Białko kształtujące mitochondria atrofii wzrokowej 1 (OPA1) ma genetycznie rozróżnialne genetycznie role w morfologii mitochondriów i apoptozie. Ta ostatnia zależy od proteazy związanej z preseniliną romboidalną (PARL), niezbędnej dla akumulacji rozpuszczalnej formy przestrzeni międzybłonowej OPA1 (IMS-OPA1). Tutaj pokazujemy, że OPA1 i PARL uczestniczą w odpowiedzi na szok cieplny, stereotypowym procesie adaptacji komórkowej. stereotypowym komórkowym procesie adaptacji do stresu termicznego. Po szoku cieplnym, długie formy OPA1 są tracone, a mitochondria ulegają fragmentacji. Jednak fuzja mitochondriów fuzja mitochondrialna jest zbędna do utrzymania żywotności, podczas gdy IMS-OPA1 jest wymagana. Po kondycjonowania - procesu łagodnego szoku termicznego i regeneracji - gromadzi się IMS-OPA1, oligomery OPA1 zwiększają się, a mitochondria uwalniają mniej cytochromu c, ostatecznie co ostatecznie skutkuje opornością komórek na kolejne induktory apoptozy. W Parl(-/-) akumulacja IMS-OPA1 jest stępiona, a kondycjonowanie nie chroni przed uwalnianiem cytochromu c i apoptozą. Tak więc, zależny od OPA1/PARL szlak przebudowy cristae jest zaangażowany w szok termiczny. Ten artykuł jest częścią Wydanie specjalne zatytułowane: 17th European Bioenergetics Conference (EBEC 2012). --- Dysfunkcja mitochondriów, w szczególności defekt biogenezy mitochondriów, jest wczesną i znaczącą cechą choroby Alzheimera (AD). Poprzednie badania wykazały, że liczba mitochondriów jest znacznie zmniejszona w podatnym hipokampie. podatnych neuronach hipokampa od pacjentów z AD. Neuronalne komórki macierzyste (NSC) u myszy z AD może zrekompensować utratę neuronów wynikającą z obecności białka z odkładania się białka amyloidu-beta. Wpływ transplantacji NSC na biogenezę mitochondriów i funkcje poznawcze u myszy z AD są jednak słabo poznane. słabo poznane. W tym badaniu wstrzyknęliśmy NSC lub nośnik do 12-miesięcznego myszy transgeniczne z białkiem prekursorowym amyloidu (APP)/PS1, mysi model patologii podobnej do AD. patologii. Wpływ przeszczepu NSC na funkcje poznawcze, ilość mitochondrialnego DNA, ekspresję czynników biogenezy mitochondriów i białek związanych z mitochondriami. białek związanych z mitochondriami oraz morfologię mitochondriów. Nasze wyniki pokazują, że u myszy z APP/PS1 (Tg-NSC), którym wstrzyknięto NSC, funkcje poznawcze funkcja poznawcza, liczba mitochondriów i ekspresja białek związanych z mitochondriami, w szczególności mitochondriów białek, w szczególności czynników rozszczepienia mitochondriów (związanych z dynaminą dynamin-related protein 1 [Drp1] i fission 1 [Fis1]) oraz czynnika fuzji mitochondriów optic atrofia 1 (OPA1), były znacznie zwiększone w porównaniu z tymi w myszy APP/PS1 (Tg-Veh), którym wstrzyknięto nośnik, podczas gdy ekspresja mitochondrialnych czynników fuzji mitofuzji 1 (Mfn1) i Mfn2 była znacząco zmniejszona. Dane te wskazują, że transplantacja NSC może zwiększyć biogenezę mitochondriów biogenezę mitochondriów i dalej ratować deficyty poznawcze u myszy z AD. --- Mutacje w LRRK2 powodują autosomalną dominującą chorobę Parkinsona (PD). LRRK2 koduje wielodomenowe białko zawierające domeny GTPazy i kinazy oraz domeny domeny interakcji białko-białko. Rodzinne mutacje PD zmieniają GTPazę i aktywność kinazy LRRK2 in vitro. Sugeruje się, że LRRK2 reguluje wiele szlaków komórkowych, chociaż mechanizmy leżące u ich podstaw są słabo poznane. słabo poznane. Aby zbadać takie mechanizmy, okazało się, że identyfikacja białek oddziałujących z LRRK2, z których niektóre służą jako substraty kinazy LRRK2. Tutaj identyfikujemy wspólne interakcje LRRK2 z członkami nadrodziny dynamin GTPazą. LRRK2 oddziałuje z dynaminami 1-3, które pośredniczą w rozszczepianiu błony w endocytozie za pośrednictwem klatryny oraz z białkami związanymi z dynaminą, które które pośredniczą w rozszczepianiu mitochondriów (Drp1) i fuzji (mitofuzyny i OPA1). LRRK2 częściowo kolokalizuje z endosomalną dynaminą-1 lub z mitofusynami i OPA1 na błonach mitochondrialnych. Dystrybucja subkomórkowa i kompleksy oligomeryczne GTPazy dynaminowe nie są zmieniane przez modulowanie LRRK2 w mózgu myszy, podczas gdy dojrzałe poziomy OPA1 są zmniejszone w mózgach PD G2019S. LRRK2 zwiększa wiązanie GTP mitofusyny-1 wiązanie GTP, podczas gdy dynamina-1 i OPA1 służą jako umiarkowane substraty fosforylacji za pośrednictwem LRRK2 in vitro. Podczas