Obecnie nie ma opublikowanego raportu na temat izolacji i ostatecznej identyfikacji histonu H1 w Saccharomyces cerevisiae. Jednakże, niedawno wykazano, że gen HHO1 drożdży koduje przewidywane białko homologiczne do H1 wyższych eukariontów (Landsman, D. (1996) Trends Biochem. Sci. 21, 287-288; Ushinsky, S. C., Bussey, H. , Ahmed, A. A., Wang, Y., Friesen, J., Williams, B. A., i Storms, R. K. (1997) Yeast 13, 151-161), chociaż nie ma nie ma dowodów biochemicznych wskazujących, że Hho1p jest rzeczywiście drożdżowym histonem H1. My wykazaliśmy, że oczyszczony rekombinowany Hho1p (rHho1p) ma właściwości elektroforetyczne i chromatograficzne podobne do właściwości elektroforetyczne i chromatograficzne podobne do histonów łącznikowych. Białko tworzy stabilny trójskładnikowy kompleks z odtworzonym di-nukleosomem rdzenia in vitro w stosunku molowym rHho1p:rdzeń do 1. Rekonstytucja rHho1p z chromatyną pozbawioną H1 powoduje przerwę kinetyczną przy około 168 parach zasad w mikrokokowym wzorcu trawienia nukleazą nukleazy w chromatynie. Wyniki te zdecydowanie sugerują, że Hho1p jest bona fide histonem łącznikowym. Usunęliśmy gen HHO1 i wykazaliśmy, że szczep jest żywotny i nie ma wad wzrostu ani krycia. Hho1p nie jest wymagany do wyciszania telomerów, podstawowej represji transkrypcji lub wydajnej sporulacji. W przeciwieństwie do mutacji histonów rdzeniowych, szczep hho1Delta nie wykazuje fenotypu fenotypu Sin lub Spt. Brak Hho1p nie prowadzi do zmiany w długości powtórzeń nukleosomowych długości powtórzeń nukleosomowych w chromatynie luzem, ani do różnic w rozszczepieniu nukleazy mikrokokowej in vivo miejsca rozszczepienia nukleazy mikrokokowej w poszczególnych genach, jak wykryto przez primer mapowanie wydłużenia starterów. --- Różnicowanie gamet obejmuje dramatyczne zmiany w chromatynie, wpływające na transkrypcję, mejozę i morfologię komórek. Sporulacja u Saccharomyces cerevisiae dzieli wiele cech chromatyny ze spermatogenezą, w tym 10-krotne zagęszczenie jądra. Aby zidentyfikować nowe białka zaangażowane w organizacji jądra, oczyściliśmy chromatynę z dojrzałych zarodników i odkryliśmy znaczące wzbogacenie histonu łącznikowego (Hho1). Funkcja Hho1 okazała się okazała się nieuchwytna podczas wzrostu wegetatywnego, ale tutaj wykazujemy jej dla wydajnej sporulacji i pełnego zagęszczenia genomu zarodników. Immunoprecypitacja chromatyny Hho1, a następnie sekwencjonowanie (ChIP-seq) ujawniły zwiększone wiązanie w całym genomie w dojrzałych zarodnikach i dostarcza nowych in vivo dowodów na wiązanie histonu łącznikowego z nukleosomalnym DNA łącznikowym. Łączymy również Hho1 z czynnikiem transkrypcyjnym Ume6, głównym represorem wczesnych genów mejotycznych. genów mejotycznych. Hho1 i Ume6 są zubożone podczas mejozy, a analiza opublikowanych danych ChIP-chip uzyskanych podczas wzrostu wegetatywnego ujawnia wysoką korelację wiązania obu białek w promotorach wczesnych genów mejotycznych. Co więcej, Ume6 promuje wiązanie Hho1 do promotorów genów mejotycznych. Zatem Hho1 może odgrywać podwójną rolę podczas sporulacji: Zubożenie Hho1 i Ume6 ułatwia początek mejozy poprzez aktywację początek mejozy poprzez aktywację wczesnych genów mejotycznych represjonowanych przez Ume6, podczas gdy wzbogacenie Hho1 w dojrzałych zarodnikach