TŁO: Kanoniczna sygnalizacja Notch jest inicjowana, gdy wiązanie ligandu indukuje proteolityczne uwalnianie wewnątrzkomórkowej części Notch (ICN) z błony komórkowej. błony komórkowej. ICN następnie przemieszcza się do jądra, gdzie napędza montaż kompleksu aktywacji transkrypcji kompleksu aktywacji transkrypcji zawierającego wiążący DNA czynnik transkrypcyjny czynnik transkrypcyjny CSL, ICN i wyspecjalizowany koaktywator z rodziny Mastermind. A motyw miejsca wiązania DNA dla białka CSL został wcześniej zdefiniowany przy użyciu metod opartych na selekcji, ale to, czy późniejsze połączenie Notch i Mastermind wpływa na preferencje wiązania DNA przez CSL nie zostało wcześniej wcześniej badane. GŁÓWNE WYNIKI: Tutaj wykorzystaliśmy mikromacierze wiążące białka (PBM) do porównać preferencje miejsca wiązania izolowanego CSL z preferowanymi miejscami wiązania miejsca CSL po związaniu z domenami wiążącymi CSL wszystkich czterech różnych ludzkich receptorów Notch. ludzkich receptorów Notch. Pomiary wykonano zarówno pod nieobecność, jak i w obecności Mastermind-like-1 (MAML1). Nasze dane nie wykazują wykrywalnej różnicy w preferencjach miejsca wiązania DNA preferencji miejsca wiązania CSL przed i po załadowaniu białek Notch i MAML1 białek. WNIOSKI/ZNACZENIE: Odkrycia te potwierdzają wniosek, że akumulacja białek Notch i MAML1 promują aktywację transkrypcji bez dramatycznej zmiany preferowanych miejsc wiązania DNA i ilustrują potencjał PBM do analizy preferencji miejsc wiązania kompleksów wielobiałkowych-DNA. --- Szlak sygnałowy Notch pełni kluczową funkcję w określaniu losów komórek w wielu tkankach organizmów wielu tkankach organizmów metazoicznych. Po związaniu z ligandami receptor Notch jest rozszczepiany proteolitycznie i uwalnia swoją domenę wewnątrzkomórkową (NotchICD). NotchICD wchodzi do jądra i działa kooperatywnie z innymi czynnikami, stymulując transkrypcję. czynnikami, stymulując transkrypcję genów docelowych. Wysoki poziom aktywacji transkrypcji za pośrednictwem Notch wymaga utworzenia trójskładnikowego kompleksu składającego się z trójskładnikowego kompleksu składającego się z NotchICD, CSL (CBF-1, supresor bezwłosych, LAG-1) i członka rodziny członka rodziny Mastermind. Jednak nadal nie jest jasne, w jaki sposób regulowane jest tworzenie trójskładnikowego kompleksu jest regulowane. Tutaj pokazujemy, że kinaza Nemo-podobna (NLK) negatywnie reguluje zależną od Notch aktywację transkrypcyjną poprzez zmniejszenie tworzenie tego trójskładnikowego kompleksu. Wykorzystując badania biochemiczne, zidentyfikowaliśmy Notch jako nowy substrat NLK. Fosforylowany przez NLK Notch1ICD jest upośledzony w swojej zdolność do tworzenia aktywnego transkrypcyjnie kompleksu trójskładnikowego. Ponadto, knockdown NLK prowadzi do hiperaktywacji sygnalizacji Notch i w konsekwencji zmniejsza neurogenezę u danio pręgowanego. Nasze wyniki zarówno definiują nową funkcję dla NLK i ujawniają wcześniej niezidentyfikowany sposób regulacji w szlaku sygnałowym Notch szlaku sygnałowego Notch. --- Receptory transbłonowe Notch kierują istotnymi procesami komórkowymi, takimi jak proliferacja i różnicowanie, poprzez bezpośrednie interakcje między komórkami. Niewłaściwe uwolnienie wewnątrzkomórkowej domeny Notch (N(ICD)) z błony komórkowej z błony plazmatycznej skutkuje akumulacją rozregulowanego jądrowego