Starając się zoptymalizować chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RPLC) dla proteomiki proteomiki, zbadaliśmy wpływ składu roztworu wtryskowego próbki na selekcję i retencję białek na kolumnie. Wszystkie badane białka zostały zatrzymane na kolumnie, gdy wstrzyknięcia wykonano w 50% kwasie mrówkowym, 0,1% TFA lub 8,3M mocznika. Gdy kwas mrówkowy został zwiększony do 80%, dysmutaza ponadtlenkowa (MW 26,159) i 58 mysich białek mikrosomalnych, które posiadały niskie masy cząsteczkowe, wysokie p masy cząsteczkowe, wysokie pI lub podstawowe skupiska aminokwasów nie były zatrzymywane, co skutkowało selektywnością retencji podczas wstrzykiwania próbki. Wprowadzenie do 80% kwasu mrówkowego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak acetonitryl lub acetonitryl lub acetonitryl-DMSO indukowało dalszą selektywność retencji, a rosnące poziomy rozpuszczalników organicznych rozpuszczalników organicznych zmniejszało retencję na kolumnie. Proteom został podzielony na białka, które zostały zatrzymane na kolumnie, które eluowały przy wyższych czasach retencji (RT), w porównaniu do białek, które zebrały się w przepływie wtryskowym, który zwykle eluowały przy niższych RT. Ta selektywność białek została potwierdzona po zbieraniu frakcji, 1D-GE i nano-LC-MS/MS. Znaczenie tej procedury jest to, że można ją wykorzystać do szybkiej ekstrakcji małych podstawowych białek z większości proteomu i wzbogacania białek hydrofobowych na kolumnie. --- W niniejszym raporcie badamy zastosowanie spektrometrii mas MALDI-FTICR do analizy ilościowej pięciu inhibitorów proteazy HIV-1 w lizatach komórkowych. Jako matrycę zastosowano kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB). Z ilościowego punktu widzenia z ilościowego punktu widzenia, DHB jest zwykle słabą matrycą ze względu na słabą powtarzalność z miejsca na miejsce. odtwarzalność punkt po punkcie. Stwierdziliśmy, że dokładność ilościowa znacznie się poprawiły, gdy do matrycy dodano DMSO (dimetylosulfotlenek). roztworu. W przypadku lopinawiru i rytonawiru, obecnie najczęściej przepisywanych inhibitorów proteazy Inhibitory proteazy HIV-1, stosunek sygnału do szumu znacznie się poprawił gdy do roztworu matrycy dodano jodek potasu. Średnie ilościowe ilościowe, wyrażone jako % względnego odchylenia standardowego, wynosiły 6,4% dla sakwinawiru, 7,3% dla lopinawiru, 8,5% dla rytonawiru, 11,1% dla indynawiru i 7,2% dla nelfinawiru. Średnia dokładność ilościowa, wyrażona jako odchylenie proc, wynosiły 4,5% dla sakwinawiru, 6,0% dla lopinawiru, 5,9% dla rytonawiru, 6,6% dla indynawiru i 8,6% dla nelfinawiru. indynawiru i 8,0% dla nelfinawiru. Stężenia zmierzone dla poszczególnych próbek kontroli jakości mieściły się w zakresie 85-117% teoretycznych stężeń. teoretycznych stężeń. Dolne granice oznaczalności w lizatach komórkowych wynosiły 4 fmol/mikrolitr dla sakwinawiru, 16 fmol/mikrolitr dla lopinawiru, 31 fmol/mikrolitr dla rytonawiru i 100 fmol/mikrolitr dla nelfinawiru. rytonawiru i 100 fmol/mikrolitr dla indynawiru i nelfinawiru. Średnia masa dla inhibitorów proteazy wynosiła 0,28 ppm przy użyciu zewnętrznej kalibracji. Nasze wyniki pokazują, że spektrometria mas MALDI-FTICR może być z powodzeniem stosowana do precyzyjnych, dokładnych i selektywnych analiz ilościowych inhibitorów proteazy HIV-1 w lizatach komórkowych. w lizatach komórkowych. Ponadto, niższe granice kwantyfikacji pozwalają na kliniczne zastosowanie tej techniki.
Czy DMSO jako dodatek może poprawić wyniki analizy proteomicznej?
Precyzja ilościowa uległa znacznej poprawie, gdy do roztworu matrycy dodano DMSO (dimetylosulfotlenek).
Wprowadzenie do 80% roztworu iniekcyjnego kwasu mrówkowego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak acetonitryl lub acetonitryl-DMSO, indukowało dalszą selektywność retencji, a rosnące poziomy rozpuszczalników organicznych zmniejszały retencję na kolumnie.
Niski procent dimetylosulfotlenku (DMSO) w rozpuszczalnikach do chromatografii cieczowej prowadzi do silnego wzmocnienia jonizacji peptydów metodą elektrorozpylania, poprawiając czułość identyfikacji białek w proteomice bottom-up nawet dziesięciokrotnie.