Guz Wilmsa (WT) jest pediatrycznym nowotworem nerki, który powstaje w wyniku niepowodzenia programu rozwojowego płodu. Brak możliwych do zidentyfikowania mutacji w większości WT większości WT sugeruje częsty udział aberracji epigenetycznych w WT. WT. Dlatego też przeprowadziliśmy analizę hipermetylacji promotorów w całym genomie w WT i zidentyfikowaliśmy hipermetylację w chromosomie 5q31 obejmującą 800 kilobaz (kb) (kb) i ponad 50 genów. Wszystkie metylowane geny należą do alfa-, beta-, i gamma-protokadheryny (PCDH) (Human Genome Organization nomenklatura PCDHA@, PCDHB@ i PCDHG@, odpowiednio). To pokazuje, że wyciszanie epigenetyczne dalekiego zasięgu (LRES) występuje w guzach rozwojowych, jak również w guzach dorosłych. Analiza łańcuchowej reakcji polimerazy bisulfitowej wykazała, że hipermetylacja PCDH jest częstym zjawiskiem występującym we wszystkich podtypach guza Wilmsa. Hipermetylacja jest zgodna ze zmniejszoną ekspresją PCDH w guzach. ZMIANY PREKURSOROWE WT nie wykazały hipermetylacji PCDH, co sugeruje, że hipermetylacja PCDH de novo występuje podczas progresji nowotworu złośliwego. Dyskretne granice domeny PCDH są wyznaczone przez nagłe zmiany w modyfikacjach histonów; niemetylowane geny flankujące LRES są związane z permisywnymi znakami, które są nieobecne w metylowanych genach w obrębie domeny. Wyciszone geny są oznaczone z niedozwoloną dimetylacją histonu 3 lizyny 9. Analiza ekspresji embrionalnych mysich nerek i różnicujących się szczurzych metanefrycznych komórek mezenchymalnych wykazuje, że ekspresja Pcdh jest regulowana rozwojowo, a geny Pcdhg@ ulegają ekspresji w komórkach blastemalnych. Co ważne, pokazujemy, że PCDHs negatywnie regulują kanoniczną sygnalizację Wnt, ponieważ indukowana krótkim interferującym RNA redukcja białek kodowanych przez PCDHG@ prowadzi do podwyższonego poziomu białka beta-kateniny, zwiększonej aktywności reportera beta-kateniny / czynnika komórkowego (TCF) i indukcji genów docelowych genów docelowych Wnt. I odwrotnie, nadekspresja PCDH tłumi aktywność reporterową beta-kateniny / TCF, a także hamuje tworzenie kolonii i wzrost komórek nowotworowych w miękkim agarze. Tak więc PCDH są kandydatami na supresory nowotworów, które modulują szlaki regulacyjne o krytycznym znaczeniu dla rozwoju i choroby, takie jak kanoniczna sygnalizacja Wnt. --- Hipermetylacja DNA promotora i represyjna chromatyna stanowią częsty mechanizm częsty mechanizm inaktywacji genów w nowotworach. Istnieje duże zainteresowanie analizą mechanizmów leżących u podstaw tego nieprawidłowego wyciszania. Badania wykazały zmiany w jądrowej organizacji chromatyny w komórkach nowotworowych, jak również nieprawidłowej metylacji z wyciszaniem sąsiednich genów na dużą odległość. genów. Ponadto, niektóre nowotwory wykazują wysoką częstość występowania metylacji promotorów określany jako fenotyp metylatora wysp CpG. Tutaj przeanalizowaliśmy rolę architektury chromatyny jądrowej dla genów w hipermetylowanych stanach nieaktywnych i niemetylowanych niemetylowanych stanach aktywnych i jej związek z wyciszaniem dalekiego zasięgu i fenotypem metylatora wysp CpG fenotypem metylatora wyspowego. Stosując połączone barwienie immunologiczne dla aktywnych/represyjnych markerów chromatyny i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w liniach komórkowych raka jelita grubego pokazujemy, że nieprawidłowe wyciszanie tych genów występuje bez wymogu dla ich umiejscowienia w domenach heterochromatycznych. Co ważne, hipermetylacja, nawet jeśli jest związana z długotrwałym epigenetycznym wyciszaniem sąsiednich genów sąsiednich genów, występuje niezależnie od ich euchromatycznej lub heterochromatycznej lokalizacji. Łącznie wyniki te wskazują, że w nowotworach rozległe zmiany wokół chromatyny promotora