Leczenie myszy etylonitrozomocznikiem (ENU) jest skutecznym sposobem mutagenizacji komórek spermatogonalnych. komórek spermatogonialnych, a leczenie to okazało się skuteczne w różnych ekranach zarówno dla mutacji dominujących, jak i recesywnych. Jednakże, istotnym problemem dla tej technologii jest to, że skuteczność mutagenezy jest oceniana najczęściej poprzez empiryczne określenie częstotliwości mutacji per-locus za pomocą za pomocą specyficznego testu locus, który jest kosztowny, czasochłonny i logistycznie trudny. trudne logistycznie. Aby podejść do tego pytania bardziej bezpośrednio i efektywniej, można wykorzystać metody wykrywania mutacji oparte na PCR do charakterystyki potomstwa zmutagenizowanych myszy. Ponieważ analiza ta może być przeprowadzona po jednym pokoleniu hodowli, jest ona przydatna jako szybki sposób na oceny skuteczności leczenia mutagenem. Co więcej, można sobie łatwo wyobrazić można sobie wyobrazić, że strategia ta może być stosowana do ogólnego określania funkcji genów w systematyczny sposób. funkcji genów w systematyczny sposób. Rozważania teoretyczne i analiza empiryczna empiryczne sugerują, że częstotliwość mutacji na bazę dla ułamkowej dawki jest rzędu 1 zmiany sekwencji na 10(5) bp. --- W celu zmaksymalizowania mutagennej skuteczności N-etylo-N-nitrozomocznika w spermatogoniach mysich komórek macierzystych spermatogoniach mysich komórek macierzystych, wykorzystano fakt, że komórki te mogą gromadzić mutacje z powtarzanych dawek podawanych przez stosunkowo długi czas. okresach czasu. Powtarzane dawki (100 mg/kg) etylonitrozomocznika wstrzyknięte dootrzewnowo samcom myszy w cotygodniowych odstępach. odpowiednie przeżycie i płodność przy całkowitych dawkach 300 i 400 mg/kg. Częstotliwości mutacji w tych dawkach wynosiły odpowiednio 1,8 i 2,2 razy większe niż uzyskane przy maksymalnej możliwej do zastosowania pojedynczej dawce 250 mg/kg. Częstotliwość mutacji wywołana dawką 400 mg/kg etylonitrozomocznika jest 12 maksymalna częstotliwość mutacji osiągalna przy pojedynczej ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie i 36 razy więcej niż w przypadku prokarbazyny, najskuteczniejszego mutagenu chemicznego znanego wcześniej dla spermatogonii mysich komórek macierzystych. Etylonitrozomocznik jest już mutagenem z wyboru w celowych próbach stworzenia mysich modeli ludzkich chorób oraz we wszelkich eksperymentach, w których pożądany jest maksymalny wskaźnik mutacji. Schematy powtarzanych dawek podobne do tych opisanych tutaj powinny zwiększyć skuteczność takich badań. --- Postrzeganą wadą testów mutacji transgenicznych gryzoni jest to, że częstotliwość spontanicznych mutacji jest wysoka w porównaniu do endogennych genów co w konsekwencji może zmniejszać wrażliwość na indukowaną mutację. Wcześniej argumentowaliśmy, że nienaprawione niedopasowania G:T ze spontanicznej deaminacji 5-metylocytozyny w miejscach CpG mogą zostać przekształcone w pozorne mutacje in vivo w systemach odzyskiwania bakterii z powodu szybkiej, losowej naprawy niedopasowania w Escherichia coli. W tym badaniu zmierzyliśmy częstotliwości mutacji w śledzionie samców myszy indukowanych przez N-etylo-N-nitrozomocznik (ENU) przy użyciu transgenu PhiX174, który nie podlega naprawie niedopasowania w E.coli, przy użyciu analizy pojedynczego wybuchu, unikalną metodę identyfikacji mutacji in vivo. Aby porównać nasze wyniki z z transgenami lacI i cII, przekonwertowaliśmy wszystkie częstotliwości mutacji na częstotliwości mutacji na nukleotyd w oparciu o widma mutacji z tego badania i opublikowaną literaturę. z tego badania i opublikowanej literatury. Stwierdziliśmy, że ta częstotliwość w kontrolnej śledziony była podobna dla lacI (3,8 +/- 0,7 x 10(-8)) i PhiX174 (3,1 +/- 1,2 x 10(-8)). +/- 1,2 x 10(-8)) w wieku 6 tygodni. Stwierdziliśmy silną zależność od wieku dla spontanicznej mutacji lacI, która ekstrapolowała się do wartości w momencie poczęcia (1,8 +/- 0,9 x 10(-8)), która