Aby utrzymać integralność genomu, enzymy naprawcze DNA nieustannie usuwają uszkodzone zasady i zmiany wynikające z procesów endogennych i egzogennych. Te enzymy naprawcze muszą odróżniać uszkodzone zasady od normalnych zasad, aby zapobiec aby zapobiec przypadkowemu usunięciu normalnych zasad, co sprzyjałoby niestabilności genomu. Mechanizmy, dzięki którym osiąga się ten wysoki poziom specyficzności, są jak dotąd jeszcze nierozwiązane. Jeden z członków rodziny enzymów naprawczych glikozylazy uracyl-DNA, Escherichia enzymów naprawczych, glikozylaza uracylo-DNA specyficzna dla niedopasowania Escherichia coli (Mug), jest rozróżnia niedopasowane pary zasad U:G od par zasad U:A na podstawie specyficznych kontakty z nieprawidłowo sparowaną guaniną po odwróceniu docelowego uracylu z dupleksu. Jednak ostatnie badania sugerują inne mechanizmy selekcji zasad, w tym lokalną stabilność dupleksu. W tym badaniu wykorzystaliśmy zmodyfikowaną zasadę N6-metyloadeninę do zbadania wpływu lokalnej perturbacji helisy na rozpoznawanie uracylu przez Mug rozpoznawanie uracylu. N6-metyloadenina występuje w E. coli jako część zarówno systemu systemów naprawy niedopasowania i modyfikacji restrykcyjnej. W swoim izomerze cis, N6-metyloadenina destabilizuje wiązanie wodorowe poprzez zakłócanie wiązania pseudo-Watsona-Cricka. Zaobserwowano, że selekcja uracylu przez Mug jest zależna od sekwencji i że reszty uracylu w sekwencjach o zmniejszonej termostabilności są preferencyjnie usuwane. Zastąpienie adeniny przez N6-metyloadeniną zwiększa częstotliwość usuwania reszt uracylu sparowanych naprzeciwko zmodyfikowanej adeniny. Wyniki te są zgodne z sugestiami, że lokalna stabilność helisy jest ważnym wyznacznikiem rozpoznawania zasad przez niektóre enzymy enzymy naprawcze DNA i zapewniają potencjalną strategię identyfikacji sekwencji lokalizacji zmodyfikowanych zasad w DNA. --- Glikozylaza DNA niedopasowania uracylu (Mug) z Escherichia coli jest enzymem inicjującym enzymem w szlaku naprawy rozcięć zasad. Podobnie jak w przypadku innych glikozylaz DNA, produkt produkt abazy jest potencjalnie bardziej szkodliwy niż początkowa zmiana. Ponieważ Mug jest ściśle wiąże swój produkt, hamując obrót enzymu, zrozumienie, w jaki sposób Mug wiąże DNA ma znaczenie przy rozważaniu, w jaki sposób Mug oddziałuje z enzymami enzymami w szlaku naprawy rozcięć zasad. Wykazaliśmy zróżnicowane tryby wiązania kubka między jego substratem a abazowym produktem DNA wykorzystując zarówno przesunięcie pasma, jak i testy anizotropii fluorescencji. Kubek wiąże swój produkt kooperatywnie, a analiza stechiometryczna wiązania DNA, aktywności katalitycznej i zależności od soli wskazuje, że tworzenie dimerów ma znaczenie funkcjonalne zarówno w aktywności katalitycznej, jak i wiązaniu produktu. Jest to pierwsze doniesienie o kooperatywności w nadrodzinie enzymów uracylowej glikozylazy DNA i stanowi podstawę inhibicji produktu w Mug. Zapewnia to zatem nową perspektywę na ochronę miejsca abazy, a wyniki są omawiane w kontekście przetwarzania uszkodzeń i komunikacji enzymatycznej w szlaku naprawy wycięcia zasady szlaku naprawy. --- Niedopasowania G:U wynikające z deaminacji cytozyny są najczęstszymi promutagennymi zmianami występującymi w DNA. Uracyl jest usuwany w szlaku naprawy przez glikozylazę przez uracylową glikozylazę DNA (UDG), która usuwa uracyl zarówno z jednoniciowego, jak i dwuniciowego DNA. jedno- i dwuniciowego DNA. Niedawno zidentyfikowano biochemicznie odrębną rodzinę enzymów enzymów naprawczych DNA, które usuwają