Pokazujemy, że czas wymagany do transkrypcji ludzkich genów większych niż 800 kb obejmuje więcej niż jeden pełny cykl komórkowy, podczas gdy ich szybkość transkrypcji jest równa mniejszym genom. Niezależnie od ich stanu ekspresji, stwierdzamy, że długie geny replikują się późno. Regiony jednoczesnej transkrypcji i replikacji w późnej fazie S wykazują gorące punkty pęknięć DNA znane jako wspólne kruche (CFS). Niestabilność CFS zależy od ekspresji leżących u ich podstaw długich genów. długich genów. Pokazujemy, że hybrydy RNA:DNA (pętle R) tworzą się w miejscach kolizji transkrypcji/replikacji i że RNaza H1 działa w celu tłumienia niestabilności CFS niestabilności. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że na najdłuższych ludzkich genach, kolizje maszyn transkrypcyjnych z widełkami replikacyjnymi są nieuniknione, tworząc pętle R i w konsekwencji formację CFS. Funkcjonalna replikacji musi być zaangażowana w rozwiązywanie konfliktów między mechanizmami transkrypcji i replikacji, aby zapewnić stabilność genomu. --- Mutanty Escherichia coli rnhA pozbawione RNazy HI wykazują konstytutywną stabilną replikację DNA replikację DNA, cSDR, która, jak się uważa, jest inicjowana z pętli R stabilizowanych przez nieobecności RNazy HI. Odkryliśmy, że połączenie mutacji rnhA i recG mutacji recG, które inaktywują aktywność helikazy białka RecG i hamują aktywność białka RecG. białka RecG i hamują odwrotną migrację rozgałęzień Holliday nadają fenotypy przypominające mutanty rnhA. Tak więc mutanty recG wykazują aktywność cSDR, a podwójne mutanty recG polA są niezdolne do życia, podobnie jak podwójne mutanty rnhA polA. Wyniki te sugerują, że helikaza RecG odgrywa rolę w zapobieganiu powstawania pętli R. Model, w którym pętle R są tworzone przez asymilację transkryptów RNA do dupleksu DNA. Model dalej postuluje że białko RecA katalizuje tę reakcję asymilacji i że białko RecG przeciwdziała RecA w tej reakcji, rozwiązuje pętle R poprzez swoją aktywność helikazy, lub robi jedno i drugie. --- Po transkrypcji niektórych sekwencji przez polimerazy RNA in vitro lub in vivo, transkrypcja transkrypt RNA może powrócić do matrycowej nici DNA, powodując powstanie pętli R loop. Wcześniej wykazaliśmy, że inicjacja tworzenia pętli R w strefie inicjacji pętli R (RIZ) (RIZ) jest faworyzowana przez klastry G. Tutaj, przy użyciu oczyszczonego systemu in vitro z polimerazą RNA T7, pokazujemy, że zwiększona odległość między promotorem a pętlą promotorem a regionem bogatym w G wspierającym pętlę R zmniejsza tworzenie pętli R. Kiedy bogata w G część transkryptu RNA znajduje się za końcem 5' transkryptu transkryptu, zdolność tej części transkryptu do annealowania do nici do matrycowej nici DNA jest zmniejszona. Kiedy nukleolitycznie usuwamy początek transkryptu, pętla R transkryptu, tworzenie pętli R wzrasta, ponieważ bogata w G część RNA znajduje się teraz bliżej końca 5' transkryptu. Krótkie regiony skupione w G mogą działać jako RIZ i zmniejszać indukowaną odległością supresję tworzenia pętli R. Wiadomo, że superskręcone DNA sprzyja przejściowemu oddzieleniu dwóch nici DNA, i okazuje się, że sprzyja to powstawaniu pętli R nawet w regionach nie bogatych w G. Najbardziej uderzające jest to, że nić może służyć jako silny RIZ, nawet w regionach bez bogactwa G . Ma to ważne implikacje dla rekombinacji i hipermutacji somatycznej. somatycznej hipermutacji i prawdopodobnie dla innych procesów biologicznych w regionach transkrybowanych. regionach. --- Polimerazy DNA i RNA ścierają się wzdłuż genomu, konkurując o tę samą matrycę DNA. DNA. Komórki rozwinęły wyspecjalizowane strategie, aby zapobiegać i rozwiązywać interferencji replikacji i transkrypcji. Tutaj dokonujemy przeglądu topologii i w miejscach kolizji widełek replikacyjnych