Mechanizmy regulujące zależną od selenu (Se) stabilność mRNA selenoprotein są częściowo scharakteryzowane. mRNA selenoprotein są częściowo scharakteryzowane. Aby dokładniej zbadać Se-zależna regulacja selenoprotein, opracowaliśmy nowy reporter chemiluminescencyjny do monitorowania poziomu mRNA sztucznej selenoproteiny w stanie stacjonarnym. Nasz reporter jest fuzją genu lucyferazy Renilla i genu β-globiny. ale zawiera cechy wymagane do przyłączenia selenocysteiny (SEC), a mianowicie kodon UGA-SEC i pętlę macierzystą RNA w regionie 3' bez translacji, zwaną sekwencją inkorporacji SEC (SECIS). Przy różnych poziomach Se, aktywność reporterów zawierających elementy SECIS GPX1 lub GPX4 jest proporcjonalna do poziomu mRNA w stanie stacjonarnym konstruktu reporterowego i odzwierciedla poziom odpowiedniego endogennego mRNA. odpowiadającego endogennego mRNA. W reporterze zawierającym kodon UGA i element funkcjonalny GPX1 SECIS, zależny od Se rozpad za pośrednictwem nonsensu (NMD) wystąpił w cytoplazmie, w przeciwieństwie do cytoplazmie, w przeciwieństwie do bardziej typowej lokalizacji jądrowej. Aby zweryfikować system system reporterowy, zastosowaliśmy podejścia genetyczne i farmakologiczne do hamowania lub promować NMD. Modulacja UPF1 przez siRNA, nadekspresję lub przez hamowanie SMG1 zmieniła NMD w tym systemie. Nasz reporter pochodzi z genu reporterowego lucyferazy Renilla lucyferazy połączonego z intronem zawierającym gen B-globiny i podlega degradacji przez NMD. podlega degradacji przez NMD, gdy kodon stop jest wstawiony przed drugim intronem. intronem. --- Elementy SECIS tworzą struktury pętli macierzystych w 3' regionach nieulegających translacji (UTR) eukariotycznych mRNA, które kodują selenoproteiny. Elementy te bezpośrednio przyłączają selenocysteiny w kodonach UGA, pod warunkiem, że element SECIS znajduje się w wystarczającej odległości od UGA. odległość od UGA. CDNA kodujące selenoproteinę W mięśni szkieletowych od człowieka, małpy rezus, owcy, szczura i myszy zawierały bardzo podobne elementy SECIS które zachowały ważne cechy wspólne dla wszystkich znanych elementów SECIS. Analiza porównawcza tych elementów SECIS wykazała, że w niektórych regionach zarówno zarówno przewidywana struktura drugorzędowa, jak i sekwencje nukleotydów były zachowane, w innych obszarach struktura drugorzędowa została zachowana przy użyciu innej sekwencji pierwotnej, a w jeszcze innych częściach parowanie zasad nie zostało zachowane. Selenoproteina W selenoproteina W mRNA gryzoni i owiec wykorzystywała UGA jako kodon stop i jako kodon selenocysteiny. W ten sposób UGA określał zarówno inkorporację selenocysteiny, jak i zakończenie w pojedynczym mRNA. pojedynczym mRNA. Elementy selenoproteiny W SECIS zawierały dodatkowy wysoce konserwowany trzon sparowany z zasadą, który może zapobiegać niewłaściwemu włączaniu selenocysteiny w kodonach stop UGA. --- Selenoproteiny to białka zawierające rzadki aminokwas selenocysteinę (Sec). Sec jest wstawiany przez specyficzną maszynerię translacyjną, która rozpoznaje element strukturę pętli macierzystej, element SECIS, w 3' UTR genów selenoprotein i przekodowuje kodon UGA w sekwencji kodującej. Ponieważ UGA jest zwykle sygnał zatrzymania translacji, selenoproteiny są generalnie błędnie przypisywane i wyznaczone narzędzia muszą zostać opracowane dla tej klasy białek. Tutaj przedstawiamy dwie nowe metody obliczeniowe do identyfikacji i analizy selenoprotein. analizy, które udostępniamy publicznie za pośrednictwem serwerów internetowych pod adresem http://gladyshevlab.org/SelenoproteinPredictionServer lub http://seblastian.crg.es. SECISearch3 zastępuje swojego poprzednika SECISearch jako narzędzie narzędzie do przewidywania eukariotycznych elementów SECIS. Seblastian jest nową metodą dla wykrywania genów selenoprotein, która wykorzystuje SECISearch3, a następnie przewiduje sekwencje selenoprotein kodowane przed elementami SECIS. Seblastian jest w stanie zarówno identyfikować znane selenoproteiny, jak i przewidywać