Cas9, kierowana przez RNA endonukleaza DNA występująca w klastrowych systemach odpornościowych bakterii krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR), jest wszechstronnym narzędziem do edycji genomu, regulacji transkrypcji i obrazowania komórkowego. zastosowań. Struktury Streptococcus pyogenes Cas9 samego lub związanego z jednoprzewodowym RNA (sgRNA) i docelowym DNA ujawniły dwustronną architekturę białka która ulega poważnym zmianom konformacyjnym po związaniu z RNA i DNA. Aby zbadać molekularne determinanty i znaczenie rearanżacji między płatami dla rozpoznawania i rozszczepiania celu, zaprojektowaliśmy enzym split-Cas9 w którym płat nukleazy i płat α-helikalny są wyrażane jako oddzielne polipeptydy. polipeptydy. Chociaż płaty nie oddziałują ze sobą samodzielnie, sgRNA rekrutuje je do trójskładnikowego kompleksu, który odtwarza aktywność pełnej długości Cas9 i katalizuje specyficzne dla miejsca rozszczepienie DNA. Zastosowanie zmodyfikowanego sgRNA znosi aktywność split-Cas9 poprzez zapobieganie dimeryzacji, pozwalając na rozwój indukowalnego systemu dimeryzacji. Proponujemy, aby split-Cas9 mógł działać jako wysoce regulowana platforma do zastosowań inżynierii genomowej. --- Prokariotyczne systemy CRISPR-Cas typu II można zaadaptować w celu umożliwienia ukierunkowanych modyfikacji genomu u wielu eukariontów. modyfikacje genomu u wielu eukariontów. Tutaj zaprojektowaliśmy ten system, aby umożliwić regulację genomu kierowaną przez RNA w ludzkich komórkach poprzez wiązanie domen aktywacji transkrypcji domen aktywacji transkrypcji bezpośrednio do białka Cas9 pozbawionego nukleazy lub do zmodyfikowanego aptamerem pojedynczego RNA (sgRNA). Wykorzystując tę funkcjonalność opracowaliśmy test oparty na aktywacji transkrypcyjnej w celu określenia krajobrazu wiązania kompleksów sgRNA:Cas9 i porównaliśmy go z aktywnością aktywnością efektorów podobnych do aktywatorów transkrypcji (TAL). Nasze wyniki ujawniają że profile specyficzności są zależne od sgRNA oraz że kompleksy sgRNA:Cas9 i 18-merowe efektory TAL mogą potencjalnie tolerować odpowiednio 1-3 i 1-2 niedopasowania docelowe, odpowiednio. Poprzez inżynierię wymogu kooperatywności poprzez offset w celu edycji genomu lub poprzez wiele synergistycznych sgRNA dla solidnej aktywacji transkrypcji aktywacji transkrypcji, sugerujemy metody łagodzenia zjawisk poza celem. Nasze wyniki rozszerzają wszechstronność narzędzia sgRNA:Cas9 i podkreślają krytyczną potrzebę krytyczną potrzebę zaprojektowania lepszej specyficzności. --- CRISPR-Cas koduje adaptacyjny układ odpornościowy, który broni prokariotów przed zakaźnymi wirusami i plazmidami. W odporności pośredniczą nukleazy Cas, które wykorzystują małe prowadnice RNA (crRNA), aby określić miejsce cięcia w genomie inwazyjnych kwasów nukleinowych. W systemach CRISPR-Cas typu II, aktywność cięcia DNA jest wykonywane przez pojedynczy enzym Cas9 prowadzony przez dupleks RNA. Używając syntetycznych pojedynczych prowadnic RNA, Cas9 może być przeprogramowany do tworzenia specyficznych dwuniciowego DNA w genomach różnych organizmów, od komórek ludzkich po bakterie. od komórek ludzkich po bakterie, a tym samym stanowi potężne narzędzie inżynierii genetycznej. inżynierii genetycznej. Tutaj opisujemy ostatnie postępy w naszym rozumieniu odporności typu II CRISPR-Cas i jak te badania doprowadziły do rewolucyjnych zastosowań edycji genomu. zastosowań. --- System klastrowych regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/Cas9 