Skład polipeptydowy fikobilisomu, głównego kompleksu zbierającego światło cyjanobakterii prokariotycznych i niektórych alg eukariotycznych, może być modulowany przez różne jakości światła u cyjanobakterii wykazujących chromatyczną adaptację adaptację chromatyczną. Zidentyfikowaliśmy fragmenty genomu kodujące grupę polipeptydów polipeptydów fikobilisomowych (fikobiliprotein) z chromatycznie adaptujących się cyjanobakterii Fremyella diplosiphon przy użyciu wcześniej scharakteryzowanych fragmentów DNA fragmentów genów fikobiliprotein z eukariotycznej algi Cyanophora paradoxa i z F. diplosiphon. Charakterystyka dwóch klonów lambda-EMBL3 zawierających nakładające się fragmenty genomu wskazuje, że trzy zestawy genów likobiliprotein alfa- i beta-alofiocyjaniny oraz dwa zestawy genów alfa- i geny alfa- i beta-fiocyjaniny - są skupione w obrębie 13 kilobaz w genomie cyjanobakterii i transkrybowane z tego samego genomu. i transkrybowane z tej samej nici. Kolejność genów (alfa-alofiocyjanina, a następnie beta-alofiocyjanina i beta-fiocyjanina a następnie alfa-fiocyjanina) wydaje się być zachowanym układem znalezionym wcześniej w eukariotycznej aldze i innej cyjanobakterii. Zgłosiliśmy że jeden zestaw genów fikocyjaniny jest transkrybowany jako dwa obfite czerwone mRNA mRNA (1600 i 3800 zasad). Teraz przedstawiamy dane pokazujące, że geny allofykocyjaniny i drugi zestaw genów fikocyjaniny są transkrybowane do główne mRNA o długości odpowiednio 1400 i 1600 zasad. Transkrypty te są obecne w RNA izolowanym z kultur uprawianych w świetle czerwonym i zielonym, chociaż niższe poziomy poziomy transkryptu fikocyjaniny 1600-zasadowej są obecne w komórkach hodowanych w zielonym świetle. Ponadto, większy transkrypt o długości 1750 zasad hybrydyzuje z genami allofykocyjaniny i może być prekursorem gatunku 1400-zasadowego. --- Badanie morskich jednokomórkowych szczepów cyjanobakterii pod kątem fikobiliprotein o wysoką zawartością fikourobiliny (PUB) doprowadziło do szczegółowego badania Synechocystis sp. WH8501. Fikobiliproteiny tego szczepu zostały oczyszczone i scharakteryzowane pod względem składu bilinowego i miejsc przyłączenia. Określono sekwencje aminokońcowe dla podjednostek alfa i beta fikocyjaniny oraz głównych i podrzędnych fikoerytryn. Sekwencje aminokwasów wokół miejsc przyłączenia wszystkich bilinowych grup prostetycznych fikocyjaniny i mniejszej fikoerytryny zostały również określone. Fikocyjanina z tego szczepu niesie pojedynczy PUB na podjednostce alfa i dwie fikocyjanobiliny na podjednostce beta. beta. Jest to jedyna znana fikocyjanina niosąca chromofor PUB. The natywne białko, wyizolowane w stanie agregacji (alfa beta) 2, wyświetla maksima absorpcji przy 490 i 592 nm. Wzbudzenie przy 470 nm, absorbowane prawie absorbowane prawie wyłącznie przez PUB, prowadzi do emisji przy 644 nm z fikocyjanobiliny. Główne i pomniejsze fikoerytryny ze szczepu WH8501 zawierają po pięć bilin na jednostkę alfa beta, cztery PUB i jedną fikoerytrobilinę. Właściwości spektroskopowe określają, że grupy PUB funkcjonują jako donory energii dla jedynej fikoerytrobiliny. Analiza peptydów bilinowych jednoznacznie identyfikuje fikoerytrobilinę w pozycji beta-82 (numeracja reszt przypisana przez homologię z B-fykoerytryną; Sidler, W., Kumpf, B., Suter, F., Klotz, A. V., Glazer, A. N., and Zuber, H. (1989) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 370, 115-124) jako końcowy akceptor energii akceptor energii w fikoerytrynach. --- Fikobilisomy, główne kompleksy zbierające światło cyjanobakterii, są wielocząsteczkowe struktury zbudowane z chromoforowych białek zwanych fikobiliprotein i niechromoforowych polipeptydów łącznikowych. Przedstawiamy tutaj izolację i sekwencję nukleotydową genów, cpeA i cpeB, które u Calothrix PCC 7601 kodują podjednostki alfa i beta fikoerytryny, jednej z głównych fitobiliprotein. W Calothrix PCC 7601 modulacja składu polipeptydowego skład polipeptydowy fikobilisomów występuje w odpowiedzi na zmiany długości fali