z pęcherzykami transkrypcyjnymi, jak również a także obwody regulacyjne, które kontrolują przejście widełek replikacyjnych przez transkrybowane geny. transkrybowane geny. W przypadku genów transkrybowanych przez polimerazę RNA II, procesy kotranskrypcyjne, takie jak dojrzewanie mRNA, splicing i eksport wpływają na integralność widełek replikacyjnych i transkrybowanych loci. Przejście widełek prawdopodobnie przyczynia się do zresetowania krajobrazu epigenetycznego, wpływając na ekspresję genów i pamięć transkrypcyjną. ekspresję genów i pamięć transkrypcyjną. Gdy którykolwiek z tych procesów nie jest odpowiednio skoordynowane, powstają nieprawidłowe wyniki, takie jak odwrócenie widełek i pętla R powstają i wyzwalają nieplanowane zdarzenia rekombinogenne i rearanżacje genomu. i rearanżacje genomu. Ewolucyjne implikacje takich konfliktów na dynamikę genomu i ich potencjalny wpływ na stres onkogenny. --- Transkrypcyjne pętle R są anomalnymi hybrydami RNA:DNA, które zostały wykryte w organizmach od bakterii po ludzi. Struktury te zostały wykazane u eukariontów, powodując uszkodzenia i rearanżacje DNA; jednak mechanizmy leżące u podstaw tych efektów pozostały w dużej mierze nieznane. Aby to zbadać, my najpierw pokazujemy, że tworzenie pętli R indukuje rearanżacje chromosomalnego DNA i rekombinację u Escherichia coli, podobnie jak u eukariontów. Co więcej co ważniejsze, pokazujemy następnie, że tworzenie pętli R powoduje zatrzymanie widełek replikacji DNA i że w rzeczywistości leży to u podstaw wpływu pętli R na stabilność genomu. stabilność genomu. Co uderzające, odkryliśmy, że tłumienie replikacji silnie tłumi rearanżacje DNA za pośrednictwem pętli R zarówno w komórkach E. coli, jak i HeLa. Nasze odkrycia zapewniają zatem bezpośrednią demonstrację, że tworzenie pętli R upośledza replikację DNA i że jest to odpowiedzialne za szkodliwy wpływ pętli R na stabilność genomu od bakterii po ludzi. --- W ludzkich mitochondriach mechanizm transkrypcji generuje startery RNA potrzebne do zainicjowania replikacji DNA. Krytyczną cechą wiodącej nici replikacji mitochondrialnego DNA jest element bogaty w CG oznaczony jako konserwowany blok sekwencji II (CSB II). Podczas transkrypcji CSB II, struktura G-kwadrupleksowa struktura tworzy się w powstającym RNA, który stymuluje transkrypcję zakończenie transkrypcji i tworzenie starterów. Poprzednie badania wykazały, że nowo zsyntetyzowane startery tworzą stabilną i trwałą hybrydę RNA-DNA, pętlę R, w pobliżu wiodącej nici replikacji DNA. Tutaj pokazujemy, że nietypowe zachowanie startera RNA jest wyjaśnione przez tworzenie stabilnej struktury G-kwadrupleksu. G-kwadrupleksowej struktury, obejmującej region CSB II zarówno w powstającym RNA, jak i i nieszablonowej nici DNA. Na podstawie naszych danych sugerujemy, że tworzenie G-kwadrupleksu między powstającym RNA a nieszablonową nicią DNA może być regulowanym regulowanym zdarzeniem, które decyduje o losie starterów RNA i ostatecznie o tempie inicjacji syntezy DNA w ludzkich mitochondriach. --- Podczas fazy S, replikosom musi pokonać wiele fizycznych przeszkód, które mogą spowodować zatrzymanie widełek replikacyjnych i zagrozić integralności genomu. Transkrypcja jest ważnym źródłem stresu replikacyjnego, a co za tym idzie, utrzymanie integralności genomu integralności genomu wymaga ochrony chromosomów przed szkodliwymi szkodliwymi efektami wynikającymi z interakcji między powstającym RNA i matrycowym DNA, co prowadzi do powstawania stabilnych hybryd DNA-RNA (pętli R). Wcześniej zgłosiliśmy istotną rolę Omcg1 (Ovum Mutant Candidate Gene) dla progresji cyklu komórkowego podczas wczesnego rozwoju embrionalnego. Tutaj pokazujemy, że OMCG1 jest celem kinaz punktu kontrolnego cyklu komórkowego kinaz punktu kontrolnego cyklu