Metylotransferazy domeny SET osadzają znaczniki metylowe na specyficznych resztach lizyny ogona histonu lizyny i odgrywają główną rolę w epigenetycznej regulacji transkrypcji genów. transkrypcji genów. Rozwiązaliśmy struktury domen katalitycznych GLP, G9a, Suv39H2 i PRDM2, czterech z ośmiu znanych ludzkich metylotransferaz H3K9 w ich konformacji apo lub w kompleksie ich konformacji apo lub w kompleksie z kofaktorem oddającym metyl, oraz substratami peptydowymi. Przeanalizowaliśmy strukturalne determinanty metylacji i zaprojektowaliśmy mutanta G9a zdolnego do trójmetylacji H3K9. Wykazaliśmy że domena I-SET działa jako sztywna platforma dokowania, podczas gdy indukowane dopasowanie domeny Post-SET jest niezbędne do osiągnięcia katalitycznie kompetentnej konformacji. Proponujemy również model, w którym elektrostatyka dalekiego zasięgu łączy enzym i substrat histonowy. substrat, podczas gdy obecność argininy przed docelową lizyną lizyny jest krytyczna dla wiązania i specyficzności. ULEPSZONA WERSJA: Ten artykuł może być również przeglądany jako wersja rozszerzona, w której w której tekst artykułu jest zintegrowany z interaktywnymi reprezentacjami 3D i animowanymi przejściami. Należy pamiętać, że do uzyskania dostępu do tej rozszerzonej funkcjonalności wymagana jest wtyczka internetowa. tej rozszerzonej funkcjonalności. Instrukcje dotyczące instalacji i korzystania z są dostępne w Tekście S1. --- Przeprowadzono badanie ludzkiego genomu w celu zrozumienia składu metylotransferaz białkowych (zarówno białkowych metylotransferaz argininowych, jak i lizynowych) oraz pokrewieństwo ich domen katalitycznych. Zidentyfikowaliśmy 51 białkowych metylotransferaz lizyny metylotransferaz białkowych na podstawie podobieństwa do kanonicznych białek Drosophila Su(var)3-9, enhancer of zeste (E(z)) i domeny trithorax (trx). Disruptor of telomeric silencing-1-like, znana białkowa metylotransferaza lizyny, nie pasuje do rodziny metylotransferaz lizyny białkowej, ale grupuje się z metylotransferazą argininy białkowej. białkowymi metylotransferazami argininowymi, wraz z 44 innymi białkami, w tym METTL i białkami z rodziny domen NOP2/Sun. Pokazujemy, że reprezentatywna METTL, METTL11A, wykazuje aktywność katalityczną jako metylotransferaza histonów. My rozwiązaliśmy również współkrystaliczne struktury disruptora telomerycznego wyciszania-1-like z S-adenozylometioniną i S-adenozylohomocysteiną związanymi w miejscu aktywnym. Konformacja obu ligandów jest praktycznie identyczna z konformacją występującą w znanych białkowych metylotransferaz argininowych, METTL i białek z rodziny domen NOP2/Sun i różni się od tej obserwowanej w Drosophila Su(var)3-9, enhancer of zeste (E(z)) i metylotransferazach lizyny domeny trithorax (trx). Mamy opracowaliśmy testy biochemiczne dla 11 członków klasy docelowej metylotransferaz białkowych i sprofilowaliśmy powinowactwo trzech ligandów do tych enzymów: wspólnego substratu metylodonorującego S-adenozylometioniny; wspólnego produktu reakcji produkt reakcji S-adenozylohomocysteina; oraz naturalny produkt sinefungina. Powinowactwo każdego z tych ligandów jest odwzorowane na drzewach genealogicznych lizyny białkowej metylotransferaz białkowych i metylotransferaz argininowych, aby ujawnić wzorce rozpoznawania ligandów przez te enzymy. rozpoznawania ligandów przez te enzymy. --- Metylacja reszt lizyny histonów jest ważnym znakiem epigenetycznym, który koreluje z funkcjonalnie odrębnymi regionami chromatyny. Przedstawiamy tutaj strukturę krystaliczną trójskładnikowego kompleksu enzymu Pr-Set7 (znanego również jako Set8), który metyluje Lys 20 histonu H4 (H4-K20). Pokazujemy, że enzym ten jest wyłącznie mono-metylazą i dlatego jest odpowiedzialny za rolę sygnalizacyjną zupełnie odmienną od tej ustalonej przez inne enzymy, które celują w tę resztę histonu histonu. Dostarczamy dowodów z NMR dla domen C-flanking białek SET stają się uporządkowane po dodaniu kofaktora AdoMet i rozwijają model cyklu katalitycznego tych enzymów. cyklu katalitycznego tych enzymów. Struktura krystaliczna ujawnia podstawę specyficzności enzymu dla H4-K20, ponieważ reszta histydynowa w substracie substratu, blisko docelowej lizyny, jest wymagana do ukończenia miejsca aktywnego. aktywnego. Pokazujemy również, w jaki sposób wysoce zmienny składnik domeny SET jest odpowiedzialny za wiele oddziaływań enzymów z docelowym peptydem histonowym peptydem histonowym i