Inhibitor fosfatazy białkowej-1 został oczyszczony z bydlęcej tkanki tłuszczowej. Białko białko miało pozorną masę cząsteczkową 32 kDa przez SDS/PAGE i promień Stokesa promień Stokesa 3,4 nm. Było fosforylowane przez kinazę białkową zależną od cAMP na reszcie reszta treonylowa; ta fosforylacja była konieczna do zahamowania białka fosfatazy-1. Bydlęcy inhibitor tkanki tłuszczowej-1 porównano bezpośrednio z inhibitorem-1 mięśni szkieletowych królika oraz z 32000-Mr, dopaminą i fosfoproteiną regulowaną dopaminą i cAMP z mózgu bydła (DARPP-32), również inhibitorem fosfatazy białkowej-1. Według następujących kryteriów biochemicznych i immunochemicznych, bydlęcy inhibitor tkanki tłuszczowej-1 okazał się bardzo podobny i prawdopodobnie identyczny z DARPP-32 i wyraźnie różnił się od inhibitora-1 mięśni szkieletowych: masa cząsteczkowa przez SDS/PAGE; promienie Stokesa; fosforylacja na resztach treoniny reszty; Wzory peptydów generowane przez Staphylococcus-aureus-V8-proteaza analizowane przez SDS/PAGE; tryptyczne mapy fosfopeptydów analizowane przez dwuwymiarową cienką warstwę elektroforezę cienkowarstwową/chromatografię; elucję w odwróconej fazie HPLC; mapy peptydów chymotryptowych mapy peptydów analizowane za pomocą HPLC w odwróconej fazie; skład aminokwasowy; przeciwciało przez immunoprecypitację i immunoblotting; wpływ rozszczepienia bromkiem cyjanogenu na białko na aktywność inhibitora fosfatazy białkowej. Na podstawie tych wyniki stwierdzamy, że bydlęcy mózg i tkanka tłuszczowa zawierają identyczny fosfoproteinowy inhibitor fosfatazy białkowej-1 (DARPP-32), który jest odmienny od tego z mięśni szkieletowych (inhibitor-1). --- Fosfataza białkowa typu 1 (PP1) jest krytycznym negatywnym regulatorem cyklu Ca(2+) i kurczliwości w kardiomiocytach. W szczególności pośredniczy w przywrócenie funkcji serca do poziomów podstawowych po stymulacji beta-adrenergicznej poprzez defosforylację kluczowych fosfobiałek. PP1 jest holoenzymem składającym się z podjednostki katalitycznej i pomocniczej. Te białka regulatorowe dyktują subkomórkową lokalizację PP1, specyficzność substratową i aktywność. Wśród nich szczególne znaczenie ma inhibitor-1, ponieważ jest on zaangażowany jako integrator wielu szlaków neurohormonalnych, które drobno regulują aktywność PP1 na poziomie retikulum sarkoplazmatycznego (SR). W rzeczywistości, perturbacje w regulacji PP1 przez inhibitor-1 zostały zaangażowane w patogenezę niewydolności serca. patogenezie niewydolności serca, co sugeruje, że interwencje terapeutyczne oparte na inhibitorze-1 mogą złagodzić dysfunkcję serca i przebudowę w niewydolnym sercu. serca. W niniejszym przeglądzie omówione zostaną aktualne poglądy na temat roli inhibitora-1 w fizjologii fizjologii serca, jego możliwego wpływu na choroby serca i jego potencjału jako nowej strategii terapeutycznej. i jego potencjał jako nowej strategii terapeutycznej. --- Inhibitor 1 (I-1) jest białkowym inhibitorem fosfatazy białkowej 1 (PP1), głównej eukotycznej fosfatazy Ser/Thr. eukariotyczna fosfataza Ser/Thr. Niefosforylowany I-1 jest nieaktywny, podczas gdy fosforylowany I-1 jest silnym inhibitorem PP1. I-1 jest fosforylowana in vivo na Thr(35) i Ser(67). Thr(35) jest