Pomijanie eksonów okazało się skuteczną strategią w terapii genowej dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). terapii genowej dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD): racjonalne jest przekształcenie ciężkich form Duchenne'a w łagodniejsze formy Beckera. Tutaj pokazujemy wybór konstruktów U1 snRNA-antysensownych konstruktów zdolnych do skutecznego ratowania syntezy dystrofiny na tle genetycznym Δ44 Duchenne'a, poprzez pominięcie eksonu 45; Co więcej, wykazujemy, że powstała dystrofina jest w stanie odzyskać czas ekspresji markerów miogennych, do relokalizacji neuronalnej syntazy tlenku azotu (nNOS) i ratować ekspresję miRNA, które wcześniej okazały się wrażliwe na szlak Dystrofina-nNOS-HDAC2. Mutacje Beckera wykazują różne fenotypy, prawdopodobnie w zależności od tego, czy krótsze białko jest w stanie odtworzyć szeroki zakres funkcji typu dzikiego. Wśród nich, wydajne kompleksu białkowego związanego z dystrofiną (DAPC) i lokalizacja nNOS. są ważne. Porównując różne delecje Beckera wykazujemy korelację między zdolnością zmutowanej dystrofiny do relokalizacji nNOS a poziomami ekspresji dwóch miRNA, miR-1 i miR29c, o których wiadomo, że są zaangażowane w w homeostazę mięśni i są kontrolowane przez szlak Dys-nNOS-HDAC2. --- Małe jądrowe RNA U1 (U1 snRNA) jako składnik głównego spliceosomu zależnego od U2 spliceosomu rozpoznaje miejsca splicingu 5' (5'ss) zawierające GT jako kanoniczny dinukleotyd w pozycjach intronowych +1 i +. kanoniczny dinukleotyd w pozycjach intronowych +1 i +2. Mutacja germinalna c.165+1G>T w 5'ss genomu U2. w 5'ss egzonu 2 genu niedokrwistości Fanconiego C (FANCC), powszechnie zapobiegająca prawidłowemu splicingowi została zidentyfikowana u dziewięciu pacjentów z FA z trzech rodowodów. Analiza RT-PCR endogennego wzoru splicingu mRNA FANCC fibroblastów pochodzących od pacjentów ujawniła nieprawidłowe przetwarzanie mRNA, ale zaskakująco również prawidłowe splicing w dinukleotydzie TT, aczkolwiek z niższą wydajnością. wydajnością. W konsekwencji skutkowało to niskimi poziomami prawidłowo splicowanego transkryptu transkryptu i niewielkimi poziomami normalnego posttranslacyjnie przetworzonego białka FANCD2 białko, wskazując, że ten naturalnie występujący splicing TT może przyczyniać się do łagodniejszych objawów klinicznych choroby u tych pacjentów. Analiza funkcjonalna tego FANCC 5'ss w obrębie reporterów splicingu ujawniła, że zarówno niekanoniczny dinukleotyd TT, jak i kontekst genomowy FANCC były wymagane do prawidłowego splicingu w tym zmutowanym 5'ss. Wreszcie, zastosowanie wektorów lentiwirusowych jako systemu dostarczania w celu wprowadzenia kaset ekspresyjnych dla U1 snRNA dostosowanych do TT do pierwotnych fibroblastów pacjentów z FANCC pozwoliło na korektę zatrzymania cyklu komórkowego G2 wywołanego uszkodzeniem DNA w tych komórkach, a tym samym stanowiąc alternatywne podejście ukierunkowane na transkrypcję w terapii genetycznej dziedzicznych mutacji miejsca splicingu. --- Znaczna część mutacji powodujących choroby wpływa na splicing prekursorowego mRNA splicing, indukując pominięcie eksonu z dojrzałego transkryptu. Używając F9 exon 5, CFTR exon 12 i SMN2 exon 7, scharakteryzowaliśmy naturalne mutacje związane z pomijaniem eksonów w hemofilii B, mukowiscydozie i rdzeniowym zaniku mięśni (SMA). mięśni (SMA), odpowiednio, oraz terapeutyczne ratowanie splicingu przez przy użyciu małego jądrowego RNA (snRNA) U1. W systemach ekspresji minigenu, ładowanie U1 przez komplementarność do normalnych lub zmutowanych miejsc splicingowych dawcy (5'ss) skorygowało