Białko alfa-synukleina (AS) jest głównym składnikiem fibrylarnym ciał Lewy'ego, patologicznej cechy choroby Parkinsona. ciał Lewy'ego, patologicznej cechy charakterystycznej choroby Parkinsona. Ludzka AS typu dzikiego i trzy zmutowane formy związane z chorobą Parkinsona (A53T, A30P i E46K) wszystkie tworzą fibryle poprzez szlak zależny od zarodkowania; jednakże biofizyczne szczegóły tych zdarzeń fibrylacji nie są jeszcze dobrze poznane. Wgląd strukturalny na poziomie atomowym strukturalny jest wymagany w celu wyjaśnienia potencjalnej roli fibryli AS w chorobie Parkinsona. Tutaj pokazujemy, że niskotemperaturowa akwizycja widm NMR fibryli AS typu dzikiego w niskiej temperaturze znacznie zwiększa czułość spektralną, umożliwiając wykrycie znacznie większej liczby układów spinowych. systemów spinowych. W temperaturze próbki 0 +/- 3 stopnie C, polaryzacja krzyżowa (CP) eksperymenty dają słabe sygnały. Widma w niższej temperaturze (-40 +/- 3 stopnie C) wykazały kilkakrotnie większą intensywność sygnału, efekt dodatkowo wzmocniony w eksperymentach 3D 15N-13C-13C, które są wymagane do wykonania szkieletu na tej próbce. W ten sposób eksperymenty 3D umożliwiły przypisanie większości aminokwasów w sztywnej części fibryli (w przybliżeniu reszty od 64 do 94), a także wstępne przypisania specyficzne dla miejsca dla T22, V26, A27, Y39, G41, S42, H50, V52, A53, T54, V55, V63, A107, I112 i S129. Większość z tych sygnałów była nie zaobserwowano w widmach 2D lub 3D w temperaturze 0 +/- 3 stopni C. Widma uzyskane w niskich temperaturach pozwoliły zatem na bardziej kompletne przypisanie przesunięć chemicznych. temperaturach pozwoliły na bardziej kompletne przypisanie przesunięcia chemicznego. Obserwacja większości reszt we włóknach AS stanowi ważny krok w kierunku rozwiązania struktury 3D. krok w kierunku rozwiązania struktury 3D. --- Mutacje w genie alfa-synukleiny są powiązane z rzadkimi przypadkami rodzinnej choroby Parkinsona (PD). Parkinsona (PD). Alfa-synukleina jest głównym składnikiem ciał Lewy'ego (LB), patologicznej cechy charakterystycznej PD. Transgeniczne myszy i Drosophila wyrażające typu dzikiego lub zmutowaną ludzką alfa-synukleinę rozwijają deficyty motoryczne, LB-podobne w niektórych neuronach i degenerację neuronów. Jednak związek między nieprawidłowymi agregatami alfa-synukleiny a degeneracją ludzkich neuronów dopaminergicznych (DA) pozostaje niejasny. pozostaje niejasny. W niniejszym raporcie zbadaliśmy wpływ ekspresji alfa-synukleiny na neurony DA w pierwotnej hodowli embrionalnego ludzkiego mezencefalonu. ludzkiego mezencefalonu. Dwa dni po hodowli, ludzkie komórki DA transdukowano za pomocą typ dziki lub zmutowany ludzki (Ala (53) Thr) adenowirusy alfa-synukleiny i utrzymywano przez 5 dni. Nadekspresja zmutowanej i dzikiej ludzkiej alfa-synukleiny spowodowała utratę odpowiednio 49% (P<0,01) i 27% (P<0,05) neuronów DA, odpowiednio, nie wpływając na żywotność innych komórek w hodowli. Nadekspresja szczurzej alfa-synukleiny lub GFP (zielonego białka fluorescencyjnego) nie miała wpływu na przeżywalność neuronów DA. wpływu na przeżywalność neuronów DA. Cytoplazmatyczne inkluzje alfa-synukleiny zostały wykryto immunohistochemicznie w komórkach DA transdukowanych zmutowaną ludzką alfa-synukleiną, ale nie alfa-synukleiną typu dzikiego. Wyniki te pokazują, że nadekspresja ludzkiej alfa-synukleiny, w szczególności zmutowanej formy, może powodować śmierć ludzkich neuronów DA, co sugeruje, że alfa-synukleina może odgrywać główną rolę w patogenezie PD. w patogenezie PD. --- Choroba Parkinsona (PD) jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się ciał Lewy'ego (LB) w neuronach dopaminergicznych w istocie czarnej i postępującą utratą tych neuronów. w neuronach dopaminergicznych w istocie czarnej i postępującą utratą tych neuronów. Niedawno zidentyfikowano mutacje w genie alfa-synukleiny we rodzinnej PD o wczesnym początku, a alfa-synukleinę uznano za główny składnik LB u wszystkich pacjentów. składnikiem LB u wszystkich pacjentów. Jednak patofizjologiczna funkcja alfa-synukleiny alfa-synukleiny pozostaje nieznana. W tym raporcie zbadaliśmy toksyczne skutki wpływ nadekspresji alfa-synukleiny za pośrednictwem adenowirusa na neurony dopaminy neurony w pierwotnych hodowlach mezencefalicznych szczurów oraz w szczurzych komórkach dopaminergicznych szczurzych komórkach dopaminergicznych - unieśmiertelnionym dużym antygenie T, pochodzącym z mezencefalonu 1RB3AN27 (N27). Hodowle transdukowane adenowirusem wykazywały wysoki poziom ekspresji alfa-synukleiny w komórkach. Nadekspresja ludzkiej zmutowanej alfa-synukleiny (Ala(53)Thr) selektywnie indukowała apoptotyczną zaprogramowaną śmierć komórek pierwotnych neuronów dopaminergicznych jak również komórek N27. Zmutowane białko nasilało również neurotoksyczność 6-hydroksydopaminy (6-OHDA). Natomiast nadekspresja ludzkiej alfa-synukleiny typu dzikiego alfa-synukleiny nie była bezpośrednio neurotoksyczna, ale zwiększała śmierć komórek po 6-OHDA. Nadekspresja szczurzej alfa-synukleiny typu dzikiego nie miała wpływu na przeżycie komórek dopaminy lub neurotoksyczność 6-OHDA. Wyniki te wskazują, że nadekspresja ludzkiej zmutowanej alfa-synukleiny bezpośrednio prowadzi do śmierci neuronów dopaminergicznych, a nadekspresja śmierć, a nadekspresja ludzkiej zmutowanej lub ludzkiej dzikiej typu alfa-synukleiny sprawia, że neurony dopaminergiczne są bardziej podatne na działanie neurotoksyczne. --- Naturalnie nieuporządkowane białka są rosnącą klasą anomalii w paradygmacie struktura-funkcja. paradygmatu struktura-funkcja. Naturalnie nieuporządkowane białko alfa-synukleina jest głównym składnikiem ciał Lewy'ego, komórkowej cechy charakterystycznej choroby Parkinsona. Parkinsona. Zauważyliśmy dramatyczną różnicę w rozcieńczonym roztworze 1H-15N Heteronuklearna pojedyncza koherencja kwantowa (HSQC) typu dzikiego alfa-synukleiny i dwóch mutantów związanych z chorobą (A30P i A53T), z widmami zebrane w temperaturze 35 stopni C wykazują mniej pików krzyżowych niż widma uzyskane w temperaturze 10 stopni C. Tutaj pokazujemy, że zmiana jest wynikiem odwracalnej wymiany konformacyjnej związanej ze wzrostem konformacji. wymiana konformacyjna związana ze wzrostem promienia hydrodynamicznego i struktury drugorzędowej wraz ze wzrostem temperatury. W połączeniu z analitycznymi dane ultrawirowania pokazujące, że alfa-synukleina jest monomeryczna w obu temperaturach temperaturach, dochodzimy do wniosku, że słaba jakość widm 1H-15N HSQC uzyskanych w temperaturze 35 stopni C jest spowodowana fluktuacjami konformacyjnymi, które występują na skali czasu przesunięcia chemicznego protonu. Używając skróconego wariantu alfa-synukleiny, pokazujemy, że wymiana konformacyjna zachodzi w pierwszych 100 aminokwasach białka. białka. Nasze dane ilustrują kluczową różnicę między białkami kulistymi i natywnie nieuporządkowanymi. nieuporządkowanymi białkami. Właściwości białek globularnych zmieniają się nieznacznie w warunkach warunki roztworu, aż do momentu ich kooperatywnej denaturacji, ale właściwości białek natywnie nieuporządkowanych białek mogą się znacznie różnić w zależności od warunków panujących w roztworze. --- Głównym składnikiem białkowym ciał Lewy'ego (LBs), patologicznej cechy charakterystycznej Parkinsona i otępienia z ciałami Lewy'ego, jest alfa-synukleina. alfa-synukleinę, ale inne białka, w szczególności związane z mikrotubulami białko białko tau, są zaangażowane w