Wstęp: Mięsak Ewinga / obwodowy pierwotny guz neuroektodermalny (ES/pPNET) jest często trudny do odróżnienia od innych małych guzów okrągłokomórkowych. Fuzje genów EWS-Ets, które wynikają z translokacji chromosomalnych w tym nowotworze stanowią potencjalne molekularne markery diagnostyczne. Aby zastosować te markery molekularne markerów molekularnych do powszechnie dostępnych materiałów archiwalnych, oceniliśmy wykonalność wykrycia EWS-Ets, w tym transkryptów fuzyjnych EWS-Fli1 i EWS-ERG w w tkankach zatopionych w parafinie i ich wartość diagnostyczną w wykrywaniu ES/pPNET. METODY: Trzynaście zatopionych w parafinie próbek ES/pPNET pobrano z archiwów. archiwów. Trzynaście przypadków innych guzów z cechami małych okrągłych komórek (w tym mięsaka prążkowanokomórkowego, nerwiaka niedojrzałego, chłoniaka, raka drobnokomórkowego oraz desmoplastyczny guz drobnokomórkowy) wykorzystano jako kontrole negatywne. Beta-aktyna i beta2-mikroglobulina zostały użyte jako kontrole wewnętrzne. Zagnieżdżony łańcuch odwrotnej Łańcuchowa reakcja odwrotnej transkryptazy-polimerazy (RT-PCR) została przeprowadzona w celu wykryć transkrypty fuzyjne EWS-Fli1 i EWS-ERG. WYNIKI: Beta-aktynę i beta2-mikroglobulinę wykryto odpowiednio w 10/13 i 13/13 ES/pPNET. ES/pPNET. Transkrypty fuzyjne EWS-Fli1 wykryto w 11 z 13 (85%) ES/pPNET. (85%) ES/pPNET. Trzy chimeryczne transkrypty, wszystkie EWS-Fli1, wykryto w próbkach ES/pPNET. ES/pPNET. Spośród 11 przypadków EWS-Fli1-pozytywnych, 7 przypadków miało transkrypt fuzyjny typu I obejmujący fuzję egzonu 7 EWS z egzonem 6 Fli1, 2 przypadki miały transkrypt fuzyjny typu II transkrypt fuzyjny obejmujący egzon 7 EWS z egzonem 5 Fli1, a 2 przypadki wyrażały transkrypty fuzyjne obejmujące ekson 7 EWS i ekson 8 Fli1. Typ I Fuzja EWS-Fli1 przeważała nad innymi typami. Typy fuzji nie mogły być rozróżnić w pozostałych 2 przypadkach. Trzynaście kontroli negatywnych nie wykazało wykrywalnych wiadomości chimerycznych. Istniał znaczący związek między EWS-Fli1 a ekspresją CD99. WNIOSKI: Molekularne wykrywanie transkryptów fuzyjnych EWS-Fli1 w utrwalonym w formalinie materiale zatopionym w parafinie za pomocą zagnieżdżonego RT-PCR jest wykonalne i jest użyteczne w diagnostyce i diagnostyce różnicowej ES/pPNET. --- Oceniliśmy wykonalność i przydatność reakcji łańcuchowej odwrotnej transkryptazy-polimerazy reakcji łańcuchowej odwrotnej transkryptazy (RT-PCR) na aspiratach cienkoigłowych do kategoryzacji małych guzów z niebieskich okrągłych komórek (SBRCT). Łącznie 51 przypadków, w tym 25 mięsaków Ewinga mięsaka Ewinga/obwodowych pierwotnych guzów neuroektodermalnych (PNET), 11 mięsaki prążkowanokomórkowe, 13 nerwiakowłókniaków i 2 desmoplastyczne małe okrągłokomórkowe guzy (DSRCT). Wykrycie transkryptów fuzyjnych EWS-FLI1 (20/25) i EWS-ERG (4/25) rozwiązało 24 z 25 przypadków mięsaka Ewinga/PNET. Transkrypcja transkrypt fuzyjny PAX3/7-FKHR wykryto w 2 z 4 przypadków mięsaka pęcherzykowego a transkrypt EWS-WT1 w obu przypadkach DSRCT. Hydroksylaza tyrozyny hydroksylazy tyrozynowej i transkryptów dekarboksylazy 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (dopa) wykazano w 10 z 13 przypadków nerwiaka zarodkowego. Dla porównania, analiza immunocytochemiczna rozwiązała 19 (76%) z 25 mięsaków Ewinga, 9 (82%) z 11 mięsaków prążkowanokomórkowych. 