nowe selenoproteiny. Poprzez stosując te narzędzia do różnych genomów eukariotycznych, dostarczamy uszeregowaną listę selenoprotein wraz z ich homologami zawierającymi cysteinę. homologami zawierającymi cysteinę. Analiza reprezentatywnego kandydata należącego do rodziny AhpC pokazuje, jak wykorzystanie Sec w tym białku ewoluowało w liniach bakteryjnych i eukariotycznych. bakteryjnych i eukariotycznych. --- Selenocysteina (Sec) jest współtranslacyjnie włączana do selenoprotein w kodonie przeprogramowanym kodonie UGA. U ssaków wymaga to dedykowanej maszynerii obejmującej strukturę pętli macierzystej w 3' UTR RNA (element SECIS) i specyficzne białko wiążące SECIS SECIS Binding Protein 2. W niniejszym raporcie metody przewidywania zaburzeń i kilka technik biofizycznych i kilka technik biofizycznych wykazały, że ok. 70% sekwencji SBP2 jest nieuporządkowana, podczas gdy domena wiążąca RNA wydaje się być zwinięta i funkcjonalna. Wyniki te są zgodne z niedawnym doniesieniem o roli chaperonu Hsp90 w fałdowaniu SBP2 i innych funkcjonalnie niepowiązanych białek posiadających domenę wiążącą RNA homologiczną do SBP2. --- Selen (Se) jest niezbędnym pierwiastkiem śladowym występującym głównie w selenoproteinach jako jako 21. aminokwas (selenocysteina, Sec lub U). Selenoproteiny odgrywają ważną rolę we wzroście i proliferacji i są zazwyczaj zaangażowane w komórkową równowagę redoks. komórkową równowagę redoks. Selenocysteina jest kodowana przez wbudowany kodon UGA określony przez strukturę pętli macierzystej, element sekwencji wstawiania Sec (SECIS), który u eukariontów znajduje się w 3'-nietranslowanym regionie (UTR). Dostępność dostępność sekwencji genomu Naegleria gruberi (ATCC 30224) i wykorzystanie tego organizmu jako systemu modelowego. tego organizmu jako systemu modelowego dla patogennej ameby N. fowleri pozwoliło nam na zbadanie szlaku inkorporacji Sec w tym prymitywnym eukarioncie. Korzystając z narzędzi bioinformatycznych, zidentyfikowaliśmy sekwencje genów kodujących PSTK (kinaza O-fosfoserylo-tRNA(Sec)), SepSecS (syntaza O-fosfoserylo-tRNA:selenocysteinylo-tRNA), SelD/SPS2 (syntaza selenofosforanu syntetazy), EFSec (czynnik elongacji specyficzny dla selenocysteiny) i SBP (białko wiążące SECIS białko wiążące SECIS). Odkrycia te zostały potwierdzone przez RT-PCR i sekwencjonowanie. A potencjalny gen tRNA(Ser)Sec (SelC) i przypuszczalna selenoproteina z sekwencją podobieństwem do mitochondrialnej reduktazy tioredoksyny (TR3). Nasze wyniki pokazują, że mechanizm inkorporacji selenocysteiny jest rzeczywiście obecny w N. gruberi. Co ciekawe, gen SelD/SPS2 ma długość 2214 pz. i zawiera dwie odrębne domeny. Region N-końcowy wykazuje sekwencję podobieństwo do przewidywanych białek metylotransferaz, a region C-końcowy jest homologiczny do prokariotycznej SelD/SPS2. Nasze wyniki sugerują możliwość nowych selenoprotein. --- Aminokwas selenocysteina jest kodowany przez UGA, zwykle kodon stop, a zatem wymaga wyspecjalizowanej maszynerii, aby umożliwić jej włączenie do selenoprotein. Mechanizm ten obejmuje tRNA(Sec), pętlę macierzystą 3'-UTR mRNA określana jako SElenoCysteine Insertion Sequence (SECIS), która jest obowiązkowa dla przekodowania UGA jako kodonu Sec, białka wiążącego SECIS 2 (SBP2) i innych białek. białka. Niewiele wiadomo na temat mechanizmu molekularnego, a w szczególności, kiedy, gdzie i w jaki sposób SECIS i SBP2 kontaktują się z rybosomem. Wcześniejsze prace inne wykorzystały wyizolowane RNA SECIS, aby odpowiedzieć na to pytanie. Tutaj opracowaliśmy nowatorskie podejście wykorzystujące zamiast tego zmodyfikowane minimalne selenoproteinowe mRNA zawierające SECIS derywatyzowane grupami fotoreaktywnymi. Poprzez sieciowanie eksperymenty w lizacie retikulocytów królika, można było uzyskać nowe informacje na temat SBP2 i SECIS ze składnikami maszynerii translacyjnej na różnych etapach translacji. różnych etapach translacji. W szczególności stwierdziliśmy, że SBP2 wiązał się tylko do SECIS w kompleksach 48S przed inicjacją i 80S