CEL: Mikroalbuminuria wiąże się ze zwiększonym ryzykiem śmiertelności z jakiejkolwiek przyczyny i z przyczyn sercowo-naczyniowych. i śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych, ale mechanizm patofizjologiczny leżący u podstaw między wydalaniem albumin z moczem a chorobami układu krążenia pozostaje niejasny. pozostaje niejasny. Tutaj przetestowaliśmy hipotezę, że zwiększona apoptoza śródbłonka mikrocząsteczki i obniżone poziomy komórek progenitorowych śródbłonka (EPC) mogą przyczyniać się do patofizjologii mikroalbuminurii lub makroalbuminurii w chorobach sercowo-naczyniowych. choroby sercowo-naczyniowej. METODY: Cytometrię przepływową wykorzystano do oceny apoptozy komórek śródbłonka i poziomów krążących EPC poprzez ilościowe oznaczenie krążących apoptotycznych mikrocząstek CD31/annexin V i markerów EPC i markerów EPC (zdefiniowanych jako KDRCD133, CD34CD133, CD34KDR) we krwi obwodowej. krwi obwodowej. WYNIKI: Do badania włączono łącznie 125 pacjentów z nadciśnieniem tętniczym, z których z których 80 pacjentów (64%) miało normoalbuminurię (szybkość wydalania albuminy <20 mikrog/min, nocne próbki moczu), 35 pacjentów (28%) z mikroalbuminurią (wskaźnik wydalania albuminy 20-200 mikrog/min) i 10 pacjentów (8%) z makroalbuminurią (szybkość wydalania albumin >200 mikrog/min). W porównaniu z nadciśnieniem tętniczym z normoalbuminurią, pacjenci z mikroalbuminurią lub lub makroalbuminurią mieli istotnie więcej przypadków cukrzycy (P = 0,005), wyższe skurczowe ciśnienie ciśnienie krwi (P = 0,018) i podwyższony poziom kreatyniny w surowicy (P < 0,001). Wśród trzech grup, pacjenci z mikroalbuminurią lub makroalbuminurią mieli znacznie zwiększoną liczbę apoptotycznych mikrocząstek CD31/aneksyny V (1,8 +/- 2,2 w porównaniu z 3,0 +/- 4,3 w porównaniu z 5,2 +/- 6,2%, P = 0,044) i zmniejszoną liczbę krążących EPC (P < 0,05). W analizie wieloczynnikowej poziom apoptotycznych mikrocząsteczek CD31/annexin V był niezależnym predyktorem wydalania albumin z moczem u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym (P = 0,05). albumin w moczu u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym (P < 0,001). Mikrocząsteczki izolowane od pacjentów z nadciśnieniem tętniczym z mikroalbuminurią lub makroalbuminurią osłabiały proliferację i migrację EPC proliferacji, migracji i zwiększonej produkcji H2O2, starzenia się komórek i apoptozę w porównaniu z tymi pochodzącymi od pacjentów z nadciśnieniem tętniczym z normoalbuminurią. WNIOSEK: Wyniki te sugerują, że pacjenci z nadciśnieniem tętniczym z mikroalbuminurią lub makroalbuminurią mają zwiększoną apoptozę śródbłonka śródbłonka i obniżone poziomy krążących EPC, co może przyczyniać się do progresji choroby miażdżycowej i zwiększonego ryzyka sercowo-naczyniowego u u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym i nefropatią. --- CEL: Powszechnie wiadomo, że eksperymentalne skręcanie jąder indukuje apoptozę apoptozę specyficzną dla komórek rozrodczych. Aneksyna V (znak BD Pharmingentrade) wiąże fosfatydyloserynę, która zostaje odsłonięta na błonie komórkowej w komórkach apoptotycznych. Wykrywanie in vivo komórek apoptotycznych za pomocą fluorescencyjnie znakowanej aneksyny V jest nową techniką. techniką, którą oceniliśmy pod kątem wykrywania apoptotycznych komórek zarodkowych w mysim modelu skrętu jąder. mysim modelu skrętu jąder. MATERIAŁY I METODY: Aneksyna V znakowana fluoroforem indocyjaninowym (dwufunkcyjny ester bursztynoimidylowy cyjaniny 5.5) (Amersham, Little Chalfont, Wielka Brytania) wstrzyknięto dożylnie myszom 18 godzin po naprawie jednostronnego skrętu jąder o 720 stopni przez 2 godziny. Seryjne obrazy fluorescencji uzyskano 21, 24, 28 i 42 godziny po naprawie skrętu. Względną lokalizację fluoroforu wizualizowano in vivo przy użyciu optycznego systemu obrazowania małych zwierząt zamontowanego z filtrem w świetle bliskiej podczerwieni. Średnia intensywność fluorescencji w i jądrach pozorowanych określono ilościowo na obrazach jąder in situ odsłoniętych przez nacięcie brzucha i w jądrach ex vivo. WYNIKI: Stwierdzono znaczący wzrost intensywności fluorescencji na obrazach jąder w porównaniu z jądrami pozorowanymi. Zaobserwowano to w jądrach ex vivo, odsłoniętych i in vivo (odpowiednio 215%, 250% i 161%, p <0,05). Bisfunkcyjny ester bursztynoimidylowy cyjaniny 5.5 sprzężony z dehydrogenazą, białkiem o wielkości podobnej do aneksyny V, był do aneksyny V, zostało użyte do oceny wycieku kapilarnego. Było ono również bardziej zlokalizowane w jądrze torsyjnym w stosunku do jego kontralateralnej kontroli pozorowanej niezależnie od tego, czy były one eksponowane, czy ex vivo (odpowiednio 174% i 176%). WNIOSKI: Zgodnie z naszą wiedzą, badanie to po raz pierwszy demonstruje możliwość obrazowania fluorescencji w bliskiej podczerwieni in vivo apoptotycznych komórek zarodkowych komórek zarodkowych po skręceniu jąder u myszy. Pokazuje ważne czynniki zakłócające które należy wziąć pod uwagę, ponieważ ta nowa technika obrazowania jest rozwijana w celu wykrywania komórek apoptotycznych in vivo w jądrach lub w innych narządach. --- TŁO: Przeżywalność komórek endometriozy w miejscu ektopowym została badane pod kątem podatności tkanek endometriozy na apoptozę. apoptozę. W celu zbadania charakteru nieprawidłowego przeżycia komórek komórek endometriozy w lokalizacjach ektopowych, porównaliśmy apoptozę indukowaną lekami w w komórkach endometrium i endometriozy. METODY: Komórki zrębu endometrium uzyskano z prawidłowego endometrium u 11 pacjentek, które przeszły histerektomię. pacjentek, które przeszły histerektomię z powodu mięśniaka gładkokomórkowego bez endometriozy. Komórki endometriozy wyizolowano z wyściółki torbieli czekoladowej jajnika u 13 pacjentek poddanych operacji laparoskopowej. Komórki hodowano w obecności lub nieobecności staurosporyny. Apoptotyczną śmierć komórek oceniano poprzez barwienie jąder jodkiem propidyny i fosfatydyloseryną (marker wczesnych zdarzeń apoptotycznych) za pomocą apoptotycznych) za pomocą aneksyny V, a także za pomocą testu fragmentacji DNA. Liczba liczbę żywych komórek oszacowano za pomocą zmodyfikowanego MTT [3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2, 5-difenylobromek tetrazoliowy WST-8]. WYNIKI: Po 3 godzinach ekspozycji na staurosporynę, >50% komórek zrębu endometrium komórki stały się aneksyną V dodatnią. W przeciwieństwie do tego> 30% komórek endometriozy było dodatnich pod względem aneksyny V. Fragmentacja DNA nie była wyraźnie indukowana w komórkach komórkach endometriozy. Mniej niż 20% komórek endometrium przeżyło po ekspozycji na ekspozycji na staurosporynę, podczas gdy >40% komórek endometrium przeżyło. Śmierć komórek indukowana przez staurosporynę była częściowo blokowana przez inkubację z inhibitorem kaspazy inhibitorem kaspaz, N-benzyoksykarbonylo-Val-Ala-Asp(OMe)fluorometylo-ketonem (ZVAD-fmk), co sugeruje, że kaskada kaspaz może odgrywać rolę w procesie śmierci komórki. procesie śmierci komórki. WNIOSKI: Obniżona podatność na apoptozę w endometriotycznych komórkach zrębu może być związana z nieprawidłowym przetrwaniem w miejscach ektopowych w środowisku, które prawdopodobnie jest niekorzystne. środowisku, które jest