gdy ortologi GTPazy dynaminy nie są wymagane do toksyczności indukowanej przez LRRK2 u drożdży, LRRK2 funkcjonalnie oddziałuje z dynaminą-1 i mitofusiną-1 w hodowanych neuronach. LRRK2 osłabia skracanie neurytu skrócenie neurytów indukowane przez dynaminę-1 poprzez zmniejszenie jej poziomów, podczas gdy LRRK2 ratuje upośledzony wzrost neurytów indukowany przez mitofusynę-1 potencjalnie poprzez odwrócenie nadmierną fuzję mitochondriów. Nasze badanie wyjaśnia nowe funkcjonalne interakcje LRRK2 z GTPazami z nadrodziny dynamin, które implikują LRRK2 w regulacji dynamiki błonowej ważnej dla endocytozy i morfologii mitochondriów. morfologii mitochondriów. --- Nowy członek rodziny GTPaz dynaminowych (OPA1) został niedawno zidentyfikowany u ludzi. u ludzi i wykazano, że jest zmutowany u pacjentów z dominującym zanikiem nerwu wzrokowego. Aby lepiej zrozumieć funkcję OPA1 ssaków, wyizolowaliśmy mysiego ortologa (mOPA1) z mózgu i wyhodowaliśmy specyficzne przeciwciało przeciwko jego C-końcowi. The Subkomórkowa dystrybucja mOPA1 nadeksprymowanego w komórkach COS-7 w dużej mierze pokrywała się z endogennym cytochromem c, dobrze znanym markerem mitochondrialnym, i dramatycznie wpłynęła na morfologię mitochondriów, zmieniając ją z rurkowej na pęcherzykową. W celowaniu mitochondrialnym pośredniczył N-końcowy region mOPA1 w następujący sposób: usunięcie 124 N-końcowych aminokwasów wyeliminowało celowanie mitochondrialne, chociaż fuzja N-końcowych 60 lub 90 aminokwasów mOPA1 z zielonym białkiem fluorescencyjnym skutkowało jego ukierunkowaniem na mitochondria. mOPA1 ulegała szerokiej ekspresji w mózgu myszy, zwłaszcza w neuronach neuronach opuszki węchowej, kory mózgowej, kory piramidowej, podwzgórza, hipokampa, jądra czerwonego, jądra ślimaka. jądro, jądro ślimakowe, motoryczne jądro trójdzielne, jądro twarzy, jądro móżdżku i jądro Purkinjego. jądro móżdżku i komórki Purkinjego. W obrębie zdysocjowanych komórek móżdżku białko mOPA1 było wyraźnie obserwowane w dendrytach i synapsach komórek neuronalnych, a także w astrocytach i komórkach opon mózgowych. W każdym przypadku było ono rozmieszczone w pęcherzykowy wzór obserwowany w innych typach komórek. --- Mitochondria są wysoce dynamicznymi organellami, a rozszczepienie mitochondriów jest kluczowym etapem apoptozy. kluczowym etapem apoptozy. Chociaż uważa się, że Oma1 jest odpowiedzialna za przetwarzanie długiej formy Opa1 (L-Opa1) podczas fragmentacji mitochondriów, czy i w jaki sposób Oma1 jest zaangażowany w przetwarzanie w jaki sposób Oma1 jest zaangażowany w przetwarzanie L-Opa1 i uczestniczy w regulacji chemooporności jest nieznane. Chemowrażliwe i chemiooporne raki jajnika (OVCA) i szyjki macicy (CECA) komórki raka szyjki macicy (CECA) traktowano cisplatyną (CDDP). Dynamika mitochondriów i zawartość białka oceniano odpowiednio metodą immunofluorescencji i Western blot, odpowiednio. Wymagania Oma1 i p53 dla indukowanego CDDP przetwarzania L-Opa1 fragmentacji mitochondriów i apoptozy badano za pomocą siRNA lub cDNA. cDNA. CDDP indukuje przetwarzanie L-Opa1 i fragmentację mitochondriów w komórkach chemiowrażliwych, ale nie w komórkach chemioopornych. CDDP indukował wzrost formy Oma1 40-kDa w komórkach OV2008, ale nie w komórkach C13*. Nokaut Oma1 hamował przetwarzanie L-Opa1 fragmentację mitochondriów i apoptozę. Wyciszenie ekspresji p53 osłabiło wpływ CDDP na wzrost Oma1 (40 kDa), przetwarzanie L-Opa1, fragmentacji mitochondriów i apoptozy w chemowrażliwych komórkach OVCA, podczas gdy rekonstytucja p53 w zmutowanych lub null p53 chemioopornych komórkach OVCA indukowała wzrost Oma1 (40 kDa), przetwarzanie L-Opa1, fragmentację mitochondriów i apoptozę niezależnie od obecności CDDP. Prohibityna 1 (Phb1) dysocjuje z kompleksu Opa1-Phb1 i wiąże fosforylowane p53 (seryna 15) w odpowiedzi na CDDP w chemiowrażliwych, ale nie chemioopornych komórkach CECA. Wyniki te wykazują, że (a) p53 i Oma1 pośredniczą w przetwarzaniu L-Opa1, (b) fragmentacja mitochondriów jest zaangażowana w apoptozę indukowaną CDDP w komórkach OVCA i CECA, oraz (c) rozregulowana dynamika mitochondriów może być częściowo zaangażowana w patofizjologii oporności na CDDP. --- OPA1 jest genem powodującym autosomalny dominujący zanik nerwu wzrokowego i posiada osiem alternatywnych wariantów splicingu. alternatywnych wariantów splicingu. Tutaj zidentyfikowaliśmy dwie izoformy białek OPA1 w komórkach