Fascin jest białkiem wiążącym aktynę, zaangażowanym w tworzenie filopodii i inwazję nowotworów inwazji i przerzutach wielu typów nowotworów nabłonkowych. Fascyna tworzy stabilne wiązki wiązki aktyny z powolną kinetyką dysocjacji in vitro i jest regulowana przez fosforylację seryny 39 przez kinazę białkową C (PKC). Komórki nowotworowe wykorzystują inwazyjne wypukłości przypominające palce, zwane invadopodia, do inwazji i degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej. macierzy zewnątrzkomórkowej. Inwadopodia mają wysoce dynamiczną aktynę, która jest montowana przez zarówno przez kompleks Arp2/3, jak i forminy; zawierają one również składniki błonowe, takie jak dynamina i kortaktyna, i zostały porównane z zrostami ogniskowymi i podosomami. Pokazujemy, że fascynacja jest integralnym składnikiem inwadopodiów i że jest ważna dla stabilności aktyny w inwadopodiach. Stan fosforylacji fascynacji w S39, miejscu PKC, przyczynia się do jej regulacji w inwadopodiach. regulacji w inwadopodiach. Dalej wiążemy fascynację z inwazyjną migracją do żeli kolagenowych I-Matrigel, a zwłaszcza w typach komórek, które wykorzystują wydłużony mezenchymalny typ ruchliwości w 3D. Zapewniamy potencjalny mechanizm molekularny molekularny mechanizm zwiększający inwazyjność komórek nowotworowych, a także porównujemy invadopodia z inwazyjnymi strukturami podobnymi do filopodów w 3D. --- Filopodia to wysoce dynamiczne wypustki komórkowe przypominające palce, wypełnione równoległymi wiązkami włókien aktyny. wiązkami włókien aktyny. Wcześniej wykazaliśmy, że formina dDia2 związana z Diaphanous formina dDia2 jest zaangażowana w tworzenie filopodii. Innym kluczowym graczem dla tworzenia filopodii u wielu gatunków jest fosfoproteina stymulowana przez wazodylatatory fosfoproteina (VASP). Zaproponowano, że kluczową rolą VASP dla tworzenia filopodii jest jego konkurencja z białkami zamykającymi dla filamentu filamentu. Aby lepiej zrozumieć funkcję VASP w tworzeniu filopodiów przeanalizowaliśmy właściwości in vitro i in vivo Dictyostelium VASP (DdVASP) i rozszerzyliśmy nasze odkrycia na ludzki VASP. Rekombinowany VASP z obu gatunków zarodkował i wiązał filamenty aktyny, ale nie konkurował z białkami zamykającymi białka lub blokować depolimeryzację z kolczastych końców. Wraz z odkryciem że DdVASP wiąże się z domeną FH2 dDia2, dane te wskazują, że kluczowa rola kluczowa rola VASP w tworzeniu filopodiów różni się od odklejania filamentów aktynowych. Aby zidentyfikować aktywność DdVASP wymaganą w tym procesie, eksperymenty ratunkowe komórek DdVASP-null ze zmutowanymi konstruktami DdVASP zostały przeprowadzono. Tylko WT DdVASP, ale nie mutant pozbawiony aktywności wiązania F-aktyny może uratować zdolność tych komórek do tworzenia filopodii podobnych do WT. Nasze dane sugerują, że DdVASP jest skompleksowany z dDia2 w końcówkach filopodialnych i obsługuje wydłużanie filamentów za pośrednictwem forminy poprzez wiązanie powstających filamentów aktyny. --- Stożki wzrostu na dystalnych końcach rosnących aksonów nerwowych zawierają wiązki filamentów aktyny aktyny rozmieszczone w całym lamellipodium i które wystają do filopodia. Regulacja wiązania aktyny przez specyficzne białka wiążące aktynę prawdopodobnie odgrywa ważną rolę w wielu zachowaniach stożka wzrostu. Chociaż białko białko wiążące aktynę, fascynacja, zostało zlokalizowane w stożkach wzrostu, niewiele informacji na temat jego funkcjonalnego znaczenia. Wykorzystaliśmy duże stożków wzrostu ślimaka Helisoma, aby określić, czy