prawdopodobnie również w jaki sposób ta część struktury zapewnia, że Pr-Set7 jest specyficzna dla nukleosomów. --- Kompleks ESC-E(Z) represorów grupy Polycomb (PcG) Drosophila melanogaster jest metylotransferazą histonu H3 (HMTase). Kompleks ten wycisza geny Hox muchy, i pokrewne HMTazy kontrolują rozwój linii zarodkowej u robaków, kwitnienie u roślin, i inaktywację X u ssaków. Kompleks muchy zawiera katalityczną domenę SET podjednostkę katalityczną SET, E(Z), oraz trzy podjednostki niekatalityczne, SU(Z)12, ESC i NURF-55. Kompleks kompleks czterech podjednostek jest >1000 razy bardziej aktywny niż sam E(Z). Tutaj pokazujemy że ESC i SU(Z)12 odgrywają kluczową rolę w zwiększaniu aktywności HMTazy E(Z). My pokazujemy również, że utrata ESC zakłóca globalną metylację histonu H3-lizyny 27 w zarodkach much. Mutacje podjednostkowe identyfikują domeny wymagane dla aktywności katalitycznej aktywności katalitycznej i/lub wiązania z określonymi partnerami. Opisujemy mutacje typu missense w pętlach powierzchniowych ESC, w domenie CXC E(Z) oraz w konserwowanej domenie VEFS domenie SU(Z)12, z których każda zakłóca aktywność HMTazy, ale zachowuje złożenie kompleksu. kompleks. Tak więc domena SET E(Z) wymaga wielu wejść partnerskich do wytworzenia aktywnej HMTazy. aktywnej HMTazy. Stwierdziliśmy również, że rekombinowany kompleks robaka zawierający homolog E(Z) MES-2, ma silną aktywność HMTazy, która zależy zarówno od MES-6, homologa ESC, jak i MES-3. ESC, jak i MES-3, białka pionierskiego. Tak więc, chociaż kompleksy PcG much i ssaków PcG bezwzględnie wymagają SU(Z)12, kompleks robaka generuje aktywność HMTase z odrębnego zestawu partnerów. --- Metylacja lizyny 4 (K4) histonu H3 jest powszechnym znacznikiem związanym z aktywacją transkrypcji. aktywacją transkrypcji i jest katalizowana głównie przez metylotransferazy histonowe z rodziny MLL/SET1. metylotransferazy. Wspólną cechą kompleksów MLL/SET1 u ssaków jest obecność trzech podstawowych składników (RbBP5, Ash2L i WDR5) oraz podjednostki katalitycznej podjednostki katalitycznej zawierającej domenę SET. W przeciwieństwie do większości innych histonów metylotransferaz histonowych, wszystkie cztery białka są wymagane do wydajnej metylacji H3 K4 metylacji. Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków, mechanizmy, w jaki sposób trzy podstawowe składniki regulują aktywność metylotransferazy MLL/SET1 pozostają nieuchwytne. Tutaj pokazujemy, że heterodimer heterodimer Ash2L i RbBP5 ma wewnętrzną aktywność metylotransferazy histonów. Aktywność ta wymaga wysoce konserwatywnej domeny SPRY Ash2L i krótkiego peptydu RbBP5. peptydu RbBP5. Wykazaliśmy, że zarówno Ash2L, jak i domena SET MLL1 są zdolne do wiązania się z S-adenozylo-L- [metylo-(3)H] metioniną w kompleksie MLL1 core kompleksu. Mutacje w domenie MLL1 SET, które nie wspierają ogólnej metylacji H3 K4 metylacji również osłabiają wiązanie SAM przez Ash2L. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że heterodimer Ash2L/RbBP5 odgrywa kluczową rolę w ogólnej katalizie MLL1. katalizie metylacji H3 K4, w której pośredniczy MLL1. Wyniki, które tutaj opisujemy zapewniają mechanistyczny wgląd w unikalną regulację metylotransferazy MLL1 MLL1. Sugeruje to, że zarówno Ash2L/RbBP5, jak i domena SET MLL1 nawiązują bezpośrednie kontakty z substratami i przyczyniają się do metylacji H3 K4. kontakty z substratami i przyczyniają się do tworzenia wspólnego centrum katalitycznego. centrum katalitycznego. Biorąc pod uwagę wspólną konfigurację rdzenia wśród wszystkich HMT z rodziny MLL/SET1 HMT z rodziny MLL/SET1, interesujące będzie sprawdzenie, czy opisany tutaj mechanizm można być uogólniony na innych członków rodziny MLL/SET1 w przyszłości. --- Organizacja chromatyny w struktury wyższego rzędu wpływa na funkcję chromosomu i epigenetyczną regulację genów. i epigenetyczną regulację genów. Chromatyna wyższego rzędu została przez kowalencyjną modyfikację ogonów histonów i późniejsze ustanowienie subdomen chromosomalnych przez modyfikatory niehistonowe. późniejsze ustanowienie subdomen chromosomalnych przez niehistonowe czynniki modyfikujące czynniki. Tutaj pokazujemy, że ludzki SUV39H1 i mysi Suv39h1 - ssaki homologi Drosophila Su(var)3-9 i Schizosaccharomyces pombe clr4 - kodują metylotransferazy specyficzne dla histonu H3, które selektywnie metylują lizynę 9 końca aminowego histonu H3 in vitro. Zmapowaliśmy motyw katalityczny do ewolucyjnie