LST8 jest składnikiem zarówno kompleksu mTOR 1 (mTORC1), jak i kompleksu mTOR 2 (mTORC2). Niniejszym, w celu zbadania roli LST8, wspólnego składnika kompleksów mTOR, w regulacji mTORC1 i mTORC2, najpierw regulacji mTORC1 i mTORC2, po pierwsze, wykazaliśmy nadekspresję LST8 w HepG2, aby znacznie zwiększyć podstawowe poziomy fosforylacji nie tylko kinazy p70 S6 ale także Akt. W przeciwieństwie do tego, nokaut LST8 przez siRNA w HepG2 zmniejszył poziomy fosforylacji zarówno kinazy p70 S6, jak i Akt. Wyniki te wskazują na poziom ekspresji LST8 w celu określenia podstawowej aktywności mTORC1 i mTORC2, ponieważ LST8 wydaje się być składnikiem obecnym na najniższym poziomie zarówno w kompleksach mTORC1, jak i mTORC2. Wcześniej donosiliśmy, że fosforylacja kinazy S6 jest zmniejszona przez nadekspresję C-końcowo usuniętego mutanta Raptor (Raptor-ΔCT) nie wiążącego się z mTOR lub LST8, podczas gdy poziomy fosforylacji Akt były znacznie zwiększone bez zmian w fosforylacji IRS-1 lub aktywności kinazy PI 3. Używając Raptor-ΔCT, zbadaliśmy konkurencję o powiązanie z LST8 pomiędzy mTORC1 i mTORC2. Nadekspresja Raptor-ΔCT zniosła tworzenie się kompleksu Raptor, kinazy S6, mTOR i LST8, podczas gdy ilość LST8 w kompleksie Rictor-mTOR była zwiększona. Dlatego jest prawdopodobne, że kompleksy Raptor-mTOR i Rictor-mTOR konkurują o połączenie z LST8, a mechanizm ten może przyczyniać się do wzajemnej negatywnej regulacji aktywności mTORC1 i mTORC2 pod względem ich składników LST8: --- Kompleks kinazy białkowej mTORC1 składa się z mTOR, raptora, mLST8/GbetaL i PRAS40. Wcześniej donosiliśmy, że mTOR odgrywa ważną rolę w regulacji syntezy białek w odpowiedzi na alkohol (EtOH). syntezy białek w odpowiedzi na alkohol (EtOH). Jednak mechanizmy przez które EtOH reguluje aktywność mTORC1 nie zostały ustalone. Tutaj zbadaliśmy wpływ EtOH na fosforylację i interakcję składników mTORC1 w miocytach C2C12. Zbadaliśmy również specyficzną rolę, jaką PRAS40 odgrywa w tym procesie. Inkubacja miocytów z EtOH (100 mM, 24 h) zwiększyła fosforylację raptora i PRAS40. Podobnie, nastąpił wzrost poziomy regulatorów PRAS40 Akt i IRS-1. EtOH spowodował również zmiany w interakcjach białko-białko mTORC1. EtOH zwiększył wiązanie raptora i PRAS40 z mTOR. Zmiany te wystąpiły w połączeniu ze zwiększonym wiązaniem 14-3-3 z raptorem, podczas gdy interakcja PRAS40 i 14-3-3 nie uległa zmianie. Nokaut shRNA (KD) PRAS40 zmniejszył syntezę białek podobnie do EtOH. KD PRAS40 zwiększyło fosforylację raptora i jego powiązanie z 14-3-3, podczas gdy zmniejszyło wiązanie GbetaL-mTOR. Efekty EtOH i PRAS40 KD były mediowane przez AMPK. Oba czynniki zwiększyły aktywność AMPK in vitro wobec substratu raptora. substratu raptora. Ponadto KD zwiększała aktywność AMPK wobec TSC2. Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że EtOH stabilizuje związek raptora, PRAS40 i GbetaL z mTOR, jednocześnie zwiększając interakcję raptora z 14-3-3. Dane te sugerują możliwy mechanizm hamujący wpływ EtOH na aktywność kinazy mTOR i syntezę białek w miocytach. miocytach. --- Kinaza białkowa mTOR (mammalian target of rapamycin) jest ważnym regulatorem wzrostu komórek i kluczowym celem interwencji terapeutycznej. regulatorem wzrostu komórek i jest kluczowym celem interwencji terapeutycznej w nowotworach. raka. Zidentyfikowano dwa kompleksy mTOR: kompleks 1 (mTORC1), składający się z mTOR, Raptor (białko regulatorowe związane z mTOR) i mLST8 (mammalian lethal with SEC13 protein 8) i kompleks 2 (mTORC2) składający