Naprawa DNA sprzężona z transkrypcją (TCR) jest podszlakiem naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER). (NER), która jest uruchamiana, gdy polimeraza RNA zostaje zatrzymana przez uszkodzenie DNA. Uszkodzenia ukierunkowane przez TCR są naprawiane szybciej niż uszkodzenia naprawiane przez niezależny od transkrypcji "globalny" szlak NER, ale mechanizm leżący u podstaw ten mechanizm nie jest zrozumiały. Rozpoznawanie uszkodzeń podczas bakteryjnego NER zależy od UvrA, który wiąże się z uszkodzeniem i ładuje UvrB na DNA. Bakteryjny TCR dodatkowo wymaga białka Mfd, translokazę DNA, która usuwa zatrzymane kompleksy transkrypcyjne. Określiliśmy właściwości Mfd, UvrA i UvrB, które są wymagane do podwyższonej szybkości naprawy obserwowanego podczas TCR. Pokazujemy, że TCR i globalny NER różnią się pod względem wymagania dotyczące rozpoznawania uszkodzeń przez UvrA, wskazując, że Mfd działa na najwcześniejszym etapie procesu naprawy i rozszerzając funkcjonalne podobieństwa między TCR u bakterii i podobieństwa między TCR u bakterii i eukariontów. --- Transkrypcja i naprawa DNA są sprzężone w E. coli przez białko Mfd, które dysocjuje kompleksy elongacji transkrypcji zablokowane na niesparowanych uszkodzeniach i pośredniczy w rekrutacji białek naprawy DNA. Pokazujemy, że Mfd wpływa na stan elongacji polimerazy RNA (RNAP); kompleksy transkrypcyjne, które mają odwrotnej translokacji do pozycji backtracked, potencjalnie ważnego w korekcie i naprawie RNA, są przywracane do pozycji do przodu przez aktywność Mfd. pozycja przez aktywność Mfd, a zatrzymane kompleksy są ratowane do produktywnej elongacji. Mfd może działać poprzez aktywność translokazy, która przewija DNA, prowadząc albo do translokacji, albo do uwolnienia polimerazy RNA gdy miejsce aktywne enzymu nie może kontynuować elongacji. --- Naprawa wycięcia nukleotydów sprzężona z transkrypcją (TC-NER) jest zaangażowana w korygowanie uszkodzeń wywołanych promieniowaniem UV i innych blokad napotkanych w transkrybowanej nici transkrybowanej nici. Spadek częstotliwości mutacji (Mfd) jest czynnikiem sprzęgającym naprawę transkrypcji transkrypcji, zaangażowanym w naprawę nici matrycowej podczas transkrypcji. Mfd z M. tuberculosis (MtbMfd) ma długość 1234 aminokwasów i zawiera charakterystyczne moduły o różnej aktywności. moduły dla różnych aktywności. Mtbmfd uzupełnia niedobór mfd Escherichia coli (Ecomfd), zwiększał przeżywalność komórek napromieniowanych promieniowaniem UV i zwiększało represję blokady drogowej in vivo. Białko wykazywało aktywność ATPazy która była stymulowana ∼1,5-krotnie w obecności DNA. Podczas gdy C-końcowa domena (CTD) obejmująca aminokwasy od 630 do 1234 wykazywała ∼2-krotnie podwyższoną aktywność ATPazy niż MtbMfd, domena N-końcowa (NTD) zawierająca pierwsze 433 reszty aminokwasowe były zdolne do wiązania ATP, ale miały niedobór hydrolizy. Nadekspresja NTD MtbMfd prowadziła do defektu wzrostu i nadwrażliwości na światło UV światło. Usunięcie 184 aminokwasów z C-końcowego końca MtbMfd (MfdΔC) zwiększała aktywność ATPazy ∼10-krotnie i odpowiednio wykazywała wydajną translokację wzdłuż DNA w porównaniu do MtbMfd i CTD. Co zaskakujące, stwierdzono, że MtbMfd jest dystrybuowany w postaci monomeru i heksameru zarówno in vivo, jak i in vitro, a monomer wykazywał zwiększoną podatność na proteazy w porównaniu do heksameru. MfdΔC, z drugiej strony, był głównie monomeryczny w roztworze, co implikuje ekstremalny region C-końcowy w oligomeryzacji