Nieprawidłowy rozwój i utrata płodu w okresie poimplantacyjnym są obawami w przypadku produkcji zwierząt transferowanych jądrowo. Nieprawidłowa metylacja DNA jest jednym z powodów słabej przeżywalności klonowanych zwierząt. W genomowym DNA ssaków wyspy CpG są preferencyjnie zlokalizowane na początku transkrypcji genów opiekuńczych i są związane z genami specyficznymi dla tkanek. Prawidłowe i następujące po sobie mechanizmy metylacji DNA w wyspach CpG są niezbędne do selektywnej ekspresji genów, które determinują właściwości poszczególnych komórek, tkanek i narządów. narządów. W tym badaniu zbadaliśmy status metylacji wysp CpG bydlęcych genów leptyny i POU5F1 w tkankach płodowych i łożyskowych z płodów wyprodukowanych przez sztuczną inseminację (AI) i transfer jądrowy (NT) w 48 i 59 dniu ciąży. w 48 i 59 dniu ciąży. Zmienioną metylację DNA zaobserwowano w normalnym i sklonowanych tkankach płodu, łożyska i endometrium przy użyciu sekwencjonowania bisulfitowego i pirosekwencjonowania. Różne specyficzne dla tkanek metylowane regiony w bydlęcym DNA geny leptyny i POU5F1 wykazują zmienny status metylacji u płodów NT w porównaniu do kontroli AI. --- Wyspy CpG to odcinki sekwencji DNA, które są wzbogacone w powtórzenia (CpG)n i są obecne w ścisłym związku ze wszystkimi genami gospodarza, a także niektórymi genami genami specyficznymi dla tkanek w genomie ssaków. Metylacja wysp CpG silnie wpływa zarówno na organizację strukturalną, jak i funkcję chromatyny. Obecność obecność wyspy CpG w danej domenie chromosomalnej może sama w sobie powodować powstanie stosunkowo otwartą i aktywną chromatynę. Ostatnio kilka acetylotransferaz acetylotransferaz, deacetylaz histonowych i czynników remodelujących chromatynę. i czynników remodelujących chromatynę. Staje się coraz coraz bardziej jasne, że wyspy CpG i ich stan metylacji mogą wpływać na funkcję lub rekrutację tych nowo odkrytych czynników remodelujących chromatynę, w szczególności czynników remodelujących chromatynę, zwłaszcza deacetylaz histonowych. Ponadto, wyspy CpG mogą również odgrywać znaczącą rolę w reorganizacji chromatyny podczas spermiogenezy ssaków. spermiogenezy ssaków. --- Niemetylowane wyspy bogate w CpG są cechą DNA kręgowców: są one związane z utrzymaniem porządku i wieloma genami specyficznymi dla tkanek. Wyspy CpG na aktywnym chromosomie aktywnym chromosomie X ssaków są również niemetylowane. Jednak wyspy na nieaktywnym chromosomie X są silnie metylowane. Zidentyfikowaliśmy wyspę CpG w regionie 5' genu G6PD i dwie wyspy czterdzieści Kb 3' od genu G6PD, na ludzkim chromosomie X. Ekspresja genu G6PD jest związana z zgodną demetylacją wszystkich trzech wysp CpG. Wykazaliśmy, że jedna z wysp znajduje się w regionie promotorowym genu podtrzymującego, GdX. W tym artykule pokazujemy, że druga wyspa CpG jest również związana z genem P3. Gen P3 nie ma homologii do wcześniej opisanych genów. Jest to pojedyncza kopia, 4 kb gen, zachowany w ewolucji i ma cechy dwóch genów podtrzymujących. genów znajduje się w obrębie wyspy CpG, a sekwencje w wyspach mają funkcję promotora. funkcję. --- Eksperymenty in vivo i in vitro przeprowadzone na mysich fibroblastach L929 sugerowały, że proces że proces atrybucji poli(ADP-rybozylu) działa w jakiś sposób jako czynnik chroniący przed pełną metylacją dinukleotydów CpG w genomowym DNA. Ponieważ wyspy CpG, które znajdują się prawie