β-talasemia (β-Thal) to grupa zagrażających życiu zaburzeń krwi spowodowanych przez mutacje punktowe lub delecje nukleotydów w genie β-globiny (HBB). Szacuje się, że szacuje się, że 4,5% populacji na świecie jest nosicielami mutacji β-Thal (1), stanowiąc trwałe zagrożenie dla zdrowia publicznego. Generowanie specyficznych dla pacjenta indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i późniejsza korekta mutacji mutacji chorobotwórczych stanowi idealne rozwiązanie terapeutyczne tego problemu. Jednakże, korekcja genów oparta na rekombinacji homologicznej w ludzkich iPSC pozostaje w dużej mierze nieefektywna. Tutaj opisujemy solidny proces łączący wydajne generowanie wolnych od integracji β-Thal iPSCs z komórek pacjentów oraz nukleazę podobną do aktywatora transkrypcji (TALEN) - opartą na uniwersalnej korekcji mutacji HBB in situ. Wygenerowaliśmy wolne od integracji i iPSC od dwóch pacjentów niosących różne typy mutacji homozygotycznych i wykazaliśmy, że homozygotyczne mutacje i wykazaliśmy, że te iPSC są pluripotencjalne i mają normalny kariotyp. kariotyp. Wykazaliśmy, że proces korekcji nie wygenerował mutacji wywołanych przez TALEN przez sekwencjonowanie. Co ważniejsze, skorygowane geny β-Thal iPS od każdego pacjenta mogą być indukowane do różnicowania w hematopoetyczne komórki progenitorowe, a następnie do erytroblastów wyrażających normalną β-globinę. Nasze badania zapewniają skuteczną i uniwersalną strategię korekcji różnych typów mutacji β-globiny w β-Thal iPSCs dla modelowania i zastosowań choroby modelowania i zastosowań. --- Informacje o autorze: (1)pracuje w Centrum Genomu oraz na Wydziale Biochemii i Medycyny Molekularnej Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, Stany Zjednoczone. Medicine , University of California, Davis , Stany Zjednoczone djsegal@ucdavis.edu. --- Endonukleazy sterowane RNA (RGEN), wywodzące się z prokariotycznego adaptacyjnego systemu odpornościowego znane jako CRISPR/Cas, umożliwiają ukierunkowaną inżynierię genomu w komórkach i organizmach. organizmach. RGEN są rybonukleoproteinami, które składają się z prowadzącego RNA i Cas9, składnika białkowego pochodzącego ze składnika białkowego pochodzącego ze Streptococcus pyogenes. Enzymy te rozszczepiają chromosomalne DNA, którego sekwencja jest komplementarna do RNA w ukierunkowany sposób, tworząc specyficzne dla miejsca sposób, wytwarzając specyficzne dla miejsca pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB), których naprawa które powodują ukierunkowane modyfikacje genomu. Pomimo szerokiego zainteresowania RGEN, nukleazy te są ograniczone przez mutacje poza celem i niepożądane chromosomalne mutacje. mutacje i niepożądane translokacje chromosomalne związane z rozszczepieniami DNA poza celem. rozszczepienia. Tutaj pokazujemy, że efekty RGEN poza celem można zmniejszyć poniżej granic wykrywalności głębokiego sekwencjonowania poprzez wybór unikalnych sekwencji docelowych w genomie w genomie i modyfikując zarówno prowadnicę RNA, jak i Cas9. Odkryliśmy, że zarówno i struktura RNA-przewodnika mogą wpływać na aktywność RGEN w komórkach, aby zmniejszyć efekty poza celem. RGEN skutecznie odróżniały miejsca docelowe od miejsc poza celem, które różnią się o dwie zasady. Co więcej, analiza sekwencjonowania egzomu wykazało, że dwie RGEN nie indukowały mutacji poza celem w czterech populacjach zmutowanych komórek klonalnych populacjach zmutowanych komórek. Ponadto, sparowane nickazy Cas9, składające się z z D10A Cas9 i prowadzącego