Tlenek azotu (NO) i peptyd natriuretyczny typu B (BNP) chronią przed urazowi niedokrwienno-reperfuzyjnemu, ponieważ zwiększają wewnątrzkomórkowy poziom cGMP poprzez aktywację rozpuszczalnych (sGC) lub cząsteczkowych cyklaz guanylanowych (pGC), odpowiednio. Celem niniejszego badania było zbadanie, czy mediatory podnoszące poziom cGMP mediatory, NO i BNP, mają wspólny szlak sygnałowy poprzez zależną od cGMP kinazę białkową (PKG) w cytoprotekcji serca. Noworodkowe szczurze miocyty serca in vitro poddano 2,5-godzinnemu symulowanemu niedokrwieniu (SI) a następnie 2-godzinnej reoksygenacji. Żywotność komórek testowano za pomocą błękitu trypanu z wykluczeniem błękitu trypanu. Aktywność PKG miocytów serca oceniano za pomocą fosfolambanu (PLB) określoną metodą western blot. Śmierć komórek wynosiła 34 +/- 2% po SI/reoksygenacji w grupie kontrolnej. Czynniki indukujące cGMP znacząco zmniejszały nieodwracalne uszkodzenie komórek. zmniejszyły nieodwracalne uszkodzenie komórek: analog cGMP 8-bromo-cGMP (8-Br-cGMP, 10 nM) zmniejszył je do 13 +/- 1% (p < 0,001), bezpośredni donor NO S-nitrozo-N-acetylopenicylamina (SNAP, 1 mikroM) do 18 +/- 6% (p < 0,05) i BNP (10 nM) odpowiednio do 12 +/- 2% (p < 0,001). Ten efekt ochronny został zniesiony przez selektywny inhibitor PKG KT-5823 (600 nM) w każdym przypadku. Ponieważ PLB nie jest unikalnym reporterem dla aktywności PKG, ponieważ jest również fosforylowany przez kinazę białkową A (PKA), zbadaliśmy fosforylację PLB w obecności inhibitora PKA inhibitora PKA KT-5720 (1 mikroM). Stosunek pPLB/PLB znacząco wzrósł po podaniu zarówno BNP, jak i 8-Br-cGMP w warunkach niedokrwienia, co został zniesiony przez inhibitor PKG. Jest to pierwszy dowód na to, że podwyższony cGMP wytwarzany przez aktywator sGC SNAP lub aktywator pGC BNP wywiera działanie cytoprotekcyjne poprzez wspólny szlak sygnałowy downstream obejmujący aktywację PKG. --- Zależna od Ca(2+)-kalmoduliny kinaza białkowa II (CaMKII) odgrywa ważną rolę pośrednicząc w apoptozie / martwicy podczas niedokrwienia i reperfuzji (IR). Zbadaliśmy mechanizmy mechanizmy tego szkodliwego efektu. Serca szczurów i transgenicznych myszy perfundowano metodą Langendorffa serca myszy z inhibicją CaMKII ukierunkowaną na retikulum sarkoplazmatyczne (SR-AIP) zostały poddane globalnej IR. Początek reperfuzji zwiększył fosforylację fosforylację miejsca Thr(17) fosfolambanu, bez zmian w całkowitym białku. białka, co jest zgodne ze wzrostem aktywności CaMKII. Zamiast tego nastąpił proporcjonalny spadek fosforylacji miejsca Ser2815 receptorów ryanodynowych (RyR2) i receptorów ryanodynowych (RyR2) i ilości RyR2 na początku reperfuzji, tj. stosunek Ser2815/RyR2 nie uległ zmianie. Zahamowanie odwrotnego Na(+)/Ca(2+)trybu wymiennika (NCX) (KBR7943) zmniejszyło fosforylację fosfolambanu fosforylację, zmniejszało apoptozę/nekrozę i zwiększało regenerację mechaniczną. Zahamowanie CaMKII (KN-93), znacząco zmniejszyło fosforylację fosfolambanu fosforylację, obszar zawału, uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (martwica), dodatnie jądra TUNEL, aktywność kaspazy-3, stosunek Bax/Bcl-2 i indukowane przez Ca(2+) obrzęk mitochondriów (apoptoza) i zwiększona odbudowa kurczliwości, gdy w porównaniu z nieleczonymi sercami IR lub sercami IR poddanymi działaniu nieaktywnego analogu analogiem KN-92. Blokowanie ładowania i uwalniania SR Ca(2+) (tapsigargina/dantrolen), mitochondrialnego uniportera Ca(2+) (czerwień rutenowa/RU360) lub mitochondrialnego (cyklosporyna A), znacząco zmniejszyły wielkość zawału, uwalnianie LDH i apoptozę. rozmiar zawału, uwalnianie