fascynacja była zaangażowana w czasowe zmiany w filamentach aktynowych podczas morfogenezy stożka wzrostu. Fascyna zlokalizowana w promieniowo zorientowanych wiązkach aktyny w lamellipodiach (żebrach) i filopodiach. filopodia. Używając przeciwciała Fascin i konstruktu Fascin GFP, odkryliśmy, że Fascynacja włączona do wiązek aktyny od początku stożka wzrostu tworzenia stożka wzrostu na odciętym końcu aksonów. Fascyna wiązała się z większością wiązek aktyny z wyjątkiem proksymalnych 6-12% przylegających do domeny centralnej, która jest regionem region związany z demontażem aktyny. Później, podczas morfogenezy morfogenezy, gdy żebra aktyny uległy skróceniu, proksymalna strefa wolna od fascynacji ale fascynacja została zachowana w dystalnej, filopodialnej części wiązek. wiązek. Leczenie promotorem nowotworowym 12-O-tetradekanoiloforbol-13-octanem (TPA), który fosforyluje fascynację i zmniejsza jej powinowactwo do aktyny, spowodowało utratę wszystkich wiązek aktyny ze stożków wzrostu. Nasze odkrycia sugerują że fascynacja może być szczególnie ważna dla liniowej struktury i dynamiki filopodii i dynamiki żeber lamellipodialnych poprzez regulację organizacji filamentów w wiązkach. w wiązkach. --- Slug, członek rodziny czynników transkrypcyjnych Snail, odgrywa kluczową rolę w regulacji przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) poprzez w regulacji przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) poprzez tłumienie kilku markerów nabłonkowych i cząsteczek adhezyjnych, w tym E-kadheryny. A ostatnie badanie wykazało, że nie istnieje związek między Slug i E-kadheryną w raku trzustki. Inne badanie wykazało, że w złośliwych wysiękach wysięku międzybłoniaka Slug był związany z ekspresją metaloproteinazy macierzy (MMP) ale nie było związku z E-kadheryną. F-ascyna jest białkiem białkiem wiążącym aktynę, zaangażowanym w tworzenie filopodiów i inwazję nowotworów oraz przerzuty wielu typów raka nabłonkowego. W tym badaniu zbadaliśmy Slug, E-kadherynę i ekspresję MMP-9 przy użyciu immunohistochemii u 60 pacjentów z rakiem trzustki i ich korelację z inwazją raka i przerzutami. przerzutami. Dodatkowo zaobserwowaliśmy wpływ Slug na inwazję i przerzuty w raku trzustki. przerzuty w linii komórkowej raka trzustki PANC-1. Zmiany w Slug, MMP-9 i E-kadheryny określono za pomocą RT-PCR, western blot i immunohistochemii. immunohistochemii. Zmiany w MMP-9 i cytoszkielecie F-aktyny zostały przez barwienie immunofluorescencyjne, cytometrię przepływową (FCM) lub zymografię żelatynową. zymografii żelatynowej. Ekspresja ślimaka, E-kadheryny i MMP-9 w raku trzustki była istotnie związana z przerzutami do węzłów chłonnych i stwierdziliśmy istotną korelację między Slug i ekspresją MMP-9; jednak nie zaobserwowano istotnej korelacji między Slug a ekspresją E-kadheryny. Transfekcja Slug znacząco zwiększała inwazję i przerzuty w komórkach PANC-1 i ortotopowym guzie myszy. ortotopowym guzie myszy in vivo, a także znacząco regulowała i aktywowała MMP-9; jednak nie miało to wpływu na ekspresję E-kadheryny. Ślimak promował tworzenie lamelliopodii lub filopodii w komórkach PANC-1. Wewnątrzkomórkowa F-aktyna i MMP-9 zostały zwiększone i przeniesione na przód rozszerzających się pseudopodia pseudopodia z puli okołojądrowej w komórkach PANC-1 transfekowanych Slug. Te Wyniki te sugerują, że Slug promuje migrację i inwazję komórek PANC-1, co może korelować z reorganizacją MMP-9 i przebudową cytoszkieletu F-aktyny ale nie z ekspresją E-kadheryny. --- Rodzina białek bogatych