białka. Tak więc, chociaż MtbMfd przypomina EcoMfd w w wielu swoich cechach reakcyjnych, niektóre z jego dotychczas nieznanych odrębnych właściwości wskazują na jego specyficzną gatunkowo rolę w prątkach podczas naprawy sprzężonej z transkrypcją. naprawy sprzężonej z transkrypcją. --- W warunkach zatrzymanej lub ograniczonej replikacji genomu, takich jak te doświadczane przez sporulujących komórkach Bacillus subtilis, bardziej bezpośrednią szkodą spowodowaną przez uszkodzenia DNA jest zmiana programu transkrypcyjnego, który napędza ten proces rozwojowy. proces rozwojowy. Tutaj donosimy, że mfd, które koduje konserwatywne białko bakteryjne które pośredniczy w naprawie DNA sprzężonej z transkrypcją (TCR), jest wyrażane razem z uvrA w obu przedziałach sporangiów B. subtilis. Funkcja Mfd została okazała się ważna dla przetwarzania uszkodzeń genetycznych podczas sporulacji B. subtilis sporulacji. Zakłócenie mfd uwrażliwiło rozwijające się zarodniki na działanie mitomycyny-C (M-C) i promieniowanie UV-C. Co ciekawe, w nierosnących komórkach sporulujących, Mfd odgrywał rolę antymutagenną, ponieważ jego brak promował mutagenezę indukowaną promieniowaniem UV poprzez szlak obejmujący syntezę translesionów (TLS), w której pośredniczy YqjH/YqjW. Dwie obserwacje obserwacje potwierdzają udział TCR zależnego od Mfd w morfogenezie zarodników morfogenezie: (i) zakłócenie mfd notorycznie wpływało na wydajność sporulacji B. subtilis oraz (ii) w porównaniu ze szczepem typu dzikiego, znaczna część znaczna część sporangiów z niedoborem Mfd, które przetrwały leczenie UV-C rozwinęła fenotyp asporogeniczny. Proponujemy, aby zależny od Mfd szlak naprawy działa podczas sporulacji B. subtilis i że jego funkcja jest wymagana do eliminacji uszkodzeń genetycznych z genów aktywnych transkrypcyjnie. --- Badania in vivo sugerują, że widełki replikacyjne są zatrzymywane przez spotkania z kompleksami transkrypcyjnymi kompleksami transkrypcyjnymi. Jednak los replikosomu i polimerazy RNA polimerazy RNA (RNAP) po zderzeniu czołowym jest nieznany. Odkryliśmy, że Escherichia coli zatrzymuje się po zderzeniu z kompleksem transkrypcyjnym head-on kompleksem transkrypcyjnym, ale zamiast zapadać się, widełki replikacyjne pozostają wysoce stabilne i ostatecznie wznawia elongację po wyparciu RNAP z DNA. Odkryliśmy również odkryliśmy, że czynnik sprzęgający transkrypcję i naprawę Mfd promuje bezpośredni restart widełek po kolizji poprzez ułatwienie przemieszczenia RNAP. Te Odkrycia te pokazują wewnętrzną stabilność aparatu replikacyjnego i nieznaną wcześniej rolę wcześniej nieznaną rolę szlaku naprawy sprzężonego z transkrypcją w w promowaniu replikacji po zablokowaniu RNAP. --- Naprawa wycięcia nukleotydów sprzężona z transkrypcją (TC-NER) usuwa pewne rodzaje uszkodzeń z transkrybowanej nici ekspresjonowanych genów. Uważa się, że sygnałem dla TC-NER jest polimeraza RNA, która utknęła w miejscu uszkodzenia w matrycy DNA. W Escherichia coli, zatrzymana polimeraza jest odłączana od uszkodzenia przez czynnik sprzęgający naprawy transkrypcji (M czynnik sprzęgający naprawę transkrypcji (białko Mfd), który również rekrutuje białka naprawcze białka naprawcze, co skutkuje skutecznym usunięciem uszkodzenia. TC-NER został udokumentowany w komórkach różnych organizmów, od bakterii po ludzi. do ludzi. W każdym przypadku zaangażowana polimeraza RNA była multimerycznym kompleksem białkowym. kompleks białkowy. Aby ustalić, czy gen transkrybowany przez monomeryczną