Dejodynaza jodotyroninowa typu II (D2) jest retikulum endoplazmatycznym typu I (ER) - rezydentna selenoproteina zawierająca fałd tioredoksyny, która aktywuje hormon tarczycy hormon tarczycy. D2 jest inaktywowana przez ubikwitynację związaną z ER i może być reaktywowany przez dwie specyficzne dla ubikwityny peptydazy oddziałujące z D2 deubikwitynazy (DUB). Tutaj wykorzystaliśmy modele komórkowe z ekspresją D2, aby określić, że Ubikwitynacja D2 (UbD2) zachodzi poprzez łańcuchy ubikwityny związane z K48 i że ekspozycja na jego naturalny substrat, T4, przyspiesza tworzenie UbD2 i retrotranslokację do cytoplazmy poprzez interakcję z kompleksem p97-ATPazy. Retrotranslokacja D2 obejmuje również deubikwitynację przez DUB związaną z p97 Ataksynę-3 (Atx3). Hamowanie Atx3 za pomocą eeyarestatyny-I nie wpłynęło na wiązanie D2:p97 ale zmniejszyło retrotranslację UbD2 i spowodowało akumulację w ER pasm UbD2 o wysokiej masie cząsteczkowej prawdopodobnie poprzez zakłócanie wiązanie peptydaz specyficznych dla D2-ubikwityny. Po znalezieniu się w cytozolu, D2 jest dostarczany do proteasomów, o czym świadczy koprecypitacja z podjednostką proteasomu 19S S5a i zwiększoną kolokalizacją z proteasomem 20S. Wnioskujemy, że interakcja między UbD2 i p97/Atx3 pośredniczy w retranslokacji UbD2 do cytoplazmy w celu końcowej degradacji. cytoplazmy w celu końcowej degradacji w proteasomach, szlaku, który jest przyspieszany przez ekspozycję na T4. --- Ubikwitynacja białek zachodzi poprzez tworzenie wiązania izopeptydowego pomiędzy C-końcową glicyną ubikwityny (Ub) i grupą ɛ-aminową substratu reszt lizyny substratu. Ta potranslacyjna modyfikacja, która zachodzi poprzez przyłączenie pojedynczych i/lub wielokrotnych kopii łańcuchów mono-ubikwityny i poli-ubikwityny łańcuchów, jest zaangażowana w kluczowe zdarzenia komórkowe, takie jak degradacja białek, regulacja cyklu komórkowego i naprawa DNA. Nieprawidłowe funkcjonowanie szlaków ubikwityny jest również zaangażowane w patogenezę kilku ludzkich chorób, od raka po neurodegenerację. od raka po neurodegenerację. Jednakże, pomimo niewątpliwego znaczenia biologicznego, zrozumienie molekularnych podstaw tego, w jaki sposób ubikwitynacja reguluje różne szlaki było do tej pory silnie ograniczone przez trudności z wytworzeniem ilości wysoce jednorodnych próbek, które są potrzebne do charakterystyki strukturalnej za pomocą krystalografii rentgenowskiej i/lub NMR. W niniejszym artykule opisujemy produkcję miligramów wysoce czystej józefiny mono-ubikwitynowanej na lizynie 117 poprzez enzymatyczną ubikwitynację in vitro na dużą skalę. ubikwitynacji. Josephin jest domeną katalityczną ataksyny-3, białka odpowiedzialnego za ataksję rdzeniowo-móżdżkową typu 3. Ataksyna-3 jest pierwszym enzymem enzymem deubikwitynującym (DUB) aktywowanym przez mono-ubikwitynację. Wykazaliśmy, że próbki wytworzone opisaną metodą są prawidłowo fałdowane i odpowiednie do badań strukturalnych. Protokół pozwala na łatwe selektywne selektywne znakowanie składników. Nasze wyniki stanowią ważny dowód słuszności koncepcji który może utorować drogę do nowych podejść do badania ubikwitynowanych białek in vitro. białek. --- Ilościowe oznaczanie potranslacyjnych modyfikacji lizyny (PTM) metodą spektrometrii mas bottom-up spektrometrii mas jest utrudnione ze względu na potrzebę analogicznych pochodnych i produkcji różnych peptydów tryptycznych z niezmodyfikowanych i zmodyfikowanych wersji białka. wersji białka. Chemiczna derywatyzacja lizyn przed trawieniem enzymatycznym enzymatycznym omija te problemy i okazała się skuteczną metodą kwantyfikacji PTM lizyny. Najbardziej godnym uwagi przykładem jest zastosowanie