Białka cytoszkieletowe należące do rodziny spektryn mają wydłużoną strukturę złożoną z powtarzających się jednostek. Trójwymiarowa struktura roztworu 16. powtórzenia ze spektryny alfa mózgu kurczaka (R16) została określona za pomocą spektroskopii NMR i obliczeń symulowanego wyżarzania geometrii odległości. My wykorzystaliśmy łącznie 1035 ograniczeń odległości, w tym 719 wartości opartych na NOE uzyskanych przez zastosowanie niejednoznacznych ograniczeń dla iteracyjnego przypisania (ARIA) (ARIA). Ponadto przeprowadziliśmy bezpośrednie udoskonalenie względem przesunięć 1H-chemicznych. przesunięciami. Ostateczny zespół 20 struktur wykazuje średnią RMSD wynoszącą 1,52 A od średniej dla atomów szkieletu, z wyłączeniem pętli oraz końców N i C. R16 jest składa się z trzech antyrównoległych alfa-heliksów oddzielonych dwiema pętlami i fałduje się w lewoskrętną zwiniętą cewkę. Podstawową jednostką spektryny jest antyrównoległy heterodimer heterodimer składający się z dwóch homologicznych łańcuchów, beta i alfa. Łańcuchy te tworzą tetramer poprzez mechanizm, który opiera się na zakończeniu pojedynczego powtórzenia przez asocjację częściowych powtórzeń zlokalizowanych na końcu C łańcucha beta (dwie helisy) i na końcu N łańcucha alfa (jedna helisa). Ten tetramer jest zespołem zdolnym do sieciowania filamentów aktyny. Budowanie modelu przez homologii powtórzenia "tetrameryzacji" z ludzkiej spektryny erytrocytów wyjaśnia możliwą rolę mutacji punktowych, które powodują anemie hemolityczne. --- Spektryna, białko sieciujące aktynę, jest ważnym składnikiem cytoszkieletu błonowego. cytoszkieletu błonowego. Spektryna jest tetramerem dwóch antyrównoległych alfabeta-dimerów, które mają unikalną i starożytną strukturę genową. The alfa-spectrin i beta-spectrin składają się głównie z tandemowo powtarzających się 106-aminokwasowych segmentów, z których każdy tworzy potrójną alfa-helikalną zwiniętą cewkę. Zarówno geny, jak i same powtórzenia są homologiczne. Uważa się, że dwa geny są uważane za wynik zdarzenia duplikacji genu, a każdy gen jest produktem duplikacji 106-aminokwasowych powtórzeń. W tej pracy porównujemy proces ewolucji molekularnej w powtarzających się segmentach alfa- i beta-spektryny. Odkryliśmy, że segmenty alfa-spektryny, w większości ewoluowały w jednorodny sposób, podczas gdy znaczna heterogeniczność występuje wśród segmentów beta-spektryny. Kilka segmentów z o unikalnych znanych funkcjach ewoluowało inaczej niż pozostałe. Na Na podstawie heterogeniczności procesu ewolucyjnego sugerujemy, że co najmniej jedno powtórzenie ma unikalną funkcję, która nie została jeszcze udokumentowana. Przedstawiamy również nowe metody statystyczne do porównywania procesu ewolucji między różnymi regionami sekwencji DNA. regionami sekwencji DNA. --- Duży rozmiar spektryny, elastycznego białka promującego odwracalne deformację czerwonych krwinek, był przeszkodą w wyjaśnieniu molekularnego mechanizmu molekularnego mechanizmu jej działania. Badając sklonowane fragmenty domeny powtarzającej się jednostki domeny, znaleźliśmy zgodność między pozycjami wybranych powtórzeń spektryny w tetramerze. w tetramerze z ich stabilnością fałdowania. Sześć fragmentów składających się z dwóch powtórzeń spektryny zostało wybranych do badań głównie na podstawie na podstawie przewidywanych struktur drugorzędowych ich regionów łącznikowych. Fragmenty z rzekomo helikalnym łącznikiem były bardziej stabilne na mocznik i indukowane ciepłem niż te z rzekomo niehelikalnym łącznikiem. Dwa z mniej stabilnie