konserwowanej domeny SET, która wymaga sąsiadujących regionów regionów bogatych w cysteinę do nadania aktywności metylotransferazy histonowej. Metylacja lizyny 9 zakłóca fosforylację seryny 10, ale ma na nią również wpływ Na metylację lizyny 9 wpływa fosforylacja seryny 10, ale wpływają na nią również istniejące wcześniej modyfikacje na aminowym końcu H3. SUV39H1 lub zaburzona aktywność Suv39h modulują fosforylację seryny H3 10 w natywnej chromatynie i indukują nieprawidłowe podziały mitotyczne. Nasze dane ujawniają funkcjonalną współzależność specyficznych dla miejsca modyfikacji ogona H3 i sugerują dynamiczny mechanizm regulacji chromatyny wyższego rzędu. --- Domena SET zawiera centrum katalityczne metylotransferaz lizyny, które celują w N-końcowe ogony histonów i regulują funkcję chromatyny. Tutaj my strukturę białka SET7/9 w nieobecności i obecności jego produktu kofaktora kofaktora, S-adenozylo-L-homocysteiny (AdoHcy). Węzeł w domenie SET pomaga utworzyć miejsce aktywne metylotransferazy, w którym wiąże się AdoHcy i prawdopodobnie zachodzi metylacja lizyny. Strukturalne porównanie sekwencji sekwencji w obrębie rodziny białek SET sugeruje, że podstruktura węzła i środowisko miejsca aktywnego i środowisko miejsca aktywnego są zachowanymi cechami domeny SET. --- Kowalencyjne modyfikacje ogonów histonów odgrywają ważną rolę w transkrypcji genów transkrypcji i wyciszaniu genów. Niedawno zidentyfikowaliśmy białko ERG (ets -related gene) gene) z domeną SET (suppressor of variegation, enhancer of zest i trithorax) (ESET), które wykazuje aktywność metylotransferazy specyficznej dla histonu H3-specyficznej metylotransferazy. W niniejszym badaniu zbadaliśmy interakcję ESET z innymi czynnikami remodelującymi chromatynę. Wykazaliśmy, że ESET metylotransferaza histonowa wiąże się z deacetylazą histonową 1 (HDAC1) i HDAC2, a także, że ESET oddziałuje również z korepresorami transkrypcji mSin3A i mSin3B. Analiza delecji ESET ujawnia, że region N-końcowy zawierający domenę tudor jest odpowiedzialny za interakcję z mSin3A/B i asocjację z HDAC1/2, a skrócenie ESET zwiększa jego wiązanie do mSin3. Po związaniu z promotorem ESET hamuje transkrypcję reportera lucyferazy genu reporterowego lucyferazy. Ta represja przez ESET jest niezależna od jego aktywność metylotransferazy histonowej, ale koreluje z jego wiązaniem z ko-represorami mSin3. Ponadto, represja może być częściowo odwrócona przez leczenie inhibitorem HDAC trichostatyną A. Podsumowując, te dane sugerują, że metylotransferaza histonowa ESET może tworzyć duże, wielobiałkowe kompleksy kompleks(y) z ko-represorami mSin3A/B i HDAC1/2, które uczestniczą w wielu ścieżkach represji transkrypcji. --- Białko białaczki linii mieszanej MLL1 jest regulatorem transkrypcji o odgrywa istotną rolę we wczesnym rozwoju i hematopoezie. Funkcja biologiczna MLL1 jest pośredniczona przez aktywność metylotransferazy histonów H3K4 w domenie karboksylowo-końcowej domeny SET. Określiliśmy strukturę krystaliczną domeny MLL1 w kompleksie z produktem kofaktora AdoHcy i peptydem histonu H3 peptydem. Struktura ta wskazuje, że w celu utworzenia dobrze uporządkowanego miejsca aktywnego miejsce, wysoce zmienny, ale istotny składnik domeny SET musi zostać zmieniona. Aby przetestować ten pomysł, porównaliśmy wpływ dodania członków kompleksu MLL na aktywność metylotransferazy i wykazaliśmy, że zarówno RbBP5, jak i Ash2L ale nie Wdr5 stymulują aktywność. Dodatkowo, określiliśmy wpływ modyfikacji potranslacyjnych na resztach histonu H3 poniżej i powyżej od docelowej lizyny i zapewniliśmy strukturalne wyjaśnienie, dlaczego fosforylacja H3T3 fosforylacja i acetylacja H3K9 regulują aktywność. --- Procesywny i dystrybucyjny transfer grup metylowych został oceniony dla grochu metylotransferazy dużej podjednostki Rubisco, białkowej metylotransferazy lizyny domeny SET katalizującej tworzenie trimetylolizyny-14 w dużej podjednostce Rubisco. podjednostce Rubisco. Katalitycznie kompetentne kompleksy pomiędzy unieruchomioną unieruchomioną formą des(metylo) Rubisco i metylotransferazą dużej podjednostki Rubisco były wykorzystano do zademonstrowania uwalniania enzymu, które było współbieżne i zależne od powstawaniem trimetylolizyny. Katalityczne stałe szybkości określone dla tworzenia trimetylolizyny były znacznie niższe (około 10-krotnie) niż stałe szybkości wyznaczone dla całkowitej inkorporacji radioznacznika z [3H-metylo]-S-adenozylometioniny. Wykresy