patogenezę ciał Lewy'ego. Tau jest głównym strukturalnym składnikiem splątków neurofibrylarnych (NFT). Zarówno bezpośrednie immunochemiczne częściowo oczyszczonych LB, jak i pośrednie badania immunohistochemiczne sugerowały, że LB mogą zawierać tau, ale większość z tych badań opierała się na tych badań opierała się na pojedynczym przeciwciele tau, a immunologiczna reaktywność krzyżowa nie została całkowicie wykluczona. Aby uzyskać wgląd w związek między tau i alfa-synukleiną w ciałach Lewy'ego przeprowadzono podwójne barwienie immunologiczne przypadkach ciał Lewy'ego z króliczym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko alfa-synukleinie i panelem przeciwciał monoklonalnych do epitopów fosfo- i niefosfo-tau (Alz50, CP9, CP13, PG5, TG3, PHFI), które obejmowały długość cząsteczki tau. Tau-immunoreaktywne LB były obecne w rdzeniu w 80% przypadków, niezależnie od stadium Braaka. Wszystkie przeciwciała tau rozpoznawały przynajmniej niektóre LB, co przemawia przeciwko niespecyficznej reaktywności krzyżowej przeciwciał. W większości zmian tau było obecne na obrzeżach LB. Przeciwciało fosfo-tau, TG3, wykryło więcej LB niż którekolwiek z pozostałych przeciwciał tau. Odsetek LB z immunoreaktywnością tau był największy w neuronach wrażliwych na NET, takich jak neuronach podatnych na NET, takich jak te w locus ceruleus i jądrze podstawnym Meynerta, a najmniej w neuronach neuronach odpornych na NFT, takich jak grzbietowe jądro ruchowe błędnika w rdzeniu rdzenia. Obecne wyniki sugerują, że tau może koagregować z alfa-synukleiną w LB, szczególnie w populacjach neuronów podatnych zarówno na NFT i LB. --- Alfa-synukleina (α-Syn) jest głównym składnikiem białkowym ciał Lewy'ego, patologicznej cechy choroby Parkinsona (PD). patologiczną cechą charakterystyczną choroby Parkinsona (PD). Białko to może regulować aktywność fosfatazy białkowej 2A (PP2A), chociaż mechanizmy molekularne dla α-Syn pośredniczy w regulacji PP2A i potencjalnych działań neuroprotekcyjnych PP2A przeciwko patologii związanej z PD pozostają w dużej mierze niezbadane. Stwierdziliśmy, że nadekspresja genu α-Syn w komórkach SK-N-SH i pierwotnych neuronach prowadziła do fosforylacji PP2A/C fosforylacji w Y307, znanym celu kinazy Src, i w konsekwencji hamowanie fosfatazy. Ponadto, fosfo-aktywowany Src (p-Y416 Src, pSrc) był wyższy w komórkach SK-N-SH i pierwotnych neuronach z nadekspresją α-Syn. Tak więc, α-Syn może promować aktywację Src i inaktywację PP2A, prowadząc do hiperfosforylacji białek. Immunoprecypitacja ujawniła wyższe tworzenie kompleksu kalmodulina/Src w komórkach z nadekspresją α-Syn i u myszy transgenicznych α-Syn transgenicznych myszy. Test apoptozy TUNEL i test żywotności komórek MTT wykazały, że aktywator PP2A C2-ceramid chronił neurony przed uszkodzeniem komórek wywołanym przez α-Syn. Buforowanie wzrostu poziomu Ca(2+) indukowanego przez nadekspresję α-Syn łagodziło cytotoksyczność α-Syn. Nasze odkrycia definiują potencjalny mechanizm molekularny regulacji PP2A za pośrednictwem α-Syn poprzez tworzenie kompleksu kalmodulina/Src, aktywację Src i za pośrednictwem Src zahamowanie fosforylacji PP2A. Nadekspresja α-Syn może prowadzić do neurodegeneracji w PD częściowo poprzez tłumienie endogennej aktywności neuroprotekcyjnej PP2A. aktywność PP2A. --- Agregacja α-synukleiny (αSyn), głównego składnika białkowego w ciałach Lewy'ego w ciałach Lewy'ego u pacjentów z chorobą Parkinsona, powstaje, gdy normalnie rozpuszczalne, wewnętrznie nieuporządkowane białko przekształca się w fibryle amyloidowe. W tej pracy przedstawiamy mechanistyczne spojrzenie na rolę N-końcowej acetylacji na fibrylacji poprzez ustalenie ilościowego związku między monomerem wtórną skłonnością strukturalną i kinetyką montażu fibryli, a po drugie przez wykazanie w N-końcowej acetylowanej formie wczesnej mutacji A53T że N-końcowe przejściowe helisy utworzone i/lub zahamowane przez N-końcową acetylację modulują szybkość montażu fibryli. Wykorzystując przesunięcia chemiczne NMR przesunięcia chemiczne i eksperymenty fluorescencyjne, donosimy, że wtórna struktura w resztach 5-8, 14-31 i 50-57 są silnie skorelowane z szybkością wzrostu fibryli. szybkością wzrostu. Czterokierunkowe porównanie drugorzędowej skłonności strukturalnej i szybkości wzrostu fibryli szybkości wzrostu N-końcowo acetylowanych A53T i WT αSyn z nieacetylowanymi A53T i WT αSyn przedstawia nowy mechanistyczny wgląd w rolę N-końcowej acetylacji w amyloidozie. acetylacji w tworzeniu włókien amyloidowych. Pokazujemy, że N-końcowa acetylacja hamuje tworzenie "promującej fibrylację" przejściowej helisy przy resztach 14-31 resztach 14-31 wynikających z mutacji A53T w wariancie nieacetylowanym i wspiera tworzenie "hamującej fibrylację" przejściowej helisy w resztach resztach 1-12, co skutkuje wolniejszym tempem fibrylacji w porównaniu do wcześniej badanego nieacetylowanego wariantu A53T. Nasze wyniki podkreślają krytyczną interakcję specyficznej dla regionu przejściowej struktury drugorzędowej N-końcowego regionu z fibrylacją i hamującą rolą N-końcowej grupy acetylowej w fibrylacji. grupy acetylowej w tworzeniu fibryli. --- Włóknista α-synukleina (α-Syn) jest głównym składnikiem ciał Lewy'ego, które są widoczne u osób z chorobą Parkinsona (PD). są widoczne u osób dotkniętych chorobą Parkinsona (PD). Ta neuropatologiczna forma α-Syn odgrywa kluczową rolę w progresji PD, jak wykazano propaguje się między neuronami. Narzędzia, które zakłócają montaż α-Syn lub zmieniają właściwości fizykochemiczne fibryli, mają potencjalne właściwości właściwości terapeutyczne, ponieważ mogą być wystarczające do zakłócenia i/lub zatrzymania transmisji między komórkami i systematycznego rozprzestrzeniania się zespołów α-Syn w ośrodkowym układzie nerwowym. ośrodkowego układu nerwowego. Chaperony molekularne kręgowców z grupy konstytutywnego/indukowalnego białka szoku cieplnego 70 (Hsc/p70) zostały wykazano, że utrudniają gromadzenie się rozpuszczalnego α-Syn w fibryle i wiążą się z fibrylami fibryli i bardzo znacząco zmniejszają ich toksyczność. Aby zrozumieć, w jaki sposób członkowie rodziny Hsc70 sekwestrują rozpuszczalną α-Synę, przeprowadziliśmy eksperymenty w celu zidentyfikowania molekularne interfejsy powierzchniowe przyzwoitka-α-Syn. Usieciowaliśmy ludzkie Hsc70 i jego drożdżowy homolog Ssa1p i α-Syn za pomocą chemicznego środka sieciującego i zmapowaliśmy interfejsy Hsc70- i Ssa1p-α-Syn. Pokazujemy, że domena wiążąca klienta Hsc70 i Ssa1p wiąże dwa regiony w obrębie α-Syn podobne do pincety, przy czym pierwszy obejmujący reszty 10-45, a drugi obejmujący reszty 97-102. Nasze ustalenia określają, co jest konieczne i wystarczające do inżynierii Hsc70- i Ssa1p o właściwościach minichaperonu z potencjałem jako środki terapeutyczne w chorobie Parkinsona poprzez terapeutycznych w chorobie Parkinsona poprzez ich zdolność do wpływania na α-Syn i/lub toksyczność. --- Alfa-synukleina stanowi główny składnik ciał Lewy'ego i neurytów Lewy'ego, definiujących cechy neuropatologiczne choroby Parkinsona i demencji. definiujących cechy neuropatologiczne choroby Parkinsona i demencji z ciałami Lewy'ego. Tutaj pokazujemy, że alfa-synukleina jest również głównym składnikiem nitkowatych inkluzji zaniku wieloukładowego, który obejmuje kilka chorób neurodegeneracyjnych ze wspólną nitkowatą patologią w komórkach nerwowych i komórkach glejowych. Odkrycia te zapewniają nieoczekiwany związek między zanikiem wieloukładowym