N(ICD), który została powiązana z ludzkimi nowotworami, w szczególności z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek T (T-ALL). Jądrowy N(ICD) tworzy kompleks aktywujący transkrypcję poprzez oddziaływanie z białkiem koaktywatora Mastermind-like 1 i białkiem wiążącym DNA CSL (dla CBF-1/Suppressor of Hairless/Lag-1) w celu regulacji ekspresji genów docelowych. ekspresji. Chociaż dobrze wiadomo, że N(ICD) tworzy kompleks aktywujący transkrypcję kompleks aktywacji transkrypcji, niewiele wiadomo o tym, jak kompleks jest montowany. W tym badaniu wykazaliśmy, że N(ICD) multimeryzuje i że te multimery funkcjonują jako prekursory dla stopniowego montażu kompleksu aktywacyjnego Notch. Co ważne, wykazujemy, że w montażu pośredniczą multimery N(ICD) oddziałujące ze Skip i Mastermind. Interakcje te tworzą kompleks kompleks, który jest następnie rozwiązywany przez CSL w celu utworzenia kompleksu aktywacji transkrypcyjnej Notch na DNA. --- Szlak Notch to mechanizm sygnalizacyjny krótkiego zasięgu między sąsiednimi komórkami który powoduje zmiany w ekspresji genów. Pozakomórkowe interakcje między receptorami receptorami Notch i ligandami wyzwalają proteolityczne rozszczepienie receptora Notch. Po rozszczepieniu, uwolniona wewnątrzkomórkowa domena Notch (NotchIC) przemieszcza się z cytoplazmy do jądra komórkowego. cytoplazmy do jądra, angażując wiążący DNA czynnik transkrypcyjny CBF-1, Su(H), Lag-1 (CSL) - jądrowy efektor szlaku. NotchIC, wraz z koaktywatorem transkrypcji Mastermind, tworzą trójskładnikowy kompleks z CSL, który aktywuje transkrypcję genów reagujących na sygnalizację Notch sygnalizację. Oświetlenie szczegółów molekularnych, które leżą u podstaw tworzenia aktywnego transkrypcyjnie trójskładnikowego kompleksu CSL-NotchIC-Mastermind jest kluczem do zrozumienia, w jaki sposób geny są włączane w odpowiedzi na sygnał Notch. Ostatnio, kilka badań z wykorzystaniem metod biofizycznych i obliczeniowych zbadało, w jaki sposób trójskładnikowy kompleks CSL-NotchIC-Mastermind i rolę poszczególnych domen w tym procesie. odgrywają w tym procesie. Te szczegółowe analizy dostarczyły wielu molekularnego wglądu w montaż aktywnego kompleksu transkrypcyjnego szlaku Notch ale także podniosły kilka intrygujących, ale kłopotliwych pytań. Niniejszy przegląd skupi się na wynikach tych ostatnich badań biofizycznych i spekulatywnych modelach, które odpowiadają na te pytania bez odpowiedzi. --- Mastermind (Mam) jest składnikiem sygnalizacji szlaku Notch. W połączeniu z wewnątrzkomórkową domeną Notch i Suppressor of Hairless, Mam tworzy kompleks aktywacji transkrypcji kompleks aktywujący transkrypcję. Zainicjowaliśmy genetyczne podejście do zidentyfikować inne loci zaangażowane w funkcję Mam. Ekran wykorzystuje zmodyfikowane mutacje mutacje w Mam, które pochodzą z ekspresji dominujących negatywnych konstruktów GAL4-UAS. negatywnych konstruktów. Po wysterowaniu na brzegu skrzydła, skrócone wersje Mam fenokopiują mutacje szlaku Notch. Z tymi fenotypami skorelowana jest depresja docelowej ekspresji szlaku Notch. Szczepy wyrażające skrócone Mam zostały przetestowane pod kątem interakcji genetycznych z dużą kolekcją niedoborami chromosomalnymi. Zidentyfikowano segmenty genomowe, które wzmacniały i tłumiły dominujący fenotyp skrzydła. dominujący fenotyp skrzydła. Regiony te mogą zawierać niescharakteryzowane