fosforylowany przez kinazę białkową zależną od cAMP (kinaza A), a fosforylowany Thr (35) I-1 hamuje PP1. Do tej pory kinaza która fosforyluje Ser(67) nie została zidentyfikowana, a fizjologiczna rola fosforylacji Ser(67) była nieznana. W tym badaniu wykryliśmy wysoki poziom aktywności kinazy w ekstrakcie mózgowym, gdy S-transferaza glutationu (GST) mutant fuzyjny I-1 zawierający Ala podstawiony dla Thr (35) [GST-I-1 (T35A)] był stosowany jako substrat. Kinaza GST-I-1 (T35A) i neuronalne białko podobne do cdc2 kinaza (NCLK) w ekstrakcie mózgowym nie mogły być oddzielone od siebie przez serii sekwencyjnych chromatografii. Kinaza GST-I-1(T35A) immunoprecypitowana przeciwciałem anty-NCLK z aktywnych kinazowo frakcji kolumnowych. Oczyszczona NCLK-fosforylowana GST-I-1(T35A) i I-1 (0,7 mola fosforanu na mol I-1). Mapowanie fosfopeptydów HPLC, sekwencjonowanie aminokwasów i mutageneza ukierunkowana na miejsce mutageneza ustaliła, że NCLK fosforyluje Ser(67) I-1. Fosforylowane przez NCLK I-1 i I-1(T35A) hamowały PP1 z wartościami IC(50) odpowiednio około 9,5 i 13. 8 nM, odpowiednio. W porównaniu, A fosforylowany przez kinazę I-1 był tylko około 1,2 razy bardziej hamujący niż NCLK-fosforylowany I-1. Nasze dane wskazują, że NCLK jest potencjalną in vivo kinazą I-1 i że fosforylacja Thr (35) i Ser (67) niezależnie aktywuje I-1. --- Transgeneza oparta na ekspresji genów specyficznych dla danego narządu stanowi podstawę do wyjaśnienia funkcjonalnej roli białek przez ostatnie 15 lat. Korzystając z tej wykazaliśmy, że hamowanie fosfatazy białkowej 1 przez jej konstytutywnie aktywny inhibitor konstytutywnie aktywny inhibitor-1, znacząco zwiększa kurczliwość serca i obsługę wapnia. Aby odkryć zmiany białkowe towarzyszące przewlekłemu wzrostowi funkcji serca tych transgenicznych serc, przeanalizowaliśmy proteom serca. proteomu serca. Co ciekawe, stwierdziliśmy znaczny wzrost poziomów 6 białek zaangażowanych w metabolizm, wiązanie wapnia i wychwytywanie stresu oksydo-redukcyjnego. Białka te zostały zidentyfikowane jako: dehydrogenaza hydroksyacylo-CoA dehydrogenaza II, podjednostka alfa mitochondrialnej ATPazy protonowej, peroksydoksyna 2, nowe białko EF-hand zawierające białko-2, aneksyna 5 oraz wcześniej niescharakteryzowane cDNA. Tak więc, długotrwała nadekspresja inhibitora fosfatazy białkowej 1 i związany z tym wzrost kurczliwości serca wydaje się zwiastować zmiany w raczej niewielkiej liczbie białek, które mogą odzwierciedlać ważne adaptacje kompensacyjne w hiperdynamicznym sercu [poprawione]. --- Inhibitor-1 (I-1) jest selektywnym inhibitorem fosfatazy białkowej-1 (PP1) i reguluje kilka szlaków sygnałowych zależnych od PP1, w tym kurczliwość serca kurczliwość serca oraz regulację uczenia się i pamięci. Ludzki gen I-1 został spliced, aby wygenerować dwa alternatywne mRNA, określane jako I-1alfa i I-1beta, kodujące polipeptydy, które różnią się od I-1 sekwencjami C-końcowymi. Odwrotna transkrypcja-PCR wykazała, że mRNA I-1alfa i I-1beta ulegają ekspresji w sposób sposób specyficzny dla rozwoju i tkanki. Analiza funkcjonalna I-1 w Szczep Saccharomyces cerevisiae zależny od ludzkiego I-1 dla żywotności ustalony że nowa domena obejmująca aminokwasy 77-110 jest