TŁO: Modyfikacje histonów i metylacja DNA są dwoma głównymi czynnikami w zjawisku epigenetycznym. zjawisku epigenetycznym. W przeciwieństwie do inhibitorów deacetylazy histonowej, które są które wywierają działanie radiosensybilizujące, do tej pory przeprowadzono tylko kilka badań dotychczas dotyczących roli inhibitorów metylotransferazy DNA (DNMT) jako radiosensybilizatory. Głównym celem tego badania była ocena wpływu inhibitorów DNMT na promieniowrażliwość ludzkich linii komórkowych raka, oraz wyjaśnienie mechanizmów związanych z tym procesem. METODY: Komórki A549 (rak płuc) i U373MG (glejak wielopostaciowy) poddano działaniu promieniowania promieniowanie z lub bez sześciu inhibitorów DNMT (5-azacytydyna, 5-aza-2'-deoksycytydyna, zebularyna, hydralazyna, galusan epigallokatechiny i psammaplinę A) przez 18 godzin przed napromieniowaniem, po czym przeżywalność komórek była oceniano za pomocą testów klonogennych. Cykl komórkowy i apoptozę analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. cytometrii przepływowej. Ekspresję DNMT1, 3A/3B i rozszczepionej kaspazy-3 wykryto poprzez Western blotting. Ekspresję γH2AX, markera indukowanego promieniowaniem pęknięcia podwójnej nici DNA dwuniciowego DNA, zbadano za pomocą immunocytochemii. WYNIKI: Wstępne leczenie psammapliną A, 5-aza-2'-deoksycytydyną i zebularyną radiosensybilizowało zarówno komórki A549, jak i U373MG. Wstępne leczenie psammapliną A zwiększyło frakcję sub-G1 komórek A549 w porównaniu z komórkami narażonymi na samym promieniowaniem. Wydłużenie ekspresji γH2AX zaobserwowano w komórkach leczonych inhibitorami DNMT przed napromieniowaniem w porównaniu z komórkami leczonymi samym promieniowaniem. WNIOSKI: Psammaplina A, 5-aza-2'-deoksycytydyna i zebularyna indukują promieniowrażliwość zarówno w liniach komórkowych A549, jak i U373MG, i sugerują, że ten efekt może być związany z hamowaniem naprawy DNA. --- Dynamiczne metylacje i demetylacje histonowych reszt lizyny są ważne dla regulacji genów. dla regulacji genów i są ułatwiane przez metylotransferazy histonów i demetylazy histonów (HDM). KDM5B/Jarid1B/PLU1 jest demetylazą lizyny specyficzną dla H3K4me3/me2. demetylazą lizyny należącą do rodziny demetylaz histonowych zawierających domenę JmjC (JHDM). demetylaz histonowych (JHDM). Kilka badań powiązało KDM5B z rakiem piersi, prostaty i skóry. rakiem skóry, podkreślając jego potencjał jako celu dla leków. Jednak większość badań nad inhibitorami koncentrowała się na innych JHDM, a inhibitory dla KDM5B pozostają do zbadania. Tutaj opisujemy ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę charakterystykę katalitycznego rdzenia rekombinowanego KDM5B (ccKDM5B, reszty 1-769). Pokazujemy, że ccKDM5B, rekombinowany w komórkach owadzich, demetyluje H3K4me3 i H3K4me2 in vitro. Charakterystyka kinetyczna wykazała że ccKDM5B ma pozorną stałą Michaelisa (K(m) (app) ) o wartości 0,5 μm dla jego trimetylowanego substratu H3(1-15)K4me3, znacznie zwiększone pozorne powinowactwo do substratu niż podano dla trimetylowanego substratu H3(1-15)K4me3. powinowactwo do substratu niż w przypadku pokrewnych HDM. Pomimo obecności domeny PHD na aktywność katalityczną nie miała wpływu dodatkowa metylacja w pozycji H3K9, co sugeruje, że w warunkach in vitro chromatyna krzyżuje się między H3K4 i H3K9 nie występuje w przypadku ccKDM5B. Badania inhibicji ccKDM5B wykazały