Pomimo postępu w mechanistycznym zrozumieniu szlaków interferencji RNA (RNAi) szlaki, subkomórkowe miejsca wyciszania RNA pozostają przedmiotem dyskusji. Tutaj my pokazujemy, że ładowanie transfekowanych lipidami siRNA i endogennych mikroRNA (miRNA) do RISC (kompleksów wyciszających indukowanych RNA), napotkanie docelowego mRNA i za pośrednictwem Ago2 w komórkach ssaków są zarodkowane w szorstkim retikulum endoplazmatycznym. retikulum endoplazmatycznym (rER). Chociaż główne białka szlaku RNAi znajdują się w większości przedziałów subkomórkowych, populacje Ago2 załadowane miRNA i siRNA współosadzają się prawie wyłącznie z błonami rER, wraz z czynnikami RISC RISC (RLC) Dicer, białkiem wiążącym TAR RNA (TRBP) i aktywatorem białka aktywatorem kinazy białkowej indukowanej interferonem (PACT). Frakcjonowanie i i ko-immunologiczne precypitacje błonowe dodatkowo potwierdzają, że siRNA-loaded Ago2 fizycznie wiąże się z cytozolową stroną błony rER. Dodatkowo, dwuniciowe siRNA związane z RLC, diagnostyczne dla ładowania RISC i produkty rozszczepienia mRNA za pośrednictwem RISC wyłącznie współosadzają się z rER. Wreszcie, identyfikujemy TRBP i PACT jako kluczowe czynniki kotwiczące RISC do błon ER w sposób sposób niezależny od RNA. Łącznie nasze odkrycia pokazują, że zewnętrzna błona rER jest centralnym miejscem nukleacji wyciszania RNA za pośrednictwem siRNA. --- Jednym z najbardziej ekscytujących ostatnich odkryć w biologii RNA było odkrycie małych niekodujących RNA, które wpływają na ekspresję genów poprzez mechanizm RNA (RNAi). Dwie główne klasy RNA zaangażowane w RNAi to małe interferujące RNA (siRNA) i mikroRNA (miRNA). Dicer, enzym RNaza III, odgrywa centralną rolę w szlaku RNAi, rozszczepiając prekursory obu tych klas klas RNA, tworząc dojrzałe siRNA i miRNA, które są następnie ładowane do kompleksu wyciszającego Prekursory miRNA i siRNA różnią się od siebie strukturalnie; miRNA i siRNA są bardzo podobne. strukturalnie różne; prekursory miRNA są krótkimi, niedoskonałymi spinkami do włosów, podczas gdy prekursory siRNA są siRNA są długimi, doskonałymi dupleksami. Niemniej jednak, Dicer jest w stanie przetwarzać jedne i drugie. Dicer, podobnie jak większość enzymów RNazy III, zawiera domenę wiążącą dsRNA domenę wiążącą dsRNA (dsRBD), ale dane są skąpe na temat dokładnej roli tej domeny w mechanizmie wiązania i rozszczepiania Dicer. Aby dokładniej zbadać rolę ludzkiego Dicer-dsRBD w szlaku RNAi, określiliśmy jego wiązanie do różnych RNA modelujących zarówno prekursory miRNA, jak i siRNA. Nasze badanie pokazują, że Dicer-dsRBD jest silnym spoiwem dsRNA, ale jego wiązanie jest tylko minimalny wpływ na jego wiązanie ma połączenie jednoniciowe - dwuniciowe spowodowane przez duże pętle końcowe obserwowane w prekursorach miRNA. Zatem Dicer-dsRBD przyczynia się bezpośrednio do wiązania substratu, ale nie do mechanizmu rozróżniania między pre-miRNA i pre-siRNA. Ponadto, relaksacja spinowa NMR i symulacje MD zapewniają przegląd roli, jaką dynamika przyczynia się do mechanizmu wiązania. Porównujemy to obecne badanie z naszymi wcześniejszymi badaniami dsRBDs z Drosha i DGCR8, aby przedstawić dynamiczny profil dsRBDs w ich stanie apo i mechanistyczny obraz wiązania dsRNA przez dsRBDs w ogóle. --- Cytoplazmatyczny kompleks wyciszający indukowany RNA (RISC) zawiera białka wiążące dsRNA RNA, w tym aktywator kinazy białkowej RNA (PACT), białko wiążące transaktywację transaktywacji (TRBP) i Dicer, które przetwarzają pre-mikroRNA w dojrzałe mikroRNA (miRNA). dojrzałe mikroRNA (miRNA), które celują w określone gatunki mRNA w celu regulacji. Istnieje coraz więcej dowodów na ważne funkcjonalne interakcje między miRNA i sieciami sygnalizacyjnymi receptora jądrowego (NR), z ostatnimi danymi pokazującymi że estrogen, działając poprzez receptor estrogenowy, może modulować początkowe aspekty jądrowego przetwarzania miRNA. Tutaj pokazujemy, że cytoplazmatyczne