HeLa i zbadaliśmy ich lokalizację submitochondrialną i formacje kompleksu formacje. RT-PCR pokazuje, że komórki HeLa wyrażają głównie izoformy 7 i 1 OPA1. OPA1. Ponieważ trzecie miejsce rozszczepienia jest wykorzystywane głównie w komórkach HeLa, przewidywane masy cząsteczkowe przewidywane masy cząsteczkowe ich przetworzonych białek są zgodne z białkami 93- i 88-kDa. Badania biochemiczne wskazują, że obie izoformy OPA1 są obecne w przestrzeni międzybłonowej. Frakcjonowanie Submitochondrial przez wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy pokazuje, że białko 88-kDa wiąże się głównie z zewnętrzną błoną mitochondrialną, wręcz przeciwnie, białko 93-kDa wiąże się z błoną wewnętrzną. Analiza filtracji żelowej wskazuje, że tworzą one kompleksy o różnej masie cząsteczkowej w mitochondriach. mitochondriach. Te różnice między dwiema izoformami OPA1 sugerują ich kluczową rolę w mitochondriach. kluczową rolę w tworzeniu błony mitochondrialnej. --- Mutacje w genie OPA1 są związane z autosomalnym dominującym zanikiem nerwu wzrokowego. OPA1 koduje białko związane z dynaminą, ortologiczne do Msp1 z Schizosaccharomyces pombe i Mgm1p z Saccharomyces cerevisiae. Schizosaccharomyces pombe i Mgm1p Saccharomyces cerevisiae, oba zaangażowane w morfologię mitochondriów w morfologię mitochondriów i utrzymanie genomu. Przedstawiamy immunofluorescencyjne i biochemiczne dowody wskazujące, że OPA1 rezyduje w mitochondriach, gdzie jest importowana przez swoje wysoce podstawowe amino-końcowe rozszerzenie amino-końcowego. Eksperymenty proteolizy wskazują, że OPA1 jest obecna w przestrzeni przestrzeni międzybłonowej, a mikroskopia elektronowa dodatkowo lokalizuje ją blisko cristae. Silna asocjacja OPA1 z błonami sugeruje jej zakotwiczenie w błonie wewnętrznej. błony wewnętrznej. --- Mitochondria to dynamiczne organelle, które nieustannie łączą się i dzielą. Równowaga Równowaga między fuzją a rozszczepieniem kontroluje morfologię mitochondriów. mitochondriów, które pojawiają się jako kropki lub wydłużone kanaliki w zależności od dominującej siły. siły. Charakterystyka składników mechanizmów rozszczepiania i fuzji mitochondriów i fuzji poczyniła znaczne postępy, a obecnie pojawiającym się pytaniem jest to, jaką rolę w funkcjonowaniu mitochondriów i komórek. Jej znaczenie zostało podkreślone przez odkrycie, że dwie ludzkie choroby są spowodowane mutacjami w dwóch mitochondrialnych genach pro-fuzji, MFN2 i OPA1. Niniejszy przegląd skupi się na danych dotyczących funkcji OPA1, którego mutacje powodują atrofię wzrokową. które powodują zanik nerwu wzrokowego, w odniesieniu do podstawowych procesów patofizjologicznych. procesów patofizjologicznych. --- CEL: Mutacje w genie zaniku nerwu wzrokowego 1 (OPA1) zostały zgłoszone u pacjentów z autosomalnym dominującym zanikiem nerwu wzrokowego (ADOA). pacjentów z autosomalnym dominującym zanikiem nerwu wzrokowego (ADOA). OPA1 odgrywa ważną rolę w dynamice mitochondriów i apoptozie komórek. Związek między mutacjami OPA1 a zmianami w bioenergetyce nadal nie jest w pełni wyjaśniony. Celem tego badania było zbadanie wpływu mutacji OPA1 na mitochondrialną sieć kanalików i bioenergetykę. sieć kanalików i bioenergetykę. METODY: Stworzyliśmy linie komórek limfoblastoidalnych z czterech rodzin ADOA niosących różne mutacje OPA1, krewnych bez zmian (linie komórek kontroli wewnętrznej linie komórkowe kontroli wewnętrznej) i niespokrewnionych normalnych kontroli (normalne kontrolne linie komórkowe). Warianty splicingu OPA1 i mRNA analizowano za pomocą odwrotnej transkrypcji-PCR i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Izoformy białkowe badano metodą Western blotting. Sieć Sieć mitochondrialną wizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Bioenergetykę mitochondriów bioenergetyki oceniano za pomocą analizatora strumienia Seahorse XF24. Mitochondrialny potencjał błonowy i uszkodzenia oksydacyjne analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. WYNIKI: Zmutowane linie komórkowe OPA1 wykazały znaczny spadek ekspresji mRNA i białka OPA1 ekspresji białka, potencjału błony mitochondrialnej i syntezy ATP. A długiej izoformy OPA1 zaobserwowano w komórkach z mutacjami OPA1 w domenie środkowej i domenie efektorowej GTPazy. Mikroskopia konfokalna ujawniła zwiększoną fragmentację mitochondriów w zmutowanych komórkach OPA1. Zmutowane komórki OPA1 OPA1 wykazywały