Utrata terminalnie zróżnicowanych kardiomiocytów z powodu choroby serca jest nieodwracalna. nieodwracalna, a obecne schematy terapeutyczne są ograniczone. Terapia komórkowa z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych jest atrakcyjną opcją naprawy uszkodzonego serca. serca. Odkrycie bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ang. w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) i udane różnicowanie iPSC do w kardiomiocyty zapewniło rewolucyjny paradygmat w badaniach nad regeneracją serca. W ciągu ostatnich dziesięcioleci poczyniono znaczne postępy w hodowli komórek macierzystych, różnicowania i oczyszczania, a także w metodach transplantacji komórek. komórek. Z drugiej strony, ostatnie badania wykazały, że komórka somatyczna może zostać przekształcona w alternatywny zróżnicowany typ komórki bez uprzedniego przekształcenia jej w komórkę macierzystą poprzez nadekspresję czynników czynników specyficznych dla danej linii. Odkryliśmy, że funkcjonalne kardiomiocyty mogą być bezpośrednio indukowane z fibroblastów przez kombinację trzech czynników transkrypcyjnych sercowych czynników transkrypcyjnych, Gata4, Mef2c i Tbx5, in vitro i in vivo. Przedstawię omówię perspektywy regeneracji serca przy użyciu technologii przeprogramowania. --- UZASADNIENIE: Bezpośrednie przeprogramowanie fibroblastów w kardiomiocyty jest nową strategią regeneracji serca. strategią regeneracji serca. Jednak kluczowe determinanty zaangażowane w ten proces są nieznane. CEL: Ocena skuteczności bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów poprzez wirusową nadekspresję GATA4, GATA4 i GATA4. nadekspresję GATA4, Mef2c i Tbx5 (GMT). METODY I WYNIKI: Wywołaliśmy nadekspresję GMT w mysich fibroblastach ogonowych ogonowych (TTF) i fibroblastach sercowych (CF) z wielu linii transgenicznych myszy transgenicznych myszy niosących różne reportery linii kardiomiocytów. Stwierdziliśmy że indukcja nadekspresji GMT w TTF i CF jest nieskuteczna przy w indukowaniu molekularnych i elektrofizjologicznych fenotypów dojrzałych kardiomiocytów. Ponadto, przeszczepienie CF zainfekowanych GMT do uszkodzonych serc myszy spowodowało zmniejszenie przeżywalności komórek przy minimalnej indukcji genów kardiomiocytów. kardiomiocytów. WNIOSKI: Znaczące wyzwania pozostają w naszej zdolności do przekształcania fibroblastów w komórki podobne do kardiomiocytów, a lepsze zrozumienie epigenetyki sercowo-naczyniowej epigenetyki układu sercowo-naczyniowego, aby zwiększyć potencjał translacyjny tej strategii. --- Przeprogramowanie mysich fibroblastów w kierunku komórek mięśnia sercowego poprzez wymuszoną ekspresję sercowych czynników transkrypcyjnych lub mikroRNA ekspresję sercowych czynników transkrypcyjnych lub mikroRNA zostało ostatnio wykazano. Potencjalna przydatność kliniczna tych odkryć opiera się na minimalnym potencjale regeneracyjnym dorosłego ludzkiego serca i ograniczonej dostępność ludzkiej tkanki serca. Początkowym, ale obowiązkowym krokiem w kierunku klinicznego zastosowania tego podejścia jest ustalenie warunków konwersji dorosłych ludzkich fibroblastów do fenotypu serca. W tym celu staraliśmy się określić optymalną kombinację czynników niezbędnych i wystarczających do bezpośredniego przeprogramowania ludzkich fibroblastów. Tutaj pokazujemy, że cztery ludzkie czynniki transkrypcyjne, w tym białko wiążące GATA 4, Hand2, T-box5 i miokardynę oraz dwa mikroRNA, miR-1 i miR-133, aktywowały ekspresję markerów sercowych u noworodków. ekspresję markerów sercowych w noworodkowych i dorosłych ludzkich fibroblastach. Po utrzymaniu w hodowli przez 4-11 tygodni, ludzkie fibroblasty przeprogramowane tymi białkami i mikroRNA wykazywały struktury podobne do sarkomerów i transjenty wapnia, a niewielki podzbiór takich komórek niewielki podzbiór takich komórek wykazywał spontaniczną kurczliwość. Tym fenotypowym fenotypowe towarzyszyła ekspresja szerokiego zakresu genów sercowych i i supresji genów innych niż miocyty. Odkrycia te wskazują, że ludzkie fibroblasty można przeprogramować na miocyty podobne do serca poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych czynników transkrypcyjnych z mikroRNA specyficznymi dla mięśni i stanowią krok w kierunku możliwego terapeutycznego zastosowania tego podejścia do przeprogramowania. --- Jednoczesna nadekspresja kilku czynników transkrypcyjnych stała się skuteczną strategią przekształcania fibroblastów w inne typy komórek, w tym komórki pluripotencjalne, neurony i kardiomiocyty. Wybór i badanie przesiewowe czynników czynników są krytyczne i często wiązały się z testowaniem dużej puli czynników transkrypcyjnych. czynników transkrypcyjnych, a następnie sukcesywne usuwanie pojedynczych czynników. Tutaj, zidentyfikować kombinację sercowych czynników transkrypcyjnych ułatwiającą przeprogramowanie mysich przeprogramowanie mysich fibroblastów w kardiomiocyty, bezpośrednio