świetlnej, zjawisko znane jako komplementarna adaptacja chromatyczna. Przy zielonym oświetleniu komórki syntetyzują fikoerytrynę i jej dwa specyficznie związane polipeptydy łącznikowe (LR35 i LR36), podczas gdy pod czerwonym oświetleniu żadne z tych białek nie jest wykrywane. Przy użyciu specyficznych sond pojedynczy transkrypt (o długości 1450 nukleotydów) odpowiadający genom cpe był ale tylko w komórkach rosnących w świetle zielonym, co wskazuje na występowanie regulacji transkrypcji dla ekspresji tego operonu w odpowiedzi na zmiany długości fali światła. zmiany długości fali światła. Rozmiar tego transkryptu wyklucza możliwość że LR35 i LR36 związane z fikoerytryną mogą ulegać kotranskrypcji z genami cpeA i cpeB. --- Celem tego badania było systematyczne badanie mechanizmów hamujących C-fikocyjaniny (C-PC), jednej z głównych fitobiliprotein Spirulina platensis (niebiesko-zielonej algi), w aktywacji płytek krwi. W tym badaniu, C-PC zależnie od stężenia (0,5-10 nM) hamował agregację płytek krwi stymulowaną przez agonistów. przez agonistów. C-PC (4 i 8 nM) hamował wewnątrzkomórkową mobilizację Ca2 + i tworzenie tromboksanu A2, ale nie rozpad fosfoinozytydów stymulowany przez kolagen (1 mikrog / ml) w ludzkich płytkach krwi. Ponadto, C-PC (4 i 8 nM) znacznie zwiększone poziomy cyklicznego GMP i cyklicznego GMP indukowanego fosforylacji Ser(157) fosfoproteiny stymulowanej przez wazodylatator (VASP). Szybka fosforylacja białka płytkowego o Mw 47,000 (P47), markera białka kinazy C, została wywołana przez forbol-12,13-dwumaślan (150 nM). Ta fosforylacja była znacznie hamowana przez C-PC (4 i 8 nM). Ponadto, C-PC (4 i 8 nM) znacznie zmniejszyło intensywność sygnału elektronowego rezonansu spinowego (ESR) rodników hydroksylowych w płytkach krwi aktywowanych kolagenem (1 mikrog/mL). Niniejsze badanie donosi o nowym i bardzo silnym (w stężeniach nanomolarnych) środek przeciwpłytkowy, C-PC, który jest zaangażowany w następujące szlaki hamujące szlaki: (1) C-fiocyjanina zwiększa fosforylację cyklicznego GMP/VASP Ser157 i a następnie hamuje aktywność kinazy białkowej C, powodując hamowanie zarówno fosforylacji fosforylacji P47 i wewnątrzkomórkowej mobilizacji Ca2+ oraz (2) C-PC może hamować wolne rodniki (takie jak rodniki hydroksylowe) uwalniane z aktywowanych płytek krwi, co ostatecznie hamuje agregację płytek krwi. Wyniki te silnie wskazują, że C-PC wydaje się reprezentować nowy i potencjalny środek przeciwpłytkowy do leczenia tętniczej choroby zakrzepowo-zatorowej. --- R-fykoerytryna została wyizolowana i oczyszczona z czerwonej algi, Polysiphonia urceolata Grev, przy użyciu kolumny Streamline w połączeniu z chromatografią jonowymienną chromatografią jonowymienną lub chromatografią hydroksyapatytową. Czystość R-fykoerytryny izolowana przez kolumnę Streamline wynosiła do 1,66, a wydajność R-fykoerytryny może wynosić nawet 0,68 mg/g zamrożonego P. urceolata. Wszystkie eluaty z kolumny Streamline podzielono odpowiednio na dwie równoważne części. Jedna część została przepompowana do kolumny jonowymiennej załadowanej Q-Sepharose, a drugą do kolumny adsorpcyjnej z hydroksyapatytem. Czystość R-fykoerytryny oczyszczonej przy użyciu tych dwóch metod wynosiła do 3,26, czyli więcej niż 3,2 powszechnie przyjętego kryterium. Wydajność oczyszczonej R-fykoerytryny z z chromatografii jonowymiennej wynosiła 0,40 mg/g zamrożonego P. urceolata, a z chromatografii hydroksyapatytowej z chromatografii hydroksyapatytowej mogła osiągnąć 0,34 mg/g zamrożonego P. urceolata. Oczyszczone białko oczyszczone białko miało trzy piki absorpcji przy 498, 535 i 565 nm i wykazywało maksimum fluorescencji przy 580 nm, co było zgodne z typowym widmem typowym widmem R-fykoerytryny. Oczyszczona R-PE została również zidentyfikowana za pomocą elektroforezy. Tylko jedno pojedyncze pasmo białka pojawiło się na natywnej barwieniu srebrem. SDS-PAGE wykazał obecność jednej głównej podjednostki 20 kDa, i jednego pasma o niskiej intensywności odpowiadającego podjednostce 