Pomyślne uzyskanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSCs) poprzez przez dedyferencjację komórek somatycznych oferuje znaczący potencjał w pokonywaniu przeszkód w dziedzinie chorób układu krążenia. Pochodne hiPSC oferują niesamowity potencjał w zakresie nowych modeli chorób i terapii medycyny regeneracyjnej. niesamowity potencjał dla nowych modeli chorób i terapii medycyny regeneracyjnej. Pozostaje jednak wiele pytań dotyczących optymalnych materiałów wyjściowych i metod i metod umożliwiających bezpieczne, wydajne uzyskiwanie hiPSC odpowiednich do zastosowań klinicznych. klinicznych. Wstępne eksperymenty przeprogramowywania przeprowadzono przy użyciu lentiwirusowych lub retrowirusowych metod dostarczania genów. Niedawno pojawiły się różne metody niewirusowe niewirusowe, które unikają trwałego i losowego wstawiania transgenów. alternatywy. Obejmują one przejściową transfekcję DNA przy użyciu plazmidów lub minikręgów, transdukcję białek lub transfekcję RNA. Ponadto stwierdzono, że kilka Ponadto stwierdzono, że kilka małych cząsteczek znacząco zwiększa wydajność wyprowadzania hiPSC umożliwiając wykorzystanie mniejszej liczby genów podczas indukcji pluripotencji. indukcji pluripotencji. Dokonujemy przeglądu tych różnych metod uzyskiwania hiPSCs, koncentrując się na ich ostatecznej przydatności klinicznej, z naciskiem na ich w terapiach sercowo-naczyniowych i platformach do modelowania chorób. --- Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności w krajach rozwiniętych. krajach rozwiniętych. Niniejszy przegląd podsumowuje aktualne przedkliniczne i i kliniczne dowody na potencjalną rolę i mechanizmy działania komórek macierzystych i progenitorowych komórek macierzystych i progenitorowych w naprawie i regeneracji naczyń krwionośnych i serca. Oprócz strategii przeszczepiania komórek, podejścia do utrzymania funkcji niszy komórek macierzystych i ukierunkowanie mobilizacji/rekrutacji określonych populacji komórek macierzystych/progenitorowych mogą pomóc w zachowaniu funkcji naczyń krwionośnych i serca. Co więcej, dzięki indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, medycyna regeneracyjna wkracza w nową erę. medycyny regeneracyjnej wkracza w nową erę. Potencjalne zastosowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i bezpośrednio przeprogramowanych komórek, jak również ostatnie w inżynierii tkankowej. --- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z komórek śródbłonka (hiPSC-EC) są obiecujące w leczeniu chorób naczyniowych. są obiecujące w leczeniu chorób naczyniowych. Jednakże, hiPSC-EC oczyszczone na podstawie ekspresji na podstawie ekspresji CD31 składają się z podtypów tętniczych, żylnych i limfatycznych. Nie jest nie jest jasne, czy hiPSC-EC są z natury heterogeniczne i czy mogą istnieć funkcjonalne korzyści z wzbogacania dla określonych podtypów. Dlatego staraliśmy się scharakteryzować hiPSC-EC i wzbogacić dla każdego podtypu oraz wykazać czy takie wzbogacenie miałoby znaczenie funkcjonalne. Komórki hiPSC-EC zostały wygenerowane z różnicowania hiPSC przy użyciu czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)-A i białka morfogenetycznego kości-4. Komórki hiPSC-EC zostały oczyszczone na podstawie pozytywnej ekspresji CD31. Następnie staraliśmy się wzbogacić je dla każdego podtypu. podtypu. Tętnicze hiPSC-EC indukowano przy użyciu wyższych stężeń VEGF-A i 8-bromoadenozyno-3':5'-cyklicznego monofosforanu w pożywce, podczas gdy niższe stężenia stężenia VEGF-A sprzyjały podtypowi żylnemu. VEGF-C i angiopoetyna-1 promowały ekspresję fenotypu limfatycznego. Po oczyszczeniu FACS na podstawie ekspresji CD31+, zaobserwowano, że populacja hiPSC-EC wykazuje typowe typowe markery powierzchniowe i funkcje śródbłonka. Jednakże, populacja hiPSC-EC była heterogeniczna, ponieważ wykazywała markery linii tętniczej, żylnej i w mniejszym stopniu limfatycznej, markery linii limfatycznej. Porównując tworzenie naczyń krwionośnych w zatyczkach matrigelowych in vivo, zaobserwowaliśmy, że wzbogacone tętnicze hiPSC-EC tworzyły bardziej rozległą sieć naczyń włosowatych w tym modelu. sieć naczyń włosowatych w tym modelu, w porównaniu z heterogeniczną populacją hiPSC-EC. Badanie to pokazuje, że oczyszczanie