poszczególnych genów lub klastrów genów mogą potencjalnie wystąpić lokalnie bez preferencji dla pozycji jądrowej i/lub powodując repozycjonowania. Odkrycia te mają ważne implikacje dla zrozumienia między organizacją jądrową a wzorcami ekspresji genów w nowotworach. raka. --- Pomimo ukończenia Projektu Poznania Ludzkiego Genomu, wciąż jesteśmy daleko od zrozumienia zdarzeń molekularnych leżących u podstaw zmian epigenetycznych w nowotworach. Rak jest chorobą DNA, w której występują zarówno zmiany genetyczne, jak i epigenetyczne przyczyniającymi się do zmian w ekspresji genów. Epigenetyka obejmuje wzajemne oddziaływanie między metylacją DNA, modyfikacjami histonów i ekspresją niekodujących RNA w regulacji transkrypcji genów. Obecnie wiemy, że geny supresorowe nowotworów geny supresorowe nowotworów, z promotorami związanymi z wyspami CpG, są często hipermetylowane i wyciszane w nowotworach. wyciszane w nowotworach, ale nie rozumiemy, co wyzwala ten proces i kiedy zachodzi podczas kancerogenezy. Epigenetyczne wyciszanie genów zawsze było jako lokalne zdarzenie wyciszające poszczególne geny, ale najnowsze dane wskazują, że wskazują, że duże regiony chromosomów mogą być koordynacyjnie tłumione; proces określany mianem proces określany jako wyciszanie epigenetyczne dalekiego zasięgu (LRES). LRES może obejmować megabazy DNA i obejmuje szerokie tworzenie heterochromatyny, któremu towarzyszy hipermetylacja klastrów sąsiadujących wysp CpG w regionie. Nie jest jasne nie jest jasne, czy LRES jest inicjowany przez jeden krytyczny gen docelowy, który rozprzestrzenia się i rozprzestrzenia się i wciela niewinne osoby postronne, analogicznie do dużych delecji genetycznych, czy też skoordynowane wyciszanie wielu genów jest ważne w kancerogenezie? W ciągu następnej dekady, wraz z ekscytującymi nowymi podejściami genomicznymi do analizy epigenomu i zainicjowanie projektu Human Epigenome Project, będziemy mogli lepiej zrozumieć między metylacją DNA i modyfikacjami chromatyny a ekspresją niekodujących RNA. niekodujących RNA, obiecując nowy zakres molekularnych markerów diagnostycznych raka i celów molekularnych dla terapii epigenetycznej raka. --- Fenotyp metylatora wysp CpG (CIMP), charakteryzujący się wyjątkowo wysoką częstotliwością metylacji dyskretnych wysp CpG, obserwuje się w 18% do 25% sporadycznych raków jelita grubego. Inny wzór hipermetylacji występujący w raka jelita grubego, określany jako długotrwałe wyciszenie epigenetyczne, jest związany z metylacją metylacją DNA/histonów w trzech różnych klastrach genów na chromosomie 2q14.2, pokazując, że hipermetylacja DNA może obejmować większe domeny chromosomalne i prowadzić do do wyciszenia flankujących, niezmetylowanych genów. Zbadaliśmy, czy te dwa fenotypy są ze sobą powiązane w raku jelita grubego. Status CIMP 148 sporadycznych raków jelita grubego określono metodą PCR specyficzną dla metylacji. My określiliśmy mutację BRAF V600E za pomocą amplifikacji PCR specyficznej dla zmutowanego allelu. Status metylacji genu MLH1 i trzech wysp CpG (EN1, SCTR i INHBB), odpowiadających trzem odrębnym klastrom wzdłuż 2q14.2, określono za pomocą PCR specyficzny dla metylacji. Średnia liczba miejsc wykazujących metylację w guzach CIMP+ wynosiła 2,21, w porównaniu z 1,22 dla osób z CIMP-, a różnica ta była wysoce istotna (P różnica była wysoce znacząca (P = 3,6 x 10(-8), test Manna-Whitneya). Co więcej, wszystkie guzy CIMP+ wykazywały hipermetylację co najmniej jednego z tych loci, w przeciwieństwie do guzów CIMP-. loci, w przeciwieństwie do guzów CIMP-, gdzie 18 (16%) próbek pozostało niezmetylowanych. Średnia liczba jednocześnie hipermetylowanych wysp CpG w 2q14.2 różni się znacznie między guzami CIMP- i CIMP+, co sugeruje różne efekty wyciszania domeny w tym