Glikoproteiny w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) są zmienione u pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) w porównaniu do osób kontrolnych. Wykorzystaliśmy deplecję albuminy przed elektroforezą żelową 2D w celu zwiększenia stężenia glikoprotein do analizy obrazu, jak również do oznaczania glikoprotein strukturalnych bez glikanów przy użyciu spektrometrii mas (MS). Korzyści płynące z bezpośredniej analizy glikoprotein obejmują minimalną manipulację próbką i zachowanie szczegółów strukturalnych. Ilościowe porównanie oddzielonych żelem izoform glikoprotein izoform od dwunastu pacjentów z AD i dwunastu osób kontrolnych przeprowadzono za pomocą specyficznych dla glikoprotein i białek całkowitych. Porównaliśmy również glikoformy w zbiorczym płynie mózgowo-rdzeniowym uzyskanym od pacjentów z AD i osób kontrolnych za pomocą spektrometrii masowej. spektrometrii mas. Jedna izoforma alfa1-antytrypsyny wykazywała zmniejszoną glikozylację u pacjentów z AD, podczas gdy inna glikozylowana izoforma nieprzypisanego białka była w górę. Poziomy ekspresji białka alfa1-antytrypsyny były obniżone, podczas gdy poziomy białka apolipoproteiny E i klasteryny były zwiększone w AD. Żadna konkretna glikoforma nie mogła być przypisana do AD. --- Stwierdzono, że glikoproteiny w płynie mózgowo-rdzeniowym są zmienione u pacjentów z chorobą Alzheimera w porównaniu do osób zdrowych. Wykorzystaliśmy mikro-roztwór izoelektryczny i chromatografię powinowactwa, przed żelem elektroforezę, aby umożliwić specyficzne dla miejsca oznaczenie strukturalne N-linked glikanów w apolipoproteinie J przy użyciu FT-ICR MS. Metoda usuwania albuminy jest najbardziej odpowiednia jako metoda wstępnej frakcjonacji płynu mózgowo-rdzeniowego przed 2-DE dla strukturalnego oznaczania glikoprotein w badaniach zaburzeń neurodegeneracyjnych. zaburzeń neurodegeneracyjnych. --- CELE: Dwie różne strategie usuwania albuminy z ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), Microcon płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), filtr odśrodkowy Microcon vs. zestaw Montage Albumin Deplete, zostały ocenione pod kątem poprawy wzorca profilowania białek i powtarzalności analizy SELDI. powtarzalności w analizie SELDI. PROJEKT I METODY: Zbiorczy płyn mózgowo-rdzeniowy podzielono na 20 podwielokrotności i te podwielokrotności poddano analizie SELDI po usunięciu albuminy lub bez wstępnego przetwarzania. Profile białkowe uzyskano przy użyciu chipów CM10, Q10 i IMAC. WYNIKI: Obie strategie doprowadziły do wiarygodnego zubożenia albuminy (<6,2 mg/L, filtr; 8,1 mg/L, zestaw do usuwania). Badane metody usuwania albuminy nie wykazały znaczących różnic we współczynnikach zmienności (CV) intensywności piku w porównaniu do nieprzetworzonego płynu mózgowo-rdzeniowego na prawie wszystkich typach chipów. Intensywności pików były znacząco wyższe po usunięciu albuminy w porównaniu do CSF bez wstępnego przetwarzania na chipach Q10 i CM10. Niemniej jednak, obie strategie zubożenia w albuminy doprowadziły do zmniejszenia liczby wykrytych pików na wszystkich w porównaniu do nieprzetworzonego płynu mózgowo-rdzeniowego, ale kilka dodatkowych pików, nie w nieprzetworzonym płynie mózgowo-rdzeniowym. WNIOSKI: Badanie to pokazuje, że zmniejszenie złożoności próbki poprzez zubożenie płynu mózgowo-rdzeniowego w albuminy można przeprowadzić bez pogorszenia CV. Jednakże znaczenie tej strategii należy jednak oceniać oddzielnie dla każdego indywidualnego badania odkrywania biomarkerów. --- TŁO: W płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), który jest bogatym źródłem biomarkerów dla chorób neurologicznych, identyfikacja biomarkerów wymaga metod, które pozwalają na powtarzalne wykrywanie białek o niskiej liczebności. Dlatego kluczowe jest zmniejszenie zakresu dynamicznego i poprawa oceny obfitości białek. WYNIKI: Zastosowaliśmy LC-MS/MS do porównania wydajności dwóch technik wzbogacania CSF które immunodeplementują samą albuminę (IgYHSA) lub 14 białek o wysokiej obfitości (IgY14). białek (IgY14). W celu oszacowania zakresu dynamicznego zidentyfikowanych białek mierzyliśmy obfitość białek za pomocą metody zliczania spektralnego APEX. Obie metody immunodeplecji poprawiły liczbę wykrytych białek o niskiej (3-krotnie dla IgYHSA, 4-krotnie dla IgY14). 