Główną fitoaleksyną w lucernie jest izoflawonoid (-)-medikarpina (lub 6aR, 11aR)-medikarpina. Reduktaza izoflawonowa (IFR), przedostatni enzym w biosyntezie biosyntezy medikarpiny, jest odpowiedzialna za wprowadzenie jednego z dwóch centrów chiralnych w (-)-medikarpinie. centrów w (-)-medikarpinie. Wyizolowaliśmy cDNA lucerny o wielkości 1,18 kb (pIFRalf1) który po ekspresji w Escherichia coli przekształca 2'-hydroksyformononetynę stereospecyficznie do (3R) -vestitone, jak można by przewidzieć dla IFR z lucerny. Obliczona masa cząsteczkowa polipeptydu (35 400) pochodzi z otwartej ramki odczytu 954 bp wypada korzystnie w porównaniu z szacowaną masą cząsteczkową Mrs określonymi dla białek IFR oczyszczonych z innych roślin strączkowych. Transkrypt (1,4 kb) jest silnie indukowany w wywołanych kulturach komórkowych lucerny. Kinetyka indukcji są zgodne z pojawieniem się aktywności IFR, akumulacją medikarpiny i obserwowaną indukcją innych enzymów w szlaku. Niskie poziomy transkryptów IFR stwierdzono w zdrowych częściach roślin (korzenie i guzki) które gromadzą niski poziom glukozydu medikarpiny. IFR wydaje się być kodowany przez pojedynczy gen w lucernie. Klonowanie IFR otwiera możliwość genetycznej manipulacji biosyntezą fitoaleksyn w lucernie poprzez zmianę stereochemię izoflawonoidów. --- Koniugaty izoflawonoidów: medikarpina-3-O-glukozyd-6''-O-malonian (MGM), afrormozyna-7-O-glukozyd (AG) i afrormozyna-7-O-glukozyd-6''-O-malonian (AGM) zostały wyizolowane i scharakteryzowane z kultur zawiesin komórkowych lucerny (Medicago sativa L.), gdzie były głównymi konstytutywnymi metabolitami wtórnymi. metabolity wtórne. Znaleziono je również w korzeniach lucerny, ale nie w innych częściach rośliny. roślin. Medikarpina fitoaleksyny szybko gromadziła się w zawiesinie hodowanych komórek. komórkach traktowanych elicytorem z Colletotrichum lindemuthianum, czemu towarzyszył towarzyszył wzrost poziomu MGM. W przeciwieństwie do tego, akumulacja netto akumulacja koniugatów afrormozyny nie była zaburzona przez traktowanie elicytorem. Badania znakowania [(14)C]fenyloalaniną wykazały, że koniugaty afrormozyny były głównymi produktami izoflawonoidowymi syntetyzowanymi de novo w komórkach niepoddanych elicytacji. Podczas elicytacji, [(14)C]fenyloalanina była włączana głównie do medikarpina, chociaż znaczna część nowo zsyntetyzowanej medikarpiny była również sprzężona. Traktowanie znakowanych (14)C, wywołanych komórek za pomocą kwasem l-alfa-aminooksy-beta-fenylopropionowym, silnym inhibitorem aktywności PAL in vivo, spowodował początkowe pojawienie się znakowanej medikarpiny o bardzo niskiej specyficznej aktywności, co sugeruje, że fitoaleksyna może być uwalniana z wstępnie uformowanego koniugatu w tych warunkach. Nasze dane zwracają uwagę na zaangażowanie hydroksylaz izoflawonowych podczas konstytutywnego i akumulacji izoflawonoidów i ich koniugatów w kulturach komórkowych lucerny. lucerny. --- Medicarpin, główna fitoaleksyna w lucernie, jest syntetyzowana poprzez izoflawonoidowej gałęzi metabolizmu fenylopropanoidów. Grupa metylowa w pozycji 9 medikarpiny jest ogólnie akceptowana jako powstająca poprzez metylację pozycji 4' (pierścień B) daidzeiny. Zaskakujące