TŁO: Receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i jego dalsze czynniki KRAS i BRAF są zmutowane w kilku typach raka, wpływając na kliniczną odpowiedź na inhibitory odpowiedź na inhibitory EGFR. Mutacje w domenie kinazy EGFR przewidują wrażliwość na inhibitory kinazy tyrozynowej gefitynib i erlotynib w gruczolakoraku płuc, podczas gdy gruczolakoraka płuc, podczas gdy aktywujące mutacje punktowe w KRAS i BRAF nadają oporność na przeciwciało monoklonalne anty-EGFR cetuximab w raku jelita grubego. Opracowanie metod nowej generacji do systematycznego badania przesiewowego mutacji tych genów tych genów pozwoli na bardziej odpowiednie wybory terapeutyczne. METODY: Opisujemy test topnienia o wysokiej rozdzielczości (HRM) do wykrywania mutacji wykrywania mutacji w eksonach 19-21 EGFR, kodonie 12/13 KRAS i BRAF V600 przy użyciu utrwalonych w formalinie próbek zatopionych w parafinie. Zmienność somatyczna eksonu 2 KRAS została również analizowano również za pomocą masowo równoległego pirosekwencjonowania amplikonów przy użyciu platformy GS Junior 454. WYNIKI: Przebadaliśmy 120 rutynowych próbek diagnostycznych od pacjentów z rakiem jelita grubego lub płuc. Mutacje w KRAS, BRAF i EGFR zaobserwowano u odpowiednio 41,9%, 13,0% i 11,1% wszystkich próbek, wzajemnie się wykluczając. wzajemnie się wykluczające. W przypadku KRAS wykryto sześć rodzajów substytucji (17 G12D, 9 G13D, 7 G12C, 2 G12A, 2 G12V, 2 G12S), podczas gdy V600E stanowiła wszystkie mutacje aktywujące BRAF mutacje aktywujące BRAF. Jeśli chodzi o EGFR, dwa przypadki wykazały delecje eksonu 19 (delE746-A750 i delE746-T751insA) i kolejne dwie substytucje w eksonie 21 (jeden wykazywał L858R z mutacją oporności T590M w eksonie 20, a drugi miał mutację P848L). Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, nasze wyniki pokazują, że częstość mutacji KRAS i BRAF w raku jelita grubego wynosiły odpowiednio 44,3% i 13,0%, podczas gdy mutacje EGFR wykryto w 11,1% próbek raka płuc. płuc. Ultra głębokie pirosekwencjonowanie amplikonów z powodzeniem potwierdziło wyniki HRM i pozwoliło na wykrycie i ilościowe oznaczenie mutacji somatycznych KRAS. WNIOSKI: HRM jest szybką i czułą metodą dla umiarkowanej przepustowości opłacalnych badań przesiewowych mutacji onkogenów w próbkach klinicznych. Zamiast walidacja sekwencji Sangera, technologia sekwencjonowania następnej generacji skutkuje dokładniejsze wyniki ilościowe w zmienności somatycznej i może być osiągnięta przy wyższej przepustowości. --- Analiza genetyczna choroby von Willebranda za pomocą sekwencjonowania genu czynnika von Willebranda nie stała się jeszcze rutynową praktyką. Niemniej jednak, perspektywy dla molekularnej zmieniły się diametralnie w ostatnich latach wraz z ujawnieniem platform sekwencjonowania nowej generacji. Mając na celu zastosowanie tej technologii w chorobie von Willebranda, opracowaliśmy strategię wzbogacania i multiplikacji genów czynnika von Willebranda i multipleksowania w oparciu o krótkie reakcje łańcuchowe polimerazy. reakcje łańcuchowe. Czterdziestu pacjentów poddano jednoczesnej analizie, umożliwiając identyfikację 43 mutacji, w tym 36 substytucji, 2 intronowych mutacji miejsca splice splice, 2 indels i 3 delecje. Poprzez połączenie genomowego DNA pacjenta przed wzbogacenie reakcji łańcuchowej polimerazy, indeksowanie próbek za pomocą znaczników kodów kreskowych i sekwencjonowanie na instrumencie do sekwencjonowania nowej generacji, co najmniej 350 pacjentów i krewnych może być jednocześnie analizowanych w szybki i niedrogi sposób, niedrogi sposób. Jest to jeden