Sekwencja SV40 PolyA (Simian virus 40 PolyA, zwana również PolyA) jest sekwencją DNA (240 bp), która posiada aktywność terminacji transkrypcji i może dodawać ogon PolyA do mRNA. PolyA zawiera heksanukleotydowy sygnał poliadenylacji AATAAA. Czternaście kopii Alu w orientacji sensownej (Alu14) wstawiono za GFP w pEGFPP. GFP w pEGFP-C1 w celu skonstruowania plazmidu pAlu14, a następnie komórki HeLa były transfekowano przejściowo pAlu14. Northern blot i mikroskop fluorescencyjny zostały wykorzystane do obserwacji ekspresji RNA i białka GFP. Nasze wyniki wykazały, że sekwencja tandemowa Alu znacząco hamowała ekspresję genu GFP, ale powodowała powstawanie RNA fuzji GFP o wyższej masie cząsteczkowej. PolyA i jego sekwencja, która została usunięta Sygnał AATAAA w orientacji sensownej lub antysensownej wstawiono między GFP a sekwencją tandemową Alu w pAlu14. Wyniki pokazały, że wszystkie wstawione sekwencje PolyA częściowo eliminowały inhibicję indukowaną przez Alu14. Sekwencje PolyA bez sygnału AATAAA w orientacji sensownej lub antysensownej nadal indukowały zakończenie transkrypcji. Antysensowna sekwencja PolyA (PolyAas) została podzielona na cztery fragmenty o długości 60 bp, a dwa środkowe fragmenty nazwano 2F2R i 3F3R. 2F2R lub 3F3R wstawiono przed sekwencją tandemową Alu w pAlu14. Masa cząsteczkowa RNA fuzji GFP wzrosła, gdy liczba kopii 2F2R wzrosła. 2F2R może wspierać wydłużanie transkrypcji, gdy 2F2R znajduje się przed innym 2F2R. Niemniej jednak, 2F2R zlokalizowany przed sekwencją tandemową Alu może indukować zakończenie transkrypcji. Wstawienie jednej kopii lub 64 kopii 3F3R przed sekwencją tandemową Alu spowodowało produkcję RNA GFP o niższej masie cząsteczkowej. --- Geny Sox dzielą wysoce konserwatywny motyw wiążący DNA, domenę HMG (high mobility group) i pełnią różnorodne role w rozwoju embrionalnym kręgowców. A nowy cDNA związany z SRY (tymczasowo nazwany Sox33) wyizolowany z chińskiego aligatora (Alligator sinensis). aligatora (Alligator sinensis) ma długość 1,819 bp, z otwartą ramką odczytu od 220 do 1113 bp, kodując białko o długości 298 aminokwasów. Dwie domniemane sekwencje sygnałowe sekwencje sygnałowe poliadenylacji (AATAAA) są obecne przed ogonem poli(A) w 3' UTR (przy 1255-1260 i 1774-1779). Domniemane białko zawiera domenę HMG-box najbardziej zbliżoną do hSox12, mSox4, rtSox11 i mSox11 wskazując, że aligator Sox33 należy do grupy C w rodzinie genów Sox rodziny genów Sox. Dorosłe i rozwijające się tkanki aligatora zostały przetestowane na obecność mRNA Sox33 przez niezależne Northern blots przy użyciu sondy 336-bp (w 907-1243) pomiędzy HMG-box i miejscem poli(A) I oraz sondę 277-bp (przy 1477-1754) między dwoma miejscami poliadenylacji. miejscami poliadenylacji. Dwa transkrypty (1,3 kb i 1,8 kb) w rozwijającym się mózgu i jeden (1,8 kb) w dorosłym mózgu zostały zidentyfikowane przez sondę 336-bp; tylko jeden transkrypt (1,8 kb) w rozwijających się i dorosłych mózgach został wykryty przez sondę 277-bp sonda. Wyniki sugerują, że aligator Sox33 może wykorzystywać inny mechanizm poliadenylacji mechanizm poliadenylacji w rozwijającym się mózgu i odgrywać rolę w rozwoju i utrzymaniu układu nerwowego. rozwoju i utrzymaniu układu nerwowego. --- Poliadenylacja pre-mRNA, krytyczny etap w ekspresji genów eukariotycznych, jest w którym pośredniczą elementy cis zwane sygnałami poliadenylacji. Analiza takich sygnałów poliadenylacji w całym genomie była nieobecna w rozszczepieniu drożdżach, mimo że jest to ważny organizm modelowy. Wykazaliśmy, że kanoniczny motyw AATAAA jest najczęstszym i najbardziej funkcjonalnym sygnałem poliadenylacji w Schizosaccharomyces pombe. Wykorzystując analizę zestawów danych RNA-Seq z komórek komórek hodowanych w różnych warunkach fizjologicznych, zidentyfikowaliśmy 