Egzosomy to pęcherzyki uwalniane z nerek do moczu. Zawierają one białko i RNA z kłębuszków nerkowych i wszystkich odcinków nefronu. stanowią rezerwuar do odkrywania biomarkerów. Obecne metody identyfikacji i kwantyfikacji egzosomów w moczu są czasochłonne i tylko półilościowe. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) zlicza i określa rozmiary poprzez pomiar ich ruchu Browna w roztworze. W tym badaniu zastosowaliśmy NTA do ludzkiego moczu i zidentyfikowaliśmy cząsteczki o różnych rozmiarach. Używając przeciwciał przeciwko egzosomalnym białkom CD24 i akwaporynie 2 (AQP2), skoniugowanym z fluoroforem do fluoroforu, mogliśmy zidentyfikować subpopulację CD24- i AQP2-pozytywnych o charakterystycznej wielkości egzosomalnej. Rozległe przetwarzanie moczu przed NTA nie było konieczne. Jednak zmienność wewnątrz testu w pomiarze stężenia egzosomów była znacznie zmniejszona, gdy stężenia egzosomów była znacznie zmniejszona, gdy etap ultrawirowania poprzedzał NTA. Bez przetwarzania próbek, NTA śledziła egzosomalną regulację AQP2 indukowaną przez stymulację desmopresyną komórek kanalików zbiorczych nerki. komórek przewodu zbiorczego nerki. Analiza śledzenia nanocząsteczek była również w stanie śledzić zmiany w stężeniu egzosomalnego AQP2, które nastąpiły po leczeniu desmopresyną myszy i pacjenta z moczówką prostą centralną. Gdy mocz był przechowywany w temperaturze pokojowej, 4°C lub zamrożony, stężenie nanocząstek było zmniejszone; zamrożenie w temperaturze -80°C z dodatkiem inhibitorów proteazy z dodatkiem inhibitorów proteazy powodowało najmniejszą redukcję. Podsumowując, przy odpowiednim przechowywaniu próbek, NTA ma potencjał jako narzędzie do charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkim moczu. --- Pęcherzyki podobne do egzosomów moczowych (ELV) są heterogeniczną mieszaniną (średnica 40-200 nm) zawierającą pęcherzyki wydzielane przez wszystkie segmenty nefronu, w tym podocytów kłębuszkowych. Zanieczyszczenie oligomerami białka Tamm-Horsfall (THP) utrudniało ich izolację i analizę proteomiczną. Tutaj ulepszyliśmy protokoły izolacji ELV wykorzystując wirowanie gęstościowe w celu usunięcia THP i albuminy, i wyizolowaliśmy podfrakcję wzbogaconą w pęcherzyki błonowe kłębuszków nerkowych (GMV) z 7 identyfikując 1830 białek i u 3 pacjentów z chorobą kłębuszkową identyfikując 5657 unikalnych białek. Frakcja GMV składała się z podocyny/podokaliksyny-dodatnich pęcherzyków błonowych o nieregularnym kształcie i podocyna/podokaliksyna-ujemne klasyczne egzosomy. Analiza ścieżek Ingenuity zidentyfikowała integrynę, cytoszkielet aktyny i sygnalizację Rho GDI w trzech najlepszych kanonicznych szlakach sygnałowych i 19 innych białkach związanych z dziedzicznymi chorobami kłębuszków nerkowych. dziedzicznymi chorobami kłębuszków nerkowych. GMV pochodzą z podocytów, a technika gradientu gęstości a technika gradientu gęstości umożliwiła izolację w powtarzalny sposób. Pokazujemy wiele białek białek zespołu nerczycowego, proteaz i białek dopełniacza zaangażowanych w choroby kłębuszków nerkowych. kłębuszkach nerkowych znajduje się w GMV, a niektóre z nich są uwalniane tylko w stanie chorobowym (nefryna, TRPC6, INF2 i receptor fosfolipazy A2). Obliczyliśmy wielkość próbek wymagane do zidentyfikowania nowych biomarkerów choroby kłębuszków nerkowych, rozszerzenia proteomu ELV, i zapewnienia proteomu referencyjnego w bazie danych, która może okazać się przydatna w w poszukiwaniu biomarkerów choroby kłębuszków nerkowych. --- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe moczu (uEV) są uwalniane przez komórki w całym nefronie. nefronu i zawierają biomolekuły z komórek, z których