jest to, że izoflawono-O-metylotransferaza (IOMT), która jest indukowana wraz z innymi enzymami zaangażowany w biosyntezę medikarpiny, metyluje 7-hydroksylową grupę pierścienia A daidzeiny in vitro, reakcja, która prawdopodobnie nie zachodzi in vivo. Wykorzystując informacje o wewnętrznej sekwencji aminokwasów z oczyszczonego IOMT lucerny, wyizolowaliśmy wyizolowaliśmy trzy pełnej długości klony cDNA IOMT. Przeszukanie baz danych białek ujawniło podobieństwo sekwencji do O-metylotransferaz z różnych źródeł. Najwyższe najwyższe dopasowanie (50,5% identyczności) stwierdzono między IOMT8 i 6a-hydroksymaackiainą 3-O-metylotransferazą z Pisum sativum. Masa cząsteczkowa IOMT lucerny wyrażonej w Escherichia coli była podobna do masy oczyszczonej IOMT z lucerny lucerny (41 kDa przez SDS-PAGE). Rekombinowany enzym katalizował O-metylację grup hydroksylowych pierścienia A izoflawonów, a także może metylować pterokarpan (+) 6a-hydroksymaackiainę. Lucerna zawiera wiele genów IOMT, a blisko spokrewnione sekwencje są obecne w genomach ciecierzycy i cowpea, gatunków, które również produkują metylowane izoflawonoidy pierścienia B in vivo. Analiza Northern blot wykazała, że transkrypty IOMT są szybko indukowane po elicytacji, przed wzrostem aktywności IOMT i akumulacji medikarpiny i akumulacją medikarpiny. Możliwa rola izoflawonu 7-OMT w syntezie formononetyny formononetyny in vivo. --- Medicarpin, główna fitoaleksyna w lucernie, jest syntetyzowana poprzez izoflawonoidowej gałęzi metabolizmu fenylopropanoidów. Jeden z ostatnich etapów biosyntezy biosyntezy medikarpiny, od vestitonu do 7,2'-dihydroksy-4'-metoksyizoflavanolu, jest katalizowany przez reduktazę vestitonu. Klon cDNA o długości 1245 pz, który koduje reduktazę vestitone zidentyfikowano wykorzystując wewnętrzną sekwencję aminokwasową oczyszczonej reduktazy vestitone. Po ekspresji w Escherichia coli, sklonowany enzym enzym wykazuje ścisłą stereospecyficzność substratową dla (3R)-westytonu, jak zaobserwowano w przypadku zaobserwowano dla reduktazy vestitone oczyszczonej z lucerny. Obliczona masa cząsteczkowa białka (35,918) jest podobna do masy oczyszczonej reduktazy vestitone reduktazy z lucerny (38 kDa przez SDS-PAGE). Poziomy transkryptu reduktazy vestitone transkryptu (1,35 kb) znacznie wzrasta w ciągu 2 godzin od dodania elicytora do lucerny lucerny, poprzedzając gwałtowny wzrost aktywności enzymu reduktazy vestitione i biosyntezy medikarpiny. W zdrowych roślinach lucerny najwyższe poziomy transkryptów wykryto w korzeniach i guzkach korzeniowych, co jest zgodne z syntezą medikarpiny i jej koniugatu w tych tkankach. Klonowanie genu reduktazy vestitone zapewnia specyficzne narzędzie do badania i manipulowania biosyntezą pterokarpanu w roślinach strączkowych. --- Aby ustalić, dlaczego aktywowany cykl metylowy jest regulowany w górę w roślinach przechodzących reakcje obronne na patogeny grzybowe, monitorowaliśmy wykorzystanie grup metylowych pochodzących z metioniny w kulturach zawiesiny komórkowej lucerny siewnej (Medicago sativa L.) traktowanych przez różny czas elicytorem grzybowym, poprzez przeprowadzenie równoległego badania znakowania [(35)S]metioniną i [metylo-(3)H]metioniną. Dystrybucja