CELE: Opracowanie nieinwazyjnej metody określania statusu RhD płodu w celu w celu zapewnienia lepszej opieki kobietom najbardziej zagrożonym. PROJEKT: Badanie prospektywne. METODY: Erytroblasty płodowe zostały wzbogacone z krążenia obwodowego 96 RhD ujemnych kobiet z ciążami na różnych etapach ciąży przy użyciu nieciągłych gradientów gęstości. Amplifikację mRNA specyficznego dla RhD przeprowadzono za pomocą reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy. Do amplifikacji wybrano RNA, a nie DNA, zostało wybrane do amplifikacji, ponieważ rzadko zanieczyszcza próbki, a tym samym co skutkuje mniejszą liczbą wyników fałszywie dodatnich; ponadto jego obecność w wielu kopiach na komórkę na komórkę powinna zwiększyć czułość testu, skutkując mniejszą liczbą fałszywie negatywnych. Badanie było prospektywne i opierało się na poporodowym serologicznym potwierdzeniu fenotypu RhD. potwierdzenie fenotypu RhD. WYNIKI: Test był w 75% dokładny w przewidywaniu statusu RhD płodu, porównując w porównaniu ze standardowymi testami opartymi na genomowym DNA. Stwierdziliśmy jednak, że dokładność spadła z 85% (29/34) w trzecim trymestrze ciąży do 82% (32/39) w drugim trymestrze ciąży. (32/39) w drugim i 48% (11/23) w pierwszym trymestrze ciąży. Niezgodne dane były w większości (78%) przypadków fałszywie ujemne. WNIOSKI: Sugerujemy, że odwrotna transkrypcja może być użyteczną i być może bardziej czułą alternatywą dla standardowej genomowej reakcji łańcuchowej polimerazy w większości przypadków. większości przypadków. Jednak w pewnych okolicznościach brak lub zmniejszenie erytroblastów płodowych lub prawdopodobnie RhD mRNA w niektórych preparatach może zagrozić dokładności testu. dokładność testu. --- TŁO: Analiza bezkomórkowego DNA płodu (cff) w osoczu matki jest stosowana rutynowo do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej (NIPD) determinacji płci płodu, statusu D płodu i niektórych zaburzeń pojedynczego genu. Prawdziwie pozytywne wyniki zależą od na wykryciu analizowanego celu płodowego. Brak amplifikacji celu może być interpretowany jako wynik prawdziwie ujemny lub fałszywie ujemny z powodu braku lub bardzo niskiego poziomu cffDNA. Hipermetylowany promotor RASSF1A został zgłoszony jako uniwersalny marker płodowy potwierdzający obecność cffDNA. cffDNA. Przy użyciu wrażliwych na metylację enzymów restrykcyjnych hipometylowane sekwencje sekwencje matczyne są trawione, pozostawiając hipermetylowane sekwencje płodowe wykrywalne. Całkowite trawienie sekwencji matczynych jest wymagane w celu wyeliminowania fałszywie dodatnich wyników. METODY: cfDNA zostało wyekstrahowane z osocza matki (n = 90) i strawione za pomocą enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi i niewrażliwymi na metylację. Analizę RASSF1A, SRY i DYS14 przeprowadzono metodą PCR w czasie rzeczywistym. WYNIKI: Hipermetylowany RASSF1A amplifikowano w 79 próbkach (88%), co wskazuje na obecność cffDNA. obecność cffDNA. Wyniki PCR w czasie rzeczywistym SRY i płeć płodu przy porodzie były w 100% dokładne. w 100% dokładne. Jedenaście próbek (12%) nie miało wykrywalnego hipermetylowanego RASSF1A a 10 z nich (91%) miało wiek ciążowy poniżej 7 tygodni i 2 dni. Sześć tych próbek było płci męskiej w momencie porodu, pięć miało niejednoznaczne wyniki analizy SRY a jedna próbka nie miała amplifikacji SRY. WNIOSEK: Zastosowanie tego testu do wykrywania hipermetylowanego RASSF1A jako uniwersalnego markera płodowego uniwersalnego markera płodowego