Opisujemy ulepszoną metodę wykrywania niedoboru hydrolazy kwasowej, alfa-1,4-glukozydazy w leukocytach, defektu enzymu w chorobie spichrzeniowej glikogenu typu II (choroba Pompego). glikogenu typu II (choroba Pompego). Procedura wymaga mniejszych objętości krwi i krótszego czasu niż poprzednie metody. Test obejmuje oddzielenie leukocytów metodą Petera dla beta-glukozydazy i modyfikację fluorometrycznej metody Salafsky'ego i Nadlera dla alfa-glukozydazy. --- Choroba Pompego (choroba spichrzeniowa glikogenu II) jest spowodowana mutacjami w genie alfa-glukozydazy kwasowej. alfa-glukozydazy. Najczęstszą postacią choroby jest szybko postępujące glikogenu, szczególnie w mięśniach, co prowadzi do głębokiego osłabienia, niewydolności serca i śmierci w wieku 2 lat. Chociaż zwykle uważa się ją za za chorobę mięśni, odkładanie glikogenu występuje również w OUN. Oceniliśmy progresję nieprawidłowości neuropatologicznych i behawioralnych w mysim modelu choroby Pompego (6neo/6neo), który wykazuje wiele cech ludzkiej choroby. Homozygotyczne zmutowane myszy przechowują nadmiar glikogenu w dużych neuronach tyłomózgowia, rdzenia kręgowego i zwojów czuciowych w wieku 1 miesiąca; akumulacje następnie rozprzestrzeniają się stopniowo w wielu typach komórek OUN. "Srebrna degeneracja" i Fluoro-Jade C ujawniły ciężką degenerację w zakończeniach aksonów pierwotnych neuronów neuronów czuciowych w wieku od 3 do 9 miesięcy. Nieprawidłowościom tym towarzyszyły postępujące upośledzenie behawioralne w testach rotorod, zwisania na drucie i błędu stopy testach. Rozległe zmiany neuropatologiczne w tym modelu sugerują, że że terapia zaburzeń mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego poprzez ogólnoustrojową enzymatyczną terapię zastępczą może nie być wystarczająca do odwrócenia deficytów funkcjonalnych spowodowanych magazynowaniem glikogenu w OUN glikogenu w ośrodkowym układzie nerwowym, szczególnie w przypadku wczesnej, szybko postępującej choroby. Lepsze zrozumienie podstaw objawów klinicznych jest potrzebne, aby skorelować patologię patologii OUN z objawami choroby Pompego. --- Choroba Pompego jest autosomalną recesywną chorobą genetyczną charakteryzującą się niedoborem enzymu odpowiedzialnego za degradację glikogenu lizosomalnego (kwaśnej α-glukozydaza (GAA)). Dysfunkcja serca i osłabienie mięśni oddechowych są podstawowe cechy tego zaburzenia. Aby złagodzić postępujące i szybkie akumulację glikogenu skutkującą dysfunkcją układu sercowo-oddechowego, dorosłym myszom Gaa (-/-) podano pojedynczą ogólnoustrojową iniekcję rAAV2/9-DES-hGAA (AAV9-DES) lub dwumiesięczne zastrzyki rekombinowanego ludzkiego GAA (enzymatyczna terapia zastępcza (ERT)). (enzymatyczna terapia zastępcza (ERT)). Ocenę czynności i morfologii serca mierzono 1 i 3 miesiące po rozpoczęciu leczenia, podczas gdy pletyzmografia całego ciała i funkcję skurczową przepony oceniano 3 miesiące po leczeniu we wszystkich grupach. wszystkich grupach. Zwierzęta Gaa (-/-) otrzymujące AAV9-DES lub ERT wykazały znaczną poprawę czynności serca i kurczliwości przepony w porównaniu do zwierząt kontrolnych. Leczenie AAV9-DES spowodowało znaczące zmniejszenie wymiaru serca (końcowo-rozkurczowa masa lewej komory masa/gram mokrej masy; EDMc) po 3 miesiącach od wstrzyknięcia. Ani terapia AAV, ani ERT nie zmieniały wentylacji minutowej podczas spokojnego oddychania (eupnea). Jednakże, częstotliwość oddychania i czas wydechu uległy znacznej poprawie u zwierząt AAV9-DES zwierząt. Wyniki te wskazują, że ogólnoustrojowe dostarczanie obu strategii poprawia funkcji serca, ale sam AAV9-DES poprawia