stał się potężnym i precyzyjnym narzędziem do ukierunkowanej modyfikacji genów (np. nokaut genów i zastępowanie genów) w wielu organizmach eukariotycznych. Pierwsze próby zastosowania tej technologii w modelu jednokomórkowej algi, Chlamydomonas reinhardtii, nie udało się uzyskać komórek zawierających edytowane geny. Aby określić, czy geny Cas9 i pojedynczego RNA (sgRNA) były funkcjonalne w C. reinhardtii, przetestowaliśmy zdolność zoptymalizowanego kodonowo genu Cas9 wraz z jednym z czterech różnych sgRNA. z czterech różnych sgRNA do powodowania ukierunkowanych zaburzeń genów w okresie 24 godzin bezpośrednio po transformacji. Wszystkie trzy egzogennie dostarczone geny jak również endogenny gen FKB12 (wrażliwość na rapamycynę) C. reinhardtii wykazywały odmienne modyfikacje miejsca docelowego za pośrednictwem Cas9/sgRNA, co określone przez sekwencjonowanie DNA sklonowanych amplikonów PCR regionu miejsca docelowego. Sukces w przejściowej ekspresji genów Cas9 i sgRNA kontrastował z odzyskaniem tylko jednej kolonii odpornej na rapamycynę, posiadającej odpowiednio zmodyfikowane miejsce docelowe FKB12 w 16 niezależnych eksperymentach transformacji obejmujących >10(9) komórek. Niepowodzenie w odzyskaniu transformantów z nienaruszonymi lub lub wyrażonymi genami Cas9 po transformacji samym genem Cas9 (lub nawet z genem kodującym Cas9 pozbawionym aktywności nukleazy) dostarczyło silnych sugestywne dowody na toksyczność Cas9, gdy Cas9 jest wytwarzany konstytutywnie w C. reinhardtii. Obecne wyniki dostarczają przekonujących dowodów na to, że geny Cas9 i sgRNA funkcjonują prawidłowo w C. reinhardtii, powodując ukierunkowane modyfikacje genów i wskazują na potrzebę skupienia się na opracowaniu metod prawidłowego hamowania produkcji i/lub aktywności Cas9 po edycji genów. --- Modyfikacja genetyczna, w tym hodowla roślin, była szeroko stosowana w celu poprawy plonów i jakości, a także w celu zwiększenia odporności na choroby. Ukierunkowana Oczekuje się, że ukierunkowana inżynieria genomu znacząco przyczyni się do przyszłego ulepszania odmian. i technologie edycji genomu wykorzystujące nukleazy z palcem cynkowym (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) i klasteryzowane regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/Cas9/pojedynczego RNA prowadzącego (sgRNA) zostały już z powodzeniem wykorzystane do genetycznej modyfikacji roślin. Jednak do tej pory nie zgłoszono zastosowania żadnej z obecnych metod edycji genomu w słodkiej pomarańczy. w słodkiej pomarańczy, ważnej roślinie owocowej. W niniejszym badaniu po raz pierwszy opracowaliśmy nowe narzędzie, agroinfiltrację wspomaganą przez Xcc, w celu zwiększenia przejściowej ekspresji białek w liściach słodkiej pomarańczy. Następnie z powodzeniem zastosowaliśmy agroinfiltrację wspomaganą przez Xcc w celu dostarczenia Cas9 wraz z syntetycznym sgRNA celującym w gen CsPDS, do słodkiej pomarańczy. Sekwencjonowanie DNA potwierdziło, że gen CsPDS został zmutowany w miejscu docelowym w traktowanych liściach słodkiej pomarańczy. liściach pomarańczy. Wskaźnik mutacji przy użyciu systemu Cas9/sgRNA wynosił ok. 3,2 do 3,9%. W naszym badaniu nie wykryto mutagenezy poza celem dla sekwencji DNA związanych z CsPDS. związanych z CsPDS. Jest to pierwsze doniesienie o ukierunkowanej modyfikacji genomu w cytrusach przy użyciu systemu Cas9/sgRNA - systemu, który jest bardzo obiecujący do badania funkcji genów cytrusowych i ukierunkowanej modyfikacji genetycznej. --- TŁO: