Centriole są niezbędne do tworzenia rzęsek i wici. Tworzą one również rdzeń centrosomu, który organizuje tablice mikrotubul ważne dla kształtu kształtu komórki, polaryzacji, ruchliwości i podziału. Tutaj wykorzystaliśmy super-rozdzielczość mikroskopię strukturalną 3D do analizy relacji przestrzennych 18 centrioli i pericentrioli. centrioli i składników macierzy pericentriolarnej (PCM) ludzkich centrosomów na różnych etapach cyklu komórkowego. Podczas mitozy białka PCM tworzyły rozszerzone sieci sieci z przeplatającą się γ-tubuliną. Podczas interfazy większość białek była rozmieszczona w określonych odległościach od ścian centrioli, co skutkuje barwieniem pierścieniowym często z widocznymi masami gęstości. Dzięki zastosowaniu przeciwciał przeciwciał, stwierdziliśmy, że C-koniec Cep152 jest bliżej centrioli niż N-końca, ilustrując moc 3D-SIM do badania rozmieszczenia białek. Białka wyrostka robaczkowego wykazywały pierścienie z wieloma masami gęstości, a liczba tych mas była silnie zredukowana podczas mitozy. Na proksymalnym końcu centrioli, Sas-6 tworzył kropkę w miejscu montażu centrioli potomnej, co jest zgodne z jego rolą w formowaniu koła wozu. Plk4 i STIL kolokalizowały z Sas-6, ale Cep135 był związany głównie z centriolami macierzystymi. Co ciekawe, Plk4 utworzył kropkę na powierzchni centrioli macierzystej, zanim barwienie Sas-6 stało się wykrywalne, wskazując, że Plk4 stanowi wczesny marker dla miejsca powstawania centrioli. Nasze badanie zapewnia nowy wgląd w architekturę ludzkich centrosomów i ilustruje moc mikroskopii superrozdzielczej mikroskopii w ujawnianiu względnej lokalizacji centrioli i białek PCM w niespotykanej dotąd szczegółowości. --- Struktura centrioli i ciała podstawnego (CBB) zarodkuje rzęski i wici, a także jest istotnym składnikiem centrosomu, leżącym u podstaw eukariotycznej ruchliwości opartej na mikrotubulach, podziału komórek i polaryzacji. W ostatnich latach zostały zidentyfikowane, ale niewiele wiadomo na temat ich regulacji i ewolucji. niewiele wiadomo na temat ich regulacji i ewolucji. Biorąc pod uwagę różnorodność kontekstów komórkowych kontekstów komórkowych napotykanych u eukariontów, ale niezwykłą konserwację morfologii CBB zapytaliśmy, czy ogólne zasady mechanistyczne mogą wyjaśnić montaż CBB montaż. Przeanalizowaliśmy rozmieszczenie każdego składnika ludzkiej maszynerii CBB u eukariontów jako strategię generowania testowalnych hipotez. hipotez. Znaleźliśmy ewolucyjnie spójny i ancestralny moduł, który określamy mianem określamy jako UNIMOD i jest on zdefiniowany przez trzy komponenty (SAS6, SAS4/CPAP i BLD10/CEP135), który koreluje z występowaniem CBB. Nieoczekiwanie, inni gracze (SAK/PLK4, SPD2/CEP192 i CP110) pojawiły się w sposób specyficzny dla taksonu. My że duplikacja genów odgrywa ważną rolę w ewolucji składników CBB CBB i pokazujemy, że w przypadku BLD10/CEP135 jest to źródło specyficzności tkankowej w CBB i biogenezie wici. Ponadto obserwujemy ekstremalną dywergencję białek wśród komponentów CBB i pokazujemy eksperymentalnie, że istnieje utrata komplementarności międzygatunkowej wśród członków rodziny SAK/PLK4, co sugeruje specyficzne dla gatunku adaptacje w montażu CBB. Proponujemy, aby teoria UNIMOD wyjaśnia zachowanie architektury CBB i że specyficzne dla