parametry oddechowe po 3 miesiącach po leczeniu w mysim modelu choroby Pompego. --- CEL: Dziecięca choroba Pompego jest spowodowana niedoborem kwasu lizosomalnego alfa-glukozydazy. Próby z rekombinowanym ludzkim enzymem alfa-glukozydazy kwasu (ERT) wykazują zmniejszenie masy lewej komory serca i poprawę jej funkcji. funkcji. Oceniliśmy 24-godzinne ambulatoryjne elektrokardiogramy (EKG) na początku badania i podczas ERT u pacjentów z dziecięcą chorobą Pompego. METODY: Oceniono trzydzieści dwa ambulatoryjne EKG u 12 pacjentów z dziecięcą chorobą Pompego w latach 2003-2005. Mediana wieku pacjentów wynosiła 7,4 miesięcy (2,9-37,8 miesięcy) w momencie rozpoczęcia ERT. Ambulatoryjne zapisy EKG były w określonych odstępach czasu i analizowano. WYNIKI: Istotna ektopia występowała u 2 z 12 pacjentów. Pacjent 1 miał 211 i 229 przedwczesnych skurczów komorowych (0,2% uderzeń serca) na początku i po 11,5 tygodniach ERT. odpowiednio po 11,5 tygodniach ERT. Pacjent 2 miał 10 445 przedwczesnych skurczów komorowych (6,7% uderzeń serca). przedwczesnych skurczów komorowych (6,7% uderzeń serca) po 11 tygodniach terapii. WNIOSKI: W dziecięcej chorobie Pompego może występować wcześniejsza ektopia; może się ona również rozwinąć w trakcie ERT. może również rozwinąć się w trakcie ERT. Dlatego rutynowe monitorowanie pacjentów za pomocą 24-godzinnego ambulatoryjnego EKG. Okresy największego ryzyka mogą występować na początku ERT, kiedy następuje znaczny spadek masy lewej komory i początkowy spadek frakcji wyrzutowej. i początkowy spadek frakcji wyrzutowej. --- Choroba Pompego jest ogólnoustrojowym zaburzeniem metabolicznym charakteryzującym się brakiem glukozydazy alfa-kwasowej (GAA), co skutkuje wszechobecną akumulacją glikogenu w lizosomach. glikogenu w lizosomach. Dysfunkcja oddechowa i ambulatoryjna są głównymi cechami u pacjentów z chorobą Pompego. pacjentów z chorobą Pompego, jednak mechanizm definiujący rozwój osłabienia mięśni jest obecnie mięśni jest obecnie niejasny. Transgeniczne modele zwierzęce choroby Pompego odzwierciedlające fenotyp pacjenta są nieocenione w badaniach mechanistycznych i terapeutycznych. terapeutycznych. Tutaj wykazujemy znaczące zmiany patologiczne w połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) przepony i mięśnia piszczelowego przedniego jako jako główne cechy patologii choroby u myszy z nokautem Gaa. Defekty postsynaptyczne wady, w tym zwiększony obszar płytki motorycznej i fragmentacja, były łatwo obserwowane u myszy Gaa(-/-), ale nie u myszy typu dzikiego. Presynaptyczne zmiany neuropatyczne były również widoczne, o czym świadczy znaczne obniżenie poziomów białek neurofilamentowych białek neurofilamentowych oraz zmiany średnicy włókien aksonalnych i mieliny w obrębie nerwu kulszowego i przeponowego. Nasze dane sugerują, że utrata Integralność NMJ jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do spadku funkcji oddechowych i i funkcji ambulatoryjnych w Pompe i wynika zarówno z patologii pre-, jak i postsynaptycznej. patologii. Obserwacje te podkreślają znaczenie ogólnoustrojowej korekty fenotypu a konkretnie przywrócenie GAA do mięśni szkieletowych i układu nerwowego w leczeniu choroby Pompego. w leczeniu choroby Pompego. --- Chociaż wiele zaburzeń lizosomalnych jest korygowanych przez niewielką ilość brakującego enzymu. enzymu, ogólnie przyjęto, że 20-30% normalnej aktywności kwaśnej alfa-glukozydazy (GAA), zapewnione przez gen lub enzymatyczną terapię zastępczą enzymatyczną, byłoby wymagane do odwrócenia miopatii i kardiomiopatii w chorobie Pompego. Pompego. Zajęliśmy się kwestią