również zmniejszone zużycie tlenu i przechodziły glikolizę w celu produkcji ATP. Ponadto mutacje OPA1 powodowały akumulację uszkodzeń oksydacyjnych. uszkodzeń oksydacyjnych. WNIOSKI: Nasze eksperymenty wykazały, że mutacje OPA1 indukowały fragmentację mitochondriów, niesprzężone oddychanie mitochondrialne i wywołały dysfunkcyjną bioenergetykę. Jednak nie było znaczących różnic między różnymi mutacjami OPA1. --- Mechanizmy komórkowe zaangażowane w wiele chorób neurodegeneracyjnych zbiegają się na mitochondria, aby wywołać nadprodukcję reaktywnych form tlenu, uszkodzenie mitochondriów, a następnie uwalnianie cytochromu c. Obecnie niewiele wiadomo w odniesieniu do udziału dynamiki mitochondriów w uwalnianiu cytochromu c w następstwie stresu oksydacyjnego w chorobach neurodegeneracyjnych. Tutaj indukowaliśmy stres oksydacyjny w linii komórkowej HT22 za pomocą glutaminianu i zbadaliśmy kluczowe mediatory dynamiki mitochondriów w celu określenia roli, jaką ten proces może odgrywać w śmierci neuronów wywołanej stresem oksydacyjnym. Donosimy, że leczenie glutaminianem w komórkach HT22 indukuje wzrost reaktywnych form tlenu (ROS), uwalnianie mitochondrialnego białka fuzyjnego mitochondrialnego białka fuzyjnego Opa1 do cytozolu, z jednoczesnym uwalnianiem cytochromu c. Co więcej, po leczeniu glutaminianem zmiany w sygnalizacji komórkowej zbiegają się z uwalnianiem mitochromu c. w sygnalizacji komórkowej zbiegają się z fragmentacją mitochondriów, co prowadzi do znaczną śmiercią komórek HT22. Wreszcie, donosimy, że leczenie przeciwutleniaczem tokoferolem osłabia wzrost ROS indukowany glutaminianem, uwalnianie mitochondrialnego Opa1 i cytochromu c oraz zapobiega śmierci komórek. --- TŁO: Sugeruje się, że mitochondria są zaangażowane w patologię choroby afektywnej dwubiegunowej (BD) i schizofrenii. choroby afektywnej dwubiegunowej (BD) i schizofrenii. Jednak mechanizm leżący u podstaw dysfunkcja mitochondriów jest niejasna. Dynamika sieci mitochondrialnej, która odzwierciedla komórkowy stan metaboliczny, jest ważna dla rozwoju embrionalnego, tworzenia synaps i neurodegeneracji. Niniejsze badanie miało na celu zbadanie dynamiki sieci mitochondrialnej i jej prawdopodobnego związku z nieprawidłowym komórkowym zużyciem tlenu w schizofrenii. METODY: Żywe limfocyty transformowane wirusem Epsteina-Barr (EBV) (limfoblastoidy) od pacjentów ze zdiagnozowaną DSM-IV schizofrenią (n = 17), BD (n = 15) i zdrowych osób kontrolnych (n = 15) oceniano pod kątem oddychania mitochondrialnego, mitochondriów oddychania, dynamiki mitochondriów i odpowiednich poziomów białek za pomocą oksygrafii, mikroskopii konfokalnej i immunoblottingu. WYNIKI: Oddychanie limfoblastoidów pochodzących ze schizofrenii było znacząco niższe w porównaniu z osobami kontrolnymi i było dwukrotnie bardziej wrażliwe na inhibicję dopaminy (DA). W przeciwieństwie do DA, haloperidol hamował oddychanie napędzane kompleksem I w podobnym stopniu zarówno w schizofrenii, jak i w komórkach kontrolnych. Oba leki oddziałują z kompleksem I, ale w różnych miejscach. W miejscu interakcji DA stwierdziliśmy zmiany w poziomach białek trzech podjednostek kompleksu I w schizofrenii. I w schizofrenii. Ponadto zaobserwowaliśmy strukturalne i łącznościowe i łączność w sieci mitochondrialnej, związane ze zmianami w białku profuzyjnym OPA1, które było podobnie zmniejszone w próbkach kory przedczołowej w schizofrenii. kory przedczołowej w schizofrenii. Żadnej z tych zmian nie zaobserwowano w komórkach BD, które były podobne do komórek kontrolnych. WNIOSKI: Wykazaliśmy upośledzoną dynamikę sieci mitochondrialnej związaną z zmniejszonym oddychaniem komórkowym i nieprawidłowościami kompleksu I w schizofrenii, ale nie w BD. ale nie w BD. Jeśli wyniki te reprezentują zmiany specyficzne dla choroby, mogą one stać się endofenotypowym biomarkerem schizofrenii. --- Cristae, zorganizowane wgłębienia wewnętrznej błony mitochondrialnej, odpowiadają strukturalnie na zapotrzebowanie energetyczne komórki. Mechanizm, przez który w którym te dynamiczne zmiany są regulowane, a ich konsekwencje są w dużej mierze nieznane. w dużej mierze nieznane. Zanik nerwu wzrokowego 1 (OPA1) jest mitochondrialną GTPazą odpowiedzialną za za fuzję błony wewnętrznej i utrzymanie struktury cristae. Tutaj donosimy że OPA1 dynamicznie reaguje na zmiany warunków energetycznych w celu regulacji strukturę