RNA, które generują dwa pęknięcia jednoniciowe (SSB) lub na różnych niciach DNA, były wysoce specyficzne w ludzkich komórkach, unikając mutacji poza celem bez poświęcania wydajności edycji genomu. Co ciekawe, sparowane nickazy indukowały delecje chromosomalne w ukierunkowany sposób sposób, nie powodując niepożądanych translokacji. Nasze wyniki podkreślają znaczenie wyboru unikalnych sekwencji docelowych i optymalizacji przewodnika RNA i Cas9 w celu uniknięcia lub zmniejszenia mutacji poza celem indukowanych przez RGEN. --- Technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) niesie ogromne nadzieje na wyleczenie hemoglobinopatii. hemoglobinopatii. Należy opracować konstrukty i metody bezpiecznego wprowadzania genów terapeutycznych geny w celu skorygowania defektu genetycznego. Specyficzne dla miejsca jest bardzo atrakcyjną metodą terapii genowej, ponieważ ryzyko mutagenezy insercyjnej jest wyeliminowane. mutagenezy insercyjnej jest wyeliminowane, pod warunkiem, że "bezpieczna przystań" jest i ponieważ pojedynczy zestaw zatwierdzonych konstruktów może być użyty do skorygować wiele różnych mutacji, co upraszcza ewentualne zastosowanie kliniczne. My zgłaszamy tutaj korektę α-talasemii major hydrops fetalis w wolnych od transgenów komórkach iPS przy użyciu insercji globiny za pośrednictwem palca cynkowego w miejscu AAVS1 na ludzkim chromosomie 19. Homozygotyczna insercja najlepszego z 4 testowanych konstruktów doprowadziło do całkowitej korekty niezrównoważenia łańcucha globiny w komórkach erytroidalnych zróżnicowanych z poprawionych komórek iPS. --- Nukleazy efektorowe (TALEN) to zmodyfikowane białka, które mogą stymulować precyzyjną edycję genomu poprzez specyficzne pęknięcia podwójnej nici DNA. Choroba sierpowata i β-talasemia są powszechnymi zaburzeniami genetycznymi spowodowanymi mutacjami w β-globinie. β-globinie, a my zaprojektowaliśmy parę wysoce aktywnych TALEN, które indukują modyfikację modyfikację 54% ludzkich alleli β-globiny w pobliżu miejsca mutacji sierpowatej. mutacji. Te TALENy stymulują ukierunkowaną integrację terapeutyczną, cDNA beta-globiny o pełnej długości do endogennego locus β-globiny w 19% komórek przed selekcją, co określono ilościowo za pomocą sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym. My również wysoce aktywne TALEN do ludzkiej γ-globiny, celu farmakologicznego w terapii farmakologicznym w terapii choroby sierpowatokrwinkowej. Używając TALEN-ów β-globiny i γ-globiny, wygenerowaliśmy linie komórkowe wygenerowaliśmy linie komórkowe, które wyrażają GFP pod kontrolą endogennej β-globiny i tdTomato pod kontrolą endogennego promotora γ-globiny promotora. Za pomocą tych fluorescencyjnych reporterowych linii komórkowych zbadaliśmy bibliotekę związków małocząsteczkowych pod kątem ich zróżnicowanego wpływu na aktywność transkrypcyjną aktywność endogennych genów β- i γ-globiny i zidentyfikowaliśmy kilka, które które preferencyjnie zwiększają ekspresję γ-globiny. --- Efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALE), po raz pierwszy zidentyfikowane w bakteriach Xanthomonas są naturalnie występującymi lub sztucznie zaprojektowanymi białkami, które modulują transkrypcję genów. Białka te rozpoznają i wiążą sekwencje DNA w oparciu o zmienną liczbę powtórzeń tandemowych. Każde powtórzenie składa się z zestawu ∼ 34 konserwowanych aminokwasów; w obrębie tej konserwowanej domeny zwykle występują zazwyczaj dwa aminokwasy, które odróżniają jedną TALE od drugiej. Co ciekawe, TALE ujawniły