Czynniki alkilujące są szeroko rozpowszechnione w środowisku, a także występują endogennie. Mogą być cytotoksyczne lub mutagenne dla komórek, wprowadzając alkilowane zasady do DNA lub RNA. DNA lub RNA. Wszystkie organizmy rozwinęły wiele mechanizmów naprawy DNA, aby przeciwdziałać skutkom alkilacji DNA: najbardziej cytotoksycznej zmiany, N(3)-metyladenina (3meA), jest wycinana przez glikozylazę AlkA inicjującą naprawę przez wycięcie zasady (BER). (BER); toksyczna N(1)-metyladenina (1meA) i N(3)-metylocytozyna (3meC), indukowane przez glikozylazę AlkA. (3meC), indukowane w DNA i RNA, są usuwane przez dioksygenazę AlkB; i mutagenny i cytotoksyczna O(6)-metyloguanina (O(6) meG) jest naprawiana przez metylotransferazę Ada metylotransferazę. U Escherichia coli odpowiedź Ada obejmuje ekspresję czterech genów czterech genów, ada, alkA, alkB i aidB, kodujących odpowiednie białka Ada, AlkA, AlkB i AidB. Odpowiedź Ada jest zachowana wśród wielu gatunków bakterii; jednak może być zorganizowana inaczej, z różną specyficznością substratową poszczególnych białek. poszczególnych białek. Poniżej przedstawiono przegląd organizacji regulonu Ada i funkcji poszczególnych białek. Szczególny wysiłek włożyliśmy w charakterystykę dioksygenaz AlkB, ich specyficzność substratową i funkcję w naprawie alkilacji. w naprawie uszkodzeń alkilacyjnych w DNA/RNA. --- Rola naprawy przez wycięcie zasad w naprawie uszkodzeń alkilacyjnych wytwarzanych przez przez serię specyficznych sekwencyjnie analogów distamycyny A zawierających oligopirol które wiążą musztardę kwasu benzoesowego (BAM). Podczas gdy BAM alkiluje i sieciuje w głównym rowku DNA, przyłączenie do jednostek pirolowych powoduje monoalkilacje w mniejszym rowku DNA na odcinkach AT. Zarówno sekwencja specyficzność alkilacji i cytotoksyczność wzrastają od jednej do trzech przyłączonych jednostek pirolowych jednostek pirolowych (związki 1-3), a przy 3 alkilacja jest selektywna dla puryn-N3 w sekwencji 5'-TTTTGPu (gdzie Pu = guanina lub adenina). W modelowej bakterii (Escherichia coli) naprawa sekwencji specyficznych dla drugorzędowego rowka alkilacji wytwarzanych przez 2 i 3 nie wydaje się obejmować BER, ponieważ ani formamidopirymidyny-DNA z niedoborem glikozylazy naprawczej E. coli (BH 20, mutant fpg- mutant) ani mutant z niedoborem naprawy glikozylazy 3-metyloadeniny-DNA (GC 4803, tag-alkA- mutant) wykazały zwiększoną cytotoksyczność do 2 lub 3 w porównaniu z typem dzikim, AB 1157. typ, AB 1157. Związek monopirolu 1 był jednak około 4-krotnie bardziej cytotoksyczny bardziej cytotoksyczny dla mutanta GC 4803 w porównaniu z typem dzikim i BH 20, sugerując rolę glikozylazy 3-metyloadeniny-DNA w rozpoznawaniu i Natomiast zwiększoną wrażliwość (> 10-krotną) zaobserwowano dla mutanta GC 4803 w porównaniu z typem dzikim i BH 20. 