Wcześniej odkryliśmy, że psi model selektywnej chirurgicznej denerwacji komorowej (VD) (VD), który nie pozwala na zwiększenie napięcia współczulnego podczas patogenezy niewydolności serca (HF). patogenezy niewydolności serca (HF), tolerował rozwój HF lepiej niż kontrole. Aby zbadać mechanizmy komórkowe, zbadaliśmy skurcz komórkowy skurcz komórkowy i prądy kanałów Ca(2+) typu L (I(Ca)) oraz ich odpowiedzi na stymulację receptora beta-adrenergicznego (beta-AR) w miocytach lewej komory z 1) kontrolnych, 2) VD, 3) HF indukowanej szybką stymulacją i 4) HF indukowanej w VD (VD-HF). Wielkość skurczu miocytów i szybkość relaksacji w VD były podobne do kontroli, ale były obniżone zarówno w HF, jak i VD-HF. Zmiany te były związane ze zmniejszoną ekspresją białka retikulum sarkoplazmatycznego Ca(2+)-ATPazy (SERCA2a) i kinazy białkowej A fosforylowanego fosfolambanu (PLB), który był zmniejszony w HF, ale zasadniczo zniesiony w VD-HF. kinaza beta-AR (GRK2) była zwiększona w HF, ale zmniejszona w VD-HF. Podstawowa gęstość I(Ca) nie różniła się między grupami kontrolnymi, VD i HF, ale miocyty VD-HF wykazywały znacznie znacznie zmniejszoną gęstość I(Ca) (około 40%). W porównaniu z grupą kontrolną, wrażliwość I(Ca) na izoproterenol (ISO) była znacząco wyższa w VD, ale zmniejszona w HF. HF. Podczas gdy odpowiedzi I(Ca) na ISO w VD-HF utrzymywały się na poziomach kontrolnych, amplituda amplituda I(Ca) stymulowanego przez ISO była znacznie mniejsza (o ok. 50%) w porównaniu z miocytami HF. Względny spadek napływu Ca(2+) spowodowany obniżenie gęstości I(Ca) może przyczyniać się do efektów kardioprotekcyjnych w sercach VD-HF poprzez zapobieganie przeciążeniu Ca(2+) podczas rozwoju HF. Odkrycia te, w połączeniu z wirtualnym zniesieniem fosforylowanego PLB w VD-HF i spadkiem GRK2, mogą częściowo wyjaśniać, dlaczego psy z VD tolerują rozwój HF lepiej niż psy kontrolne. rozwój HF lepiej niż psy kontrolne. --- Aktywacja sarkoplazmatycznej retikulum Ca2+-ATPazy mięśnia sercowego (SERCA2a) przez beta1-agonistów obejmuje zależną od cAMP i PKA fosforylację fosfolambanu (PLB), która łagodzi hamujące działanie PLB na SERCA2a. Aby zbadać mechanizm aktywacji SERCA2a, porównaliśmy właściwości kinetyczne SERCA2a wyrażonego z (+) i bez (-) PLB w komórkach owadów High Five mikrosomach do SERCA1 i SERCA2a w natywnych mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym SR. Zarówno natywna SERCA1, jak i wyrażona SERCA2a bez PLB wykazywały wysokie powinowactwo (10-50 mikroM) aktywację defosforylacji miejsca katalitycznego przed stanem ustalonym przez ATP, akumulację fosfoenzymu wrażliwego na ADP (E1P) w stanie ustalonym oraz szybka faza hydrolizy fosfoenzymu indukowanego przez EGTA (E2P). W przeciwieństwie do tego, SERCA2a w natywnych pęcherzykach SR serca i ekspresji SERCA2a z PLB brakowało aktywacji o wysokim powinowactwie przez ATP i szybkiej fazy hydrolizy E2P oraz wykazywały niskie poziomy E1P w stanie ustalonym. Wyniki wskazują, że różnice kinetyczne różnice w transporcie Ca2+ między szkieletowym i sercowym SR są spowodowane obecność fosfolambanu w SR serca, a nie z powodu zależnych od izoformy różnice między SERCA1 i SERCA2a. Dlatego wyniki są omawiane w modelu, w którym PLB zakłóca interakcje oligomeryczne SERCA2a, które są ważne dla mechanizmu transportu Ca2+ w mięśniach szkieletowych SERCA1 [Mahaney, J. E., Thomas, D. D., and Froehlich, J. P. (2004) Biochemistry 43, 4400-4416]. Proponujemy, aby międzycząsteczkowe sprzężenie cząsteczek SERCA2a podczas cyklu katalitycznego jest obowiązkowe dla zmian w transporcie Ca2+ które towarzyszą złagodzeniu hamowania PLB sercowej SR Ca2+-ATPazy. --- Dysfunkcja siateczki