11 mięsaków prążkowanokomórkowych, 6 (46%) z 13 nerwiaków niedrobnokomórkowych i 1 (50%) z 2 DSRCT. Ogólnie, RT-PCR rozwiązał 38 (86%) z 44 vs 35 (69%) z 51 przypadków za pomocą analizie immunocytochemicznej. RT-PCR można łatwo zastosować do aspiratów cienkoigłowych z SBRCT i znacznie ułatwia dokładne typowanie guza. --- Na przestrzeni lat zidentyfikowano szerokie spektrum kliniczno-patologiczne w obrębie rodziny guzów Ewinga (EFT). Ponieważ guzy te są chemiowrażliwe, ich prawidłowa i terminowa identyfikacja jest konieczna. Celem niniejszego badania było (1) przedstawienie zróżnicowanego profilu kliniczno-patologicznego i molekularnego EFT w naszych (2) określenie pragmatycznego podejścia do diagnozowania EFT, w szczególności do zastosowania technik pomocniczych, a mianowicie RT-PCR dla określonych transkryptów (EWS-FLI1, EWS-ERG) i FISH dla rearanżacji genu EWSR1, w niektórych przypadkach oraz (3) wykazanie użyteczności mikromacierzy tkankowych w tworzeniu nowego testu FISH. Pięćdziesiąt osiem EFT zidentyfikowano u 38 mężczyzn i 20 kobiet w przedziale wiekowym 1-65 lat (mediana, 16), głównie w kończynach dolnych (14) (24,1%). Większość pacjentów poddano chemioterapii neoadiuwantowej z następową operacją. chemioterapię z następowym zabiegiem chirurgicznym. Histopatologicznie, rozpoznanie EFT początkowo zaproponowano w 41/58 (70,6%) guzów. Podczas przeglądu 59% guzów wykazywało rozproszony wzór, podczas gdy 41% wykazywało rozety. Immunohistochemicznie, komórki nowotworowe były głównie rozproszone dodatnie dla CD99 (48/52) (92,3%); FLI-1 (17/18) (94,4%); zmiennie dla dla BCL2 (16/18) (88,8%), synaptofizyny (6/20) (35%), S100-P (2/7) (28,5%), CD56 (2/5) (40%), NSE (2/5) (40%), kalponina (3/4) (75%), EMA (5/24) (20,8%) i CK (3/24) (12,5%), te dwa ostatnie głównie ogniskowo. Pięćdziesiąt pięć guzów było EWS-FLI1, podczas gdy pojedynczy guz był EWS-ERG dodatni. Czułość dla PCR wynosiła 61%. Rearanżację EWSR1 wykryto metodą FISH w 12/13 mięsakach Ewinga/PNET. mięsaków Ewinga/PNET. Czułość testu EWSR1 wynosiła 92,3%, a swoistość 100%. Trzydzieści osiem guzów, w tym 14 EFT potwierdzonych molekularnie i 21 innych guzów przebadano pod kątem rearanżacji EWSR1. Wśród 21 niespokrewnionych guzów, rearanżację EWSR1 wykryto w kilku guzach mioepitelialnych, sporadycznych guzach desmoplastycznych i pozaszkieletowym chrzęstniakomięsaku śluzowatym. Ponadto, mikromacierz mikromacierz tkankowa z oddzielnym zestawem 8 EFT, potwierdzona w innym laboratorium przeanalizowano w celu walidacji testu rearanżacji EWSR1. 23/28 (82,1%) tkanek rdzenie mikromacierzy tkankowej, wybarwione metodą FISH, były interpretowalne, w tym rearanżację EWSR1, wykrytą w 20/28 rdzeniach tkankowych; nie wykryto jej w 3 rdzeniach wątrobowych w 3 rdzeniach wątrobowych i nie dające się zinterpretować w 5 (17,8%) rdzeniach. Klasyczne EFT można zdiagnozować z rozproszonym, błoniastym CD99 dodatnim, wewnątrzjądrowym FLI1 dodatnim i LCA w złośliwych okrągłych komórkach. W niekonwencjonalnych przypadkach W niekonwencjonalnych