Roślinna metylotransferaza cytozyny cDNA została wyizolowana przy użyciu zdegenerowanych oligonukleotydów oligonukleotydów, w oparciu o homologię między metylotransferazami prokariotów i myszy metylotransferazami i PCR w celu amplifikacji krótkiego fragmentu genu metylotransferazy genu metylotransferazy. Fragment o przewidywanej wielkości został amplifikowany z genomowego DNA z Arabidopsis thaliana. Nakładające się klony cDNA, niektóre z homologią do amplifikowanego fragmentu PCR zostały zidentyfikowane i zsekwencjonowane. Zmontowana sekwencja kwasu nukleinowego nukleinowego wynosi 4720 bp i koduje białko o 1534 aminokwasach, które ma znaczącą homologię do metylotransferaz cytozyny prokariotów i ssaków. Podobnie jak metylazy ssaków, enzym ten ma domenę metylotransferazy na końcu C połączoną z drugą większą domeną. Metylaza Arabidopsis posiada osiem z dziesięciu konserwowanych motywów sekwencyjnych występujących w metylotransferazach cytozyny-5 prokariotów i wykazuje 50% homologii do enzymu mysiego w domenie metylotransferazy. Domena domena amino-końcowa jest tylko w 24% homologiczna do enzymu mysiego i nie posiada regionu wiążącego cynk, który został znaleziony w metylotransferazach zarówno od myszy i człowieka. W przeciwieństwie do myszy, gdzie zidentyfikowano pojedynczy gen metylotransferazy. zidentyfikowano małą rodzinę wielogenową z homologią do regionu amplifikowanego w PCR. PCR została zidentyfikowana w Arabidopsis thaliana. --- Wzorce metylacji genu MET1 w organach Arabidopsis thaliana były badane przez hybrydyzację Southern blot próbek DNA hydrolizowanych za pomocą różnie wrażliwymi na metylację endonukleazami restrykcyjnymi. Wysoce metylowane na wewnętrznych resztach cytozyny miejsce CCGG znaleziono 1,5 kb przed genem genu, podczas gdy miejsca CCGG zlokalizowane w bardziej proksymalnych częściach regionu 5'-flanking i sam gen są zasadniczo niemetylowane. Ten wzór metylacji zaobserwowano w różnych organach roślin należących do dwóch różnych ekotypów, jak również w różnych transgenicznych liniach roślin. Poziom metylacji miejsca CCGG w eksonie 3 (2,1 kb od 5'-końca genu) okazał się być zmienny pomiędzy różnymi liniami roślin transgenicznych i dwoma badanymi ekotypami. Poziomy transkrypcji genu MET1 różnią się nieznacznie w organach roślin typu dzikiego bez żadnej oczywistej korelacji z jego metylacją. Transgeniczne antysensowne konstrukty MET1 wyrażane w genomie roślinnym wpływają zarówno na metylację MET1, jak i na jego transkrypcję, ale ponownie bez wyraźnej korelacji. transkrypcję, ale ponownie bez wyraźnej korelacji. Porównawcze badanie poziomów transkrypcji różnych genów z rodziny metylotransferaz cytozyny DNA MET (MET1, MET2a, MET2b, MET3) i ich wzorów metylacji pokazuje, że mogą istnieć pewne mechanizmy metylacji pokazują, że mogą istnieć pewne mechanizmy broniące najaktywniej transkrybowanego genu transkrybowany gen MET1 z tej rodziny przed wyciszeniem za pośrednictwem metylacji. W przeciwieństwie do przeciwieństwie do genu DRM2 nie mogliśmy znaleźć żadnych miejsc GATC metylowanych adeniną w genie MET1. MET1. --- U palmy olejowej (Elaeis guineensis Jacq.), około 5% somatycznych regenerantów pochodzących z zarodków zarodków somatycznych wykazuje zmiany homeotyczne podczas rozwoju kwiatowego, obejmujące pozorną feminizację męskich części kwiatów obu płci, zwany fenotypem "mantled". Ten wariant fenotypu jest związany z obniżeniem poziomu globalnej metylacji DNA. Aby zbadać możliwe zależności między poziomem metylacji DNA a akumulacją metylotransferazy DNA-(cytozyna-5) metylotransferazy DNA (DNMT), sekwencje kodujące pełnej długości odpowiadające trzem różnym rodzinom DNMT w palmie olejowej, a mianowicie klasom MET, CMT, i DRM, zostały wyizolowane i scharakteryzowane. Odpowiednie geny zostały oznaczone jako EgMET1, EgCMT1 i EgDRM1 i kodują przewidywane polipeptydy odpowiednio 