sarkoplazmatycznej (SR) jest jedną z wielu zmian, które występuje w sercach poddanych reperfuzji niedokrwiennej. Ponieważ funkcja SR jest regulowana przez fosforylację fosfolambanu (PLB), białka SR fosforylowanego przez kinazę białkową zależną od cAMP (PKA) przy Ser(16) i kinazę białkową zależną od Ca(2+) kalmoduliny (CaMKII). kinazę białkową (CaMKII) na Thr (17), fosforylacja tych reszt podczas niedokrwienia i reperfuzji badano w sercach szczurów poddanych perfuzji Langendorffa. Fosforylacja Ser(16) wzrosła znacząco po 20 minutach niedokrwienia z 2,5+/-0,6% do 99,8+/-25,5% maksymalnej specyficznej dla miejsca fosforylacji indukowanej izoproterenolem i zmniejszyła się do wartości kontrolnych natychmiast po reperfuzji. Fosforylacja Thr(17) przejściowo wzrosła po 2-5 minutach niedokrwienia i po 1 min. reperfuzji (R1, 166,2+/-28,2%). Wywołany niedokrwieniem wzrost fosforylacji Ser(16)fosforylacja była znacznie zmniejszona w sercach z zwierząt pozbawionych katecholaminy i / lub po beta-blokadzie i zniesiony w obecność inhibitora PKA, H-89. Fosforylacja Thr(17) na początku niedokrwienia niedokrwienia była stępiona przez nifedypinę, podczas gdy w R1 była znacząco zmniejszona przez perfuzję 0 m m Ca(2+) w obecności EGTA i przez inhibitora wymiennika Na(+)/Ca(2+) KB-R7943. KN-93, stosowany do specyficznego hamowania CaMKII, zmniejszył fosforylację Thr (17) w R1 i znacznie wydłużył połowę czasu relaksacji. czas relaksacji. Wyniki wykazały dysocjację między fosforylacją miejsc PLB, będąc fosforylacją Ser (16) zależną od kaskady beta-adrenergicznej kaskada beta-adrenergiczna podczas niedokrwienia i fosforylacja Thr (17) na napływ Ca(2+) zarówno na początku niedokrwienia, jak i reperfuzji. Fosforylacja Thr(17) na początku ponownego przepływu może zapewnić komórce mechanizm radzenia sobie z przeciążeniem Ca przeciążeniem Ca(2+), przejściowo sprzyjając przywróceniu relaksacji podczas wczesnej reperfuzji. reperfuzji. --- Indukowane fosforylacją przesunięcie ruchliwości formy o wysokiej masie cząsteczkowej fosfolambanu (24 500 daltonów) w retikulum sarkoplazmatycznym serca wytwarzanym na 3',5'-cykliczny AMP (cAMP) - zależna fosforylacja z 5 mM ATP została rozwiązana na pięć wyraźnych etapów na żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu elektroforezy (SDS-PAGE) i na fosforylację zależną od Ca2+-kalmoduliny na dziesięć etapów. Przesunięcie ruchliwości formy o niskiej masie cząsteczkowej fosfolambanu (mniej niż 14 400 daltonów) w tych reakcjach nastąpiło w jednym etapie i dwóch etapach. Przy dwóch aktywnościach kinazy białkowej elektroforetyczny wzór przesunięć ruchliwości form o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej i niskocząsteczkowych form fosfolambanu był podobny do tego uzyskanego z Ca2+-kinazy białkowej zależnej od kalmoduliny. Wyniki eksperymentów z wykorzystaniem metody kolumny wirówkowej sugerowały, że miejsce(a) fosforylacji przez aktywność kinazy białkowej zależnej od cAMP i Ca2+-kalmoduliny znajdują się na tej samej cząsteczce fosfolambanu. Dwuwymiarowe mapy peptydów tryptycznych fosforylowanego fosfolambanu wskazują, że kinaza białkowa zależna od cAMP fosforyluje w pojedynczym miejscu, A, a kinaza białkowa zależna od Ca2+-kalmoduliny fosforyluje w miejscach C1 i C2 w formie o niskiej masie cząsteczkowej, gdzie A jest różni się od C1, ale może być taki sam jak C2. Forma o wysokiej masie cząsteczkowej fosfolambanu sugeruje się, że jest pentamerem identycznych monomerów (niskocząsteczkowa forma o niskiej masie cząsteczkowej) posiadającym jedno miejsce fosforylacji dla kinazy białkowej zależnej od cAMP i dwa dla kinazy białkowej zależnej od Ca2+-kalmoduliny. --- Fosfolamban (PLB) jest białkiem retikulum sarkoplazmatycznego (SR), które gdy fosforylowane w Ser16 przez PKA i / lub w Thr17 przez CaMKII zwiększa powinowactwo pompy SR Ca2+ dla Ca2+. PLB jest zatem krytycznym regulatorem funkcji SR funkcji, relaksacji mięśnia sercowego i kurczliwości mięśnia sercowego. Niniejsze badanie zostało podjęte w celu zbadania stanu fosforylacji PLB po niedokrwieniu i reperfuzji i dostarczenie dowodów na temat możliwej roli fosforylacji reszty Thr17 PLB w odzyskiwaniu kurczliwości i relaksacji po okresie niedokrwienia. Eksperymenty przeprowadzono w Langendorff perfundowanych sercach szczurów rasy Wistar. Serca poddano protokołowi globalnego normotermicznego niedokrwienia i reperfuzji. Wyniki wykazały, że (1) fosforylacja fosforylacja reszt Ser16 i Thr17 PLB wzrosła pod koniec niedokrwienia i początku reperfuzji. Wzrost fosforylacji Thr17 był związany z przywróceniem relaksacji do wartości sprzed niedokrwienia. wartości sprzed niedokrwienia. Powrót ten nastąpił pomimo faktu, że kurczliwość była kurczliwości. (2) Indukowany reperfuzją wzrost fosforylacji Thr17 był zależny od napływu Ca2+ do komórki mięśnia sercowego. Ten napływ Ca2+ występowałby głównie poprzez sprzężoną aktywację wymiennika Na+/H+ i wymiennika Na+/Ca2+ działającego w trybie odwrotnym, ponieważ fosforylacja Thr17 została zmniejszona przez hamowanie tych wymienników i nie ma na nie wpływu blokada kanałów Ca2+ typu L. typu L. (3) Specyficzne hamowanie CaMKII przez KN93 znacząco zmniejszyło fosforylację Thr17. fosforylację Thr17. Spadek ten był związany z upośledzeniem relaksacji mięśnia sercowego. Niniejsze badanie sugeruje, że fosforylacja Thr17 PLB po ponownym przepływie może sprzyjać pełnemu przywróceniu relaksacji po niedokrwieniu. niedokrwieniu. --- Retikulum sarkoplazmatyczne (SR) odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w kurczliwości serca. a jego funkcja jest nieprawidłowa w sercu chorego na cukrzycę. Jednakże, mechanizmy mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji SR w sercu cukrzycowym nie są jednak jasne. Ponieważ fosforylacja białek reguluje funkcję SR, w niniejszym badaniu zbadano stan fosforylacji fosfolambanu, kluczowego białka SR, które reguluje wychwyt wapnia (Ca2+) przez SR wychwyt wapnia (Ca2+) w sercu. Cukrzycę wywołano u samców szczurów Sprague-Dawley szczurów przez wstrzyknięcie streptozotocyny (STZ; 65 mg kg (-1) i.v.), a zwierzęta zostały humanitarnie zabite po 6 tygodniach i zbadano funkcję SR serca. Obniżona wydolność serca była związana ze zmniejszonym wychwytem SR Ca2+ u zwierząt z cukrzycą. u zwierząt z cukrzycą. Zmniejszenie wychwytu SR Ca2+ było zgodne ze znacznym spadkiem poziomu ATPazy pompy SR Ca2+ (SERCA2a) białka. Poziom białka fosfolambanu (PLB) był jednak również obniżony, stosunek PLB do SERCA2a był zwiększony w sercu cukrzycowym. Obniżony wychwyt SR Ca2+ był również spowodowany zmniejszeniem fosforylacji PLB przez układ kinazę białkową zależną od Ca2+-kalmoduliny (CaMK) i kinazę białkową zależną od cAMP (PKA). kinazę białkową zależną od cAMP (PKA). Chociaż aktywność związanej z SR kinazy białkowej zależnej od Ca2+-kalmoduliny (CaMK), kinazy białkowej zależnej od cAMP (PKA) były zwiększone w sercu cukrzycowym, obniżona fosforylacja PLB można częściowo przypisać wzrostowi aktywności fosfatazy białkowej związanej z SR aktywności fosfatazy białkowej związanej z SR. Wyniki te sugerują, że istnieje zwiększone hamowanie SERCA2a przez PLB i wydaje się, że jest to główny defekt leżący u podstaw dysfunkcji SR w sercu chorych na cukrzycę. --- Oligomeryczne interakcje między łańcuchami polipeptydowymi Ca-ATPazy i ich modulację przez