W ciągu ostatniego stulecia do opracowania szczepionek zastosowano kilka podejść. szczepionek, począwszy od immunizacji żywymi atenuowanymi bakteriami, aż po bezpieczniejszych szczepionek podjednostkowych. To konwencjonalne podejście do rozwoju szczepionek szczepionki wymaga hodowli patogenu i jego sekcji przy użyciu metod biochemicznych, immunologicznych i mikrobiologicznych. Chociaż metoda ta jest skuteczna w w kilku przypadkach, metoda ta jest czasochłonna i nie zapewnia rozwiązania dla wielu ludzkich patogenów. dla wielu ludzkich patogenów. Obecnie podejścia genomiczne pozwalają na projektowanie szczepionek, począwszy od przewidywania wszystkich antygenów in silico, niezależnie od ich niezależnie od ich obfitości i bez konieczności hodowania mikroorganizmów in vitro. A nowa strategia, określana jako "odwrotna wakcynologia", która została z powodzeniem zastosowana w ciągu ostatnich kilku lat, zrewolucjonizowała podejście do badań nad szczepionkami. Szczepionka Neisseria meningitidis serogrupy B, pierwszy przykład odwrotnej wakcynologii, jak również odwrotnej wakcynologii, a także zastosowanie tej strategii do opracowania nowych szczepionek przeciwko innym ludzkim patogenom. --- TŁO: Od czasu przełomowej pracy nad Neisseria meningitidis B, Reverse Vaccinology znacznie poprawiła identyfikację kandydatów na szczepionki poprzez zastępując kilka zadań eksperymentalnych etapami przewidywania in silico. Te pozwoliły naukowcom zmierzyć się z wyborem antygenów z przewidywanego proteomu patogenów. patogenów, dla których hodowla komórkowa jest trudna lub niemożliwa, oszczędzając czas i pieniądze. niemożliwe, oszczędzając czas i pieniądze. Jednak ten dobry przykład immunologii opartej na bioinformatyce może być dalej rozwijany poprzez usprawnienie etapów in silico i wdrażając narzędzia przyjazne dla biologów. WYNIKI: Przedstawiamy NERVE (New Enhanced Reverse Vaccinology Environment), przyjazne dla użytkownika środowisko programowe dla immunologii in silico. przyjazne dla użytkownika środowisko oprogramowania do identyfikacji in silico najlepszych kandydatów na szczepionki z całych proteomów patogenów bakteryjnych. Oprogramowanie integruje wiele solidnych i dobrze znanych algorytmów do analizy i porównywania białek. analizy i porównywania białek. Kandydaci na szczepionki są uszeregowani i przedstawieni w tabeli html pokazującej istotne informacje i linki do odpowiednich danych pierwotnych. Informacje dotyczące wszystkich białek analizowanego proteomu nie są usuwane na etapach selekcji ale raczej trafiają do bazy danych SQL w celu dalszej eksploracji i analizy. WNIOSEK: Po wyciągnięciu wniosków z ostatnich lat prac w tej dziedzinie i przeanalizowaniu i analizie dużego zbioru danych, NERVE zostało zaimplementowane i dostrojone jako pierwsze dostępne narzędzie narzędzie zdolne do uszeregowania ograniczonej puli (około 8-9% całego proteomu) kandydatów na szczepionki i wykazać wysoką skuteczność (około 75-80%) znanych antygenów ochronnych. antygenów ochronnych. Kandydaci na szczepionki muszą być "bezpieczni" (biorąc pod uwagę biorąc pod uwagę ryzyko autoimmunizacji) i "łatwe" do dalszych eksperymentów, badań przesiewowych o wysokiej przepustowości (unikając prawdopodobnie nierozpuszczalnych antygenów). NERVE jest pomóc zaoszczędzić czas i pieniądze przy projektowaniu szczepionek i jest dostępny jako jako dodatkowy plik z tym manuskryptem; zaktualizowane wersje będą dostępne pod adresem http://www.bio.unipd.it/molbinfo. --- Stosując strategię odwrotnej wakcynologii, wykorzystaliśmy sekwencję kodującą enolazę enolazę z Taenia asiatica, aby wyszukać jej homolog w bazie danych sekwencji ekspresji tag (EST) Echinococcus granulosus i znaleźliśmy dwie sekwencje EST (numer dostępu: CN653186 i CN649593) klonu Eg_PSGRS_13B09 z E. granulosus protoscolex o pełnej długości cDNA, które odpowiadają za 5' i 3' odpowiednio częściowego