polimerazę RNA bakteriofaga polimerazę RNA bakteriofaga T7 może być naprawiany przez TC-NER, skonstruowaliśmy szczepy szczepy E. coli, w których chromosomalny gen lacZ jest kontrolowany przez promotor T7 przez promotor T7. W przypadku braku polimerazy RNA T7, beta-galaktozydaza jest wytwarzana w niewielkim stopniu lub nie jest wytwarzana wcale. lub jej brak, co wskazuje, że polimeraza RNA E. coli nie transkrybuje lacZ skutecznie, jeśli w ogóle, w tych szczepach. Poprzez wprowadzenie plazmidu (pAR1219) niosącego gen T7 1 pod kontrolą promotora E. coli lac UV5 do tych szczepów, uzyskaliśmy pochodne uzyskaliśmy pochodne, w których poziom polimerazy RNA T7 mógł być regulowany. być regulowany. W hodowlach zawierających regulowany poziom polimerazy, beta-galaktozydaza była aktywnie produkowana, co wskazuje, że polimeraza RNA T7 skutecznie transkrybuje gen lacZ. W tych warunkach zaobserwowaliśmy, że indukowane promieniowaniem UV dimery cyklobutanu pirymidyny były szybciej usuwane z transkrybowanej nici transkrybowanej nici lacZ niż z nici nietranskrybowanej, wspierając wniosek, że TC-NER wystąpił w tym genie. Ta odpowiedź była nieobecna w mutancie mutancie mfd-1, co wskazuje, że mechanizm leżący u jej podstaw może być podobny do mechanizmu dla bakteryjnej polimerazy RNA. --- W sprzężeniu transkrypcji i naprawy DNA u bakterii pośredniczy czynnik sprzęgający transkrypcję i naprawę (TRCF, produkt genu mfd), który usuwa kompleksy elongacji transkrypcji zatrzymane na uszkodzeniach DNA i rekrutuje nukleotydów do miejsca uszkodzenia. Tutaj opisujemy strukturę krystaliczną o rozdzielczości 3.2 A struktury krystalicznej Escherichia coli TRCF. Struktura składa się ze zwartego układu ośmiu domen, w tym modułu translokacji moduł podobny do SF2 ATPazy RecG i region strukturalnego podobieństwa do UvrB. Eksperymenty biochemiczne i genetyczne wykazały, że inna domena ze strukturalnym podobieństwem do podobieństwem strukturalnym do domeny podobnej do Tudora czynnika wydłużania transkrypcji NusG odgrywa krytyczną rolę w interakcjach TRCF z polimerazą RNA. Porównanie z modułem translokacji RecG, jak również inne cechy strukturalne wskazują, że funkcja TRCF obejmuje zmiany konformacyjne na dużą skalę zmiany konformacyjne. Dane te, wraz z modelem strukturalnym dla interakcji TRCF z kompleksem wydłużania transkrypcji, zapewniają mechanistyczny wgląd w funkcję funkcji TRCF. --- Heterogeniczność naprawy DNA zaobserwowano na różnych poziomach organizacji genomu organizacji genomu, w tym domen chromatyny, ekspresji genów i nici DNA. Jeśli heterogeniczność istniała również wewnątrzgenowo, mogłoby to ujawnić drobne szczegóły mechanizmu naprawy mechanizmu naprawy in vivo. Tutaj mierzymy częstotliwość indukowanych przez UV dimerów cyklobutanu pirymidyny w poszczególnych nukleotydach w określonych częściach dwóch genów Escherichia coli, lacl i lacZ, w różnym czasie po napromieniowaniu. napromieniowaniu. Widoczne były dwie domeny zróżnicowanych szybkości naprawy, z naprawą była powolna w nukleotydach sąsiadujących z miejscami startu transkrypcji. W lacZ, domena szybszej naprawy rozpoczynała się 32 bazy poniżej miejsca startu transkrypcji transkrypcji i wymagała genu mfd. Ponieważ mfd koduje czynnik sprzężenia transkrypcja-naprawa czynnik sprzęgający, ten system naprawy sprzężony z transkrypcją najwyraźniej staje się działa poniżej regionu kompleksu inicjacyjnego in vivo. Niespodziewanie, jednak (1) mutacja mfd zmniejszyła naprawę w domenie