przed translacją. W kompleksie kompleksie, w którym Sec-tRNA(Sec) został umieszczony w miejscu A, ale transpeptydacja była zablokowana, SBP2 wiązał rybosom i prawdopodobnie element SECIS i prawdopodobnie również element SECIS, a SECIS miał elastyczne kontakty z podjednostką rybosomalną 60S z udziałem kilku białek rybosomalnych. W sumie nasze odkrycia doprowadziły do poszerzenia naszego zrozumienia unikalnego mechanizmu inkorporacji selenocysteiny u ssaków. u ssaków. --- Selenocysteina, zawierający selen analog cysteiny, znajduje się w królestwach prokariotycznych i eukariotycznych w miejscach aktywnych enzymów biorących udział w reakcjach reakcje utleniania-redukcji. Jego biosynteza i kotranslacyjna insercja do selenoprotein odbywa się za pomocą wyjątkowego mechanizmu, implikującego udział kilku produktów genowych. Jednym z nich jest tRNA(Sec). U u eukariontów, jego tryb transkrypcji przez polimerazę RNA III różni się od trybu transkrypcji klasycznych genów tRNA, zarówno na poziomie elementów promotora, jak i zaangażowanych czynników transkrypcyjnych. zaangażowanych czynników transkrypcyjnych. Ponadto, wzmocniona transkrypcja jest zapewniona przez nowo scharakteryzowany aktywator palca cynkowego. Nie tylko transkrypcja genu genu, ale także sam tRNA(Sec) jest nietypowy, ponieważ jego struktury 2D i 3D wykazują cechy, które odróżniają je od klasycznych tRNA. Dekodowanie eukariotycznej selenocysteiny UGA wymaga struktury pętli macierzystej w 3'UTR mRNA, elementu SECIS (selenocysteine insertion sequence). Sondowanie struktury i i porównania sekwencji doprowadziły nas do zaproponowania modelu struktury 2D dla elementu SECIS zawierającej nowy motyw RNA składający się z czterech następujących po sobie zasad nie-Watsona-Cricka. Model 3D, racjonalizujący dane dotyczące dostępności, został opracowany za pomocą modelowania komputerowego. Daje on orientacyjne lub sugestywne dowody na rolę, jaką mogą odgrywać niektóre konserwowane reszty i/lub cechy strukturalne w funkcji SECIS. Mogą one działać jako sygnały do interakcji z SBP, białkiem wiążącym białkiem wiążącym SECIS, które scharakteryzowaliśmy. --- Zidentyfikowane do tej pory białka ssaków zawierające selen zawierają selen w postaci reszt selenocysteiny postaci reszty selenocysteiny kodowanej przez UGA. Białka te nie mają wspólnych motywów sekwencji aminokwasów, ale 3'-nietranslowane regiony genów selenoprotein zawierają wspólną strukturę pętli macierzystej, sekwencję insercji selenocysteiny (SECIS) element, który jest niezbędny do dekodowania UGA jako selenocysteiny, a nie sygnału stop sygnał. Opisujemy tutaj program komputerowy SECISearch, który identyfikuje geny selenoprotein ssaków poprzez rozpoznawanie elementów SECIS na podstawie ich pierwotnych i drugorzędowych struktur oraz wymagań dotyczących energii swobodnej. Kiedy SECISearch został zastosowany do przeszukiwania ludzkiego dbEST, dwie nowe selenoproteiny ssaków, SelT i SelR, zostały zidentyfikowane. Określiliśmy ich sekwencje cDNA i wyraziliśmy je w małpiej linii komórkowej jako białka fuzyjne z zielonym białkiem fluorescencyjnym. białkiem fluorescencyjnym. Inkorporacja selenu do nowych białek została potwierdzona przez metaboliczne znakowanie (75)Se, a ekspresja SelT została dodatkowo udokumentowana w testach immunoblot. SelT i SelR nie wykazywały homologii do do wcześniej scharakteryzowanych białek, ale ich domniemane homologi wykryto w różnych organizmach. różnych organizmach. Homologi SelR były obecne w każdym organizmie scharakteryzowanym przez kompletne sekwencjonowanie genomu. Dane sugerują możliwość zastosowania SECISearch do identyfikacji nowych genów selenoprotein w nukleotydowych bazach danych. --- Selen (Se) jest niezbędnym pierwiastkiem śladowym dla kilku organizmów i jest obecny w białkach jako selenocysteina (Sec lub U), aminokwas, który jest chemicznie różni się chemicznie od seryny i cysteiny jednym atomem (Se zamiast O lub S.), odpowiednio). Sec jest włączana do selenoprotein w kodonie UGA w ramce określonym