zarówno uracyl, jak i tyminę, ale tylko z błędnych par z guaniną. Struktury krystaliczne specyficznych dla niedopasowania uracylowej glikozylazy DNA (MUG) z E. coli i kompleksu DNA, ujawniają niezwykłą strukturalną i funkcjonalną homologię z guaniną. strukturalną i funkcjonalną homologię do UDG, pomimo niskiej identyczności sekwencji. sekwencji. Szczegóły struktury MUG wyjaśniają jej aktywność tyminowej glikozylazy DNA i specyficzność dla błędnych par G:U/T, która wywodzi się z bezpośredniego rozpoznawania guaniny na nici komplementarnej. --- Utlenianie grupy metylowej tyminy może generować 5-formyluracyl (FoU). Wiadomo, że szablonowe reszty FoU są błędnie kodowane, generując mutacje podstawienia zasad mutacje. Naprawa zmiany FoU jest zatem ważna dla zminimalizowania mutacji indukowanych przez utlenianie DNA. Zbadaliśmy naprawę FoU w syntetycznych oligonukleotydach w połączeniu z A i G. W ekstrakcie komórkowym E. coli, naprawa FoU jest o cztery rzędy wielkości niższa niż naprawa U i jest podobna dla obu par zasad FoU:A i FoU:G. W ekstrakcie jądrowym HeLa, naprawa FoU:A jest podobnie o cztery rzędy wielkości niższa niż naprawa uracylu, chociaż uszkodzenie FoU:G jest naprawiane 10 razy wydajniej niż FoU:A. FoU:G jest naprawiana przez glikozylazę DNA niedopasowania uracylu E. coli (Mug), termofilową glikozylazę niedopasowanego tyminowego DNA (Tdg), mysią glikozylazę niedopasowanego tyminowa glikozylaza DNA (mTDG) i ludzka tyminowa glikozylaza DNA wiążąca metylo-CpG (MBD4), podczas gdy uszkodzenie FoU:A jest naprawiane tylko przez Mug i mTDG. Naprawa FoU w stosunku do innych pirymidyn badanych tutaj w ekstrakcie ludzkich komórek różni się od preferencji substratowych znanych glikozylaz, sugerując, że w ludzkich komórkach istnieją dodatkowe i jeszcze niezidentyfikowane glikozylazy do naprawy uszkodzeń FoU. Rzeczywiście, jak zaobserwowano w ekstrakcie jądrowym HeLa, naprawa naprawa uszkodzonego FoU pochodzącego z błędnej inkorporacji dGMP w poprzek od FoU może raczej promować niż minimalizować mutagenezę. Ścieżki, przez które w których ta ważna zmiana jest naprawiana w ludzkich komórkach, są jak dotąd niewyjaśnione, i prawdopodobnie są złożone. --- Promutagenny i genotoksyczny egzocykliczny addukt DNA 1,N(2)-etenoguanina (1,N(2)-epsilonG) jest głównym produktem powstającym w DNA narażonym na działanie aldehydów pochodzących z peroksydacji lipidów aldehydami pochodzącymi z peroksydacji lipidów in vitro. Tutaj donosimy, że dwa strukturalnie niespokrewnione białka, specyficzna dla niedopasowania Escherichia coli glikozylaza uracylo-DNA glikozylaza (MUG) i ludzka alkilopuryna-DNA-N-glikozylaza (ANPG), mogą uwalniać uwalniać 1,N(2)-epsilonG ze zdefiniowanych oligonukleotydów zawierających pojedynczą zmodyfikowaną zasadę. Porównanie stałych kinetycznych reakcji wskazuje, że białko MUG że białko MUG usuwa uszkodzenie 1,N(2)-epsilonG bardziej wydajnie (k(cat)/K(m) = 0,95 x 10(-3) min(-1) nm(-1)) niż białko ANPG (k(cat)/K(m) = 0,1 x 10(-3) min(-1) nm(-1)). Dodatkowo, podczas gdy niezachowane, N-końcowe 73 aminokwasy białka ANPG nie są wymagane do aktywności na 1,N(6)-etenoadenina, hipoksantyna lub N-metylopuryny, pokazujemy, że są one niezbędne dla aktywności glikozylazy 1,N(2)-epsilonG-DNA. Zarówno białka MUG, jak i ANPG białka preferencyjnie wycinają 1,N(2)-epsilonG, gdy jest on przeciwny do dC; jednak, w przeciwieństwie do MUG, ANPG nie jest w stanie wyciąć 1,N(2)-epsilonG, gdy znajduje się naprzeciwko dG. Wykorzystując wolne od komórek ekstrakty z genetycznie zmodyfikowanych