10 najbardziej obfitych białek po immunodeplecji stanowiło 41% (IgY14) i 46% (IgYHSA) zawartości białek w płynie mózgowo-rdzeniowym. zawartość, podczas gdy stanowiły one 64% w próbkach bez deplecji, tym samym wykazując znaczące wzbogacenie białek o niskiej zawartości. Zdefiniowane metryki eksperymentów proteomicznych wykazały ogólnie dobrą odtwarzalność dwóch metod metod immunodeplecji i analizy MS. Co więcej, frakcjonowanie peptydów offline w próbce IgYHSA pozwoliło na 4-krotny wzrost liczby zidentyfikowanych białek (520 vs. 131 bez frakcjonowania), bez utrudniania odtwarzalności. WNIOSKI: Nowością tego badania było pokazanie zalet i wad tych metod obok siebie. tych metod obok siebie. Biorąc pod uwagę lepszą wykrywalność i potencjalną utratę białek innych niż docelowe po rozległej immunodeplecji, stwierdzono, że że obie metody zubożania w połączeniu z liczeniem spektralnym mogą być interesujące przed zainteresowania przed dalszym frakcjonowaniem, podczas poszukiwania biomarkerów CSF. Zgodnie z wiarygodną identyfikacją i kwantyfikacją uzyskaną za pomocą algorytmu APEX można uznać za tanią i szybką alternatywę do badania zawartości proteomicznej próbki. zawartości proteomicznej próbki. --- Obecnie dostępne są różne metody usuwania składników o wysokiej zawartości w płynach ustrojowych. obecnie dostępne. Podczas gdy większość metod jest skonstruowana do usuwania osocza, istnieje potrzeba opracowania strategii specyficznych dla płynów ustrojowych. Celem niniejszego badania było zaprojektowanie matrycy powinowactwa odpowiedniej do usuwania białek o wysokiej białek w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Stąd, cząsteczki o specyficznym powinowactwie do białek obecnych w wysokim stężeniu w płynie mózgowo-rdzeniowym. Affibody to specyficzne cząsteczki wiążące o niewielkich rozmiarach, które wykazały wysoką stabilność w różnych warunkach i dlatego są dobrymi kandydatami do takiej matrycy. Skład białek w płynie mózgowo-rdzeniowym przypomina ten w osoczu. Jednak 20% białek białek pochodzi z mózgu i dlatego są obecne w wyższych proporcjach w płynie mózgowo-rdzeniowym niż w osoczu. CSF niż w osoczu, podczas gdy większe białka pochodzące z osocza są mniej obfite w CSF. CSF. Dlatego pięć białek CSF o wysokiej obfitości zostało wybranych do zaprojektowania zestawu CSF. Cząsteczki affibody o swoistości wobec HSA (albumina surowicy ludzkiej), IgG, transferyna i transtyretyna zostały połączone w kolumnie powinowactwa. kolumnie powinowactwa. Ponadto, poliklonalne przeciwciała przeciwko cystatynie C zostały sprzężone z kulkami chromatograficznymi i umieszczone w oddzielnej kolumnie. Wysoce zaobserwowano wysoce powtarzalne i skuteczne usuwanie pięciu docelowych białek. Odsetek odsetek zubożonych białek oszacowano na 99, 95, 74, 92 i 83% dla HSA, IgG, transferyny, transtyretyny i cystatyny C. ANALIZA SDS/PAGE wykorzystano do monitorowania i identyfikacji białek w natywnym płynie mózgowo-rdzeniowym, zubożonych próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego i wychwyconych frakcjach. Ponadto, proteomika shotgun do identyfikacji białek w natywnym, jak i zubożonym płynie mózgowo-rdzeniowym i porównano uzyskane dane. porównano uzyskane dane. Zwiększoną identyfikację składników o niższej liczebności składników zaobserwowano we frakcji zubożonej, pod względem większej liczby wykrytych peptydów na białko. peptydów na białko.
Pozbawienie albuminy jest powszechnym pierwszym krokiem w analizie proteomicznej płynu mózgowo-rdzeniowego. Jakie są zalety i wady tej procedury?
Pozbawienie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego białka albuminy o wysokiej obfitości poprawia wykrywanie białek o niższej obfitości, ale może również prowadzić do potencjalnej utraty białek innych niż docelowe.