CEL: Pilnie potrzebne są nowe terapie dla pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML). białaczką szpikową (AML). Nowy inhibitor NEDDylacji MLN4924 (pevonedistat) ma wykazał znaczącą przedkliniczną aktywność przeciwbiałaczkową i wstępną skuteczność u pacjentów z AML w badaniu fazy I. Na podstawie jego właściwości przeciwnowotworowe i uszkadzające DNA, zbadaliśmy zdolność MLN4924 do wspomagania konwencjonalnej terapii cytarabiną (ara-C). PROJEKT EKSPERYMENTALNY: Wpływ MLN4924 / ara-C na żywotność, przeżycie klonogenne klonogenną, apoptozę, uszkodzenia DNA i odpowiednie cele farmakodynamiczne. określono. Skuteczność i farmakodynamikę MLN4924/ara-C oceniano w modelu ksenoprzeszczepu AML. WYNIKI: Leczenie linii komórkowych AML i pierwotnych próbek pacjentów za pomocą MLN4924 i ara-C prowadziło do zmniejszenia przeżywalności klonogennej, zwiększonej apoptozy, i synergistyczne poziomy uszkodzeń DNA. RNAi wykazało, że stabilizacja CDT-1, wcześniej wykazana jako czynnik pośredniczący w uszkadzającym DNA działaniu MLN4924, nie była kluczowym regulatorem wrażliwości na kombinację MLN4924/ara-C. Globalne profilowanie metaboliczne ujawniło, że MLN4924 zakłóca metabolizm nukleotydów i wyczerpuje wewnątrzkomórkowe pule nukleotydów w komórkach AML. Kolejne eksperymenty wykazały, że MLN4924 promował zwiększoną inkorporację ara-C do DNA komórek AML. komórek AML. Efekt ten, jak również korzyści terapeutyczne kombinacji MLN4924/ara-C był antagonizowany przez suplementację nukleotydowym blokiem bloku nukleotydowego - rybozy. Jednoczesne podawanie MLN4924 i ara-C myszom noszącym FLT3-ITD(+) AML stabilnie hamowało progresję choroby i zwiększało uszkodzenia DNA in vivo. vivo. WNIOSKI: Nasze odkrycia stanowią mocne uzasadnienie dla badań klinicznych kombinacji MLN4924/ara-C i ustanawiają nowy związek między terapeutycznym między terapeutycznym hamowaniem NEDDylacji a zmianami w metabolizmie nukleotydów. Clin Cancer Res; 21(2); 439-47. ©2014 AACR. --- Trójfosfohydrolaza deoksynukleozydów SAMHD1 ogranicza replikację retrowirusów w komórkach szpikowych. Ludzki wirus niedoboru odporności typu 2 (HIV-2) i małpi wirus niedoboru odporności wirus niedoboru odporności pochodzący od makaków rezus (SIVmac) kodują Vpx, białko pomocnicze białko pomocnicze, które przeciwdziała SAMHD1 poprzez indukowanie jego degradacji. degradację. Uważa się, że SAMHD1 działa poprzez wyczerpanie puli wewnątrzkomórkowych trifosforanów deoksynukleozydów, ale stwierdzono również, że ma aktywność egzonukleazy aktywność, która może pozwolić mu na degradację wirusowego genomowego RNA lub wirusowego wirusowego odwrotnie transkrybowanego DNA. Aby wywołać degradację SAMHD1, Vpx współpracuje z opartym na ligazę ubikwityny E3 opartą na cullin4a, CRL4. Ligazy ubikwityny E3 są regulowane przez kowalencyjne przyłączenie białka podobnego do ubikwityny Nedd8 do podjednostki kulliny do podjednostki cullin. Neddylacji można zapobiec za pomocą MLN4924, leku, który hamuje enzym aktywujący nedd8. Donosimy, że MLN4924 hamuje neddylację CRL4, blokując indukowaną przez Vpx degradację SAMHD1 i utrzymując restrykcję ograniczenie. Usunięcie leku kilka godzin po zakażeniu uwolniło blokadę. Podobnie, cząstki wirusopodobne zawierające Vpx i dezoksynukleozydy dodane do komórek komórki ponad 24 godziny po zakażeniu zwolniły blok, w którym pośredniczy SAMHD1. Podsumowując razem, odkrycia te potwierdzają wyczerpanie puli trifosforanów deoksynukleozydów jako podstawowy mechanizm ograniczenia SAMHD1 i argumentują przeciwko mechanizmowi nukleolitycznemu mechanizm, który nie byłby odwracalny. --- Enzym aktywujący NEDD8 (NAE) inicjuje białkowy szlak homeostatyczny niezbędny dla wzrostu i przeżycia komórek nowotworowych. MLN4924 jest selektywnym inhibitorem NAE, który obecnie znajduje się w fazie badań klinicznych