fałdowane fragmenty, ludzkie erytroidalne powtórzenia alfa-spektryny 13 i 14 (HEalpha13,14) i ludzka erytroidalna beta-spektryna powtórzenia 8 i 9 (HEbeta8,9), znajdują się naprzeciwko siebie na antyrównoległych dimerach spektryny. Przynajmniej częściowe rozwinięcie tych powtórzeń w warunkach fizjologicznych wskazuje, że że mogą one służyć jako zawias. Również mniej stabilnie zwinięty fragment ludzkiej erytroidalnych powtórzeń alfa-spektryny 4 i 5 (HEalpha4,5) leży naprzeciwko miejsca interakcji między częściowymi powtórzeniami na C- i N-końcowych końcach odpowiednio beta- i alfa-spektryny, odpowiednio, na przeciwległym dimerze. Bardziej stabilnie sfałdowane fragmenty, ludzkie erytroidalne powtórzenia alfa-spektryny 1 i 2 (HEalpha1,2) i ludzkie erytroidalne powtórzenia alfa-spektryny 2 i 3 (HEalpha2,3), leżą prawie naprzeciwko siebie na antyrównoległych dimerach spektryny tetrameru. Te skupiska wzdłuż tetrameru spektryny powtórzeń o podobnej stabilności fałdowania może mieć znaczenie dla funkcji spektryny, w szczególności dla jej dobrze znanej elastyczności. --- Pytania o to, czy i kiedy struktury białkowe zmieniają się w komórkach, przenikają biologię i obejmują pytania o to, w jaki sposób cytoszkielet utrzymuje naprężenia na szczególnie w zmutowanych i normalnych komórkach. Etykietowanie strzelby cysteinowej z fluoroforami jest tutaj analizowane za pomocą spektrometrii masowej szkieletu błony spektryna-aktyna w ściętych duchach czerwonych krwinek od normalnych i chorych myszy. myszy. Ścięte próbki porównano z próbkami statycznymi w temperaturze 37 °C pod względem intensywności błony komórkowej we fluorescencji. intensywności błony komórkowej w mikroskopii fluorescencyjnej, fluorescencji oddzielonych białek, i modyfikacji peptydów tryptycznych w chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrii mas (LC-MS/MS). Etykietowanie spektryną okazuje się być najbardziej wrażliwe na ścinanie, podczas gdy partnerzy wiążący ankyrynę i aktynę wykazują progi ścinania w znakowania i zarówno białko błonowe wiążące ankyrynę pasmo 3, jak i stabilizator spektryna-aktyna stabilizator spektryna-aktyna 4.1R wykazują minimalne różnicowe znakowanie. Komórki od myszy 4.1R różnią się znacząco od normalnych w zależnym od ścinania znakowaniu spektryny, ankyryny i pasma 3: Zmniejszone znakowanie spektryny ujawnia mniejszy stres w zmutowanej sieci, ponieważ spektryna dysocjuje od aktyny. Mapowanie zależną od naprężeń kinetykę znakowania α- i β-spektryny za pomocą LC-MS/MS identyfikuje Cys w tych antyrównoległych łańcuchach, które są albo wzmocnione siłą, albo niezależne od siły w znakowaniu, z analizami strukturalnymi wskazującymi na miejsca o zwiększonej sile są sekwestrowane albo w potrójnie helikalnych domenach spektryny lub w interakcjach z aktyną lub ankyryną. Miejsca wrażliwe na ścinanie zidentyfikowane zarówno w spektrynie, jak i ankyrynie, wydają się być spójne ze stresem poprzez wymuszone rozwijanie, po którym następuje zaburzenie cytoszkieletu. --- Antyrównoległe połączenie bok do boku monomerów spektryny alfa i beta jest dwuetapowy proces, który zachodzi w ciągu kilku sekund nawet w temperaturze 0 stopni C i przy niskich stężeniach. stężeniach. Montaż obejmuje początkowy kontakt komplementarnych miejsc zarodkowania na każdej podjednostce, które znajdują się w pobliżu końca wiążącego aktynę długiego, elastycznego pręta heterodimeru, elastycznego pręta heterodimeru. Minimalne miejsca nukleacji składają się z około czterech sąsiadujących ze sobą homologicznych