LDH i apoptozę. Serca SR-AIP nie wykazywały wzrostu fosforylacji Thr(17). fosforylacji Thr(17) fosfolambanu na początku reflow i wykazywały znaczny spadek wielkości zawału, apoptozy i martwicy w stosunku do kontroli. kontroli. Wyniki ujawniają szlak apoptotyczno-martwiczy, w którym pośredniczą zależne od CaMKII fosforylacje w SR, które obejmują odwrotny tryb NCX i mitochondria jako odpowiednio wyzwalacz i efekt końcowy kaskady. --- Pompa wapniowa siateczki sarkoplazmatycznej (SERCA) i jej regulator, fosfolamban, są niezbędnymi składnikami kurczliwości serca. Fosfolamban moduluje kurczliwość poprzez hamowanie SERCA, a proces ten jest dynamicznie regulowany przez stymulację β-adrenergiczną i fosforylację fosfolambanu. W niniejszym artykule ujawniamy mechanistyczny wgląd w to, w jaki sposób cztery dziedziczne mutanty fosfolambanu, Arg(9) do Cys, Arg(9) do Leu, Arg(9) do His i Arg(14) zmieniają regulację SERCA. Delecja Arg(14) zakłóca motyw rozpoznawania kinazy białkowej motyw rozpoznawania kinazy białkowej A, który znosi fosforylację fosfolambanu i skutkuje konstytutywnym hamowaniem SERCA. Mutacja Arg(9) powoduje bardziej złożone zmiany w funkcji, gdzie podstawienia hydrofobowe, takie jak cysteina i leucyna leucyna eliminują zarówno hamowanie SERCA, jak i fosforylację fosfolambanu, podczas gdy podstawienie aromatyczne, takie jak histydyna, selektywnie zakłóca fosforylację. Wykazaliśmy, że rola Arg(9) w funkcji fosfolambanu jest wielopłaszczyznowa: jest ważna dla hamowania SERCA, zwiększa wydajność fosforylacji i ma kluczowe znaczenie dla kinazy białkowej A w kontekście pentameru fosfolambanu. Biorąc pod uwagę synergistyczne konsekwencje dla kurczliwości, nie jest zaskakujące, że mutanty powodują śmiertelną, dziedziczną kardiomiopatię rozstrzeniową. --- Fosfolamban jest głównym białkiem błonowym serca fosforylowanym w odpowiedzi na stymulację beta-renergiczną. odpowiedzi na stymulację beta-adrenergiczną. W systemach bezkomórkowych, zależna od cAMP kinaza białkowa katalizuje wyłączną fosforylację seryny 16 fosfolambanu, podczas gdy fosfolambanu, podczas gdy kinaza białkowa zależna od Ca2+/kalmoduliny daje wyłączną fosforylację treoniny fosforylację treoniny 17 (Simmerman, H. K. B., Collins, J. H., Theibert, J. L., Wegener, A. D. i Jones, L. R. (1986) J. Biol. Chem. 261, 13333-13341). W tej pracy zlokalizowaliśmy miejsca fosforylacji fosfolambanu w nienaruszonych komorach poddanych działaniu agonisty beta-adrenergicznego izoproterenolu. Izolacja fosforylowanego fosfolambanu z komór świnki morskiej poddanych perfuzji 32P a następnie częściową hydrolizę kwasową i analizę fosfoaminokwasów, ujawniła fosforylację zarówno reszt serynowych, jak i treoninowych. W stanie stacjonarnym po ekspozycji na izoproterenol, fosfolamban zawierał w przybliżeniu równe ilości tych dwóch fosfoaminokwasów. Dwa główne tryptyczne fosfopeptydy zawierające więcej niż 90% włączonej radioaktywności uzyskano z fosfolambanu znakowanego w nienaruszonych komorach. Sekwencje aminokwasowe tych dwóch peptydów tryptycznych odpowiadały dokładnie resztom 14-25 i 15-25 psiego sercowego fosfolambanu, lokalizując w ten sposób miejsca fosforylacji in situ do seryny 16 i treoniny 17. Fosforylacja fosfolambanu w dwóch miejscach w serce perfundowane izoproterenolem było wspierane przez wykrycie 11 różnych form ruchliwości pentamerycznego białka przy użyciu metody Western blotting, zgodnie z każdym monomerem fosfolambanu zawierającym dwa miejsca fosforylacji, oraz z każdym pentamerem zawierającym od 0 do 10 wbudowanych fosforanów. Nasze wyniki lokalizują miejsca