loci zaangażowane w funkcję szlaku Notch. --- W rozwijającym się ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) sygnalizacja Notch zachowuje progenitorów i hamuje neurogenezę oraz różnicowanie oligodendrogleju. Niedawno postulowano, że Notch instruktywnie napędza różnicowanie astrocytów. różnicowanie astrocytów. Czy rola sygnalizacji Notch w promowaniu różnicowania astrogleju jest w promowaniu różnicowania astrogleju jest permisywna lub instruktywna. Przedstawiamy tutaj że w astrogliogennej roli Notch częściowo pośredniczy bezpośrednie wiązanie domeny wewnątrzkomórkowej domeny wewnątrzkomórkowej Notch do białka wiążącego DNA CSL, tworząc kompleks aktywujący kompleks aktywacji transkrypcji na genie markera astrocytów, glejowym kwaśne białko fibrylarne (GFAP). Ponadto odkryliśmy, że w kulturach neuronalnych komórek macierzystych CSL-/- neuronalnych komórkach macierzystych różnicowanie astrocytów było opóźnione, ale kontynuowane w normalnym tempie po zainicjowaniu, co sugeruje, że CSL jest zaangażowany w regulację początek astrogliogenezy. Co ważne, chociaż klasyczny, zależny od CSL szlak sygnałowy szlak sygnałowy Notch jest nienaruszony i zdolny do aktywacji kanonicznego promotora Notch podczas fazy neurogennej, nie jest w stanie aktywować promotora GFAP podczas neurogenezy. podczas neurogenezy. Dlatego też wpływ sygnalizacji Notch na docelowe geny geny wpływa kontekst komórkowy w regulacji neurogenezy i gliogenezy. gliogenezy. --- Wiązanie ligandu przez receptory Notch wyzwala serię cięć proteolitycznych, które uwalniają wewnątrzkomórkową część Notch (ICN). które uwalniają wewnątrzkomórkową część Notch (ICN) z błony komórkowej, umożliwiając jej translokację do jądra. Jądrowy ICN wiąże się z wysoce czynnikiem transkrypcyjnym wiążącym DNA o nazwie CSL (znanym również jako RBP-Jkappa, CBF1, Suppressor of Hairless i Lag-1) i rekrutuje podobne do Masterminda w celu utworzenia kompleksu aktywacji transkrypcji. Korzystając z narzędzi bioinformatycznych, zidentyfikowaliśmy region homologii Rel (RHR) w CSL który został wykorzystany jako przewodnik do określenia minimalnych wymagań białkowych dla tworzenia kompleksu trójskładnikowego. RHR CSL zawiera zarówno N-, jak i C-końcowe domeny domeny beta-arkuszowe (RHR-n i RHR-c) typowych czynników transkrypcyjnych Rel, jak oceniane przez widma dichroizmu kołowego. Wiązanie monomerycznego CSL z DNA wymaga całego RHR CSL i dodatkowej 125-residue N-końcowej sekwencji, podczas gdy wiązanie z ICN wymaga tylko domeny RHR-n. Chociaż RAM (RBP-Jkappa (białko wiążące sygnał rekombinacji z sekwencją dla genów Jkappa), domena ICN cząsteczka) domeny ICN jest elastyczna i stosunkowo niestrukturalna jako izolowany polipeptyd w roztworze. polipeptyd w roztworze, stabilnie wiąże się z CSL na DNA. Rekrutacja Mastermind-like 1 (MAML1) do kompleksów CSL.ICN na DNA wymaga włączenia domeny powtarzalnej domeny powtórzenia ankyryny ICN oraz N- i C-końcowych sekwencji CSL rozciągających się poza regionem wiążącym DNA. Wymóg kooperatywnego montażu kompleksów MAML1.ICN.CSL.DNA sugeruje, że podstawową funkcją ICN jest renderowanie CSL kompetentnym do ładowania MAML. Na podstawie naszych wyników przedstawiamy działający model strukturalny dla organizacji kompleksu MAML1.ICN.CSL.DNA. --- Domena wewnątrzkomórkowa Notch (NICD) tworzy kompleks aktywujący