Metylacja DNA jest ważną modyfikacją epigenetyczną regulującą różne zjawiska biologiczne, w tym zjawiska biologiczne, w tym imprinting genomowy i wyciszanie transpozonów. Wiadomo, że wiadomo, że metylacja różnicowo metylowanych regionów (DMR) związanych z genami wdrukowanymi ojcowsko i niektórych elementów powtarzalnych zachodzi podczas rozwoju męskich komórek rozrodczych u myszy. Przeprowadziliśmy szczegółową analizę metylacji ojcowsko metylowanych DMR (H19, Dlk1/Gtl2 i Rasgrf1), powtórzeń interspersyjnych [SineB1, wewnątrzcząsteczkowa cząsteczka A (IAP) i Line1] i powtórzenia satelitarne (główne i drugorzędne) w celu określenia czasu tej metylacji de novo w męskich komórkach rozrodczych. Ponadto zbadaliśmy rolę metylotransferaz de novo (Dnmt3a i Dnmt3b) i pokrewnego białka (Dnmt3L) w tym procesie. Stwierdziliśmy, że metylacja wszystkich DMR i powtórzeń zachodziła stopniowo w płodowej prospermatogonii i została zakończona w stadium noworodka. stadium noworodka. Analiza nowonarodzonych prospermatogonii ze specyficznych dla linii zarodkowej Dnmt3a i Dnmt3b wykazała, że Dnmt3a metyluje głównie H19 i DMRs Dlk1/Gtl2 oraz krótką interspersyjną powtórkę SineB1. Zarówno Dnmt3a, jak i Dnmt3b były zaangażowane w metylację DMR Rasgrf1 i długich międzywęzłowych powtórzeń IAP i Line1. Tylko Dnmt3b był wymagany do metylacji powtórzeń satelitarnych. powtórzeń satelitarnych. Wyniki te wskazują zarówno na wspólne, jak i zróżnicowane specyficzność Dnmt3a i Dnmt3b in vivo. Wreszcie, wszystkie te sekwencje wykazały umiarkowaną do ciężkiej hipometylację w prospermatogoniach z niedoborem Dnmt3L, wskazując na krytyczną funkcję i szeroką specyficzność tego czynnika w metylacji de novo metylacji. --- MikroRNA (miRNA) to małe, niekodujące RNA, które regulują ekspresję wielu genów. genów. Ostatnie badania sugerują rolę miRNA w kancerogenezie. My i inni wykazaliśmy, że profile ekspresji miRNA różnią się w raku płuc w porównaniu z normalnymi płucami. normalne płuca, chociaż znaczenie tej nieprawidłowej ekspresji jest słabo słabo poznane. Wśród zgłoszonych miRNA o obniżonej regulacji w raku płuc, rodzina miRNA (miR)-29 (29a, 29b i 29c) wykazuje intrygującą komplementarność do 3'-UTR metylotransferazy DNA (DNMT) 3A i -3B (metylotransferazy de novo), dwa kluczowe enzymy zaangażowane w metylację DNA, które są często regulowane w górę w raka płuc i są związane ze złym rokowaniem. Zbadaliśmy, czy miR-29s może celować w DNMT3A i -B i czy przywrócenie miR-29s może normalizować nieprawidłowe wzorce metylacji w niedrobnokomórkowym raku płuca. Tutaj pokazujemy że ekspresja miR-29s jest odwrotnie skorelowana z DNMT3A i -3B w tkankach raka płuc i że miR-29s jest odwrotnie skorelowany z DNMT3A i -3B w tkankach raka płuc. tkankach raka płuc i że miR-29s bezpośrednio celują zarówno w DNMT3A, jak i -3B. The wymuszona ekspresja miR-29s w liniach komórkowych raka płuc przywraca normalne wzorce metylacji DNA, indukuje reekspresję genów supresorowych nowotworu, takich jak genów supresorowych, takich jak FHIT i WWOX, oraz hamuje nowotworzenie in vitro i in vivo. i in vivo. Odkrycia te potwierdzają rolę miR-29s w epigenetycznej normalizacji NSCLC, zapewniając uzasadnienie dla rozwoju strategii opartych na miRNA w leczeniu raka płuc. --- Metylacja DNA jest głównym mechanizmem epigenetycznym, który został zasugerowany do kontrolować regulację genów rozwojowych podczas embriogenezy, ale jego mechanizmy regulacyjne mechanizmy pozostają niejasne. W tym raporcie pokazujemy, że wyspy CpG związane z z powiązanym z chromosomem X klastrem genów homeobox Rhox, który ulega silnej ekspresji w pozazarodkowym trophektodzie pozazarodkowej trophektodermie, są różnie metylowane w sposób etapowy i i linii podczas rozwoju poimplantacyjnego myszy. Inaktywacja zarówno Dnmt3a, jak i Dnmt3b, metylotransferaz DNA niezbędnych do inicjacji de novo metylacji DNA. inicjacji metylacji DNA de novo, zniosła proces metylacji DNA metylacji DNA i wyciszenie genów klastra Rhox we właściwym zarodku. The Zależna od Dnmt3 metylacja wysp CpG w locus Rhox rozciągała się na duży region genomowy (około 1 M). region genomowy (około 1 Mb) zawierający klaster Rhox i otaczające go geny. geny. Eksperymenty komplementacyjne z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych (ES) z niedoborem metylotransferaz DNA sugerowały, że metylacja wysp CpG przez Dnmt3a i Dnmt3b była ograniczona w obrębie tego dużego regionu genomowego i nie miała wpływu na sąsiednie geny poza nim. sąsiednie geny poza nim, co sugeruje istnienie specyficznych dla regionu granic. Nasze wyniki sugerują, że metylacja DNA odgrywa ważną rolę w zarówno w wyciszaniu genów dalekiego zasięgu, jak i wyciszaniu specyficznym dla linii w embriogenezie. --- Autosomalna dominująca ataksja móżdżkowa, głuchota i narkolepsja (ADCA-DN) charakteryzuje