Wycięcie intronów z powstających transkryptów eukariotycznych jest katalizowane przez spliceosom, wysoce złożoną i dynamiczną maszynę makromolekularną złożoną z RNA i białka. Ze względu na swoją złożoność, analiza biochemiczna spliceosomu była wcześniej ograniczona do testów masowych w głównie niefrakcjonowanych ekstraktach komórkowych. ekstraktach komórkowych. Obecnie donosimy o opracowaniu metodologii badania splicingu izolowanych pojedynczych cząsteczek pre-mRNA w czasie rzeczywistym. W tym systemie fluorescencyjnie znakowany pre-mRNA jest przywiązany do szklanej powierzchni poprzez swój 3'-koniec. Splicing można obserwować w ekstrakcie z całych komórek Saccharomyces cerevisiae poprzez monitorowanie utraty fluorescencji specyficznej dla intronu za pomocą fluorescencji z całkowitym mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym odbiciem wewnętrznym (TIRF). Aby przedłużyć żywotność fluoroforu żywotność, opracowano również dwa systemy zmiatania O2 oparte na enzymach, kompatybilne ze splicingiem. również opracowane. Praca ta zapewnia nowe, potężne podejście do wyjaśnienia mechanizmów funkcjonowania spliceosomu i demonstruje wykonalność wykorzystania mikroskopii mikroskopii TIRF do badań biochemicznych pojedynczych cząsteczek w wysoce złożonych środowiskach. środowiskach. --- TŁO: Splicing i alternatywny splicing to dwa kluczowe procesy biologiczne które skutkują generowaniem różnorodnych izoform transkryptów i białek w Plasmodium falciparum, a także w innych organizmach eukariotycznych. Niewiele wiadomo na temat niewiele wiadomo na temat organizacji i mechanizmów splicingu u człowieka pasożyta malarii. W niniejszym badaniu opisano organizację i montaż Plasmodium spliceosome Sm core complex. METODY: Obecność wszystkich siedmiu białek podobnych do Plasmodium Sm w stadiach etapach wewnątrzerytrocytarnych oceniano na podstawie ekspresji białka (białek) przy użyciu immunolokalizacji i western blottingu. Badania lokalizacji/współlokalizacji przeprowadzono metodą immunofluorescencji na cienkich rozmazach pasożytów przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Badania interakcji przeprowadzono przy użyciu analizy dwuhybrydowej drożdży i zweryfikowane przez testy ściągania in vitro. PfPRMT5 (metylotransferaza argininy) i PfSmD1 przeprowadzono metodą pull-down, a oddziałujące białka zidentyfikowano metodą oddziałujące białka zidentyfikowano za pomocą spektrometrii MALDI-TOF. WYNIKI: Białka PfSm ulegają ekspresji w bezpłciowych stadiach rozwojowych pasożyta. wykazują lokalizację nukleo-cytoplazmatyczną. Badania interakcji białko-białko wykazały że białka PfSm tworzą heptameryczny kompleks, typowy dla rdzenia spliceosomu kompleks, jak pokazano u ludzi. Interakcja PfSMN (przeżycie neuronu ruchowego, białko zawierające domenę Tudora) lub PfTu-TSN (domena Tudora nukleazy gronkowcowej Tudor nukleazy gronkowcowej) z białkami PfSmD1 była zależna od metylacji zależną od metylacji. Ko-lokalizacja przez immunofluorescencję i ko-immunoprecypitację badania sugerują związek między PfPRMT5 i PfSmD1, wskazując na rolę metylacji argininy w montażu kompleksu spliceosomu Plasmodium. WNIOSKI: Białka podobne do Sm Plasmodium tworzą heptameryczną strukturę pierścieniową, chociaż układ białek PfSm nieznacznie różni się od ludzkiego splicingu maszyn. Dane wskazują na interakcję PfSMN z PfSmD1 i tę interakcja jest zależna od metylacji. PfPRMT5 prawdopodobnie istnieje jako część kompleksu metylosomowego, który może funkcjonować w cytoplazmatycznym