Zredukowany nośnik folianów (RFC) jest głównym systemem transportu folianów w komórkach ssaków. komórkach ssaków. RFC ulega silnej ekspresji w jelicie i uważa się, że odgrywa rolę we wchłanianiu folianów. Badania z naszego laboratorium i innych scharakteryzowały różne aspekty procesu wchłaniania folianów w jelitach, ale niewiele jest o możliwym istnieniu białek pomocniczych, które wchodzą w interakcje z RFC i wpływa na jego fizjologię i/lub biologię komórek. Zbadaliśmy tę kwestię poprzez stosując bakteryjny system dwuhybrydowy do przesiewania ludzkiej biblioteki cDNA BacterioMatch II przy użyciu dużej wewnątrzkomórkowej pętli między domenami transbłonowymi 6 i 7 ludzkiego RFC. domenami 6 i 7 ludzkiego RFC (hRFC) jako przynęty. Nasze badania przesiewowe zaowocowały identyfikację bloku drogowego łańcucha lekkiego dyneiny-1 (DYNLRB1) jako partnera jako partnera oddziałującego z hRFC. Istnienie bezpośredniej interakcji białko-białko między hRFC i DYNLRB1 zostało potwierdzone przez test in vitro pull-down i in vivo test lucyferazy i analizę koimmunoprecypitacji. Ponadto, obrazowanie konfokalne żywych ludzkich komórek nabłonka jelitowego HuTu-80 wykazało kolokalizację DYNLRB1 z hRFC. Koekspresja DYNLRB1 z hRFC doprowadziła do znaczącego (P < 0,05) wzrostu wychwytu folianów. Z drugiej strony z drugiej strony, hamowanie endogennego DYNLRB1 za pomocą specyficznego dla genu małego interferującego RNA lub farmakologicznie za pomocą specyficznego inhibitora (wanadanu) doprowadziło do znacznego (P < 0,05) spadek wychwytu folianów. Badanie to pokazuje po raz pierwszy identyfikację DYNLRB1 jako partnera białkowego oddziałującego z hRFC. Co więcej, DYNLRB1 wydaje się wpływać na funkcję i biologię komórkową hRFC. --- km23-1 został pierwotnie zidentyfikowany jako białko oddziałujące z receptorem TGFß, które odgrywa ważną rolę w sygnalizacji TGFß. Co więcej, km23-1 jest w rzeczywistości częścią starożytnej nadrodziny białek regulujących NTPazy, szeroko reprezentowanych w archeonów i bakterii. Aby dokładniej wyjaśnić funkcję km23-1, zidentyfikowaliśmy nowych partnerów oddziałujących z białkami dla km23-1 przy użyciu tandemowego powinowactwa oczyszczanie (TAP) i tandemową spektrometrię mas (MS). Tutaj pokazujemy, że km23-1 oddziaływał z klasą białek zaangażowanych w ruchliwość komórek opartą na aktynie i modulację cytoszkieletu aktynowego. Ponadto wykazaliśmy, że km23-1 moduluje tworzenie wysoce zorganizowanej sieci włókien naprężeniowych. Co ważniejsze, wykazaliśmy wykazaliśmy, że knockdown (KD) km23-1 zmniejszył aktywację RhoA w komórkach nabłonka Mv1Lu komórkach nabłonkowych. Wreszcie, nasze wyniki po raz pierwszy wykazały, że pozbawienie km23-1 hamowało migrację komórek ludzkiego raka okrężnicy (HCCC) w testach gojenia ran. Ogólnie rzecz biorąc, nasze odkrycia pokazują, że km23-1 reguluje RhoA i białka modulujące aktynę związane z ruchliwością, sugerując że km23-1 może stanowić nowy cel terapii przeciwprzerzutowej. --- Wcześniej zidentyfikowaliśmy km23 jako nowe białko oddziałujące z receptorem TGFbeta. Tutaj pokazujemy, że km23 ulega wszechobecnej ekspresji w ludzkich tkankach i że istnieją specyficzne dla typu komórki różnice w endogennej ekspresji białka km23. Ponadto Ponadto wykazujemy, że fosforylacja km23 jest zależna od TGFbeta, w tym EGF nie był w stanie fosforylować km23. Co więcej, aktywność kinazowa Wydaje się, że oba receptory TGFbeta odgrywają rolę w fosforylacji km23 za pośrednictwem TGFbeta. fosforylacja km23, chociaż aktywność kinazy TGFbeta RII jest absolutnie wymagana do fosforylacji km23. Blokada km23 przy użyciu małych interferujących RNA znacząco zmniejszyła kluczowe odpowiedzi TGFbeta, w tym indukcję ekspresji fibronektyny i hamowanie wzrostu komórek. Tak więc, nasze wyniki pokazują, że km23 jest wymagany do indukcji fibronektyny przez TGFbeta ekspresji fibronektyny i jest niezbędny, ale niewystarczający, dla wzrostu za pośrednictwem TGFbeta hamowanie. --- CEL: Bardzo wysoka częstotliwość mutacji