prędkości podwójnie odwrotnej w warunkach katalitycznych faworyzujących monometylolizynę wskazywały na losowy lub uporządkowany mechanizm reakcji. mechanizm reakcji, podczas gdy warunki sprzyjające trimetylolizynie sugerowały hybrydowy mechanizm mechanizm ping-pong. Wyniki te zostały porównane z wykresami prędkości podwójnie odwrotnej i analizami produktów uzyskanymi dla HsSET7/9 (monometylotransferazy) i SpCLR4 (dimetylotransferaza) i sugerują zdolność predykcyjną dla pojedynczych i wielokrotnych transferów grup metylowych przez domenę SET białka lizyny przez metylotransferazy lizyny białek domeny SET. Zaproponowano model dla metylotransferaz lizyny białek domeny SET, w którym początkowe wiązanie substratu polipeptydowego i S-adenozylometioniny jest losowe, z wiązaniem polipeptydu, po którym następuje deprotonacja po którym następuje deprotonacja epsilon-aminy docelowej reszty lizylowej i późniejsza metylacja. a następnie metylacja. Po przeniesieniu grupy metylowej, S-adenozylohomocysteina i monometylowany polipeptyd dysocjują od monometylotransferazy, ale di- i trimetylotransferazy rozpoczynają kolejny i katalitycznie obowiązkową deprotonizację związanych z enzymem metylowanych półproduktów lizylowych, które wraz z wiązaniem które wraz z wiązaniem i uwalnianiem S-adenozylometioniny i S-adenozylohomocysteiny objawia się jako hybrydowa reakcja podobna do ping-ponga mechanizm. --- Białko ESET (zwane również SETDB1) zawiera N-końcową domenę tudor, która pośredniczy w interakcjach białko-białko i C-końcową domenę SET, która katalizuje metylację histonu H3 przy lizynie 9. Donosimy tutaj, że białko ESET jest przejściowo podwyższone w przedhipertroficznych chondrocytach u nowonarodzonych myszy. Aby zbadać in vivo wpływ ESET na różnicowanie chondrocytów, my myszy, aby specyficznie wyeliminować katalityczną domenę SET białka ESET tylko w komórkach mezenchymalnych. Taka delecja genu ESET powodowała przyspieszenie przerostu chondrocytów zarówno u zarodków, jak i młodych zwierząt, uszczuplając chondrocyty, które w przeciwnym razie byłyby dostępne do tworzenia płytek nasadowych dla endochondralnego wzrostu kości. Myszy z niedoborem ESET charakteryzują się zatem wadliwym wzrostem kości długich i tworzeniem kości beleczkowej. Aby zrozumieć mechanizm regulacji chondrocytów przez ESET, przeprowadziliśmy eksperymenty koekspresji eksperymenty koekspresji i odkryliśmy, że ESET wiąże się z deacetylazą histonową deacetylazą 4 w celu wiązania i hamowania aktywności Runx2, czynnika transkrypcyjnego promującego hipertrofię. czynnika transkrypcyjnego. Represja transaktywacji genów za pośrednictwem Runx2 przez ESET jest zależna od jego aktywności metylotransferazy H3-K9, jak również związanej z nią aktywności deacetylazy aktywności deacetylazy histonów. Ponadto, nokaut ESET jest związany z represją genu jeża indyjskiego w chondrocytach przed- i wczesnohipertroficznych. Łącznie wyniki te dostarczają wyraźnych dowodów na to, że ESET kontroluje przerostowe różnicowanie chondrocytów płytki wzrostowej i kostnienie endochondralne podczas embriogenezy i rozwoju postnatalnego. --- Wcześniej zidentyfikowaliśmy kompleks Set1A u ssaków, analogiczny do kompleksu drożdżowego Set1/COMPASS metylotransferazy histonów H3-Lys4 (Lee, J.-H., and Skalnik, D. G. (2005) J. Biol. Chem. 280, 41725-41731). Analiza bazy danych wskazuje, że ludzkie białko Set1A ma 39% identyczności z niescharakteryzowaną domeną SET KIAA1076, dalej oznaczanym jako Set1B. Immunoprecypitacja i spektrometria ujawniają, że Set1B wiąże się z kompleksem o masie około 450 kDa który zawiera wszystkie pięć niekatalitycznych składników kompleksu Set1A, w tym CFP1, Rbbp5, Ash2, Wdr5 i Wdr82. Dane te ujawniają dwa ludzkie kompleksy białkowe które różnią się jedynie tożsamością katalitycznej metylotransferazy histonów katalitycznej metylotransferazy histonów. Testy in vitro pokazują, że kompleks Set1B jest metylotransferazą histonów, która wytwarza trimetylowany histon H3 w Lys(4). Zarówno Set1A i Set1B są szeroko wyrażane. Indukowalna ekspresja karboksylowego końca karboksylowego Set1A lub Set1B zmniejsza poziomy w stanie stacjonarnym zarówno endogennego białka Set1A i Set1B, ale nie zmienia ekspresji niekatalitycznych składników niekatalitycznych składników kompleksów Set1. 