Geny linii zarodkowej nowotworu (CG) są normalnie wyrażane w komórkach zarodkowych i nieprawidłowo wyrażane w różnych nowotworach. ekspresji w różnych nowotworach; ich immunogenność doprowadziła do do powszechnego rozwoju szczepionek przeciwnowotworowych ukierunkowanych na te antygeny. BORIS/CTCFL jest autosomalnym antygenem CG i obiecującym celem szczepionki przeciwnowotworowej. BORIS jest jedynym znanym paralogiem CTCF, genu ściśle zaangażowanego w imprinting genomowy, izolację chromatyny i regulację jądrową. Wcześniej wykazaliśmy, że BORIS ulega ekspresji w nabłonkowym raku jajnika (EOC) i że jego ekspresja pokrywa się z promotorem i globalną hipometylacją DNA. Ostatnio, 23 różne warianty warianty mRNA BORIS i zostały funkcjonalnie pogrupowane w sześć rodzin izoform BORIS. sześć rodzin izoform BORIS (sf1-sf6). W niniejszym badaniu scharakteryzowaliśmy ekspresję rodzin izoform BORIS w prawidłowym jajniku (NO) i EOC, z których te ostatnie zostały wybrane w celu uwzględnienia dwóch grup o bardzo zróżnicowanym globalny status metylacji DNA. Stwierdziliśmy selektywną ekspresję rodzin izoform BORIS w NO, która ulega zmianie w EOC, głównie poprzez aktywację BORIS sf1 w EOC. Porównując próbki EOC w oparciu o status metylacji, stwierdzamy, że stwierdzamy, że rodziny izoform BORIS sf1 i sf2 są selektywnie aktywowane w globalnie hipometylowanych guzach. W przeciwieństwie do tego, CTCF jest regulowany w dół w EOC i stosunek rodzin izoform BORIS sf1, sf2 i sf6 w funkcji CTCF jest podwyższony w guzach hipometylowanych. Wreszcie, ekspresja wszystkich rodzin izoform BORIS była indukowana w różnym stopniu przez epigenetyczne leki modulujące w liniach komórkowych EOC szczególnie, gdy inhibitory DNMT i HDAC były stosowane w połączeniu. --- BORIS (CTCFL) jest paralogiem CTCF (czynnik wiążący CCCTC; NM_006565), wszechobecnie wyrażanego białka wiążącego DNA białko wiążące DNA o zróżnicowanej roli w ekspresji genów i organizacji chromatyny. i organizacji chromatyny. BORIS i CTCF mają praktycznie identyczne domeny palca cynkowego palec cynkowy, ale wykazują znaczne różnice w ich odpowiednich regionach C- i N-końcowych. regionach. W przeciwieństwie do CTCF, ekspresja BORIS została odnotowana tylko w jądrach i niektórych nowotworach złośliwych. niektórych nowotworach złośliwych, co prowadzi do jego klasyfikacji jako antygenu "rak-jądro". antygen. Jednak wzór ekspresji BORIS jest zarówno istotnym, jak i nierozwiązaną kwestią w dziedzinie białek wiążących DNA. Tutaj zidentyfikowaliśmy BORIS w cytoplazmie i jądrze wielu normalnych i nowotworowych komórek. Porównujemy lokalizację CTCF i BORIS w jądrze i wykazujemy wzbogacenie BORIS w obrębie nukleolu, wewnątrz struktury rdzenia nukleoliny i w sąsiedztwie fibrylliny w gęstym składniku fibrylarnym. W przeciwieństwie do tego, CTCF nie jest wzbogacony w jąderku. Obrazowanie na żywo komórek przejściowo transfekowanych z BORIS znakowanym GFP potwierdziło jąderkową akumulację BORIS. Podczas gdy poziomy transkryptu BORIS są niskie w porównaniu do CTCF, poziomy jego białka są łatwo wykrywalne. wykrywalne. Odkrycia te pokazują, że ekspresja BORIS jest bardziej rozpowszechniona niż wcześniej sądzono wcześniej sądzono, i sugerują rolę BORIS w funkcjonowaniu jąder komórkowych. --- Brother of the Regulator of Imprinted Sites (BORIS) jest paralogiem CTCF ssaków z tymi samymi centralnymi palcami 11Zn (11ZF), które pośredniczą w specyficznych interakcjach z różnymi miejscami docelowymi o długości około 50 pz. Regulowane in vivo zajmowanie takie miejsca mogą dawać strukturalnie i funkcjonalnie różne kompleksy CTCF/DNA zaangażowane w różne aspekty regulacji genów, w tym kontrolę epigenetyczną imprintingu genów i inaktywacji chromosomu X. W tych ostatnich funkcjach pośredniczą przez wrażliwe na meCpG wiązanie 11ZF. Ponieważ CTCF jest normalnie obecny we wszystkich komórkach somatycznych komórkach somatycznych, podczas gdy BORIS jest aktywny tylko w CTCF- i z niedoborem 5-metylocytozyny dorosłych męskich komórkach zarodkowych, zasugerowano przełączenie obłożenia DNA z CTCF na BORIS aby regulować specyficzność miejsca i czas przeprogramowania epigenetycznego. Dodatkowo do regionów kontrolnych imprintingu ojcowskiego wiążących 11ZF, promotory genów nowotworowych również ulegają remetylacji podczas przełączania CTCF/BORIS w komórkach zarodkowych. Tylko promotory genów jąder nowotworowych są normalnie wyciszone we wszystkich komórkach somatycznych ale aktywowane podczas spermatogenezy, gdy są demetylowane w BORIS-dodatnich komórkach zarodkowych i są nieprawidłowo derepresjonowane w różnych nowotworach. Pokazujemy tutaj, że BORIS ulega również ekspresji w wielu nowotworach, a zatem sam jest genem raka jąder i że warunkowa ekspresja BORIS w normalnych fibroblastach aktywuje selektywnie geny selektywnie aktywuje geny nowotworowe. Sprawdziliśmy, czy zastąpienie CTCF przez BORIS na regulacyjnym DNA występuje in vivo po aktywacji prototypowego genu nowotworowego, MAGE-A1. Przejście od hipermetylowanego/wyciszonego do hipometylowanego/aktywowanego stanu indukowanego w normalnych komórkach przez 5-aza-2'-deoksycytydynę (5-azadC) było naśladowane przez warunkowe wprowadzenie BORIS i jest związane z całkowitym przełączeniem z CTCF na BORIS w pojedynczym celu 11ZF. Miejsce to wykazało nowy typ wiązania CTCF/BORIS 11ZF niewrażliwy na metylację CpG. Podczas gdy indukcja BORIS przez 5-azadC trwa tylko kilka godzin kilka godzin, derepresja MAGE-A1 nastąpiła 1 do 2 dni później, co sugeruje, że BORIS pośredniczy w aktywacji genów nowotworowych przez 5-azadC. Rzeczywiście, zakażenie normalnych fibroblastów retrowirusami anty-BORIS z krótką spinką do włosów RNA przed leczenie 5-azadC blokowało reaktywację MAGE-A1. Sugerujemy, że BORIS jest prawdopodobnie wiąże maszynerię epigenetyczną z nową klasą sekwencji docelowych CTCF/BORIS 11ZF, które pośredniczą w indukcji sekwencji, które pośredniczą w indukcji genów nowotworowych. --- Sekwencje regulatorowe rozpoznawane przez unikalną parę paralogicznych czynników, CTCF i BORIS, zostały zaangażowane w epigenetyczną regulację imprintingu i inaktywacji chromosomu X i inaktywacji chromosomu X. Nowotwory płuc wykazują demetylację w całym genomie związaną z derepresją określonej klasy genów kodujących antygeny nowotworowe (CT), takich jak NY-ESO-1. Geny CT ulegają normalnej ekspresji w BORIS-dodatnich męskich komórkach zarodkowych z niedoborem zawartości CTCF i meCpG, ale są ściśle wyciszone w komórkach somatycznych. Niniejsze badanie zostało podjęte w celu ustalenia, czy nieprawidłowa aktywacja BORIS przyczynia się do derepresji NY-ESO-1 podczas