33 kDa. Wyniki wskazują że zastosowanie adsorpcji na rozszerzonym złożu w połączeniu z chromatografią jonowymienną lub chromatografią hydroksyapatytową, R-fykoerytryna może być oczyszczana z zamrożonego P. urceolata na dużą skalę. --- W algach występuje szeroka gama pigmentów, w tym fitobiliproteiny. C-fikocyjanina (C-PC), fikobiliproteina, jest jednym z kluczowych pigmentów Spiruliny, mikroalgi stosowanej w wielu krajach jako suplement diety. Spirulina, mikroalga stosowana w wielu krajach jako suplement diety. Pigmenty mają ogromną wartość handlową jako naturalne barwniki w nutraceutykach, przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym, oprócz korzyści zdrowotnych. Obecnie Obecnie rosnąca świadomość szkodliwych skutków związków syntetycznych i i skłonność społeczności do korzystania z naturalnych produktów doprowadziły do wykorzystania mikroalg jako źródła naturalnych pigmentów/barwników. Niniejszy przegląd opisuje najnowsze odkrycia dotyczące źródeł i produkcji C-PC, z naciskiem na z naciskiem na konkretne techniki ekstrakcji i oczyszczania, wraz z potencjalnymi zastosowaniami przemysłowymi w diagnostyce, przemyśle spożywczym, kosmetycznym i przemyśle farmaceutycznym. --- Wyizolowano geny kodujące podjednostki alfa i beta allofykocyjaniny, fikocyjaniny i fikoerytrynę z czerwonej algi Aglaothamnion neglectum zostały wyizolowane i scharakteryzowane. Podczas gdy operony zawierające różne geny fikobiliprotein są rozproszone w genomie plastydów, geny kodujące podjednostki alfa i beta dla każdej fikobiliproteiny są przyległe. Gen podjednostki beta znajduje się w 5' zarówno dla operonów fikocyjaniny, jak i fikoerytryny, podczas gdy gen podjednostki alfa jest 5' dla operonu allofykocyjaniny. Sekwencje aminokwasowe fikobiliprotein A. neglectum wydedukowane z sekwencji nukleotydowych genów, są w 65-85% identyczne z sekwencjami analogicznych genów 65-85% identyczne z analogicznymi białkami z innych czerwonych alg i cyjanobakterii. Zachowany charakter kodowanych przez plastyd genów fikobiliprotein czerwonych alg i cyjanobakterii cyjanobakteryjnych wspiera proponowane pochodzenie plastydów czerwonych alg z cyjanobakteryjnych endosymbiontów. Wiele czynników środowiskowych wpływa na biosyntezę biosyntezę fikobilisomów. Wpływ zarówno dostępności składników odżywczych, jak i ilości światła na poziom podjednostek fikobiliprotein A. neglectum i gatunków mRNA kodujących te podjednostki. te podjednostki. --- Spirulina platensis wytwarza nutraceutyczny produkt C-fiocyjaninę (C-PC) i jednocześnie jednocześnie łagodzi emisję CO2 podczas wzrostu. Wykorzystując zaprojektowany fotobioreaktora typu płaskiego, produkcja biomasy S. platensis została znacznie zwiększona, prowadząc do szybkości usuwania CO2 i stężenia biomasy 0,23 g/L/d i 2,25 g/L, odpowiednio. Wzrost komórek, szybkość wiązania CO2 i produkcja C-PC S. platensis badano, gdy był uprawiany w różnych warunkach naświetlania. różnych warunkach naświetlania. Wraz ze wzrostem natężenia światła od 100 do 700 μmol/m(2)/s, ogólna produktywność biomasy, szybkość zużycia CO2 i maksymalna produktywność C-PC znacznie wzrosły. C-PC wzrosły znacząco do 0,74, 1,53 i 0,11 g/L/d, odpowiednio. Po określeniu odpowiedniej intensywności światła, stężenie azotu aby jeszcze bardziej zwiększyć wydajność wiązania CO2 i produkcji C-PC. i produkcji C-PC. Wyniki pokazują, że przy optymalnym stężeniu azotu optymalnym stężeniu azotu wynoszącym 0,045 M, wskaźnik zużycia CO2 i maksymalna produktywność C-PC zostały zwiększone odpowiednio do 1,58 i 0,13 g/L/d. --- Allofykocyjanina (APC) należy do rodziny fitobiliprotein, które są dobrze jako odczynniki fluorescencyjne do analizy cytometrycznej przepływu, ponieważ mają one szerokie spektrum wzbudzenia, duże przesunięcie Stoke'a i fluoryzują z wysoką wydajnością kwantową. wydajnością kwantową. Powszechne stosowanie APC było ograniczone dostępnością surowca i wysokimi kosztami oczyszczania. surowca i wysoki koszt oczyszczonej fikobiliproteiny. Oceniliśmy