Homologiczne parowanie chromosomów jest warunkiem wstępnym do ustanowienia fizycznego powiązania między homologami, co jest krytyczne dla wiernej segregacji chromosomów podczas mejozy I. Ustanowienie parowania jest genetycznie oddzielne od późniejszej synapsy, definiowanej jako stabilizacja parowania przez synapsę. synapsy, definiowanej jako stabilizacja parowania przez kompleks synaptonemalny (SC). Mechanizm leżący u podstaw parowania presynaptycznego jest słabo poznany. W nicieni Caenorhabditis elegans, unikalny element działający cis, centrum parowania (PC), jest niezbędny do parowania presynaptycznego; nie wiadomo jednak, czy i w jaki sposób pozostała część chromosomu przyczynia się do parowania presynaptycznego. Tutaj my zgłaszamy bezpośrednie dowody na aktywność parowania presynaptycznego nieodłącznie związaną z regionami innymi niż PC która jest ułatwiana przez konserwatywne białko chromodomeny, MRG-1. W mutantach z utratą funkcji mrg-1, parowanie jest upośledzone szczególnie w regionach nie-PC prowadząc do niehomologicznego składania SC. Nasze dane potwierdzają model, w którym wyrównanie presynaptyczne w regionach innych niż PC współpracuje z początkowym parowaniem PC, aby zapewnić prawidłową homologiczną synapsę. --- CHD7 jest członkiem rodziny CHD (chromodomain helicase DNA binding domain) enzymów remodelujących chromatynę ATP-zależnych enzymów remodelujących chromatynę. Jest zmutowany w zespole CHARGE, zespole zespół wielu wad wrodzonych. CHD7 jest jednym z podzbioru białek CHD, unikalnych dla metazoanów, które zawierają domenę BRK, moduł białkowy występujący również w rodzinie helikaz Brahma/BRG1. Opisujemy tutaj strukturę roztworu NMR dwóch domen BRK CHD7. Każda domena ma zwarty fałd betabetaalphabeta fałd. Druga domena ma C-końcowe przedłużenie składające się z dwóch dodatkowych helis. dodatkowych helis. Struktura różni się od struktury innych domen obecnych w białkach białkach związanych z chromatyną. --- Remodelery chromatyny są zależnymi od ATP maszynami, które dynamicznie zmieniają pakowanie chromatyny genomów eukariotycznych poprzez montaż, przesuwanie i przemieszczanie nukleosomy. Remodelator chromatyny Chd1 posiada C-końcową domenę wiążącą DNA domenę, która jest wymagana do wydajnego przesuwania nukleosomów i uważana za niezbędna do wykrywania długości DNA flankującego rdzeń nukleosomu. Struktura Struktura domeny wiążącej DNA Chd1 została niedawno wykazana jako składająca się z domeny SANT i domeny SLIDE, analogicznej do domeny wiążącej DNA z rodziny ISWI. szczegóły tego, jak Chd1 rozpoznaje DNA, nie były znane. Tutaj przedstawiamy strukturę krystaliczną domeny wiążącej DNA Saccharomyces cerevisiae Chd1 w kompleksie z dupleksem DNA. w kompleksie z dupleksem DNA. Związany dupleks DNA jest prosty, co jest zgodne z preferencją wykazywaną przez domenę wiążącą DNA Chd1 dla pozanukleosomalnego DNA. Porównanie tej struktury z niedawno rozwiązaną domeną wiążącą DNA ISW1a związaną z DNA ujawnia, że DNA układa się w poprzek każdego białka pod innym kątem, ale kontaktuje się z podobnymi powierzchniami w domenach SANT i SLIDE. W przeciwieństwie do W przeciwieństwie do wiązania mniejszego rowka obserwowanego dla Isw1 i przewidywanego dla Chd1, domena SLIDE domeny wiążącej DNA Chd1 styka się z głównym rowkiem DNA. Większość bezpośrednich kontaktów ze szkieletem fosforanowym występuje tylko na jednej nici DNA, sugerując, że Chd1 może nie silnie rozróżniać między głównymi i mniejszymi rowkami. rowkami. --- Białka z grupy Polycomb (PcG) są niezbędne do utrzymania wzorców ekspresji genów podczas rozwoju. Represja transkrypcji przez białka PcG obejmuje trimetylację H3K27 (H3K27me3) przez kompleks represyjny Polycomb 2 (PRC2) u zwierząt i roślin. zwierząt i roślin. PRC1 wiąże się z H3K27me3 i jest wymagany do transkrypcji represji transkrypcji u zwierząt, ale u roślin aktywność podobna do PRC1 pozostaje nieuchwytna. Jednym z kandydujących białek, które może być zaangażowane w funkcje podobne do PRC1 w roślinach jest LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1), ponieważ LHP1 wiąże się z genami oznaczonymi jako przez H3K27me3 in vivo i ma chromodomenę, która wiąże H3K27me3 in vitro. Tutaj, pokazujemy, że zakłócenie chromodomeny Arabidopsis thaliana LHP1 znosi rozpoznawanie H3K27me3, uwalnia wyciszanie genów i powoduje podobne zmiany fenotypowe jak zmiany fenotypowe jak transkrypcyjne mutanty zerowe lhp1. Dlatego wiązanie do H3K27me3 jest niezbędne dla funkcji białka LHP1. --- Chromodomena, helikaza, białko wiążące DNA 5 (CHD5) jest enzymem enzymem remodelującym chromatynę, który bierze udział w supresji nowotworów. W tym badaniu wykazać zdolność palców PHD CHD5 do specyficznego rozpoznawania niezmodyfikowanego N-końca histonu H3. Używamy dwóch różnych zmodyfikowanych zmodyfikowane platformy peptydowo-biblioteczne (kulki i szklane szkiełka) w celu określenia szczegółowych preferencje wiązania histonów przez same PHD(1) i PHD(2) oraz tandemową konstrukcję PHD(1-2) . Obie domeny wykazywały podobne preferencje wiązania histonu H3, gdzie modyfikacja (np. metylacja, acetylacja i fosforylacja) w H3R2, H3K4, H3T3, H3T6 i H3S10 zakłóca wiązanie o wysokim powinowactwie, a trzy najbardziej najbardziej N-końcowe aminokwasy (ART) są kluczowe dla wiązania. Tandem CHD5-PHD(1-2) wykazywał podobne preferencje do tych wykazywanych przez każdy palec PHD samodzielnie. Wykorzystując NMR, rezonans plazmonów powierzchniowych i dwa nowe testy biochemiczne testy, wykazujemy, że CHD5-PHD(1-2) jednocześnie angażuje dwa H3 N-końce i powoduje 4-11-krotny wzrost powinowactwa w porównaniu z każdym z nich PHD. Badania te dostarczają biochemicznych dowodów na użyteczność tandemowych palców PHD do rekrutacji kompleksów białkowych w docelowych loci genomowych i zapewniają ramy dla zrozumienia, w jaki sposób wiele modułów wiążących chromatynę funkcjonują w celu interpretacji kombinatorycznej zdolności PTM zapisanej w chromatynie. --- Pojawiające się dowody wskazują na gen helikazy chromodomenowej/ATPazy wiążącej DNA (CHD1L) jako specyficzny onkogen w ludzkim raku wątrobowokomórkowym (HCC). raka wątrobowokomórkowego (HCC). Aby lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw HCC z amplifikacją CHD1L (>50% HCC), zidentyfikowaliśmy cel CHD1L, kontrolowane translacyjnie białko nowotworowe (TCTP) i zbadaliśmy jego rolę w progresji HCC. progresji HCC. Tutaj donosimy, że białko CHD1L bezpośrednio wiąże się z regionem promotora regionu promotora (nt -733 do -1,027) TCTP i aktywuje transkrypcję TCTP. Nadekspresja TCTP została wykryta w 40,7% analizowanych próbek ludzkiego HCC i pozytywnie korelowała z nadekspresją CHD1L. Klinicznie, nadekspresja TCTP była istotnie związana z zaawansowanym stadium nowotworu (P = 0,037) i całkowitym czasem przeżycia pacjentów z HCC (P = 0,037). całkowitym czasem przeżycia pacjentów z HCC (P = 0,034). W analizach wieloczynnikowych, TCTP został uznany za niezależny marker związany ze złymi wynikami prognostycznymi. wynikami prognostycznymi. Badania funkcjonalne in vitro i in vivo na myszach wykazały, że TCTP ma zdolności nowotworowe, a nadekspresja TCTP indukowana przez CHD1L przyczyniała się do do defektów mitotycznych komórek nowotworowych. Dalsze badania mechanistyczne wykazały że TCTP promował ubikwitynowo-proteasomową degradację Cdc25C podczas progresji mitotycznej progresji mitotycznej, co spowodowało niepowodzenie w defosforylacji Cdk1 na Tyr15 i zmniejszenie aktywności Cdk1. W konsekwencji, nagły spadek aktywności Cdk1 w mitozie indukował szybsze wyjście mitotyczne i nieprawidłową segregację chromosomów, co prowadziło do niestabilności chromosomalnej. Eksperyment deplecji dowiódł, że nowotworowość TCTP była związana z jego rolą w defektach mitotycznych. WNIOSEK: Podsumowując, ujawniliśmy nowy szlak molekularny (CHD1L/TCTP/Cdc25C/Cdk1), który powoduje złośliwą transformację hepatocytów z fenotypami hepatocytów z fenotypami przyspieszonej progresji mitotycznej i produkcji aneuploidii. produkcji aneuploidii. --- Remodelery chromatyny to zależne od ATP maszyny odpowiedzialne za kierunkowe przesuwanie nukleosomów wzdłuż DNA. Jesteśmy zainteresowani określeniem, które elementy białka wiążącego DNA 1 (Chd1) są niezbędne do przesuwania nukleosomów. i wystarczające do przesuwania nukleosomów. Ta praca koncentruje się na segmencie polipeptydowym który łączy silnik ATPazy z C-końcową domeną wiążącą DNA. My zidentyfikować pozycje aminokwasów poza silnikiem ATPazy, które po zmianie, drastycznie zmniejszają zdolność przesuwania nukleosomów, a jednocześnie mają tylko ∼3-krotne zmniejszenie stymulacji ATPazy przez nukleosomy. Wydaje się zatem, że reszty te odgrywają rolę w funkcjonalnym sprzężeniu hydrolizy ATP z przesuwaniem nukleosomów, i sugerują, że silnik ATPazy wymaga współpracy z elementami zewnętrznymi, aby DNA poza rdzeń histonowy. --- CEL: Chromodomainowa helikaza wiążąca DNA białko 5 (CHD5) odgrywa rolę w prawidłowym rozwoju neuronalnym i w nowotworzeniu różnych ludzkich nowotworów. Jednakże, jego rola w pierwotnym raku pęcherzyka żółciowego (PGC) jest nadal niejasna. Celem tego było zbadanie ekspresji CHD5 w PGC i jej znaczenia klinicznego. METODY: Ekspresję mRNA i białka CHD5 w 120 PGC i 20 prawidłowych próbkach pęcherzyka żółciowego pęcherzyka żółciowego określono za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji-polimerazy (QRT-PCR) i analizę Western blotting. WYNIKI: Poziomy ekspresji CHD5 mRNA i białka w tkankach PGC były zarówno znacznie niższe niż w prawidłowym nabłonku pęcherzyka żółciowego (mRNA: P = 0,006; białko: P = 0,01). Ekspresja mRNA CHD5 była ściśle ściśle skorelowana z ekspresją białka (r = 0,8; P < 0,001). Dodatkowo niska ekspresja białka CHD5 była istotnie związana z wysokim patologicznym stadium T (P = 0,01) i stadium klinicznym (P = 0,008) oraz zaawansowanym stopniem histologicznym (P = 0,009). (P = 0.009). Poziomy ekspresji białka CHD5 w tkankach PGC z dodatnimi przerzutami węzłowymi były również znacząco niższe niż w tkankach bez przerzutów (P = 0,01). Analiza przeżycia wykazała, że niska ekspresja CHD5 była związana z krótszym czasem przeżyciem wolnym od choroby (P = 0,01) i przeżyciem całkowitym (P = 0,008) w porównaniu z osobami z wysoką ekspresją CHD5 u pacjentów z PGC. Ponadto analizy wieloczynnikowe wykazały że obniżona ekspresja CHD5 była niezależnym markerem prognostycznym dla zarówno niekorzystnego przeżycia wolnego od choroby (P = 0,01), jak i przeżycia całkowitego (P = 0,006). WNIOSEK: CHD5 może być zaangażowany w kancerogenezę PGC, a jego w dół może być istotnie skorelowana z niekorzystnymi cechami kliniczno-patologicznymi, w tym słabym przeżyciem całkowitym i wolnym od choroby u pacjentów pacjentów. --- MRG15 to nowe białko chromodomenowe, które jest członkiem rodziny genów związanych z MORF4. MORF4 (czynnik śmiertelności na chromosomie 4) indukuje starzenie w podzbiorze ludzkich linii komórek nowotworowych. Nasze poprzednie wyniki wskazały, że MRG15 (gen związany z MORF na chromosomie 15) może hamować promotor B-myb przez związek z Rb. W tym badaniu analiza gradientu sacharozy wykazała, że MRG15 był obecny w dwóch różnych kompleksach białek jądrowych, MAF1 (MRG15-associated factor 1) i MAF2. Rb był związany z MRG15 i PAM14 (nowe białko cewki nowe białko cewkowe) w MAF1, a acetylotransferaza histonowa, hMOF, była partnerem MRG15 w MAF2. MRG15 w MAF2. Analiza mutantów delecyjnych MRG15 wykazała, że suwak leucynowy w C-końcowym regionie MRG15 był ważny dla białka w MAF1 i że N-końcowa chromodomena była wymagana do montażu kompleksu białkowego MAF2. Spójny z tymi danymi był fakt że aktywność acetylotransferazy histonów związana z MRG15 została utracona, gdy chromodomena została usunięta i że oba zmutowane białka MRG15 nie zdołały aktywować promotora B-myb. Omówiono różne mechanizmy, za pomocą których MRG15 może aktywować transkrypcję genów. --- Mutacje w genie CHD7 (chromodomain helicase DNA binding protein 7) powodują zespół zespół CHARGE. Obecnie jednak badanie genetyczne genu CHD7 nie jest powszechnie stosowane w warunkach klinicznych, ponieważ obecnie dostępne testy są technicznie i finansowo wymagające, głównie ze względu na rozmiar genu. W niniejszym badaniu zoptymalizowaliśmy wysoce czułą i specyficzną metodę skanowania mutacji zautomatyzowaną denaturującą wysokosprawną chromatografię cieczową (DHPLC) do analizy mutacji. (DHPLC) do analizy całego regionu kodującego CHD7. Region kodujący został amplifikowany przez 39 par starterów, z których wszystkie mają te same warunki cykliczne, na 96-dołkowej płytce do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W ten sposób W ten sposób wszystkie eksony były amplifikowane jednocześnie przy użyciu pojedynczego bloku w termocyklerze. termocyklerze. Następnie napisaliśmy skrypt komputerowy do analizy każdego segmentu genu CHD7 przez DHPLC w sposób seryjny przy użyciu warunków zoptymalizowanych dla każdego amplikonu. zoptymalizowanych dla każdego amplikonu. Wdrożenie tej metody badań przesiewowych dla CHD7 pomoże genetykom medycznym potwierdzić ich wrażenia kliniczne i zapewnić dokładne poradnictwo genetyczne pacjentom z zespołem CHARGE i ich rodzinom. --- Centromery służą jako platformy do montażu kinetochorów i są są niezbędne do podziału jądra. Tutaj zidentyfikowaliśmy centromeryczne DNA Neurospora crassa DNA przez immunoprecypitację chromatyny, a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (ChIP-seq) DNA związanego ze znakowanymi wersjami fundamentów centromerowych CenH3 (CENP-A) i CEN-C (CENP-C) oraz białkiem kinetochorowym CEN-T (CENP-T). Na każdym chromosomie znaleźliśmy region wzbogacenia ∼150- do 300-kbp dla wszystkich trzech białek. Regiony te odpowiadają interwałom przewidywanym jako centromerycznego DNA przez mapowanie genetyczne i analizy sekwencji DNA. Przez ChIP-seq my znaleźliśmy rozległą kolokalizację CenH3, CEN-C, CEN-T i trimetylacji histonu H3K9 (H3K9me3). W przeciwieństwie do tego, H3K4me2, który został znaleziony w rdzeniu rdzeniach centromerów roślin, drożdży rozszczepialnych, Drosophila i ssaków, nie był wzbogacony w centromerowe DNA Neurospora. Metylacja DNA była najbardziej wyraźna na peryferiach centromerowego DNA. Mutacja dim-5, która koduje metylotransferazę H3K9 metylotransferazę H3K9 odpowiedzialną za prawie wszystkie H3K9me3, skutkowała zmienioną dystrybucji CenH3-zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Podobnie, rozkład CenH3-GFP została zmieniona pod nieobecność HP1, białka chromodomeny, które wiąże się z H3K9me3. Wnioskujemy, że eukarionty z regionalnymi centromerami wykorzystują z różnych strategii utrzymania CenH3 w centromerach i sugerujemy model, w którym białka centromerowe zarodkują w rdzeniu, ale wymagają DIM-5 i HP1 do rozprzestrzeniania się. --- Głównym wyzwaniem w biologii chromatyny jest zrozumienie mechanizmów, dzięki którym chromatyna jest przebudowywana do stanów aktywnych lub nieaktywnych, zgodnie z wymaganiami podczas rozwoju i różnicowania komórek. Jednym z kompleksów zaangażowanych w te procesy jest kompleks remodelowania nukleosomów i deacetylazy histonowej (NuRD), który zawiera zarówno aktywność deacetylazy histonowej, jak i remodelowania nukleosomów i został jest zaangażowany w wyciszanie podzbiorów genów zaangażowanych w różne etapy rozwoju komórkowego. rozwoju komórkowego. Białko 4 wiążące chromodomenę-helikazę-DNA (CHD4) jest podstawowym składnikiem kompleksu NuRD. podstawowym składnikiem kompleksu NuRD i zawiera domenę ATPazy remodelującą nukleosomy wraz z dwoma chromodomenami wraz z dwoma chromodomenami i dwoma palcami homeodomen roślinnych (PHD). My wcześniej wykazaliśmy, że drugi palec PHD CHD4 wiąże peptydy odpowiadające N-końcowi histonu H3 metylowanego w Lys(9). Tutaj określamy strukturę roztworu PHD2 w kompleksie z H3K9me3, ujawniając molekularne podstawy rozpoznawania histonów, w tym mechanizm rozpoznawania kation-π dla metylowanej Lys(9). Dodatkowo wykazaliśmy, że pierwszy palec PHD wykazuje również wiązanie do N-końca H3 i ustalamy powierzchnię wiążącą histony powierzchnię tej domeny. Jest to pierwszy przypadek, w którym zdolność wiązania histonów zdolność wiązania histonów została wykazana dla dwóch oddzielnych modułów PHD w jednym białku. jednego białka. Odkrycia te sugerują, że CHD4 może wiązać się z dwoma N-końcowymi ogonami H3 na tym samym nukleosomie lub na dwóch oddzielnych nukleosomach jednocześnie, przedstawiając ekscytujące implikacje dla mechanizmu, za pomocą którego CHD4 i kompleks NuRD mogą kierować przebudową chromatyny. --- TŁO: Wcześniej wykazaliśmy, że geny płodności DAZ (usunięte w azoospermii) i CDY (białko chromodomeny Y) geny płodności DAZ (usunięte w azoospermii) i CDY (białko chromodomeny Y) różniły się pod względem liczby kopii i pozycji wśród szympansów (Pan troglodytes). Dla porównania, siedem linii chromosomu Y u bonobo (Pan paniscus), najbliższego żyjącego krewnego szympansa, nie wykazało żadnych różnic. My rozszerzamy nasze wcześniejsze badania porównawcze, aby uwzględnić analizę wewnątrzgatunkową zmienność tych genów u goryli (Gorilla gorilla) i orangutany (Pongo pygmaeus) i zbadać wynikające z tego wzorce w świetle wyraźnie różne zachowania społeczne i godowe gatunków. METODOLOGIA/GŁÓWNE USTALENIA: Analiza fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) DAZ i CDY w 12 liniach chromosomalnych Y zachodniego goryla nizinnego (G. gorilla gorilla) i pojedynczej linii goryla nizinnego wschodniego (G. beringei graueri) nie wykazały różnic między liniami. Podobne wyniki zostały odnotowano dla 10 linii chromosomalnych Y badanych u orangutana borneańskiego (Pongo pygmaeus) i 11 linii chromosomalnych Y orangutana sumatrzańskiego (P. abelii). Zweryfikowaliśmy kontrastujące wzory DAZ i CDY przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) u szympansa i bonobo. WNIOSEK/ZNACZENIE: Wysoka wewnątrzgatunkowa zmienność liczby kopii i pozycji genów DAZ i CDY obserwuje się tylko u szympansów. Stawiamy hipotezę że jest to najlepiej wyjaśnione przez konkurencję plemników, która skutkuje wariantem DAZ i CDY wykrytych u tego gatunku. W przeciwieństwie do tego, bonobo, goryle i orangutany - gatunki, które nie podlegają konkurencji plemników - nie wykazały wewnątrzgatunkowej zmienności w DAZ i CDY, co sugeruje, że monoandria u goryli, i preferencyjny wybór partnerki u bonobo i orangutanów, prawdopodobnie pozwoliły na utrwalenie pojedynczego wariantu Y w każdym taksonie. Dane te potwierdzają że ewolucyjna historia chromosomu Y naczelnych nie jest po prostu zaszyfrowana w jego sekwencjach DNA, ale jest również kształtowana przez społeczne i behawioralne okoliczności, w których ewoluował konkretny gatunek. --- Komórki eukariotyczne wykształciły wiele równoległych i nadmiarowych szlaków odpowiedzi na uszkodzenia DNA. które funkcjonują w skoordynowany sposób, aby zapobiec utrwaleniu uszkodzeń DNA jako mutacji. Pomimo bogactwa wiedzy na temat sygnalizacji uszkodzeń DNA sygnalizacji dalszych zdarzeń komórkowych, mechanizmów rozpoznawania uszkodzeń DNA, naprawy DNA, a także rozpoznawania, naprawy DNA, a także sygnalizacji uszkodzeń DNA w kontekście chromatyny są słabo poznane. chromatyny są słabo poznane. Białka wiążące DNA helikazy chromodomenowe (CHD) należą do grupy wysoce konserwatywnych białek remodelujących chromatynę, które są zaangażowanych w regulację transkrypcji. W celu zrozumienia fizjologicznej roli fizjologiczną rolę jednego z członków CHD w modelowym układzie ssaków, opracowaliśmy zmutowany model myszy dla opracowaliśmy zmutowany model myszy dla genu Chd2. Zmutowane myszy Chd2 są wysoce podatne na spontaniczne powstawanie guzów limfoidalnych. W tym badaniu przedstawiamy dowody na to, że zmutowane komórki Chd2 mają wadliwą zdolność do naprawy uszkodzeń DNA wywołanych promieniowaniem jonizującym i ultrafioletowym. Zgodnie z rolą Chd2 w regulacji odpowiedzi na uszkodzenia DNA, zmutowane komórki Chd2 są również wrażliwe na czynniki uszkadzające DNA w również wrażliwe na czynniki uszkadzające DNA w testach klonogennych. Podsumowując, nasze dane sugerują, że białko Chd2 jest zaangażowane w regulację odpowiedzi na uszkodzenia DNA na poziomie chromatyny. --- CHARGE (koloboma oka, wady serca, atrezja dróg żółciowych, opóźnienie wzrostu i rozwoju, hipoplazja narządów płciowych, wady uszu i/lub utrata słuchu). rozwój, hipoplazja narządów płciowych i anomalie uszu i/lub utrata słuchu) jest rzadkim genetycznym zespołem wielu wad rozwojowych. Około 80% pacjentów z diagnozą kliniczną, ma mutację lub delecję w genie kodującym białko wiążące DNA helikazy chromodomenowej 7 (CHD7). Korelacja genotyp-fenotyp korelacja genotyp-fenotyp jest znana tylko częściowo. W tym ogólnokrajowym badaniu 18 duńskich osób z dodatnim wynikiem badania CHARGE w kierunku mutacji CHD7 (N = 18). została przedstawiona. Przeanalizowaliśmy dokumentację pacjentów, zdjęcia kliniczne, tomografię komputerową i rezonans magnetyczny. tomografię komputerową i rezonans magnetyczny (MRI). Informacje nie były dostępne dla wszystkich cech u wszystkich badanych. Dlatego wyniki są przedstawione jako frakcje. Stwierdzono następującą częstość występowania objawów kardynalnych: coloboma, 16/17; wady serca, 14/18; atrezja dróg żółciowych, 7/17; opóźnienie wzrostu i rozwoju, 