Ataksja Friedreicha wynika z niedoboru białka mitochondrialnego frataxin, które u niektórych pacjentów jest nosicielem mutacji jednopunktowych. W niniejszym przeanalizowaliśmy konsekwencje różnych mutacji związanych z chorobą in in vitro na stabilność i dynamikę ludzkiej frataksyny. Dwie z mutacji, G130V i D122Y, zostały zbadane po raz pierwszy. Analiza za pomocą spektroskopii CD wykazała znaczny spadek stabilności termodynamicznej wariantów podczas wariantów podczas rozkładu chemicznego i termicznego (typ dziki > W155R > I154F > D122Y > G130V), który był odwracalny we wszystkich przypadkach. Dynamika białka została szczegółowo i ujawniła, że mutanty mają różne skłonności do agregacji. Zaobserwowano, że mutanty mają zwiększoną korelację i różne względne stosunki między rozpuszczalnym i nierozpuszczalnym / zagregowanym białkiem. białkiem. NMR wykazał, że mutanty kliniczne zachowały zwarty i stosunkowo zwarty i stosunkowo sztywny rdzeń kulisty pomimo ich zmniejszonej stabilności. Ograniczona proteoliza w połączeniu z LC-MS pozwoliły na identyfikację szczególnie elastycznych regionów w mutantach. regionów w mutantach; co ciekawe, regiony te obejmowały te zaangażowane w wiązanie żelaza. wiązanie żelaza. Zgodnie z tym, aktywność metalochaperonu żelaza w mutantach Friedreicha: niektóre mutanty wytrącają się po związaniu żelaza (I154F i W154F). (I154F i W155R), a inne mają niższą stechiometrię wiązania (G130V i D122Y). Nasze wyniki sugerują, że u pacjentów heterozygotycznych rozwój ataksji Friedreicha może wynikać z połączenia zmniejszonej wydajności fałdowania białka i przyspieszonej degradacji in vivo, co prowadzi do niższych niż normalne stężeń niż normalne stężenia frataksyny. Hipoteza ta sugeruje również, że chociaż różni się od innych chorób neurodegeneracyjnych związanych z toksyczną agregacją białek. z toksyczną agregacją, ataksja Friedreicha może być również związana z procesem nieprawidłowego fałdowania białek spowodowanego specyficzną destabilizacją frataksyny. --- U eukariontów niedobór frataksyny (FXN) powoduje poważne fenotypy, w tym utratę aktywności białek klastra żelazo-siarka (Fe-S), akumulację mitochondrialnego żelaza w mitochondriach i prowadzi do choroby neurodegeneracyjnej - ataksji Friedreicha. Natomiast W przeciwieństwie do tego, u prokariotów, niedobór homologa FXN, CyaY, nie powodował żadnego znaczącego fenotypu. powodować żadnego znaczącego fenotypu, kwestionując zarówno jego znaczenie, jak i rzeczywisty wkład w biogenezę klastrów Fe-S. Ponieważ FXN jest konserwowany między eukariotami i prokariotami, ta zaskakująca rozbieżność skłoniła nas do do ponownego zbadania roli CyaY w Escherichia coli. Donosimy, że CyaY (i) wzmacnia kondycję E. coli, (ii) należy do szlaku ISC katalizującego proces dojrzewanie białek zawierających klastry Fe-S i (iii) wymaga warunków bogatych w żelazo aby jego udział był znaczący. Interakcja genetyczna została między cyaY i iscX, ostatnim genem operonu isc. Usunięcie obu genów wykazała addytywny wpływ na dojrzewanie białek klastra Fe-S, co prowadziło, między innymi, do zwiększonej oporności na aminoglikozydy i zwiększonej wrażliwość na infekcję fagiem lambda. Wszystkie te wyniki in vivo potwierdzają znaczenie CyaY jako członka biogenezy klastra Fe-S, w której pośredniczy ISC w E. coli, podobnie jak ma to miejsce u eukariontów, i potwierdzają, że IscX jest