przydatność suchej, sproszkowanej Spiruliny platensis, dostępnej w sklepach ze zdrową żywnością jako niedrogiego źródła APC. APC ekstrahowano ze Spirulina platensis przez nocne traktowanie lizozymem, a następnie wytrącanie siarczanem amonu. wytrącanie. Następnie APC oddzielono od fikocyjaniny (jedynej innej głównej fikobiliproteiny w Spirulinie) przez elucję związanego materiału z kolumny z kolumny hydroksyloapatytowej przy użyciu rosnącego gradientu fosforanów. APC wyizolowana w ten sposób zachowała swoją normalną strukturę trimeryczną. Absorbancja oraz widma wzbudzenia i emisji fluorescencji oczyszczonych fikobiliprotein fikobiliprotein były identyczne z tymi pokazanymi wcześniej dla C-PC i APC. APC może być przechowywany w stężeniu w temperaturze 4 stopni C, zamrożony w temperaturze -70 stopni C lub jako nasycony osad siarczanu amonu, bez dysocjacji podjednostki lub zmiany we właściwościach spektralnych. Co więcej, APC zostało sprzężone z przeciwciałami monoklonalnymi i przeciwciałami monoklonalnymi i poliklonalnymi do stosowania w wielokolorowej analizie FACS, z aktywnością sprzężonego przeciwciała aktywność przeciwciała pozostaje stabilna przez co najmniej 2 lata. Zatem ta procedura jest prosta, opłacalna metoda przygotowywania odczynników do wielokolorowej immunofluorescencji i cytometrii przepływowej. --- C-Fykocyjanina (C-PC), główna biliproteina zbierająca światło ze Spirulina platensis ma większe znaczenie ze względu na jej różne właściwości biologiczne i farmakologiczne. właściwości biologiczne i farmakologiczne. Jest to rozpuszczalne w wodzie, nietoksyczne białko fluorescencyjne pigment o silnych właściwościach przeciwutleniających, przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych. W niniejszym badaniu wpływ wysoce oczyszczonego C-PC był testowany na wzrost i namnażanie ludzkiego przewlekłego szpiku kostnego. namnażanie linii komórkowej ludzkiej przewlekłej białaczki szpikowej (K562). Wyniki wskazują na znaczny spadek (49%) proliferacji komórek K562 traktowanych z 50 mikroM C-PC do 48 h. Dalsze badania obejmujące fluorescencję i mikroskop elektronowy wykazały charakterystyczne apoptozy. mikroskopu elektronowego ujawniły charakterystyczne cechy apoptotyczne, takie jak kurczenie się komórek, pękanie błon i kondensacja jądrowa. Elektroforeza agarozowa genomowego DNA komórek traktowanych C-PC wykazała wzór fragmentacji typowy dla komórek apoptotycznych. dla komórek apoptotycznych. Analiza cytometryczna komórek poddanych działaniu 25 i 50 microM C-PC przez 48 h wykazała odpowiednio 14,11 i 20,93% komórek w fazie sub-G0/G1, odpowiednio. Traktowanie komórek K562 C-PC spowodowało również uwolnienie cytochromu c do cytozolu i rozszczepienie polimerazy poli(ADP) rybozy (PARP). Badania te wykazały również obniżoną regulację antyapoptotycznego Bcl-2, ale bez żadnych zmian w proapoptotycznym Bax, a tym samym przechylając stosunek Bcl-2 / Bax w kierunku apoptozy. Wydaje się, że w tych efektach C-PC pośredniczy wejście C-PC do cytozolu przez nieznany mechanizm. Niniejsze badanie pokazuje zatem że C-PC indukuje apoptozę w komórkach K562 poprzez uwalnianie cytochromu c z mitochondriów do cytozolu, rozszczepienie PARP i regulację w dół Bcl-2. --- W niniejszym raporcie opisano studium wykonalności dotyczące zastosowania widzialnego lasera diodowego do dwóch ważnych zastosowań fluorescencji w cytometrze przepływowym. dla dwóch ważnych zastosowań fluorescencji w cytometrze przepływowym. Za pomocą lasera diodowego 3 mW 635 nm, wykonaliśmy pomiary immunofluorescencji przy użyciu fluoroforu allofykocyjaniny (APC). fluoroforu allofykocyjaniny (APC). Zmierzyliśmy limfocyty CD8 dodatnie za pomocą dwuetapowej procedury znakowania, a uzyskane histogramy wykazały dobrą separację między komórkami ujemnymi a subpopulacjami o słabej i jasnej fluorescencji. subpopulacjami. Jako drugie zastosowanie fluorescencji wybraliśmy analizę DNA za pomocą niedawno opracowanych barwników DNA/RNA TOTO-3 i TO-PRO-3. W naszej konfiguracji