Poziomy i aktywność p53 są kontrolowane w dużej mierze poprzez regulowaną ubikwitynację i późniejsze zniszczenie przez proteasom 26S. Monoubikwitynacja p53 jest pośredniczona głównie przez ligazę ubikwityny RING-finger E3 MDM2 i wpływa na aktywność p53 poprzez modulację lokalizacji p53 i aktywności aktywności transkrypcyjnej. Niedawno zidentyfikowano kilka ligaz ubikwityny E4 (E4s), które służą do rozszerzenia tych które służą do przedłużania tych łańcuchów monoubikwitynowych. Aktywność ligazy ubikwityny ubikwityny tych czynników w stosunku do p53 i ich udział w degradacji p53 można badać przy użyciu różnych metod i odczynników in vitro i in vivo, które zostaną opisane w tym artykule. odczynników, które zostaną opisane w tym rozdziale. Metody te obejmują in vivo ubikwitynację p53 przy użyciu HA-ubikwityny lub his-ubikwityny; test ligazy ubikwityny E3 in vitro w którym składniki reakcji ubikwityny (URC) są inkubowane z oczyszczoną E3-ubikwityną. inkubowane z oczyszczoną ligazą E3 lub E4; jednoetapowy test E4, w którym URC są są inkubowane z substratem, E3 i E4; oraz dwuetapowy test E4, w którym p53 jest monoubikwitynowany w reakcji E3, a następnie oczyszczany i inkubowany z E4. Na koniec opiszemy test degradacji in vitro, w którym ubikwitynowane p53 jest inkubowane z oczyszczonymi proteasomami 26S. Razem, te testy mogą być wykorzystane do zapewnienia wglądu w biochemiczną naturę ubikwitynacji i degradacji p53 ubikwitynacji i degradacji. --- MDM2 jest ligazą ubikwityny E3, która reguluje proteasomalną degradację i aktywność białek aktywność białek zaangażowanych we wzrost komórek i apoptozę, w tym supresorów nowotworu supresorów nowotworów p53 i retinoblastoma oraz czynnika transkrypcyjnego E2F1. Chociaż wpływ kilku celów MDM2 na przeżycie i przerost kardiomiocytów został już zbadany. na przeżycie i przerost kardiomiocytów, rola MDM2 w tych procesach nie została jeszcze ustalona. w tych procesach. Dlatego przeanalizowaliśmy wpływ nadekspresji, jak również a także hamowanie MDM2 na uszkodzenie niedokrwienia / reperfuzji serca i przerost. Tutaj pokazujemy, że izolowane miocyty serca z nadekspresją MDM2 nabyły odporność na śmierć komórkową wywołaną niedotlenieniem/reoksygenacją. I odwrotnie, inaktywacja MDM2 przez inhibitor peptydowy skutkowała podwyższonym poziomem p53 i promowała apoptozę indukowaną niedotlenieniem/reoksygenacją. Zgodnie z tym, zmniejszona ekspresja ekspresji MDM2 w genetycznym modelu myszy towarzyszyła zmniejszona funkcjonalna regeneracja lewej komory serca określona za pomocą modelu Langendorff ex vivo modelu niedokrwienia/reperfuzji. W przeciwieństwie do przeżycia komórek przerost komórek indukowany przez alfa-agonistów fenylefrynę lub endotelinę-1 był hamowany przez nadekspresję MDM2. Podsumowując, nasze badania wskazują, że MDM2 promuje przeżycie i osłabia przerost miocytów serca. Ta zróżnicowana regulacja wzrostu i przeżycia komórek jest wyjątkowa, ponieważ większość inne czynniki przeżycia są prohipertroficzne. MDM2 może być zatem potencjalnym celem terapeutycznym w celu obniżenia zarówno śmierci komórek, jak i patologicznego przerost podczas przebudowy po zawale serca. Ponadto, nasze dane sugerują również, że leczenie raka inhibitorami MDM2 w celu reaktywacji p53 może mieć niekorzystne skutki uboczne dla serca poprzez promowanie śmierci kardiomiocytów. --- Protoonkogen Mdm2 ulega amplifikacji i