i zaburzeniami ciał Lewy'ego i ustalają, że alfa-synukleinopatie stanowią główną klasę ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. neurodegeneracyjnych. --- Alfa-synukleina gromadzi się w mózgach pacjentów ze sporadyczną chorobą Parkinsona jako główny składnik ciał Lewy'ego. jako główny składnik ciał Lewy'ego, a mutacje w alfa-synukleinie są związane z rodzinnymi postaciami choroby Parkinsona. Patogenne mechanizmy mechanizmy, które poprzedzają i promują agregację alfa-synukleiny do ciał Lewy'ego w neuronach pozostają do ustalenia. Tutaj skonstruowaliśmy serię wzmocnione alfa-synukleiną zielone białko fluorescencyjne (alfa-synukleinaEGFP, SynEGFP), aby ustalić, czy mutacje związane z chorobą Parkinsona mutacje zmieniają subkomórkową dystrybucję alfa-synukleiny i do wykorzystania jako narzędzie do eksperymentalnych manipulacji w celu wywołania tworzenia agregatów. Kiedy transfekowane do pierwotnych neuronów hodowanych na myszach, 49-kDa alfa-synukleinaEGFP są częściowo skracane do postaci około 27-kDa. To niefluorescencyjne karboksy-terminalnie zmodyfikowane białko fuzyjne spontanicznie tworzy w cytoplazmie neuronów. Wyraźny wzrost akumulacji inkluzji jest wykrywany po leczeniu każdym z trzech inhibitorów proteasomu inhibitorami proteasomu, n-acetylo-leu-leu-norleukiną, laktacystyną i MG132. Interesujące, Ala30Pro alfa-synukleinaEGFP nie tworzy cytoplazmatycznych inkluzji, które są charakterystyczne dla alfa-synukleinyEGFP typu dzikiego i Ala53Thr, wspierając koncepcję pomysł, że konformacja białka alfa-synukleiny Ala30Pro różni się od alfa-synukleiny typu dzikiego. Podobne inkluzje powstają, gdy karboksyterminus alfa-synukleiny jest modyfikowana przez dodanie znacznika epitopowego V5/6xHistidine. Natomiast nadekspresja niezmodyfikowanej alfa-synukleiny nie prowadzi do tworzenia agregatów. tworzenia agregatów. Co więcej, synfilina-1, białko oddziałujące z alfa-synukleiną białko występujące również w ciałach Lewy'ego, kolokalizuje z karboksy-terminalnie skróconą alfa-synukleiną. skróconym białkiem fuzyjnym alfa-synukleiny w dyskretnych inkluzjach cytoplazmatycznych. Nasze odkrycie, że manipulacje karboksy-końcem alfa-synukleiny prowadzą do tworzenia inkluzji, może stanowić model do badań nad alfa-synukleiną. może stanowić model do badań nad mechanizmami patogennymi alfa-synukleiny. agregacji alfa-synukleiny w ciałach Lewy'ego. --- Choroba Parkinsona jest najczęstszym neurodegeneracyjnym zaburzeniem ruchowym. α-synukleina jest niewielkim białkiem synaptycznym, które zostało powiązane z rodzinną chorobą Parkinsona (PD). Parkinsona (PD), a także jest głównym składnikiem ciał Lewy'ego, charakterystycznej neuropatologii charakterystycznej neuropatologii występującej w mózgu sporadycznych i rodzinnych pacjentów z PD. Funkcja α-synukleiny jest obecnie nieznana, chociaż została ona w regulacji lokalizacji lub fuzji pęcherzyków synaptycznych. Ostatnio wykazano, że nadekspresja α-synukleiny powoduje akumulację pęcherzyków cytoplazmatycznych w modelu drożdżowym. w drożdżowym modelu toksyczności α-synukleiny, ale dokładna rola α-synukleiny w pośredniczeniu w agregacji pęcherzyków jest niejasna. Tutaj pokazujemy, że α-synukleina indukuje agregację wielu białek GTPazy Rab drożdży, że agregacja α-synukleiny jest zwiększona w mutantach drożdży, które wytwarzają wysokie kwaśnych fosfolipidów oraz że α-synukleina kolokalizuje z błonami drożdży wzbogaconymi w błonami drożdży, które są wzbogacone w kwas fosfatydowy. Co istotne, wykazaliśmy że ekspresja α-synukleiny indukuje podatność na perturbacje Ypt6 i innych białek zaangażowanych w endogenezę wsteczną. inne białka zaangażowane w wsteczny transport endosomów-Golgiego, łącząc specyficzny defekt transportu do wiązania fosfolipidów α-synukleiny. Dane te sugerują nowe mechanizmy patogenetyczne neurotoksyczności α-synukleiny. --- Uważa się, że alfa-synukleina odgrywa ważną rolę w chorobie Parkinsona (PD). Mutacje w genie alfa-synukleiny są odpowiedzialne za rodzinne formy PD. PD, a białko alfa-synukleiny jest głównym składnikiem ciał Lewy'ego u pacjentów ze sporadyczną PD. u pacjentów ze sporadyczną PD. Synfilina-1 jest nowym białkiem, które wcześniej wcześniej stwierdzono, że wiąże się in vivo z alfa-synukleiną. Teraz pokazujemy, że synfilina-1 jest obecna w ciałach Lewy'ego pacjentów z PD. Nasze dane sugerują, że synfilina-1 może odgrywać rolę w tworzeniu ciał Lewy'ego i patogenezie PD. --- α-synukleina (αSyn), która tworzy fibryle amyloidowe, jest powiązana z patologią neuronów w chorobie Parkinsona. choroby Parkinsona, ponieważ jest głównym składnikiem fibrylarnym ciał Lewy'ego, wtrąceń charakterystycznych dla choroby Parkinsona. ciał Lewy'ego, wtrąceń charakterystycznych dla tej choroby. Struktury oligomeryczne struktury, wspólne dla wielu białek związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi, mogą w rzeczywistości w rzeczywistości być głównym gatunkiem toksycznym, podczas gdy fibryle amyloidowe istnieją albo jako mniej toksyczny martwy gatunek lub nawet jako korzystny mechanizm usuwania uszkodzonych białek. uszkodzonych białek. Aby zmienić postęp agregacji i uzyskać wgląd w struktury prefibrylarne, określiliśmy wpływ hemu na oligomeryzację αSyn oligomeryzację kilkoma różnymi technikami, w tym natywną (niedenaturującą) elektroforezę w żelu poliakrylamidowym, fluorescencję tioflawiny T, transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia sił atomowych, dichroizm kołowy, i przenikanie przez błonę przy użyciu testu uwalniania kalceiny. Podczas agregacji, hem jest w stanie wiązać αSyn w specyficzny sposób, stabilizując różne konformacje oligomeryczne konformacje i promowanie tworzenia αSyn w struktury pierścieniowe, tym samym opóźniając i/lub hamując proces fibrylacji. Wyniki te wskazują, że hem może odgrywać rolę regulacyjną w progresji choroby Parkinsona. choroby Parkinsona; ponadto zapewniają wgląd w to, jak proces agregacji może agregacji, co może mieć zastosowanie w zrozumieniu wielu chorób neurodegeneracyjnych. chorób neurodegeneracyjnych. --- α-synukleina jest obfitym białkiem presynaptycznym i głównym składnikiem ciał Lewy'ego w chorobie Parkinsona. w chorobie Parkinsona. Chociaż jej patogenna rola pozostaje niejasna, w zdrowych zakończeniach nerwowych α-synukleina przechodzi cykl wiązania i dysocjacji błony. dysocjacji. Test wiązania α-synukleiny został wykorzystany do badania przesiewowego białek pęcherzykowych białka zaangażowane w interakcje błonowe α-synukleiny i wykazały, że przeciwciała skierowane do GTPazy Rab3a związanej z Ras i jej opiekuna RabGDI znosiły wiązanie błonowe α-synukleiny. Analizy biochemiczne, w tym sedymentacja w gradiencie gęstości sedymentację w gradiencie gęstości i koimmunoprecypitację, sugerują, że α-synukleina oddziałuje z związanym z błoną GTP Rab3a, ale nie z cytozolowym GDP-Rab3a. Akumulacja α-synukleiny związanej z błoną była indukowana przez ekspresję mutanta Rab3a z niedoborem GTPazy, przez dominująco-ujemny mutant inhibitora dysocjacji GDP inhibitora dysocjacji niezdolnego do recyklingu Rab3a poza błonami oraz przez Inhibitory Hsp90, radikol i geldanamycyna, o których wiadomo, że hamują dysocjację Rab3a z błon. Tak więc, wszystkie zabiegi, które hamowały recykling Rab3a również zwiększały sekwestrację α-synukleiny na błonach wewnątrzkomórkowych. Nasze wyniki sugerują, że związany z błoną GTP-Rab3a stabilizuje α-synukleinę na pęcherzykach synaptycznych pęcherzykach