się ataksja móżdżkowa, głuchota neuronalna, narkolepsja-katapleksja i demencja. głuchota neuronalna, narkolepsja-katapleksja i demencja. Przeprowadziliśmy sekwencjonowanie egzomu u pięciu osób z trzech rodzin ADCA-DN i zidentyfikowaliśmy DNMT1 jako jedyny gen z mutacjami znalezionymi u wszystkich pięciu osób dotkniętych chorobą. Sekwencjonowanie Sangera Sekwencjonowanie Sangera potwierdziło mutację de novo p.Ala570Val w jednej rodzinie i wykazało p.Val606Phe i p.Ala570Val, z fenotypem ADCA-DN, w dwóch innych rodzinach. dwóch innych rodzinach. Następnie zidentyfikowano dodatkową rodzinę ADCA-DN z mutacją p.GLY605Ala. został następnie zidentyfikowany. Narkolepsja i głuchota były pierwszymi objawami, które we wszystkich rodach, a następnie ataksja. DNMT1 jest szeroko wyrażoną metylotransferazą DNA utrzymującą wzorce metylacji w rozwoju i pośredniczącą w represji transkrypcji poprzez bezpośrednie wiązanie represji transkrypcji poprzez bezpośrednie wiązanie z HDAC2. Jest również wysoce ekspresji w komórkach odpornościowych i jest wymagana do różnicowania CD4+ w komórki regulatorowe T w komórki regulatorowe T. Mutacje w eksonie 20 tego genu zostały niedawno opisane jako powodują dziedziczną neuropatię czuciową z demencją i utratą słuchu (HSAN1). Nasze mutacje są zlokalizowane w eksonie 21 i w bardzo bliskiej odległości przestrzennej, sugerując różne fenotypy w zależności od lokalizacji mutacji w tym genie. --- Genom tkanek pozazarodkowych, takich jak łożysko, jest hipometylowany w stosunku do genomu tkanek somatycznych. w stosunku do tkanek somatycznych. Jednak pochodzenie i rola tej hipometylacji pozostaje niejasne. Metylotransferazy DNA DNMT1, -3A i -3B są głównymi mediatorami ustanawiania i utrzymywania metylacji DNA metylacji DNA u ssaków. W tym badaniu zbadaliśmy promotor za pośrednictwem metylacji epigenetyczną regulację w dół genów DNMT jako potencjalnego jako potencjalnego regulatora globalnych poziomów metylacji w tkance łożyskowej. Chociaż promotory DNMT3A i -3B brak metylacji we wszystkich badanych tkankach somatycznych i pozazarodkowych, znaleźliśmy specyficzną hipermetylację utrzymującej metylotransferazy DNA (DNMT1) i hipometylację genu DNMT3L w tkankach łożyskowych urodzonych o czasie i w pierwszym trymestrze ciąży. trymestrze ciąży. Sekwencjonowanie bisulfitowe DNA ujawniło monoalleliczną metylację DNMT1, bez dowodów na imprinting (efekt rodzica pochodzenia). Eksperymenty reporterowe in vitro potwierdziły, że metylacja promotora DNMT1 osłabia aktywność transkrypcyjną w komórkach trofoblastów. Jednakże, globalna hipometylacja przy braku regulacji DNMT1 w dół jest widoczna w łożyskach łożyskach innych niż naczelne i ludzkich komórkach macierzystych cytotrofoblastów in vitro, sugerując, że regulacja w dół DNMT1 nie jest absolutnym wymogiem dla genomu hipometylacji we wszystkich przypadkach. Dane te stanowią pierwszą demonstrację regulacji genu DNMT1 za pośrednictwem metylacji w dowolnym systemie i pokazują, że unikalny epigenom ludzkiego łożyska obejmuje w dół DNMT1 z jednoczesną hipometylacją genu DNMT3L. To silnie implikuje epigenetyczną regulację rodziny genów DNMT w ustanowienie unikalnego profilu epigenetycznego tkanki pozazarodkowej u ludzi. --- Metylacja DNA jest główną modyfikacją epigenetyczną i odgrywa kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. regulacji ekspresji genów. W obrębie rodziny metylotransferaz DNA (Dnmts), Dnmt3a i 3b ustanawiają ślady metylacji podczas wczesnego rozwoju, podczas gdy Dnmt1 utrzymuje wzorce metylacji po replikacji DNA. Funkcja funkcja konserwacyjna Dnmt1 jest regulowana przez jego dużą regulatorową N-końcową domenę która oddziałuje z innymi czynnikami chromatynowymi i jest niezbędna do rozpoznawania hemi-metylowanego DNA. Analiza gelfiltracji wykazała, że oczyszczony Dnmt1 eluuje przy pozornej masie cząsteczkowej odpowiadającej wielkości dimeru. Dzięki testom interakcji białek mogliśmy wykazać, że Dnmt1 oddziałuje z samym sobą poprzez poprzez swoją N-końcową domenę regulatorową. Poprzez analizę delecji i i koimmunoprecypitacji zmapowaliśmy domenę dimeryzacji do docelowej sekwencji sekwencji TS, która znajduje się w centrum domeny N-końcowej (aminokwasy 310-629) i wcześniej wykazano, że pośredniczy w niezależnej od replikacji asocjacji z heterochromatyną w chromocentrach. Dalsze analizy mutacyjne sugerowały że kompleks dimeryczny ma dwudzielny interfejs interakcji i jest utworzony w orientacji orientacji head-to-head. Tworzenie dimeru Dnmt1 może ułatwić dyskryminację hemi-metylowanych miejsc docelowych, jak stwierdzono w przypadku innych enzymów rozpoznających palindromiczną sekwencję DNA. Wyniki te przypisują dodatkową funkcję funkcję domenie TS i podnoszą interesujące pytanie, w jaki sposób te funkcje są przestrzennie i czasowo skoordynowane. --- CEL: