Procesy przetwarzania RNA zachodzące na transkrybowanym pre-mRNA obejmują zamykanie, splicing, edycję, przetwarzanie 3' i poliadenylację. Większość z tych procesów zachodzi współtranskrypcyjnie, podczas gdy enzym polimerazy RNA II (Pol II) jest zaangażowany w wydłużanie transkrypcji. W jaki sposób szybkość elongacji Pol II jest Pol II nie jest dobrze poznane. Stworzyliśmy rodzinę indukowalnych konstruktów genowych zawierających rosnącą liczbę intronów i eksonów, które zostały stabilnie zintegrowane w ludzkich komórkach, aby służyć jako aktywnie transkrybujące loci genów. aktywnie transkrybujące loci genowe. Poprzez monitorowanie powiązania transkrypcji i splicingu na tych genach in vivo, wykazaliśmy, że tylko U1 snRNP zlokalizowane do bezintronowego genu, co jest zgodne z niezależną od splicingu rolą U1 snRNP w transkrypcji. transkrypcji. W przeciwieństwie do tego, wszystkie snRNP gromadziły się na genach zawierających introny, a zwiększenie liczby intronów zwiększyło ilość rekrutowanych składników spliceosomu. składników spliceosomu. Wskazuje to, że powstający RNA może jednocześnie tworzyć wiele spliceosomy jednocześnie. Pomiary kinetyczne elongacji Pol II in vivo, Pol II ChIP, a także zastosowanie inhibitorów splicingu Spliceostatin i Meayamycin wykazały, że tempo elongacji polimerazy było odłączone od trwającego splicingu. Badanie to pokazuje, że kinetyka elongacji transkrypcji przebiega niezależnie od splicingu w badanych tutaj genach modelowych. Co zaskakujące, retencja poliadenylowanego mRNA wykryto w miejscu transkrypcji po zakończeniu transkrypcji. zakończeniu transkrypcji. Sugeruje to, że polimeraza jest uwalniana z chromatyny przed przed zakończeniem splicingu, a pre-mRNA jest posttranskrypcyjnie przetwarzany potranskrypcyjnie, podczas gdy nadal jest związany z chromatyną w pobliżu końca genu. --- Splicing to usuwanie sekwencji intronowych z pre-mRNA przez spliceosom. Naukowcy pracujący na wielu organizmach modelowych - w szczególności na drożdżach, owadach i komórkach ssaków komórkach ssaków - wykazali, że pre-mRNA może być splicingowane podczas procesu transkrypcji (tj. ko-transkrypcyjnie), jak również po zakończeniu transkrypcji (tj. post-transkrypcyjnie). transkrypcji (tj. posttranskrypcyjnie). Splicing ko-transkrypcyjny nie zakłada, że zakłada, że mechanizmy transkrypcji i splicingu są mechanicznie sprzężone, jednak podnosi taką możliwość. Wczesne badania opierały się na ograniczonej liczbie genów, które często wybierano ze względu na ich dostępność eksperymentalną. Od 2010 roku w ośmiu badaniach wykorzystano globalne zbiory danych jako narzędzia liczące, w celu w celu ilościowego określenia ko-transkrypcyjnego usuwania intronów. Konsensus, oparty na czterech organizmach, jest taki, że większość zdarzeń splicingowych zachodzi współtranskrypcyjnie w większości komórek i tkanek. Tutaj omawiamy naturę różnych globalnych zbiorów danych i sposób przeprowadzenia analiz bioinformatycznych. Biorąc pod uwagę duże różnice w podejściu eksperymentalnym i analizie, poziom poziom zgodności co do rozpowszechnienia ko-transkrypcyjnego splicingu jest niezwykły. godny uwagi. --- Domena karboksyterminalna (CTD) dużej podjednostki polimerazy RNA II (pol II) jest niezbędna dla kilku ko-transkrypcyjnych procesów przetwarzania pre-messenger RNA RNA, w tym zamykania, przetwarzania 3'-końcowego i splicingu. Zbadaliśmy rolę rolę CTD RNA pol II w koordynacji edycji od A do I i splicingu ADAR2 (ADAR: deaminazy adenozyny działające na RNA) pre-mRNA. The automatyczna edycja intronu 4 Adar2 przez deaminazę adenozyny ADAR2 jest ściśle sprzężona ze splicingiem, ponieważ modyfikacja