z pierwszych raportów, w których ta technologia wykazano, że technologia ta jest wykonalna do badań przesiewowych mutacji na dużą skalę za pomocą sekwencjonowania sekwencjonowanie pojedynczego genu. --- Zespół Alporta (ATS) jest dziedziczną nefropatią często związaną z niedoczulicą czuciowo-nerwową. niedosłuchem czuciowo-nerwowym i nieprawidłowościami oczu. Mutacje w genie COL4A5 powodują ATS sprzężoną z chromosomem X. Mutacje w genach COL4A4 i COL4A3 zostały zgłoszone w zarówno w autosomalnym recesywnym, jak i autosomalnym dominującym ATS. Konwencjonalne badania przesiewowe mutacji przesiewowe, wykonywane przez DHPLC i / lub sekwencjonowanie Sangera, jest czasochłonne i i wiąże się ze stosunkowo wysokimi kosztami ze względu na brak gorących punktów i wysoką liczby eksonów na gen: 51 (COL4A5), 48 (COL4A4) i 52 (COL4A3). Kilka miesięcy miesięcy na postawienie diagnozy, szczególnie w przypadkach z mniej informacyjnymi rodowodami. mniej informatywnych rodowodach. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zaprojektowaliśmy protokół sekwencjonowania nowej generacji (NGS) umożliwiający jednoczesne wykrywanie wszystkich możliwych wariantów w trzech genach. Zastosowaliśmy metodę łączącą selektywną amplifikację amplifikację z platformą sekwencjonowania DNA 454 Roche (Genome Sequencer junior). Zastosowanie tej technologii pozwoliło nam zidentyfikować drugą mutację mutację u dwóch pacjentów z ATS (p.Ser1147Phe w COL4A3 i p.Arg1682Trp w COL4A4) i ponownie rozważyć diagnozę ATS u trzeciego pacjenta. Niniejsze badanie, ilustruje zatem udane zastosowanie NGS do badań przesiewowych mutacji zaburzeń mendlowskich z heterogenicznością locus. --- Patogenne insercje elementów Alu są rzadko zgłaszane, podczas gdy ich występowanie powinno być znacznie wyższe. Allele zawierające element Alu są zazwyczaj niekompetycyjne podczas procesu PCR i w konsekwencji niewykrywalne przy użyciu klasycznych metod metody przesiewowe. Jednak wraz z wprowadzeniem technologii sekwencjonowania sekwencjonowania (NGS) w dziedzinie diagnostyki, pojawiają się nowe możliwości. pojawiają się nowe możliwości. Dane NGS dla określonego regionu genomu mogą być postrzegane jako suma wszystkich pojedynczych sekwencji (odczytów) uzyskanych dla tego regionu, a już nie jako średnia tej sumy, jak ma to miejsce w przypadku tradycyjnego sekwencjonowania Sangera. Ponieważ oczekuje się, że każdy pojedynczy odczyt obejmujący ten region zostanie wygenerowany z innej cząsteczki szablonu, obecność jednego zmutowanego odczytu musi teoretycznie wystarczająca do zidentyfikowania mutacji. Jednak generowanie i i identyfikacja zmutowanych odczytów zawierających wstawki Alu pozostaje wyzwaniem i należy zoptymalizować kilka parametrów metody mokrej/suchej. Niniejszym przedstawiamy dowód zasady procedury przesiewowej mutacji opartej na NGS, umożliwiającej wykrywanie odziedziczonych insercji Alu w dowolnej predefiniowanej sekwencji przez badając 2 przypadki: c.1739_1740insAlu w BRCA1 i c.156_157insAlu w BRCA2. --- TŁO: Konwencjonalne bezpośrednie sekwencjonowanie genów kandydujących oparte na PCR dla rodziny z rodzina z leukoencefalopatią sprzężoną z chromosomem X o nieznanej etiologii zawiodła zidentyfikować żadnych mutacji przyczynowych. CEL: Przeprowadzenie sekwencjonowania egzomu całych transkryptów całego chromosomu X w celu zbadania rodziny z leukoencefalopatią sprzężoną z chromosomem X. METODY I WYNIKI: Sekwencjonowanie następnej generacji wszystkich transkryptów chromosomu X wszystkich transkryptów chromosomu X, po partycjonowaniu genomu na bazie cieczy, przeprowadzono