nowym bona fide czynnik biogenezy klastra Fe-S. --- Frataksyna jest białkiem mitochondrialnym, którego niedobór występuje w ataksji Friedreicha (FRDA). które jest związane z nieprawidłową wewnątrzmitochondrialną gospodarką żelazem. My zidentyfikowaliśmy mitochondrialną peptydazę przetwarzającą beta (MPPbeta) jako partnera białka frataxin przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży. W testach in vitro MPPbeta wiąże frataxin, który jest rozszczepiany przez zrekonstruowany heterodimer MPP. MPP rozszczepienie frataxin skutkuje formą pośrednią (aminokwasy 41-210), która jest dalej przetwarzana do postaci dojrzałej. Eksperymenty in vitro i in vivo sugerują, że dwie C-końcowe mutacje missense znalezione u pacjentów z FRDA modulują interakcję z MPPbeta, powodując wolniejszy proces dojrzewania w normalnym miejscu rozszczepienia. miejscu rozszczepienia. Wolniejsze tempo przetwarzania frataksyny niosącej takie mutacje missense może zatem przyczyniać się do niedoboru frataksyny, oprócz upośledzenia jej funkcji. upośledzenia jej funkcji. --- Ataksja Friedreicha (FRDA) jest autosomalną recesywną chorobą zwyrodnieniową spowodowaną niedoborem niedoborem frataksyny, konserwowanego białka mitochondrialnego o nieznanej funkcji. funkcji. Mitochondrialna akumulacja żelaza, utrata enzymów zawierających klaster żelazo-siarka enzymów zawierających klaster żelaza i siarki oraz zwiększone uszkodzenia oksydacyjne występują u drożdży i mysich mutantach pozbawionych frataxin, jak również w tkankach i liniach komórkowych pacjentów z FRDA sugerując, że frataxin może być zaangażowany w eksport żelaza z mitochondriów, syntezę mitochondriów, syntezę klasterów żelazowo-siarkowych i/lub ochronę przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. uszkodzeniami oksydacyjnymi. Wcześniej wykazaliśmy, że frataxin drożdży ma strukturalne i funkcjonalne cechy białka magazynującego żelazo. strukturalne i funkcjonalne cechy białka magazynującego żelazo. W niniejszym badaniu zbadaliśmy funkcję ludzkiej frataksyny w Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae. Po ekspresji w E.coli, dojrzała forma ludzkiej frataxin łączy się w stabilny homopolimer, który może wiązać około 10 atomów żelaza na cząsteczkę. atomów żelaza na cząsteczkę frataksyny. Obciążony żelazem homopolimer może być na żelach niedenaturujących przez barwienie białkiem lub żelazem, wykazując stabilny związek między frataksyną i żelazem. Jak analizowano przez filtrację żelową i mikroskopii elektronowej, homopolimer składa się z kulistych cząstek o masie około 1 MDa i uporządkowanych polimerów w kształcie pręta tych cząstek, które gromadzą małe rdzenie o gęstości elektronowej. Kiedy ludzki prekursor frataxin jest w S.cerevisiae, mitochondrialnie generowana dojrzała forma jest rozdzielana przez filtrację żelową na monomer i pulę o wysokiej masie cząsteczkowej >600 kDa. Pula frataksyny o wysokiej masie cząsteczkowej jest również obecna w sercu myszy. sercu myszy, co wskazuje, że frataxin może gromadzić się w warunkach natywnych. W radioznakowanych komórkach drożdży, ludzka frataxin jest odzyskiwana przez immunoprecypitację z około pięcioma atomami (55)Fe związanymi na cząsteczkę. Wyniki te sugerują, że FRDA wynika ze zmniejszonego mitochondrialnego magazynowania żelaza z powodu niedobór frataksyny, który może upośledzać metabolizm żelaza, promować uszkodzenia