synaptycznych i że kompleks inhibitor dysocjacji GDP-Hsp90, który kontroluje dysocjację błonową Rab3a również reguluje dysocjację α-synukleiny podczas aktywności synaptycznej. aktywności synaptycznej. --- Manifestacja ciał Lewy'ego (LB) w mózgu jest cechą charakterystyczną choroby Parkinsona. choroby Parkinsona. Tutaj przedstawiamy kompleksową analizę elementów białkowych w ciałach Lewy'ego ciał Lewy'ego za pomocą porównawczej spektrometrii mas. Korowe inkluzje LB zostały wzbogacone przez wirowanie w gradiencie sacharozy z pośmiertnych mózgów, a negatywną kontrolę próbka została przygotowana z próbki bez patologii LB. Podczas gdy około 550 białek zidentyfikowano w próbce wzbogaconej w LB za pomocą spektrometrii mas, porównanie ilościowe z próbką kontrolną ujawniło, że około 40 białek było wzbogaconych o alfa-synukleinę, główny składnik ciał Lewy'ego. ciał Lewy'ego. Zgodnie z oczekiwaniami, lista białek obejmowała wcześniej zgłoszone składniki, takie jak te zaangażowane w fałdowanie białek, transport błonowy i stres oksydacyjny. Co ciekawsze, odkryliśmy w próbce wzbogaconej o LB kinaz (MAPKK1/MEK1, kinaza białkowa C i kinaza podobna do podwójnej kortyny), nową deubstratową kinazę kinaza), nowy enzym deubikwitynujący (otubaina 1) i liczne ligazy ubikwityny ligazy ubikwityny (KPC i SCF). Badania proteomiczne dostarczają kandydatów na enzymy do badać regulację alfa-synukleiny i/lub innych białek LB, które mogą przyczyniać się do powstawania ciał Lewy'ego i toksyczności alfa-synukleiny w powiązanych zaburzeniach neurodegeneracyjnych. --- TŁO: Choroba Parkinsona (PD) jest chorobą neurodegeneracyjną o cechach cechami i objawami, które są dobrze zdefiniowane. Niemniej jednak jej etiologia pozostaje nieznana. PD charakteryzuje się obecnością ciał Lewy'ego wewnątrz neuronów. α-synukleina (α-syn) jest rozpuszczalnym białkiem obecnym w przedsynaptycznych zakończeniach neuronów. zakończeniach neuronów. Dowody sugerują, że α-syn odgrywa fundamentalną rolę w patogenezie PD patogenezie PD, ponieważ jest ważnym składnikiem ciał Lewy'ego zlokalizowanych w neuronach dopaminergicznych pacjentów z PD. METODY: W niniejszym badaniu zbadaliśmy wpływ typu dzikiego (WT) i nadekspresji A30P α-syn na toksyczność neuroblastoma SH-SY5Y indukowaną przez pożywkę kondycjonowaną (CM) z pierwotnych hodowli glejaków poddanych działaniu lipopolisacharydem (LPS) z Escherichia coli. WYNIKI: Zaobserwowaliśmy, że komórki SH-SY5Y transdukowane α-synem (WT lub A30P) i traktowane CM z komórek glejowych aktywowanych LPS wykazują oznaki śmierci komórkowej, która nie jest odwracana przez hamowanie NF-κB salicylanem sodu lub przez blokowanie P50 (podjednostka NF-κB). Ponadto ekspresja A30P α-syn w neuroblastoma SH-SY5Y zmniejsza śmierć komórek wywołaną przez CM aktywowanych glejaków w porównaniu do WT α-syn lub grupy kontrolnej. Ten efekt A30P α-syn może być spowodowany niską fosforylacją fosforylacji MAPK42/44. Odkrycie to jest potwierdzone przez hamowanie MEK1 przez PD98059, zmniejszające uwalnianie LDH przez CM w komórkach SH-SY5Y. WNIOSEK: Nasze wyniki sugerują, że komórki SH-SY5Y transdukowane α-synem (WT lub A30P) i traktowane CM z komórek glejowych aktywowanych LPS wykazują śmierć komórkową, która nie jest odwracana przez blokadę NF-κB. Dodatkowo, ekspresja A30P α-syn na komórkach neuroblastoma SH-SY5Y prowadzi do zmniejszonej śmierci komórek wywołanej przez CM aktywowane glejaki, w porównaniu do WT α-syn lub grupy kontrolnej. Mechanizm leżący u podstaw tego procesu pozostaje do końca wyjaśniony, ale obecne dane dane sugerują, że fosforylacja MAPK42/44 odgrywa ważną rolę w tym procesie. procesie. PROSPERO: CRD42015020829. --- α-synukleina jest głównym składnikiem białkowym ciał Lewy'ego - patologicznego cechą charakterystyczną choroby Parkinsona (PD) i demencji z ciałami Lewy'ego (DLB). Jej w agregaty wewnątrzkomórkowe jest zaangażowana w proces tworzenia ciał Lewy'ego. powstawania ciał Lewy'ego. Jednak jego rola zarówno w normalnym funkcjonowaniu, jak i chorobie, pozostaje kontrowersyjne. Wykorzystując nowy model przewlekłego stresu oksydacyjnego w hodowanych neuronach dopaminergicznych i korowych neuronach dopaminergicznych i korowych, donosimy, że endogenna α-synukleina jest w odpowiedzi na niską dawkę toksyczności. Ta odpowiedź jest zachowana między subpopulacjami neuronów korowych i dopaminergicznych i nadaje względną odporność na apoptozę po wtórnym uszkodzeniu. Dodatkowy ostry stres oksydacyjny stres prowadzi do wewnątrzkomórkowej akumulacji α-synukleiny. Te punktowe kolokalizują się z ubikwityną, która ma kluczowe znaczenie dla proteosomów i jest drugim głównym składnikiem ciał Lewy'ego. Obecne Obecne wyniki sugerują, że zróżnicowane poziomy ekspresji α-synukleiny mogą wpływać na wrażliwość neuronów w przewlekłych chorobach neurodegeneracyjnych. Wyniki te dodatkowo wspierają hipotezę "dwóch trafień" w tworzeniu ciał Lewy'ego, zgodnie z którą łagodny stres stres powoduje ochronną regulację w górę α-synukleiny. Jednak takie zwiększone poziomy α-synukleiny mogą prowadzić do jej akumulacji, po dodatkowej toksycznej toksycznej. Wreszcie, wyniki te potwierdzają wspólny mechanizm degeneracji neuronów dopaminergicznych i korowych, dotkniętych odpowiednio PD i DLB. --- Ciała Lewy'ego, neuropatologiczne cechy charakterystyczne choroby Parkinsona i demencji z ciałami Lewy'ego, składają się z filamentów alfa-synukleiny i innych mniej zdefiniowanych białek. białka. Charakterystyka białek ciał Lewy'ego, które oddziałują z alfa-synukleiną może zapewnić wgląd w mechanizm powstawania ciał Lewy'ego. Podwójne znakowanie immunofluorescencyjne i mikroskopia konfokalna ujawniły około 80% korowych ciał Lewy'ego zawierało białko związane z mikrotubulami białko 1B (MAP-1B), które pokrywało się z alfa-synukleiną. Ciała Lewy'ego zostały izolowane przy użyciu techniki immunomagnetycznej z tkanki mózgowej pacjentów umierających z otępieniem z ciałami Lewy'ego. Białka ciał Lewy'ego zostały rozdzielone przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym. Immunoblotting potwierdził obecność MAP-1B i alfa-synukleiny w oczyszczonych ciałach Lewy'ego. Bezpośrednie badania wiązania ujawniły interakcję o wysokim powinowactwie (IC(50) około 20 nm) między MAP-1B i alfa-synukleiną. Miejsca wiązania MAP-1B zostały zmapowane do ostatnich 45 aminokwasów ostatnich 45 aminokwasów końca C alfa-synukleiny. MAP-1B wiązał również in vitro zmontowane fibryle alfa-synukleiny. Zatem MAP-1B może być zaangażowany w patogenezę ciał Lewy'ego poprzez Lewy'ego poprzez interakcję z monomeryczną i fibrylarną alfa-synukleiną. --- α-synukleina jest głównym patologicznym składnikiem synukleinopatii, w tym choroby Parkinsona i otępienia z ciałami Lewy'ego. Ostatnie badania wykazały, że α-synukleina odgrywa również ważną rolę w uwalnianiu pęcherzyków synaptycznych i błon synaptycznych. pęcherzyków synaptycznych i recyklingu błony synaptycznej w zdrowych neuronach. Jednakże, dokładny związek między patogennością a funkcjami fizjologicznymi α-synukleiny pozostaje do wyjaśnienia. Aby rozwiązać tę kwestię, zbadaliśmy lokalizację subkomórkową α-synukleiny w warunkach prawidłowych i patologicznych warunkach przy użyciu pierwotnych mysich hodowli neuronów hipokampa. Podczas gdy niektóre neurony wyrażały wysoki poziom α-synukleiny w boutonach presynaptycznych i ciałach komórek, inne neurony nie wykazywały lub wykazywały bardzo słabą ekspresję tego białka. Te α-synukleiny