się z mTOR, Rictor (niewrażliwy na rapamycynę towarzysz mTOR), Sin1 (aktywowany stresem białko oddziałujące z kinazą białkową 1), mLST8 i Protor-1 lub Protor-2. Oba kompleksy fosforylują hydrofobowe motywy członków rodziny kinaz AGC: mTORC1 fosforyluje S6K (kinazę S6), podczas gdy mTORC2 reguluje fosforylację Akt, PKCα (kinaza białkowa Cα) i SGK1 (kinaza białkowa 1 indukowana surowicą i glukokortykoidami). kinaza białkowa 1). Aby zbadać rolę izoform Protor, wygenerowaliśmy zarówno pojedyncze, jak i podwójne myszy z nokautem Protor-1 i Protor-2 i zbadaliśmy, w jaki sposób aktywacja znanych substratów mTORC2. Zaobserwowaliśmy, że utrata Protor-1 i/lub Protor-2 nie wpłynęła na ekspresję innych składników mTORC2 ani ich zdolność do łączenia się w aktywny kompleks. Ponadto, Myszy z nokautem Protor nie wykazują defektów w fosforylacji Akt i PKCα na ich hydrofobowych lub zwrotnych motywach. Co uderzające, zaobserwowaliśmy, że myszy z nokautem Protor-1 wykazywały znacznie zmniejszoną fosforylację motywu hydrofobowego SGK1 i jego fizjologicznego substratu NDRG1 (N-Myc downregulated gene 1) w nerkach. nerce. Podsumowując, wyniki te sugerują, że Protor-1 może odgrywać rolę w umożliwiając mTORC2 skuteczną aktywację SGK1, przynajmniej w nerce. --- Insulina i aminokwasy działają niezależnie, stymulując syntezę białek w mięśniach szkieletowych noworodków świń. mięśniach szkieletowych nowonarodzonych świń, a odpowiedzi zmniejszają się wraz z rozwojem. Celem tego badania było porównanie oddzielnych efektów podawanych poziomów INS i AA na aktywację składników sygnalizacyjnych prowadzących do translacji. INS i AA na aktywację składników sygnalizacyjnych prowadzących do translacji i jak te odpowiedzi zmieniają się wraz z rozwojem. Karmione przez noc 6- (n = 4/grupę) i 26-dniowe (n = 6/grupę) świnie badano podczas 1) euinsulinemic-euglycemiceuaminoacidemic conditions (kontrole), 2) zaciski euinsulinemiczno-euglikemiczno-hiperaminoacidemiczne (AA) i 3) zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczno-euaminoacydemiczne (INS). INS, ale nie AA, zwiększały fosforylację kinazy białkowej B (PKB) i stwardnienia guzowatego 2 (TSC2). Zarówno INS, jak i AA zwiększały syntezę białek i fosforylację ssaczego celu rapamycyny (mTOR), rybosomalnej kinazy białkowej S6-1 i eukariotyczny czynnik inicjacji (eIF) 4E wiążący białko 1 (4E-BP1), a te odpowiedzi były wyższe u 6-dniowych w porównaniu z 26-dniowymi świniami. Zarówno INS, jak i AA zmniejszyły wiązanie 4E-BP1 z eIF4E i zwiększyły wiązanie eIF4E z eIF4G; efekty te były większe u 6-dniowych niż u 26-dniowych świń. Ani INS ani AA nie zmieniły składu mTORC1 (raptor, mTOR i GbetaL) lub mTORC2 (rictor, mTOR i GbetaL). Co więcej, ani INS, ani AA, ani wiek nie miały żadnego wpływu na obfitość Rheb i fosforylację kinazy białkowej aktywowanej AMP i eukariotycznego czynnika elongacji 2. Nasze wyniki sugerują, że aktywacja przez insulinę i aminokwasy składników sygnalizacyjnych prowadząca do inicjacji translacji jest regulowana rozwojowo i jest równoległa do rozwojowy spadek syntezy białek w mięśniach szkieletowych noworodków świń. --- Ssaczy cel rapamycyny (mTOR) jest częścią dwóch odrębnych kompleksów, mTORC1, zawierającego raptor i mLST8, oraz mTORC2, zawierającego rictor, mLST8 i sin1. Chociaż podjęto już wielkie wysiłki w celu wyjaśnienia funkcji i regulację mTOR, cytoplazmatyczna dystrybucja jądrowa kompleksów mTOR jest nieznana. Po ustaleniu odpowiednich warunków eksperymentalnych, stwierdziliśmy, że