wyłącznie na 5'-końcu genów opiekuńczych, są bogate w dinukleotydy CpG, które są celem metylotransferazy DNA ssaków, zbadaliśmy możliwość, że reakcja poli(ADP-rybozylo)atacji jest zaangażowana w utrzymaniu niemetylowanego stanu tych sekwencji DNA. Eksperymenty zostały przeprowadzono za pomocą dwóch różnych strategii, wykorzystując zależne od metylacji enzymy restrykcyjne enzymów restrykcyjnych na oczyszczonym genomowym DNA lub zależnego od sekwencji enzymu restrykcyjnego na próbce tego samego DNA, uprzednio zmodyfikowanego przez reakcję bisulfitu. reakcję. W przypadku enzymów restrykcyjnych zależnych od metylacji zaobserwowano, że że "małe fragmenty HpaII" znacznie się zmniejszyły, gdy komórki były preinkubowane z 3-aminobenzamidem, dobrze znanym inhibitorem polimerazy poli(ADP-rybozy) polimerazy. Drugie podejście eksperymentalne pozwoliło nam udowodnić, że w wyniku w wyniku zahamowania procesu polimerazy poli(ADP-rybozy), anomalny wzór metylacji anomalny wzór metylacji można było wykazać na wyspie CpG fragmentu promotora fragmentu promotora genu Htf9, amplifikowanego z DNA uzyskanego z fibroblastów preinkubowanych z 3-aminobenzamidem. Dane te potwierdzają hipotezę, że przynajmniej przynajmniej dla regionu promotora Htf9, aktywna poli(ADP-rybozylo)atacja chroni niemetylowany stan wyspy CpG. --- Wzorce metylacji DNA w dinukleotydach CpG i ich związki z ekspresją genów są złożone. są złożone. Klastry CpG wolne od metylacji, tzw. wyspy HTF, są najczęściej związane z regionami promotorowymi genów opiekuńczych, podczas gdy geny wyrażane w typie jednokomórkowym są zwykle ubogie w te sekwencje. sekwencji. Jednakże, w rodzinie ludzkich genów anhydrazy węglanowej (CA), zarówno zarówno wszechobecnie wyrażany CAII, jak i specyficzny dla mięśni CAIII wydają się mieć takie wyspy wyspy CpG, chociaż CAI specyficzny dla erytrocytów nie. Wyspa CAII jest ilościowo bardziej bogata w CpG niż CAIII, ze stosunkiem CpG:GpC wynoszącym 0,94 w porównaniu do 0,82 dla CAIII. Oszacowanie stosunku CpG:GpC w regionach proksymalno-promotorowych proksymalnych regionach promotorowych 44 genów kręgowców sugerują, że 40% genów z tkankowo-specyficznych lub o ograniczonej dystrybucji tkankowej może wykazywać wolne od metylacji klastry CpG w swoich regionach promotorowych. W wielu przypadkach stosunek CpG:GpC jest mniejszy niż niż w genach housekeeping, co może odzwierciedlać zmienność w interakcji klastrów CpG z czynnikami regulacyjnymi, które definiują różne wzorce ekspresji tkankowej. --- Wyspy CpG (CGI) są często uważane za markery genów, ale liczba wysp CGI różni się między genomami ssaków, które mają podobną liczbę genów. W tym badaniu zbadaliśmy rozkład CGI w regionach promotorowych 3 197 ortologicznych genów ortologicznych par genów człowieka i myszy i odkryliśmy, że genom myszy ma znacznie mniej CGI w regionach promotorowych i mniej wyraźną charakterystykę CGI niż ludzki genom. niż genom ludzki. Następnie wywnioskowaliśmy stan przodków CGI przy użyciu genomu psa jako odniesienia i zbadaliśmy wzór substytucji nukleotydów i kierunek mutacji w konserwowanych regionach. kierunek mutacji w konserwowanych regionach ludzkich i mysich CGI. Wyniki Wyniki ujawniają wiele strat CGI w obu genomach, ale wskaźnik strat w linii u myszy jest dwa do czterech razy wyższy niż u ludzi. Znaleźliśmy intrygującą cechę utraty CGI, a mianowicie, że utrata CGI zwykle