Mutacje w genie ELG1 drożdży prowadzą do niestabilności genomowej, przejawiającej się w wysokim poziomem rekombinacji genetycznej, utratą chromosomów i dużymi rearanżacjami chromosomalnymi. rearanżacje chromosomalne. Elg1 wykazuje podobieństwo do dużej podjednostki klamry ładującej czynnika replikacji i tworzy kompleks podobny do RFC (RLC) w połączeniu z 4 małymi podjednostkami RFC. 4 małymi podjednostkami RFC. Dwa dodatkowe RLC istnieją w drożdżach: w jednym z nich dużą podjednostką jest duża podjednostka to Ctf18, a w drugiej Rad24. Ctf18 został scharakteryzowany jako RLC, który funkcjonuje w kohezji chromatyd siostrzanych. Tutaj przedstawiamy dowody że RLC Elg1 (ale nie Rad24) również odgrywa ważną rolę w tym procesie. Ekran genetyczny zidentyfikował podjednostkę kohezyny Mcd1 / Scc1 i jej ładowarkę Scc2 jako jako supresory syntetycznej letalności między elg1 i ctf4. Opisujemy interakcje genetyczne między ELG1 a genami kodującymi podjednostki kohezyny i ich białka pomocnicze. Pokazujemy również, że defekty w Elg1 prowadzą do wyższej przedwczesnej separacji chromatyd siostrzanych oraz że Ctf18 i Elg1 wpływają na kohezję poprzez wspólną ścieżkę wspólny szlak. Wreszcie, lokalizujemy zarówno Ctf18, jak i Elg1 w chromatynie i pokazujemy, że Elg1 odgrywa rolę w rekrutacji Ctf18. Nasze wyniki sugerują, że Elg1, Ctf4 i Ctf18 mogą koordynować względny ruch widełek replikacyjnych w odniesieniu do pierścienia kohezyny. --- CTF4 i CTF18 są wymagane dla wysokiej wierności segregacji chromosomów. Oba wykazują genetyczne i fizyczne powiązania ze składnikami widełek replikacyjnych. Stwierdziliśmy, że brak CTF4 lub CTF18 powoduje niepowodzenie kohezji chromatyd siostrzanych i prowadzi do akumulacji komórek w preanafazie, która zależy od wrzeciona punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Fizyczne i genetyczne interakcje między CTF4, CTF18, i podstawowymi składnikami kompleksów widełek replikacyjnych obserwowanymi w tym badaniu i innych sugerują, że oba produkty genowe działają w połączeniu z widełkami replikacyjnymi widełek replikacyjnych, aby ułatwić kohezję chromatyd siostrzanych. Odkryliśmy, że Ctf18p, białko podobne do RFC1 bezpośrednio oddziałuje z Rfc2p, Rfc3p, Rfc4p i Rfc5p. Jednakże, Ctf18p nie jest składnikiem biochemicznie oczyszczonego antygenu jądrowego proliferujących komórek RF-C, co sugeruje obecność dyskretnego kompleksu zawierającego Ctf18p, Rfc2p, Rfc3p, Rfc4p i Rfc5p. Niedawna identyfikacja i charakterystyka polimerazy kappa drożdży pączkujących, kodowanej przez TRF4, silnie wspiera hipotezę hipotezę, że mechanizm replikacji DNA jest wymagany do prawidłowej kohezji chromatyd siostrzanych. kohezji chromatyd siostrzanych. Analogicznie do roli przełączania polimerazy w kompleksach bakteryjnych i ludzkich kompleksów RF-C, proponujemy, aby pączkujące drożdże RF-C (CTF18) mogły być zaangażowany w przełączanie polimerazy, które ułatwia spójność chromatyd siostrzanych. Wymóg CTF4 i CTF18 w silnej kohezji identyfikuje nowe role dla białek pomocniczych białek pomocniczych replikacji w tym procesie. --- Kohezja między chromatydami siostrzanymi, w której pośredniczy wielopodjednostkowy kompleks zwany kohezyna jest ustanawiana podczas replikacji DNA i jest niezbędna dla uporządkowanej segregacji chromatyd podczas anafazy. U pączkujących drożdży, wyspecjalizowany czynnik replikacyjny C o nazwie RF-C(Ctf18/Dcc1/Ctf8) i kompleks związane z polimerazą DNA alfa białko Ctf4 są wymagane do utrzymania spójności chromatyd siostrzanych w komórkach zatrzymanych na długi czas w mitozie. Pokazujemy