komórkowego ATR/ATM i jest niezbędny do progresji fazy S w mysich fibroblastach embrionalnych. Stosując strategię warunkowej inaktywacji genów, wykazujemy, że pozbawienie OMCG1 upośledza żywotność komórek w wyniku DSB, aktywacji punktu kontrolnego i załamania widełek replikacyjnych. Pokazujemy również że w komórkach pozbawionych Omcg1 nie dochodziło do pęknięć chromosomów. Co więcej, zwiększona ekspresja RNaseH znacząco złagodziła niestabilność genomową niestabilność genomową w fibroblastach z niedoborem, co sugeruje, że tworzenie kotranskrypcyjnych pętli R przyczynia się do powstawania zależnych od replikacji DSB w tych komórkach. komórkach. Wraz z ostatnimi doniesieniami opisującymi jego udział w kompleksach zaangażowanych w procesy kotranskrypcyjne, nasze wyniki sugerują, że OMCG1 odgrywa rolę w ścisłym sprzężeniu między szlakami przetwarzania mRNA a utrzymaniem integralności genomu podczas progresji cyklu komórkowego. --- Primery dla replikacji mitochondrialnego DNA są produktami transkrypcji syntetyzowanymi przez mitochondrialną polimerazę RNA. transkrypcji syntetyzowane przez mitochondrialną polimerazę RNA. Prekursor RNA istnieje jako trwała hybryda RNA-DNA, znana jako pętla R, utworzona podczas transkrypcji przez początek replikacji (Xu, B. i Clayton, D. A. (1996) EMBO J. 15, 3135-3143). W celu zbadania dokładnej struktury RNA, wykorzystaliśmy dwie metody do odtworzenia modelu R zawierające sekwencję pochodzenia mysiego mitochondrialnego DNA. Po pierwsze wykazać, że polimeraza RNA bakteriofaga SP6 może skutecznie katalizować tworzenie pętli R w sekwencji pochodzenia mysiego mtDNA. Po drugie, pętla R można zmontować przez annealing wstępnie zsyntetyzowanego RNA i superzwiniętej matrycy DNA w obecności formamidu. obecności formamidu. Tworzenie pętli R za pomocą obu metod zależy od specyficznych sekwencji matrycy. Odtworzona pętla R jest wyjątkowo stabilna i wykazuje nieoczekiwaną strukturę. Badania strukturalne wskazują, że nić RNA jest zorganizowana w regionie sparowanym zasadą RNA-DNA, co sugeruje, że interakcja heterodupleksu interakcja heterodupleksu zachodzi poprzez określoną konformację. Proponujemy, aby zorganizowana struktura pętli R jest krytyczna dla funkcji primera RNA in vivo z ważnymi implikacjami dla przetwarzania RNA i replikacji DNA maszyny. --- Bakteriofag T4 inicjuje replikację DNA z wyspecjalizowanych struktur, które tworzą się w jego genomie. w jego genomie. Natychmiast po zakażeniu, hybrydy RNA-DNA (pętle R) występują na (przynajmniej niektórych) źródłach replikacji, z wyżarzonym RNA służącym jako starter do syntezy nici wiodącej w jednym kierunku. W miarę postępu infekcji, inicjacja replikacji staje się zależna od białek rekombinacyjnych w procesie zwanym replikacją zależną od rekombinacji (RDR). RDR występuje, gdy maszyna replikacyjna jest montowana na pośrednich rekombinacjach pętli D, i w tym przypadku inwazyjny koniec 3' DNA jest używany jako starter do syntezy nici wiodącej. syntezy nici wiodącej. W ciągu ostatnich 15 lat te dwa tryby inicjacji replikacji DNA T4 zostały zbadane in vivo przy użyciu różnych podejść, w tym replikację plazmidów z segmentami genomu T4, analizę pośrednich etapów replikacji przez dwuwymiarową elektroforezę żelową i podejścia genomowe, które mierzą liczbę kopii DNA podczas infekcji. które mierzą liczbę kopii DNA w miarę postępu infekcji. Ponadto, podejścia biochemiczne odtworzyły replikację ze struktur pętli R pochodzenia i wyjaśniły niektóre szczegółowe role zarówno replikacji, jak i białek rekombinacyjnych w procesie replikacji. białek rekombinacyjnych w procesie RDR i powiązanych szlakach. Omówimy również omówimy również podobieństwa między trybami replikacji DNA T4 a podobnymi zdarzeniami w replikacji DNA w komórkach i organellach