fosfolamban (PLB) mierzono w natywnych mikrosomach retikulum sarkoplazmatycznego serca mikrosomach retikulum sercowego (SR). Stopniowa modyfikacja Lys(514) za pomocą fluoresceiny 5-izotiocyjanianem (FITC), który fizycznie blokuje dostęp do miejsca wiązania nukleotydu przez ATP. przez ATP, pokazuje, że miejsca aktywne Ca-ATPazy funkcjonują niezależnie od siebie przed niezależnie od siebie przed fosforylacją PLB. Jednakże, po zależnej od cAMP kinazy białkowej (PKA) fosforylacji PLB, zależność drugiego rzędu zależność między resztkową aktywnością enzymu a frakcją aktywnych miejsc jest zaobserwowano, co jest zgodne z funkcjonalnym kompleksem dimerycznym. Uzupełniające pomiary odległości wykonano przy użyciu FITC lub 5-jodoacetamidofluoresceiny (IAF) związanej z Cys(674) odpowiednio w domenach N lub P, w celu wykrycia sprzężenia strukturalnego w kompleksach oligomerycznych. Towarzysząca fosforylacji PLB, sąsiednie łańcuchy polipeptydowe Ca-ATPazy wykazują spadek o 4 +/- 2 A w bliskość między miejscami FITC w domenie N i 9 +/- 3 A wzrost w bliskość między miejscami IAF w domenach P. Zatem fosforylacja PLB indukuje rearanżacje przestrzenne między elementami domeny N i P proksymalnego polipeptydu łańcuchów polipeptydowych Ca-ATPazy, które przywracają funkcjonalne interakcje między sąsiednimi łańcuchami polipeptydowymi i sąsiadującymi łańcuchami polipeptydowymi, co z kolei skutkuje zwiększoną szybkością obrotu katalitycznego. obrotu katalitycznego. Wyniki te są interpretowane w kategoriach modelu strukturalnego modelu strukturalnego, obliczonego poprzez optymalizację komplementarności kształtu, desolwatacji, i energii elektrostatycznych, który sugeruje dimeryczny układ łańcuchów polipeptydowych Ca-ATPazy łańcuchów polipeptydowych poprzez proksymalne połączenie domen N, które umożliwia interakcję z PLB. Sugerujemy, że fosforylacja PLB działa w celu uwolnienia ograniczeń obejmujących interakcje podjednostek międzydomenowych, które zwiększają katalitycznie ważne ruchy domeny N. --- Chociaż wiadomo, że kardiomiopatia rozstrzeniowa (DCM) powoduje dysfunkcję skurczową serca serca, mechanizmy leżące u jej podstaw są niejasne. Retikulum sarkoplazmatyczne (SR) jest głównym regulatorem wewnątrzkomórkowego Ca2+ wymaganego do skurczu i rozkurczu serca. skurczu i rozkurczu serca. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że nieprawidłowości w funkcjonowaniu i regulacji funkcji i regulacji SR przyczynią się do dysfunkcji skurczowej serca kardiomiopatycznego chomika J2N-k, odpowiedniego modelu DCM. Ocena echokardiograficzna wskazywała na dysfunkcję skurczową, ponieważ frakcja wyrzutowa, frakcja skracania, pojemność minutowa serca i częstość akcji serca były u chomików J2N-k w porównaniu z grupą kontrolną. Obniżona Funkcja serca była związana ze zmniejszonym wychwytem SR Ca2 + w sercu kardiomiopatycznych chomików. Zmniejszony wychwyt SR Ca2+ może być dalej powiązany z zmniejszenie ekspresji SR Ca(2+)-ATPazy i zależnej od cAMP kinazy białkowej (PKA) fosforylacji fosfolambanu (PLB) przy serynie-16. Obniżonej fosforylacji PLB towarzyszyło zmniejszenie aktywności PKA związanej z SR. PKA związanej z SR, a także wzrost aktywności fosfatazy białkowej w J2N-k chomika. Wyniki tego badania sugerują, że zmiany w funkcji SR i jego regulacja przyczyniają się do dysfunkcji kurczliwości serca w J2N-k kardiomiopatycznego chomika. --- Status fosforylacji fosfolambanu (PLB) w niedokrwionych sercach pozostaje kontrowersyjny. serca pozostaje kontrowersyjny. Chociaż spadek fosforylacji obu reszt PLB (Ser16, miejsce PKA i Thr17, miejsce CaMKII) został wcześniej zgłoszony, eksperymenty z naszego laboratorium nie wykryły