zarówno in hamowanie ccKDM5B zarówno in vitro, jak i w komórkach przez kwas 2,4-pirydynokarboksylowy (2,4-PDCA) z siłą podobną do tej opisanej dla HDM KDM4C. Ukierunkowane strukturalnie dopasowanie sekwencji wykazało, że sposób wiązania 2,4-PDCA jest zachowany pomiędzy KDM4A/C i KDM5B. --- Metylotransferaza histonu H3-lizyny79 (H3K79) DOT1L odgrywa kluczową rolę w normalnym różnicowaniu komórek, jak również w inicjacji ostrej białaczki. normalnym różnicowaniu komórek, jak również inicjacji ostrej białaczki. Wykorzystaliśmy projektowanie oparte na strukturze i mechanizmie, aby odkryć kilka silnych inhibitorów DOT1L z wartościami IC(50) tak niskimi jak 38 nM. Inhibitory te wykazują jedynie słabą lub brak aktywności wobec czterech innych reprezentatywnych histonów lizyny i argininy metylotransferaz histonowych, G9a, SUV39H1, PRMT1 i CARM1. kompleksu DOT1L-inhibitor ujawnia, że grupa N6-metylowa inhibitora, zlokalizowana korzystnie w głównie hydrofobowej wnęce DOT1L, zapewnia obserwowaną wysoką selektywność. obserwowaną wysoką selektywność. Analiza strukturalna pokazuje, że zakłóci ona co najmniej co najmniej jedno wiązanie H i/lub odpychanie steryczne dla innych metylotransferaz histonowych. metylotransferaz histonowych. Związki te stanowią nowe sondy chemiczne do badań funkcji biologicznej DOT1L w zdrowiu i chorobie. --- Wirus Epsteina-Barr (EBV) w przeważającej mierze ustanawia utajone zakażenie w komórkach B a reaktywacja wirusa z latencji zależy od ekspresji wirusowego białka BZLF1. ekspresji wirusowego białka BZLF1. Promotor BZLF1 (Zp) normalnie wykazuje jedynie tylko niską aktywność podstawową, ale jest aktywowany w odpowiedzi na chemiczne lub biologiczne induktory, takie jak 12-O-tetradekanoiloforbol-13-octan (TPA), jonofory wapnia lub histony jonofory lub inhibitory deacetylazy histonowej (HDAC). W niektórych liniach komórkowych latentnie zakażonych EBV, sam inhibitor HDAC może indukować transkrypcję BZLF1 transkrypcję, podczas gdy leczenie nie zwiększa ekspresji w innych liniach komórkowych, takich jak liniach komórkowych, takich jak B95-8 lub komórki Raji, co sugeruje nieznane mechanizmy supresyjne oprócz deacetylacji histonów w tych komórkach. Tutaj znaleźliśmy epigenetyczną modyfikację modyfikację promotora BZLF1 w utajonych komórkach Raji przez trimetylację lizyny histonu H3 27 (H3K27me3), H3K9me2/me3 i H4K20me3. Poziomy aktywnych markerów takich jak acetylacja histonów i H3K4me3 były niskie w utajonych komórkach, ale wzrosły po reaktywacji. Leczenie 3-deazaneplanocyną A (DZNep), inhibitorem H3K27me3 i H4K20me3, znacząco zwiększyło transkrypcję BZLF1 w komórkach Raji w połączeniu z inhibitorem HDAC, trichostatyną A (TSA). The knockdown Ezh2 lub Suv420h1, metylotransferaz histonowych dla H3K27me3 lub H4K20me3, dodatkowo udowodniło supresję Zp przez metylacje. metylacje. Podsumowując, wyniki wskazują, że metylacja H3K27 i H4K20 są zaangażowane, przynajmniej częściowo, w utrzymanie latencji, a acetylacja histonów i metylacja H3K4 korelują z reaktywacją wirusa w komórkach Raji. wirusa w komórkach Raji. --- Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) jest katalityczną podjednostką kompleksu polycomb-repressive complex 2 (PRC2), który epigenetycznie wycisza geny. kompleksu polikombinowo-represyjnego 2 (PRC2), który epigenetycznie wycisza transkrypcję genów poprzez trimetylację lizyny