pochodzą. Chociaż białka i RNA związane z uEV zostały szczegółowo zbadane, niewiele informacji istnieje niewiele informacji dotyczących charakterystyki glikozylacji uEV. Profilowanie glikozylacji powierzchniowej profilowanie za pomocą cytometrii przepływowej i mikromacierzy lektynowej zastosowano do uEV wzbogaconych z moczu zdrowych osób dorosłych poprzez ultrawirowanie i filtrację odśrodkową. Specyficzność węglowodanowa profili mikromacierzy lektynowych została potwierdzona przez konkurencyjną inhibicję cukrów i hydrolizę enzymatyczną specyficzną dla węglowodanów. Porównano profile glikozylacji uEV i oczyszczonego białka Tamm Horsfall. Zarówno w cytometrii przepływowej, jak i w testach mikromacierzy lektynowych, uEV wykazywały wiązanie powierzchniowe, o niskiej i umiarkowanej intensywności. wiązanie, przy niskiej do umiarkowanej intensywności, szerokiego zakresu lektyn, niezależnie od tego, czy przygotowane przez ultrawirowanie lub filtrację odśrodkową. Ogólnie, uEV przygotowane metodą ultrawirowania wykazywały wyższą intensywność wiązania lektyny niż uEV przygotowane metodą filtracji odśrodkowej, co jest zgodne z mniejszymi ilościami z mniejszą ilością oczyszczonych białek niepęcherzykowych. Profile glikozylacji powierzchniowej uEVs wykazywały niewielką zmienność międzyosobniczą i różniły się od profili białka Tamm Horsfalla, które wiązały ograniczoną liczbę lektyn. W badaniu pilotażowym, mikromacierz lektynową wykorzystano do porównania uEV od osób z autosomalną dominującą policystyczną chorobą nerek z osobami z grupy kontrolnej dopasowanej wiekowo. Profile lektyn Profile mikromacierzy lektyn z policystycznych chorób nerek i zdrowych uEV wykazały różnice w intensywności wiązania 6/43 lektyn. Nasze wyniki ujawniają złożony profil glikozylacji powierzchniowej uEV, który jest dostępny dla lektyn analiza po wielu technikach wzbogacania uEV, różni się od białka Tamm Horsfall i może wykazywać modyfikacje specyficzne dla choroby. modyfikacje. --- Ostatnie badania wskazują, że mikroRNA (miRNA) jest zawarte w egzosomie. Tutaj staraliśmy się zoptymalizować metodologie izolacji i kwantyfikacji egzosomalnego mikroRNA w moczu jako wstępu do badań nad odkrywaniem biomarkerów. Egzosomy zostały wyizolowane poprzez ultrawirowanie i scharakteryzowane za pomocą mikroskopii immunoelektronowej. mikroskopii immunoelektronowej. Aby określić, czy RNA było zamknięte wewnątrz egzosomów, osad został traktowany RNazą przed izolacją RNA. Minimalna objętość moczu, warunki przechowywania warunki przechowywania egzosomów i egzosomalnego miRNA. Obecność miRNA u pacjentów z różnymi chorobami nerek potwierdzono metodą PCR w czasie rzeczywistym. Wynik miRNA wyekstrahowane z frakcji egzosomalnej były odporne na trawienie odporne na trawienie RNazą, a ich wysoką jakość potwierdziła elektroforeza agarozowa. 16 ml moczu było wystarczające do izolacji miRNA przez bezwzględną kwantyfikację z 4,15×10(5) kopii/ul dla miR-200c. Egzosomy były stabilne w temperaturze 4 ℃ 24h do wysyłki przed przechowywaniem w temperaturze -80 ℃ i był stabilny w moczu, gdy był przechowywany w temperaturze -80 ° C przez 12 miesięcy. Egzosomalne miRNA było wykrywalne pomimo 5 powtórzonych cykli zamrażania-rozmrażania. Wykrywanie Wykrywanie miRNA za pomocą ilościowego PCR wykazało wysoką powtarzalność (>94% dla wewnątrz testu i >76% dla między testami), wysoką czułość (dodatnie wywołanie 100% dla pacjentów z CKD), szeroki zakres dynamiczny (8 log) i dobrą liniowość dla miR-29c i miR-200c wykazywały różną ekspresję w różnych typach chorób nerek. różnych typach chorób nerek. Podsumowując, obecność egzosomalnego miRNA w moczu miRNA w