odwracalności choroby w modelu myszy Gaa(-/-). Stworzyliśmy linie transgeniczne wyrażające ludzkie GAA w mięśniach mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym myszy Gaa(-/-) i włączyliśmy transgen na różnych etapach progresji choroby przy użyciu systemu kontrolowanego tetracykliną tetracykliny. Wykazaliśmy, że poziomy 20-30% normalnej aktywności są rzeczywiście wystarczające do usunięcia glikogenu w sercu młodych myszy Gaa(-/-), ale nie u starszych myszy ze znacznie wyższym poziomem glikogenu. starszych myszy ze znacznie wyższym obciążeniem glikogenem. Jednak w mięśniach szkieletowych mięśniach szkieletowych - głównym narządzie dotkniętym niemowlętami i łagodniejszymi, późnymi wariantami w u ludzi - indukcja ekspresji GAA u młodych myszy Gaa(-/-) do poziomów znacznie przekraczających wartości dzikiego typu nie spowodowała pełnej korekty fenotypowej, a niektóre włókna mięśniowe włókna mięśniowe wykazywały niewielki lub żaden klirens glikogenu. Wyniki pokazują że całkowite odwrócenie patologii w mięśniach szkieletowych lub mięśniu sercowym mięśnia sercowego będzie wymagało znacznie większej ilości enzymu niż wcześniej oczekiwano lub innego podejścia. podejścia. --- Choroba Pompego jest lizosomalną chorobą spichrzeniową (LSD) spowodowaną mutacjami w genie kodującym kwaśną alfa-glukozydazę (GAA). genie kodującym kwaśną alfa-glukozydazę (GAA). Niedawno wykazano, że wykazano, że małocząsteczkowe chaperony farmakologiczne zwiększają stabilność białka i zmutowanych enzymów lizosomalnych i stały się nową strategią terapeutyczną w leczeniu LS. strategia terapeutyczna w leczeniu LSD. W tym badaniu scharakteryzowaliśmy farmakologiczny chaperon 1-deoksynojirimycynę (DNJ) na 76 różnych mutantach form GAA zidentyfikowanych w chorobie Pompego. DNJ znacząco zwiększył aktywność enzymu aktywność enzymu i poziom białka dla 16 różnych mutantów GAA w fibroblastach pochodzących od pacjenta fibroblastach i przejściowo transfekowanych komórkach COS-7. Dodatkowo DNJ zwiększył przetwarzanie tych mutantów GAA do ich dojrzałych form lizosomalnych, sugerując ułatwiony transport przez szlak wydzielniczy. Badania mikroskopii immunofluorescencyjnej wykazały zwiększoną kolokalizację GAA z markerem lizosomalnym LAMP2 po inkubacji z DNJ, potwierdzając zwiększone transport lizosomalny. Wreszcie, model strukturalny GAA został skonstruowany w oparciu o eukariotycznej glukozydazy maltaza-glukoamylaza. Zmutowane reszty zidentyfikowane w responsywnych formach GAA znajdują się w większości domen strukturalnych domen strukturalnych, przy czym połowa tych reszt znajduje się w dwóch krótkich regionach w obrębie domeny katalitycznej. Podsumowując, dane te wspierają dalszą ocenę DNJ jako potencjalnego leczenia choroby Pompego u pacjentów, którzy wyrażają reagujące formy GAA. --- Choroba Pompego jest dziedziczną lizosomalną chorobą spichrzeniową, która wynika z niedoboru aktywności α-glukozydazy kwaśnej (GAA) z powodu mutacji w genie GAA genie. Choroba Pompego charakteryzuje się akumulacją glikogenu lizosomalnego głównie w sercu i mięśniach szkieletowych, co prowadzi do postępującego osłabienia mięśni. osłabienia mięśni. Wcześniej wykazaliśmy, że mała cząsteczka farmakologicznego chaperon AT2220 (chlorowodorek 1-deoksynojirimycyny, chlorowodorek duvoglustatu) wiąże i stabilizuje dziki typ, jak również wiele zmutowanych form GAA, i może prowadzić do wyższych poziomów komórkowych GAA. W tym badaniu zbadaliśmy wpływ AT2220 na zmutowany GAA, in vitro i in vivo, z głównym naciskiem na retikulum endoplazmatycznym (ER) - zachowanej zmutowanej formie P545L ludzkiego