histonu H3 (H3K27me3). poprzez trimetylację lizyny histonu H3 (H3K27me3). EZH2 jest w utrzymaniu komórek macierzystych i ulega nadekspresji w nowotworach hematologicznych i nowotworach złośliwych, w tym w glejaku złośliwym. Uważa się, że EZH2 promuje progresję nowotworu progresję poprzez wyciszanie genów supresorowych nowotworów. Stąd farmakologiczne PRC2 jest atrakcyjną strategią terapeutyczną w leczeniu raka. leczenie. Tutaj pokazujemy, że EZH2 ulega ekspresji w ludzkim glejaku i koreluje ze złośliwością. Wyciszenie EZH2 zmniejszyło proliferację i inwazyjność komórek glejaka. inwazyjność. Chociaż nie zaobserwowaliśmy indukcji genów supresorowych związanych z cyklem komórkowym genów supresorowych przez wyciszenie lub farmakologiczne zahamowanie EZH2, analizy mikromacierzy wykazały silną transkrypcyjną redukcję kinazy receptora AXL kinazy AXL. Ani histon, ani metylacja DNA nie wydawały się być zaangażowane w pozytywną regulację AXL przez EZH2. pozytywnej regulacji AXL przez EZH2. Wyciszenie AXL naśladowało antyinwazyjne działanie efekty nokautu EZH2. Wreszcie, ekspresja AXL występuje w ludzkich glejakach z wysoką ekspresją EZH2. Łącznie dane te sugerują, że EZH2 napędza inwazyjność glejaka poprzez transkrypcyjną kontrolę AXL niezależną od histonów lub metylacji DNA. metylacji DNA. --- TŁO: Ujemny pod względem receptora estrogenowego α (ERα) rak piersi jest klinicznie agresywny i zwykle nie reaguje na konwencjonalne terapie estrogenowe terapie ukierunkowane na estrogen. Izoflawon sojowy, genisteina (GE), został wykazano, że zapobiega i hamuje raka piersi, a ostatnie badania sugerują, że że GE może zwiększać zdolność przeciwnowotworową antagonisty estrogenu, tamoksyfenu (TAM), szczególnie w komórkach raka piersi ERα-dodatnich. Jednak rola GE w ERα-ujemnym raku piersi pozostaje nieznana. METODY: Oceniliśmy epigenetyczny wpływ GE in vitro i in vivo na reaktywację ERα za pomocą testu MTT, odwrotnej transkrypcji-polimerazy w czasie rzeczywistym reakcja łańcuchowa (RT-PCR) w czasie rzeczywistym, test western-blot, immunoprecypitacja (ChIP) test, immunohistochemia i analiza epigenetycznej aktywności enzymatycznej. Przedkliniczne modele mysie, w tym ksenograft i spontaniczny mysi rak piersi zostały wykorzystane do przetestowania skuteczności GE in vivo. WYNIKI: Stwierdziliśmy, że GE może reaktywować ekspresję ERα, a efekt ten był synergistycznie wzmocniony w połączeniu z deacetylazą histonów (HDAC) inhibitorem, trichostatyną A (TSA), w ERα-ujemnych komórkach raka piersi MDA-MB-231. Leczenie GE również ponownie uwrażliwiło odpowiedzi komórkowe zależne od ERα na aktywator 17β-estradiol (E2) i antagonistę TAM. Dalsze badania wykazały, że GE może prowadzić do przebudowy struktury chromatyny w promotorze ERα, tym samym przyczyniając się do reaktywacji ERα. Konsekwentnie, dieta GE znacząco zapobiegała rozwojowi raka i zmniejszała wzrost mysich guzów piersi ERα-ujemnych. myszy. Dieta GE dodatkowo zwiększyła skuteczność przeciwnowotworową indukowaną przez TAM ze względu na przynajmniej częściowo epigenetycznej reaktywacji ERα. WNIOSKI: Nasze badania sugerują, że genisteina sojowa może epigenetycznie przywrócić ekspresję ERα, co z kolei zwiększa zależną od TAM antyestrogenową wrażliwość terapeutyczną in vitro i in vivo. Wyniki naszych badań ujawniają nowatorskie podejście terapeutyczne wykorzystujące bioaktywny produkt