w leczeniu raka. Tutaj pokazujemy że MLN4924 jest inhibitorem NAE opartym na mechanizmie i tworzy kowalencyjne połączenie addukt NEDD8-MLN4924 katalizowany przez enzym. Addukt NEDD8-MLN4924 przypomina adenylan NEDD8, pierwszy produkt pośredni w cyklu reakcji NAE, ale nie może być dalej wykorzystywany w kolejnych reakcjach wewnątrzenzymatycznych. Stabilność adduktu adduktu NEDD8-MLN4924 w miejscu aktywnym NAE blokuje aktywność enzymu, tym samym co odpowiada za silne hamowanie szlaku NEDD8 przez MLN4924. Co ważne, ustaliliśmy, że związki przypominające MLN4924 wykazują zdolność do tworzenia analogicznych adduktów z innymi białkami podobnymi do ubikwityny (UBL) katalizowanych przez ich kognatyczne enzymy aktywujące. Odkrycia te ujawniają wgląd w mechanizm działania E1s i sugerują ogólną strategię selektywnego hamowania szlaków koniugacji UBL. --- Informacje o autorze: (1)1] Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center; Collaborative Centrum Innowacji Medycyny Nowotworowej; Wydział Onkologii, Shanghai Medical College, Uniwersytet Fudan, Szanghaj, Chiny [2] Zakład Immunologii, Szkoła Podstawowych Nauk Medycznych, Uniwersytet Fudan, Szanghaj, Chiny of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai, Chiny [3] Department of Chirurgii Trzustki i Wątroby, Centrum Onkologii Uniwersytetu Fudan w Szanghaju, Shanghai Medical College, Uniwersytet Fudan, Szanghaj, Chiny. (2)1] Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center; Collaborative Centrum Innowacji Medycyny Nowotworowej; Departament Onkologii, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, Chiny. College, Fudan University, Szanghaj, Chiny [2] Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Chiny of Basic Medical Sciences, Uniwersytet Fudan, Szanghaj, Chiny. (3) Shanghai Key Laboratory of Regulatory Biology, Institute of Biomedical Sciences and School of Life Sciences, East China Normal University, Szanghaj, Chiny. (4) State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Department of Wydział Biochemii, Uniwersytet Nanjing, Nanjing, Chiny. (5) Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center; Collaborative Centrum Innowacji Medycyny Onkologicznej; Wydział Onkologii, Shanghai Medical College, Uniwersytet Fudan, Shanghai. College, Uniwersytet Fudan, Szanghaj, Chiny. (6)Department of Pancreas and Hepatobiliary Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, Shanghai Medical College, Fudan University, Szanghaj, Chiny. (7) College of Pharmacy, Seoul National University, Seul, Korea. (8) AntiCancer Biotech Beijing Co. Ltd., Pekin, Chiny. (9) Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Szanghaj, Chiny. (10)Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. Center, Houston, TX, USA. (11)1] Department of Surgery, University of California, San Diego, CA, USA [2] AntiCancer, Inc, San Diego, CA, USA. --- MLN4924, nowo odkryty małocząsteczkowy inhibitor enzymu aktywującego NEDD8 (NAE) (NAE), inaktywuje ligazy ubikwityny E3 Cullin-RING (CRL) poprzez blokowanie neddylacji kullin neddylację. W rezultacie MLN4924 powoduje akumulację kilku kluczowych substratów CRL i skutecznie hamuje wzrost komórek nowotworowych poprzez indukowanie apoptozy i senescencji. apoptozę i senescencję. Jednak rola MLN4924 w indukcji autofagii i jej znaczenie biologiczne są całkowicie nieznane. znaczenie biologiczne są całkowicie nieznane. Tutaj wykazaliśmy, że MLN4924 skutecznie indukuje autofagię zarówno w sposób zależny od czasu, jak i dawki w wielu ludzkich liniach nowotworowych, wskazując na ogólne zjawisko. Mechanistycznie, poprzez inaktywację CRL, MLN4924 powoduje akumulację DEPTOR i HIF1α. Badania siRNA knockdown i badania KO genów wykazały, że DEPTOR i oś HIF1-REDD1-TSC1 są odpowiedzialne za autofagię indukowaną MLN4924 poprzez hamowanie mTORC1. Z