zostały zidentyfikowane jako neurony hamujące przez immunobarwienie specyficznymi przeciwciałami przeciwko dekarboksylazie kwasu glutaminowego (GAD), parwalbuminie i somatostatynie. W przeciwieństwie do tego, synapsy α-synukleinododatnie były kolokalizowane z markerem synapsy pobudzającej - pęcherzykowym transporterem glutaminianu transporterem-1. Ten profil ekspresji α-synukleiny został zachowany w hipokampie in vivo. hipokampie in vivo. Ponadto odkryliśmy, że podczas gdy presynaptyczna α-synukleina kolokalizuje z synapsyną, markerem pęcherzyków presynaptycznych, nie jest niezbędna dla zależnego od aktywności recyklingu błony indukowanego przez leczenie wysokim stężeniem potasu. Wykazano, że egzogenna podaż wstępnie uformowanych fibryli generowanych przez rekombinowaną α-synukleinę wykazano, że promuje tworzenie wewnątrzkomórkowych agregatów podobnych do ciał Lewy'ego (LB) z udziałem endogennej α-synukleiny. Neurony GAD-pozytywne nie tworzyły agregatów podobnych do LB agregaty po traktowaniu wstępnie uformowanymi fibrylami, jednak egzogenne ekspresja ludzkiej α-synukleiny umożliwiła wewnątrzkomórkowe tworzenie agregatów w tych komórkach. tych komórkach. Wyniki te sugerują obecność innego mechanizmu regulacji ekspresji α-synukleiny. regulacji ekspresji α-synukleiny między neuronami pobudzającymi i hamującymi. neuronami pobudzającymi i hamującymi. Co więcej, poziomy ekspresji α-synukleiny mogą determinować efektywność tworzenia agregatów wewnątrzkomórkowych w różnych podtypach neuronów. --- Utrata neuronów w określonych regionach mózgu i neurony z wewnątrzkomórkowymi ciałami Lewy'ego są patologiczną cechą charakterystyczną zarówno choroby Parkinsona (PD), jak i otępienia z ciałami Lewy'ego (DLB). Parkinsona (PD) i otępieniu z ciałami Lewy'ego (DLB). Ciała Lewy'ego składają się z agregowanych wewnątrzkomórkowych pęcherzyków i białek, a α-synukleina jest głównym składnikiem białkowym. głównym składnikiem białkowym. Wykorzystując ludzką tkankę mózgową z kontroli, PD i DLB oraz światła i konfokalnej immunohistochemii z przeciwciałami przeciwko dysmutazie ponadtlenkowej 2 jako markera mitochondriów, α-synukleiny dla ciał Lewy'ego i βIII tubuliny dla mikrotubul zbadaliśmy zbadaliśmy związek między ciałkami Lewy'ego a utratą mitochondriów. utratą mitochondriów. Wykazaliśmy regresję mikrotubul oraz mitochondrialną i jądrową degradację w neuronach z ciałami Lewy'ego. w neuronach z rozwijającymi się ciałami Lewy'ego. W PD często obserwowano liczne ciała Lewy'ego z α-synukleiną wchodzącą w interakcje z DNA, powodując znaczną degradację jądrową. degradację jądrową. W DLB mitochondria są wciągane do ciał Lewy'ego, a integralność mitochondriów integralność mitochondriów zostaje utracona. Ta praca sugeruje, że ciała Lewy'ego są cytotoksyczne. W DLB sugerujemy, że regresja mikrotubul i utrata mitochondriów powoduje zmniejszenie energii komórkowej i transportu aksonalnego, co prowadzi do śmierci komórki. śmierci. W PD agregacje α-synukleiny są związane z nienaruszonymi mitochondriami ale oddziałuje i powoduje degradację jądrową, która może być główną przyczyną śmierci komórki. śmierci komórek. --- alfa-synukleina i ubikwityna to dwa składniki białkowe ciał Lewy'ego, które mogą odgrywać antagonistyczną rolę w patogenezie ciał Lewy'ego. antagonistyczne role w patogenezie ciał Lewy'ego. Zbadaliśmy związek między alfa-synukleiną, ubikwityną i lipidami w ciałach Lewy'ego utrwalonych skrawków mózgu lub wyizolowanych z tkanek korowych otępienia z ciałami Lewy'ego. ciał Lewy'ego. Ciała Lewy'ego wykazywały szereg wzorów znakowania alfa-synukleiny i ubikwityny, od jednorodnego wzoru, w którym alfa-synukleina i ubikwityna były równomiernie rozmieszczone i zachodziły na siebie w całym ciele inkluzyjnym do koncentrycznego wzór, w którym alfa-synukleina i ubikwityna były częściowo posegregowane, z znakowanie alfa-synukleiny skoncentrowane w domenie obwodowej i ubikwitynie w centralnej domenie ciała Lewy'ego. Lipidy stanowiły istotny składnik zarówno w jednorodnych, jak i koncentrycznych ciałach Lewy'ego. Wyniki te sugerują, że ciała Lewy'ego są niejednorodne pod względem składu subregionalnego. Segregacja alfa-synukleiny do obwodowej domeny ciał Lewy'ego jest zgodna z hipotezą że alfa-synukleina jest stale odkładana na ciałkach Lewy'ego. --- Alfa-synukleina (alfaS) jest głównym składnikiem ciał Lewy'ego, patologicznej cechy charakterystycznej patologiczną cechą charakterystyczną choroby Parkinsona. Uważa się, że agregacja alfaS przebiega od stanu pierwotnie nieuporządkowanego z rodzącą się strukturą drugorzędową poprzez konformacje pośrednie do form oligomerycznych i ostatecznie do dojrzałych amyloidu. Niskie pH prowadzi do zmian konformacyjnych związanych ze zwiększonym tworzeniem się fibryli alfaS. Tutaj charakteryzujemy te strukturalne i dynamiczne zmiany za pomocą pomiarów NMR w stanie roztworu wtórnych przesunięć chemicznych przesunięcia, parametry relaksacyjne, resztkowe sprzężenia dipolarne i paramagnetyczne wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej. Stwierdziliśmy, że neutralizacja ujemnie naładowanych łańcuchów bocznych łańcuchów bocznych eliminuje odpychanie elektrostatyczne w C-końcowym ogonie alfaS i prowadzi do zapadnięcia się tego regionu przy niskim pH. Hydrofobowe kontakty między zwartym C-końcowym ogonem i regionem NAC (składnik nieamyloidowy-beta) są utrzymywane i mogą prowadzić do utworzenia domeny globularnej. Przejściowe kontakty dalekiego zasięgu między C-końcem białka a regionami N-końcowymi do regionu NAC są również zachowane. Zatem uwolnienie kontaktów dalekiego zasięgu nie odgrywa roli w zwiększonej agregacji alfaS przy niskim pH, co przypisujemy przypisujemy zwiększonej hydrofobowości białka. --- Alfa-synukleina (α-syn) jest głównym składnikiem białkowym ciał Lewy'ego (LB), które wraz z utratą neuronów dopaminowych nigrostriatalnych stanowią typowe cechy patologiczne cechy charakterystyczne choroby Parkinsona (PD). Nieprawidłowości receptora N-metylo-d-asparaginianu glutaminianu (NMDAR), szczególnie obejmujące NMDAR zawierający NR2B, zaobserwowano w mózgu pacjentów z PD i w mózgu pacjentów z PD oraz w kilku eksperymentalnych modelach tej choroby. choroby. Ostatnie odkrycia, wskazujące, że α-syn może modulować ruch NMDAR i funkcję, sugerują, że białko to może być kluczowym regulatorem aktywności NMDAR aktywność. Zachęceni tymi dowodami, zastosowaliśmy immunocytochemię fluorescencyjną, western blotting i pomiary ratiometryczne Ca(2+) w celu zbadania, czy dziki typ (wt) lub C-końcowo skrócony α-syn może specyficznie modulować poziomy NMDAR zawierające NR2B, handel subkomórkowy i funkcję. Dodatkowo, oceniliśmy, czy ekspozycja pierwotnych neuronów korowych na rosnące stężenia rotenonu mogą w różny sposób regulować poziomy NR2B i komórki żywotność komórek w obecności lub pod nieobecność α-syn. Nasze wyniki wskazują, że zarówno wt, jak i C-końcowo skrócony α-syn negatywnie modulują poziomy NR2B zawierające NMDAR, translokację błonową i funkcję. Co więcej, odkryliśmy, że brak α-syn znosi zależny od rotenonu spadek poziomów NR2B i zmniejsza wrażliwość neuronów w pierwotnych neuronach korowych. Wyniki te sugerują, że α-syn może modulować odporność neuronów poprzez regulację NMDAR zawierający NR2B, którego specyficzne zmiany mogą łączyć patologię α-syn z degeneracją neuronów w PD. --- Choroba Parkinsona (PD) jest scharakteryzowana jako neurodegeneracyjne zaburze