cds enolazy E. granulosus. Primery zostały zaprojektowane zgodnie z końcem 5' i końcem 3' domniemanej sekwencji kodującej do amplifikacji genomowego DNA szczepu E. granulosus wyizolowanego od owiec w prowincji Qinghai w Chinach metodą łańcuchowej reakcji polimerazy Chin za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Uzyskano pojedynczy produkt o długości 1,449 bp który zawiera dwa małe introny o długości odpowiednio 78 bp i 69 bp, odpowiednio. Introny zostały wycięte przez niesymetryczną PCR z połączonymi sekwencjami bocznymi sekwencjami intronów jako starterami. Strukturalne, funkcjonalne i immunologiczne charakterystyka przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej została przewidziana przez bioinformatykę analizę bioinformatyczną. Przewidywano, że pełna sekwencja kodująca koduje 433 reszty i i zawiera region transbłonowy aa(104-124), z końcem N na zewnątrz i C wewnątrz. Wewnętrzna część jest domeną funkcjonalną. SWISS-MODEL modulował jego strukturę 3D jako beczkę, która składa się z alternatywnie ułożone alfa helisa-beta arkusz, z kluczowymi miejscami, takimi jak wiązanie substratu region, miejsca aktywne, miejsca wiążące Mg(2+) ściśle zlokalizowane w centrum. Białko białko zawiera potencjalną sekwencję lokalizacji jądrowej aa (190-199) i kilka liniowych epitopów komórek B i epitopów komórek T CTL, z których zewnętrzny epitop aa (49-57) i wewnętrzny epitop aa (228-236) są fakultatywnymi epitopami komórek T i B B, a liniowy epitop komórek B aa(206-213) zawiera aktywne centrum centrum Glu (210), co sugeruje, że domniemane białko jest potencjalną błoną o silnej immunogenności. Kompletny cds został wyrażony w Escherichia coli, a rekombinowane białko może być rozpoznawane przez surowicę pacjenta zakażonego E. granulosus. W procesie odwrotnej wakcynologii zidentyfikowano białko błony tegumentalnej E. granulosus jako kandydata na szczepionkę. --- Dyzenteria świń (SD) jest śluzowo-krwotocznym zapaleniem jelita grubego świń wynikającym z zakażenia jelita grubego beztlenowym krętkiem jelitowym Brachyspira hyodysenteriae. Dostępne są całokomórkowe szczepionki bakteryjne, które pomagają kontrolować SD, ale ich skuteczność była niespójna. Niniejsze badanie miało na celu wykorzystanie podejście odwrotnej wakcynologii do identyfikacji białek B. hyodysenteriae do wykorzystania jako rekombinowane składniki szczepionki. rekombinowanych składników szczepionki. Przewidywano, że dziewiętnaście otwartych ramek odczytu (ORF) kodować potencjalne cząsteczki kandydujące do szczepionki zostały zidentyfikowane na podstawie analizy in silico analizy częściowych danych sekwencji genomowych. Rozkład tych ORF wśród szczepów B. hyodysenteriae zbadano metodą PCR, a szeroko rozpowszechnione ORF zostały sklonowane. Produkty zostały przebadane za pomocą panelu surowic odpornościowych świń, i spośród nich wybrano podzbiór konserwowanych, immunogennych białek. Myszy immunizowane domięśniowo tymi rekombinowanymi białkami rozwinęły specyficzne systemowe odpowiedzi przeciwciał na nie, a ich surowice aglutynują komórki B. hyodysenteriae in vitro. W eksperymencie pilotażowym osiem świń zaszczepiono dwukrotnie domięśniowo kombinacją czterech białek. U świń świnie wytworzyły przeciwciała przeciwko białkom, a po prowokacji eksperymentalnej tylko jedna świnia w porównaniu do pięciu z dziewięciu nieszczepionych świń kontrolnych. Chociaż te różnice w częstości występowania nie były znaczące, wskazywały one na trend w kierunku ochrony przy użyciu rekombinowanych białek jako immunogenów. To badanie pokazuje, że podejście odwróconej wakcynologii ma znaczny potencjał do wykorzystania w opracowywaniu nowych rekombinowanych szczepionek przeciwko SD. --- Odwrócona wakcynologia (RV), pierwsze zastosowanie technologii genomicznych w badaniach nad szczepionkami w badaniach nad szczepionkami, stanowiła wielką rewolucję w procesie odkrywania