TO-PRO-3 dał najlepsze wyniki z CV wynoszącym 3,4%. Nasze wyniki wskazują, że kilka kilka miliwatów światła 635 nm z widzialnego lasera diodowego jest wystarczające do wykonania pomiarów immunofluorescencji pojedynczych kolorowych pomiarów immunofluorescencji z allofykocyjaniną i analizy DNA za pomocą TO-PRO-3. Główne zalety stosowania lasera diodowego w cytometrze przepływowym to niewielki rozmiar, niska cena, wysoka wydajność i długa żywotność. --- Jednokomórkowe glony kryptofitowe wykorzystują białka antenowe z chromoforami fikobilinowymi w swoich mechanizmach fotosyntezy. Mechanizm zbierania światła w tych organizmach jest znacząco różny od procesów w fikobilisomach wykorzystywanych przez cyjanobakterie i czerwone algi. Jedną z najbardziej uderzających cech kryptofitów jest lokalizacja rozpuszczalnych w wodzie fikobiliprotein, które są zawarte w przestrzeniach intratyloakoidalnych, a nie na zrębie. i nie znajdują się po stromalnej stronie lameli, jak w czerwonych algach i cyjanobakteriach. cyjanobakterii. Badania mobilności fikobiliprotein po stronie lumenalnej błon błony tylakoidów i tego, jak ich zachowanie dyfuzyjne może wpływać na etapy na etapy zbierania światła. Mikroskopia konfokalna i odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) są używane do pomiaru współczynnika dyfuzji fikoerytryny 545 (PE545), głównego białka zbierającego światło białka Rhodomonas CS24 in vivo. Stwierdzono, że dyfuzja PE545 w świetle jest zahamowana, co sugeruje możliwą asocjację błonową lub agregację jako potencjalne źródło utrudnień w mobilności. --- Fikoerytryna jest głównym pigmentem zbierającym światło czerwonych alg i cyjanobakterii. który jest szeroko stosowany jako sonda fluorescencyjna i odczynnik analityczny. W tym artykule, B-fykoerytryna i R-fykocyjanina w stanie natywnym, z czerwonej algi Porphyridium cruentum uzyskano w niedrogim i prostym procesie. Najlepsze wyniki Najlepsze wyniki tej procedury oczyszczania zostały zwiększone o współczynnik 13 do dużego poziomu preparatywnego przy użyciu anionowej kolumny chromatograficznej z celulozy DEAE celulozy. Zastosowano elucję gradientową buforem kwas octowy-octan sodu (pH 5,5). użyto. W tych warunkach zarówno 32% B-fykoerytryny, jak i 12% R-fykocyjaniny zawartej w biomasie mikroalg. B-fykoerytryna była jednorodna, jak określono za pomocą żelu dodecylosiarczanu sodu-poliakryloamidu elektroforezy (SDS-PAGE), dając trzy migrujące pasma odpowiadające jego trzy podjednostki, zgodne ze składem podjednostek (alfa beta) (6) gamma charakterystyczną dla tej biliproteiny i charakterystyką spektroskopową B-PE (spektroskopia absorpcji i emisji w świetle UV; fluorescencja w stanie ustalonym i fluorescencja polaryzacyjna). Na koniec przedstawiono wstępną analizę kosztów procesu odzyskiwania. --- R-fykoerytryna jest głównym białkiem pigmentowym zbierającym światło większości czerwonych alg fikobilisomów. Składa się z trzech pigmentowanych podjednostek polipeptydowych, alfa alfa, beta i gamma. Podczas gdy podjednostki alfa i beta fikoerytryny są unikalne w czerwonej aldze Aglaothamnion neglectum, istnieją dwie różne podjednostki gamma o różnych masach cząsteczkowych. Obie podjednostki gamma są pigmentowane przez dzięki kowalencyjnie przyłączonym liniowym tetrapirolom. Sekwencja aminokwasowa jednej z podjednostek gamma, wydedukowana z sekwencji nukleotydowej klonu cDNA nie wykazuje znaczącego podobieństwa do żadnej znanej sekwencji w bazach danych. Wynik ten jest zaskakujący, ponieważ uważa się, że podjednostka gamma fikoerytryny pełnić funkcję podobną do cyjanobakteryjnych polipeptydów łącznikowych. Podjednostka gamma A. neglectum jest syntetyzowana jako białko prekursorowe o masie 36 kDa, które jest przetwarzane na końcu aminowym, aby uzyskać dojrzałe białko o masie 33 kDa. Rozszerzenie amino-końcowe rozszerzenie było w stanie skierować małą podjednostkę Rubisco grochu do izolowanych chloroplastów grochu. Wynik ten sugeruje, że czerwone algi transportują transportują białka