Transpozony wniosły sekwencje kodujące białka do nieoczekiwanie dużej liczby liczbę ludzkich genów. Z wyjątkiem rekombinazy V(D)J i telomerazy, wszystkie pozostają o nieznanej funkcji. Tutaj badamy aktywność ludzkiego białka SETMAR białka o wysokiej ekspresji, będącego fuzją metylazy histonu H3 i transpozazy z rodziny mariner transpozazą z rodziny mariner. Chociaż SETMAR wykazał aktywność metylazy i fenotyp naprawy naprawy DNA, jego sposób działania i rola domeny transpozazy pozostają niejasne. pozostają niejasne. Jako punkt wyjścia do rozwiązania tego problemu, przeanalizowaliśmy aktywność domeny transpozazy w kontekście białka o pełnej długości i wyizolowanej domeny transpozazy. Całkowita transpozycja zmodyfikowanego transpozonu Hsmar1 przez domenę transpozazy, chociaż zakres reakcji był ograniczony przez poważny defekt domeny transpozazy. reakcji był ograniczony przez poważny defekt rozszczepiania na końcach 3' elementu. elementu. Pomimo tego problemu, SETMAR zachowuje silną aktywność dla innych etapów transpozonu Hsmar1. etapów reakcji transpozycji Hsmar1, a mianowicie wiązania DNA specyficznego dla miejsca do końców transpozonu, tworzenia kompleksu sparowanych końców, rozszczepiania 5' elementu w Mn(2+) i integracja w docelowym miejscu dinukleotydu TA. Jest mało prawdopodobne, aby SETMAR katalizował transpozycję w ludzkim genomie, chociaż aktywność może odgrywać rolę w fenotypie naprawy DNA. Kluczową aktywnością dla domeny mariner jest zatem silna aktywność wiązania i zapętlania DNA która ma wysoki potencjał do kierowania domeny metylazy histonowej do wielu tysięcy specyficznych miejsc wiązania w ludzkim genomie dostarczanych przez kopie transpozonu transpozonu Hsmar1. --- Po replikacji DNA chromatydy siostrzane muszą zostać rozplątane lub zdekatenizowane, przed mitozą, aby chromatydy nie rozerwały się podczas anafazy. Topoizomeraza IIalfa (Topo IIalfa) jest głównym enzymem dekatenującym. Inhibitory topo IIalfa zapobiegają dekatenacji, powodując zatrzymanie komórek podczas mitozy. Tutaj donosimy że komórki ostrej białaczki szpikowej nie zatrzymują się w punkcie kontrolnym dekatenacji mitotycznej punktu kontrolnego, a ich progresja przez ten punkt kontrolny jest regulowana przez składnik naprawy DNA Metnase (określany również jako SETMAR). Metnase zawiera SET metylazę histonów i domenę nukleazy transpozazy i jest składnikiem systemu szlaku naprawy podwójnych pęknięć nici DNA. Metnase oddziałuje z Topo IIalfa i zwiększa jej aktywność dekatenacyjną. Tutaj pokazujemy że wiele typów komórek ostrej białaczki ma osłabione zatrzymanie mitotyczne gdy dekatenacja jest zahamowana i że w linii komórkowej ostrej białaczki szpikowej (AML) linii komórkowej AML pośredniczy Metnase. Co ważniejsze, Metnase pozwala na dalszą proliferację tych komórek AML nawet w obecności klinicznego inhibitora inhibitora Topo IIalfa VP-16. In vitro, oczyszczona Metnase zapobiega VP-16 hamowaniu dekatenacji splątanego DNA przez Topo IIalfa. Tak więc, poziomy ekspresji może przewidywać oporność AML na inhibitory Topo IIalfa, a Metnase jest potencjalnym celem terapeutycznym potencjalnym celem terapeutycznym dla interferencji małych cząsteczek. --- Mechanizm molekularny, za pomocą którego obce DNA integruje się z ludzkim genomem, jest słabo poznany, ale krytyczny dla wielu procesów chorobowych, w tym infekcji retrowirusowej infekcji retrowirusowej i kancerogenezy, a także terapii genowej. Postawiliśmy hipotezę, że mechanizm mechanizm integracji genomowej może być