11/13; nieprawidłowości narządów płciowych, 11/13. rozwój, 11/13; nieprawidłowości narządów płciowych, 5/18; anomalie ucha, 15/17 i niedosłuch odbiorczy, 14/15. Dysfunkcje przedsionkowe (10/13) i problemy z połykaniem (12/15) (12/15) były innymi częstymi dysfunkcjami nerwów czaszkowych. Trójwymiarowe rekonstrukcje skanów MRI wykazały nieprawidłowości kości skroniowej u >85% pacjentów. kości skroniowej u >85%. Zespół CHARGE charakteryzuje się szerokim spektrum fenotypowym, chociaż niektóre cechy kliniczne występują częściej niż inne. Tutaj, sugerujemy, że badanie genetyczne w kierunku mutacji CHD7 należy rozważyć u noworodków ze specyficzną kombinacją kilku objawów klinicznych. --- Zidentyfikowano kilka kluczowych czynników transkrypcyjnych i koregulatorów ważnych dla mielinizacji nerwów obwodowych. mielinizacji nerwów obwodowych, ale wkład konkretnych kompleksów remodelujących chromatynę do mielinizacji nerwów obwodowych nie został przeanalizowany. Białko 4 wiążące DNA helikazy chromodomenowej (Chd4) jest główną podjednostką katalityczną kompleksu przebudowy nukleosomów i deacetylazy chromatyny (NuRD). kompleks. Poprzednie badania wykazały, że Chd4 oddziałuje z Nab (NGFI-A/Egr-binding), które są wymagane do wczesnej odpowiedzi na wzrost 2 (Egr2/Krox20), aby kierować mielinizacją nerwów obwodowych przez komórki Schwanna. W W tym badaniu zbadaliśmy znaczenie rozwojowe kompleksu NuRD w mielinizacji nerwów obwodowych. mielinizacji nerwów obwodowych poprzez generowanie warunkowego Chd4 w komórkach Schwanna (Chd4(loxP/loxP); P0-cre). Myszy z warunkowym nokautem Chd4 stwierdzono opóźnioną mielinizację, wady sortowania promieniowego, hipomielinizację i utrzymywanie się promielinizujących komórek Schwanna. Utrata Chd4 prowadzi do podwyższonej ekspresji niedojrzałych genów komórek Schwanna (Id2, c-Jun, i p75) oraz utrzymującej się ekspresji promielinizującego genu komórek Schwanna, Oct6/Scip, bez wpływu na poziom Egr2/Krox20. Ponadto, proliferacja komórek Schwanna jest regulowana w nerwach kulszowych pozbawionych Chd4. Badania immunoprecypitacji chromatyny in vivo badania immunoprecypitacji ujawniają rekrutację Chd4 i innego składnika NuRD Mta2, do genów, które są pozytywnie i negatywnie regulowane przez Egr2 podczas mielinizacji. Łącznie wyniki te podkreślają konieczność funkcji Chd4 do kierowania prawidłowym różnicowaniem końcowym komórek Schwanna i implikują kompleks remodelujący chromatynę NuRD jako niezbędny czynnik w terminowej i stabilnej mielinizacji nerwów obwodowych. mielinizacji nerwów obwodowych. --- Przedstawiamy tutaj charakterystykę molekularną i cytologiczną dwóch białek, ScoHET1 i ScoHET2 (dla heterochromatyny Sciara coprophila), które wiążą się z konstytutywnej heterochromatyny u dipterana S. coprophila. Oba białka, ScoHET1 o masie 37 kDa i ScoHET2 o masie 44 kDa, wykazują dwa motywy chromodomen, które zawierają konserwowane reszty niezbędne do rozpoznawania metylowanego histonu H3 przy lizynie 9. Wyhodowaliśmy przeciwciała do analizy lokalizacji chromosomalnej ScoHET1 i ScoHET2 w komórkach somatycznych i zarodkowych. W chromosomach polietylenowych S. coprophila w chromosomach polietylenowych S. coprophila, oba białka wiążą się do regionów pericentromerycznych i do heterochromatycznych pasm subterminalnych chromosomów. W jądrach zarodkowych, białka ScoHET1 i ScoHET2 rozprowadzają się do heterochromatycznych regionów regularnego dopełnienia chromosomów i są obficie obecne wzdłuż heterochromatycznych chromosomów "L" ograniczonych do linii zarodkowej. Zbadaliśmy modyfikacje metylacji histonów modyfikacje metylacji i odkryliśmy, że wszystkie regiony heterochromatyczne wzbogacone w ScoHET1/ScoHET2 wykazują wysoki poziom di- i tri-metylowanego histonu H3 przy lizynie 9. Podsumowując, nasze wyniki potwierdzają, że związek białek ScoHET1/ScoHET2 z heterochromatyną odbywa się za pośrednictwem metylacji histonu H3K9. Stosując przeciwciała 5-metylocytozyny, udowodniliśmy cytologiczne wykrywanie metylacji DNA metylacji DNA u S. coprophila. Z naszych obserwacji w chromosomach linii zarodkowej L, heterochromatyna u S. coprophila jest wysoce wzbogacona w reszty 5-metylocytozyny DNA. reszt. --- Chromodomena (CD) jest wysoce konserwatywnym motywem obecnym w różnych białkach zwierzęcych i roślinnych. i roślinnych, a jego prawdopodobną rolą jest łączenie różnych kompleksów makromolekularnych w chromatynie. kompleksów makromolekularnych w chromatynie. Znaczenie CD dla przetrwania komórek ssaków komórek ssaków. W związku z tym usunęliśmy funkcję CD przy użyciu dwóch jednołańcuchowych wewnątrzkomórkowych fragmentów Fv (scFv) skierowanych przeciwko nienakładającym się epitopom w obrębie motywu CD HP1. Fragmenty scFv mogą rozpoznawać zarówno motywy CD HP1, jak i Polycomb (Pc) in vitro, a po ekspresji wewnątrzkomórkowo, oddziałują z białkiem (białkami) HP1 i usuwają je z ich heterochromatyny in vivo. Fibroblasty mysie i ludzkie wyrażające anty-chromodomenowe fragmenty scFv wykazują fenotyp letalny dla komórek i apoptotyczną morfologię. morfologia staje się widoczna wkrótce po transfekcji. Mechanizm śmierci komórki wydaje się być niezależny od p53, a komórki są tylko częściowo ratowane przez inkubację z inhibitorem kaspaz o szerokim spektrum działania Z-VAD fmk. Wnioskujemy, że ekspresja wewnątrzkomórkowych przeciwciał przeciwko chromodomenom jest wystarczająca do uruchomić niezależny od p53 szlak apoptotyczny, który jest tylko częściowo zależny od znanych kaspaz hamujących Z-VAD, co sugeruje, że funkcja CD jest niezbędna dla przeżycia komórek. przeżycia komórek. --- TŁO: Podstawowym założeniem hipotezy kodu epigenetycznego jest istnienie domen białkowych, które mogą rozpoznawać różne struktury chromatyny. Do tej pory Do tej pory pojawiły się dwa główne kandydatury: (i) bromodomena, która może rozpoznawać pewne znaczniki acetylacji i (ii) chromodomena, która może rozpoznawać pewne znaczniki metylacji. WYNIKI: Domena Epc-N (Enhancer of Polycomb-N-terminus) została formalnie zdefiniowana w niniejszym dokumencie. tutaj. Domena ta jest konserwowana u eukariontów i przewiduje się, że tworzy prawoskrętną ortogonalną wiązkę czterech helis z wydłużonymi pasmami na obu końcach. Rodzaje reszt aminokwasowych, które definiują domenę Epc-N, sugerują rolę w pośredniczeniu w interakcjach białko-białko, prawdopodobnie szczególnie w kontekście wiązania chromatyny, a także rodzaje białek, w których się znajduje (znane składniki kompleksów acetylotransferazy histonowej) silnie sugerują rolę w tworzeniu i/lub rozpoznawaniu struktur epigenetycznych. Wydaje się, że istnieją dwie główne rodziny białek Rodziny białek Epc-N, które można podzielić na cztery unikalne podrodziny białek. Dwie z tych podrodzin (I i II) mogą być ze sobą powiązane w ten sposób, że podrodzina I może być postrzegana jako specyficzna dla roślin ekspansja podrodziny II. Pozostałe Pozostałe dwie podrodziny (III i IV) wydają się być ze sobą powiązane przez duplikacji w pierwotnym przodku grzybów-metazoan-mycetozoan. Podrodziny III i IV są dalej definiowane przez obecność ewolucyjnie ewolucyjnie konserwowanego motywu wiążącego pięć centrów cynku w pętli łączącej drugą i i trzecią helisę wiązki czterech helis. Motyw ten wydaje się składać z PHD po którym następuje jednojądrowa kostka Zn, a następnie pochodna podobna do PHD, i będzie zatem określany jako PZPM. Wszystkie badane do tej pory białka inne niż Epc-N które zawierają PZPM, były zaangażowane w metylację histonów i/lub wyciszanie genów. wyciszanie genów. Ponadto zaobserwowano nietypową dystrybucję filetyczną białek zawierających Epc-N białek. WNIOSEK: Dane sugerują, że domena Epc-N jest modułem interakcji białko-białko moduł interakcji białko-białko występujący w białkach związanych z chromatyną. Jest możliwe, że domena Epc-N służy jako bezpośredni łącznik między acetylacją histonów a a stanem metylacji. Niezwykła dystrybucja filetyczna białek zawierających Epc-N Epc-N może w przyszłości zapewnić wgląd w to, jak różne organizmy tworzą, postrzegają i reagują na informacje epigenetyczne. --- Żaby grzebiące w zielonych paskach, Cyclorana alboguttata, przeżywają susze poprzez wchodząc w depresję metaboliczną zwaną estywacją, charakteryzującą się zmniejszeniem w spoczynkowym zużyciu tlenu o 80%. Estywacja u C. alboguttata objawia się przez transkrypcyjne wyciszenie genów bioenergetycznych mięśni szkieletowych, takich jak NADH oksydoreduktaza ubichinonowa 1, syntaza ATP i dysmutaza ponadtlenkowa 2. W tym postawiliśmy hipotezę, że estywacja jest związana ze zmianami epigenetycznymi w mięśniach żaby. mięśniach żaby. Oceniliśmy obfitość transkryptów mRNA siedmiu genów, które kodują białka o ustalonej roli w epigenetycznym wyciszaniu genów [ko-represor transkrypcyjny SIN3A, metylotransferaza DNA (cytozyna-5-) 1, białko wiążące metyl CpG 2, helikaza chromodomenowa wiążąca białko DNA 4, białko wiążące histony rbbp4, deacetylaza histonów 1 i receptor jądrowy 2] przy użyciu qRT-PCR. Te siedem genów wykazało skromną (1,1-3,5-krotną) ale skoordynowaną regulację w górę w 6-miesięcznych mięśniach. Osiągnęło to znaczenie dla SIN3A i cytozyno-5-metylotransferazy DNA 1 w standardowych porównaniach parami (p < 0,05), a kandydaci jako całość, gdy analizowani przez Fishera (p < 0,01). Dane te są zgodne z hipotezą, że wyciszenie transkrypcji i depresja metaboliczna, które występuje podczas sezonowego spoczynku, są związane z przebudową chromatyny i stanowią nowy przykład indukowanej środowiskowo modyfikacji epigenetycznej u dorosłych kręgowców. dorosłych kręgowców. --- Izolatory chromatyny są elementami granicznymi między wyraźnie regulowanymi, sąsiadującymi domenami chromosomalnymi i działają poprzez blokowanie efektów pobliskich wzmacniaczy w sposób zależny od pozycji. Tutaj pokazujemy, że CHD8 oddziałuje z białkiem wiążącym izolator CTCF. białkiem wiążącym izolator CTCF. Analiza immunoprecypitacji chromatyny ujawniła, że CHD8 było obecne w znanych miejscach docelowych CTCF, takich jak różnicowo metylowany region region (DMR) H19, region kontrolny locus beta-globiny i region promotora genów BRCA1 i c-myc. Znokautowanie CHD8 za pomocą interferencji RNA znacząco zniosło aktywność izolatora H19 DMR, która w dużym stopniu zależy od CTCF, prowadząc do reaktywacji wdrukowanego IGF2 z chromosomu pochodzenia matczynego. pochodzenia matczynego. Ponadto, brak CHD8 wpływał na metylację CpG i acetylację histonów wokół CTCF. acetylację wokół miejsc wiązania CTCF, w sąsiedztwie heterochromatyny, genów BRCA1 i c-myc. Odkrycia te zapewniają wgląd w rolę kompleksu CTCF-CHD8 w izolacji i regulacji epigenetycznej w miejscach aktywnych izolatorów. --- Fosfoproteina fazy M 8 (MPP8) zawiera N-końcową chromodomenę i C-końcową domenę powtórzeń ankyryny. C-końcową domenę powtórzeń ankyryny. MPP8, poprzez swoją chromodomenę, wiąże peptyd histonu H3 trój- lub dwumetylowany w lizynie 9 (H3K9me3/H3K9me2) w submikromolarnym powinowactwie. powinowactwie. Określiliśmy strukturę krystaliczną chromodomeny MPP8 w kompleksie z peptydem H3K9me3. MPP8 oddziałuje z co najmniej sześcioma resztami histonu H3 od glutaminy 5 do seryny 10, umożliwiając jego zdolność do rozróżniania peptydu zawierającego lizynę 9 (QTARKS) od peptydu zawierającego lizynę 27 (KAARKS). dzieląc sekwencję ARKS. Częściowa hydrofobowa klatka z trzema aromatycznymi resztami aromatycznymi (Phe59, Trp80 i Tyr83) i jednym asparaginianem (Asp87) otacza metylowaną lizynę 9. MPP8 jest fosforylowana in vivo, w tym reszta klatkowa Tyr83 oraz kolejne Thr84 i Ser85. Modelowanie grupy grupy fosforanowej na tlen hydroksylowy łańcucha bocznego Tyr83 sugeruje, że ujemnie naładowana grupa fosforanowa może zwiększać wiązanie dodatnio naładowanej metylo-lizyny lub tworzyć sygnał regulacyjny, umożliwiając lub hamując wiązanie innych białek. --- Białka HP1 są głównymi składnikami heterochromatyny, która jest ogólnie postrzegana jako obojętna i nieaktywna transkrypcyjnie struktura chromatyny. Jednak wiązanie HP1 do chromatyny jest wysoce dynamiczne, a silne wyciszanie genów heterochromatycznych heterochromatycznych genów może obejmować przetwarzanie RNA. Tutaj pokazujemy przez kombinacji eksperymentów in vivo i in vitro, że białko HP1(Swi6) drożdży rozszczepialnych gwarantuje ścisłą represję genów heterochromatycznych poprzez sekwestrację i degradację RNA sekwestrację i degradację RNA. Stymulowany przez dodatnio naładowane reszty w regionie zawiasowym RNA konkuruje z metylowanym histonem H3K9 o wiązanie z chromodomeną HP1(Swi6). chromodomeną HP1(Swi6). W związku z tym wiązanie HP1 (Swi6) z RNA jest niezgodne z stabilną asocjacją heterochromatyny. Proponujemy model, w którym zespół białek HP1(Swi6) funkcjonuje jako specyficzny dla heterochromatyny punkt kontrolny, wychwytując i priming heterochromatycznego RNA dla mechanizmów degradacji RNA. Utrzymanie funkcjonalnego punktu kontrolnego wymaga ciągłej wymiany HP1(Swi6) w obrębie heterochromatyny, co wyjaśnia dynamiczną lokalizację białek HP1 na heterochromatynie. --- Chromodomainowa helikaza wiążąca białko DNA 5 (CHD5) jest silnym supresorem nowotworów. który służy jako główny regulator sieci supresyjnej nowotworów. Badanie roli odgrywanej przez CHD5 w szerokim zakresie ludzkich nowotworów jest uzasadnione. W tym badaniu skupiliśmy się na modyfikacji epigenetycznej i roli supresyjnej nowotworu CHD5 w raku płuc. Zmierzyliśmy ekspresję mRNA i białka CHD5 w komórkach raka płuca komórkach raka płuc, tkankach raka płuc i odpowiadających im nienowotworowych tkankach płuc przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym i analizy Western blot. Następnie określiliśmy stan metylacji promotora CHD5 w tych próbkach przy użyciu sekwencjonowania sekwencjonowania specyficznego dla metylacji i przeanalizowaliśmy reekspresję CHD5 w komórkach raka płuca komórek raka płuc leczonych lub nie 5-aza-2-deoksycytydyną, inhibitorem metylacji DNA. metylacji DNA. Następnie, klony komórek raka płuc stabilnie wyrażające białko EGFP-CHD5 lub białko EGFP, a następnie zbadano wpływ przywróconej ekspresji CHD5 na proliferację komórek. CHD5 na proliferację komórek, tworzenie kolonii i nowotworowość. oceniano. Ekspresja CHD5 wahała się od niskiej do nieobecnej w badanych liniach komórkowych i tkankach raka płuc. badanych liniach komórkowych i tkankach; promotor CHD5 był hiperetylowany w tych próbkach. próbkach. Leczenie 5-aza-dC spowodowało miejscowy spadek gęstości metylacji i wzrost CHD5. i wzrost ekspresji CHD5. Klonogenność i wzrost guza zostały w komórkach A549 i H1299 po przywróceniu ekspresji CHD5. A zaobserwowano znaczne zmniejszenie klonogenności; średnio o 47,83 ± 4,6% dla A549-EGFP. dla A549-EGFP-CHD5 zaobserwowano w porównaniu do A549-EGFP, a średnio 56,39 ± 5,3% redukcji dla H1299-EGFP-CHD5 zaobserwowano w porównaniu do H1299-EGFP. A549-EGFP wykazywał średni rozmiar guza 452,3 ± 36,5 mm(3), podczas gdy A549-EGFP-CHD5 wykazywał średni rozmiar guza tylko 57,7 ± 18,5 mm(3). Zatem nasze odkrycia wskazują, że CHD5 jest potencjalnym genem supresorowym nowotworu który jest inaktywowany poprzez mechanizm epigenetyczny w raku płuc. --- Acetylacja histonów jest istotnym mechanizmem dla potranslacyjnych modyfikacji składników chromatyny. Acetylotransferazy histonowe (HAT) są krytyczne elementy, które determinują acetylację histonów i regulują dynamikę chromatyny oraz ekspresję genów. dynamikę chromatyny i ekspresję genów. Podczas gdy acetylotransferazy histonowe zostały dobrze dobrze zbadane u ssaków i Drosophila melanogaster, informacje z rolniczych ważnych szkodników owadzich są nadal ograniczone. W naszym dążeniu do zrozumienia epigenetyczne mechanizmy regulujące rozwój u brązowej mszycy, Nilaparvata lugens (Stål) (Hemiptera: Geometroidea), głównego szkodnika ryżu w wielu częściach Azji. części Azji, dwie pełnej długości sekwencje cDNA kodujące członków HAT z rodziny GNAT i MYST, a mianowicie odpowiednio NlElp3 i NlMof, zostały wyizolowane i scharakteryzowane strukturalnie i filogenetycznie. NlElp3 zawiera otwartą ramkę odczytu ramkę odczytu (ORF) 1656bp kodującą białko 551 aminokwasów. NlMof zawiera ORF 1353bp kodujący białko 450 aminokwasów. Analiza sekwencji wykazała, że NlElp3 zawiera domenę HAT typu GNAT i radykalną domenę SAM, a NlMof zawiera chromodomenę i domenę acetylotransferazy MOZ-SAS. Wielokrotne dopasowania sekwencji wykazały, że NlElp3 i NlMof mają wysoką sekwencję aminokwasów identyczność z innymi homologami owadów. Analiza ekspresji NlElp3 i NlMof ujawniła znaczące różnice w poziomach ekspresji mRNA między stadiami rozwojowymi N. lugens etapów rozwojowych, co sugeruje, że aktywność HAT NlElp3 i NlMof może być kontrolowane, przynajmniej częściowo, przez ich regulację rozwojową. Co ciekawe, poziomy ekspresji poziomy ekspresji mRNA NlElp3 i NlMof u dorosłych kobiet były znacząco wyższe niż u dorosłych samców, co potwierdza ważną rolę obu genów w żeńskiej funkcji reprodukcyjnej u N. lugens. --- Analiza białka chromodomeny CDP-2 Neurospora crassa, składnika nowo scharakteryzowanego kompleksu nowo scharakteryzowanego kompleksu zawierającego HP1, ujawnia drugi mechanizm wyciszania genów mechanizm wyciszania genów i zapewnia wgląd w dynamiczną naturę domen chromatyny które posiadają wspólne komponenty. --- W różnicowaniu komórek pośredniczą czynniki transkrypcyjne determinujące linię. Pokazujemy, że chromodomainowa helikaza wiążąca domenę DNA 2 (Chd2), członek rodziny enzymów remodelujących chromatynę SNF2 członek rodziny enzymów remodelujących chromatynę SNF2, oddziałuje z sekwencjami regulacyjnymi MyoD i genów miogennych sekwencjami regulatorowymi genów miogennych, aby specyficznie oznaczyć te loci poprzez odkładanie wariantu histonowego H3.3 przed różnicowaniem komórek. Ukierunkowana i obejmująca cały genom analiza endogennej inkorporacji H3.3 pokazuje, że knockdown Chd2 zapobiega odkładaniu się H3.3 w genach zależnych od różnicowania, ale nie w genach housekeeping, genów i hamuje aktywację genów miogennych. Dane te wskazują, że MyoD determinuje los komórek i ułatwia ekspresję genów zależnych od różnicowania poprzez zależne od Chd2 odkładanie H3.3 w loci miogenicznych przed różnicowaniem. --- Wzory heterochromatyny analizowano w rodzaju Ctenomys z Urugwaju, który wykazuje dużą zmienność kariotypu. Zaobserwowano różne ilości i lokalizacje heterochromatyny zaobserwowano u analizowanych gatunków i populacji. Podczas gdy gatunki jak C. rionegrensis prezentowały ramiona heterochromatyczne we wszystkich chromosomach kariotypu. kariotypu, inne gatunki, takie jak C. torquatus, wykazywały tylko kilka chromosomów z pericentryczną heterochromatyną. Na etapie pachytenu biwalenty łączą się w gęsto zabarwionych chromocentrach. gęsto zabarwionych chromocentrach. Wykryliśmy w tych chromocentrach typowe wysoce powtarzające się DNA tego rodzaju po hybrydyzacji in situ, chromodomenę M31 poprzez immunofluorescencję, jak również gęste barwienie Giemsą po C-bandingu. U u gatunków, u których występuje niewielka ilość heterochromatyny, zaobserwowano tylko 1 lub 2 chromocentry w których łączą się biwalenty, jak zaobserwowano u C. rionegrensis. Po BRCA1 zaobserwowaliśmy we wczesnych komórkach pachytenu pozytywne plamki zlokalizowane nad heterochromatycznymi chromocentrami, które silnie sugerują heterochromatyczną naprawę DNA. naprawę DNA. Stres mechaniczny spowodowany głównie wzrostem zwartości chromatyny przed metafazą I może być mechanizmem rozprzestrzeniania heterochromatyny między różnymi chromosomami w obrębie kariotypu. --- Represja polikombinowa kontroluje ekspresję setek genów zaangażowanych w rozwój. rozwój i jest mediowana przez zasadniczo dwie klasy kompleksów białkowych związanych z chromatyną kompleksów białkowych. Kompleks represyjny Polycomb 2 (PRC2) trimetyluje histon H3 przy lizynie 27, znak epigenetyczny, który służy jako miejsce dokowania dla kompleksu białkowego kompleksu białkowego PRC1. Rdzeń PRC1 u Drosophila składa się z czterech podjednostek: Polycomb (Pc), Posterior sex combs (Psc), Polyhomeotic (Ph) i Sex combs extra (Sce). Każde z tych białek ma wiele ortologów u kręgowców, co generując ogromny zakres potencjalnej różnorodności kombinatorycznej. W szczególności W szczególności genomy ssaków kodują pięciu członków rodziny Pc: CBX2, CBX4, CBX6, CBX7 i CBX8. Aby jeszcze bardziej skomplikować sprawę, różne izoformy mogą powstać z pojedynczych genów. pojedynczych genów. Tutaj zajmujemy się funkcjonalną rolą dwóch ludzkich izoform CBX2 izoform. Dzięki różnym miejscom poliadenylacji i alternatywnemu splicingowi zdarzeń, ludzki locus CBX2 wytwarza dwa transkrypty: 5-eksonowy transkrypt, który koduje 532-aminokwasową izoformę CBX2-1, która zawiera konserwowaną chromodomenę i skrzynkę Pc oraz 4-eksonowy transkrypt kodujący krótszą izoformę, CBX2-2, pozbawioną pola Pc, ale nadal posiadającą chromodomenę. Wykorzystując podejścia biochemiczne i nowatorski test obrazowania in vivo, pokazujemy, że krótka izoforma izoforma CBX2-2 pozbawiona pola Pc, nie uczestniczy w kompleksach białkowych PRC1 PRC1, ale samoasocjuje in vivo i tworzy kompleksy o wysokiej masie cząsteczkowej. masie cząsteczkowej. Co więcej, krótka izoforma CBX2 jest nadal zdolna do represji transkrypcji transkrypcję, co sugeruje, że represja Polycomb może wystąpić przy braku tworzenia PRC1. --- Metylacja DNA CpG i metylacja lizyny 9 histonu H3 (H3K9) to dwie główne represyjne modyfikacje epigenetyczne. represyjne modyfikacje epigenetyczne, a metylacje te są pozytywnie skorelowane ze sobą w chromatynie. Tutaj pokazujemy, że G9a lub G9a-like (GLP) dimetylują amino-końcową lizynę 44 (K44) mysiego Dnmt3a (odpowiednik K47 ludzkiego DNMT3A) in vitro oraz w komórkach z nadekspresją G9a lub GLP. Chromodomena MPP8 rozpoznaje dimetylowaną Dnmt3aK44me2. MPP8 oddziałuje również z samometylowanym GLP w sposób zależny od metylacji. Chromodomena Chromodomena MPP8 tworzy dimer w roztworze i w kryształach, co sugeruje, że cząsteczka dimeryczna cząsteczka MPP8 może łączyć metylowane Dnmt3a i GLP, co skutkuje powstaniem kompleks wyciszający Dnmt3a-MPP8-GLP/G9a na szablonach chromatyny. Razem, te odkrycia dostarczają molekularnego wyjaśnienia, przynajmniej częściowo, dla współwystępowania metylacji DNA i metylacji H3K9 w chromatynie. --- Domena wiążąca metylo-cytozynę 2 (MBD2) - remodeling nukleosomów i kompleks deacetylazy kompleks deacetylazy (NuRD) rozpoznaje metylowane DNA i wycisza ekspresję powiązanych genów poprzez deacetylazę histonów i remodeling nukleosomów funkcje. Nasze wcześniejsze prace strukturalne wykazały, że interakcja coiled-coil między MBD2 i domeną palca cynkowego GATA zawierającą 2A (GATAD2A/p66α) rekrutuje białko wiążące DNA helikazę chromodomenową (CHD4/Mi2β) do kompleksu NuRD i jest niezbędna dla zależnego od MBD2 DNA zależnego od metylacji wyciszania genów in vivo (Gnanapragasam, M. N., Scarsdale, J. N., Amaya, M. L., Webb, H. D., Desai, M. A., Walavalkar, N. M., Wang, S. Z., Zu Zhu, S., Ginder, G. D., and Williams, D. C., Jr. (2011) p66α-MBD2 coiled-coil interaction and recruitment Mi-2 are i rekrutacja Mi-2 są krytyczne dla wyciszania genów globiny przez kompleks MBD2-NuRD. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7487-7492). The p66α-MBD2 różni się od większości cewek badanych do tej pory, tworząc antyrównoległy heterodimeryczny kompleks między dwoma peptydami, które są w dużej mierze monomeryczne w izolacji. Aby dalej scharakteryzować unikalne cechy tego kompleksu które napędzają specyficzność heterodimeryczną i wiązanie o wysokim powinowactwie, przeprowadziliśmy analizy biofizyczne MBD2 i pokrewnych homologów MBD3, białka podobnego do MBD3 1 (MBD3L1) i białka podobnego do MBD3 2 (MBD3L2), a także specyficzne mutacje, które modyfikują interakcje ładunek-ładunek i helikalną skłonność domen coiled-coil domen. Analityczne analizy ultrawirowania pokazują, że poszczególne peptydy peptydy pozostają monomeryczne w izolacji nawet przy stężeniu 300 μM dla MBD2. Analizy dichroizmu kołowego wykazują bezpośrednią korelację między helikalną zawartością domen spiralnych w izolacji i powinowactwem wiązania dla p66α. Ponadto, komplementarne elektrostatyczne potencjały powierzchniowe i nieodłączna zawartość helikalna każdego peptydu są niezbędne do utrzymania wysokiego powinowactwa wiązania. Czynniki te prowadzą do hierarchii powinowactwa wiązania p66α dla różnych homologów MBD2 (MBD2). MBD2 (MBD2 ≈ MBD3 > MBD3L1 ≈ MBD3L2) i sugerują hierarchiczny model regulacyjny w tkance i etapie cyklu życiowego. model regulacyjny w wyciszaniu specyficznym dla tkanki i etapu cyklu życiowego przez kompleksy NuRD kompleksy. --- Represjonowana chromatyna genu PHO5, wyizolowana z drożdży w stanie natywnym, była remodelowana przez ekstrakt drożdżowy w sposób zależny od aktywatora genu i ATP. Produkt reakcji nosił znamiona procesu in vivo, selektywnego usuwania nukleotydów promotora. selektywne usuwanie nukleosomów promotora, bez wpływu na nukleosomy otwartej ramki odczytu. nukleosomy otwartej ramki odczytu. Frakcjonowanie ekstraktu pozwoliło zidentyfikować pojedyncze białko, białko wiążące DNA helikazy chromodomenowej 1 (Chd1), zdolne do remodelowania aktywność. Delecja genu CHD1 w szczepie isw1Δ pho80Δ zniosła ekspresję genu PHO5 ekspresję genu, wykazując znaczenie reakcji remodelingu in vitro do procesu in vivo. --- TŁO: Białko 5 wiążące chromodomainę-helikazę-DNA (CHD5) jest nowo zidentyfikowanym supresorem nowotworu, który jest często regulowany w dół. zidentyfikowany supresor nowotworu, który jest często regulowany w dół w różnych ludzkich nowotworach. Nasza poprzednia praca ujawniła, że niska ekspresja CHD5 w raka jelita grubego jest skorelowana z hipermetylacją wysp CpG promotora CHD5. W tym badaniu zbadaliśmy wpływ regulowanej przez mikroRNA-211 (miR-211) ekspresji CHD5 na nowotworzenie jelita grubego. METODOLOGIA / GŁÓWNE USTALENIA: Przewidywano, że miR-211 celuje w CHD5 poprzez analizę oprogramowania Analiza oprogramowania TargetScan. Stabilnie wyrażająca egzogenny miR-211 linia komórkowa raka jelita grubego linia komórkowa raka jelita grubego (HCT-116(miR-211)) została wygenerowana przy użyciu transdukcji lentiwirusowej i wykorzystano jako model do badań in vitro i in vivo. Poziom ekspresji miR-211 w komórkach HCT-116(miR-211) został zwiększony 16-krotnie w porównaniu do wektora komórek kontrolnych (HCT-116(wektor)). Egzogenny miR-211 bezpośrednio wiąże się z regionem 3'-untranslated region (3'-UTR) mRNA CHD5, powodując 50% spadek poziomu białka CHD5 w HCT-116(wektor). CHD5 w komórkach HCT-116(miR-211). Poziomy proliferacji komórek, wzrostu guza i migracji komórek HCT-116(miR-211) były znacząco wyższe niż wyższe niż w przypadku komórek HCT-116(wektor) zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. określone przy użyciu metod MTT, tworzenia kolonii, cytometrii przepływowej, testu scratch i ksenograftów nowotworowych. Ponadto stwierdziliśmy, że wymuszona ekspresja miR-211 w komórkach HCT-116 była w stanie zmienić białka regulatorowe związane ze szlakiem p53, takie jak białka regulatorowe, takie jak MDM2, Bcl-2, Bcl-xL i Bax. WNIOSEK/ZNACZENIE: Nasze wyniki pokazują, że CHD5 jest bezpośrednim celem regulacji miR-211. Wymuszona ekspresja miR-211 promuje wzrost komórek nowotworowych, przynajmniej częściowo przynajmniej częściowo poprzez obniżenie poziomu ekspresji supresora nowotworu CHD5. supresora. Nasze wyniki zapewniają lepsze zrozumienie związku między regulowaną przez miR-211 ekspresją CHD5 a funkcją CHD5 w nowotworach jelita grubego. nowotworu jelita grubego. --- Chromodomena rodziny białek HP1 rozpoznaje ogony histonów z specyficznie metylowanymi lizynami. Tutaj przedstawiamy strukturalne, energetyczne i analizy mutacyjne kompleksu między chromodomeną HP1 Drosophila a ogonem histonu H3 z metylozyną przy reszcie 9, modyfikacją związaną z epigenetycznym wyciszaniem. z epigenetycznym wyciszaniem. Ogon histonowy wstawia się jako nić beta, uzupełniając architekturę architekturę beta-sandwich chromodomeny. Grupa metyloamoniowa jest w klatce przez trzy aromatyczne łańcuchy boczne, podczas gdy sąsiednie reszty tworzą rozróżniające kontakty z jedną powierzchnią chromodomeny. Porównanie dimetylo- i i trimetylo-lizyny sugeruje rolę oddziaływań kation-pi i van der Waalsa, przy czym trimetylacja nieznacznie poprawia powinowactwo wiązania. --- TŁO: Pasożyty Apicomplexan są odpowiedzialne za niektóre z najbardziej śmiertelnych chorób pasożytniczych dotykających ludzi, w tym chorób pasożytniczych dotykających ludzi, w tym malarii i toksoplazmozy. Te obligatoryjne pasożyty wewnątrzkomórkowe wykazują złożony cykl życiowy i skoordynowany program ekspresji program ekspresji zależny od cyklu komórkowego. Ich podział komórkowy jest skoordynowanym wieloetapowym procesem. Sposób organizacji tego złożonego mechanizmu pozostaje słabo słabo poznany. METODY I WYNIKI: W tym badaniu przedstawiamy dowody na związek między heterochromatyną, podziałem komórkowym i przedziałami jądra u Toxoplasma gondii. Scharakteryzowaliśmy chromodomenę T. gondii zawierającą białko (nazwane TgChromo1), które specyficznie wiąże się z heterochromatyną. Używając ChIP-on-chip w skali całego genomu, zgłaszamy wzbogacenie TgChromo1 w peri-centromeryczną chromatynę. chromatyny. Ponadto wykazujemy, że TgChromo1 jest regulowany cyklem komórkowym i kolokalizowany z markerami centromeru. Poprzez specyficzną dla loci technikę FISH dla T. gondii, potwierdziliśmy, że TgChromo1 zajmuje tę samą lokalizację jądrową co centromer. lokalizację jako sekwencje peri-centromeryczne. WNIOSEK: Sugerujemy, że TgChromo1 może odgrywać rolę w sekwestracji chromosomów w perycentromerze jądrowym. chromosomów na peryferiach jądrowych oraz w procesie podziału komórki T. gondii. gondii. --- Coloboma, wada serca, atrezja dróg żółciowych, opóźnienie wzrostu i rozwoju, hipoplazja narządów płciowych, anomalie uszu (CHARGE) jest zespołem genetycznym, w którym w którym częstą cechą jest hipogonadyzm. Przyczynową mutacją w obrębie genu białka wiążącego DNA-7, który odgrywa ważną rolę w rozwoju embrionalnym. w rozwoju embrionalnym, występuje u 2/3 pacjentów dotkniętych chorobą. Opisujemy opisujemy kliniczną, hormonalną i molekularną charakterystykę młodego mężczyzny z Ekwadoru, u którego w wieku dorosłym zdiagnozowano zespół CHARGE. Pacjent Pacjent wykazywał kilka fenotypowych cech zespołu, związanych ze stanem przedpokwitaniowym i wnętrostwem; hipogonadyzm hipogonadotropowy z niewykrywalnym poziomem testosteronu. niewykrywalnym poziomem testosteronu niereagującym na testy hCG i ciężką osteoporozą. stwierdzono osteoporozę. Ocena molekularna genu CHD7 wykazała nową heterozygotyczną mutację p.Tyr1046Glyfs*23 z przesunięciem ramki w eksonie 12. Rezonans magnetyczny ujawnił łagodną hipoplazję przysadki mózgowej i hipoplazję tylnej części przysadki mózgowej. niedorozwój tylnego dołu czaszki. Pozajelitowa terapia testosteronem doprowadziła do rozwoju płciowego w czasie i, w połączeniu z terapią diffonianem i suplementacją wapnia i witaminy D, znacząco poprawiła mineralizację kości. mineralizację kości. Wczesne prawidłowe leczenie hormonalne hipogonadyzmu u pacjentów z złożonymi zespołami genetycznymi jest ważne dla osiągnięcia prawidłowego dojrzewania płciowego, poprawy jakości życia i uniknięcia istotnych chorób współistniejących, takich jak osteoporoza. osteoporoza. --- Odpowiedź na uszkodzenie DNA obejmuje złożoną serię szlaków sygnałowych, które działają w celu regulacji i ułatwienia naprawy uszkodzonego DNA. Ostatnie badania wykazały, że naprawa nieaktywnej transkrypcyjnie chromatyny, zwanej heterochromatyny, jest zależna od fosforylacji korepresora, Krüppel-associated box (KRAB) domain-associated protein (KAP-1), przez ataxia ataxia telangiectasia-mutated (ATM) kinase. Ko-represory, takie jak KAP-1, działają w celu regulują sztywną strukturę heterochromatyny poprzez rekrutację enzymów modyfikujących histony, takich jak enzymy modyfikujące histony, takie jak HDAC1/2, SETDB1 i kompleksy remodelujące nukleosomy, takie jak CHD3. Tutaj scharakteryzowaliśmy miejsce fosforylacji w domenie wiążącej HP1 KAP-1, Ser-473, które jest fosforylowane przez kinazę punktu kontrolnego cyklu komórkowego Chk2. Ekspresja niefosforylującego mutanta S473A nadawała komórkowej wrażliwość na czynniki uszkadzające DNA i prowadziła do wadliwej naprawy dwuniciowych pęknięć DNA w heterochromatynie. Ponadto, komórki wyrażające S473A wykazywały również wadliwą mobilizację białka chromodomeny HP1-β. Defekt naprawy DNA zaobserwowany w komórkach wykazujących ekspresję S473A został złagodzony przez zubożenie HP1-β, co sugeruje, że fosforylacja KAP-1 na Ser-473 sprzyja mobilizacji HP1-β. mobilizację HP1-β z heterochromatyny i późniejszą naprawę DNA. Te wyniki sugerują nowy mechanizm restrukturyzacji chromatyny za pośrednictwem KAP-1 poprzez regulowaną przez Chk2 wymianę HP1-β z heterochromatyny, promując naprawę DNA. --- Stwierdzono, że białko 5 wiążące DNA helikazy chromodomainowej (CHD5) jest kandydatem na gen supresorowy nowotworu (TSG) w złośliwych guzach nerwowych. U myszy heterozygotycznych dla niedoboru chd5, pierwszym zaobserwowanym guzem był patologiczny rak płaskonabłonkowy. Ponad 95% pierwotnego raka krtani to rak płaskonabłonkowy. rak płaskonabłonkowy. Dlatego zbadaliśmy ekspresję CHD5 u 65 pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani. raka płaskonabłonkowego krtani (LSCC) przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym, immunohistochemii i Western blotting. Metylacja DNA została wykryta przy użyciu sekwencjonowania specyficznego dla dwusiarczanu. Potencjalna funkcja CHD5 została określona  Hep-2. Nasze wyniki ujawniły, że poziomy ekspresji mRNA i białka CHD5 w tkankach LSCC były znacznie niższe niż w tkankach z czystym marginesem chirurgicznym (p<0,05). tkanek (p<0,05) i istnieje istotna korelacja między poziomami ekspresji mRNA i białka CHD5 (p<0,05). a poziomem ekspresji białka CHD5 (p<0,01). Ponadto wystąpiły znaczące różnice w poziomach mRNA i białka CHD5 w odniesieniu do stadium klinicznego stadium klinicznego (p<0,05). Aberrant metylacja promotora CHD5 została często stwierdzana w linii komórkowej Hep-2 i tkankach nowotworowych LSCC, zwłaszcza w tkankach nowotworowych szczególnie w tkankach nowotworowych pochodzących od pacjentów z zaawansowanym TNM (p<0,05) lub starszych (p<0,05). Wreszcie, ektopowa ekspresja CHD5 w komórkach raka krtani doprowadziła do znacznego zahamowania wzrostu i inwazyjności. wzrostu i inwazyjności. Nasze dane sugerują, że CHD5 jest genem supresorowym nowotworu który jest epigenetycznie regulowany w dół w LSCC. --- Chromodomeny występują w wielu regulatorach struktury chromatyny, a większość z nich rozpoznaje metylowane lizyny histonów. rozpoznaje metylowane lizyny na histonach. Tutaj badamy rolę chromodomeny chromodomeny białka Corto u Drosophila melanogaster. Enhancer of Trithorax i Polycomb Corto jest zaangażowany zarówno w wyciszanie, jak i aktywację ekspresji genów. ekspresji genów. Nadekspresja chromodomeny Corto (CortoCD) u transgenicznych much transgenicznych muchach pokazuje, że jest to moduł ukierunkowany na chromatynę, krytyczny dla funkcji funkcji Corto. Nieoczekiwanie, analiza spektrometrii masowej ujawnia, że polipeptydy ściągnięte przez CortoCD z ekstraktów jądrowych odpowiadają białkom rybosomalnym. Co więcej, analizy interakcji w czasie rzeczywistym pokazują, że CortoCD wiąże z wysokim powinowactwem RPL12 trójmetylowaną na lizynie 3. Corto i RPL12 kolokalizują z aktywnymi znacznikami epigenetycznymi na chromosomach polietylenowych, sugerując, że oba są zaangażowane w dostrajanie transkrypcji genów w otwartej chromatynie. Transkryptomy oparte na RNA-seq dysków imaginalnych skrzydeł z nadekspresją CortoCD lub RPL12 ujawniają, że oba czynniki deregulują duże zestawy wspólnych genów. geny, które są wzbogacone w geny odpowiedzi na ciepło i białka rybosomalne, co sugeruje, że mogą one być zaangażowane w dynamiczną koordynację biogenezy rybosomów. biogenezy rybosomów. Eksperymenty immunoprecypitacji chromatyny pokazują, że Corto i RPL12 wiążą hsp70 i są podobnie rekrutowane na korpusie genu po szoku cieplnym. Stąd, Corto i RPL12 mogą być zaangażowane w regulację transkrypcji genów. Omawiamy, czy kompleksy pseudo-rybosomalne złożone z różnych białek rybosomalnych mogą uczestniczyć w regulacji ekspresji genów w połączeniu z regulatorami chromatyny. regulatorami chromatyny. --- Wstęp: Trimetylacja H3K9 (H3K9me3) i wiązanie kompleksu represora PcG-1 (PRC1) mogą odgrywać kluczową rolę w epigenetycznym wyciszaniu genu p16. Mechanizm inicjacji tej trimetylacji jest jednak nieznany. METODOLOGIA / GŁÓWNE WYNIKI: W niniejszym badaniu stwierdziliśmy, że zwiększenie ekspresji składnika PRC1 ekspresji składnika PRC1 Cbx7 w liniach komórkowych raka żołądka MGC803 i BGC823 doprowadziło do znacznego zahamowania ekspresji genów w obrębie locus p16-Arf-p15. Tworzenie się H3K9me3 zaobserwowano w promotorze p16 i domenie regulatorowej (RD). Wiązanie CBX7 i SUV39H2 do tych regionów było również wykrywalne w stabilnie regulowanych komórkach CBX7. Kompleksy CBX7-SUV39H2 były obserwowane w jądrze w teście komplementacji fluorescencji dwucząsteczkowej (BiFC). Mutacje chromodomeny lub delecja Pc-box zniosły wiązanie CBX7 i H3. CBX7 i tworzenie H3K9me3, a tym samym częściowo tłumiły funkcję CBX7. CBX7. SiRNA-knockdown Suv39h2 zablokował represyjny wpływ CBX7 na transkrypcję p16 transkrypcję. Ponadto stwierdziliśmy, że ekspresja CBX7 w tkankach raka żołądka tkankach z metylacją p16 była znacznie niższa niż w odpowiadających im odpowiadających im normalnych tkankach, co wykazało ujemną korelację z transkrypcją p16 w błonie śluzowej żołądka. WNIOSEK/ZNACZENIE: Wyniki te wykazały po raz pierwszy, według naszej wiedzy, że CBX7 może inicjować tworzenie H3K9me3 w promotorze p16. --- TŁO: Fosfoproteina fazy M 8 (MPP8) została początkowo zidentyfikowana jako składnik składnikiem dużego kompleksu białkowego zawierającego RanBPM, a ostatnio została wykazano, że wiąże się z metylowanym H3K9 zarówno in vivo, jak i in vitro. Wiązanie MPP8 do metylowanego H3K9 sugeruje się rekrutację metylotransferaz H3K9 GLP i ESET oraz metylotransferazy DNA 3A do promotora genu E-kadheryny, pośrednicząc w wyciszaniu genu E-kadheryny i promując ruchliwość i inwazję komórek nowotworowych. inwazji. MPP8 zawiera chromodomenę w swoim N-końcu, która jest wykorzystywana do wiązania metylowanego H3K9. METODOLOGIA / GŁÓWNE USTALENIA: Tutaj opisaliśmy struktury krystaliczne chromodomeny ludzkiej chromodomeny MPP8 samodzielnie i w kompleksie z trimetylowanym peptydem histonu H3K9 (reszta 1-15). Struktura kompleksu ujawnia, że ludzka chromodomena MPP8 wiąże metylowany H3K9 poprzez konserwatywny mechanizm rozpoznawania, który został również zaobserwowany w Drosophila HP1, białku zawierającym chromodomenę które również wiąże się z metylowanym H3K9. Struktura ujawnia również, że ludzka chromodomena MPP8 tworzy homodimer, w którym pośredniczy nieoczekiwana domena poprzez dwie nici β z dwóch podjednostek protomeru. WNIOSKI/ZNACZENIE: Nasze odkrycia ujawniają molekularny mechanizm selektywnego wiązania ludzkiej chromodomeny MPP8 do metylowanego histonu H3K9. Obserwacja obserwacja ludzkiej chromodomeny MPP8 zarówno w roztworze, jak i w sieci krystalicznej może dostarczyć wskazówek do dalszego badania regulacji genów za pośrednictwem MPP8. --- Murine Chd1 (chromodomain helicase DNA-binding protein 1), białko remodelujące chromatynę zawierające chromodomenę białko remodelujące chromatynę, jest niezbędne dla pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych (ES). pluripotencji komórek macierzystych (ES). Chd1 wiąże się z nukleosomami trimetylowanymi w histonie 3 Lys 4 (H3K4me3) w pobliżu początku aktywnych genów, ale nie do domen dwuwartościowych zawierających również H3K27me3. Aby zbadać mechanizm tej specyficzności, odtworzyliśmy odtworzyliśmy aktywację genów stymulowaną przez H3K4me3 i CHD1 w ekstraktach HeLa. Wielowymiarowa technologia identyfikacji białek (MuDPIT) i analizy immunoblot analizy oczyszczonych kompleksów preinicjacyjnych (PIC) ujawniły rekrutację CHD1 do naiwnej chromatyny, ale wzmocnienie na chromatynie H3K4me3. Badania w ekstraktach wykazały, że kompleks koaktywatora Mediator, który kontroluje montaż PIC, jest również niezbędny do rekrutacji CHD1. Analizy MuDPIT białek białek związanych z CHD1 potwierdzają dane dotyczące rekrutacji i ujawniają liczne składniki PIC, w tym Mediator. In vivo, CHD1 i Mediator są rekrutowane do indukowalnego genu, a wiązanie obu białek w całym genomie dobrze koreluje z aktywną transkrypcją genów w mysich komórkach ES. Wreszcie, koimmunoprecypitacja CHD1 i Mediatora z ekstraktów komórkowych może zostać wyeliminowana przez shRNA knockdown specyficznej podjednostki Mediatora. Nasze dane potwierdzają model, w którym w którym Mediator koordynuje montaż PIC wraz z rekrutacją CHD1. Połączone działanie PIC i H3K4me3 zapewnia specyficzność w kierowaniu CHD1 do aktywnych genów. --- TŁO: Posttranslacyjne modyfikacje histonów (PTM) stanowią gałąź mechanizmów epigenetycznych, które mogą kontrolować ekspresję genów mechanizmów epigenetycznych, które mogą kontrolować ekspresję genów eukariotycznych w eukariotycznych w sposób dziedziczny. Ostatnie badania zidentyfikowały kilka białek wiążących PTM zawierających różne wyspecjalizowane domeny, których rozpoznawanie określonych miejsc PTM prowadzi do aktywacji lub represji genów. Tutaj przedstawiamy wysokoprzepustową platformę platformę proteogenomiczną zaprojektowaną w celu scharakteryzowania nukleosomalnego składu chromatyny wzbogaconej zestawem białek wiążących histony PTM, znanych jako czytniki histonów PTM. Wspieramy nasze odkrycia danymi dotyczącymi ekspresji genów korelującymi z rozkładem PTM. WYNIKI: Wyizolowaliśmy ludzkie mononukleosomy związane przez białka zawierające bromodomenę Brd2, Brd3 i Brd4 oraz przez heterochromatynę zawierającą chromodomeny HP1β i HP1α. PTM histonów określono ilościowo za pomocą spektrometrii masowej (ChIP-qMS), a związane z nimi DNA zmapowano za pomocą głębokiego sekwencjonowania. Nasze wyniki ujawniają, że nukleosomy związane z Brd i HP1 są wzbogacone w PTM histonów zgodne z aktywnie transkrybowaną euchromatyną i cichą heterochromatyną, odpowiednio. Dane zebrane przy użyciu RNA-Seq pokazują, że miejsca związane z Brd korelują z genami o wysokiej ekspresji. W szczególności, Brd3 i Brd4 są najbardziej wzbogacone na nukleosomach zlokalizowanych w obrębie klastrów genów HOX, których ekspresja jest zmniejszona po Brd4 przez