eukariotycznych, a także zakończymy kilkoma aktualnymi pytania dotyczące mechanizmów replikacji, rekombinacji i naprawy u faga T4. --- Pętla R to rodzaj trójniciowej struktury kwasu nukleinowego, która składa się z hybrydy hybrydy RNA:DNA, utworzonej w wyniku nieudanej separacji powstającej cząsteczki RNA z szablonem matrycą transkrypcyjną podczas transkrypcji lub przez ponowne zespolenie cząsteczki RNA z jedną z dwóch nici w dwuniciowej cząsteczce DNA, wraz z jednoniciowym DNA, który jest jednoniciowym DNA, który jest albo nieszablonową nicią w pęcherzyku transkrypcyjnym, albo bańce transkrypcyjnej lub nicią DNA podstawioną przez RNA. Tworzenie pętli R może może wystąpić, gdy transkrypcja przechodzi przez region genomowego DNA mający ciąg zasad G w nieszablonowej nici w pęcherzyku transkrypcyjnym lub przez typ mikrosatelitarnych sekwencji DNA, o których wiadomo, że są związane z pewnymi chorobami ludzkimi. Ujemne siły superskręcania nagromadzone w pęcherzyku transkrypcyjnym bańce transkrypcyjnej oraz nieprawidłowe przetwarzanie prekursorów RNA, jak również opóźnione wykorzystanie i transport cząsteczek RNA do cytoplazmy sprzyjają powstawaniu pętli R tworzenie pętli. Wiele badań pokazuje, że komórki mogą zarządzać tworzeniem pętli R z wydajnością z wydajnością, a także mogą przetwarzać pętle R już utworzone w komórce, przez co przez co zły wpływ pętli R na replikację DNA, mutację genów i rekombinację homologiczną może być regulowany. rekombinację homologiczną. W tym przeglądzie podsumowujemy i wpływ pętli R na replikację DNA, szybkość mutacji i częstotliwość rekombinacji homologicznej. częstotliwości rekombinacji homologicznej, a także omawiamy możliwą rolę indukowanej przez pętlę R replikacji DNA w pośredniczeniu w ekspansji powtórzeń trinukleotydowych jak widać z tymi często związanymi z ludzkimi nerwowo-mięśniowymi chorobami zwyrodnieniowymi choroby nerwowo-mięśniowe. --- Prekursorowy primer RNA dla replikacji nici wiodącej mitochondrialnego DNA ssaków replikacji pozostaje jako trwała pętla R utworzona podczas transkrypcji przez region kontrolny mitochondrialnego DNA. Zbadaliśmy modelowe pętle R, które istnieją w nowej i fizjologicznie dokładnej konformacji preprimeru, jako jako potencjalne substraty dla mitochondrialnej RNazy ssaków (MRP). Myszowa RNaza MRP dokładnie rozszczepia pętlę R zawierającą pochodzenie mysiego mitochondrialnego DNA. DNA myszy. Wielokrotne miejsca rozszczepienia na substracie pętli R pasują do miejsca primingu obserwowane in vivo, co sugeruje, że sama RNaza MRP jest w stanie generowania praktycznie wszystkich primerów replikacji nici wiodącej. --- W komórkach bakteryjnych dwukierunkowa replikacja kolistego chromosomu jest inicjowana z pojedynczego źródła (oriC) i kończy się w antypodalnym regionie terminus regionie, tak że ruch pary widełek replikacyjnych jest w dużej mierze współkierunkowy z transkrypcją. Region zakończenia jest otoczony dyskretnymi sekwencjami Ter które działają jako polarne lub zależne od kierunku miejsca zatrzymania dla progresji widełek. progresji widełek. Możliwe są alternatywne, niezależne od oriC tryby inicjacji replikacji. możliwe, z których jednym jest konstytutywna stabilna replikacja DNA (cSDR) z związanych z transkrypcją hybryd RNA-DNA lub pętli R. Tutaj omówię charakterystyczne atrybuty progresji widełek i zakończenia związane z różnymi trybami inicjacji replikacji bakteryjnej. Zaproponowano dwa hipotetyczne modele zaproponowano: zderzenia czołowe między parami widełek replikacyjnych, które są cechą zakończenia replikacji we wszystkich królestwach życia, prowokują dwustronne reakcje reakcje odwrócenia widełek; oraz że cSDR charakteryzuje się istnieniem odrębnych subpopulacji w bakteriach. subpopulacji w kulturach bakteryjnych i