somatycznych w składniku sygnałowym transformującego czynnika wzrostu czynnika wzrostu beta km23 została odnotowana w niewielkiej serii raków jajnika (8 z 19, 42%). raków jajnika (8 z 19, 42%). Badania funkcjonalne wykazały, że niektóre mutacje zakłócają funkcję km23, powodując nieprawidłową sygnalizację transformującego czynnika wzrostu-beta i przypuszczalnie zwiększoną nowotworowość. Jeśli zostanie to zweryfikowane mutacja km23 jako najczęstsze zdarzenie somatyczne w raku jajnika. raka jajnika. PROJEKT EKSPERYMENTALNY: Staraliśmy się zweryfikować częstotliwość wyciszania km23 wśród 104 pierwotnych raków jajnika (49 surowiczych, 18 śluzowych, 29 endometrioidalnych/jasnokomórkowych i 8 niezróżnicowanych). komórek i 8 niezróżnicowanych), a także 72 raków piersi i 61 raków jelita grubego poprzez podejmując zarówno analizy mutacji somatycznych, jak i metylacji promotora. Wszystkie cztery eksony km23 były indywidualnie amplifikowane z genomowego DNA ze starterami komplementarnymi do otaczających sekwencji intronowych i analizowane za pomocą jednoniciowych analizę polimorfizmu konformacyjnego. WYNIKI: Zidentyfikowano dwa polimorfizmy linii zarodkowej, ale żaden z 237 guzów analizowanych guzów nie zawierał mutacji somatycznych km23. Ponadto, analiza metylacji promotora wykazała, że we wszystkich przypadkach wyspa 5' CpG była niemetylowana. WNIOSKI: Nasze dane sugerują, że wyciszenie km23, albo poprzez somatyczną mutację genetyczną mutację genetyczną lub hipermetylację promotora, jest rzadkie w rakach jajnika, piersi i jelita grubego. raka jelita grubego. --- Wcześniej informowaliśmy, że łańcuch lekki dyneiny (DLC) km23-1 jest wymagany do sygnalizacji TGFbeta zależnej od Smad2. Tutaj opisujemy innego członka rodziny km23/DYNLRB/LC7/robl, określany jako km23-2, który jest również zaangażowany w sygnalizację TGFbeta. sygnalizację TGFbeta. Pokazujemy nie tylko, że TGFbeta stymuluje interakcję km23-2 (DYNLRB2) z receptorem TGFbeta II (TbetaRII), ale także, że TGFbeta reguluje interakcję między km23-2 i endogennym TbetaRII in vivo. Ponadto Ponadto leczenie TGFbeta powoduje fosforylację km23-2, podczas gdy a forma TbetaRII z niedoborem kinazy zapobiega fosforylacji km23-2. W przeciwieństwie do do izoformy km23-1, blokada ekspresji km23-2 przy użyciu małych interferujących RNA (siRNA) zmniejszyło kluczowe odpowiedzi specyficzne dla TGFbeta / Smad3, w tym indukcja zarówno ekspresji genu inhibitora aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1), jak i ekspresji białka p21. ekspresji białka p21. Blokada ekspresji km23-1 nie miała wpływu na te dwa główne odpowiedzi TGFbeta/Smad3 w podobnych warunkach. Ponadto km23-2 był wymagane do stymulacji TGFbeta zależnego od Smad3 elementu wiążącego Smad (SBE) 2-Luc aktywność transkrypcyjna, ale nie do stymulacji TGFbeta Smad2-zależnej aktywności transkrypcyjnej elementu reagującego na aktywinę (ARE) -Lux. W celu oceny mechanizmów leżących u podstaw preferencyjnej stymulacji Smad3- w porównaniu ze specyficznymi dla Smad2 odpowiedziami TGFbeta, immunoprecypitacja (IP) / blot przeprowadzono analizy, które wykazały, że TGFbeta stymulował preferencyjne tworzenie kompleksów km23-2 ze Smad3, w stosunku do Smad2. Podsumowując, nasze odkrycia wskazują, że km23-2 jest wymagany do sygnalizacji TGFbeta zależnej od Smad3. Co ważniejsze, wykazujemy, że km23-2 pełni funkcje w sygnalizacji TGFbeta które różnią się od tych dla km23-1. Jest to pierwszy raport opisujący zróżnicowane wymagania dla unikalnych izoform określonej rodziny DLC w sygnalizacji TGFbeta specyficznej dla Smad.
Jakie są skutki pozbawienia komórki białka km23-1 (DYNLRB1)?
Znokautowanie km23-1 skutkuje licznymi efektami na poziomie komórkowym, takimi jak zmniejszona migracja komórek. Ponadto, km23-1 jest zaangażowany w szlaki sygnałowe, a jego knockdown skutkuje zmniejszoną aktywacją RhoA, hamowaniem aktywacji ERK i JNK za pośrednictwem TGFβ, fosforylacją c-Jun, transaktywacją promotora c-Jun i zmniejszoną odpowiedzią na TGFbeta.