Analiza danych w proteomice jest złożona, a dodatkowe wyzwania związane z interpretacją danych z eksperymentów N-terminomicznych Interpretacja danych z eksperymentów N-terminomiki może być zniechęcająca. Dlatego opracowaliśmy racjonalny potok kroków, aby podejść do analizy danych N-terminomicznych w sposób statystycznie uzasadniony i prawidłowy. analizy danych N-terminomicznych w sposób statystycznie uzasadniony i prawidłowy. Mamy zautomatyzowaliśmy te kroki w CLIPPER, dodatku do Trans-Proteomic Pipeline (TPP). Zastosowanie CLIPPER do analizy danych N-terminomiki generowanych przez końcowe znakowanie izotopowe amin substratów (TAILS) umożliwia wysoką przypisanie peptydu do białka, charakterystykę N-końca białka i adnotację, a w przypadku analizy proteazy z łatwością pozwala na odkrycie substratu proteazy z dużą pewnością. --- Specyficzna dla neutrofili proteaza metaloproteinazy macierzy typu 6 (MT6-MMP) (MT6-MMP)/MMP-25/leukolizyna jest zaangażowana w stwardnienie rozsiane i raka, ale pozostaje słabo scharakteryzowana. pozostaje słabo scharakteryzowana. Aby scharakteryzować biologiczną rolę MT6-MMP, jest zidentyfikowanie jej substratów, których obecnie znanych jest tylko siedem. znanych. Tutaj scharakteryzowaliśmy biochemicznie MT6-MMP, sprofilowaliśmy jego tkankę tkankowego inhibitora spektrum hamowania metaloproteinaz, przeprowadziliśmy analizy degradomiki analizy i zbadaliśmy 26 chemokin pod kątem rozszczepienia przy użyciu lasera wspomaganego matrycą desorpcji/jonizacji czasu przelotu (MALDI-TOF) spektrometrii mas. MT6-MMP przetwarza po siedem z podrodzin chemokin CXC i CC. W szczególności, rozszczepienie chemoatraktantu neutrofili CXCL5 aktywuje chemokinę, zwiększając w ten sposób jej aktywność agonistyczną. zwiększając jej aktywność agonistyczną, wskazując na mechanizm sprzężenia zwrotnego dla rekrutacji neutrofili. rekrutacji neutrofili. Podobnie, rozszczepienie aktywowało również CCL15 i CCL23, zwiększając rekrutację monocytów. zwiększając rekrutację monocytów. Wykorzystując podejście proteomiczne, proteomiczna identyfikacji specyficzności miejsca rozszczepienia (PICS), zidentyfikowaliśmy 286 peptydowych od P6 do P6', z których zidentyfikowano niezwykłą preferencję glutaminianu w P1. w P1. Ekran degradomiki terminalnego znakowania aminowo-izotopowego substratów (TAIL) znakowanie substratów (TAILS), które wzbogaca się o neo-N-końcowe peptydy rozszczepionych substratów, wykorzystano do identyfikacji 58 nowych natywnych substratów w sekrecjach fibroblastów fibroblastów po inkubacji z MT6-MMP. Wimentyna, cystatyna C, galektyna-1, IGFBP-7 i wydzielane białko, kwaśne i bogate w cysteinę (SPARC) były wśród tych substratów, które biochemicznie potwierdziliśmy. substratów, które potwierdziliśmy biochemicznie. Pozakomórkowa "księżycowa" wimentyny jest chemoatraktantem dla komórek THP-1, ale rozszczepienie MT6-MMP zniosło rekrutację monocytów. Nieoczekiwanie, wimentyna rozszczepiona przez MT6-MMP silnie stymulowała fagocytozę, co nie było właściwością białka o pełnej długości białka. W związku z tym MT6-MMP reguluje chemotaksję neutrofili i monocytów oraz poprzez generowanie sygnałów "eat-me" po rozszczepieniu wimentyny potencjalnie zwiększa fagocytarne usuwanie neutrofili w celu złagodzenia stanu zapalnego. --- Proteoliza jest jednym z najściślej kontrolowanych procesów fizjologicznych. procesów fizjologicznych, ponieważ proteazy tworzą zdarzenia, które zazwyczaj angażują ścieżki w nieodwracalny sposób. nieodwracalny sposób. Pomimo ich znaczenia w prawie wszystkich systemach biologicznych, nasze zrozumienie roli proteaz w patologii chorób jest często ograniczone. często ograniczone. Istnieje kilka podejść do badania aktywności proteolitycznej w odniesieniu do biologii, patofizjologii i terapii lekowej, w tym niedawno opisany izotop terminalnej aminy. niedawno opisana strategia znakowania izotopowego substratów (TAILS) przez Kleifelda i współpracowników. przez Kleifeld i współpracowników. Tutaj badamy TAILS jako metodologię opartą na ukierunkowanym wzbogacaniu i spektrometrycznym wykrywaniu endogennych N-końcowych peptydów z klinicznie istotnych próbek biologicznych i jego potencjał dostarczania ilościowych informacji na temat proteolizy i wyjaśniania miejsc rozszczepienia proteaz. Podczas optymalizacji najbardziej aktualnego protokołu, poprzez przejście na usprawniony format jednorurowy i uproszczenie etapów usuwania odczynników. etapy, wykazujemy zalety w porównaniu z wcześniej opublikowanymi metodami i rozwiązania niektórych wyzwań technicznych przedstawionych w publikacji Kleifeld Kleifelda. Identyfikujemy również niektóre z obecnych i nierozwiązanych ograniczeń. My wykorzystujemy ludzkie osocze jako system modelowy w celu dostarczenia danych, które ilustrują niektóre z kluczowych parametrów analitycznych. kluczowe parametry analityczne zmodyfikowanej procedury TAILS, w tym specyficzność, czułość, precyzję ilościową i dokładność.
Jakie jest znaczenie akronimu "TAILS" używanego w N-terminomice białek?
TAILS to skrót od "Terminal Amine Isotopic Labeling of Substrates" (znakowanie izotopowe substratów aminami terminalnymi).