Obecne wirusowe wektory dostarczania genów do terapii genowej są nieefektywne z powodu krótkotrwałej ekspresji transgenu przypisywanej motywom cytozyna-fosforan-guanina (CpG) w transgenie. Tutaj oceniliśmy wpływ redukcji motywu CpG w kontekście dostarczania genów lentiwirusowych (LV) na poziom i czas trwania ekspresji genu reporterowego u chomików chińskich. ekspresji genu reporterowego w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO), ludzkich Immortalizowane komórki białaczki szpikowej (K562) i hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC). Komórki transdukowano LV niosącym zieloną fluorescencję Zero-CpG (ZGFP), LV/CMV/ZGFP. Ekspresja GFP została porównana do jego odpowiednikiem LV (LV/CMV/GFP) z genem reporterowym GFP pozbawionym CpG. Gen LV/CMV/ZGFP wykazywał przedłużoną ekspresję transgenu w komórkach CHO i HSC do 10 dni i 14 dni w odpowiednich komórkach. Efekt ten nie był widoczny w transdukowanych komórkach K562, co może wynikać z hipometylacji DNA tej linii komórek nowotworowych. linii komórek nowotworowych. Analiza liczby kopii transgenów potwierdziła, że ekspresja GFP nie wynikała z pseudotransdukcji, a transgen pozostawał w genomie komórek przez cały okres transdukcji. genomie komórek przez cały okres badania. Umiarkowane pozytywne efekty LV/CMV/ZGFP sugerują, że redukcja CpG w konstrukcie LV nie była znacząca, aby wygenerować wyższą i dłuższą ekspresję transgenu. ekspresji transgenu. --- TŁO: Terapia genowa podwójnego samobójstwa jest obiecującą strategią leczenia zaawansowanego raka. Stała się ona ważną linią badawczą w rozwoju terapii genowej w celu przezwyciężenia wad terapii jednogenowej. CEL: Celem niniejszego badania było zbadanie przydatności terapii genowej z dwoma genami samobójczymi, gef i apoptyną, w raku jelita grubego. raka okrężnicy. METODY: Geny gef i apoptyny zostały sklonowane do regulowanego doksycykliną system ekspresji genów za pośrednictwem retrowirusa. Ekspresja obu genów w linii komórkowej DLD-1 została potwierdzona przez reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR). Żywotność komórek określono za pomocą kolorymetrycznego testu sulforhodaminy B. a cykl komórkowy badano za pomocą barwienia jodkiem propidyny (PI). Aneksyna V-FITC i PI zostały wykorzystane do oceny apoptozy, a wyniki zostały potwierdzone przez mikroskopię elektronową. Potencjał błony mitochondrialnej był mierzony za pomocą testu JC-1. WYNIKI: Nasze wyniki wykazały, że połączona ekspresja genów gef i apoptin była uderzająco bardziej skuteczna niż ekspresja każdego z genów osobno. Koekspresja gef i apoptyny synergistycznie zwiększała spadek żywotności komórek, zwiększając nekrozę i martwicę. żywotności komórek, zwiększając martwicę i indukując apoptozę w komórkach raka okrężnicy poprzez szlak mitochondrialny, który może być wadliwy w zaawansowanym lub przerzutowym raku jelita grubego. raka okrężnicy. WNIOSKI: Podwójnie samobójcza terapia genowa oparta na genach gef i apoptyny może być kandydatem do opracowania nowych strategii leczenia raka jelita grubego, a dalsze badania badania są uzasadnione w celu ustalenia przydatności terapii genowej podwójnego samobójstwa in vivo. --- Zbadano teoretyczną możliwość zastosowania metod transferu genów do ludzkiej linii badana jest linia zarodkowa. Transgeniczne metody