zaczyna się od od erozji na obu krawędziach i stopniowo przesuwa się w kierunku środka. Znaleźliśmy funkcjonalne odchylenie w genach, które utraciły CGI związane z promotorem w linii ludzkiej lub mysiej. ludzkiej lub mysiej linii. Wreszcie, nasza analiza wskazuje, że związek CGI z genami porządkowymi nie jest tak silny, jak wcześniej szacowano. Nasze badanie zapewnia szczegółowy obraz ewolucji CGI związanych z promotorami w genomach genomach człowieka i myszy, a nasze odkrycia są pomocne w zrozumieniu ewolucji genomów ssaków. ewolucji genomów ssaków i roli CGI w funkcjonowaniu genów. --- Przewiduje się, że wyspy CpG są często obserwowane w pobliżu miejsc startu transkrypcji (TSS) genów gospodarza. Jednakże, ani dokładne pozycje wysp CpG w stosunku do TSS genów, ani korelacja między obecnością wysp CpG a specyficznością ekspresji tych genów. specyficznością ekspresji tych genów. Używając tysięcy sekwencji ze znanymi TSS u człowieka i myszy, odkryliśmy, że istnieje wyraźny pik w rozkładzie wysp CpG wokół TSS w genach tych dwóch gatunków. W ten sposób sklasyfikowaliśmy ludzkie (mysie) geny na 6600 (2948) genów CpG+ i 2619 (1830) genów CpG-, na podstawie obecności wyspy CpG w regionie -100: +100. Oszacowaliśmy stopień, w jakim każdy gen był gospodynią, na podstawie liczby bibliotek cDNA, w których wykryto jego EST zostały wykryte. Następnie, tendencja, że gen pozbawiony wysp CpG wokół jego TSS ulega ekspresji z wyższym stopniem specyficzności tkankowej. okazała się ewolucyjnie konserwowana. Potwierdziliśmy również tę tendencję, analizując analizując adnotację ontologii genów sklasyfikowanych genów. Ponieważ nie stwierdzono takiej wyraźnej korelacji nie stwierdzono w danych kontrolnych (mRNA, pre-mRNA i wzór prążkowania chromosomów). wzór prążkowania), doszliśmy do wniosku, że efekt wyspy CpG w pobliżu TSS powinien być ważniejszy niż globalna zawartość GC w regionie, w którym znajduje się gen. genu. --- Wyspy CpG to krótkie, rozproszone regiony niemetylowanego DNA o wysokiej dinukleotydów CpG w stosunku do całego genomu. Przeanalizowaliśmy 375 genów i 58 pseudogenów z ludzkich wpisów w bazie danych EMBL pod kątem obecności wysp CpG. Wszystkie 240 zidentyfikowanych wysp jest powiązanych z genami, i prawie wszystkie obejmują co najmniej część jednego eksonu; tj. są użytecznymi użytecznymi punktami orientacyjnymi w genomie do identyfikacji genów. Ponad połowa analizowanych genów analizowanych genów było powiązanych z wyspami. Wszystkie geny gospodarza i geny o szerokiej ekspresji geny mają wyspę CpG obejmującą początek transkrypcji, podczas gdy 40% genów genów o specyficznej dla tkanki lub ograniczonej ekspresji jest powiązanych z wyspami. W tej ostatniej grupie genów położenie wysp nie było tendencyjne w kierunku końca 5' jednostki transkrypcyjnej. --- W genach gospodarza i wielu genach specyficznych dla tkanek, promotor jest osadzony w tzw. tak zwanej wyspie CpG. Porównaliśmy dostępne ludzkie i mysie sekwencje DNA w odniesieniu do ich właściwości wysp CpG. Podczas gdy sekwencje myszy wykazały prosty rozkład gradientowy zawartości G + C i gęstości CpG, człowiek miał wyraźny szczyt sekwencji o typowych cechach wysp CpG. Porównanie parami 23 ortologicznych genów ujawniło, że mysz prawie zawsze miała mniej wyraźną wyspę CpG niż człowiek lub nie miała jej wcale. U obu gatunków wymagania dla funkcjonalnej wyspy CpG