3' UTR dla prawie 90% genów drożdży. prawie 90% genów drożdży. Heterogeniczność miejsc rozszczepienia jest powszechna, podobnie jak alternatywna poliadenylacja w obrębie i pomiędzy warunkami. Zweryfikowaliśmy obliczeniowo zidentyfikowane elementy sekwencji, które mogą promować poliadenylację przez testy funkcjonalne, w tym qRT-PCR i analizę 3'RACE. Biologiczne znaczenie motywu AATAAA jest podkreślone przez analizę funkcjonalną genów zawierających go. Ponadto wykazano, że geny konwergentne wymagają elementów trans, takich jak kohezyna, do wydajnej terminacji transkrypcji. Tutaj my pokazujemy, że geny konwergentne pozbawione kohezyny (na chromosomie 2) są generalnie związane z dłuższymi nakładającymi się transkryptami mRNA. Nasze bioinformatyczne i i eksperymentalne wyniki dla całego genomu są podsumowane i mogą być dostępne i dostosowane w przyjaznej dla użytkownika bazie danych Pomb(A). --- Wielkoskalowa analiza sygnałów poliadenylacji u ludzi została przeprowadzona in silico. Najbardziej kanoniczny heksamer AAUAAA i jego 11 wariantów pojedynczych nukleotydów które są najczęstsze w ludzkich genach, zostały wykorzystane do poszukiwania sygnałów poliadenylacji w sekwencjach terminalnych. w sekwencjach końcowych. Spośród 18 277 miejsc poli(A), które zostały zidentyfikowanych z 26 414 ludzkich genów, 82,5% miejsc zawierało co najmniej co najmniej jeden z tych 12 heksamerów jako sygnał poliadenylacji w ciągu 40 nukleotydów przed miejscem poli(A). Reszta (17,5%) nie zawierała żadnego z tych heksamerów, co sugeruje istnienie jeszcze nieznanych sygnałów. Łącznie 20 347 sekwencji terminalnych w pobliżu 12 sygnałów poliadenylacji zostały przy użyciu zmodyfikowanej techniki klastrowania EST w celu utworzenia wielkoskalowej bazy danych sygnałów poliadenylacji. Aby scharakteryzować 12 heksamerów, określono lokalizacje sygnałów poliadenylacji, które zostały zidentyfikowane jako "autentyczne" oraz zawartość zbadano zawartość uracylu w dalszym regionie sygnału. Na podstawie tej analizy, 11 wariantów kanonicznego AAUAAA zostało zidentyfikowanych jako prawdopodobnie tworzących "funkcjonalne" sygnały jako AAUAAA. Ponadto zaobserwowano częstotliwość 41,9% dla AAUAAA była znacznie niższa niż w przypadku innych raportów, co sugeruje, że niekanoniczne warianty są ważniejsze w procesie procesie poliadenylacji niż często rozpoznawane. Ponieważ miejsca poli(A) przetwarzane przez te niekanoniczne warianty nie zostały ogólnie opisane w głównych bazach danych genów. głównych bazach danych genów, ważne jest ustalenie, czy wariantowe heksamery mogą działać jako sygnały poliadenylacyjne, które mogą być odpowiedzialne za generowanie heterogenność mRNA poprzez alternatywną poliadenylację. --- TŁO: Revolver to nowo odkryta wielogenowa rodzina elementów transpozycyjnych w genomie Triticeae. elementów w genomie Triticeae. Revolver obejmuje od 2929 do 3041 bp, ma 20 bp końcowych odwróconych powtarzających się sekwencji na obu końcach i zawiera aktywny transkrypcyjnie gen kodujący białko podobne do wiązania DNA. Domniemany TATA znajduje się przy podstawie 221, z miejscem czapeczki przy podstawie 261 i możliwym sygnałem poliadenylacji sygnał poliadenylacji AATAAA przy podstawie 2918. Revolver wykazuje znaczną zmienność ilościową u pszenicy i jej krewnych. WYNIKI: Długość cDNA Revolver wahała się od 395 do 2,182 bp. Pierwszy ekson wykazywał zmienność długości, ale drugi i trzeci ekson były prawie identyczne. Te warianty w rodzinie Revolver współdzieliły region downstream drugiego intronu, ale różniły się strukturalnie w pierwszym eksonie 5'. Istniało 58 klonów, które wykazywały częściową homologię z Revolver, wśród 440 000 klonów z ekspresją klonów znakowanych sekwencją (EST) pochodzących z Triticeae. W tych Revolver o długości 