pomijanie eksonów spowodowane mutacjami na szlaku polipirymidynowym miejsca splicingu akceptora, w konsensusie 5'ss lub w egzonowych elementach regulacyjnych elementach regulacyjnych. Aby poprawić specyficzność i zmniejszyć potencjalne efekty poza celem, opracowaliśmy opracowane warianty U1 snRNA ukierunkowane na nieskonserwowane sekwencje intronowe poniżej 5'ss. Dla każdego systemu genów zidentyfikowaliśmy specyficzne dla egzonu U1 U1 (ExSpeU1) zdolny do ratowania splicingu upośledzonego przez różne typy mutacji. mutacje. Poprzez konstrukty cDNA kompatybilne ze splicingiem wykazaliśmy, że ExSpeU1-pośredniczona korekta splicingu kilku mutacji F9 skutkuje całkowitym przywrócenie poziomów wydzielanego funkcjonalnego czynnika IX. Ponadto, dwa ExSpeU1s dla SMA poprawiły splicing eksonu 7 SMN w kontekście chromosomalnym normalnych komórek. Proponujemy ExSpeU1s jako nową strategię terapeutyczną w celu skorygowania, w kilku ludzkich zaburzeniach różnych typów mutacji splicingowych związanych z wadliwą definicją eksonu Definicja. --- Zespół Bardeta-Biedla (BBS) jest wieloukładowym zaburzeniem spowodowanym wadami rzęsek. Do tej pory z chorobą powiązano mutacje w 15 genach, a BBS1 jest najczęściej najczęściej występuje u pacjentów z BBS. Zastosowanie mapowania homozygotyczności w dużej spokrewnionej rodzinie pozwoliło nam zidentyfikować mutację miejsca dawcy splotu (SD) c.479G>A w eksonie 5 BBS1. Klinicznie dotknięci członkowie rodziny wykazują objawy barwnikowego zapalenia siatkówki (RP), ale brakuje im innych pierwotnych cech, które wyraźnie wspierałyby diagnozę BBS. Zgodnie z tym wyjątkowo łagodnym fenotypem związanym z BBS1, nie wykryliśmy oczywistych wad rzęskowych w komórkach komórkach pochodzących od pacjentów. SD są wiązane przez mały jądrowy RNA U1 (U1), proces który inicjuje rozpoznawanie eksonów podczas splicingu. Opisana tutaj mutacja zakłóca wiązanie U1 i indukuje nieprawidłowy splicing BBS1. Dla podejścia terapeutycznego podejście terapeutyczne, dostosowaliśmy sekwencję U1, aby zwiększyć jego komplementarność do zmutowanego komplementarność do zmutowanego SD. Leczenie lentiwirusowe fibroblastów fibroblastów z zaadaptowanym U1 częściowo skorygowanym nieprawidłowym splicingiem endogennie wyrażonych transkryptów BBS1. Ten efekt terapeutyczny był zależny od dawki. Nasze wyniki pokazują, że adaptacja U1 może korygować patogenne skutki mutacji miejsca dawcy splicingu i sugerują wysoki potencjał dla terapii genowej. --- Zgłaszamy zastosowanie U1 snRNA jako wektora do stabilnej ekspresji cząsteczek antysensownych przeciwko cząsteczek antysensownych przeciwko złączom splicingowym specyficznych eksonów dystrofiny. Jednoniciowy koniec 5' U1 można zastąpić niepowiązanymi sekwencjami o długości do 50 nukleotydów. o długości do 50 nukleotydów bez wpływu zarówno na stabilność, jak i zdolność do łączenia się w cząsteczki snRNP. Skuteczne pomijanie eksonów uzyskano dla różnych eksonów dystrofiny przez sekwencje antysensowne przeciwko 5' i 3' miejscom splicingu samodzielnie lub w połączeniu z sekwencjami ESE. Skuteczność tych cząsteczek została badano zarówno w systemach in vitro, jak i na zwierzętach. W obu przypadkach chimeryczne cząsteczki cząsteczki, dostarczane jako część wektorów lentiwirusowych lub AAV (De Angelis i in. Proc Natl Acad Sci USA 99:9456-9461, 2002; Denti et al. Proc Natl Acad Sci USA 103: 3758-3763, 2006; Denti et al. Hum Gene Ther 17: 565-743, 2006; Denti et al. Hum Gene Ther 19: 601-608, 2008; Incitti et al. Mol Ther 18: 1675-1682, 2010), zapewniały wysoką aktywność pomijania i skuteczne