nowych szczepionek. nowych szczepionek. Określając cały repertuar antygenów, naukowcy mogli mogli zidentyfikować cele ochronne i zaprojektować skuteczne szczepionki przeciwko patogenom w przypadku których konwencjonalne metody zawiodły. Bexsero, pierwsza szczepionka opracowana przy użyciu przy użyciu RV, otrzymała niedawno pozytywną opinię Europejskiej Agencji Leków. Agencji Leków. Zastosowanie RV zapoczątkowało kaskadę zmian, które wpłynęły na cały proces opracowywania szczepionek, przenosząc na cały proces opracowywania szczepionek, przenosząc punkt ciężkości z identyfikacji listy kandydatów na szczepionki na definicję zestawu wysokowydajnych ekranów w celu zmniejszenia zapotrzebowania na kosztowne i pracochłonne testy na modelach zwierzęcych. Obecnie Obecnie jasne jest, że dogłębne zrozumienie epidemiologii kandydatów na szczepionki, oraz ich regulacji i roli w interakcjach gospodarz-patogen, musi stać się integralnym elementem integralnym elementem procesu badań przesiewowych. Daleko od bycia przestarzałym przez technologiczny, RV nadal stanowi paradygmat tego, w jaki sposób technologie o wysokiej przepustowości i wgląd naukowy można zintegrować z badaniami biotechnologicznymi. badania biotechnologiczne. --- Wirusy opryszczki pospolitej (HSV) typu 1 i 2 (HSV-1 i HSV-2) są najczęstszymi czynnikami zakaźnymi u ludzi. czynniki zakaźne u ludzi. Nie istnieją bezpieczne i skuteczne szczepionki przeciwko HSV. licencjonowane. Odwrócona wakcynologia to nowa i rewolucyjna strategia rozwoju szczepionek, która zaczyna się od przewidywania strategia rozwoju szczepionki, która rozpoczyna się od przewidywania celów szczepionki poprzez analizę informatyczną sekwencji genomu. Vaxign (http://www.violinet.org/vaxign) to pierwszy internetowy program do projektowania szczepionek oparty na odwrotnej wakcynologii. W tym badaniu wykorzystaliśmy Vaxign do analizy 52 genomów genomów herpeswirusów, w tym 3 genomów HSV-1, jednego genomu HSV-2, 8 innych genomów ludzkiego genomów ludzkich herpeswirusów i 40 genomów herpeswirusów innych niż ludzkie. Genom szczepu HSV-1 17 który zawiera 77 białek, został wykorzystany jako genom nasienny. Te 77 białek są konserwowane w dwóch innych szczepach HSV-1 (szczep F i szczep H129). Dwa glikoproteiny otoczkowe gJ i gG nie mają ortologów w HSV-2 lub 8 innych ludzkich herpeswirusach. ludzkich herpeswirusów. Siedem białek HSV-1 (w tym gJ i gG) nie ma ortologów we wszystkich 40 herpeswirusach innych niż ludzkie. Dziewiętnaście białek jest konserwowanych we wszystkich ludzkich herpeswirusów, w tym białko rusztowania kapsydu UL26.5 (NP_044628.1). Jako jako jedyne białko HSV-1, które może być adhezyną, UL26.5 jest obiecującym celem szczepionki. obiecującym celem szczepionki. Epitopy MHC klasy I i II zostały przewidziane przez program Vaxign Vaxitop i programy przewidywania IEDB, które zostały niedawno zainstalowane i w Vaxign. Nasza analiza porównawcza wykazała, że oba programy zidentyfikowały w dużej mierze te same najlepsze epitopy, ale także niektóre pozytywne wyniki przewidywane z jednego programu mogą nie być pozytywne z innego programu. Ogólnie, Nasza prognoza obliczeniowa Vaxign dostarcza wielu obiecujących kandydatów do racjonalnego rozwoju szczepionek przeciwko HSV. Metoda jest ogólna i może być również stosowana do przewidywania innych celów szczepionek wirusowych. --- Brucella jest czynnikiem etiologicznym brucelozy, jednej z najczęstszych i szeroko rozpowszechnionych chorób odzwierzęcych. szeroko rozpowszechnionych chorób odzwierzęcych. Jej wysoce zakaźny charakter podstępne, ogólnoustrojowe, przewlekłe, wyniszczające aspekty choroby i brak zatwierdzonej szczepionki do stosowania u ludzi w Stanach Zjednoczonych to cechy, które sprawiają, że Brucella stanowi realne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Jedną z głównych przeszkód w rozwoju rozwoju szczepionki jest