dwóch radioznaczników wśród pożywki, rozpuszczalnych składników komórkowych i ściany komórkowej. W przypadku nieobecności elicytora wykorzystanie obu radioznaczników było podobne. Jednakże, w obecności elicytora całkowite włączenie radioaktywności z [metylo-(3)H]metioniny do metabolitów było znacznie większe niż z [(35)S]metioniny, co wskazuje, że etykieta metylowa została wykorzystana w reakcjach metylacji. reakcjach metylacji. Leczenie elicytorem spowodowało nawet sześciokrotny wzrost w wykorzystaniu grup (3)H-metylowych w metylacji metabolitów hydrofobowych. W okresie 0-24 h po działaniu elicytora, zwiększona metylacja była ukierunkowana głównie na syntezę izoflawonoidowej fitoaleksyny medicarpin i pokrewnych metabolitów. Nowo zsyntetyzowane fitoaleksyny były eksportowane do pożywki. pożywki, podczas gdy znaczna część medikarpiny gromadzi się w komórce we wczesnych etapach elicytacji. we wczesnych etapach elicytacji pochodziła z hydrolizy jej odpowiedniego koniugatu. odpowiedniego koniugatu. Leczenie elicytorem zmodyfikowało również przyłączanie grup (3)H-metylowych do ściany komórkowej. Między 0 a 24 godziną po działaniu elicytora zmniejszyła się metylacja pektyny w ścianie komórkowej. Po 24 godz, metylacja pektyn powróciła do normy i była związana ze wzrostem metylacji innych składników polisacharydowych związanych ze ścianą. Ponieważ żaden inny główny metaboliczny dla zwiększonej metylacji został określony, wnioskujemy, że zwiększona aktywność aktywowanego cyklu metylowego podczas interakcji obronnych w lucernie lucerny jest wymagana do wspierania syntezy fitoaleksyn i modyfikacji ściany komórkowej. modyfikacji. --- Hodowle zawiesin komórkowych lucerny (Medicago sativa L.) gromadziły wysokie stężenia fitoaleksyny pterokarpanu medikarpiny, osiągając maksimum w ciągu 24 godzin po ekspozycji na preparat elicytora ze ścian komórkowych fitopatogennego grzyba Colletotrichum lindemuthianum. Było to poprzedzone wzrost ekstrahowalnych aktywności enzymów biosyntezy izoflawonoidów l-fenyloalaninowej liazy amoniakalnej, 4-hydroksylazy kwasu cynamonowego, koenzymu 4-kumaranu A-ligaza, syntaza chalkonu, izomeraza chalkonu i izoflawon O-metylotransferaza. Polisacharydy pektynowe były słabymi elikitorami fenyloalaniny amoniakalnej, ale nie indukowały akumulacji medikarpiny, podczas gdy zredukowany glutation był całkowicie nieaktywny jako elicitor w tym systemie. Ekstrakt ekstrakt ze ściany komórkowej grzyba był słabym elicytorem enzymów biosyntezy ligniny, O-metylotransferazy kwasu kawowego i dehydrogenazy alkoholu koniferylowego, ale nie nie indukuje znaczącego wzrostu aktywności enzymów hydrolitycznych chitynazy i 1,3-beta-d-glukanazy. Wyniki zostały omówione w odniesieniu do aktywacji biosyntezy izoflawonoidów w innych roślinach strączkowych i rozwoju lucerny jako modelu do badania enzymologii i biologii molekularnej obrony roślin. biologii molekularnej ekspresji obrony roślin.
Co jest główną fitoaleksyną w lucernie (Medicago sativa L.)?
Główną fitoaleksyną w lucernie (Medicago sativa L.) jest izoflawonoid (-)-medikarpina (lub 6aR, 11aR)-medikarpina. Medicarpin jest syntetyzowany poprzez izoflawonoidową gałąź metabolizmu fenylopropanoidów.