SP1 jest wszechobecnym czynnikiem transkrypcyjnym, który bierze udział w regulacji różnych genów regulatorowych. Wiadomo, że działa poprzez wiązanie się z dwuniciowym motywem konsensusowym. Tutaj odkryliśmy, że SP1 wiąże się również do niekanoniczną strukturą DNA, kwadrupleksem G, z wysokim powinowactwem. W szczególności W szczególności zbadaliśmy miejsce wiązania SP1 w regionie promotora onkogenu c-KIT i odkryliśmy, że miejsce to może składać się w antyrównoległą dwu-tetradowy G-kwadrupleks. Eksperymenty ściągania SP1 z ekstraktów komórkowych, wraz z biofizycznymi testami wiązania wykazały, że SP1 ma porównywalne powinowactwo wiązania dla tej struktury G-kwadrupleksu i kanonicznej sekwencji dupleksowej SP1 sekwencji. Korzystając z zestawów danych SP1 ChIP-on-chip, odkryliśmy również, że 87% miejsc wiązania SP1 pokrywa się z sekwencjami tworzącymi G-kwadrupleks. Ponadto, podczas gdy wielu z tych immuoprecypitowanych sekwencji (36%) brakuje nawet minimalnego motywu konsensusu SP1 SP1, 5'-GGGCGG-3', wykazaliśmy, że 77% z nich to domniemane G-kwadrupleksy. Łącznie, dane te sugerują, że SP1 jest w stanie wiązać zarówno, kanoniczne dupleksy DNA SP1, jak również struktury G-kwadrupleksowe in vitro, a my hipotezę, że oba typy interakcji mogą występować w komórkach. --- Policytemiczny szczep wirusa tworzącego ognisko śledzionowe (SFFVp) zawiera najsilniejszą konfigurację wzmacniacza najsilniejszą znaną dotychczas konfigurację mysiego retrowirusowego enhancera dla ekspresji genów ekspresji genów w komórkach krwiotwórczych mieloerytroidów. W niniejszym badaniu zmapowaliśmy dwa kluczowe elementy odpowiedzialne za wysoką aktywność enhancera SFFVp do zmienionego regionu kontrolnego (UCR) zawierającego motyw bogaty w GC (5'-GGGCGG-3') i do unikalnego rdzenia enhancera (5'-TGCGGTC-3'). Nabycie tych motywów odpowiada za połowę aktywności kompletnego retrowirusowego retrowirusowego w komórkach krwiotwórczych, niezależnie od etapu rozwoju lub linii krwiotwórczej. linii rozwojowej. Ponadto, motyw UCR zawiera główny czynnik determinujący aktywność wzmacniacza aktywności enhancera SFFVp w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Wykorzystując testy elektroforetyczne testy przesunięcia elektroforetycznego, pokazujemy, że UCR SFFVp, ale nie Friend murine jest namierzany przez wszechobecny aktywator transkrypcyjny Sp1. Motyw rdzenia SFFVp tworzy specyficzny cel o wysokim powinowactwie dla białko wiążące wzmacniacz poliomawirusa / czynnik wiążący rdzeń (PEBP / CBF) i wyklucza dostęp białka wiążącego CAAT/enhancer. Eksperymenty kotransfekcji z komórkami ES sugerują, że PEBP/CBF współpracuje z sąsiednim elementem, LVb (jedyny zachowany konsensus Ets w enhancerze SFFVp) oraz że motyw Sp1 w UCR stymuluje transaktywację poprzez interakcję Ets-PEBP. Przypuszczalne struktury wtórne retrowirusowych enhancerów są proponowane na podstawie tych danych. dane. --- Transporter aminokwasów adipocytów (AAAT) jest indukowany podczas procesu różnicowania preadipocytów 3T3-L1 procesu różnicowania preadipocytów. W -1819-bp 5'-upstream flanking genomowego genu AAAT, sześć miejsc chronionych DNazą I zostało zidentyfikowanych przez przy użyciu ekstraktu jądrowego adipocytów 3T3-L1. Wyniki acetylotransferazy chloramfenikolu acetylotransferazy (CAT) z chimerycznego promotora AAAT napędzanego genem reporterowym CAT wskazywały, że jedno miejsce wiązania białka, od -68 do -26, było niezbędne dla aktywności promotora. Jednak to miejsce wiązania białka nie zawiera miejsc rozpoznawania czynników transkrypcyjnych ważnych dla różnicowania adipocytów, tj. adipocytów, tj. rodziny C/EBP lub PPAR. Dalsza analiza