segmentów lub powtórzeń o długości 106 reszt. Trzy powtórzenia w miejscu nukleacji zawierają wstawkę o długości 8 reszt i mają największą homologię do czterech powtórzeń podobnych do spektryny w alfa-aktyninie. Domena domena wiążąca aktynę na podjednostce beta i sąsiednie motywy EF na podjednostce alfa. na podjednostce alfa nie są wymagane do złożenia heterodimeru. Miejsca miejsca nukleacji prawdopodobnie mają specyficzną strukturę zamka i klucza, która definiuje unikalne parowanie wielu homologicznych segmentów w obu podjednostkach. podjednostkach. Montaż heterodimerów spektryny jest prawdopodobnie najbardziej analogiczny do zamka błyskawicznego. Po początkowym związaniu miejsca nukleacji, pozostałe podjednostki szybko łączą się wzdłuż ich pełnych długości, aby odtworzyć normalny dimer poprzez zwijanie się wokół siebie, tworząc elastyczny pręt przypominający linę. Montaż jest zakończony, jeśli którykolwiek z polipeptydów zostanie przerwany przez rozszczepienie proteazy. Przewiduje się, że mutacje heterozygotyczne obejmujące jedno z miejsc nukleacji wpływają na włączenie allelu do dojrzałego szkieletu błony. --- Heterodimer spektryny jest tworzony przez antyrównoległe boczne połączenie podjednostki alfa i beta. alfa i podjednostki beta, z których każda zawiera w dużej mierze serię homologicznych potrójnie helikalnych motywów. Inicjacja montażu dimeru obejmuje silne wiązanie między komplementarnymi motywami w pobliżu końca dimeru wiążącego aktynę. W tym mechanizm asocjacji bocznej spektryny w tym miejscu zarodkowania dimeru dimerów został zbadany przy użyciu ultrawirówki analitycznej do analizy heterodimerów utworzonych z rekombinowanych peptydów zawierających dwa lub cztery homologiczne motywy motywy z każdej podjednostki (alfa20-21/beta1-2; alfa18-21/beta1-4). Zarówno zarówno dwumotywowe, jak i czteromotywowe asocjacje dimerów zostały znacznie osłabione przy zwiększając stężenie soli, co wskazuje, że oddziaływania elektrostatyczne są ważne dla procesu inicjacji dimeru. Modelowanie potencjału elektrostatycznego na powierzchni motywów alfa20 i beta2 wykazało, że strona motywów obejmujących helisy A i B jest najbardziej korzystna dla asocjacji, z obszarem dodatniego potencjału elektrostatycznego na powierzchni AB motywu beta2 przeciwnego ujemnego potencjału na powierzchni AB motywu alfa20 i odwrotnie. odwrotnie. Analiza ochrony dimeru alfa20-21/beta1-2 przed proteazą wykazała, że wiele miejsc trypsyny i proteinazy K w helisach A motywów beta2 i alfa21 zostają zakopane po utworzeniu dimeru. Łącznie dane te wspierają model, w którym komplementarne oddziaływania elektrostatyczne dalekiego zasięgu na powierzchniach AB potrójnie helikalnych motywów w miejscu nukleacji dimeru inicjują prawidłowe parowanie motywów, tj. alfa21-beta1 i alfa20-beta2. Po początkowym dokowania tych komplementarnych trójhelikalnych motywów, to połączenie jest prawdopodobnie stabilizowana przez późniejsze tworzenie silniejszych oddziaływań hydrofobowych w kompleksie obejmującym helisy A obu podjednostek i prawdopodobnie większość powierzchni AB. W szczególności helisa A podjednostki beta wydaje się być zakopana w interfejsie dimeru. interfejsie dimeru. --- Poprzednie rentgenowskie struktury krystaliczne wykazały, że łączniki pięciu reszt aminokwasowych reszt aminokwasowych łączących pary powtórzeń alfa-spektryny mózgu kurczaka i ludzkiej erytroidy beta-spektryny mogą ulegać zginaniu bez utraty ich alfa-helikalnej struktury alfa-helikalnej. Aby sprawdzić, czy zginanie na jednym