Niedawno opublikowane wytyczne WHO/FAO dotyczące oceny alergenności nowych białek żywnościowych nowych białek żywności zapewniają strategię, za pomocą której można podejść do określenia potencjału nowych białek w żywności jako alergenów. Kluczem do tej strategii jest ocena podobieństwa sekwencji do znanych alergenów i ocena odporności na pepsynę. ocena odporności na hydrolizę pepsyną. Białka strukturyzujące lód (powszechnie określane również jako białka zapobiegające zamarzaniu lub histerezie termicznej) to grupa naturalnie występujących białek, które grupa naturalnie występujących białek, które wiążą się z lodem i tworzą kryształy lodu. kryształy lodu. Sekwencja aminokwasowa białka strukturyzującego lód (ISP) typu III HPLC 12 (ISP typu III) porównano in silico z sekwencjami znanych alergenów. alergenów. Po drugie, odporność na hydrolizę pepsyny ISP typu III i jego glikokoniugatów glikokoniugatów (produkowanych w rekombinowanych drożdżach piekarskich). Wyniki Wyniki wskazują, że ISP typu III nie ma podobieństwa sekwencji ze znanymi białkami alergennymi. alergennymi białkami. Zarówno ISP typu III, jak i glikokoniugaty ISP typu III zawarte w produkcie fermentacji były łatwo hydrolizowane przez pepsynę (50% utrata w <10 min przy pH 1,5), dając fragmenty peptydów, które były zbyt małe, aby być alergizujące lub powodujące sieciowanie z IgE. W towarzyszącym badaniu wykazaliśmy, że IgE od osób uczulonych na ryby nie wiązały ISP typu III. Dlatego też, zgodnie ze strategią WHO/FAO, ocena ISP typu III i glikokoniugatów ISP typu III poprzez analizę sekwencji wraz z brakiem opornością na hydrolizę pepsyny i brakiem wiązania IgE wspiera wniosek, że że jest mało prawdopodobne, aby oba stanowiły potencjalne zagrożenie uczuleniem. --- TŁO: Ryby odporne na mróz przeżywają w temperaturach poniżej zera poprzez niekoligatywnie obniżając temperaturę zamarzania ich płynów ustrojowych za pomocą białek zapobiegających zamarzaniu (AFP). Staraliśmy się ocenić i porównać efekty przedłużonej kriokonserwacji poniżej zera przeszczepionych serc szczurów przy użyciu AFP I lub AFP III. METODY: Zastosowano dwa protokoły heterotopowego przeszczepu serca szczura. W Protokół 1 (n = 104), serca (n = 8/grupę) były przechowywane przez 12, 18 i 24 godziny w roztworze Uniwersytetu Wisconsin. godziny w roztworze Uniwersytetu Wisconsin (UW) w temperaturze 4 stopni C, UW w temperaturze -1,3 stopni C, UW/AFP I w -1,3 stopni C i UW/AFP III w -1,3 stopni C, z zarodkowaniem i bez zarodkowania. bez zarodkowania. Ocena pooperacyjna składała się z wizualnej oceny żywotności serca po 60 minutach. Protokół 2 (n = 58) obejmował ocenę 24-godzinnej żywotności po przeszczepie, badanie echokardiograficzne (frakcja skracania [FS], końcoworozkurczowa i rozkurczowa średnica lewej komory [ESD, EDD] oraz grubość skurczowa i rozkurczowa ściany przedniej i tylnej [AWT-S, AWT-D, PWT-S, PWT-D]), barwienie TUNEL i wyniki mikroskopii elektronowej (EM) dla serc zachowanych przez 18, 21 i 24 godziny w UW w temperaturze 4 stopni C lub UW/AFP III w temperaturze -1,3 stopni C. WYNIKI: Serca konserwowane w UW w temperaturze -1,3 stopnia C z nukleacją zamarzły i zmarły. zamarzały i umierały. Trzy z 8 serc przechowywanych w UW w temperaturze 4 stopni C przez 24 godziny zmarły, podczas gdy wszystkie serca konserwowane w temperaturze -1,3 stopnia C przeżyły. Serca konserwowane w UW/AFP przez 18 i 24 godziny w temperaturze -1,3 stopnia C miały lepsze wyniki żywotności w porównaniu z tymi w UW w temperaturze 4 stopni C. Serca w AFP III w temperaturze -1,3 stopnia C wykazywały większą AWT-S i AWT-D (3,5 +/- 0,2 vs 2,4 +/- 0,2, p < 0,05, i 3,5 +/- 