Unikalny skład i przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA (RBP) na transkrypcie transkryptu kierują różnymi aspektami regulacji potranskrypcyjnej. Dlatego istotnym krokiem w kierunku zrozumienia regulacji transkryptu na poziomie molekularnym na poziomie molekularnym jest uzyskanie informacji pozycyjnych na temat miejsc wiązania RBP. Interakcje białko-RNA mogą być badane przy użyciu metod biochemicznych, ale te podejścia podejścia nie odnoszą się do wiązania RNA w jego natywnym kontekście komórkowym. Początkowe próby badania kompleksów białko-RNA w ich środowisku komórkowym wykorzystywały oczyszczanie powinowactwa lub immunoprecypitację w połączeniu z wyświetlaniem różnicowym lub analizą mikromacierzy (RIP-CHIP). Podejścia te były podatne na identyfikację pośrednich lub niefizjologicznych interakcji. W celu zwiększenia specyficzności i rozdzielczości pozycyjnej, wprowadzono strategię określaną jako CLIP (sieciowanie UV i immunoprecypitacja). immunoprecypitacja). CLIP łączy sieciowanie UV białek i cząsteczek RNA z rygorystycznymi schematami oczyszczania, w tym z denaturującym elektroforezę w żelu poliakrylamidowym. W połączeniu z technologiami sekwencjonowania technologie sekwencjonowania, CLIP okazał się potężnym narzędziem do badania interakcji białko-RNA w skali całego genomu (określane jako HITS-CLIP lub CLIP-seq). Niedawno wprowadzono PAR-CLIP, który wykorzystuje fotoreaktywne analogi rybonukleozydów do sieciowania. Pomimo wysokiej specyficzności uzyskanych danych, eksperymenty CLIP często generują biblioteki cDNA o ograniczonej złożoności sekwencji. Jest to jest częściowo spowodowane ograniczoną ilością współoczyszczonego RNA i dwoma nieefektywnymi reakcjami ligacji RNA. nieefektywnych reakcji ligacji RNA wymaganych do przygotowania biblioteki. Ponadto Ponadto testy wydłużania starterów wykazały, że wiele cDNA przedwcześnie ulega skróceniu w usieciowanym nukleotydzie. Takie skrócone cDNA są tracone podczas standardowego protokołu przygotowania biblioteki CLIP. Niedawno opracowaliśmy iCLIP (CLIP o rozdzielczości pojedynczego nukleotydu), który wychwytuje obcięte cDNA poprzez zastępując jeden z nieefektywnych etapów międzycząsteczkowej ligacji RNA bardziej wydajną wewnątrzcząsteczkową cyrkularyzacją cDNA (Rysunek 1). Co ważne, sekwencjonowanie skróconych cDNA zapewnia wgląd w położenie miejsca miejsca sieciowania z rozdzielczością nukleotydów. Z powodzeniem zastosowaliśmy iCLIP do badania hnRNP C w skali całego genomu i oceny jego roli w regulacji splicingu. regulacji splicingu. --- Wszystkie cząsteczki mRNA podlegają w pewnym stopniu posttranskrypcyjnej regulacji genów (PTGR) regulacji (PTGR) obejmującej zależną od sekwencji modulację splicingu, rozszczepiania i poliadenylacji, edycji, transportu, stabilności i translacji. Niedawne wprowadzenie technologii głębokiego sekwencjonowania umożliwiło opracowanie nowych metod szerokiego mapowania miejsc interakcji między białkami wiążącymi RNA (RBP) i ich miejscami docelowymi RNA. W tym artykule dokonujemy przeglądu sieciowania i metody immunoprecypitacji (CLIP) dostosowane do identyfikacji na dużą skalę docelowych miejsc wiązania RNA i odpowiednich elementów rozpoznających RNA. METODY CLIP mają potencjał do wykrywania setek tysięcy miejsc wiązania w pojedynczych eksperymentach. w pojedynczych eksperymentach, chociaż oddzielenie sygnału od szumu może być trudne. W konsekwencji każda metoda CLIP opracowała różne strategie strategie odróżniania prawdziwych celów od tła. Skupiamy się na fotoaktywowalnym CLIP wzmocnionym rybonukleozydem, który opiera się na wewnątrzkomórkowym wewnątrzkomórkowej inkorporacji fotoaktywowalnych analogów rybonukleozydów do powstających transkryptów. transkryptów i daje charakterystyczne