360-744 bp, część po 2. eksonie była zachowana (65-79% homologii). zachowana (65-79% homologii), ale sekwencje pierwszego eksonu miały wzajemnie niską homologię. homologię, z mutacjami podzielonymi na 12 typów i nie miały sekwencji EST z otwartymi ramkami odczytu (ORF). Za pomocą PCR z regionem 3'-flankingowym typowego klonu genomowego Revolver-2 używanego jako pojedynczy starter, chromosomy żyta 1R i 5R mogły zostać jednocześnie zidentyfikowane. Wśród chromosomów żyta i rozbieżności zaobserwowano wśród 161 genotypów pojedynczego gatunku Triticum dicoccoides zebranych z 18 populacji w Izraelu o różnej ekspozycji na stresy abiotyczne i biotyczne (gleba, temperatura, wysokość, dostępność wody i patogeny), i patogeny). WNIOSKI: Na podstawie istniejących różnic między wariantami Revolver, markery molekularne opracowano markery molekularne, które mogą rozróżniać różne chromosomy żyta. Dywersyfikacja ekogeograficzna dzikiego ementalera T. dicoccoides w Izraelu i wysoka liczba kopii Revolver są związane z wyższymi opadami deszczu i stresami biotycznymi. Znaczące różnice ilościowe między liczbą kopii Revolver u tego samego gatunku z różnych ekosystemów w tych samych gatunkach z różnych ekosystemów sugerują silną aktywność amplifikacyjną w ciągu ostatnich 10 000 lat. Jest to interesujące odkrycie, ponieważ większość wysokokopijnych elementów transpozycyjnych Triticeae wydaje się być nieaktywna w ostatnim czasie. z wyjątkiem elementu BARE-1 w Hordeum, a fakt ten może być interesujący dla postrzeganie procesów ewolucji adaptacyjnej roślin. --- Scharakteryzowaliśmy reduktazę tioredoksyny 1 (TrxR1) z Chironomus riparius (CrTrxR1) i zbadaliśmy jej ekspresję pod wpływem stresu oksydacyjnego. Pełnej długości cDNA ma długość 1820 pz i zawiera otwartą ramkę odczytu (ORF) o długości 1488 pz. The białko CrTrxR1 ma 495 aminokwasów i obliczoną masę cząsteczkową wynoszącą 54,41 kDa i punkt izoelektryczny 6,15. Występował 71bp 5' i 261bp 3' z miejscem sygnałowym poliadenylacji (AATAAA). Homologiczne wykazały obecność konserwatywnej domeny katalitycznej Cys-Val-Asn-Val-Gly-Cys (CVNVGC), C-końcowych aminokwasów "CCS" i konserwowanych aminokwasy wymagane w katalizie. Ekspresja CrTrxR1 jest mierzona przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym po ekspozycji na 50 i 100 mg / L parakwatu (PQ) i 2, 10 i 20mg/L chlorku kadmu (Cd). CrTrxR1 mRNA było regulowane w górę po ekspozycji na PQ we wszystkich badanych warunkach. Najwyższy poziom ekspresji CrTrxR1 był zaobserwowano po ekspozycji na 10 mg / L Cd przez 24 godziny, a następnie 20 mg / L przez 48 godzin. Znaczący spadek ekspresji CrTrxR1 zaobserwowano po ekspozycji na 10 i 20mg/L Cd przez 72h. Badanie to pokazuje, że CrTrxR1 może być potencjalnie stosowany jako biomarker stresu oksydacyjnego wywołującego zanieczyszczenia środowiska. --- Zidentyfikowaliśmy i scharakteryzowaliśmy gen z rodziny CYP9, CrCYP9AT2, z Chironomus riparius, eko-toksykologicznie ważnego organizmu modelowego. Długość 1978 par zasad (bp) długość CrCYP9AT2 cDNA ma otwartą ramkę odczytu 1587 bp kodującą białko o przypuszczalnej długości 528 aminokwasów. Było 267 bp 5 'i 123 bp 3' nieulegający translacji region region z miejscem sygnału poliadenylacji (AATAAA). Domniemana wiążąca hem cysteina w pozycji 471 i typowa sekwencja sygnaturowa p450 463-FGIGPRNCIG-473. Transkrypt CrCYP9AT2 był obecny we wszystkich stadiach rozwojowych, z najwyższą ekspresją u larw. Modulacja CrCYP9AT2 badano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym po 24h ekspozycji na chlorek kadmu, benzo(a)piren; bisfenol A; nonylofenol; chloropiryfos i etynyloestradiol. Znaczącą regulację w górę genu CrCYP9AT2 zaobserwowano po ekspozycji na Cd, B(a)P i CP. Jednakże, CrCYP9AT2 był znacząco w dół po ekspozycji