prosty szyfr do rozpoznawania białek jeden do jednego dla zasad DNA. DNA. Syntetyczne TALE zostały z powodzeniem wykorzystane do celowania w geny różnych gatunków, w tym ludzi. gatunków, w tym ludzi. W zależności od rodzaju domeny funkcjonalnej, która jest domeny funkcjonalnej, białka te mogą mieć różne efekty biologiczne. efekty biologiczne. Na przykład, po związaniu DNA, TALE połączone z domenami aktywacji transkrypcji mogą funkcjonować jako silne czynniki transkrypcyjne (TALE-TF), podczas gdy połączone z endonukleazami restrykcyjnymi (TALEN) mogą ciąć DNA. Ukierunkowana edycja genomu w teorii jest w stanie zmodyfikować dowolną endogenną sekwencję genu, która nas interesuje. może być przeprowadzana w komórkach lub organizmach i może zostać zastosowana do klinicznych terapiach opartych na genach w przyszłości. Dzięki obecnym technologiom, wysoce nie można osiągnąć bardzo dokładnej, specyficznej i niezawodnej edycji genów. Zatem, mechanizmy rozpoznawania i wiązania regulujące biologię TALE są obecnie gorącymi obszarami badawczymi. obszary badawcze. W niniejszym przeglądzie podsumowujemy główne postępy w technologii TALE w ciągu ostatnich kilku lat, koncentrując się na interakcji między TALE a DNA, projektowaniu i budowie TALE, potencjalnych zastosowaniach tej technologii oraz unikalnych cechach, które sprawiają, że i unikalnych cechach, które sprawiają, że TALE są lepsze od endonukleaz z palcem cynkowym. od endonukleaz z palcem cynkowym. --- Endonukleaza Cas9 jest centralnym składnikiem systemu CRISPR/Cas typu II, prokariotycznego adaptacyjnego systemu restrykcyjnego przeciwko inwazyjnym kwasom nukleinowym, takim jak pochodzących z bakteriofagów i plazmidów. Niedawno ten endonukleaza DNA ukierunkowana na RNA została wykorzystana do celowania w interesujące sekwencje DNA. sekwencji DNA. Tutaj dokonujemy przeglądu rozwoju Cas9 jako ważnego narzędzia nie tylko do nie tylko edytować genomy wielu różnych gatunków prokariotycznych i eukariotycznych, ale także jako wydajny system gatunków prokariotycznych i eukariotycznych, ale także jako skuteczny system do specyficznej dla miejsca transkrypcji represji lub aktywacji transkrypcji. Dodatkowo, zaobserwowano, że specyficzne białko Cas9 zaobserwowano celowanie w substrat RNA, co sugeruje, że Cas9 może mieć zdolność być zaprogramowany do celowania również w RNA. Białka Cas z innych podtypów CRISPR/Cas mogą być również wykorzystywane w tym zakresie. Tak więc, systemy CRISPR/Cas stanowią skuteczne i wszechstronne narzędzie biotechnologiczne, które będzie miało znaczący wpływ na przyszłe postępy w inżynierii genomowej. --- Edycja genomu przy użyciu zmodyfikowanych nukleaz, takich jak nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (transcription activator-like nukleazy efektorowe (TALEN) stała się potężną technologią dla genetyki odwrotnej. genetyki. W tym badaniu opisaliśmy skuteczne metody wykrywania mutacji indukowanych przez mutacji indukowanych przez TALEN w endogennych loci i przedstawiliśmy wytyczne dotyczące projektowania TALEN dla skutecznej ukierunkowanej mutagenezy u medaki, Oryzias latipes. My przeprowadziliśmy test mobilności heterodupleksów (HMA) przy użyciu zautomatyzowanego systemu elektroforezy microchip elektroforezy, która jest prostą i wysokowydajną metodą oceny aktywności TALEN in vivo. oceny aktywności in vivo TALEN i do genotypowania zmutowanych ryb F1 lub późniejszych pokoleń. Odkryliśmy, że specyficzny wzór mutacji jest dominujący dla TALEN posiadających kilka