Stworzyliśmy wysokowydajną metodę transformacji jądrowej dla okrzemki Phaeodactylum tricornutum przy użyciu systemu elektroporacji. W oparciu o uniwersalny protokół protokół elektroporacji, zoptymalizowano warunki wprowadzania egzogennego DNA w tym natężenie pola elektrycznego i postać plazmidu, zostały zoptymalizowane. Po optymalizacji, komórki okrzemek mogły być łatwo transformowane egzogennym genem, maksymalna uzyskana częstotliwość transformacji wyniosła 2,8×10(-5) komórek. The kotransformacja P. tricornutum nieselektywnym genem GUS wraz z selektywnym genem oporności. selektywnym genem oporności została również osiągnięta przy użyciu naszej nowej metody i okazała się bardzo wydajna (do 60%). Procedura elektroporacji opisana w tym artykule oferuje szereg zalet, w tym prostotę, ogólną użyteczność, niskie koszty i wysoką wydajność. użyteczność, niski koszt i wysoką wydajność. Opisana metoda dostarcza również wskazówek do opracowania systemu transformacji elektroporacyjnej w innych mikroalgach eukariotycznych. eukariotycznych. --- Tutaj przedstawiamy ilościowe badanie oparte na mechanizmie, mające na celu porównanie pobór komórek, wewnątrzkomórkowy handel, ucieczkę endosomalną i ostateczny los lipopleksów i nanocząstek lipidowo-protaminowych/kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) (LPD) (NPs) w żywych komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO). Jako model, dwa lipidy lipidowe zostały użyte do porównania. Pierwszy preparat składa się z kationowego lipidu 1,2-dioleoilo-3-trimetyloamoniopropanu (DOTAP) oraz zwitterionowy lipid dioleoilofosfocholina (DOPC), podczas gdy druga mieszanina jest składa się z kationowego 3β-[N-(N,N-dimetyloaminoetano)-karbamoilo] cholesterolu (DC-Chol) i zwitterionowego lipidu pomocniczego dioleoilofosfatydyloetanoloaminy (DOPE). Nasze odkrycia wskazują, że lipopleksy są skutecznie pobierane przez makropinocytozę w fazie płynnej, podczas gdy mniej wydajny wychwyt LPD NPs występuje poprzez połączenie makropinocytozy i szlaków zależnych od klatryny. Wewnątrz komórki zarówno lipopleksy, jak i LPD NPs są aktywnie transportowane w kierunku jądra komórkowego. jądra komórkowego, co zostało ilościowo zbadane za pomocą spektroskopii korelacji przestrzenno-czasowej obrazu spektroskopii korelacji przestrzenno-czasowej (STICS). Dla każdego preparatu lipidowego, LPD NPs uciekają z endosomów z endosomów bardziej efektywnie niż lipopleksy. Gdy komórki były traktowane układami DOTAP-DOPC, większość DNA została uwięziona w przedziale lizosomalnym, co sugeruje lizosomie, co sugeruje, że rozległa degradacja lizosomalna była czynników ograniczających szybkość transfekcji za pośrednictwem DOTAP-DOPC. Z drugiej strony, ucieczka z endosomów jest duża dla systemów zawierających DC-Chol-DOPE, najprawdopodobniej ze względu na DOPE i cząsteczki podobne do cholesterolu, które są w stanie destabilizować błonę błonę endosomalną. Zależne od lipidów i struktury wzmocnienie aktywności transfekcji sugeruje, że DNA jest dostarczane do jądra synergistycznie: proces wymaga synergistycznie: proces ten wymaga zarówno aktywności błonotwórczej otoczki nanonośnika, jak i błonotwórczej otoczki nanonośnika, jak i zastosowania gatunków lipidów o wewnętrznej endosomalnej zdolności do pękania. --- Mikroiniekcja ma długą i wybitną historię w Xenopus i była używana do wprowadzania zaskakująco zróżnicowanej gamy czynników do zarodków zarówno wewnątrz- i międzykomórkowych. Oprócz jąder, badacze w różny sposób wstrzykiwali peptydy, przeciwciała, biologicznie