cristae. Ta regulacja cristae jest niezależna od roli OPA1 w fuzji mitochondriów. fuzji mitochondriów, ponieważ mutant OPA1, który nadal może oligomeryzować, ale nie ma aktywność fuzji była w stanie utrzymać strukturę cristae. Co ważne, OPA1 była wymagana do odporności na śmierć komórkową wywołaną głodem, do oddychania mitochondrialnego oddychania, do wzrostu w pożywce galaktozowej i do utrzymania syntazy ATP niezależnie od jej aktywności fuzji. Zidentyfikowaliśmy mitochondrialne nośniki substancji rozpuszczonych (SLC25A) jako interaktory OPA1 i wykazaliśmy, że ich farmakologiczna i genetyczna blokada i blokada genetyczna hamowały oligomeryzację i funkcję OPA1. W ten sposób proponujemy nowy sposób, w jaki OPA1 wyczuwa dostępność substratu energetycznego, który moduluje swoją funkcję w regulacji architektury mitochondriów w sposób sposób zależny od białka SLC25A. --- Mitochondria są dynamicznymi organellami komórkowymi, które równoważą rozszczepienie i fuzję w celu regulują morfologię, dystrybucję i aktywność organelli, a Opa1 jest jedną z trzech trzech GTPaz regulujących fuzję mitochondriów. U ludzi utrata Opa1 powoduje dominujący zanik nerwu wzrokowego, stan zwyrodnieniowy prowadzący do utraty wzroku. prowadzi do utraty wzroku. Tutaj pokazujemy, że fenotyp zmutowanej myszy lilR3 jest spowodowany mutacją punktową w genie Opa1, powodującą błędną lokalizację białka białka Opa1 z mitochondriów do cytozolu. Co ważne, mutacja jest w środkowej domenie białka Opa1, dla której nie opisano żadnej funkcji. opisana. Brak mitochondrialnej retencji Opa1 jest wystarczający, aby spowodować komórkowy fenotyp utraty funkcji Opa1, ponieważ mitochondria są pofragmentowane, wskazując na niezdolność do fuzji. Pomimo normalnie wszechobecnej ekspresji Opa1 i istotnej natury mitochondriów, zarodki z nieprawidłową ekspresją Opa1 przetrwały do połowy ciąży i zmarły w E11.5. Mutanty te wykazywały opóźnienie wzrostu opóźnienie wzrostu, wytrzeszcz i nieprawidłowe wzorcowanie wzdłuż osi przednio-tylnej, chociaż sama oś A-P chociaż sama oś A-P była nienaruszona. Złożony związek między mitochondrialną a śmiercią komórki jest podkreślany przez apoptozę w określonych populacjach komórek lilR3. populacjach komórek zarodków lilR3. Nasze wyniki po raz pierwszy definiują funkcję środkowej domeny funkcję środkowej domeny białka Opa1 i pokazują, że mitochondrialna retencja białka Opa1 jest niezbędna dla prawidłowej embriogenezy. --- Wcześniej opisaliśmy, że wyciszenie mitochondrialnego białka OPA1 zwiększa mitochondrialną sygnalizację Ca(2+) i produkcję aldosteronu w komórkach kory nadnerczy H295R komórkach kory nadnerczy. Ponieważ pozamitochondrialne OPA1 (emOPA1) zostało zgłoszone do ułatwia lipolizę indukowaną cAMP, postawiliśmy hipotezę, że emOPA1, poprzez zwiększoną hydrolizę estrów cholesterolu, zwiększa produkcję aldosteronu w komórkach H295R komórkach. Kilka immunopozytywnych plamek OPA1 wykryto w ∼40% komórek. W w badaniach frakcjonowania komórek stosunek OPA1/COX IV (marker mitochondrialny) we frakcji postmitochondrialnej frakcji postmitochondrialnej był o rząd wielkości wyższy niż we frakcji mitochondrialnej. frakcji mitochondrialnej. Stosunek długich do krótkich izoform OPA1 był niższy we frakcji postmitochondrialnej niż postmitochondrialnych niż we frakcjach mitochondrialnych. Knockdown OPA1 nie zdołał zmniejszyć indukowaną db-cAMP fosforylację lipazy wrażliwej na hormony (HSL), sygnalizację Ca(2+) i wydzielania aldosteronu. Podsumowując, OPA1 można wykryć w frakcjach postmitochondrialnych, niemniej jednak OPA1 nie zakłócała procesu cAMP - PKA - HSL pośredniczyła w aktywacji wydzielania aldosteronu. --- Podczas inwazji komórek nowotworowych, szybciej poruszające się komórki nowotworowe odgrywają dominującą rolę poprzez inwazję i wcześniejsze przerzuty. Pomimo znaczenia tych komórek odstających, źródło heterogeniczności w ich zachowaniu migracyjnym pozostaje słabo poznane. Tutaj pokazujemy, że przednia lokalizacja mitochondriów, w między jądrem a przednią krawędzią migrujących komórek raka nabłonkowego, koreluje z szybszą prędkością migracji i zwiększoną trwałością kierunkową. kierunkową. Asymetria lokalizacji mitochondriów wzdłuż osi migracji jest nieobecna podczas spontanicznej migracji komórek na dwuwymiarowych powierzchniach powierzchni i występuje tylko w obecności chemicznych bodźców wabiących lub w warunkach