TŁO: Wykrywanie in vivo regionów genomowych związanych z białkami można osiągnąć poprzez połączenie immunoprecypitacji chromatyny z sekwencjonowaniem nowej generacji (ChIP-seq). Duża ilość danych sekwencyjnych generowanych przez tę metodę musi być analizowana w statystycznie poprawny i wydajny obliczeniowo sposób. sposób. Generowanie dużej liczby kopii fragmentów DNA jako artefakt etapu PCR w ChIP-seq. etapu PCR w ChIP-seq jest ważnym źródłem stronniczości tej metodologii. WYNIKI: Przedstawiamy tutaj pakiet R do analizy statystycznej eksperymentów ChIP-seq eksperymentów ChIP-seq. Biorąc pod uwagę średni rozmiar fragmentów DNA poddanych sekwencjonowaniu oprogramowanie oblicza wartości wzbogacenia odczytów pojedynczych nukleotydów. Po normalizacji, próbka i kontrola są porównywane przy użyciu testu opartego na lub rozkład Poissona. Progi statystyk testowych do kontroli fałszywych odkryć uzyskuje się poprzez losowe permutacje. Wydajność obliczeniowa Wydajność obliczeniowa jest osiągana poprzez implementację najbardziej czasochłonnych funkcji w C++ i zintegrowanie ich w pakiecie R. Analiza symulowanych i eksperymentalnych danych ChIP-seq, aby zademonstrować odporność naszej metody na na artefakty PCR i odpowiednią kontrolę poziomu błędów. WNIOSKI: Oprogramowanie ChIP-seq Analysis in R (CSAR) umożliwia szybkie i dokładne wykrywanie regionów genomowych związanych z białkami poprzez analizę eksperymentów ChIP-seq. ChIP-seq. W porównaniu z istniejącymi metodami stwierdziliśmy, że nasz pakiet wykazuje większą odporność na artefakty PCR i lepszą kontrolę poziomu błędów. błędów. --- Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest złotą techniką lokalizacji białek jądrowych w genomie. lokalizowania białek jądrowych w genomie. Wykorzystaliśmy ChIP w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem (Seq), aby zbadać ogólnogenomową dystrybucję kompleksu Silent (Sir) w Saccharomyces cerevisiae. Przeanalizowaliśmy ChIP-Seq białek wyciszających Sir2, Sir3 i Sir4 i odkryliśmy 238 nieoczekiwane loci euchromatyczne, które wykazywały wzbogacenie wszystkich trzech białek. Co zaskakujące, opublikowane zestawy danych ChIP-Seq dla czynnika transkrypcyjnego Ste12 i centromerycznego białka Cse4 wskazywały, że białka te były również wzbogacone w tych samych regionach euchromatycznych z wysokim poziomem białka Sir. 238 loci, określane jako "hiper-ChIPable", znajdowały się w regionach o wysokiej ekspresji z silnym wzbogaceniem w polimerazę II i polimerazą III, a korelacja między poziomem transkrypcji a wzbogaceniem ChIP poziomem transkrypcji a wzbogaceniem ChIP nie ograniczała się do tych 238 loci, ale rozszerzona na cały genom. Pozorne wzbogacenie różnych białek w loci nie było konsekwencją artefaktów związanych z metodami głębokiego sekwencjonowania. metodami sekwencjonowania, co zostało potwierdzone przez ilościową PCR ChIP. Lokalizacja niepowiązanych białek, w tym całego kompleksu wyciszającego, do najbardziej transkrybowanych genów była wysoce sugerująca kwestię techniczną związaną z immunoprecypitacją. immunoprecypitacji. ChIP-Seq na chromatynie immunoprecypitowanej z zlokalizowanym jądrowo GFP odtworzył powyższe wzbogacenie w sposób zależny od ekspresji sposób: indukcja genów GAL skutkowała zwiększonym sygnałem ChIP białka GFP w tych loci, prawdopodobnie bez znaczenia biologicznego. Podczas gdy ChIP jest szeroko wartościową techniką, niektóre opublikowane wnioski oparte na procedurach ChIP mogą zasługiwać na ponowną ocenę w świetle tych ustaleń. --- Pojawienie się technologii o wysokiej przepustowości, takich jak ChIP-seq, umożliwiło badanie modyfikacji histonów. Szczególnie interesującym problemem jest identyfikacja regionów genomu, w których różne typy komórek z tego samego organizmu wykazują różne wzorce wzbogacenia histonów. Problem ten okazuje się okazuje się zaskakująco trudny, nawet w prostych porównaniach parami, z powodu z powodu znacznego poziomu szumu w danych ChIP-seq. W niniejszym artykule proponujemy dwuetapową metodę statystyczną, zwaną ChIPnorm, do normalizacji danych ChIP-seq oraz znaleźć regiony różnicowe w genomie, biorąc pod uwagę dwie biblioteki modyfikacji histonów różnych typów komórek. Pokazujemy, że metoda ChIPnorm usuwa większość szumu i stronniczości w danych i