Ludzkie deaminazy cytydyny APOBEC3G (A3G) i APOBEC3F (A3F) hamują replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) z niedoborem Vif. HIV-1 Vif pokonuje te czynniki ograniczające gospodarza poprzez wiązanie się z nimi i indukowanie ich proteasomalną degradację. Interakcje Vif-A3G i Vif-A3F są atrakcyjnymi dla rozwoju leków przeciwwirusowych, ponieważ hamowanie tych interakcji może pozwolić mechanizmowi obronnemu gospodarza kontrolować replikację HIV-1. Niedawno że aminokwasy Vif D(14)RMR(17) są ważne dla funkcjonalnej interakcji i degradacji HIV-1. interakcji i degradacji wcześniej zidentyfikowanego mutanta opornego na Vif A3G (D128K-A3G). Jednakże, determinanty Vif ważne dla funkcjonalnej interakcji z A3G i A3F nie zostały w pełni scharakteryzowane. Aby zidentyfikować Aby zidentyfikować te determinanty, przeprowadziliśmy obszerną analizę mutacyjną HIV-1 Vif. Nasza analiza ujawniła dwa odrębne determinanty Vif, aminokwasy Y(40)RHHY(44) i D(14)RMR(17), które są niezbędne do wiązania się odpowiednio z A3G i A3F. Co ciekawe, mutacja regionu wiążącego A3G zwiększyła zdolność Vif do hamowania A3F. Wiązanie Vif do D128K-A3G było również zależne od regionu Y(40)RHHY(44) ale nie od regionu D(14)RMR(17). Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, późniejsza neutralizacja aktywności przeciwwirusowej D128K-A3G wymagała substytucji determinanty Vif D(14)RMR(17) przez SEMQ, podobne do SERQ aminokwasów w wirusie niedoboru odporności SIV(AGM) Vif, który jest zdolny do neutralizujący D128K-A3G. Badania te są pierwszymi, które wyraźnie identyfikują dwa odrębne regiony Vif, które są krytyczne dla niezależnych interakcji z A3G i A3F. Farmakologiczna ingerencja w interakcje Vif-A3G lub Vif-A3F może skutkować silnym hamowaniem replikacji HIV-1 przez białka APOBEC3. --- Ludzkie APOBEC3G (A3G) i APOBEC3F (A3F) hamują replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) z niedoborem Vif. ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). HIV-1 Vif pokonuje te czynniki gospodarza poprzez wiązanie się z nimi i indukowanie ich degradacji. W ten sposób Vif-A3G i Vif-A3F są atrakcyjnymi celami dla rozwoju leków przeciwwirusowych, ponieważ hamowanie tych interakcji przeciwwirusowych, ponieważ hamowanie tych interakcji może pozwolić mechanizmowi obrony gospodarza gospodarza na kontrolowanie replikacji HIV-1. Ostatnio doniesiono, że aminokwasy od 105 do 156 A3G są zaangażowane w interakcję z Vif; jednak, do tej pory region A3F zaangażowany w wiązanie Vif nie został zidentyfikowany. Wykorzystując nasze wcześniej zgłoszone mutanty Vif, które są zdolne do wiązania się tylko z A3G (wiązanie 3G) lub tylko A3F (wiązanie 3F), w połączeniu z serią chimer A3G-A3F zmapowaliśmy domeny interakcji APOBEC3-Vif. Odkryliśmy, że domena A3G, która oddziałuje z regionem Vif YRHHY, znajduje się między aminokwasami 126 i 132 kwasami 126 i 132 A3G, co jest zgodne z wnioskami przedstawionymi w poprzednich badaniach. poprzednich badaniach. Domena A3F, która oddziałuje z regionem Vif DRMR, nie występowała w domenie homologicznej, ale występowała w domenie homologicznej, ale zamiast tego znajdowała się między aminokwasami 283 i 300 A3F. Badania te są pierwszymi, które zidentyfikowały domenę A3F, która oddziałuje z regionem Vif DRMR i pokazują, że różne domeny A3G i A3F oddziałują z różnymi regionami Vif. Farmakologiczne hamowanie jednej lub obu tych interakcji Vif-A3 powinno zapobiegać degradacji białek APOBEC3 i może być stosowana jako terapia przeciwko HIV-1. --- Skuteczne wewnątrzkomórkowe patogeny muszą omijać lub neutralizować wrodzone