par zasad homologicznych sekwencji w sekwencji docelowej. Co więcej, odkryliśmy, że 5' T, przed każdą sekwencją wiążącą TALEN, jest nie jest niezbędna do rozszczepienia genomowego DNA. Nasze odkrycia dostarczają informacji, które rozszerzają potencjał TALEN i innych zmodyfikowanych nukleaz jako narzędzi do ukierunkowanej edycji genomu w szerokim zakresie organizmów, w tym medaki. --- Naprawa niedopasowania DNA (MMR) w znacznym stopniu przyczynia się do integralności genomu poprzez korektę niedopasowanych zasad, które są generowane głównie przez błędy replikacji. Postreplikacyjny MMR usuwa stosunkowo długi odcinek jednoniciowego DNA zawierający błędy. jednoniciowy DNA. MutL jest szeroko konserwowaną endonukleazą, która kieruje reakcję wycięcia do zawierającej błąd nici dupleksu poprzez specyficzne nacinanie nici potomnej. Ponieważ MutL najwyraźniej wykazuje niespecyficzną aktywność endonukleazy odcinającej in vitro, mechanizm regulacyjny MutL był przedmiotem dyskusji. Ostatnie badania sugerują zależne od ATP zmiany konformacyjne i i funkcjonalne zmiany MutL, wskazując, że mechanizm regulacyjny obejmuje cykl wiązania i hydrolizy ATP. W tym badaniu zbadaliśmy wpływ wiązania ATP na strukturę MutL. Po pierwsze, eksperyment sieciowania potwierdził, że N-końcowa domena ATPazy fizycznie oddziałuje z endonukleazą C-końcową domeną endonukleazy. Następnie spektrometria masowa z wymianą wodór/deuter wyjaśniła, że wiązanie spektrometria wyjaśniła, że wiązanie ATP z domeną N-końcową indukuje lokalne zmiany strukturalne w miejscach katalitycznych C-końcowej domeny MutL. Wreszcie, na podstawie wyników eksperymentu wymiany wodoru/deuteru z powodzeniem zidentyfikowaliśmy nowe regiony istotne dla aktywności aktywności endonukleazy MutL. Wyniki wyraźnie pokazują, że ATP moduluje aktywność endonukleazy aktywność endonukleazy MutL poprzez rearanżacje strukturalne miejsca katalitycznego. miejsca katalitycznego. Ponadto, kilka mutacji związanych z zespołem Lyncha w ludzkim homologu MutL MutL znajduje się w pozycji odpowiadającej nowo zidentyfikowanemu regionowi katalitycznemu. region katalityczny. Nasze dane przyczyniają się do zrozumienia związku między mutacjami w homologu MutL a chorobami człowieka. --- Naprawa przez wycinanie zasad (BER) to system naprawczy pierwszej linii, który jest odpowiedzialny za utrzymanie integralności genomu, a tym samym zapobieganie przedwczesnemu starzeniu się, rakowi i wielu innym chorobom ludzkim poprzez naprawę tysięcy uszkodzeń DNA i pęknięć nici w sposób ciągły powodowanych przez endogenne i egzogenne mutageny. Ta podstawowa i zasadnicza funkcja BER nie tylko wymaga ścisłej kontroli nad ciągłej dostępności podstawowych składników do szybkiej i dokładnej naprawy, ale także wymaga czasowej i przestrzennej koordynacji BER i cyklu komórkowego aby zapobiec replikacji uszkodzonego DNA. Głównym celem tego przeglądu jest krytyczne zbadanie kontrowersyjnych i nowo pojawiających się pytań dotyczących szlaków BER ssaków, mechanizmów regulujących zdolność BER, odpowiedzi BER na uszkodzenia DNA i ich powiązań z kontrolą punktu kontrolnego i ich powiązań z kontrolą replikacji DNA w punktach kontrolnych. --- W tym badaniu wykorzystaliśmy nokaut receptora arylowego węglowodoru (AHR) lub jądrowego translokatora AHR (ARNT) w MCF7 i MCHR. receptora węglowodorowego (AHR) lub translokatora jądrowego AHR (ARNT) w MCF7 i AHR w ludzkich komórkach raka piersi MDA-MB-231 w celu zbadania krzyżowej rozmowy między AHR, ARNT i receptorem