Epigenetyczne zmiany w ekspresji genów, w tym metylacja DNA i modyfikacje histonów, mogą przyczyniać się do autoimmunizacji. modyfikacje histonów, mogą przyczyniać się do autoimmunizacji. Metylacja DNA jest pośredniczy rodzina metylotransferaz DNA. Polimorfizmy metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA 3B (DNMT3B) mogą wpływać na aktywność DNMT3B na metylację DNA metylację DNA, modulując w ten sposób podatność na niektóre choroby. Celem tego badania było zbadanie związku między polimorfizmem pojedynczego nukleotydu polimorfizmem pojedynczego nukleotydu (SNP) w promotorze genu DNMT3B a ryzykiem rozwoju idiopatycznej plamicy małopłytkowej (ITP). METODY: W tym szpitalnym badaniu kliniczno-kontrolnym genotypowano SNP DNMT3B u 201 pacjentów z ITP i 136 zdrowych osób z grupy kontrolnej za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. WYNIKI: Genotypu C/C nie wykryto zarówno u pacjentów z ITP, jak i w grupie kontrolnej. kontroli. W grupie kontrolnej częstość genotypów T/T i C/T oraz alleli T i C wynosiły odpowiednio 97,8%, 2,2%, 98,9% i 1,1%. Nie było istotnej różnicy w rozkładzie genotypów i alleli między pacjentami z ITP i grupą kontrolną (odpowiednio P = 0,745 i 0,747). Nie zaobserwowano znaczącej nie zaobserwowano znaczącej różnicy w genotypie i rozkładzie alleli między dwiema grupami. grupami w zależności od wieku. Podobne wyniki wykazano wśród czterech grup pacjentów z ITP: ostre dzieciństwo, przewlekłe dzieciństwo, ostry dorosły, i przewlekła postać dorosła. WNIOSEK: Polimorfizm ten rozkładał się podobnie między pacjentami z ITP i grupą kontrolną. z ITP i grupą kontrolną. Wykazano, że nie może on być stosowany jako marker marker stratyfikacji do przewidywania podatności na ITP, przynajmniej w populacji północnych Chin. populacji północnych Chin. --- Zmiany epigenetyczne w neuroblastomie dziecięcej mogą przyczyniać się do agresywnej patofizjologii tej choroby. patofizjologii tej choroby, ale niewiele wiadomo na temat podstaw takich zmian. zmian. W tym badaniu zbadaliśmy rolę metylotransferazy DNA DNMT3B, w szczególności skróconej izoformy DNMT3B7, która jest często generowana w nowotworach. raka. Aby zbadać, czy nieprawidłowe transkrypty DNMT3B zmieniają metylację DNA, ekspresję genów i charakter fenotypowy w neuroblastoma, zmierzyliśmy ekspresję DNMT3B w guzach pierwotnych. Wyższe poziomy DNMT3B7 wykryto w zróżnicowanych nerwiakach zwojowych w porównaniu do niezróżnicowanych nerwiaków neuroblastoma, co sugeruje, że ekspresja DNMT3B7 może indukować mniej agresywny fenotyp kliniczny. agresywny fenotyp kliniczny. Aby przetestować tę hipotezę, zbadaliśmy efekty wymuszonej ekspresji DNMT3B7 w komórkach nerwiaka niedrobnokomórkowego, stwierdzając znaczące zahamowanie proliferacji komórek in vitro oraz angiogenezy i wzrostu guza in vivo. wzrostu guza in vivo. Komórki DNMT3B7-pozytywne miały wyższy poziom całkowitej metylacji genomu metylacji genomu i dramatyczny spadek ekspresji członków rodziny FOS i JUN które obejmują czynniki transkrypcyjne AP1. Zgodnie z ustalonym antagonistycznym związkiem między ekspresją AP1 a aktywnością receptora kwasu retinowego kwasem retinowym, zaobserwowano zwiększone różnicowanie w komórkach neuroblastoma z ekspresją DNMT3B7 komórek neuroblastoma po leczeniu kwasem all-trans retinowym (ATRA) w porównaniu z grupą kontrolną. Nasze wyniki wskazują, że DNMT3B7 modyfikuje epigenom w komórkach nerwiaka niedojrzałego, indukując zmiany w ekspresji genów, hamując wzrost guza i zwiększając wrażliwość na ATRA. wzrost guza i zwiększenie wrażliwości na ATRA. --- Rodzina enzymów TET zależnych od FE(II) i 2-oksoglutaranu (Tet1/2/3) promuje demetylację DNA poprzez konwersję 5-metylocytozyny do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), którą następnie utleniają do 5-formylocytozyny i 5-karboksylocytozyny. Tet1 ulega silnej ekspresji w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (mESC) i jest zaangażowany w utrzymanie mESC. Tutaj pokazujemy, że w przeciwieństwie do genetycznej delecji, zubożenie Tet1 w mESCs za pośrednictwem RNAi doprowadziło do znacznego redukcji 5hmC i utraty tożsamości mESC. Fenotyp różnicowania spowodowany na skutek deplecji Tet1 dodatnio korelował ze stopniem utraty 5hmC. Metaanalizy zestawów danych genomowych sugerowały interakcję między Tet1 a czynnikiem hamującym białaczkę (LIF). Wiadomo, że sygnalizacja LIF promuje samoodnowę i pluripotencję w mESC, częściowo poprzez przeciwstawianie się różnicowaniu, w którym pośredniczy MAPK/ERK. różnicowanie. Wycofanie LIF prowadzi do różnicowania mESC. Odkryliśmy odkryliśmy, że pozbawienie Tet1 upośledza zależną od LIF aktywację genów za pośrednictwem Stat3 poprzez wpływ na zdolność Stat3 do wiązania się z miejscami docelowymi na chromatynie. Nadekspresja Nanog lub zahamowanie sygnalizacji MAPK/ERK, oba