raka płuc. Wstępne eksperymenty wykazały, że NY-ESO-1 zbiegła się z derepresją BORIS w hodowanych komórkach raka płuc. komórkach raka płuc. Ilościowa analiza odwrotnej transkrypcji-PCR wykazała silną, silną, zbieżną indukcję ekspresji BORIS i NY-ESO-1 w komórkach raka płuc, ale ale nie normalnych ludzkich komórkach nabłonka oskrzeli po zastosowaniu 5-aza-2'-deoksycytydyny (5-azadC), depsipeptydu FK228 (DP) lub sekwencyjnej ekspozycji na 5-azadC/DP w warunkach klinicznie istotnych warunkach. Sekwencjonowanie bisulfitowe, PCR specyficzny dla metylacji, i eksperymenty immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) wykazały, że indukcja BORIS zbiegła się z bezpośrednią modulacją struktury chromatyny w obrębie wyspy CpG w 5'-flankującym niekodującym regionie tego genu. Eksperymenty kotransfekcji przy użyciu konstruktów promotor-reporter potwierdziły, że BORIS moduluje ekspresję NY-ESO-1 w komórkach raka płuc. Eksperymenty przesunięcia żelu i ChIP ujawniły nowe miejsce wiążące CTCF/BORIS w promotorze NY-ESO-1, które w przeciwieństwie do takie miejsca w regionie kontrolnym imprintingu H19 i chromosomie X są niewrażliwe na metylację CpG in vitro. In vivo zajęcie tego miejsca przez CTCF było związane z wyciszeniem promotora NY-ESO-1, podczas gdy przejście z CTCF do BORIS zbiegło się z derepresją NY-ESO-1. Podsumowując, te dane wskazują, że wzajemne wiązanie CTCF i BORIS z promotorem NY-ESO-1 pośredniczy w epigenetycznej regulacji tego genu CT w komórkach raka płuc i sugeruje, że indukcja że indukcja BORIS może być nową strategią zwiększania immunogenności raka płuc. raka płuc. --- CTCF jest wszechobecnym białkiem z palcem cynkowym (ZF) o bardzo wszechstronnych funkcjach. funkcjach: oprócz wyciszania lub aktywacji transkrypcji w sposób zależny od kontekstu, organizuje epigenetycznie kontrolowaną chromatynę izolatory, które regulują wdrukowane geny w soma. Niedawno zidentyfikowaliśmy paralog paralog CTCF, określany jako BORIS dla Brother of the Regulator of Imprinted Sites, który ulega ekspresji tylko w jądrach. BORIS ma te same eksony kodujące domenę 11 ZF jak geny CTCF ssaków, a zatem wchodzi w interakcje z podobnymi elementami cis ale koduje zakończenia aminowe i karboksylowe różne od tych w CTCF. Normalnie, CTCF i BORIS są wyrażane we wzajemnie wykluczającym się wzorze, który koreluje z ponownym ustawianiem znaczników metylacji podczas różnicowania męskich komórek zarodkowych różnicowania męskich komórek płciowych. Antagonistyczne cechy tych dwóch genów rodzeństwa są podkreślone przez wykazanie, że podczas gdy nadekspresja CTCF blokuje proliferację komórek, ekspresja BORIS w komórkach normalnie BORIS-negatywnych promuje wzrost komórek, który może prowadzić do transformacji. Sugestia, że BORIS kieruje epigenetycznym przeprogramowanie w miejscach docelowych CTCF wpływa na obserwacje, że ludzki BORIS jest nie tylko nieprawidłowo aktywowany w szerokim zakresie ludzkich nowotworów, ale także mapuje do regionu amplifikacji związanego z rakiem w 20q13. Rywalizacja rodzeństwa spowodowana nieprawidłową ekspresją BORIS w nowotworach może zakłócać normalne funkcje CTCF, w tym hamowanie wzrostu, i przyczyniać się do epigenetycznej rozregulowania, które jest powszechną cechą ludzkiego raka. --- CTCF odgrywa istotną rolę w strukturze i funkcji