tutaj, że CTF8, CTF4 i helikaza kodowana przez CHL1 są wymagane do wydajnej kohezji chromatyd siostrzanych w niezaburzonych komórkach mitotycznych i dostarczają dowodów na to, że że Chl1 funkcjonuje podczas fazy S. Pokazujemy również, że w przeciwieństwie do mitozy, RF-C(Ctf18/Dcc1/Cft8), Ctf4 i Chl1 są niezbędne do segregacji chromosomów podczas mejozy i dla żywotności produktów mejozy. Nasze odkrycie, że komórki usunięte dla CTF8, CTF4 lub CHL1 ulegają masowej mejozie II bez dysjunkcji sugeruje, że drugi podział mejotyczny jest szczególnie wrażliwy na defekty kohezji. defekty. Wykorzystując testy funkcjonalne i cytologiczne, wykazaliśmy, że CTF8, CHL1 i CTF4 są niezbędne dla kohezji między siostrzanymi centromerami podczas mejozy, ale są zbędne do wiązania kohezyny z centromerowym DNA. Nasze odkrycie, że mutanty ctf18 i dcc1 drożdży rozszczepkowych mają podobne defekty sugeruje, że zaangażowanie alternatywnego kompleksu RF-C(Ctf18/Dcc1/Ctf8) w kohezji chromatyd siostrzanych może być wysoce konserwatywny. --- Kohezja między chromatydami siostrzanymi, w której pośredniczy kompleks kohezyny chromosomalnej, jest warunkiem wstępnym dla ich wyrównania na aparacie wrzeciona i segregacji w mitozie. Kohezyna drożdży najpierw łączy się z chromosomami w fazie G1. Następnie, podczas replikacji DNA w fazie S, związana z widełkami replikacyjnymi acetylotransferaza Eco1 acetyluje podjednostkę kohezyny Smc3, aby uczynić wiązanie DNA kohezyny wiązanie odporne na destabilizację przez białko Wapl. Czy stabilizacja cząsteczek kohezyny, które łączą chromatydy siostrzane, jest wystarczająca do zbudować kohezję chromatyd siostrzanych, czy też wymagane są dodatkowe reakcje w celu nie są znane. Oprócz Eco1, kilka innych czynników przyczyniają się do ustanowienia kohezji, w tym Ctf4, Ctf18, Tof1, Csm3, Chl1 i Mrc1, ale niewiele wiadomo o ich roli. Tutaj pokazujemy, że każdy z tych czynników z tych czynników ułatwia acetylację kohezyny. Co więcej, brak Ctf4 i Chl1, ale nie innych czynników, powoduje syntetyczny defekt wzrostu w komórkach pozbawionych Eco1. W odróżnieniu od defektów acetylacji, kohezja chromatyd siostrzanych w ctf4Δ i chl1Δ nie jest poprawiana przez usunięcie Wapl. W przeciwieństwie do wcześniej myśleliśmy, nie znajdujemy dowodów na rolę Ctf4 i Chl1 w przetwarzaniu fragmentów Okazaki lub przetwarzania fragmentów Okazaki w kohezji chromatyd siostrzanych. Tak więc, Ctf4 i Chl1 wyznaczają dodatkową ścieżkę niezależną od acetylacji, która może zawierać ważne wskazówki dotyczące mechanizmu spójności chromatyd siostrzanych ustanowienie. --- Dwie identyczne siostrzane kopie chromosomów eukariotycznych są syntetyzowane podczas fazy S . Aby ułatwić ich rozpoznanie jako pary do segregacji w mitozie, chromatydy siostrzane są utrzymywane razem od momentu ich syntezy przez kompleks kompleks kohezyny chromosomalnej. Uważa się, że progresja widełek replikacyjnych jest sprzężony z ustanowieniem kohezji chromatyd siostrzanych, ułatwiając identyfikację produktów replikacji, ale dowody na to pozostają poszlakowe. Tutaj pokazujemy, że trzy białka wymagane dla spójności chromatyd siostrzanych Eco1, Ctf4 i Ctf18, znajdują się na, a Ctf4 podróżuje wzdłuż chromosomów z widełkami replikacyjnymi. Kompleks kohezyny w kształcie pierścienia jest ładowany na chromosomy przed fazą S w reakcji zależnej od hydrolizy ATP. Ustanowienie kohezji podczas replikacji DNA następuje bez dalszej rekrutacji kohezyny i bez potrzeby ponownego angażowania przez kohezynę motywu hydrolizy ATP który jest krytyczny dla początkowego