prawdopodobnie niekorzystne. Wyniki te mogą mieć wpływ na patofizjologii endometriozy. --- Monocyty/makrofagi (Mphis), dominujące typy komórek w podostrym i przewlekłym zapaleniu przewlekłym zapaleniu, są przyciągane i aktywowane przez chemotaktyczny peptyd monocytów peptyd chemotaktyczny monocytów-1 (MCP-1). Mphis promują rozwiązanie stanu zapalnego poprzez indukcję apoptozy i fagocytozy starzejących się (zużytych) i przypadkowych (zbędnych) granulocytów. (zbędnych) granulocytów. Chcieliśmy ustalić, czy MCP-1, który selektywnie wiąże się z Mphis, może być stosowany do obrazowania podostrego i przewlekłego zapalenia. i przewlekłego stanu zapalnego. Staraliśmy się również zobrazować apoptozę granulocytów w obrębie tych zmian za pomocą aneksyny V znakowanej technetem-99m, markera komórek apoptotycznych. Sterylne zapalenie wywołano u 45 12-tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley przez głębokie domięśniowe wstrzyknięcie domięśniowe wstrzyknięcie terpentyny w prawe udo. Grupy od czterech do sześciu zwierząt zostały następnie zobrazowane 1 godzinę po wstrzyknięciu do żyły ogonowej 37-148 MBq (1-4 mCi) znakowanego 99mTc MCP-1 lub aneksyny V 1-14 dni po podaniu terpentyny. Analiza obrazu wykazała znacznie większą aktywność zarówno MCP-1, jak i aneksyny V w udach objętych stanem zapalnym niż w udach kontrolnych (odpowiednio 165%-290% i 188%-313%, odpowiednio; P<0,01) w dniach 1-5 po wstrzyknięciu terpentyny. Podwójna autoradiografia u zwierząt, którym jednocześnie wstrzyknięto surowicę bydlęcą znakowaną jodem 125 albuminą bydlęcą w dniach 1 i 4 wykazała specyficzną lokalizację MCP-1 do naciekających Mphis podczas gdy aneksyna V zlokalizowana w ogniskowych strefach apoptozy w granulocytach nacieków granulocytarnych przylegających do jam ropni. Liczenie studzienek scyntylacyjnych w dniu 5 wykazało znacznie wyższy (P<0,005) stosunek ropnia do kontrolnego uda specyficzne aktywności dla MCP-1 (5.83 +/- 2.17) i aneksyny V (9.24 +/- 2.8), jak w porównaniu do albuminy surowicy bydlęcej znakowanej 125I (3,11 +/- 0,65). Nie odnotowano znaczącego wzrostu wychwytu odnotowano podczas obrazowania lub analiz ex vivo w dniach 13. i 14, kiedy zmiany były głównie zwłókniałe. Stwierdzono, że znakowane 99mTc MCP-1 i aneksyna V znakowana 99mTc lokalizują się w strefach podostrego zapalenia. podostrego zapalenia, odzwierciedlając odpowiednio gęstość Mphis i częstość występowania apoptotycznych granulocytów. granulocytów. Środki te mogą być przydatne w charakteryzowaniu podostrego zapalenia. --- Zaproponowano nową strategię czułego wykrywania wczesnego etapu apoptozy w oparciu o metodę znakowania nanocząstkami złota (GNP) wzmocnionymi srebrem. Podłoże zmodyfikowane aneksyną-V zmodyfikowane podłoże zostało skonstruowane metodą warstwa po warstwie (LBL) dla specyficznego wychwytywania apoptotycznych komórek Jurkat we wczesnym stadium. Nowy rodzaj nanocząstek złota modyfikowanych kwasem aminofenyloboronowym kwasu aminofenyloboronowego (APBA-GNP) został zsyntetyzowany i wykorzystany do znakowania komórek. znakowania komórek, a następnie wzmocniono srebrem. Anodowa woltamperometria stripingowa (ASV) zastosowano do czułego wykrywania Ag(+) rozpuszczonego z osadzonych cząstek srebra. srebra, co odzwierciedlało liczbę komórek. Dobry zakres liniowy od 1 × 10(2) do 3,5 × 10(3) komórek, z granicą wykrywalności 38 komórek apoptotycznych. Co więcej, szary kolor srebrnego wzmocnienia może być zaobserwować gołym okiem, co można wykorzystać do odróżnienia komórek apoptotycznych od normalnych komórek. Dlatego też, stosując metodę znakowania GNP wzmocnioną srebrem, komórki apoptotyczne można nie tylko wykryć z dużą czułością za pomocą techniki elektrochemicznej, ale także elektrochemicznej, ale także mogą być odróżniane od normalnych komórek gołym okiem. --- Drobnokomórkowy rak płuca (SCLC) jest agresywną chorobą o złym rokowaniu. Nowotwory te mają niedobór ekspresji receptora glukokortykoidowego (GR), a zatem są i dlatego są odporne na glukokortykoidy. Nadekspresja GR zarówno in vivo i in vitro prowadzi do apoptotycznej śmierci komórek, co sugeruje, że utrata GR jest sprzyja wzrostowi nowotworu. Rzeczywiście, promotor GR jest wyciszony w komórkach SCLC przez metylację. Teraz pokazujemy, że leczenie komórek linii komórkowej SCLC (DMS79) z czynnikiem demetylującym, 5-aza-2'-deoksycytydyną (5-aza), powoduje znaczącą endogenną reekspresję zarówno GRα, jak i niezależnego od ligandu GR-P. Gen GR ma złożony region promotorowy składający się z dziewięciu alternatywnych promotorów. promotorów, z których siedem proksymalnych leży w obrębie wyspy CpG. Endogenna ponowna ekspresja jest przypisywana konstytutywnym promotorom 1B i 1C i 1J ale głównie 1F, który, jak wykazaliśmy, jest silnie metylowany w komórkach SCLC. Przepływ analiza cytometryczna przy użyciu markera apoptotycznego, aneksyny V, pokazuje, że ta endogenna reekspresja jest wystarczająca, aby doprowadzić komórki SCLC do apoptozy. Indukcja apoptozy jest specyficzna dla ponownej ekspresji GR, ponieważ jednoczesne leczenie 5-aza i antagonistą GR, RU486 zapobiegało apoptozie. Spośród trzech funkcjonalnych domen GR domen (domena wiążąca DNA, domena wiążąca ligand i domena transaktywacji domena), zidentyfikowaliśmy, że domena transaktywacji jest niezbędna dla apoptozy w SCLC. Odkrycie, że endogenna reekspresja GR w komórkach SCLC jest wystarczająca do wywołania apoptotycznej śmierci komórek poprzez odwrócenie efektu metylacji DNA wywołanego przez raka. efekt metylacji DNA może prowadzić do opracowania nowych terapii wspomagających. --- Mechanizmy, za pomocą których Ca(2+)-niezależna fosfolipaza A(2) (iPLA(2)) pośredniczy we wzroście komórek wzrost komórek w p53-dodatnich LNCaP i p53-ujemnych liniach komórkowych raka prostaty PC-3 badano linie komórkowe. Ekspozycja komórek na selektywny inhibitor iPLA(2) lakton bromoenolu (BEL; 0-20 mikroM) indukował zależne od stężenia i czasu spadek wzrostu komórek w oparciu o 3-(4, dimetylotiazolilo-2)-2,5-difenylotetrazoliowego i liczby komórek. Zmniejszony wzrost komórek nie był spowodowany śmiercią komórek, ponieważ ekspozycja na BEL nie zmieniła morfologii jądrowej ani nie zwiększała stężenia aneksyny V (marker komórek apoptotycznych) lub jodku propidium jodku propidium (marker komórek nekrotycznych) po 48 h. Zmniejszony wzrost korelował z G(1)/G(2). z zatrzymaniem G(1)/G(0) w komórkach LNCaP i zatrzymaniem G(2)/M w komórkach PC-3. W komórkach LNCaP zatrzymanie G(1) było poprzedzone zależnym od czasu (0-48 h) i stężenia (0-10 mikroM) wzrost ekspresji białka supresorowego nowotworu p53 i inhibitora kinazy zależnej od cyklin p21. Wzrost ekspresji białka p53 poprzedzał wzrost ekspresji p21 o 8 h. W komórkach LNCaP leczenie BEL zmniejszało ekspresję antagonisty p53 Mdm2, jednocześnie zwiększając fosforylację Akt fosforylację. Leczenie BEL zwiększyło również fosforylację Akt w komórkach PC-3, ale nie wykryto Mdm2. Zdolność BEL do zwiększania fosforylacji Akt była hamowana przez inhibitor 3-kinazy fosfoinozytydowej LY294002 [2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one]. Leczenie BEL również zmniejszyło indukowaną agonistą aktywację receptora naskórkowego