przyczynia się do zagęszczenia genomu zarodników. --- Dotychczasowe badania biochemiczne nie były w stanie zidentyfikować białka łącznikowego histonu H1 w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Homologia bazy danych przeszukując kompletny genom drożdży zidentyfikowano gen HHO1 (lub YPL127C, dawniej LPI17), który koduje białko posiadające dwa regiony wykazujące podobieństwo do domeny globularnej histonu H1 grochu. Aby ustalić, czy Hho1p może przyjąć kształt białka H1, przeprowadzono eksperymenty budowania modelu homologicznego przeprowadzono przy użyciu struktury domeny globularnej histonu H5 kurczaka jako podstawy dla porównania. Statystycznie istotne dopasowanie między każdą z dwóch globularnych domen Hho1p i struktury histonu H5 kurczaka, a wartości prawdopodobieństwa wskazują, że istnieje wartości prawdopodobieństwa wskazują, że istnieje mniej niż 1 na 100 szans, że takie że takie dopasowanie byłoby wynikiem zdarzenia losowego. Wyniki te potwierdzają propozycję, że Hho1p działa jako "dimer H1" i może być odpowiedzialny za zmniejszoną długość łącznika DNA obserwowaną między nukleosomalnymi cząsteczkami rdzenia. --- Skomplikowane, dynamiczne i absolutnie nieuniknione starzenie się wpływa na komórki i organizmy przez całe życie. organizmów przez cały okres ich życia. Napędzany przez różnorodne mechanizmy prowadzące do upośledzenia funkcji komórkowych i ostatecznie do śmierci, proces ten stanowi wyzwanie dla naukowców. wyzwaniem dla badaczy. Mechanizmy molekularne, ogólne zasady, którymi się kieruje i złożone wzajemne oddziaływanie na poziomie molekularnym i komórkowym są jeszcze mało poznane. Tutaj przedstawiamy nasze wyniki pokazujące związek między histonami łącznikowymi, strukturami chromatyny wyższego rzędu i procesem chronologiczną długością życia komórek drożdży. Poprzez usunięcie genu dla histonu łącznikowego histonu łącznikowego w Saccharomyces cerevisiae stworzyliśmy model do badania struktury chromatyny głównie na jej najbardziej nieuchwytnych i jak dotąd ledwie w procesach chronologicznej długości życia drożdży. chronologicznej długości życia. Zmutowane komórki wykazywały kontrowersyjne cechy wykazując wolniejszy wzrost niż typ dziki w połączeniu z lepszą przeżywalnością podczas całego procesu. całego procesu. Analiza globalnej organizacji chromatyny podczas różnych punktach czasowych wykazała pewną utratę górnych poziomów zagęszczenia chromatyny zagęszczenia chromatyny w komórkach pozbawionych histonu łącznikowego. Wyniki te podkreślają znaczenie tego histonu dla utrzymania struktur pętli chromatyny podczas starzenia. --- Cząsteczki rdzenia nukleosomu u eukariontów są połączone odcinkiem DNA, który jest zwykle związany z histonem łącznikowym. Tutaj pokazujemy na drożdżach, że obecność obecność drożdżowego histonu łącznikowego Hho1p hamuje ekspresję transkrybowanego genu pol II (MET15) osadzonego w rDNA. Delecje in vivo sekwencji Hho1p in vivo wykazały, że druga domena globularna jest wystarczająca do tej represji. represji, podczas gdy obecność końca N jest wymagana do jej derepresji. W przeciwieństwie do tego, test run-on potwierdzony eksperymentem ChIP wykazał że Hho1p jest wymagany do maksymalnej procesywności pol I podczas transkrypcji rDNA. Eksperymenty z dostępnością psoralenu wykazały, że Hho1p jest niezbędny do normalnego zagęszczania rDNA. zagęszczania rDNA. Analiza ekspresji macierzy DNA porównująca transkrypcje RNA w szczepach szczepach typu dzikiego i hho1 przed i po szoku termicznym wykazała, że Hho1p jest niezbędny do osiągnięcia poziomów mRNA typu dzikiego transkryptów, które kodują rybosomalne składniki. Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że Hho1p jest zaangażowany w zagęszczanie rDNA i podobnie jak histony rdzeniowe, jest wymagany do wydajnej transkrypcji rDNA przez pol I. --- Histon łącznikowy Hho1p Saccharomyces cerevisiae nie jest niezbędny dla żywotności komórek i bardzo niewiele wiadomo o jego funkcji in vivo. Pokazujemy, że delecja HHO1 (hho1Delta) tłumi defekt w wyciszaniu transkrypcji spowodowany mutacją w domenie globularnej histonu H4. hho1Delta również tłumi redukcję wyciszania HML przez delecję SIR1, która jest zaangażowany w tworzenie cichej chromatyny w HML. Dalej pokazujemy, że hho1Delta tłumi zmiany w strukturze cichej chromatyny spowodowane mutacją histonu H4 i sir1Delta. Wyniki te sugerują, że HHO1 odgrywa negatywną rolę w chromatynie cichej transkrypcyjnie. Dostarczamy również dowodów na to, że Hho1p utrudnia tworzenie cichej chromatyny de novo, ale nie wpływa na stabilność wcześniej istniejącej cichej chromatyny. W przeciwieństwie do kanonicznych histonów łącznikowych w wyższych eukariontów, które mają pojedynczą konserwatywną domenę globularną, Hho1p posiada dwie domeny globularne. Pokazujemy, że karboksylowo-końcowa domena globularna Hho1p jest zbędna dla jego funkcji, co sugeruje, że sposób działania Hho1p jest podobny do działania kanonicznych histonów łącznikowych. --- Pomimo istnienia pewnych różnic między drożdżami a wyższymi komórkami eukariotycznymi komórek eukariotycznych, znaczna część naszej wiedzy na temat struktury i funkcji chromatyny została uzyskana dzięki eksperymentom na Saccharomyces cerevisiae. Jedną z osobliwości komórek S. cerevisiae jest niezwykły i mniej obfity łącznik histon, Hho1p. Informacje na temat udziału Hho1p w organizacji chromatyny wyższego rzędu u drożdży są skąpe. organizacji chromatyny wyższego rzędu. W próbie poszukiwania możliwych wpływu Hho1p na globalną organizację chromatyny, zastosowaliśmy metodę Chromatin Comet Assay (ChCA) na komórkach drożdży pozbawionych HHO1. Wyniki pokazały że zmutowane komórki wykazywały wysoce zniekształconą chromatynę wyższego rzędu organizację chromatyny. Charakterystyczne jest, że chromatyna zubożona w histon łącznikowy generalnie wykazywała dłuższe pętle chromatyny niż typ dziki. Zgodnie z danymi mikroskopii sił atomowych dane z mikroskopii sił atomowych chromatyna typu dzikiego wydawała się dobrze zorganizowana w strukturach bardzo przypominających włókno "30-nm" w przeciwieństwie do HHO1 znokautowanych drożdży. --- Saccharomyces cerevisiae koduje pojedynczy histon łącznikowy, Hho1p, z dwoma domenami domenami kulistymi. Podniosło to możliwość, że Hho1p może wiązać się do dwóch rdzeni nukleosomów jednocześnie. rdzeni nukleosomów jednocześnie. Aby ocenić ten pomysł, zbadaliśmy zdolność czterokierunkowego złącza, unieruchomionego na powierzchni kulki magnetycznej, aby przyciągnąć w dół radioznakowanego połączenia czterokierunkowego w obecności różnych