sojowy i terapię antyhormonalną w opornym na leczenie ERα-ujemnym raku piersi, która zapewni bardziej skuteczne opcje w terapii raka piersi. --- W niniejszym badaniu opisano farmakokinetykę i dystrybucję tkankową nowego inhibitora deacetylazy histonowej i metylotransferazy DNA deacetylazy histonów i inhibitora metylotransferazy DNA, psammapliny A (PsA), u myszy. myszy. Stężenia PsA określono za pomocą zwalidowanej metody LC-MS/MS (LLOQ 2 ng/ml). Po dożylnym wstrzyknięciu w dawce 10 mg/kg u myszy, PsA był szybko eliminowany, ze średnim okresem półtrwania (t(1/2, λn)) wynoszącym 9,9 ± 1,4 min, a klirens ogólnoustrojowy (CL(s)) wynosił 925,1 ± 570,1 ml/min. Stabilność in vitro stabilność PsA in vitro określono w różnych homogenatach tkankowych. Średni t(1/2) PsA we krwi, wątrobie, nerkach i płucach był stosunkowo krótki (≤ 12,8 min). stosunkowo krótki (≤ 12,8 min). Jeśli chodzi o charakterystykę dystrybucji w tkankach in vivo, Stwierdzono, że PsA jest wysoce dystrybuowany do tkanek płuc, z płucami do surowicy (K(p)) w zakresie od 49,9 do 60,2. Natomiast stężenia PsA w innych tkankach były porównywalne lub niższe niż stężenia w surowicy. stężenia w surowicy. Wysoka i specyficzna charakterystyka ukierunkowana na płuca wskazuje, że że PsA ma potencjał do opracowania jako środek do leczenia raka płuc. --- Aerobowa reakcja sprzęgania, w której pośredniczy miedź, umożliwia bezpośrednie amidowanie heterocykli lub związków aromatycznych posiadających słabo kwaśne wiązania C-H z różnymi nukleofilami azotowymi. Reakcje te zapewniają wydajny dostęp do wielu biologicznie ważnych szkieletów, w tym takich, które mogą służyć jako inhibitorów HMT. --- Antygeny nowotworowe jąder (CTA), takie jak NY-ESO-1, MAGE-A1 i MAGE-A3, są immunogennymi białkami kodowanymi przez geny, które normalnie ulegają ekspresji tylko u mężczyzn. immunogenne białka kodowane przez geny, które normalnie ulegają ekspresji tylko w męskich komórkach zarodkowych, ale są aktywowane przez źle zdefiniowane mechanizmy epigenetyczne w ludzkich nowotworach, w tym raku płuc. Wcześniej zgłaszaliśmy indukcję tych CTAs w komórkach nowotworowych, ale nie w normalnych komórkach, przez czynniki demetylujące DNA i inhibitory deacetylazy histonów inhibitory deacetylazy histonowej przy użyciu klinicznie osiągalnych warunków ekspozycji. W W niniejszym badaniu oceniliśmy zmiany chromatyny związane z represją/aktywacją genów nowotworowych w komórkach raka płuc w celu dalszego opracować schematy indukcji genów dla immunoterapii nowotworów. Represja genów NY-ESO-1, MAGE-A1 i MAGE-A3 zbiegła się z hipermetylacją DNA, rekrutacją, i wiązaniem białek z grupy polycomb oraz modyfikacjami heterochromatyny histonowej modyfikacjami w obrębie promotorów tych genów. Derepresja zbiegła się z demetylacją DNA, dysocjacją białek polycomb i obecnością euchromatyny w obrębie odpowiednich promotorów. Krótkie RNA ze spinką do włosów zostały użyte do zahamowania kilku metylotransferaz histonowych (KMT) i demetylaz histonowych (KDM), które pośredniczą w metylacji histonów i hamują ekspresję genów. Zablokowanie KMT6, KDM1 lub KDM5B znacznie zwiększyło pośredniczoną przez dezoksyazacytydynę (DAC) aktywację tych genów nowotworowych w komórkach raka płuc. DZNep, farmakologiczny inhibitor farmakologiczny inhibitor ekspresji KMT6, odtworzył efekty KMT6 knockdown. Po ekspozycji na DAC-DZNep, komórki