Genom Dictyostelium discoideum został zsekwencjonowany, złożony i opatrzony adnotacjami w wysokim stopniu wiarygodności. Lista części białek i RNA kodowanych przez sześć chromosomów sześć chromosomów może być teraz dostępna i analizowana. Jedną z początkowych niespodzianek była niezwykle duża liczba genów, które są wspólne dla roślin, zwierząt i grzybów, które musiały być obecne u ich wspólnego przodka ponad miliard lat temu. miliard lat temu. Genom koduje łącznie około 10 300 białek, w tym rodziny białek zaangażowane w kontrolę cytoszkieletu, potranslacyjną modyfikację białek, detoksykację, metabolizm wtórny modyfikację białek, detoksykację, metabolizm wtórny, adhezję komórek i transdukcję sygnałów. transdukcji sygnału. Genom ma wyższy odsetek homopolimerycznych szlaków i prostych powtórzeń sekwencji, takich jak prostych powtórzeń sekwencji, takich jak [CAA]n, niż większość innych genomów. Powtórzenia trypletowe powtórzenia w regionach tłumaczonych wytwarzają najwyższy znany odsetek poliglutaminowych w każdym znanym proteomie. Analizy filogenetyczne oparte na na kompletnych proteomach potwierdzają, że amebozy są grupą siostrzaną dla zwierząt i grzybów. i grzybów, różniącą się od roślin i wczesnych gatunków, takich jak Leishmania, Plasmodium czy Giardia. Ukończona sekwencja Dictyostelium otwiera drzwi do funkcjonalnej eksploracji jego genomu na dużą skalę. --- Ameba społeczna Dictyostelium discoideum jest już znana jako organizm modelowy dla różnych badań komórkowych i molekularnych. Teraz, gdy projekt sekwencjonowania genomu i dostępne są różne narzędzia do nadekspresji lub eliminacji genów. znokautowania genów, gatunek ten również znalazł się w centrum uwagi badań genomiki funkcjonalnej. funkcjonalnych badań genomicznych. W związku z tym informacje o sekwencji genomowej mogą być mogą być teraz wykorzystywane do realizacji projektów proteomiki D. discoideum. Tutaj przedstawiamy zatwierdzone protokoły dostosowane do analizy proteomu D. discoideum. Opisany w tym rozdziale przepływ pracy opisany w tym rozdziale obejmuje dwuwymiarowy żel poliakrylamidowy elektroforezę poliakrylamidową do separacji białek i odcisk palca masy peptydowej (spektrometria masowa czasu przelotu wspomagana laserowo desorpcją/jonizacją matrycy) do identyfikacji białek. --- Wydzielanie białek płaszcza zarodników z pęcherzyków wydzielniczych przedporowych (PSV) u Dictyostelium discoideum Dictyostelium discoideum jest zdarzeniem, w którym pośredniczy sygnał, który leży u podstaw różnicowania komórek terminalnych różnicowanie i stanowi ważny przypadek regulowanego rozwojowo wydzielania. W celu zbadania mechanizmów biochemicznych, które rządzą regulowana fuzja PSV z błoną plazmatyczną i późniejsze wydzielanie ich ładunku. wydzielanie ich ładunku, oczyściliśmy te organelle z komórek presporowych. Analiza ekstraktów białkowych wysoce oczyszczonych PSV wykazała, że oprócz do ładunku strukturalnych białek płaszcza zarodników, wiele innych białek jest związanych z PSV. Ich identyfikacja ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu regulowanego wydzielania w tym systemie. W niniejszym badaniu podjęliśmy pierwsze kompleksowe podejście proteomiczne do analizy całego, wcześniej niescharakteryzowanych organelli, w celu zidentyfikowania głównych białek związanych z PSV. Pokazujemy, że oprócz strukturalnych białka płaszcza zarodników, PSV zawierają enzymy potrzebne do prawidłowego (tioredoksyna 2 i 3), białka regulatorowe, które według naszych przewidywań odbierają i sygnał rozwojowy do sekrecji (GTPazę rab7, kinazę PI-3, kinazę NDP kinaza i białka wiążące wapń kalfumiryna-1 i kalretikulina), jak również białka, które oddziałują z cytoszkieletem, aby pośredniczyć w przemieszczaniu PSVs do błony plazmatycznej (białka wiążące aktynę - kaktozyna i profilina 1). Ponadto Ponadto wyniki sugerują, że białka mogą odgrywać wiele ról w komórce, i że funkcja białka może być częściowo podyktowana lokalizacją subkomórkową. Identyfikacja białek PSV