oksydacyjne i prowadzić do postępującej akumulacji żelaza. --- Poważne obniżenie poziomu mRNA i białka mitochondrialnego białka mitochondrialnego, kodowanego przez gen X25, powoduje ataksję Friedreicha (FRDA), najbardziej najczęstszą formę recesywnej dziedzicznej ataksji. Coraz więcej dowodów podkreśla patogenetyczną rolę stresu oksydacyjnego w tej chorobie. Stworzyliśmy model komórkowy in vitro model komórkowy regulowanej nadekspresji ludzkiej frataksyny. Zidentyfikowaliśmy, za pomocą techniką wyświetlania różnicowego, kinazę białkową aktywowaną mitogenem 4 w komórkach z nadekspresją frataxiny. Zbadaliśmy szlak kinaz stresu w tym modelu komórkowym oraz w fibroblastach pochodzących od pacjentów z FRDA. Nadekspresja frataksyny zmniejszyła fosforylację N-końcowej kinazy c-Jun. Ponadto, ekspozycja fibroblastów FRDA na kilka form stresu środowiskowego stres spowodował wzrost regulacji fosfo-JNK i fosfo-c-Jun. Aby zrozumieć czy ta podatność skutkuje śmiercią komórki, zbadaliśmy zaangażowanie kaspaz. zaangażowanie kaspaz. Zaobserwowano znacznie wyższą aktywację kaspazy-9 zaobserwowano w fibroblastach FRDA w porównaniu z fibroblastami kontrolnymi po odstawieniu surowicy. Nasze wyniki sugerują obecność w komórkach pacjentów z FRDA "nadaktywnego" szlaku sygnalizacji stresu. szlaku sygnałowego. Rola frataksyny w patogenezie FRDA może być wyjaśniona, co najmniej częściowo przez tę nadaktywność. --- Ataksja Friedreicha jest najczęstszą dziedziczną ataksją u osób rasy kaukaskiej. Jest ona spowodowana niedoborem frataksyny, wysoce konserwatywnego białka kodowanego jądrowo zlokalizowanego w mitochondriach. Nieprawidłowość DNA występująca w 98% chromosomów ataksji Friedreicha Friedreicha jest niestabilna hiperekspansja powtórzenia tripletu GAA w pierwszym intronie frataksyny. pierwszym intronie genu frataxin. Większość pacjentów jest homozygotyczna dla tego powtórzenia. ekspansji. Rozszerzone powtórzenie GAA powoduje niedobór frataksyny, ponieważ zakłóca transkrypcję genu poprzez przyjęcie struktury innej niż B (prawdopodobnie (prawdopodobnie potrójną strukturę helikalną). Dłuższe powtórzenia powodują głębszy niedobór frataxin i są związane z wcześniejszym początkiem i zwiększonym nasileniem choroby. choroby. Badania molekularne wykazały, że spektrum fenotypowe Friedreicha jest szersze niż wcześniej sądzono. Do 10% pacjentów z recesywną lub sporadyczną ataksją zwyrodnieniową, którzy nie spełniają kryteriów diagnostycznych ataksji Friedreicha Friedreicha są homozygotyczni pod względem rozszerzonych alleli w regionie locus ataksji Friedreicha. Późny wiek zachorowania, zachowane odruchy ścięgniste i brak objawów piramidowych należą do piramidowych należą do nietypowych cech obserwowanych u niektórych pacjentów z pozytywnym wynikiem testu molekularnego. Komórki drożdży z niedoborem homologu frataksyny gromadzą żelazo w mitochondriach i wykazują zwiększoną wrażliwość na stres oksydacyjny. stres oksydacyjny. Sugeruje to, że ataksja Friedreicha jest spowodowana dysfunkcją mitochondriów i toksycznością wolnych rodników. dysfunkcję mitochondriów i toksyczność wolnych rodników, a w konsekwencji uszkodzenie mitochondriów, degeneracją aksonów i śmiercią komórek. --- Poważny niedobór mitochondriów prowadzi do wielu wyniszczających zaburzeń zwyrodnieniowych. zaburzeń, jednak łagodna dysfunkcja mitochondriów u różnych gatunków, w tym