GAA (P545L GAA). AT2220 zwiększył specyficzną aktywność P545L GAA zarówno w stosunku do naturalnego (glikogen) i sztucznych substratów in vitro. Inkubacja z AT2220 również zwiększyła eksport ER, dostarczanie lizosomalne, przetwarzanie proteolityczne i stabilność P545L GAA. W nowym transgenicznym mysim modelu choroby Pompego, który wyraża ludzki P545L na znokautowanym tle Gaa (Tg / KO) i charakteryzuje się zmniejszoną aktywnością GAA i podwyższonym poziomem glikogenu w tkankach związanych z chorobą tkanek, codzienne doustne podawanie AT2220 przez 4 tygodnie spowodowało znaczny i zależny od dawki wzrost dojrzałych lizosomalnych izoform GAA i aktywności GAA w sercu i mięśniach szkieletowych. Co ważne, doustne podawanie AT2220 również spowodowało również znaczną redukcję glikogenu w tkankach związanych z chorobą. W porównaniu do codziennego podawania, mniej częste podawanie AT2220, w tym powtarzane cykle cykle 4 lub 5 dni z AT2220, a następnie 3 lub 2 dni bez leku, skutkowało jeszcze większą redukcją glikogenu. Łącznie, te dane wskazują, że AT2220 zwiększa specyficzną aktywność, handel i lizosomalną stabilność P545L GAA, prowadzi do zwiększonego poziomu dojrzałego GAA w lizosomach i promuje redukcję glikogenu in situ. Jako taki, AT2220 może uzasadniać dalszą ocenę jako leczenie choroby Pompego. --- TŁO: Choroba Pompego jest autosomalnym recesywnym zaburzeniem metabolizmu glikogenu. glikogenu, które charakteryzuje się niedoborem kwasu lizosomalnego alfa-glukozydazy. Enzymatyczna terapia zastępcza dla dziecięcych i młodzieńczych postaci choroby postaci choroby Pompego jest obecnie poddawana badaniom klinicznym. Wczesna diagnoza przed wystąpieniem nieodwracalnej patologii jest uważana za krytyczną dla maksymalnej skuteczności obecnych i proponowanych terapii. W przypadku braku wywiadu rodzinnego, przedobjawowe wykrycie tych zaburzeń można idealnie osiągnąć poprzez program badań przesiewowych noworodków. program badań przesiewowych noworodków. Obecnie kliniczne rozpoznanie choroby Pompego jest potwierdzona przez wirtualny brak, w okresie niemowlęcym, lub znaczną redukcję, w wieku młodzieńczym i dorosłym, aktywności kwaśnej alfa-glukozydazy w biopsjach mięśni i hodowanych fibroblastach. w mięśniach i hodowanych fibroblastach. Testy te są inwazyjne i nie nadają się do badań przesiewowych na dużą skalę. METODY: Czuły test aktywności enzymatycznej z wychwytem immunologicznym do pomiaru białka kwaśnej alfa-glukozydazy został opracowany i wykorzystany do określenia aktywności tego enzymu w wysuszonych plamkach krwi od noworodków i dorosłych osób kontrolnych, osób dotkniętych chorobą Pompego i obligatoryjnych heterozygot. WYNIKI: Osoby dotknięte chorobą Pompego wykazały prawie całkowity brak kwaśnej alfa-glukozydazy alfa-glukozydazy w plamkach krwi. Test wykazał czułość i czułość i swoistość 100% dla identyfikacji osób dotkniętych chorobą Pompego. WNIOSKI: Oznaczanie aktywności kwaśnej alfa-glukozydazy w wysuszonych plamkach krwi jest użytecznym, nieinwazyjnym testem diagnostycznym do identyfikacji choroby Pompego. Pompego. Po dalszej walidacji procedura ta mogłaby zostać dostosowana do użytku z plamek krwi zebranych w programach badań przesiewowych noworodków. --- Aby wyjaśnić mechanizm leżący u podstaw defektów transportu i przetwarzania z punktu widzenia punktu widzenia fałdowania enzymu, skonstruowaliśmy trójwymiarowe modele ludzkiej kwaśnej alfa-glukozydazy obejmujące 27 istotnych podstawień aminokwasów za pomocą modelowania homologicznego. za pomocą modelowania homologicznego. Następnie określiliśmy w każdym oddzielnym