nadekspresji w różnych nowotworach. Jedną z głównych funkcji Mdm2 opisanych do tej pory jest jego zdolność do modulowania poziomu i aktywności białka supresorowego nowotworu p53. Mdm2 wiąże się z N-końca p53 i poprzez swoje działanie jako ligazy ubikwityny E3, ukierunkowuje p53 do szybkiej degradacji proteasomalnej. Mdm2 może również wiązać się z innymi białkami komórkowymi takimi jak hNumb, E2F1, Rb i Akt; jednak biologiczne znaczenie tych interakcji jest mniej jasne. interakcji jest mniej jasne. Aby uzyskać wgląd w funkcję Mdm2 in vivo, wygenerowaliśmy transgeniczny szczep Drosophila niosący mysi gen Mdm2. Ektopowa ekspresja Mdm2, przy użyciu systemu UAS/GAL4, powoduje fenotypy oka i skrzydła u muchy. i skrzydła u muchy. Analiza dysków imaginalnych skrzydeł larw w trzecim stadium rozwoju wykazała, że ekspresja Mdm2 indukuje apoptozę. Krzyżówki nie ujawniły genetycznych interakcji między Mdm2 a homologami E2F, Numb i Akt u Drosophila. Te transgeniczne muchy mogą stanowić unikalny model eksperymentalny do badania molekularnych interakcji Mdm2 w kontekście rozwojowym. --- Białko supresorowe nowotworu p53 odgrywa ważną rolę w ochronie integralności genomu. integralności genomu. W normalnych warunkach Mdmx i Mdm2 kontrolują aktywność p53. Oba białka hamują regulację transkrypcji przez p53, podczas gdy Mdm2 również funkcjonuje również jako ligaza ubikwityny E3, kierując zarówno p53, jak i Mdmx do proteasomalnej degradacji. proteasomalnej degradacji. HAUSP przeciwdziała destabilizującemu działaniu Mdm2 poprzez bezpośrednią deubikwitynację p53. Następnie wykazano, że HAUSP deubikwitynuje Mdm2 i Mdmx, stabilizując w ten sposób te białka. Kinaza białkowa ATM jest kluczowym regulatorem szlaku p53 w odpowiedzi na podwójne pęknięcia nici (DSB) w DNA. DNA. ATM dostraja odpowiedź p53 na uszkodzenia DNA poprzez bezpośrednią fosforylację, regulując dodatkowe modyfikacje potranslacyjne tego białka oraz poprzez wpływ na dwa regulatory p53: Mdm2 i Mdmx. ATM bezpośrednio i pośrednio indukuje fosforylację Mdm2 i Mdmx, powodując zmniejszenie aktywności i stabilności tych białek. stabilność tych białek. Niedawno przedstawiliśmy mechanizm zmniejszonej stabilności Mdm2 i Mdmx poprzez wykazanie, że fosforylacja zależna od ATM obniża ich powinowactwo do enzymu deubikwitynującego HAUSP. Podsumowując, wyłaniający się obraz przedstawia skomplikowaną, ale precyzyjną kontrolę aktywacji i stabilizacji p53 za pośrednictwem ATM. i stabilizację po uszkodzeniu DNA. Dalszy wgląd w mechanizm mechanizm, za pomocą którego ATM przełącza interakcje między HAUSP, Mdmx, Mdm2 i p53, aby faworyzować aktywację p53, może zaoferować nowe narzędzia do interwencji terapeutycznej w szlaku szlaku p53 w leczeniu raka. --- Ligaza ubikwityny E3 domeny RING Mdm2 jest głównym regulatorem supresora nowotworu supresora p53. Ukierunkowuje p53 na degradację proteasomalną, ograniczając silną aktywność p53 i umożliwiając przeżycie i proliferację komórek. Jak większość ligaz ligaz E3, Mdm2 może również ubikwitynować samą siebie. W jaki sposób auto-ubikwitynacja Mdm2 może może wpływać na aktywność ligazy ubikwityny substratu jest niezdefiniowane. Tutaj pokazujemy że auto-ubikwitynacja Mdm2 jest zdarzeniem aktywującym. Mdm2, który został sprzężony z łańcuchami poliubikwityny, ale nie z pojedynczymi ubikwitynami, wykazuje znacznie zwiększoną aktywność do poliubikwitynacji