Nukleazy specyficzne dla sekwencji, takie jak TALEN i system CRISPR/Cas9, znacznie rozszerzyły możliwości edycji genomu w organizmach modelowych, takich jak danio pręgowany. Oba systemy zostały ostatnio wykorzystane do tworzenia alleli knock-out z dużą skutecznością. wydajnością, a TALEN zostały również z powodzeniem zastosowane w knock-in kaset DNA w określonych loci poprzez rekombinację homologiczną (HR). Poniżej przedstawiamy Pośredniczone przez CRISPR/Cas9 wbijanie kaset DNA do genomu danio pręgowanego przy bardzo wysokiej szybkości poprzez niezależną od homologii naprawę podwójnych pęknięć nici (DSB) ścieżki. Po jednoczesnym wstrzyknięciu plazmidu-dawcy z krótkim RNA (sgRNA) i mRNA nukleazy Cas9, jednoczesne rozszczepienie DNA plazmidu dawcy i i wybranego chromosomalnego miejsca integracji skutkowało wydajną ukierunkowaną integracją DNA dawcy. Z powodzeniem zastosowaliśmy to podejście do przekształcenia eGFP w linie transgeniczne Gal4 a te same plazmidy i sgRNA mogą być stosowane u każdego gatunku, u którego wygenerowano linie eGFP. gdzie linie eGFP zostały wygenerowane jako część ekranów wzmacniaczy i pułapek genowych. Ponadto Ponadto pokazujemy możliwość łatwego ukierunkowania integracji DNA na endogennych loci, znacznie ułatwiając w ten sposób tworzenie alleli reporterowych i alleli utraty funkcji. Ze względu na swoją prostotę, elastyczność i bardzo wysoką wydajność, nasza metoda znacznie rozszerza repertuar edycji genomu u danio pręgowanego. danio pręgowanego i może być łatwo zaadaptowana do wielu innych organizmów. --- Zastosowaliśmy system CRISPR/Cas9 do komórek Drosophila S2, aby wygenerować ukierunkowanych mutacji genetycznych w ponad 85% alleli. Poprzez celowanie w konstytutywny ekson genu AGO1, wykazaliśmy homozygotyczną mutację w maksymalnie 82% komórek, umożliwiając w ten sposób badanie nokautów genetycznych w linii komórkowej Drosophila po raz pierwszy. Wykazaliśmy, że homologiczne celowanie w geny jest możliwe z wydajnością 1-4% przy użyciu tego systemu, pozwalając na konstrukcję zdefiniowanych insercji i delecji. Wykazaliśmy, że ramię homologiczne o długości 1&emsp14;kb jest optymalna do integracji przez homologiczne targetowanie genów i demonstrujemy jego skuteczność poprzez znakowanie endogennego białka AGO1. Technologia ta umożliwia kontrolowaną manipulację genetyczną w liniach komórkowych Drosophila, a jej prostota oferuje możliwość badania fenotypów komórkowych w całym genomie. --- Myszy niosące mutacje w wielu genach są tradycyjnie generowane przez sekwencyjną rekombinację w embrionalnych komórkach macierzystych i/lub czasochłonne krzyżowanie myszy z pojedynczą mutacją. System CRISPR/Cas został zaadaptowany jako wydajna technologia celowania w geny z potencjałem do multipleksowej edycji genomu. Pokazujemy, że edycja genów za pośrednictwem CRISPR/Cas pozwala na jednoczesne zakłócenie pięciu genów (Tet1, 2, 3, Sry, Uty--8 ) w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ES) z wysoką wydajnością. Wstrzyknięcie Cas9 mRNA i jednoprzewodowych RNA (sgRNA) ukierunkowanych na Tet1 i Tet2 do zygot wygenerowało myszy z biallelicznymi mutacjami w obu genach z wydajnością 80%. Wreszcie, pokazujemy, że jednoczesne wstrzyknięcie Cas9 mRNA/sgRNA ze zmutowanymi oligos wygenerowało precyzyjne mutacje punktowe jednocześnie w dwóch genach docelowych. Tak więc system CRISPR/Cas pozwala na jednoetapowe generowanie zwierząt niosących mutacje w wielu genach, podejście, które znacznie przyspieszy badanie in vivo funkcjonalnie redundantnych genów i epistatycznych interakcji między genami. --- System CRISPR/Cas9 typu II (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) stał się ostatnio skutecznym i prostym narzędziem inżynierii proste narzędzie do inżynierii genomów eukariotycznych. Aby poprawić jego zastosowania w inżynierii genomu Drosophila, uprościliśmy standardowy dwuskładnikowy system CRISPR/Cas9 poprzez wygenerowanie stabilnej linii transgenicznej muchy wyrażającą endonukleazę Cas9 w linii zarodkowej (linia Vasa-Cas9). Poprzez wstrzyknięcie wektory wyrażające specyficzne dla celu przewodnie RNA do zarodków muchy Vasa-Cas9 zarodki, mutacje zostały wygenerowane z rozszczepień DNA specyficznych dla miejsca i skutecznie przenoszone na potomstwo. Ponieważ endonukleaza Cas9 jest uniwersalnym składnikiem systemu CRISPR/Cas9 typu II, inżynieria genomowa specyficzna dla miejsca inżynieria genomowa oparta na tej ulepszonej platformie może być osiągnięta przy niższej złożoności i toksyczności, większej spójności i doskonałej wszechstronności. --- Od