mechanizmy obronne obronę komórek gospodarza i uczynić środowisko komórkowe sprzyjającym replikacji. replikacji. Na przykład, aby skutecznie replikować się w limfocytach T CD4(+), ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) koduje białko zwane wirusowym czynnikiem zakaźności (Vif). czynnik zakaźności (Vif), który promuje patogenezę poprzez wyzwalanie degradację retrowirusowego czynnika restrykcyjnego APOBEC3G. Inne białka APOBEC3 zostały zaangażowane w restrykcję HIV-1, ale odpowiedni repertuar pozostaje niejednoznaczny. pozostaje niejednoznaczny. Tutaj przedstawiamy pierwszą kompleksową analizę kompletnych, siedmioosobowych ludzkich i rezuskich rodzin APOBEC3 w restrykcji HIV-1. Oprócz APOBEC3G, odkryliśmy, że trzy inne ludzkie białka APOBEC3, APOBEC3D, APOBEC3F i APOBEC3H, są silnymi czynnikami restrykcyjnymi HIV-1. Te cztery białka ulegają ekspresji w limfocytach T CD4(+), są pakowane i i ograniczają HIV-1 z niedoborem Vif, gdy ulegają stabilnej ekspresji w limfocytach T, mutują prowirusowy DNA i są zwalczane przez HIV-1 Vif. Ponadto, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G i APOBEC3H z makaka rezus również są pakowane do i ograniczają HIV-1 z niedoborem Vif, gdy jest stabilnie wyrażany w komórkach T, i wszystkie są neutralizowane przez białko Vif wirusa niedoboru odporności. Z drugiej strony, ani ludzkie, ani rezusowe APOBEC3A, APOBEC3B, ani APOBEC3C nie miały znaczącego wpływu na replikację HIV-1. wpływ na replikację HIV-1. Dane te silnie wskazują na połączenie czterech białek białek APOBEC3 - APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G i APOBEC3H - w restrykcji HIV-1. restrykcji. --- Kilku członków rodziny APOBEC3 komórkowych czynników restrykcyjnych zapewnia wewnętrzną odporność gospodarza na infekcje wirusowe. W szczególności, APOBEC3DE, APOBEC3F, APOBEC3G i APOBEC3H haplotypy II, V i VII zapewniają ochronę przeciwko HIV-1Δvif poprzez hipermutację genomu wirusowego, hamowanie odwrotnej transkrypcji i hamowanie integracji wirusowego DNA z genomem gospodarza. genomu gospodarza. HIV-1 przeciwdziała białkom APOBEC3 poprzez kodowanie wirusowego białka Vif, które zawiera odrębne domeny, które specyficznie oddziałują z tymi białkami APOBEC3 aby zapewnić ich proteasomalną degradację, umożliwiając replikację wirusa. replikację wirusa. Tutaj dokonujemy przeglądu naszego obecnego zrozumienia struktury APOBEC3, mechanizmów edycji i nieedytujących mechanizmów restrykcji, w których pośredniczy APOBEC3, interakcji Vif-APOBEC3 które wyzwalają degradację APOBEC3, oraz wkład białek APOBEC3 w ograniczaniu i kontroli replikacji HIV-1 u zakażonych pacjentów. --- W ludzkim genomie gen katalitycznego polipeptydu apolipoproteiny B edytującego mRNA gen polipeptydu (APOBEC)3 rozszerzył się do tandemowej macierzy genów określanych jako APOBEC3A-G. Dwóch członków tej rodziny, APOBEC3G i APOBEC3F, zostało uznanych za mają silną aktywność przeciwko niedoborowi czynnika zakaźności wirionów (Deltavif) ludzkiego wirusa niedoboru odporności 1 (HIV-1). Enzymy te ulegają enkapsydacji w wirionach Deltavif HIV-1 i w następnej rundzie infekcji deaminują nowo nowo zsyntetyzowane odwrotne transkrypty. Lentiwirusowe białko Vif zapobiega deaminacji poprzez deaminacji poprzez indukowanie degradacji APOBEC3G i APOBEC3F. Donosimy tutaj że dwaj dodatkowi członkowie rodziny APOBEC3, APOBEC3B i APOBEC3C, mają silną aktywność przeciwwirusową przeciwko małpiemu wirusowi niedoboru odporności (SIV), ale nie HIV-1. Oba enzymy były enkapsydowane w wirionach HIV-1 i SIV i były aktywne przeciwko Deltavif SIV(mac) i SIV(agm). SIV Vif