przypadku liczbę atomów, wartość odległości pierwiastek-średnia-kwadrat i pole powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika. wartość powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika. Analiza wykazała, że substytucje aminokwasów powodujące defekt przetwarzania lub transportu odpowiedzialny za chorobę Pompego były szeroko rozprzestrzenione we wszystkich pięciu domenach składających się na kwaśną alfa-glukozydazy. Były one rozmieszczone od rdzenia do powierzchni cząsteczki enzymu. a przewidywane zmiany strukturalne wahały się od dużych do bardzo małych. małych. Wśród zmian strukturalnych szczególną uwagę zwróciliśmy na G377R i G483R. Przewiduje się, że te dwie substytucje powodują zmiany elektrostatyczne w sąsiadujących małych regionach na powierzchni cząsteczki. System kontroli jakości retikulum endoplazmatycznego najwyraźniej wykrywa te bardzo małe zmiany strukturalne zmiany strukturalne i degraduje zmutowany prekursor enzymu (G377R), ale również komórkowy system system sortowania może być wprowadzony w błąd przez te drobne zmiany, w wyniku których prekursor jest wydzielany zamiast być transportowany do lizosomów (G483R). --- Choroba Pompego jest spowodowana wrodzonym niedoborem enzymu lizosomalnego kwaśnej alfa-glukozydazy. Nagromadzenie glikogenu lizosomalnego powoduje śmiertelną miopatię i kardiomiopatię. śmiertelną miopatię i kardiomiopatię. Opracowaliśmy enzymatyczną terapię zastępczą opartą na rekombinowanym ludzkim enzymie kwaśnej alfa-glukozydazy ukierunkowanym na narządy narządów poprzez obecność mannozy-6-fosforanu na tym prekursorowym enzymie i receptora mannozo-6-fosforanu obecnego w mięśniach i sercu. Wykorzystując techniki molekularne molekularnych i po szeroko zakrojonej selekcji, komórki jajnika chomika chińskiego zostały które wytwarzały bardzo duże ilości prekursorowej ludzkiej kwaśnej alfa-glukozydazy w pożywce hodowlanej. Ulepszona metoda oczyszczania opracowano ulepszoną metodę oczyszczania tego enzymu prekursorowego z pożywki do hodowli tkankowej. Ten oczyszczony enzym prekursorowy był skutecznie pobierany przez fibroblasty pacjenta i skorygowano za pomocą pojedynczej dawki nagromadzenie glikogenu lizosomalnego przez tydzień. Wreszcie, dożylne podanie rekombinowanego enzymu skorygowało patologię i objawy modelu zwierzęcego. patologię i objawy zwierzęcego modelu tego zaburzenia, kwaśnej alfa-glukozydazy przepiórki japońskiej z niedoborem alfa-glukozydazy. --- Choroba Pompego jest autosomalną recesywną chorobą powodującą zanik mięśni. niedoborem lizosomalnego enzymu alfa-glukozydazy kwasowej. Ze względu na wirtualny alfa-glukozydazy, u pacjentów z klasyczną dziecięcą chorobą Pompego postępującą kardiomiopatią, osłabieniem mięśni szkieletowych i niewydolnością oddechową prowadzącą do śmierci. niewydolność oddechowa prowadząca do śmierci we wczesnym niemowlęctwie. Przedstawiamy wyniki wyniki badania klinicznego fazy II obejmującego dwóch pacjentów z klasyczną Pompego otrzymujących enzymatyczną terapię zastępczą przez okres 48 tygodni w cotygodniowych tygodni poprzez cotygodniowe wlewy. Rekombinowana kwaśna alfa-glukozydaza pochodziła z mleka transgenicznych królików. mleka transgenicznych królików. Bezpieczeństwo oceniano poprzez rejestrowanie zdarzeń niepożądanych podczas gdy skuteczność kliniczną oceniano na podstawie przeżycia bez respiratora, wskaźnika masy lewej komory wskaźnik masy lewej komory, rozwój motoryczny, a także histologiczną i biochemiczną analizę biopsji mięśni. analizę biopsji mięśni. Terapia ta była ogólnie dobrze tolerowana. Nastąpiła nastąpiła ogólna