w cysteinę (CRP) jest podgrupą białek domeny LIM. CRP1, które łączy filamenty aktyny, tworząc wiązki aktyny, jest jedynym członkiem rodziny CRP wyrażanym w OUN. w OUN, przy czym niewiele wiadomo na temat jego funkcji w komórkach nerwowych. komórkach nerwowych. Tutaj donosimy, że CRP1 kolokalizuje z aktyną w filopodiach stożków wzrostu w hodowanych szczurzych hipopotamach. stożków wzrostu w hodowanych szczurzych neuronach hipokampa. Obniżenie ekspresji CRP1 przez interferencję RNA z krótką spinką do włosów powoduje zahamowanie tworzenia filopodii i wzrostu dendrytycznego w neuronach. Nadekspresja CRP1 zwiększa tworzenie filopodii i rozgałęzianie neurytów, co wymaga jego aktywności wiązania aktyny. Ekspresja CRP1 z konstytutywnie aktywną formą Cdc42, GTPazy zaangażowanej w tworzenie filopodiów, zwiększa tworzenie filopodiów. w tworzenie filopodii, zwiększa tworzenie filopodii w komórkach COS-7, co sugeruje współpracę między tymi dwoma białkami. Ponadto wykazaliśmy, że aktywność neuronalna zwiększa ekspresję CRP1 w neuronach hipokampa poprzez napływ Ca²⁺ po depolaryzacji. po depolaryzacji. Kinazy białkowe zależne od Ca²⁺/kalmoduliny IV (CaMKIV) i białko wiążące element odpowiedzi cAMP pośredniczy w indukowanej przez Ca²⁺ regulacji w górę ekspresji CRP1. Ponadto CRP1 jest wymagany do wzrostu dendrytycznego indukowanego przez napływ Ca²⁺ lub CaMKIV. Łącznie dane te są pierwszymi, które wykazały rolę CRP1 we wzroście dendrytów. --- Substrat kinazy tyrozynowej receptora insuliny p53 (IRSp53) został zidentyfikowany jako adaptor zawierający domenę SH3, który łączy Rac1 z zespołem Wiskotta-Aldricha rodziny verprolin-homologous protein 2 (WAVE2) w celu indukcji lamellipodii lub Cdc42 z Mena w celu indukcji filopodii. Rekrutacja tych partnerów wiążących SH3 przez IRSp53 jest uważana za kluczową dla rearanżacji F-aktyny. Tutaj pokazujemy, że N-końcowy przewidywany helikalny odcinek 250 aminokwasów IRSp53 jest ewolucyjnie zachowanym ewolucyjnie konserwowaną domeną wiązania F-aktyny zaangażowaną w tworzenie filopodium filopodium. Pięć białek, w tym IRSp53 i brakujące w przerzutach (MIM) dzieli tę unikalną domenę i jest wysoce konserwatywna u kręgowców. My nazwaliśmy konserwowaną domenę IRSp53/MIM homology domain (IMD). IMD ma domenę domenę u bezkręgowców, ale nie wykazuje oczywistej homologii do żadnego ze znanych białek oddziałujących z aktyną. białek oddziałujących z aktyną. Sama IMD, pochodząca z IRSp53 lub MIM, indukowała filopodia w komórkach HeLa i tworzenie ciasno upakowanych równoległych wiązek F-aktyny in vitro. Wyniki te sugerują, że IRSp53 i MIM należą do nowej rodziny białek rodziny białek wiążących aktynę. Ponadto stwierdziliśmy, że aktywność IMD w pełnej długości IMD w pełnej długości IRSp53 była regulowana przez aktywne Cdc42 i Rac1. Domena SH3 nie była niezbędna do tworzenia filopodium indukowanego przez IMD. Nasze wyniki wskazują, że IRSp53, aktywowany przez małe GTPazy, uczestniczy w reorganizacji reorganizacji F-aktyny nie tylko w sposób zależny od SH3, ale także w sposób zależny od aktywności IMD. --- Białka sieciujące aktynę organizują aktynę w wysoce dynamiczne i zróżnicowane architektonicznie subkomórkowe rusztowania, które architektonicznie zróżnicowane rusztowania subkomórkowe, które orkiestrują różne procesy mechaniczne, w tym procesy mechaniczne, w tym wypukłości lamellipodialne i filopodialne w komórkach ruchliwych komórkach. Sposób, w jaki szlaki sygnalizacyjne kontrolują i koordynują aktywność jest słabo zdefiniowany. IRSp53, wielodomenowe