znane w celu utrzymania mESC w nieobecności LIF, uratowało zubożenie Tet1, dodatkowo potwierdzając zależność sygnalizacji LIF/Stat3 od Tet1. Dane te potwierdzają wniosek, że analiza mESC w godzinach/dniach następujących bezpośrednio po skuteczna deplecja Tet1 ujawnia normalną fizjologiczną rolę Tet1 w utrzymywaniu w utrzymaniu stanu pluripotencjalnego, który może podlegać kompensacji homeostatycznej w modelach genetycznych. modelach genetycznych. --- W poprzedniej analizie genomicznej, wykorzystującej komórki znokautowane somatyczną metylotransferazą (DNMT) wykazaliśmy, że hipometylacja zmniejszyła ekspresję tak wielu genów zaobserwowano wzrost, co sugeruje nieznany wcześniej mechanizm regulacji epigenetycznej. regulacji epigenetycznej. Aby odnieść się do tego pomysłu, ekspresja genów z rodziny BAG została wykorzystana jako model. Geny te zostały wykorzystane, ponieważ ich ekspresja była zmniejszona w komórkach DNMT1(-/-), DNMT3B(-/-) i podwójnie znokautowanych oraz zwiększona w komórkach z nadekspresją DNMT1. komórkach z nadekspresją DNMT1 i DNMT3B. Chromatyna analiza immunoprecypitacji promotora BAG-1 w komórkach z nadekspresją DNMT1 lub DNMT3B wykazała permisywny stan chromatyny dimetylo-H3-K4/dimetylo-H3-K9 związany z wiązaniem DNA. stan chromatyny związany z wiązaniem DNA CTCFL/BORIS, jak również zwiększona ekspresja BAG-1. W przeciwieństwie do tego, niedozwolony stan chromatyny dimetylo-H3-K4/dimetylo-H3-K9 był związany z wiązaniem DNA CTCF DNA i zmniejszoną ekspresją BAG-1 w pojedynczych i podwójnych komórkach DNMT knockout. Znokautowanie krótkiej spinki do włosów RNA BORIS zmniejszyło zarówno wiązanie DNA promotora wiązanie DNA, jak i ekspresję BAG-1, a także zmieniło poziom stosunek dimetylo-H3-K4/dimetylo-H3-K9 do tego charakterystycznego dla stanu chromatyny nonpermissive stan chromatyny. Wyniki te sugerują, że DNMT1 i DNMT3B regulują ekspresję BAG-1 poprzez wiązanie DNA białka izolatora i dynamikę chromatyny poprzez regulując dimetylację histonów. --- Metylotransferazy DNA (DNMT) to rodzina enzymów, które metylują DNA w pozycji C5 reszt cytozyny. C5 reszt cytozyny, a ich hamowanie jest obiecującą strategią w leczeniu różnych chorób rozwojowych i proliferacyjnych. w leczeniu różnych chorób rozwojowych i proliferacyjnych, szczególnie nowotworów. W niniejszym badaniu model wiązania hydralazyny, z zatwierdzonym modelem homologicznym ludzkiej DNMT, został opracowany przy użyciu zautomatyzowanego dokowania molekularnego i symulacji dynamiki molekularnej. Protokół dokowania został zwalidowany poprzez przewidywanie sposobu wiązania 2'-deoksycytydyny, 5-azacytydyny i 5-aza-2'-deoksycytydyny. Aktywność hamująca hydralazyny wobec DNMT może być zracjonalizowana na poziomie molekularnym przez podobne interakcje w obrębie kieszeni wiążącej (np. przez podobny farmakofor), jak ustalone przez podobne do substratów analogi deoksycytydyny. Interakcje te obejmują złożoną sieć wiązań wodorowych z argininą i kwasem glutaminowym które również odgrywają główną rolę w mechanizmie metylacji DNA. Pomimo różnych rusztowań innych nienukleozydowych inhibitorów DNMT, takich jak prokaina i prokainamid, obecne prace modelowe ujawniają, że leki te wykazują podobne interakcje w miejscu wiązania DNMT1. Odkrycia te są cenne w prowadzeniu racjonalnego projektowania i wirtualnych badań przesiewowych nowych inhibitorów DNMT inhibitorów DNMT. --- Metylacja DNA jest zaangażowana w podstawowe procesy komórkowe, takie jak wyciszanie genów i elementów transpozycyjnych. genów i elementów transpozycyjnych, ale mechanizm leżący u podstaw regulacji metylacji DNA jest w dużej mierze nieznany. Białko podobne do metylotransferazy DNA 3 (Dnmt3L), członek rodziny białek Dnmt3, jest wymagane podczas ustalania wzorców metylacji DNA w komórkach zarodkowych. Dnmt3L nie posiada aktywności enzymatycznej. Analiza in vitro wskazuje raczej, że Dnmt3L stymuluje metylację DNA zarówno przez Dnmt3a, jak i Dnmt3b poprzez bezpośrednie wiązanie z tymi białkami. białkami. W obecnym badaniu wykazaliśmy, że in vivo Dnmt3L fizycznie i funkcjonalnie oddziaływał z izoformą Dnmt3 Dnmt3a2. W dzikich zarodkowych komórkach macierzystych (ES), ale nie w komórkach pozbawionych Dnmt3a, endogenny Dnmt3L był skoncentrowany w ogniskach chromatyny. W komórkach ES pozbawionych zarówno Dnmt3a, jak i Dnmt3b, Dnmt3L był rozproszony w jądrze i cytoplazmie, a ektopowa ekspresja Dnmt3a2, ale nie Dnmt3a lub Dnmt3b, przywracała lokalizację Dnmt3L typu dzikiego. Dnmt3L. Wykazaliśmy, że endogenny Dnmt3L fizycznie oddziaływał z Dnmt3a2, ale nie Dnmt3a lub Dnmt3b, w komórkach ES i jądrach embrionalnych. Odkryliśmy również stwierdziliśmy, że określone miejsca CpG zostały zdemetylowane po usunięciu Dnmt3a lub Dnmt3L, ale nie Dnmt3b, w komórkach ES. Wyniki te dostarczają dowodów na fizyczną i funkcjonalną