123-aminokwasowy fragment przed domeną Set1A SET jest niezbędny do interakcji z CFP1, Ash2, Rbbp5 i Wdr5. Ta domena białkowa jest również wymagana do pośredniczenia w sprzężeniu zwrotnym hamowania ekspresji Set1A i Set1B, co jest konsekwencją zmniejszonej stabilności Set1A i Set1B, gdy nie są związane z kompleksem metylotransferazy kompleksem. Mikroskopia konfokalna ujawnia, że Set1A i Set1B lokalizują się do w dużej mierze nienakładający się zestaw euchromatycznych plamek jądrowych, co sugeruje, że Set1A i Set1B wiążą się z unikalnym zestawem genów docelowych, a tym samym tworzą nieredundantny wkład w epigenetyczną kontrolę struktury chromatyny i ekspresji genów. --- Domena SET, po raz pierwszy zidentyfikowana i nazwana na cześć białek kodowanych przez trzy geny Drosophila trzech genów Drosophila [Su(var)3-9, E(z) i Trithorax], jest rozpoznawana jako dla metylotransferaz histonowych, które są zaangażowane w procesy epigenetyczne. procesy epigenetyczne. Rodzina białek domeny SET SUV39H metyluje specyficznie resztę lizyny 9 histonu. resztę lizyny 9 histonu H3, tworząc kod dla wyciszania genów. Ta rodzina białek zawiera na swoich końcach C unikalną domenę katalityczną składającą się z domen pre-SET, SET i post-SET. Wyszukiwanie oparte na homologii sekwencji zidentyfikowało 15 białek Arabidopsis, 14 kukurydzy i 12 ryżu, które można przypisać do rodziny SUV39H. Te wysokie liczby w roślinach wyraźnie kontrastują z sytuacją u zwierząt, u których każdy gatunek wydaje się zawierać tylko dwa do trzech białek z tej rodziny. białek z tej rodziny. Nasze analizy filogenetyczne ujawniły, że białka roślinne można podzielić na siedem grup ortologicznych. Reprezentatywnych członków każdej grupy można znaleźć u pojedynczych gatunków roślin, co sugeruje, że członkowie różnych grup są ewolucyjnie konserwowane w celu pełnienia określonych funkcji. --- Aberracje genu metylotransferazy histonowej NSD3/WHSC1L1 obserwuje się w białaczce i raku piersi i płuc. oraz w raku piersi i płuc, co sugeruje, że NSD3 jest zaangażowany w kancerogenezę. kancerogenezie. W tym badaniu zbadaliśmy w ludzkich komórkach raka piersi izoformę NSD3L która zawiera katalityczną domenę SET metylotransferazy histonów. siRNA NSD3L, a następnie analizę mikromacierzy w całym genomie zidentyfikowano geny regulowane przez NSD3L, które mogą być funkcjonalnie powiązane z komórkowymi szlakami sygnałowymi, takimi jak wzrost komórek, cykl komórkowy, ruchliwość komórek, transkrypcja i apoptoza. Szczególnie regulowane w górę geny to regulatory cyklu komórkowego regulatorami cyklu komórkowego E2F2 i Arl2. Zgodnie z funkcją NSD3L w cyklu komórkowym regulacja NSD3L spowodowała wzrost liczby komórek w fazach cyklu komórkowego S i fazie cyklu komórkowego G2/M. Co więcej, zubożenie NSD3L zwiększyło inwazyjność komórek raka piersi MDA-MB-231, co wskazuje, że NSD3L normalnie ogranicza potencjał przerzutowy komórek. Łącznie przedstawione dane wskazują że NSD3L jest kandydatem na supresor nowotworu. --- Enzymy z klasy metylotransferaz histonowych (HMT)(1), które metylują reszty lizyny histonów lub białek zawierają konserwowany rdzeń katalityczny określany jako domena SET który dzieli homologię sekwencji z niezależnie opisanym motywem sekwencji, domeną motywem sekwencyjnym, domeną PR. Nienaruszona sekwencja PR lub SET jest wymagana dla funkcji funkcji supresji nowotworów, ale pozostaje niejasne, czy to aktywność metylotransferazy histonów aktywność metylotransferazy histonów, która leży u podstaw supresji nowotworów. Teraz pokazujemy, że supresor nowotworów RIZ1 (PRDM2) metyluje histon H3 na lizynie 9, a aktywność ta jest zmniejszona przez mutacje w sekwencji aktywność jest zmniejszona przez mutacje w domenie PR występujące w ludzkich nowotworach. Również, S-adenozylohomocysteina lub niedobór donora metylu hamuje RIZ1 i inne aktywności metylacji H3 aktywność metylacji lizyny 9. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że aktywność metylacji lizyny 9 H3 aktywność metylacji lizyny 9 domeny PR/SET ma funkcje supresji nowotworu i mogą leżeć u podstaw kancerogenezy związanej z dietetycznym niedoborem metylo-dawców w diecie. --- W tym wydaniu Molecular Cell, Zhang i wsp. donoszą o strukturze trójskładnikowego kompleksu pomiędzy domeną SET metylotransferazy histonowej DIM-5, jej kofaktorem, i peptydem histonu H3. Wgląd uzyskany dzięki analizie kluczowego aminokwasu zapewnia ekscytującą możliwość przeanalizowania możliwego znaczenia funkcjonalnego mono-, di- i trimetylacji histonowych reszt lizyny in vivo, które będą uzupełni istniejące podejścia w dążeniu do złamania kodu metylacji histonów metylacji histonów. --- Uważa się, że metylacja reszt lizyny w N-końcowych ogonach histonów stanowi ważny składnik mechanizmu regulującego strukturę chromatyny strukturę chromatyny. Ewolucyjnie konserwowana domena SET występuje w większości znanych białek posiadających aktywność metylotransferazy lizyny histonowej. Przedstawiamy tutaj strukturę krystaliczną dużego fragmentu ludzkiego SET7/9, który zawiera N-końcową domenę domenę arkusza beta, jak również konserwowaną domenę SET. Mutageneza identyfikuje dwie reszty w C-końcu białka, które wydają się niezbędne dla aktywności katalitycznej wobec lizyny-4 histonu H3. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób kofaktor AdoMet wiąże się z tą domeną i przedstawiamy dane biochemiczne potwierdzające rolę niezmiennych reszt w katalizie, wiązaniu AdoMet i interakcjach z substratem peptydowym. --- Metylacja reszt lizyny histonów odgrywa kluczową rolę w regulacji struktury chromatyny i ekspresji genów. regulacji struktury chromatyny i ekspresji genów. Tutaj przedstawiamy dwie struktury krystaliczne SET7/9, metylotransferazy histonów (HMTase), która przenosi grupy metylowe do Lys4 histonu H3, w kompleksie z S-adenozylo-L-metioniną (AdoMet) oznaczoną w rozdzielczości 1,7 i 2,3 A. Struktury Struktury ujawniają miejsce aktywne składające się z: (i) kieszeni wiążącej między domeną SET i helisą c-SET, w której wiąże się cząsteczka AdoMet w nietypowej konformacji (ii) wąskiego kanału specyficznego dla substratu, do którego dostęp mają tylko niemetylowane reszty lizyny oraz (iii) katalityczna reszta tyrozyny. Grupa metylowa AdoMet jest skierowana do wąskiego kanału, gdzie substrat lizyny wchodzi z przeciwnej strony. z przeciwnej strony. Wykazaliśmy, że SET7/9 może przenosić dwie, ale nie trzy grupy metylowe do niezmodyfikowanej lizyny 4 H3 bez dysocjacji substratu. The niezwykłe cechy HMTazy zawierającej domenę SET rozróżniają między niezmetylowaną i metylowaną lizyną substratu, a miejscami metylacji ogona histonu H3. --- Metylacja niektórych reszt lizyny w N-końcowych ogonach rdzeniowych białek histonowych w nukleosomie w nukleosomach ma fundamentalne znaczenie w regulacji struktury chromatyny i ekspresji genów. struktury chromatyny i ekspresji genów. Taka modyfikacja histonów jest katalizowana przez białkowe metylotransferazy lizyny (PKMT). PKMT zawierają konserwowaną domenę SET w prawie wszystkich przypadkach i mogą przenosić od jednej do trzech grup metylowych od S-adenozylo-L-metioniny (AdoMet) do grupy epsilon-aminowej docelowej reszty lizyny. reszty lizyny. Tutaj, mechanika kwantowa / mechanika molekularna dynamika molekularna i symulacje wolnej energii są przeprowadzane na ludzkiej PKMT SET7/9 i jej mutantach w celu zrozumienia dwóch nierozstrzygniętych kwestii dotyczących reakcji katalizowanych przez PKMT: mechanizmu mechanizm deprotonacji dodatnio naładowanej metylo-lizyny (lizyny) oraz pochodzenie specyficzności produktu. Wyniki symulacji sugerują, że Tyr-335 (absolutnie konserwowana reszta w PKMT) może odgrywać rolę jako ogólną bazę dla deprotonacji po dysocjacji AdoHcy (S-adenozylo-L-homocysteiny) i przed związaniem AdoMet. Wykazano, że zmiany konformacyjne mogą doprowadzić Y335 do docelowej metylo-lizyny (lizyny) w celu abstrakcji protonu. Mechanizm ten wyjaśnia, dlaczego transfer metylu może być katalizowany przez PKMT w sposób procesowy. Profile energii swobodnej dla przeniesienia metylu są raportowane i analizowane dla typu dzikiego i niektórych mutantów (Y305F i Y335F) oraz omówiono interakcje w miejscu aktywnym, które mają znaczenie dla funkcji enzymu. enzymu. Wyniki symulacji dostarczają ważnych wgląd w proces katalityczny i prowadzą do lepszego zrozumienia obserwacji eksperymentalnych obserwacji eksperymentalnych dotyczących pochodzenia specyficzności produktu dla PKMT. --- Epigenetyczne modyfikacje histonów regulują ekspresję genów i strukturę chromatyny. strukturę. Tutaj pokazujemy, że Meisetz (czynnik indukowany mejozą zawierający domenę PR/SET domenę i motyw palca cynkowego) jest metylotransferazą histonów, która jest ważna dla progresji wczesnej profazy mejotycznej. Transkrypty Meisetz są wykrywane tylko w komórkach zarodkowych wchodzących w profazę mejotyczną w żeńskich gonadach płodowych i w postnatalnym jądrze. Warto zauważyć, że Meisetz ma aktywność katalityczną dla