E. coli i mysich embrionalnych fibroblastów pozbawionych odpowiednio aktywności MUG i mANPG, pokazujemy, że nacięcie dupleksowego oligonukleotydu zawierającego 1,N(2)-epsilonG ma bezwzględny wymóg dla MUG lub ANPG. Podsumowując, obserwacje te sugerują możliwą rolę tych białek w przeciwdziałaniu genotoksycznym efektom 1,N(2)-epsilonG in vivo. --- Wycięcie zasady samouzupełniającego się oligonukleotydu z centralnymi niedopasowaniami G:T przez specyficzną dla G:T/U glikozylazę niedopasowanego DNA (MUG), generuje niezwykłą strukturę DNA, która jest niezwykle podobna do konformacji nietypową strukturę DNA, która jest niezwykle podobna w konformacji do międzypasmowego adduktu DNA leku przeciwnowotworowego cis-diamminedichloroplatyny. Cukry cukry abasowe generowane przez wycięcie niedopasowanych tymin są wytłaczane z podwójnej helisy, a "owdowiałe" dezoksyguanozyny obracają się tak, że ich grupy N7 i grupy N7 i O6 wystają do mniejszego rowka dupleksu i ponownie układają się w przeplatanej geometrii interkalacyjnej, generując załamanie w osi helisy. --- Reszta 3,N(4)-etenocytozyny (epsilon C) może odgrywać rolę biologiczną in vivo ponieważ jest rozpoznawana i skutecznie wycinana in vitro przez E. coli specyficzną dla niedopasowania glikozylazę uracylo-DNA (MUG) i ludzką tyminę-DNA (hTDG). W niniejszej pracy wygenerowaliśmy wadliwego mutanta E. coli poprzez wstawienie kasety kanamycyny w celu oceny roli MUG in vivo. vivo. Pokazujemy, że ludzka TDG uzupełnia aktywność enzymatyczną MUG, gdy jest wyrażana w mutancie mug. w mutancie mug. Szczep z defektem glikozylazy epsilon C-DNA nie wykazywał spontanicznego fenomenu mutanta. nie wykazywał spontanicznego fenotypu mutatora i nie wykazywał niezwykłej wrażliwości na następujące czynniki uszkadzające DNA: metylometanosulfonian, N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna, światło ultrafioletowe, H(2)O(2), parakwat. Jednakże, plazmidowe DNA uszkodzone przez traktowanie 2-chloroacetaldehydem in vitro było inaktywowane w większym stopniu w mutancie mug niż w gospodarzu typu dzikiego, co sugeruje, że że MUG jest wymagany do przetwarzania etenobaz in vivo. Ponadto, 2-chloroacetaldehyd indukuje preferencyjnie G.C --> C.G i A.T --> T.A w mutancie. Porównanie częstotliwości mutacji indukowanych przez specyficznie wbudowaną resztę epsilon C w E. coli typu dzikiego wskazuje, że MUG naprawia ponad 80% reszt epsilon C in vivo. vivo. Ponadto wyniki pokazują, że naprawa przez wycinanie nukleotydów i rekombinacja rekombinacja nie są zaangażowane w przetwarzanie epsilon C w E. coli. Na podstawie na danych mutagenezy sugerujemy, że epsilon C może być mniej toksyczny i mniej mutagenny niż oczekiwano. Zwiększony wskaźnik mutacji spontanicznych dla przejścia G.C --> A.T w podwójnym mutancie ung mug w porównaniu do pojedynczego mutanta ung sugeruje, że MUG może być zapasowym enzymem naprawczym dla klasycznej glikozylazy uracyl-DNA glikozylazy uracyl-DNA. --- Ludzka tyminowa glikozylaza DNA ma homologa sekwencji w Escherichia coli który został opisany jako wycina uracyl z niedopasowań U.G (Gallinari, P., and Jiricny, J. (1996) Nature 383, 735-738) i została nazwana niedopasowaną glikozylazą uracylową (Mismatched Uracil glikozylazą uracylową (Mug). Opisano również, że usuwa 3,N(4)-etenocytozynę (epsilonC) z niedopasowań epsilonC.G (Saparbaev, M., i Laval, J. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 8508-8513). Użyliśmy mutanta kubka, aby wyjaśnić rolę tego białka w naprawie DNA i unikaniu mutacji. Odkryliśmy, że inaktywacja mug nie ma wpływu na mutacje C do T lub 5-metylocytozyny do T w E. coli i że kontrastuje to z wpływem defektu ung na mutacje C do T i defektu vsr na mutacje 5-metylocytozyny do T. Nawet w warunkach warunkach, w których jest on nadprodukowany w komórkach, Mug ma niewielki wpływ na częstotliwość mutacji częstotliwość mutacji C do T. Ponieważ glikozylaza uracylo-DNA (Ung) i Vsr są naprawiają odpowiednio niedopasowania U.G i T.G, dochodzimy do wniosku, że Mug nie naprawia nie naprawia niedopasowań U.G lub T.G in vivo. Defekt kubka ma również niewielki wpływ na mutacje typu forward, co sugeruje, że kubek nie odgrywa roli w unikaniu mutacji spowodowanych endogennymi uszkodzeniami DNA w rosnącej E. coli. Ekstrakty bezkomórkowe z komórek mug(+) ung wykazują bardzo małą zdolność do usuwania uracylu z DNA, ale mogą usuwać epsilonC. Tej ostatniej aktywności brakuje w ekstraktach z komórek mug, sugerując, że Mug może być jedynym enzymem w E. coli, który może usunąć ten mutagenny addukt. Zatem główną rolą Mug w E. coli może być pomoc w naprawy uszkodzeń DNA spowodowanych przez egzogenne czynniki chemiczne, takie jak chloroacetaldehyd. --- Aldehyd glicydowy jest przemysłową substancją chemiczną, która okazała się genotoksyczna w eksperymentach in vitro i rakotwórcze w badaniach na gryzoniach. Jest to dwufunkcyjny bifunkcyjny środek alkilujący zdolny do reagowania z DNA w celu utworzenia egzocyklicznych hydroksymetylopodstawionych etenobaz. W tej pracy, 8-(hydroksymetylo)-3,N4-eteno-2'-deoksycytydyna (8-HM-epsilondC), potencjalna pochodna nukleozydowa nukleozydowa pochodna glicydaldehydu, została zsyntetyzowana przy użyciu fosforoamidytu i miejscowo specyficznie włączona do zdefiniowanego 25-merowego oligodeoksynukleotydu. Addukt 8-HM-epsilonC jest strukturalnie związany z 3,N4-etenocytozyną (epsilonC), produktem reakcji z chlorkiem winylu lub przez peroksydację lipidów. W Escherichia coli wykazano wcześniej, że epsilonC wcześniej, że jest głównym substratem dla niedopasowanej glikozylazy uracyl-DNA (Mug). W tym badaniu donosimy, że ta sama glikozylaza działa również na 8-HM-epsilonC w dupleksie oligonukleotydowym. Enzym wiąże się z 8-HM-epsilonC-oligonukleotyd w podobnym stopniu jak epsilonC-oligonukleotyd. Aktywność wycięcia kubka wobec 8-HM-epsilonC jest około 2,5-krotnie niższa niż w przypadku substratu epsilonC. Obie aktywność może być stymulowana do około 2-krotnie wyższej przez dodanie endonukleazy IV E. coli. Te dwa addukty, gdy są nieprawidłowo sparowane z normalnymi zasadami, zostały usunięte z DNA przez Mug z podobną wydajnością. Badania strukturalne przy użyciu symulacji molekularnych wykazały podobne dopasowanie i wiązanie wodorowe dla par 8-HM-epsilonC*G i epsilonC*G w dupleksach oligomerycznych. My Wierzymy, że te odkrycia mogą mieć biologiczne i strukturalne implikacje w definiowaniu roli 8-HM-epsilonC w rozpoznawaniu/naprawie glikozylazy. --- Glikozylaza DNA Escherichia coli Mug usuwa 3,N(4)-etenocytozynę (epsilon C) i uracyl z DNA, ale jej funkcja biologiczna jest niejasna. Dzieje się tak, ponieważ epsilon C nie występuje w DNA E. coli, a glikozylaza uracyl-DNA (Ung), odrębny enzym, jest znacznie bardziej jest znacznie bardziej wydajna w usuwaniu uracylu z DNA niż Mug. Stwierdziliśmy, że Mug ulega nadekspresji, gdy komórki wchodzą w fazę stacjonarną i jest utrzymuje się na dość wysokim poziomie w komórkach spoczynkowych. Dotyczy to komórek hodowanych w bogatych lub minimalnych pożywkach, a główna regulacja kubka odbywa się na poziomie mRNA. Chociaż