mTOR, mLST8, rictor i sin1 są mniej obfite w jądrze niż w cytoplazmie cytoplazmie nietransformowanych, nieimmortalizowanych, diploidalnych ludzkich pierwotnych fibroblastów. pierwotnych ludzkich fibroblastów. Chociaż raptor jest również bardzo obfity w jądrze, kompleks kompleks mTOR/raptor jest głównie cytoplazmatyczny, podczas gdy kompleks mTOR/rictor jest obfity w obu przedziałach. Rapamycyna negatywnie reguluje tworzenie obu kompleksów mTOR, ale molekularny mechanizm jej wpływu na mTORC2 pozostawał nieuchwytny. Opisujemy, że w komórkach pierwotnych krótkotrwałe leczenie rapamycyną wywołuje dephosforylację rictora i sin1 wyłącznie w cytoplazmie, ale nie cytoplazmie, ale nie wpływa na montaż mTORC2. Długotrwałe leczenie lekiem prowadzi do całkowitej defosforylacji i cytoplazmatycznej translokacji jądrowego rictor i sin1, któremu towarzyszy zahamowanie montażu mTORC2. Różne cytoplazmatyczne i jądrowe czynniki efektorowe mTOR są zaangażowane w wiele nowotworów i ludzkich chorób genetycznych, takich jak nowotworach i ludzkich chorobach genetycznych, takich jak stwardnienie guzowate, zespół Peutz-Jeghersa Peutza-Jeghersa, choroba von Hippla-Lindaua, nerwiakowłókniakowatość typu 1, wielotorbielowatość nerek, choroba Alzheimera, choroba Alzheimera. choroba Alzheimera, przerost mięśnia sercowego, otyłość i cukrzyca. W związku z tym analogi rapamycyny są obecnie testowane w wielu różnych badaniach klinicznych. badaniach klinicznych. Nasze dane pozwalają na nowy wgląd w molekularne konsekwencje dysregulacji mTOR w warunkach patofizjologicznych i powinny pomóc w zoptymalizować leczenie rapamycyną chorób u ludzi. --- Kinaza białkowa mTOR (mammalian target of rapamycin) jest ważnym regulatorem wzrostu komórek. regulatorem wzrostu komórek. Zidentyfikowano dwa kompleksy mTOR: kompleks 1, składający się z mTOR-Raptor (regulatorowe białko związane z mTOR)-mLST8 (określany jako mTORC1), oraz kompleks 2, składający się z mTOR-Rictor (wrażliwy na rapamycynę towarzysz mTOR)-mLST8-Sin1 (określany jako mTORC2). mTORC1 fosforyluje rybosomalną kinazę p70 S6K (kinaza S6) w jej motywie hydrofobowym (Thr389), podczas gdy mTORC2 fosforyluje PKB (kinazę białkową B) w jej motywie hydrofobowym (Ser473). W niniejszym badaniu donoszą, że szeroko wyrażone izoformy niezbadanych białek określanych jako Protor-1 (białko obserwowane z Rictor-1) i Protor-2 oddziałują z Rictor i są składnikami mTORC2. Wykazaliśmy, że immunoprecypitacja Protor-1 lub Protor-2 powoduje koimmunoprecypitację innych podjednostek mTORC2, ale nie Raptor, specyficznego składnika mTORC1. Pokazujemy, że detergenty takie jak Triton X-100 lub n-oktyloglukozyd dysocjują mTOR i mLST8 z kompleksu Protor-1, Sin1 i Rictor. Dostarczamy również dowodów na to, że Rictor reguluje ekspresję Protor-1 i że Protor-1 nie jest wymagany do łączenia innych podjednostek mTORC2 w kompleks. Protor-1 jest nową podjednostką mTORC2 wiążącą Rictor, ale konieczne są dalsze prace w celu ustalenia jego roli.
Jakie są główne składniki mTORC1?
Kinaza białkowa mTOR (mammalian target of rapamycin) jest ważnym regulatorem wzrostu komórek i kluczowym celem interwencji terapeutycznej w nowotworach. Zidentyfikowano dwa kompleksy mTOR: kompleks 1 (mTORC1), składający się z mTOR, Raptor (białko regulatorowe związane z mTOR) i mLST8 (śmiertelne dla ssaków białko SEC13 8) oraz kompleks 2 (mTORC2) składający się z mTOR, Rictor (niewrażliwy na rapamycynę towarzysz mTOR), Sin1 (białko 1 oddziałujące z kinazą białkową aktywowaną stresem) i mLST8.