objawiające się sztywnością, drżeniem spoczynkowym, zaburzeniami równowagi i powolnością ruchów. powolnością ruchów. Ważną patologiczną cechą PD jest obecność ciał Lewy'ego. Podstawowym składnikiem strukturalnym ciał Lewy'ego są fibryle złożone głównie z alfa-synukleiny, wysoce konserwatywnego białka o długości 140 aminokwasów które ulega ekspresji głównie w neuronach i które może odgrywać rolę w plastyczności synaptycznej i neuroprzekaźnictwie. plastyczności i neurotransmisji. Liczne badania sugerują agregację i modyfikację i modyfikację alfa-synukleiny jako kluczowy etap prowadzący do powstawania ciał Lewy'ego i i utraty komórek neuronalnych związanych z PD. Ze względu na centralną rolę alfa-synukleiny w PD, stanowi ona nowy cel farmakologiczny dla możliwego leczenia tej choroby. leczenia tej choroby. W niniejszym przeglądzie dokonano przeglądu roli alfa-synukleiny w PD zostanie omówiony z naciskiem na ostatnie badania wykorzystujących podejście immunizacyjne przeciwko alfa-synukleinie jako możliwą opcję leczenia tej wyniszczającej choroby. opcję leczenia tej wyniszczającej choroby. --- Mutacje genu alfa-synukleiny okazały się istotne w niektórych rzadkich rodzinach rodzinach z autosomalną dominującą chorobą Parkinsona (PD). Ponadto, białko alfa-synukleiny jest głównym składnikiem ciał Lewy'ego również u sporadycznych pacjentów z PD. pacjentów z PD. Zwiększony poziom alfa-synukleiny typu dzikiego w komórce prowadzi do zwiększonego wewnątrzkomórkowego poziomu nadtlenku wodoru i powoduje śmierć neuronów dopaminergicznych w neuronów dopaminergicznych w pierwotnej hodowli szczurów. Następnie stres oksydacyjny został został bezpośrednio powiązany z agregacją alfa-synukleiny in vitro. Rodzi to pytanie, czy pytanie, czy zwiększona ekspresja alfa-synukleiny może być powiązana z wyższą podatnością na PD i czy polimorfizmy promotora alfa-synukleiny są związane z PD. związane z PD. Tutaj, dwa polimorfizmy (-116C>G i -668T>C) promotora alfa-synukleiny alfa-synukleiny definiujące cztery haplotypy zostały scharakteryzowane u 315 niemieckich pacjentów z PD. niemieckich pacjentów z PD. Wpływ czterech haplotypów na ekspresję genów został badano za pomocą testów genów reporterowych CAT w neuronalnych komórkach SK-N-AS. Haplotyp -668C/-116G wykazał znacznie wyższą ekspresję CAT niż haplotypy -668T/-116G lub -668T/-116C. Chociaż haplotyp -668C/-116G był bardziej częstszy u pacjentów z PD, różnica ta nie była znacząca. --- Ciałka Lewy'ego, charakterystyczne patologiczne uszkodzenie neuronów istoty czarnej w chorobie Parkinsona (PD), są często obserwowane jako towarzyszące amyloidowi amyloidu i patologii splątków neurofibrylarnych w chorobie Alzheimera (AD). Jednakże typowy rozkład anatomiczny ciał Lewy'ego w AD różni się od PD. Najczęstszym Najczęstszym miejscem występowania jest ciało migdałowate, w którym obserwuje się ciała Lewy'ego w około 60% zarówno sporadycznych, jak i rodzinnych przypadków AD. Inne częste miejsca występowania obejmują korę okołowodociągową i entorhinową, podczas gdy w obszarach neokorty i obszary pnia mózgu rozwijają ciała Lewy'ego w mniejszym odsetku przypadków. Natomiast W przeciwieństwie do tego, otępienie z ciałami Lewy'ego (DLB), definiowane przez rozległe neokortykalne i pnia mózgu, ale często towarzyszy mu zmienny poziom patologii typu AD reprezentuje drugi koniec spektrum patologii związanej z otępieniem. demencją. Obserwacja ciał Lewy'ego w rodzinnych przypadkach AD sugeruje, że podobnie jak splątki neurofibrylarne, tworzenie ciał Lewy'ego może być indukowane przez stan patologiczny stan patologiczny spowodowany nadprodukcją abeta-amyloidu. Rola ciał Lewy'ego w dysfunkcji i degeneracji neuronów pozostaje niejasna. Białko białko alfa-synukleina wydaje się być ważnym składnikiem strukturalnym ciał Lewy'ego. białko alfa-synukleina wydaje się być ważnym składnikiem strukturalnym ciał Lewy'ego. alfa-synukleiny powiązanych z rzadkimi przypadkami autosomalnej dominującej PD. Dalsze badanie alfa-synukleiny i jej związku ze stanami patologicznymi ciał Lewy'ego w AD, PD i DLB mogą przynieść dalszy wgląd w patogenezę tych chorób. patogenezę tych chorób. --- TŁO: Mutacje utraty funkcji ATP13A2 (PARK9) są genetyczną przyczyną wczesnej postaci choroby Parkinsona (PD). wczesnej postaci choroby Parkinsona (PD), z badaniami in vitro wykazującymi, że ATP13A2 prowadzą do dysfunkcji lizosomalnej i mitochondrialnej oraz akumulacji α-synukleiny. podczas gdy podwyższona ekspresja ATP13A2 zmniejsza toksyczność α-synukleiny. Trzy badania ludzkiej tkanki mózgowej oceniające zmiany w ekspresji ATP13A2 w PD PD dały rozbieżne wyniki; mRNA jest zwiększone, podczas gdy poziomy białka były zaobserwowano wzrost lub spadek poziomu białka. Ten pozorny konflikt w poziomach białka mógł wynikać z badania przypadków choroby ciał Lewy'ego ze współistniejącymi patologiami typu Aby ocenić, czy poziomy ATP13A2 w chorobie Lewy'ego są modyfikowane przez patologie typu Alzheimera są modyfikowane przez odkładanie β-amyloidu typu Alzheimera, oceniliśmy przypadki czystej PD i czystej demencji z ciałami Lewy'ego (DLB) pod kątem zmian w ATP13A2, α-synukleinie i β-amyloidu w obszarach korowych z ciałami Lewy'ego i bez nich. WYNIKI: We wszystkich przypadkach choroby ciał Lewy'ego zidentyfikowaliśmy obniżone poziomy białka ATP13A2 które korelowały ze wzrostem zarówno α-synukleiny, jak i β-amyloidu. Zaobserwowano częściową zaobserwowano częściową kolokalizację między ATP13A2 i α-synukleiną w ciałach Lewy'ego, podczas gdy ATP13A2 nie kolokalizował z patologicznym odkładaniem β-amyloidu. WNIOSKI: Nasze dane pokazują, że pacjenci z chorobami ciał Lewy'ego mają ogólny deficyt poziomów białka ATP13A2, przy czym pozostałe białko jest bardziej nierozpuszczalne i częściowo redystrybuowane w kierunku ciał Lewy'ego. Potwierdza to koncepcję że zwiększenie poziomu ATP13A2 może oferować potencjalne korzyści terapeutyczne terapeutyczne pacjentom z chorobami ciał Lewy'ego. --- Choroba Parkinsona (PD) jest drugą najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną. A kluczową cechą patologiczną PD są ciałka Lewy'ego, których głównym składnikiem białkowym jest α-synukleina (α-syn). głównym składnikiem białkowym jest α-synukleina (α-syn). Badania genetyczne u ludzi wykazały, że mutacje (A53T, A30P, E46K) i namnażanie genu α-syn są związane z rodzinną PD. rodzinną PD. Myszy z nadekspresją ludzkiego zmutowanego genu α-syn A53T rozwijają poważne zaburzenia ruchowe. zaburzenia ruchowe. Jednak molekularne mechanizmy toksyczności α-syn nie są dobrze poznane. dobrze poznane. Ostatnio dysfunkcja mitochondriów została powiązana z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Parkinsona. Tutaj zbadaliśmy, czy ruchliwość, dynamika i funkcje oddechowe mitochondriów są zaburzone w pierwotnych neuronach z mysiego modelu wyrażającego ludzką mutację A53T . Stwierdziliśmy, że ruchliwość mitochondriów była selektywnie hamowana w neuronach A53T podczas gdy transport innych organelli nie był zaburzony. Ponadto neurony z ekspresją A53T wykazały upośledzenie potencjału błony mitochondrialnej i oddychania mitochondrialnego. mitochondrialnej funkcji oddechowej. Ponadto odkryliśmy, że rapamycyna, induktor autofagii induktor autofagii, ratowała zmniejszoną ruchliwość mitochondriów. Podsumowując, dane te pokazują, że A53T α-syn upośledza funkcję i dynamikę mitochondriów dynamikę, a deficyt transportu mitochondrialnego jest odwracalny, zapewniając