może potencjalnie poprawić wiarygodność diagnostyczną NIPD do określania płci płodu i zaburzeń pojedynczego genu. --- TŁO: Odkrycie krótkich fragmentów płodowego DNA (cffDNA) w osoczu matki spowodowało poważne zmiany w dziedzinie diagnostyki prenatalnej. w osoczu matki spowodowało poważne zmiany w dziedzinie diagnostyki prenatalnej. Wykorzystanie cffDNA do przeprowadzenia nieinwazyjnego testu prenatalnego jest ograniczone ze względu na niskie stężenie płodowego DNA w osoczu matki. stężenie płodowego DNA w osoczu matki, dlatego zastosowanie metody ekstrakcji o wysokiej metody ekstrakcji prowadzi do dokładniejszych wyników. Celem tego badania była ocena skuteczności protokołu Triton/Heat/Phenol (THP) w porównaniu z protokołem w porównaniu z zestawem QIAamp DNA Blood mini Kit do oczyszczania cffDNA. METODY: W celu oceny skuteczności protokołu THP, DNA Rhesus D (RhD) pobrano osocze ciężarnych kobiet, a następnie przeprowadzono PCR w czasie rzeczywistym dla RHD exon 7. Porównano dane wartości Ct PCR w czasie rzeczywistym uzyskane dwiema różnymi metodami. porównano, a po porodzie wykonano badanie serologiczne krwi pępowinowej w celu przeprowadzono w celu walidacji wyników PCR w czasie rzeczywistym. WYNIKI: Wyniki wykazały istotne różnice między dwiema metodami ekstrakcji (p=0,001). metodami ekstrakcji (p=0,001). Średnia ± SD wartości Ct przy użyciu protokołu THP wynosiła 33,8 ± 1,6 i 36,1±2,47 przy użyciu zestawu QIAamp DNA Blood mini Kit. WNIOSEK: Nasze odkrycie wykazało, że protokół THP był bardziej skuteczny niż Zestawy QIAamp DNA Blood mini do ekstrakcji cffDNA i prowadzą do zmniejszenia wyników fałszywie ujemnych. --- Nieinwazyjna diagnostyka prenatalna i testowanie poprzez analizę bezkomórkowego DNA w krążeniu matki to szybko rozwijająca się dziedzina. w krążeniu matki jest szybko rozwijającą się dziedziną. Obecne zastosowania kliniczne obejmują określanie płci płodu, określanie D płodu rezusa, diagnozowanie niektórych zaburzeń jednogenowych oraz bardzo dokładny test przesiewowy w kierunku aneuploidii. aneuploidii. W przyszłości będzie on prawdopodobnie wykorzystywany do diagnozowania zaburzeń monogenowych, a nawet może być wykorzystywany do profilowania całych genomów płodu. genomów płodu. Wprowadzenie tych testów do praktyki klinicznej przynosi przynosi wyraźne korzyści, ale także stwarza kilka wyzwań etycznych, społecznych i związanych ze świadczeniem usług. wyzwań. Omawiamy tutaj obecne zastosowania kliniczne, omawiamy niektóre z wyzwań wyzwania techniczne i etyczne, a także spojrzenie na to, co może przynieść przyszłość w miarę rozwoju technologii. technologia nadal ewoluuje. --- TŁO: Nieinwazyjne badania prenatalne bezkomórkowego DNA płodu (cffDNA) w osoczu matki w osoczu matki może przewidzieć typ RhD płodu u kobiet w ciąży D-ujemnych. W Danii, rutynowe przedporodowe badania przesiewowe w kierunku płodowego genu RhD (RHD) kierują przedporodowej profilaktyki anty-D tylko kobietom, które noszą płód RhD-dodatni. RhD dodatni płód. Profilaktyka zmniejsza ryzyko immunizacji, która może prowadzić do choroby hemolitycznej płodu i noworodka. Wiarygodność przewidywania typu RhD płodu zależy od czynników przedanalitycznych i czułości testu. My oceniliśmy konfigurację testowania w regionie stołecznym Danii, w oparciu o dane z rutynowych przedporodowych badań przesiewowych w kierunku RHD. METODY: Próbki krwi pobrano w wieku ciążowym 25 tygodni. DNA wyekstrahowane z 1 ml osocza analizowano pod kątem RHD płodu