mechanicznego ograniczenia. warunkach mechanicznego ograniczenia. Co więcej, zaburzanie asymetrycznej rozkład mitochondriów w migrujących komórkach poprzez zakłócanie fuzji mitochondriów (ang. fuzję mitochondriów (opa-1) lub białka rozszczepiające (drp-1), znacząco zmniejsza liczbę komórek z przednią lokalizacją mitochondriów i znacząco zmniejsza prędkość i kierunkową trwałość najszybciej poruszających się komórek. Zaobserwowaliśmy również podobne zmiany po zaburzeniu połączenia między mitochondriami i mikrotubulami poprzez knockdown mitochondrialnej rhoGTPazy-1 (miro-1). Podsumowując, zmiany w prędkości migracji i kierunkowości w komórkach z mitochondriami zlokalizowanymi w przedniej części mogą odpowiadać za rzędu wielkości różnice w zdolnościach inwazyjnych między komórkami z jednorodnych populacji komórek. --- Związane z dynaminą białko GTPazy OPA1, zlokalizowane w przestrzeni międzybłonowej i przywiązane do wewnętrznej błony mitochondriów, uczestniczy w fuzji tych organelli. tych organelli. Jego mutacja jest najczęstszą przyczyną autosomalnego dominującego zaniku nerwu wzrokowego. OPA1 kontroluje średnicę połączeń między graniczną częścią błony wewnętrznej a błoną cristae i zmniejsza dyfuzyjność cytochromu c przez te połączenia. Postulowaliśmy, że jeśli znaczny pobór Ca²⁺ do macierzy następuje ze światła cristae, zmniejszona ekspresja OPA1 zwiększyłaby dostęp Ca²⁺ do transporterów w błonie crista, a tym samym zwiększyłby wychwyt Ca²⁺. W nienaruszonym H295R i komórkach HeLa sygnały cytozolowe Ca²⁺ wywołane odpowiednio K⁺ i histaminą, zostały przeniesione do mitochondriów. Szybkość i amplituda mitochondrialnego wzrostu [Ca²⁺] (śledzona za pomocą konfokalnego skanowania laserowego mikroskopia laserowa i pomiary FRET za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii szerokokątnej) były zwiększone po knockdown OPA1, w porównaniu z komórkami transfekowanymi kontrolnym RNA lub siRNA mitofusin1. Wychwyt Ca²⁺ był zwiększony pomimo obniżonego potencjału błony mitochondrialnej. potencjału błony mitochondrialnej. W permeabilizowanych komórkach szybkość wychwytu Ca²⁺ przez zdepolaryzowane mitochondria była również zwiększona w komórkach wyciszonych przez OPA1. Udział udział antyporterów Na⁺/Ca²⁺ i Ca²⁺/H⁺ w tym procesie transportu wskazują dane farmakologiczne. wskazują dane farmakologiczne. Podsumowując, nasze obserwacje ujawniają znaczenie OPA1 w kontroli mitochondrialnego metabolizmu Ca²⁺. --- Mgm1 jest członkiem rodziny dynamin białek wiążących GTP. Mgm1 został po raz pierwszy zidentyfikowany w drożdżach, gdzie wpływa na morfologię mitochondriów. Ludzki homolog ludzki homolog Mgm1 nosi nazwę OPA1. Mutacje w genie OPA1 są dominującą przyczyną przyczyną dominującego zaniku nerwu wzrokowego, choroby dziedzicznej, w której postępuje postępująca degeneracja nerwu wzrokowego może prowadzić do ślepoty. Tutaj badamy właściwości białka Mgm1/OPA1 w komórkach ssaków. Odkryliśmy, że Mgm1/OPA1 jest zlokalizowane w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, gdzie jest ściśle związane z zewnętrzną powierzchnią błony wewnętrznej. do zewnętrznej powierzchni błony wewnętrznej. Nadekspresja typu dzikiego lub zmutowanych form białka Mgm1/OPA1 powoduje fragmentację mitochondriów, a w niektórych przypadkach w niektórych przypadkach skupiają się w pobliżu jądra, podczas gdy utrata białka spowodowana przez RNA (siRNA) prowadzi do rozproszenia fragmentów mitochondriów w cytozolu. w całym cytozolu. Kryształy tych pofragmentowanych mitochondriów są zdezorganizowane. We wczesnych punktach czasowych po transfekcji siRNA Mgm1/OPA1, mitochondria mitochondria nie są jeszcze pofragmentowane. Zamiast tego mitochondria pęcznieją i rozciągają się, po czym tworzą zlokalizowane zwężenia podobne do nieprawidłowości mitochondrialne obserwowane podczas wczesnych etapów apoptozy. Te nieprawidłowości mogą być najwcześniejszymi skutkami utraty białka Mgm1/OPA1. --- Nerwy obwodowe mają szczególne wymagania energetyczne ze względu na znaczną długość aksonów. długość aksonów i dlatego prawidłowe funkcjonowanie i rozmieszczenie mitochondriów wzdłuż nerwów ma fundamentalne znaczenie. Dynamika mitochondriów odnosi się do ciągłej zmiany rozmiaru, kształtu i położenia mitochondriów w komórkach. Nieprawidłowości dynamiki mitochondriów spowodowane mutacjami w białkach zaangażowanych w fuzję mitochondriów (mitochondria). fuzję