dalsze zrozumienie patogenezy choroby i potencjalną strategię terapeutyczną dla PD. strategię terapeutyczną dla PD. --- Ciała Lewy'ego i neuryty Lewy'ego są definiującymi cechami neuropatologicznymi choroby Parkinsona i otępienia z ciałami Lewy'ego. Są one zbudowane z nieprawidłowych włóknistych zespołów o nieznanym składzie. Pokazujemy tutaj, że ciała Lewy'ego i Lewy'ego i neuryty z choroby Parkinsona i demencji z ciałami Lewy'ego są barwione silnie przez przeciwciała skierowane przeciwko sekwencjom amino-końcowym i karboksylo-końcowym sekwencjom alfa-synukleiny, wykazując obecność pełnej lub zbliżonej do pełnej długości alfa-synukleiny. Liczba struktur wybarwionych alfa-synukleiną przewyższała tę immunoreaktywną dla ubikwityny, która jest obecnie najbardziej obecnie najbardziej czułym markerem ciał Lewy'ego i neurytów Lewy'ego. Barwienie dla alfa-synukleiny zastąpi zatem barwienie na ubikwitynę jako preferowaną metodę wykrywania ciał Lewy'ego i neurytów Lewy'ego. ciał Lewy'ego i neurytów Lewy'ego. Wyizolowaliśmy filamenty ciał Lewy'ego metodą stosowaną do ekstrakcji sparowanych filamentów helikalnych z mózgu z chorobą Alzheimera. mózgu. Za pomocą mikroskopii immunoelektronowej wyekstrahowane filamenty były silnie znakowane przez przeciwciała przeciwko alfa-synukleinie. Morfologie filamentów o wielkości od 5 do 10 nm i ich charakterystyka barwienia sugerują, że wydłużone cząsteczki cząsteczki alfa-synukleiny biegną równolegle do osi filamentu i że filamenty są strukturami polarnymi. filamenty są strukturami polarnymi. Odkrycia te wskazują, że alfa-synukleina tworzy główny składnik włókienkowy ciał Lewy'ego i neurytów Lewy'ego. --- Choroba Parkinsona (PD) charakteryzuje się postępującą utratą neuronów dopaminergicznych istoty nigra neuronów dopaminergicznych i obecnością wtrąceń cytoplazmatycznych zwanych ciałami Lewy'ego. Lewy'ego. Dwie mutacje missense alfa-synukleiny (alfa-syn; A30P i A53T) zostały opisane w kilku rodzinach z autosomalną dominującą postacią PD. alfa-syn stanowi również jeden z głównych składników ciał Lewy'ego w sporadycznych przypadkach PD. przypadkach PD. Aby opracować zwierzęcy model PD, wektory lentiwirusowe wyrażające różne ludzkie lub szczurze formy alfa-syn wstrzyknięto do istoty czarnej szczurów. nigra szczurów. W przeciwieństwie do transgenicznych modeli mysich, selektywna utrata neuronów dopaminergicznych nigralnych neuronów dopaminergicznych związanych z dopaminergicznym odnerwieniem prążkowia zaobserwowano u zwierząt wyrażających dzikie lub zmutowane formy ludzkiego alfa-syn. Ta degeneracja neuronów koreluje z pojawieniem się obfitych alfa-syn-dodatnich inkluzji i rozległą patologią neurytową wykrytą za pomocą zarówno alfa-synem, jak i barwieniem srebrem. Lentiwirusowa ekspresja typu dzikiego lub zmutowanych form ludzkiego alfa-syn odtwarza istotne cechy neuropatologiczne neuropatologiczne cechy PD. Szczurza alfa-syn podobnie prowadzi do białka agregacji białek, ale bez utraty komórek, co sugeruje, że inkluzje nie są główną przyczyną główną przyczyną degeneracji komórek w PD. Modele genetyczne z udziałem wirusów mogą przyczynić się do wyjaśnienia mechanizmu śmierci komórek indukowanej alfa-synem i umożliwić badanie przesiewowe kandydujących cząsteczek terapeutycznych. --- Uważa się, że białko alfa-synukleina (ASYN) jest zaangażowane w rozwój demencji z ciałami Lewy'ego (DLB). demencji z ciałami Lewy'ego (DLB). Nadekspresja ASYN została powiązana z toksycznością komórkową i chorobą u ludzi. toksycznością komórkową i chorobami ludzkimi, a w modelach eksperymentalnych, przyzwoitki takie jak białka szoku cieplnego (HSP) chronią przed toksycznością ASYN. Oceniliśmy oceniliśmy obfitość mRNA dla ASYN i chaperonów oraz obfitość i rozpuszczalność kodowanych białek w korze skroniowej sporadycznie występującej ludzkiej DLB. Stwierdziliśmy zmniejszenie mRNA ASYN w DLB (44,9% kontroli). Obfitość frakcji rozpuszczalnej w Tritonie (białko biodostępne) nie uległa zmianie, ale nastąpił wzrost był wzrost składnika nierozpuszczalnego w Tritonie (prawdopodobnie reprezentującego agregaty). Oceniliśmy 3 chaperony: HSP70, HSP90 i HDJ1. HSP70 mRNA był zwiększone w DLB, podczas gdy mRNA dla HSP90 i HDJ1 pozostały niezmienione. HSP70 gromadził się we frakcji rozpuszczalnej w Tritonie, podczas gdy białka HSP90 i HDJ1 gromadziły się we frakcji nierozpuszczalnej w Tritonie. Obserwacje te sugerują, że sporadyczna DLB nie jest związana z nadekspresją ASYN. Raczej utrzymywanie się normalnych poziomów rozpuszczalnego białka ASYN, pomimo redukcji jego mRNA, sugeruje pierwotny defekt w klirensie białka. Jednak ten zmniejszony klirens nie może być przypisany niepowodzeniu ekspresji chaperonu, ponieważ ich mRNA jest niezmienione lub zwiększone w mózgu DLB. --- CEL: Otępienie z ciałami Lewy'ego jest α-synukleinopatią charakteryzującą się patologią związaną z neokortykalną patologią związaną z ciałami Lewy'ego (LRP). Przeprowadziliśmy badanie asocjacyjne badanie asocjacyjne (GWAS) na neokortykalnej LRP w próbie populacyjnej osób w wieku 85 lat lub starszych. METODY: LRP analizowano u 304 osób w próbie Vantaa 85+ z południowej Finlandii. Finlandii. GWAS obejmował 41 przypadków z LRP w śródmózgowiu, hipokampie i korze nowej oraz 177 przypadków kontrolnych bez LRP w śródmózgowiu, hipokampie i korze nowej. LRP oraz 177 osób z grupy kontrolnej bez LRP śródmózgowia i hipokampa. Badanie Medical Research Council Cognitive Function and Ageing Study (CFAS) został wykorzystany do (51 przypadków i 131 kontroli). WYNIKI: Analizując 327,010 markerów, najwyższy sygnał uzyskano na poziomie HLA-DPA1/DPB1 (P = 1,29 × 10(-7)); pięć innych loci na chromosomach 15q14, 2p21, 2q31, 18p11 i 5q23 było związanych z neokortykalnym LRP przy P < 10(-5). Dwa loci zostały oznaczone wieloma markerami, 2p21 (P = 3,9 × 10(-6), przed genem SPTBN1). SPTBN1) i HLA-DPA1/DPB1; zostały one przetestowane w materiale CFAS. Asocjacje pojedynczego markera (P = 0,0035) i haplotypu (P = 0,04) na 2p21 były replikowane w CFAS, podczas gdy asocjacja HLA-DPA1/DPB1 nie była. Analizy bioinformatyczne analizy sugerują efekty funkcjonalne dla markerów HLA-DPA1/DPB1, a także markera markera 15q14 rs8037309. INTERPRETACJA: Zidentyfikowaliśmy sugestywne nowe czynniki ryzyka dla neokortykalnego ŁRP. SPTBN1 jest kandydatem na 2p21, koduje beta-spektrynę, białko wiążące α-synukleinę i składnik Lewy'ego. białko wiążące α-synukleinę i składnik ciał Lewy'ego. Związek HLA-DPA1/DPB1 sugeruje rolę w prezentacji antygenu lub alternatywnie, cis-regulacyjne efekty jeden ze zidentyfikowanych tutaj regulowanych sąsiednich genów (wakuolarny sortowanie białek 52) odgrywa rolę w transporcie pęcherzykowym i wykazano, że interakcję z α-synukleiną w modelu drożdżowym. --- Naturalnie nieuporządkowane białko alfa-synukleina jest głównym składnikiem ciał Lewy'ego ciał Lewy'ego, komórkowej cechy charakterystycznej choroby Parkinsona. Większość badań tego białka przeprowadza się w rozcieńczonym roztworze, ale jego biologicznie istotna rola jest w zatłoczonym środowisku wewnątrz komórek. Zajęliśmy się wpływem makromolekularnego stłoczenia na alfa-synukleinie poprzez połączenie danych NMR uzyskanych w Escherichia coli z danymi NMR uzyskanymi in vitro. Zatłoczone środowisko w E. coli zapobiega zmianie konformacyjnej, która jest wykrywana w temperaturze 35 stopni C w rozcieńczonym roztworze. C w rozcieńczonym roztworze. Zmiana ta jest związana ze wzrostem