pozwala nam opracować testowalne hipotezy dotyczące roli tych białek w kontekście funkcjonalnym wydzielania regulowanego przez rozwój. --- W tym badaniu zastosowano podejście ilościowej proteomiki porównawczej do analizy zmian proteomu mitochondrialnego Dictyostelium discoideum podczas wzrostu wegetatywnego, głodu i wczesnych etapów rozwoju. Zastosowanie technologii 2-D DIGE pozwoliło na wykrycie około 2000 plamek białkowych na każdym na każdym żelu 2-D, przy czym 180 białek wykazywało znaczące zmiany w poziomie ekspresji. poziomie ekspresji. W sumie zidentyfikowano 96 białek (51 unikalnych i 45 nadmiarowych). jednoznacznie zidentyfikowane. Pokazujemy, że mitochondrialny proteom D. discoideum wpływają głównie na enzymy metabolizmu energetycznego (cykl Krebsa, anaplerotyczny, system fosforylacji oksydacyjnej i rozpraszanie energii) rozpraszanie energii), białka zaangażowane w procesy rozwojowe i sygnalizacyjne, jak również a także w biosyntezę i los białek. Najbardziej uderzającymi obserwacjami były przeciwstawna regulacja ekspresji syntazy cytrynianowej i akonitazy oraz bardzo duże zróżnicowanie ekspresji duża zmienność w ekspresji alternatywnej oksydazy, która podkreśliła znaczenie cytrynianu i alternatywnej oksydazy w fizjologii rozwoju D. discoideum. rozwoju D. discoideum. Mitochondrialne stany energetyczne mierzone in vivo za pomocą MitoTracker Orange CM Ros wykazały wzrost polaryzacji błony mitochondrialnej podczas rozwoju D. discoideum. polaryzacji błony mitochondrialnej podczas głodu D. discoideum i rozwoju wywołanego głodem. --- Dostępność kompletnych informacji o sekwencjach genomów różnych organizmów, w tym modelowych organizmów genetycznych w tym modelowych organizmów genetycznych zapoczątkowała nową erę porównywania sekwencji białek białek, umożliwiając wyszukiwanie podobieństw między całymi proteomami proteomów przy użyciu narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Chociaż identyfikacja i analiza białek wspólnych dla ludzi i organizmów modelowych okazała się nieocenionym narzędziem okazała się nieocenionym narzędziem do zrozumienia funkcji genów, zestawy białek unikalne dla proteomu danego organizmu modelowego pozostały w dużej mierze niezbadane. My skonstruowaliśmy przeszukiwalną bazę danych, która pozwala biologom zidentyfikować białka unikalne dla danego proteomu. Baza danych Negative Proteome Database (NPD) jest wypełniona parami porównań sekwencji białek między każdym z następujących proteomów następujących proteomów: Homo sapiens, Mus musculus, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Saccharomyces cerevisiae, Dictyostelium discoideum, Chlamydomonus reinhardti, Escherichia coli K12, Arabidopsis thaliana i Methanoscarcina acetivorans. Nasza analiza negatywnych zestawów danych proteomu przy użyciu NPD ujawniła do tej pory 107 białek u ludzi, które mogą być zaangażowane w funkcję rzęsek ruchliwych, 1628 potencjalnych białek docelowych pestycydów u much, 659 białek wspólnych dla much i ludzi, które nie są reprezentowane w mniej neurologicznie złożonym proteomie robaka, oraz 180 kodowanych jądrowo ludzkich białek związanych z chorobami ludzkimi, które są nieobecne w proteomie much. NPD jest jedynym zasobem online, w którym użytkownicy mogą szybko wykonywać złożone negatywne i pozytywne porównania proteomów organizmów modelowych. Przewidujemy, że NPD i adaptowalny algorytm adaptowalny algorytm, który można łatwo wykorzystać do powielenia tej analizy na niestandardowych zestawach proteomów będzie nieocenionym narzędziem w badaniu zestawów białek specyficznych dla organizmu.
Czy proteom Dictyostelium discoideum jest znany?
Tak, genom Dictyostelium discoideum został zsekwencjonowany, złożony i opatrzony adnotacjami o wysokim stopniu wiarygodności. Lista części białek i RNA kodowanych przez sześć chromosomów może być teraz dostępna i analizowana. W związku z tym informacje o sekwencji genomu mogą być teraz wykorzystywane do realizacji projektów proteomiki D. discoideum.