FACS komórek CD31+ hiPSC-ECs wytwarza zróżnicowaną populację ECs. Udoskonalenie metod różnicowania może podtypu hiPSC-EC z funkcjonalnymi korzyściami w postaci poprawy neowaskularyzacji. neowaskularyzacji. --- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być generowane z dorosłych tkanek somatycznych tkanek poprzez wymuszoną ekspresję kilku zdefiniowanych czynników transkrypcyjnych, w tym Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc, w tym Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc. Technologia iPSC niesie ze sobą ogromne nadzieje na dla terapeutycznej regeneracji układu sercowo-naczyniowego ze względu na nieograniczoną komórek do proliferacji i różnicowania we wszystkie linie komórkowe. Komórki iPSC mogą być generowane z komórek somatycznych pacjentów z genetycznym podłożem ich choroby, aby zrozumieć patobiologię zaburzenia. Modelowanie tej choroby modelowanie można dostosować do wysokowydajnych badań przesiewowych w celu odkrycia nowych cząsteczek terapeutycznych. terapeutycznych. Wreszcie, technologia iPSC może umożliwić spersonalizowane terapie komórkowe, przy jednoczesnym uniknięciu obaw etycznych związanych z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi. Trwają intensywne prace nad opracowaniem niezawodnych metod kierowania różnicowaniem komórek macierzystych do linii sercowo-naczyniowych. do linii sercowo-naczyniowych w leczeniu chorób tętnic obwodowych i chorób serca. tętnic obwodowych i chorób serca. Badania nad patogenezą chorób i przy użyciu technologii iPSC przyczynią się do odkrycia nowych metod leczenia chorób układu krążenia. na choroby układu krążenia. --- Odkrycie, że komórki somatyczne mogą zostać przeprogramowane do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez nadekspresję kombinacji czynników transkrypcyjnych (iPSC) poprzez nadekspresję kombinacji czynników transkrypcyjnych niesie ze sobą potencjał potencjalnie przyczynić się do powstania wielu nowych zastosowań zarówno w przedklinicznych, jak i w badaniach przedklinicznych i klinicznych nad układem sercowo-naczyniowym. Modelowanie chorób, które jest realizowane przez uzyskiwanie linii iPSC od pacjentów dotkniętych chorobami dziedzicznymi, a następnie badanie patofizjologii chorób w komórkach somatycznych zróżnicowanych z tych specyficznych dla pacjenta linii iPSC, jest jak dotąd najbardziej zaawansowanym z tych zastosowań. zastosowań. Zespół długiego QT i katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy to dwie choroby serca. katechaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy to dwa zaburzenia rytmu serca, które zostały już z powodzeniem już z powodzeniem modelowane przez kilka grup stosujących to podejście, które prawdopodobnie posłuży do modelowania innych mono- lub poligenetycznych zaburzeń sercowo-naczyniowych w przyszłości. Systemy testowe oparte na komórkach pochodzących z iPSC mogą okazać się korzystne do badania nowych leków sercowo-naczyniowych lub niepożądanych skutków ubocznych leków oraz do indywidualizacji terapii medycznej. terapii. Zastosowanie iPSC w terapii komórkowej zaburzeń sercowo-naczyniowych, aczkolwiek obiecujące, stanie się wykonalne tylko wtedy, gdy zostanie rozwiązany problem bezpieczeństwa biologicznego tych komórek. biologicznego bezpieczeństwa tych komórek. --- CEL PRZEGLĄDU: Rozwój technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) doprowadził do wielu postępów w obszarach ukierunkowanego różnicowania i charakterystyki komórek. różnicowania i charakteryzacji komórek. Nowe metody generowania kardiomiocytów pochodzących z iPSC kardiomiocytów stanowią nieocenione źródło do badania niektórych zaburzeń sercowo-naczyniowych. Niniejszy przegląd podkreśla obecną technologię w tej dziedzinie w tej dziedzinie, jej dotychczasowe zastosowanie do badania zaburzeń genetycznych szlaku RAS/MAPK i zespołu długiego QT (LQTS), a także przyszłe kierunki rozwoju tej dziedziny. przyszłości. Najnowsze odkrycia: Udoskonalone metody zwiększają wydajność generowania i i rygorystycznego oczyszczania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Wykorzystanie kardiomiocytów kardiomiocytów pochodzących od pacjentów z zespołem LEOPARD i LQTS rzuciło światło na molekularne mechanizmy