krótką spinkę do włosów RNA. WNIOSKI: Mapowanie proteogenomiczne czytników PTM histonów, wraz z scharakteryzowanie ich lokalnych środowisk chromatynowych i transkrypcyjnych informacje, powinny okazać się przydatne do określenia, w jaki sposób PTM histonów są wiązane przez te czytniki te czytniki i w jaki sposób przyczyniają się one do różnych stanów transkrypcyjnych. --- Wiązanie białka heterochromatyny 1 (HP1) ze znakiem trimetylacji lizyny 9 histonu H3 (H3K9me3) znak trimetylacji (H3K9me3) jest cechą charakterystyczną ustanowienia i utrzymania heterochromatyny. Chociaż aspekty genetyczne i biologiczne zostały szczegóły molekularne wiązania HP1 do nukleosomów H3K9me3 są nieznane. nieznane. Wykorzystując połączenie spektroskopii NMR i pomiarów biofizycznych na w pełni zdefiniowanych rekombinowanych systemach eksperymentalnych, wykazujemy, że H3K9me3 działa jako włącznik/wyłącznik regulujący różne tryby wiązania hHP1β do nukleosomu. nukleosomu. Znak metylowy determinuje wysoce elastyczną i bardzo dynamiczną interakcję chromodomeny hHP1β z ogonem H3. Nie ma żadnych innych ograniczeń interakcji lub dodatkowych interfejsów multimeryzacji. W przeciwieństwie do tego W przeciwieństwie do tego, w przypadku braku metylacji, region zawiasowy i N-końcowy ogon tworzą słabe kontakty nukleosomowe głównie z DNA. Zgodnie z wysoką elastycznością elastycznością w obrębie kompleksu nukleosomowego hHP1β-H3K9me3, domena chromoshadow nie zapewnia bezpośredniego interfejsu wiążącego. Nasze wyniki stanowią pierwszą szczegółową analizę strukturalną dynamicznego kompleksu białko-nukleosom kierowanego przez przez modyfikację histonów i zapewniają ramy koncepcyjne dla zrozumienia podobnych interakcji w kontekście chromatyny. --- Napadowa nocna hemoglobinuria (PNH) jest rzadkim, nabytym zaburzeniem charakteryzującym się przewlekłą hemolizą wewnątrznaczyniową jako głównym objawem klinicznym klinicznym i chorobami, które obejmują niedokrwistość, zakrzepicę, zaburzenia czynności nerek, nadciśnienie płucne i niewydolność szpiku kostnego. Częstość występowania klonu PNH (od <1-100% granulocytów PNH) wynosi około 16 na milion i wymagane jest dokładne monitorowanie. monitorowania. Średni wiek wystąpienia choroby klinicznej to Średni wiek wystąpienia choroby klinicznej to wczesne lata 30-ste, chociaż może ona wystąpić w każdym wieku. PNH jest spowodowana nabyciem somatycznej mutacji genu kotwicy glikanu fosfatydyloinozytolu (PIG-A) w multipotencjalnym układzie krwiotwórczym. multipotencjalnych hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC), z klonalną ekspansją zmutowanych HSC. zmutowanych HSC. Mutacja powoduje niedobór syntezy glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI). W komórkach pochodzących z prawidłowych HSC, białka regulatorowe dopełniacza białka regulatorowe dopełniacza CD55 i CD59 są zakotwiczone na powierzchni błony komórek krwiotwórczych powierzchni błony komórkowej przez GPI, chroniąc komórki przed lizą za pośrednictwem dopełniacza. lizą. Jednakże, u pacjentów z PNH, te 2 białka, wraz z licznymi innymi białkami związanymi z GPI, są nieobecne na powierzchni komórek czerwonych krwinek, granulocytów, monocytów i płytek krwi, co skutkuje hemolizą wewnątrznaczyniową hemolizę wewnątrznaczyniową i inne powikłania. Liza czerwonych krwinek jest najbardziej oczywistym objawem, ale ponieważ dotyczy to również innych linii komórkowych, ten za pośrednictwem dopełniacza przyczynia się do dodatkowych powikłań, takich jak zakrzepica. zakrzepica. Eculizumab, humanizowane przeciwciało monoklonalne przeciwko białku dopełniacza C5 jest jedynym skutecznym lekiem stosowanym u pacjentów z PNH. Przeciwciało przeciwciało zapobiega rozszczepieniu białka C5 przez konwertazę C5, z kolei zapobiegając wytwarzaniu C5b-9 i uwalnianiu C5a, chroniąc w ten sposób przed hemolizą komórek pozbawionych białka powierzchniowego CD59 i innymi powikłaniami związanych z aktywacją dopełniacza. Doktorzy Ilene C. Weitz, Anita Hill i Jeff Szer omawiają 3 niedawne przypadki pacjentów z PNH. --- Oprócz poliploidii, elementy transpozycyjne są głównymi czynnikami powodującymi wzrostu wielkości genomu u roślin. Tak więc, zrozumienie różnorodności i ewolucyjnej elementów transpozycyjnych w słoneczniku (Helianthus annuus L.), zwłaszcza biorąc pod uwagę jego duży rozmiar genomu (∼3,5 Gb) i dobrze udokumentowane przypadki amplifikacji niektórych transpozonów. amplifikacji niektórych transpozonów w obrębie rodzaju, ma znaczące znaczenie dla zrozumienia historii ewolucji tego wyłaniającego się modelu modelowego gatunku. Analizując około 25% genomu słonecznika z losowych sekwencji odczytów sekwencji i zmontowanych klonów sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC), pokazujemy, że pokazujemy, że składa się on w ponad 81% z elementów transpozycyjnych, z których 77% to retrotranspozony o długich powtórzeniach terminalnych (LTR). Co więcej, frakcja retrotranspozonów LTR w klonach BAC zawierających geny nieproporcjonalnie składa się z retrotranspozonów Gypsy LTR zawierających chromodomeny ("chromowirusy") oraz Większość nienaruszonych chromowirusów zawiera tandemowe duplikacje chromodomen. Pokazujemy, że istnieje odchylenie w skuteczności homologicznej rekombinacji w usuwaniu DNA retrotranspozonu LTR, zapewniając w ten sposób wgląd w mechanizmy związane ze składem elementów transpozycyjnych (TE) w genomie słonecznika. Pokazujemy również, że zdecydowana większość obserwowanych insercji retrotranspozonów LTR prawdopodobnie wystąpiła od czasu powstania tego gatunku, dostarczając dalszych dowodów na to, że tendencyjna aktywność retrotranspozonów LTR odegrała główną rolę w kształtowaniu chromatyny i krajobrazu DNA genomu słonecznika. Chociaż nasze ustalenia dotyczące wieku i struktury retrotranspozonów LTR mogą być pod wpływem wybór analizowanych klonów BAC, globalna analiza losowych odczytów sekwencji wskazuje, że opisane tutaj wzorce ewolucyjne mają zastosowanie do genomu słonecznika jako całości. słonecznika jako całości. --- Restrukturyzacja chromatyny poprzedza ściśle regulowane zdarzenia, takie jak transkrypcja DNA transkrypcja, replikacja i naprawa. Jeden rodzaj przebudowy chromatyny obejmuje kowalencyjną modyfikację nukleosomów przez kompleksy acetylotransferazy histonowej (HAT). Obserwacja, że apicydyna wywiera działanie przeciwpierwotniakowe poprzez celowanie w deacetylotransferazę histonową skłoniło nas do poszukiwania kolejnych składników maszynerii modyfikującej histony u pasożytniczych pierwotniaków. Zidentyfikowaliśmy wcześniej zidentyfikowaliśmy HAT z rodziny GNAT u oportunistycznego patogenu Toxoplasma gondii, a teraz opisujemy pierwsze HAT z rodziny MYST (nazwane dla członków MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2, i Tip60) w apicomplexa (TgMYST-A i -B). Genomowy locus TgMYST-A jest pojedynczy i generuje około 3,5-kb transkrypt, który może kodować dwa białka o długości 411 lub 471 aminokwasów. MRNA TgMYST-B ma długość ok. 7,0 kb i koduje drugi homolog MYST. Oprócz kanonicznej domeny katalitycznej MYST HAT, zarówno TgMYST-A, jak i -B posiadają nietypowy palec cynkowy C2HC i chromodomenę. Rekombinowany TgMYST-A wykazuje predylekcję do acetylowania histonu H4 in vitro na lizynach 5, 8, 12 i 16. Przeciwciało wygenerowane dla TgMYST-A ujawnia, że zarówno długie, jak i krótkie (dominujące) wersje są obecne w jądrze jądrze i są również obfite w cytoplazmie. Co więcej, obie formy TgMYST-A są znacznie bardziej obfite w szybko replikujących się pasożytach (tachyzoitach) niż encystowane pasożyty (bradyzoity). Badanie bioinformatyczne genomu Toxoplasma ujawnia liczne homologi, o których wiadomo, że działają w natywnych kompleksach MYST. Charakterystyka HAT TgMYST stanowi kolejny ważny krok w kierunku zrozumienia regulacji ekspresji genów u patogennych pierwotniaków i zapewnia ewolucyjny wgląd w to, jak te procesy działają ogólnie w komórkach eukariotycznych. komórkach eukariotycznych. --- Gen pp32 (ANP32A) działa jako supresor nowotworu, podczas gdy jego blisko spokrewniony homolog pp32r1 (ANP32C) jest onkogenny i ulega nadekspresji. homolog pp32r1 (ANP32C) jest onkogenny i ulega nadekspresji w nowotworach piersi, prostaty i nowotworach trzustki. Transdukcja linii komórkowych p53wt (ACHN i HeLa) za pomocą pp32r1 lub pp32r1Y140H zwiększała proliferację linii komórkowych p53wt w porównaniu do nietransdukowanych komórek kontrolnych, podczas gdy transdukcja linii komórkowej p53(R248W) MiaPaCa2 nie miała żadnego wpływu. Analiza cyklu komórkowego transdukowanych komórek ACHN przez barwienie PI i inkorporację BrdU zilustrowała wyraźne przesunięcie w kierunku fazy S cyklu komórkowego w komórkach z nadekspresją białek pp32r1 i pp32r1Y140H białka. Mikroskopia konfokalna i western blotting wykazały, że pp32r1 i pp32r1 i zmutowane białko pp32r1Y140H rezydują głównie w cytoplazmie w przeciwieństwie do pp32, które jest białkiem jądrowym/cytoplazmatycznym. Aby określić skutki nadekspresji pp32r1 lub pp32r1Y140H na poziomie proteomicznym przeprowadziliśmy kompleksową analizę proteomu na ACHN, ACHN-pp32r1 i ACHN-pp32r1Y140H przy użyciu metody znakowania białek kodowanych izotopowo (ICPL). metoda. Wśród tych białek z >40% regulacją były Macrophage Capping (CAPG) i białko wiążące DNA helikazy chromodomenowej 4 (CHD4). które były znacząco regulowane w górę przez nadekspresję pp32r1 i pp32r1Y140H. Ten wzrost CHD4 wydaje się również wpływać na szereg genów regulujących cykl komórkowy, w tym geny, w tym; p53, p21 i cyklinaD1, jak oceniono metodą western blotting. Wyciszenie CHD4 w komórkach ACHN-pp32r1Y140H przy użyciu specyficznego shRNA odwróciło cykl komórkowy cyklu komórkowego spowodowaną ekspresją pp32r1Y140H do poziomu nietransdukowanej linii komórkowej ACHN sugerując, że CHD4 jest głównym efektorem linii komórkowej pp32r1/pp32r1Y140H. --- Zespół CHARGE jest autosomalnym dominującym zaburzeniem wieloukładowym spowodowanym mutacją w genie CHD7, kodującym białko 7 wiążące DNA helikazy chromodomenowej. Diagnostyka molekularna mutacji CHD7 jest dostępna w warunkach klinicznych od 2005 roku. w warunkach klinicznych od 2005 roku. Przedstawiamy tutaj wyniki z pierwszych 642 niespokrewnionych próbek niespokrewnionych probantów przesłanych do badania. Trzydzieści dwa procent (n = 203) próbek pacjentów pacjentów zidentyfikowano heterozygotyczny wariant patogenny. Niższy wskaźnik mutacji niż ten opublikowany dla dobrze scharakteryzowanych próbek klinicznych jest prawdopodobnie spowodowany skierowania, ponieważ próbki przesłane do badań klinicznych mogą służyć do "wykluczenia" diagnozy, a nie wyłącznie w celu potwierdzenia podejrzeń klinicznych. Zidentyfikowaliśmy zidentyfikowaliśmy 159 unikalnych mutacji patogennych, a spośród nich 134 mutacje były u jednej osoby, a 25 mutacji stwierdzono u dwóch do pięciu osób (n = 69). osób (n=69). Spośród 203 mutacji tylko 9 było typu missense, 107 było typu nonsense, 69 typu frameshift. nonsensownych, 69 z przesunięciem ramki i 15 mutacji w miejscu splicingu prawdopodobnie prowadzących do haploinsufficiency na poziomie komórkowym. Dodatkowe 72 warianty zidentyfikowane w 642 badanych próbkach (11%) uznano za mające nieznane znaczenie kliniczne. znaczenie kliniczne. Zmiany liczby kopii (delecja/duplikacja całego genu lub jednego/kilku eksonów) stwierdzono w bardzo małej liczbie przypadków (n = 3). 3). Ta kohorta reprezentuje największą jak dotąd wielkość próby zespołu CHARGE i ma służyć jako źródło informacji dla klinicystów, doradców genetycznych, badaczy i innych laboratoriów diagnostycznych. --- W Schizosaccharomyces pombe maszyneria RNAi i białka pośredniczące w tworzeniu heterochromatyny heterochromatyny regulują transkrypcję niekodujących powtórzeń centromerycznych powtórzeń. Powtórzenia te wykazują wysokie podobieństwo sekwencyjne do genów telomerazy genami helikazy telomerowej (tlh), co sugeruje związek między tymi dwoma typami elementów elementów i sugerując, że transkrypcja genów tlh może być regulowana przez te same czynniki, co powtórzenia centromerowe. Rzeczywiście, odkryliśmy, że mutanty pozbawione metylotransferazy histonowej Clr4, kulliny Pcu4, Clr7 lub Clr8, akumulują wysokie poziomy transkryptów tlh do przodu i do tyłu. Mutacje i warunki zaburzające acetylację histonów miały podobne efekty, dodatkowo wykazując, że geny tlh są normalnie represjonowane przez heterochromatynę. Natomiast mutacje w czynnikach RNAi Dcr1, Ago1 lub Rdp1 prowadziły jedynie do niewielkiej derepresji genów tlh, wskazując, że alternatywny szlak rekrutuje składniki heterochromatyny do telomerów. Białko wiążące telomery Taz1 może być częścią takiego nadmiarowego szlaku, transkrypty tlh są obecne na niskich poziomach w mutantach Deltataz1 i na wyższych poziomach w podwójnych mutantach Deltataz1 Deltadcr1. Co zaskakujące, białko chromodomeny Chp1, składnik kompleksu RITS zawierającego Ago1 RITS, przyczynia się bardziej do represji tlh niż Ago1, co wskazuje na represyjne działanie Chp1 jest częściowo niezależne od RITS. Geny tlh znajdują się znajdują się w regionach subtelomerowych kilku innych grzybów, podnosząc intrygującą możliwość możliwość konserwatywnej regulacji i funkcji. --- Chromodomain on Y-like (CDYL) jest białkiem chromodomainowym, które ma sekwencję homologię do członków rodziny hydrataz enoilo-CoA. Chociaż chromodomena CDYL została zaangażowana w przebudowę chromatyny podczas spermatogenezy ssaków spermatogenezy ssaków, funkcja genu Cdyl pozostaje niejasna. Ostatnio, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (komórki iPS) zostały uzyskane z komórek somatycznych poprzez wymuszoną ekspresję kilku czynników transkrypcyjnych. Komórki iPS pod wieloma względami przypominają embrionalne komórki macierzyste. embrionalne komórki macierzyste pod wieloma względami. Dlatego komórki iPS stanowią potężne narzędzie narzędzie do badania funkcji genów. W tym badaniu zbadaliśmy, czy iPS pochodzące z fibroblastów Cdyl-/- i Cdyl+/+ mają różne cechy. charakterystykę. Nasze wyniki wykazały, że zarówno fibroblasty Cdyl-/-, jak i Cdyl+/+ mogą być indukowane, aby stać się komórkami iPS, ale spontaniczna zdolność różnicowania neuronalnego zdolność różnicowania komórek iPS Cdyl-/- była znacznie większa niż komórek iPS Cdyl+/+ iPS. Wyniki te zapewniają pewien wgląd w molekularną molekularną genu Cdyl, pokazując, że hamuje on różnicowanie neuronalne komórek iPS. różnicowanie komórek iPS. --- Chromodomena (CD) białka Polycomb Drosophila wykazuje preferencyjne powinowactwo wiązania do histonu H3, gdy jest trimetylowane przy lizynie 27. Tutaj zbadaliśmy zbadaliśmy pięć mysich homologów Polycomb znanych jako Cbx2, Cbx4, Cbx6, Cbx7, i Cbx8. Pomimo wysokiego stopnia zachowania, chromodomeny Cbx wykazują znaczące różnice w preferencjach wiązania. Nie wszystkie CD wiążą się preferencyjnie do K27me3; raczej niektóre wykazują powinowactwo zarówno do trimetylowanego histonu H3 w K9 i H3K27me3, a jedna CD preferuje K9me3. W szczególności Cbx7 wykazuje silne powinowactwo zarówno do H3K9me3, jak i H3K27me3 i jest regulowany rozwojowo w jego powiązaniu z chromatyną. Cbx7 wiąże się z fakultatywną heterochromatyną, a dokładniej, jest wzbogacony na nieaktywnym chromosomie X chromosomie X. Wreszcie, odkryliśmy, że in vitro chromodomena Cbx7 może wiązać RNA i że in vivo interakcja Cbx7 z chromatyną, a w szczególności z nieaktywnym chromosomem X, zależy częściowo od jego powiązania z RNA. My proponujemy, aby zdolność tego mysiego homologa Polycomb do wiązania się z nieaktywnym chromosomem X lub jakimkolwiek innym regionem chromatyny, zależy nie tylko od jego chromodomeny, ale także od kombinacji modyfikacji histonów i cząsteczek RNA obecnych w miejscach docelowych. --- Mutacje w CHD7, genie chromodomeny, występują u większości osób z zespołem CHARGE. z zespołem CHARGE, zaburzeniem charakteryzującym się wieloma anomaliami, takimi jak coloboma, wadami serca, atrezją dróg żółciowych, opóźnieniem wzrostu i rozwoju, hipoplazją narządów płciowych i anomaliami ucha. rozwój, hipoplazję narządów płciowych i anomalie uszu. Cechy kliniczne zespołu CHARGE są bardzo zmienne i nie w pełni penetrujące. Dysfunkcja węchu Dysfunkcja węchu jest częstą cechą zespołu CHARGE i jest potencjalnie z pierwotnymi defektami opuszki węchowej, ale nie ma danych potwierdzających to mechanistyczne powiązanie. mechanistycznego powiązania. Na podstawie tych obserwacji postawiliśmy hipotezę, że utrata Chd7 zaburza rozwój i funkcję tkanki węchowej ssaków. i funkcję. Stwierdziliśmy poważne wady węchu u osób z mutacjami CHD7 i CHARGE, a także utratę wywołanych zapachem odpowiedzi elektro-olfaktogramu u myszy z niedoborem myszy z niedoborem Chd7, co sugeruje, że zmniejszona węchowość jest spowodowana dysfunkcją nabłonka węchowego. Ekspresja Chd7 była wysoka w podstawowych komórkach nabłonka węchowego neuronalnych komórkach macierzystych i obniżona w dojrzałych węchowych neuronach czuciowych. Zaobserwowaliśmy zaobserwowaliśmy mniejsze opuszki węchowe, zmniejszone neurony węchowe i zdezorganizowaną ultrastrukturę nabłonka u zmutowanych myszy Chd7, pomimo pozornie normalne funkcjonalne rzęski i komórki sustentakularne. Znaczące zmniejszenie proliferacji neuronalnych komórek macierzystych i regeneracji węchowych neuronów czuciowych w dojrzałym nabłonku węchowym Chd7(Gt/+) wskazują na krytyczną rolę Chd7 w regulacji neurogenezy. Badania te dostarczają dowodów na to, że u ssaków dysfunkcja węchowa spowodowana haploinsuficjencją Chd7 jest związana z pierwotnymi w proliferacji neuronalnych komórek macierzystych i może wpływać na rozwój opuszki węchowej. rozwój opuszki węchowej. --- Białko chromodomeny, Chromator, można podzielić na dwie główne domeny, domenę domenę NH(2)-końcową (NTD) zawierającą chromodomenę (ChD) i domenę domenę końcową COOH (CTD) zawierającą sygnał lokalizacji jądrowej. Podczas Chromator jest zlokalizowany na chromosomach; jednak podczas podziału komórki Chromator ulega redystrybucji, tworząc makrocząsteczkowy kompleks macierzy wrzeciona wraz z innymi białkami jądrowymi, które przyczyniają się do dynamiki wrzeciona mikrotubul wrzeciona mikrotubul i prawidłowej segregacji chromosomów podczas mitozy. Wcześniej wykazano, że CTD jest wystarczająca do kierowania Chromatora do macierzy wrzeciona macierzy wrzeciona. W tym badaniu pokazujemy, że domena NTD Chromatora jest wymagana do prawidłowej lokalizacji do chromatyny podczas interfazy i że defekty morfologii chromosomów obserwowane w hipomorficznych mutantach Chromatora mogą być w dużej mierze uratowane przez ekspresję tej domeny. Ponadto pokazujemy, że domena ChD może oddziaływać z histonem H1 i że ta interakcja jest niezbędna do prawidłowego ukierunkowania chromatyny. Niemniej jednak, lokalizacja do chromatyny nadal występuje pod nieobecność ChD wskazuje, że Chromator posiada drugi mechanizm asocjacji z chromatyną i dostarczamy dowodów na to, że że w tej asocjacji pośredniczą inne sekwencje rezydujące w NTD. Podsumowując razem te odkrycia sugerują, że funkcje chromatyny Chromatora są w dużej mierze regulowane przez domenę NH(2)-końcową, podczas gdy funkcje związane z mitozą są pośredniczą głównie sekwencje COOH-końcowe. --- W otoczce jądrowej w wyższych komórkach eukariotycznych, blaszka jądrowa i heterochromatyna przylegają do wewnętrznej błony jądrowej. heterochromatyna przylegają do wewnętrznej błony jądrowej, a ich mocowanie jest prawdopodobnie pośredniczone przez integralne białka błonowe. W badaniu dwuhybrydowym drożdży domena nukleoplazmatyczna receptora lamin B (LBR), integralnego białka wewnętrznej błony jądrowej, związanego z dwoma ludzkimi polipeptydami homologicznymi do do Drosophila HP1, białka heterochromatyny zaangażowanego w efekt pozycji variegation. Białka fuzyjne LBR związane z białkami HP1 syntetyzowanymi przez translację in vitro translacji in vitro i obecne w lizatach komórkowych. Przeciwciała przeciwko LBR również koimmunoprecypitowały białka HP1 z ekstraktów komórkowych. LBR może oddziaływać z białka chromodomenowe, które są wysoce konserwatywne w gatunkach eukariotycznych i mogą funkcjonować w przyłączaniu heterochromatyny do wewnętrznej błony jądrowej w komórkach komórkach. --- Prawidłowa morfogeneza kanałów półkolistych ucha wewnętrznego wymaga precyzyjnej regulacji regulacji proliferacji komórkowej, przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego i fuzji płytek nabłonkowych. fuzji płytek nabłonkowych. Epigenetyczna regulacja tych procesów nie jest dobrze poznana, ale prawdopodobnie obejmuje enzymy remodelujące chromatynę. CHD7 jest zawierającym chromodomenę, zależnym od ATP białkiem helikazy, które jest wysoce w rozwijającym się uchu i jest wymagane do rozwoju kanału półkolistego zarówno u ludzi, jak i myszy. u ludzi i myszy. Tutaj donosimy, że myszy z heterozygotyczną utrata funkcji Chd7 wykazuje opóźnioną genezę kanału półkolistego, opóźnioną ekspresję Ekspresja Netrin1 i zaburzona ekspresja genów, które są krytyczne dla tworzenia kanałów półkolistych (Bmp2, Bmp4, Msx1 i Fgf10). Całkowita utrata Chd7 skutkuje aplazją kanałów półkolistych i czuciowych narządów przedsionkowych, ze zmniejszoną lub nieobecną ekspresją Otx1, Hmx3, Jagged1, Lmo4, Msx1 i Sox2. Nasze wyniki sugerują, że Chd7 może mieć krytyczne funkcje genów selekcyjnych podczas