przewyższa inne metody normalizacji. metody normalizacji. Korelujemy oznaczenia histonów z danymi dotyczącymi ekspresji genów i potwierdzamy, że że modyfikacje histonów H3K27me3 i H3K4me3 działają odpowiednio jako represor i aktywator genów. i aktywator genów. W porównaniu do tego, co wcześniej opisywano w literaturze w literaturze, stwierdzamy, że znacznie wyższa frakcja dwuwartościowych znaczników w komórkach ES dla H3K27me3 i H3K4me3 przechodzi w stan tylko K27. Stwierdziliśmy, że większość regionów promotorowych w genach kodujących białka ma zróżnicowane miejsca modyfikacji histonów. Oprogramowanie do tej pracy można pobrać ze strony http://lcbb.epfl.ch/software.html. --- Immunoprecypitacja chromatyny, a następnie analiza sekwencjonowania następnej generacji (ang. (ChIP-Seq) to potężna metoda, za pomocą której można badać rozmieszczenie białek białek wiążących chromatynę i modyfikacji histonów w dowolnym genomie o znanej sekwencji. genomie o znanej sekwencji. Zastosowanie tej techniki w różnych systemach systemów rozwojowych i różnicowania zapewniło globalne spojrzenie na elementów cis-regulacyjnych, funkcji czynników transkrypcyjnych i procesów epigenetycznych zaangażowanych w kontrolę transkrypcji genów. Tutaj opisujemy kilka technicznych aspektów testu ChIP-Seq, które zmniejszają stronniczość i szum tła i pozwalają na spójne generowanie wysokiej jakości danych. --- Przedstawiamy algorytm przewidywania miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych na podstawie na ChIP-chip i danych filogenetycznych. Nasz algorytm jest odporny na niskie podobieństwo sekwencji promotora i rearanżacje motywów, ponieważ nie zależy od wielokrotnych dopasowań sekwencji. To z kolei pozwala nam na włączenie informacje od bardziej odległych gatunków. Reprezentatywne losowe zestawy danych są używane do oszacowania istotności wyniku. Nasz algorytm jest w pełni automatyczny i nie wymaga interwencji człowieka. nie wymaga interwencji człowieka. Na najnowszym zestawie danych S. cerevisiae osiąga on wyższą dokładność niż poprzednio najlepsze algorytmy. Adaptacyjny próg ChIP-chip i modułowy wynik odchylenia pozycyjnego to dwie ogólne cechy naszego algorytmu, które algorytmu, które zwiększają dokładność przewidywania motywów i mogą być zaimplementowane również w innych algorytmach. również w innych algorytmach. Ponadto, ponieważ nasz algorytm działa częściowo ortogonalnie do innych algorytmów, połączenie kilku algorytmów może jeszcze bardziej zwiększyć dokładność przewidywania. dokładność przewidywania. W szczególności nasza metoda znajduje 6 motywów, które nie zostały znalezionych przez drugi najlepszy algorytm. --- TŁO: Immunoprecypitacja chromatyny na macierzach kafelkowych (ChIP-chip) jest szeroko stosowana do szeroko stosowane do badania miejsc wiązania DNA dla różnych białek na białek w skali całego genomu. Jednakże, kilka kwestii związanych z przetwarzaniem i analizą danych ChIP-chip nie zostało w pełni rozwiązanych, w tym wpływ tła (mock control) i normalizacji w obrębie i pomiędzy macierzami. WYNIKI: Profile wiązania kompleksu Drosophila male-specific lethal (MSL) na macierzy kafelkowej stanowią wyjątkową okazję do zbadania tych tematów, ponieważ wiadomo, że wiąże się on z chromosomem X, ale nie z autosomami. Te duże te duże regiony wiążące i kontrolne na tej samej macierzy pozwalają na jasną ocenę metod analitycznych. Wprowadzamy nowy schemat normalizacji zaprojektowany specjalnie dla danych ChIP-chip z podwójnych chromosomów. ChIP-chip z macierzy dwukanałowych i wykazujemy, że ten krok jest krytyczny dla korekty systematycznych krytyczny dla skorygowania systematycznego odchylenia barwnika, które może występować w danych. Odjęcie danych kontrolnych mock (niespecyficzne przeciwciało lub brak przeciwciała) jest generalnie generalnie potrzebne do wyeliminowania błędu systematycznego, ale odpowiednia normalizacja eliminuje normalizacja eliminuje potrzebę przeprowadzania próbnych eksperymentów i zwiększa korelację między powtórzeniami. Idea leżąca u podstaw normalizacji może być następnie wykorzystana do oszacowania poziomu szumu tła w każdej macierzy w celu normalizacji między macierzami. My zademonstrujemy skuteczność metod z danymi wiązania kompleksu MSL i innych publicznie dostępnych