nie różniła się znacząco od ludzkiej linii zarodkowej bps na nukleotyd wynoszącej 1,7 +/- 0,2 x 10(-8). Te dwa transgeny zapewniały podobne odpowiedzi mutacyjne na 40 mg/kg ENU, 7- do 9-krotne. Natomiast W przeciwieństwie do tego, gen docelowy cII w tej samej tkance wytwarza zarówno spontaniczne, jak i zarówno spontaniczne, jak i indukowane częstotliwości mutacji około 10 razy wyższe, z nieznanych powodów. Wnioskujemy, że spontaniczne częstotliwości mutacji mierzone przez transgen lacI i PhiX174 w tej umiarkowanie dzielącej się tkance dokładnie mierzą częstotliwości mutacji in vivo częstotliwości mutacji we wczesnym wieku. W przypadku tych dwóch transgenów, pozornie wysokie częstotliwości mutacji mogą odzwierciedlać oczekiwaną akumulację mutacji somatycznych z wiekiem. z wiekiem. --- CEL: Zbadanie widm molekularnych i mechanizmu ludzkiej hipoksantyny mutacji genu fosforybozylotransferazy guaninowej (HPRT) indukowanej przez ethyluitrosourea (ENU). METODY: Hodowla z klonowaniem pojedynczych komórek, dwukierunkowe badania przesiewowe, wielokrotna amplifikacja PCR amplifikację i technikę elektroforezy. WYNIKI: Wraz ze wzrostem dawki ENU zmniejszała się wydajność namnażania komórek (w grupie grupie z dawkami 100-200 mikro g/ml, P < 0,01), a częstotliwość mutacji wzrosła (w grupie z dawkami 12,5-200,0 mikro g/ml, P < 0,05). Nie nie było delecji wszystkich eksonów w spontanicznych mutacjach, a tylko 7,7% z nich zostało wykryto jako delecję pojedynczego eksonu. Ale delecję stwierdzono w 79,7% mutacji wywołanych przez mutacji wywołanych przez ENU (62,5%-89,4%, P < 0,01) i mutacje delecyjne we wszystkich dziewięciu eksonach genu HPRT. dziewięciu eksonach genu HPRT. Większość mutacji wywołanych przez ENU była delecją łańcucha z wielu eksonów (88,1%). WNIOSKI: Widma w spontanicznych mutacjach różniły się całkowicie od widm indukowanych przez ENU. ENU mógł powodować większe zmiany w strukturze genetycznej, co sugeruje silniejszą mutagenezę ENU. --- Zdolność do generowania mutacji jest warunkiem wstępnym funkcjonalnej analizy genetycznej. analizy funkcjonalnej. Pomimo długiej historii wykorzystywania myszy jako systemu modelowego do analizy genetycznej genetycznej, społeczność naukowa nie wygenerowała kompleksowej kolekcji wielu alleli dla większości genów myszy. Chemicznym mutagenem z wyboru dla myszy był N-etylo-N-nitrozomocznik (ENU), środek alkilujący, który głównie powoduje głównie podstawienia zasad w DNA, a zatem pozwala na odzyskanie pełnej i częściową utratę, a także wzmocnienie alleli funkcyjnych. Specyficzne testy locus zaprojektowane do wykrywania mutacji recesywnych wykazały, że ENU jest najskuteczniejszym mutagenem u myszy z przybliżonym wskaźnikiem mutacji wynoszącym 1 na 1000 gamet. W rzeczywistości W rzeczywistości przeprowadzono kilka badań przesiewowych w całym genomie i specyficznych dla regionu na podstawie fenotypów. fenotypów. Oczekiwanie na ukończenie projektów genomu człowieka i myszy i myszy kładzie obecnie nacisk na genetykę opartą na genotypie - od sekwencji do mutacji. do mutantów. Aby wykorzystać mutagenność ENU i jego zdolność do tworzenia allelicznych serii mutacji, opracowaliśmy uzupełniające podejście do generowania mutacji przy użyciu mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES). Pokazujemy, że można osiągnąć że można osiągnąć wysoką częstotliwość mutacji i że modulowanie aktywności naprawy DNA DNA może zwiększyć tę częstotliwość. Leczone komórki zachowują germinalną, dzięki czemu podejście to ma zastosowanie do wydajnego generowania allelicznych serii mutacji kluczowych dla precyzyjnego rozbioru szlaków biologicznych. szlaków biologicznych.
Jaka jest częstotliwość mutacji indukowanych spontanicznie przez mutagenezę etylonitrozomocznika (ENU)?
Rozważania teoretyczne i analiza empiryczna sugerują, że częstotliwość mutacji na bazę dla protokołu leczenia dawkami frakcjonowanymi jest rzędu 1 zmiany sekwencji na 10(5) bp.