moczu została potwierdzona u pacjentów z różnymi przewlekłymi chorobami nerek. Warunki warunki pobierania moczu, przechowywania i wykrywania miRNA określone w tym badaniu mogą być przydatne w przyszłych wysiłkach związanych z odkrywaniem biomarkerów. --- Egzosomy moczu zostały zaproponowane jako potencjalne narzędzia diagnostyczne. CYTOKINY I RECEPTORY Z NADRODZINY TNF i receptory mogą być obecne w egzosomach i są wyrażane przez komórki kanalików proksymalnych. przez komórki kanalików proksymalnych. Obecnie zbadaliśmy ekspresję wybranych białek nadrodziny TNF w egzosomopodobnych pęcherzykach z hodowanych ludzkich proksymalnych komórek kanalików i ludzkiego moczu. komórek kanalików proksymalnych i ludzkiego moczu oraz zidentyfikowaliśmy dodatkowe białka w tych pęcherzykach za pomocą proteomiki LC-MS/MS. Ludzkie komórki kanalików proksymalnych konstytutywnie uwalniały pęcherzyki podobne do egzosomów, które nie zawierały cytokin z nadrodziny TNF cytokin TRAIL lub TWEAK. Jednakże, pęcherzyki egzosomowe zawierały osteoprotegerynę (OPG), białko z nadrodziny receptorów TNF, jak oceniono metodą Western blot, ELISA lub monitorowanie wybranych reakcji za pomocą nLC-(QQQ)MS/MS. Dwadzieścia jeden dodatkowych białek zidentyfikowano w pęcherzykach egzosomowych komórek kanalików pęcherzyków, w tym jedno (białko wiążące witaminę D), które nie było wcześniej w pęcherzykach podobnych do egzosomów. Dwanaście było białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym białka błony podstawnej kolagen typu IV, nidogen-1, agryna i fibulina-1. Mocz pacjentów z przewlekłą chorobą nerek zawierał większą ilość białka egzosomalnego i egzosomalnego OPG niż mocz zdrowych ochotników. W szczególności OPG było zwiększone w autosomalnej dominującej policystycznej chorobie nerek pęcherzykach moczowych podobnych do egzosomów i ekspresji przez nabłonek torbielowaty in vivo. Podsumowując Podsumowując, OPG jest obecna w pęcherzykach podobnych do egzosomów wydzielanych przez proksymalne komórki nabłonka kanalików komórek nabłonka kanalików proksymalnych i izolowanych z moczu z przewlekłą chorobą nerek. --- Egzosomy to nanocząsteczki wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego po fuzji pęcherzyka wewnętrznego z błoną plazmatyczną. Zawartość molekularna egzosomów jest odciskiem palca typu komórki uwalniającej i jej statusu. Z tego z tego powodu, a także dlatego, że są one uwalniane w łatwo dostępnych płynach ustrojowych, takich jak krew i mocz, stanowią one cenne narzędzie biomedyczne. Rosnąca liczba dowodów dowodów sugeruje, że egzosomy mogą być wykorzystywane jako biomarkery w diagnostyce i prognozowaniu nowotworów złośliwych. diagnozowania i prognozowania nowotworów złośliwych. Niniejszy artykuł koncentruje się na wykorzystaniu egzosomów jako narzędzi diagnostycznych dla ludzkich nowotworów i omawia możliwe zastosowania tych samych strategii w innych patologiach, takich jak choroby neurodegeneracyjne. --- Schyłkowa niewydolność nerek (ESRD) wymaga w leczeniu stałej dializy lub przeszczepu nerki (KT). przeszczepu nerki (KT). KT jest najlepszą metodą leczenia klinicznego, jednak wczesna funkcja alloprzeszczepu różni się w zależności od wielu czynników związanych z z czasem zimnego niedokrwienia (CIT) i procesem odrzucania alloprzeszczepu. Wiadomo, że że stężenie kreatyniny w surowicy jest niewrażliwym i późnym markerem do przewidywania po KT, głównie u pacjentów z opóźnioną funkcją przeszczepu (DGF). Lipokalina związana z żelatynazą neutrofilową (NGAL) jest wytwarzana w dystalnym nefronie i jest jednym z markerów kreatyniny. nefronie i jest jednym z najbardziej obiecujących nowych biomarkerów