wykazała, że sekwencja DNA, TTCAAGTCCCGCCCTCCGCT od -65 do -46, była cis-elementem niezbędnym i częściowo wystarczającym dla indukowalnej aktywności promotora genu AAAT. promotora. --- Wcześniej wykazaliśmy, że proksymalna sekwencja 2-kb promotora syntazy kwasów tłuszczowych (FAS) syntazy kwasów tłuszczowych (FAS) transfekowana do adipocytów szczura była wysoce wrażliwa na kontekst komórkowy, wykazując nadaktywność w otyłych (fa/fa) w porównaniu z chudymi adipocytami szczura adipocytach szczura Zucker. Wykorzystując analizę delecyjną, pokazujemy tutaj, że aktywność promotora FAS zależy głównie od regionu od -200 do -126. Ta sekwencja wywiera silny negatywny wpływ na promotor FAS w adipocytach szczurów chudych, ale nie w adipocytach szczurów otyłych. szczurów otyłych, powodując znaczną aktywność nadtranskrypcyjną w tych ostatnich komórkach. te ostatnie komórki. Region ten, połączony z heterologicznym promotorem, E1b TATA box, indukował zróżnicowane poziomy aktywności reporterowej genów w adipocytach szczurów chudych i otyłych adipocytach szczurów, wskazując, że zawiera element(y) reagujący(e) na fa. Niezależnie od genotypu szczura genotyp szczura, wykazano, że białka jądrowe adipocytów zawierają tę samą chronioną sekwencję sekwencja w regionie reagującym na fa, a analiza supershift wykazała że białka Sp1 lub podobne do Sp1 były związane z tym podregionem DNA. Przekonujące dowody na to, że miejsce wiązania Sp1 zawarte w tej sekwencji było zaangażowane w zróżnicowanej aktywności promotora u szczurów szczupłych i otyłych, została dostarczona przez że mutacje w tym miejscu Sp1 indukowały 2,5-krotny wzrost aktywności promotora FAS w tkance tłuszczowej. aktywności promotora FAS w adipocytach od szczurów szczupłych, podczas gdy nie miały one wpływu w adipocytach otyłych szczurów. --- Wcześniej wykazaliśmy, że mutacje w motywie rdzeniowym GGAA miejsca wiązania Ets1 EBSI lub delecja EBSI, zmniejszały transaktywację podstawową i Tax1 promotora PTHrP P2. Tutaj pokazujemy, że oprócz EBSI, motyw podobny do motyw podobny do CACCC zlokalizowany między -53 i -58 jest wymagany do pełnej aktywności podstawowej tego promotora w komórkach T Jurkat. Mutacje specyficzne dla miejsca w motywie CACCC zmniejszały aktywność promotora około 5-krotnie. W celu zidentyfikowania czynników transkrypcyjnych, które wiążą się z elementem CACCC, odkryliśmy, że oczyszczone ludzki Sp1, a także Sp1 w ekstrakcie jądrowym HeLa, może specyficznie wiązać się z sondą DNA, która odpowiada sondą DNA, która odpowiada sekwencji specyficznej dla PTHrP między -94 i -34. Badania konkurencji przesunięcia żelu i analizy śladu DNazy I ujawniły, że Sp1 specyficznie oddziałuje z motywem CACCC. W obecności Ets1, ruchliwość ruchliwość kompleksu przesunięcia żelowego specyficznego dla Sp1 z DNA PTHrP zmniejszyła się. Analiza śladu DNazy I tego kompleksu żelowego wykazała rozszerzony ślad ślad zarówno w miejscu wiązania Sp1, jak i Ets1, wykazując, że Sp1 i Ets1 tworzą trójskładnikowy kompleks z DNA PTHrP. Kotransfekcja wektora ekspresyjnego Ets1 i Sp1 do komórek Drosophila Schneider wykazała, że Sp1 może funkcjonalnie współpracować z Ets1 w celu transaktywacji promotora PTHrP. My wnioskujemy z tych danych, że Ets1 i Sp1 mogą kooperatywnie regulować aktywność promotora PTHrP P2 aktywność promotora.
Jaki jest motyw miejsca wiązania Sp1?
Sp1 wiąże się z bogatym w GC elementem sekwencji zawierającym dekanukleotydową sekwencję konsensusową 5′-(G/T)GGGCGG(G/A)(G/A)(C/T)-3′ (element GC box) w dwuniciowym DNA (dsDNA). Badania konkurencji przesunięcia żelowego i analizy śladów DNazy I ujawniły, że Sp1 specyficznie oddziałuje z motywem CACCC.