deuteroacetylacji do ilościowego oznaczania acetylacji lizyny. W tej pracy, poziomy ubikwitynacji lizyny określono ilościowo przy użyciu strukturalnie homologicznej etykiety który jest chemicznie podobny do znacznika diglicyny (GlyGly), który pozostaje w miejscu ubikwitynacji po ubikwitynacji po trypsynolizie. Analiza LC-MS chemicznie równoważnego znacznika monoglicyny (Gly), który jest analogiczny do odpowiedniego znacznika GlyGly udowodniła, że znacznik monoglicyny może być stosowany do ilościowego oznaczania ubikwitynacji. ubikwitynacji. Protokół glicynylacji został następnie ustalony dla derywatyzacji białek w celu znakowania niezmodyfikowanych reszt lizyny pojedynczym znacznikiem glicyną. Zastosowano multimery ubikwityny, aby pokazać, że po glicynylacji i glicynylacji i trawieniu tryptycznym, odpowiedź spektrometryczna odpowiadających im analogicznych znakowanych peptydów można porównać w celu względnego oznaczenia ilościowego. Dla dowód zasady dotyczący możliwości zastosowania tej techniki do analizy ubikwitynacji w próbkach biologicznych, technika glicynylacji została wykorzystana do do ilościowego określenia wzrostu monoubikwitynowanego histonu H2B, który obserwuje się w drożdżach, w których brakuje enzymu odpowiedzialnego za deubikwitynację H2B-K123, w porównaniu do do drożdży typu dzikiego. --- Gen oksydazy lizylowej hamuje sygnalizację Ras w transformowanych fibroblastach i komórkach raka piersi. komórkach raka piersi. Jego aktywność została zmapowana do 162 aminokwasowej domeny propeptydowej (LOX-PP) białka prekursorowego oksydazy lizylowej. LOX-PP hamował oś sygnałową Oś sygnałowa Her-2/Ras w komórkach raka piersi i zmniejszyła obciążenie guza piersi wywołane przez Her-2 w modelu ksenoprzeszczepu. Ponieważ jego mechanizm działania jest w dużej mierze nieznany, przeprowadzono oczyszczanie powinowactwa / spektrometrię masową i "białko oddziałujące z Cbl o masie 85 kDa" (CIN85) zidentyfikowane jako białko towarzyszące białko. CIN85 jest białkiem adapterowym zawierającym SH3, które ulega nadekspresji w inwazyjnych rakach piersi. inwazyjnych rakach piersi. Domeny SH3 CIN85 oddziałują z c-Cbl, ligazą ubikwityny E3 ligazą ubikwityny E3, poprzez niekonwencjonalną sekwencję ligandu PxxxPR, z najwyższym powinowactwem wykazywanym przez domenę SH3-B. Interakcja z CIN85 rekrutuje c-Cbl do kompleksu kompleksu AMAP1, gdzie jego aktywność ubikwitynacji jest niezbędna dla komórek rakowych komórek nowotworowych do rozwoju fenotypu inwazyjnego i degradacji macierzy. Bezpośrednia interakcji LOX-PP z CIN85 została potwierdzona przy użyciu koimmunoprecypitacji lizatów z komórek raka piersi i oczyszczonych białek ulegających ekspresji. Interakcja CIN85 z c-Cbl była zmniejszona przez LOX-PP. Specyficzne dla domeny CIN85 i mutanty delecyjne LOX-PP zostały przygotowane i wykorzystane do mapowania miejsc interakcji z domeną SH3-B CIN85 i epitopem obejmującym aminokwasy kwasy od 111 do 116 LOX-PP. Specyficzne mutanty punktowe LOX-PP P111A i R116A nie oddziaływały z CIN85 lub nie konkurowały o wiązanie CIN85 z c-Cbl. Modelowanie strukturalne zidentyfikowało nowy nietypowy motyw wiążący PxpxxRh SH3 w tym regionie LOX-PP. regionie LOX-PP. Wykazano, że interakcja LOX-PP z CIN85 zmniejsza fenotyp inwazyjny inwazyjny fenotyp komórek raka piersi, w tym ich zdolność do degradacji otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej i wzrostu Matrigelu. Zatem LOX-PP oddziałuje z CIN85 za pośrednictwem nowego motywu wiążącego SH3, a związek ten zmniejsza inwazję promowaną przez CIN85 przez komórki raka piersi. --- Ubikwitynacja jest procesem, który obejmuje kowalencyjne przyłączenie 76-residowego białka ubikwityny do lizyny. 