morfogenezy ucha wewnętrznego. morfogenezy ucha wewnętrznego. Szczegółowa analiza modyfikacji epigenetycznych leżących u podstaw tych zmian ekspresji genów powinna zapewnić wgląd w rozwój kanału półkolistego i pomóc w projektowaniu terapii dla osób z wadami ucha wewnętrznego. osób z wadami ucha wewnętrznego. --- TŁO: Limfocytarne zapalenie przysadki mózgowej jest chorobą autoimmunologiczną specyficzną dla narządu przysadki mózgowej. Obecnie nie istnieje specyficzny i czuły test serologiczny nie istnieje, aby pomóc w diagnozie. CEL: Zidentyfikowanie docelowych autoantygenów w limfocytarnym zapaleniu przysadki i opracowanie testu diagnostycznego dla tych białek. PROJEKT/METODY: Biblioteka ekspresji cDNA przysadki została poddana immunoscreeningowi przy użyciu surowic od czterech pacjentów z limfocytarnym zapaleniem przysadki. Odpowiednie klony cDNA z badań przesiewowych, wraz z wcześniej zidentyfikowanymi autoantygenami przysadki czynnikiem specyficznym dla przysadki 1a i 2 (PGSF1a i PGSF2) oraz specyficzną dla neuronów enolazą (NSE) testowano w teście immunoprecypitacji transkrypcji i translacji in vitro test immunoprecypitacji. Czynnik transkrypcyjny specyficzny dla kortykotropów, TPIT, był badany oddzielnie jako kandydat na autoantygen. WYNIKI: Stwierdzono istotnie dodatnią reaktywność autoprzeciwciał przeciwko TPIT u 9/86 pacjentów z zapaleniem przysadki w porównaniu do 1/90 osób z grupy kontrolnej (P = 0,018). Reaktywność przeciwko TPIT nie była specyficzna dla limfocytarnego zapalenia przysadki z autoprzeciwciałami wykrywalne w surowicy pacjentów z innymi autoimmunologicznymi chorobami endokrynologicznymi. Autoprzeciwciała wykryto również przeciwko białku wiążącemu chromodomainę-helikazę-DNA białko 8, białko cytomatrycy presynaptycznej (piccolo), zależny od Ca(2+) aktywator wydzielania aktywator, PGSF2 i NSE w próbkach surowicy od pacjentów z limfocytowym zapaleniem ale z częstotliwością, która nie różniła się od zdrowych kontroli. Co ważne, 8/86 pacjentów z limfocytarnym zapaleniem przysadki miało autoprzeciwciała przeciwko dowolnym dwóm autoantygenom w porównaniu z 0/90 osób z grupy kontrolnej (P = 0,0093). WNIOSKI: TPIT, czynnik transkrypcyjny specyficzny dla kortykotropów, został zidentyfikowany jako docelowy autoantygen u 10,5% pacjentów z limfocytarnym zapaleniem przysadki. Dalsze autoantygeny związane z przetwarzaniem pęcherzyków zostały również zidentyfikowane jako z różnymi wzorcami immunoreaktywności u pacjentów i osób z grupy kontrolnej. kontrolnych. --- Molekularne białko motoryczne CHD1 zostało zaangażowane w regulację transkrypcji i w niezależnej od transkrypcji inkorporacji w całym genomie H3.3 do chromatyny ojcowskiej u Drosophila melanogaster. Kluczową cechą CHD1 jest obecność dwóch chromodomen, które mogą wiązać się z histonem H3 metylowanym przy lizyny 4 i w ten sposób mogą służyć do rekrutacji i/lub utrzymania CHD1 w chromatynie. Tutaj opisujemy genetyczne i biochemiczne podejścia do badania chromodomeny chromodomen CHD1 u Drosophila. Stwierdziliśmy, że ogólna lokalizacja CHD1 na chromosomach chromosomach polietylenowych nie zmienia się znacząco u muszek z mutantami chromodomen. W przeciwieństwie do tego, chromodomeny są ważne dla aktywności niezależnej od transkrypcji aktywności CHD1 podczas wczesnego rozwoju embrionalnego, jak również dla regulacji transkrypcji kilku genów szoku cieplnego. Jednak ani CHD1 ani jego chromodomeny nie są potrzebne do lokalizacji polimerazy RNA II i metylacji H3K4 metylacji, ale utrata CHD1 zmniejsza indukowaną transkrypcją eksmisję histonów w genie genu Hsp70 in vivo. Mutacje chromodomen negatywnie wpływają na aktywność składania chromatyny CHD1 in vitro i wydają się być zaangażowane w łączenie silnika zależnego od ATP silnika zależnego od ATP z funkcją składania chromatyny CHD1. --- Retrotranspozon Tf1 reprezentuje grupę retroelementów o długim terminalnym powtórzeniu które wykorzystują samokrimer RNA do inicjowania odwrotnej transkrypcji podczas syntetyzując minus-sensowną nić DNA. Odwrotna transkryptaza Tf1 (RT) została do generowania samokrimera in vitro. Tutaj pokazujemy, że ta RT może usunąć z zsyntetyzowanego cDNA cały samokrimer, jak również kompletną sekwencję szlaku polipurynowego (PPT) (służącą jako drugi starter do syntezy cDNA). syntezy cDNA). Jednak usuwanie starterów, w którym pośredniczy aktywność RNazy H Tf1 RT, są dość nieefektywne. Co ciekawe, integraza Tf1 stymulowała specyficzne, kierowane przez Tf1 RT rozszczepienie zarówno własnego primera, jak i PPT, chociaż nie było ogólnego wzmocnienia aktywności RNazy H RT (a integraza sama w sobie jest pozbawiona jakiegokolwiek rozszczepiania starterów). RT dwóch prototypowych retrowirusów, wirusa białaczki mysiej i ludzkiego wirusa niedoboru odporności, wykazały tylko częściowe i niespecyficzne rozszczepienie obu primerów związanych z Tf1 bez stymulacji przez integrazę Tf1. Mutageneza integrazy Tf1 ujawniła, że kompletne białko integrazy Tf1 (z wyłączeniem jego chromodomeny) jest wymagane do stymulowania aktywności usuwania starterów Tf1 RT. Niemniej jednak, podwójny mutant integraza, która utraciła swoje funkcje integracyjne, może nadal stymulować aktywność RT aktywność RT, chociaż inaktywowana termicznie integraza nie może wzmocnić usuwania primerów. Odkrycia te sugerują, że aktywność enzymatyczna integrazy Tf1 nie jest niezbędna do stymulowania usuwania primerów za pośrednictwem RT, podczas gdy prawidłowe fałdowanie tego białka jest obowiązkowe dla tej funkcji. Wyniki te podkreślają możliwe nowe funkcje integrazy Tf1 w procesie odwrotnej transkrypcji retrotranspozonu. procesie odwrotnej transkrypcji retrotranspozonu. --- Białka kotwiczące kinazę A (AKAP) wiążą podjednostki regulatorowe kinazy białkowej kinazy białkowej A (PKA) i lokalizują holoenzym do dyskretnych mikrodomen sygnalizacyjnych w wielu przedziałach subkomórkowych. Pomimo pojawiających się dowodów na istnienie jądrowej puli PKA, która szybko reaguje na aktywację kaskady sygnalizacyjnej PKA, tylko kilka zidentyfikowano tylko kilka AKAP, które lokalizują się w jądrze. Tutaj pokazujemy domenę domenę wiążącą PKA na aminowym końcu Chd8 i wykazujemy subkomórkową kolokalizację Chd8 z RII. Nakładanie RII i testy immunoprecypitacji wykazują wiązanie między Chd8-S i RIIα. Wiązanie jest zniesione po dephosphorylation of RIIα. Poprzez immunofluorescencję zidentyfikowaliśmy jądrowe i okołojądrowe pule Chd8 w komórkach HeLa i szczurzych kardiomiocytach noworodków. Wykazaliśmy również wykazać wysoki poziom mRNA Chd8 w RNA ekstrahowanym z postnatalnych serc szczurów. Te dane dodają Chd8 do krótkiej listy znanych jądrowych AKAP i wskazują na funkcję dla Chd8 w postnatalnym rozwoju serca szczura. --- Elementy transpozycyjne z długimi terminalnymi bezpośrednimi powtórzeniami (LTR TE) są jedną z najlepiej zbadanych grup elementów mobilnych. Są to wszechobecne elementy obecne w prawie wszystkich genomach eukariotycznych. Ich liczba i stan zachowania mogą być podkreślać dynamikę genomu. Przeszukaliśmy wszystkie opublikowane genomy grzybów w poszukiwaniu retrotranspozonów zawierających LTR, w tym zarówno kompletnych, funkcjonalnych elementów jak i pozostałości. Zidentyfikowaliśmy łącznie ponad 66 000 elementów, z których wszystkie należą do nadrodzin Ty1/Copia lub Ty3/Gypsy. Większość wykrytych elementów Gypsy reprezentuje Chromoviridae, tj. posiada chromodomenę w pol ORF. Przeanalizowaliśmy nasze dane z perspektywy ekologii genomu, patrząc na obfitość różnych typów LTR TE w poszczególnych genomach i na element o najwyższej kopiowalności z każdego genomu. z każdego genomu. Zawartość TE jest bardzo zmienna wśród analizowanych genomów. genomów. Niektóre genomy są bardzo ubogie w LTR TE (<50 elementów), inne wykazują ogromną ekspansję (>8000 elementów). Dane pokazują, że ekspansje transpozonów transpozonów u grzybów zwykle wiąże się ze wzrostem zarówno liczby kopii pojedynczych elementów, jak i liczby typów elementów. Większość TE o najwyższej liczbie kopii ze wszystkich genomów to transpozony Ty3/Gypsy. Analiza filogenetyczna Analiza filogenetyczna tych elementów sugeruje, że ekspansje TE pojawiły się niezależnie od siebie, w odległych genomach i na różnych poziomach taksonomicznych. poziomach taksonomicznych. Przeanalizowaliśmy również ewolucyjne relacje między domenami białkowymi domenami białkowymi kodowanymi przez ORF transpozonu pol i stwierdziliśmy, że proteaza jest najszybciej ewoluującą domeną. najszybciej ewoluującą domeną, podczas gdy odwrotna transkryptaza i RNaza H ewoluują znacznie wolniej i w korelacji ze sobą. --- WPROWADZENIE: Helikaza chromodomenowa wiążąca białko DNA 5 (CHD5) została niedawno zostało niedawno zidentyfikowane jako supresor nowotworu w modelu mysim. Locus CHD5 na 1p36 jest usunięty, a jego mutacja została wykryta w raku piersi. My, dlatego oceniliśmy, czy CHD5 odgrywa rolę w ludzkim raku piersi. METODY: Zbadaliśmy mutacje w 55 guzach, określiliśmy metylację promotora w 39 guzach, zmierzyliśmy ekspresję RNA w 90 guzach, przeanalizowaliśmy ekspresję białka w 289 guzach i skorelowaliśmy zmiany ekspresji z kliniczno-patologicznymi charakterystyką raka piersi. Funkcjonalny wpływ CHD5 na proliferację komórek na proliferację komórek, inwazję i nowotworzenie. WYNIKI: Chociaż wykryto tylko jedną mutację, ekspresja mRNA CHD5 była znacznie obniżona, czemu towarzyszyła częsta delecja genomu i metylacja promotora i metylacji promotora w raku piersi. Zakres metylacji był znacząco związany ze zmniejszoną ekspresją mRNA, a leczenie demetylujące przywróciło ekspresję CHD5. CHD5. Niższe poziomy mRNA CHD5 korelowały z przerzutami do węzłów chłonnych (P = 0.026). Ekspresja białka CHD5 była również zmniejszona w raku piersi, a brak ekspresji CHD5 istotnie korelował z wyższym stadium zaawansowania nowotworu, ER/PR-ujemnością, HER2-dodatniością, odległymi przerzutami i gorszym przeżyciem pacjentów (P ≤ 0.01). Funkcjonalnie, ektopowa ekspresja CHD5 w komórkach raka piersi hamowała proliferację komórek i inwazję in vitro oraz nowotworzenie u nagich myszy. myszy. Zgodnie z hamowaniem inwazji, CHD5 regulował w dół markerów mezenchymalnych wimentyny, N-kadheryny i ZEB1 w komórkach raka piersi. WNIOSEK: Zmniejszona regulacja CHD5, w której pośredniczy przynajmniej częściowo metylacja promotora przyczynia się do rozwoju i progresji ludzkiego raka piersi. raka piersi. --- Uważa się, że zachowany wzór pasmo-pasmo odzwierciedla zapętloną domenę organizację chromosomów polietylenowych owadów. Wcześniej wykazaliśmy, że białko chromodomeny Chriz i białko palca cynkowego Z4 są zasadniczo wymagane do utrzymania struktury chromosomów polietylenowych. Tutaj pokazujemy, że oba białka tworzą kompleks, który rekrutuje kinazę JIL-1 do chromosomów polietylenu chromosomów, umożliwiając lokalną fosforylację H3S10 międzypasmowych nukleosomalnych histonów histonów międzypasmowych. Międzypasmowe domeny docelowe zostały zidentyfikowane w N-końcowych regionach Chriz i Z4, a nasze dane sugerują częściową współpracę kompleksu z białkiem elementu granicznego białkiem elementu granicznego BEAF w komórkach polietylenowych i diploidalnych. Zmniejszenie Chriz przez RNAi skutkuje destabilizacją kompleksu i silną redukcją silną redukcję fosforylacji histonu H3S10 specyficznej dla międzypasmowej fosforylacji. --- Chloroplasty zawierają unikalną cząsteczkę rozpoznającą sygnał (cpSRP). W przeciwieństwie do formy cytoplazmatyczne, cpSRP nie zawiera RNA, ale zawiera konserwowaną GTPazę 54-kDa i nową podjednostkę 43-kDa (cpSRP43). Ostatnio, trzy funkcjonalnie różne chromodomeny (CD) zostały zidentyfikowane w cpSRP43. W niniejszym badaniu przedstawiamy trójwymiarowe struktury roztworów trzech CD (CD1, CD2 i CD3) przy użyciu różnych eksperymentów potrójnego rezonansu NMR. Struktura CD1 składa się z trójniciowego segmentu beta-arkusza. C-końcowy segment helikalny zwykle występujący w chromodomenach jądrowych jest nieobecny w CD1. Drugorzędowe elementy strukturalne w CD2 i CD3 obejmują trójniciowy antyrównoległy arkusz beta-arkusz i C-końcową helisę. Co ciekawe, orientacja helisy C-końcowej helisy jest znacząco różna w strukturach CD2 i CD3. Krytyczne porównanie struktur chromodomen cpSRP43 z tymi znalezionymi w białkach chromodomen jądrowych ujawniło, że różnorodne interakcje białko-białko interakcje białko-białko, w których pośredniczą CD, wydają się wynikać z różnic, które istnieją w potencjałach ładunku powierzchniowego każdego CD. Wyniki izotermicznego miareczkowania kalorymetrii izotermicznej potwierdziły, że tylko CD2 jest zaangażowany w wiązanie do cpSRP54. Ujemnie naładowana C-końcowa helisa w CD2 prawdopodobnie odgrywa kluczową rolę w wiązaniu cpSRP54. rolę w interakcji cpSRP54-cpSRP43. --- Białko heterochromatyny 1 (HP1) zostało po raz pierwszy odkryte u Drosophila jako dominujący supresor wariacji z efektem pozycji i główny składnik heterochromatyny. Rodzina HP1 jest ewolucyjnie konserwatywna, z członkami w grzybach, roślinach i zwierzętach, ale nie u prokariotów, a jej członkowie występują wielokrotnie w obrębie tego samego gatunku. Amino-końcowa chromodomena wiąże metylowaną lizynę 9 histonu H3, powodując represję transkrypcji. Wysoce konserwowana karboksy-końcowa domena chromoshadow umożliwia dimeryzację, a także służy jako miejsce dokowania dla białek zaangażowanych w wiele różnych funkcji jądrowych, od transkrypcji do architektury jądrowej. Oprócz pakowania heterochromatyny, staje się coraz bardziej jasne, że białka HP1 pełnią różnorodne role w jądrze jądrze, w tym w regulacji genów euchromatycznych. Białka HP1 są podatne na modyfikacje potranslacyjne, które prawdopodobnie regulują te różne funkcje, tworząc w ten sposób podkod w kontekście "kodu histonowego" modyfikacji potranslacyjnych histonów. --- Chromodomeny zazwyczaj rekrutują kompleksy białkowe do chromatyny i odczytują epigenetyczny kod histonowy epigenetyczny kod histonowy poprzez rozpoznawanie metylacji lizyny w ogonach histonów. My przedstawiamy strukturę krystaliczną chloroplastowej cząsteczki rozpoznającej sygnał (cpSRP) z Arabidopsis thaliana, z ogonem cpSRP54 zawierającym motyw bogaty w argininę motyw związany z drugą chromodomeną cpSRP43. Bliźniacza aromatyczna klatka odczytuje dwie sąsiednie niemetylowane argininy i dostosowuje chromodomeny do funkcji pozajądrowej w celowaniu potranslacyjnym. --- Kompleksy remodelujące chromatynę Mi-2/nukleosom i deacetylaza (NuRD) są ważnymi regulatorami struktury chromatyny i dostępności DNA. My zbadaliśmy wymagania dla poszczególnych domen helikazy chromodomenowej białka wiążącego DNA 4 (CHD4), głównego składnika katalitycznego kompleksów NuRD, jak również podjednostki NuRD jak również podjednostki NuRD białka domeny wiążącej metyl 2 (MBD2) i metylowane DNA, dla funkcji NuRD w kontekście transkrypcji specyficznej dla tkanki. Sama sama utrata aktywności NuRD nie jest wystarczająca do aktywacji transkrypcji. Jednak kompleksy NuRD znacznie zmniejszają aktywację specyficznego dla komórek B genu mb-1 (Cd79a) przez czynniki transkrypcyjne EBF1 i Pax5. Korzystając z naszego modelu komórek B ustaliliśmy, że dwie chromodomeny i ATPaza/helikaza oraz domeny C-końcowe domeny (CTD) CHD4 są niezbędne do represji promotorów mb-1 przez NuRD. Wszystkie te domeny z wyjątkiem CTD są wymagane do efektywnej asocjacji CHD4 z chromatyną promotora mb-1. Utrata ekspresji MBD2 lub metylacji DNA upośledzała asocjację CHD4 z chromatyną promotora mb-1 chromatyną i nasila jego transkrypcję. Wnioskujemy, że funkcje represyjne kompleksów NuRD zawierających MBD2 zależą od interakcji kooperacyjnych między głównymi domenami CHD4 z histonami i DNA oraz na wiązaniu metylowanego DNA przez MBD2. --- Histon łącznikowy (H1) i białko heterochromatyny 1 (HP1) są istotnymi składnikami heterochromatyny, które przyczyniają się do represji transkrypcji genów. Wykazano, że znak metylacji histonu H1 kręgowców jest specyficznie rozpoznawany przez chromodomenę HP1. Jednakże, dokładna biologiczna rola wiązania histonu łącznikowego z HP1 nie została jednak określona. Tutaj, badamy funkcję wariantu H1 Caenorhabditis elegans HIS-24 i białek podobnych do HP1 HPL-1 i HPL-2 w kooperatywnej transkrypcji regulacji genów związanych z odpornością. Dostarczamy pierwszych dowodów na to, że HPL-1 oddziałuje z HIS-24 monometylowanym przy lizynie 14 (HIS-24K14me1) i wiąże się in vivo z promotorami genów zaangażowanych w odpowiedź przeciwdrobnoustrojową. My również zgłaszamy wzrost ogólnego poziomu komórkowego i zmiany w dystrybucji HIS-24K14me1 po zakażeniu bakteriami chorobotwórczymi. Lokalizacja HIS-24K14me1 zmienia się z głównie jądrowej na jądrową i cytoplazmatyczną w jelitach. cytoplazmatycznych w komórkach jelitowych zakażonych zwierząt. Nasze wyniki podkreślają przeciwdrobnoustrojową rolę HIS-24K14me1 i sugerują funkcjonalny związek między regulacją epigenetyczną przez kompleks HP1/H1 a wrodzonym układem odpornościowym u C. elegans. --- Domena modyfikatora organizatora chromatyny (chromodomena) jest obecna w białkach które przyczyniają się do organizacji chromatyny i pośredniczy w ich wiązaniu do metylowanego histonu H3. Pomimo wysokiego poziomu zachowania sekwencji, poszczególne chromodomeny wykazują znaczne różnice w preferencjach wiązania dla metylowanych form histonu H3, co sugeruje, że potranslacyjna modyfikacja chromodomeny może być ważnym wyznacznikiem specyficzności wiązania. My że mysie białko Cbx2 (znane również jako M33), homolog białka Drosophila Polycomb jest silnie fosforylowane w niektórych liniach komórkowych. Pasmo o niskiej ruchliwości Cbx2 obserwowane na elektroforezie żelowej SDS-poliakryloamidowej zostało zatem przekształcone w pasmo o do pasma o wyższej ruchliwości poprzez traktowanie fosfatazą alkaliczną. Analiza spektrometryczna ujawniła serynę-42, konserwowany aminokwas w chromodomenie, jako miejsce fosforylacji miejsce fosforylacji Cbx2. Fosforylacja chromodomeny Cbx2 na tej reszcie in vitro skutkowała zmniejszonym poziomem wiązania z peptydem H3 zawierającym trimetylowaną lizynę-9, jak również zwiększenie zakresu wiązania z peptydem H3 zawierającym trimetylowaną lizynę-27, co sugeruje, że taka fosforylacja zmienia specyficzność wiązania Cbx2 dla zmodyfikowanego zmodyfikowanego histonu H3. Fosforylacja chromodomeny Cbx2 może zatem służyć jako przełącznik molekularny, który wpływa na odczyt przełącznik molekularny, który wpływa na odczyt kodu modyfikacji histonów i w ten sposób kontroluje epigenetyczną pamięć komórkową. --- Uważa się, że białka należące do rodziny CHD (chromodomain helicase DNA-binding) regulują ekspresję genów. Uważa się, że regulują ekspresję genów. Wśród ssaczych białek CHD, CHD8 zostało pierwotnie wyizolowane jako negatywny regulator szlaku sygnałowego Wnt-β-katenina. który wiąże się bezpośrednio z β-kateniną i hamuje jej aktywność transaktywacyjną. aktywność. Mechanizm, za pomocą którego CHD8 hamuje transkrypcję zależną od β-kateniny był jednak niejasny. Tutaj pokazujemy, że CHD8 promuje asocjację β-kateniny i histonu H1, z tworzeniem trimerycznego kompleksu na chromatynie jest wymagane do zahamowania transaktywacji zależnej od β-kateniny. MUTANT CHD8 mutant, któremu brakuje domeny wiążącej histon H1, nie wykazywał takiej aktywności hamującej aktywność, wskazując, że rekrutacja histonu H1 jest niezbędna do hamowania hamującego działania CHD8. Co więcej, albo zubożenie histonu H1, albo ekspresja dominującego ujemnego mutanta tego białka spowodowało wzmocnienie odpowiedzi na sygnalizację Wnt. Obserwacje te ujawniają nowy sposób regulacji szlaku sygnałowego Wnt przez CHD8, który przeciwdziała funkcji β-kateniny poprzez rekrutację histonu H1 do genów docelowych Wnt. Biorąc pod uwagę, że CHD8 ulega ekspresji głównie podczas embriogenezy, może zatem przyczyniać się do ustalenia progu progu responsywności na sygnalizację Wnt, która działa w sposób sposób zależny od rozwoju. --- Białko wiążące GATA 3 (Gata3) jest czynnikiem transkrypcyjnym z rodziny GATA, który kontroluje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 w komórki T helper 2 (Th2). Nie wiadomo jednak, w jaki sposób Gata3 jednocześnie aktywuje geny specyficzne dla Th2 jednocześnie tłumiąc te z innych linii Th. Tutaj pokazujemy, że chromodomena helikaza wiążąca DNA białko 4 (Chd4) tworzy kompleks z Gata3 w komórkach Th2 który zarówno aktywuje transkrypcję cytokin Th2, jak i hamuje cytokinę Th1 IFN-γ. Zdefiniowaliśmy kompleks aktywacji transkrypcji Gata3/Chd4/p300 w loci cytokin Th2 loci cytokin i Gata3/Chd4-nukleosom remodelujący deacetylazę histonową w locus Tbx21 w komórkach Th2. Wykazaliśmy również fizjologiczną rolę Chd4 w zapaleniu zależnym od Th2 w modelu in vivo astmatycznego zapalenia. Tak więc, Gata3/Chd4 tworzy funkcjonalnie różne kompleksy, które pośredniczą zarówno w pozytywnej, jak i negatywnej regulacji genów w celu ułatwienia różnicowania komórek Th2 różnicowanie. --- Dwa nakładające się cDNA, które kodują 197-kDa sekwencyjnie selektywne białko wiążące DNA zostały wyizolowane z bibliotek pochodzących z mRNA mysich komórek limfoidalnych. W Oprócz domeny wiążącej DNA, białko zawiera zarówno chromodomenę, która występuje w białkach zaangażowanych w zagęszczanie chromatyny, oraz domenę SNF2/SWI2-podobną domenę helikazy, która występuje w