sprawdziliśmy wszystkie triplety kombinacje 10 czynników kandydujących w połączeniu z testem Q-PCR zgłaszającym indukcję wielu genów specyficznych dla serca. Dzięki tej metodzie przesiewowej kombinacja Tbx5, Mef2c i Myocd została zidentyfikowana jako zwiększająca regulację szerszego spektrum genów serca w porównaniu do spektrum genów sercowych w porównaniu do kombinacji Tbx5, Mef2c i Gata4 która, jak ostatnio wykazano, indukuje przeprogramowanie fibroblastów w kardiomiocyty. kardiomiocyty. Komórki poddane kotransdukcji z Tbx5, Mef2c i Myocd wyrażały białka kurczliwe serca białka kurczliwe, miały podobne do serca prądy potasowe i sodowe oraz potencjały czynnościowe. potencjały czynnościowe. Podsumowując, alternatywne podejście do badań przesiewowych, które pozwoliło uniknąć eliminacji czynników transkrypcyjnych, których moc jest maskowana w złożonych mieszankach czynników transkrypcyjnych. Ponadto, nasze wyniki wskazują na znaczenie weryfikacji wielu genów specyficznych dla linii podczas oceny reprogramowania. przeprogramowania. --- Ostatnie postępy w biologii komórek macierzystych pozwoliły na przeprogramowania ludzkich i mysich komórek fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. komórki macierzyste. Wykazano, że trzy główne regulatory są wystarczające do zarządzania statusem komórek "pluripotencjalnych" i "zróżnicowanych". Ta sama strategia strategia została wykorzystana do bezpośredniej konwersji jednego typu komórek somatycznych w inny typ komórek. w inny typ komórek, np. przekształcanie komórek zewnątrzwydzielniczych trzustki w komórki blisko przypominające komórki beta i przeprogramowanie komórek fibroblastów w funkcjonalne komórki neuronów. komórki neuronów. Grupa Srivastavy zgłosiła pierwsze bezpośrednie przeprogramowanie mysich komórek fibroblastów w komórki linii mezodermalnej (kardiomiocyty) z wykorzystaniem wymuszoną ekspresją trzech sercowych czynników transkrypcyjnych: Gata4, Mef2c i Tbx5. Indukowane kardiomiocyty wykazują globalny profil ekspresji genów oraz podstawową charakterystykę elektrofizjologiczną podobną do kardiomiocytów postnatalnych. kardiomiocytów postnatalnych. Badanie to poczyniło znaczące postępy w dziedzinie kardiomiocytów i komórek macierzystych. i komórek macierzystych i ma ważne implikacje w zrozumieniu biologii rozwoju serca a także w potencjalnych terapiach chorób układu krążenia u ludzi. --- Choroby serca pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie. Ze względu na ograniczoną zdolności regeneracyjne tkanki serca, terapia regeneracyjna serca stała się jako atrakcyjne podejście. Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów serca (HCF) w kardiomiocyty może mieć ogromny potencjał w tym zakresie. My że indukowane komórki podobne do kardiomiocytów (iCM) mogą być bezpośrednio generowane z mysich fibroblastów serca. generowane z mysich fibroblastów serca in vitro i in vivo poprzez transdukcję trzech czynników transkrypcyjnych trzech czynników transkrypcyjnych: Gata4, Mef2c i Tbx5, łącznie określanych jako GMT. W W niniejszym badaniu staraliśmy się ustalić, czy ludzkie fibroblasty mogą również być przekształcane w iCM przez określone czynniki. Nasze początkowe odkrycie, że GMT nie było wystarczające do indukcji serca w HCF skłoniło nas do zbadania dodatkowych czynników czynników promujących przeprogramowanie serca poprzez analizę indukcji wielu specyficznych dla serca za pomocą ilościowej reakcji RT-PCR. Dodanie Mesp1 i Myocd do GMT skuteczniej regulowało w górę szersze spektrum genów sercowych w HCF w porównaniu z samym GMT. HCF i ludzkie fibroblasty skórne transdukowane za pomocą GMT, Mesp1 i Myocd (GMTMM) zmieniły morfologię komórek z kształtu wrzeciona do kształtu przypominającego pręt lub wielokąt, wyrażały wiele białek specyficznych dla serca, zwiększał szeroki zakres genów sercowych i jednocześnie tłumił geny fibroblastów oraz wykazywał spontaniczne i wykazywały spontaniczne oscylacje Ca(2+). Co więcej, komórki dojrzewały, aby wykazywać potencjały czynnościowe i kurczyć się synchronicznie w kokulturze z mysimi kardiomiocytami. Test 5-etynylo-2'-deoksyurydyny ujawnił, że wytworzone w ten sposób iCM nie przechodzą przez stan komórki mitotycznej. Wyniki te pokazują, że ludzkie fibroblasty mogą być bezpośrednio przekształcane w iCM przez zdefiniowane czynniki czynniki, co może ułatwić przyszłe zastosowania w medycynie regeneracyjnej.
Jakie są 3 podstawowe czynniki transkrypcyjne, które zostały wykorzystane do bezpośredniego przeprogramowania fibroblastów w kardiomiocyty lub komórki podobne do kardiomiocytów?
Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów serca (HCF) w kardiomiocyty może mieć w tym celu ogromny potencjał. Odkryliśmy, że funkcjonalne kardiomiocyty mogą być bezpośrednio indukowane z fibroblastów przez kombinację trzech sercowych czynników transkrypcyjnych, Gata4, Mef2c i Tbx5, in vitro i in vivo.