przez strukturę pętli macierzystej mRNA zwaną sekwencją zawierającą selenocysteinę (SECIS) (SECIS) prezentowaną w selenoproteinowym mRNA i specyficznej syntezie selenocysteiny syntezy i inkorporacji selenocysteiny. Selenoproteiny występują we wszystkich domenach, ale nie występują we wszystkich organizmach. Chociaż kilka funkcji zostało przypisywanych tej klasie, większość białek jest zaangażowana w obronę przed stresem oksydacyjnym. obronę przed stresem oksydacyjnym. Tutaj omawiamy szlak selenocysteiny kinetoplastydów oraz jak suplementacja selenem jest w stanie zmienić przebieg infekcji trypanosomatydów. trypanosomatydów. Organizmy te posiadają kanoniczne elementy wymagane do produkcji selenoprotein, takie jak kinaza fosfoserylowa tRNA (PSTK), syntaza selenocysteiny (SepSecS), syntaza selenofosfatazy (SelD lub SPS), oraz czynnik elongacji EFSec (SelB), podczas gdy inne ważne czynniki prezentowane w komórkach ssaków, takie jak komórkach ssaków, takie jak białko wiążące SECIS 2 (SBP) i SecP 43, są nieobecne. Selenoproteom selenoproteom trypanosomatydów jest niewielki, podobnie jak selenoproteom innych pasożytów, co jest przeciwieństwem pasożytów, co kontrastuje z dużą liczbą selenoprotein występujących w bakteriach, organizmach wodnych i wyższych eukariontach. Trypanosoma i Leishmania są wrażliwe na auranofinę, silny inhibitor selenoprotein; jednak prawdopodobny mechanizm działania leku prawdopodobny mechanizm działania leku nie jest związany z selenoproteinami u kinetoplastydów. Suplementacja selenem zmniejsza parazytemię różnych infekcji Trypanosome i zmniejsza ważne parametry związane z chorobami, takimi jak niedokrwistość i uszkodzenia narządów wywołane przez pasożyty. Konieczne są nowe eksperymenty, aby określić, w jaki sposób działa selen, ale dowody sugerują, że odpowiedź immunologiczna i zwiększona obrona gospodarza przed stresem oksydacyjnym przyczyniają się do kontroli infekcji pasożytniczej. --- Selenocysteina (Sec), 21. aminokwas w białku, jest kodowana przez UGA. Sekwencja insercyjna Sec (SECIS), który jest strukturą pętli łodygi obecną w 3' regionach nieulegających translacji (UTR). 3' regionach nieulegających translacji (UTR) eukariotycznych genów kodujących selenoproteiny, jest niezbędna do rozpoznania UGA jako kodonu dla Sec, a nie jako sygnału stop sygnał. Obecnie donosimy o identyfikacji nowej eukariotycznej selenoproteiny, oznaczonej jako selenoproteina M (SelM). Ludzki gen kodujący SelM o długości 3 kb ma pięć eksonów eksonów i znajduje się na chromosomie 22, ale nie został poprawnie zidentyfikowany przez ani Celera, ani publiczny Human Genome Project. Scharakteryzowaliśmy ludzkie i SelM i mysie sekwencje cDNA i wyraziliśmy selenoproteinę w różnych liniach komórkowych ssaków. liniach komórkowych ssaków. W 3" UTR ludzkich, mysich i szczurzych genów kodujących SelM brakuje kanonicznego elementu SECIS. kanonicznego elementu SECIS. Zamiast tego Sec jest włączany w odpowiedzi na konserwatywną strukturę strukturę mRNA, w której cytydyny są obecne zamiast adenozyny wcześniej uważane za niezmienne. Zastąpienie adenozyny cytydyną nie nie zmieniło inkorporacji Sec; jednak inne zmutowane struktury nie wspierały syntezy selenoprotein, wykazując, że ta nowa forma elementu SECIS jest funkcjonalna. SelM ulega ekspresji w różnych tkankach, ze zwiększonym poziomem w mózgu. mózgu. Jest zlokalizowany w strukturach okołojądrowych, a jego N-końcowy peptyd sygnałowy jest niezbędny do syntezy białka. peptyd sygnałowy jest niezbędny do translokacji białka. --- Selen, niezbędny pierwiastek śladowy, wchodzi w skład selenoprotein jako selenocysteina (Sec), 21. aminokwas. W celu syntezy selenoprotein, musi nastąpić przeprogramowanie translacyjne, ponieważ Sec jest kodowany przez kodon stop UGA. U ssaków rekodowanie UGA jako Sec zależy od elementu sekwencji insercji selenocysteiny (SECIS), struktury pętli macierzystej w regionie 3' nieulegającym translacji regionie transkryptu. SECIS działa jako platforma dla białek wiążących