biologicznego punktu widzenia autofagia jest sygnałem przeżycia dla komórek nowotworowych, a blokada autofagii poprzez knockdown siRNA, gen KO i inhibitor małych cząsteczek znacząco wzmocniona apoptoza indukowana MLN4924. Nasze badanie ujawnia niescharakteryzowany mechanizm działania mechanizm działania MLN4924 i dostarcza dowodów potwierdzających słuszność koncepcji dla strategiczne połączenie MLN4924 z inhibitorem autofagii w celu maksymalnego zabijania komórek nowotworowych poprzez zwiększenie apoptozy. --- Ligaza ubikwityny Cullin-RING (CRL), z jej członkiem-założycielem SKP1-Cullins-F-box proteins (SCF) E3 ligaza ubikwityny, jest największą rodziną ligaz E3, która wymaga neddylacji kullin. ligaz E3, która do swojej aktywacji wymaga neddylacji kullin. Ostatnio, inhibitor inhibitor enzymu aktywującego NEDD8 (NAE), MLN4924, został zgłoszony do blokowania neddylację kulliny i inaktywację CRL/SCF E3, co skutkuje indukcją apoptozy i supresji guza zarówno in vitro, jak i in vivo. Donosimy tutaj, że apoptoza nie jest jedynym mechanizmem, za pomocą którego MLN4924 hamuje wzrost komórek nowotworowych, ponieważ apoptoza jest umiarkowanie indukowana przez lek w niektórych liniach komórek nowotworowych i indukowana lekiem supresja wzrostu jest tylko częściowo blokowana przez pan-caspase inhibitor z-VAD. Leczenie MLN4924 indukuje cechy fenotypów senescencji fenotypów starzenia, o czym świadczy powiększona i spłaszczona morfologia komórek oraz Pozytywne barwienie β-Gal związanego ze starzeniem. Starzenie indukowane MLN4924 jest związane z komórkową odpowiedzią na uszkodzenia DNA. jest związana z odpowiedzią komórkową na uszkodzenia DNA, wywołaną przez akumulację białek CDT1 i ORC1, w wyniku inaktywacji białek CRL/SCF E3s. Senescencja zachodzi w sposób niezależny od pRB/p16 i p53, ale zależna od p21, znanego substratu CRL/SCF E3s i mediatora starzenia, który gromadzi się po inaktywacji CRL/SCF przez MLN4924. Ponadto, Indukowana przez MLN4924 senescencja jest nieodwracalna i połączona z uporczywą akumulacją p21 i trwałą aktywacją odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Nasze badanie ujawnia nowy mechanizm działania MLN4924 i wykazało, że MLN4924 może być dalej rozwijany jako skuteczny środek przeciwnowotworowy poprzez indukowanie apoptozy i nieodwracalną senescencję. --- MLN4924 jest badanym małocząsteczkowym inhibitorem enzymu aktywującego Nedd8. obecnie w fazie I badań klinicznych. MLN4924 indukuje uszkodzenia DNA poprzez rereplikację w większości linii komórkowych. Ten odmienny mechanizm uszkodzenia DNA może wpływać na jego zdolność do łączenia ze standardowymi lekami i może wpływać na rozwój kliniczny MLN4924. rozwój kliniczny MLN4924. W związku z tym zbadaliśmy jego interakcję z innymi czynnikami uszkadzającymi DNA. Mitomycyna C, cisplatyna, cytarabina, promieniowanie UV, SN-38, i gemcytabina wykazały synergię w połączeniu z MLN4924 in vitro. Połączenie mitomycyny C i MLN4924 wykazano synergizm w mysim modelu ksenograficznym. modelu ksenoprzeszczepu u myszy. Co ważne, zubożenie genów w obrębie ataksji telangiektazji i związanych z Rad3 (ATR) i BRCA1/BRCA2, modyfikacji chromatyny i transkrypcji modyfikacja i naprawa sprzężona z transkrypcją zmniejszyły synergię między mitomycyną C i MLN4924. Ponadto test kometowy wykazał zwiększoną liczbę pęknięć nici DNA pęknięć nici DNA w połączeniu MLN4924 i mitomycyny C. Nasze dane sugerują, że że mitomycyna C powoduje zablokowanie widełek replikacyjnych, co w połączeniu z replikacją indukowaną przez MLN4924 powoduje częste kolizje widełek replikacyjnych, prowadzące do śmierci komórki. co prowadzi do śmierci komórki. Badanie to zapewnia proste podejście do zrozumienia mechanizmu synergii, które może dostarczyć użytecznych informacji dla rozwoju klinicznego tych kombinacji. --- MLN4924 