montażu białek Sm w bezpłciowych stadiach rozwojowych P. falciparum. --- Spliceosomy są makrokompleksami obejmującymi setki białek z wieloma funkcjonalnymi interakcjami. funkcjonalnymi interakcjami. Montaż spliceosomu należy do kluczowych procesów, które umożliwiają splicing mRNA i modulują alternatywny splicing. Szczegółowa lista czynników zaangażowanych w reakcje spliceosomalne została opracowana w ciągu ostatniej dekady. w ciągu ostatniej dekady, ale ich funkcjonalne wzajemne oddziaływanie jest często nieznane, a większość obecnych modeli biologicznych modeli biologicznych obejmuje tylko część kompletnego procesu składania. Jest to trudnym zadaniem jest zbudowanie modelu obliczeniowego, który integruje rozproszoną wiedzę rozproszoną wiedzę i łączy w sobie wiele zaproponowanych wcześniej schematów reakcji. ponieważ dla większości reakcji zaangażowanych w montaż spliceosomu parametry kinetyczne nie są dostępne. parametry kinetyczne nie są dostępne, proponujemy modelowanie dyskretne z wykorzystaniem sieci Petriego, dzięki któremu jesteśmy w stanie wgląd w zachowanie systemu poprzez obliczanie właściwości strukturalnych i dynamicznych. i właściwości dynamicznych. W tym artykule zestawiamy i badamy reakcje z raportów eksperymentalnych, które przyczyniają się do powstania funkcjonalnego spliceosomu. Wszystkie te reakcje tworzą sieć, która opisuje zasoby i warunki niezbędne do przeprowadzenia procesu splicingu. do przeprowadzenia procesu splicingu. Analiza opiera się głównie na niezmiennikach. Warianty przejścia (T-invariants) mogą być interpretowane jako sygnalizacja trasy sygnalizacyjne przez sieć. Ze względu na ogromną liczbę wariantów T, które powstają wraz ze wzrostem rozmiaru i złożoności sieci, maksymalne wspólne zestawy przejść (MCTS) i klastry T zostały wykorzystane do dalszej analizy. Dodatkowo wprowadziliśmy reprezentację mapy fałszywych kolorów, która pozwala na szybki przegląd modułów sieciowych i wizualne wykrywanie pojedynczych reakcji lub sekwencji reakcji, które uczestniczą w więcej niż jednym szlaku sygnalizacyjnym. Zaprojektowaliśmy strukturalny model spliceosomu, który łączy wymagania dotyczące platformy, która i) może i) może wyświetlać zaangażowane czynniki i współbieżne procesy, ii) oferuje możliwość uruchomić metody obliczeniowe do ekstrakcji wiedzy, oraz iii) jest sukcesywnie rozszerzalna, ponieważ nowe spostrzeżenia na temat funkcji spliceosomu są zgłaszane przez eksperymentalne. Sieć składa się z 161 przejść (reakcji) i 140 miejsc (reagentów). Wszystkie reakcje są częścią co najmniej jednego z 71 wariantów wariantów T. Te warianty T definiują ścieżki, które są zgodne z obecną wiedzą i znanymi hipotezami na temat reakcji. z obecną wiedzą i znanymi hipotezami na temat sekwencji reakcji podczas spliceosomu, przyczyniając się tym samym do powstania funkcjonalnego spliceosomu. My wykazujemy, że obecna wiedza, w szczególności dotycząca początkowej części procesu składania opisuje równoległość i interakcję szlaków sygnalizacyjnych, które wskazują na funkcjonalną redundancję i odzwierciedlają zależność inicjacji montażu spliceosomu od różnych warunków komórkowych. Złożoność sieci jest dodatkowo zwiększona przez dwa przełączniki, które wprowadzają alternatywne trasy podczas formowania kompleksu A we wczesnym etapie składania spliceosomu i po przejściu z kompleksu z kompleksu B do kompleksu C. Poprzez kompilację znanych reakcji w kompletną sieć, kombinatoryczny charakter niezmiennych obliczeń prowadzi do ścieżek, które