podobny do transpozycji u niższych organizmów. organizmach niższych. Zidentyfikowaliśmy białko o nazwie Metnase, które posiada domenę SET i domenę domenę transpozazy/nukleazy. Metnase metyluje lizyny 4 i 36 histonu H3, które są związane z otwartą chromatyną. Metnase zwiększa odporność na promieniowanie jonizujące i zwiększa niehomologiczną naprawę podwójnych pęknięć nici DNA. podwójnych pęknięć nici DNA. Co najważniejsze, metnase promuje integrację egzogennego DNA do genomów komórek gospodarza. W związku z tym, Metnase jest niehomologicznym białkiem naprawczym, które reguluje integrację genomową egzogennego DNA i ustala egzogennego DNA i ustanawia związek między modyfikacją histonów, naprawą DNA i integracją. DNA i integracją. Dane sugerują model, w którym Metnase promuje integrację egzogennego DNA poprzez otwieranie chromatyny i ułatwianie łączenia końców DNA. końców DNA. Badanie to pokazuje, że eukariotyczne domeny transpozazy mogą mieć ważne funkcje komórkowe poza transpozycją elementów genetycznych. --- Metnase, znana również jako SETMAR, jest białkiem fuzyjnym SET i transpozazy o nieokreśloną rolę w naprawie DNA ssaków. Domena SET jest odpowiedzialna za aktywność metylotransferazy lizyny histonowej w histonie 3 K4 i K36, podczas gdy domena domena transpozazy posiada 5'-końcowe odwrócone powtórzenie (TIR) specyficzne dla DNA wiązanie DNA, zapętlanie DNA i aktywność rozszczepiania DNA. Chociaż domena transpozazy jest niezbędna dla funkcji Metnazy w naprawie DNA, nie jest jasne, w jaki sposób białko białko o aktywności wiązania DNA specyficznej dla sekwencji odgrywa rolę w naprawie DNA. Tutaj pokazujemy, że ludzki homolog ScPSO4/PRP19 (hPso4) tworzy stabilny kompleks z Metnazą na obu T kompleks z Metnazą zarówno na DNA TIR, jak i nie-TIR. Domena transpozazy niezbędna do interakcji Metnase-TIR nie jest wystarczająca do jej interakcji z DNA non-TIR DNA w obecności hPso4. In vivo, hPso4 jest indukowana i kolokalizowana z Metnazą po leczeniu promieniowaniem jonizującym. Komórki poddane działaniu hPso4-siRNA nie wykazywały lokalizacji Metnazy w miejscach DSB i Stymulacja łączenia końców DNA w połączeniu z integracją genomową, w której pośredniczy Metnase, sugerując, że hPso4 jest niezbędny do doprowadzenia Metnazy do miejsc DSB w celu jej funkcji w naprawie DNA. --- Poprzednie badania wykazały, że składnik naprawy DNA Metnase (SETMAR) pośredniczy w oporności na chemioterapię raka uszkadzającą DNA. Metnase ma domenę nukleazy która dzieli homologię z rodziną transpozaz. Dlatego też wirtualnie zbadaliśmy trzeciorzędową strukturę Metnazy względem biblioteki ChemDiv zawierającej 550 000 związków aby zidentyfikować małe cząsteczki, które mogą dokować w miejscu aktywnym domeny nukleazy transpozazy domeny nukleazy transpozazy Metnazy. Zidentyfikowaliśmy osiem związków jako możliwych inhibitorów Metnazy. Co ciekawe, wśród tych potencjalnych inhibitorów były antybiotyki chinolonowe i inhibitory integrazy HIV, które mają wspólne cechy strukturalne. cechy strukturalne. Wcześniejsze doniesienia opisywały możliwą aktywność chinolonów jako środków przeciwnowotworowych. Dlatego wybraliśmy chinolon cyprofloksacynę do dalszych badań, w oparciu o jej szeroką dostępność kliniczną i niską toksyczność. toksyczność. Stwierdziliśmy, że cyprofloksacyna hamuje zdolność Metnazy do rozszczepiania DNA i hamuje zależną od Metnazy naprawę DNA. Ciprofloksacyna sama w sobie nie indukowała uszkodzeń DNA, ale zmniejszała naprawę uszkodzeń DNA wywołanych chemioterapią. Ciprofloksacyna