identyfikacja odpowiednich antygenów. Aby zidentyfikować antygenów, które mogłyby być potencjalnie wykorzystane w szczepionce, opisujemy wieloetapowe podejście do wyboru antygenów. wieloetapowe podejście do selekcji antygenów. Początkowo wykorzystaliśmy algorytm (Vaxign) do przewidywania ORF kodujących białka błony zewnętrznej z determinantami antygenowymi. Różnicowa ekspresja genów podczas ostrej infekcji i opublikowane dowody na rolę wirulencji roli w wirulencji zostały wykorzystane jako kryteria selekcji kandydatów na antygeny antygenów, które wynikały z przewidywania in silico. Podejście to zaowocowało Identyfikacja dziewięciu białek błony zewnętrznej Brucella melitensis, z których 5 z których 5 poddano rekombinacji i wykorzystano do walidacji. Omp22 i Hia miały najwyższe wyniki in silico dla prawdopodobieństwa adhezyny, a także nadawały inwazyjność zdolność do inwazji E. coli z nadekspresją rekombinowanych białek. Z wyjątkiem FlgK u kozy, wszystkie białka reagowały z połączonymi surowicami od narażonych kóz, myszy, i ludzi. BtuB, Hia i FlgK stymulowały mieszaną odpowiedź Th1-Th2 w splenocytach splenocytach immunizowanych myszy, podczas gdy BtuB i Hia wywoływały uwalnianie NO z splenocytów myszy immunizowanych S19. Wyniki potwierdzają możliwość zastosowania do identyfikacji antygenów o właściwościach immunogennych i inwazyjnych. właściwościach immunogennych i inwazyjnych. Badania mające na celu ocenę immunogenności i skuteczności ochronnej poszczególnych białek u myszy są obecnie w toku. --- Leiszmanioza to grupa chorób o spektrum objawów klinicznych, od owrzodzeń skórnych po leiszmaniozę trzewną. od owrzodzeń skórnych po leiszmaniozę trzewną, która jest skutkiem ukąszenia człowieka przez zakażoną muchę piaskową. Próby opracowania skutecznej szczepionki okazały się wykonalne, ale żadna szczepionka nie jest obecnie stosowana klinicznie. Niniejsze badanie przyjmuje podejście Reverse Vaccinology w celu zidentyfikowania wspólnych kandydatów na szczepionkę z obu wysoce patogennych gatunków Leishmania major i Leishmania infantum. Porównano całkowity proteom obu gatunków, aby zidentyfikować wspólne białek, które są następnie wykorzystywane do lokalizacji subkomórkowej i przewidywania przewidywania helis transmembranowych. Białka błony plazmatycznej posiadające tylko jedną najpierw zidentyfikowano i przeanalizowano białka błony plazmatycznej posiadające tylko jedną helisę transmembranową, które nie są homologiczne u ludzi i myszy w celu uniknięcia mimikry molekularnej z innymi białkami. Wybrane białka przeanalizowano pod kątem ich skuteczności wiązania zarówno z głównym allelami głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i klasy II. W rezultacie, 19 potencjalnych epitopów jest badanych w tym badaniu przy użyciu różnych podejść, które można dalej zweryfikować poprzez eksperymenty in vivo na modelach zwierzęcych kompatybilnych z MHC modelach zwierzęcych zgodnych z MHC. Badanie to pokazuje, że podejście odwróconej wakcynologii ma potencjał w odkrywaniu różnych antygenów immunogennych na podstawie analizy in silico genomu lub proteomu patogenu zamiast hodowania całego organizmu konwencjonalnymi metodami. konwencjonalnymi metodami.
Przeciwko jakim organizmom stosowano odwrotną wakcynologię?
Odwrócona wakcynologia (RV) została po raz pierwszy zastosowana do serogrupy B Neisseria meningitidis. Praca ta zainspirowała dalsze badania nad innymi patogenami w ten sam sposób: Porphyromonas gingivalis, Streptococcus pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bacillus anthracis, paciorkowce grupy B, Helicobacter pylori i Mycobacterium tuberculosis. Jeśli chodzi o organizmy atakujące zwierzęta, RV został zastosowany do projektowania szczepionek przeciwko Theileria parva, Brachyspira hyodysenteriae, Echinococcus granulosus, Ehrlichia ruminantium, Leishmania spp, Rhipicephalus microplus i Brucella melitensis.