downstream, nawet gdy transkrypcja była na bardzo niskim poziomie i (2) indukcja transkrypcji lacZ z izopropylo-beta-D-tiogalaktozydem przezwyciężyła tę redukcję. Najwyraźniej Czynnik sprzęgający transkrypcję i naprawę Mfd jest wymagany dla podstawowych poziomów naprawy naprawy specyficznej dla nici w tym genie, ale indukowane poziomy naprawy są związane z transkrypcją poprzez inny mechanizm. --- Naprawa sprzężona z transkrypcją (TCR) jest podszlakiem naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER). (NER), który działa specyficznie na zmiany w transkrybowanej nici wyrażonych genów. Po raz pierwszy opisany w komórkach ssaków, TCR został następnie udokumentowany w Escherichia coli. W tym organizmie polimeraza RNA zatrzymana w miejscu uszkodzenia jest przemieszczana przez czynnik sprzęgający naprawę transkrypcji, Mfd. Białko to rekrutuje czynnik NER UvrA, a następnie oddysocjowuje od DNA. UvrA wiąże UvrB, a złożony kompleks UvrAB* inicjuje naprawę. U mutantów pozbawionych aktywnego Mfd, TCR jest nieobecny. Gen transkrybowany przez polimerazę RNA bakteriofaga T7 polimerazę RNA bakteriofaga T7 w E. coli również wymaga Mfd dla TCR. Białko CSB (brakujące lub wadliwe w komórkach pacjentów z zespołem Cockayne'a, grupa dopełniacza B) jest niezbędne dla TCR u ludzi. CSB i jego homologi u wyższych eukariontów są prawdopodobnie funkcjonalnymi odpowiednikami prawdopodobnie funkcjonalnymi odpowiednikami Mfd. --- Bakteryjne białko Mfd jest czynnikiem sprzęgającym transkrypcję i naprawę, który pełni dwie kluczowe funkcje podczas naprawy DNA sprzężonej z transkrypcją. Pierwszą z nich jest usunięcie kompleksów polimerazy RNA (RNAP), które zostały zatrzymane przez uszkodzenie DNA z miejsca uszkodzenia, a drugą jest pośredniczenie w rekrutacji białek naprawy DNA białek naprawczych DNA. Mfd wypiera również kompleksy transkrypcyjne, które zostały zablokowane przez blokady białkowe i katalizuje reaktywację kompleksów transkrypcyjnych kompleksów transkrypcyjnych, które zostały "cofnięte". Zidentyfikowaliśmy podstawienia aminokwasów podstawienia aminokwasów w podjednostce beta RNAP Escherichia coli, które zakłócają bezpośrednią interakcję między Mfd i RNAP. Podstawienia te uniemożliwiają Mfd wypieranie RNAP z DNA in vivo i in vitro. Definiują one wysoce konserwatywny na powierzchni domeny beta1 RNAP, która jest wymagana przez Mfd dla początkowego etapu naprawy sprzężonej z transkrypcją, wzmocnienia represji blokady drogowej represji i reaktywacji cofniętych kompleksów transkrypcyjnych. --- Naprawa wycięcia nukleotydów sprzężona z transkrypcją (TCR) przyspiesza usuwanie niekodujących zmian niekodujących zmian z nici matrycowej aktywnych genów, a tym samym przyczynia się do zmienności częstotliwości mutacji w całym genomie. Obecne modele dla TCR zakładają, że uszkodzenie musi powodować zatrzymanie polimerazy RNA (RNAP), jeśli ma ona być substratem do przyspieszonej naprawy. Zbadaliśmy wymagania substratowe dla TCR przy użyciu systemu, w którym zatrzymanie transkrypcji i lokalizacja uszkodzenia i lokalizacja uszkodzeń mogą być odłączone. Pokazujemy, że TCR zależna od Mfd u bakterii obejmuje tworzenie kompleksu poszukującego uszkodzeń, który może wykrywać uszkodzenia za RNAP i że specyficzność nici przyspieszonego szlaku naprawy jest niezależna od wymogu uszkodzenia w celu zatrzymania RNAP. Pokazujemy również, że miejsce wstrzymania transkrypcji ops (operon polarity suppressor), które powoduje cofanie się RNAP, może promować naprawę