czynnika wzrostu. Dane te sugerują, że hamowanie iPLA(2) zmniejsza wzrost komórek raka prostaty przez p53-zależne i niezależne mechanizmy. Ponadto, zmiany w Mdm2 i aktywacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu po ekspozycji na BEL sugerują nowe rolę iPLA(2) w sygnalizacji komórek raka prostaty. --- CEL: Celem tego badania była ocena cytotoksycznego wpływu fluorochinolonu ofloksacyny i aminoglikozydu netilmicyny na stromalne ludzkie keratocyty in vitro. keratocyty in vitro. METODY: Hodowane ludzkie keratocyty poddano działaniu różnych stężeń ofloksacyny lub netilmicyny (0,16-5,0 mg/ml). Zarówno proliferacja komórek (test MTT) i morfologię komórek (mikroskopia fazowo-kontrastowa) oceniano po 1, 4, 12, i 24 godzinach inkubacji. Pomiar wiązania aneksyny V przeprowadzono w w połączeniu z testem wykluczenia barwnika przy użyciu jodku propidium (PI) był również przeprowadzono również za pomocą analizy FACS po 4 godzinach ekspozycji. WYNIKI: Oba środki przeciwdrobnoustrojowe indukowały zależne od dawki i czasu zmiany morfologiczne w keratocytach. zmiany morfologiczne w keratocytach, jednak wpływ netilmicyny był minimalny. Po 24 godziny ekspozycji, oba leki indukowały zależne od dawki hamowanie proliferacji komórek. proliferacji komórek; jednak ofloksacyna wykazywała znacznie bardziej toksyczne działanie niż netilmicyna (test t dla wartości ED50, P < 0,0001). Różnice statystyczne między 2 antybiotykami zaczynają się przy stężeniach powyżej 1,25 mg/ml (ANOVA z post-hoc, P < 0,01). Ekspresja markera apoptotycznego aneksyny V była nie miała wpływu ekspozycja na antybiotyk, podczas gdy wychwyt markera nekrotycznego PI było zwiększone przez ofloksacynę (5 mg/ml), ale nie przez netilmicynę (ofloksacyna versus netilmicyna, ANOVA, P < 0,05). WNIOSKI: Względne działanie aminoglikozydów i fluorochinolonów na keratocyty zrębu keratocyty wydają się być różne: wykazano, że netilmicyna jest znacząco mniej toksyczna niż ofloksacyna. Odkrycie to jest szczególnie istotne przy podejmowaniu decyzji antybiotyku w sytuacjach klinicznych, w których nabłonek jest nieobecny lub uszkodzony. jest nieobecny lub uszkodzony, jak po keratektomii fotorefrakcyjnej, oparzeniach alkalicznych lub wrzodziejącym zapaleniu rogówki. wrzodziejące zapalenie rogówki. --- Wcześniej informowaliśmy, że granulocyty obojętnochłonne szybko uwalniają część ich Fc gamma RIII z błony plazmatycznej po aktywacji in vitro, prawdopodobnie przez proteolityczne rozszczepienie. W osoczu i innych płynach ustrojowych, uwolnione lub rozpuszczalny Fc gamma RIII został znaleziony w znacznych ilościach. W niniejszym neutrofile utrzymywano w hodowli podtrzymującej przez 18 do 24 godzin. Czterdzieści neutrofili całkowicie utraciło Fc gamma RIII, a pozostałe komórki wykazywały 60% spadek Fc gamma RIII. komórek wykazała 60% spadek ekspresji Fc gamma RIII na ich powierzchni. Uwolnione Fc gamma RIII wykryto w supernatancie hodowli. Niemniej jednak, ponad 90% komórek było żywotnych, jak oceniono na podstawie hydrolizy fluoresceiny dwuoctanu fluoresceiny. Obecność interferonu gamma, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów lub czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów, ale nie interleukiny-3 (IL-3), IL-6 lub IL-8, w pożywce hodowlanej zwiększała liczbę komórek, które nadal wyrażały komórek, które nadal wyrażały Fc gamma RIII. Stwierdziliśmy, że utrata Fc gamma RIII nie była wynikiem aktywacji komórek, ale silnie korelowała z apoptozą. apoptozą. Subpopulacja Fc gamma RIII-ujemna wykazywała typowe zmiany morfologiczne, takie jak typowe zmiany morfologiczne, takie jak kondensacja jądrowa i fragmentacja DNA. Co więcej, subpopulacja ta wydawała się nabyć właściwość wiązania aneksyny V, zależnego od wapnia białka wiążącego fosfolipidy o wysokim powinowactwie do fosfatydyloseryny. powinowactwie do fosfatydyloseryny. Zewnętrzna ekspozycja tego fosfolipidu przez komórki przez komórki występuje podczas apoptozy. Właściwość wiązania aneksyny V nie była wspólna dla subpopulacji nieapoptotycznej, Fc gamma RIII-pozytywnej. subpopulacji. W związku z tym zidentyfikowaliśmy wiązanie aneksyny V jako dogodny marker dla komórek apoptotycznych. Nasze wyniki wskazują, że rozpuszczalna Fc gamma RIII w płynach ustrojowych może pochodzić w dużej mierze z neutrofili ulegających apoptozie w tkankach. --- Tworzenie się ropnia powoduje ogólnoustrojową i miejscową regulację w górę szlaków sygnałowych neutrofili [leukocytów wielojądrzastych (PMN)]. [leukocytów wielojądrzastych (PMN)]. W ropniu, po spożyciu bakterii lub aktywacji PMN przez mediatory zapalne, PMN apoptoza jest podwyższona i prowadzi do eksternalizacji fosfatydyloseryny. Wykazano, że aneksyna-V (AnxV) ma wysokie powinowactwo do eksternalizowanej fosfatydyloseryny. fosfatydyloseryny. Postawiliśmy hipotezę, że (99m)Tc-AnxV będzie celować w wysokie gęstości apoptotycznych PMN i obrazować ropnie. AnxV, sprzężony z hydrazinenikotynamidem (HYNIC), został wyznakowany zredukowanym (99m)TcO(4)(-), a jego czystość czystość określono za pomocą natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej. Apoptoza była indukowano w izolowanych ludzkich PMN przez inkubację w 2% roztworze soli fizjologicznej przez 17 i 22 godziny w temperaturze 37 stopni C. Następnie PMN inkubowano z (99m)Tc-HYNIC-AnxV i powiązano z (99m)Tc. (99m)Tc. Ropnie indukowano u myszy przez domięśniowe wstrzyknięcie bakterii lub terpentyny. wstrzyknięcie bakterii lub terpentyny. Po dożylnym podaniu (99m)Tc-HYNIC-AnxV, myszy zostały zobrazowane i zbadano dystrybucję tkanki po 4 i 24 godzinach. h. Czystość radiochemiczna (99m)Tc-HYNIC-AnxV wynosiła 84,9+/-8,11%. Po 17 godz, (99m)Tc-HYNIC-AnxV związany z apoptotycznymi PMN wynosił 71,6+/-0,01% i 48,6+/-0,01% odpowiednio dla komórek eksperymentalnych i kontrolnych (odpowiednio odpowiednio dla komórek eksperymentalnych i kontrolnych (P=.002). Po 22 godzinach komórki eksperymentalne zatrzymały 74,9+/-0,02%, a komórki kontrolne 47,2+/-0,02% (P=.005). (99m)Tc-HYNIC-AnxV związany z ropniami bakteryjnymi wynosił 1,25+/-0,09 i 3,75+/-0,83 procent wstrzykniętej dawki na gram (%ID/g) po 4 i 24 godzinach w porównaniu do ropnie terpentynowe, które wynosiły 1,02+/-0,16 i 0,72+/-0,17 %ID/g po 4 (P<or=.05) i 24 h (P<or=.01). (99m)Tc-HYNIC-AnxV reprezentuje minimalnie inwazyjny i obiecujący środek do obrazowania i potencjalnego rozróżnienia między ropniami zakaźnymi i ropnie zapalne. --- W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że apoptoza wzrasta w zależności od wieku ciążowego. wieku ciążowego, co częściowo odpowiada obecności wolnego płodowego DNA w osoczu i surowicy matki. osoczu i surowicy matki. Korzystając z jednoczesnego testu TUNEL i analizy FISH, zidentyfikowaliśmy zidentyfikowaliśmy płodowe pochodzenie części populacji komórek apoptotycznych, ale bardzo komórek wykazało sygnały hybrydyzacji, ponieważ były one w późnym stadium apoptozy, a jądra apoptozy i jądra zostały zniszczone. W niniejszym badaniu populacja komórek apoptotycznych została zidentyfikowana immunocytochemicznie przy użyciu aneksyny V, markera komórek we wczesnym stadium apoptozy. Średni wskaźnik apoptozy w komórkach jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej 20 ciężarnych kobiet w 16. do 19. tygodnia ciąży przy użyciu z aneksyną V wynosił 6,8 +/- 0,5% (zakres: 4,2-8,1%) w porównaniu do 6,14 +/- 0,5% (zakres: 4,2-8,1%). w porównaniu do 6,14 +/- 0,5% (zakres: 3,7-6,9%) uzyskanych z barwieniem bromkiem etydyny barwienie. FISH z użyciem sond specyficznych dla chromosomów X i Y zastosowano w 11 przypadkach. płodów płci męskiej. Osiemdziesiąt procent komórek aneksyny V+ wykazało sygnały hybrydyzacji sygnały hybrydyzacyjne, podczas gdy odsetek komórek apoptotycznych wykazujących sygnały X/Y wynosił 7,8% (zakres: 5-12%). Chociaż nasze wyniki są nadal wstępne wydaje się, że zastosowanie przeciwciała aneksyny V do wykrywania populacji komórek apoptotycznych poprawia analizę FISH i pozwala na dokładniejsze oszacowanie proporcji komórek komórek płodowych wśród populacji komórek apoptotycznych. --- Aneksyna V jest białkiem wiążącym Ca(++), które jest szeroko stosowane jako marker dla komórek komórek apoptotycznych, ponieważ wiąże się z resztami fosfatydyloseryny odsłoniętymi na powierzchni komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule opisano metodę znakowania znakowania immunologicznego sprzężonej z biotyną aneksyny V w celu wykrycia apoptotycznych tymocytów w mikroskopii elektronowej. Tymocyty poddane działaniu etopozydu poddano reakcji w pożywce hodowli tkankowej ze sprzężoną z biotyną aneksyną V, utrwaloną utrwalono aldehydem glutarowym i poddano obróbce w celu zatopienia w żywicy; cienkie skrawki inkubowano z przeciwciałami antybiotynowymi sprzężonymi ze złotem koloidalnym. Cytometryczne oszacowania wskaźnika apoptotycznego przeprowadzono również poprzez ocenę zawartości DNA DNA po barwieniu jodkiem propidium lub wartości rozpraszania światła, jak również pozytywność dla przeciwciał antybiotyny sprzężonych z izotiocyjanianem fluoresceiny. W mikroskopii elektronowej, znakowanie złotem aneksyny V było zlokalizowane na błonie tylko na błonie plazmatycznej apoptotycznych tymocytów i na szczątkach cytoplazmatycznych, prawdopodobnie wynikające z typowego apoptotycznego pękania. Nieznakowane tymocyty zawsze zawsze wykazywały normalną, nieapoptotyczną morfologię jądrową. Zastosowanie znakowania aneksyną V w mikroskopii elektronowej pozwoli na bardziej szczegółowy opis zdarzeń zdarzeń morfologicznych zachodzących podczas apoptozy. --- Zaproponowano, że bezpośrednie i pośrednie mechanizmy przyczyniają się do nierozwiązanej kwestii zubożenia komórek T CD4(+), które wynika z zakażenia HIV-1. Niedawno donieśliśmy, że poziomy czynnika martwicy nowotworów (TNF) w osoczu ligandu indukującego apoptozę (TRAIL) są podwyższone u pacjentów zakażonych HIV-1 i że korelują one z wiremią. W niniejszym badaniu zbadano ekspresję receptora śmierci TRAIL 5 (DR5) w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC) zakażonych HIV-1. krwi obwodowej (PBMC) pacjentów zakażonych HIV-1 i jego rolę w śmierci komórek T CD4(+). Ekspresja DR5 była podwyższona i związana z markerem apoptozy aneksyną V. Apoptoza była zmniejszona w komórkach T CD4(+) podczas hodowli z przeciwciałem anty-DR5. CD4(+), ale nie CD8(+), komórki T od niezakażonych dawców wyrażały TRAIL, DR5 i aktywowały kaspazę-3 podczas hodowli z zakaźnym lub niezakaźnym wirusem HIV-1, powodując preferencyjną apoptozę limfocytów T CD4(+). TRAIL, ekspresja kaspazy-3 i apoptoza były zależne od interferonu typu 1 (IFN). Indukcja apoptozy i ekspresji DR5 wymagała interakcji glikoproteiny 120 (gp120) - CD4. Na koniec przeanalizowaliśmy ekspresję DR5 przez limfocyty T CD4(+) w wysoce aktywnej terapii antyretrowirusowej (HA). pacjentów leczonych wysoce aktywną terapią antyretrowirusową (HAART). Zmniejszone miano wirusa i Zwiększona liczba CD4 u pacjentów reagujących na HAART była związana z spadek ekspresji DR5 mRNA przez limfocyty T CD4(+). Proponujemy nowy model, w którym model, w którym regulowany przez IFN typu 1 mechanizm TRAIL / DR5 indukuje apoptozę HIV-1-eksponowanych limfocytów T CD4(+). --- Przeniesienie fosfatydyloseryny z cytozolu na zewnętrzną powierzchnię błony plazmatycznej błony plazmatycznej została udokumentowana jako charakterystyczna cecha apoptozy w wielu typach komórek. Aneksyna V jest zależnym od wapnia białkiem wiążącym fosfolipidy, które ma wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny. Aby zbadać, czy aneksyna V stanowi marker apoptozy w ośrodkowym układzie nerwowym. nerwowym przeprowadziliśmy analizę histochemiczną jej wiązania w 21-dniowym mózgu szczura w różnych punktach czasowych po umiarkowanym jednostronnym niedotlenienia-niedokrwienia (HI). Neurony piramidalne CA1, które są selektywnie wrażliwe na uszkodzenie HI i które umierają przez mechanizm apoptotyczny wykazały wzrost wiązania aneksyny V 48-168 godzin po urazie. --- Exendin-4 (ex-4) jest długo działającym receptorem glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1R) agonista, który wywiera korzystny wpływ na kontrolę glikemii i promuje żywotność komórek żywotność komórek. W niniejszym badaniu zbadaliśmy antyapoptotyczne działanie ex-4, a także potencjalne mechanizmy odpowiedzialne za te efekty u szczurów szczurzych mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (BM-MSC) w warunkach niedoboru tlenu, pozbawienia glukozy i surowicy (OGD). Apoptoza MSC była indukowana przez poddanie komórek warunkom OGD przez 4 godziny i wykryto za pomocą aneksyny V/PI i Hoechst 33258. MSC były wstępnie kondycjonowane za pomocą ex-4 przez 12 h przed poddaniem ich warunkom OGD, a poziomy ekspresji markera apoptotycznego (rozszczepionego markera apoptotycznego (rozszczepionej kaspazy-3), markerów stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) [fosforylowanej (p-)kinazy białkowej RNA podobnej do kinazy retikulum endoplazmatycznego (PERK), PERK, wiążące białko immunoglobulinowe (BIP), aktywujący czynnik transkrypcyjny 4 (ATF-4) i białka homologicznego C/EBP (CHOP)], a także markera przeżycia (Bcl-2). (Bcl-2) mierzono za pomocą analizy western blot. Ponadto, poziomy mRNA ATF-4 i CHOP określono metodą RT-qPCR. Test ELISA został użyty do zbadania aktywność wewnątrzkomórkowego cAMP. Co więcej, antagonista GLP-1R, exendin9-39 (ex9-39), inhibitor kinazy białkowej A (PKA), H89 i małe interferujące RNA (siRNA) ukierunkowane na szczurze ATF-4 i CHOP były współinkubowane z MSC. Wskaźnik apoptotyczny był znacznie zmniejszony po wstępnym kondycjonowaniu z ex-4 w sposób w sposób zależny od dawki (P<0,05). Markery stresu ER, p-PERK, BIP, ATF-4 i CHOP, były podwyższone w komórkach poddanych warunkom OGD. Wstępne kondycjonowanie Ex-4 znacząco obniżył poziom mRNA i białka ATF-4 i CHOP (P<0,05) oraz zwiększało aktywność wewnątrzkomórkowego cAMP (P<0,05). Co więcej, antyapoptotyczne działanie ex-4 zostało prawie odwrócone przez leczenie H89 lub ex9-39 (P<0,05); transfekcja siRNA-CHOP znacząco zmniejszyła szybkość apoptozy MSC i nie osłabiła cytoprotekcyjnego działania cytoprotekcyjnego działania ex-4. Podsumowując, wyniki te sugerują, że ex-4 chroni szczurze BM-MSC przed apoptozą indukowaną OGD poprzez aktywację szlaku PKA/cAMP i osłabienie szlaku sygnałowego stresu ER. Ex-4 może zatem okazać się środkiem terapeutycznym z potencjałem do poprawy