nicieni Caenorhabditis elegans, może mieć pozytywny wpływ na długowieczność. Ten pozorny paradoks wskazuje, że adaptacja komórkowa do częściowego stresu mitochondrialnego może wywoływać korzystne reakcje, ale sposób, w jaki jest to osiągane, jest w dużej mierze nieznany. Całkowity brak frataksyny, białka mitochondrialnego wadliwego w pacjentów z ataksją Friedreicha, jest śmiertelny u C. elegans, podczas gdy jego częściowy niedobór wydłuża długość życia zwierząt w sposób zależny od p53. W tym artykule zapewniamy dalszy wgląd w kontrolę frataxin nad długowiecznością C. elegans, pokazując że znaczna redukcja ekspresji białka frataxin jest wymagana do wydłużenia życia, wpłynięcia na funkcjonalność neuronów czuciowych, przemodelowania metabolizmu lipidów i wywołania autofagii. Odkryliśmy, że geny Beclin i p53 są wymagane do indukcji autofagii i jednocześnie zmniejszają zapasy lipidów i wydłużają żywotność zwierząt w odpowiedzi na supresję odpowiedź na supresję frataxin. Wzajemnie, ekspresja frataxin moduluje autofagię przy braku p53. Ludzkie limfoblasty pochodzące z ataksji Friedreicha również wykazują zwiększoną autofagię, co wskazuje na ewolucyjnie zachowaną odpowiedź na zmniejszoną ekspresję frataxin. Podsumowując, wykazaliśmy związek przyczynowo-skutkowy związek między indukcją autofagii a wydłużeniem długości życia po zmniejszona ekspresja frataxin, zapewniając w ten sposób uzasadnienie dla badania autofagii w patogenezie i leczeniu ataksji Friedreicha i prawdopodobnie innych ludzkich zaburzeń związanych z mitochondriami. --- Choroba neurodegeneracyjna FRDA (ataksja Friedreicha) wynika z niedoboru niedoboru frataksyny, przypuszczalnego chaperonu żelaza, i jest spowodowane obecnością dużej liczby powtórzeń GAA w regionach kodujących obu alleli genu genu frataxin, które upośledzają ekspresję białka. Jednak niektórzy pacjenci z FRDA są heterozygotyczni dla tej ekspansji tripletów i zawierają szkodliwą mutację punktową na drugim allelu. na drugim allelu. W niniejszym badaniu zbadaliśmy, czy dwa związane z FRDA mutacje frataksyny, I154F i W155R, powodują rozfałdowanie białko w wyniku poważnej modyfikacji strukturalnej. Szczegółowe porównanie szczegółowe porównanie właściwości konformacyjnych białek typu dzikiego i zmutowanych łącząc metodologie biofizyczne i biochemiczne. Wykazaliśmy, że mutanty FRDA zachowują natywny fałd w warunkach fizjologicznych, ale są różnie destabilizowane, co odzwierciedla zarówno ich zmniejszona stabilność termodynamiczna stabilność termodynamiczną i wyższą tendencję do trawienia proteolitycznego. Mutant I154F ma najsilniejszy wpływ na stabilność fałdu, zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z faktu, że zmutowana reszta zmutowana reszta przyczynia się do tworzenia hydrofobowego rdzenia. Funkcjonalnie, właściwości właściwości wiązania żelaza przez zmutowane frataksyny są częściowo upośledzone. Pozornie paradoksalna sytuacja posiadania klinicznie agresywnych wariantów frataxin które są fałdowane i są tylko znacznie mniej stabilne niż forma forma typu dzikiego w danym niekorzystnym fizjologicznym stanie stresu jest omawiana i kontekstualizowana w kategoriach mechanizmu determinującego patologię heterozygot FRDA heterozygotycznych. --- Ataksja Friedreicha (FRDA), autosomalna recesywna choroba kardiologiczna i neurodegeneracyjna, jest spowodowana niską ekspresją jest