W niniejszym badaniu przetestowano hipotezę, że N-bromoacetylo-3,3',5-[125I]trijodotyronina (BrAc[125I]T3) jest użytecznym znacznikiem powinowactwa dla dejodynaz jodotyroninowych typu I i typu III (ID-I i ID-III). Dlatego frakcje mikrosomalne różnych tkanek szczurów badano pod kątem aktywności ID-I i ID-III, a białka mikrosomalne znakowano BrAc[125I]T3 i analizowane przez SDS-PAGE. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, wysoką aktywność ID-I stwierdzono w wątrobie, nerkach i tarczycy, a wysoką aktywność ID-III w mózgu, w szczególności w mózgu płodu i łożysku. SDS-PAGE z BrAc[125I]T3-znakowane mikrosomy wykazały wyraźne radioaktywne białko około 27 kDa (p27) w wątrobie, nerkach i tarczycy, które zostało wcześniej zidentyfikowane jako jako ID-I i białko o masie około 32 kDa (p32) w mózgu, w szczególności w mózgu płodu i łożysku. mózgu i łożysku. Stwierdzono dobrą korelację między znakowaniem powinowactwa p32 i inaktywacją ID-III przez BrAcT3, co sugeruje, że p32 reprezentuje ID-III lub jego podjednostkę. Po traktowaniu mikrosomów 0,05% dezoksycholanem lub buforem węglanowym (pH 11,5) p32 był nadal znakowany przez BrAc[125I]T3, co wskazuje, że p32 jest białkiem transmembranowym. Chociaż 3,3',5'-trijodotyronina (rT3) nie jest substratem dla ID-III, p32 był łatwo znakowane BrAc[125I]rT3. Znakowanie p32 w mikrosomach mózgu szczura przez BrAc[125I]rT3 nie miało wpływu dodanie 100 mikroM nieznakowanej tyroksyny (T4) lub T3, podczas gdy dejodynacja [125I]T3 przez ID-III była hamowana przez 91 i 96% w obecności odpowiednio 1 mikroM T4 i T3.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 SŁÓW) --- Po aktywacji ditiotreitolem, aktywność 5'-dejodynazy jodotyroninowej (I-5'D) w mikrosomach nerkowych jest mniej wrażliwa na hamowanie przez propylotiouracyl (PTU) i jopanian (IOP) w nanomolarnych, w porównaniu do mikromolarnych, stężeniach substratu stężeniach. Aktywność enzymatyczna przy nanomolarnych stężeniach substratu są jednak całkowicie wyeliminowane w obecności kombinacji 10 mikroM IOP i 100 mikroM PTU. W niniejszym raporcie przedstawiamy dowody na to, że 1) względna niewrażliwość na PTU wynika z resztkowej aktywności enzymu o wysokim Km enzymu, który będąc bardzo wrażliwym na hamowanie PTU przy mikromolarnych stężeniach substratu stężeniach substratu, staje się stopniowo mniej wrażliwy na PTU, gdy stężenie substratu stężenia substratu zmniejszają się w stosunku do jego Km; i 2) względna niewrażliwość na IOP jest spowodowana obecnością w mikrosomach nerek enzymu o niskim Km, który jest stosunkowo niewrażliwy na IOP, ale bardzo wrażliwy na hamowanie przez PTU. Klasyfikacja dejodynaz na podstawie wrażliwości na PTU wymaga zatem że nie tylko stężenia tiolu, ale, jak w przypadku enzymu typu I należy również określić stężenia substratów. Odporność na PTU typu I przy nanomolarnych stężeniach substratu sugeruje rolę tego enzymu w neogenezie T3. enzymu w neogenezie T3 u zwierząt leczonych PTU. --- Zbadaliśmy wpływ warunków testu na wrażliwość 6-n-propylo-2-tiouracyl (PTU) wrażliwość 5'-dejodynazy jodotyroniny w brązowej tkance tłuszczowej (BAT) od szczurów z niedoczynnością tarczycy. Wyniki te zostały porównane z podobnymi badaniami aktywności 5'-dejodynazy w mikrosomach nerkowych od eutyreozy. Chociaż mikrosomy BAT zawierają głównie typ II (niewrażliwe na PTU) aktywność dejodynazy, 5'-dejodynacja T4 może być hamowana przez PTU, jeśli stężenie ditiotreitolu (DTT) w teście jest zmniejszone do 5 mM lub mniej. Pozorne Ki dla PTU mikrosomów BAT wynosiło 4,3 mM przy 5,0 mM DTT i 0,41 mM przy 0,5 mM DTT. Kinetyka hamowania była niekonkurencyjna. W przypadku mikrosomów nerkowych hamowanie PTU 5'-dejodowania rT3 było zależne zarówno od czasu, jak i stosunku enzym/substrat. Na przykład, przy użyciu 1 mikrogramów białka mikrosomalnego, 2 nM rT3 i 5 mM DTT, hamujący wpływ PTU nie był maksymalny aż do 12 minut po dodaniu PTU. Przy stabilnych prędkościach reakcji hamowanie PTU było niekonkurencyjne, a Ki wynosiło około 1 mikroM. Dejodynacja przez mikrosomy nerkowe była całkowicie hamowana przez 50 mikroM PTU. Mimo że możliwe jest zahamowanie aktywności 5'-dejodynazy typu II za pomocą wysokimi stężeniami PTU (w obecności niskich stężeń DTT), dejodynaza w nerkach jest dejodynaza w nerce jest około 1000 razy bardziej wrażliwa na PTU. Według tych kryteriów 5'-dejodynaza w mikrosomach nerki jest typu I.
Które dedydynazy są obecne w nerkach?
Dejodynazy typu 1 i typu 3 są obecne w wątrobie