jest badanym małocząsteczkowym inhibitorem enzymu aktywującego NEDD8 (NAE). (NAE) w badaniach klinicznych w leczeniu raka. MLN4924 jest inhibitorem inhibitorem opartym na mechanizmie, z inhibicją enzymu zachodzącą poprzez tworzenie ściśle wiążącego adduktu NEDD8-MLN4924. W modelach komórkowych i ksenograftach raka, zidentyfikowaliśmy heterozygotyczne mutacje związane z leczeniem w regionie adenozynotrifosforanowej kieszeni wiążącej i szczelinie wiążącej NEDD8 NAEβ jako główny mechanizm oporności na MLN4924. główny mechanizm oporności na MLN4924. Analizy biochemiczne mutantów NAEβ ujawniły wolniejsze tempo tworzenia adduktów i zmniejszone powinowactwo adduktów do zmutowanych enzymów. zmutowanych enzymów. Związek o ściślejszych właściwościach wiązania był w stanie silnie silnie hamować zmutowane enzymy w komórkach. Dane te dostarczają racjonalnych przesłanek dla selekcji pacjentów i rozwoju inhibitorów NAE nowej generacji zaprojektowanych w celu przezwyciężyć mutacje NAEβ związane z leczeniem. --- MLN4924, małocząsteczkowy inhibitor enzymu aktywującego NEDD8 (NAE), został wykazuje działanie przeciwnowotworowe na różne nowotwory złośliwe. W tym badaniu, zbadaliśmy działanie przeciwnowotworowe MLN4924 w ludzkim raku urotelialnym (UC) in vitro i in vivo przy użyciu trzech ludzkich linii komórkowych UC o różnym stopniu złośliwości (T24, NTUB1 i RT4). Wpływ MLN4924 na komórki UC został określony przez pomiar żywotności (MTT), proliferacji (inkorporacja BrdU), cyklu komórkowego cyklu komórkowego (cytometria przepływowa z barwieniem jodkiem propidium) i apoptozy (cytometria przepływowa z cytometria przepływowa ze znakowaniem aneksyną V-FITC). Cząsteczki regulujące cykl komórkowy, cząsteczki związane z apoptozą i białka związane ze stresem komórkowym zostały zbadane przez Western blotting. Wpływ migracji i inwazji komórek nowotworowych został  Oceniliśmy również wpływ MLN4924 na wzrost guza za pomocą mysiego modelu ksenoprzeszczepu SCID. Dane pokazują, że MLN4924 indukował zależną od dawki cytotoksyczność, antyproliferację, anty-migrację, przeciwinwazyjną i apoptozę w ludzkich komórkach UC, czemu towarzyszyła aktywacja Bad, fosfo-histonu H2A.X, kaspazy-3, 7 i PARP, obniżony poziom fosfo-Bcl2 i powodował opóźnienie cyklu komórkowego w fazie G2M. Ponadto, MLN4924 aktywował cząsteczki związane ze stresem retikulum endoplazmatycznego (kaspaza-4, fosfo-eIF2α, ATF-4 i CHOP) i inne odpowiedzi na stres (aktywacja JNK i c-Jun). aktywacje). Wreszcie, potwierdziliśmy, że MLN4924 hamował wzrost guza w mysim modelu UC z minimalną toksycznością ogólną. Doszliśmy do wniosku, że MLN4924 indukuje apoptozę i zatrzymanie cyklu komórkowego, a także aktywację odpowiedzi komórek na stres w ludzkim UC. Odkrycia te sugerują, że MLN4924 zapewnia nową strategię w leczeniu UC. --- Wielojednostkowa ligaza E3 Cullin (CUL)-RING (CRL) kontroluje różnorodne procesy biologiczne poprzez procesy biologiczne poprzez kierowanie masy substratów do ubikwitynacji i degradacji, podczas gdy jej dysfunkcja powoduje rakotwórczość. Posttranslacyjna neddylacja białka CUL, proces wyzwalany przez enzym aktywujący NEDD8 E1 podjednostkę 1 (NAE1), jest wymagany do aktywacji CRL. wymagany do aktywacji CRL. Niedawno MLN4924 został odkryty przez jako specyficzny inhibitor NAE1 i pierwszy w swojej klasie lek przeciwnowotworowy. lek przeciwnowotworowy. Blokując neddylację CUL, MLN4924 inaktywuje CRL i powoduje akumulację substratów CRL, które powodują zatrzymanie cyklu komórkowego, senescencję i/lub apoptozę, hamując wzrost komórek nowotworowych in vitro i in vivo. Niedawno odkryliśmy, że MLN4924 wyzwala również ochronną autofagię w odpowiedzi na inaktywację CRL. na inaktywację CRL. Autofagia indukowana przez MLN4924 jest częściowo przypisywana hamowaniu mechanistycznego celu rapamycyny (znanego