przy użyciu metody dupleksowej dla eksonu 7/10. Zbadaliśmy wpływ czasu transportu próbki krwi (n = 110) i temperatury otoczenia (n = 1539) na poziomy cffDNA i całkowitego DNA. DNA. Porównaliśmy dwie różne metody kwantyfikacji, metodę delta Ct i uniwersalną krzywą standardową. uniwersalną krzywą standardową. Porównano pipetowanie PCR w dwóch systemach (n = 104). WYNIKI: Na poziom cffDNA nie miał wpływu transport próbki krwi przez okres do 9 dni i temperatura otoczenia na zewnątrz. do 9 dni i temperatury otoczenia na zewnątrz w zakresie od -10 °C do 28 °C podczas transportu. Uniwersalna krzywa standardowa miała zastosowanie do kwantyfikacji cffDNA kwantyfikacji. Identyczne poziomy cffDNA zaobserwowano przy użyciu dwóch zautomatyzowanych systemów pipetowania PCR. systemów pipetowania PCR. Wykryliśmy średnio 100 kopii płodowego DNA/ml przy medianie wieku ciążowym wynoszącym 25 tygodni (zakres 10-39, n = 1317). WNIOSEK: Konfiguracja nieinwazyjnych testów prenatalnych opartych na PCR w czasie rzeczywistym dla cffDNA w regionie stołecznym Danii jest bardzo solidna. Nasze ustalenia dotyczące transportu próbek krwi wykazują wysoką stabilność cffDNA. Zastosowanie uniwersalnej krzywej standardowej ułatwia kwantyfikację cffDNA. kwantyfikację cffDNA. --- Wstęp: Bezkomórkowe płodowe kwasy nukleinowe (cffNA) mogą być wykrywane w krążeniu matki podczas ciąży. w krążeniu matki podczas ciąży, potencjalnie oferując doskonałą metodę do wczesnej nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej (NIPD) statusu genetycznego płodu. genetycznego płodu. Przy użyciu technik molekularnych, DNA i RNA płodu mogą być wykrywane od 5 tygodnia ciąży i są szybko usuwane. tygodnia ciąży i są szybko usuwane z krążenia po urodzeniu. METODY: Systematycznie przeszukiwaliśmy PubMed przy użyciu słów kluczowych free fetal DNA i NIPD. NIPD. Przeszukano również listy referencyjne odpowiednich artykułów, aby zapewnić kompleksowe pokrycie tego obszaru. WYNIKI: Wolne od komórek płodowe DNA stanowi jedynie 3-6% całkowitego krążącego DNA. bezkomórkowego DNA, dlatego diagnozy są ograniczone głównie do tych spowodowanych przez odziedziczone po ojcu sekwencje, a także stany, które można wywnioskować na podstawie unikalne wzorce ekspresji genów u płodu i łożyska. Ogólnie rzecz biorąc potencjalne zastosowania tej technologii dzielą się na dwie kategorie: po pierwsze, rodziny wysokiego ryzyka rodziny wysokiego ryzyka genetycznego z dziedzicznymi chorobami monogenowymi, w tym określanie płci w przypadkach zagrożonych chorobami sprzężonymi z chromosomem X i wykrywanie specyficznych odziedziczonych po ojcu zaburzeń jednogenowych; i po drugie, rutynowa opieka przedporodowa oferowana wszystkim kobietom w ciąży, w tym prenatalne badania przesiewowe/diagnostyka w kierunku aneuploidii, w szczególności zespołu Downa (DS), oraz diagnostykę czynnika Rhesus u kobiet RhD-ujemnych. u kobiet RhD ujemnych. Określanie płci i diagnostyka czynnika Rhesus są bliskie przełożenia na praktykę kliniczną dla osób wysokiego ryzyka. osób z grupy wysokiego ryzyka. WNIOSKI: Analiza cffNA może pozwolić na NIPD dla różnych schorzeń genetycznych genetycznych i może w przyszłości stanowić część krajowych programów badań przedporodowych przesiewowych w kierunku DS i innych powszechnych zaburzeń genetycznych. --- CEL: Nieinwazyjne genotypowanie płodowego Rhesus (Rh) D, przy użyciu bezkomórkowego płodowego DNA (cffDNA) we krwi matki, umożliwia ukierunkowane anty-RhD. DNA (cffDNA) we krwi