Wirusowe interakcje RNA-białko gospodarza mają kluczowe znaczenie dla replikacji flawiwirusy, rodzaj wirusów RNA o dodatniej nici, obejmujący główne przenoszone przez wektory ludzkie patogeny, w tym wirusy dengi (DENV). Zbadaliśmy trzy konserwatywne białka wiążące RNA gospodarza (RBP) G3BP1, G3BP2 i CAPRIN1 w zakażeniu wirusem dengi (DENV-2) i odkryliśmy, że są one nowymi regulatorami odpowiedzi interferonu (IFN) przeciwko DENV-2. Trzy RBP były wymagane do akumulacji produktów białkowych kilku genów stymulowanych interferonem (ISG) oraz do wydajnej translacji mRNA PKR i IFITM2. Identyfikuje to G3BP1, G3BP2 i CAPRIN1 jako nowe regulatory stanu przeciwwirusowego. Ich aktywność przeciwwirusowa była antagonizowana przez obfity niekodujący subgenomowy flawiwirusowy RNA (sfRNA) DENV-2, który wiązał się z G3BP1, G3BP2 i CAPRIN1, hamował ich aktywność i prowadził do głębokiego zahamowania translacji mRNA ISG. Ta praca opisuje nowy i nieoczekiwany poziom regulacji nieoczekiwany poziom regulacji ekspresji genów stymulowanych przez interferon i przedstawia pierwszy mechanizm działania sfRNA jako molekularnej gąbki przeciwwirusowych efektorów w ludzkich komórkach. --- Po ekspozycji na różne stresy środowiskowe, takie jak arsenit, niedotlenienie i szok cieplny, komórki szok termiczny, komórki hamują ich translację i apoptozę, a następnie naprawiają zmiany wywołane stresem, takie jak uszkodzenie DNA i akumulacja nieprawidłowo sfałdowanych białek. białek. Tego typu stresy indukują powstawanie cytoplazmatycznych granulek RNA zwanych granulkami stresu (SGs). SG są miejscami przechowywania wielu mRNA uwalnianych ze zdemontowanych polisomów w tych warunkach stresowych i są niezbędne do selektywnej translacji genów indukowanych stresem. Białko wiążące domenę SH3 białka aktywującego Ras-GTPazę 1 (G3BP1) jest składnikiem składnikiem SG, który inicjuje montaż SG poprzez utworzenie multimeru. W W tym badaniu zbadaliśmy rolę G3BP2, bliskiego krewnego G3BP1, w tworzeniu SG formacji. Chociaż pojedynczy knockdown G3BP1 lub G3BP2 w komórkach 293T częściowo zmniejszyło liczbę komórek SG-pozytywnych indukowanych przez arsenin, nokauty obu genów knockdown obu genów znacząco zmniejszył tę liczbę. G3BP2 tworzył homo-multimer i hetero-multimer z G3BP1. Ponadto, podobnie jak G3BP1, nadekspresja nadekspresja G3BP2 indukowała SG nawet bez bodźców stresowych. Łącznie, te wyniki sugerują, że zarówno G3BP1, jak i G3BP2 odgrywają rolę w tworzeniu SG w różnych komórkach ludzkich, a tym samym w regeneracji po stresie komórkowym. --- TŁO: Regulacja mRNA jest jednym ze sposobów kontrolowania poziomów białek, a tym samym ważnych procesów komórkowych, takich jak wzrost, inwazja i apoptoza. G3BP stanowią rodzinę białek wiążących mRNA, których nadekspresję wykazano w kilku typach nowotworów, w tym w raku piersi, okrężnicy i trzustki. G3BP zostały zarówno stabilizować, jak i indukować degradację określonych mRNA. WYNIKI: Tutaj pokazujemy, że G3BP1, ale nie G3BP2, wspiera proliferację kilku linii komórkowych raka piersi. kilku linii komórkowych raka piersi. Globalne analizy ekspresji genów G3BP1- i G3BP2 wskazują, że przede wszystkim G3BP1, a znacznie mniej G3BP2, wpływa na poziom ekspresji mRNA. Białko mieliny obwodowej 22 (PMP22) było jednym genem, na który znacząco wpłynęła deplecja G3BP1, co doprowadziło do 2-3-krotnego wzrostu ekspresji. krotnie zwiększonej ekspresji. Zubożenie PMP22 skutkowało zwiększoną proliferacją i G3BP1. proliferacji, a wpływ na proliferację, w którym pośredniczy G3BP1, nie był widoczny po Zubożenie PMP22. WNIOSKI: Wskazuje to na nową rolę G3BP1 w regulacji proliferacji komórek raka piersi. proliferacji w komórkach raka piersi, być może poprzez regulacyjny wpływ na ekspresję PMP22 ekspresję. --- Wirus Sindbis (SINV) jest prototypowym przedstawicielem rodzaju Alphavirus, którego członkowie powodują poważne choroby u ludzi, na które nie ma specyficznego leczenia. Aby ustalić czynniki gospodarza ważne w replikacji genomu RNA SINV, my wygenerowaliśmy SINV wyrażający nsP4, wirusową polimerazę RNA zależną od RNA, z znacznikiem epitopowym 3xFlag. Analiza proteomiczna kompleksów zawierających nsP4 wyizolowanych z komórek zakażonych oznaczonym wirusem ujawniła 29 powiązanych białek gospodarza białek gospodarza. Spośród nich 10 białek było związanych tylko w późniejszym czasie infekcji (12 h), 14 było związanych z białkami gospodarza. infekcji (12 godzin), 14 było związanych zarówno wcześnie, jak i późno, a pięć zostało wyizolowanych tylko we wcześniejszym czasie (6 godzin po zakażeniu). Wyniki te pokazują