ekspresja kubka jest silnie zależna od czynnika sigma czynnika sigma fazy stacjonarnej, sigma(S), gdy komórki są hodowane w podłożu minimalnym, wykazuje tylko niewielką zależność od sigma(S), gdy komórki są hodowane w bogatym pożywce. Gdy komórki mug są utrzymywane w fazie stacjonarnej przez kilka dni, nabywają one nabywają znacznie więcej mutacji niż ich odpowiedniki mug(+). Jest to prawdą zarówno w przypadku ung jak i ung(+), a większość nowych mutacji może nie być C do T. Nasze wyniki wskazują na biologiczną rolę Mug. wyniki pokazują, że biologiczna rola Mug jest zbieżna z jego ekspresją w komórkach. Ulega ona słabej ekspresji w komórkach rosnących wykładniczo i nie odgrywa widocznej roli w unikaniu mutacji w tych komórkach. w unikaniu mutacji w tych komórkach. W przeciwieństwie do tego, Mug jest dość obfity w komórkach komórkach w fazie stacjonarnej i odgrywa ważną rolę w zapobieganiu mutacjom na tym etapie wzrostu komórek. wzrostu komórek. W ten sposób Mug dołącza do bardzo małej grupy enzymów naprawy DNA, których główną funkcją jest główną funkcją jest unikanie mutacji w komórkach fazy stacjonarnej. --- Gen dla specyficznej dla niedopasowania uracylowej glikozylazy DNA (MUG) został zidentyfikowany w genomie Escherichia coli jako homolog sekwencji ludzkiej tyminowej glikozylazy DNA z aktywnością przeciwko niedopasowanym parom zasad uracylu. Badanie ekstraktów komórkowych doprowadziło nas do wykrycia nieznanej wcześniej glikozylazy DNA ksantyny (XDG) w E. coli. Testy glikozylazy DNA z oczyszczonymi enzymami wykazały, że nową aktywność XDG można przypisać MUG. Poniżej przedstawiamy biochemiczną charakterystykę aktywności glikozylazy DNA ksantyny w MUG. MUG dziki typ MUG posiada silniejszą aktywność przeciwko ksantynie niż uracylowi i jest aktywny wobec wszystkich DNA zawierających ksantynę (C/X, T/X, G/X, A/X i jednoniciowy X). Analiza potencjałów średniej siły wskazuje, że dwuniciowe pary zasad ksantynowych mają stosunkowo wąską różnicę energetyczną w przerzucaniu zasad, podczas gdy tendencja do przerzucania zasad uracylu następuje w kolejności C/U > G/U > T/U > A/U. Przeprowadzona mutageneza ukierunkowana na konserwowanych motywach ujawniła, że Asn-140 i Ser-23 są ważnymi determinantami dla aktywności XDG w E. coli MUG. Modelowanie molekularne i symulacje dynamiki molekularnej ujawniają różne wzory wiązań wodorowych w miejscu aktywnym E. coli MUG, które odpowiadają za różnice specyficzności między E. coli MUG i ludzką tyminową glikozylazą DNA, a także między MUG typu dzikiego a mutacjami mutantami Asn-140 i Ser-23. Badanie to podkreśla rolę korzystnych interakcji wiążących w modulowaniu specyficzności glikozylaz DNA.
Jaka jest rola niedopasowanej glikozylazy uracylowej (Mug) w naprawie DNA?
Uracylowa glikozylaza DNA specyficzna dla niedopasowań (MUG) należy do homologicznej rodziny glikozylaz DNA, które inicjują naprawę niedopasowań G:U/T. Struktura krystaliczna kompleksu naprawczego Mug wskazuje na preferencję Mug dla niedopasowań G:U nad G:T. Niemniej jednak, Mug nie naprawia niedopasowań U:G lub T:G in vivo. Mug posiada aktywność glikozylazy ksantynowej DNA (XDG) w E.coli. Aktywność naprawcza Mug jest silniejsza wobec ksantyny niż uracylu. Co więcej, Mug usuwa alkilowaną zasadę, 3, N(4)-etenocytozynę (epsilonC) z niedopasowań epsilonC:G i może być jedynym enzymem w E.coli, który może usunąć ten mutagenny addukt. Zatem główną rolą Mug może być naprawa uszkodzeń DNA spowodowanych przez egzogenne czynniki chemiczne, takie jak aldehyd chlorooctowy.