dalszych uszkodzeń, gdy te uszkodzenia same w sobie nie powodują przeciągnięcia polimerazy. Nasze odkrycia wskazują że czynnik sprzęgający transkrypcję i naprawę Mfd, który jest zależną od ATP nadrodziny 2, który wiąże się z RNAP, kontynuuje translokację wzdłuż DNA po przemieszczeniu RNAP, dopóki nie zostanie zlokalizowane uszkodzenie w nici matrycowej. Odkrycie, że miejsca pauzy mogą promować naprawę niestałych uszkodzeń sugeruje, że szlaki TCR mogą odgrywać szerszą rolę w modulowaniu częstotliwości mutacji w różnych częściach genomu, niż wcześniej podejrzewano. --- Naprawa DNA sprzężona z transkrypcją wykorzystuje składniki maszyny transkrypcyjnej do identyfikacji uszkodzeń DNA i inicjowania ich naprawy. Te ścieżki naprawy są złożone, więc ich mechanizmy pozostają słabo poznane. Bakteryjna naprawa sprzężona z transkrypcją jest inicjowana, gdy polimeraza RNA zatrzymana w uszkodzeniu DNA jest usuwana przez Mfd, zależną od ATP translokazę DNA. Tutaj używamy nanomanipulację DNA pojedynczą cząsteczką, aby obserwować dynamiczne interakcje Escherichia coli Mfd z kompleksami elongacyjnymi polimerazy RNA zatrzymanymi przez dimer cyklopirymidyny lub głód nukleotydów. Pokazujemy, że Mfd działa poprzez katalizując dwa nieodwracalne, zależne od ATP przejścia o różnych strukturalnych, kinetycznych i mechanistycznych. Mfd pozostaje związany z DNA w kompleksie kompleksie, który może działać jako marker miejsc uszkodzenia DNA, kierując montażem kolejnych czynników naprawy DNA. montaż kolejnych czynników naprawy DNA. Wyniki te zapewniają ramy dla kinetyki naprawy sprzężonej z transkrypcją in vivo i otwierają drogę do rekonstrukcji kompletnych ścieżek naprawy DNA. drogę do rekonstrukcji kompletnych ścieżek naprawy DNA w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki. rozdzielczości. --- Naprawa sprzężona z transkrypcją (TCR) jest procesem komórkowym, w którym niektóre formy uszkodzeń DNA są naprawiane szybciej z transkrybowanych nici aktywnych genów niż z nietranskrybowanych nici lub całego genomu. U ludzi czynnik sprzęgający TCR CSB, odgrywa kluczową rolę w przywracaniu transkrypcji po zarówno indukowanego promieniowaniem UV, jak i oksydacyjnego uszkodzenia DNA. Przyczynia się również pośrednio do globalnej naprawy niektórych form oksydacyjnych uszkodzeń DNA. Homolog Escherichia coli homolog, Mfd, jest podobnie wymagany do TCR zmian indukowanych promieniowaniem UV. Jednakże, jego do przywrócenia transkrypcji i globalnej naprawy uszkodzeń oksydacyjnych uszkodzeń oksydacyjnych nie został zbadany. Tutaj przedstawiamy pierwsze bezpośrednie badanie odzyskiwania transkrypcji po indukowanym UV i oksydacyjnym uszkodzeniu DNA w E. coli. Zaobserwowaliśmy, że mutacje w mfd lub uvrA zmniejszały szybkość, z jaką transkrypcji po uszkodzeniu wywołanym promieniowaniem UV. W przeciwieństwie do tego, nie wykryto różnicy wykryto w szybkości odzyskiwania transkrypcji w mutacjach mfd, uvrA, fpg, nth lub polB dinB umuDC w stosunku do komórek typu dzikiego po uszkodzeniu oksydacyjnym. Mutanty mfd były również w pełni odporne na nadtlenek wodoru (H(2)O(2)) i i usuwały zmiany oksydacyjne z genomu w tempie porównywalnym do komórek typu dzikiego. komórki. Wyniki pokazują, że Mfd promuje szybkie odzyskiwanie ekspresji genów ekspresji genów po uszkodzeniu wywołanym promieniowaniem UV w E. coli. Ponadto, wyniki te sugerują, że Mfd może funkcjonalnie różnić się od swojego ludzkiego homologa CSB, ponieważ nie przyczynia się w wykrywalny sposób