ratowanie syntezy dystrofiny. Co więcej, cząsteczki U1-antisense, dostarczane myszom poprzez ogólnoustrojowe wstrzyknięcie rekombinowanych wirusów AAV, wykazywały transdukcję całego ciała, długoterminową ekspresję, ratowanie dystrofiny, a także korzyści morfologiczne i funkcjonalne (Denti et al. Hum Gene Ther 19: 601-608, 2008). W niniejszym rozdziale przedstawiamy metody wytwarzania kaset ekspresyjnych U1-antysensownych w szkielecie konstruktów lentiwirusowych i testowania ich aktywności zarówno w mioblastach pochodzących od pacjentów, jak i w pacjentów, jak również w fibroblastach przeprogramowanych do różnicowania mięśni. --- Modulacja splicingu precesorowego RNA, w której pośredniczy antysens, stanowi nową strategię terapeutyczną strategię terapeutyczną dla kilku rodzajów patologii, takich jak zaburzenia genetyczne, nowotwory i choroby zakaźne. Antysensowne oligonukleotydy zaprojektowane do wiązania się z określonymi cząsteczkami z określonymi cząsteczkami mRNA są aktywnie rozwijane od ponad 20 lat jako w celu modulowania wzorców splicingu lub hamowania translacji białek. translację białek. Ostatnio, małe jądrowe RNA, takie jak U7 lub U1 małe jądrowe RNA zostały wykorzystane do przenoszenia sekwencji antysensownych, oferując zaletę długotrwałego długotrwały efekt, gdy są dostarczane do komórek za pomocą wektorów wirusowych. Wcześniej wykazaliśmy potencjał terapeutyczny U7snRNA ukierunkowanego na mRNA dystrofiny jako w leczeniu dystrofii mięśniowej Duchenne'a. W szczególności wykazaliśmy, że bifunkcyjne U7 snRNA zawierające motywy wyciszające indukują całkowite pominięcie eksonu 51, a tym samym przywracają ekspresję dystrofiny w komórkach pacjentów z DMD do poziomu bliskiego do poziomu zbliżonego do dzikiego. Te nowe konstrukty są bardzo obiecujące dla optymalizacji terapeutycznego pomijania eksonów w DMD, ale także oferują potężne i wszechstronne narzędzia do modulowania splicingu pre-mRNA w szerokim zakresie zastosowań. Tutaj zarys projektu tych konstruktów U7snRNA w celu osiągnięcia wydajnego exon-skipping i opisujemy metody oceny skuteczności takich konstruktów U7snRNA in vitro na przykładzie genu dystrofiny. --- Opisujemy metodę wyciszania genów, która wykorzystuje odmienny mechanizm działania od mechanizmów antysensownych i interferencji RNA. Adaptory U1 są dwufunkcyjnymi oligonukleotydy z "domeną docelową" komplementarną do miejsca w końcowym eksonie docelowym eksonie genu i "domeną U1", która wiąże się z małym jądrowym RNA U1 składnikiem małej jądrowej rybonukleoproteiny U1 (U1 snRNP) czynnika splicingowego. Wiązanie U1 snRNP do docelowego pre-mRNA hamuje dodawanie ogona poli(A), powodując degradację tego gatunku RNA w jądrze. Adaptory U1 mogą hamować zarówno endogenne, jak i reporterowe geny w sposób specyficzny dla sekwencji. Porównanie Adaptory U1 z małym interferującym RNA (siRNA) przy użyciu mikromacierzy w całym genomie analiza wskazuje, że adaptory U1 mają ograniczone efekty poza celem i nie mają wykrywalnego negatywnego wpływu na splicing. Co więcej, celowanie w ten sam gen z wieloma adaptorami U1 lub z adaptorem U1 i siRNA silnie wzmacnia wyciszanie genu wyciszanie genów.
Jak można wykorzystać małe jądrowe RNA U1 w terapii?
Do tej pory opracowano dwa główne rodzaje strategii terapeutycznych wykorzystujących małe jądrowe RNA (snRNA) U1: 1) Produkcja wadliwego, ale częściowo funkcjonalnego białka za pomocą pomijania eksonów poprzez modulację splicingu pre-mRNA oraz 2) Korekta patogennych skutków mutacji miejsca donorowego splicingu za pomocą U1 snRNA dostosowanego do wadliwego wariantu.