System klastrowych, regularnie rozmieszczonych, krótkich powtórzeń palindromowych (CRISPR) / CRISPR (CRISPR)/ CRISPR-associated protein 9 (Cas9) jest nowym narzędziem molekularnym do modyfikacji genomu. narzędziem do modyfikacji genomu specyficznej dla danego miejsca. System CRISPR-Cas9 został niedawno wprowadzony do roślin poprzez przejściową lub stabilną transformację. WYNIKI: Tutaj opisujemy celowanie w geny ryżu za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens za pośrednictwem systemu CRISPR-Cas9. Zaprojektowano trzy 20-nt CRISPR RNA do sparowania z różnymi miejscami, po których następuje sąsiadujący motyw protospacer (PAM) genu odporności na herbicyd ryżowy BEL. Po zintegrowaniu jednoprzewodowego RNA (sgRNA) i kasety Cas9 w pojedynczym wektorze binarnym, transgeniczne rośliny ryżu sgRNA:Cas9 zostały wygenerowane przez stabilną transformację za pośrednictwem A. tumefaciens. transformacji. Analizując miejsce docelowe w genomie odpowiednich transgenicznych roślin transgenicznych roślin, określono mutacje. Wydajność mutagenezy była wahała się od ~2% do ~16%. Ponadto analiza fenotypowa wykazała, że bialleliczna zmutowana roślina transgeniczna była wrażliwa na bentazon. WNIOSKI: Nasze wyniki wskazują, że cecha rolnicza może być celowo modyfikowana przez celowanie w geny indukowane przez sgRNA:Cas9. System CRISPR-Cas9 może być wykorzystany jako potężne narzędzie do poprawy cech w hodowli roślin. --- Systemy CRISPR/Cas9 są wszechstronnym narzędziem do edycji genomu ze względu na wysoce wydajnemu celowaniu w sekwencje DNA komplementarne do ich nici prowadzących RNA. Wykazano jednak, że kierowana przez RNA nukleaza Cas9 rozszczepia sekwencje genomowego DNA sekwencje zawierające niedopasowania do nici prowadzącej. Lepsze zrozumienie specyficzności CRISPR/Cas9 jest potrzebne, aby zminimalizować rozszczepianie poza celem w dużych genomach ssaków. genomach ssaków. Tutaj pokazujemy, że miejsca genomowe mogą zostać rozszczepione przez systemy systemy CRISPR/Cas9, gdy sekwencje DNA zawierają insercje ("wybrzuszenie DNA") lub delecje ("wybrzuszenie RNA") w porównaniu do nici prowadzącej RNA, a nicpazy Cas9 stosowane mogą również tolerować wybrzuszenia w jednej z nici prowadzących. Warianty jednoprzewodowego RNA (sgRNA) dla czterech endogennych loci zostały wykorzystane jako systemy modelowe. systemy modelowe, a ich aktywność rozszczepiania określono ilościowo w różnych pozycjach z wybrzuszeniami od 1 do 5 pb. Następnie zbadaliśmy 114 domniemanych genomowych loci pozacelowych loci 27 różnych sgRNA i potwierdziliśmy 15 miejsc pozacelowych, z których każde zawierające wybrzuszenie pojedynczej zasady i od jednego do trzech niedopasowań do nici prowadzącej. Nasze wyniki zdecydowanie wskazują na potrzebę przeprowadzenia kompleksowej analizy off-target analizy związanej z wybrzuszeniami DNA i sgRNA oprócz niedopasowań zasad oraz sugerują konkretne wytyczne dotyczące zmniejszenia potencjalnego rozszczepienia poza celem. --- Toxoplasma gondii stała się modelem do badania gromady Apicomplexa, częściowo dzięki dostępności doskonałych narzędzi genetycznych. częściowo ze względu na dostępność doskonałych narzędzi genetycznych. Chociaż narzędzia genetyczne narzędzia genetyczne są dostępne w kilku szeroko wykorzystywanych szczepach laboratoryjnych, są one opierają się na specjalnym tle genetycznym, które nie jest łatwo zaimplementować w naturalnych izolatach. izolatach. Ostatnie postępy w modyfikacji CRISPR (clustered