wiązania DNA. Dostarcza to dowodów na ustanowienia kohezji w kontekście widełek replikacyjnych i nakłada ograniczenia na zaangażowany mechanizm. --- Kohezja chromatyd siostrzanych, proces parowania replikowanych chromosomów podczas mitozy i mejozy mitozy i mejozy, odbywa się za pośrednictwem niezbędnego kompleksu kohezyny i szeregu nieistotnych genów kohezji. szereg nieistotnych genów kohezji, ale specyficzne role tych nieistotnych genów w kohezji chromatyd siostrzanych pozostaje do wyjaśnienia. My przeanalizowaliśmy kohezję chromatyd siostrzanych w podwójnych mutantach mrc1Delta, tof1Delta, i csm3Delta i zidentyfikowaliśmy addytywne defekty kohezji, które wskazywały na istnienie co najmniej dwóch ścieżek, które przyczyniają się do spójności chromatyd siostrzanych. Aby zrozumieć związek innych nieistotnych genów kohezji w odniesieniu do do tych dwóch szlaków, kombinacje par delecji i alleli wrażliwych na temperaturę alleli wrażliwych na temperaturę pod kątem defektów kohezji. Dane te zdefiniowały dwa szlaki kohezji, jeden zawierający CSM3, TOF1, CTF4 i CHL1, oraz drugi zawierający MRC1, CTF18, CTF8 i DCC1. Ponadto stwierdziliśmy, że nieistotne geny nie są ważne dla utrzymania spójności w G(2)/M. G(2)/M. Zatem nasze dane sugerują, że nieistotne geny kohezji mają krytyczny redundantny wkład w ustanowienie spójności chromatyd siostrzanych i definiują dwa szlaki spójności, ustanawiając w ten sposób ramy dla zrozumienia rolę nieistotnych genów w spójności chromatyd siostrzanych. --- Ctf8p jest składnikiem Ctf18-RFC, alternatywnego czynnika replikacji C-podobnego kompleksu wymaganego do wydajnej kohezji chromatyd siostrzanych w Saccharomyces cerevisiae. Przeprowadziliśmy analizę syntetycznej macierzy genetycznej (SGA) ze szczepem delecyjnym ctf8 jako podstawowego badania przesiewowego w celu zidentyfikowania innych nieistotnych genów wymaganych do wydajnej kohezji chromatyd siostrzanych. Następnie oceniliśmy biegłość kohezji w trzech loci chromosomalnych w szczepach zawierających delecje genów zidentyfikowanych w ctf8. genów zidentyfikowanych w badaniu ctf8 SGA. Delecja siedmiu genów (CHL1, CSM3, BIM1, KAR3, TOF1, CTF4 i VIK1) skutkowała wadliwą kohezją chromatyd siostrzanych. spójności. Analiza spektrometrii masowej kompleksów immunoprecypitowanych zidentyfikowała fizyczną asocjację między Kar3p i Vik1p oraz interakcję między Csm3p i Tof1p, którą potwierdziliśmy przez koimmunoprecypitację z ekstraktów komórkowych. Te dane wskazują, że syntetyczna analiza macierzy genetycznej w połączeniu ze specyficznymi może skutecznie identyfikować kompleksy białkowe funkcjonalnie funkcjonalnie związane z genem referencyjnym. Ponadto odkryliśmy, że geny zaangażowane w integralność i pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego wrzeciona mitotycznego mają wcześniej nierozpoznaną rolę w spójności chromatyd siostrzanych. kohezji chromatyd.
Czy istnieje związek między CTF4 i CTF18 podczas kohezji chromatyd siostrzanych?
Tak. CTF4 i CTF18 są wymagane dla wysokiej wierności segregacji chromosomów. Oba wykazują genetyczne i fizyczne powiązania ze składnikami widełek replikacyjnych. Brak CTF4 lub CTF18 powoduje awarię kohezji chromatyd siostrzanych i prowadzi do akumulacji komórek przed anafazą, która zależy od punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Fizyczne i genetyczne interakcje między CTF4, CTF18 i podstawowymi składnikami kompleksów widełek replikacyjnych sugerują, że oba produkty genowe działają w połączeniu z widełkami replikacyjnymi, aby ułatwić kohezję chromatyd siostrzanych.