RNA, które pośredniczą lub regulują mechanizm rekodowania. Używając sieciowania UV zidentyfikowaliśmy białko o masie 110 kDa, które wiąże się z wysokim powinowactwem do elementów SECIS z podzbioru SECIS z podzbioru selenoproteinowych mRNA. Aktywność sieciowania oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa do RNA i zidentyfikowano jako nukleolinę za pomocą analizy spektrometrii masowej spektrometrii mas. Testy wiązania in vitro wykazały, że oczyszczona nukleolina rozróżnia elementy SECIS przy braku innych czynników. Na podstawie eksperymentów eksperymenty siRNA, nukleolina jest wymagana do optymalnej ekspresji niektórych selenoprotein. Stwierdzono dobrą korelację między powinowactwem nukleoliny do SECIS i jego wpływem na ekspresję selenoprotein. Jako selenoproteina poziomy transkryptów i lokalizacja nie zmieniły się w komórkach traktowanych siRNA, nasze wyniki sugerują, że nukleolina selektywnie zwiększa ekspresję podzbioru selenoprotein na poziomie translacyjnym. --- Elementy SECIS to struktury pętli macierzystych zlokalizowane w 3' regionach nieulegających translacji (UTR) eukariotycznych selenoproteinowych mRNA, które są wymagane do kierowania kotranslacyjnej inkorporacji selenocysteiny w kodonach UGA. U prokariotów, pętle macierzyste pośredniczące w przyłączaniu selenocysteiny znajdują się bezpośrednio poniżej kodonu selenocysteiny UGA, w regionie kodującym. Poprzednie badania charakterystyki elementów SECIS dejodynazy typu 1 u ssaków, peroksydazy glutationowej i selenoproteiny P wykazały, że konserwowane nukleotydy w pętlach i niesparowanych wybrzuszeniach, a parowanie zasad w łodygach jest wymagane dla funkcji SECIS. SECIS. Te wstępne badania wykorzystały około 175-230-nt segmenty 3'UTR mRNA selenoprotein. Tutaj definiujemy minimalną funkcjonalną szczurzą dejodynazę typu 1 SECIS, 45-nt segment, którego granica 5' odpowiada dokładnie 5'-najbardziej krytycznemu konserwowanemu nukleotydowi zidentyfikowanemu wcześniej. Definiujemy również wymagania dotyczące parowania zasad w rdzeniu tego elementu. elementu. W związku z obecnością elementów SECIS w otwartych ramkach odczytu (ORF) bakterii (ORF) bakteryjnych selenoprotein, badamy efekty w dejodynazie typu 1 dejodynazy wydłużenia ORF do elementu SECIS i stwierdzamy, że to dramatycznie hamuje funkcję SECIS. Na koniec definiujemy minimalny odstęp 51-111 nt między eukariotycznym kodonem selenocysteiny UGA a elementem SECIS a elementem SECIS. --- Selenoproteina S (SelS) to 189-aminokwasowe białko transbłonowe, które odgrywa ważną, ale niezdefiniowaną rolę w odpowiedzi na niesfałdowane białko. ważną, ale nieokreśloną rolę w odpowiedzi na niesfałdowane białko. Zostało zaproponowano, że SelS może funkcjonować jako reduktaza, z przedostatnią selenocysteiny (Sec(188)) uczestniczącej w wiązaniu selenosulfidowym z cysteiną (Cys(174)). Kotranslacyjne włączenie Sec do SelS zależy od przekodowania kodonu UGA, co wymaga elementu insercji selenocysteiny (SECIS) w 3'UTR transkryptu. Tutaj zidentyfikowaliśmy wiele mechanizmów regulujących ekspresję SelS. Ludzki gen SelS koduje dwa transkrypty (warianty 1 i 2), które różnią się sekwencjami 3'UTR sekwencjami z powodu alternatywnego splicingu, który usuwa element SECIS z transkryptu wariantu 1. Oba transkrypty są szeroko wyrażane w ludzkich w ludzkich liniach komórkowych, przy czym mRNA wariantu 2 zawierającego SECIS jest bardziej obfite. Eksperymenty in eksperymenty in vitro pokazują, że wariant 1 3'UTR nie pozwala na odczyt kodonu UGA/Sec. Zatem transkrypt ten produkowałby białko, które nie zawiera Sec i nie może tworzyć wiązania selenosulfidowego. wiązania selenosiarczkowego. Podczas gdy wariant 2 3'UTR obsługuje wstawianie Sec, jego aktywność jest słaba. Analiza bioinformatyczna ujawniła dwie wysoce konserwatywne struktury pętli macierzystej, jedna w proksymalnej części wariantu 2 3'UTR, a druga bezpośrednio bezpośrednio za elementem SECIS. Proksymalna pętla macierzysta promuje insercję Sec w kontekście natywnym, ale nie wtedy, gdy