10-krotnie) zaobserwowano dla konwencjonalnej musztardy azotowej BAM w szczepie BH 20 sugerując rolę glikozylazy formamidopirymidyno-DNA w naprawie uszkodzeń wytworzonych przez 1. naprawy uszkodzeń spowodowanych przez ten czynnik. W systemie bezkomórkowym E. coli wykazano, że glikozylaza 3-metyloadeniny-DNA (AlkA) usuwa alkilacje przy 5'-TTTTGPu. Jednak skuteczność w usuwaniu adduktów utworzonych przez związki oligopirolu zmniejszyła się dramatycznie od związku 1 do związku 3. Zwiększenie rozmiaru adduktu DNA utworzonego w rowku mniejszym zmniejszyło zatem zmniejszyło skuteczność rozpoznawania i usuwania adduktu przez glikozylazę DNA glikozylazę DNA. --- Białko Escherichia coli AlkA jest glikozylazą naprawczą wycinania zasad, która usuwa różne alkilowane zasady z DNA. Struktura krystaliczna 2.5 A AlkA skompleksowanego z DNA pokazuje duże zniekształcenie związanego DNA. Enzym przerzuca 1-azaribozowy abazy nukleotyd z DNA i indukuje 66-stopniowe zgięcie w DNA z wyraźnym poszerzeniem rowka mniejszego. Pozycja nukleotydu 1-azarybozy w miejscu aktywnym enzymu sugeruje mechanizm typu S(N)1 dla reakcji glikozylazy glikozylazy, w którym niezbędny katalityczny Asp238 zapewnia bezpośrednie pomoc w usuwaniu zasady. Katalityczna selektywność może wynikać z wzmocnionego łączenia dodatnio naładowanych, alkilowanych zasad z aromatycznym łańcuchem bocznym łańcuch boczny Trp272 w połączeniu ze względną łatwością rozszczepiania osłabionego wiązania glikozylowego tych zmodyfikowanych nukleotydów. Struktura kompleksu AlkA-DNA oferuje pierwsze spojrzenie na glikozylazę złożoną z helisy-spinki do włosów (HhH) glikozylazy skompleksowanej z DNA. Badania modelowe sugerują, że inne glikozylazy HhH mogą wiązać się z DNA w podobny sposób. --- 3-Metyloadeninowa glikozylaza DNA II (AlkA) jest enzymem naprawczym DNA, który usuwa alkilowane zasady w DNA poprzez szlak naprawy przez wycięcie zasady (BER). Enzym należy do nadrodziny glikozylaz DNA helix-hairpin-helix (HhH) i i posiada szeroką specyficzność substratową. W genomie Deinococcus radiodurans, zidentyfikowano dwa geny kodujące domniemane AlkA (Dr_2074 i Dr_2584). Dr_2074 jest homologiem ludzkiego AlkA (MPG lub AAG), a Dr_2584 jest homologiem bakteryjnych AlkA. W niniejszym artykule przedstawiono trójwymiarową strukturę Dr_2584 (DrAlkA2) przedstawiona i porównana z wcześniej ustaloną strukturą Escherichia coli AlkA (EcAlkA). Wyniki pokazują, że enzym składa się z dwóch oddzielonych szeroką szczeliną wiążącą DNA i zawiera motyw HhH i zawiera motyw HhH. Ogólnie rzecz biorąc, fałd białka jest podobny do dwóch helikalnych domen wiązki EcAlkA, podczas gdy trzecia N-końcowa mieszana domena α/β obserwowana w EcAlkA jest nieobecna. jest nieobecna. Analizy specyficzności substratowej pokazują, że DrAlkA2, podobnie jak EcAlkA, jest w stanie usuwać zarówno 3-metyloadeninę (3meA), jak i 7-metyloguaninę (7meG) z DNA; jednak enzym nie wykazuje aktywności wobec 1,N(6)-etenoadeniny (ℇA) i hipoksantyny (Hx). Ponadto wykazuje aktywność wobec dioksygenazy AlkB substratów 3-metylocytozyny (3meC) i 1-metyloadeniny (1meA). Tak więc enzym wydaje się preferencyjnie naprawiać metylowane zasady z osłabionymi wiązaniami N-glikozydowymi wiązaniami N-glikozydowymi; jest to nietypowa specyficzność dla bakteryjnego białka AlkA i jest prawdopodobnie jest prawdopodobnie podyktowana połączeniem szerokiej szczeliny wiążącej DNA i wysoce dostępnej kieszeni specyficzności. dostępnej kieszeni specyficzności. --- Ludzka glikozylaza alkiladeninowa (AAG) i glikozylaza 3-metyloadeninowa Escherichia coli (AlkA) to glikozylazy