interakcję między Dnmt3L i Dnmt3a2 w jądrze. Proponujemy, aby Dnmt3a2 rekrutował Dnmt3L do chromatyny i indukował regionalną metylację DNA w komórkach zarodkowych. metylację w komórkach zarodkowych. --- Metylacja DNA odgrywa istotną rolę w imprintingu genomowym obserwowanym u ssaków eutherian ssaków i torbaczy. U myszy, jedna z dwóch metylotransferaz DNA de novo metylotransferaz DNA, Dnmt3a, i pokrewne białko, Dnmt3L, okazały się być niezbędne do ustanowienia odcisku w rodzicielskiej linii zarodkowej. Aby uzyskać wgląd w ewolucję mechanizmów imprintingu, zidentyfikowaliśmy i scharakteryzowaliśmy geny z rodziny DNMT3 u innych gatunków kręgowców. Sklonowaliśmy cDNA dla kurzych DNMT3A i DNMT3B, których domniemane produkty białkowe mają odpowiednio 81,5% i 48,6% identyczności sekwencji aminokwasów z ich mysimi ortologami. Używając wspomagane komputerowo przeszukiwanie baz danych, zidentyfikowaliśmy również DNMT3A i DNMT3B u ryb (fugu i danio pręgowany) i torbaczy (opos). Odkryliśmy że podczas gdy oposy miały ortologa dla DNMT3L, kurczaki i ryby nie miały tego genu. miały tego genu. Tak więc, w przeciwieństwie do innych członków DNMT3, DNMT3L był ograniczony do gatunków, u których występuje imprinting. Nabycie DNMT3L przez wspólnego przodka euteryków i torbaczy mogło być ściśle związane z ewolucją imprintingu. ewolucją imprintingu. --- U eukariontów metylacja DNA jest ważną modyfikacją epigenetyczną, która jest ogólnie zaangażowana w regulację genów. Metylotransferazy (MTazy) z rodziny DNMT2 wykazują podwójną specyficzność substratową, działając zarówno na DNA, jak i na jak również na trzy specyficzne tRNA (tRNA(Asp), tRNA(Val), tRNA(Gly)). Entamoeba histolytica jest głównym ludzkim patogenem i wyraża pojedynczą MTazę DNA (EhMeth) która należy do rodziny DNMT2 i wykazuje wysoką homologię do ludzkiego enzymu, a także do bakteryjnej a także do bakteryjnej MTazy DNA M.HhaI. Molekularne podstawy dla rozpoznawania substratowych tRNA i dyskryminacji nierozpoznanych tRNA jest nieznane. Tutaj przedstawiamy strukturę krystaliczną cytozyny-5-metylotransferazy EhMeth w rozdzielczości 2,15 Å, w kompleksie z produktem reakcji produktem reakcji S-adenozylo-L-homocysteiną, ujawniając wszystkie części DNMT2 MTazy, w tym pętlę miejsca aktywnego. Testy przesunięcia mobilności pokazują, że in vitro pełna długość tRNA jest wymagana do stabilnego tworzenia kompleksów z EhMeth. --- Stwierdzono, że metylotransferaza DNA 1 (DNMT1) wchodzi w interakcje z wieloma różnorodnymi czynnikami i posiada wewnętrzną aktywność represora transkrypcji. Kiedy konserwatywna mutacja punktowa została wprowadzona w kluczowej reszcie katalitycznej, DNMT1 nie udało się uratować żadnego z fenotypów embrionalnych komórek macierzystych Dnmt1-null (ES). (ES), co wskazuje, że biologiczne funkcje DNMT1 są wywierane poprzez metylację DNA. Komórki ES, które wyrażały zmutowane białko nie przetrwały różnicowania. Wewnątrzcząsteczkowe retrotranspozony z rodziny A nie były już metylowane i były transkrybowane na wysokim poziomie. Właściwa DNMT1 zależała od prawidłowej metylacji genomowej i omawiamy implikacje tego odkrycia dla epigenetyki. implikacje tego odkrycia dla dysregulacji epigenetycznej w raku. --- Metylacja DNA, niezbędny regulator transkrypcji i struktury chromatyny jest ustalana i utrzymywana przez skoordynowane działanie trzech metylotransferaz DNA metylotransferaz DNA: DNMT1, DNMT3A i DNMT3B oraz nieaktywnego czynnika pomocniczego DNMT3L. Zaburzenia funkcji DNMT3B są powiązane z kancerogenezą i chorobami genetycznymi. chorobami genetycznymi. DNMT3B jest również wysoce alternatywnie splicowany w sposób sposób zależny od tkanki i choroby. Wpływ interakcji wewnątrz DNMT3 i alternatywnego splicing na funkcję członków rodziny DNMT3 pozostaje niejasny. W niniejszej pracy skupiliśmy się na DNMT3B. Korzystając z panelu testów in vitro, zbadaliśmy konsekwencje splicingu DNMT3B i mutacji na jego zdolność do wiązania DNA, interakcji z samym sobą i innymi DNMT3 oraz metylacji DNA. Nasze wyniki pokazują że podczas gdy C-końcowa domena katalityczna jest krytyczna dla większości funkcji DNMT3B funkcje, części regionu N-końcowego, w tym domena PWWP, są również ważne. Alternatywny splicing i delecje domen również wpływają na lokalizację komórkową DNMT3B. DNMT3B. Co więcej, nasze dane ujawniają istnienie rozległych DNMT3B, które w różny sposób wpływają na jego aktywność. Wreszcie pokazujemy, że katalitycznie nieaktywne izoformy DNMT3B są zdolne do modulowania aktywność kompleksów DNMT3A-DNMT3L. Nasze badania sugerują zatem, że pozornie "nieaktywne" izoformy DNMT3B mogą wpływać na wzorce metylacji genomu in vivo. --- Metylotransferaza DNA de novo DNMT3B (DNMT) odgrywa główną rolę w ustalaniu wzorców metylacji DNA we wczesnym rozwoju ssaków, ale jej mechanizm mechanizm katalityczny