również jako cel ssaków rapamycyny, MTOR) poprzez akumulację białka hamującego MTOR DEPTOR, a także stresem wywołanym przez reaktywne formy tlenu (ROS). Ponadto blokada odpowiedzi autofagii zwiększa apoptozę w komórkach leczonych MLN4924. Nasze odkrycia nie tylko ujawniają autofagię jako nową odpowiedź komórkową na inaktywację CRL przez MLN4924. inaktywację CRL przez MLN4924, ale także dostarczają dowodu słuszności koncepcji dowodów na połączenie MLN4924 z inhibitorami autofagii w celu zwiększenia skuteczność terapeutyczną. --- Zbadano komórkowe skutki działania inhibitora enzymu aktywującego Nedd8 (NAE), MLN4924, przy użyciu formatu AlphaScreen. MLN4924 działa jako inhibitor NAE wspomagany substratem inhibitor NAE poprzez tworzenie ściśle wiążącego adduktu Nedd8-MLN4924. Zahamowany enzym enzym nie może już przenosić Nedd8 w dół łańcucha, aby modyfikować i aktywować ligazy E3 ligazy kullin-RING. Powoduje to stabilizację białek regulowanych przez proteasom proteasom, co prowadzi do śmierci komórki. Badania te monitorowały endogenne zmiany komórkowe w tioestrze NAE∼Nedd8, powstawanie adduktu Nedd8-MLN4924 i redukcję Cul1-Nedd8. Lizaty pochodzące z komórek HCT116 traktowanych MLN4924 wykazały, że podczas gdy podjednostka β NAE pozostała na stałym poziomie, nastąpiła redukcja zarówno tioestru NAE∼Nedd8, jak i poziomu Cul1-Nedd8 z jednoczesnym wzrostem adduktu. Co więcej, tworzenie Nedd8-MLN4924 było w przybliżeniu stechiometryczne ze stężeniem NAEβ. Testy oparte na komórkach z 384 dołkami o wyższej gęstości zilustrowały kinetykę inaktywacji enzymu w szerszym zakresie. inaktywacji enzymu w szerszym zakresie stężeń MLN4924, wykazując szybką utratę tioestru NAE∼Nedd8 i Cul1-Nedd8. Redukcja tioestru NAE∼Nedd8 poprzedza utratę Cul1-Nedd8 w dwukrotnie szybszym tempie. Wreszcie, te wyniki wyraźnie pokazują użyteczność jednorodnego testu dla ilościowej oceny tych endogennych składników komórkowych w 384-dołkowej płytce w odpowiedzi na hamowanie NAE przez MLN4924. --- Brownell i wsp. (2010) wyjaśnili mechanizm działania MLN4924, inhibitora enzymu aktywującego inhibitora enzymu aktywującego NEDD8. MLN4924 wymaga aktywności enzymu do wygenerowania analogu adenylanu NEDD8, który silnie i selektywnie wyłącza ten posttranslacyjny system modyfikacji ten potranslacyjny system modyfikacji. --- Enzym aktywujący ubikwitynę (UAE lub E1) aktywuje ubikwitynę poprzez pośredni adenylan i katalizuje jej transfer do enzymu sprzęgającego ubikwitynę (E2). i katalizuje jej transfer do enzymu sprzęgającego ubikwitynę (E2). MLN4924 jest analogiem sulfamatu adenozyny, który został zidentyfikowany jako selektywny, oparty na mechanizmie inhibitor enzymu aktywującego NEDD8 (NAE), innego enzymu E1, poprzez tworzenie adduktu NEDD8-MLN4924, który ściśle wiąże się w miejscu aktywnym NAE, nowy mechanizm określany jako hamowanie wspomagane substratem (Brownell, J. E, Sintchak, M. D., Gavin, J. M., Liao, H., Bruzzese, F. J., Bump, N. J., Soucy, T. A., Milhollen, M. A., Yang, X., Burkhardt, A. L., Ma, J., Loke, H. K., Lingaraj, T., Wu, D., Hamman, K. B., Spelman, J. J., Cullis, C. A., Langston, S. P., Vyskocil, S., Sells, T. B., Mallender, W. D., Visiers, I., Li, P., Claiborne, C. F., Rolfe, M., Bolen, J. B., and Dick, L. R. (2010) Mol. Cell 37, 102-111). W w niniejszym badaniu, wspomagane substratem hamowanie ludzkiego UAE (Ube1) przez inny analog sulfaminianu adenozyny, 5'-O-sulfamoilo-N(6)-[(1S)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ylo]-adenozynę (związek I), nieselektywny inhibitor E1 (Ube1). scharakteryzowano nieselektywny inhibitor E1. Związek I hamował zależną od UAE aktywność wymiany ATP-PP(i), powodowała utratę tioestru UAE i hamowała transtiolację E1-E2 w sposób zależny od dawki. Badania mechanistyczne związku I i jego oczyszczonym adduktem ubikwityny