raka płuc były specyficznie rozpoznawane i lizowane przez allogeniczne limfocyty wyrażające rekombinowane receptory komórek T rozpoznające NY-ESO-1 i MAGE-A3. Połączenie czynników demetylujących DNA ze związkami, takimi jak DZNep, które modulują metylację lizyny histonów, może zapewnić nową strategię epigenetyczną w celu zwiększenia ekspresji genów nowotworowych jako jako uzupełnienie adoptywnej immunoterapii przeciwnowotworowej. --- Komórki satelitarne funkcjonują jako komórki macierzyste mięśni szkieletowych, wspierając postnatalny wzrost wzrost i regenerację mięśni po urazie lub chorobie. Istnieje wielka obietnica poprawy wydajności mięśni u zwierząt gospodarskich i terapii patologii mięśni u ludzi. terapii patologii mięśni u ludzi poprzez celowanie w miostatynę (MSTN) w tej populacji komórek. w tej populacji komórek. Dieta człowieka zawiera wiele inhibitorów deacetylazy histonowej (HDAC) inhibitorów deacetylazy histonowej (HDAC), takich jak bioaktywny składnik sulforafan (SFN), którego epigenetyczne wpływ na gen MSTN w komórkach satelitarnych jest nieznany. Dlatego też, naszym celem było zbadanie epigenetycznego wpływu SFN na gen MSTN w komórkach satelitarnych. komórkach satelitarnych. Niniejsza praca dostarcza pierwszych dowodów, które różnią się od trichostatyny A (TSA), że suplementacja SFN in vitro nie tylko działa jako inhibitor HDAC, ale także jako inhibitor metylotransferazy DNA (DNMT) w świńskich komórkach satelitarnych. W porównaniu z TSA i 5-aza-2'-deoksycytydyną (5-aza-dC), leczenie SFN znacząco hamuje ekspresję MSTN, czemu towarzyszy silnie osłabiona ekspresja inhibitorów ujemnego sprzężenia zwrotnego szlaku sygnałowego MSTN. miRNA ukierunkowane na MSTN nie są zaangażowane w posttranskrypcyjną regulację MSTN. posttranskrypcyjnej regulacji MSTN. Niemniej jednak, słabo wzbogacone białko determinacji mioblastów (MyoD) związane ze zmniejszoną acetylacją histonów w miejscu wiązania miejscu wiązania MyoD zlokalizowanym w regionie promotora MSTN może przyczyniać się do represji transkrypcyjnej MSTN przez SFN. Odkrycia te ujawniają nowy tryb epigenetycznej represji MSTN przez bioaktywny związek SFN. Ta nowa farmakologiczna, biologiczna aktywność SFN w komórkach satelitarnych może zatem umożliwić na opracowanie nowych podejść do osłabienia szlaku sygnałowego MSTN, zarówno w terapiach zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi, jak i w produkcji zwierzęcej. poprawy produkcji zwierzęcej. --- Czynniki epigenetyczne, takie jak metylacja histonów, kontrolują rozwój rozwój pasożytów malarii podczas złożonego cyklu życia w ludzkim żywicielu żywiciela. Zbadaliśmy metylotransferazy histonowe lizyny Plasmodium falciparum jako jako potencjalną klasę docelową dla rozwoju nowych leków przeciwmalarycznych. Zsyntetyzowaliśmy zsyntetyzowaliśmy bibliotekę związków opartą na znanym specyficznym inhibitorze (BIX-01294) ludzkiej metylotransferazy histonowej G9a. Dwa związki, BIX-01294 i jego pochodna pochodna TM2-115, hamowały pasożyty P. falciparum 3D7 w hodowli z wartościami IC(50) o wartości ~100 nM, wartości co najmniej 22-krotnie silniejsze niż ich pozorne IC(50) w stosunku do dwóch ludzkich linii komórkowych i jednej mysiej linii komórkowej. Związki te nieodwracalnie zatrzymały wzrost pasożytów na wszystkich etapach wewnątrzerytrocytarnego cyklu życia. Spadek żywotności pasożytów (>40%) zaobserwowano