chromatyny. CTCF jest ulega wszechobecnej ekspresji i odgrywa różne role w regulacji genów, imprintingu, izolacji, interakcjach wewnątrz/ międzychromosomalnych, kompartmentalizacji jądrowej, i alternatywny splicing. CTCF ma pojedynczy paralog, specyficzny dla jąder gen gen podobny do CTCF (CTCFL)/BORIS. CTCF i BORIS mogą być deregulowane w nowotworach. Gen gen supresorowy nowotworu CTCF może być zmutowany lub usunięty w nowotworze, lub wiązanie DNA może być zmienione przez zmiany epigenetyczne. BORIS ulega nieprawidłowej ekspresji często w nowotworach, co prowadzi do tego, że niektórzy proponują pro-nowotworową rolę BORIS. Jednak BORIS może hamować proliferację komórek i jest zmutowany w raku podobnie jak CTCF, co sugeruje, że aktywacja BORIS w raku może być spowodowana globalnymi zmian genetycznych lub epigenetycznych typowych dla transformacji nowotworowej. --- BORIS, podobnie jak inni członkowie rodziny "antygenów nowotworowych/jądrowych", jest normalnie ulega ekspresji w komórkach zarodkowych jąder i represji w komórkach somatycznych, ale jest nieprawidłowo aktywowany w nowotworach. Aby zrozumieć mechanizmy regulujące ekspresję ludzką ekspresję BORIS, scharakteryzowaliśmy jego region 5'-flanking. Używając 5' RACE, zidentyfikowaliśmy trzy promotory, oznaczone jako A, B i C, odpowiadające miejsca startu transkrypcji w -1447, -899 i -658 bp przed pierwszym ATG. Alternatywne użycie promotora wygenerowało co najmniej pięć alternatywnie splicowanych mRNA BORIS o różnych okresach półtrwania określonych przez różne 5'-UTR. W normalnym jądrze, BORIS jest transkrybowany ze wszystkich trzech promotorów, ale 84% z 30 testowanych linii komórek rakowych nowotworowych wykorzystywało tylko promotor(y) A i/lub C, podczas gdy inne wykorzystywały głównie promotory Różnice w wykorzystaniu promotorów między normalnymi i nowotworowymi komórkami sugerowały, że podlegały one zmianom. i komórkami nowotworowymi sugerowały, że podlegały one zróżnicowanej regulacji. My że metylacja DNA i funkcjonalne p53 przyczyniają się do negatywnej regulacji każdego promotora. Co więcej, redukcja CTCF w normalnie BORIS-negatywnych ludzkich fibroblastach spowodowało derepresję promotorów BORIS. Wyniki te stanowią mechanistyczną podstawę do zrozumienia związanych z rakiem między haploinsuficjencją CTCF a derepresją BORIS, a także między brakiem funkcjonalnego p53 a nieprawidłową aktywacją BORIS.
Czy CTCF i BORIS są zaangażowane w regulację genomu i raka?
Tak. CTCF ulega wszechobecnej ekspresji i odgrywa różne role w regulacji genów, imprintingu, izolacji, interakcjach wewnątrz/ międzychromosomalnych, kompartmentalizacji jądrowej i alternatywnym splicingu. CTCF ma jeden paralog, specyficzny dla jąder gen podobny do CTCF (CTCFL)/BORIS. CTCF i BORIS mogą być deregulowane w nowotworach. Gen supresorowy nowotworu CTCF może być zmutowany lub usunięty w raku, lub wiązanie DNA CTCF może być zmienione przez zmiany epigenetyczne. BORIS często ulega nieprawidłowej ekspresji w nowotworach, co prowadzi niektórych do sugerowania pro-nowotworowej roli BORIS. Jednak BORIS może hamować proliferację komórek i jest zmutowany w raku podobnie jak CTCF, co sugeruje, że aktywacja BORIS w raku może być spowodowana globalnymi zmianami genetycznymi lub epigenetycznymi typowymi dla złośliwej transformacji.