regularly interspaced krótkich powtórzeń palindromicznych), systemu rozpoznawania DNA wykorzystywanego jako mechanizm obronny mechanizm obronny u bakterii i archeonów, doprowadził do niezwykle skutecznego w różnych organizmach. Tutaj wykorzystaliśmy system oparty na CRISPR/CAS9 CRISPR/CAS9 do niszczenia genów u T. gondii. CRISPR/CAS9 zapewnił niezwykle wydajny system do ukierunkowanego przerywania genów i do wstawiania selektywnych markerów poprzez homologiczną rekombinację. CRISPR/CAS9 ułatwił również wstawianie specyficzne dla miejsca w przypadku braku homologii, zwiększając tym samym użyteczność tego podejścia w porównaniu z istniejącą technologią. Następnie czy CRISPR/CAS9 umożliwi skuteczną transformację naturalnego izolatu. izolatu. Używając CRISPR/CAS9, byliśmy w stanie szybko wygenerować zarówno knockouty rop18 nokauty i linie komplementarne w szczepie GT1 typu I, który był używany do krzyżówek genetycznych, ale który pozostaje oporny na odwrotne metody genetyczne. podejścia. Ocena ich fenotypów in vivo wykazała, że ROP18 miał większy udział w ostrej patogenezie w GT1 niż w laboratoryjnym szczepie laboratoryjnym szczepie RH typu I. W ten sposób CRISPR/CAS9 rozszerza techniki odwrotnej genetyki do różnych izolatów T. gondii, umożliwiając eksplorację znacznie szerszego spektrum różnorodności biologicznej. znacznie szersze spektrum różnorodności biologicznej. WAŻNOŚĆ: Podejścia genetyczne okazały się bardzo skuteczne w badaniu biologii organizmów, w tym drobnoustrojów. Jednak łatwość manipulacji genetycznej różni się znacznie między izolatami, przy czym zwykłe izolaty laboratoryjne są często najbardziej najbardziej podatne na takie podejścia. Niestety, takie powszechne izolaty laboratoryjne były również często pasażowane in vitro i w ten sposób utraciły wiele atrybutów dzikich izolatów, często wpływając na ważne cechy, takie jak wirulencja. Z drugiej strony z drugiej strony, dzikie izolaty często nie poddają się standardowym metodom genetycznym, co ograniczając w ten sposób badanie genetycznych podstaw różnorodności biologicznej. Tutaj my zaimportowaliśmy nowy system genetyczny oparty na CRISPR / CAS9, który pozwala na wysoką wydajność ukierunkowanego zakłócania genów w naturalnych izolatach T. gondii. Ten postęp obiecuje przynieść moc genetyki na szeroką różnorodność szczepów T. gondii. szczepów T. gondii, które zostały niedawno opisane. --- Jako potężne narzędzie do edycji genomu, CRISPR (ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) - system klastra regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (Cas9) został szybko przekształcony w strategię przesiewową opartą na funkcjach na dużą skalę. w strategię badań przesiewowych opartych na funkcjach w komórkach ssaków. Ten nowy typ biblioteki genetycznej jest konstruowany poprzez lentiwirusowe dostarczanie RNA, które kierują Cas9 lub nieaktywnym martwym Cas9 połączonym z efektorami w celu zbadania funkcji genu lub regulacji transkrypcji genu w komórkach docelowych. transkrypcji genów w komórkach docelowych. W porównaniu z badaniem interferencji RNA, system CRISPR-Cas9 wykazuje znacznie wyższy poziom skuteczności i niezawodności w odniesieniu do zarówno w odniesieniu do badań przesiewowych utraty funkcji, jak i wzmocnienia funkcji. W przeciwieństwie do strategii interferencji RNA interferencji RNA, biblioteka CRISPR-Cas9 może być ukierunkowana zarówno na sekwencje kodujące białko, jak i elementy regulacyjne, w tym promotory. sekwencje