promienia hydrodynamicznego promień i tworzenie struktury drugorzędowej w N-końcowych 100 aminokwasach reszt aminokwasowych. Zapobiegając tej wywołanej temperaturą zmianie konformacyjnej, zatłoczenie w peryplazmie E. coli stabilizuje nieuporządkowany monomer. Uzyskujemy tę samą stabilizację in vitro po zatłoczeniu alfa-synukleiny 300 g / l albuminy surowicy bydlęcej albuminy surowicy bydlęcej, co wskazuje, że samo zatłoczenie jest wystarczające do stabilizacji nieuporządkowane, monomeryczne białko. Dwa warianty związane z chorobą (A30P i A53T) zachowują się w ten sam sposób zarówno w rozcieńczonym roztworze, jak i w peryplazmie E. coli. Dane te ujawniają znaczenie podejścia do skutków makromolekularnego makromolekularnych na podstawie poszczególnych przypadków. Dodatkowo, nasza praca pokazuje, że dyskretne strukturyzowane konformacje białkowe mogą nie być osiągane przez alfa-synukleinę wewnątrz komórek komórek, co wskazuje na powszechnie pomijany aspekt stłoczenia makromolekularnego jako jako możliwy czynnik w etiologii choroby Parkinsona. --- Wiele chorób neurodegeneracyjnych jest związanych z agregacją nieprawidłowo sfałdowanych białek białek w oligomery amyloidowe lub fibryle, które odkładają się jako patologiczne w obszarach mózgu. Atrakcyjna strategia terapeutyczna dla zapobieganie lub łagodzenie powstawania amyloidu jest identyfikacja środków, które hamują początek lub propagację agregacji białek. Tutaj pokazujemy, jak magnetyczny rezonans jądrowy w stanie stałym (ssNMR) może być wykorzystany do identyfikacji kluczowych w sekwencjach białek amyloidogennych, które mogą być ukierunkowane na hamowanie agregacji białka gospodarza. agregacji białka gospodarza. W przypadku alfa-synukleiny, głównego białka składnik ciał Lewy'ego związanych z chorobą Parkinsona, zastosowaliśmy połączenie ssNMR i danych biochemicznych w celu zidentyfikowania kluczowego regionu dla samoregregacji białka jako reszty 77-82 (VAQKTV). Wykorzystaliśmy nasze nowe informacje strukturalne do zaprojektowania peptydu pochodzącego z reszt od 77 do 82 alfa-synukleiny z grupą N-metylową na C-końcowej reszcie, która była w stanie zakłócać agregację alfa-synukleiny. W ten sposób pokazaliśmy, jak dane strukturalne uzyskane z ssNMR mogą kierować projektowaniem zmodyfikowanych peptydów do stosowania jako inhibitory amyloidu, jako główny krok w kierunku opracowania związków terapeutycznych związków terapeutycznych do zapobiegania i/lub leczenia chorób amyloidowych. --- Synukleinopatie obejmują zróżnicowaną grupę neurodegeneracyjnych proteinopatii które mają wspólne zmiany patologiczne złożone z agregatów konformacyjnych i potranslacyjnych modyfikacji alfa-synukleiny w wybranych populacjach neuronów i gleju. Nieprawidłowe nitkowate agregaty nieprawidłowo sfałdowanego białka alfa-synukleiny są głównymi składnikami ciał Lewy'ego, neurytów dystroficznych ciał Lewy'ego, neurytów dystroficznych (Lewy'ego) i włókien Papp-Lantosa w oligodendrogleju i neuronach w zaniku wieloukładowym związanym ze zwyrodnieniem dotkniętych obszarów mózgu. Do synukleinopatie obejmują (1) zaburzenia ciał Lewy'ego i otępienie z ciałami Lewy'ego, (2) zanik wieloukładowy (MSA) i (3) chorobę Hallervordena-Spatza. (1) patologiczne zaburzenia ciał Lewy'ego i otępienie z ciałami Lewy'ego są jest ustalana na podstawie zatwierdzonych kryteriów konsensusu opartych na półilościowej ocenie podkorowych i korowych ciał Lewy'ego jako ich wspólnych cech charakterystycznych. Są to towarzyszy podkorowe zwyrodnienie wieloukładowe z utratą neuronów i glejozą z lub bez stanu patologicznego Alzheimera. Ciała Lewy'ego występują również w wielu innych zaburzeniach, w tym w czystej niewydolności autonomicznej, dystrofiach neuroaksonalnych neuroaksonalne oraz różne amyloidozy i tauopatie. (2) Zanik wieloukładowy atrofia wieloukładowa, sporadyczne, występujące u dorosłych zwyrodnieniowe zaburzenie ruchowe o nieznanej przyczynie. przyczyny, charakteryzuje się dodatnimi pod względem alfa-synukleiny cytoplazmatycznymi glejowymi i rzadkimi neuronalne w całym ośrodkowym układzie nerwowym związane z zwyrodnieniem prążkowia i rdzenia kręgowego, zanikiem oliwkowo-móżdżkowym i zajęciem rdzenia i rdzeniowych jąder autonomicznych. (3) W neurodegeneracji z akumulacją żelaza w mózgu typu akumulacją żelaza w mózgu typu I lub w chorobie Hallervordena-Spatza, alfa-synukleina jest obecna w sferoidach aksonalnych oraz inkluzjach glejowych i neuronalnych. Podczas gdy tożsamość głównych składników ciał Lewy'ego sugeruje, że szlak prowadzący od normalnego rozpuszczalnych do nieprawidłowo sfałdowanych białek nitkowatych ma kluczowe znaczenie dla ich patogenezy. patogenezy, niezależnie od pierwotnego zaburzenia, istnieją różnice konformacyjne w alfa-synukleinie. różnice w alfa-synukleinie między agregatami neuronalnymi i glejowymi, wykazując niejednolite mapowanie jej epitopów. Pomimo kilku modeli komórkowych i transgenicznych modeli komórkowych i transgenicznych, nie jest jasne, czy tworzenie ciałek inkluzyjnych jest adaptacyjną/neuroprotekcyjną lub patogenną reakcją/procesem generowanym w odpowiedzi na różne, w większości nieokreślone, funkcjonalne wyzwalacze związane z neurodegeneracją. neurodegeneracją. --- Jest coraz bardziej jasne, że normalne białko alfa-synukleina jest w pewien sposób sposób ściśle związane z presynaptycznymi składnikami wybranych typów neuronów w dorosłym ludzkim ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), a ponadto, że w patologicznie zmienionym stanie alfa-synukleina patologicznie zmienionym stanie alfa-synukleina agreguje selektywnie w w postaci nitkowatych ciałek inkluzyjnych podczas niektórych postępujących zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak neurodegeneracyjnych, takich jak rodzinna i sporadyczna choroba Parkinsona. Poprzez podniesienie przeciwciała AFshp specyficznie do alfa-synukleiny w celu oznaczenia specyficznych dla choroby Parkinsona ciał Lewy'ego i neurytów Lewy'ego, a także boutonów synaptycznych boutonów synaptycznych zawierających niezmienione białko, podjęto wstępną próbę zmapowania ogólny wzór dystrybucji i opisać zachowanie barwienia immunoreaktywnych punkcików w wybranych regionach prosencefalonu. Neokortykalne immunoznakowanie jest najbardziej widoczne w rozległych, ale niekompletnie mielinizowanych, pola asocjacyjne i najsłabsze w silnie mielinizowanych pierwotnych polach motorycznych i pierwotnych polach czuciowych, z przedruchowymi i sensorycznymi polami asocjacyjnymi pierwszego rzędu obszary zajmujące pozycję pośrednią. Spośród ocenianych szarości wzgórzowych, te zawierające silnie mielinizowane szlaki włókien (np. centrum medianum, habenular kompleks) wykazują najsłabsze immunoznakowanie, podczas gdy mniej silnie mielinizowane struktury struktury są wysoce immunoreaktywne. Fakt, że spektrum immunobarwienia dla normalnej alfa-synukleiny jest tak szerokie, wraz z faktem, że niektóre że niektóre miejsca wzgórza są immunonegatywne, prowadzi do następujących wniosków (1) alfa-synukleina, chociaż obecna w boutonach synaptycznych wielu komórek nerwowych komórek nerwowych w dorosłym ludzkim OUN, nie jest tam wszechobecna i (2) typy neuronów pozbawione normalnego białka neuronalne pozbawione normalnego białka nie mogą generować specyficznej dla choroby Parkinsona Parkinsona.
Co jest głównym składnikiem białkowym ciał Lewy'ego?
Podstawowym składnikiem białkowym ciał Lewy'ego są fibryle złożone z alfa-synukleiny.