powszechnym rozmieszczeniem genów w genomie. genomie, z których każdy ma niewielki potencjał wypalania. Ponieważ wiadomo, że pętle R istnieją w komórkach eukariotycznych i powodują uszkodzenia genomu w fazie G1, możliwe jest, że zdarzenia podobne do cSDR że zdarzenia podobne do cSDR promują nieprawidłową inicjację replikacji nawet u eukariontów. --- Niespodziewane powszechne występowanie stabilnych hybrydowych struktur DNA/RNA (pętli R) w ludzkich komórkach i coraz więcej dowodów na ich zaangażowanie w kilka ludzkich nowotworów złośliwych ożywiło badania nad biologią pętli R w ostatnich latach. Tutaj proponujemy, że fizjologiczne tworzenie pętli R na wyspach CpG może przyczyniać się do specyfikacji pochodzenia replikacji DNA w tych regionach. regionach, najbardziej wydajnych miejscach inicjacji replikacji w komórkach ssaków. Całkiem prawdopodobne, że dzieje się to poprzez reakcję wypierania nici aktywującą tworzenie struktur G-kwadrupleksowych, które są ukierunkowane na kompleks rozpoznawania pochodzenia (ORC) w konformacji jednoniciowej. Zgodnie z tym stwierdziliśmy, że R-pętle kolokalizują się z ORC w tym samym regionie wyspy CpG w znacznej części tych wydajnych źródeł replikacji, dokładnie w miejscu pozycji wykazującej największą gęstość motywów G4. Ten scenariusz opiera się na związek między transkrypcją a replikacją w ludzkich komórkach i sugeruje że rozregulowanie pętli R w miejscach pochodzenia promotorów wysp CpG może przyczyniać się do fenotypu fenotypu nieprawidłowości replikacji DNA i utraty integralności genomu wykrytej w komórkach nowotworowych. --- Niedawno donieśliśmy, że topoizomeraza 1 (Top1) współpracuje z ASF/SF2, czynnikiem splicingowym z rodziny czynnikiem splicingowym z rodziny SR, aby zapobiec nieplanowanemu zatrzymaniu widełek replikacyjnych i niestabilności genomowej w ludzkich komórkach. Nasze wyniki sugerują, że Top1 wykonuje tę funkcję poprzez hamowanie tworzenia hybryd DNA-RNA podczas transkrypcji, tzw. transkrypcji, tak zwane pętle R zakłócające progresję widełek replikacyjnych. widełek replikacyjnych. Używając ChIP-chip, wykazaliśmy, że γ-H2AX, marker uszkodzeń DNA gromadzi się w regionach genomu bogatych w geny w komórkach z niedoborem Top1. Najlepiej widać to na przykładzie genów histonowych, które wykazują wysoką ekspresję w fazie S i wykazują dyskretne piki γ-H2AX na profilach ChIP-chip. Tutaj pokazujemy że te domeny γ-H2AX różnią się od tych indukowanych przez kamptotecynę, inhibitor inhibitor Top1 indukujący dwuniciowe pęknięcia DNA w całym genomie. Te dane potwierdzają pogląd, że pętle R promują niestabilność genomu w określonych miejscach poprzez blokowanie progresji widełek i indukowanie pęknięć chromosomów. Czy ten typ zatrzymanie widełek zależne od transkrypcji przyczynia się do stresu replikacyjnego replikacyjnego obserwowanego w zmianach przedrakowych jest ważnym pytaniem, które zasługuje na dalszą uwagę. uwagę.
Czy pętle R mają tendencję do tworzenia się w miejscach replikacji DNA?
Pętle R kolokalizują z ORC w tym samym regionie wyspy CpG w znacznej części tych wydajnych miejsc inicjacji replikacji. Fizjologiczne tworzenie pętli R w promotorach wysp CpG może przyczyniać się do specyfikacji pochodzenia replikacji DNA w tych regionach, najbardziej wydajnych miejscach inicjacji replikacji w komórkach ssaków. Jednym z mechanizmów może być to, że po zablokowaniu replikacji, RNA w pętlach R jest wydłużane przez polimerazę DNA I, otwierając dupleks DNA i prowadząc do rekrutacji repliksomu. Pozwoliłoby to na kontynuowanie replikacji, podczas gdy pierwotny blok jest naprawiany lub omijany. Tak więc zorganizowana struktura pętli R ma kluczowe znaczenie dla funkcji startera RNA in vivo, co ma istotne implikacje dla mechanizmów przetwarzania RNA i replikacji DNA.