pozostaje słabo scharakteryzowany. Tutaj przedstawiamy kompleksową analizę biochemiczną funkcji ludzkiej DNMT3B poprzez charakterystykę serii wariantów DNMT3B ukierunkowanych na miejsce związanych z niedoborem odporności, niestabilnością centromerową i zespołem anomalii twarzy (ICF). Nasze dane ujawniają kilka nowych i ważnych aspektów funkcji DNMT3B. Po pierwsze, DNMT3B, w przeciwieństwie do DNMT3A, wymaga kofaktora DNA, aby stabilnie wiązać się z S-adenozylo-l-metioniny (SAM), co sugeruje, że przebiega zgodnie z uporządkowanym schematem katalitycznym. uporządkowanym schematem katalitycznym. Po drugie, mutacje ICF powodują szerokie spektrum defekty biochemiczne w funkcjonowaniu DNMT3B, w tym defekty w homo-oligomeryzacji, wiązania SAM, wykorzystania SAM i wiązania DNA. Po trzecie, wszystkie testowane mutacje ICF, w tym warianty A766P i R840Q, powodują zmiany właściwości katalityczne bez zakłócania stymulacji, w której pośredniczy DNMT3L; to wskazuje, że DNMT3L nie jest zaangażowany w patogenezę zespołu ICF. Wreszcie, nasze badanie ujawnia nowy poziom sprzężenia między wiązaniem substratu, oligomeryzacją i katalizą, który jest prawdopodobnie konserwowany w rodzinie enzymów DNMT3 enzymów. --- W genomie ssaków występuje podzbiór genów, znanych jako geny imprintowane. Imprinting genomowy reguluje monoalleliczną ekspresję tych genów, w zależności od tego, czy od tego, czy gen został odziedziczony od plemnika czy komórki jajowej. Ten specyficzna dla rodzica pochodzenia ekspresja genu jest generalnie zależna od epigenetycznej modyfikacji, metylacji DNA i statusu metylacji DNA dinukleotydów CpG dinukleotydów rezydujących w loci znanych jako regiony różnie metylowane (DMR). (DMR). Mechanizm enzymatyczny odpowiedzialny za dodawanie grup metylowych (-CH(3)) do reszt cytozyny w dinukleotydach CpG są znane jako metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA (DNMT). Prawidłowe ustanowienie i utrzymanie wzorów metylacji w genach wdrukowanych jest związane z funkcją łożyska i regulacją regulacją rozwoju zarodka/płodu. Wiele prac zostało przeprowadzonych na geny wdrukowane u myszy i ludzi; jednak niewiele wiadomo na temat dynamiki metylacji u bydła. dynamiki metylacji w oocycie bydlęcym. Głównym celem niniejszego badania było scharakteryzowanie ustanowienia metylacji w matczynym odciśniętych genów w rosnących oocytach bydlęcych i określenie, czy ekspresja bydlęcych DNMT - DNMT3A, DNMT3B i DNMT3L - była skoordynowana z metylacją DNA podczas rozwoju oocytów. W tym celu wybrano panel genów wdrukowanych matczynie (SNRPN, MEST, IGF2R, PEG10 i PLAGL1) oraz domniemane DMR dla MEST, IGF2R, PEG10 i PLAGL1 zostały zidentyfikowane w regionach 5' dla każdego genu; DMR SNRPN został zgłoszony wcześniej. Konwencjonalne sekwencjonowanie dwusiarczynowe ujawniło, że znaczniki metylacji zostały nabyte we wszystkich pięciu DMR badanych w sposób zależny od wielkości oocytu. Zostało to potwierdzone dla wybranych genów przy użyciu analizy pirosekwencjonowania. Ponadto, ekspresja mRNA i analiza białek ujawniła, że DNMT3A, DNMT3B i DNMT3L są również obecne w oocycie bydlęcym podczas fazy wzrostu. Badanie to pokazuje po raz pierwszy, że wzrost wzrost metylacji DMR bydlęcego genu wdrukowanego występuje podczas wzrostu oocytu, co obserwuje się u myszy. --- MikroRNA (miRNA) to małe niekodujące cząsteczki RNA o długości 20-24 nukleotydów, które regulują ekspresję genów. U zwierząt miRNA tworzą niedoskonałe interakcje z sekwencjami sekwencjami w regionie 3'UTR (3'UTR) mRNA, powodując zahamowanie translacji i rozpad mRNA. hamowanie translacji i rozpad mRNA. Natomiast roślinne miRNA wiążą się głównie z regionami kodującymi regionami kodującymi białka. Tutaj pokazujemy, że ludzki miR-148 hamuje metylotransferazę DNA ekspresję genu metylotransferazy DNA 3b (Dnmt3b) poprzez region w jego sekwencji kodującej. sekwencji. Region ten jest ewolucyjnie konserwowany i obecny w wariantach splicingu Dnmt3b wariantach Dnmt3b1, Dnmt3b2 i Dnmt3b4, ale nie w obficie wyrażanym Dnmt3b3. Podczas gdy nadekspresja miR-148 powoduje zmniejszenie ekspresji DNMT3b1 ekspresji, represja miR-148 za pośrednictwem krótkich spinek RNA prowadzi do wzrostu ekspresji DNMT3b1. w ekspresji DNMT3b1. Co ciekawe, mutacja domniemanego miejsca docelowego miR-148 w Dnmt3b1 znosi regulację przez miR-148. Co więcej, endogenne mRNA Dnmt3b3, w którym brakuje domniemanego miejsca docelowego miR-148, jest odporny na regulację za pośrednictwem miR-148. regulację. Zatem nasze wyniki pokazują, że sekwencja kodująca Dnmt3b pośredniczy w regulacji przez rodzinę miR-148. Ogólnie rzecz biorąc, dostarczamy dowodów że regiony kodujące ludzkich genów mogą być ukierunkowane przez miRNA i że taki mechanizm mechanizm może odgrywać rolę w określaniu względnej obfitości różnych wariantów splicingu. wariantów