białkach, które uważa się za aktywują transkrypcję poprzez przeciwdziałanie represyjnym efektom struktury chromatyny struktury chromatyny. Analiza Southern blot wykazała, że to białko, które nazwaliśmy nazwaliśmy CHD-1, dla białka wiążącego chromodomenę-helikazę-DNA, jest obecne w większości, jeśli nie u wszystkich gatunków ssaków. Analiza Northern blot ujawniła wiele składników CHD mRNA, które różniły się zarówno jakościowo, jak i ilościowo między różnych typów komórek. Różne mRNA, które są prawdopodobnie produkowane przez alternatywnego przetwarzania RNA, mogą kodować specyficzne dla tkanki i etapu rozwoju izoformy CHD. specyficzne dla tkanki i etapu rozwoju izoformy białka. W oparciu o interesującą kombinację kombinacji cech, podejrzewamy, że CHD-1 odgrywa ważną rolę w regulacji genów. regulacji genów. --- Podczas mejotycznego podziału komórki, prawidłowa synapsa chromosomowa i dokładna naprawa podwójnych pęknięć nici DNA (DSB) są wymagane do utrzymania integralności genomu, której utrata prowadzi do apoptozy lub defektów mejotycznych. prowadzi do apoptozy lub defektów mejotycznych. Mechanizmy leżące u podstaw mejotycznej synapsy chromosomowej, naprawy DSB i apoptozy nie są w pełni poznane. Tutaj donosimy, że białko MRG-1 zawierające chromodomenę jest ważnym czynnikiem czynnikiem integralności genomowej w mejozie u Caenorhabditis elegans. Utrata funkcji mrg-1 spowodowała znaczny wzrost apoptozy komórek zarodkowych, który był częściowo hamowana przez mutacje wpływające na geny punktów kontrolnych uszkodzeń DNA. Konsekwentnie, zmutowane linie zarodkowe mrg-1 wykazywały DSB generowane przez SPO-11 i podwyższoną fragmentację chromosomów wywołaną egzogennymi uszkodzeniami DNA podczas diakinezy. Ponadto Ponadto nadmierna apoptoza u mutantów mrg-1 była częściowo tłumiona przez utratę genu punktu kontrolnego synapsy pch-2, a znaczna liczba jąder mejotycznych jąder mejotycznych gromadziła się na etapach leptotenu/zygotenu z podwyższonym poziomem H3K9me2 na chromatynie, co podobnie zaobserwowano u mutantów z niedoborem kompleksu synaptonemalnego kompleksu synaptonemalnego, co sugeruje, że prawidłowy postęp synapsy chromosomowej synapsy jest prawdopodobnie upośledzony pod nieobecność mrg-1. W sumie, te odkrycia sugerują, że MRG-1 ma kluczowe znaczenie dla integralności genomu poprzez promowanie mejotycznej naprawy DSB i progresję synapsy w mejozie. --- TŁO I CELE: Choroby kłębuszków nerkowych są trzecią najczęstszą przyczyną niewydolności nerek na świecie. niewydolności nerek na całym świecie, ustępując jedynie cukrzycy i nadciśnieniu tętniczemu. Mechanizmy molekularne mechanizmy leżące u podstaw chorób kłębuszków nerkowych są nadal w dużej mierze nieznane. Identyfikacja i charakterystyka nowych cząsteczek związanych z funkcją kłębuszków nerkowych powinna zapewnić nowy wgląd w zrozumienie zróżnicowanej grupy chorób kłębuszków nerkowych. zróżnicowanej grupy chorób kłębuszków nerkowych. Białko Chd2 należy do rodziny enzymów enzymów zaangażowanych w zależną od ATP przebudowę chromatyny, co sugeruje, że prawdopodobnie funkcjonuje jako epigenetyczny regulator ekspresji genów poprzez modyfikację struktury chromatyny. METODY: W tym badaniu przedstawiamy szczegółową charakterystykę histomorfologiczną myszy zawierających mutację w chromodomenie helikazy wiążącej DNA białko 2 (Chd2). WYNIKI: Wykazaliśmy, że myszy z mutacją Chd2 mają glomerulopatię, białkomocz, i znacznie upośledzoną czynnością nerek. Dodatkowo, analiza surowicy ujawniła obniżony poziom hemoglobiny i hematokrytu u myszy z mutacją Chd2, sugerując, że glomerulopatia obserwowana u tych myszy jest związana z niedokrwistością. niedokrwistością. WNIOSEK: Łącznie dane sugerują rolę białka Chd2 w utrzymaniu funkcji nerek. utrzymaniu funkcji nerek. --- Modyfikacje DNA i histonów kierują funkcjonalnym stanem chromatyny, a tym samym odczytem genomu. a tym samym odczyt genomu. Podejścia kandydackie i eksperymenty oczyszczania powinowactwa peptydów histonowych zidentyfikowały kilka białek, które wiążą się z markerami chromatyny. znakami chromatyny. Jednakże, uzupełnienie czynników, które są rekrutowane przez poszczególne i kombinacje modyfikacji DNA i histonów nie zostały jeszcze nie został jeszcze zdefiniowany. Tutaj przedstawiamy strategię opartą na rekombinowanych, jednolicie zmodyfikowanych szablony chromatyny stosowane w eksperymentach oczyszczania powinowactwa w połączeniu z ilościową spektrometrią mas opartą na SILAC. Na Na prototypowych znakach modyfikacji histonów H3K4me3 i H3K9me3 porównujemy naszą metodę z metodą oczyszczania powinowactwa peptydów N-końcowych histonów. Nasza analiza pokazuje, że tylko niektóre czynniki wiążą się zarówno z chromatyną, jak i matrycami peptydowymi ale zaskakująco duża liczba białek różni się w ich asocjacji z tymi szablonami. z tymi szablonami. Globalna analiza zidentyfikowanych białek sugeruje specyficzne domeny pośredniczące w rekrutacji do znaczników chromatynowych. Nasze badania pokazują, że szablony chromatyny ze zdefiniowanymi wzorami modyfikacji wzory modyfikacji mogą być wykorzystane do rozszyfrowania, w jaki sposób kod histonowy jest odczytywany i tłumaczony. --- TŁO: Mutacje w genie białka 7 wiążącego DNA helikazy chromodomenowej (CHD7) prowadzą do zespołu CHARGE, autosomalnego dominującego zespołu wielu wad rozwojowych zaburzenie. Białka zaangażowane w przebudowę chromatyny zazwyczaj działają w kompleksach kompleksach wielobiałkowych. Wcześniej wykazaliśmy, że część ludzkiego CHD7 wchodzi w interakcje z częścią ludzkiego CHD8, innego białka wiążącego DNA helikazy chromodomainowej. białko prawdopodobnie zaangażowane w patogenezę zaburzeń neurorozwojowych i spektrum autyzmu. (NDD) i zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD). Ponieważ identyfikacja nowych partnerów CHD7 i CHD8 zapewni dalszy wgląd w patogenezę zespołu CHARGE i zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD). patogenezę zespołu CHARGE i ASD/NDD, poszukiwaliśmy dodatkowych powiązanych polipeptydów przy użyciu metody stabilnego znakowania izotopowego amino kwasów w hodowli komórkowej (SILAC) w połączeniu ze spektrometrią mas. ZASADNICZE WYNIKI: Dotychczas niescharakteryzowana FAM124B (rodzina z podobieństwem sekwencji 124B) została zidentyfikowana jako potencjalny partner interakcji zarówno CHD7 i CHD8. Potwierdziliśmy ten wynik poprzez badania koimmunoprecypitacji i wykazaliśmy bezpośrednie wiązanie z częścią CHD8 poprzez bezpośrednie eksperymenty hybrydyzacji drożdży. Ponadto, scharakteryzowaliśmy FAM124B jako białko zlokalizowane głównie jądrowo z z powszechną ekspresją w embrionalnych i dorosłych tkankach myszy. WNIOSEK: Nasze wyniki pokazują, że FAM124B jest potencjalnym partnerem interakcji partnerem kompleksu zawierającego CHD7 i CHD8. Z nakładającego się wzoru ekspresji wzór między Chd7 i Fam124B w dniu embrionalnym myszy E12.5 i wysoki ekspresji Fam124B w rozwijającym się mózgu myszy, doszliśmy do wniosku, że Fam124B jest nowym białkiem prawdopodobnie zaangażowanym w patogenezę zespołu CHARGE i zaburzeń neurorozwojowych. zaburzeń neurorozwojowych. --- Cucurbit[7]uril selektywnie wiąże znak epigenetyczny N(ε),N(ε),N(ε)-trimetylolizynę (LysMe(3), K(CB[7]) = (1,8 ± 0,6)× 10(6) dm(3) mol(-1)) o 3500 razy w porównaniu z lizyną ((5,3 ± 0,7) × 10(2) dm(3) mol(-1)) w roztworze wodnym roztworze, wykorzystując interakcje jon-dipol i efekt hydrofobowy, a nie oddziaływań kation-π, jak w "aromatycznych klatkach" gospodarzy p-SO(3)-kaliks[4]arenu lub białek chromodomenowych, które rozpoznają LysMe(3). Tendencja w K(CB[7]) z LysMe(3) > LysMe(2) > LysMe > Lys podąża za wzorcem rozpoznawania chromodomeny HP1 i innych czytników białek LysMe(n). W przypadku CB[6] protonowanie grupy karboksylanowej gościa grupy karboksylanowej gościa jest wymagane do tworzenia kompleksów inkluzyjnych z serią LysMe(n). Host CB[7] wykazuje również umiarkowaną selektywność między asymetrycznym ((2,0 ± 0,3) × 10(3) dm(3) mol(-1)) i symetrycznym ((6,1 ± 0,6) × 10(3) dm(3) mol(-1)) dimetyloargininy, z których oba wiążą się silniej niż macierzysta arginina lub monometyloarginina. --- Kompleks śmiertelny specyficzny dla samców (MSL) reguluje w górę pojedynczy męski chromosom X w celu osiągnięcia kompensacji dawki u Drosophila melanogaster. Zaproponowaliśmy, że MSL rozpoznaje określone miejsca wejścia na X, po czym następuje lokalne ukierunkowanie aktywnych genów oznaczonych trimetylacją histonu H3 (H3K36me3). Tutaj analizujemy rolę chromodomeny MSL3 w drugim etapie namierzania. Wykorzystując analizę ChIP-chip stwierdzamy, że mutanty chromodomeny MSL3 zachowują wiązanie z chromatyną ale wykazują wyraźne zakłócenie w pełnym wzorze celowania MSL in vivo, co jest zgodne z utratą rozprzestrzeniania się. Ponadto, w porównaniu do typu dzikiego typu dzikiego, mutantom chromodomeny brakuje preferencyjnego powinowactwa do nukleosomów zawierających H3K36me3 in vitro. Nasze wyniki potwierdzają model, w którym kompleksy aktywujące, podobnie jak ich wyciszające odpowiedniki, wykorzystują wiązanie nukleosomalne specyficzność ich odpowiednich chromodomen do rozprzestrzeniania się z miejsc inicjacji do flankującej chromatyny. --- Koloboma oczna, wady rozwojowe serca, atrezja nozdrzy, opóźnienie wzrostu i/lub rozwoju, hipoplazja narządów płciowych i / lub rozwoju, hipoplazja narządów płciowych i anomalie ucha związane z głuchotą z głuchotą (CHARGE) jest rzadkim, zwykle sporadycznym, autosomalnym dominującym dominujące, spowodowane mutacjami w obrębie genu CHD7 (chromodomain helicase DNA-binding białko 7), w prawie 70% przypadków. Ponieważ ludzki CHD7 jest stosunkowo duży (38 eksonów kodujących białko o masie 300 kDa), analiza genetyczna wymaga opłacalnych i czasochłonnych technik. i czasochłonnych technik. Niniejszym proponujemy alternatywną metodę przesiewową do szybkiego wykrywania mutacji CHD7 przy użyciu głównie denaturującej wysokosprawnej chromatografii cieczowej. chromatografii cieczowej. Cały region kodujący z granicami ekson-intron był amplifikowany w tych samych warunkach eksperymentalnych. amplifikowany w tych samych warunkach eksperymentalnych. Każdy amplikon tego samego regionu CHD7 poddano denaturującej wysokosprawnej chromatografii cieczowej a uzyskane chromatogramy porównano w małych seriach pacjentów. pacjentów. Ponieważ mutacja CHD7 zasadniczo różni się u poszczególnych pacjentów, odpowiadające chromatogramy wykazywały unikalny wzór, który jest znacząco różni się od powszechnych polimorfizmów. Tylko amplikony wykazujące unikalny profil zostały poddane analizie sekwencjonowania DNA. Wewnątrzgenowe rearanżacje zostały zbadane przy użyciu tylko dziewięciu multipleksowych reakcji PCR. Podsumowując, stosując nasz protokół, możemy szybko wykryć odpowiedni amplikon zawierający mutację i zapewniamy solidną, szybką i tańszą metodę badania mikrorearanżacji CHD7 lub całej delecji. całej delecji. --- Rozwój skrzydła Drosophila melanogaster zależy od jego podziału na przednie i tylne przedziały, które stanowią dwie niezależne linie komórkowe linie komórkowe od momentu ich powstania w embrionalnej ektodermie. Przednio-tylna granica przedziału granica przedziałów jest miejscem, w którym odbywa się sygnalizacja przez szlak Hedgehog a to wymaga aktywacji szlaku w komórkach przednich przez ligand wyrażany wyłącznie w komórkach tylnych. Kilka mechanizmów zapewnia ograniczenie ekspresji hedgehog do komórek tylnych, w tym represję przez Cubitus interruptus, korepresor Groucho i Master of thick veins. W tej zidentyfikowaliśmy Kismet, białko zawierające chromodomenę z rodziny ATPaz SNF2-like jako nowy składnik mechanizmu represji transkrypcji hedgehog w komórkach przedniego przedziału w komórkach przedziału przedniego. W mutantach kismet, hedgehog ulega ektopowej ekspresji w domenie przednich komórek w pobliżu w pobliżu granicy przedziału przednio-tylnego, powodując niewłaściwą aktywację szlaku i zmiany w rozwoju centralnej części skrzydła. Udział udział Kismet w wyciszaniu ekspresji hedgehog jest ograniczony do komórek przednich z niskim poziomem formy represorowej Cubitus interruptus. My pokazujemy również, że knockdown CHD8, homologa kismet u Xenopus tropicalis, jest również jest również związane z ektopową ekspresją sonic hedgehog i regulacją w górę jednego z genów jego docelowych genów w oku, Pax2, wskazując na ewolucyjną konserwację funkcji Kismet/CHD8 w negatywnym kontrolowaniu ekspresji jeża. --- Heterochromatyna fakultatywna jest odwracalnie ustanawiana i niszczona podczas różnicowania, ale jej regulacja pozostaje mechanistycznie niejasna. Tutaj pokazujemy, że dwa loci genów mejotycznych w drożdżach rozszczepialnych, mei4 i ssm4, obejmują fakultatywną heterochromatynę, która jest regulowana w sposób zależny od etapu rozwoju. sposób. Ta heterochromatyna koordynuje poziomy ekspresji poprzez asocjację z białkiem chromodomeny Chp1 i czynnikiem antysilencyjnym Epe1. Niedawno wykazano, że wykazano, że maszyneria nadzoru RNA do eliminacji mejotycznych transkryptów genów transkryptów genów mejotycznych, która obejmuje element cis zwany determinantą selektywnego usuwania (DSR) i czynniki transaktywujące, Mmi1 i Red1, również uczestniczą w heterochromatyny w genach mejotycznych, ale mechanizm molekularny leżący u podstaw tego procesu jest w dużej mierze nieznany. Analizując gen mei4, zidentyfikowaliśmy region zidentyfikowaliśmy region, który promuje zależną od DSR metylację lizyny histonu H3 9 (H3K9). Integracja tego regionu mei4 wraz z DSR do niespokrewnionego genu genu skutkuje ektopową metylacją H3K9. Co więcej, nasze wyniki sugerują, że transkrypcja tych elementów indukuje asocjację chromatynową Mmi1, która z kolei z kolei rekrutuje Red1 oddziałujący z metylotransferazą H3K9 Clr4/Suv39h. Mmi1 pozostaje związany w komórkach pozbawionych Red1, co sugeruje, że rekrutacja Red1 podąża za asocjacją chromatyny Mmi1. Ogólnie rzecz biorąc, zapewniamy szczegółowy wgląd w fakultatywną regulację heterochromatyny w drożdżach rozszczepialnych. --- Kompleks polikombinowo-represyjny 1 (PRC1) odgrywa centralną rolę w regulacji dziedzicznego wyciszania genów podczas różnicowania i rozwoju. REKRUTACJA PRC1 jest ogólnie przypisywana interakcji chromodomeny białka rdzeniowego białka rdzeniowego Polycomb z trimetylowym histonem H3K27 (H3K27me3), katalizowanym przez drugi kompleks, PRC2. drugi kompleks, PRC2. Nieoczekiwanie odkryliśmy, że RING1B, podjednostka katalityczna PRC1 i związana z nią monoubikwitylacja histonu H2A są ukierunkowane na ściśle nakładające się miejsca w mysich embrionalnych komórkach macierzystych typu dzikiego i z niedoborem PRC2 (mESC), wykazując niezależną od H3K27me3 ścieżkę rekrutacji aktywności PRC1 aktywność. Pokazujemy, że w szlaku tym pośredniczy RYBP-PRC1, kompleks składający się z katalitycznych podjednostek PRC1 i białka RYBP. RYBP-PRC1 jest rekrutowany do docelowych loci w mESC i jest również zaangażowany w wyciszanie za pośrednictwem Xist RNA, co sugeruje wyciszanie, co sugeruje szerszą rolę w wyciszaniu Polycomb. Omówiliśmy implikacje tych odkryć dla zrozumienia rekrutacji i funkcji represorów represorów Polycomb. --- TŁO I CELE: Chromodomainowa helikaza / adenozynotrifosfataza wiążąca DNA białko 1-podobne (CHD1L) jest czynnikiem transkrypcyjnym podobnym do SNF2 zaangażowanym w rozwój ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (HCC). Sparc/osteonektyna, cwcv, i kazalopodobne domeny proteoglikanu 1 (SPOCK1) są regulowane w górę przez CHD1L; my zbadaliśmy jego rolę w raku wątrobowokomórkowym. METODY: Zbadaliśmy interakcje między SPOCK1 i CHD1L przy użyciu przesunięcia elektroforetycznego i testów reporterowych lucyferazy. Poziomy SPOCK1 RNA (mRNA) i białka zmierzono w próbkach HCC i sąsiednich nienowotworowych tkanek wątroby (135 par) i porównano przy użyciu współczynników korelacji Pearsona Pearsona. Efekty nadekspresji i wyciszenia SPOCK1 określono w liniach komórkowych liniach komórkowych HCC (QGY-7703, PLC-8024, BEL-7402 i QGY-7701). WYNIKI: Białko CHD1L wiązało się bezpośrednio z regionem promotora (nt-1662 do +34) SPOCK1 i aktywowało transkrypcję. Poziomy mRNA i białka SPOCK1 były podwyższone w 60% próbek ludzkiego HCC, w porównaniu z żywymi tkankami nienowotworowymi, i był istotnie związany ze stopniem zaawansowania klinicznego. Poziomy SPOCK1 mRNA były podwyższone wśród guzów, które dały przerzuty, w porównaniu z tymi, które ich nie dały, oraz wśród pacjentów z krótszym czasem przeżycia całkowitego i wolnego od choroby. Ektopowa SPOCK1 w komórkach HCC zwiększała proliferację, tworzenie ognisk i tworzenie kolonii w miękkim agarze. tworzenie kolonii w miękkim agarze; komórki te tworzyły również większe guzy ksenoprzeszczepu, szybciej u nagich myszy niż kontrolne komórki HCC. Wyciszenie ekspresji SPOCK1 za pomocą krótkiej spinki do włosów RNA miało odwrotne skutki. Stwierdziliśmy, że SPOCK1 zapobiega apoptozie komórek HCC poprzez aktywację Akt, w celu zablokowania uwalniania cytochromu c i aktywację kaspazy-9 i kaspazy-3; efekty te zostały odwrócone za pomocą inhibitora Akt inhibitora. Komórki HCC z nadekspresją SPOCK1 wyrażały wyższe poziomy metalopeptydazy macierzy metalopeptydazy 9, były bardziej inwazyjne w testach Matrigel i tworzyły bardziej przerzutowe u myszy z niedoborem odporności niż kontrolne komórki HCC. WNIOSKI: CHD1L aktywuje ekspresję SPOCK1, który aktywuje sygnalizację Akt w celu zablokowania apoptozy i inwazji komórek HCC w hodowli i u myszy. Poziomy SPOCK1 wzrasta wraz z progresją ludzkiego HCC. SPOCK1 może być stosowany jako czynnik prognostyczny lub cel terapeutyczny. --- Białka zawierające określone moduły rozpoznawania pośredniczą w odczycie i translacji modyfikacji histonów. Uważa się, że czynniki te inicjują zdarzenia sygnalizacyjne regulujące strukturę i funkcję chromatyny. Zidentyfikowaliśmy CDYL1 jako partnera interakcji trimetylowanego histonu H3 na lizynie 9 (H3K9me3). CDYL1 należy do rodziny czynników chromodomenowych występujących u kręgowców. kręgowców. Pokazujemy, że trzy różne warianty splicingu CDYL1, a, b i c, są różnie wyrażane w różnych tkankach, przy czym CDYL1b jest najbardziej obficie występującym wariantem. Chociaż wszystkie trzy warianty splicingu mają wspólny C-końcowy fragment domenę podobną do hydratazy enoilo-CoA, tylko CDYL1b zawiera funkcjonalną chromodomenę zaangażowaną w wiązanie H3K9me3. Zdarzenie splicingu wprowadzające N-końcowe rozszerzenie na początku chromodomeny CDYL1a inaktywuje jej chromodomenę. chromodomenę. CDYL1c w ogóle nie zawiera chromodomeny. Chociaż CDYL1b wykazuje powinowactwo wiązania do reszt metylo-lizyny w różnych sekwencjach kontekście podobnym do chromodomen w innych czynnikach chromatynowych, wykazujemy, że interakcja chromodomeny CDYL1b/H3K9me3 jest konieczna, ale niewystarczająca dla asocjacji czynnika z heterochromatyną. Rzeczywiście, multimeryzacja białka przez domenę podobną do hydratazy enoilo-CoA jest niezbędna do wiązania chromatyny H3K9me3 in vitro i lokalizacji heterochromatyny in vivo. W zgodnie, nadekspresja CDYL1c, która może multimeryzować, ale nie oddziałuje z H3K9me3 może wyprzeć CDYL1b z heterochromatyny. Nasze wyniki sugerują, że multimeryczne wiązanie z H3K9me3 przez homomeryczne kompleksy CDYL1b jest niezbędne dla skutecznego ukierunkowania chromatyny. Sugerujemy, że podobne wiązanie wielowartościowe stabilnie kotwiczy inne czynniki wiążące modyfikacje histonów w ich docelowych regionach chromatyny. regionach chromatyny. --- Genetyczna delecja lub mutacje genów preseniliny (PS1/PS2) powodują rodzinną chorobę Alzheimera i zaburzenia sygnalizacji wapniowej (Ca²z). chorobę Alzheimera i zaburzenia sygnalizacji wapniowej (Ca²⁺). PS1/PS2 działają jako retikulum endoplazmatycznego (ER), które ułatwiają bierny wyciek Ca²⁺ przez błonę ER. przez błonę ER. Badania przeprowadzone na mysich fibroblastach embrionalnych z podwójnym nokautem PS1/PS2 (PS1/PS2-DKO) wykazały, że PS1/PS2 były odpowiedzialne za 80% biernego wycieku Ca²⁺ z błony ER. Ca²⁺ ze światła retikulum endoplazmatycznego do cytozolu. Transfekcja przejściowa transfekcja konstruktu ekspresyjnego PS1 typu dzikiego zwiększyła cytoplazmatyczny Ca²⁺ w wyniku wycieku Ca²⁺ przez błonę ER, podczas gdy konstrukt FADPS1 (PS1-M146V) konstrukt mutacji sam lub w połączeniu z ekspresją PS1 typu dzikiego w komórkach SK-N-SH znosiły wyciek Ca²⁺. Zahamowanie podstawowego c-jun-NH2-końcowej kinazy (JNK) przez inhibitor JNK SP600125 tłumiło transkrypcję PS1 i ekspresję białka PS1 przez transkrypcję i ekspresję białka PS1 poprzez zwiększenie poziomu białka p53 w komórkach SK-N-SH (Lee i Das 2008). W tym raporcie wykazaliśmy również, że represja transkrypcji PS1 przez inhibitor JNK SP600125 hamowała bierny wyciek Ca²⁺ przez błonę ER, który można było przywrócić. przez błonę ER, który można uratować przez ekspresję PS1 typu dzikiego, a nie przez ekspresję FADPS1 (PS1-M146V) pod promotorem niereagującym na SP600125. Leczenie komórek SK-N-SH za pomocą SP600125 wyzwalało również za pośrednictwem InsP3R uwalnianie Ca²⁺ z ER przez dodanie 500 nM bradykininy, agonisty receptora InsP3 (InsP3R1) bez zmiany ekspresji InsP3R1. Dane te potwierdzają, że SP600125 zwiększa magazyn Ca²⁺ w ER poprzez hamowanie PS1-pośredniczy w wycieku Ca²⁺ przez błonę ER. p53, ZNF237 i helikaza chromodomenowa