żywotności MSC w środowisku niedokrwiennym, a co za tym idzie, do optymalizacji efektów terapeutycznych terapii MSC w ostrym zawale mięśnia sercowego. --- Eozynofile, główne komórki w zapaleniu astmatycznym, ulegają apoptozie lub zaprogramowanej śmierci komórkowej po pozbawieniu kontaktu z cytokinami promującymi przeżycie, takimi jak cytokinami, takimi jak IL-5 i GM-CSF. Celem tego badania była ocena szeregu technik ilościowego oznaczania apoptozy w ludzkich eozynofilach hodowanych z lub bez IL-5 lub GM-CSF i po leczeniu staurosporyną. Zależność Określono również związek między apoptozą a martwicą eozynofilów. Eozynofile "starzone" in vitro przez 48 godzin wykazywały degradację DNA endonukleazy, apoptotyczną morfologię, zwiększoną czerwoną autofluorescencję i eksternalizację fosfatydyloseryny (PS), jak oceniono przez wiązanie aneksyny V znakowanej FITC. Wiązanie aneksyny V-FITC było po raz pierwszy wykrywalne w eozynofilach utrzymywanych w temperaturze 37 C przez 5 godzin po oczyszczeniu. Metoda ta okazała się najbardziej czułym markerem apoptozy. Ocena morfologiczna mokrych preparatów eozynofilów za pomocą barwienia Kimura okazała się kolejnym najbardziej czułym markerem, a następnie zwiększona czerwona autofluorescencja. Ta ostatnia była stosunkowo mało czułą metodą do wykrywania apoptozy. Po 5, 20 i 24 godzinach hodowli błękit trypanu wskazywało, że żywotność eozynofili była wysoka (85-90% żywych komórek). Jednak barwienie jodkiem propidyny (PI) i cytometria przepływowa wykazały, że do 24 h h, około 75% komórek miało naruszoną integralność błony. Eozynofile utrzymywane w IL-5 lub GM-CSF wykazywały morfologię nieapoptotyczną i poziomy wiązania aneksyny V-FITC i wychwytu PI podobny do świeżo wyizolowanych komórek. Leczenie staurosporyną (10(-5) M) eozynofilów utrzymywanych w IL-5 lub GM-CSF skutkowało znaczącym poziomem morfologii apoptotycznej po 2 godzinach (23,8% +/- 6,9, p < 0,025), co było związane ze znikomym wiązaniem aneksyny. Po 6 h po leczeniu sturosporyną zaobserwowano znaczące wiązanie aneksyny-FITC (38% +/- 1,5, p < 0,025) zaobserwowano w porównaniu z 93% +/- 1,2 eozynofilów wykazujących morfologię apoptotyczną. morfologię apoptotyczną. Wykluczenie PI wykazało integralność błony we wszystkich punktach czasowych do 6 godzin. Tak więc eozynofile starzone in vitro pod nieobecność cytokin promujących żywotność cytokin promujących żywotność wykazują dowody zarówno apoptozy, jak i martwicy jednocześnie. W przeciwieństwie do tego, eozynofile traktowane staurosporyną wykazywały zarówno integralność błony i szybkie zmiany morfologiczne związane z apoptozą wykrywane przez jednoetapowe barwienie Kimura, które poprzedzało eksternalizację PS. --- CEL: Zbadanie wpływu kwercetyny na morfologię komórek i ekspresję VEGF w komórkach ostrej białaczki szpikowej NB4 in vitro. METODY: Cytomorfologię komórek NB4 oceniano za pomocą plamy Wrighta, apoptozę za pomocą markera apoptozy Aneksyny V, a poziom wydzielania VEGF za pomocą testu ELISA. WYNIKI: Typową apoptozę stwierdzono w komórkach NB4 po leczeniu kwercetyną. kwercetyną. Analiza markera apoptotycznego Aneksyny V wykazała, że szybkość apoptozy komórek komórek NB4 wzrosła po leczeniu kwercetyną. Wydzielanie VEGF przez komórki komórek NB4 było znacząco zmniejszone po leczeniu kwercetyną. WNIOSEK: Kwercetyna może indukować apoptozę i hamować wydzielanie VEGF w komórkach białaczki NB4 komórkach białaczkowych. --- W niniejszym artykule porównano wiarygodność czterech wcześniej opisanych cytofluorometrycznych metod kwantyfikacji apoptozy do fenotypowania apoptotycznych ludzkich limfocytów. Każdy z tych testów wykrywa różne zmiany komórkowe procesu apoptozy. procesu apoptozy. Zmiana integralności błony plazmatycznej może być oceniana po inkorporacji 7-AAD i translokacji fosfatydyloseryny z warstwy wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony plazmatycznej można wykryć za pomocą barwienia Barwienie aneksyną V FITC. Pęknięcia nici DNA w jądrach apoptotycznych można wykazać za pomocą testu ISNT, a modyfikacje morfologiczne można śledzić za pomocą kryteriów kryteria FSC/SSC. Analiza porównawcza apoptozy w hodowanych PBMC od pacjentów zakażonych pacjentów zakażonych wirusem HIV z uwzględnieniem parametrów FSC/SSC, barwienia 7-AAD i utrwalania aneksyny V aneksyny V wykazała, że ta ostatnia identyfikuje wczesne komórki apoptotyczne, również scharakteryzowane jako 7-AAD(low) z obniżonym FSC. Ponadto te trzy metody okazały się niezawodne i dały statystycznie podobne wyniki, gdy w połączeniu z wykrywaniem powierzchni komórek antygenów, takich jak CD4, CD8 i CD19 przez specyficzne mAbs. Co ważne, test 7-AAD z łatwością pozwolił na identyfikację ciałek apoptotycznych, które nadal były wybarwione przez przeciwciała przeciw powierzchni komórek i mogą zatem znacząco zniekształcać procent apoptozy w danym podzbiorze limfocytów. podzbiorze limfocytów. W niniejszym raporcie wskazujemy również, że test ISNT nie jest odpowiedni do fenotypowania apoptotycznych limfocytów w PBMC. W rzeczywistości może szczególnie niedoszacować wskaźnika apoptozy w podzbiorze limfocytów B. Zostało to stwierdzono, że jest to związane ze związanym z apoptozą spadkiem ekspresji antygenu na powierzchni komórki. ekspresji antygenu na powierzchni komórek, co jest dramatycznie nasilone w teście ISNT z powodu efekt usuwania etanolu stosowanego do permeabilizacji komórek. Na koniec proponujemy trzystopniową strategię analityczną w celu dokładnego fenotypowania apoptotycznych limfocytów ludzkich limfocytów. Obejmuje ona dwa etapy bramkowania wykonywane na podstawie kryteriów FSC/SSC i parametrach 7-AAD/FSC w celu wyeliminowania monocytów, granulocytów i granulocytów i ciałek apoptotycznych, a trzecim etapem jest sam etap fenotypowania, wykonywany w eksperymentach z podwójnym lub potrójnym barwieniem. W sumie te obserwacje podkreślają, że niezbędna jest krytyczna ocena zdolności metody cytofluorometrycznej do cytofluorometrycznej do fenotypowania komórek apoptotycznych w złożonych populacjach limfoidalnych limfoidalnych i że niedokładna identyfikacja podzbiorów komórek poddawanych apoptozie można łatwo przezwyciężyć, odpowiednio bramkując populację limfoidalną, i stosując testy, które zachowują strukturę powierzchni komórek. --- TŁO / CELE: Des-gamma-karboksy-protrombina (DCP), nieprawidłowa protrombina wytwarzana przez komórki raka wątrobowokomórkowego (HCC), jest znana jako marker HCC. Ostatnie badania wykazały, że wysoki poziom DCP jest związany ze złośliwym potencjałem HCC. złośliwym potencjałem HCC. W tym badaniu, naszym celem było zbadanie związek DCP z niepowodzeniem leczenia gefitynibem w HCC i czy DCP przeciwdziała indukowanemu przez gefitynib hamowaniu wzrostu i apoptozie HCC. METODY: Eksperymenty przeprowadzono na liniach komórkowych HCC HepG2 i PLC/PRF/5. Oceniono wpływ gefitynibu na HCC w obecności lub nieobecności DCP za pomocą bromku 3-[4, 5-dimetylotiazol-2-ylo]-2, 5-difenylo-tetrazoliowego (MTT) . Komórki apoptotyczne identyfikowano za pomocą barwienia aneksyną V-FITC/PI. Western blotting przeprowadzono w celu analizy ekspresji cząsteczek związanych z apoptotycznym szlakiem zależnym od kaspazy i