aktywne substancje chemiczne, markery linii, mRNA, DNA, morfoliny i enzymy. Wymieniając wiele różnych metod podejść do mikroiniekcji, skupimy się na operacjach mechanicznych i opcjach mechanicznych i dostępnych opcjach wprowadzania mRNA, DNA i morfolino wewnątrzkomórkowo do zarodków we wczesnym stadium rozwoju w celu badania neurogenezy. --- Bailey-Wilson JE(1), Almasy L, de Andrade M, Bailey J, Bickeböller H, Cordell HJ, Daw EW, Goldin L, Goode EL, Gray-McGuire C, Hening W, Jarvik G, Maher BS, Mendell N, Paterson AD, Rice J, Satten G, Suarez B, Vieland V, Wilcox M, Zhang H, Ziegler A, MacCluer JW. --- Membrana plazmatyczna komórek ssaków może być przejściowo permeabilizowana przez i egzogenne materiały lub geny mogą być wprowadzane do cytoplazmy żywych komórek. cytoplazmy żywych komórek. Do tej pory wykorzystywano kilka mechanizmów do manipulacji manipulacji: laser jest bezpośrednio i ściśle skupiony na komórkach w celu optoiniekcji, fale naprężeniowe indukowane laserem, internalizacja fotochemiczna i napromienianie selektywnych komórek cząsteczkami pochłaniającymi światło. W ciągu W ciągu ostatnich kilku lat poczyniono znaczne postępy i dokonano licznych przełomów w tym obszarze badań. Niniejszy przegląd obejmuje cztery różne techniki oraz ich zalety i wady. Uniwersalność w stosunku do różnych linii komórkowych jest prawdopodobnie główną zaletą optoporacji wspomaganej laserem w porównaniu z obecnie istniejącymi metodami transfekcji komórek. --- Zsyntetyzowano nową serię kationowych lipidów połączonych karbaminianem, zawierających hydroksylową grupę głów została zsyntetyzowana i włączona do preparatów do testów transfekcji. Kompleksy DNA-lipidowe zostały scharakteryzowane pod kątem ich zdolności do wiązania DNA, ich rozmiar, potencjał ζ i cytotoksyczność. W porównaniu z wcześniej opisanym kationowym lipidem transfekcyjnym DDCDMA pozbawionym grupy hydroksylowej i dostępnym komercyjnie dostępne w handlu, te kationowe liposomy wykazywały stosunkowo wyższą wydajność transfekcji. --- Niniejsze badanie poszukuje korelacji między strukturami molekularnymi kationowych i neutralnych lipidów neutralnych lipidów, zachowaniem fazy lipidowej lipopleksów mieszanych lipidów, które tworzą z plazmidowym DNA, a skutecznością transfekcji lipopleksów. Syntetyczny kationowe lipidy pirydyniowe były współformułowane (1:1) z kationowym lipidem 1,2-dimyristoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholiną (EPC), a te lipidy były współformułowane (3: 2) z neutralnymi lipidami 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloaminą (DOPE) lub cholesterolem. Wszystkie preparaty lipoplex wykazywały wiązanie plazmidowego DNA i poziom ochrony przed degradacją DNazy I. Transfekcja zależna od składu (beta-galaktozydaza i GFP) i cytotoksyczność zaobserwowano w komórkach jajnika chomika chińskiego-K1. Najbardziej najbardziej aktywne preparaty zawierające lipidy pirydyniowe były mniej cytotoksyczne ale o porównywalnej aktywności do kontroli Lipofectamine 2000™. Parametry struktury molekularnej i współczynniki podziału obliczono dla wszystkich lipidów przy użyciu metod metod addytywnych fragmentów. Uzyskane wartości parametrów kształtu prawidłowo korelowały z obserwowanym zachowaniem heksagonalnej fazy lipidowej lipopleksów, jak wynika z eksperymentów rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem. Wskaźnik transfekcji mający zastosowanie do lipopleksów w fazie heksagonalnej wyprowadzony z obliczonych parametrów mieszaniny lipidów (współczynnik