fosforylacji fosfolambanu in situ do seryny 16 i treoniny 17, a ponadto są zgodne z fosforylacją te 2 reszty są katalizowane odpowiednio przez kinazy białkowe zależne od cAMP i Ca2+/kalmoduliny. kinazy, odpowiednio. --- ATPaza wapniowa 2a sarkoendoplazmatycznego retikulum (SERCA2a) ma kluczowe znaczenie dla sekwestracji wapnia cytozolowego do siateczki sarkoendoplazmatycznej (SR) i regulując relaksację mięśnia sercowego. Interakcje białko-białko wskazywały że istnieje w kompleksie z kinazą białkową II zależną od Ca(2+)/kalmoduliny (CaMKII) i jej białkiem kotwiczącym alfaKAP. Konfokalne obrazowanie izolowanych kardiomiocytów ujawniło kolokalizację CAMKII i alfaKAP z SERCA2a w SR. Analiza delecji wykazała, że SERCA2a i CaMKII wiążą się do różnych regionów w domenie asocjacyjnej alfaKAP. regionami w domenie asocjacyjnej alphaKAP, ale nie ze sobą nawzajem. Chociaż delecja domniemanego N-końcowego hydrofobowego odcinka aminokwasu w alfaKAP uniemożliwiła jego ukierunkowanie na błonę, nie wpłynęła na wiązanie z SERCA2a lub CaMKII. Stwierdzono, że zarówno CaMKIIdelta (C), jak i nowe izoformy CaMKIIbeta (4) istnieją w kompleksie z alfaKAP i SERCA2a w SR i były w stanie fosforylować Thr-17 na fosfolambanie (PLN), podjednostce pomocniczej i znanym regulator aktywności SERCA2a. Co ciekawe, stwierdzono również, że obecność alfaKAP znacząco moduluje zależną od Ca(2+)/kalmoduliny fosforylację Thr-17 na PLN. Dane te pokazują, że alfaKAP wykazuje nową interakcję z SERCA2a i interakcję z SERCA2a i może służyć do przestrzennego pozycjonowania izoform CaMKII w SR i unikalnie modulować fosforylację PLN. --- Fosfolamban (PLN) jest małą fosfoproteiną ściśle związaną z retikulum sarkoplazmatycznym serca (SR). Pozbawiony fosforylacji PLN tonicznie hamuje SR Ca-ATPazę (SERCA2a), podczas gdy fosforylacja Ser16 przez PKA i Thr17 przez Ca(2+) / kinazę białkową zależną od kalmoduliny (CaMKII) łagodzi hamowanie, a to zwiększa wychwyt SR Ca(2+). Z tego powodu PLN jest jednym z głównych determinantów kurczliwości i relaksacji serca. W tym przeglądzie próbowaliśmy podkreślić funkcjonalne znaczenie PLN w fizjologii serca kręgowców. kręgowców. Odniesiemy się do ogromnej literatury na temat ssaków w celu opisania charakterystykę molekularną tego białka, jego interakcję z SERCA2a i jego rolę w regulacji mechaniki mięśnia sercowego. jego rolę w regulacji mechaniki i wydajności elektrycznej serca w warunkach serca w warunkach podstawowych, w obecności stresów chemicznych i fizycznych, takich jak stymulacja β-adrenergiczna, odpowiedź na rozciąganie, zależność siła-częstotliwość i kwasica wewnątrzkomórkowa. zależność siła-częstotliwość i kwasica wewnątrzkomórkowa. Naszym celem jest zapewnienie podstaw do omówienia roli PLN również w funkcji serca kręgowców innych niż ssaki. kręgowców, ponieważ do tej pory ten aspekt był prawie pomijany. Odpowiednio, o ile to możliwe, literatura na temat PLN zostanie przeanalizowana z uwzględnieniem niejednolite cechy strukturalne i funkcjonalne serca napotkane w ektotermicznych kręgowców, takich jak specyficzna i zmienna organizacja SR, duże spektrum odpowiedzi na stres i dezaptacyjny brak kluczowych białek (np. kluczowych białek (tj. gatunki pozbawione hemoglobiny i mioglobiny). --- Zmniejszona cykliczność wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej (SR), odzwierciedlająca upośledzony transport Ca w SR transportu i uwalniania Ca, jest kluczową i uniwersalną cechą ludzkiej i eksperymentalnej niewydolności serca. i eksperymentalnej niewydolności serca. Te procesy SR są regulowane przez multimeryczne białkowe, w