receptorem naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) . WYNIKI: Gefitynib hamował proliferację komórek HCC i indukował apoptozę w komórkach HCC. komórkach. Działanie gefitynibu na komórki HCC było antagonizowane przez DCP. W obecności obecności DCP, komórki HCC były oporne na indukowane gefitynibem hamowanie proliferację i stymulację apoptozy. DCP zapobiegał aktywacji apoptotycznego szlaku zależnego od kaspazy indukowanego przez gefitynib. Te antagonistyczne antagonistyczne działanie DCP wynikało również z jego zdolności do regulacji w górę EGFR, c-Met i czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) w komórkach HCC. WNIOSEK: DCP antagonizował indukowane gefitynibem hamowanie wzrostu komórek HCC poprzez przeciwdziałając apoptozie i regulując w górę szlak EGFR. Wysoki poziom DCP może zatem prowadzić do niskich wskaźników odpowiedzi lub prawdopodobnie braku odpowiedzi na gefitynib u pacjentów z HCC. --- We wczesnych etapach apoptozy na powierzchni komórek zachodzą zmiany, które do tej pory były trudne do rozpoznania. do tej pory pozostawały trudne do rozpoznania. Jedną z tych zmian błony błony plazmatycznej jest translokacja fosfatydyloseryny (PS) z wewnętrznej strony błony plazmatycznej do warstwy zewnętrznej, przez co PS zostaje odsłonięta na zewnętrznej powierzchni komórki. zewnętrznej powierzchni komórki. Aneksyna V jest zależnym od Ca2+ białkiem wiążącym fosfolipidy białko o wysokim powinowactwie do PS. Dlatego białko to może być stosowane jako czuła sonda sonda ekspozycji PS na błonie komórkowej. Translokacja PS na na zewnętrzną powierzchnię komórki nie jest unikalna dla apoptozy, ale występuje również podczas nekrozy komórek. martwicy komórek. Różnica między tymi dwiema formami śmierci komórki polega na tym, że podczas początkowych etapach apoptozy błona komórkowa pozostaje nienaruszona, podczas gdy w momencie nekrozy pozostaje nienaruszona. nekrozy błona komórkowa traci swoją integralność i staje się nieszczelna. staje się nieszczelna. Dlatego pomiar wiązania aneksyny V do powierzchni komórki jako wskaźnika apoptozy musi być przeprowadzony w połączeniu z testem wykluczenia barwnika w celu testem wykluczenia barwnika w celu ustalenia integralności błony komórkowej. Niniejszy artykuł opisano wyniki takiego testu, uzyskane w hodowanych komórkach HSB-2, poddanych apoptozie przez napromieniowanie i w ludzkich limfocytach po leczeniu deksametazonem. deksametazonem. Nieleczone i leczone komórki oceniano pod kątem apoptozy za pomocą mikroskopii świetlnej, mierząc ilość komórek hipodiploidalnych za pomocą cytometrii przepływowej DNA (FCM) i elektroforezy DNA w celu ustalenia czy doszło do fragmentacji DNA. Wiązanie aneksyny V oceniano za pomocą dwuwymiarowej FCM, a barwienie komórek oceniano za pomocą fluoresceiny izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) znakowanym aneksyną V (zielona fluorescencja), jednocześnie z wykluczeniem barwnika jodku propidium (PI) (negatywny dla czerwonej fluorescencji). Opisany test Opisany test rozróżnia komórki nienaruszone (FITC-/PI-), komórki apoptotyczne (FITC+/PI-) i komórki nekrotyczne (FITC+/PI+). W porównaniu z istniejącymi tradycyjnymi testami, test aneksyny V jest czuły i łatwy do przeprowadzenia. Test Test aneksyny V oferuje możliwość wykrywania wczesnych faz apoptozy apoptozy przed utratą integralności błony komórkowej i pozwala na pomiary kinetyki śmierci apoptotycznej w odniesieniu do cyklu komórkowego. Bardziej rozbudowany FCM pozwoli na rozróżnienie między różnymi subpopulacjami komórek, które mogą, ale nie muszą być zaangażowane w proces apoptozy. --- Przetestowaliśmy wpływ dwóch różnych stężeń (150 μg/l i 0,15 μg/l) mikotoksyny zearalenonu (ZEA) na parametry reprodukcyjne i ekspresję genów jąder u samców myszy. genów jąder u samców myszy. U dorosłych samców nie zaobserwowano zmniejszenia masy ciała lub zaobserwowano zmniejszenie masy ciała lub narządów rozrodczych, a kanaliki nasienne były morfologicznie normalne z trwającą spermatogenezą. Stwierdziliśmy jednak zmniejszone stężenie plemników, wzrost morfologicznie nieprawidłowych plemników i zwiększone wiązanie markera apoptotycznego aneksyny V. Badanie to koncentrowało się również na ocenie profili ekspresji genów. ocenę profili ekspresji 28 genów odgrywających ważną rolę w procesach zachodzących w jądrach. podczas procesów zachodzących w tkance jąder. Wykryliśmy zmiany w ekspresji genów ważnych dla prawidłowej spermatogenezy. Co zaskakujące, zaobserwowaliśmy zaobserwowaliśmy silniejszy efekt po ekspozycji na niższą dawkę ZEA. --- W celu zbadania wpływu standaryzowanych (referencyjnych) preparatów tytoniowych na ludzkie komórki jamy ustnej komórki jamy ustnej, dwie linie komórkowe raka płaskonabłonkowego jamy ustnej (101A, 101B) i normalne ludzkie komórki nabłonka dziąseł (HGEC) poddano działaniu dymu papierosowego całkowitym pyłem zawieszonym (TPM), tytoniem bezdymnym ekstrahowanym kompletną sztuczną śliną (ST/CAS) lub pożywką kondycjonowaną dymem papierosowym (WS-CM). WARTOŚCI EC-50 określone za pomocą testów z sulfodaminą B, różniły się w zależności od typu komórek i czynników. i czynników. Po znormalizowaniu do zawartości nikotyny, cytotoksyczność WS-CM i TPM była wyższa w porównaniu do obserwowanej w przypadku ST/CAS. Sama nikotyna nie miała cytotoksyczności lub minimalną cytotoksyczność dla wszystkich typów komórek w zastosowanym zakresie. Aktywacja pro-apoptotycznej kaspazy-3 we wszystkich typach komórek przy odpowiednich dawkach EC-50 dla wszystkich trzech czynników. TPM, ale nie ST/CAS lub WS-CM znacząco aktywował kaspazę-3 we wszystkich trzech typach komórek. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) dla ekspresji markera wczesnej apoptozy aneksyny V i dla barwienia jądrowego przez 7-aminoaktynomycynę (7-AAD) ujawniło różne zakresy apoptozy w porównaniu do nieapoptotycznej śmierci komórek dla trzech czynników. Dane te charakteryzują zróżnicowane odpowiedzi normalnych i złośliwych komórek jamy ustnej po ekspozycji na TPM, ST/CAS lub WS-CM. Pomagają one w zrozumieniu zróżnicowanych skutków palnych w porównaniu z niepalnymi wyrobami tytoniowymi, a także w identyfikacji nowych biomarkerów ekspozycji na dym tytoniowy i jego wpływu na jamę ustną. --- Aneksyna V znakowana 99mTc została wykorzystana do obrazowania apoptozy guza indukowanej przez chemioterapię. Jednak ze względu na krótki okres półtrwania aneksyny V, wielokrotne wstrzyknięcia wstrzyknięcia radioznacznika są konieczne do uchwycenia szczytowej aktywności apoptotycznej. aktywności apoptotycznej. W tym badaniu oceniliśmy właściwości obrazowania aneksyny V znakowanej (111)In, długo krążącej aneksyny V. METODY: Zarówno glikol polietylenowy (PEG), jak i chelator metalu kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA) zostały jednocześnie wprowadzone do aneksyny V lub albuminy jaja kurzego poprzez zastosowanie heterofunkcyjnego prekursora PEG. Badania obrazowania przeprowadzono na myszach, którym podskórnie zaszczepiono ludzki nowotwory sutka MDA-MB-468. Myszy leczono poli(kwasem L-glutaminowym) kwasem L-glutaminowym)-paklitakselem, przeciwciałem monoklonalnym C225 lub kombinacją poli(kwasu L-glutaminowego) kwas) -paklitaksel