niezbędna do inhibicji PP1 w drożdżach. Ekspresja ludzkiego I-1 w S. cerevisiae z częściową częściową mutacją utraty funkcji kinazy eukariotycznego czynnika inicjacji-2alfa (eIF2alfa) (Gcn2p) mutacja pozwalała na wzrost podczas głodu aminokwasowego, zgodnie z hamowanie Glc7p/PP1, drożdżowej fosfatazy eIF2alfa. W przeciwieństwie do tego, ludzka I-1alfa, któremu brakuje aminokwasów 83-134, i I-1 z C-końcowymi delecjami były znacznie mniej skuteczne w promowaniu wzrostu drożdży w warunkach głodu warunkach głodu. Dane te sugerują, że C-końcowe sekwencje I-1 zwiększają regulację eukariotycznej fosfatazy eIF2alfa. Badania in vitro wykazały że sekwencje C-końcowe, usunięte zarówno w I-1alfa, jak i I-1beta, zwiększają wiązanie i hamowanie PP1 wiązanie i hamowanie. Ekspresja pełnej długości i C-końcowo skróconej I-1 w komórkach HEK293T ustaliła znaczenie końca C I-1 w przekazywaniu sygnałów sygnałów cAMP, które promują fosforylację eIF2alfa. To badanie pokazuje że wiele domen w I-1 celuje w komórkowe kompleksy PP1 i ustanawia I-1 jako komórkowy regulator fosforylacji eIF2alfa. --- Sercowa sarkoplazmatyczna retikulum (SR) Ca(2+) ATPaza (SERCA2a) promuje wychwyt Ca(2+) w SR. Fosforylowany fosfolamban (PLB) hamuje aktywność SERCA2a aktywność. Stwierdziliśmy wyraźną defosforylację PLB przy Thr(17) i Ser(16) po 20-30 minutach niedokrwienia wywołanego okluzją tętnicy wieńcowej u szczurów. Celem Celem badania było zbadanie, w jaki sposób PLB jest defosforylowany w niedokrwieniu i określenie, czy defosforylacja PLB powoduje hiperkurcz mięśnia sercowego i aktywację kalpainy poprzez przeciążenie Ca(2+) w reperfuzji. Białko inhibitor-1 (I-1) specyficznie hamuje fosfatazę białkową 1 (PP1), dominującą fosfatazę PLB. dominującą fosfatazę PLB w sercu. Zależna od Ca(2+) fosfataza kalcyneuryna może również indukować defosforylację PLB. Niedokrwienie przez 30 minut indukowało translokację PKC-α powodując inaktywację I-1 poprzez fosforylację zależną od PKC-α fosforylację przy Ser(67). Aktywacja PP1 po inaktywacji I-1 była indukować defosforylację PLB w niedokrwieniu. Niedokrwienie przez 30 min aktywowało kalcyneurynę i wstępne leczenie inhibitorem kalcyneuryny, cyklosporyną A (CsA), hamowało translokację PKC-α, fosforylację I-1 przy Ser(67) i defosforylację PLB w niedokrwieniu. Reperfuzja przez 5 minut po 30 min niedokrwienia indukowała rozprzestrzenianie się pasm skurczu (CB) i proteolizę fodryny przez kalpainę. Zarówno CsA, jak i przeciwciało anty-PLB, które hamuje wiązanie PLB do SERCA2a zmniejszały obszar CB i rozpad fodryny po reperfuzji. Te wyniki ujawniają nowy szlak, poprzez który niedokrwienie indukuje zależną od kalcyneuryny aktywację PKC-α, inaktywację I-1 poprzez zależną od PKC-α fosforylację na Ser(67) i zależną od PP1 defosforylację PLB. Szlak ten przyczynia się do rozprzestrzeniania się CB i aktywacji kalpainy poprzez przeciążenie Ca(2+) we wczesnej reperfuzji. reperfuzji.
Które białko jest głównym inhibitorem fosfatazy białkowej 1 (PP1)?
Inhibitor 1 (I-1) jest białkowym inhibitorem fosfatazy białkowej 1 (PP1), głównej eukariotycznej fosfatazy Ser/Thr. Niefosforylowany I-1 jest nieaktywny, podczas gdy fosforylowany I-1 jest silnym inhibitorem PP1.   