taksonu i tkanki innowacje molekularne specyficzne dla taksonu i tkanki innowacje molekularne, uzyskane poprzez pojawienie się, duplikację i dywergencji, odgrywają ważną rolę w koordynowaniu biogenezy i funkcji CBB w różnych kontekstach komórkowych. różnych kontekstach komórkowych. --- Cep135 jest białkiem centrosomowym o masie 135 kDa, ważnym dla organizacji mikrotubul w komórkach ssaków [Ohta et al. w komórkach ssaków [Ohta et al., 2002: J. Cell Biol. 156: 87-99]. Aby zidentyfikować cząsteczki oddziałujące z Cep135, przeanalizowaliśmy drożdżowe biblioteki dwuhybrydowe. Jeden klon kodował dynamitynę, podjednostkę p50 dynaktyny, która jest zlokalizowana w centrosomie i wykazano, że oddziałuje z Cep3535. centrosomie i wykazano, że jest zaangażowana w kotwiczenie mikrotubul do centrosomów. Centralna domena p50 wiąże się z C-końcową sekwencją Cep135; zostało to dodatkowo potwierdzone przez immunoprecypitację i immunobarwienie komórek CHO koeksprymujących domeny wiążące dla Cep135 i p50. Egzogenny p50 pozbawiony domeny wiążącej Cep 135 nie zlokalizował się w centrosomie, sugerując, że Cep135 jest wymagany do początkowego ukierunkowania centrosomu. Zmienione poziomy Cep135 i p50 przez RNAi i nadekspresję białka spowodowały uwolnienie endogennych cząsteczek partnerskich z centrosomów. Spowodowało to również przemieszczenie innych cząsteczek centrosomalnych, takich jak gamma-tubulina i pericentryna, ostatecznie prowadząc do dezorganizacji wzorów mikrotubul. Wyniki te sugerują, że Cep135 i p50 odgrywają ważną rolę w montażu i utrzymanie funkcjonalnych centrów organizujących mikrotubule. --- W celu zbadania mechanizmu duplikacji centrosomów w komórkach cyklicznych ustanowiliśmy nowy system tworzenia wielu centrosomów w dwóch typach komórek komórkach: Komórki CHO traktowane RO3306, inhibitorem kinazy zależnej od cyklin 1 (Cdk1) oraz komórkach DT40, w których Cdk zostały wyeliminowane za pomocą genetyki chemicznej. Komórki inaktywowane przez Cdk1 zainicjowały replikację DNA i duplikację centrosomu na początku fazy na początku fazy S. Zostały one zatrzymane pod koniec fazy G2, ale cykl centrosomowy nadal wytwarzały nadliczbowe centriole/centrosomy bez endoreplikacji DNA w tych komórkach. bez endoreplikacji DNA w tych komórkach. Centrosomy były amplifikowane w wysoce synchroniczny i powtarzalny sposób: wszystkie z nich znajdowały się obok jądra zlokalizowane obok jądra i rozrzucone daleko od siebie w odległości kilku μm. Podwójny nokaut Cdk1 i Cdk2 spowodował zatrzymanie cyklu komórkowego w G1/S i centrosomy nie były już duplikowane. Jednak komórki nadal rosły i zwiększały swoją objętość ponad 10-krotnie w ciągu 48 godzin hodowli. Składniki centrosomu składniki, w tym γ-tubulina i Cep135, były syntetyzowane i gromadzone podczas zatrzymania, umożliwiając szybkie namnażanie centrosomów po wyzdrowieniu z zatrzymania cyklu komórkowego lub ekspresji egzogennego Plk4 w komórkach G1/S. Tak więc amplifikacja centrosomu wynika z dyskoordynacji cyklu centrosomu od progresji innych zdarzeń cyklu komórkowego, który jest kontrolowany przez różne poziomy aktywności Cdk. --- Ciała podstawowe zarodkują, zakotwiczają i organizują rzęski. Jako kotwica dla ruchliwych rzęsek, ciała podstawne muszą być odporne na siły skierowane w stronę komórki