po 3-godzinnej inkubacji z 1 µM B inkubacji z 1 µM BIX-01294 i spowodowało całkowite zabicie pasożyta po 12-godzinnej inkubacji. Dodatkowo, myszy z opatentowanym zakażeniem Plasmodium berghei szczepem ANKA potraktowane pojedynczą dawką (40 mg/kg) TM2-115 miały 18-krotnie zmniejszoną parazytemię parazytemię następnego dnia. Co ważne, leczenie pasożytów P. falciparum w hodowli za pomocą BIX-01294 lub TM2-115 spowodowało znaczne zmniejszenie histonu H3K4me3 w sposób zależny od stężenia i czasu ekspozycji. sposób. Łącznie wyniki te sugerują, że BIX-01294 i TM2-115 hamują metylotransferazy histonowe pasożytów malarii, powodując szybką i nieodwracalną śmierć pasożytów. śmierć pasożyta. Nasze dane pozycjonują metylotransferazy lizyny histonowej jako wcześniej nierozpoznaną klasę docelową, a BIX-01294 jako obiecujący ołów związek, w obecnie niewykorzystanej drodze do odkrywania leków przeciwmalarycznych ukierunkowane na wiele etapów cyklu życia. --- Badania epidemiologiczne sugerują istotny związek między otyłością a rakiem tarczycy. rakiem tarczycy. Pochodzący z tkanki tłuszczowej polipeptyd leptyna działający poprzez receptor leptyny może modulować migrację komórek raka tarczycy. Wcześniej wykazaliśmy wykazaliśmy, że receptor leptyny ulega nadekspresji w raku brodawkowatym tarczycy i jest związany z agresywnością guza. Niniejsze badanie zostało podjęte w celu zbadać możliwe czynniki regulacyjne, które mogłyby wpływać na receptor leptyny w komórkach raka brodawkowatego tarczycy. Stwierdziliśmy, że inhibitor metylotransferazy DNA (5-Aza-2'-deoksycytydyna) i inhibitor deacetylazy histonów (trichostatyna A). (trichostatyna A) zmniejszały ekspresję receptora leptyny. I odwrotnie, insulina zwiększała ekspresję receptora leptyny w sposób zależny od czasu i dawki sposób. Czynnik naśladujący niedotlenienie (chlorek kobaltu) nie miał wpływu na ekspresję receptora leptyny. ekspresję receptora leptyny. Podsumowując, nasze badanie dostarcza dowodów na to, że epigenetyczne zdarzenia i stymulacja insuliną biorą udział w regulacji receptora leptyny w komórkach raka brodawkowatego tarczycy. --- TŁO: Inhibitory deacetylazy histonowej (HDAC) to grupa małych cząsteczek chemicznych hamujących deacetylazę histonową. które hamują deacetylazę histonową. Na poziomie komórkowym inhibitory HDAC mają wiele efektów biologicznych, takich jak zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptoza, różnicowanie komórek i auotofagia. różnicowanie komórek i auotofagia. Na poziomie molekularnym inhibitory HDAC powodują acetylację histonów i niehistonów oraz indukują ekspresję genów. Inhibitory HDAC są szeroko stosowane w terapii nowotworów ze względu na ich funkcję indukowania apoptozy. Jednak mechanizmy efektu apoptozy nie są w pełni poznane. TSA jest klasycznym inhibitorem HDAC i jest szeroko stosowany w badaniach epigenetycznych i przeciwnowotworowych. W tym badaniu wybraliśmy trichostatynę A (TSA) do zbadania mechanizmów działania apoptotycznego inhibitorów HDAC. Działanie apoptotyczne inhibitorów HDAC na komórki nowotworowe. METODY: Linie komórkowe raka szyjki macicy, takie jak Hela, Caski i normalna ludzka linia keratynocytów HaCa. linia keratynocytów HaCaT były traktowane różnymi stężeniami TSA. Kryształ i bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy (MTT). (MTT) w celu określenia liczby komórek. Rozszczepienie