na jednym z dwóch dwóch dotkniętych chorobą mężczyzn (proband) i niezmienionego chorobowo mężczyzny (jego brat). brat). U probanta zidentyfikowano mutację nonsensowną w MCT8 (c.1102A→T (p.R368X)). u probanta. Późniejsze bezpośrednie sekwencjonowanie oparte na PCR innych członków rodziny potwierdziło obecność tej mutacji, hemizygotycznej u drugiego chorego brata i heterozygotycznej brata i heterozygotyczną u matki i babki ze strony matki probanta. MUTACJE MCT8 zwykle powodują nieprawidłową czynność tarczycy oprócz zaburzeń neurologicznych. nieprawidłowości neurologiczne, ale u tego probanta czynność tarczycy była prawidłowa. WNIOSEK: Jednopasmowe sekwencjonowanie egzomów nowej generacji jest wystarczające do pełnej analizy wszystkich transkryptów. analizy wszystkich transkryptów chromosomu X. Ta metoda jest szczególnie szczególnie odpowiednia do badań przesiewowych mutacji w zaburzeniach recesywnych sprzężonych z chromosomem X i może uniknąć stronniczości w wyborze genów kandydujących. --- Zespoły Marfana (MFS) i Loeysa-Dietza (LDS) są spowodowane mutacjami w receptorach fibryliny-1 (FBN1) i transformującego czynnika wzrostu beta 1 i 2 (TGFBR1). fibryliny-1 (FBN1) i receptora 1 i 2 transformującego czynnika wzrostu beta (odpowiednio TGFBR1 i TGFBR2). i TGFBR2). Przy obecnych konwencjonalnych technologiach analiza tego zestawu genów jest czasochłonna i kosztowna. kosztowna. Dostosowaliśmy opłacalną i niezawodną strategię odkrywania mutacji przy użyciu multipleksowej reakcji PCR, a następnie sekwencjonowania nowej generacji (NGS). W W pierwszym etapie, genomowe DNA z pięciu próbek pacjentów z MFS lub LDS z wcześniej zidentyfikowanymi mutacjami i/lub polimorfizmami w FBN1 i TGFBR1 i 2 zostały przeanalizowane i ujawniły wszystkie oczekiwane warianty. W drugim etapie zwalidowaliśmy technikę na 87 próbkach od pacjentów z MFS spełniających kryteria z Gandawy. To Zaowocowało to identyfikacją 75 mutacji FBN1, z których 67 było unikalnych. Późniejsza analiza multipleksowej amplifikacji sondy zależnej od ligacji (MLPA) pozostałych negatywnych próbek zidentyfikowano cztery duże delecje/insercje. Wreszcie, sekwencjonowanie Sangera zidentyfikowało mutację missense w eksonie 1 FBN1, która nie została uwzględniona w przepływie pracy NGS. W sumie uzyskano ogólny wskaźnik identyfikacji mutacji wskaźnik identyfikacji mutacji na poziomie 92%, co jest zgodne z danymi opublikowanymi wcześniej. Wnioskujemy, że multipleksowa PCR wszystkich kodujących eksonów FBN1 i TGFBR1/2, a następnie analiza NGS i MLPA jest solidną strategią czasowej i i efektywnej kosztowo identyfikacji mutacji. --- Obecnie głównymi barierami w stosowaniu technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) w badaniach przesiewowych mutacji genetycznych na skalę epidemiologiczną wydaje się być wysoka dokładność wymagana przez zastosowania kliniczne i wysoki koszt w przeliczeniu na próbkę. Jak osiągnąć wysoką skuteczność we wzbogacaniu docelowych genów chorobowych przy zachowaniu niskiego koszt/próbkę jest kluczową przeszkodą techniczną do pokonania. Zweryfikowaliśmy podejście podejście oparte na sondach cDNA do wychwytywania eksonów grupy genów, o których wiadomo, że powodują głuchotę. głuchotę. Amplikony reakcji łańcuchowej polimerazy zostały wykonane z klonów cDNA genów i wykorzystano jako sondy przynętowe w hybrydyzacji do wychwytywania ludzkiego genomowego DNA (gDNA). genomowego DNA (gDNA). Biblioteka cDNA zawierająca klony docelowych genów zapewniła łatwo dostępne, tanie i regenerowalne źródło do do produkcji sond wychwytujących