matki, umożliwia ukierunkowaną przedporodową profilaktykę anty-RhD u nieuczulonych kobiet w ciąży RhD-ujemnych. Celem tego badania badania było określenie kosztów i korzyści tego podejścia w porównaniu z rutynowej przedporodowej profilaktyki anty-RhD dla wszystkich nieuczulonych RhD-ujemnych kobiet w ciąży, zgodnie z obecną polityką w prowincji Alberta w Kanadzie. METODY: Badanie to było analizą decyzyjną opartą na teoretycznej populacji reprezentującej całkowitą liczbę ciąż w prowincji Alberta w okresie 1 roku (n = 69 286). Stworzono drzewo decyzyjne, które nakreśliło ukierunkowaną profilaktykę dla nieuczulonych RhD-ujemnych kobiet w ciąży badanych pod kątem cffDNA (grupa docelowa) vs. rutynowa profilaktyka dla wszystkich nieuczulonych RhD-ujemnych kobiet w ciąży (grupa rutynowa). grupa). Prawdopodobieństwa w każdym punkcie decyzyjnym i koszty związane z każdym z zasobów zostały obliczone na podstawie lokalnych danych klinicznych i administracyjnych. Wyniki były koszty, liczba uczulonych kobiet i dawki immunoglobuliny Rh (RhIG). WYNIKI: Szacowany koszt na ciążę w grupie rutynowej wyniósł 71,43 w porównaniu do 67,20 dolarów kanadyjskich w grupie docelowej. Wskaźniki uczulenia na ciążę RhD-ujemną były równe, na poziomie 0,0012, dla obecnych i ukierunkowanych programów. programów ukierunkowanych. Wdrożenie ukierunkowanej przedporodowej profilaktyki anty-RhD pozwoliłoby zaoszczędziłoby 4072 dawki (20,1%) RhIG w okresie 1 roku w Albercie w porównaniu do obecnego programu. WNIOSKI: Dane te potwierdzają wykonalność ukierunkowanego programu przedporodowej profilaktyki anty-RhD przy niższych kosztach niż w przypadku istniejącego rutynowego programu profilaktyki program profilaktyczny, bez zwiększonego ryzyka uczulenia. --- W tym badaniu oceniliśmy wykonalność genotypowania RhD płodu poprzez analizę bezkomórkowego DNA płodu (cffDNA) wyekstrahowanego z próbek osocza kobiet w ciąży RhD-ujemnych za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR). D-ujemnych kobiet w ciąży przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR). Genotypowanie płodu przeprowadzono na 30 RhD-ujemnych kobietach między 9 a 39 tygodniem ciąży, które zostały skierowane do nas na badania inwazyjne [amniopunkcja/pobranie próbek kosmków kosmówkowych (CVS)]. Genotyp RHD płodu został na podstawie metody PCR w czasie rzeczywistym. Celowano w eksony 7 i 10 genów RHD i SRY i SRY. Wśród ciężarnych kobiet 12 nosiło płody płci męskiej, a 17 płody płci żeńskiej. płodów płci żeńskiej. Spośród 29 ciężarnych kobiet 21 miało RhD-dodatnie, a dziewięć a dziewięć miało płody RhD-ujemne. Jedna próbka (przypadek 12, u którego stwierdzono grupę krwi AB Rh [+]) została wykluczona z powodu kontrowersyjnych wyników powtarzanych analiz serologicznych. serologicznych. Wszystkie wyniki prenatalne były zgodne z poporodowym statusem RhD i płcią płodu. płodu bez wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. Przeprowadzenie PCR w czasie rzeczywistym na cffDNA wykazało dokładne, wydajne i wiarygodne wyniki, umożliwiając szybkie i nieinwazyjne określenie płci płodu i statusu RhD w próbkach klinicznych. próbkach klinicznych. --- CEL: Immunoglobulina anty-D jest stosowana u wszystkich kobiet w ciąży z niezgodnością RhD w celu zapobiegania chorobie hemolitycznej noworodka. Celem tego badania jest określenie statusu RhD płodu w ciążach niezgodnych z Rh za pomocą nieinwazyjnej techniki nieinwazyjnej techniki; izolacji wolnego DNA płodu z krążenia matki. W