1543, 925 i 591 reszt aminokwasowych. Ekspresję DNMT palmy olejowej DNMT porównano między normalnymi i wariantowymi kalli i tkankami kwiatostanu przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją. Zaobserwowano stały wzrost poziomów transkryptów EgMET1 i EgCMT1 stwierdzono w wariantach szybko rosnących kalli w stosunku do kalii o zwartym kształcie. Guzkowato-kompaktowe kalle dają początek około 5% nieprawidłowych regenerantów, podczas gdy szybko rosnące kalle generują 95% "mantled palm w ich klonalnym potomstwie i zostały wcześniej wykazane jako posiadające wyraźnie hipometylowane DNA. W niedojrzałych nieprawidłowych kwiatostanach tylko poziomy transkryptu EgMET1 zostały zwiększone, podczas gdy nie nastąpiły żadne zmiany we względnej liczebności transkryptów EgCMT1 lub EgDRM1. Dlatego hipometylacja w całym genomie hipometylacja opisana wcześniej w materiale "mantled" nie może być wyjaśniona przez spadek poziomów ekspresji DNMT de novo lub konserwujących, paradoks, który paradoks, który został wcześniej opisany w komórkach nowotworowych, gdzie istnieje dowody na globalną hipometylację DNA. --- Metylacja cytozyny w eukariotycznym DNA może być wykorzystywana do transkrypcyjnego wyciszania sekwencji powtarzalnych, w tym transpozonów i retrowirusów. To wyciszenie jest stabilne między pokoleniami komórek, ponieważ metylacja cytozyny jest utrzymywana epigenetycznie poprzez replikację DNA. Arabidopsis thaliana Dnmt3, ortolog metylotransferazy cytozyny ortolog metylotransferazy DOMAINS rearanżowanej metylotransferazy2 (DRM2) jest wymagana do ustanowienia małych interferujących RNA (siRNA) ukierunkowanych na metylację DNA metylacji. U ssaków białka PIWI i piRNA działają w konwergentnie wyewoluowany sposób ukierunkowany przez RNA system metylacji DNA, który jest wymagany do tłumienia ekspresji transpozonu w linii zarodkowej. Metylacja de novo może być również niezależna od interferencji RNA interferencji RNA i małych RNA, jak u Neurospora crassa. Tutaj identyfikujemy klad katalitycznie zmutowanych paralogów DRM2 w genomach roślin kwitnących, które w A.thaliana określamy mianem domeny rearanżowanej metylotransferazy3 (DRM3). Pomimo tego, że katalitycznie zmutowana, DRM3 jest wymagana do normalnego utrzymania metylacji DNA non-CG metylacji, ustanowienia metylacji DNA kierowanej przez RNA wyzwalanej przez sekwencje powtórzone sekwencje i akumulacji małych RNA związanych z powtórzeniami. Chociaż ssaków katalitycznie nieaktywne paralogi Dnmt3L działają w analogiczny sposób, analiza filogenetyczna wskazuje, że rodziny białek DRM i Dnmt3 rozeszły się niezależnie u roślin i zwierząt. niezależnie u roślin i zwierząt. Pokazujemy również przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce że zarówno N-końcowe domeny UBA DRM2, jak i C-końcowa domena metylotransferazy są wymagane do normalnej metylacji DNA kierowanej przez RNA, wspierając istotną funkcję ukierunkowującą dla domen UBA. Wyniki te sugerują, że systemy metylacji DNA kierowane przez RNA u roślin i ssaków składają się z kombinacji cech przodków i cech zbieżnych. --- Metylacja DNA odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu stanów aktywności genów w większości organizmów większości organizmów eukariotycznych i jest niezbędna dla prawidłowego wzrostu i rozwoju. rozwoju. Wzorce metylacji są ustalane przez metylotransferazy de novo metylotransferazy i utrzymywane przez aktywność metylotransferazy konserwującej. Rodzina metylotransferaz DNA de novo Dnmt3 została niedawno scharakteryzowana u zwierząt. scharakteryzowana u zwierząt. Tutaj opisujemy geny metylotransferaz DNA zarówno z Arabidopsis i kukurydzy, które wykazują wysoki poziom podobieństwa sekwencji do Dnmt3, co sugeruje, że kodują one roślinne metylotransferazy de novo. W stosunku do wszystkich znanych eukariotycznych metylotransferaz, te białka roślinne