tego spadku. W próbie wyjaśnić przyczynę tej rozbieżności, eksperymenty przeprowadzono w Langendorffa z dwoma głównymi celami: (1) Określenie, czy utrzymanie stymulacji podczas niedokrwienia, protokół stosowany w innych modelach modelach niedokrwienia i reperfuzji, zmniejsza fosforylację reszt PLB, poniżej wartości przed niedokrwieniem; (2) Zbadanie, czy maksymalne wyzwanie beta-adrenergiczne pozwala wykryć spadek zdolności PLB do bycia fosforylowanym w sercach poddanych reperfuzji niedokrwiennej. Serca zostały poddane globalnemu protokół niedokrwienia/reperfuzji (20/30 min) z (P) lub bez (NP) stymulacji podczas niedokrwienia, a fosforylację reszt PLB oceniano metodą immunodetekcji. Przywrócenie kurczliwości po reperfuzji było niższe w sercach P w porównaniu z sercami NP. Ser16 PLB był fosforylowany pod koniec niedokrwienia w sercach NP. Ten wzrost pojawił się wcześniej w sercach P i był znacznie zmniejszony przez katecholaminy i beta-blokadę. Miejsce Thr17 było fosforylowane na początku początku niedokrwienia i początku reperfuzji. Wywołana niedokrwieniem fosforylacja Thr17 była wyższa i bardziej trwała w sercach P w porównaniu z sercami NP, i hamowana przez bloker kanału wapniowego, nifedypinę, podczas gdy indukowany reperfuzją wzrost fosforylacji Thr17 był podobny w sercach P i NP i był znacząco zmniejszony przez inhibitor wymiennika Na+/Ca2+ KB-R7943. Fosforylacja reszt PLB nie spadła poniżej poziomów podstawowych w żadnym momencie podczas niedokrwienia i reperfuzji. Jednak fosforylacja, inotropowa i lusitropowa odpowiedź na stymulację beta-adrenergiczną była znacząco zmniejszona zarówno w sercach P, jak i NP. --- Fosfolamban, proteolipid retikulum sarkoplazmatycznego serca, jest fosforylowany przez przez kinazę białkową zależną od cAMP, przez kinazę białkową zależną od Ca2+/fosfolipidów, oraz przez endogenną kinazę białkową zależną od Ca2+/kalmoduliny, której tożsamość pozostaje do określenia. która pozostaje do zdefiniowania. Celem tego badania było zatem scharakteryzowanie tej ostatniej kinazy, zwanej kinazą fosfolambanu. Kinaza fosfolambanowa została oczyszczona około 42-krotnie z wydajnością 11%. Oczyszczona frakcja wykazuje specyficzną aktywność 6,5 nmol fosforanu włączonego do egzogennego fosfolambanu na minutę na miligram białka. Kinaza fosfolambanu wydaje się być enzymem o wysokiej masie cząsteczkowej i wykazuje szeroką specyficzność substratową, synapsynę-1, syntazę glikogenu i miozynę mięśni gładkich są najlepszymi substratami. Kinaza fosfolambanu fosforyluje synapsynę-1 na peptydzie o Mr 30 000. Enzym wykazuje optymalne pH 8,6, Km dla ATP 9 mikroM i zapotrzebowanie na jony Mg2+. Dane te sugerują, że kinaza fosfolambanu może być izoenzymem wielofunkcyjnej kinazy białkowej zależnej od Ca2+/kalmoduliny. W związku z tym poszukiwaliśmy Mr 50 000-60 000 wśród białek retikulum sarkoplazmatycznego serca. białka. Stwierdzono, że białko o Mr 56 000 jest fosforylowane w obecności Ca2+/kalmoduliny. Taka fosforylacja zmienia prędkość migracji elektroforetycznej białka. prędkość migracji elektroforetycznej białka. Ponadto, to białko wiążące kalmodulinę było zawsze obecne we frakcjach zawierających kinazę fosfolambanu aktywność. To białko Mr 56 000 jest zatem dobrym kandydatem do bycia podjednostką kinazy fosfolambanu. Jednak białko wiążące kalmodulinę o Mr 56 000 białko i wewnętrzna glikoproteina Mr 53 000, która wiąże ATP, to dwa odrębne jednostki.
Czy fosfolamban jest fosforylowany przez kinazę białkową A?
Fosfolamban (PLB) jest białkiem retikulum sarkoplazmatycznego (SR), które jest fosforylowane przy Ser16 przez PKA. Fosforylacja PLB przez PKA odwraca hamujące działanie PLB.