Porównawczą analizę biochemiczną przeprowadzono przy użyciu rekombinowanego ludzkiego białka Chk2 (kinaza punktu kontrolnego 2) wyrażonej w bakteriach i komórkach owadzich. Odfosforylowana, nieaktywna, rekombinowana ludzka Chk2 może być reaktywowana w sposób sposób zależny od stężenia. Pomimo różnych, zależnych od czasu kinetyki autofosforylacji poprzez monitorowanie fosforylacji reszt aminokwasowych reszt aminokwasowych T68, S19, S33/35, T432, w Chk2 typu dzikiego i mutantach Chk2 (T68A, T68D i Q69E) dały identyczne specyficzne aktywności. Jednak po filtracji żelowej Chk2 wildtype i mutantów, tylko Chk2 wildtype i mutant T68D prowadziły do tworzenia "czystego" dimeru; pozbawiony fosforylacji dziki typ Chk2 eluował jako monomer. Transfekcja komórek HEK293 dziką odmianą Chk2 i mutantami Chk2 w nieobecności lub obecności uszkodzeń DNA nieobecności lub obecności uszkodzenia DNA wykazała znaczącą fosforylację T68 już w nieobecności odczynników uszkadzających DNA. Po uszkodzeniu DNA zaobserwowano fosforylację zaobserwowano fosforylację dodatkowych miejsc Chk2 (S19, S33/35). Porównanie komórek ATM+/+ i ATM-/- w odniesieniu do fosforylacji reszt T68, S19, S33/35 w przypadku i obecności uszkodzenia DNA wykazało we wszystkich przypadkach fosforylację T68, chociaż intensywność sygnału wzrosła około trzykrotnie po uszkodzeniu DNA. Masa analizy spektrometryczne ludzkiej rekombinowanej Chk2 izolowanej z bakterii i komórek owadzich komórek owadzich wykazały wyraźne różnice. Liczba fosforylowanych reszt w ludzkim rekombinowanym Chk2 wyizolowanym z bakterii wynosiła 16, podczas gdy w przypadku rekombinowanego ludzkiego Chk2 z komórek owadzich wynosiła 8. Z wyjątkiem fosforylowanego aminokwasu T378, który był fosforylowany w komórkach owadzich. aminokwasu T378, którego nie znaleziono w Chk2 wyizolowanym z bakterii, wszystkie inne fosforylowane reszty zidentyfikowane w ludzkim Chk2 z komórek owadzich były obecne również w Chk2 z bakterii.
Jakie są główne wewnątrzcząsteczkowe miejsca fosforylacji ludzkiego Chk2 zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego?
Główne miejsca fosforylacji ludzkiego Chk2 zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego to T68, S19 i S33/35.