i C225, a następnie dożylne wstrzyknięcie (111)In-DTPA-PEG-annexin V. Obrazy uzyskano 48 godzin po wstrzyknięciu radioznacznika. radioznacznika. Autoradiografia i TUNEL (terminalna deoksynukleotydylotransferazy za pośrednictwem znakowania nickiem dUTP) zostały wykonano na sąsiednich wycinkach guza w celu zlokalizowania komórek apoptotycznych. Właściwości Właściwości obrazowania unPEGylowanej aneksyny V i PEGylowanej owalbuminy zostały również w celu umożliwienia oceny specyficzności (111)In-DTPA-PEG-aneksyny V. WYNIKI: Wskaźnik apoptotyczny guza wzrósł z 1,67% +/- 0,31% na początku badania do 7,60% +/- 0,72% i 11,07% +/- 1,81%, odpowiednio, 4 dni po leczeniu poli(kwas L-glutaminowy)-paklitaksel lub połączony poli(kwas L-glutaminowy)-paklitaksel i C225. Wychwyt guza (procent wstrzykniętej dawki na gram guza [%ID/g]) PEGylowanej (111) In-DTPA-PEG-annexin 4 d po leczeniu był znacząco wyższy w guzach leczonych poli(kwasem L-glutaminowym)-paklitakselem (10,76 +/- 1,38 %ID/g; P = 0,001) oraz z połączonym poli(kwasem L-glutaminowym)-paklitakselem i C225 (9,84 +/- 2,51 %ID/g; P = 0,029) niż w nieleczonych guzach (6,14 +/- 0,67 %ID/g), co skutkuje lepszą wizualizacją leczonych guzów. (111)In-DTPA-PEG-annexin V rozprzestrzenił się w centralnej strefie guzów, podczas gdy (111)In-DTPA-annexin V był w dużej mierze ograniczony do obwodu guza. Ponadto, (111)In-DTPA-PEG-annexin V przez guzy korelował z indeksem apoptotycznym (r = 0,87, P = 0,02). Zwiększenie wychwytu niespecyficznego białka PEGylowanego (111)In-DTPA-PEG-ovalbumin zaobserwowano również po poli(L-glutaminowym) (55,6%), chociaż wzrost ten był mniejszy niż obserwowany dla (111)In-DTPA-PEG-ovalbumin. obserwowany dla (111)In-DTPA-PEG-annexin V (96,7%). WNIOSEK: Zwiększony wychwyt i lepsza wizualizacja dzięki (111) In-DTPA-PEG-annexin V w guzach litych po chemioterapii są mediowane zarówno poprzez specyficzne wiązanie z komórkami apoptotycznymi, jak i niespecyficzną retencję makromolekularnych środków kontrastowych w guzach. (111)Znakowana, PEGylowana aneksyna V może być stosowana do oceny odpowiedzi guza na chemioterapię. --- Zależne od Ca(2+) wiązanie aneksyny V z fosfatydyloseryną na powierzchni komórek jest wiarygodnym markerem apoptozy, który jest szeroko stosowany w testach apoptozy opartych na cytometrii przepływowej. cytometrii przepływowej. W tym artykule przedstawiamy nową klasę sond opartych na aneksynie V dla apoptozy. Lucyferaza z Renilla reniformis (RLuc) została połączona z aneksyną V i z powodzeniem wyrażona w formie rozpuszczalnej w Escherichia coli BL21 (DE3). Nowa sonda nowa sonda, Rluc / Aneksyna V, została oczyszczona i funkcjonalnie przetestowana do wykrywania apoptozy w indukowanych aktynomycyną D apoptotycznych komórkach Jurkat. Ponadto spontaniczna apoptoza w neutrofilach została wykazana przy użyciu nowej sondy. Wyniki wskazują, że Rluc/Annexin V może wiązać się z komórkami apoptotycznymi, a sygnał lucyferazy lucyferazy Renilla można wykryć za pomocą pomiarów luminometrycznych. The Dostępność Rluc/Annexin V może mieć potencjalne znaczenie komercyjne dla poprawy obecnych testów apoptozy. --- Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) charakteryzuje się rozległą infiltracją monocytów w wątrobie. naciek monocytów, a makrofagi pochodzące z monocytów odgrywają ważną rolę w regulując rozwój choroby. Jednak niewiele wiadomo na temat funkcjonalnych zmian zachodzących w makrofagach wątrobowych podczas progresji NASH. W tym badaniu, zbadaliśmy fenotypowe i funkcjonalne modyfikacje makrofagów wątrobowych w eksperymentalnym NASH indukowanym przez karmienie myszy C57BL/6 dietą z niedoborem metioniny i choliny (MCD). z niedoborem metioniny i choliny (MCD) do 8 tygodni. U myszy ze stłuszczeniowym zapaleniem wątroby F4/80-dodatnie makrofagi zwiększały się równolegle z postępem choroby i tworzyły małe skupiska powiększonych i wakuolizowanych komórek. W immunofluorescencji komórki te zawierały pęcherzyki lipidowe dodatnie pod względem markera komórek apoptotycznych aneksyny V, co sugeruje fagocytozę ciał apoptotycznych pochodzących z martwych hepatocytów obciążonych tłuszczem. Cytometria przepływowa ujawniła, że te powiększone makrofagi wyrażały markery monocytów zapalnych (CD11b, Ly6C, TNF-α) markery. Jednakże, w porównaniu do makrofagów o regularnych rozmiarach, powiększony podzbiór charakteryzował się zwiększoną produkcją arginazy-1 i mediatorów przeciwzapalnych mediatorów przeciwzapalnych IL-10 i aneksyny A1. Podobne wakuolizowane makrofagi wytwarzające aneksynę A1 były również widoczne w biopsjach wątroby pacjentów z NASH. U myszy z NASH, akumulacja powiększonych komórek F4/80(+) była równoległa z spadek ekspresji markerów aktywacji makrofagów M1 iNOS, IL-12 i CXCL10, podczas gdy poziomy markerów polaryzacji M2 arginazy-1 i MGL-1 pozostały niezmienione. Co ciekawe, obniżenie ekspresji IL-12 dotyczyło głównie podgrupy makrofagów o regularnych rozmiarach. Wnioskujemy, że podczas NASH gromadzenie się tłuszczu w makrofagach wątrobowych promuje produkcję mediatorów przeciwzapalnych, które wpływają na wątrobowe odpowiedzi zapalne. odpowiedzi. --- Magnetyczne sortowanie komórek (MACS) przy użyciu mikrokul sprzężonych z aneksyną V eliminuje apoptotyczne plemniki w oparciu o eksternalizację reszt fosfatydyloseryny pozostałości fosfatydyloseryny. Procedura dostarcza dwóch frakcji plemników: ujemnych pod względem aneksyny V (nieapoptotyczne) i aneksyny V-dodatnie (apoptotyczne). Naszym celem było określenie czy potencjał zapładniający plemników można poprawić, wybierając frakcję frakcji nieapoptotycznej przy użyciu MACS. Próbki nasienia (n = 35) zostały poddane separacji na gradiencie gęstości, a następnie MACS. Stopień apoptozy został oceniano poprzez pomiar poziomów aktywowanej kaspazy 3 przy użyciu znakowanych fluoresceiną inhibitorów kaspazy, zmiany potencjału błony mitochondrialnej (MMP) przy użyciu lipofilowego barwnika kationowego i fragmentacji DNA przy użyciu terminalnego dezoksynukleotydylotransferazy za pośrednictwem testu znakowania nickiem fluoresceiny-dUTP. Potencjał zapłodnienia plemników oceniano za pomocą testu penetracji oocytów chomika i wstrzyknięcie plemnika do oocytu chomika (ICSI). Aneksyna V-ujemne plemniki wykazywały wyższą jakość pod względem wysokiej ruchliwości, niskiej aktywacji kaspazy aktywacji kaspazy 3, integralności MMP i niewielkiego stopnia fragmentacji DNA. Plemniki ujemne pod względem aneksyny V wykazywały wyższą zdolność penetracji oocytów, ale porównywalną dekondensację chromatyny plemników (SCD) po ICSI. I odwrotnie, plemniki plemniki aneksyny V-dodatniej wykazywały niską jakość i potencjał zapłodnienia. potencjał zapłodnienia. Wskaźnik penetracji oocytów był ujemnie skorelowany z ekspresją markerów apoptotycznych. ekspresją markera apoptotycznego, podczas gdy SCD po ICSI było związane tylko z apoptozą na błonach uszkodzonych przez plemniki. Wnioskujemy, że apoptoza wydaje się wpływać na szybkość penetracji plemników przez komórki jajowe; jednak wydaje się, że nie wpływa ona na wczesne etapy zapłodnienia, takie jak zapłodnienia, takich jak SCD w plemnikach zdrowych dawców. Wybór plemników plemników nieapoptotycznych