białko, które może może wiązać się z Rho-GTPazami Rac i Cdc42, uczestniczy w tych procesach głównie poprzez swoją amino-końcową domenę IMD (domena IRSp53 i MIM). Wyizolowany IMD ma aktywność wiązania aktyny in vitro i jest wystarczająca do indukowania filopodii in vivo. Jednak sposób regulacji tej aktywności w białku o pełnej długości pozostaje w dużej mierze nieznany. białko pozostaje w dużej mierze nieznane. Eps8 jest zaangażowany w dynamikę aktyny poprzez jej aktyny i jej zdolność do modulowania aktywności Rac. Co więcej, Eps8 wiąże się z IRSp53. Tutaj opisujemy nową aktywność sieciowania aktyny aktywność Eps8. Dodatkowo, Eps8 aktywuje i synergizuje z IRSp53 w pośrednicząc w wiązaniu aktyny in vitro, wzmacniając zależne od IRSp53 rozszerzenia błony in vivo. Cdc42 wiąże się i kontroluje komórkową dystrybucję kompleksu IRSp53-Eps8, wspierając istnienie szlaku sygnalizacyjnego Cdc42-IRSp53-Eps8. szlaku sygnałowego Cdc42-IRSp53-Eps8. Konsekwentnie, filopodia indukowana przez Cdc42 jest hamowana po indywidualne usunięcie IRSp53 lub Eps8. Podsumowując, wyniki te potwierdzają model, w którym synergiczna aktywność wiązania kompleksu IRSp53-Eps8, regulowana przez Cdc42, przyczynia się do tworzenia wiązek aktyny, tym samym promując wypukłości filopodialne. --- Makrofagowe białko fosforylowane tyrozyną związane z aktyną (MAYP) należy do rodziny homologii rodziny białek Pombe Cdc15 homology (PCH) zaangażowanych w regulację funkcji opartych na aktynie, w tym funkcji opartych na aktynie, w tym adhezji i ruchliwości komórek. W mysich makrofagach makrofagach myszy, MAYP jest fosforylowany tyrozyną po aktywacji receptora czynnika stymulującego kolonie receptora czynnika stymulującego kolonie-1 (CSF-1R), który również indukuje reorganizację aktyny reorganizację aktyny, marszczenie błony, rozprzestrzenianie się komórek, polaryzację i migrację. Ponieważ MAYP wiąże się z F-aktyną, zbadaliśmy funkcję MAYP w regulacji organizacji aktyny w makrofagach. w regulacji organizacji aktyny w makrofagach. Nadekspresja MAYP zmniejszyła CSF-1 i zwiększała tworzenie filopodii, ruchliwość i chemotaktynę makrofagów. chemotaksję za pośrednictwem CSF-1. Odwrotny fenotyp zaobserwowano przy zmniejszonej ekspresji ekspresji MAYP, co wskazuje, że MAYP jest negatywnym regulatorem CSF-1 i pozytywnie reguluje tworzenie filopodii i kierunkową migrację. i kierunkową migrację. Nadekspresja MAYP prowadziła do zmniejszenia całkowitej zawartości zawartości F-aktyny w makrofagach, ale była związana ze zwiększonym wiązaniem aktyny. Zgodnie z tym, oczyszczony MAYP wiązał F-aktynę i regulował jej obrót in vitro. Ponadto MAYP kolokalizował z korową i filopodialną F-aktyną in vivo. vivo. Ponieważ postuluje się, że filopodia zwiększają ruchliwość kierunkową poprzez działając jako czujniki środowiskowe, stymulowany przez MAYP wzrost ruchliwości kierunkowej może być przynajmniej częściowo wyjaśniony przez wzmocnienie tworzenia filopodii.
Które białka biorą udział w wiązaniu aktyny oraz tworzeniu i funkcjonowaniu filopodii?
Stwierdzono, że wiele białek reguluje wiązanie F-aktyny i zwiększa tworzenie filopodii i ruchliwość. Wśród nich znajdują się: białko bogate w cysteinę 1 (CRP1), fascyna, białko fosforylowane tyrozyną związane z aktyną makrofagów (MAYP/PSTPIP2), substrat kinazy tyrozynowej receptora insuliny p53 (IRSp53), białko brakujące w przerzutach (MIM), Eps8, formina związana z diafanalem (dDia2) i fosfoproteina stymulowana przez leki rozszerzające naczynia krwionośne (VASP).