znajduje się daleko od kodonu UGA/Sec w heterologicznym mRNA. heterologicznym mRNA. W przeciwieństwie do tego, 140 nukleotydów poniżej elementu SECIS hamują insercję Sec. Pokazujemy również, że endogenny SelS jest wzbogacony w plamkach okołojądrowych, oprócz znanej lokalizacji w retikulum endoplazmatycznym. retikulum endoplazmatycznym. Nasze wyniki sugerują, że ekspresja endogennej SelS jest bardziej złożona niż wcześniej doceniano, co ma wpływ na dotychczasowe i przyszłe badania na temat funkcji tego białka. --- Selenoproteiny to elitarna grupa białek zawierających rzadki aminokwas, selenocysteinę (Sec), kodowaną przez kodon UGA. U eukariontów włączenie Sec wymaga elementu sekwencji insercyjnej Sec (SECIS), struktury pętli macierzystej zlokalizowanej w 3'-nietranslowanych regionach mRNA selenoprotein. Tutaj zgłaszamy identyfikację niekanonicznej formy elementu SECIS w Toxoplasma gondii i Neospora canine, jednokomórkowych pasożytów apikompleksowych ludzi i zwierząt domowych. zwierząt domowych. Ten SECIS ma sekwencję GGGA w miejscu wiązania SBP2 w miejsce AUGA, którą wcześniej uważano za niezmienną. Wykorzystując kombinację technik obliczeniowych i technik molekularnych pokazujemy, że Toxoplasma i Neospora posiadają zarówno zarówno kanoniczne, jak i niekanoniczne elementy SECIS. Element SECIS typu GGGA obsługuje Sec w komórkach ssaków HEK 293 i NIH 3T3 i robił to bardziej wydajnie niż testowane naturalne elementy SECIS ssaków. Ponadto, elementy SECIS typu I i typu II SECIS zmutowane do form GGGA były funkcjonalne, ale ale wykazywały zmniejszoną wydajność insercji Sec. Przeprowadziliśmy obliczenia wyszukiwania zarówno form AUGA, jak i GGGA elementów SECIS w Toxoplasma i wykryliśmy pięć genów selenoprotein, w tym jeden kodujący wcześniej nieopisaną selenoproteinę, oznaczoną jako SelQ, i dwa zawierające formę GGGA elementu elementu SECIS. W przeciwieństwie do tego, elementy SECIS typu GGGA nie zostały wykryte u ssaków i nicieni. Jako praktyczny wynik badania, opracowaliśmy pSelExpress1, wektor do wygodnej ekspresji selenoprotein w komórkach ssaków. komórkach ssaków. Zawiera on gen SBP2 i najbardziej wydajny testowany element SECIS: mutant AUGA genu GG. AUGA mutant struktury Toxoplasma SelT typu GGGA. --- Zbadaliśmy wymagania dotyczące insercji selenocysteiny w pojedynczych lub kodonach UGA w eukariotycznych selenoproteinach. Dwa funkcjonalne elementy SECIS zostały zidentyfikowane w 3' nieulegającym translacji regionie szczurzego mRNA selenoproteiny P, z przewidywanymi pętlami macierzystymi i krytycznymi nukleotydami podobnymi do tych w elementach SECIS w 5' dejodynazie jodotyroninowej typu I (5'DI) i peroksydazie selenoproteinowej glutationu peroksydazy selenoproteinowej mRNA typu I. Analizy mutacyjne trzech elementów SECIS SECIS potwierdziły, że konserwowane nukleotydy w pętli i w niesparowanych regionach trzonu regionach łodygi są krytyczne dla aktywności. Wskazuje to, że wiele miejsca kontaktu są wymagane dla funkcji SECIS. Funkcja kodonu stop w dowolnym z pięciu pozakontekstowych kodonów UGA w 5'DI mRNA była tłumiona przez elementy SECIS z genów 5'DI lub selenoproteiny P połączonych z nimi. Tak więc obecność elementów SECIS w eukariotycznych selenoproteinowych mRNA pozwala na pełną elastyczność w pozycji kodonu pozycji kodonu UGA. --- U ssaków większość selenu zawartego w organizmie występuje w postaci nietypowego aminokwasu, selenocysteiny (Sec). aminokwas, selenocysteina (Sec), którego kodon to UGA. Ponieważ kodon UGA jest zwykle rozpoznawany jako sygnał zatrzymania translacji, intrygujące jest to, w jaki sposób komórka rozpoznaje i odróżnia kodon UGA Sec od kodonu UGA stop. Dla eukariotycznych selenoproteinowych mRNA, zaproponowano, że zachowana struktura pętli łodygi oznaczana jako sekwencja insercyjna Sec (SECIS) w regionie 3'-untranslated (3'-UTR) jest wymagana do rozpoznania UGA jako kodonu Sec. Niektóre białka które wiążą się z SECIS (SBP). Nie jest jednak jasne, w jaki sposób SECIS w 3'-UTR może pośredniczyć w insercji