białko wiążące DNA 3, które są represorami transkrypcji PS1, również zmniejszyły przeciek Ca²⁺ przez błonę ER w komórkach SK-N-SH, ale inhibitor γ-sekretazy lub dominujący ujemny mutant PS1 specyficzny dla γ-sekretazy (PS1-D257A) nie miał znaczącego efektu. Dlatego p53, ZNF237 i białko 3 wiążące DNA helikazy chromodomenowej hamują funkcję kanałów wycieku ER Ca²⁺, regulując zarówno poziomy ER, jak i cytoplazmatyczne Poziomy Ca²⁺ i mogą potencjalnie kontrolować funkcję sygnalizacji Ca²⁺ PS1. --- Fluorescencyjne znakowanie chromatyny przez system operatora lacO / represora lac w Arabidopsis thaliana jest przydatne do śledzenia różnych domen chromatyny w żywych komórkach komórkach. Niemniej jednak, tandemowe powtórzenia systemu znakowania mogą zmieniać przestrzenną organizację chromatyny w jądrach poprzez zwiększenie parowania homologicznego jak również asocjację z heterochromatyną. Wydajne parowanie homologiczne występuje jeśli tablice powtórzeń lacO ∼10 kb są obecne w dwóch loci, albo na tym samym chromosomie, albo na różnych chromosomach. chromosomie lub na różnych chromosomach. Hipometylacja DNA powtórzeń lacO skutkuje zmniejszonym parowaniem homologicznym. Ponieważ w roślinach metylacja DNA może służyć jako sygnał dla H3-lizyny9-dimetylacji (H3K9me2), a następnie dla metylacji DNA w kontekście innym niż CG, metylotransferazy histonów domeny SET i mutacje metylotransferazy DNA domeny SET i chromodomeny 3 (cmt3). W suvh4 suvh5 suvh6 i cmt3 mutanty, H3K9me2 związane z powtórzeniami lacO jest zmniejszona, ale parowanie homologiczne utrzymuje się. Tak więc ani H3K9me2, ani CMT3 nie są wymagane na poziomie typu dzikiego do homologicznego parowania powtórzeń lacO. parowania loci powtórzeń lacO. --- Białko heterochromatyny 1 (HP1a) jest dobrze znanym konserwatywnym białkiem zaangażowanym w tworzenie heterochromatyny i wyciszanie genów. tworzenie heterochromatyny i wyciszanie genów u różnych gatunków, w tym ludzi. Zaproponowano ogólny model tworzenia heterochromatyny i epigenetycznego wyciszania genów u różnych gatunków. epigenetycznego wyciszania genów u różnych gatunków, który sugeruje istotną rolę dla HP1a. Zgodnie z tym modelem, enzymy metylotransferazy histonów (HMTazy) metylują histon H3 przy lizynie 9 (H3K9me), tworząc selektywne miejsca wiązania dla siebie i chromodomeny HP1a. Uważa się, że kompleks ten tworzy stan chromatyny wyższego rzędu, który hamuje aktywność genów. Stwierdzono również, że że HP1a odgrywa rolę w ograniczaniu telomerów. Co zaskakujące, ostatnie badania wykazały, że HP1a jest obecny w wielu miejscach euchromatycznych wzdłuż chromosomów polietylenowych chromosomów Drosophila melanogaster, w tym rozwojowych i wywołane szokiem termicznym, i że białko to może być usunięte z tych miejsc przez leczenie RNazą in vivo, sugerując w ten sposób związek HP1a z transkryptami wielu aktywnych genów. Aby przetestować tę sugestię, przeprowadziliśmy rozległe badanie przesiewowe za pomocą testu RIP-chip (immunoprecypitacja RNA na mikromacierzach), i odkryliśmy, że HP1a jest związany z transkryptami ponad stu genów euchromatycznych. genów euchromatycznych. Analiza ekspresji w mutantach HP1a pokazuje, że HP1a jest wymagana do pozytywnej regulacji tych genów. Testy cytogenetyczne i molekularne molekularne pokazują, że HP1a oddziałuje również z dobrze znanymi białkami DDP1, HRB87F, i PEP, które należą do różnych klas heterogenicznych jądrowych rybonukleoprotein jądrowych (hnRNP) zaangażowanych w przetwarzanie RNA. Co zaskakujące, odkryliśmy że wszystkie te białka hnRNP również wiążą heterochromatynę i są dominującymi dominującymi supresorami zmienności efektu pozycji. Łącznie nasze dane pokazują nowe i nieoczekiwane funkcje dla białek HP1a i hnRNP. Wszystkie te białka są zaangażowane zarówno w przetwarzanie transkryptów RNA, jak i w tworzenie heterochromatyny. tworzenie heterochromatyny. Sugeruje to, że ogólnie rzecz biorąc, podobne mechanizmy epigenetyczne mają znaczącą rolę zarówno w metabolizmie RNA, jak i heterochromatyny. --- Aby zapewnić stabilność genomu, komórki rozwinęły solidny mechanizm obronny do wykrywania, sygnalizowania i naprawy uszkodzonego DNA, które jest generowane przez egzogenne stresory takie jak promieniowanie jonizujące, stresory endogenne, takie jak wolne rodniki, lub normalne procesy fizjologiczne, takie jak replikacja DNA. Homologiczna rekombinacja (HR) jest krytycznym szlakiem naprawy podwójnych pęknięć nici DNA i odgrywa istotną rolę w utrzymaniu genomu. odgrywa istotną rolę w utrzymaniu integralności genomu. Poprzednie badania wykazały, że BRIT1, znany również jako MCPH1, jest kluczowym regulatorem naprawy HR. Tutaj że białko wiążące DNA 4 (CHD4) jest nowym partnerem wiążącym BRIT1, który reguluje naprawę HR. które reguluje proces naprawy HR. C-końcowe domeny BRIT1 BRIT1 są wymagane do jego interakcji z CHD4. Pozbawienie CHD4 i nadekspresja nieaktywnej ATPazowo formy CHD4 upośledza rekrutację BRIT1 do uszkodzeń DNA. W konsekwencji funkcjonalnej, niedobór CHD4 uwrażliwia komórki na czynniki indukujące pęknięcia dwuniciowe, zmniejsza rekrutację czynnika naprawy HR czynnika naprawy HR BRCA1 i upośledza wydajność naprawy HR. Ponadto wykazać, że komórki pozbawione CHD4 są bardziej wrażliwe na leczenie inhibitorem polimerazy poli(ADP-rybozy) leczenie inhibitorem polimerazy. W odpowiedzi na uszkodzenia DNA indukowane przez inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy), niedobór CHD4 upośledza rekrutację białek naprawy DNA BRIT1, BRCA1 i białka replikacyjnego A na wczesnych etapach naprawy HR. naprawy HR. Podsumowując, nasze odkrycia wskazują na ważną rolę CHD4 w kontrolowaniu naprawy HR w celu utrzymania stabilności genomu i ustalenia potencjalnych terapeutyczne implikacje celowania w niedobór CHD4 w nowotworach. --- MSL3 znajduje się w kompleksie MSL (male-specific lethal), który reguluje w górę transkrypcję poprzez rozprzestrzenianie znaku acetylowego histonu H4 Lys16 (H4K16). My odkryliśmy zależną od DNA interakcję chromodomeny MSL3 z monometylowym znacznikiem H4K20 znak monometylowy. Struktura trójskładnikowego kompleksu pokazuje, że rowek mniejszy DNA DNA mieści ogon histonu H4, a monometylolizyna wstawia się do czteropozostałościową klatkę aromatyczną w MSL3. Acetylacja H4K16 antagonizuje wiązanie MSL3, sugerując, że funkcja MSL jest regulowana przez kombinację modyfikacji potranslacyjnych modyfikacji. --- Powtórzenia tandemowe występują zarówno w kodujących, jak i niekodujących sekwencjach wyższych organizmów. Sekwencje te mogą być wykorzystywane w genetyce i diagnostyce nowotworów w celu odkryć genetyczne podstawy powstawania i progresji nowotworów. W tym badaniu zbadano możliwy związek między dystrybucją SSR a rakiem płuc został zbadany przez analizę porównawczą EST-SSR w tkankach prawidłowych i nowotworowych płuc. Podczas gdy rozkład EST-SSR był podobny między tkankami nowotworowymi, rozkład ten był różnił się między tkankami prawidłowymi i nowotworowymi. Powtórzenia tandemowe trinukleotydów były bardzo różne; liczba trinukleotydów w EST raka płuc była 3 razy wyższa niż w tkance prawidłowej. Znacząca ujemna korelacja między tkanką a tkanką nowotworową wykazała, że tkanka nowotworowa generuje różne rodzaje trinukleotydów. GGC i CGC były częściej wyrażanymi trinukleotydami w tkance nowotworowej. w tkance nowotworowej, ale te SSR nie ulegały ekspresji w normalnej tkance. Podobny do poziom EST, wzór ekspresji aminokwasów pochodzących z EST-SSR był znacząco różnił się między tkankami prawidłowymi i nowotworowymi. Arg, Pro, Ser, Gly i Lys były najbardziej rozpowszechnionymi aminokwasami w tkankach nowotworowych, a Leu, Cys, Phe i His były znacznie bardziej obfite w tkankach prawidłowych niż w tkankach nowotworowych. tkankach nowotworowych. Następnie przeanalizowano przypuszczalne funkcje genów zawierających triplet SSR zostały przeanalizowane. W tkance nowotworowej geny EST-SSR wytwarzają różne rodzaje białek. białka. Białka wiążące DNA helikazy chromodomenowej były jednym z głównych produktów białkowych produktów białkowych EST-SSR w bibliotece nowotworowej, podczas gdy białka te nie były nie były produkowane z EST-SSR w normalnej tkance. Po raz pierwszy wyniki badania potwierdziły, że EST-SSR w prawidłowych tkankach płuc są inne niż w tkankach niezdrowych. niezdrowych tkankach, a znakowane EST z SSR powodują znaczące różnice we wzorcach ekspresji aminokwasów i białek w aminokwasów i białek w tkance nowotworowej. Sugerujemy, że EST-SSR i EST-SSR różnie wyrażane w tkance nowotworowej mogą być odpowiednimi markerami kandydującymi do diagnozowania i przewidywania raka płuc. --- TŁO I CEL: Korzeń zęba jest jedną z krytycznych części dla utrzymania funkcji zęba; jednak molekularne mechanizmy rozwoju korzenia pozostają nieznane. Naszym celem było zidentyfikowanie specyficznych czynników morfogenezy korzenia przy użyciu nowo opracowanego systemu eksperymentalnego. MATERIAŁ I METODY: Wstępne cementoblasty i komórki więzadeł przyzębia z zębów trzonowych żuchwy myszy zostały wyizolowane przy użyciu mikrodysekcji laserowej. Oddzielnie wychwycono ponad 500 cementoblastów i komórek więzadeł przyzębia. oddzielnie. Po ekstrakcji i amplifikacji RNA, ekspresję mRNA w wyizolowanych cementoblastów porównano z ekspresją komórek więzadeł przyzębia za pomocą analizy mikromacierzy cDNA za pomocą analizy mikromacierzy cDNA. Następnie, przypuszczalne geny specyficzne dla cementoblastów zostały poddane analizie hybrydyzacji in situ w celu potwierdzenia wyników w żuchwie myszy. WYNIKI: Około 2000 genów ulegało różnej ekspresji między tymi tkankami. tkankami. Wśród tych genów, helikaza palca cynkowego (ZFH), określana również jako białko wiążące chromodomainę-helikazę-DNA 3 (Chd3), było jednym z wysoce transkryptów w cementoblastach. Hybrydyzacja in situ ujawniła że ZFH/Chd3 ulegał silnej ekspresji w nabłonkowej osłonce korzenia Hertwiga, a nie w cemencie. niż w cemencie. Co więcej, jego ekspresja zanikała, gdy tworzenie korzenia było w pierwszym zębie trzonowym. W przeciwieństwie do tego, Chd3 ulegał ciągłej ekspresji w komórkach nabłonka komórkach nabłonka szyjki zęba, w których przedłużenie korzenia nigdy nie jest zakończone. nigdy nie jest zakończone. WNIOSEK: Wyniki te sugerują, że ZFH/Chd3 może odgrywać ważną rolę w rozwoju korzenia zęba i późniejszej cementogenezie. rozwoju korzenia zęba i późniejszej cementogenezie. --- Metylacja lizyny histonowej jest krytycznym markerem kontrolującym ekspresję genów. Pozycja i zakres metylacji (mono-, di- lub tri-) kontroluje wiązanie białek efektorowych wiązanie białek efektorowych, które określają, czy powiązane DNA jest DNA ulega ekspresji. Dysregulacja metylacji białek histonowych została z wieloma rodzajami nowotworów, a rozwój inhibitorów dla białek efektorowych białek efektorowych staje się aktywnym obszarem badań. Z tego powodu, zrozumienie mechanizmu, dzięki któremu białka efektorowe uzyskują selektywność dla różnych stanów metylacji lizyny jest bardzo interesujące. W tym celu przeprowadziliśmy badania mutacji chromodomeny HP1α Drosophila, która wiąże H3K9Me(2). H3K9Me(2) i H3K9Me(3) z mniej więcej równym powinowactwem. Selektywność HP1α dla H3K9Me(3) nad H3K9Me(2) zbadano poprzez mutację E52 w celu usunięcia lub osłabienia wiązania wodorowego do K9Me(2) przy jednoczesnym zachowaniu powinowactwa do K9Me(3), w tym E52F, E52I, E52V, E52D i E52Q. Mutant E52Q wykazywał największy stopień selektywności dla KMe3, z 3,5-krotnie słabszym wiązaniem do dimetylowanym peptydem (K(D) =52 μM) w porównaniu do trimetylowanego peptydu (K(D) =15 μM). Badania te zapewniają wgląd w rolę oddziaływań elektrostatycznych oddziaływań elektrostatycznych i wiązań wodorowych w różnicowaniu stanów metylacji i mają implikacje dotyczące ewolucyjnej presji na selektywność w tej interakcji białko-białko. tej interakcji białko-białko. Co więcej, informacje z tego badania mogą pomóc w opracowaniu inhibitorów dla tej klasy białek. --- Fosforylacja białka heterochromatyny 1 (HP1) została wcześniej opisana w badaniach na ssakach, ale biologiczne implikacje tej modyfikacji pozostają w dużej mierze nieuchwytne. Tutaj pokazujemy, że N-końcowa fosforylacja fosforylacja HP1α odgrywa centralną rolę w jego ukierunkowaniu na chromatynę. Rekombinowany HP1α przygotowany z hodowanych komórek ssaków wykazywał silniejsze powinowactwo wiązania do K9-metylowanego histonu H3 (H3K9me) niż ten wytwarzany w Escherichia coli. Analizy biochemiczne wykazały, że HP1α był wielokrotnie fosforylowany na N-końcowych resztach serynowych (S11-14) w komórkach ludzkich i mysich i że ta fosforylacja zwiększa powinowactwo HP1α do H3K9me. Co ważne, N-końcowa fosforylacja wydaje się ułatwiać początkowe wiązanie HP1α do H3K9me poprzez pośredniczenie w interakcji między HP1α a częścią ogona H3 która różniła się od metylowanego ogona K9. Niefosforylujący mutant HP1α wykazywał poważne defekty lokalizacji heterochromatyny in vivo, a jego przedłużona ekspresja ekspresja prowadziła do zwiększonej niestabilności chromosomalnej. Nasze wyniki sugerują, że N-końcowa fosforylacja HP1α jest niezbędna do prawidłowego ukierunkowania na heterochromatyny i że jego wiązanie z metylowanym ogonem histonowym jest osiągane przez kooperatywne działanie chromodomeny i sąsiednich modyfikacji potranslacyjnych. modyfikacji potranslacyjnych. --- Białka remodelujące chromatynę odgrywają kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu i rozwoju komórek. rozwój, katalizując zmiany konformacyjne w DNA, które ostatecznie skutkują zmiany we wzorcach ekspresji genów. Białko wiążące DNA helikazy chromodomenowej 4 (CHD4), definiująca podjednostka kompleksu remodelującego i deacetylazy nukleosomów (NuRD), jest nukleosomem. kompleks, jest białkiem remodelującym nukleosomy z rodziny SNF2/ISWI2, której członkowie które zawierają dwie domeny chromosomowe i zależny od ATP moduł helikazy. CHD3, CHD4 i CHD5 zawierają również dwie sąsiadujące domeny PHD i mają rozszerzony N-końcowy region, który nie został wcześniej scharakteryzowany. Zidentyfikowaliśmy stabilną domenę w regionie N-końcowym CHD4 i przedstawiliśmy tutaj szkielet i przypisania rezonansu łańcucha bocznego dla tej domeny przy pH 7,5 i 25 ° C (BMRB Nr 18906). --- Wydajność transkrypcji w locus genomowym u eukariontów jest określana, częściowo częściowo przez wzór modyfikacji histonów, które są odczytywane i interpretowane przez kluczowe białka efektorowe. Aktywność deacetylazy histonowej ewolucyjnie konserwowanego białka kompleksu Rpd3S/Sin3S jest kluczowa dla tłumienia nieprawidłowej transkrypcji z kryptycznych miejsc startu w regionach intragenicznych aktywnie transkrybowanych genów. aktywnie transkrybowanych genów. Precyzyjne ukierunkowanie kompleksu zależy od aktywności wiązania chromatyny MRG15 (MRG oznacza czynnik śmiertelności związany z chromosomem 4) i podjednostki Pf1. gene) i podjednostki Pf1. Podczas gdy cel molekularny chromodomeny MRG15 (CD) sugeruje się, że jest nim H3K36me(2/3), dokładny cel molekularny podjednostki Pf1 roślinnej homeodomeny 1 (PHD1) pozostał nieuchwytny. Tutaj pokazujemy, że Pf1 PHD1 wiąże się preferencyjnie z niezmodyfikowanym skrajnym N-końcem histonu H3 (H3K4me(0)), ale nie do H3K4me(2/3), które są wzbogacone w promotor i regiony 5' regionów genów. W przeciwieństwie do wcześniej scharakteryzowanych domen CD i PHD, które wiążą się do swoich celów z powinowactwem mikromolarnym, zarówno MRG15 CD, jak i Pf1 PHD1 wiążą się z z powinowactwem >100 μM, oferując wyjaśnienie, dlaczego zarówno domeny MRG15 CD i Pf1 PHD1 są wymagane do ukierunkowania kompleksu Rpd3S/Sin3S na chromatyny. Nasze wyniki sugerują również, że dwuwartościowość, a nie kooperatywność, jest mechanizmem operacyjnym, za pomocą którego Pf1 i MRG15 łączą się, aby zaangażować H3 w biologicznie znaczący sposób. Wreszcie, badania ujawniają nieoczekiwaną rolę rolę Pf1 PHD1 w angażowaniu domeny MRG15 MRG, aczkolwiek w domenie Pf1 MRG w sposób zależny od domeny wiążącej MRG, co sugeruje kluczową rolę interakcji MRG15 MRG-Pf1 MBD w ukierunkowaniu chromatyny kompleksu Rpd3S/Sin3S. --- Znajomość domen białkowych, które funkcjonują jako biologiczne efektory dla różnorodnych potranslacyjnych modyfikacji histonów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób ustanawiane są programy jądrowe i epigenetyczne. Rzeczywiście, mutacje domen efektorowych chromatyny występujące w kilku białkach są związane z wieloma ludzkimi patologiami, w tym rakiem i zespołami zespołami niedoboru odporności. Do tej pory zidentyfikowano stosunkowo niewiele domen efektorowych w porównaniu do liczby modyfikacji obecnych na histonach i białkach niehistonowych. białkach niehistonowych. Tutaj opisujemy generowanie i zastosowanie ludzkich zmodyfikowanych mikromacierzy peptydowych jako platformy do wysokoprzepustowego odkrywania efektorów chromatyny i do analizy swoistości epitopowej przeciwciał powszechnie wykorzystywanych w badaniach chromatyny. Badanie przesiewowe z biblioteką zawierającą większość domen rodziny królewskiej obecnych w ludzkim proteomie doprowadziło do odkrycia TDRD7, JMJ2C i MPP8 jako trzech nowych zmodyfikowanych białek wiążących histony. Zatem, proponujemy, aby metodologie mikromacierzy peptydowych były nowym, potężnym narzędziem do wyjaśniania interakcji molekularnych w chromatynie. --- Chociaż uważa się, że regulacja metylacji histonów przyczynia się do samoodnowy embrionalnych komórek macierzystych (ESC), mechanizmy pozostają niejasne. Pokazujemy że demetylaza trimetylo lizyny 4 histonu H3 (H3K4me3), KDM5B, jest celem Nanog i ma krytyczne znaczenie dla samoodnowy ESC. Nanog i ma krytyczne znaczenie dla samoodnowy ESC. Chociaż KDM5B jest KDM5B funkcjonuje jako represor związany z promotorem, okazuje się, że paradoksalnie paradoksalnie działa jako aktywator sieci genów związanych z samoodnową. samoodnową. ChIP-Seq ujawnia, że KDM5B jest głównie ukierunkowany na regiony regionów intragenicznych i że jest rekrutowany do H3K36me3 poprzez interakcję z białkiem chromodomeny MRG15. Zubożenie KDM5B lub MRG15 zwiększa wewnątrzgenowe H3K4me3, zwiększa kryptyczną transkrypcję intrageniczną i hamuje wydłużenie transkrypcji genów docelowych KDM5B. Proponujemy, aby KDM5B aktywuje ekspresję genów związanych z samoodnową poprzez tłumienie kryptycznej inicjację i utrzymywanie gradientu H3K4me3 ważnego dla produktywnej wydłużania transkrypcji. --- CELE: Białko wiążące DNA helikazy chromodomenowej (CHD) jest regulatorem procesu remodelowania chromatyny. procesu przebudowy chromatyny. Celem pracy było określenie statusu mutacyjnego CHD1, CHD2, CHD3, CHD1, CHD2, CHD3, CHD4, CHD7, CHD8 i CHD9 w raku żołądka i jelita grubego. i raka jelita grubego z niestabilnością mikrosatelitarną (MSI). METODY I WYNIKI: Powtórzenia zostały określone w 28 rakach żołądka (GC) z wysokim MSI (MSI-H), 45 GC z niskim MSI (MSI-L)/stabilnym MSI (MSS), 35 raka jelita grubego (CRC) z MSI-H i 45 CRC z MSI-L/MSS za pomocą analizy polimorfizmu konformacji jednoniciowej analiza polimorfizmu konformacji pojedynczej nici. Ekspresja CHD4 i CHD8 została również zbadana w GC i CRC za pomocą immunohistochemii. Mutacje CHD1, CHD2, CHD3, CHD4, CHD7, CHD8 i CHD9 stwierdzono odpowiednio w pięciu, 19, trzech, pięciu, siedmiu, 10 i siedmiu nowotworach, odpowiednio. Wykryto je w nowotworach MSI-H, ale nie w nowotworach MSI-L/MSS. Utratę ekspresji CHD4 zaobserwowano w 56,4% GC i 55,7% CRC, a utratę CHD8 zaobserwowano w 35,7% GC i 28,6% CRC. Nowotwory nowotwory z mutacjami CHD4 i CHD8 wykazywały utratę ekspresji CHD4 i CHD8, odpowiednio. WNIOSKI: Mutacja Frameshift i utrata ekspresji genów CHD są powszechne w GC i CRC z MSI-H. Zmiany te mogą przyczyniać się do patogenezy raka poprzez deregulację patogenezy raka poprzez deregulację remodelowania chromatyny za pośrednictwem CHD. --- Somitogeneza jest złożonym procesem podczas wczesnego rozwoju kręgowców, obejmującym interakcje między wieloma czynnikami w celu utworzenia dwustronnej serii somitów. Rola remodelerów remodelerów chromatyny w somitogenezie nie została jeszcze wykazana. Tutaj zbadać funkcję białka wiążącego DNA helikazy chromodomenowej 7 (chd7) podczas somitogenezy danio pręgowanego. Pokazujemy, że niedobór Chd7 prowadzi do asymetrycznej segmentacji mezodermy presomitycznej (PSM), co ujawnia ekspresja genów somitogenezy, cd genów somitogenezy, cdx1a, dlc, her7, mespa i ripply1. Co więcej, pokazujemy że abrogacja Chd7 powoduje utratę asymetrycznej ekspresji spaw w mezodermie bocznej płytki mezodermie płytki bocznej, co jest zgodne z bardziej ogólnymi wadami lateralności. wady. Na podstawie obserwacji, że niewystarczająca ilość Chd7 prowadzi do wad asymetrii lewo-prawo wady asymetrii podczas segmentacji PSM, a ponieważ CHD7 został powiązany z ludzkimi deformacjami kręgosłupa, sugerujemy, że morfanty zebrafish chd7 mogą być dobrym modelem in vivo do badania patofizjologii tych chorób. --- Duża część genomu eukariotycznego jest upakowana w transkrypcyjnie cichej heterochromatyny. Zidentyfikowano kilka czynników, które odgrywają ważną rolę podczas podczas tworzenia i utrzymywania tej skondensowanej formy. Metylacja lizyny 9 w histonie H3 i późniejsze wiązanie białka heterochromatyny białka heterochromatyny 1 (HP1) są uważane za inicjujące tworzenie