacharydu maltozy ze wzrostem siły represji przez zwiększenie stężenia ksylozy poprzez zwiększenie stężenia ksylozy. Złożony wpływ glukozy na glukozę na ekspresję kontrolowaną przez promotor glaA analizowano również przy użyciu niemetabolizowalnych analogów glukozy, a mianowicie 5-tio-glukozy i 2-deoksyglukozy, które zostały zidentyfikowane jako nowe i silne induktory jako nowe i silne induktory systemu ekspresji glaA. Wyniki pokazują że siła indukcji zależy od stężenia induktora z maksimum przy określonych stężeniach i niższej indukcji lub nawet represji przy stężeniach powyżej stężeniach powyżej. Co więcej, kontrolowane hodowle wsadowe przy użyciu wysokiej dawki maltozę z jednoczesną pozakomórkową akumulacją glukozy skutkowały niższymi poziomami białka reporterowego w porównaniu do hodowli z z niską szybkością podawania maltozy bez zewnątrzkomórkowej akumulacji glukozy, tym samym potwierdzając wniosek, że zwiększenie stężenia glukozy poza punkt krytyczny zmniejsza siłę indukcji lub może nawet powodować represję. W ten sposób W ten sposób szybkość hydrolizy polimeru, wychwytu glukozy i rozkładu wewnątrzkomórkowego może być precyzyjnie dostosowana do optymalnego wzrostu grzybów i obciążenia metabolicznego dla syntezy glukoamylazy. syntezy glukoamylazy może być odpowiednio ograniczone w odpowiedzi na dostępność składników odżywczych. dostępność składników odżywczych. --- Potencjalne zastosowania terapeutyczne hepatocytów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) hepatocytów są ograniczone przez ich stosunkowo niską wydajność w różnicujących kulturach ESC ESC, jak również przez niebezpieczeństwo zanieczyszczenia nowotworowymi niezróżnicowanymi ESC. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy transgeniczne klony mysich ESC posiadające bicistroniczny wektor ekspresyjny, który zawiera promotor genu alfa-fetoproteiny prowadzący kasetę dla wzmocnionego zielonego "żywego" fluorescencyjnego białka reporterowego (eGFP) i genu oporności na puromycynę. W ustalonych warunkach hodowli klony te pozwoliły zarówno na monitorowanie różnicowania i selekcji puromycyną komórek hepatocytów w masowej hodowli zawiesinowej transgenicznych masowej hodowli transgenicznych agregatów ESC ("ciał embrioidalnych" [EB]). Po umieszczeniu na fibronektynie, wybrane komórki eGFP-dodatnie utworzyły kolonie, w których w których intensywnie proliferujące komórki podobne do prekursorów hepatocytów dały początek morfologicznie zróżnicowane komórki wyrażające alfa-1-antytrypsynę, alfa-fetoproteinę i albuminę. Pewna liczba komórek syntetyzowała glikogen, a w niektórych komórkach niektórych komórkach wykryto mikrofilamenty cytokeratyny 18. Główne geny markerów hepatocytów hepatocytów, wraz z ekspresją genów i białek markerów macierzystych/progenitorowych. ekspresji markerów macierzystych/progenitorowych, co sugeruje cechy zarówno prekursorów hepatocytów, jak i bardziej zaawansowanych komórek zróżnicowanych. Podczas hodowli w zawiesinie zawiesinie, wyselekcjonowane komórki EB z puromycyną tworzyły sferoidy zdolne do wyrastać na adhezyjnym podłożu, przypominając zachowanie płodowych mysich komórek progenitorowych komórek progenitorowych wątroby. Ustanowiony system oparty na wysoce wydajnej procedurze selekcji/oczyszczania może być odpowiedni do skalowalnego generowania ESC-pochodzących z hepatocytów i komórek podobnych do prekursorów hepatocytów i oferuje potencjalne źródło komórek in vitro do terapii transplantacyjnej chorób wątroby chorób wątroby, inżynierii tkankowej oraz badań przesiewowych leków i toksykologii. --- Istnieje rosnące zapotrzebowanie na wysokowydajne (HTP) metody analizy genów w skali całego genomu. w skali całego genomu. Jednak obecny repertuar metod wykrywania HTP pozwala na badanie jedynie ograniczonego zakresu fenotypów komórkowych. fenotypów komórkowych. Skonstruowaliśmy dwa zoptymalizowane pod kątem HTP wektory ekspresyjne wygenerowane z z genu czerwonego fluorescencyjnego białka reporterowego (RFP). Wektory te produkują białka docelowe znakowane RFP w systemie wielokrotnej ekspresji przy użyciu technologii klonowania gateway (GCT). Znacznik RFP został połączony ze sklonowanymi genami, umożliwiając w ten sposób nam zlokalizować wyrażone białka w komórkach ssaków. Skuteczność wektorów wektorów została oceniona przy użyciu systemu przesiewowego HTP. Sześćdziesiąt reprezentatywnych ludzkich domen C2 znakowano RFP i nadeksprymowano w neuronalnych komórkach progenitorowych HiB5. i szczegółowo zbadaliśmy dwie domeny C2, które promowały neuronalne różnicowanie komórek HiB5. różnicowanie komórek HiB5. Nasze wyniki pokazują, że dwa wektory opracowane w tym badaniu są przydatne do funkcjonalnej analizy genów przy użyciu systemu przesiewowego HTP w skali całego genomu. --- Borrelia spirochaetes są unikalne wśród bakterii zarodźcowych pod względem obfitości powierzchniowych lipoprotein, z których niektóre odgrywają ważną rolę w patogenezie boreliozy. patogenezie choroby z Lyme i nawracającej gorączki. Aby zidentyfikować sygnały sortowania lipoprotein w Borrelia burgdorferi, wygenerowaliśmy chimery między zewnętrzną lipoproteiną powierzchniową OspA, peryplazmatyczną lipoproteiną wiążącą oligopeptyd OppAIV i mRFP1, monomerycznym czerwonym fluorescencyjnym białkiem reporterowym. Lokalizacja mutantów punktowych OspA i OppAIV wykazała, że lipoproteiny Borrelia nie są zgodne z zasadą sortowania "+2", która kieruje lipoproteiny do cytoplazmatycznej lub zewnętrznej błony bakterii Gram-ujemnych poprzez szlak Lol. Fuzje mRFP1 z krótkimi N-końcowymi lipopeptydami OspA i zaskakująco OppAIV, były ukierunkowane na powierzchnię krętka. Mutageneza N-końca OspA określiła mniej niż pięć N-końcowych aminokwasów jako minimalny sygnał ułatwiający wydzielanie. sygnał ułatwiający sekrecję. Z wyjątkiem ładunków ujemnych, które mogą działać jako częściowe sygnały retencji podpowierzchniowej w pewnych kontekstach peptydowych, wydzielanie lipoprotein zachodzi niezależnie od sekwencji N-końcowej. Razem, te dane wskazują, że lipoproteiny Borrelia są ukierunkowane na powierzchnię bakterii domyślnie, ale mogą być zatrzymywane w peryplazmie przez sygnały specyficzne dla sekwencji.
Lista fluorescencyjnych białek reporterowych.
Fluorescencyjne i luminescencyjne geny reporterowe stały się popularnymi narzędziami do monitorowania ekspresji genów w żywych komórkach w czasie rzeczywistym:
zielone białko fluorescencyjne
Timer
czerwone białko fluorescencyjne
żółte białko fluorescencyjne
beta-fykoerytryna
koralowe fluorescencyjne białko reporterowe
wzmocnione zielone fluorescencyjne białko reporterowe
mCherry