przypadku niezgodności Rh, zwłaszcza z historią wcześniejszej niedokrwistości płodu płodu, korzystne może być przedporodowe poznanie statusu Rh w zakresie świadomego monitorowania płodów z Rh dodatnim [RhD(+)] statusem. MATERIAŁY I METODY: Całkowite wolne DNA wyizolowano u 50 Rh ujemnych [RhD(-)] kobiet w ciąży, które miały RhD all. kobiet w ciąży, które miały alloimmunizację RhD ze swoimi mężami. Gen w wyizolowanym DNA badano za pomocą TagMan prob i PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów należących do eksonu 7 genu RhD. WYNIKI: Autorzy przeanalizowali 50 kobiet RhD(-) przy użyciu techniki ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. PCR w czasie rzeczywistym. Pięć z nich było RhD(-), a pozostałe okazały się RhD(+). RhD(+). Po urodzeniu jedno z niemowląt, które analizowano jako RhD(+), okazało się być RhD(-). RhD(-). WNIOSEK: Stwierdzono, że wykrywanie statusu RhD płodu za pomocą nieinwazyjnej metody z krążenia matki okazało się możliwe. Ocena statusu RhD płodu nieinwazyjnie przy użyciu wolnego DNA płodu we krwi matki będzie opłacalne, unikając niepotrzebnego pośredniego testu Coombsa i niepotrzebnych zastosowań Rhogamu który jest stosowany w ciążach niezgodnych pod względem RhD. Badanie to rzuci nowe światło na diagnostykę prenatalną. --- Alloimmunizacja przeciwko antygenowi powierzchniowemu krwinek czerwonych RhD była do niedawna najczęstszą przyczyną do niedawna najczęstszą przyczyną choroby hemolitycznej płodu i noworodka. Osocze matki osocze matki prawie zastąpiło komórki płodu uzyskane przez amniopunkcję lub jako źródło płodowego DNA, eliminując w ten sposób potrzebę inwazyjnych procedur pobierania próbek. potrzebę inwazyjnych procedur pobierania próbek. Typowanie płodu rezusa zostało wykonane z osocza matki u kobiety w jej czwartej ciąży, chociaż była izoimmunizowana w poprzednich ciążach i wymagała inwazyjnych testów, takich jak kordocenteza w przeszłości. kordocenteza. Zdiagnozowano, że płód jest ujemny pod względem rezusów z osocza matki. co pozwoliło uniknąć amniopunkcji lub kordocentezy. --- Pobieranie materiału genetycznego płodu jest wymagane do diagnostyki prenatalnej chorób genetycznych płodu. Konwencjonalne metody pobierania próbek materiału genetycznego płodu, takie jak amniopunkcja materiału genetycznego płodu, takie jak amniopunkcja i pobranie próbki kosmówki, mają charakter inwazyjny i wiążą się z ryzykiem poronienia płodu. inwazyjne i wiążą się z ryzykiem poronienia płodu. Przez dziesięciolecia naukowcy prowadzili badania mające na celu opracowanie nieinwazyjnych metod do diagnostyki prenatalnej. W 1997 r. stwierdzono istnienie cząsteczek DNA pochodzących z komórek płodu w osoczu ciężarnych. w osoczu kobiet w ciąży. Odkrycie to stanowiło nowe źródło materiału genetycznego płodu, które można było bezpiecznie uzyskać poprzez pobranie próbki krwi matki i zapewniło nową drogę dla rozwoju nieinwazyjnej rozwoju nieinwazyjnych prenatalnych testów diagnostycznych. Teraz 15 lat później, potencjał diagnostyczny analizy krążącego DNA płodu został zrealizowany. Owocne wysiłki badawcze zaowocowały klinicznym wdrożeniem szeregu nieinwazyjnych testów prenatalnych opartych na analizie DNA osocza matki i obejmowały testy do oceny płci płodu, genotypowania grupy krwi D płodu rhesus i wykrywanie aneuploidii chromosomalnej płodu. Ostatnio grupom badawczym udało się udało się zdekodować cały genom płodu na podstawie analizy DNA osocza matki co utorowało drogę