estrogenowym α (ERα). Nokaut AHR lub ARNT zapobiegał powstawaniu 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioksyna (TCDD) - zależna indukcja wszystkich docelowych genów AHR badanych genów. Znokautowanie AHR lub ARNT również znacząco zmniejszyło podstawowe poziomy ekspresji cytochromu P4501B1 (CYP1B1), które zostały przywrócone z nadekspresji któregokolwiek z białek, ale nie z mutantem AHR z niedoborem wiązania DNA mutanta. Rekrutacja podstawowa i zależna od TCDD, 17β-estradiolu (E2) lub TCDD + E2 AHR, ARNT, ERα, NCoA3 i polimerazy RNA II do CYP1B1, jak również CYP1B1 mRNA zostały zniesione w komórkach MCF7-AHR((ko)) i MDA-MB-231 AHR(ko). Jednakże, zmniejszona, ale znacząca zależna od E2 rekrutacja ERα, NCoA3 i RNA polimerazy II do CYP1B1 i słaby wzrost poziomów mRNA CYP1B1 zaobserwowano w komórkach MCF7 ARNT((ko)). Co ciekawe, zależny od E2 wzrost czynnika trefoil czynnika 1, ale nie regulacji wzrostu przez estrogen w raku piersi 1 (GREB1) mRNA były zależne od ekspresji ARNT. Ponadto, zależny od TCDD wzrostowi proteolitycznej degradacji ERα zapobiegała utrata AHR lub ARNT. Nasze dane pokazują, że AHR i ARNT odgrywają kluczową rolę w podstawowym, TCDD i indukowanej przez E2 regulacji CYP1B1, ale także ujawniają różne role dla oba białka w transaktywacji ERα. --- W ciągu ostatnich 5 lat nastąpiła znacząca transformacja w naszej zdolności do precyzyjnego manipulowania genomami zwierząt. precyzyjnego manipulowania genomami zwierząt. Wydajność wprowadzania precyzyjnych genetycznych w genomach dużych zwierząt poprawiła się 100000-krotnie dzięki nukleaz specyficznych dla danego miejsca, które wprowadzają dwuniciowe pęknięcia DNA ze specyficznością 10(-9). Poniżej opisujemy nasze zastosowania nukleazy specyficzne dla miejsca, zwłaszcza nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji do inżynierii specyficznych zmian w genomach świń i krów. Możemy możemy wprowadzać zmienne zmiany, w których pośredniczy niehomologiczne łączenie końców DNA do nieaktywnych genów. Alternatywnie, stosując naprawę ukierunkowaną homologicznie, wprowadziliśmy specyficzne zmiany, które wspierają albo precyzyjne zmiany w polipeptydzie kodowanego polipeptydu, eliminację genu lub zastąpienie go inną niepowiązaną sekwencją DNA. sekwencją DNA. W zależności od genu i mutacji, możemy osiągnąć 10%-50% skutecznych wskaźników precyzyjnych mutacji. Zastosowania nowej genetyki precyzyjnej są bardzo szerokie. Zwierzęta hodowlane mogą być teraz projektowane z wybranymi fenotypami, które które zwiększą ich wartość i adaptację do zmiennych ekosystemów. Ponadto, zwierzęta mogą być zaprojektowane tak, aby naśladować ludzkie choroby i zaburzenia, co przyspieszy produkcję niezawodnych leków i urządzeń. Co więcej, zwierzęta mogą zostać zaprojektowane tak, aby stały się lepszymi dostawcami biomateriałów stosowanych w leczeniu chorób i zaburzeń. biomateriałów stosowanych w leczeniu chorób i zaburzeń. --- 1. --- 1.
Które z nowo zidentyfikowanych nukleaz DNA mogą być stosowane w leczeniu talasemii?
Talasemia to choroba genetyczna krwi spowodowana mutacjami w genie globiny.  Głównym celem leczenia talasemii jest opracowanie terapii genowej opartej na rekombinacji homologicznej w celu wyleczenia tych chorób. Nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) i nukleazy efektorowe TAL (TALEN) są właściwymi celami dla ludzkiego genu globiny. Edycja genomu przy użyciu zmodyfikowanych nukleaz, takich jak ZFN i TALEN, stała się potężną technologią dla genetyki odwrotnej.