na BPA, NP i EE. --- Powszechnie wiadomo, że prawie wszystkie eukariotyczne mRNA zawierają 3' ogon poli(A). A sygnał poliadenylacji (AAUAAA) w pobliżu 3' końca pre-mRNA jest wymagany do syntezy syntezy poli(A). Kompleks białkowy zaangażowany w poliadenylację pre-mRNA jest sprzężony z polimerazą RNA II podczas transkrypcji genu. Zgodnie z zgodnie z powszechnie przyjętym poglądem, tylko RNA syntetyzowane przez polimerazę RNA II może być poliadenylowany w sposób zależny od AAUAA. Tutaj opisujemy poliadenylację krótkich elementów interspersyjnych (SINE) B2 i transkryptów VES generowanych przez polimerazę RNA polimerazę RNA III. Komórki HeLa transfekowano konstruktami SINE z sygnałami poliadenylacji lub bez nich. sygnałami poliadenylacji. Analizy transkryptów SINE wykazały, że tylko RNA z sygnałem AAUAAA zawierały ogony poli(A). Poliadenylowany RNA B2 było znacznie bardziej stabilne w komórkach niż B2 RNA bez ogona poli(A). --- Inhibitory proteinazy odgrywają ważną rolę w systemach obronnych gospodarza obejmujących krzepnięcia krwi i trawienia patogenów. Wyizolowaliśmy i scharakteryzowaliśmy klon cDNA dla inhibitora proteazy typu Kazal (KPI) z biblioteki cDNA hemocytów orientalnej białej krewetki Fenneropenaeus chinensis. Gen KPI składa się z trzech eksonów i dwóch intronów. KPI cDNA zawiera otwartą ramkę odczytu o długości 396 bp, sekwencję sygnałową poliadenylacji AATAAA i ogon poli (A). KPI cDNA koduje polipeptyd o długości 131 aminokwasów z domniemanym peptydem sygnałowym o długości 21 aminokwasów. aminokwasów. Wydedukowana sekwencja aminokwasowa KPI zawiera dwie homologiczne domeny Kazal każda z sześcioma konserwowanymi resztami cysteiny. mRNA KPI ulega ekspresji w hemocytach zdrowych krewetek, a wyższą ekspresję transkryptu KPI obserwuje się u krewetek zakażonych wirusem zespołu białej plamki (WSSV), co sugeruje potencjalną rolę KPI w mechanizmach obronnych gospodarza. --- Poliadenylacja (poli(A)) eukariotycznego mRNA jest krytycznym etapem ekspresji genów. ekspresji genów. W roślinach sygnały poli(A) prowadzące do tworzenia ogonów poliadenozyny ogonów po mRNA obejmują elementy znajdujące się daleko w górze łańcucha, sygnały podobne do AAUAAA, i miejsca cięcia mRNA dla poli(A). Wiele sygnałów AAUAAA prowadzących do alternatywnego tworzenia poliadenozyny znaleziono w wielu genach, ale wpływ każdego sygnału AAUAA na ekspresję genów pozostaje do odkrycia. FRAGMENT DNA którego transkrypt zawiera dwa kanoniczne sygnały AAUAA z regionu regionu 3'-nietranslacyjnego genu endochitynazy tytoniu (Nicotiana tabacum L. cv. W38), został zmutowany i skonstruowany do regionu kodującego beta-glukuronidazę (GUS). Przejściowa ekspresja genu GUS z tych konstruktów wskazała, że dystalny sygnał AAUAAA z kodonu stop był ważniejszy niż proksymalny w stymulowaniu ekspresji genu. Ponadto, sekwencja, a nie niż odległość między kodonem stop a regionem sygnałowym AAUAA była krytyczna dla ekspresji genu. Transgeniczne tytonie z tymi konstruktami zostały również również wygenerowane, a pozycja tworzenia ogona poliadenozyny w tym regionie została zmapowana. regionie. Wyniki wykazały, że oba sygnały AAUAA były funkcjonalne, i że ogony poliadenozyny większości transkryptów były kierowane przez dystalny sygnał AAUAA. Na koniec zmierzono stabilność RNA tych wariantów w roślinach transgenicznych. roślinach transgenicznych. RNA z wariantów z funkcjonalnym dystalnym sygnałem AAUAAA były bardziej stabilne niż te z funkcjonalnym sygnałem proksymalnym. Możliwa struktura drugorzędowa Przewidywano i omówiono możliwą strukturę drugorzędową w tym regionie sygnałowym poli(A). omówione.
Jaka jest sekwencja RNA kanonicznego sygnału poliadenylacji?
Sygnał poliadenylacji (AAUAAA) w pobliżu 3' końca pre-mRNA jest wymagany do syntezy poli(A).