molekularne mechanizmy choroby i potwierdziło ich zastosowanie jako wiarygodnych modeli modeli choroby u ludzi. PODSUMOWANIE: Wykorzystanie kardiomiocytów pochodzących z iPSC do badania genetycznych zaburzeń sercowo-naczyniowych sercowo-naczyniowych umożliwi głębsze i bardziej odpowiednie zrozumienie molekularnych mechanizmów molekularnych mechanizmów ludzkich chorób, a także poprawi naszą zdolność do skutecznych terapii komórkowych. Metody skutecznego generowania tych komórek są coraz doskonalsze i obiecujące dla przyszłych zastosowań tej technologii. technologii. --- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) potencjalnie stanowią unikalny zasób do generowania kardiomiocytów specyficznych dla pacjenta w celu badania mechanizmów i leczenia chorób serca. Jednak istniejące podejścia do produkcji kardiomiocytów z ludzkich komórek iPS kardiomiocytów z ludzkich komórek iPS są nieefektywne, co ogranicza zastosowanie komórek iPS w podstawowych i translacyjnych badaniach kardiologicznych. Co więcej, strategie dokładnego rejestrowania zmian w czasie trwania potencjału czynnościowego (APD) kardiomiocytów pochodzących z komórek iPS. (APD) są potrzebne do monitorowania chorób serca związanych z APD i do szybkiego badań przesiewowych leków. Zbadaliśmy, czy modulacja białka morfogenetycznego kości 4 (BMP-4) i szlaków sygnałowych Wnt/β-kateniny może indukować wydajne różnicowanie serca ludzkich komórek iPS. różnicowanie ludzkich komórek iPS. Stwierdziliśmy, że wczesne leczenie ludzkich komórek iPS z BMP-4, a następnie późne leczenie małocząsteczkowymi inhibitorami Wnt doprowadziło do znacznego wzrostu produkcji kardiomiocytów w porównaniu do istniejących strategii różnicowania. strategii różnicowania. Stosując barwienie immunocytochemiczne i obrazowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowego obrazowania wapnia, wykazaliśmy, że te indukowane kardiomiocyty wyrażały typowe markery sarkomerów, wykazywały normalne rytmiczne transjenty Ca(2+) i reagowały zarówno na stymulację β-adrenergiczną, jak i elektryczną. Ponadto, ludzkie kardiomiocyty pochodzące z komórek iPS wykazywały charakterystyczne charakterystyczne zmiany czasu trwania potencjału czynnościowego w odpowiedzi na leki kardioaktywne prokainamid i werapamil przy użyciu czułej na napięcie rejestracji optycznej opartej na barwnikach. Tak więc, modulacja szlaków sygnałowych BMP-4 i Wnt w ludzkich komórkach iPS prowadzi do wysoce wydajnej produkcji kardiomiocytów o typowej kardiomiocytów z typową funkcją elektrofizjologiczną i reaktywnością farmakologiczną. Wykorzystanie ludzkich kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS oraz zastosowanie barwników wrażliwych na wapń i do bezpośredniego, szybkiego pomiaru aktywności kardiomiocytów pochodzących z komórek iPS. kardiomiocytów obiecują zaoferować atrakcyjne platformy do badania mechanizmów chorób serca i środków terapeutycznych. --- Wskaźniki rezygnacji z leków wzrosły w ostatnich latach, powodując rosnące koszty dla przemysłu farmaceutycznego i konsumentów. dla przemysłu farmaceutycznego i konsumentów. Przyczyny tego zjawiska obejmują brak modeli in vitro, które korelują z wynikami klinicznymi i słabe przedkliniczne testy przesiewowe toksyczności. Produkcja in vitro ludzkich komórek ludzkich komórek progenitorowych serca i kardiomiocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zapewnia źródło komórek do zastosowań w odkrywaniu leków, modelowaniu chorób modelowaniu chorób, medycynie regeneracyjnej i badaniach przesiewowych kardiotoksyczności. Ponadto zdolność do wyprowadzania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych z tkanek somatycznych, w połączeniu z obecnymi wysokowydajnymi badaniami przesiewowymi i farmakogenomiką, może pomóc wykorzystać te komórki do realizacji potencjału spersonalizowanej medycyny. spersonalizowanej medycyny. W niniejszym przeglądzie omówiono wykorzystanie pluripotencjalnych komórek macierzystych kardiomiocytów do odkrywania leków i badań przesiewowych kardiotoksyczności, a także przeszkody, które muszą zostać pokonane w celu szerszego zastosowania klinicznego tego obiecującego podejścia. obiecującego podejścia. --- Komórki progenitorowe układu sercowo-naczyniowego (CVPC) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs), w tym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSCs). pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), są bardzo obiecujące w badaniach nad rozwojem rozwoju układu sercowo-naczyniowego i komórkowej terapii chorób serca, ale ich zastosowania są ich zastosowania są utrudnione przez trudności w ich skutecznym generowaniu i stabilnej konserwacji. Niniejsze badanie ma na celu opracowanie chemicznie zdefiniowanych systemów do wydajnego generowania i stabilnego rozmnażania CVPC pochodzących z hPSC poprzez modulację kluczowych wczesnych szlaków rozwojowych zaangażowanych w specyfikację ludzkiego układu sercowo-naczyniowego i samoodnowę CVPC. i samoodnowę CVPC. Niniejszym donosimy, że połączenie białka morfogenetycznego kości białka morfogenetycznego 4 (BMP4), inhibitora kinazy syntazy glikogenu 3 (GSK3) CHIR99021 i kwasu askorbinowego jest wystarczająca do szybkiej konwersji hodowanych w monowarstwie hPSCs, w tym hESCs i hiPSCs, w jednorodne CVPCs w chemicznie chemicznie zdefiniowanej pożywce w warunkach hodowli bez podajnika i surowicy. Te CVPC stabilnie samoodnawiały się w warunkach bez podajnika i surowicy, a ich liczba wzrosła ponad 10(7)-krotnie, gdy sygnały indukujące różnicowanie ze szlaków BMP, GSK3 i Activin/Nodal zostały jednocześnie wyeliminowane. Co więcej, te CVPC wykazywały oczekiwane w całym genomie cechy molekularne CVPC, zachowały potencjał do generowania głównych linii sercowo-naczyniowych, w tym kardiomiocytów, komórek mięśni gładkich i śródbłonka. mięśni gładkich i komórek śródbłonka in vitro, a także były nienowotworowe in vivo. Podsumowując, przedstawione tutaj systemy pozwalają na wydajne generowanie i stabilne utrzymanie CVPC pochodzących z hPSC, które stanowią potężne narzędzie do do badania wczesnego rozwoju embrionalnego układu sercowo-naczyniowego i stanowią potencjalnie bezpieczne źródło komórek do źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej mięśnia sercowego.
W jaki sposób indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są wykorzystywane w badaniach i leczeniu chorób układu krążenia?
Głównym celem w dziedzinie medycyny regeneracyjnej układu sercowo-naczyniowego jest zastąpienie utraconego lub uszkodzonego mięśnia sercowego i naczyń wieńcowych w następstwie choroby niedokrwiennej. Obecnie kardiomiocyty de novo mogą być generowane zarówno in vitro, przy użyciu ukierunkowanego różnicowania embrionalnych komórek macierzystych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, jak i in vivo poprzez bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych dorosłych fibroblastów serca lub ektopową stymulację rezydentnych komórek macierzystych lub progenitorowych serca. Produkcja ludzkich komórek progenitorowych serca i kardiomiocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zapewnia odpowiednie źródło komórek do zastosowań w odkrywaniu leków, modelowaniu chorób, medycynie regeneracyjnej i badaniach przesiewowych kardiotoksyczności. Ponadto, zdolność do uzyskiwania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z tkanek somatycznych, w połączeniu z obecnymi wysokowydajnymi badaniami przesiewowymi i farmakogenomiką, może pomóc w wykorzystaniu tych komórek do realizacji potencjału medycyny spersonalizowanej. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zapewniają wyjątkową możliwość badania "choroby w naczyniu" na określonym tle genetycznym i środowiskowym. Pochodzące od pacjentów komórki iPSC zostały z powodzeniem wykorzystane do modelowania kardiomiopatii, zaburzeń rytmu i zaburzeń naczyniowych. Zespół długiego QT i katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy to dwa zaburzenia rytmu serca, które zostały już z powodzeniem zamodelowane przez kilka grup stosujących to podejście, które prawdopodobnie posłuży do modelowania innych mono- lub poligenetycznych zaburzeń sercowo-naczyniowych w przyszłości. Wykorzystanie kardiomiocytów pochodzących z iPSC do badania genetycznych zaburzeń sercowo-naczyniowych umożliwi głębsze i bardziej odpowiednie zrozumienie molekularnych mechanizmów ludzkich chorób, a także poprawi naszą zdolność do osiągnięcia skutecznych terapii opartych na komórkach.