poprawa masy lewej komory, czynności serca, funkcji mięśni szkieletowych i histologicznego wyglądu mięśni szkieletowych. mięśni szkieletowych i wyglądu histologicznego mięśni szkieletowych. --- Choroba Pompego jest lizosomalną chorobą spichrzeniową (LSD) spowodowaną niedoborem enzymu lizosomalnego enzymu lizosomalnego alfa-glukozydazy kwasowej. W kilku LSD inhibitory enzymu zostały były stosowane jako małocząsteczkowe przyzwoitki w celu ułatwienia i zwiększenia translokacji zmutowanego białka z retikulum endoplazmatycznego do lizosomu. Aktywatory enzymów z aktywnością przyzwoitości byłyby jeszcze bardziej pożądane, ponieważ nie hamowałyby enzymu po translokacji i mogłyby wzmacniać aktywność aktywność enzymu, który został pomyślnie przeniesiony. Poniżej przedstawiamy nasze wstępne ustalenia dotyczące nowej serii aktywatorów kwaśnej alfa-glukozydazy. --- Dziecięca choroba Pompego jest śmiertelną genetyczną chorobą mięśni spowodowaną niedoborem niedoborem kwaśnej alfa-glukozydazy, enzymu lizosomalnego rozkładającego glikogen. My skonstruowaliśmy plazmid zawierający skróconą o 5'ludzką kwaśną alfa-glukozydazę cDNA napędzany promotorem wirusa cytomegalii, a także fosfotransferazę aminoglikozydową fosfotransferazę i geny reduktazy dihydrofolianowej. Po transfekcji w komórki jajnika chomika chińskiego z niedoborem reduktazy dihydrofolianowej, selekcja za pomocą Genetyna i amplifikacja metotreksatem, linia komórkowa wytwarzająca wysokie poziomy poziomów alfa-glukozydazy. W ciągu 48 godzin komórki hodowane w pożywce Iscove'a z 5 mM maślanem wydzielały 110-kDa enzym prekursorowy, który do 91 mikrogramów.ml-1 w pożywce (aktywność, > 22,6 mumol.hr-1.ml-1). Enzym ten ma optymalne pH podobne do pH dojrzałej formy ale niższe Vmax i Km dla 4-metylobelliferylo-alfa-D-glukozydu. Jest skutecznie pobierany przez fibroblasty od pacjentów z Pompe, przywracając normalne poziomy kwasowej alfa-glukozydazy i glikogenu. Wychwyt jest blokowany przez 6-fosforan mannozy 6-fosforan mannozy. Po wstrzyknięciu dożylnym obserwuje się wysoki poziom enzymu w sercu i wątrobie. sercu i wątrobie. Obecnie istnieje wydajny system produkcji rekombinowanej ludzkiej alfa-glukozydazy ukierunkowanej na serce i zdolnej do korygowania fibroblastów od pacjentów z chorobą Pompego. --- Charakter zmutowanej kwaśnej alfa-glukozydazy (AAG) w mięśniach badano u 6 pacjentów z chorobą Pompego. pacjentów z chorobą Pompego, składających się z 2 typów: niemowlęcego, dziecięcego i dorosłych. Przeciwciało królicze przeciwko ludzkiej wątrobie AAG przygotowane w niniejszym badaniu potwierdzono jako monospecyficzne za pomocą immunodyfuzji, immunotitracji i metod immunohistochemicznych. metody immunohistochemiczne. Stwierdzono to za pomocą metod immunodyfuzji i enzymatycznej metody immunologiczne wykorzystujące to przeciwciało, że mutacja wytworzyła normalną ilość białka enzymatycznego, ale to ostatnie było formą nieaktywną, co sugeruje strukturalną mutację genu w 5 z 6 przypadków. W pozostałym przypadku typu dziecięcego nie było wykrywalnej ilości białka enzymatycznego, co sugeruje, że mutacja mutacja powoduje zmniejszenie ilości białka enzymu lub syntezę niestabilnego białka enzymu. niestabilnego białka enzymu. Podobnie, aktywność enzymatyczna AAG była znacznie zmniejszona u wszystkich pacjentów, ale aktywność neutralnej alfa-glukozydazy była najmniej zredukowana w typie dorosłym, średnia w typie dziecięcym i najbardziej zredukowana w typie niemowlęcym. typu niemowlęcego. --- Choroba spichrzeniowa glikogenu typu II (GSDII; choroba Pompego lub niedobór kwaśnej maltazy ) jest autosomalnym