0,2 vs 2,2 +/- 0,2, p < 0,05, odpowiednio) po 18-godzinnej konserwacji. W 21-godzinnej grupie zachowawczej, serca leczone AFP wykazywały poprawę echokardiograficzne wskaźniki skurczu skurczowego, w tym: poprawę FS (27 +/- 3,7 vs 15 +/- 4, p = 0,04); zmniejszenie ESD (0,28 +/- 0,57 vs 0,47 +/- 0,6, p < 0,05); większy AWT-S (3,4 +/- 0,18 vs 2,8 +/- 0,2, p < 0,05); i mniej dodatnio zabarwionych jąder TUNEL na próbkę (35 +/- 14 vs 5,3 +/- 2,7, p = 0.04). Odnotowano również lepsze wyniki EM w porównaniu z UW w temperaturze 4 stopni C. WNIOSKI: W przedłużonej kriokonserwacji poniżej zera, AFP chronią serce przed zamarzaniem, poprawiają przeżywalność i hemodynamikę oraz zmniejszają apoptotyczną śmierć komórek. --- Przeprowadzono analizę termodynamiczną białka przystosowanego do zimna, białka przeciwzamrożeniowego typu III (AFP). Wyniki wskazują, że równowaga fałdowania AFP typu AFP typu III jest odwracalnym, jednocząsteczkowym, dwustanowym procesem bez wypełnionych pośrednich. W porównaniu do większości białek mezofilnych, których fałdowanie jest dwustanowe, psychrofilowe AFP typu III ma znacznie niższą stabilność termodynamiczną w temperaturze 25 stopni C, około 3 kcal/mol, i wykazuje znacznie przesuniętą w dół krzywą krzywą stabilność-temperatura, osiągając maksimum 5 kcal/mol około 0 stopni C. AFP typu III zawierają niewiele i nieoptymalnie rozmieszczone ładunki powierzchniowe w stosunku do ich mezofilnych homologów, C-końcowych domen syntaz kwasu sialowego syntazy kwasu sialowego. Zastosowaliśmy termodynamiczne cykle podwójnych mutacji, aby ocenić energetyczną rolę każdego powierzchniowego mostka solnego w AFP typu III. Dwa izolowane mostki solne nie przyczyniały się do stabilności, podczas gdy mostek solny Asp36-Arg39, zaangażowany w sieć mostków solnych z C-końcowym karboksylanem, miał znaczący wkład (około 1 kcal/mol). Jednak ten wkład był więcej niż przeciwdziałany przez destabilizujący wpływ karboksylanu Asp36 którego usunięcie doprowadziło do 30% wzrostu stabilności netto w temperaturze 25 stopni C. Badanie to sugeruje, że AFP typu III mogły ewoluować w celu uzyskania minimalnej akceptowalną stabilność w ograniczonym, niskim zakresie temperatur (około 0 stopni C), w którym AFP muszą funkcjonować. Ponadto wskazuje, że sieci mostków są wykorzystywane w przyrodzie również do stabilizacji białek psychrofilowych, i doprowadziło do powstania wariantu AFP typu III o zwiększonej stabilności, który może być wykorzystany do celów biotechnologicznych. do celów biotechnologicznych. --- Charakterystyka specyficznego miejsca glikozylacji O-linkowej typu mucyny jest wyzwaniem analitycznym ze względu na heterogeniczność glikanów. wyzwanie analityczne ze względu na heterogeniczność glikanów, brak sekwencji konsensusowej miejsca glikozylacji glikozylacji i wysoką gęstość zajętych miejsc glikozylacji. Tutaj zastosowanie dysocjacji transferu elektronów (ETD) do specyficznej dla miejsca charakterystyki gęsto glikozylowanych glikopeptydów O-związanych z mucyną przy użyciu ESI-IT-MS/MS. Syntetyczne glikopeptydy z tandemowego regionu powtórzeń ludzkiej mucyny-1 (MUC-1) zawierający szereg O-związanych, związanych z nowotworem węglowodanów antygenów węglowodanowych, a mianowicie Tn, T i sialyl T, z różnymi miejscami glikozylacji glikozylacji i rosnącą liczbą powtórzeń tandemowych. Ponadto Ponadto, glikopeptyd z glikoproteiny przeciw zamarzaniu Antarktyki i arktycznych notothenoidów, zawierający cztery O-związane, per-acetylowane antygeny T został scharakteryzowano. ETD MS/MS glikopeptydów infuzyjnych lub kapilarnych oddzielonych LC zapewniały szerokie pokrycie sekwencji peptydów (jony