kodujące białka i elementy regulatorowe, w tym promotory, wzmacniacze i elementy transkrybujące mikroRNA i długie niekodujące RNA. To potężne narzędzie genetyczne niewątpliwie przyspieszy mechanistyczne odkrywanie różnych procesów biologicznych. procesów biologicznych. W tym mini-przeglądzie podsumowujemy ogólną procedurę CRISPR-Cas9, optymalizację systemu, strategie i zastosowania tego nowego narzędzia genetycznego. strategie i zastosowania tego nowego zestawu narzędzi genetycznych. --- Zaprojektowane białka wiążące DNA, które manipulują ludzkim genomem i transkryptomem umożliwiły szybki postęp w badaniach biomedycznych. W szczególności, kierowany przez RNA system CRISPR/Cas9 został ostatnio zaprojektowany do tworzenia do tworzenia specyficznych dla miejsca dwuniciowych pęknięć w celu edycji genomu lub bezpośredniej regulacji transkrypcji. Unikalną zdolnością systemu CRISPR/Cas9 jest multipleksowa inżynieria genomu poprzez dostarczanie pojedynczego enzymu Cas9 i dwóch lub więcej RNA (sgRNA) ukierunkowanych na różne miejsca genomu. Podejście to może być wykorzystywane do jednoczesnego tworzenia wielu pęknięć DNA lub do kierowania wielu aktywatorów transkrypcyjnych do pojedynczego promotora w celu synergistycznego wzmocnienia indukcji genów. indukcji genów. Aby zaspokoić potrzebę jednolitego i trwałego dostarczania narzędzi inżynierii genomu opartych na CRISPR/Cas9, opracowaliśmy pojedynczy system system lentiwirusowy do ekspresji wariantu Cas9, genu reporterowego i do czterech sgRNA z niezależnych promotorów polimerazy RNA III, które są włączane do wektora wektora za pomocą wygodnej metody klonowania Golden Gate. Każdy sgRNA jest wydajnie ekspresji i może pośredniczyć w multipleksowej edycji genów i trwałej transkrypcji w unieśmiertelnionych i pierwotnych komórkach ludzkich. Ten system dostarczania będzie znaczący dla wykorzystania potencjału multipleksowej inżynierii genomu opartej na CRISPR/Cas9 w różnych typach komórek. --- Informacje o autorze: (1)Gene Regulatory Lab, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, Chiny. (2)Gene Regulatory Lab, School of Medicine, Tsinghua University, Pekin 100084, Chiny; Tsinghua Fly Center, Uniwersytet Tsinghua, Pekin 100084, Chiny; Szkoła Podstawowych Nauk Medycznych, Wuhan. Podstawowych Nauk Medycznych, Uniwersytet Wuhan, Wuhan 430071, Chiny; College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, Chiny. (3)Gene Regulatory Lab, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, Chiny; Sichuan Academy of Grassland Science, Chengdu 611731, Chiny. (4) Department of Genetics, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA. (5) Tsinghua Fly Center, Uniwersytet Tsinghua, Pekin 100084, Chiny. (6) Department of Genetics, Stanford University, Stanford, CA 94305, USA. (7)Gene Regulatory Lab, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, Chiny; Tsinghua Fly Center, Uniwersytet Tsinghua, Pekin 100084, Chiny. (8)Department of Molecular and Cellular Medicine, College of Medicine, Texas A&M Health Science Center, College Station, TX 77843, USA. (9) Department of Genetics, Stanford University, Stanford, CA 94305, USA. Adres elektroniczny: jin.billy.li@stanford.edu. (10)Gene Regulatory Lab, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, Chiny. Adres elektroniczny: nijq@mail.tsinghua.edu.cn.
Czy pojedynczy przewodnik RNA jest częścią narzędzia CRISPR/Cas9 czy inhibitorem jego funkcji?
Pojedynczy przewodnik RNA jest częścią systemu CRISPR/Cas9.