jako w kierunku komórki w wyniku bicia rzęsek. Cząsteczki i uogólnione mechanizmy, które przyczyniają się do utrzymania ciał podstawnych pozostają do odkrycia. Bld10/Cep135 jest zewnętrznym białkiem domeny cartwheel ciała podstawnego, które ma ustalone rolę w montażu rodzących się ciał podstawnych. Odkryliśmy, że białko Bld10 najpierw włącza się stabilnie do ciał podstawnych na wczesnym etapie nowego montażu. Białko Bld10 nadal gromadzi się w ciałach podstawnych po złożeniu i stawiamy hipotezę, że pełny zestaw Bld10 jest wymagany do stabilizacji ciał bazalnych. Zidentyfikowaliśmy nowy mechanizm dla Bld10/Cep135 w utrzymaniu ciał bazalnych, tak aby ciała bazalne mogły mogą wytrzymać siły wytwarzane przez ruchliwe rzęski. Bld10 stabilizuje ciała poprzez promowanie stabilności A- i C-tubul ciała podstawnego oraz poprzez odpowiednie pozycjonowanie ostrzy mikrotubul tripletowych. Siły generowane przez bicie rzęsek promują demontaż ciała podstawnego w komórkach bld10Δ komórek. W ten sposób Bld10/Cep135 działa w celu utrzymania integralności strukturalnej ciał podstawnych ciała przeciwko siłom bicia rzęskowego oprócz jego oddzielnej roli w montażu ciała podstawnego. --- Cep135/Bld10 jest konserwatywnym białkiem centriolarnym wymaganym do tworzenia centralnego koła, wczesnego półproduktu w montażu centrioli. Co zaskakujące, Cep135/Bld10 nie jest niezbędny do duplikacji centrioli u Drosophila, co sugeruje, że Cep135/Bld10 nie jest niezbędny do tworzenia koła wozu, lub że koło wozu nie jest niezbędne do montażu centrioli u much. Używając tomografii elektronowej i mikroskopii superrozdzielczej pokazujemy, że centriole mogą tworzyć koło pod nieobecność Cep135/Bld10, ale szerokość centrioli jest zwiększona, a kółko wydaje się z czasem rozpadać. Używając mikroskopii 3D mikroskopii strukturalnej pokazujemy, że Cep135/Bld10 jest zlokalizowany w regionie między między wewnętrznymi (SAS-6, Ana2) i zewnętrznymi (Asl, DSpd-2 i D-PLP) komponentami centriolowymi, a lokalizacja wszystkich a lokalizacja wszystkich tych składników jest subtelnie zaburzona w brak Cep135 / Bld10, chociaż dziewięciokrotna symetria centriole jest zachowana. Tak więc u muszek Cep135/Bld10 nie jest niezbędny do montażu koła zamachowego lub do ustanowienia dziewięciokrotnej symetrii centrioli; raczej wydaje się, że stabilizuje połączenie między wewnętrznymi i zewnętrznymi komponentami centrioli. --- Komórki nowotworowe często indukują nieprawidłowe centrosomy, które mają wpływ na w inicjacji i progresji raka. Ludzkie komórki raka jelita grubego HCT116, zawierają nieprawidłowe centriole złożone ze zdezorganizowanych cylindrycznych mikrotubul i przemieszczonych wyrostków. Komórki te wyrażają również unikalne struktury związane z centrosomami struktury związane z podzbiorem składników centrosomalnych, w tym gamma-tubuliną, centryną i PCM1. Podczas leczenia hydroksymocznikiem te nieprawidłowe struktury struktury stają się bardziej obfite i ulegają zmianie kształtu z małych kropek na wydłużonych włókien. Chociaż gamma-tubulina wydaje się istnieć jako kompleks pierścieniowy, nieprawidłowe struktury nieprawidłowe struktury nie wspierają zarodkowania mikrotubul. Kilka linii dowodów sugeruje, że włókna odpowiadają zdezorganizowanej formie mikrotubul