naprawy wycięcia zasad glikozylaza (AlkA) są glikozylazami naprawczymi, które rozpoznają i wycinają różne alkilowane zasady z DNA. Struktury krystaliczne tych enzymów zapewniły wgląd w ich specyficzność substratową i mechanizmy katalizy. mechanizmy katalizy. Oba enzymy wykorzystują mechanizmy zginania DNA i przerzucania zasad do ekspozycji i wiązania zasad substratowych. Struktury krystaliczne AAG skompleksowanego z DNA sugerują, że enzym wybiera zasady substratowe poprzez połączenie wiązania wodorowego i ograniczeń sterycznych miejsca aktywnego, oraz że enzym aktywuje cząsteczkę wody. aktywuje cząsteczkę wody do ataku wstecznego wiązania N-glikozylowego. wiązania N-glikozylowego. W przeciwieństwie do AAG, struktura kompleksu AlkA-DNA sugeruje, że rozpoznawanie substratu AlkA i specyficzność katalityczna są ściśle zintegrowane w mechanizmie typu S(N)1, w którym katalityczny Asp238 bezpośrednio promuje uwalnianie zmodyfikowanych zasad. --- Różnorodne addukty zasad alkilowanych są naprawiane przez 3-metyloadeninowe glikozylazy DNA glikozylazy, jeden z enzymów naprawczych wycinania zasad. W tym badaniu zbadaliśmy addukty DNA indukowane przez hepsulfam i ustaliliśmy, czy alkilowane mogą być substratami dla bakteryjnych i ssaczych 3-metyladeninowych glikozylaz DNA metodą elektroforezy. Hepsulfam, syntetyczny analog busulfanu, jest znany z alkilowania DNA i tworzenia wiązań międzypasmowych. Zakres wiązań międzypasmowych DNA indukowanych przez hepsulfam i busulfan okazał się być podobny, ale znacznie niższy niż indukowany przez chlorambucyl, jak zmierzono w żelu agarozowym. Główne monofunkcyjne miejsce alkilacji hepsulfamu zaobserwowano w pozycji N7 guaniny, a nie w pozycji N3 adeniny. Oba związki nie wykazywały żadnych sekwencyjnie selektywnych wzorów alkilacji DNA wzorców. Wycięcie indukowanych hepsulfamem adduktów DNA zostało określone przez leczenie homogennymi rekombinowanymi bakteryjnymi, szczurzymi i ludzkimi glikozylazami 3-metyloadeninowymi glikozylazami DNA i kolejnymi zabiegami przez glikozylazę formamidopirymidyno-DNA glikozylazą formamidopirymidynową. Wykazano, że białko alkA Escherichia coli całkowicie usuwa addukty N7 guaniny, podczas gdy 3-metyloadeninowa glikozylaza DNA ssaków nie była w stanie ich ich usunąć. Ponadto, test cytotoksyczności wykazał, że zmutowane szczepy E. coli szczepy wadliwe w genie alkA lub genie uvrA były bardziej wrażliwe na zabicie przez hepsulfam niż typ dziki. --- TŁO: Reaktywne formy tlenu, promieniowanie jonizujące i inne generatory wolnych rodników generatory inicjują konwersję reszt guaniny (G) w DNA do 8-oksoguaniny (OG), która jest wysoce mutagenna, ponieważ preferencyjnie źle paruje się z adeniną (A) podczas replikacji. Bakterie przeciwdziałają temu zagrożeniu za pomocą wieloskładnikowy system, który usuwa uszkodzenie, koryguje błędy OG:A i i oczyszcza pulę prekursorów nukleotydów z dOGTP. Chociaż dowody biochemiczne sugerują istnienie białek naprawczych DNA specyficznych dla OG u eukariontów, niewiele wiadomo na temat tych białek. WYNIKI: Stosując chromatografię powinowactwa naśladującą substrat, a następnie wyizolowaliśmy oparte na mechanizmie kowalencyjnego pułapkowania białko naprawy