Sec daleko w ramce kodonów UGA Sec. Pomysł, że musi istnieć sygnał w pobliżu kodonu UGA Sec jest nadal nadal brany pod uwagę. Dlatego poszukiwaliśmy białka, które wiąże się z sekwencją RNA otaczającej kodon UGA Sec na ludzkiej peroksydazie glutationowej (GPx) mRNA. Znaleźliśmy znaleźliśmy białko, które silnie wiązało się z fragmentem RNA przed kodonem UGA Sec kodonu. Jednak białko to nie wiązało się z sekwencją RNA poniżej kodonu kodonu UGA. Białko to wiązało się również z sekwencją SECIS w 3'-UTR ludzkiej GPx. GPx, a to wiązanie z SECIS konkurowało z fragmentem RNA przed kodonem kodonu UGA Sec. Porównanie fragmentu RNA z fragmentem SECIS zidentyfikowało konserwowane regiony, które pojawiły się w regionie przed kodonem w ramce kodonu UGA Sec mRNA białek Se. W związku z tym badanie to proponuje nowy aby zrozumieć mechanizmy inkorporacji Sec w kodonie UGA Sec, zwłaszcza regiony przed kodonem UGA mRNA ssaków selenoprotein ssaków. Model ten wyjaśnia, że struktura pętli macierzystej obejmująca kodon UGA jest rozpoznawana przez SBP i w jaki sposób kodon UGA Sec ucieka przed atakiem przez eRF czynnika uwalniającego peptyd. --- Wstawianie selenocysteiny (Sec, U) do białek jest kierowane przez translację przekodowanie określonych kodonów UGA znajdujących się przed strukturą pętli macierzystej znaną jako jako element sekwencji wstawiania Sec (SECIS). Selenoproteiny o znanych funkcjach są oksydoreduktazami zawierającymi pojedynczy redoks-aktywny Sec w swoich miejscach aktywnych. W tej pracy zidentyfikowaliśmy rodzinę selenoprotein, oznaczoną jako SelL, zawierających dwa Sec oddzielone dwiema innymi resztami, tworząc motyw UxxU. SelL wykazują niezwykłe występowanie, będąc obecne w różnych organizmach wodnych, w tym ryb, bezkręgowców i bakterii morskich. Zarówno eukariotyczne, jak i eukariotyczne, jak i bakteryjne geny SelL wykorzystują pojedyncze elementy SECIS do insercji dwóch Sec. eukariontów, SECIS znajduje się w 3' UTR, podczas gdy bakteryjny SelL SECIS znajduje się w regionie kodującym i jest umieszczony w odległości, która umożliwia wstawienie jednego z dwóch Sec lub obu tych reszt. Białka SelL posiadają fałd podobny do tioredoksyny, w którym motyw UxxU odpowiada katalitycznemu motywowi katalitycznemu motywowi CxxC w tioredoksynach, co sugeruje funkcję redoks białek SelL białek. Daleko spokrewnione białka podobne do SelL zostały również zidentyfikowane w różnych organizmach, w których jeden lub oba Sec zastąpiono Cys. Danio rerio SelL, przejściowo wyrażane w komórkach ssaków, zawierało dwa Sec i i zlokalizowany w cytozolu. W tych komórkach występował w postaci utlenionej i nie był redukowalny przez DTT. W bakteryjnym systemie ekspresji bezpośrednio zademonstrowaliśmy tworzenie wiązania diselenidowego między dwoma Sec, ustanawiając je pierwszym wiązaniem diselenidowym znalezionym w naturalnym białku. --- STRESZCZENIE: Selenoproteiny zawierają 21. aminokwas selenocysteinę, który jest kodowany przez kodon inframe UGA, zwykle odczytywany jako stop. U eukariontów jej współtranslacyjne kodowanie wymaga obecności struktury pętli macierzystej RNA, elementu SECIS w 3 nieulegającym translacji regionie (UTR) mRNA selenoprotein. Pomimo niewielkiej ochrony sekwencji, elementy SECIS mają tę samą ogólną strukturę wtórną. strukturę drugorzędową. Do niedawna, brak znacząco wysokiej liczby sekwencji mRNA selenoprotein utrudniał identyfikację innej potencjalnej sekwencji. W tej pracy narzędzie internetowe SECISaln po raz pierwszy zapewnia po raz pierwszy obszerne, oparte na strukturze dopasowanie sekwencji elementów SECIS wynikające z dobrze zdefiniowanej drugorzędowej struktury SECIS RNA i zwiększonego rozmiaru eukariotycznego selenoproteomu. Wykorzystaliśmy SECISaln do poprawić naszą wiedzę na temat struktury drugorzędowej SECIS i odkryć nowe, konserwowanych pozycji nukleotydów i wierzymy, że będzie to przydatne narzędzie dla selenoprotein i RNA. DOSTĘPNOŚĆ: SECISaln jest dostępny bezpłatnie jako narzędzie internetowe pod adresem