zwiększała wrażliwość linii komórek nowotworowych i ksenoprzeszczepu na klinicznie istotną chemioterapię. Badania te dostarczają mechanizm wcześniej postulowanej aktywności przeciwnowotworowej chinolonów, i sugerują, że cyprofloksacyna może być prostym, ale skutecznym dodatkiem do chemioterapii raka. chemioterapii. --- Metnase (SETMAR) jest białkiem fuzyjnym SET i transpozazy, które promuje aktywność łączenia końców in vivo i pośredniczy w integracji genomowej obcego DNA. Ostatnie badania wykazały, że Metnase zachowuje większość aktywności transpozazy, w tym specyficzne dla 5'-końcowego odwróconego powtórzenia (TIR) wiązanie i montaż kompleksu oraz rozszczepienie 5'-końca elementu TIR. Tutaj pokazujemy że R432 w obrębie motywu helisa-obrót-helisa ma kluczowe znaczenie dla sekwencji specyficznej rozpoznawania, ponieważ mutacja R432A znosi jego specyficzne dla TIR wiązanie DNA aktywność. Metnase posiada unikalną aktywność rozszczepiania DNA i/lub endonukleazy która pośredniczy w rozszczepianiu dupleksowego DNA przy braku sekwencji TIR. Podczas gdy motyw HTH jest niezbędny dla interakcji Metnase-TIR, nie jest wymagany dla jej aktywności rozszczepiania DNA. Motyw podobny do DDE jest kluczowy dla działania rozszczepiającego DNA jako mutacja punktowa w tym motywie (D483A) zniosła jego aktywność rozszczepiania DNA. aktywność rozszczepiania DNA. Łącznie nasze wyniki sugerują, że aktywność Metnazy do rozszczepiania DNA aktywność, w przeciwieństwie do innych transpozaz eukariotycznych, nie jest sprzężona z jej specyficznym dla sekwencji wiązaniem DNA. --- Pojawienie się nowych genów i funkcji ma kluczowe znaczenie dla ewolucji gatunków. ewolucji gatunków. Wkład różnych typów duplikacji w innowacje genetyczne innowacji genetycznych został szeroko zbadany. Mniej zrozumiałe jest tworzenie nowych genów poprzez recykling materiału kodującego z samolubnych mobilnych mobilnych elementów genetycznych. Aby zbadać ten proces, zrekonstruowaliśmy ewolucyjną historię historię SETMAR, nowego chimerycznego genu naczelnych powstałego w wyniku fuzji SET genu metylotransferazy histonowej do genu transpozazy elementu mobilnego. My pokazujemy, że gen transpozazy został zrekrutowany jako część SETMAR 40-58 milionów lat temu, po insercji lat temu, po wstawieniu transpozonu Hsmar1 za istniejącym wcześniej genem wcześniej istniejącego genu SET, po którym nastąpiła egzonizacja de novo wcześniej sekwencji niekodującej i utworzeniu nowego intronu. Oryginalna struktura genu fuzyjnego jest zachowana we wszystkich liniach antropoidalnych, ale tylko N-końcowa połowa transpozazy ewoluuje. połowa transpozazy ewoluuje pod wpływem silnej selekcji oczyszczającej. Testy in vitro testy pokazują, że region ten zawiera domenę wiążącą DNA, która zachowała swoją pierwotną specyficzność wiązania dla motywu 19-bp zlokalizowanego w obrębie terminalnych odwróconych powtórzeń transpozonów Hsmar1 i ich pochodnych. Obecność Obecność tych transpozonów w ludzkim genomie stanowi potencjalny rezerwuar rezerwuar około 1500 doskonałych lub prawie doskonałych miejsc wiążących SETMAR. Nasze wyniki nie tylko zapewniają wgląd w warunki wymagane do udanej fuzji genów, ale także sugerują mechanizm, za pomocą którego obwody leżące u podstaw złożonych sieci regulacyjnych. --- Metnase jest ludzkim białkiem SET i domeną transpozazy, która metyluje histon H3 i promuje naprawę podwójnych pęknięć nici DNA. Teraz pokazujemy, że Metnase fizycznie oddziałuje i kolokalizuje z topoizomerazą IIalfa (Topo