do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej wielu chorób jednogenowych. wielu chorób jednogenowych. Rozpoczęła się zmiana paradygmatu w praktyce diagnostyki prenatalnej. prenatalnej. --- Technologie sekwencjonowania DNA rozwinęły się w ostatnich latach w tempie wykładniczym. lat: pierwszy ludzki genom został zsekwencjonowany w 2001 roku po wielu latach wysiłków przez dziesiątki międzynarodowych laboratoriów kosztem dziesiątek milionów dolarów. dolarów, podczas gdy w 2013 roku genom można zsekwencjonować w ciągu 24 godzin za kilkaset dolarów (sekwencjonowanie egzomu trwa za kilkaset dolarów (sekwencjonowanie egzomu trwa zaledwie kilka godzin). Coraz więcej laboratoriów szpitalnych nabywa nowe urządzenia do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości ("sekwenatory nowej generacji", NGS), pozwalające na analizę dziesiątek lub setek genów, a nawet całego egzomu. genów, a nawet całego egzomu. Ma to duży wpływ na koncepcje i praktyki koncepcje i praktyki medyczne, zwłaszcza w odniesieniu do genetyki i onkologii. Ta zdolność do jednoczesnego wyszukiwania mutacji w dużej liczbie genów jest znajduje zastosowanie w diagnostyce chorób mendlowskich (w tym przy urodzeniu), rutynowych badaniach przesiewowych heterozygot i diagnostyce prekoncepcyjnej. NGS jest obecnie wystarczająco czuły, aby analizować krążące DNA płodu we krwi matki (bezkomórkowe DNA płodu, cffDNA), umożliwiając takie zastosowania, jak nieinwazyjna diagnostyka płci płodu (i chorób sprzężonych z chromosomem X), rezus płodu wśród rhesus, trisomii, a w niedalekiej przyszłości mutacji mendlowskich. Dane dotyczące chorób wieloczynnikowych są nadal wstępne, ale wkrótce powinno być możliwe możliwe zidentyfikowanie "silnych" czynników predyspozycji genetycznych, które do tej pory były dotychczas poza zakresem badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS). W dziedzinie w dziedzinie onkogenetyki konstytucyjnej, NGS może być również wykorzystywany do jednoczesnej analizy zaangażowanych w "dziedziczne" nowotwory (21 genów raka piersi, 6 genów raka jelita grubego itp. geny raka jelita grubego itp.) Bardziej ogólnie, NGS może zidentyfikować wszystkie nieprawidłowości genomowe (delecje, translokacje, mutacje) w danej tkance złośliwej (hemopatia lub guza litego) i ma potencjał do rozróżnienia między ważnymi mutacjami (te, które napędzają progresję guza) od "przypadkowych" lub dodatkowych mutacji, a także zidentyfikować mutacje "nadające się do leczenia" podatne na terapie celowane (np. imatynib i rearanżacja Bcr/Abl; werumafemib i mutacja BRAF V600E). Systematyczne sekwencjonowanie wszystkich genów zaangażowanych w metabolizm leków i doprowadzi do zindywidualizowanej farmakogenetyki. Wreszcie, sekwencjonowanie genomu nowotworowego i konstytucyjnego, identyfikacja mutacji somatycznych i wykrywanie wariantów farmakogenetycznych, i wykrywanie wariantów farmakogenetycznych otworzy erę spersonalizowanej medycyny. spersonalizowanej medycyny. Pierwsze wyniki tych ukierunkowanych wskazań terapeutycznych pokazują w czasie trwania remisji i przeżywalności, chociaż opłacalność tych metod tych podejść pozostaje do ustalenia. Wreszcie, ta ogromna zdolność do sekwencjonowania genomu rodzi szereg kwestii regulacyjnych i etycznych. --- CEL: Opracowanie protokołu nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej statusu RhD (Rhesus D (RhD). MATERIAŁY I METODY: Do przetestowania skuteczności testu wykorzystano 112 pojedynczych limfocytów. skuteczność