heterochromatyny tworzenie heterochromatyny in vivo i propagację stanu heterochromatycznego trwający przez kilka podziałów komórkowych. W niniejszym badaniu przeanalizowaliśmy wiązanie HP1 do metylowanej chromatyny w pełni zrekonstruowanym systemie. W przeciwieństwie do silnego wiązania z metylowanymi peptydami, HP1 wiąże się tylko słabo z metylowaną chromatyną. metylowaną chromatyną. Jednak dodanie rekombinowanego białka SU(VAR), takiego jak ACF1 lub SU(VAR)3-9, ułatwia wiązanie HP1 do chromatyny metylowanej lizyną 9 w obrębie H3 N terminus (H3K9). Proponujemy, aby HP1 miał wiele miejsc docelowych które przyczyniają się do jego rozpoznawania chromatyny, tylko jeden z nich jest metylowane w H3K9. Odkrycia te mają wpływ na mechanizmy rozpoznawania specyficznych modyfikacji chromatyny in vivo. --- Ssak Mi-2, autoantygen zapalenia skórno-mięśniowego, jest czynnikiem remodelującym nukleosomy zależnym od adenozynotrifosforanu (ATP). zależnym od adenozynotrifosforanu (ATP) czynnikiem remodelującym nukleosomy. Homolog Drosophila homolog genu Mi-2 (dMi-2) znajduje się w 76D5-6 na lewym ramieniu trzeciego chromosomu i jest transkrybowany do chromosomie i jest transkrybowany na dwa alternatywne transkrypty (dMi-2a i dMi-2b). Oba transkrypty są obecne na wysokim poziomie w jajniku i podczas pierwszych 8 godzin embriogenezy, gdy są wykrywane przez analizę Northern blot. Lokalizacja lokalizacja białka była jądrowa, co jest zgodne z jego proponowaną funkcją jako składnik kompleksu remodelującego chromatynę. Kilka linii recesywnych mutantów, w tym mutacji w dMi-2, zostało wyizolowanych i sklasyfikowanych do cztery różne grupy komplementacyjne. Cztery allele mutantów dMi-2 zostały dalej scharakteryzowane pod względem molekularnym; stwierdzono, że dMi-2(BL1) ma mutację mutację w motywie wiążącym ATP domeny ATPazy, dMi-2(BL7) w rdzeniu histydyny pierwszego roślinnego palca cynkowego homeodomeny i dMi-2(BL12) w konserwowanej serynie w chromodomenie. konserwowanej serynie w chromodomenie. Z drugiej strony, dMi-2(BL3) nie miał żadnych zmian w regionie kodującym. Wzór ekspresji dMi-2 i fenotypy zarodkowe letalne fenotypy mutantów wskazują, że dMi-2 jest niezbędny do rozwoju embrionalnego u Drosophila melanagaster. --- Integracja kopii DNA w genomie gospodarza jest niezbędnym etapem w cyklu życia retrowirusów. retrowirusów i retrotranspozonów LTR. Nadal nie ma jasnego zrozumienia specyficzności integracji retroelementów do miejsca docelowego. Uważa się, że wybór docelowego DNA może potencjalnie wpływać na szereg czynników, takich jak status transkrypcyjny, asocjacja z histonami i innymi białkami wiążącymi DNA oraz białkami wiążącymi DNA i zginanie DNA. Autorzy przeprowadzili kompleksową komputerową analizę specyficzności integracji Drosophila melanogaster LTR-retrotranspozonów i retrowirusów, w tym analizę składu nukleotydów nukleotydów, sekwencji terminalnych LTR i sekwencji integrazy. A klasyfikację LTR-retrotranspozonów opartą na specyficzności integracji. integracji. Wszystkie LTR-retrotranspozony z grupy cygańskiej z trzema otwartymi ramkami (errantiwirusy) zostały sklasyfikowane jako LTR-retrotranspozony. ramkami (errantiwirusy) i ich pochodne z dwiema otwartymi ramkami wykazują ścisłą specyficzność w stosunku do docelowej selekcji DNA. Taka specyficzność koreluje z cechami strukturalnymi docelowego DNA: podatnością na zginanie, A-filowością lub odkształcalność indukowana białkami. Pozostałe retrotranspozony LTR (grupy copia i BEL blastopia i 412 podgrup grupy cygańskiej) nie wykazują specyficzności integracji. integracji. Chromodomena jest obecna w strukturach integrazy blastopii i 412 podgrupy LTR-retrotranspozonów i może ułatwiać proces niespecyficznej integracji. niespecyficznej integracji. --- W kompensacji dawki u Drosophila pośredniczą geny znane jako "specyficzne dla samców lethals" (msls). Kilka msls, w tym specyficzny dla samców lethal-3 (msl-3), koduje białka o nieznanej funkcji. Sklonowaliśmy gen msl-3 Drosophila virilis. Używając informacje dostarczone przez sekwencje genów Drosophila melanogaster i D. virilis, odkryliśmy, że sekwencje innych gatunków mogą być dopasowane na całej długości do msl-3. na całej długości z msl-3. Wśród nich są geny drożdży (geny Schizosaccharomyces pombe Alp13, a także domniemany homolog Alp13, występujący u Saccharomyces cerev w Saccharomyces cerevisae) i u ssaków (MRG15 i MSL3L1 oraz ich i ich krewnych) oraz niescharakteryzowane sekwencje nicienia Caenorhabditis elegans oraz roślin Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum i Zea mays. A Znaleziono również drugi gen Drosophila z tej rodziny. Jest zatem prawdopodobne, że że geny podobne do msl-3 są obecne u wszystkich eukariontów. Analizy filogenetyczne sugerują, że msl-3 jest ortologiem genów MSL3L1 ssaków, podczas gdy drugi gen Drosophila melanogaster (który nazwaliśmy Dm MRG15) jest ortologiem ortologiczny do MRG15 ssaków. Analizy te sugerują również, że duplikacja msl-3/MRG15 nastąpiła po podziale grzyb/zwierzę, podczas gdy niezależna duplikacja duplikacja nastąpiła u roślin. Białka kodowane przez te geny mają podobne struktury, w tym struktury, w tym domniemaną chromodomenę w pobliżu ich N-końcowego końca i domniemany suwak leucynowy na ich C-końcu. Omówiono możliwe role funkcjonalne tych białek. --- Kontrolowanie ekspresji genów determinujących losy komórek jest kluczem do różnicowania komórek macierzystych różnicowania komórek macierzystych, regeneracji tkanek i terapii nowotworów. Do tej pory niestandardowe czynniki transkrypcyjne rozpoznają informacje zakodowane w określonych sekwencjach DNA sekwencjach DNA. Białka chromatyny ulegają kowalencyjnym modyfikacjom i tworzą kompleksy które kodują drugą warstwę informacji, która określa proksymalną aktywność genów. aktywność. Tutaj stosujemy nowe podejście do celowania w geny, które wykorzystuje specyficzną modyfikację chromatyny w celu reaktywacji wyciszonych loci w ludzkich komórkach. My wykorzystaliśmy ludzkie białko chromatyny Polycomb i homologi innych gatunków do skonstruować modułowe syntetyczne czynniki transkrypcyjne, zwane Pc-TF, które rozpoznają represyjny sygnał lizyny 27 trimetylo-histonu H3 (H3K27me3) i przełączają wyciszone geny do stanu aktywnego. Ekspresja Pc-TF w komórkach kostniakomięsaka U2OS prowadzi do zwiększonej transkrypcji locus senescencji CDKN2A (p16) i innych loci w chromodomenie loci w sposób zależny od chromodomeny i modułu aktywacyjnego, przejście do fenotypu fenotyp senescencji i zmniejszoną proliferację komórek. Wyniki te wskazują że wyciszone regulatory rozwojowe mogą być reaktywowane przez syntetyczny czynnik transkrypcyjny, który oddziałuje raczej z chromatyną niż DNA, co skutkuje zmieniony stan komórki. Jako taka, nasza praca rozszerza elastyczność inżynierii czynników inżynierii czynników transkrypcyjnych i jest pierwszym przykładem pośrednictwa chromatyny syntetycznego czynnika transkrypcyjnego. --- TŁO: Nasze ostatnie badania sugerują, że gen helikazy chromodomainowej DNA białko wiążące chromodomenę 1 (CHD1L) odgrywa onkogenną rolę w ludzkim raku wątrobowokomórkowym. raka wątrobowokomórkowego. Jednakże, status ekspresji białka CHD1L w raku jajnika i jego znaczenie kliniczne/prognostyczne są niejasne. METODY: W tym badaniu, immunohistochemia (IHC) dla CHD1L została przeprowadzona na mikromacierzy tkankowej (TMA) zawierającej 102 pierwotne raki jajnika i 44 zmiany przerzutowe (przerzuty do sieci). Analizę krzywej operatora-odbiornika (ROC) została wykorzystana do oceny przeżywalności pacjentek. WYNIKI: Istnieje zwiększona tendencja do ekspresji CHD1L w przerzutach raka jajnika przerzutów niż w zmianach pierwotnych (P<0,05). Stwierdzono istotny związek między dodatnią ekspresją CHD1L a typem histologicznym guza (P <0,05). Przez Jednoczynnikowa analiza przeżycia kohort raka jajnika, dodatnia ekspresja ekspresja CHD1L była istotnie skorelowana ze skróconym czasem przeżycia pacjentek (średnio 66,7 miesiąca w porównaniu do 97,4 miesiąca, P<0,05). Co więcej, ekspresja CHD1L została niezależnym czynnikiem prognostycznym w analizie wieloczynnikowej (P<0,05). analizie wieloczynnikowej (P<0,05). WNIOSKI: Wyniki te dostarczają dowodów na to, że dodatnia ekspresja białka CHD1L jest istotnie skorelowana z postępowaniem przerzutów raka jajnika, a CHD1L raka jajnika, a ekspresja białka CHD1L, badana przez IHC, może działać jako nowy biomarker prognostyczny dla pacjentek z rakiem jajnika. --- Chociaż rak gruczołu krokowego jest często łagodny, jest on jednak główną przyczyną zgonów z powodu śmierci z powodu raka. Zdefiniowanie podstawowych molekularnych zmian genetycznych może prowadzić do nowych strategii zapobiegania lub leczenia. W tym celu przeprowadziliśmy porównawczą hybrydyzację genomową (CGH) na 86 pierwotnych guzach prostaty. guzów prostaty. Wśród najczęstszych zmian niezwiązanych ze znanym genem raka genem nowotworowym, zidentyfikowaliśmy ogniskowe delecje w obrębie 5q21 w 15 z 86 (17%) przypadków. Poprzez CGH o wysokiej rozdzielczości, najmniejsza wspólna delecja dotyczyła tylko jednego genu, remodelatora chromatyny gen, remodeler chromatyny chromodomaina helikaza białko wiążące DNA 1 (CHD1). Ekspresja CHD1 była znacząco zmniejszona w guzach z delecją (P=0,03) i w porównaniu z prawidłową prostatą (P=0,04). Analiza sekwencjonowania eksonów ujawniła również mutacje niesynonimiczne w 1 z 7 (14%) linii komórkowych (LAPC4) oraz w 1 z 24 (4%) badanych guzów prostaty. Pośredniczone przez interferencję RNA knockdown CHD1 w dwóch nienowotworowych liniach komórkowych nabłonka prostaty, OPCN2 i RWPE-1, nie zmieniło wzrostu komórek, ale promowało ich inwazyjność, a w OPCN2-wzmocniona klonogenność komórek. Podsumowując, nasze odkrycia sugerują, że delecja CHD1 może leżeć u podstaw inwazyjności komórek w podgrupie raków prostaty, i wskazują na możliwą nową rolę zmienionej przebudowy chromatyny w nowotworzeniu prostaty. prostaty. --- Heterochromatyna drożdży rozszczepialnych jest tworzona w centromerach, telomerach oraz w regionie gdzie pośredniczy w transkrypcyjnym wyciszaniu loci donorowych mat2-P i mat3-M oraz kierunkowość przełączania typu godowego. My przeprowadziliśmy badania genetyczne mutantów kierunkowych. Badanie to ujawniło istotną rolę dwóch wcześniej niescharakteryzowanych czynników, Clr7 i Clr8, w tworzeniu heterochromatyny. tworzeniu heterochromatyny. Clr7 i Clr8 są wymagane do lokalizacji białka chromodomeny białka chromodomeny Swi6 i metylacji lizyny 9 histonu H3, tym samym wpływając nie tylko na przełączanie typu kojarzenia, ale także na wyciszanie transkrypcji we wszystkich wcześniej scharakteryzowanych regionach heterochromatycznych, segregację chromosomów, i rekombinację mejotyczną w regionie typu godowego. Przedstawiamy dowody na fizyczne interakcje między Clr7 i regionem typu godowego oraz między Clr7 i S. pombe cullin Pcu4, wskazując, że kompleks zawierający te białka białka pośredniczą we wczesnym etapie tworzenia heterochromatyny i sugerują rolę dla ubikwitynacji na tym wczesnym etapie przed działaniem histonu Clr4 metylo-transferazy Clr4. Podobnie jak Clr7 i Clr8, Pcu4 jest wymagany do metylacji lizyny 9 histonu H3 metylacji i dwukierunkowych transkryptów centromerycznych, które są normalnie przetwarzane na siRNA przez maszynerię RNAi w komórkach typu dzikiego są łatwo wykrywane w komórkach pozbawionych Clr7, Clr8 lub Pcu4. Inna fizyczna interakcja, między nukleoporyną Nup189 i Clr8, sugeruje, że Clr8 może być zaangażowany w wiązanie regionów heterochromatycznych do otoczki jądrowej poprzez powiązanie z kompleksem kompleks jądrowo-porowy. --- Montaż heterochromatyny centromerowej u drożdży rozszczepialnych wymaga szlaku RNAi. Chp1, białko chromodomeny (CD), tworzy kompleks wyciszania transkrypcji (RITS) zawierający Ago1. wyciszanie transkrypcji (RITS) i rekrutuje RITS związane z siRNA do metylowanego histonu H3 lizyny 9 (H3K9me) poprzez jego CD. Tutaj pokazujemy, że CD Chp1 (Chp1-CD) posiada unikalną aktywność wiązania kwasów nukleinowych, które są niezbędne do heterochromatycznego wyciszania genów. Szczegółowe analizy przesunięcia elektroforetycznego wykazały, że Chp1 wiąże się z RNA poprzez CD oprócz jego centralny motyw rozpoznawania RNA. Co ciekawe, silna aktywność wiązania RNA i DNA Chp1-CD była silnie wzmocniona, gdy wiązała się z H3K9me, co zostało ujawniono, że obejmuje dodatnio naładowaną domenę w Chp1-CD poprzez analizy strukturalne analizy. Wyniki te pokazują rolę CD, która zapewnia połączenie między RNA, DNA i metylowanymi ogonami histonów, aby zapewnić heterochromatyczne wyciszanie genów heterochromatyczne wyciszanie genów. --- Interferencja RNA (RNAi) jest krytyczna dla montażu heterochromatyny w centromerach Schizosaccharomyces pombe. Centralnym elementem tego procesu jest kompleks RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing), który fizycznie kotwiczy małe niekodujące RNA do chromatyny. RITS obejmuje Ago1, białko białko chromodomeny Chp1 i Tas3, które tworzy pomost między Chp1 i Ago1. Chp1 jest dużym białkiem bez rozpoznawalnych domen, z wyjątkiem jego chromodomeną. Tutaj opisujemy, w jaki sposób ustrukturyzowana C-końcowa połowa Chp1 wiąże N-końcową domenę Tas3, ujawniając ścisłą asocjację Chp1 i Tas3. Struktura pokazuje również domenę PIN na C-końcowym końcu Chp1, która kontroluje transkrypty subtelomerowe poprzez mechanizm posttranskrypcyjny. My sugerujemy, że kompleks Chp1-Tas3 stanowi solidną i wszechstronną platformę do rekrutować zarówno zależne od RNAi, jak i niezależne od RNAi szlaki wyciszania genów dla specyficznej dla miejsca regulacji heterochromatyny. --- SUV39H1, pierwsza zidentyfikowana metylotransferaza lizyny histonowej u ludzi, jest bierze udział w modyfikacji chromatyny i regulacji genów. SUV39H1 zawiera chromodomenę chromodomenę w jej N-końcu, która potencjalnie odgrywa rolę w rozpoznawaniu metylo-lizyny i celowaniu SUV39H1. W tym badaniu zbadano strukturę chromodomeny ludzkiego SUV39H1 została określona za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Struktura SUV39H1 wykazuje ogólnie zachowaną strukturę w porównaniu z innymi rozwiązanymi chromodomenami. innymi rozwiązanymi chromodomenami. Jednakże, w odróżnieniu od innych chromodomen, chromodomena SUV39H1 posiada znacznie dłuższą helisę na C-końcu. Ponadto wykazano, że chromodomena SUV39H1 rozpoznaje histon H3K9me2/3 specyficznie. --- Wiele białek koregulatorowych jest rekrutowanych przez czynniki transkrypcyjne związane z DNA w celu remodelować chromatynę i aktywować transkrypcję. Jednak mechanizmy koordynujące działania wielu białek koregulatorowych są słabo poznane. My wykazać, że wiele interakcji białko-białko przez białko acetylotransferazy TIP60 są wymagane do indukowanej estrogenem transkrypcji podzbioru genów docelowych receptora estrogenowego alfa (ERα) w komórkach ludzkich. Indukowana estrogenem rekrutacja TIP60 wymaga bezpośredniego wiązania TIP60 z ERα i działania ATPazy BRG1 remodelującej chromatynę, co prowadzi do zwiększonej rekrutacji metylotransferazy histonów MLL1 i zwiększonej monometylacji histonu H3 na Lys4. Rekrutacja TIP60 wymaga również preferencyjnego wiązania chromodomeny chromodomeny TIP60 do histonu H3 zawierającego monometylowaną Lys4, która oznacza aktywne i opanowane elementy wzmacniające. Po rekrutacji, TIP60 zwiększa acetylację histonu H2A na Lys5. Tak więc, złożona współpraca TIP60 z ERα i innymi enzymami remodelującymi chromatynę jest wymagana do indukowanej estrogenem transkrypcji. --- Talipes equinovarus jest jedną z najczęstszych wrodzonych anomalii mięśniowo-szkieletowych. anomalii układu mięśniowo-szkieletowego i na całym świecie występuje z częstością 1 na 1000 urodzeń. Predyspozycje genetyczne genetyczna predyspozycja do talipes equinovarus jest potwierdzona przez wysoki wskaźnik zgodności w badaniach bliźniąt i zwiększone ryzyko dla krewnych pierwszego stopnia. Pomimo Pomimo częstości występowania izolowanych talipes equinovarus i silnych dowodów na genetyczne genetycznych dla tego zaburzenia, zidentyfikowano niewiele genów sprawczych. Aby zidentyfikować rzadkich i / lub powtarzających się wariantów liczby kopii, przeprowadziliśmy badanie przesiewowe w całym genomie dla delecji i duplikacji u 413 izolowanych pacjentów z talipes equinovarus przy użyciu macierzy Affymetrix 6.0. Analiza segregacji w rodzinach i ekspresja genów w mysich pąkach kończyn E12.5 zostały wykorzystane do określenia znaczenia wariantów liczby kopii. wariantów liczby kopii. Zidentyfikowaliśmy 74 rzadkie, zawierające geny warianty liczby kopii które były obecne w talipes equinovarus probands i nie występowały w 759 kontrolach lub w bazie danych wariantów genomowych. Ogólna częstotliwość była podobna u pacjentów z talipes equinovarus w porównaniu z grupą kontrolną. z grupą kontrolną. Dwanaście rzadkich wariantów liczby kopii segreguje z talipes equinovarus w multipleksowych rodowodach i zawiera rozwojowo wyrażane czynniki transkrypcyjne i regulatory transkrypcji. czynniki transkrypcyjne i regulatory transkrypcji PITX1, TBX4, HOXC13, UTX, CHD (białko chromodomenowe)1 i RIPPLY2. Chociaż nasze wyniki nie potwierdzają głównej roli powtarzających się zmian liczby kopii w etiologii izolowanych talipes equinovarus, sugerują one rolę genów zaangażowanych we wczesne embrionalne w niektórych rodzinach, które można teraz przetestować metodami sekwencjonowania na dużą skalę. metody sekwencjonowania. --- CEL: Różnicowanie komórek mięśni gładkich (SMC) jest krytycznym procesem podczas i rozwoju układu sercowo-naczyniowego, ale leżący u jego podstaw mechanizm molekularny pozostaje niejasny. METODY I WYNIKI: Tutaj wykazaliśmy, że homolog białka chromobox 3 (Cbx3) ma kluczowe znaczenie dla różnicowania SMC z komórek macierzystych i że chromodomena i domena chromoshadow Cbx3 są odpowiedzialne za różnicowanie SMC indukowane przez Cbx3. różnicowanie SMC. Ponadto zidentyfikowaliśmy, że 4 aminokwasy (165 do 168) w domenie chromoshadow Cbx3 są kluczowymi elementami interakcji Cbx3 z Dia-1 i indukowanego przez Cbx3 różnicowania SMC. Mechanistycznie stwierdziliśmy, że Cbx3 pośredniczy w różnicowaniu SMC poprzez modulowanie czynnika odpowiedzi na surowicę (SRF) do promotorów genów SMC, w których interakcja między Cbx3 i Dia-1/SRF odgrywa kluczową rolę w tym procesie. Co więcej, nasze badanie in vivo wykazało, że misexpresja Cbx3 w komórkach grzebienia nerwowego zarodków pisklęcia zarodków spowodowała śmierć zarodków piskląt na wczesnych etapach z powodu nieprawidłowego rozwoju tętnic łuku gałęziowego. WNIOSKI: Nasze odkrycia sugerują, że interakcja między Cbx3 i Dia-1/SRF jest niezbędna do różnicowania SMC z komórek macierzystych i rozwoju funkcjonalnego układu sercowo-naczyniowego. rozwoju funkcjonalnego układu sercowo-naczyniowego. --- Osiem białek Cbx ssaków to białka zawierające chromodomeny, zaangażowane w w regulację heterochromatyny, ekspresji genów i programów rozwojowych. Są one ewolucyjnie spokrewnione z białkami Drosophila HP1 (dHP1) i Pc (dPc) białkami, które są kluczowymi składnikami kompleksów związanych z chromatyną, zdolnych do rozpoznawania represyjnych znaczników, takich jak trimetylowane Lys-9 i Lys-27, odpowiednio na histonie H3. Jednak specyficzność wiązania i funkcja ludzkich homologów, Cbx1-8, pozostają niejasne. W tym celu zastosowaliśmy badania strukturalne, podejścia biofizyczne i mutagenne, aby scharakteryzować molekularne determinanty sekwencji kontekstowego wiązania metylozyny z ludzkimi białkami Cbx1-8. Chociaż wszystkie trzy ludzkie homologi HP1 (Cbx1, -3, -5) replikują cechy strukturalne i wiążące ich odpowiedników dHP. cechy swoich odpowiedników dHP, pięć homologów Pc (Cbx2, -4, -6, -7, -8) wiąże się z niższym powinowactwem do peptydów H3K9me3 lub H3K27me3 i nie jest w stanie rozróżnić tych dwóch znaczników. Dodatkowo, tablice permutacji peptydów ujawniły większą tolerancję sekwencji w rodzinie Pc i sugerują alternatywne sekwencje niehistonowe jako potencjalne cele wiązania dla tej klasy chromodomen. Nasze struktury wyjaśniają rozbieżność wiązania peptydów peptydów w podrodzinie Pc i podkreślają wcześniej nierozpoznane cechy chromodomeny, które wpływają na wiązanie i specyficzność.
W których białkach obecna jest chromodomena?
Chromodomena (chromatin organizer modifier domain) jest wysoce konserwatywnym motywem o długości 40-50 aminokwasów, obecnym w szerokiej gamie białek zwierzęcych i roślinnych zaangażowanych w organizację chromatyny. Białka zawierające chromodomeny można sklasyfikować w rodziny oparte w szczególności na obecności innych typów domen. Chromodomena jest obecna w: białkach heterochromatyny HP1 alfa i HP1 beta, chromointgrazach (np. integraza Tf1), białka wiążące DNA helikazy chromodomenowej (CHD) i CHD 1-podobne (CHD1L), CReMM (mezenchymalny modulator związany z chromatyną), metylotransferaza DNA 3 (cmt3), chromointegraza LTR-retrotranspozonów, białka grupy Polycomb (PcG), mysie homologi Polycomb (Cbx2, Cbx4, Cbx6, Cbx7, Cbx8), rodzina białek chromodomeny Y chromosomu (CDY) i białko podobne do CDY (CDYL), acetylotransferazy histonów TgMYST-A i -B, MRG-1 i -15 (MORF4-Related Gene na chromosomie 15), translokaza ADP/ATP 1, MPP8, MSL3, NlMof, Chp1, Chriz, dMi-2, Corto, cpSRP43, KISMET, PICKLE (PKL), ScoHET1 i ScoHET2.