do plastydów za pomocą mechanizmu podobnego do tego występującego u roślin wyższych. Istnieją występują znaczące zmiany w poziomach mRNA kodującego podjednostkę gamma 33, gdy A. neglectum jest uprawiana w różnych warunkach oświetlenia i w pożywce pożywce z niedoborem azotu. Zmiany te są równoległe do tych zaobserwowanych wcześniej dla transkryptów kodujących podjednostki alfa i beta fikoerytryny. W związku z tym może być skoordynowana ekspresja genów kodujących podjednostki fikoerytryny jądrowej i plastydowej. genów. --- Fikobilisomy są agregatami białek zbierających światło przyczepionych do po stronie zrębu błon tylakoidów cyjanobakterii (niebiesko-zielonych alg) i czerwonych alg. Rozpuszczalne w wodzie fitobiliproteiny, których są trzy główne grupy, to główne grupy, chromofory tetrapirolowe kowalencyjnie związane z apoproteiną. Kilka dodatkowych białek znajduje się w obrębie fikobilisomu i służy do łączenia fikobiliproteiny ze sobą w uporządkowany sposób, a także do mocowania do błony tylakoidu. Energia wzbudzenia pochłaniana przez przez fikoerytrynę jest przenoszona przez fikocyjaninę do allofikocyjaniny z wydajnością zbliżoną do 100%. wydajnością zbliżoną do 100%. Ta ścieżka transferu energii wzbudzenia, bezpośrednio potwierdzony przez czasowo-rozdzielcze pomiary spektroskopowe, został w modelach opisujących ultrastrukturę fikobilisomu. Model model dla najbardziej typowego typu fikobilisomu opisuje zawierający alofiocyjaninę rdzeń składający się z trzech cylindrów ułożonych tak, że ich osie wzdłużne są równoległe, a ich końce tworzą trójkąt. Do tego rdzenia jest sześć struktur pręcikowych, które zawierają fikocyjaninę proksymalnie do rdzenia i fikoerytrynę dystalnie do rdzenia. Osie tych prętów są prostopadłe do osi wzdłużnej rdzenia. Taki układ zapewnia bardzo wydajny transfer energii. Połączenie fikoerytryny i fikocyjaniny w obrębie pręcików pręcików oraz przyłączenie pręcików do rdzenia i rdzenia do tylakoidu wymaga obecności kilku polipeptydów łącznikowych. Od niedawna możliwe jest funkcjonalnie i strukturalnie nienaruszonych fikobilisomów in vitro z oddzielonych komponentów, jak również ponowną asocjację fikobilisomów z pozbawionymi tylakoidami. Zrozumienie biosyntezy i montażu fikobilisomów in vivo fikobilisomów in vivo będzie znacznie ułatwione dzięki obecnym postępom w genetyce molekularnej. molekularnej, czego przykładem jest niedawna identyfikacja kilku genów kodujących składniki fikobilisomów. Połączone podejścia ultrastrukturalne, biochemiczne i biofizyczne do badania cyjanobilisomów. Połączone podejścia ultrastrukturalne, biochemiczne i biofizyczne do badania komórek cyjanobakterii i czerwonych alg oraz izolowanych Połączone podejścia ultrastrukturalne, biochemiczne i biofizyczne do badania komórek cyjanobakterii i czerwonych alg oraz izolowanych frakcji fikobilisomów-tylakoidów prowadzą do lepszego zrozumienia strukturalnych interakcji między fikobilisomem a tylakoidem, transferu energii do centrów reakcji i regulacji rozkładu energii wzbudzenia. Jednak w porównaniu do naszej obecnej wiedzy na temat strukturalnej i funkcjonalnej organizacji i funkcjonalnej organizacji wyizolowanego fikobilisomu, ten obszar badawczy jest stosunkowo niezbadany. --- Przeciwciała podniesione przeciwko mieszaninom polipeptydów fikobilisomów z eukariotycznej algi Cyanidium caldarium zostały użyte w immunologicznym ekranie do wykrycia ekspresji genów fikobiliprotein w bibliotece Escherichia coli zawierającej segmenty plastydowego (chloroplastowego, cyjanelowego) DNA z innego eukariotycznej algi Cyanophora paradoxa. Cztery uzyskane klony kandydujące zostały zmapowane przez analizę restrykcyjną i stwierdzono, że się pokrywają. Klon z najmniejszą wstawką (1,4 kilobazy) został częściowo zsekwencjonowany, a region kodujący podobny do końca karboksylowego podjednostki fitobiliproteiny beta-fikocyjaniny. Region kodujący genu beta-fykocyjaniny u C. paradoxa został zmapowany do małego regionu pojedynczej kopii na genomie cyanelle