fragmentów typu c/z) z nienaruszonymi glikany nadal przyłączone do reszt Ser/Thr. W ten sposób miejsca glikozylacji zostały jednoznacznie określone, jednocześnie uzyskując informacje o o masie przyłączonego glikanu i tożsamości peptydu. Wysoce sialilowane O-glikopeptydy wykazywały mniej wydajną fragmentację peptydów, ale niektóre sekwencje i glikozylacja sekwencji i glikozylacji. Badanie to demonstruje możliwości ETD MS/MS do specyficznej dla miejsca charakterystyki glikopeptydów typu mucyny glikopeptydów typu mucyny, zawierających klastry glikanów o wysokiej gęstości, przy użyciu dostępnej i względnej o niskiej rozdzielczości/niskiej dokładności masowej. --- Wraz z rozwojem technologii embrionalnych, takich jak zapłodnienie in vitro, klonowanie i transgeneza, kriokonserwacja gamet i zarodków ssaków zyskała szczególne zainteresowanie. zyskała szczególne zainteresowanie. Pomimo pewnego sukcesu, różne techniki kriokonserwacji często powodują znaczące zmiany morfologiczne i zmiany morfologiczne i biochemiczne, które prowadzą do zaburzeń organelli komórkowych, uszkodzeń cytoszkieletu, śmierci komórek i utraty żywotności zarodków. Badania ultrastrukturalne badania potwierdzają wysoką wrażliwość błony komórkowej i błony organelli na zamrażanie i rozmrażanie. Stwierdzono, że wiele substancji o niskiej masie cząsteczkowej ma działanie ochronne przed uszkodzeniami wywołanymi przez zimno. W tym przypadku, białko zapobiegające zamarzaniu (AFP) i glikoproteiny zapobiegające zamarzaniu (AFGP), które występują w bardzo wysokich stężeniach u ryb żyjących w wodach arktycznych i chronią je przed zamarzaniem. przed zamarzaniem, mogą być potencjalnie interesujące dla kriostorowania zarodków zwierząt w bardzo niskich temperaturach. Niniejszy mini-przegląd krótko opisuje kilka modeli działania AFP/AFGP w celu ochrony komórek przed uszkodzeniami spowodowanymi zamrażaniem i wskazuje kilka sposobów na poprawę potencjału rozwojowego zarodka po rozmrożeniu. zarodka po rozmrożeniu. --- Flądra zimowa zawiera dwie różne izoformy białek zapobiegających zamarzaniu, którymi są zewnątrzkomórkowe białko przeciw zamarzaniu typu wątrobowego i wewnątrzkomórkowe białko przeciw zamarzaniu typu skórnego wewnątrzkomórkowe białko przeciw zamarzaniu. Białka przeciw zamarzaniu typu skórnego wykazują niższą aktywność przeciw zamarzaniu niż izoformy typu wątrobowego, co może być spowodowane brakiem kompletnych motywów wiążących lód. Jedno z białek przeciw zamarzaniu typu skórnego białek, białko przeciw zamarzaniu typu skóry-3, zawiera przypuszczalnie nakładające się motywy wiążące lód z sekwencjami "-K-DT-" i "-DT-K-". Syntetyczne przeciw zamarzaniu zawierające 0-3 powtórzenia motywu "-DT-K-" zostały przetestowane pod kątem stabilności i aktywności. Utrata pojedynczego "-DT-K-" w białku przeciwzamrożeniowym typu skin białka-3 zwiększa aktywność przeciwzamrożeniową, a zwiększenie liczby motywów do dwóch lub trzech obniża aktywność. Spadek aktywności wraz ze wzrostem Częstotliwość motywu koreluje ze spadkiem zawartości helikalnej tych peptydów w temperaturze 0 stopni C. --- Niska temperatura i susza to główne czynniki środowiskowe zagrażające zwierzętom żyjącym w obszarach arktycznych i zimnych regionach umiarkowanych. Aby przystosować się do surowego środowiska, zwierzęta powinny przyjąć odpowiednie strategie. Jako grupa stawonogów ze strategią unikania zamarzania, sprężyki glebowe mają podobne mechanizmy ekologiczne i sposoby odporności/tolerancji na zimno jak owady, przejawiające się w zimnej aklimatyzacji i tolerancji na suszę w celu zmniejszenia szkód powstawania kryształów lodu. Podczas aklimatyzacji w