mogą być podobne, ponieważ większość regionów DNA z gęstością sześciu lub więcej CpG na 100 bp pozostaje niemetylowana. Jednakże Mysz najwyraźniej doświadczyła bardziej przypadkowej metylacji wysp CpG, co sugeruje lokalny nadmiar TpG i CpA. Proponujemy, aby: (1) u myszy wyspy CpG nie reprezentują stanu przodków, ale uległy erozji podczas ewolucji, oraz (2) ta erozja ewolucji, oraz (2) erozja ta może być związana z małą masą ciała myszy i krótką długością życia, co pozwala na bardziej swobodną kontrolę aktywności genów. --- Metylacja DNA jest modyfikacją epigenetyczną, która wprowadza 5mC jako piątą zasadę do DNA. zasadę do DNA. Jeśli chodzi o dystrybucję 5mC, dobrze wiadomo, że są one rozmieszczają się w genomowym DNA w sposób nielosowy, tak że wzór metylacji metylacji charakteryzuje się obecnością metylowanych cytozyn na większości DNA, podczas gdy te niezmetylowane znajdują się głównie w określonych regionach zwanych wyspami CpG. Regiony te stanowią około 1% genomowego DNA i są generalnie znajdują się w regionie promotorowym genów gospodarza. Ich niemetylowany stan, który jest niezbędnym warunkiem prawidłowej ekspresji skorelowanych genów, jest paradoksalny, jeśli genów, jest paradoksalny, jeśli weźmie się pod uwagę, że regiony te są określane jako wyspy CpG ponieważ są one szczególnie bogate w ten dinukleotyd, który jest najlepszym substratem dla enzymów zaangażowanych w metylację DNA. Anomalne wstawienie grup metylowych w tych regionach zazwyczaj prowadzi do braku transkrypcji skorelowanych genów. skorelowanych genów. Interesującym problemem naukowym jest wyjaśnienie mechanizm(y), dzięki któremu wyspy CpG, które pozostają chronione przed metylacją w normalnych komórkach normalnych komórkach, są podatne na metylację w komórkach nowotworowych. W jaki sposób cząsteczki CpG w wyspach CpG stają się wrażliwe lub odporne na działanie metylotransferaz DNA metylotransferaz DNA i w ten sposób mogą utracić lub utrzymać swój charakterystyczny wzór metylacji. metylacji jest wciąż otwartym pytaniem. Naszym celem jest zebranie pewnych mechanizmów w odniesieniu do tej intrygującej zagadki, która pomimo całej poświęconej energii nadal pozostaje nierozwiązaną zagadką.
Czy wyspy CpG znajdują się w pobliżu genów opiekuńczych?
Nasza analiza wskazuje, że związek CGI z genami porządkowymi nie jest tak silny, jak wcześniej szacowano. Regiony te stanowią około 1% genomowego DNA i zazwyczaj znajdują się w regionie promotorowym genów porządkowych. W genach housekeeping i wielu genach specyficznych dla tkanek, promotor jest osadzony w tak zwanej wyspie CpG. Klastry CpG wolne od metylacji, tak zwane wyspy HTF, są najczęściej związane z regionami promotorowymi genów porządkowych, podczas gdy geny ulegające ekspresji w typie jednokomórkowym są zwykle ubogie w te sekwencje. Wszystkie geny porządkowe i geny o szerokiej ekspresji mają wyspę CpG obejmującą początek transkrypcji, podczas gdy 40% genów o ekspresji specyficznej dla tkanki lub ograniczonej jest związanych z wyspami. Przewiduje się, że wyspy CpG są często obserwowane w pobliżu miejsc startu transkrypcji (TSS) genów porządkowych. Wyspy CpG, które znajdują się prawie wyłącznie na 5'-końcu genów porządkowych. Wyspy CpG były związane z końcami 5' wszystkich genów podtrzymujących i wielu genów specyficznych dla tkanek, a także z końcami 3' niektórych genów specyficznych dla tkanek.