zmiany sekwencji po usieciowaniu, które ułatwiają oddzielenie sygnału od szumu. Dokładna wiedza na temat i rozmieszczenie miejsc wiązania w dojrzałych i pierwotnych transkryptach mRNA transkryptów pozwala na krytyczny wgląd w lokalizację komórkową i funkcję regulacyjną funkcję regulacyjną badanego RBP. W połączeniu z innymi podejściami obejmującymi cały system pomiarami obfitości transkryptów i białek, generowanie wysokiej rozdzielczości map miejsc wiążących RBP w transkryptomie poszerzy nasze zrozumienie PTGR, a tym samym doprowadzi do nowych strategii terapeutycznego leczenia chorób genetycznych zaburzających te procesy. chorób genetycznych zaburzających te procesy. --- Chociaż mikroRNA (miRNA), inne niekodujące RNA (ncRNA) (np. lncRNA, pseudogeny i circRNA) oraz konkurujące endogenne RNA (ceRNA) zostały są zaangażowane w determinację losów komórek i w różne choroby ludzkie, zaskakująco niewiele wiadomo na temat sieci interakcji regulacyjnych między wielu klas RNA. W tym badaniu opracowaliśmy starBase v2.0 (http://starbase.sysu.edu.cn/) do systematycznej identyfikacji sieci interakcji RNA-RNA i białko-RNA ze 108 zestawów danych CLIP-Seq (PAR-CLIP, HITS-CLIP, iCLIP, CLASH) wygenerowanych przez 37 niezależnych badań. Analizując miliony białek wiążących RNA, zidentyfikowaliśmy ∼9000 miRNA-circRNA, 16 000 miRNA-pseudogen i 285 000 relacji regulatorowych białko-RNA. Ponadto, starBase v2.0 została zaktualizowana, aby zapewnić najbardziej wszechstronne CLIP-Seq obsługiwane eksperymentalnie sieci interakcji miRNA-mRNA i miRNA-lncRNA do tej pory do tej pory. Zidentyfikowaliśmy ∼10 000 par ceRNA z miejsc docelowych miRNA wspieranych przez CLIP. Łącząc 13 funkcjonalnych adnotacji genomowych, opracowaliśmy serwery internetowe miRFunction i ceRNAFunction do przewidywania funkcji miRNA i innych ncRNA z sieci regulacyjnych, w których pośredniczy miRNA. Na koniec opracowaliśmy interaktywne aby zapewnić wizualizację, analizę i pobieranie wspomnianych dużych zbiorów danych. wyżej wymienionych zbiorów danych na dużą skalę. Badanie to znacznie rozszerzy nasze zrozumienie funkcji ncRNA i ich skoordynowanych sieci regulacyjnych. --- Zwierzęce mRNA są regulowane przez setki białek wiążących RNA (RBP). Identyfikacja Identyfikacja celów RBP ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich funkcji. A Ostatnia metoda, PAR-CLIP, wykorzystuje fotoreaktywne nukleozydy do sieciowania RBP do RNA w komórkach przed immunoprecypitacją. Tutaj ustanowiliśmy iPAR-CLIP (in vivo PAR-CLIP) w celu określenia, z rozdzielczością nukleotydową, miejsc wiązania GLD-1, transkryptomu miejsca wiązania GLD-1, konserwatywnego, specyficznego dla linii zarodkowej represora translacji u C. elegans. Zidentyfikowaliśmy 439 powtarzalnych docelowych mRNA i wykazaliśmy doskonały zakres dynamiczny wykrywania celu przez iPAR-CLIP. Po knockdown GLD-1, białko, ale nie ekspresja mRNA 439 celów, było specyficznie regulowane w górę, demonstrując funkcjonalność. Wreszcie, odkryliśmy silnie konserwowane miejsca wiązania GLD-1 w pobliżu kodonu start genów docelowych. Miejsca te są funkcjonalne in vitro i prawdopodobnie zapewniają silną represję in vivo. Proponujemy, aby GLD-1 oddziałuje z maszynerią translacyjną w pobliżu kodonu startowego, co jest dotychczas nieznanym sposób regulacji genów u eukariontów. --- Metoda sieciowania i immunoprecypitacji PAR-CLIP (Photo-Activatable Ribonucleoside-enhanced CrossLinking and Metoda PAR-CLIP (ang. Photo-Activatable Ribonucleoside-enhanced CrossLinking and ImmunoPrecipitation) została niedawno opracowana do globalnej identyfikacji identyfikacji RNA oddziałujących z białkami. Siła tej wszechstronnej wynika z indukcji specyficznych przejść T do C w miejscach interakcji. interakcji. Jednak obecne narzędzia analityczne nie rozróżniają między nieeksperymentalnie i eksperymentalnie indukowanych przejść. Ponadto, właściwości geometryczne w potencjalnych miejscach wiązania nie są brane pod uwagę. Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, opracowaliśmy dwuetapowy algorytm składający się z nieparametrycznego dwuskładnikowego modelu mieszaniny i opartej na falach szczytów. Nasz algorytm może zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich do 24% identyfikując w ten sposób miejsca interakcji o wysokim poziomie zaufania. Z powodzeniem zastosowaliśmy to podejście w połączeniu ze zmodyfikowanym protokołem PAR-CLIP w celu zbadania funkcjonalnej roli jądrowego wirusa białaczki Moloney 10, domniemanej helikazy RNA oddziałującej z Argonaute2 i Polycomb. Nasza metoda, dostępna jako pakiet R wavClusteR, ma ogólne zastosowanie do każdego problemu wnioskowania opartego na substytucji w genomice. w genomice. --- Białko wiążące RNA HuR, choć znane z tego, że stabilizuje cytoplazmatyczne mRNA, jest w dużej mierze jądrowe. W tym wydaniu Molecular Cell, Mukherjee i wsp. (2011) oraz Lebedeva et al. (2011) identyfikują interakcje HuR-RNA w całym transkryptomie za pomocą PAR-CLIP, ujawniając jądrową rolę HuR w przetwarzaniu pre-mRNA. --- Transkrypty RNA podlegają posttranskrypcyjnej regulacji genów obejmującej setki białek wiążących RNA (RBP) i kompleksów rybonukleoproteinowych (miRNP) zawierających mikroRNA. kompleksy rybonukleoproteinowe (miRNP) wyrażane w sposób zależny od typu komórki. Opracowaliśmy metodę sieciowania opartą na komórkach w celu określenia w wysokiej rozdzielczości i transkryptomicznych miejsc wiązania komórkowych RBP i miRNP. Usieciowane miejsca usieciowane miejsca są ujawniane przez przejścia tymidyny do cytydyny w cDNA przygotowanym z immunopurifikowanych RNP komórek traktowanych 4-tiourydyną. Określiliśmy miejsca wiązania i konsekwencje regulacyjne dla kilku intensywnie badanych RBPs i miRNP, w tym PUM2, QKI, IGF2BP1-3, AGO/EIF2C1-4 i TNRC6A-C. Nasze badanie ujawniły, że czynniki te wiążą tysiące miejsc zawierających określone motywy sekwencji motywy sekwencyjne i mają różne preferencje dla regionów transkryptów egzonicznych i intronicznych lub kodujących i nietranslacyjnych. nieprzetłumaczone regiony transkryptu. Dokładne mapowanie miejsc wiązania w transkryptomie transkryptomu będzie miało kluczowe znaczenie dla interpretacji szybko pojawiających się danych na temat zmienności genetycznej między osobnikami i tego, jak te zmienności przyczyniają się do powstawania złożonych chorób genetycznych. --- Sieciowanie i immunoprecypitacja (CLIP) są coraz częściej wykorzystywane do mapowania transkryptomowych miejsc wiązania białek wiążących RNA. Opracowaliśmy metodę do analizy danych CLIP i zastosowaliśmy ją do porównania CLIP z fotoaktywowalnym CLIP wzmocnionym rybonukleozydem (PAR-CLIP) i odkrycia, w jaki sposób różnice w sieciowaniu i trawieniu rybonukleazą wpływają na zidentyfikowane miejsca. Znaleźliśmy tylko niewielkie różnice w dokładności tych metod w identyfikacji miejsc wiązania miejsca wiązania HuR, który wiąże sekwencje o niskiej złożoności, i Argonaute 2, który ma złożoną specyficzność wiązania. Stwierdziliśmy, że mutacje indukowane wiązaniem krzyżowym prowadziły do rozdzielczości pojedynczego nukleotydu zarówno dla PAR-CLIP, jak i CLIP. Nasze wyniki potwierdzają oczekiwania z oryginalnych publikacji CLIP, że białka wiążące RNA nie wystarczająco chronić swoich miejsc wiązania w warunkach denaturacji stosowanych podczas procedury CLIP. podczas procedury CLIP i pokazujemy, że rozległe trawienie za pomocą specyficznymi dla sekwencji RNazami silnie zniekształca odzyskane miejsca wiązania. To odchylenie może być znacznie zmniejszona