przy użyciu standardowego sprzętu do biologii molekularnej. Przechwycone fragmenty gDNA za pomocą naszej metody były sekwencjonowane na platformie Illumina NGS. Wyniki wykazały, że docelowe eksony wychwycone przez nasze podejście osiągnęły specyficzność, multipleksowość, jednorodność i głębokość pokrycia odpowiednią dla dokładnych aplikacji sekwencjonowania przez systemy NGS. Wiarygodne wywołania genotypu dla różnych mutacji homozygotycznych i heterozygotycznych. Wyniki zostały potwierdzone niezależnie przez konwencjonalne sekwencjonowanie Sangera. Metoda zweryfikowana może być łatwo rozszerzona o wszystkie znane geny głuchoty dla zastosowań, takich jak genetyczne badania przesiewowe słuchu u noworodków. Wysokie pokrycie Głębokość i korzyści kosztowe podejścia do wychwytywania eksonów opartego na sondach cDNA mogą również w praktyce klinicznej poza badaniami przesiewowymi mutacji genów głuchoty. mutacji w genach głuchoty.
Podaj przykłady zastosowań sekwencjonowania nowej generacji w badaniach przesiewowych mutacji?
Dane sekwencjonowania nowej generacji dla określonego regionu genomu mogą być postrzegane jako suma wszystkich indywidualnych sekwencji (odczytów) uzyskanych dla tego regionu, a nie jako średnia tej sumy, jak ma to miejsce w przypadku tradycyjnego sekwencjonowania Sangera. NGS jest wprowadzany do coraz większej liczby aplikacji przesiewowych mutacji. Procedura przesiewowa mutacji oparta na NGS umożliwiająca wykrywanie dziedzicznych insercji Alu w dowolnej predefiniowanej sekwencji została wykorzystana w przypadku c.1739_1740insAlu w BRCA1 i c.156_157insAlu w BRCA2. W innym badaniu NGS zbadano BRCA1 i BRCA2, uzyskując ogólną czułość dla SOLiD i PGM wynoszącą odpowiednio 97,8% (95% CI = 94,7 do 100,0) i 98,9% (95% CI = 96,8 do 100,0). Swoistość dla platformy SOLiD była wysoka i wynosiła 100,0% (95% CI = 99,3 do 100,0). PGM poprawnie zidentyfikował wszystkie 3 indele, ale wywołano również 68 fałszywie dodatnich indeli. Geny, o których wiadomo, że powodują głuchotę, były sekwencjonowane na platformie Illumina NGS. Wyniki wykazały, że docelowe eksony wychwycone przez nasze podejście osiągnęły specyficzność, multipleksowość, jednorodność i głębokość pokrycia odpowiednią do dokładnych zastosowań sekwencjonowania przez systemy NGS. Uzyskano wiarygodne wywołania genotypu dla różnych mutacji homozygotycznych i heterozygotycznych. W kontekście choroby von Willebranda 43 mutacje, w tym 36 substytucji, 2 intronowe mutacje miejsca splicingu, 2 indele i 3 delecje zostały zbadane za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. Wykazało to, że co najmniej 350 pacjentów i krewnych może być jednocześnie analizowanych w szybki i niedrogi sposób. Zespół Alporta jest spowodowany mutacjami w trzech kluczowych genach, a mianowicie COL4A3, COL4A4 i COL4A5, z których każdy składa się z około 50 eksonów, co sprawia, że badanie przesiewowe mutacji jest bardzo czasochłonnym i kosztownym przedsięwzięciem. NGS jest obecnie wykorzystywany do jednoczesnego, szybkiego i opłacalnego wykrywania wszystkich możliwych wariantów w tych trzech genach. NGS został również wykorzystany do badania przesiewowego EGFR, KRAS i BRAF pod kątem mutacji związanych z diagnozą raka i / lub odpowiedzią na kilka terapii przeciwnowotworowych. NGS został również wykorzystany w badaniach przesiewowych mutacji w dziedzicznych paraplegiach spastycznych, leukoencefalopatii sprzężonej z chromosomem X, barwnikowym zapaleniu siatkówki, dziedzicznych zaburzeniach cyklu mocznikowego, a także w zespołach Marfana (MFS), Loeysa-Dietza (LDS) i Meckela.