tym kinazy białkowe i fosfatazy, a także ich podjednostki kotwiczące i regulatorowe. podjednostki kotwiczące i regulatorowe, które precyzyjnie dostrajają obsługę Ca w określonych podprzedziałach SR podprzedziałach SR. W transporcie Ca w SR pośredniczy SR Ca-ATPaza (SERCA2a) i jej regulatorową fosfoproteinę, fosfolamban (PLN). Defosforylowany PLN jest inhibitorem SERCA2a i fosforylacji przez kinazę białkową A (PKA) lub kinazy białkowe zależne od wapnia i kalmoduliny (CAMKII) łagodzą te hamujące efekty. Ostatnie badania zidentyfikowały dodatkowe białka regulatorowe, związane z PLN, które kontrolują transport Ca w SR. Należą do nich inhibitor-1 (I-1) fosfatazy białkowej 1 (PP1), małe białko szoku cieplnego 20 (Hsp20) oraz HS-1 związane z białkiem X-1 (HAX1). Ponadto, wewnątrz światła bogate w histydynę białko wiążące wapń (HRC) oddziałuje z SERCA2a i triadyną. Warto zauważyć, że istnieje fizyczna i bezpośrednia interakcja między tymi białkowymi graczami, pośrednicząc w drobnej krzyżowej rozmowie między wychwytem SR Ca, magazynowaniem i uwalnianiem. Co ważne, regulacja cyklu SR Ca przez interakcję PLN/SERCA wpływa nie tylko na kurczliwość kardiomiocytów, ale także na przeżycie i przebudowę. Rzeczywiście, naturalnie występujące warianty w tych genach cyklu Ca modulują ich aktywność i interakcje z innymi partnerami białkowymi, powodując w obniżonej kurczliwości i przyspieszonej przebudowie. Te warianty genetyczne mogą służyć jako potencjalne markery prognostyczne lub diagnostyczne w patofizjologii serca. patofizjologii serca. --- Kardiomiocyty przystosowują się do stresu fizycznego, zwiększając swój rozmiar, jednocześnie utrzymując funkcję komórki. Kinaza serynowo-treoninowa Akt odgrywa kluczową rolę w tym procesie adaptacji. w tym procesie adaptacji. Wcześniej donosiliśmy, że transgeniczna nadekspresja aktywnej formy Akt (Akt-E40K) u myszy skutkuje zwiększoną kurczliwością serca i rozmiarem komórek. kurczliwości serca i wielkości komórek, a także poprawę sarkoplazmatycznego retikulum (SR) Ca(2+). Ponieważ nie jest to w pełni wyjaśnione, postanowiliśmy zbadać molekularny mechanizm mechanizm molekularny, dzięki któremu nadekspresja Akt-E40K poprawia obsługę SR Ca(2+) handling. W tym celu, wychwyt SR Ca(2+) i status fosforylacji fosfolambanu (PLN) oceniano w ekstraktach z serca myszy typu dzikiego i Akt-E40K myszy i myszy z indukowalnym i specyficznym dla serca nokautem kinazy zależnej od fosfatydyloinozytolu-1, aktywatora Akt. Co więcej, wpływ Akt oceniano in vitro poprzez nadekspresję zmutowanego Akt ukierunkowanego preferencyjnie na SR oraz przez testy biochemiczne w celu oceny potencjalną interakcję z PLN. Stwierdziliśmy, że po aktywacji Akt oddziałuje z i fosforyluje PLN na Thr(17), miejscu kinazy zależnej od Ca(2+)-kalmoduliny IIdelta, podczas gdy wyciszenie sygnalizacji Akt, poprzez nokaut kinazy zależnej od fosfatydyloinozytolu-1, spowodowało zmniejszenie fosforylacji PLN na Thr (17). Ponadto nadekspresja Akt ukierunkowanego na SR w kardiomiocytach poprawiła obsługę Ca(2+) bez wpływu na rozmiar komórek. Tak więc, opisujemy tutaj nowy mechanizm, w którym preferencyjna translokacja Akt do SR jest jest odpowiedzialna za zwiększenie kurczliwości bez stymulacji przerostu.
Które kinazy białkowe fosforylują fosfolamban i wpływają na jego aktywność biologiczną?
Fosforylacja fosfolambanu przy Ser16 jest głównie mediowana przez PKA, a przy Thr17 przez kinazę białkową zależną od Ca(2+)/kalmoduliny (CaMKII). Fosfolamban jest również reporterem aktywności PKG, a kinaza Akt oddziałuje z PLN i fosforyluje go na Thr(17).