wykazują, że proponowane hamowanie wspomagane substratem poprzez tworzenie kowalencyjnego adduktu jest całkowicie zgodne z trzystopniowym procesem aktywacji ubikwityny i że addukt powstaje poprzez nukleofilowy atak tioestru UAE przez grupę sulfaminianową związku Związek I po zakończeniu etapu 2. Analiza kinetyczna i powinowactwa związku I, MLN4924 i ich oczyszczonych adduktów ubikwityny sugerują, że zarówno szybkość tworzenia tworzenia adduktów i powinowactwo między adduktem a E1 przyczyniają się do ogólną siłę działania. Ponieważ uważa się, że wszystkie E1 wykorzystują podobny mechanizm do aktywują swoje białka podobne do ubikwityny, wspomagane substratem hamowanie przez analogi sulfaminianu adenozyny stanowi obiecującą strategię opracowanie silnych i selektywnych inhibitorów E1, które mogą modulować różne szlaki biologiczne. szlaki biologiczne. --- Hamowanie enzymu aktywującego NEDD8 (NAE) stało się bardzo obiecującym podejściem do leczenia raka poprzez podejście do leczenia raka za pomocą analogu sulfaminianu adenozyny MLN4924. Tutaj, pokazujemy, że selektywna presja powoduje, że komórki raka jelita grubego HCT116 o zmniejszonej wrażliwości na MLN4924 i identyfikujemy przejście pojedynczego nukleotydu która zmienia alaninę 171 na treoninę (A171T) podjednostki NAE UBA3. To zmniejsza powinowactwo enzymu do MLN4924 i ATP, jednocześnie zwiększając NEDD8 przy fizjologicznych stężeniach ATP. Ekspresja UBA3 A171T jest wystarczająca do zmniejszenia wrażliwości na MLN4924 naiwnych komórek HCT116, wskazując że jest to dominujący supresor śmierci komórkowej, w której pośredniczy MLN4924. Nasze dane sugerują, że siła działania MLN4924 na cel wybiera mutację punktową w NAE, która przezwycięża hamujące działanie cząsteczki, umożliwiając komórkom nowotworowym przeżycie. --- MLN4924 jest pierwszym w swojej klasie eksperymentalnym lekiem przeciwnowotworowym, który hamuje enzym aktywujący enzym aktywujący NEDD8, hamując w ten sposób ligazy ubikwityny kullin-RING E3 i stabilizując wiele substratów kullin stabilizując wiele substratów kullin. Mechanizm, za pomocą którego MLN4924 hamuje proliferację komórek nowotworowych proliferację komórek nowotworowych nie został zdefiniowany, chociaż towarzyszy mu rereplikacji DNA i towarzyszącym jej uszkodzeniom DNA. Tutaj pokazujemy, że stabilizacja czynnika replikacji DNA Cdt1, substratu kullin 1 i 4, jest krytyczna dla MLN4924 do uruchomienia replikacji DNA i zahamowania proliferacji komórek. Nawet tylko 1 godzina godzina ekspozycji na MLN4924, która była wystarczająca do podniesienia poziomu Cdt1 przez 4-5 godzin, była wystarczająca do wywołania replikacji DNA i aktywacji szlaków apoptozy i szlaków starzenia. Komórki w fazie S były najbardziej podatne, co sugeruje, że MLN4924 będzie najbardziej toksyczny dla wysoce proliferujących nowotworów. Chociaż MLN4924 wydaje się być zależny od indukcji p53 i jego efektora p21(2). p21(Waf1), stwierdziliśmy, że komórki p53(-/-) i p21(-/-) były nawet bardziej podatne niż komórki dzikie. były nawet bardziej podatne na MLN4924 niż komórki typu dzikiego. Nasze wyniki sugerują, że apoptoza, a nie senescencja, może być ważniejsza dla antyproliferacyjnego działania MLN4924. Co więcej, nasze odkrycia pokazują, że przejściowa ekspozycja na ten nowy badany lek powinna być przydatna do kontrolowania p53-ujemnych komórek nowotworowych, które często stanowią istotne wyzwanie kliniczne. wyzwanie. --- MLN4924 jest silnym i selektywnym małocząsteczkowym inhibitorem enzymu aktywującego NEDD8 (NAE). inhibitor. W większości testowanych komórek nowotworowych hamowanie NAE prowadzi do indukcji DNA, co skutkuje uszkodzeniem DNA i śmiercią komórki. Jednak w przedklinicznych modelach aktywowanego chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (ABC) (DLBCL), wykazujemy, że MLN4924 indukuje