genetycznej manipulacji zarodkami mogą być zasadniczo stosowane u ludzi. W szczególności, mikroiniekcja retrowirusowego wydaje się być najbardziej obiecująca, a transgeniczne naczelne już uzyskane dzięki temu podejściu. Transfer genów za pośrednictwem plemników oferuje potencjalnie najłatwiejszą drogę do ludzkiej linii zarodkowej, jednak wymagana metodologia jest obecnie metodologia jest obecnie słabo rozwinięta. Transfer jądrowy (klonowanie) oferuje alternatywne podejście do modyfikacji genetycznej linii zarodkowej, jednak istnieją poważne istnieją jednak poważne obawy zdrowotne związane z obecnymi metodami transferu jądrowego. Stwierdzono, że że ludzka terapia genowa linii zarodkowej pozostaje dla wszystkich praktycznych celów możliwość, która musi czekać na znaczący i ważny postęp w technologii transferu genów. technologii transferu genów. --- Chociaż dziedzina ta rozwijała się w zastraszającym tempie, terapie genowe zostały z powodzeniem z powodzeniem u pacjentów z zaburzeniami szpiku kostnego, w tym z niedoborami odporności. niedoborami odporności. Dziedzina ta może być gotowa do szybszego postępu, ale wiele barier musi jeszcze barier musi jeszcze zostać pokonanych. --- Mukopolisacharydoza VII (MPS VII) jest spowodowana upośledzoną aktywnością enzymu lizosomalnego β-glukuronidazy (GUSB). enzymu lizosomalnego β-glukuronidazy (GUSB) i powoduje gromadzenie się glikozaminoglikanów (GAG). W niniejszym badaniu określono długoterminowy wpływ dożylnego wektora retrowirusowego gamma (RV) na chorobę zastawek serca u psów z MPS VII. serca u psów z MPS VII. Transdukowane hepatocyty wydzielały GUSB do krwi GUSB do krwi przez okres do 11 lat na poziomie podobnym lub wyższym niż osiągany z enzymatyczną terapią zastępczą (ERT). Niedomykalność i pogrubienie zastawek były od 0 (normalne) do +4 (poważnie nieprawidłowe). Po 1 roku nieleczone psy z MPS VII psy miały niedomykalność mitralną, pogrubienie zastawki mitralnej, niedomykalność aortalną, i pogrubienie zastawki aortalnej wynosiły odpowiednio 2,3 ± 0,7, 2,3 ± 0,6, 1,8 ± 0,5 i 1,6 ± 0,7, które były odpowiednio wyższe niż wartości 0,6 ± 0,1, 0,1 ± 0,4, 0,3 ± 0,8 i 0,1 ± 0,4, odpowiednio, u leczonych psów z MPS VII. Psy leczone MPS VII psy utrzymywały niskie wyniki niedomykalności aorty i pogrubienia zastawki aortalnej w swoim życiu. i pogrubienie zastawki aortalnej. Chociaż niedomykalność mitralna i pogrubienie zastawki mitralnej wzrosły do 2,0 w wieku ≥ 8 lat u leczonych psów z MPS VII, starsze normalne psy z kolonii psy z kolonii miały podobne wyniki, co utrudniało ocenę choroby zastawki mitralnej. zastawki mitralnej. Starsze leczone psy miały zwapnienia w obrębie pierścienia zastawki mitralnej i aortalnej. i pierścienia zastawki aortalnej, podczas gdy barwienie GUSB wykazało aktywność enzymatyczną w obrębie zastawki mitralnej. zastawki mitralnej. Wnioskujemy, że noworodkowa terapia genowa z udziałem RV zmniejszyła choroby zastawek serca u psów z MPS VII przez okres do 11 lat i proponujemy, aby noworodkowa inicjacja ERT powinna mieć podobny efekt. --- Różne typy komórek śródbłonka (EC) spełniają różne zadania w zależności od ich mikrośrodowiska. ich mikrośrodowiska. EC są zatem trudne do genetycznej manipulacji ex vivo do badań funkcjonalnych lub terapii genowej. Oceniliśmy wektory