trimetylacji, ale nie mono- lub dimetylacji lizyny 4 histonu H3 oraz aktywność transaktywacji, która zależy od jego metylacji. która zależy od jego aktywności metylacyjnej. Myszy, u których gen Meisetz wykazują bezpłodność u obu płci z powodu poważnego upośledzenia szlaku naprawy szlaku naprawy pęknięć dwuniciowych, wadliwego parowania homologicznych chromosomów chromosomów i upośledzonego tworzenia ciałek płciowych. W jądrze z niedoborem Meisetz, trimetylacja lizyny 4 histonu H3 jest osłabiona, a transkrypcja genów mejotycznych jest zmieniona. transkrypcja genów mejotycznych jest zmieniona. Odkrycia te wskazują, że specyficzne dla mejozy epigenetyczne u ssaków są kluczowe dla prawidłowego przebiegu mejozy. --- Metylacja lizyny 9 (K9) w N-końcowym ogonie histonu H3 (H3) w chromatynie jest związana z transkrypcyjnie wyciszonymi genami. w chromatynie jest związana z transkrypcyjnie wyciszonymi genami i jest mediowana przez metylotransferazy histonów. Murine G9a jest 1263 aminokwasową metylotransferazą H3-K9 która posiada charakterystyczną domenę SET i powtórzenia ANK. W W tym artykule wykorzystaliśmy serię delecji znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym aby zidentyfikować dwa sygnały lokalizacji jądrowej (NLS), pierwszy NLS osadzony między aminokwasami 24 i 109, a drugi między aminokwasami 394 i 401 mysiego G9a. Nasze dane pokazują, że zarówno długie, jak i krótkie izoformy G9a były zdolne do wejścia do jądra w celu metylacji chromatyny. Pełna długość lub izoformy G9a o pełnej długości lub pozbawione N-końca były również katalitycznie aktywnymi enzymami, które metylowane rekombinowane H3 lub syntetyczne peptydy reprezentujące N-końcowy ogon H3. Reakcje metylacji in vitro z użyciem peptydów ogona N-końcowego skutkowały trójmetylacją K3. tri-metylację K9, która pozostała procesywna, nawet w enzymach G9a pozbawionych regionu N-końca przez delecję. Koekspresja G9a i H3 skutkowała di- i tri-metylacją K9. i tri-metylację H3-K9, podczas gdy knockdown G9a w komórkach HeLa za pośrednictwem siRNA spowodowało zmniejszenie globalnej di- i tri-metylacji H3-K9. A rekombinowany enzym delecyjny połączony z białkiem wiążącym maltozę (MBP-G9aDelta634) wykorzystano do analizy kinetyki w stanie stacjonarnym z różnymi substratami substratami i porównano z G9a o pełnej długości (G9aFL). Liczba obrotów MBP-G9aDelta634 dla różnych substratów była około 3-krotnie mniejsza w porównaniu do z G9aFL, podczas gdy ich stałe Michaelisa (K(m)) dla rekombinowanego H3 były podobne. K(AdoMet)m dla MBP-G9aDelta634 wynosiło około 2,3-2,65 mikroM z różnymi substratami. Wydajność katalityczna (kcat/K(m)) dla obu MBP-G9aDelta634 i G9aFL były podobne, co sugeruje, że N-koniec nie jest niezbędny do katalizy. Ponadto mutacja konserwowanych aminokwasów R1097A, W1103A, Y1120A, Y1138A i R1162A lub wiążącego metal C1168A w regionie katalitycznym w regionie katalitycznym, skutkowało katalitycznie upośledzonymi enzymami, potwierdzając w ten sposób zaangażowanie C-końca G9a w katalizę. Tak więc, różne domeny modulują celowanie jądrowe i funkcje katalityczne G9a. --- Dot1 jest ewolucyjnie konserwowaną metylotransferazą histonową, która metyluje lizynę-79 histonu H3 w domenie rdzeniowej. W przeciwieństwie do innych metylotransferaz histonowych, Dot1 nie zawiera domeny SET i specyficznie metyluje nukleosomalny histon H3. Rozwiązaliśmy strukturę o rozdzielczości 2,5 A domeny katalitycznej ludzkiej Dot1, hDOT1L, w kompleksie z S-adenozylo-L-metioniną (SAM). Struktura ujawnia unikalną organizację głównie alfa-helikalnej domeny N-końcowej i centralnej otwartej struktury alfa/beta, miejsce aktywne składające się z kieszeni wiążącej SAM i potencjalnego kanału wiążącego lizynę kanał wiążący lizynę. Pokazujemy również, że elastyczny, dodatnio naładowany region na C domeny katalitycznej jest krytyczny dla wiązania nukleosomów i aktywności enzymatycznej. aktywności enzymatycznej. Te analizy strukturalne i biochemiczne w połączeniu z modelowaniem molekularnym modelowaniem molekularnym, zapewniają mechanistyczny wgląd w mechanizm katalityczny i nukleosomalną specyficzność białek Dot1. --- Metylacja lizyny 9 histonu H3 (H3K9) jest głównym składnikiem regulacji genów i organizacji chromatyny. i organizacji chromatyny. SUV39H1 metyluje H3K9 w pericentrycznym regionie heterochromatyny heterochromatyny i uczestniczy w utrzymaniu stabilności genomu. W tym badaniu rekombinowany oczyszczony