przez MACS może być wykorzystana do poprawy wyników zapłodnienia in vitro poprzez zwiększenie penetracji plemnik-komórka jajowa. --- Niedawno opracowaliśmy prostą i silną terapeutyczną liposomową szczepionkę przeciwnowotworową składającą się z antygenu peptydowego i kationowego lipidu. Molekularny mechanizm adiuwantowości kationowego liposomu został zbadany i opisany w bieżącym raporcie. raporcie. Po pierwsze, wykazano, że kationowy liposom DOTAP, ale nie neutralny liposom DOPC, generuje reaktywne formy tlenu (ang. generuje reaktywne formy tlenu (ROS) w mysich komórkach dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC). komórkach dendrytycznych szpiku kostnego myszy (BMDC). Generowanie ROS przez DOTAP było wymagane do aktywacji ERK i p38 oraz indukcji chemokin/cytokin. Ponadto, ROS były wykazano, że są zaangażowane w ekspresję cząsteczek ko-stymulujących CD86/CD80 indukowanej przez DOTAP. Jednakże, gdy stężenie DOTAP wzrosło z 50 do 800 microM, marker apoptotyczny Aneksyna V i podwójnie dodatnie komórki ROS wzrosły, co sugeruje, że wysoka dawka generowanych przez DOTAP ROS powoduje apoptozę komórek. In vivo, optymalna ilość ROS w drenujących węzłach chłonnych (DLN) i aktywność przeciwnowotworowa (HPV pozytywny guz TC-1) indukowana przez peptyd E7 (antygen pochodzący z E7 onkoproteiny wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) typu 16) w postaci 100 nmol DOTAP zostały osłabione przez włączenie DOPC do preparatu, co sugeruje, że ROS są niezbędne dla indukowanej szczepionką aktywności przeciwnowotworowej. Co więcej, 600 nmol DOTAP/E7 wygenerował ogromną ilość ROS w DLN i nie wykazał aktywności guza regresji. Co ciekawe, ROS indukowane 600 nmol DOTAP / E7 zostały dostrojone do tego samego poziomu ten sam poziom indukowany przez 100 nmol DOTAP / E7 przez dodanie DOPC do preparatu i ten preparat wykazał aktywność regresji guza. Podsumowując, DOTAP jest aktywnym stymulatorem DC powodującym aktywację ERK i p38 oraz indukcję chemokin, cytokin i cząsteczek współstymulujących, w których pośredniczy odpowiednia ilość ilość ROS. Nasze dane wyjaśniły ważny mechanizm działania adiuwantowego kationowego liposomu i mogą ułatwić racjonalne projektowanie syntetycznych lipidów opartych na syntetycznych lipidach i formulacji szczepionek. --- Informacje o autorze: (1)Department of Rheumatology and Clinical Immunology, University of Groningen, Uniwersyteckie Centrum Medyczne w Groningen, Groningen, Holandia, Oddział Reumatologii, Wydział Medycyny Wewnętrznej, Seoul National University College of Medicine, Seul, Korea. of Medicine, Seoul, Korea, Department of Pathology and Medical Biology and Department of Laboratory Medicine, Section Medical Immunology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, Holandia Oddział Reumatologii i Immunologii Klinicznej, Uniwersytet w Groningen, Uniwersyteckie Centrum Medyczne w Groningen, Groningen, Holandia, Oddział Reumatologii, Wydział Medycyny Wewnętrznej, Seoul National University College of Medicine, Seul, Korea. of Medicine, Seoul, Korea, Department of Pathology and Medical Biology and Department of Laboratory Medicine, Section Medical Immunology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, Holandia. k.s.m.van.der.geest@umcg.nl. (2)Department of Rheumatology and Clinical Immunology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands, Division of Reumatologii, Wydział Medycyny Wewnętrznej, Seoul National University College of Medicine, Seul, Korea. of Medicine, Seoul, Korea, Department of Pathology and Medical Biology and Department of Laboratory Medicine, Section Medical Immunology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, Holandia. --- Nieodpowiednia lub nadmierna apoptoza (zaprogramowana śmierć komórki) jest związana z wieloma chorobami. z wieloma chorobami. Metoda obrazowania apoptozy in vivo, zamiast wymagać histologicznej oceny tkanki, mogłaby pomóc w podejmowaniu decyzji terapeutycznych w tych zaburzeniach. Zaprogramowana śmierć komórki jest związana z dobrze zaplanowaną serią zdarzeń skutkujących zaprzestaniem normalnego funkcjonowania komórki i ostatecznym zanikiem i ostatecznym zniknięciem komórki. Jednym z elementów apoptozy jest sygnalizowanie sąsiednim komórkom, że dana komórka popełnia samobójstwo poprzez eksternalizację fosfatydyloseryny do zewnętrznego płatka błony komórkowej. Aneksyna V, endogenne ludzkie białko o masie 32 kDa, ma wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny związanej z błoną. Połączyliśmy aneksynę V z dwufunkcyjnym odczynnikiem hydrazynonotynamidowym (HYNIC) w celu przygotowania technetu-99m HYNIC-aneksyny V i wykazaliśmy lokalizację radioaktywności w tkankach poddawanych apoptozie in vivo. W niniejszym raporcie opisujemy wyniki serii eksperymentów eksperymentów na myszach i szczurach w celu scharakteryzowania biologicznego zachowania (99m)Tc-HYNIC-aneksyny V. Badania biodystrybucji przeprowadzono w grupach szczurów po 10-180 minutach od podania. szczurów po 10-180 minutach od dożylnego wstrzyknięcia (99m)Tc-HYNIC-aneksyny V. W celu oszacowania stopnia apoptozy, (99m)Tc-HYNIC-aneksyna V została podana dożylnie. w celu oszacowania stopnia apoptozy wymaganego do lokalizacji (99m)Tc-aneksyny V in vivo, myszy poddano działaniu deksametazonu w dawkach od od 1 do 20 mg / kg, 5 godzin przed podaniem (99m) Tc-HYNIC-annexin V, w celu indukować apoptozę grasicy. Grasicę wycięto 1 godzinę po wstrzyknięciu HYNIC-annexin V; tymocyty izolowano, inkubowano z Hoechst 33342, a następnie jodkiem propidium i analizowano na sorterze komórek aktywowanym fluorescencją. Każda posortowaną populację komórek zliczono w liczniku scyntylacyjnym. Aby przetestować (99m)Tc-HYNIC-annexin V jako znacznik do zewnętrznego obrazowania radionuklidowego apoptotycznej śmierci komórek, obrazowanie radionuklidowe myszy z defektem Fas (myszy lpr / lpr) i myszy typu dzikiego leczonych przeciwciałem przeciwko Fas (anty-Fas) przeprowadzono 1 godzinę po wstrzyknięciu. h po wstrzyknięciu. Badania biodystrybucji u szczurów wykazały klirens krwi (99m)Tc-HYNIC-annexin V. Nerki miały najwyższe stężenie radioaktywności przez cały czas. najwyższe stężenie radioaktywności we wszystkich punktach czasowych. Badania na myszach grasicy myszy wykazały 40-krotny wzrost stężenia (99m)Tc-HYNIC-aneksyny V w apoptotycznych tymocytach w porównaniu z populacją żywych komórek. Korelacja r=0,78 między radioaktywnością a cytometrią przepływową i histologicznymi dowodami apoptozy. dowodami apoptozy. Badania obrazowe u myszy lpr/lpr i myszy typu dzikiego wykazały znaczny wzrost aktywności w wątrobie myszy typu dzikiego leczonych anty-Fas, podczas gdy nie było znaczącej zmiany, niezależnie od podawania anty-Fas u myszy lpr/lpr. Doskonałe obrazy apoptozy wątroby uzyskano uzyskano u myszy typu dzikiego 30 minut po wstrzyknięciu (99m)Tc-HYNIC-annexin V. Wyniki obrazowania były zgodne z analizą histologiczną u tych zwierząt. Podsumowując, badania te potwierdzają wartość wychwytu (99m)Tc-HYNIC-annexin V jako markera do wykrywania i kwantyfikacji komórek apoptotycznych in vivo.
Czy aneksyna V jest markerem apoptotycznym?
Tak, aneksyna V jest wczesnym markerem apoptotycznym.