centriolowych. mikrotubul. Plk4, ssaczego homologa ZYG-1, niezbędnego do inicjacji biogenezy centrioli. biogenezy centrioli, nie jest związany z nieprawidłowymi centrosomami specyficznymi dla gamma-tubuliny. centrosomami. Ilość Plk4 w każdym centrosomie była mniejsza w komórkach z niż w komórkach bez nieprawidłowych centrosomów specyficznych dla gamma-tubuliny. centrosomy. Ponadto, powstawanie nieprawidłowych struktur zostało zniesione przez ekspresję egzogennego Plk4, ale nie SAS6 i Cep135/Bld10p, które są regulatorami regulatorami wymaganymi do organizacji mikrotubul z dziewięcioma trypletami mikrotubul. Wyniki te sugerują, że komórki HCT116 nie są w stanie zorganizować dziewięciokrotnej symetrii centrioli z powodu niewystarczającej ilości Plk4. --- Większość zwierząt ma dwa centriole w spermatydach (dystalne i proksymalne centriole). centriole), ale spermatydy owadów wydają się zawierać tylko jedną centriolę (Fuller 1993), który funkcjonalnie przypomina dystalny centriol. Używając fluorescencyjnych markerów markerów centriolowych, zidentyfikowaliśmy strukturę w pobliżu dystalnego centriole muchy, która która przypomina centriole proksymalne (tj. centriole proksymalne lub PCL). Pokazujemy, że PCL wykazuje kilka cech centrioli potomnych. Po pierwsze, pojedynczy Po pierwsze, pojedyncza PCL tworzy się w pobliżu proksymalnego segmentu starszej centrioli. Po drugie, białka białka centriolarne SAS-6, Ana1 i Bld10p/Cep135 znajdują się w PCL. Po trzecie, tworzenie PCL zależy od SAK/PLK4 i SAS-6. Wykorzystując genetyczny screen dla defektu PCL, zidentyfikowaliśmy mutację w genie kodującym konserwatywne białko centriolarne POC1, które jest częścią miejsca inicjacji centrioli potomnej (Kilburn i in. 2007) u Tetrahymena. Wnioskujemy, że PCL przypomina wczesną strukturę pośrednią strukturę tworzącego się centriolu, co może wyjaśniać, dlaczego w mikroskopie elektronowym nie obserwuje się typowej struktury centriolu. nie obserwuje się pod mikroskopem elektronowym. Proponujemy, aby podczas ewolucji ewolucji owadów, proksymalny centriol został uproszczony poprzez wyeliminowanie eliminując późniejsze etapy montażu centrioli. PCL może stanowić unikalny model do badania wczesnych etapów tworzenia centrioli. --- Rzęski i wici odgrywają wiele istotnych ról w rozwoju zwierząt i fizjologii komórek. i fizjologii komórek. Wadliwy montaż lub ruchliwość rzęsek stanowi etiologiczną podstawę etiologiczną rosnącej liczby chorób u ludzi. W związku z tym, jak rzęski i wici i wici oraz procesy, które napędzają ruchliwość, są niezbędne do zrozumienia tych chorób. tych chorób. Tutaj pokazujemy, że Drosophila Bld10, ortolog Chlamydomonas reinhardtii Bld10p i ludzkiego Cep135, jest wszechobecnym białkiem centriolarnym białkiem, które również lokalizuje się w ciele podstawnym spermatydy. Mutanty pozbawione Bld10 montują centriole i tworzą funkcjonalne centrosomy, ale centriole i Ciała podstawowe spermatyd mają krótką długość. bld10 zmutowane muchy są żywotne, ale bezpłodne, produkując niemotylne plemniki, których aksony są pozbawione centralnej pary mikrotubul. centralnej pary mikrotubul. Wyniki te pokazują, że Drosophila Bld10 jest wymagany do montażu centrioli i aksonemów w celu nadania ruchliwości cilium.
Gdzie w komórce znajduje się białko Cep135?
centrosom