zawierają nowy układ motywów wymaganych do aktywności katalitycznej metylotransferazy DNA. N-końce tych metylotransferaz zawierają serię motywów domen związanych z ubikwityną (UBA). Domeny UBA znajdują się w kilku białkach szlaku ubikwityny szlaku ubikwityny oraz w enzymach naprawy DNA, takich jak Rad23, i mogą one być zaangażowane w wiązanie ubikwityny. Obecność domen UBA zapewnia możliwy związek między metylacją DNA a szlakami ubikwityna/proteasom. --- W Arabidopsis białko związane z czynnikiem remodelującym chromatynę SWI2/SNF2 DDM1 i metylotransferaza cytozyny MET1 są wymagane do utrzymania genomu metylacji cytozyny. Mutacje w obu genach powodują globalną demetylację. W W tej pracy oceniliśmy wpływ tych mutacji na rodzinę genów biosyntezy tryptofanu PAI rodziny genów biosyntezy tryptofanu PAI, która składa się z czterech gęsto metylowanych genów ułożonych jako odwrócone powtórzenie ogon-ogon oraz dwóch niepowiązanych genów singletowych. Mutacje mutacje metylacyjne powodowały tylko częściową demetylację loci PAI: ddm1 miał silny wpływ na geny singletowe, ale słabszy wpływ na odwrócone powtórzenie powtórzenie, podczas gdy met1 miał silniejszy wpływ na odwrócone powtórzenie niż na geny geny singletowe. Podwójny mutant ddm1 met1 również wykazywał częściową demetylację genów PAI, z wzorcem podobnym do pojedynczego mutanta ddm1. Aby określić związek między częściową metylacją a ekspresją singletowego genu PAI2 skonstruowaliśmy nowy szczep reporterowy Arabidopsis, w którym wyciszenie PAI2 można było monitorować za pomocą niebieskiego fluorescencyjnego fenotypu roślin, diagnostycznego dla defektów szlaku tryptofanowego. defektów szlaku tryptofanowego. Ten szczep reporterowy ujawnił, że pośrednie poziomy metylacji korelują z pośrednim tłumieniem fenotypu fluorescencyjnego. fenotypu fluorescencyjnego. --- Metylotransferaza DNA2 (DNMT2) jest zawsze uważana za enigmatyczną, ponieważ zawiera wysoce konserwatywne motywy metylotransferazy DNA, ale nie ma zdolności katalitycznej metylacji DNA zdolności katalitycznej metylacji DNA. Tutaj pokazujemy, że Arabidopsis DNA (AtDNMT2) jest zlokalizowana w jądrze i wiąże się z deacetylacją histonów. deacetylacją histonów. Dwucząsteczkowe uzupełnianie fluorescencji i testy pull-down pokazują, że AtDNMT2 oddziałuje z deacetylazami histonowymi typu 2 (AtHD2s), unikalnym typem rodziny deacetylaz histonowych w roślinach. Poprzez analizę ekspresji AtDNMT2: białko fuzyjne ss-glukuronidazy (GUS), wykazaliśmy, że AtDNMT2 ma zdolność do tłumienia ekspresji genów na poziomie transkrypcji. W międzyczasie ekspresja genu AtDNMT2 jest zmieniona w roślinach mutantów athd2c. Proponujemy, aby AtDNMT2 prawdopodobnie wiąże się z aktywnością deacetylacji histonów i roślinnej sieć regulacji epigenetycznej roślin. --- Używając 1kb 3' końcowego fragmentu DNA mysiej metylotransferazy cDNA jako sondy sondę i niskie rygorystyczne warunki hybrydyzacji, wyizolowano nową potencjalną rodzinę genów rodzina genów metylotransferazy (MTazy) została wyizolowana z biblioteki genomowego DNA Arabidopsis thaliana genomowej biblioteki DNA. Jeden klon (MTase-11), który dał najsilniejszy sygnał na Northern blot, został w całości zsekwencjonowany (11483 bp) i dalej scharakteryzowany. Biorąc pod uwagę prawdopodobne otwarte ramki odczytu i nasze wstępne eksperymenty cDNA proponujemy, że gen klonu 11 koduje białko o masie około 90 kD białko. Jak wydedukowano z sekwencji DNA, białko to zawiera wszystkie konserwowane motywy sekwencji motywy sekwencyjne specyficzne dla 5-metrowych MTaz cytozyny. Ekspresję genu MTazy-11 wykazano w kalusie i podczas kiełkowania, ale nie w jednomiesięcznych roślinach lub liściach. roślinach lub w liściach.
Jakie są rodziny roślinnych metylotransferaz DNA (cytozyny-5)?
Roślinne (cytozyno-5)metylotransferazy DNA są klasyfikowane do rodzin: MET, CMT oraz powstające de novo DRM.