wcześniej nie były opisane jako połączone szlaki, chociaż ich składniki były znane. Klastry T dzielą sieć na moduły, które interpretujemy jako bloki konstrukcyjne w dojrzewaniu spliceosomu. Doszliśmy do wniosku, że Reprezentacje sieci Petriego dużych sieci biologicznych i niezmienniki systemu, dobrze nadają się jako środek do walidacji integracji wiedzy eksperymentalnej w spójny model. wiedzy eksperymentalnej w spójny model. W oparciu o ten model sieci, projektowanie dalszych eksperymentów jest ułatwione. --- Splicing jest kluczowym, wszechobecnym i wysoce złożonym etapem ekspresji genów eukariotycznych. ekspresji genów eukotycznych. Zaskakująca złożoność reakcji splicingu, choć fascynująca fascynująca, poważnie ograniczyła nasze zrozumienie jej mechanistycznych szczegółów. Ostatnie postępy zaczęły dostarczać nowych, ekscytujących informacji na temat dynamicznych interakcje, które regulują funkcję spliceosomu, wielomegadaltonowego kompleksu kompleksu, który wykonuje splicing. Wyłaniającym się paradygmatem jest obecność różnych stanów konformacyjnych, które są stabilizowane przez skomplikowaną sieć interakcji. przez skomplikowaną sieć interakcji. Ostatnie dane sugerują, że nawet subtelne zmiany w składzie sieci interakcji mogą powodować interkonwersję różnych stanów konformacyjnych, zapewniając możliwości różnych stanów konformacyjnych, zapewniając możliwości regulacji i regulacji i korekty funkcji spliceosomu. Znaczący postęp w proteomice pozwolił wyjaśnił skład białkowy spliceosomu na różnych etapach montażu. montażu. Ponadto, zwiększone wyrafinowanie i rozdzielczość technik mikroskopii krioelektronowej mikroskopii krioelektronowej, w połączeniu z badaniami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości na w mniejszej skali, obiecują stworzenie szczegółowych obrazów globalnej struktury spliceosomu i jego głównych składników. spliceosomu i jego głównych składników, co z kolei dostarczy mnóstwa wglądów mechanistycznych. Ogólnie rzecz biorąc, w ciągu ostatnich dwóch lat nastąpiła konwergencja danych z różnych linii badawczych w coś, co zapowiada się na holistyczny obraz funkcji spliceosomu. całościowy obraz funkcji spliceosomu. --- Mechanizm spliceosomu składa się z multimerycznych kompleksów białkowych, które generują zróżnicowany repertuar mRNA poprzez skoordynowany splicing heterojądrowych RNA. Podczas gdy mutacje somatyczne w składnikach spliceosomu zostały odkryto w kilku typach nowotworów, podstawy molekularne i konsekwencje aberracji spliceosomu w nowotworach są słabo poznane. Tutaj po raz po raz pierwszy, że PRPF6, członek tri-snRNP (małej rybonukleoproteiny) kompleksu spliceosomu, napędza proliferację raka poprzez preferencyjne splicingowanie genów związanych z regulacją wzrostu. Zahamowanie PRPF6 i innych białek kompleksu tri-snRNP ale nie innych kompleksów spliceosomowych snRNP, selektywnie selektywnie hamowało wzrost komórek nowotworowych o wysokim poziomie tri-snRNP. Analizy transkryptomu o wysokiej rozdzielczości analizy transkryptomu ujawniły, że zmniejszone PRPF6 zmienia konstytutywne i alternatywny splicing dyskretnej liczby genów, w tym onkogennej izoformy kinazy ZAK. Odkrycia te wskazują na istotną rolę PRPF6 w raku poprzez splicing różnych produktów genowych związanych ze wzrostem.
Jaka jest funkcja kompleksu spliceosomu?
Wycięcie intronów z powstających transkryptów eukariotycznych jest katalizowane przez spliceosom, wysoce złożoną i dynamiczną maszynę makromolekularną składającą się z RNA i białka.