transkrypcję z czynnikiem wiążącym DNA CSL i koaktywatorem transkrypcji z rodziny Mastermind (MAML). Region "RAM" NICD rekrutuje Notch do CSL, ułatwiając wiązanie MAML na interfejsie między ankyryną (ANK) NICD i CSL. Tutaj przedstawiamy strukturę rentgenowską ludzkiego białka MAML1/RAM/ANK/CSL/DNA i sondujemy zmiany w dynamice komponentów po stopniowe składanie kompleksu MAML1/NICD/CSL przy użyciu HX-MS. Asocjacja CSL z NICD wywiera wyjątkowo niewielki wpływ na kinetykę wymiany domeny ANK domeny, podczas gdy wiązanie MAML1 znacznie opóźnia kinetykę wymiany ANK powtórzenia 2-3. Te wzorce wymiany identyfikują krytyczne cechy przyczyniające się do kooperatywnego montażu kompleksów transkrypcyjnych Notch (NTC), podkreślają znaczenie rekrutacji MAML w usztywnianiu domeny ANK i stabilizowaniu jej interfejs z CSL i zracjonalizować wymóg dla MAML1 w prowadzeniu kooperatywnej dimeryzacji NTC na sparowanym DNA. --- Indukowana ligandem proteoliza Notch wytwarza wewnątrzkomórkową domenę efektorową która przekazuje istotne sygnały poprzez regulację transkrypcji docelowych genów genów. Funkcja ta opiera się na tworzeniu kompleksów aktywacji transkrypcji aktywacji transkrypcji, które obejmują wewnątrzkomórkowy Notch, koaktywator Mastermind i czynnik czynnik transkrypcyjny CSL związany z kognatycznym DNA. Kompleksy te tworzą zespoły wyższego rzędu na sparowanych miejscach rozpoznawania CSL. Tutaj przedstawiamy strukturę rentgenowską dimerycznego ludzkiego kompleksu transkrypcyjnego Notch1 załadowanego na sparowanym miejscu z ludzkiego promotora HES1. Mały interfejs między domenami Notch ankyrin może pomieścić zginanie i odkręcanie DNA, aby umożliwić zakres między dwoma miejscami. Kooperatywna dimeryzacja wystąpiła na ludzkich i mysich promotorach Hes5 w sekwencji, która odbiegała od konsensusu wiązania CSL w jednym z miejsc. Badania te ujawniają, w jaki sposób cechy organizacyjne promotora cechy kontrolują kooperatywność, a tym samym reaktywność różnych promotorów na sygnalizację promotorów na sygnalizację Notch. --- Receptory Notch przekazują istotne sygnały rozwojowe między sąsiednimi komórkami poprzez tworzenie kompleksu, który prowadzi do transkrypcji genów docelowych po aktywacji. aktywacji. Przedstawiamy tutaj strukturę krystaliczną kompleksu aktywującego transkrypcję Notch zawierającego domenę ankyrynową ludzkiego Notch1 (ANK), czynnika transkrypcyjnego czynnik transkrypcyjny CSL na kognatycznym DNA i polipeptyd z koaktywatora Mastermind-like-1 (MAML-1). CSL i ANK razem tworzą rowek wiążący polipeptyd polipeptyd MAML-1 w postaci zagiętej helisy 70A. Złożona powierzchnia wiążąca prawdopodobnie ogranicza rekrutację białek MAML do promotorów, na których kompleksy Notch:CSL zostały wstępnie zmontowane, zapewniając ścisłą kontrolę transkrypcji genów docelowych Notch. genów docelowych Notch.
Które białka uczestniczą w tworzeniu kompleksu aktywacji transkrypcji Notch?
Domena wewnątrzkomórkowa Notch (NICD) tworzy kompleks aktywacji transkrypcji z czynnikiem wiążącym DNA CSL i koaktywatorem transkrypcji z rodziny Mastermind (MAML). ICN wiąże się z wysoce konserwatywnym czynnikiem transkrypcyjnym wiążącym DNA o nazwie CSL (znanym również jako RBP-Jkappa, CBF1, Suppressor of Hairless i Lag-1) i rekrutuje koaktywatory transkrypcyjne podobne do Mastermind, tworząc kompleks aktywacji transkrypcji.