podziału (współczynnik podziału, parametr kształtu, upakowanie lipopleksu) wytworzył bezpośrednią korelację z wydajnością transfekcji. --- Opracowano wiele wektorów wirusowych do dostarczania transgenów do określonych komórek docelowych. określonych komórek docelowych. Dla trwałej ekspresji transgenu, wektory oparte na retrowirusy są atrakcyjnymi nośnikami ze względu na ich zdolność do stabilnej stabilnej integracji DNA z genomem komórki gospodarza. Początkowo wektory oparte na proste retrowirusy były wektorami z wyboru do takich zastosowań. Jednakże, wektory te mogą jednak transdukować tylko aktywnie dzielące się komórki. Dlatego też zainteresowanie zwróciło się w stronę wektorów retrowirusowych opartych na lentiwirusach, ponieważ ze względu na ich zdolność do transdukcji zarówno dzielących się, jak i nie dzielących się komórek. Najlepiej wektory lentiwirusowe pochodzą od ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). typu 1 (HIV-1). W niniejszym rozdziale opisano podstawowe cechy cyklu replikacji HIV-1 i wiele ulepszeń zgłoszonych dla systemów wektorów lentiwirusowych w celu zwiększenia bezpieczeństwa i wydajności. w celu zwiększenia bezpieczeństwa i wydajności. Przedstawiamy również praktyczne praktyczne informacje na temat produkcji wektorów lentiwirusowych pochodzących z HIV-1, protokołu transdukcji komórek i metody protokół transdukcji i metodę określania miana transdukcji wektora lentiwirusowego. wektora lentiwirusowego. --- Wprowadzenie i ekspresja wielu transgenów jest często wymagana do badań podstawowych i stosowanych. Jednak obecnie transformacja wielu genów jest bardzo trudna ze względu na ograniczenia techniczne istniejących metod. Tutaj opisujemy system system wektorowy do wydajnego montażu i transformacji wielu genów. System składa się z opartego na transformacji sztucznego chromosomu (TAC) wektora akceptorowego wraz z dwoma wektorami donorowymi. Wykorzystując system rekombinacji CreloxP system rekombinacji i endonukleazy naprowadzające, przeprowadzono wiele rund montażu genów przeprowadzono z naprzemiennym wykorzystaniem wektorów-dawców, a wiele genów geny były sekwencyjnie dostarczane do wektora TAC. Dzięki temu systemowi stworzyliśmy konstrukty zawierające aż 10 obcych fragmentów DNA. Wiele genów, w tym sześć genów oporności ułożonych w konstrukt, zostało przeniesionych do genomu ryżu poprzez transformację za pośrednictwem Agrobacterium. System ten rozszerza repertuar badań genetyki molekularnej i przedsięwzięć biotechnologicznych poprzez umożliwiając jednoczesną manipulację wieloma genami. --- Istniejące metody ukierunkowanej mutagenezy plazmidów są ograniczone przez niewielkie spektrum modyfikacji, które mogą być wprowadzane przez startery mutagenne oraz ograniczenia wielkości amplikonu syntezy DNA in vitro. Jak wykazano tutaj, połączone wykorzystanie rekombinacji Red/ET i unikalnej eliminacji miejsc restrykcyjnych umożliwia rozległą manipulację niezależnie od wielkości plazmidu i sekwencji DNA elementów. Po pierwsze, selektywny marker jest amplifikowany metodą PCR z syntetycznymi starterami dołączając 50-bp homologiczne boki docelowe dla rekombinacji Red/ET i dowolne miejsce restrykcyjne miejsce restrykcyjne nieobecne w plazmidzie substratowym. Powstała kaseta jest ko-elektroporowana z plazmidami substratowymi w komórkach Red/ET-proficient Escherichia coli komórek. Po izolacji rekombinowanych plazmidów, liniowy nieselektywny DNA zastępuje kasetę i wprowadza pożądaną mutację (mutacje) w drugim etapie rekombinacji