przez łagodniejsze warunki trawienia nukleazą. --- Systematyczna analiza interakcji RNA-białko wymaga solidnych i skalowalnych metod. metod. Przedstawiamy tutaj połączenie dwóch całkowicie ortogonalnych, ogólnych technik do identyfikacji interakcji RNA-białko: PAR-CLIP ujawnia zbiór RNA związanych z białkiem, podczas gdy ściąganie RNA oparte na SILAC identyfikuje grupę białek związanych z RNA. Zbadaliśmy miejsca wiązania dla pięciu różnych białek (IGF2BP1-3, QKI i PUM2) wykazujących różne wzorce wiązania. My zgłaszamy niemal idealną zgodność między tymi dwoma podejściami. Niemniej jednak są one nieredundantne i idealnie się uzupełniają, aby zmapować sieć interakcji RNA-białko sieć interakcji RNA-białko. --- Transkrypty RNA podlegają posttranskrypcyjnej regulacji genów poprzez oddziaływanie z setkami białek wiążących RNA (RBP) i kompleksów rybonukleoproteinowych (miRNP) zawierających mikroRNA kompleksami rybonukleoproteinowymi (miRNP), które często ulegają ekspresji w komórkach typu zależnie od typu komórki. Aby zrozumieć, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie tych czynników wiążących RNA RNA wpływa na regulację poszczególnych transkryptów, konieczne są mapy o wysokiej rozdzielczości in vivo interakcji białko-RNA. Połączenie podejścia genetycznego, biochemicznych i obliczeniowych jest zwykle stosowana do identyfikacji RNA-RBP lub RNA-RNP. Profilowanie mikromacierzy RNA związanych z (RIP-Chip) definiuje cele na poziomie transkryptomu, ale jego zastosowanie jest ograniczone do charakterystyki interakcji RNA-RBP lub RNA-RNP. zastosowanie jest ograniczone do charakterystyki kinetycznie stabilnych interakcji i tylko w rzadkich przypadkach pozwala na identyfikację elementu rozpoznającego RBP (RRE) w obrębie długiego docelowego RNA. Bardziej bezpośrednie informacje o miejscu docelowym RBP RBP uzyskuje się poprzez połączenie sieciowania UV in vivo z immunoprecypitacją, po której następuje izolacja usieciowanych segmentów RNA i sekwencjonowanie cDNA (CLIP). sekwencjonowanie cDNA (CLIP). CLIP został wykorzystany do identyfikacji celów wielu RBP. Jednak CLIP jest ograniczony przez niską wydajność sieciowania RNA-białko UV 254 nm sieciowania, a lokalizacja sieciowania nie jest łatwa do zidentyfikowania w sekwencjonowanych usieciowanych fragmentach, co utrudnia oddzielenie Usieciowane UV docelowe segmenty RNA z tła nieusieciowanych fragmentów RNA również obecnych w próbce. Opracowaliśmy potężną metodę sieciowania opartą na komórkach aby określić w wysokiej rozdzielczości i w całym transkryptomie miejsca wiązania miejsc wiązania komórkowych RBP i miRNP, które określamy jako PAR-CliP (fotoaktywowalne sieciowanie wzmocnione rybonukleozydami i immunoprecypitacja) (patrz rys. 1A, aby zapoznać się z zarysem metody). Metoda ta opiera się na włączeniu fotoreaktywnych analogów rybonukleozydów, takich jak 4-tiourydyna (4-SU) i 6-tioguanozyna (6-SG) do powstających transkryptów RNA przez żywe komórki. Naświetlanie komórek światłem UV o długości fali 365 nm indukuje wydajne sieciowanie fotoreaktywnych komórkowych RNA znakowanych nukleozydami do oddziałujących RBP. Po immunoprecypitacji RBP następuje izolacja usieciowanego i koimmunoprecypitowanego RBP. usieciowanego i koimmunoprecypitowanego RNA. Wyizolowany RNA jest przekształcany w bibliotekę cDNA i głęboko sekwencjonowane przy użyciu technologii Solexa. Jedną z charakterystycznych cechą bibliotek cDNA przygotowanych przez PAR-CliP jest to, że dokładna pozycja można zidentyfikować na podstawie mutacji występujących w sekwencjonowanym cDNA. Kiedy przy użyciu 4-SU, usieciowane sekwencje przechodzą z tymidyny na cytydynę, podczas gdy przy użyciu 6-SG powoduje mutacje guanozyny do adenozyny. Obecność mutacji mutacji w usieciowanych