i określono jego orientację. Krótka sonda unikalna dla miejsca wiązania chromoforu współdzielonego przez co najmniej dwie podjednostki fikobiliproteiny podjednostki zostały teraz wygenerowane z karboksylowego końca genu beta-fikocyjaniny. Sonda ta może być przydatna w identyfikacji specyficznych genów podjednostek fikobiliprotein, beta-fykocyjaniny, beta-fykoerytrocyjaniny i ewentualnie beta-fykoerytryny, u innych alg eukariotycznych i prokariotycznych cyjanobakterii. cyjanobakterii. --- Fikocyjanina jest głównym białkiem produkowanym przez cyjanobakterie, ale bardzo niewiele szczepów produkujących fikocyjaninę. W niniejszym badaniu zastosowano metodologię metodologia powierzchni odpowiedzi (RSM) obejmująca centralny projekt złożony dla czterech czynników z powodzeniem zastosowano do optymalizacji składników pożywki w celu zwiększenia produkcji fikocyjaniny z Phormidium ceylanicum. Produkcja fikocyjaniny i interakcje między azotanem między azotanem sodu, chlorkiem wapnia, mieszanką metali śladowych i kwasem cytrynowym. W zoptymalizowanych warunkach P. ceylanicum był w stanie zapewnić 2,3-krotny wzrost produkcji fikocyjaniny w w porównaniu do powszechnie stosowanego podłoża BG 11 w ciągu 32 dni. Zademonstrowaliśmy ekstrakcję, oczyszczanie i charakterystykę C-fiocyjaniny przy użyciu nowej metody opartej na filtracji i jednoetapowej chromatografii. Białko zostało ekstrahowane przez powtarzane cykle zamrażania-rozmrażania, a surowy ekstrakt był filtrowany i zagęszczony w mieszanej komorze ultrafiltracyjnej (UFC). Koncentrat UFC został następnie poddany pojedynczemu etapowi chromatografii jonowymiennej. Współczynnik czystości 4,15 został osiągnięty z wartości początkowej 1,05. Skuteczność odzyskiwania C-fikocyjaniny z surowego ekstraktu wyniosła 63,50%. Czystość została sprawdzona przez elektroforezę i spektroskopię UV-Vis. --- Fikocyjanina - główna fitobiliproteina konstytutywnie produkowana przez wiele cyjanobakterie - ma kilka obiecujących zastosowań w diagnostyce, badaniach biomedycznych i terapeutycznych. badaniach biomedycznych i terapiach. W niniejszym artykule omówiono nową, szybką metodę oczyszczania cyjanobakteryjnej fikocyjaniny (C-PC) z Phormidium fragile przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Białko zostało wyekstrahowane i zatężono przez mielenie w ciekłym azocie i frakcjonowanie siarczanem amonu. frakcjonowanie. C-PC oczyszczono za pomocą jednoetapowej chromatografii oddziaływań hydrofobowych. chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Oczyszczona fikocyjanina wykazywała maksimum absorbancji (lambda(max)) przy długości fali 624 nm. Osiągnięte kryterium czystości (R) wyniosło 4,52. Fikocyjanina do stosunek czystości fikocyjaniny do fikoerytryny i fikocyjaniny do allofikocyjaniny wynosił odpowiednio 3,85 i odpowiednio 7,49. Oczyszczone białko wykazywało pI 5,2 i miało dwie podjednostki o masie cząsteczkowej 19 i 20 kDa każda, co odpowiada jego wysoce opisanym podjednostkom podjednostkom alfa i beta. Podjednostki fikocyjaniny zostały potwierdzone przez ich fluorescencji biliny przy użyciu techniki wzmocnienia fluorescencji wspomaganej cynkiem. Nienaruszona C-PC miała 125 kDa, jak określono za pomocą HPLC, co sugeruje złożenie podjednostki (alfa-beta)(3) montaż podjednostki. Wyniki uzyskane tą metodą pod względem czystości, odzysku, czasu procesu, prostoty i skuteczności są znacznie lepsze niż poprzednie metody. metodologii. Oczyszczona fikocyjanina była dalej badana pod kątem jej przeciwutleniacza przeciwutleniających i oceniono w porównaniu z pięcioma nieenzymatycznymi przeciwutleniaczami za pomocą testu FRAP. --- B-fykoerytryna (B-PE) jest głównym pigmentem zbierającym światło mikroalg. Ze względu na wysoką wydajność fluorescencji oraz intensywny i unikalny różowy kolor, jest on szeroko stosowany jako sonda fluorescencyjna i odczynnik analityczny, a także jako stosowany jako naturalny barwnik w żywności i kosmetykach. Opublikowano żmudne metodologie oczyszczania B-PE zostały