DNA DNA z Saccharomyces cerevisiae, które przetwarza OG naprzeciwko cytozyny (OG:C), ale działa tylko słabo na OG:A. Przeszukanie bazy danych genomu drożdży przy użyciu sekwencji peptydowych z OG:A. przy użyciu sekwencji peptydowych z białka zidentyfikowano gen OGG1, kodujący przewidywane białko 43 kDa (376 aminokwasów), identyczne z jednym zidentyfikowanym niezależnie przez klonowanie komplementarne. Ogg1 ma specyficzną dla OG:C OG:C, a także wewnętrzną aktywność beta-liazy, która przebiega przez pośrednią zasadę Schiffa. przebiega przez pośrednią zasadę Schiffa. Ukierunkowane przerwanie genu OGG1 w drożdżach ujawniło drugie białko glikozylazy/lizy OG, wstępnie nazwane Ogg2, które różni się od Ogg1 tym, że preferencyjnie działa na OG:G. WNIOSKI: S. cerevisiae ma dwie glikozylazy/lizy specyficzne dla OG, które różnią się znacznie różnią się preferencją dla zasady przeciwnej do zmiany. Sugerujemy że jedna z nich, Ogg1, jest blisko spokrewniona w ogólnej trójwymiarowej strukturze struktura do endonukleazy III (endo III) Escherichia coli, glikozylazy/lizy która działa na pofragmentowane i oksydacyjnie uszkodzone pirymidyny. Niedawno wykazaliśmy, że AlkA, monofunkcyjna glikozylaza DNA, która działa na alkilowane zasady, jest strukturalnie homologiczna do endo III. Obecnie zidentyfikowaliśmy wspólny motyw motyw miejsca aktywnego wśród tych trzech białek. Wykorzystując ten motyw jako narzędzie bazy danych białek, odkryliśmy, że jest on obecny w wielu innych białkach naprawy DNA, które przetwarzają różne zmiany. DNA, które przetwarzają różne uszkodzenia. W związku z tym proponujemy istnienie nadrodziny glikozylaz DNA, której członkowie posiadają wspólny fałd, ale działają na niezwykle zróżnicowane zmiany, od fotoadduktów UV po niedopasowania do alkilowane lub utlenione zasady. --- Deaminacja zasad DNA może zachodzić spontanicznie, generując wysoce mutagenne zmiany, takie jak mutagenne, takie jak uracyl i hipoksantyna. W Escherichia coli dwa enzymy inicjują naprawę reszt hipoksantyny w DNA. Glikozylaza alkilobazowa DNA, AlkA, inicjuje naprawę poprzez usunięcie uszkodzonej zasady, podczas gdy endonukleaza V, Endo V, hydrolizuje drugie wiązanie fosfodiestrowe 3' do uszkodzenia. Zidentyfikowaliśmy i scharakteryzowaliśmy zidentyfikowaliśmy i scharakteryzowaliśmy mysie cDNA o uderzającej homologii do genu nfi E.coli nfi, który ma również znaczące podobieństwa do motywów wymaganych dla aktywności katalitycznej aktywności katalitycznej endonukleazy UvrC. Mysi enzym o masie 37 kDa (mEndo V) nacina nić DNA przy drugim wiązaniu fosfodiestrowym 3' do nukleazy zawierającej hipoksantynę i nukleotydów zawierających uracyl. Aktywność mEndo V jest podwyższona na jednoniciowym substracie DNA in vitro. Ekspresja mysiego białka w DNA DNA szczepu E.coli alkA nfi tłumi jego spontaniczny fenotyp mutatora. fenotyp spontanicznego mutatora. Sugerujemy, że mEndo V inicjuje alternatywny szlak naprawy wycięcia dla usuwania hipoksantyny. Wydaje się zatem, że mEndo V ma właściwości pokrywające się z funkcją glikozylazy alkilobazowej DNA (Aag) w naprawie deaminowanej adeniny, co do pewnego stopnia może wyjaśniać brak fenotypowych nieprawidłowości związanych z nokautem