http://genome.crg.es/software/secisaln/. --- Włączenie 21. aminokwasu, selenocysteiny, do białek jest określone we wszystkich trzech domenach życia poprzez dynamiczną translacyjną redefinicję kodonów UGA kodonów. U eukariontów i archeonów insercja selenocysteiny wymaga sekwencji cis-acting sekwencji insercji selenocysteiny (SECIS), zwykle zlokalizowanej w 3'UTR mRNA selenoprotein. Tutaj przedstawiamy porównawczą analizę sekwencji i dane eksperymentalne potwierdzające obecność drugiego elementu redefinicji kodonu stop sąsiadującego z kodonem UGA kodującym selenocysteinę w eukariotycznym genie SEPN1. genie SEPN1. Element ten jest wystarczający do stymulowania wysokiego poziomu (6%) translacyjną redefinicję kodonu UGA SEPN1 w ludzkich komórkach. Poziomy Readthrough wzrósł do 12%, gdy był testowany w obecności 3'UTR SEPN1 SECIS. Ukierunkowana mutageneza i filogeneza kontekstu sekwencji silnie wspiera znaczenie pętli macierzystej rozpoczynającej się sześć nukleotydów 3' od kodonu UGA kodonu. Zidentyfikowano również sekwencje zdolne do tworzenia silnych struktur RNA 3' przylegające do lub w pobliżu kodonów UGA kodujących selenocysteinę w Sps2, SelH, SelO i SelT. --- Kilka produktów genowych jest zaangażowanych w ko-translacyjne wstawianie selenocysteiny przez tRNA(Sec). Ponadto, struktura pętli macierzystej w mRNA kodującym selenoproteiny jest niezbędna do pośredniczenia w wyborze właściwego kodonu UGA selenocysteiny. Co ciekawe, w eukariotycznych selenoproteinowych mRNA, ta struktura pętli macierzystej, element sekwencji wstawiania selenocysteiny (SECIS), znajduje się w regionie 3'-nietranslowanym, daleko za kodonem UGA. W świetle w celu rozwikłania leżącego u podstaw złożonego mechanizmu, podjęliśmy próbę wykrycia białek wiążących RNA ze specyficznością dla elementu SECIS. Wykorzystując testy mobilności, mogliśmy wykazać, że białko obecne w różnych typach ekstraktów komórek ssaków ekstraktach komórkowych ssaków, posiada zdolność wiązania elementu SECIS selenoproteiny peroksydazy glutationowej (GPx) mRNA. Określiliśmy to białko jako SBP, dla białka wiążącego Secis. Eksperymenty konkurencyjne potwierdziły, że wiązanie jest wysoce specyficzne, a sieciowanie UV wskazało, że białko ma pozorną masę cząsteczkową w zakresie 60-65 kDa. Wreszcie, niektóre dane sugerują, że elementy SECIS w mRNA GPx i innej selenoproteinie, 5' dejodynazy jodotyroninowej typu I, rozpoznają to samo białko SBP. To stanowi pierwsze doniesienie o istnieniu białka wiążącego 3' UTR prawdopodobnie zaangażowanego w eukariotyczny mechanizm insercji selenocysteiny. --- Ekspresja selenoprotein wymaga translacyjnego przekodowania kodonu stop UGA do selenocysteiny. U eukariontów wymaga to pętli macierzystej RNA w regionie 3'-nietranslowanym, określanej jako sekwencja insercji selenocysteiny (SECIS, ang. (SECIS) i białka wiążącego SECIS 2 (SBP2). Badanie to wskazuje na udział SBP2 w dyktowaniu hierarchii ekspresji selenoprotein, ponieważ jest to pierwszy wykazało, że SBP2 rozróżnia elementy SECIS in vitro. Używając RNA testy elektroforetycznego przesunięcia ruchliwości, wykazujemy, że naturalnie występująca mutacja mutacja w SBP2, która koreluje z nieprawidłową funkcją hormonu tarczycy u u ludzi, znajduje się w nowej, dwudzielnej domenie wiążącej RNA. Mutacja ta zmienia powinowactwo wiązania RNA przez SBP2, tak że nie oddziałuje on już stabilnie z podzbiorem elementów SECIS. podzbiorem elementów SECIS. Testy przeprowadzone w warunkach konkurencyjnych w celu naśladowania warunki wewnątrzkomórkowe sugerują, że zróżnicowane powinowactwo SBP2 do różnych elementów SECIS będzie determinować wzór ekspresji selenoproteomu. Stawiamy hipotezę, że selektywna utrata podzbioru selenoprotein, w tym niektórych zaangażowanych w homeostazę hormonów tarczycy, jest odpowiedzialna za nieprawidłowy metabolizm hormonów tarczycy obserwowany wcześniej u osób osób dotkniętych chorobą.
Jak nazywa się pętla macierzysta obecna na 3' końcu genów kodujących selenoproteiny?
SECIS (sekwencja insercji selenocysteiny)