PARP i FITC-AnexinV w celu określenia apoptozy. DNA-metylotransferaza (DNMT)1, DNMT3A i DNMT3B określono za pomocą zwykłego PCR, qPCR i Western Blotting. Mały interferujący RNA (SiRNAi) został użyty do znokautowania DNMT3B. WYNIKI: Inhibitory HDAC indukują jedynie apoptozę komórek raka szyjki macicy. Przy 1 µmol/L TSA, 86% komórek Hela i 76% komórek Caski uległo apoptozie. W przypadku normalnych komórek inhibitory HDAC nie mają działania cytotoksycznego w dawce terapeutycznej, (90,0 ± 8,4) % normalnych komórek przeżyło po leczeniu 1 µmol/L TSA. Porównaliśmy grupę 1 µmol/L z nieleczoną grupą kontrolną za pomocą testu t. Nie było znaczenia między grupą 1 µmol/L a nieleczoną grupą kontrolną dla normalnych komórek (P > 0,05). Inhibitory HDAC zmniejszały DNMT3B w komórkach nowotworowych, ale nie w normalnych komórkach. Ręczne znokautowanie DNMT3B indukował apoptozę komórek Hela i Caski. Ponad 99% komórek Hela i Caski komórek uległo apoptozie po usunięciu DNMT3B. WNIOSKI: DNMT3B był niezbędny do przeżycia komórek raka szyjki macicy. Zmniejszona regulacja DNMT3B przez inhibitory HDAC może odgrywać ważną rolę w toksyczności inhibitorów HDAC na komórki raka szyjki macicy. --- Potranslacyjne modyfikacje histonów są jednymi z mechanizmów epigenetycznych, które modulują strukturę chromatyny i transkrypcję genów. Metylacja i demetylacja histonów demetylacja są dynamicznymi procesami kontrolowanymi odpowiednio przez metylotransferazy histonowe metylotransferazy histonów (HMT) i demetylazy (HDM). Kilka HMT i HDM zostało w nowotworach, stanach zapalnych i cukrzycy, co czyni je atrakcyjnymi cele dla terapii lekowej. Dlatego też odkrycie małocząsteczkowych modulatorów dla tych dwóch klas enzymów tych dwóch klas enzymów przyciągnęło znaczną uwagę przemysłu farmaceutycznego. przemysł farmaceutyczny. W niniejszym artykule autorzy opisują rozwój i optymalizację homogenicznych testów opartych na przeciwciałach LANCE Ultra i AlphaLISA do pomiaru aktywności katalitycznej dwóch enzymów epigenetycznych działających na lizynę 4 histonu H3: metylotransferazy SET7/9 i demetylazy LSD1. Zarówno testy SET7/9, jak i LSD1 zostały zaprojektowane jako testy zwiększania sygnału przy użyciu biotynylowanych peptydów pochodzących z N-końca histonu H3. Ponadto, test SET7/9 został zademonstrowany przy użyciu białka histonu H3 o pełnej długości jako substratu w formacie AlphaLISA. Zoptymalizowane testy w 384-dołkowych płytkach są solidne (współczynniki Z' ≥0,7) i czułe, wymagające jedynie nanomolarnych stężeń enzymu i substratu. Wszystkie testy pozwoliły na profilowanie znanych inhibitorów SET7/9 i LSD1. Wyniki pokazują że zoptymalizowane formaty testów LANCE Ultra i AlphaLISA zapewniają odpowiednie biochemiczne podejście przesiewowe w kierunku identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów HMT i HDM, które mogą prowadzić do nowych terapii epigenetycznych.
Jakie są inhibitory metylotransferaz histonowych?
Ogólnie rzecz biorąc, metylotransferazy histonowe (HMT) nie mają powszechnie zatwierdzonego formatu testów przesiewowych o wysokiej przepustowości, a zatem inhibitory referencyjne nie są dostępne dla wielu HMT. Istnieje jednak kilka selektywnych inhibitorów HMT: Trichostatyna A (TSA), BIX-01294 i jego pochodna TM2-115, kwas 2,4-pirydynokarboksylowy (2,4-PDCA), 3-deazaneplanocyna A (DZNep), Psammaplin A (PsA) i Sulforafan (SFN).