Aag u myszy. --- Schizosaccharomyces pombe ma dwa paralogi 3-metyloadeninowej glikozylazy DNA, Mag1p i Mag2p, które dzielą homologię z Escherichia coli AlkA. Aby wyjaśnić funkcję tych redundantnych enzymów w naprawie alkilacji przez wycięcie zasady (BER) uszkodzeń, przeprowadziliśmy kilka analiz genetycznych. Pojedyncze mutanty mag1 i mag2 jak również podwójny mutant nie wykazywały oczywistej wrażliwości na metanosulfonian metylu (MMS). wrażliwość. Usunięcie mag1 lub mag2 z mutanta nth1 spowodowało tolerancję na uszkodzenia MMS, wskazując, że oba enzymy generują miejsca AP in vivo poprzez usuwanie metylowanych zasad. Mutant rad16, który ma niedobór naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER) (NER) wykazywał umiarkowaną wrażliwość na MMS. Delecja mag1 z mutanta rad16 znacznie zwiększyła wrażliwość na MMS, a delecja mag2 również osłabiła odporność na MMS rad16. odporność na MMS mutanta rad16. Potrójny mutant mag1/mag2/rad16 był najbardziej wrażliwy na MMS. Wyniki te sugerują, że szlak NER przesłania funkcje mag1 i mag2 w oporności na MMS i że oba paralogi inicjują szlak BER uszkodzenia DNA indukowanego przez MMS na tym samym poziomie w komórkach z niedoborem NER lub że Mag2p ma tendencję do wnoszenia nieco mniejszego wkładu niż Mag1p. Mag1p i Mag2p funkcjonowały addytywnie in vivo. Ekspresja mag1 i mag2 w potrójnym mutancie potwierdziła udział Mag1p i Mag2p w BER oporności na MMS. --- Naprawa przez wycięcie zasad uszkodzeń alkilacyjnych DNA jest inicjowana przez glikozylazę metylopurynową DNA (MPG). Takie enzymy zostały wcześniej scharakteryzowane bakterii i eukariontów, ale nie z archeonów. Zidentyfikowaliśmy aktywność dla uwalniania metylowanych zasad z DNA w bezkomórkowych ekstraktach Archaeoglobus fulgidus, archeona rosnącego optymalnie w temperaturze 83 stopni C. Otwarta ramka odczytu jest homologiczna do genu alkA. homologiczna do genu alkA Escherichia coli została poddana nadekspresji i zidentyfikowana jako gen kodujący enzym MPG (M(r) = 34 251), zwany dalej afalkA. Oczyszczone białko AfalkA różni się od E. coli AlkA poprzez wycinanie alkilowanych zasad z DNA, w następującej kolejności wydajności: 3-metyloadenina (m(3)A) >> 3-metyloguanina w przybliżeniu 7-metyloadenina >> 7-metyloguanina. Chociaż szybkość enzymatycznego uwalniania m(3)A jest najwyższa w temperaturze 65-75 stopni C, jest ono zmniejszone tylko o 50% w temperaturze 45 stopni C, temperaturze temperaturze, która nie sprzyja wzrostowi A. fulgidus. W temperaturach powyżej 75 stopni C, dominuje nieenzymatyczne uwalnianie metylopuryn. Wyniki sugerują, że biologiczną funkcją AfalkA jest wycięcie m(3)A z DNA w w temperaturach suboptymalnych, a może nawet mezofilnych. Ta hipoteza jest dalej wspierana przez obserwację, że funkcja genu afalkA tłumi wrażliwość na alkilację podwójnego mutanta E. coli tag alkA. Podobieństwo sekwencji aminokwasów sekwencji aminokwasów i ewolucyjne pokrewieństwo AfalkA z innymi enzymami MPG z trzech domen życia zostały opisane i omówione. --- DNA jest stale narażone na działanie endogennych i egzogennych czynników alkilujących, które mogą które mogą modyfikować jego zasady, powodując mutagenezę przy braku naprawy DNA [1,2]. Uszkodzenia alkilacyjne są usuwane przez działanie glikozylaz DNA, które inicjują szlak naprawy przez wycięcie zasad i chronią informacje o sekwencji genomu [3-5]. sekwencji genomu [3-5]. Zidentyfikowaliśmy nową klasę metylopurynowej glikozylazy DNA, oznaczoną jako MpgII, która jest członkiem rodziny endonukleaz III naprawy DNA enzymów naprawy DNA. Wyizolowaliśmy i oczyściliśmy MpgII z Thermotoga maritima i odkryliśmy, że enzym uwalnia zarówno 7-metyloguaninę, jak i 3-metyladeninę z DNA. Sklonowaliśmy geny MpgII z T. maritima i z Aquifex aeolicus i stwierdziliśmy, że oba geny mogą przywrócić odporność na metylometanosulfonian (MMS) Escherichia coli alkA tagA, które mają niedobory w naprawie zasad alkilowanych. Analogiczne geny występują u innych bakterii i archeonów i wydają się być jedynymi genami kodującymi aktywność glikozylazy metylopurynowej DNA w tych organizmach. MpgII jest piątym członkiem rodziny endonukleaz III enzymów naprawy DNA, co sugeruje, że rusztowanie białkowe endonukleazy III zostało zmodyfikowane podczas ewolucji, aby rozpoznawać i naprawiać różne uszkodzenia DNA. --- Środki metylujące i etylujące są stosowane w przemyśle chemicznym i wytwarzane podczas palenia tytoniu. podczas palenia tytoniu. Generują one uszkodzenia zasad DNA, których rola w indukcji nowotworów została udokumentowana. Alkilowane zasady są naprawiane przez szlak naprawy wycinania zasad. zasad. Ustaliliśmy skuteczność naprawy zasad metylowanych i przez różne białka naprawcze Escherichia coli, a mianowicie 3-metyloadeninę-DNA-glikozylazę I (białko TagA), która wycina 3-metyloadeninę i 3-metyloguaninę, glikozylazę 3-metyladeniny-DNA II (białko AlkA), która ma szeroką specyficzność substratową, w tym 3- i 7-alkilowane puryny oraz formamidopirymidynowa(Fapy)-DNA-glikozylaza (białko Fpg) naprawiająca imidazolowy 7-metyloguaninę z otwartym pierścieniem. Porównanie wartości Km tych różnych enzymów wykazało, że metylowane zasady były usuwane bardziej wydajnie niż zasady etylowane. Kilka pochodnych 3-alkiloadeniny zostało zsyntetyzowanych i i zbadano ich zdolność do hamowania aktywności różnych białek naprawczych. białek naprawczych. Wykazaliśmy, że 3-etylo-, 3-propylo-, 3-butylo- i 3-benzyloadenina były znacznie skuteczniejszymi inhibitorami białka TagA niż 3-metyloadenina. Efekt efekt hamujący zwiększał się wraz ze wzrostem wielkości grupy alkilowej i IC50 dla 3-benzyloadeniny wynosiło 0,4 +/- 0,1 mikroM w porównaniu do 1,5 +/- 0,3 mM dla 3-metyloadeniny. Związki te nie hamowały ani białka AlkA, ani ludzka glikozylaza 3-metyloadeniny-DNA (białko ANPG). Ponadto, 3-hydroksyetyloadenina nie wpływała na aktywność żadnego z tych enzymów. Podsumowując razem, wyniki te sugerują, że interakcje hydrofobowe są zaangażowane w mechanizm mechanizm hamowania i/lub rozpoznawania i wycinania alkilowanych puryn przez białko TagA.
Jaki typ szlaków naprawy DNA jest inicjowany przez glikozylazę AlkA?
Białko AlkA (3-metyloadeninowa glikozylaza DNA II) jest monofunkcyjną glikozylazą DNA, która rozpoznaje szeroki zakres utlenionych i alkilowanych zmian zasadowych i katalizuje hydrolizę wiązania N-glikozydowego w celu zainicjowania szlaku naprawy wycięcia zasady (BER).