IIalfa), kluczowym enzymem dekatenującym enzymem dekatenującym chromosomy. Metnase promuje postęp poprzez dekatenację i zwiększa oporność na inhibitory Topo IIalfa ICRF-193 i VP-16. Oczyszczona Metnase znacznie zwiększyła dekatenację Topo IIalfa kinetoplastowego DNA do zrelaksowanych form kolistych. Ekstrakty jądrowe zawierające Metnase dekatenowały kDNA szybciej niż te bez Metnazy, a neutralizujące neutralizujące przeciwciała przeciwko Metnase odwracały to wzmocnienie dekatenacji. Metnase autometyluje przy K485, a obecność donora metylu blokowała wzmocnienie dekatenacji Topo IIalfa przez metnazę, co sugeruje wewnętrzną hamowanie regulacyjne. Tak więc, Metnase zwiększa dekatenację Topo IIalfa i aktywność ta jest tłumiona przez autometylację. Wyniki te sugerują, że komórki nowotworowe komórki nowotworowe mogą obalić Metnazę, aby pośredniczyć w klinicznie istotnej oporności na inhibitory Topo IIalfa. --- Chociaż ludzki genom jest zaśmiecony sekwencjami pochodzącymi z transpozonu Hsmar1 transpozonu, jedyny nienaruszony gen transpozazy Hsmar1 istnieje w chimerycznym białku fuzyjnym chimerycznego białka fuzyjnego SET-transpozaza, określanego jako Metnase lub SETMAR. Metnase zachowuje wiele aktywności transpozazy, w tym terminalne odwrócone powtórzenie (TIR) specyficzną aktywność wiązania DNA, aktywność rozszczepiania DNA, aczkolwiek niesprzężoną z TIR oraz zdolność do tworzenia kompleksu synaptycznego. Jednakże, Metnase ewoluowała jako białko naprawy DNA, które jest szczególnie zaangażowane w niehomologicznym łączeniu końców. Tutaj przedstawiamy dwie struktury krystaliczne domeny katalitycznej domeny katalitycznej transpozazy Metnazy, ujawniając dimeryczny enzym z niezwykłą plastycznością miejsca aktywnego plastycznością miejsca aktywnego, która może być zaangażowana w modulowanie wiązania metali. Pokazujemy poprzez charakterystykę mutanta dimeryzacyjnego, F460K, że forma dimeryczna enzymu jest wymagana do jego rozszczepiania DNA, wiązania DNA i łączenia niehomologicznych łączenia końców. Istotne znaczenie ma zachowanie F460 wraz z resztami resztami, które, jak proponujemy, mogą być zaangażowane w modulację wiązania metali w zarówno w przewidywanej sekwencji przodka transpozazy Hsmar1, jak i we współczesnym enzymie. nowoczesnym enzymie. Transpozaza Metnase została niezwykle zachowana w toku ewolucji. ewolucji; istnieje jednak skupisko substytucji zlokalizowanych w heliksach alfa 4 i 5 w domniemanym miejscu wiązania DNA, co jest zgodne z utratą transpozycja specyficzna aktywność rozszczepiania DNA i nabycie naprawy DNA specyficznej aktywności rozszczepiania DNA. --- Białka domeny transpozazy pośredniczą w przemieszczaniu DNA z jednego miejsca w genomie do innego w niższych organizmach. Jednak w komórkach ludzkich taka mobilność DNA byłaby szkodliwa, dlatego zdecydowana większość sekwencji związanych z transpozazą u ludzi to pseudogeny. Niedawno wyizolowaliśmy i scharakteryzowaliśmy białko SET i białko domeny transpozazy o nazwie Metnase, które promuje naprawę dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). Zarówno domena SET, jak i transpozazy były wymagane dla jej aktywności NHEJ. W tym badaniu odkryliśmy, że Metnase oddziałuje z ligazą DNA IV, ważnym składnikiem klasycznego szlaku NHEJ klasycznego szlaku NHEJ. Zbadaliśmy, czy Metnase ma strukturalne wymagania dotyczące wolnych DNA do naprawy NHEJ i stwierdziliśmy, że Metnase pomaga w łączeniu wszystkich typów wolnych końców DNA równie dobrze. wolnych końców DNA równie dobrze. Metnase