lentiwirusowe (LV) ukierunkowane na marker powierzchniowy EC CD105 do dostarczania genów in vivo. Wektor mysi wektor specyficzny dla CD105, mCD105-LV, transdukował tylko komórki CD105-dodatnie w hodowlach pierwotnych komórek wątroby. pierwotnych hodowlach komórek wątroby. Po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym, silną ekspresję genu reporterowego ekspresję wykryto w wątrobie, gdzie mCD105-LV specyficznie transdukował sinusoidalne ECs (LSECs), ale nie komórki Kupffera, które były głównie transdukowane przez nieukierunkowane LV. ECs guza były specyficznie ukierunkowane po wewnątrznowotworowym wstrzyknięciu wektora do guza. Dostarczenie genu erytropoetyny za pomocą mCD105-LV spowodowało znacznie zwiększony poziom erytropoetyny i hematokrytu. Ludzki CD105 (huCD105-LV) transdukował wyłącznie ludzkie LSEC u myszy przeszczepionych z ludzkimi ECs wątroby. Co ciekawe, przy zastosowaniu wyższej dawki i przy braku komórek docelowych w wątrobie, huCD105-LV transdukował ECs z ludzkiej tętnicy przeszczepionej do aorty zstępującej myszy. Dane te pokazują po raz pierwszy ukierunkowane dostarczanie genów do wyspecjalizowanych EC po ogólnoustrojowym podaniu wektora. podaniu wektora. Strategia ta oferuje nowe możliwości lepszego zrozumienia fizjologicznych funkcji ECs i leczenia chorób genetycznych, takich jak te wpływających na czynniki krwi. --- Ostatnie 15 lat otworzyło nowe drogi dla badań nad retrowirusami i retroelementami. Nic dziwnego, że wynikały one z istotnej wiedzy zgromadzonej w przeszłości, która pozostaje podstawą teraźniejszości i dlatego należy o niej pamiętać. Należy jednak przypomnieć krótki suplement nowych przełomowych odkryć i pomysłów. przełomowych odkryć i idei. Korzystając z wybranych przykładów najnowszych prac, starałem się rozszerzyć i uzupełnić mój oryginalny artykuł i uzupełnić mój oryginalny artykuł opublikowany w Folia Biologica (1996).
Czy retrowirusy są wykorzystywane do terapii genowej?
Terapia genowa jest jedną z najbardziej obiecujących i aktywnych dziedzin badań terapeutycznych. Terapia genowa jest opcją leczenia, która wprowadza materiał genetyczny in vivo lub ex vivo do komórek chorego organizmu w celu: wymiany wadliwego genu; manipulowania genem związanym z chorobą; lub wprowadzenia dodatkowej kopii genu w celu nadekspresji kodowanego białka w celu wygenerowania leczniczego efektu biologicznego. Somatyczna terapia genowa to transfer genów za pomocą określonego wektora do komórki somatycznej; w przeciwieństwie do terapii genowej linii zarodkowej, modyfikacja komórki jest ograniczona do biorcy i nie może być przekazywana jego potomstwu. Wysoka wydajność transferu genów, wysoka specyficzność dla komórek docelowych, długotrwała ekspresja transgenu i bezpieczeństwo bez niepożądanych reakcji są pożądanymi cechami idealnego wektora do transferu genów.
Wektory retrowirusowe (gretrowirusowe i lentiwirusowe) zostały już wykorzystane w ponad 350 badaniach nad terapią genową. Wektory retrowirusowe są szczególnie odpowiednie do korekcji genów w komórkach ze względu na długotrwałą i stabilną ekspresję przeniesionego transgenu, a także dlatego, że do ich klonowania i produkcji wymagany jest niewielki wysiłek. Kilka dziedzicznych chorób monogenowych, głównie niedoborów odporności, można obecnie z powodzeniem leczyć.