danych. WNIOSEK: Właściwa normalizacja jest niezbędna dla eksperymentów ChIP-chip. Proponowana technika normalizacji zaproponowana technika normalizacji może skorygować błędy systematyczne i zrekompensować za brak danych kontrolnych, zmniejszając w ten sposób koszty eksperymentalne i uzyskując dokładniejsze wyniki. --- Sekwencjonowanie nowej generacji szybko zmienia naszą zdolność do profilowania transkrypcyjnych, genetycznych i epigenetycznych stanów komórki. W szczególności, sekwencjonowanie DNA z immunoprecypitacji kompleksów białko-DNA (ChIP-seq) i metylowanego DNA (MeDIP-seq) może ujawnić lokalizacje miejsc wiązania białek i modyfikacji epigenetycznych. Podejścia te zawierają liczne błędy, które mogą znacząco wpływać na interpretację uzyskanych danych. Rygorystyczne metody obliczeniowe do wykrywania i usuwania takich błędów są wciąż niewystarczające. Ponadto, normalizacja wielu próbek wciąż pozostaje ważnym otwartym problemem. Niniejszy teoretyczny systematycznie charakteryzuje błędy i właściwości danych ChIP-seq poprzez porównanie 62 oddzielnych publicznie dostępnych zbiorów danych, przy użyciu rygorystycznych modeli statystycznych i technik przetwarzania sygnału. Metody statystyczne metody statystyczne do oddzielania sygnału ChIP-seq od szumu tła, jak również korygowania statystyk testu wzbogacania dla błędów zależnych od sekwencji i sonikacji. sonikacji. Nasza metoda skutecznie oddziela odczyty na sygnał i tła przed normalizacją, poprawiając stosunek sygnału do szumu stosunek sygnału do szumu. Co więcej, większość programów do wywoływania pików wykorzystuje obecnie ogólny model zerowy, który który cierpi z powodu niskiej specyficzności na poziomie czułości wymaganym do wykrywania subtelnego, ale prawdziwego wzbogacenia ChIP. Proponowana metoda określania modelu zerowego specyficznego dla typu komórki modelu zerowego, który uwzględnia tendencyjność specyficzną dla typu komórki, wykazano, że jest w stanie osiągnąć niższy wskaźnik fałszywych odkryć przy danym progu istotności niż obecne metody. niż obecne metody. --- MOTYWACJA: Wysokowydajne technologie sekwencjonowania umożliwiają analizę genomu w całym analizę wpływu zmienności genetycznej na fenotypy molekularne w niespotykanej dotąd rozdzielczości. bezprecedensowej rozdzielczości. Jednakże, choć potężne, technologie te mogą również wprowadzać nieoczekiwane artefakty. WYNIKI: Zbadaliśmy wpływ błędu amplifikacji biblioteki na identyfikację zdarzeń molekularnych specyficznych dla alleli (AS) z sekwencjonowania o wysokiej przepustowości danych sekwencjonowania pochodzących z testów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq). Domniemana aktywność wiązania AS DNA dla polimerazy RNA II została określona przy użyciu danych dane ChIP-seq pochodzące z linii komórek limfoblastoidalnych dwóch trio rodzic-córka trio. Stwierdziliśmy, że na dużej głębokości sekwencjonowania wiele znaczących miejsc wiązania AS AS cierpiało z powodu tendencyjności amplifikacji, o czym świadczy większa liczba odczytów klonalnych odczytów klonalnych reprezentujących jeden z dwóch alleli. Aby złagodzić ten błąd opracowaliśmy strategię wykrywania błędu amplifikacji, która odfiltrowuje miejsca o odfiltrowuje miejsca o niskiej złożoności odczytu i miejsca o znacznym nadmiarze odczytów klonalnych. Metoda ta będzie przydatna w analizach AS obejmujących ChIP-seq i inne testy sekwencjonowania funkcjonalnego. funkcjonalnych testów sekwencjonowania. DOSTĘPNOŚĆ: Pakiet R abs filter do symulacji klonalności biblioteki i wykrywania stronniczości amplifikacji jest dostępny pod adresem http://updepla1srv1.epfl.ch/waszaks/absfilter
Czy immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) wykazuje stronniczość dla loci o wysokiej ekspresji?
Kilka kwestii związanych z przetwarzaniem i analizą danych ChIP-chip nie zostało w pełni rozwiązanych, w tym wpływ odejmowania tła (kontroli mock) i normalizacji w obrębie i między macierzami. Wykryliśmy stronniczość stanu chromatyny: otwarte regiony chromatyny dawały większe pokrycie, co prowadziło do fałszywie dodatnich wyników, jeśli nie zostały skorygowane. Lokalizacja niepowiązanych białek, w tym całego kompleksu wyciszającego, do genów o najwyższej transkrypcji była wysoce sugerująca problem techniczny z immunoprecypitacją.