splicingu. --- KONTEKST I CEL: Dysregulacja epigenetyczna jest związana z neoplazją przysadki mózgowej. jako przyczynę wyciszenia kilku genów supresorowych nowotworów. Jednakże, mediatory takich zdarzeń pozostają nieznane. PROJEKT: Zbadaliśmy trzech członków rodziny enzymów metylotransferazy DNA (DNMT) w prawidłowych i nowotworowych ludzkich i mysich komórkach przysadki mózgowej. USTAWIENIE: Badanie to przeprowadzono w instytucie badań nad rakiem stowarzyszonym z uniwersytetem. instytucie badań nad rakiem. GŁÓWNE MIARY WYNIKÓW: Ekspresja genów, metylacja DNA promotora, modyfikacje histonów i proliferacja komórek. modyfikacje histonów i proliferację komórek. WYNIKI: W przeciwieństwie do DNMT1 i DNMT3a, DNMT3b ulegał ekspresji na stosunkowo wyższych poziomach w nowotworowych komórkach przysadki. Jednakże, badanie ludzkiego regionu DNMT3b 5' wykazało jednolicie niskie poziomy metylacji DNA z niewielką różnica między próbkami normalnymi i nowotworowymi. Poprzez farmakologiczne hamowanie metylacji lub hamowanie deacetylacji histonów, zidentyfikowaliśmy, że ekspresja genu DNMT3b podlega modyfikacjom histonów. Regulacja w dół DNMT3b skutkowała indukcją retinoblastomy, p21 i p27 oraz redukcją proliferacji komórek. proliferacji komórek. Te ukierunkowane efekty były związane ze zwiększoną acetylacją histonu 3 i zmniejszoną metylacją histonów. WNIOSEK: Nasze odkrycia identyfikują DNMT3b jako przypuszczalny mediator kontroli epigenetycznej kontroli poprzez modyfikacje histonowe ekspresji genów w komórkach przysadki mózgowej. --- Metylacja nukleotydów cytozyny w DNA jest ważną modyfikacją epigenetyczną która występuje w większości organizmów eukariotycznych i jest ustalana i utrzymywana przez różne metylotransferazy DNA wraz z ich kofaktorami. Istnieją dwie główne kategorie metylotransferaz DNA: de novo i konserwujące. Tutaj przedstawiamy izolację i charakterystykę funkcjonalną metylotransferazy de novo metylotransferazy, nazwanej OsDRM2, z ryżu (Oryza sativa L.). Region kodujący pełnej długości region kodujący OsDRM2 został sklonowany i transformowany do Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae. Oba te organizmy wyrażały białko OsDRM2, które wykazywało stochastyczną aktywność metylacji de novo in vitro na CG, CHG i CHH di- i trinukleotydów. Dwie linie dowodów wykazały aktywność de aktywności de novo OsDRM2: (1) fragment DNA zawierający 5'-CCGG-3', który został poddany wstępnej obróbce białkiem OsDRM2 wyrażonym w E. coli był chroniony przed trawieniem przez wrażliwy na metylację CG izoschizomer HpaII; (2) analiza polimorfizmu amplifikowanego wrażliwego na metylację (MSAP) genomowego DNA S. cerevisiae genomowego DNA z transformantów, do których wprowadzono OsDRM2, ujawniła poziomy metylacji CG i CHG na poziomie odpowiednio 3,92-9,12% i 2,88-6,93%, podczas gdy kontrolne DNA S. cerevisiae nie wykazywało metylacji cytozyny. Wyniki te wyniki zostały dodatkowo potwierdzone przez sekwencjonowanie bisulfitowe genów 18S rRNA i EAF5 transformowanych S. cerevisiae, które wykazywały różne wzory metylacji DNA, które zaobserwowano w S. cerevisiae. wzory metylacji DNA, które obserwowano w genomowym DNA. Nasze odkrycia że OsDRM2 jest aktywnym genem metylotransferazy DNA de novo o aktywności z zachowaną aktywnością zarówno u prokariotycznych, jak i eukariotycznych gatunków niebędących gospodarzami. --- Metylacja w pozycji 5 cytozyny DNA w genomach kręgowców jest przez połączone katalityczne działanie trzech metylotransferaz DNA (DNMT), enzymów de novo DNMT3A i DNMT3B oraz enzymu konserwującego DNMT1. Chociaż zasugerowano kilka szlaków metabolicznych dla demetylacji DNA kręgowców, to czy istnieją aktywne demetylazy DNA pozostawało nieuchwytne. Co zaskakujące, odkryliśmy, że DNMT ssaków i prawdopodobnie ogólnie kręgowców DNMT mogą również działać jako aktywne demetylazy DNA zależne od jonów Ca(2+) i stanu redoks. demetylazy DNA. Odkrycie to sugeruje nowe kierunki ponownego badania struktur i funkcji tych DNMT, w szczególności ich roli w procesach biologicznych zależnych od jonów Ca(2+) w procesach biologicznych zależnych od jonów Ca(2+), w tym w ogólnogenomowej/lokalnej demetylacji DNA demetylacji podczas wczesnej embriogenezy, różnicowania komórek, ekspresji genów regulowanej aktywnością neuronów ekspresji genów regulowanej aktywnością neuronów i kancerogenezie. --- Metylotransferaza DNA ssaków 1 (DNMT1) jest niezbędna do utrzymania wzorów metylacji DNA wzorców metylacji po podziale komórki. Zakłócenie aktywności katalitycznej DNMT1 powoduje demetylację cytozyny dinukleotydów CpG w całym genomie, promując poważne dysfunkcje w komórkach somatycznych i podczas rozwoju embrionalnego. Podczas gdy Obserwacje te wskazują, że metylacja DNA zależna od DNMT1 jest wymagana do prawidłowego funkcjonowania komórek. prawidłowego funkcjonowania