alternatywny mechanizm działania. Leczenie komórek ABC DLBCL za pomocą MLN4924 spowodowało szybką akumulację pIkappaBalfa, zmniejszenie zawartości jądrowego p65, redukcję jądrowego czynnika aktywności transkrypcyjnej czynnika jądrowego-kappaB (NF-kappaB) i zatrzymanie G(1), co ostatecznie powodując indukcję apoptozy, zdarzenia zgodne z silnym hamowaniem szlaku NF-kappaB hamowanie szlaku. Leczenie komórek DLBCL podobnych do komórek zarodkowego centrum B (GCB) spowodowało wzrost komórkowego Cdt-1 i akumulację komórek w fazie S, co jest zgodne z komórkami poddawanymi replikacji DNA. Podawanie in vivo MLN4924 myszom z ludzkimi guzami ksenograftowymi ABC- i GCB-DLBCL blokowało biomarkery szlaku NAE i spowodowało całkowite zahamowanie wzrostu guza. W pierwotnych ludzkich modelach guza ABC-DLBCL, leczenie MLN4924 spowodowało zahamowanie szlaku NF-kappaB, któremu towarzyszyła regresja guza. hamowanie szlaku NF-kappaB, któremu towarzyszyła regresja guza. Niniejsza praca opisuje nowy mechanizm ukierunkowanej modulacji szlaku NF-kappaB w DLBCL i zapewnia silne uzasadnienie dla rozwoju klinicznego MLN4924 przeciwko chłoniakom zależnym od NF-kappaB. chłoniakom. --- Ligand indukujący apoptozę związany z TNF (TRAIL) jest selektywną cytokiną o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym. o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym i jest obecnie testowany klinicznie. Rak płaskonabłonkowy głowy i rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC), podobnie jak inne typy nowotworów, wykazuje zróżnicowaną wrażliwość na TRAIL. wrażliwość na TRAIL. MLN4924 jest nowo opracowanym małym inhibitorem drobnocząsteczkowy inhibitor enzymu aktywującego NEDD8 o silnym działaniu przeciwnowotworowym. Badanie to ujawnia nową funkcję MLN4924 w synergizmie z TRAIL w celu indukując apoptozę w komórkach HNSCC. Sam MLN4924 skutecznie hamował wzrost komórek komórek HNSCC i indukował apoptozę. W połączeniu z TRAIL, synergistyczne wpływ na zmniejszenie przeżywalności i indukowanie apoptozy komórek HNSCC wystąpił. MLN4924 obniżał poziom c-FLIP bez modulowania ekspresji receptora śmierci 4 i ekspresji receptora śmierci 5. Wymuszona ekspresja c-FLIP w znacznym stopniu osłabiała apoptozę indukowaną przez MLN4924/TRAIL. Tak więc redukcja c-FLIP odgrywa ważną rolę w pośredniczeniu w apoptozie indukowanej MLN4924/TRAIL. Ponadto MLN4924 zmniejszało stabilność c-FLIP, zwiększało ubikwitynację c-FLIP i ułatwiało degradację c-FLIP. c-FLIP, co sugeruje, że MLN4924 zmniejsza poziom c-FLIP poprzez poprzez promowanie jego degradacji. MLN4924 aktywował sygnalizację c-jun-NH(2)-kinazy (JNK), o czym świadczy zwiększony poziom fosfo-c-Jun w komórkach traktowanych MLN4924. Chemiczne hamowanie aktywacji JNK nie tylko zapobiegło indukowanej przez MLN4924 redukcji c-FLIP ale także hamowało apoptozę indukowaną przez MLN4924/TRAIL, sugerując, że aktywacja JNK pośredniczy w redukcji c-FLIP i późniejszym wzmocnieniu apoptozy indukowanej przez TRAIL przez MLN4924. Ponieważ knockdown NEDD8 nie powiódł się aktywować sygnalizacji JNK i obniżyć c-FLIP, jest prawdopodobne, że MLN4924 zmniejsza poziom c-FLIP i nasila apoptozę indukowaną TRAIL niezależnie od hamowania NEDD8 hamowanie. --- MLN4924 to pierwszy w swojej klasie lek przeciwnowotworowy, który hamuje enzym aktywujący Nedd8 (NAE). enzym (NAE). W niniejszym raporcie donosimy, że MLN4924 hamuje indukowaną przez Vpx/Vpr degradację SAMHD1 degradację poprzez hamowanie neddylacji ligazy ubikwityny E3 i blokuje wirusa niedoboru odporności makaków (SIVmac) w komórkach szpikowych. SAMHD1 jest wymagany do hamowania SIVmac za pośrednictwem MLN4924. Nasze odkrycia wskazują na potencjalną skuteczność hamowania neddylacji jako strategii antyretrowirusowej i identyfikują łatwo dostępny lek przeciwnowotworowy MLN4924 jako kandydata do