p53. Mechanistycznie, auto-ubikwitynacja Mdm2 ułatwia rekrutację E2 enzymu sprzęgającego ubikwitynę. Dzieje się to poprzez niekowalencyjne interakcje między łańcuchami ubikwityny na Mdm2 i domeną wiążącą ubikwitynę na E2. Mutacje, które zmniejszają niekowalencyjne interakcje sprawiają, że auto-ubikwitynacja niezdolną do stymulowania aktywności E3 substratu Mdm2. Wyniki te sugerują model, w którym w którym łańcuchy poliubikwitynowe na E3 zwiększają lokalne stężenie enzymów E2 i umożliwiają procesywność ubikwitynacji substratu. Potwierdzają one również że autokataliza może być dominującym sposobem włączania aktywności utajonych enzymów. aktywność utajonych enzymów. --- Murine double minute (MDM2) jest ligazą E3, która promuje ubikwitynację i degradację białka supresorowego nowotworu 53 (p53). degradację białka supresorowego nowotworu 53 (p53). Regulacja p53, w której pośredniczy MDM2 p53 została zbadana jako klasyczny szlak nowotworzenia. Tutaj opisujemy TRIAD1 jako nowy modulator osi p53-MDM2, który indukuje aktywację p53 poprzez hamowanie jego regulacji przez MDM2. Ablacja TRIAD1 osłabia p53 po uszkodzeniu DNA, podczas gdy ektopowa ekspresja TRIAD1 promuje stabilność p53 poprzez hamowanie ubikwitynacji/degradacji, w której pośredniczy MDM2. Ponadto TRIAD1 wiąże się z C-końcem p53, aby promować jego dysocjację z MDM2. MDM2. Wyniki te wskazują, że TRIAD1 jest nowym czynnikiem regulacyjnym p53-MDM2. --- CEL: p53 jest inaktywowany w wielu ludzkich nowotworach złośliwych poprzez mutacje missense mutacje lub nadekspresję ludzkiego homologa Mdm2 (Hdm2), ligazy ubikwityny E3 ubikwityny, która ubikwitynuje p53, promując w ten sposób jego proteasomalną degradację. degradację proteasomalną. Cis-imidazolina nutlin-3 może zakłócać interakcję p53-Hdm2 i aktywować p53, indukując apoptozę in vitro w wielu nowotworach złośliwych, w tym szpiczaka mnogiego (MM). PROJEKT EKSPERYMENTALNY: Postawiliśmy hipotezę, że supresja ubikwitynacji p53 za pośrednictwem Hdm2 może nasilać następstwa akumulacji p53 spowodowanej inhibicją proteasomalną. inhibicję proteasomalną. Porównaliśmy odpowiedź komórek MM z kilkoma modelami raka nabłonkowego na inhibicję proteasomu. na inhibitor proteasomu bortezomib w połączeniu z nutliną-3. nutliną-3. WYNIKI: Połączenie subletalnych stężeń bortezomibu i nutliny-3 indukowało addytywną cytotoksyczność wobec wrażliwych na bortezomib linii komórkowych MM. Co ważne, w przypadku raka piersi, prostaty, okrężnicy i tarczycy (brodawkowatego, linii komórkowych raka pęcherzykowego, anaplastycznego i rdzeniastego, ta kombinacja wywołało synergistyczną cytotoksyczność i zwiększoną ekspresję p53, p21, Hdm2, Bax, Noxa, PUMA oraz rozszczepienie kaspazy-3 i polimerazy poli ADP-rybozy. Kokultura z komórkami zrębu szpiku kostnego osłabiała wrażliwość komórek MM na monoterapię na monoterapię nutliną-3 i była związana z hamowaniem aktywności p53 w komórkach MM, podczas gdy skojarzone leczenie bortezomibem i nutliną-3 utrzymywało cytotoksyczność nawet w obecności cytotoksyczność nawet w obecności komórek zrębu szpiku kostnego. WNIOSKI: Ta zróżnicowana odpowiedź MM w porównaniu z rakami nabłonkowymi na połączenie nutliny-3 z bortezomibem rzuca nowe światło na rolę p53 w indukowanym apoptozie indukowanej bortezomibem. Jednoczesne hamowanie Hdm2 z bortezomibem może rozszerzyć spektrum zastosowań bortezomibu na nowotwory złośliwe o obecnie ograniczonej wrażliwości