dynamiczny charakter interakcji wirus-gospodarz, która zachodzi w trakcie infekcji infekcji i sugerują, że różne białka gospodarza mogą być wymagane dla wielu funkcji pełnionych przez nsP4. Dwa pokrewne białka znalezione w z nsP4 w obu okresach infekcji, białko aktywujące GTPazę (domena SH3 białko wiążące GTPazę (domena SH3) 1 (G3BP1) i G3BP2 zostały również wcześniej zidentyfikowane jako związane z SINV nsP2 i nsP3. Wykazujemy prawdopodobnie nakładającą się rolę tych czynników gospodarza w ograniczaniu zdarzeń replikacji SINV. Niniejsze badanie również identyfikuje 10 czynników gospodarza związanych z nsP4 6 godzin po zakażeniu, które były nie okazały się być związane z nsP2 lub nsP3. Czynniki te są kandydatami do odgrywają ważną rolę w procesie replikacji RNA. Identyfikacja czynników gospodarza niezbędnych do replikacji powinno prowadzić do nowych strategii przerywania replikacji alfawirusa. replikację. --- Wirus dengi (DENV) to szybko powracający flawiwirus, który wywołuje gorączkę denga (DF), gorączkę krwotoczną denga (DHF) i zespół wstrząsu denga (DSS). (DF), gorączkę krwotoczną denga (DHF) i zespół wstrząsu denga (DSS), choroby, na które nie ma dostępnych terapii ani szczepionek. na które nie ma dostępnych terapii ani szczepionek.  Genom DENV-2 pozytywny genom RNA zawiera 5' i 3' regiony nieulegające translacji (UTR), które wykazano, że tworzą struktury drugorzędowe wymagane do replikacji wirusa i interakcji z białkami komórek gospodarza.  W celu kompleksowej identyfikacji czynników czynniki komórkowe, które wiążą UTR DENV-2, wykonaliśmy chromatografię RNA, używając 5' i 3' UTR DENV-2 jako "przynętę", w połączeniu z ilościową spektrometrią masową spektrometrią mas.  Zidentyfikowaliśmy kilka białek, w tym DDX6, G3BP1, G3BP2, Caprin1 i USP10, zaangażowanych w funkcję ciała P (PB) i granul stresu (SG), i o których wcześniej nie było wiadomo, że wiążą RNA DENV.  Pośrednia immunofluorescencja mikroskopia wykazała, że białka te kolokalizują z kompleksem replikacyjnym DENV kompleksem replikacyjnym DENV.  Co więcej, knockdown DDX6 spowodował zmniejszenie ilości zakaźnych cząstek i wirusowego RNA w supernatantach hodowli tkankowej po zakażeniu DENV. DDX6 oddziaływał z RNA DENV in vivo podczas infekcji, a in vitro ta interakcja interakcja była pośredniczona przez struktury DB1 i DB2 w 3' UTR, prawdopodobnie poprzez tworzenie struktury pseudoknota.  Dodatkowe eksperymenty pokazują że w przeciwieństwie do DDX6, białka SG G3BP1, G3BP2, Caprin1 i USP10 wiążą się z regionem zmiennym (VR) w 3' UTR. do regionu zmiennego (VR) w 3' UTR.  Wyniki te sugerują, że DENV-2 3' UTR jest miejscem montażu białek PB i SG, a dla DDX6, montaż na 3' UTR jest wymagany do replikacji DENV. --- Białka wiążące domenę SH3 białka aktywującego Ras-GTPazę (G3BP) są ulegają nadekspresji w różnych ludzkich nowotworach i uczestniczą w kilku szlakach sygnałowych zaangażowanych we wzrost, różnicowanie i apoptozę. G3BP oddziałują z RasGAP (białko aktywujące Ras-GTPazę) tylko w rosnących komórkach i zależą od aktywacji Ras i uczestniczą w szlaku sygnałowym Ras. Dlatego blokada i obniżenie poziomu G3BP może być nową strategią w terapii nowotworów. W niniejszym raporcie wykazaliśmy, że nowy peptyd GAP161 blokował funkcje G3BP i znacząco hamował wzrost komórek HCT116 poprzez indukcję apoptozy. Peptyd wiązał się z G3BP, co zakłócało interakcję G3BP1 z RasGAP i dodatkowo hamował szlaki sygnałowe Ras. GAP161 regulował w dół białka G3BP1 i G3BP2. Podobnie, nokaut G3BP znacznie zmniejszył proliferację HCT11. proliferację komórek HCT116 i hamowała szlaki sygnałowe Ras. Ponadto, obniżenie poziomu G3BP może nasilać apoptozę indukowaną cisplatyną i hamować wzrost komórek HCT116. hamowanie wzrostu komórek HCT116. Stwierdziliśmy również, że GAP161 hamował wzrost myszy BALB/c noszących guzy okrężnicy CT26 i nagich myszy noszących ksenografty HCT116. Wyniki te sugerują, że regulacja w dół G3BP może być przydatna w terapii raka terapii i że GAP161 jest obiecującym nowym środkiem terapeutycznym dla nowotworów.
Jakie są główne funkcje białek G3BP1 i G3BP2?
Główne funkcje G3BP1 i/lub G3BP2 obejmują translację mRNA stymulowanego interferonem podczas zakażenia wirusem dengi, inicjację montażu granulek stresu, regulację mRNA PMP22, który, jak stwierdzono, wpływa na proliferację komórek raka piersi, udział w kilku szlakach sygnałowych zaangażowanych we wzrost, różnicowanie i apoptozę w ludzkich komórkach nowotworowych po nadekspresji, ograniczenie zdarzeń replikacji wirusa podczas zakażenia wirusem Sindbis (SINV) oraz modulację aktywności p53 i MDM2.