niskich temperaturach następuje szybki wzrost glicerolu, szybki spadek zawartości fukozy i glukozy oraz produkcja białek zapobiegających zamarzaniu (AFP) i istnieje wzajemna transformacja różnych rodzajów lipidów w celu poprawy przepływu błony komórkowej w celu ochrony komórki przed niską temperaturą. Ponadto sprężyki glebowe mają swoje specyficzne tryby i mechanizmy tolerowania stresu związanego z niską temperaturą, głównie pionową migracja pionowa pod osłoną pokrywy śnieżnej i wydalanie nukleatora lodu z hemolimfy, co ilustruje znaczenie badań nad kriobiologią sprężyków glebowych. kriobiologii sprężyków glebowych. W artykule podsumowano tryby i mechanizmy gleby w tolerowaniu środowiska o niskiej temperaturze, dokonano przeglądu postęp badań nad ekofizjologią skoczogonków, omówiono Istniejące problemy w badaniach nad tolerancją niskiej temperatury przez skoczogonki na niską temperaturę, omówiono istniejące problemy w badaniach nad tolerancją na niską temperaturę w kontekście globalnych zmian. --- Fałd beta-clip obejmuje zróżnicowaną grupę domen białkowych, które są zunifikowane przez obecność dwóch charakterystycznych zwężeń przypominających talię, które wiążą centralny rozszerzony region. Członkowie tego fałdu obejmują enzymy takie jak deoksyurydyna trifosfataza deoksyurydyny i metylaza SET, domeny wiążące węglowodany, takie jak ryba białka przeciw zamarzaniu / domeny C-końcowe syntazy sialanowej i funkcjonalnie enigmatyczne podjednostki pomocnicze. enigmatyczne podjednostki pomocnicze ureazy i białka biosyntezy molibdopteryny MoeA. W tym badaniu zrekonstruowaliśmy historię ewolucji tego fałdu przy użyciu czułych metod porównywania sekwencji i struktur. Wykorzystując profil sekwencji sekwencji, zidentyfikowaliśmy nowe wersje fałdu beta-clip w bakteryjnym FlgA i pokrewnym białku pilusowym CpaB, dehydrogenazach podobnych do StrU i U i dehydratazach heksuronianowych podobnych do UxaA/GarD (nadrodzina SAF superfamily). Przedstawiamy dowody na to, że te wersje domeny beta-clip, podobnie jak pokrewne białka przeciw zamarzaniu typu III i C-końcowe domeny syntaz kwasu sialowego są zaangażowane w interakcje z węglowodanami. Proponujemy, aby białka podobne do FlgA i CpaB pośredniczą w montażu wici bakteryjnych i Flp pili poprzez ich interakcje z cząsteczkami węglowodanów peptydoglikanu. Wydaje się, że N-końcowa domena beta-klipu dehydrataz heksuronianowych wyewoluowała nowe miejsce wiążące metal, podczas gdy ich C-końcowa domena prawdopodobnie przyjmuje fałd przypominający beczkę TIM wiążącą metal. Korzystając z porównań strukturalnych porównań strukturalnych, pokazujemy, że fałd beta-clip można dalej sklasyfikować na dwie główne grupy, z których jedna obejmuje nadrodziny SAF, SET, dUTPazy, a druga druga, która obejmuje białko dekoracyjne głowy faga lambda, podjednostkę beta ureazy i C-końcową domenę biosyntezy kofaktora molibdenu MoeA. Porównania strukturalne sugerują również, że fałd beta-clip został zmontowany poprzez duplikację jednostki trójniciowej. Chociaż trzypasmowe jednostki prawdopodobnie miały wspólne pochodzenie, przedstawiamy dowody że kompletne domeny beta-clip zostały zmontowane poprzez takie duplikacje, niezależnie przy wielu okazjach. Istnieją również dowody na permutacji podstawowej jednostki trójpasmowej przy różnych okazjach w ewolucji ewolucji jednostki beta-clip. Opisujemy również, w jaki sposób montaż tego fałdu z podstawowa jednostka trójpasmowa została wykorzystana do dostosowania różnych aktywności w różnych wersjach.
Lista białek zapobiegających zamarzaniu ryb.
AFP-I
AFP-II
AFP-III
Glikoproteina zapobiegająca zamarzaniu
Białko histerezy termicznej