dinukleotydu AA na AI tworzy nowe miejsce splicingu 3'. W przeciwieństwie do innych intronów, CTD nie jest wymagany do wydajnego splicingu intronu 4 ani w normalnym miejscu splicingowym 3', ani w miejscu alternatywnym utworzonym przez edycję. CTD jest jednak wymagany do wydajnego ko-transkrypcyjnej autoedycji intronu 4 ADAR2. Nasze wyniki wskazują na udział CTD w selektywnej edycji RNA przez ADAR2 i koordynacji edycji z alternatywnym splicingiem. alternatywnym splicingiem. --- Sekwencjonowanie transkryptomu pozwala na analizę dojrzałych RNA z rozdzielczością pary zasad rozdzielczości. Tutaj pokazujemy, że RNA-seq może być również wykorzystywane do badania powstających RNA w trakcie transkrypcji. Sekwencjonowaliśmy całkowity RNA z ludzkiego mózgu i wątroby i znaleźliśmy dużą frakcję odczytów (do 40%) w intronach. Intronowe RNA były obfite w tkance mózgowej, szczególnie dla genów zaangażowanych we wzrost aksonów i transmisję synaptyczną. transmisję synaptyczną. Ponadto wykryliśmy znaczące różnice w poziomach intronowego RNA między mózgami płodów i dorosłych. Pokazujemy, że wzór pokrycia sekwencji intronowych sekwencji jest wyjaśniony przez rodzącą się transkrypcję w połączeniu z ko-transkrypcyjnym splicingiem. ko-transkrypcyjnym splicingiem. Dalsza analiza ko-transkrypcyjnego splicingu wskazuje na korelację między wolno usuwanymi intronami a alternatywnym splicingiem. Nasze dane pokazują, że sekwencjonowanie całkowitego RNA zapewnia unikalny wgląd w procesy transkrypcyjne w komórce. procesy transkrypcyjne w komórce, o szczególnym znaczeniu dla prawidłowego rozwoju mózgu. rozwoju mózgu. --- Splicing pozostaje nie do końca poznanym procesem. Ostatnie odkrycia sugerują że struktura chromatyny uczestniczy w jego regulacji. Tutaj analizujemy RNA z frakcji subkomórkowych uzyskanych za pomocą RNA-seq w linii komórkowej K562. Pokazujemy, że w ludzkim genomie splicing zachodzi głównie podczas transkrypcji. transkrypcji. Wprowadzamy miarę coSI, opartą na odczytach RNA-seq mapujących do do połączeń i granic eksonów, aby ocenić stopień zakończenia splicingu wokół wewnętrznych eksonów. wewnętrznych eksonów. Pokazujemy, że zgodnie z oczekiwaniami, splicing jest prawie w pełni zakończony w cytozolowym poliA+ RNA. W RNA związanym z chromatyną (który obejmuje RNA, który jest transkrybowany), dla 5,6% eksonów, usunięcie otaczających intronów jest w pełni zakończone, w porównaniu z 0,3% eksonów, dla których nie nastąpiło usunięcie intronów. nastąpiło. Pozostałe eksony istnieją jako mieszanina cząsteczek spliced i mniej niespliced cząsteczek, z medianą coSI wynoszącą 0,75. Tak więc, większość RNA ulega splicingowi podczas podczas transkrypcji: "co-transcriptional splicing". Zgodne z ko-transkrypcyjnym składaniem spliceosomu i splicingiem, znaleźliśmy znaczące wzbogacenie spliceosomalnych snRNA w RNA związanym z chromatyną w porównaniu z innymi komórkowymi frakcjami RNA i innymi niespliceosomalnymi snRNA. Wyniki CoSI zmniejszają się wzdłuż genu, wskazując na zasadę "pierwsza transkrypcja, pierwszy splicing", jednak więcej eksonów niższego rzędu ma inne cechy, sprzyjające szybkiemu, współtranskrypcyjnemu usuwaniu intronów. Eksony o niskich wartościach coSI, czyli w procesie procesie splicingu, są wzbogacone o znaczniki chromatynowe, co jest zgodne z rolą chromatyny w splicingu podczas transkrypcji. Dla alternatywnych eksonów i długich niekodujących RNA, splicing ma tendencję do występowania później, a te ostatnie mogą pozostać niesplicingowane w niektórych przypadkach. --- Samosplatanie intronu grupy I z 26S rRNA Candida albicans jest jest niezbędna do dojrzewania RNA gospodarza. Tutaj wykazaliśmy, że