komórek, możliwość, że DNMT1 odgrywa rolę niezależną od swojej aktywności katalitycznej jest kwestią aktywności katalitycznej jest kwestią kontrowersyjną. Tutaj przedstawiamy dowody na to, że DNMT1 może wspierać funkcje komórek, które nie wymagają C-końcowej domeny katalitycznej domeny katalitycznej. Donosimy, że domeny PCNA i DMAP1 w N-końcowym regionie DNMT1 są wystarczające do modulowania ekspresji E-kadheryny przy braku zauważalnych zmian we wzorcach metylacji DNA w zaangażowanych promotorach genów. Zmiany w ekspresji E-kadheryny są bezpośrednio związane z regulacją transkrypcji zależnej od β-kateniny. Obecne dowody sugerują, że DNMT1 działa na ekspresję E-kadheryny poprzez jej bezpośrednią interakcję z represorem transkrypcji E-kadheryny represorem transkrypcji SNAIL1. --- CEL: Spójne dowody wskazują, że nieprawidłowa metylacja DNA może być zaangażowana w rozwój schizofrenii. Metylotransferaza DNA 3B (DNMT3B) jest kluczową metylotransferazą w regulacji metylacji DNA. W tym badaniu zbadaliśmy związek między polimorfizmami DNMT3B a podatnością na na schizofrenię o wczesnym początku w chińskiej populacji Han. METODY: Badanie kliniczno-kontrolne (pacjenci = 381 i kontrole = 472) i rodzinne (trio = 103) (trio=103) przeprowadzono poprzez genotypowanie dwóch polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (rs2424908 i rs6119954) obejmujących cały gen DNMT3B. Pojedynczy przeprowadzono analizę asocjacji polimorfizmów pojedynczych nukleotydów i haplotypów. WYNIKI: Częstość allelu G rs6119954 była istotnie wyższa u pacjentów niż w grupie kontrolnej (P=0,5). pacjentów niż w grupie kontrolnej (P=0,017). Rozkład genotypów rs6119954 był istotnie różnił się między pacjentami a grupą kontrolną (P=0,046). A haplotypów ujawniła wyższą częstotliwość genotypów T-G (rs2424908-rs6119954) u pacjentów niż w grupie kontrolnej (P=0,033). W analiza testu nierównowagi transmisji, allel G rs6119954 był preferencyjnie przekazywany w trójkach (P=0,030). WNIOSEK: Nasze odkrycia wskazują, że DNMT3B może być genem kandydującym dla podatności na schizofrenię o wczesnym początku. --- Metylacja DNA jest szeroko rozpowszechniona u większości gatunków, od bakterii po ssaki, i jest i ma kluczowe znaczenie dla imprintingu genomowego, ekspresji genów i embriogenezy. METYLACJA DNA zachodzi poprzez dwie główne klasy reakcji enzymatycznych: metylację typu konserwującego katalizowaną przez (cytozyno-5-)-metylotransferazę DNA (DNMT) 1, oraz metylację de novo katalizowaną przez DNMT 3 alfa (DNMT3A) i -beta (DNMT3B). Wzór ekspresji i regulacja genów DNMT w pierwotnych komórkach zarodkowych (PGC) i komórkach linii zarodkowej nie został wystarczająco ustalony u ptaków. Dlatego zastosowaliśmy bioinformatykę, RT-PCR, PCR w czasie rzeczywistym i analizy hybrydyzacji in situ analizy hybrydyzacji w celu zbadania strukturalnej konserwacji i zachowanych wzorce ekspresji genów z rodziny DNMT kurczaka. Następnie zbadaliśmy regulację genu kandydującego metylotransferazy DNA de novo, cDNMT3B przez kotransfekcję cDNMT3B 3'UTR- i cDNMT3B 3'UTR-specyficznych miRNA poprzez podwójny reporter fluorescencyjny podwójny test reporterowy fluorescencji. Wszyscy członkowie rodziny cDNMT byli różnicowo wykrywani podczas wczesnego rozwoju embrionalnego. Co ciekawe, ekspresja cDNMT3B była wysoce wykryta we wczesnych zarodkach i PGC. Podczas rozwoju linii zarodkowej i dojrzewanie płciowe, ekspresja cDNMT3B została przywrócona w żeńskich zarodkach sposób specyficzny dla żeńskich komórek zarodkowych. W teście podwójnej fluorescencji reporterowej ekspresja cDNMT3B była znacząco obniżana przez cztery miRNA: gga-miR-15c (25,82%), gga-miR-29b (30,01%), gga-miR-383 (30,0%) i gga-miR-222 (31,28%). Nasze dane podkreślają strukturalną konserwację i zachowane wzorce ekspresji DNMT kurcząt. MiRNA badane w tym badaniu mogą indukować regulację w dół ekspresji genów w PGC i komórkach zarodkowych kurczaka.
Jakie są rodziny metylotransferaz DNA (cytozyny-5) ssaków?
Metylotransferazy DNA (cytozyny-5) katalizują specyficzny transfer grupy metylowej do pozycji C5 reszt cytozyny w DNA. U ssaków zidentyfikowano trzy rodziny metylotransferaz DNA (cytozyny-5): DNMT1, DNMT2 i DNMT3 (w tym izoformy DNMT3a, DNMT3b i DNMT3L). Wszystkie z nich posiadają homologiczne domeny katalityczne. DNMT1 należy do rodziny metylotransferaz "konserwujących". DNMT1 jest specyficzna dla hemi-metylowanego DNA i zapewnia wierne przekazywanie wzorców metylacji DNA w każdym cyklu replikacji. DNMT3 jest wymagana do metylacji DNA de novo. DNMT3 celuje w niezmetylowany DNA i jest odpowiedzialny za ustanowienie nowych wzorców metylacji. Dnmt2, w przeciwieństwie do wszystkich innych metylotransferaz DNA (cytozyny-5) ssaków, nie posiada dużej N-końcowej domeny regulatorowej. Aktywność metylacji DNA DNMT2 jest nadal kontrowersyjna.