testu. Protokół został zwalidowany przy użyciu próbek krwi od 84 RhD-ujemnych kobiet w ciąży w 7-24 tygodniu ciąży. DNA bezkomórkowe (cfDNA) trawiono enzymatycznie przy użyciu AciI i analizowano za pomocą łańcucha polimerazy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która umożliwiła jednoczesną amplifikację eksonów 7 i 10 RHD, SRY, RASFF1A i ACTB. WYNIKI: Na poziomie równoważnym jednemu genomowi wydajność protokołu wynosiła ≥ 94,6% dla każdego amplifikowanego locus. Rozstrzygające wyniki z pierwszego zestawu PCR uzyskano dla 79 przypadków z jednym wynikiem fałszywie dodatnim. W pięciu przypadkach analizę została powtórzona, a następnie wszystkie przypadki zostały dokładnie zdiagnozowane. WNIOSKI: Proponowany protokół jest szybki, możliwy do zastosowania w większości laboratoriów diagnostyki molekularnej molekularnych laboratoriach diagnostycznych i stanowi podstawę do nieinwazyjnego badania RhD płodu z 96,7% swoistością i 100% czułością. --- TŁO: Poporodowa i przedporodowa profilaktyka anty-D znacznie zmniejszyła matek i przypadków choroby rezus u dzieci urodzonych przez kobiety z RhD ujemną grupą krwi. RhD ujemną grupą krwi. Ostatnie postępy naukowe oznaczają, że nieinwazyjna diagnostyka prenatalna (NIPD), oparta na obecności bezkomórkowego DNA płodu w osoczu matki DNA płodu w osoczu matki, może być wykorzystana do ukierunkowania profilaktyki na ciąże "zagrożone". w których płód jest RhD dodatni. Niniejszy artykuł zawiera pierwszą ocenę efektywności kosztowej profilaktyki ukierunkowanej na NIPD w porównaniu z obecnymi zasadami. METODY: Przeprowadziliśmy analizę ekonomiczną wdrożenia NIPD w Anglii i Walii. Walii. Rozważono dwa scenariusze. Scenariusz 1 zakładał, że NIPD będzie używany tylko wykorzystywany do ukierunkowania profilaktyki przedporodowej, a testy serologiczne będą nadal kierować profilaktyką po porodzie. W scenariuszu 2, NIPD zastąpiłoby również poporodowe testy serologiczne, jeśli zidentyfikowano płód RhD ujemny. Koszty zostały oszacowane z perspektywy świadczeniodawcy dla obu scenariuszy wraz z progową opłatą opłatą licencyjną za test. Koszty przyrostowe porównano z implikacjami klinicznymi. implikacjami klinicznymi. WYNIKI: Podstawowy koszt wewnętrznego testu NIPD wynosi 16,25 GBP za próbkę (z wyłączeniem opłaty licencyjnej). opłaty licencyjnej). Polityka dwudawkowej profilaktyki przedporodowej zalecana przez NICE jest NHS szacuje się na 3,37 miliona funtów rocznie. Szacowany próg opłata licencyjna wynosi 2,18 GBP i 8,83 GBP odpowiednio dla scenariuszy 1 i 2. Przy opłacie licencyjnej przy opłacie licencyjnej w wysokości 2,00 GBP, masowe testy NIPD nie przyniosłyby żadnych oszczędności dla scenariusza 1 i 507 154 GBP rocznie dla scenariusza 2. 507 154 GBP rocznie w przypadku scenariusza 2. Przyrostowa analiza opłacalności wskazuje, że przy czułości testu wynoszącej 99,7% i tej opłacie licencyjnej, testy NIPD NIPD w scenariuszu 2 wygeneruje jedno dodatkowe uczulenie na każde zaoszczędzone 9 190 funtów. zaoszczędzone £9,190. Jeśli polityka profilaktyki jednodawkowej zostałaby wdrożona na szczeblu krajowym, zgodnie z niedawnymi zaleceniami NICE, oszczędności w scenariuszu 2 spadłyby. WNIOSKI: Obecnie jest mało prawdopodobne, aby badanie NIPD w celu ukierunkowania profilaktyki anty-D być wystarczająco opłacalne, aby uzasadnić jego wprowadzenie na dużą skalę w Anglii i Walii. Anglii i Walii. Obliczono jedynie niewielkie oszczędności, które zostały zrównoważone, przewidywany wzrost