współtranskrypcyjne splicing intronu in vitro było blokowane przez antysensowne oligonukleotydy oligonukleotydy (AON) ukierunkowane na rdzeń P3-P7 intronu. AON AON skutecznie i specyficznie hamował splicing intronu z RNA gospodarza u żywych C. albicans. Ponadto, eksperymenty cytometrii przepływowej wykazały, że zahamowanie wzrostu było spowodowane działaniem grzybobójczym. Po raz pierwszy Po raz pierwszy wykazaliśmy, że AON celujący w składanie rdzenia rybozymu specyficznie hamuje endogenny splicing rybozymu w żywych komórkach i specyficznie zabija szczepy grzybów zawierające intron, co rzuca światło na na rozwój leków przeciwgrzybiczych w przyszłości. --- Pseudoknoty odgrywają kluczową rolę w upakowaniu aktywnej struktury różnych funkcjonalnych RNA. Znaczenie pseudowęzła P3-P7 w ponownym fałdowaniu rybozymów intronowych grupy I intronowych rybozymów zostało ostatnio docenione, podczas gdy niewiele wiadomo na temat funkcji pseudoknotów w funkcji pseudoknota w składaniu ko-transkrypcyjnym. Wykorzystaliśmy tutaj intron Candida jako model do odpowiedzi na to pytanie. Pokazujemy, że ko-transkrypcyjne składanie aktywnego samosplatającego się intronu jest dwa razy szybsze niż ponowne składanie. Pseudoknot P3-P7 fałduje się powoli podczas ko-transkrypcyjnego fałdowania z szybkością podobną do fałdowania aktywnego rybozymu, oraz fałdowanie zarówno pseudoknotów P3-P7, jak i P1-P10 jest hamowane przez antysensowne oligonukleotydy oligonukleotydy. Wnioskujemy, że gdy fałdowanie RNA jest połączone z transkrypcją transkrypcją, tworzenie struktur pseudowęzłów dominuje w szlaku produktywnego szlaku składania i służy jako etap ograniczający szybkość w produkcji samosplatującego się intronu Candida. --- Powstające transkrypty są prawdziwymi substratami dla wielu zdarzeń splicingowych w komórkach ssaków. komórkach ssaków. W niniejszym przeglądzie omawiamy transkrypcję, splicing i alternatywne splicingi w kontekście ko-transkrypcyjnego przetwarzania pre-mRNA. Uświadomienie sobie, że splicing zachodzi współtranskrypcyjnie wymaga dwóch ważnych rozważań: Po pierwsze, elementy cis-działające w substracie splicingu są syntetyzowane w różnym czasie w kierunku od 5' do 3'. Ten dynamiczny widok substratu implikuje, że w intronie o długości 100 kb miejsce łączenia 5' będzie syntetyzowane nawet godzinę przed miejscem splicingu 3'. Po drugie, maszyny maszyny transkrypcyjne i maszyny splicingowe, które są zarówno złożone, jak i bardzo duże, działają w bliskiej odległości od siebie. Jest zatem prawdopodobne, że że te dwie makromolekularne maszyny wchodzą w interakcje, a najnowsze dane potwierdzające to dane to potwierdzające. Proponujemy model ko-transkrypcyjnego przetwarzania pre-mRNA przetwarzanie, które obejmuje koncepcje splice site-tethering i dynamiczne definicji eksonu. Przedstawiamy również dynamiczny obraz alternatywnego splicingu FGF-R2 i sugerujemy, że pogląd ten może mieć ogólne zastosowanie do wielu regulowanych zdarzeń splicingowych. --- Splicing RNA jest istotnym i złożonym procesem usuwania sekwencji intronowych. sekwencji intronowych. Podczas gdy skład maszynerii splicingowej jest w większości znany znany, kinetyka splicingu, aktywność katalityczna czynników splicingowych oraz współzależność transkrypcji, splicingu i formowania końca 3' mRNA są mniej dobrze poznane. Proponujemy stochastyczny model kinetyki splicingu, który wyjaśnia dane uzyskane z analiz kinetycznych transkrypcji o wysokiej rozdzielczości, splicingu i formowania końca 3' podczas indukcji genu reporterowego zawierającego intron w drożdżach pączkujących. Modelowanie ujawnia, że splicing ko-transkrypcyjny jest najbardziej