spowodowana niską ekspresją frataksyny, małego białka mitochondrialnego, kodowanego w jądrze. Na poziomie biochemicznym brak frataksyny prowadzi do rozregulowania homeostazy żelaza mitochondrialnego i uszkodzeń oksydacyjnych, co ostatecznie ostatecznie powoduje śmierć neuronów. Nadal jednak nie jest jasne, czy frataxin jest bezpośrednio zaangażowana w wiązanie żelaza, ponieważ ortolog drożdży, ale nie ludzkiego białka, tworzy duże agregaty w obecności dużego nadmiaru żelaza. nadmiaru żelaza. Porównaliśmy właściwości trzech białek z rodziny frataxin bakteryjnej CyaY z Escherichia coli, drożdżowej Yfh1 i ludzkiej jako reprezentatywnych dla organizmów o rosnącej złożoności. Pokazujemy, że białka mają ten sam fałd, ale różną stabilność termiczną i właściwości wiązania żelaza. właściwości wiązania żelaza. Podczas gdy ludzka frataxin nie ma tendencji do wiązania żelaza, CyaY tworzy agregaty promowane żelazem z zachowaniem podobnym do drożdży frataxin. Agregacja może być jednak kompensowana przez czynniki chelatujące lub siłę jonową. siłę jonową. W warunkach fizjologicznego zasolenia prawie nie obserwuje się agregacji. Zaprojektowanie mutantów wyprodukowanych w celu identyfikacji powierzchni białka zaangażowanej w agregację promowaną żelazem pozwala nam wykazać, że w procesie tym pośredniczy ujemnie naładowany grzbiet powierzchni. przez ujemnie naładowany grzbiet powierzchni. Mutacja trzech z tych reszt jest wystarczająca do przekształcenia CyaY w białko o właściwościach podobnych do właściwości ludzkiej frataksyny. Z drugiej strony, mutacja odsłoniętej powierzchni arkusza beta arkusza, który zawiera większość konserwowanych reszt, nie wpływa na agregację, co sugeruje agregację, co sugeruje, że wiązanie żelaza jest niezachowaną częścią bardziej złożonej funkcji komórkowej złożonej funkcji komórkowej frataksyny. --- Ataksja Friedreicha jest ciężką chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną zmniejszoną ekspresją frataksyny, białka mitochondrialnego, które stymuluje biogenezę klasterów żelazo-siarka (Fe-S). biogenezę klastrów żelazo-siarka (Fe-S). U ssaków podstawowe etapy składania klastrów Fe-S są wykonywane przez kompleks NFS1-ISD11-ISCU poprzez tworzenie pośredniego nadsiarczku na NFS1. Tutaj pokazujemy, że frataxin moduluje reaktywność nadsiarczku NFS1 z tiolami. Używamy związków maleimidowo-peptydowych wraz ze spektrometrią mas do badania cysteiny-persulfidu w NFS1 i ISCU. Nasze dane ujawniają, że w obecności ISCU, frataxin zwiększa szybkość dwóch podobnych reakcji na nadsiarczku NFS1: transfer siarki do ISCU prowadzący do nagromadzenie nadsiarczku na cysteinie C104 ISCU i przeniesienie siarki do małych tioli, takich jak DTT, L-cysteina i GSH, prowadząc do persulfuracji tych tioli i ostatecznie siarczku tych tioli i ostatecznie uwolnienia siarczku. Dane te rodzą ważne pytania dotyczące fizjologicznego mechanizmu tworzenia klastrów Fe-S i wskazują na unikalną funkcję unikalną funkcję frataksyny jako wzmacniacza transferu siarki w obrębie klastra NFS1-ISD11-ISCU.
Które białko jest zmutowane w ataksji Friedreicha?
Ogólnie przyjmuje się, że ataksja Friedreicha (FRDA) jest spowodowana niedoborem ekspresji frataksyny, białka mitochondrialnego zaangażowanego w homeostazę żelaza, które wpływa głównie na mózg, zwoje korzenia grzbietowego rdzenia kręgowego, serce, a w niektórych przypadkach na trzustkę.