na bortezomib podawany pojedynczo lub, w przyszłości, u pacjentów z MM ze zmniejszoną odpowiedzią kliniczną na terapię opartą na bortezomibie. --- Pętla HDM2-p53 ma kluczowe znaczenie dla monitorowania poziomu p53 i ludzkich patologii. Dlatego identyfikacja nowych cząsteczek zaangażowanych w tę pętlę regulacyjną jest niezbędna do zrozumienia dynamicznej regulacji p53 i leczenia chorób człowieka. chorób. Tutaj scharakteryzowaliśmy, że białko rybosomalne L6 wiąże się i tłumi aktywność ligazy ubikwityny E3 HDM2, a następnie osłabia HDM2-pośredniczy w polubikwitynacji i degradacji p53. Zwiększona aktywność p53 dodatkowo spowalnia progresję cyklu komórkowego i prowadzi do zahamowania wzrostu komórek. I odwrotnie, poziom p53 jest dramatycznie zmniejszony po wyczerpaniu RPL6, co wskazuje, że RPL6 jest niezbędny do stabilizacji p53. Odkryliśmy również że RPL6 ulega translokacji z nukleolu do nukleoplazmy pod wpływem stresu rybosomalnego, co ułatwia jego wiązanie z p53. co ułatwia jego wiązanie z HDM2. Interakcja RPL6 i HDM2 napędza polubikwitynację RPL6 za pośrednictwem HDM2 i degradację proteasomalną. Dłuższe leczenie aktynomycyną D zwiększa ubikwitynację RPL6 i destabilizuje RPL6, a tym samym przypuszczalnie osłabia odpowiedź p53, dopóki poziom L6 ustąpi. Dlatego RPL6 i HDM2 tworzą autoregulacyjną pętlę sprzężenia zwrotnego, aby monitorowania poziomu p53 w odpowiedzi na stres rybosomalny. Razem, nasze badanie identyfikuje kluczową funkcję RPL6 w regulacji szlaku HDM2-p53, co podkreśla znaczenie RPL6 w ludzkich chorobach genetycznych i nowotworach. --- Mdm2 jest ligazą ubikwityny E3 typu RING finger, która promuje ubikwitynację i proteasomalną degradację białka supresorowego p53. proteasomalną degradację białka supresorowego nowotworu p53. Acetylacja p53 reguluje aktywność transkrypcyjną p53 i hamuje ubikwitynację i degradację p53, w których pośredniczy Mdm2. ubikwitynację i degradację. Obecnie donosimy, że Mdm2 jest również celem dla acetylacji. Mdm2 jest acetylowany in vitro przez białko wiążące CREB (CBP) i w mniejszym stopniu przez p300, ale w mniejszym stopniu przez p300, ale nie przez czynnik związany z p300/CPB. Acetylacja zachodzi głównie w domenie palca RING Mdm2. Acetylacja Mdm2 in vivo była łatwo wykrywana za pomocą CBP, ale nie p300. Skuteczna acetylacja in vivo wymagała zachowanie palca RING. Mutant Mdm2 (K466/467Q) naśladujący acetylację acetylacji jest upośledzony w jego zdolności do promowania ubikwitynacji p53, jak również ubikwitynacji Mdm2. Co więcej, K466/467Q jest wadliwy w promowaniu degradacji p53 degradacji w żywych komórkach. Sugerujemy zatem, że acetylotransferazy mogą modulować komórkową aktywność p53 nie tylko przez modyfikację p53, ale także przez inaktywację Mdm2. --- Uważa się, że Mdm2 reguluje supresor nowotworu p53 na dwa sposoby: poprzez maskowanie dostępu p53 do maszynerii transkrypcyjnej oraz przez ubikwitynację p53, kierując go do degradacji proteasomalnej. Ten dogmat został niedawno zakwestionowany przez dane wygenerowane przez myszy typu knockin, u których aktywność ligazy ubikwityny RING E3 została zniesiona przez pojedynczą mutację punktową. Mutant RING Mdm2 jest w pełni zdolny do wiązania się z p53, ale nie może hamować aktywności p53, co sugeruje, że Mdm2 nie może blokować p53 przez samo wiązanie, bez ubikwitynacji. Dane pochodzące od myszy RING knockin ujawniły również, że endogenny