opublikowane. W tej pracy przedstawiamy nową, szybką, preparatywną i skalowalną dwuetapową metodę chromatograficzną oczyszczania B-PE z czerwonej mikroalgi Porphyridium cruentum. Początkowo, fikobiliproteiny były uwolnione z komórek mikroalgi przez szok osmotyczny i wychwycone przez zastosowanie odwirowaną zawiesinę komórek do kolumny zawierającej 74 ml Streamline-DEAE zrównoważonej 50 mM buforem kwas octowy-octan sodu, pH 5,5, przy użyciu chromatografii adsorpcyjnej ze złożem ekspandowanym przy przepływie w górę 200 cm h(-1). Po adsorpcji, przemywanie przeprowadzono w trybie złoża rozszerzonego. Po usunięciu niezwiązane białka i resztki komórkowe, złoże pozostawiono do sedymentacji, a roztwór bogaty w roztwór bogaty w B-PE eluowano przepływem w dół tego samego buforu 250 mM. W celu w celu uzyskania czystego B-PE, wykorzystaliśmy konwencjonalną chromatografię jonowymienną z kolumną z celulozy DEAE załadowaną bezpośrednio eluatem ze Streamline-DEAE. Streamline-DEAE i rozwiniętą przy użyciu nieciągłego gradientu buforu kwas octowy buforu kwas octowy-octan sodu, pH 5,5. Dzięki tej nowej metodologii, 66% B-PE zawartego w biomasie mikroalg zostało odzyskane, co jest wartością znacznie wyższą wartość znacznie wyższa niż uzyskana przy użyciu innych metod. Czystość B-PE została przy użyciu elektroforezy żelowej dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu oraz charakterystyki spektroskopowej. charakterystykę spektroskopową. --- Widma działania fotosyntetycznego kilku cyjanobakterii wykazują pik przy około 650 nm, którego wysokość jest skorelowana z zawartością allofiocyjaniny w badanych szczepach. badanych szczepach. Alofiocyjanina zbiera światło bardziej efektywnie niż fikocyjanina i fikoerytryna. Udział absorpcji chlorofilu a w aktywności fotosyntetycznej jest ledwo wykrywalny w komórkach o normalnym składzie pigmentu. pigmentu. Chlorofil a staje się głównym pigmentem zbierającym światło w komórkach które zostały fizjologicznie pozbawione fikobiliprotein. --- Fikobilisomy jednokomórkowych cyjanobakterii morskich są unikalne pod względem posiadania pręcików z dwiema odrębnymi fikoerytrynami, PE I i PE II, z odpowiednio pięcioma i sześcioma bilinami (Ong L. J. i Glazer A. N. sześć bilin, odpowiednio (Ong, L. J., i Glazer, A. N. (1991) J. Biol. Chem. 266, 9515-9527). Geny dla podjednostek alfa i beta PE I, PE II, i fikocyjaniny, a także dla polipeptydu łącznikowego związanego z PE II, są zgrupowane w pojedynczym 15-kilobazowym regionie genomu Synechococcus sp. WH8020. Pełne sekwencjonowanie tego regionu pozwoliło na ostateczne przypisanie pozycji wszystkich miejsc przyłączenia biliny w tych fikobiliproteinach. Dwanaście innych otwartych ramek odczytu jest ściśle związanych z genami strukturalnymi określonymi powyżej. Sześć jest homologicznych do otwartych ramek odczytu sąsiadujących z genami fikobiliprotein u innych cyjanobakterii i wywnioskowano, że są one zaangażowane w dodawanie biliny. Jest to jest to największa liczba otwartych ramek odczytu tej klasy znanych w jakiejkolwiek cyjanobakterii. cyjanobakterii. Inna z otwartych ramek odczytu ma krótki region uderzające podobieństwo do sekwencji miejsca aktywnego bydła fosfatazy białkowo-fosfotyrozynowej.
Jakie są główne fitobiliproteiny obecne u sinic?
Fikobiliproteiny pochodzą z aparatu fotosyntetycznego cyjanobakterii i alg eukariotycznych i tworzą ich duże zewnętrzne kompleksy antenowe zwane fikobilisomami. Fikobilisomy mają rdzeń złożony z allofikocyjaniny (APC) i pręcików, które mają zmienny skład fikobiliprotein. C-fykocyjanina (C-Pc) jest jednym z głównych pigmentów biliproteinowych zbierających światło, produkowanym konstytutywnie przez wiele cyjanobakterii, takich jak Spirulina platenesis (niebiesko-zielona alga). B-fykoerytryna (B-PE) jest innym głównym pigmentem zbierającym światło występującym w czerwonych algach i cyjanobakteriach. R-fykoerytryna (R-PE) jest głównym zbierającym światło białkiem pigmentowym większości fikobilisomów czerwonych alg.