mitochondriów (mitofusyna-2, MFN2), rozszczepienie (gangliozyd indukowany białko związane z różnicowaniem-1, GDAP1) i mitochondrialny transport aksonalny zwykle występuje z fenotypem choroby Charcota-Marie-Tootha (CMT). MUTACJE MFN2 powodują CMT typu 2A poprzez zmianę fuzji i transportu mitochondriów wzdłuż aksonalnego układu mikrotubul. CMT2A jest aksonalnym autosomalnym dominującym typem CMT który w większości przypadków charakteryzuje się wczesnym początkiem i raczej ciężkim przebiegiem. przebiegiem. Mutacje GDAP1 również zmieniają rozszczepienie, fuzję i transport mitochondriów i są związane z recesywną demielinizacyjną (CMT4A) i aksonalną CMT (AR-CMT2K) oraz, rzadziej, z dominującą, łagodniejszą, aksonalną CMT (CMT2K). OPA1 (Optic Atrophy-1) bierze udział w fuzji wewnętrznej błony mitochondrialnej, a jego heterozygotyczne mutacje prowadzą do heterozygotyczne mutacje prowadzą do wczesnego i postępującego dominującego zaniku nerwu zaniku nerwu wzrokowego, który może być powikłany innymi objawami neurologicznymi, w tym neuropatią obwodową. Mutacje w kilku białkach o fundamentalnym znaczeniu dla transportu aksonalnego transportu aksonalnego lub tworzenia cytoszkieletu aksonalnego powodują neuropatię obwodową, CMT, dystalną dziedziczną neuropatię ruchową (dHMN) lub dziedziczną neuropatię czuciową i autonomiczną (HSAN). neuropatii czuciowej i autonomicznej (HSAN), a także w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Rzeczywiście, transport mitochondrialny obejmuje bezpośrednio lub pośrednio składniki nadrodziny kinezyn (KIF5A, KIF1A, KIF1B), odpowiedzialne za transport anterograde oraz kompleksu dyneiny i pokrewnych białek (DYNC1H1, dynaktyna, dynamin-2), zaangażowanych w przepływ wsteczny. Mikrotubule, neurofilamenty oraz chaperony, takie jak białka szoku cieplnego (HSP), również odgrywają fundamentalną rolę w transporcie mitochondrialnym. w transporcie mitochondrialnym, a mutacje w niektórych powiązanych genach kodujących powodują neuropatię obwodową (TUBB3, NEFL, HSPB1, HSPB8, HSPB3, DNAJB2). W niniejszym przeglądzie zajmujemy się nieprawidłowościami w dynamice mitochondriów i ich rolą w określaniu choroby CMT i powiązanych neuropatii. --- Prohibityny obejmują ewolucyjnie konserwowaną i wszechobecnie wyrażaną rodzinę białek błonowych o słabo opisanych funkcjach. rodzinę białek błonowych o słabo opisanych funkcjach. Duże skupiska podjednostek Podjednostki PHB1 i PHB2 są zlokalizowane w wewnętrznej błonie mitochondriów, ale różne role w innych przedziałach komórkowych zostały również zaproponowane dla obu białek. Tutaj wykorzystaliśmy warunkowe celowanie genów mysiego Phb2 do zdefiniowania aktywności komórkowej prohibityn. Nasze eksperymenty ograniczają funkcję prohibityny do mitochondriów i identyfikują przetwarzanie dynaminopodobnej GTPazy OPA1, niezbędnego składnika mitochondrialnej maszynerii fuzji, jako centralny proces komórkowy kontrolowany przez prohibityny. Delecja Phb2 prowadzi do do selektywnej utraty długich izoform OPA1. Skutkuje to nieprawidłową morfogenezą morfogenezę cristae i upośledzoną proliferację komórkową oraz odporność na apoptozę. na apoptozę. Ekspresja długiej izoformy OPA1 w komórkach z niedoborem PHB2 tłumi te defekty, identyfikując upośledzone przetwarzanie OPA1 jako główny jako podstawowy defekt komórkowy przy braku prohibityn. Nasze wyniki przypisują zatem istotną funkcję w tworzeniu mitochondrialnych cristae dla prohibityn i sugerują sprzężenie proliferacji komórek z morfogenezą mitochondriów. --- Białko Opa1 związane z dynaminą jest zlokalizowane w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, gdzie ułatwia fuzję mitochondriów. gdzie ułatwia fuzję między mitochondriami. Apoptoza powoduje uwalnianie Opa1 do cytozolu i powoduje fragmentację mitochondriów. Utrata mitochondrialnego potencjału błonowego również powoduje fragmentację mitochondriów, ale nie Opa1 do cytozolu. Oba warunki indukują proteolityczne rozszczepienie Opa1, co sugeruje, że fragmentacja mitochondriów jest wyzwalana przez inaktywację Opa1 inaktywację. Odwrotny efekt zaobserwowano w przypadku knockdownu mitochondrialnej proteazy przestrzeni międzybłonowej Yme1. Usunięcie Yme1 zapobiega konstytutywnemu rozszczepieniu podzbioru wariantów splicingu Opa1, ale nie wpływa na cyjanku karbonylu, hydrazonu m-chlorofenylu ani na rozszczepienie indukowane apoptozą. Zablokowanie Yme1 