Mdm2 nie, jak wcześniej sądzono jak wcześniej sądzono, reguluje swoją stabilność poprzez samoubikwitynację. W niniejszym przeglądzie omówimy te odkrycia i ich znaczenie dla dziedziny, w tym potencjalne przyczyny rozbieżności między wcześniejszymi danymi a tymi wygenerowanymi przez nasze myszy knockin, a także wykonalność celowania w aktywność ligazy ubikwityny E3 w nowotworach. Omówimy również dodatkowe pytania badawcze które można rozwiązać za pomocą naszego modelu myszy. --- Białko supresorowe nowotworu p53 jest ściśle kontrolowane przez ligazę ubikwityny E3 ligazę E3 ubikwityny, mysią podwójną minutę 2 (MDM2), ale utrzymuje ekspresję MDM2 jako część pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego. Zidentyfikowaliśmy immunofilinę wiążącą 25 kDa FK506 białko (FKBP25), wcześniej wykazano, że jest regulowane przez represję za pośrednictwem p53, jako partnera oddziałującego z MDM2. Pokazujemy, że FKBP25 stymuluje auto-ubikwitylację i proteasomalną degradację MDM2, prowadząc do indukcji p53. Pozbawienie FKBP25 przez siRNA prowadzi do zwiększonego poziomu MDM2 i odpowiedniego zmniejszenia poziomów p53 i p21. Dane te są zgodne z koncepcją, że FKBP25 przyczynia się do regulacji ujemnej pętli sprzężenia zwrotnego p53-MDM2. pętli sprzężenia zwrotnego. --- p53 jest krytycznym koordynatorem szerokiego zakresu reakcji na stres. Aby ułatwić szybką reakcję na stres, p53 jest produkowany konstytutywnie, ale jest negatywnie regulowany przez MDM2. MDM2 może hamować p53 na wiele niezależnych sposobów: wiążąc się z domeną aktywacji transkrypcji z jego domeną aktywacji transkrypcji, hamując acetylację p53, promując eksport jądrowy i prawdopodobnie przede wszystkim poprzez promowanie proteasomalnej degradacji p53. degradację p53. To ostatnie osiąga się poprzez ligazę ubikwityny E3 MDM2 MDM2 w domenie palca RING. Odkryliśmy, że MTBP promuje pośredniczoną przez MDM2 ubikwitynację i degradację p53, a także MDM2 w sposób zależny od palca RING MDM2. Ponadto, przy użyciu małego interferującego RNA w celu obniżenia poziomu endogennego MTBP w komórkach niestresowanych, odkryliśmy, że odkryliśmy, że MTBP znacząco przyczynia się do pośredniczonej przez MDM2 regulacji poziomów i aktywności p53 i jego aktywności. Jednak po ekspozycji komórek na promieniowanie UV, ale nie na promieniowanie gamma, MTBP jest destabilizowany jako część skoordynowanej odpowiedzi komórkowej. odpowiedzi komórkowej. Nasze odkrycia sugerują, że MTBP w różny sposób reguluje aktywność ligazy ubikwityny E3 aktywność ligazy ubikwityny MDM2 w stosunku do dwóch jej najbardziej krytycznych celów (samego siebie i p53) i w ten sposób znacząco przyczynia się do zależnej od MDM2 p53 w komórkach niestresowanych.
Które białko jest ligazą E3-ubikwityny, której celem jest degradacja proteasomalna supresora nowotworu p53?
Białko supresorowe nowotworu p53 jest ściśle kontrolowane przez ligazę ubikwityny E3, mysią podwójną minutę 2 (MDM2). Ligaza ubikwityny E3 domeny RING Mdm2 jest głównym regulatorem supresora nowotworu p53. Ukierunkowuje p53 na degradację proteasomalną, ograniczając silną aktywność p53 i umożliwiając przeżycie i proliferację komórek. p53 jest inaktywowany w wielu ludzkich nowotworach złośliwych poprzez mutacje missense lub nadekspresję ludzkiego homologa Mdm2 (Hdm2), ligazy ubikwityny E3, która ubikwitynuje p53, promując w ten sposób jego degradację proteasomalną.