76-reszty białkowej ubikwityny poprzez jej C-końcową di-glicynę (GG) do reszt lizyny (K) w białkach substratowych. (K) na białkach substratowych. Ta potranslacyjna modyfikacja wywołuje szeroki zakres konsekwencji funkcjonalnych, w tym ukierunkowanie białek na degradacji proteasomalnej, zmieniając zdarzenia związane z przemieszczaniem subkomórkowym i ułatwianie interakcji białko-białko. Istnieje wiele metod identyfikacji miejsc ubikwitynacji na interesujących nas białkach, w tym mutageneza ukierunkowana na miejsce i spektrometria masowa oczyszczania przez powinowactwo (AP-MS). Ostatnie publikacje podkreślają również zastosowanie wzbogacania peptydów na poziomie wzbogacanie peptydów zmodyfikowanych K-GG z lizatów całych komórek w celu globalnej charakterystyki miejsc ubikwitynacji. Tutaj zbadaliśmy użyteczność tej techniki do ukierunkowanego mapowania miejsc ubikwitynacji na poszczególnych białkach. Dla serii białek związanych z błoną i cytoplazmatycznych substratów, w tym erbB-2 (HER2), Dishevelled-2 (DVL2) i receptora komórek T α (TCRα), zaobserwowaliśmy, że wzbogacanie immunologiczne peptydu K-GG konsekwentnie dało dodatkowe miejsca ubikwitynacji poza tymi zidentyfikowanymi na poziomie białka Eksperymenty AP-MS. Aby ocenić to ilościowo, lizaty znakowane SILAC zostały przygotowane i wykorzystane do porównania obfitości poszczególnych peptydów K-GG z próbek przygotowanych równolegle. Konsekwentnie, wzbogacanie immunopowinowactwa peptydu K-GG dało ponad czterokrotnie wyższe poziomy zmodyfikowanych peptydów niż metody AP-MS. AP-MS. Korzystając z tego podejścia, scharakteryzowaliśmy indukowaną ubikwitynację na wielu członkach kompleksu receptora komórek T, które są na które funkcjonalnie wpływa stres retikulum endoplazmatycznego (ER). Łącznie, dane te wykazują użyteczność wzbogacania peptydów immunopowinowactwa dla pojedynczego białka analizy miejsca ubikwitynacji i zapewniają wgląd w ubikwitynację HER2, DVL2 i białek w kompleksie receptora komórek T. --- Ubikwitynacja jest niezbędna do regulacji homeostazy białek komórkowych. Odgrywa również kluczową rolę w wielu procesach sygnalizacyjnych. Ostatnie postępy w produkcji produkcji i dostępności przeciwciał, które rozpoznają pozostałości Lys-ɛ-Gly-Gly (K-ɛ-GG) powstające w wyniku trawienia trypsyną białek posiadających ubikwitynowane łańcuchy boczne lizyny. znacznie poprawiły zdolność do wzbogacania i wykrywania endogennej ubikwitynacji. endogennych miejsc ubikwitynacji za pomocą spektrometrii mas (MS). Poniższy protokół opisuje kroki wymagane do ukończenia wielkoskalowego eksperymentu ubikwitynacji w celu wykrycia dziesiątek tysięcy różnych miejsc ubikwitynacji z linii komórkowych lub próbek tkanek. z linii komórkowych lub próbek tkanek. W szczególności przedstawiamy szczegółowe, instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, frakcjonowania off-line przez chromatografię w odwróconej fazie przy pH 10, unieruchomienie przeciwciała specyficznego dla do K-ɛ-GG do kulek poprzez chemiczne sieciowanie, wzbogacanie ubikwitynowanych peptydów przy użyciu tych przeciwciał peptydów przy użyciu tych przeciwciał i analiza proteomiczna wzbogaconych próbek przez LC-tandem MS (MS/MS). Względną kwantyfikację można osiągnąć poprzez znakowanie stabilnym izotopem aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC) komórek. komórek. Po przygotowaniu próbek komórek lub tkanek do lizy, opisany protokół protokół można ukończyć w ciągu ∼5 d.
Który znacznik masowy ujawnia ubikwitynację reszty lizyny?
Lys-ɛ-Gly-Gly (K-ɛ-GG) jest pozostałością powstałą w wyniku trawienia trypsyną białek posiadających ubikwitynowane łańcuchy boczne lizyny.