tego celu. do tego celu. --- Szpiczak mnogi (MM) wykazuje ekspresję genów związaną z aktywnością NFκB. a około 20% pierwotnych próbek MM zawiera zmiany genetyczne sprzyjające wewnętrznej aktywacji sygnalizacji NFκB. Znaczenie blokowania klasycznego w porównaniu z alternatywnym szlakiem sygnałowym NFκB i molekularnymi molekularne mechanizmy wykonawcze są jednak nadal słabo poznane. Tutaj porównawczo testowaliśmy zniesienie aktywności NFκB poprzez TPCA-1 (inhibitor IKK2 inhibitor IKK2), BAY 11-7082 (inhibitor IKK słabo selektywny dla IKK1 i IKK2), i MLN4924 (inhibitor enzymu aktywującego NEDD8 (NAE)) i przeanalizował ich aktywność anty-MM. Podczas gdy TPCA-1 selektywnie zakłócał aktywację klasycznej ścieżki klasyczny szlak NFκB, pozostałe dwa związki hamowały klasyczny i alternatywną sygnalizację NFκB bez znaczącej dyskryminacji. Warto zauważyć, podczas gdy TPCA-1 i MLN4924 wywoływały raczej łagodne efekty anty-MM z niewielką do umiarkowaną indukcją śmierci komórek po 1 dniu BAY 11-7082 był jednolicie wysoce toksyczny dla linii komórkowych MM i pierwotnych komórek MM. Leczenie BAY 11-7082 indukowało szybki obrzęk komórek, a jego początkowe efekty były blokowane przez nekrostatynę-1 lub zmiatacz ROS BHA, ale trwały efekt ochronny nie został osiągnięty nawet przy dodatkowej blokadzie kaspaz. dodatkowa blokada kaspaz. Ponieważ MLN4924 hamuje alternatywny szlak NFκB szlak poniżej IKK1 na poziomie przetwarzania p100, dość niezgodne efekty między MLN4924 i BAY 11-7082 muszą zatem wynikać z blokady za pośrednictwem IKK1 NFκB-niezależne funkcje hamujące martwicę lub reprezentują efekt poza celem BAY 11-7082. Zgodnie z tym ostatnim, zaobserwowaliśmy zaobserwowaliśmy, że jednoczesne znokautowanie IKK1 i IKK2 nie miało żadnego poważnego krótkoterminowego negatywnego wpływu na żywotność komórek MM. --- Radioterapia jest stosowana w miejscowo zaawansowanych rakach trzustki, w których może ona poprawić przeżywalność w połączeniu z gemcytabiną. Jednak rokowanie jest nadal rokowania są jednak nadal złe, w związku z czym potrzebne są skuteczniejsze terapie. MLN4924 jest badaną małą cząsteczką znajdującą się obecnie w fazie I badań klinicznych. MLN4924 hamuje NAE (enzym aktywujący NEDD8), kluczowy regulator ligazy ubikwityny E3 ubikwityny E3 SCF (SKP1, Cullins i białko F-box), który został niedawno zaangażowany w w uszkodzenia i naprawę DNA. W tym badaniu dostarczamy dowodów na to, że MLN4924 może być stosowany jako skuteczny radiouczulacz w raku trzustki. W szczególności, MLN4924 (20-100 nmol / L) skutecznie hamował neddylację kullin i uwrażliwiał komórki raka trzustki na promieniowanie jonizujące in vitro z wrażliwością współczynnik wzmocnienia wynoszący około 1,5. Mechanistycznie, leczenie MLN4924 stymulowało akumulację kilku substratów SCF, w tym CDT1, WEE1 i NOXA, równolegle z nasileniem indukowanych promieniowaniem uszkodzeń DNA, aneuploidii, zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G(2)/M i apoptozy. Za pośrednictwem RNAi knockdown CDT1 i WEE1 częściowo zniósł aneuploidię indukowaną MLN4924, G(2)/M i radiosensybilizację, wskazując na efekt przyczynowy. Ponadto, MLN4924 był skutecznym radiosensybilizatorem w mysim modelu ksenoprzeszczepu ludzkiego raka trzustki. raka trzustki. Nasze odkrycia stanowią dowód słuszności koncepcji stosowania MLN4924 jako nowej klasy radiosensybilizatora w leczeniu raka trzustki. --- MLN4924 (1), który jest w badaniach klinicznych jako środek przeciwnowotworowy, został stereoselektywnie syntetyzowany z d-rybozy drogą obejmującą stereoselektywną redukcję, regioselektywne rozszczepienie ugrupowania izopropylidenowego, i selektywne przemieszczenie cyklicznej grupy siarczanowej jako kluczowych etapów.
Który enzym hamuje MLN4924?
MLN4924 jest badanym małocząsteczkowym inhibitorem enzymu aktywującego NEDD8 (NAE).