białek Hho1 białek. Wiadomo, że połączenia czterokierunkowe wiążą się z H1, prawdopodobnie z powodu podobieństwa struktury do DNA w nukleosomalnym punkcie wejścia/wyjścia. Znaleźliśmy znaczny wzrost zdolności pełnej długości Hho1p do ściągania w warunkach jonowych, w których obie domeny globularne mogą się wiązać. domeny mogły się wiązać. Wiązanie było specyficzne dla struktury, ponieważ użycie dwuniciowego DNA lub mutanta Hho1p, w którym drugie miejsce wiązania DNA domeny globularnej domeny globularnej 1 zostało zniesione, spowodowało znaczny spadek wiązania mostkowego wiązania. Dodatkowo, wiązanie mostkowe wymagało kowalencyjnego przyłączenia między dwóch domen globularnych, ponieważ traktowanie proteazą czynnika Xa kompleksu utworzonego przez zmodyfikowany Hho1p, który zawierał miejsce rozszczepienia czynnika Xa między między dwiema domenami globularnymi spowodowało znaczne uwolnienie znakowanego radioaktywnie połączenia czterokierunkowego junction. Odkrycia te wykazały, że dwie domeny globularne niezależnie związane z dwiema różnymi cząsteczkami połączenia czterokierunkowego w sposób wymagający sposób, który wymagał reszt aminokwasowych zaangażowanych w specyficzne dla struktury wiązanie w nukleosomie. Omawiamy implikacje tych odkryć dla strukturę chromatyny drożdży i proponujemy model, w którym pojedyncze białko Hho1 wiąże się z dwoma szeregowo sąsiadującymi nukleosomami. --- U praktycznie wszystkich organizmów eukariotycznych, DNA łącznikowy między nukleosomami jest związany z histonem określanym jako histon łącznikowy lub histon H1. U Saccharomyces cerevisiae, HHO1 koduje domniemany histon łącznikowy o bardzo znaczącej homologii do histonu H1. Kodowane białko ulega ekspresji w jądrze, ale nie wykazano nie wykazano wpływu na globalną strukturę chromatyny, ani jego delecja nie wykazała żadnego wykrywalnego fenotypu. Eksperymenty montażu chromatyny in vitro z rekombinowanym HHO1p wykazały, że jest on zdolny do kompleksowania z dinuncleosomami w sposób podobny sposób do histonu H1. Tutaj donosimy, że podczas gdy zakłócenie HHO1 ma niewielki wpływ na poziomy RNA większości transkryptów komórkowych, istnieje wiele wyjątki. Pomiar stężenia HHO1p w komórce typu dzikiego wykazał stechiometrię stechiometrię około jednej cząsteczki HHO1p na 37 nukleosomów. Lokalizacja HHO1p w chromatynie, przy użyciu techniki immunoprecypitacji, wykazała preferencyjne wiązanie HHO1p do sekwencji rDNA. Wyniki te sugerują, że HHO1p może odgrywać podobną rolę do histonów łącznikowych, ale w ograniczonych lokalizacjach w chromatynie. chromatynie.
Czy histon łącznikowy istnieje w genomie drożdży?
Tutaj przedstawiamy nasze wyniki pokazujące związek między histonami łącznikowymi, strukturami chromatyny wyższego rzędu i procesem chronologicznego życia komórek drożdży. Charakterystyczne jest, że chromatyna pozbawiona histonów łącznikowych wykazywała dłuższe pętle chromatynowe niż typ dziki. Wyniki te sugerują, że HHO1p może odgrywać podobną rolę do histonów łącznikowych, ale w ograniczonych miejscach w chromatynie. Wiązanie było specyficzne dla struktury, ponieważ użycie dwuniciowego DNA lub mutanta Hho1p, w którym drugie miejsce wiązania DNA domeny globularnej 1 zostało zniesione, spowodowało znaczny spadek wiązania mostkowego.