przypadkach niezbędne jest wykrycie towarzyszącego fuzji m-RNA za pomocą RT-PCR. W przypadku molekularnych konieczne jest wykazanie rearanżacji EWSR1 metodą FISH. FISH. Testy te powinny być interpretowane z uwzględnieniem korelacji kliniczno-patologicznej. Mikromacierze tkankowe do FISH są przydatne podczas walidacji nowego testu, zwłaszcza gdy mięsaki, takie jak EFT, wykazują mniejszą heterogenność genetyczną w komórkach guza. komórek. --- Translokacje chromosomalne generujące unikalne geny chimeryczne są wysoce charakterystyczne dla określonych mięsaków i sugerowano ich zastosowanie jako markerów diagnostycznych. jako markerów diagnostycznych. Z diagnostycznego patologicznego punktu widzenia, wykrywanie takich cytogenetycznych lub aberracji molekularnych w rutynowo przetwarzanych archiwalnych jest uważane za potężne narzędzie do diagnozowania nowotworów. Aby ocenić wykonalność i niezawodność molekularnego wykrywania transkryptu pochodzącego z chimerycznego genu w zatopionych w parafinie próbkach guza, my przeprowadziliśmy zagnieżdżoną reakcję łańcuchową odwrotnej transkrypcji-polimerazy (RT-PCR) w celu wykrycia chimerycznej wiadomości EWS-FLI1 w serii guzów rodziny Ewingów. guzów z rodziny Ewing. Spośród 24 próbek guza zatopionych w parafinie z 23 przypadków analizowanych, wiadomość chimeryczna była wykrywalna w 20 (83%) próbkach z 20 przypadków (87%) za pomocą tego zagnieżdżonego testu RT-PCR, podczas gdy żaden z 7 małych okrągłych komórek okrągłokomórkowych nie pochodzących z tej rodziny (3 mięsaki prążkowanokomórkowe pęcherzyków płucnych, 2 nerwiaki zarodkowe, 2 chłoniaki złośliwe). chłoniaki złośliwe) wykazały wykrywalne przekazy chimeryczne. W analizie sekwencji W analizie sekwencji produktów PCR, amplifikowane przekazy chimeryczne zawierały między eksonem 7 genu EWS i dowolnym z eksonów 5, 6 i 8 genu FLI1. genu FLI1. Proces wykrywania był zwykle zakończony w ciągu 3 dni, z wyjątkiem analizy sekwencji subseqent. Nasze wyniki potwierdzają zastosowanie tego testu molekularnego jako techniki pomocniczej w diagnostyce guzów z rodziny Ewinga przy użyciu materiału materiału zatopionego w parafinie. --- T(11.22)(q24.q12) powoduje ekspresję chimerycznego produktu RNA, EWS-FLI1. Ten produkt RNA ulega ekspresji w ponad 85% guzów należących do rodziny Ewing's Ewinga i jest coraz częściej wykorzystywany jako ostateczna charakterystyka tych nowotworów. nowotworów. W tym badaniu oceniliśmy łańcuch odwrotnej transkryptazy-polimerazy (RT-PCR) dla transkryptów fuzyjnych EWS-FLI1 w 18 nowotworach wywodzących się z małych komórek okrągłych. nowotworach. Obejmowały one sześć guzów z rodziny Ewinga i 12 nerwiakowłókniaków. Transkrypty fuzyjne EWS-FLI1 zidentyfikowano we wszystkich sześciu guzach Ewinga, ale także w dwóch z 12 nerwiaków niedrobnokomórkowych. Jeden neuroblastoma zawierał klasyczny transkrypt fuzji typu 1 transkrypt fuzji typu 1, a drugi transkrypt typu 1 zawierający wstawkę 66 bp (para zasad para), który nie pochodził z genu EWS lub FLI1. Obecność produktów fuzji EWS-FLI1 w RNA wyekstrahowanym z pierwotnego neuroblastoma sugeruje identyfikacja transkryptów fuzyjnych EWS-FLI1 nie jest patognomoniczna dla nowotworów nowotworów z rodziny Ewinga. Znaczenie kliniczne tych transkryptów fuzyjnych transkryptów w nerwiaku niedojrzałym nie jest znane. --- Przedstawiamy przypadek pacjenta, u którego rozpoznano mięsaka Ewinga wywodzącego się z tkanek miękkich. z tkanki miękkiej postawiono po skutecznym leczeniu rozlanego chłoniaka z dużych komórek B chłoniaka. 