sekwencjach umożliwia ich oddzielenie od tła tła sekwencji pochodzących z obfitych komórkowych RNA. Zastosowanie metody do wielu różnych białek wiążących RNA zostało opisane w Hafner i in. --- TŁO: MikroRNA (miRNA) odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. ekspresji genów. Łącząc się z białkami z rodziny Argonaute, miRNA wiążą się z docelowymi miejsca na mRNA i stosują represję translacji. Duża liczba interakcji miRNA-cel (MTI) została zidentyfikowana przez sieciowanie i immunoprecypitację (CLIP). immunoprecypitacji (CLIP) i fotoaktywowalnego CLIP wzmocnionego rybonukleozydem (PAR-CLIP) wraz z sekwencjonowaniem następnej generacji (NGS). PAR-CLIP wykazuje wysoką wydajność koimmunoprecypitacji RNA, ale prowadzi również do konwersji T na C w regionach sieciowania miRNA-RNA-białko. Ten sztuczny błąd oczywiście zmniejsza możliwość mapowania odczytów. Jednakże, specjalne narzędzie do analizy danych CLIP i PAR-CLIP, które uwzględnia konwersję T do C, jest nadal potrzebne. WYNIKI: Niniejszym proponujemy pierwszą platformę do analizy sekwencjonowania CLIP i PAR-CLIP specjalnie do analizy docelowych miRNA, a mianowicie miRTarCLIP. Od automatycznie usuwa sekwencje adaptorowe z surowych odczytów, filtruje odczyty niskiej filtruje odczyty niskiej jakości, zamienia C na T, dopasowuje odczyty do 3'UTR, skanuje w poszukiwaniu klastrów odczytów, identyfikuje miejsca docelowe miRNA o wysokim zaufaniu i zapewnia adnotacje z zewnętrznych baz danych. Dzięki technikom wielowątkowości i naszej nowatorskiej procedurze rewersji C do T miRTarCLIP znacznie skraca czas działania w porównaniu z konwencjonalnymi metodami. konwencjonalnymi metodami. Ponadto, miRTarCLIP jest wyposażony w internetowy interfejs interfejs, aby zapewnić lepsze doświadczenia użytkownika w przeglądaniu i wyszukiwaniu celów zainteresowanych miRNA. Aby zademonstrować doskonałą funkcjonalność miRTarCLIP, zastosowaliśmy miRTarCLIP do dwóch publicznie dostępnych zbiorów danych CLIP i PAR-CLIP. miRTarCLIP nie tylko wykazuje porównywalne wyniki z innymi istniejącymi narzędziami w znacznie szybszym czasie. narzędzi w znacznie szybszym tempie, ale także ujawnia interesujące cechy wśród tych domniemanych miejsc docelowych. W szczególności, wykorzystaliśmy miRTarCLIP do ujawnienia, że konwersja T do C w pozycjach 1-7 i w pozycjach 8-14 miejsc docelowych miRNA miRNA są znacząco różne (wartość p = 0,02), a nawet bardziej znaczące przy skupieniu się na miejscach docelowych tylko 102 miRNA o wysokiej ekspresji (wartość p = 0.01). Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami i sugerują, że że połączenie ekspresji miRNA i danych PAR-CLIP może poprawić dokładność przewidywania celu miRNA może poprawić dokładność przewidywania celu miRNA. WNIOSEK: Podsumowując, opracowaliśmy systematyczne podejście do wydobywania miejsc docelowych miRNA z danych sekwencjonowania CLIP-seq i PAR-CLIP oraz zintegrowaliśmy przepływ pracy z graficzną przeglądarką internetową, która zapewnia przyjazny dla użytkownika interfejs i szczegółową adnotację MTI. Pokazaliśmy również na rzeczywistych przykładach, że miRTarCLIP jest potężnym narzędziem do zrozumienia miRNA. Nasze zintegrowane narzędzie jest być swobodnie dostępne online pod adresem http://miRTarCLIP.mbc.nctu.edu.tw.
Jaka jest zasada metodologii PAR-CLIP?
W szczególności PAR-CLIP wykorzystuje fotoaktywny nukleozyd do bardziej wydajnego sieciowania.  Najnowsza metoda, PAR-CLIP, wykorzystuje fotoreaktywne nukleozydy do sieciowania RBP z docelowym RNA w komórkach przed immunoprecypitacją.  Jedną z charakterystycznych cech bibliotek cDNA przygotowanych za pomocą PAR-CliP jest to, że dokładna pozycja sieciowania może być zidentyfikowana przez mutacje występujące w sekwencjonowanym cDNA.   