regionie. wyciszania domeny w tym regionie. Biorąc pod uwagę, że liczba hipermetylowanych loci w 2q14.2 prawdopodobnie wpływa na zakres wyciszonych genów flankujących, wysoka częstotliwość jednoczesnej hipermetylacji trzech wysp CpG (EN1, SCTR i INHBB) może mieć potencjalny wpływ na mieć potencjalny wpływ na specyficzne cechy raków jelita grubego CIMP+. raka jelita grubego. --- Metylacja DNA i przebudowa chromatyny są często związane z wyciszanie genów zaangażowanych w kancerogenezę. Wyciszanie epigenetyczne dalekiego zasięgu (LRES) to mechanizm inaktywacji genów, który wpływa na wiele sąsiadujących wysp CpG i został opisany w różnych typach nowotworów u ludzi. Nie wiadomo jednak, czy nie wiadomo jednak, czy istnieje skoordynowana regulacja genów osadzonych w tych regionach w normalnych komórkach i we wczesnych stadiach progresji nowotworu. Aby lepiej scharakteryzować zdarzenia molekularne związane z regulacją i przebudową tych regionów przeanalizowaliśmy dwa regiony przechodzące LRES w ludzkim raku okrężnicy w modelu mysim. Wykazaliśmy, że LRES występuje również w mysim raku in in vivo i naśladuje molekularne cechy ludzkiego zjawiska, a mianowicie, obniżenie ekspresji genów, nabycie nieaktywnych znaczników histonowych oraz hipermetylacja DNA określonych wysp CpG. Geny osadzone w tych regionach wykazały dynamiczną i autonomiczną regulację podczas różnicowania komórek jelitowych myszy różnicowania komórek jelitowych myszy, wskazując, że w rozważanych tutaj ramach skoordynowana regulacja w LRES jest ograniczona do raka. Nieoczekiwanie, łagodne gruczolaki u myszy Apc(Min/+) wykazywały nadekspresję większości genów, na które wpływa przez LRES w raku, co sugeruje, że represyjna przebudowa regionu jest późnym wydarzeniem. Analiza immunoprecypitacji chromatyny izolatora transkrypcyjnego izolatora transkrypcyjnego CTCF w mysich komórkach raka okrężnicy ujawniła zaburzone granice domen chromatyny w porównaniu z normalnymi komórkami. w porównaniu z normalnymi komórkami. Złośliwa regresja komórek nowotworowych przez różnicowanie in vitro skutkowała częściowym odwróceniem LRES i wzmocnieniem wiązania wiązania CTCF. Wnioskujemy, że geny w regionach LRES są regulowane plastycznie w różnicowaniu komórek i hiperproliferacji, ale są ograniczone do skoordynowanej represji przez zniesienie granic i autonomiczną regulację domen chromatyny w komórkach nowotworowych. domen chromatyny w komórkach nowotworowych. --- Zidentyfikowano zmiany genetyczne i epigenetyczne, które prowadzą do deregulacji deregulacji transkrypcji w nowotworach. Mechanizmy genetyczne mogą wpływać na pojedyncze geny lub regiony zawierające kilka sąsiednich genów, jak wykazano w przypadku zmian liczby kopii DNA. DNA. Niedawno doniesiono, że epigenetyczna supresja ekspresji genów ekspresji genów może również obejmować cały region; jest to znane jako wyciszanie epigenetyczne dalekiego zasięgu. wyciszanie epigenetyczne. Dostępne są różne techniki identyfikacji regionalnych zmian genetycznych, ale nie przeprowadzono jeszcze analizy na dużą skalę w celu uzyskać przegląd regionalnych zmian epigenetycznych. Przeprowadziliśmy wyczerpujące wyszukiwanie regionów podatnych na takie mechanizmy przy użyciu kombinacji analizy mapy korelacji transkryptomu i danych macierzy CGH dla serii raków pęcherza moczowego. raka pęcherza moczowego. Eksperymentalnie zweryfikowaliśmy jeden region kandydujący, wykazując metylację histonów prowadzącą do utraty ekspresji sąsiednich genów bez sąsiednich genów bez metylacji DNA.
W jaki sposób zachodzi wyciszanie epigenetyczne dalekiego zasięgu (LRES)?
Wyciszanie epigenetyczne dalekiego zasięgu (LRES) to mechanizm inaktywacji genów, który wpływa na wiele sąsiadujących wysp CpG i został opisany w różnych typach nowotworów u ludzi.