SUV39H1 jest używany do badania specyficzności substratowej i analizy kinetycznej w stanie ustalonym z peptydami reprezentującymi nie- lub dimetylowany ogon lizyny 9 histonu H3 lub rekombinowany ludzki histon H3 (rH3) o pełnej długości. Rekombinowany SUV39H1 metylował swój substrat poprzez mechanizm nieprocesowy. Wiązanie peptydu lub AdoMet najpierw z enzymem tworzyło katalitycznie katalitycznie kompetentny kompleks binarny. Badania inhibicji produktu z SUV39H1 wykazały, że S-adenozylo-l-homocysteina jest kompetycyjnym inhibitorem S-adenozylo-l-metioniny i mieszanym inhibitorem peptydu substratowego. Podobnie, metylowany peptyd był konkurencyjnym inhibitorem niemetylowanego peptydu i mieszanym inhibitorem AdoMet, sugerując losowy mechanizm w reakcji bi-bi dla rekombinowanego SUV39H1, w której każdy substrat może najpierw związać się z enzymem i każdy produkt może się najpierw uwolnić. Liczba obrotów (k(cat)) dla peptydu ogonowego H3 i rH3 były porównywalne (odpowiednio 12 i 8 h(-)(1)) w porównaniu z wartością 1,5 h(-)(1) dla identycznego dimetylowanego peptydu ogona lizyny 9 H3. Stała Michaelisa Stała Michaelisa dla metylowanego peptydu (K(m)(pep)) była 13-krotnie niższa w porównaniu do niemetylowanego peptydu. Stałe Michaelisa dla AdoMet (K(m)(AdoMet)) wynosiły odpowiednio 12 i 6 mikroM dla substratu niemetylowanego peptydu i rH3. rH3, odpowiednio. Zmniejszenie poziomu metylacji zaobserwowano przy wysokich stężeniach rH3. stężeniach rH3, co sugeruje hamowanie substratu. Usunięcie chromodomeny chromodomeny lub mutacja punktowa konserwowanych aminokwasów, W64A lub W67A, w SUV39H1. SUV39H1 upośledzały aktywność enzymu pomimo obecności nienaruszonej katalitycznej domeny SET domeny katalitycznej. Zatem SUV39H1 wykorzystuje zarówno chromodomenę, jak i domenę SET do katalizy. katalizy. --- Geny domeny SET zostały zidentyfikowane w wielu genomach bakteryjnych na podstawie podobieństwo do domen SET eukariotycznych metylotransferaz histonowych. W tym przypadku gen domeny SET Chlamydophila pneumoniae został wyjaśniony jako przypadkowo z genami hctA i hctB kodującymi chlamydiowe białka histonowe podobne do H1, Hc1 i Hc2, odpowiednio. Białko z domeną SET (cpnSET) jest zlokalizowane w komórkach komórkach chlamydialnych i oddziałuje z Hc1 i Hc2 poprzez C-końcową domenę SET domenę. Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z zachowania miejsc katalitycznych w cpnSET, działa on jako metylotransferaza białkowa do mysich histonów H3 i Hc1. Jednakże, niewiele jest niewiele wiadomo na temat metylacji białek w molekularnej patogenezie zakażenia chlamydiami. cpnSET może odgrywać ważną rolę w dojrzewaniu komórek chlamydialnych ze względu na modyfikację chlamydiów. modyfikacji chlamydiowych białek histonowych podobnych do H1. --- Wyciszanie genów Polycomb wymaga aktywności metylotransferazy histonowej kompleksu represyjnego Polycomb 2 (PRC2), która metyluje lizynę 27 histonu H3. Informacje na temat działania PRC2 są ograniczone przez brak danych strukturalnych na temat podjednostki katalitycznej podjednostki katalitycznej, Enhancer of zeste (E(Z)), oraz niedostateczną liczbą mutantów E(z) które zmieniają jego domenę SET. Tutaj analizujemy allele missense Drosophila E(z), wybrane do badań molekularnych ze względu na ich dominujące efekty genetyczne. efekty genetyczne. Cztery allele missense identyfikują kluczowe reszty domeny SET E(Z), a piąty znajduje się w sąsiedniej domenie C a piąty znajduje się w sąsiedniej domenie CXC. Analiza zmutowanych kompleksów PRC2 in vitro i metylacji H3-K27 in vivo pokazuje, że każda mutacja domeny SET zaburza metylotransferazę histonów PRC2. W oparciu o znane struktury domeny SET, mutacje prawdopodobnie wpływają albo na kieszeń wiążącą lizynę-substrat, albo na miejsce wiązania dawcy metylu adenozylometioniny lub krytyczną tyrozynę przewidywanej do interakcji z grupą epsilon-aminową lizyny substratu. Natomiast mutant CXC zachowuje aktywność katalityczną, specyficzność Lys-27 i zdolność trimetylacji. zdolność trimetylacji. Analiza delecji ujawnia również wymóg funkcjonalny dla konserwowanej domeny E (Z) N-końcowej do CXC i SET. Wyniki te identyfikują krytyczne reszty domeny SET potrzebne do funkcjonowania enzymu PRC2, a także podkreślają funkcjonalny wkład spoza domeny SET.
Jaka jest charakterystyczna domena metylotransferaz histonowych?
Domena SET (suppressor of variegation, enhancer of zest and trithorax)