65-letnia kobieta zgłosiła się z szybko rosnącą masą w lewej 8 lat po skutecznej chemioterapii cyklofosfamidem, chlorowodorku hydroksydaunomycyny, winkrystyny i prednizolonu z powodu chłoniaka rozlanego z dużych komórek B. chłoniaka z dużych komórek B. Badanie tomograficzne i rezonans magnetyczny klatki piersiowej i rezonans magnetyczny klatki piersiowej ujawniły guz śródmięśniowy o wielkości 40 mm w lewej okolicy łopatki. Badanie histopatologiczne próbki z otwartej biopsji otwartej biopsji ujawniło mały guz okrągłokomórkowy, który wykazywał dodatnie barwienie dla CD99. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ wykazała rozszczepienie sygnału przez sondę break-apart dla genu EWS w chromosomie 22q12. Reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy potwierdziła ekspresję transkryptów fuzyjnych EWS-FLI1. Na podstawie Na podstawie tych wyników u pacjenta zdiagnozowano wtórnego mięsaka Ewinga. Jednak pomimo chemioterapii uzupełniającej zmarła z powodu przerzutów do płuc 2 lata po rozpoznaniu mięsaka Ewinga. po rozpoznaniu mięsaka Ewinga. Związane z terapią nowotwory hematologiczne nowotwory hematologiczne ze zrównoważonymi translokacjami były zgłaszane wcześniej. A mechanizm podobny do tego leżącego u podstaw rozwoju wtórnego nowotworu złośliwego może wyjaśniać występowanie tego nowotworu litego. --- CEL: Zbadanie ekspresji transkryptu fuzyjnego EWS-FLI1/ERG wynikającej z t(11;12)(q24;12) w tkankach zatopionych w parafinie i jej diagnostycznych implikacji dla mięsaka Ewinga / obwodowych pierwotnych guzów neuroektodermalnych (ES/pPNET). METODY: Jednoetapowa reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy-polimerazy (RT-PCR) została zastosowano do wykrycia charakterystycznego transkryptu fuzyjnego EWS-FLI1/ERG w 25 przypadkach ES/pPNET i 15 przypadkach innych małych guzów okrągłokomórkowych (w tym 8 przypadkach mięsak prążkowanokomórkowy, 4 przypadki mięsaka maziówkowego, 2 przypadki nerwiaka niedojrzałego i 1 przypadek chłoniaka). chłoniaka) przy użyciu tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. WYNIKI: Transkrypt fuzyjny EWS-FLI1/ERG wykryto w 20 z 25 przypadków ES/pPNET (80%). 15 przypadków kontrolnych innych niż ES/pPNET było negatywnych dla transkryptu fuzyjnego EWS-FLI1/ERG transkryptu fuzyjnego EWS-FLI1/ERG. WNIOSKI: Wykrycie transkryptu fuzyjnego EWS-FLI1/ERG jest wiarygodnym wskaźnikiem dla molekularnego rozpoznania ES/pPNET. Jednoetapowa RT-PCR jest praktyczną metodą dla takiej analizy w rutynowych tkankach nowotworowych zatopionych w parafinie.
Która technika jest stosowana do wykrywania transkryptów fuzyjnych EWS/FLI1?
Molekularne wykrywanie chimerycznych transkryptów EWS-FLI1 w nowotworach z rodziny Ewing jest przeprowadzane za pomocą reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji-polimerazy (RT-PCR).