również zwiększa łączność mitochondrialną, ale efekt ten jest niezależny od Opa1, ponieważ występuje również w komórkach z knockdownem Opa1. Wnioskujemy że Yme1 konstytutywnie reguluje podzbiór izoform Opa1 i nieznanej białko morfologii mitochondriów, podczas gdy utrata potencjału błonowego indukuje dalszą proteolizę Opa1. --- Zanik nerwu wzrokowego typu 1 (OPA1, MIM 165500) jest dziedziczoną dominująco neuropatią nerwu wzrokowego. neuropatia występująca u 1 na 50 000 osób, która charakteryzuje się postępującą utratą ostrości wzroku, prowadząca w wielu przypadkach do ślepoty. Fenotypowe i utrata komórek zwojowych siatkówki, jak w dziedzicznej neuropatii nerwu wzrokowego Lebera (Leber hereditary neuropatii wzrokowej Lebera (LHON), sugerują możliwe zaburzenia mitochondrialne. Gen OPA1 został zlokalizowany w regionie 3q28-q29 (referencje 13-19). Opisujemy tutaj gen jądrowy gen jądrowy, OPA1, który mapuje się w regionie kandydującym i koduje białko związane z białko związane z dynaminą zlokalizowane w mitochondriach. Znaleźliśmy cztery różne mutacje OPA1 mutacje, w tym mutacje z przesunięciem ramki i mutacje missense, które segregują z chorobą wykazując rolę mitochondriów w patofizjologii komórek zwojowych siatkówki. patofizjologii komórek zwojowych siatkówki. --- Opa1, znana również jako Mgm1 w drożdżach, jest mitochondrialnym członkiem rodziny dynamin rodziny dynamin. W przeciwieństwie do innych członków rodziny dynamin, Opa1 ma N-końcową sekwencję docelową mitochondrialną sekwencję docelową, co sugeruje, że białko to jest importowane do mitochondriów. mitochondriów. Tutaj opisujemy techniki biochemiczne, takie jak izolacja mitochondriów izolacja mitochondriów, ekstrakcja digitoniny, test ochrony proteazowej i ekstrakcja węglanu ekstrakcja, które zostały wykorzystane do określenia, że ssak Opa1 przebywa w przestrzeni międzybłonowej, gdzie jest ściśle związana z błoną wewnętrzną. Ponadto Ponadto opisujemy bakteryjną ekspresję domeny GTPazy Opa1, metody metody oczyszczania i test in vitro na hydrolizę GTP. --- Mitochondria w komórkach ssaków są wizualizowane jako sieć lub włókna, które ulegają ciągłym zmianom kształtu i lokalizacji w komórkach. Zmiany te zmiany są konsekwencją aktywności różnych procesów, takich jak fuzja i rozszczepienie mitochondriów oraz przebudowa mitochondriów. Wszystkie te procesy są określane jako dynamika mitochondriów, a istotne pytania, wciąż niewyjaśnione, to dlaczego komórki wymagają tak aktywnej dynamiki lub dlaczego mitochondria przemieszczają się do określonych regionów komórkowych. W niniejszym przeglądzie podsumujemy niektóre funkcje biologiczne przypisywane białkom zidentyfikowanym jako uczestniczącym w fuzji mitochondriów, a mianowicie mitofusinie 1, mitofusinie 2 i OPA1. Oprócz zdolności tych białek do promowania fuzji, mitofusyna 2 lub OPA1 regulują metabolizm mitochondriów, a utrata funkcji zmniejsza zużycie tlenu i zdolność do utleniania substratów. Proponujemy, aby białka fuzji mitochondrialnej działają jako integratory sygnałów, więc regulują zarówno fuzję mitochondriów, jak i metabolizm. --- Karboksy-końcowe białko modulujące (CTMP) jest supresorem nowotworów, wiążącym partnera kinazy białkowej B (PKB/Akt), który negatywnie reguluje tę kinazę. W trakcie W trakcie naszych ostatnich prac zidentyfikowaliśmy, że CTMP jest konsekwentnie związany z transmembraną-1 zawierającą suwak leucynowy/EF-hand (LETM1). Tutaj, donosimy, że adenowirus-LETM1 zwiększał wrażliwość komórek HeLa na apoptozę, indukowaną przez staurosporynę lub aktynomycynę D. Jak wykazano wcześniej, LETM1 lokalizuje się w komórkach HeLa. wcześniej, LETM1 lokalizuje się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Analiza mikroskopii elektronowej komórek transdukowanych adenowirusem LETM1 wykazała, że mitochondrialne cristae były spuchnięte w tych komórkach, fenotyp podobny do tego obserwowany w komórkach pozbawionych atrofii wzrokowej typu 1 (OPA1). Rozszczepienie OPA1 było zwiększone w komórkach z nadekspresją LETM1, a fenotyp ten został odwrócony przez nadekspresję wariantu OPA1-7, formy OPA1 odpornej na rozszczepienie. Podsumowując razem, dane te sugerują, że LETM1 jest nowym partnerem wiążącym dla CTMP, który może odgrywać ważną rolę w fragmentacji mitochondriów poprzez rozszczepianie OPA1.
Jaka jest lokalizacja komórkowa białka Opa1?
Białko Opa1 lokalizuje się w mitochondriach.