łączniku może wpływać na zginanie na sąsiednim łączniku, struktury dwóch i trzech powtórzonych fragmentów kurczaka mózgu kurczaka zostały określone za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Struktura fragmentu z trzema powtórzeniami wyraźnie pokazuje, że zginanie na jednym łączniku może wystąpić niezależnie od zginania na sąsiednim łączniku. Ta obserwacja zwiększa możliwe trajektorie modelowanych łańcuchów powtórzeń spektryny. Co więcej, cząsteczka z trzema powtórzeniami krystalizuje jako antyrównoległy dimer o znacznie mniejszej powierzchni międzyfazowej niż alfa-aktynina, cząsteczka związana ze spektryną, ale wystarczająco duża i typu wskazującego na biologiczną specyficzność. Porównanie struktur dimerów spektryny i alfa-aktyniny wspiera słabą asocjację tej pierwszej, która nie mogła być wykryte przez analityczne ultrawirowanie, w porównaniu z silną asocjacją w przeciwieństwie do silnej asocjacji tej drugiej, która została zaobserwowana przez innych. Aby skorelować cechy struktury struktury z właściwościami roztworu i przetestować poprzedni model stabilnej stabilnych powtórzeń spektryny i dystrofiny, liczbę oddziaływań międzyhelikalnych w kilku struktur spektryny została policzona i porównana z ich stabilnością termiczną. stabilnością termiczną. Interakcje międzyhelikalne, ale nie wszystkie interakcje, wzrastały równolegle ze zmierzonymi stabilnościami termicznymi każdego powtórzenia i w termicznych dwóch i trzech powtórzeń, a także częściowych powtórzeń spektryny. powtórzeń spektryny. --- Wydaje się, że rozciągliwość białek opiera się głównie na zmianach konformacyjnych, które mogą być zasadniczo modulowane przez interakcje białko-białko. Białka z rodziny z ich rozciągliwymi fałdami trzech helis, umożliwiają ocenę efektów dimeryzacji na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii sił atomowych. ocenę efektów dimeryzacji na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii sił atomowych. Chociaż niektórzy członkowie rodziny spektryn funkcjonują fizjologicznie tylko jako homodimery (np. alfa-aktynina) lub są monomerami (np. dystrofina), alfa- i beta-spektryny są stabilne jako formy monomeryczne, ale fizjologicznie występują jako fizjologicznie jako alfa, beta-heterodimery związane wzdłużnie. Dla krótkich konstrukty alfa- i beta-spektryny, albo jako monomery, albo jako alfa,beta-dimery, wzory piłokształtne w mikroskopii sił atomowych - wymuszone wydłużenie pokazują, że rozwijanie stochastycznie wydłuża powtórzenia około 4-5 razy większą długość niż natywne konformacje. Zarówno dla dimerów, jak i monomerów, rozkłady długości rozwijania wydają się bimodalne; główne piki rozwijania odzwierciedlają pojedyncze powtórzenia, a mniejsze piki rozwijania przy dwukrotnej długości odzwierciedlają tandem powtórzenia. Kooperatywne rozwijanie rozprzestrzenia się zatem przez helikalne łączniki między seryjnymi powtórzeniami (1, 2). Jednak w przypadku heterodimerów bocznych rozkład siły jest szeroki i przesunięty w kierunku wyższych sił. Powiązane łańcuchy w dimerze mogą pozostać razem i rozwijać się jednocześnie, oprócz rozwijania się niezależnie. Słabe oddziaływania boczne nie hamują rozwijania, ale silne oddziaływania boczne boczne interakcje ułatwiają jednoczesne rozwijanie, analogicznie do szeregowego w białkach z rodziny spektryn.
Podjednostki alfa-spektryny i beta-spektryny tworzą równoległe lub antyrównoległe heterodimery?
Podjednostki alfa i beta spektryny tworzą antyrównoległe heterodimery spektryny poprzez boczną asocjację.