do odzyskiwania ekspresji genów lub globalnej naprawy po uszkodzeniu oksydacyjnym. --- Naprawa sprzężona z transkrypcją, ukierunkowana naprawa transkrybowanych nici aktywnych genów, jest wadliwa. aktywnych genów, jest wadliwa w bakteriach, drożdżach i ludzkich komórkach niosących mutacje odpowiednio w mfd, RAD26 i ERCC6. Prawdopodobnie inne czynniki są również wyjątkowo zaangażowane w sprzężenie transkrypcja-naprawa. Niedawno opisano defekt w naprawie sprzężonej z transkrypcją dla mutantów naprawy niedopasowania Escherichia coli i ludzkich linii komórek nowotworowych z mutacjami w genach naprawy niedopasowania. My zbadaliśmy usuwanie uszkodzeń DNA wywołanych promieniowaniem UV w szczepach drożdży zmutowanych w genach naprawy niedopasowania w celu potwierdzenia defektu naprawy sprzężonej z transkrypcją w tym systemie. transkrypcji w tym systemie. Ponadto określiliśmy udział genu naprawy niedopasowania MSH2 do naprawy sprzężonej z transkrypcją przy braku globalnej naprawy genomowej wykorzystując mutanty rad7 delta. Określiliśmy również, czy niezależna od rad26 naprawa sprzężona z transkrypcją obserwowana w mutantach rad26 delta i rad7 delta rad26 delta zależy od MSH2, badając niedobory naprawy w mutantach rad26 delta msh2 delta i rad7 delta rad26 delta msh2 delta mutantów. Znaleźliśmy żadnych defektów w naprawie sprzężonej z transkrypcją spowodowanych mutacjami w genach naprawy niedopasowania geny MSH2, MLH1, PMS1 i MSH3. Wydaje się, że drożdże różnią się od bakterii i ludzkich komórek pod względem zdolności do naprawy sprzężonej z transkrypcją na tle mutantów naprawa zmutowanego tła. --- Uszkodzenia DNA, które blokują transkrypcję genów, są priorytetowo naprawiane przez ścieżki naprawy DNA sprzężone z transkrypcją. Polimerazy RNA zatrzymane na uszkodzeniach DNA DNA blokują enzymy naprawcze, ale sytuacja ta jest korzystna dla komórki dzięki na korzyść komórki przez czynniki sprzęgające transkrypcję i naprawę, które usuwają zablokowaną polimerazę RNA polimerazę RNA z DNA i zwiększają szybkość, z jaką uszkodzenie jest naprawiane. Ostatnie badania strukturalne bakteryjnego czynnika sprzęgającego naprawę transkrypcji, Mfd, ujawniły modułową architekturę, w której zależny od ATP silnik oparty na DNA jest sprzężony z domenami interakcji białko-białko, które mogą przyłączać silnik do polimerazy do polimerazy RNA i białka naprawy DNA UvrA. Tutaj dokonuję przeglądu kluczowych tego wielofunkcyjnego białka i omówię, w jaki sposób ostatnie odkrycia mechanistyczne i strukturalne strukturalne pogłębiły nasze zrozumienie naprawy DNA sprzężonej z transkrypcją u bakterii. naprawy DNA u bakterii.
Które białka działają jako czynniki promujące naprawę sprzężoną z transkrypcją u bakterii?
Naprawa wycięcia nukleotydów sprzężona z transkrypcją (TC-NER lub TCR) jest procesem komórkowym, w którym uszkodzenia wywołane promieniowaniem UV i inne blokady napotkane w transkrybowanej nici są przywracane. Bakteryjna naprawa sprzężona z transkrypcją jest inicjowana, gdy polimeraza RNA zatrzymana na uszkodzeniu DNA jest usuwana przez Mfd (Mutation frequency decline), zależną od ATP translokazę DNA. Mfd jest głównym czynnikiem sprzęgającym naprawę transkrypcji u bakterii. Ponadto, czynnik wydłużania transkrypcji NusA, oprócz swojej roli w rekrutacji polimerazy DNA syntezy transkryptów (TLS) do luk napotkanych podczas transkrypcji, promuje alternatywną klasę TCR zaangażowaną w identyfikację i usuwanie klasy zmian, takich jak zmiana N(2)-f-dG.