recesywnym zaburzeniem spowodowanym niedoborem lizosomalnej alfa-glukozydazy alfa-glukozydazy (AalphaGlu) i objawia się głównie osłabieniem mięśni szkieletowych. mięśni szkieletowych. Wady modyfikacji potranslacyjnej i transportu zmutowanego gatunku Zmutowane gatunki AalphaGlu są często spotykane i mogą być potencjalnie korygowane za pomocą terapii z udziałem chaperonów. W niniejszym badaniu przetestowaliśmy tę hipotezę, stosując deoksynojirimycynę i pochodne jako chemiczne chaperony w celu skorygowania niedoboru AalfaGlu w hodowanych fibroblastach od pacjentów z GSDII. Wybrano cztery zmutowane fenotypy: Y455F/Y455F, P545L/P545L, 525del/R600C i D645E/R854X. W przypadku Y455F/Y455F i P545L/P545L, N-(n-butylo)deoksynojirimycyna (NB-DNJ) przywróciła transport, dojrzewanie i aktywność AalphaGlu w sposób zależny od dawki, podczas gdy nie miało to wpływu na enzym referencyjny beta-heksozoaminidazę. NB-DNJ promował eksport z retikulum retikulum endoplazmatycznego (ER) do lizosomów i stabilizował aktywność zmutowanych gatunków AalfaGlu, Y455F i P545L, wewnątrz lizosomów. W długoterminowej hodowli, aktywność AalfaGlu w fibroblastach od pacjentów ze zmutowanymi fenotypami, Y455F i P545L, wewnątrz lizosomów. fenotypami, Y455F/Y455F i P545L/P545L, wzrosła do 14,0- i 7,9-krotnie, odpowiednio w obecności 10mumol/L NB-DNJ. Jednak wpływ NB-DNJ na Y455F/Y455F szybko ustąpił po usunięciu związku. Wnioskujemy, że NB-DNJ działa w niskim stężeniu jako chemiczny przyzwoitek dla niektórych zmutowanych form AalphaGlu, które są uwięzione w ER, słabo transportowane lub nietrwałe w środowisku lizosomalnym. środowisku lizosomalnym. Terapia chemicznym przyzwoitkiem może stworzyć nowe perspektywy dla interwencji terapeutycznej w GSDII. --- Choroba spichrzeniowa glikogenu typu II, choroba Pompego, jest spowodowana niedoborem kwaśnej alfa-D-glukozydazy w lizosomie. Wcześniej odkryliśmy, że kwaśna alfa-D-glukozydaza istniała w fibroblastach skóry i nie było również mRNA w ilości i wielkości u chińskich pacjentów z chorobą Pompego typu dziecięcego na Tajwanie. pacjentów na Tajwanie. Jednak test funkcjonalny kwaśnej alfa-D-glukozydazy tych pacjentów u tych pacjentów wykazała, że jej funkcja enzymatyczna jest wadliwa. W niniejszym badaniu, najpierw zidentyfikowaliśmy miejsce substytucji u czterech chińskich niemowląt z chorobą Pompego, które jest konwersją cytydyny do adenozyny (C1935-->A) na 5' końca eksonu 14, powodując substytucję kwasu glutaminowego na kwas asparaginowy w pozycji pozycji 645 kwaśnej alfa-D-glukozydazy. Ta substytucja została wprowadzona w cDNA typu dzikiego i wyrażono w komórkach COS-1. Podstawienie Asp-645-->Glu spowodowało znaczne zmniejszenie aktywności alfa-D-glukozydazy kwasowej. Po drugie, zgodnie z danymi przesiewowymi u 25 chińskich pacjentów z chorobą Pompego przy użyciu trawienie RT-PCR amplifikowanego specyficznego fragmentu z Aat II, analiza długości fragmentu restrykcyjnego analiza długości fragmentów wykazała, że pacjenci prezentowali pasmo 861 bp, a normalne osoby normalne osoby prezentowały pasma polimorficzne 728 bp i 133 bp. Stwierdziliśmy że częstość występowania zmutowanego allelu wynosi 0,8 u niemowląt z chińską chorobą Pompego i 0 u osób zdrowych. Pompego i 0 u osób zdrowych. Wyniki te wskazują zatem, że mutacja Asp-645-->Glu powoduje dziecięcą postać choroby Pompego jako główną przyczynę u chińskich pacjentów na Tajwanie. u chińskich pacjentów na Tajwanie. --- Niedobór kwaśnej alfa-glukozydazy (GAA) powoduje chorobę Pompego, śmiertelną lizosomalną chorobę spichrzeniową glikogenu. chorobę spichrzeniową