dawna poszukiwano prostej i niezawodnej metody ukierunkowanej mutagenezy u danio pręgowanego. od dawna. Poprzednie metody generowały monoalleliczne mutacje w linii zarodkowej zwierząt F0 zwykle opóźniając homozygotyczność mutacji do pokolenia F2. Generowanie silnych mutacji biallelicznych w F0 pozwoliłoby na analizę fenotypową bezpośrednio analizę fenotypową bezpośrednio u wstrzykniętych zwierząt. Ostatnio prokariotyczny typ II (ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) /CRISPR (ang. (CRISPR)/CRISPR-associated proteins (Cas) został zaadaptowany jako narzędzie ukierunkowanej mutagenezy genomu. ukierunkowane narzędzie mutagenezy genomu. Tutaj przedstawiamy ulepszony system CRISPR/Cas u danio pręgowanego z niestandardowymi przewodnimi RNA i białkiem Cas9 zoptymalizowanym pod kątem kodonów danio pręgowanego. które skutecznie celowało w transgen reporterowy Tg(-5.1mnx1:egfp) i cztery endogenne loci (tyr, golden, mitfa i ddx19). Wskaźniki mutagenezy osiągnęły 75-99%, wskazując, że większość komórek zawierała mutacje bialleliczne. Recesywne null-podobne fenotypy zaobserwowano w czterech z pięciu przypadków celowania, wspierając wysokie wskaźniki zaburzeń genów biallelicznych. Zaobserwowaliśmy również skuteczne transmisję mutacji indukowanych przez Cas9 w linii zarodkowej. Wreszcie, pięć loci genomowych może być celem jednocześnie, co skutkuje wieloma fenotypami utraty funkcji fenotypów u tej samej wstrzykniętej ryby. Ten system CRISPR/Cas9 reprezentuje wysoce skuteczną i skalowalną metodę eliminacji genów u danio pręgowanego i ma potencjał do zastosowań w innych organizmach modelowych. --- Doniesiono, że Cas9/CRISPR skutecznie indukuje ukierunkowane przerwanie genów i rekombinację homologiczną. rekombinacji homologicznej zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. W związku z tym opracowaliśmy platformę projektowania sekwencji prowadzącego RNA dla systemu wyciszania Cas9/CRISPR dla organizmów modelowych. Platforma jest łatwa w użyciu do projektowania gRNA z wejściowych sekwencji zapytań. Znajduje potencjalne cele przez PAM i szereguje je według czynników, w tym unikalności, SNP, struktury drugorzędowej RNA i zawartości AT zawartość. Platforma umożliwia użytkownikom przesyłanie i udostępnianie wyników eksperymentów. wynikami eksperymentów. Ponadto, większość sekwencji RNA z opublikowanych artykułów została umieszczonych w naszej bazie danych. --- Modyfikacje genów w modelach zwierzęcych zostały znacznie ułatwione dzięki zastosowanie ukierunkowanych narzędzi do edycji genomu. Prokariotyczny system edycji genomu CRISPR/Cas9 typu II został ostatnio zastosowany w liniach komórkowych i kręgowcach. kręgowców. Jednak nadal mamy bardzo ograniczone informacje na temat skuteczności mutagenezy, szybkości transmisji w linii zarodkowej i efektów poza celem w genomach organizmów modelowych. genomach organizmów modelowych. Obecnie wykazujemy, że mutageneza CRISPR/Cas9 u u danio pręgowanego jest wysoce wydajna, osiągając nawet 86,0% i jest dziedziczna. Wydajność Wydajność systemu CRISPR/Cas9 dodatkowo ułatwiła ukierunkowane knock-in znacznika białkowego dostarczonego przez oligonukleotyd dawcy z wydajnością knock-in na poziomie 3,5-15,6%. Wskaźniki mutacji w potencjalnych miejscach poza celem wynoszą tylko 1,1-2,5%, wykazując specyficzność systemu CRISPR/Cas9. Łatwość i wydajność systemu CRISPR/Cas9 z ograniczonymi efektami off-target sprawiają, że jest to potężne narzędzie inżynierii genomowej in vivo. narzędzie inżynierii genomu do badań in vivo.
Jaka jest główna funkcja biologiczna systemu edycji genomu CRISPR-CAS9?
System CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) stał się ostatnio skutecznym i prostym narzędziem do inżynierii genomów eukariotycznych. System CRISPR/Cas9 przyciągnął znaczną uwagę ze względu na swój potencjał do przekształcania inżynierii genomowej. Wykazano, że kierowana przez RNA nukleaza Cas9 może być stosowana do inżynierii genomu Drosophila, a modyfikacje te są skutecznie przenoszone przez linię zarodkową. System CRISPR/Cas9 skutecznie indukuje ukierunkowane przerwanie genów i homologiczną rekombinację zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. System CRISPR/Cas9 został wykorzystany do tworzenia alleli knock-out z dużą wydajnością, a także został wykorzystany do knock-in kaset DNA w określonych loci poprzez rekombinację homologiczną (HR). Łatwość i wydajność systemu CRISPR/Cas9 z ograniczonymi efektami poza celem sprawiają, że jest to potężne narzędzie inżynierii genomu do badań in vivo.