prawdopodobną i najwydajniejszą ścieżką splicingu dla transkryptów reporterowych, częściowo dzięki mechanizmowi dodatniego sprzężenia zwrotnego dla drugiego etapu splicingu ko-transkrypcyjnego drugiego etapu. Porównanie modeli jest wykorzystywane do oceny alternatywnych reprezentacji reakcji. reakcji. Modelowanie wskazuje również na funkcjonalne sprzężenie transkrypcji i splicingu. i splicingu, ponieważ zarówno szybkość inicjacji transkrypcji, jak i prawdopodobieństwo zarówno szybkość inicjacji transkrypcji, jak i prawdopodobieństwo, że pierwszy etap splicingu zachodzi współtranskrypcyjnie, są zmniejszone, gdy drugi etap splicingu jest zniesiony w zmutowanym reporterze. --- Podczas gdy badania nad alternatywną regulacją splicingu pre-mRNA zazwyczaj koncentrowały się na białkach wiążących na białkach wiążących RNA i ich sekwencjach docelowych w powstających wiadomościach, staje się coraz bardziej oczywiste, że staje się coraz bardziej oczywiste, że splicing mRNA, polimeraza RNA II (pol II) i struktura chromatyny są ze sobą ściśle powiązane. Większość intronów u wyższych eukariontów jest wycinana przed uwolnieniem transkryptu w sposób który jest zależny od transkrypcji przez pol II. W wyniku ko-transkrypcyjnego splicingu, zmiany w elongacji pol II wpływają na alternatywne wzorce splicingu, w których wolniejsze tempo elongacji jest związane ze zwiększonym włączaniem alternatywnych eksonów do dojrzałego mRNA. Fizjologiczne bariery dla elongacji pol II, takie jak represyjna struktura chromatyny, mogą w podobny sposób wpływać na decyzje dotyczące splicingu. Co zaskakujące, splicing pre-mRNA może wzajemnie wpływać na elongację pol II i strukturę chromatyny. Tutaj podkreślamy ostatnie postępy w splicingu ko-transkrypcyjnym, które ujawniają rozległą sieć sprzężeń między splicingiem, transkrypcją i chromatyną kompleksami remodelującymi chromatynę. Ten artykuł jest częścią specjalnego wydania zatytułowanego: Chromatyna w czasie i przestrzeni. --- Cechą charakterystyczną transkryptów polimerazy RNA II metazoan jest obecność licznych małych eksonów otoczonych dużymi intronami. Liczne dowody wskazują, że splicing w celu wycięcia intronów zachodzi ko-transkrypcyjnie, przed uwolnieniem powstającego transkryptu z RNAP powstającego transkryptu z RNAP II. Tutaj stworzyliśmy wydajny system modelowy dla splicingu ko-transkrypcyjnego in vitro. W tym systemie konstrukty CMV-DNA unieruchomione na kulkach generują transkrypty RNAP II zawierające dwa eksony i intron. intron. Zgodnie z wcześniejszymi pracami, nasze dane wskazują, że wydłużające się powstające transkrypty transkrypty są związane z RNAP II na unieruchomionej matrycy DNA. Pokazujemy że powstające transkrypty, które osiągają pełną długość, ale nadal są przyłączone do RNAP II, są wydajnie splicingowane. Kiedy powstający transkrypt jest rozszczepiany w obrębie intronu przy użyciu RNazy H, zarówno fragmenty rozszczepienia 5', jak i 3' są wykrywane we frakcji związanej frakcji, gdzie ulegają splicingowi. Razem, nasza praca ustanawia do splicingu ko-transkrypcyjnego in vitro, w którym spliceosom zawierający eksony 5' i 3' są związane z RNAP II w celu splicingu.
Czy splicing zachodzi współtranskrypcyjnie?
Zgodnie z konsensusem, opartym na czterech organizmach, większość zdarzeń splicingowych zachodzi współtranskrypcyjnie w większości komórek i tkanek. Procesy przetwarzania RNA, które zachodzą na transkrybowanym pre-mRNA, obejmują czapeczkowanie, splicing, edycję, przetwarzanie 3' i poliadenylację. Większość z tych procesów zachodzi ko-transkrypcyjnie, podczas gdy enzym polimerazy RNA II (Pol II) jest zaangażowany w wydłużanie transkrypcji.