glikogenu, na którą obecnie nie ma skutecznego leczenia. My zbadaliśmy proces endocytarny w komórkach z niedoborem ludzkiej rekombinowanej GAA produkowanego w komórkach jajnika chomika chińskiego oraz potencjał GAA z niedoborem przepiórki z niedoborem japońskiej maltazy kwasowej jako model do oceny enzymatycznej terapii zastępczej choroby Pompego. enzymatycznej terapii zastępczej choroby Pompego. Po 24-godzinnej inkubacji z pojedynczą dawką rekombinowanego enzymu, wewnątrzkomórkowe poziomy GAA i glikogenu w ludzkich fibroblastach z niedoborem glikogenu w ludzkich fibroblastach z niedoborem zostały znormalizowane, a korekta ta trwała przez 7 d. Rekombinowany prekursor 110-kD został przetworzony do dojrzałej formy 76-kD w ciągu 24 godzin po absorpcji. po pobraniu. Wewnątrzkomórkowe poziomy GAA w niedoborowych fibroblastach przepiórczych i mioblastach mioblastach zostały podobnie skorygowane do ich średnich normalnych poziomów w ciągu 24 godzin. Istniały różnice w wydajności endocytozy między podfrakcjami enzymu i między różnymi typami komórek. i między różnymi typami komórek. Frakcje z większą proporcją prekursora GAA były endocytowane bardziej efektywnie. Fibroblasty przepiórcze wymagały wyższej dawki, 4200 nmol.h-1.mL-1, aby znormalizować wewnątrzkomórkowe poziomy GAA niż ludzkie fibroblasty, 1290 nmol.h-1.mL-1. fibroblasty, 1290 nmol.h-1.mL-1, podczas gdy pierwotne mioblasty przepiórcze wymagały 2800 nmol.h-1.mL-1. We wszystkich trzech liniach komórkowych endocytowany enzym był zlokalizowany w lizosomach lizosomów w barwieniu immunofluorescencyjnym, a endocytoza była hamowana przez 6-fosforan mannozy (Man-6-P) dodany do pożywki hodowlanej. Pomimo strukturalnych różnice w receptorach Man-6-P między ptakami i ssakami, badania te ilustrują, że endocytoza, w której pośredniczy receptor Man-6-P, jest obecna w komórkach mięśni przepiórczych przepiórczych i wykazują potencjał przepiórek z niedoborem kwaśnej maltazy do testowania enzymatycznej terapii zastępczej choroby Pompego, w której pośredniczy receptor. --- Choroba Pompego jest autosomalnym recesywnym zaburzeniem miopatycznym spowodowanym niedoborem niedoborem lizosomalnej α-glukozydazy kwasowej (GAA). Niedawno wykazaliśmy, że funkcji zmutowanego GAA w fibroblastach pochodzących od pacjenta z chorobą Pompego niosącego mutację c.546G>T jest poprawiana przez leczenie inhibitorem proteasomu bortezomibem, jak również farmakologicznym chaperonem (PC). Jednakże, mutacje GAA reagujące na bortezomib nie są w pełni scharakteryzowane. W tym badaniu, wykazaliśmy wpływ bortezomibu na różne mutacje GAA w fibroblastach pacjentów fibroblastach pacjentów i przejściowo ekspresjonowanych komórkach HEK293T. Bortezomib zwiększał dojrzewanie i resztkową aktywność GAA w fibroblastach pacjentów niosących PC-responsive M519V i PC-unresponsive C647W mutations. Zwiększona kolokalizacja GAA z markerem lizosomalnym LAMP2 zaobserwowano również w fibroblastach pacjentów po leczeniu bortezomibem. Kiedy cztery różne zmutowane GAA, które wykazują różną odpowiedź na PC, były nadeksprymowane w komórkach HEK293T, bortezomib poprawiał w nich aktywność M519V, S529V i C647W (1,3-5,9-krotnie). Te wyniki wskazują, że bortezomib zwiększa aktywność niektórych mutantów GAA niereagujących na PC mutantów GAA, jak również mutantów reagujących na PC.
Czy kwaśna alfa-glukozydaza jest enzymem, którego mutacja powoduje chorobę Pompego?
Choroba Pompego jest autosomalną recesywną chorobą genetyczną charakteryzującą się niedoborem enzymu odpowiedzialnego za degradację lizosomalnego glikogenu (α-glukozydazy kwaśnej (GAA))