neutralizował aktywność przeciwwirusową APOBEC3C, ale nie APOBEC3B. APOBEC3B indukował obfite mutacje G --> A zarówno w odwrotnych transkryptach SIV typu dzikiego, jak i Deltavif. APOBEC3C indukował znacznie mniej mutacji. APOBEC3F okazał się być aktywny przeciwko SIV i wrażliwy na SIV(mac) Vif. Odkrycia te wskazują na możliwość, że różni członkowie rodziny APOBEC3 działają w celu neutralizacji określonych lentiwirusów. --- Ludzkie APOBEC3G i inne deaminazy cytydyny APOBEC3 hamują różne retrowirusy, w tym HIV-1 z niedoborem Vif. Te białka gospodarza są pakowane w cząsteczki wirusowe i hamują replikację wirusa w nowych komórkach docelowych. Wiadomo, że A3G i A3F są skutecznie pakowane do wirionów HIV-1 poprzez wiązanie do 7SL RNA poprzez domenę Gag NC; jednak mechanizmy pakowania innych białek APOBEC3 są słabo poznane. APOBEC3 są słabo zdefiniowane. Obecnie wykazaliśmy, że APOBEC3C (A3C) może być skutecznie pakowane do wirionów HIV-1, które mają niedobór wirusowego genomowego RNA. Zahamowanie enkapsydacji 7SL RNA do wirionów HIV-1 blokowało pakowanie A3G, ale nie A3C. Podczas gdy domena NC jest wymagana do skutecznego pakowania A3G, delecja tej domeny miała niewielki wpływ na pakowanie A3C pakowanie do cząsteczek HIV-1 Gag. A3C oddziaływał z HIV-1 Gag, co było zależne od domeny MA zależne od domeny MA i zależne od RNA. Usunięcie domeny MA HIV-1 Gag hamowała pakowanie A3C, ale nie A3G do cząsteczek HIV-1 Gag. Tak więc, A3G i A3C ewoluowały, aby wykorzystywać różne mechanizmy do namierzania retrowirusów. --- Ludzkie deaminazy cytydyny APOBEC3 (A3), takie jak APOBEC3G (A3G) i APOBEC3F (A3F), są silnymi inhibitorami ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). HIV-1 Vif (wirusowy czynnik zakaźności) wiąże białka A3 i ukierunkowuje te białka do ubikwitynacji i degradacji proteasomalnej. W związku z tym terapeutyczne blokowanie interakcji Vif-A3 ma stymulować naturalną aktywność przeciwwirusową poprzez ratowanie aktywność przeciwwirusową poprzez ratowanie ekspresji APOBEC i pakowania wirionów. W tym badanie, opisujemy udane zastosowanie testu komplementacji fragmentu białka Protein Fragment Complementation Assay (PCA) w oparciu o enzym β-laktamazę TEM-1 do badania interakcji Vif-A3. interakcji Vif-A3. PCA opiera się na interakcji między dwoma partnerami wiążącymi białko (np. (np. Vif i A3G), które są połączone z dwiema połówkami wyciętego białka markerowego (β-laktamazy). białka markerowego (β-laktamazy). Wiązanie dwóch partnerów powoduje reasemblację β-laktamazę, a tym samym odtwarza jej aktywność. Aby zweryfikować nasz test zbadaliśmy wpływ dobrze opisanych mutacji Vif (DRMR, YRHHY) i A3G (D128K) na interakcję między tymi dwoma białkami. Dodatkowo zbadaliśmy interakcję ludzkiego Vif z innymi członkami rodziny A3: A3F i APOBEC3C (A3C). Nasze wyniki pokazują możliwość zastosowania PCA jako prostej i niezawodnej techniki technika oceny interakcji Vif-A3. Ponadto, w porównaniu z testami koimmunoprecypitacji, PCA okazało się być bardziej czułą techniką technika ilościowej oceny interakcji Vif-A3. Tak więc, z naszymi wyniki, dochodzimy do wniosku, że PCA można wykorzystać do ilościowego badania określonych domen, które mogą być zaangażowane w interakcję między białkami Vif i APOBEC.
Którzy członkowie rodziny białek APOBEC3 są w stanie hamować replikację HIV-1 z niedoborem Vif?
Haplotypy II, V i VII APOBEC3G, APOBEC3F, APOBEC3DE, APOBEC3A i APOBEC3H zapewniają ochronę przed HIV-1 z niedoborem Vif poprzez hipermutację genomu wirusa, hamowanie odwrotnej transkrypcji i hamowanie integracji wirusowego DNA z genomem gospodarza.