ostrego uszkodzenia nerek (AKI) i przewlekłego uszkodzenia nerek. uszkodzenia nerek (AKI) i przewlekłej choroby nerek (CKD). NGAL został zaproponowany jako predyktorem regeneracji narządów z DGF po KT od dawców po śmierci sercowej. Ponieważ choroby pozanerkowe mogą również indukować NGAL, konieczne jest uzyskanie większej ilości informacji w celu aby zweryfikować czułość i swoistość NGAL w moczu i osoczu w próbkach klinicznych. próbkach klinicznych. Egzosomy są pęcherzykami uwalnianymi do moczu z nabłonka nerek. nabłonka nerek i zostały zaproponowane jako lepsze źródło do badania jako biomarker dysfunkcji nerek. Skład molekularny egzosomów moczu może być reprezentatywny dla fizjologicznego lub fizjopatologicznego stanu układu moczowego. układu moczowego. Proponujemy, aby oznaczanie NGAL w egzosomach moczu było lepszym lepszym predyktorem dysfunkcji nerek po KT niż inne frakcje moczu. My przeanalizowaliśmy 15 biorców alloprzeszczepu nerki, których średni wiek wynosił 36 lat (zakres, 16-60 lat), a 75% stanowili mężczyźni: 11 żywych dawców (LD) i 4 zmarłych dawców (DD). Średnia długość CIT wynosiła 14 godzin u DD i mniej niż 1 godzinę u LD. U trzech pacjentów rozwinęło się DGF. Przy użyciu analizy Western blot, NGAL był wykrywalny w komórkowej i egzosomalnej frakcji moczu. Egzosomy wyrażały wyższe poziomy wyższe poziomy NGAL niż frakcja komórkowa. Ekspresję NGAL obserwowano od pierwszego dnia po transplantacji. We frakcji komórkowej moczu, nie zaobserwowano znaczących różnic NGAL między pacjentami. Jednakże, jednak mediana ekspresji NGAL we frakcji egzosomów była istotnie wyższa u pacjentów DD, od pierwszego dnia po KT (P < .05). Ponadto zauważyliśmy, że ekspresja NGAL w egzosomach pozostawała podwyższona u pacjentów z DGF w porównaniu z pacjentami bez DGF (P < .05). Biorąc pod uwagę najwyższą obfitość NGAL w egzosomach moczu i jego korelację z pacjentami z DGF, sugerujemy, że frakcja egzosomalna jako bardziej czuły substrat do oceny wczesnych biomarkerów DGF po KT. DGF po KT. --- Egzosomy to małe (30-150 nm) pęcherzyki zawierające unikalny ładunek RNA i białka, wydzielane przez wszystkie typy komórek w hodowli. Występują również w dużych ilościach w płynach ustrojowych, w tym we krwi, ślinie i moczu. płynach ustrojowych, w tym krwi, ślinie i moczu. Obecnie mechanizm powstawania egzosomów mechanizm powstawania egzosomów, skład ładunku, szlaki biologiczne i wynikające z nich funkcje są nie do końca poznane. funkcje są nie do końca poznane. Jedną z ich najbardziej intrygujących ról jest komunikacja międzykomórkowa - egzosomy funkcjonują jako posłańcy, dostarczając dostarczając różne makrocząsteczki efektorowe lub sygnalizacyjne między określonymi komórkami. Istnieje wykładniczo rosnąca potrzeba rozszyfrowania struktury i funkcji egzosomów oraz wykorzystania ich do rozwoju minimalnie inwazyjnej diagnostyki i terapii. Kluczowe znaczenie dla dalszego zrozumienia egzosomów ma rozwój odczynników, narzędzi i protokołów do ich izolacji, charakteryzacji i analizy zawartości analizy zawartości RNA i białek. Tutaj opisujemy kompletne rozwiązanie egzosomów, począwszy od szybkiej i wydajnej ekstrakcji egzosomów z i surowicy do izolacji RNA, a następnie charakterystykę zawartości egzosomalnego RNA za pomocą zawartości egzosomalnego RNA przy użyciu technik qRT-PCR i sekwencjonowania następnej generacji. Skuteczność tego przepływu pracy została zilustrowana analizą zawartości RNA w egzosomów pochodzących z pożywek do hodowli komórek HeLa i ludzkiej surowicy, przy użyciu Ion Torrent PGM jako platformy sekwencjonowania.
Czy egzosomy można wykryć w moczu?
Tak, egzosomy mogą być wykrywane w moczu.