zapobiega również długim delecjom przed przetwarzaniem wolnych końców DNA i poprawia dokładność NHEJ. Poziomy metnazy koreluje z szybkością zanikania miejsc gamma-H2Ax po promieniowaniu jonizującym. promieniowaniu jonizującym. Metnase ma jednak niewielki wpływ na naprawę rekombinacji homologicznej pojedynczego DSB. pojedynczego DSB. W sumie wyniki te pasują do modelu, w którym Metnase odgrywa rolę odgrywa rolę w losie wolnych końców DNA podczas naprawy DSB metodą NHEJ. --- Chk1 zarówno zatrzymuje widełki replikacyjne, jak i usprawnia naprawę uszkodzeń DNA poprzez fosforylację dalszych efektorów. Chociaż podjęto wspólny wysiłek w celu zidentyfikowania efektorów aktywności Chk1, podstawowe mechanizmy działania efektora wciąż są identyfikowane. Metnaza (zwana również SETMAR) jest białkiem z domeną SET i domeną transpozazy, która promuje zarówno naprawę dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) i restart zatrzymanych widełek replikacyjnych. W tym badaniu wykazaliśmy, że Metnase jest fosforylowana tylko na Ser495 (S495) in vivo w odpowiedzi na uszkodzenie DNA przez promieniowanie jonizujące. uszkodzenie przez promieniowanie jonizujące. Chk1 jest głównym mediatorem tego zdarzenia fosforylacji fosforylacji. Wcześniej wykazaliśmy, że Metnase typu dzikiego (wt) wiąże się z chromatyną w pobliżu DSB i metyluje histon H3 Lys36. Tutaj pokazujemy, że Ser495Ala (S495A) mutant Metnazy, który nie jest fosforylowany przez Chk1, jest wadliwy w asocjacji chromatyny indukowanej przez DSB. Mutant S495A również nie jest w stanie nie poprawia naprawy indukowanego DSB w porównaniu do Metnazy wt. Co ciekawe, mutant S495A wykazał zwiększony restart zablokowanych widełek replikacyjnych w porównaniu do Metnazy wt. Tak więc, fosforylacja metnazy S495 różnicuje między tymi dwiema funkcjami, wzmacniając naprawę DSB i hamując restart widełek replikacyjnych. restart widełek replikacyjnych. Podsumowując, dane te dają wgląd w mechanizm, za pomocą którego Chk1 wzmacnia naprawę uszkodzeń DNA, jednocześnie tłumiąc zatrzymany restart widełek replikacyjnych. --- Translokacje chromosomowe są powszechne w białaczce, ale niewiele wiadomo o ich mechanizmie. ich mechanizmu. Metnase (określana również jako SETMAR) jest połączeniem metylazy histonowej i białka transpozazy, które powstało specjalnie u naczelnych. Transpozazy były wymarły u naczelnych, ponieważ pośredniczyłyby w szkodliwym przemieszczaniu DNA. DNA. U naczelnych, Metnase wchodzi w interakcje z Ligazą DNA IV (Lig IV) i i promuje niehomologiczną naprawę DNA (NHEJ). Pokazujemy tutaj, że specyficzne dla naczelnych białko Metnase może również wzmacniać NHEJ w komórkach mysich i może również wchodzić w interakcje z mysim Lig IV, co wskazuje, że zintegrowało się ono z istniejący szlak NHEJ po jego rozwinięciu u naczelnych. Co istotne, ekspresja Metnazy w komórkach mysich znacząco zmniejsza translokacje chromosomalne. translokacje chromosomowe. Proponujemy, aby fuzja domeny SET metylazy histonowej i domeny transpozazy w linii antropoidalnej w celu utworzenia Metnazy naczelnych promuje dokładny wewnątrzchromosomalny NHEJ, a tym samym tłumi translokacje międzychromosomalne. translokacje międzychromosomalne. Metnase mogła zostać wyselekcjonowana, ponieważ pełni funkcję przeciwstawiającą się transpozazom, a tym samym może odgrywać kluczową rolę w tłumieniu translokacji które leżą u podstaw onkogenności.
Czy białko SETMAR (Metnase) ma domenę transpozazy?
Tak, białko SETMAR (Metnase) posiada domenę transpozazy.