Poprzednie badania wykazały, że płucne białko powierzchniowo czynne D (SP-D) jest składa się z polipeptydu o masie 43 kDa z krótką domeną NH2-końcową, sekwencją kolagenu sekwencją kolagenu i domeną lektyny typu C na końcu COOH. W niniejszych badaniach, techniki ultrastrukturalne i biochemiczne zostały wykorzystane do zbadania czwartorzędowej struktury natywnego szczurzego SP-D (rSP-D). Mikroskopia elektronowa liofilizowanych preparatów preparatów wykazała wysoce jednorodną populację cząsteczek z czterema identycznymi pręcikowatymi ramionami (o długości 46 nm), każde z kulistym rozszerzeniem o średnicy 8-9 nm. o średnicy 8-9 nm. Ramiona, które mają podobną średnicę do helisy kolagenu typu I kolagenu typu I (około 4 nm), emanują z centralnej "piasty" w dwóch parach które ściśle do siebie przylegają przez pierwsze 10 nm. Ta struktura jest zgodna z badaniami hydrodynamicznymi, które przewidują wysoce asymetryczną i asymetryczną i wydłużoną cząsteczkę (f/f0 = 3,26) o dużym promieniu Stokesa (Rs = 18 nm). Trawienie pepsyną dała glikozylowane, trimeryczne fragmenty kolagenowe (43 +/- 4 nm, 17 kDa/łańcuch). Podjednostki trimeryczne zawierające nienaruszone potrójne domeny helikalne były również uwolnione z dodekamerów SP-D przez redukcję sulfhydrylową w warunkach niedenaturujących warunkach. Trawienie rSP-D kolagenazą bakteryjną wygenerowało COOH-końcowy fragment wiążący węglowodany i mniejszy peptyd (około 12 kDa, nieredukowany), który zawiera międzyłańcuchowe wiązania disiarczkowe. Mikroskopia elektronowa wykazała również wyższe rzędy multimeryzacji, z aż 8 cząsteczkami związanych w centrum. Badania te pokazują, że SP-D jest montowany jako homopolimery czterech identycznych podjednostek trimerycznych, że interakcje między domenami amino-końcowymi domenami trimerów są stabilizowane przez międzyłańcuchowe wiązania disiarczkowe wiązaniami disiarczkowymi oraz że cząsteczki SP-D mogą łączyć się w złożone wielocząsteczkowe zespoły zespoły. --- Ustalono, że niekowalencyjne kompleksy mogą być utrzymywane zarówno podczas, jak i po elektrorozpylaniu i że zespoły o rosnącym rozmiarze i złożoności często często prowadzą do poszerzenia pików w widmach masowych. To poszerzenie wynika z tendencji dużych zespołów białkowych do tworzenia adduktów z solami i jest się, gdy kompleksy są izolowane bezpośrednio z komórek, bez pełnego białek. Aby zbadać pochodzenie tego poszerzenia w pikach widma masowego i opracować optymalną metodę analizy widm mas dużych kompleksów białkowych. dużych kompleksów białkowych, przeprowadziliśmy systematyczne badania serii niekowalencyjnych kompleksów serii niekowalencyjnych kompleksów reprezentujących szereg różnych rozmiarów i architektur. architektur. Ustaliliśmy pozytywną korelację między szerokością piku a a obserwowaną zwiększoną masą i pokazujemy, że korelacja ta jest niezależna od zastosowanych parametrów instrumentalnych. zastosowanych parametrów instrumentalnych. Korzystając z tej zależności pokazujemy, że możemy określić masy zarówno podjednostek 30S, jak i nienaruszonych rybosomów 70S o masie 2,3 MDa z Thermus thermophilus. Thermus thermophilus. Masy obu cząsteczek są zgodne z wieloma populacjami rybosomów. populacjami rybosomów. Aby zidentyfikować te różne populacje, połączyliśmy symulowane widma mas rybosomów, z pełnym uzupełnieniem białkowym i bez niego. i szacujemy zakres adduktów na podstawie naszych badań znanych kompleksów. kompleksów. Wyniki pozwalają nam określić wkład różnych subpopulacji subpopulacji do ogólnego widma masowego. Potwierdzamy istnienie tych subpopulacji przy użyciu tandemowej spektrometrii mas nienaruszonych podjednostek 30S. Ogólnie, wyniki pokazują, że zamiast jednolitych cząstek, rybosomy w fazie gazowej składają się z wielu dyskretnych populacji. Bardziej ogólnie, wyniki ustanawiają rygorystyczną procedurę dokładnego pomiaru masy i analizy spektralnej i analizy spektralnej heterogenicznych zespołów makromolekularnych. --- W ostatnich latach techniki oparte na spektrometrii mas stały się narzędziami biologii strukturalnej narzędzia biologii strukturalnej do charakteryzowania makromolekularnych, niekowalencyjnych niekowalencyjnych. Wiele z tych działań obejmuje zachowanie nienaruszonych kompleksów białkowych kompleksów białkowych w spektrometrze mas, zapewniając pomiary masy cząsteczkowej które pozwalają na określenie stechiometrii podjednostek i monitorowanie w czasie rzeczywistym interakcji białkowych w czasie rzeczywistym. Podjęto próby dalszego wyjaśnienia architektury podjednostki poprzez dysocjację podjednostek z nienaruszonego kompleksu poprzez zderzając je z atomami gazów obojętnych, takich jak argon lub ksenon. Niestety, ilość ilość informacji strukturalnych, które można uzyskać z takich strategii, jest niestety jest ograniczona przez niemal wszechobecne wyrzucanie pojedynczej, rozwiniętej podjednostki. Tutaj, przedstawiamy wyniki dysocjacji kompleksów białko-białko w fazie gazowej po zderzeniu z powierzchnią. Dysocjacja serii białek tetramerycznych i pentamerycznych białek pokazują, że alternatywne fragmenty podjednostek, których nie zaobserwowano przez wielokrotne zderzenia z atomami gazu, mogą być generowane przez zderzenia powierzchniowe. powierzchni. Przedstawiono dowody na zachowanie struktury poszczególnych podjednostek, a w niektórych przypadkach na zachowanie struktury, a w niektórych przypadkach zachowanie niekowalencyjnych interakcji między podjednostkami i ligandami. podjednostkami i ligandami. Różnice te przypisujemy szybkiemu, dużemu nakładowi energii zderzeń jon-powierzchnia, co prowadzi do dysocjacji podjednostek przed rozwinięciem poszczególnych monomerów.
Nienaruszone zespoły makromolekularne są analizowane za pomocą zaawansowanej spektrometrii mas. Jak duże kompleksy (pod względem masy cząsteczkowej) zostały zbadane?
2,3 megadalton