białka RISC PACT, TRBP i Dicer są białkami wiążącymi aktywator RNA receptora steroidowego (SRA). NR, które celują w promotory reagujące na steroidy i regulują aktywność NR i regulują ekspresję genów. Ponadto, każde z białek RISC, wraz z Argonaute 2, wiąże się z SRA i specyficznymi pre-mikroRNA w zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie, dostarczając dowodów na powiązania między transkrypcją, w której pośredniczy NR transkrypcją i niektórymi czynnikami zaangażowanymi w przetwarzanie miRNA. --- Interferencja RNA (RNAi) oparta na sekwencji specyficznego wyciszania genów jest stosowana do funkcji genów, a także ma ogromny potencjał w hamowaniu replikacji wirusów zarówno u zwierząt, jak i roślin. replikacji wirusów zarówno u zwierząt, jak i roślin. Małe interferujące cząsteczki RNA (siRNA) są induktorami wyciszania genów w szlaku RNAi, ale mogą również wykazywać aktywność immunostymulującą i promować apoptozę. Kanoniczne siRNA mają długość 21 nukleotydów (nt) i są ładowane do kompleksu wyciszającego indukowanego RNA po wprowadzeniu do komórek, podczas gdy dłuższe cząsteczki siRNA są najpierw przetwarzane przez endogenny Dicer i dlatego są określane jako siRNA substratu Dicer (DsiRNA). Zastosowaliśmy zastosowaliśmy polimerazy RNA z bakteriofagów T7 i phi6 do wytwarzania wysokiej jakości dwuniciowych cząsteczek RNA, które są specyficzne dla genu UL29 wirusa herpes simplex virus (HSV). Dwuniciowe cząsteczki RNA o długości 653 nt zostały do puli siRNA i DsiRNA przy użyciu enzymów Dicer pochodzących od człowieka lub Giardia intestinalis, wytwarzając siRNA o długości odpowiednio około 21 i 27 nt. długości. Chemicznie zsyntetyzowane 21 i 27 nt jednomiejscowe siRNA ukierunkowane na UL29 zostały użyte jako punkty odniesienia. Wpływ tych siRNA na żywotność komórek żywotność komórek, reakcje zapalne, wyciszanie genów i aktywność anty-HSV były w komórkach pochodzących z ludzkiego układu nerwowego i skóry. Zarówno pule, jak i kanoniczne jednomiejscowe siRNA wykazywały znaczną aktywność przeciwwirusową, powodując zmniejszenie miana wirusa o cztery rzędy wielkości. Warto zauważyć, że pula siRNA DsiRNA powodowała niższą immunostymulację niż pula kanonicznych siRNA, podczas gdy efekt immunostymulacji był zależny od długości siRNA jednomiejscowych. siRNA z pojedynczym miejscem. Nasze wyniki sugerują również różnice w procesywności dwóch Dicerów. --- Dicer jest enzymem z rodziny endorybonukleaz RNazy III, który ma kluczowe znaczenie dla dla interferencji RNA (RNAi) u eukariontów. Dicer jest składnikiem maszynerii białkowej białkowego (RNA Induced Silencing Complex [RISC]), który jest zaangażowany w katalizowanie powstawania dojrzałych mikroRNA z ich prekursorów w procesie biogenezy mikroRNA. w procesie biogenezy mikroRNA. Związane z RISC mikroRNA wiążą się z określonymi sekwencjami sekwencjami w 3' nieulegającym translacji regionie kognatycznego mRNA, głównie poprzez komplementarne parowanie zasad, co skutkuje zahamowaniem translacji i/lub degradacji określonej puli mRNA. MikroRNA epigenetycznie regulują poziomy komórkowe receptorów, czynników transkrypcyjnych i białek sygnalizacyjnych, które regulują ścieżki rozwoju i funkcje wielu procesów komórkowych. Kluczowa rola odgrywana przez Dicer w tworzeniu mikroRNA wzbudziła również zainteresowanie immunologów molekularnych. zainteresowanie immunologów molekularnych, którzy starali się zrozumieć biologiczne znaczenie mikroRNA. znaczenie mikroRNA w rozwoju i funkcjonowaniu układu odpornościowego. Tutaj dokonujemy przeglądu głównych wyników tych badań i przedstawiamy przegląd roli Dicer i mikroRNA w rozwoju i funkcjonowaniu komórek odpornościowych. Dodatkowo, podkreślamy braki w naszej wiedzy i nowe obszary badawcze które mogą poprawić nasze zrozumienie roli Dicer i mikroRNA w odporności. odporności.
Czy Dicer jest częścią kompleksu ładującego RISC?
Tak, Dicer jest częścią kompleksu ładującego RISC.