Red/ET rekombinacji. Po selektywnym trawieniu plazmidów rodzicielskich i retransformacji, osiągnięto 38% wydajność mutacji przy użyciu syntetycznego 97-nukleotydowego oligonukleotydu w celu wyleczenia delecji 17-bp w lacZalpha pUC19 (2,686 bp). Fragment PCR został użyty z podobną wydajnością do zastąpienia mysich kodonów Cdkn1b w kodonach 9 i 76 wektora pGTC (13,083 bp). --- WPROWADZENIE: Nadekspresja receptorów transferyny (Tf) na komórkach nowotworowych czyni je użytecznym celem dla dostarczania do tych komórek leków małocząsteczkowych i nukleinowych do tych komórek. Takie podejście może złagodzić niecelowe działanie leków. OBSZARY OBJĘTE BADANIEM: Funkcja receptora Tf, rozwój kompleksów Tf-lipid-DNA (lipopleksy Tf), terapeutyczne zastosowanie lipopleksów i kompleksów polimer-DNA (poylpleksy). kompleksów polimer-DNA (poylplexes) oraz terapeutyczne zastosowanie lipopleksów Tf i przeciwciał-lipopleksów przeciwko receptorowi Tf. Przeszukiwanie literatury dla tego przeglądu opierało się przede wszystkim na terminach "lipopleksy", "lipopolipleksy "transferyna", "receptor transferyny" i "terapia genowa". Jednakże, przegląd nie miał być jednak kompleksowy. OPINIA EKSPERTA: Kompleksy Tf z kationowymi liposomami i kwasami nukleinowymi, lub liposomami z kowalencyjnie przyłączonym Tf lub przeciwciałami przeciwko receptorowi transferyny zostały wykorzystane do dostarczania genów terapeutycznych, antysensownych oligodeoksynukleotydów i krótkich interferujących RNA. Chociaż takie ukierunkowane niewirusowe nośniki mogą korzystać z dalszego zwiększania ich skuteczności, obecne osiągnięcia na poziomie hodowli komórkowych i modeli zwierzęcych powinny być zostać przełożone na zastosowania kliniczne, ograniczone początkowo do zlokalizowanego dostarczania do dostępnych tkanek w celu uniknięcia potencjalnych ogólnoustrojowych skutków ubocznych i dostarczanie niecelowe. --- Biotechnologia roślin obejmuje manipulację materiałem genetycznym w celu opracowania lepszych upraw. Mając na uwadze wyzwania stojące przed ludzkością w zakresie niedobór żywności i innych zasobów, musimy stale ulepszać technologii genomicznych i dostrajać istniejące metody. Dla skutecznej transformacji genetycznej transformacji genetycznej, metody pośredniczone przez Agrobacterium, jak również metody bezpośredniego dostarczania były z powodzeniem stosowane. Metody te mają jednak wiele wad zwłaszcza w zakresie transferu dużych genów, kompleksów genów i wyciszania genów. wyciszania genów. Aby przezwyciężyć te problemy, ostatnio podjęto pewne wysiłki w celu opracować systemy transformacji genetycznej oparte na zmodyfikowanych chromosomach roślinnych zwanych minichromosomami lub sztucznymi chromosomami roślinnymi. Istnieją dwa podejścia, a mianowicie, "top-down" lub "bottom-up" zostały zastosowane dla minichromosomów. Pierwsze z nich obejmuje inżynierię istniejących chromosomów w komórce, a drugie de z podstawowych składników. Podczas gdy niektóre sukcesy został osiągnięty przy użyciu tych chromosomów jako wektorów do transformacji genetycznej w kukurydzy, jednak potrzeba więcej badań, aby rozszerzyć tę technologię na rośliny uprawne. roślin uprawnych. W niniejszym przeglądzie podjęto próbę prześledzenia genezy minichromosomów i omówiono ich potencjał rozwoju w sztuczne wektory chromosomów roślinnych. wektory. Wykorzystanie tych wektorów w transformacji genetycznej w znacznym stopniu żywności i pomoże osiągnąć milenijne cele rozwoju ONZ. Milenijnych Celów Rozwoju ONZ. --- Rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusami (rAAV) są obecnie stosowane w kilku badaniach klinicznych w leczeniu różnych chorób. badaniach klinicznych w leczeniu różnych chorób i są obecnie preferowanym wyborem wielu badaczy w tej dziedzinie. wyborem wielu badaczy w tej dziedzinie, zarówno ze względu na ich niską patogenność i immunogenność w porównaniu z innymi wektorami wirusowymi, a także zlokalizowaną długoterminową ekspresję genów, pomimo ich ograniczeń związanych z wielkością DNA i szybkością ekspresji. szybkości ekspresji. W ostatnim czasie szereg postępów doprowadził do powstania nowych generacji wektorów rAAV. wektorów rAAV o ulepszonych właściwościach. Niniejszy przegląd dotyczy różnych strategie zastosowane w tym celu, a mianowicie badanie różnych tropizmów serotypów, produkcję mozaikowych i chimerycznych kapsydów, selekcję wektorów poprzez ukierunkowaną ewolucję, rozwój samouzupełniających się wektorów, wykorzystanie farmakologicznych adiuwantów i indukcji specyficznych mutacji kapsydu. Oczekuje się, że takie Oczekuje się, że takie podejścia pomogą w ustanowieniu klinicznej terapii genowej opartej na rAAV w najbliższej przyszłości. --- Analizy asocjacyjne całego genomu na dużych kohortach pacjentów generują duże zestawów kandydujących genów chorobowych. Jest to połączone z dostępnością genomowych baz danych i szybko rozwijającym się repozytorium literatury biomedycznej. literatury biomedycznej. Podejścia obliczeniowe do asocjacji genów chorobowych próbują wykorzystać te źródła danych, aby zidentyfikować najbardziej prawdopodobnych kandydatów na geny chorobowe kandydatów na geny chorobowe do dalszej analizy empirycznej przez badaczy translacyjnych, co skutkuje skuteczną identyfikacją genów o wartości diagnostycznej, prognostycznej i terapeutycznej. diagnostycznych, prognostycznych i terapeutycznych. Istniejące metody obliczeniowe analizują strukturę i sekwencję genów i sekwencję genów, adnotację funkcjonalną genów kandydujących, charakterystykę znanych genów choroby, sieci regulacyjne genów, interakcje białko-białko, dane z modeli zwierzęcych i fenotyp choroby. modeli zwierzęcych i fenotyp choroby. Do tej pory w kilku badaniach z powodzeniem z powodzeniem zastosowało analizę obliczeniową danych fenotypu klinicznego dla określonych chorób i wykazały powiązania genetyczne. W najbliższej przyszłości strategie obliczeniowe strategie obliczeniowe będą ułatwione dzięki lepszej integracji badań klinicznych i obliczeniowych i obliczeniowych, a także zwiększona dostępność danych dotyczących fenotypów klinicznych w formacie dostępnym dla podejść obliczeniowych.
Wymień istniejące metody genetycznej manipulacji komórkami.
Inżynieria genetyczna, zwana również modyfikacją genetyczną, to bezpośrednia manipulacja genomem organizmu przy użyciu biotechnologii. Nowy DNA może zostać wprowadzony do genomu gospodarza poprzez wyizolowanie i skopiowanie interesującego materiału genetycznego przy użyciu metod klonowania molekularnego w celu wygenerowania sekwencji DNA lub poprzez syntezę DNA, a następnie wprowadzenie tego konstruktu do organizmu gospodarza. Geny mogą być usuwane lub "nokautowane" przy użyciu nukleazy. Celowanie w geny to inna technika, która wykorzystuje homologiczną rekombinację do zmiany endogennego genu i może być stosowana do usuwania genu, usuwania eksonów, dodawania genu lub wprowadzania mutacji punktowych. Na podstawie wyników opracowano wiele metod manipulacji genetycznej komórek, takich jak mikroiniekcja, elektroporacja, liposomy i wektory wirusowe.