uczuleń matek może być niedopuszczalnie wysoki. Wiarygodność testów NIPD nadal wymaga rygorystycznego wykazania w różnych populacjach mniejszości etnicznych. różnych populacjach mniejszości etnicznych. Jest mało prawdopodobne, aby testy w pierwszym trymestrze znacząco zmienić tego obrazu, chociaż inne pojawiające się technologie mogą. --- CEL: Zbadanie potencjalnej wysokiej wydajności i wydajności zautomatyzowanego systemu ekstrakcji DNA w połączeniu ze spektrometrią mas dla nieinwazyjnego określenia statusu Rhesus D płodu. METODY: Przebadano łącznie 178 matczynych próbek osocza od kobiet w ciąży z ujemnym wynikiem testu RHD z których DNA ekstrahowano za pomocą zautomatyzowanego systemu Roche MagNA Pure system. Obecność płodowego genu RHD wykryto za pomocą PCR dla eksonu 7 RHD i późniejszą analizę przy użyciu systemu spektrometrii masowej Sequenom MassArray. WYNIKI: Ustaliliśmy, że zaledwie 15 pg genomowego DNA RHD-pozytywnego może można wykryć w tle 585 pg genomowego DNA RHD-ujemnego. Analiza próbek klinicznych dała czułość i swoistość odpowiednio 96,1 i 96,1%, odpowiednio. WNIOSEK: Nasze badanie wykazało, że zautomatyzowana ekstrakcja DNA w połączeniu ze spektrometrią masową ze spektrometrią mas pozwala na określenie płodowego genotypu Rhesus D z dokładnością porównywalną do obecnych metod wykorzystujących PCR w czasie rzeczywistym. --- Wstęp: Choroba hemolityczna płodu i noworodka (HDN) jest spowodowana przede wszystkim przez niezgodność RhD między płodem a matką. Chociaż wszystkie kobiety ciężarne RhD ujemne poddawane są rutynowej przedporodowej profilaktyce RhD w 28. tygodniu ciąży oraz po porodzie, jeśli noworodek jest RhD dodatni, HDN nie została wyeliminowana. Tutaj zbadaliśmy genotyp Rhesus D (RHD) płodu w osoczu matki podczas w pierwszym trymestrze ciąży w naszym regionie. METODY: Próbki osocza uzyskano od 111 kobiet w ciąży RhD-ujemnych, między 9 a 13 tygodniem ciąży. DNA z osocza matki zawierające wolne od komórek płodowe DNA (cffDNA) analizowano metodą ilościowego PCR (qPCR) w celu wykrycia RHD eksonów 5 i 7. Sekwencja beta-globiny (HBB) została określona ilościowo w celu oszacowania całkowitego stężenia DNA. Wyniki qPCR porównano z noworodkowym RhD oznaczonym w surowicy krwi pępowinowej. surowicy krwi pępowinowej. Przeanalizowano również wpływ kilku parametrów ciążowych na stężenie DNA DNA. WYNIKI: Swoistość i czułość testu wynosiły odpowiednio 93% i 100%, odpowiednio, z 97% dokładnością diagnostyczną. Stężenia DNA wolnego od komórek podczas w pierwszym trymestrze ciąży nie miały wpływu parametry ciążowe badane parametry ciążowe (frakcja wolna-beta ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej i osoczowe białko A związane z ciążą, płeć płodu, matczyno-płodowa niezgodność grup krwi ABO, masa ciała matki i wiek ciążowy). WNIOSKI: Nieinwazyjne genotypowanie RHD płodu podczas pierwszego trymestru ciąży ciąży można określić z wysoką swoistością, co stanowi cenne narzędzie cenne narzędzie do poprawy zarządzania RhD ujemnymi kobietami w ciąży. Ponieważ wysoki odsetek kobiet w ciąży uczestniczy w rutynowym programie badań przesiewowych w pierwszym trymestrze połączonym programie badań przesiewowych w kierunku aneuploidii, badanie RHD płodu może być natychmiastowe wdrożenie, ponieważ można zastosować tę samą metodę pobierania krwi.
Jak można określić płód Rhesus za pomocą nieinwazyjnych testów?
Status RhD płodu można wykryć za pomocą nieinwazyjnej metody oceny wolnego DNA płodu we krwi matki.