Porphyromonas gingivalis jest kluczowym patogenem w rozwoju i progresji chorób przyzębia. progresji chorób przyzębia. Przeszkody w rozwoju nasyconych bibliotek transpozonów biblioteki transpozonów wcześniej ograniczały badania przesiewowe oparte na mutantach transpozonów, jak również jak również badania istotnych genów. Opracowaliśmy system do wydajnej mutagenezy transpozonowej P. gingivalis przy użyciu zmodyfikowanego transpozonu mariner. Tn-seq to technika, która pozwala na ilościową ocenę poszczególnych mutantów w mutacji transpozonowej. mutantów w bibliotece mutantów transpozonowych poprzez sekwencjonowanie połączeń transpozon-genom a następnie zestawienie obecności mutantów poprzez mapowanie do genomu bazowego. Używając Tn-seq, możliwe jest szybkie zdefiniowanie wszystkich mutantów insercyjnych w bibliotece a tym samym zidentyfikować nieistotne geny w warunkach, w których biblioteka została wyprodukowana. biblioteka została wyprodukowana. Identyfikacja kondycji poszczególnych mutantów w w określonych warunkach można przeprowadzić poprzez poddanie biblioteki selektywnej selektywne. --- Opóźniona adnotacja genomów bakteryjnych i nieodłączna złożoność genetyczna wielu fenotypów utrudnia odkrywanie nowych celów dla leków oraz rozwój nowych środków przeciwdrobnoustrojowych i szczepionek. Tutaj przedstawiamy metodę Tn-seq, dzięki której możliwe stało się ilościowe określenie kondycji dla większości genów w mikroorganizmie i badanie ilościowych interakcji genetycznych w całym genomie. w skali całego genomu i w sposób wysokoprzepustowy. Tn-seq może w ten sposób kierować badaniami nad adnotacją genów i rozplątywać złożone fenotypy. Metoda opiera się na konstrukcji nasyconej biblioteki transpozonów Mariner Mariner. Po selekcji biblioteki, zmiany w częstotliwości każdego mutanta mutantów insercyjnych są określane przez masowe sekwencjonowanie regionów bocznych. Zmiany te są wykorzystywane do obliczenia sprawności każdego mutanta. Metoda ta została opracowana dla Gram-dodatniej bakterii Streptococcus pneumoniae, czynnika wywołującego zapalenie płuc i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. zapalenia płuc i zapalenia opon mózgowych; jednak ze względu na szeroką aktywność transpozonu transpozonu Mariner, Tn-seq może być stosowany do wielu różnych gatunków drobnoustrojów. --- Analiza kondycji całego genomu u drobnoustrojów wykorzystująca nasycającą mutagenezę transpozonową w połączeniu z masowo równoległym sekwencjonowaniem (Tn-seq) mutagenezę w połączeniu z masowo równoległym sekwencjonowaniem (Tn-seq) zapewnia pomiar wkładu każdego genu w dane warunki wzrostu. Dzięki tej Dzięki tej technice profile sprawności genów i niezbędne geny są odkrywane przez jednoczesne analizy tego, czy brak każdego produktu genu zmienia kinetykę wzrostu bakterii. kinetykę wzrostu bakterii. Tutaj modyfikujemy standardową procedurę Tn-seq w celu uproszczenia i skrócenia procesu poprzez dostarczenie transpozonu poprzez koniugację i wzbogacenie puli mutantów w kulturę płynną, tworząc sekwencjonowanie wzbogacające transpozony w płynie (TnLE-seq). Aby zilustrować sukces tych modyfikacji i solidność procedury, analizy kondycji genów dwóch kultur ściśle beztlenowej bakterii Desulfovibrio Hildenborough, ze wzrostem na mleczanie jako donorze elektronów i siarczanie jako donorze siarczanów. i siarczan jako akceptor elektronów. Dane te wykazują powtarzalność i zapewniają podstawowe warunki do analizy zmian kondycji w mutantach mutantów delecyjnych i w różnych warunkach wzrostu. Modyfikacje proceduralne ułatwią zastosowanie tej potężnej analizy genetycznej do drobnoustrojów pozbawionych łatwego systemu genetycznego. W badaniach pilotażowych uzyskano 2,5×10(5) i 3,4×10(5) unikalnych mutantów insercyjnych w beztlenowcu Desulfovibrio vulgaris Hildenborough hodowanych w typowych warunkach laboratoryjnych na bogatym podłożu. Analizy te zapewniły dwie podobne mapy wysokiej rozdzielczości sprawności genów w całym genomie, a Metoda ta została również zastosowana do wzrostu w pożywce minimalnej. Wyniki te zostały również porównane z pokryciem uzyskanym za pomocą ok. 13 000 skatalogowanych transpozonów skonstruowanej przez sekwencjonowanie miejsc insercji transpozonów w poszczególnych mutantach. mutantach. --- Opisujemy procedurę głębokiego sekwencjonowania do śledzenia dużej liczby mutantów transpozonowych mutantów Pseudomonas aeruginosa. Procedura wykorzystuje nową metodologię Tn-seq opartą na generowaniu i amplifikacji jednoniciowych okręgów niosących sekwencje łączące transpozony (metoda Tn-seq circle), metoda która może być stosowana z praktycznie każdym transpozonem. Procedura ta niezawodnie zidentyfikowała ponad 100 000 insercji transpozonów w pojedynczym eksperymencie, zapewniając bliskie nasyceniu pokrycie genomu. Aby przetestować skuteczność procedury identyfikacji mutantów, sprawdziliśmy mutacje zmniejszające wewnętrzną oporność na antybiotyk aminoglikozydowy tobramycynę. Wewnętrzna oporność na tobramycynę była wcześniej analizowana w skali genomu przy użyciu mutant po mutancie, a tym samym stanowiła punkt odniesienia do oceny nowej metody. metody. Nowa procedura Tn-seq zidentyfikowała 117 genów oporności na tobramycynę. z których większość została następnie zweryfikowana z poszczególnymi mutantami. Grupa genów z najsilniejszymi zmutowanymi fenotypami obejmowała prawie wszystkie (13 z 14) genów z silnymi zmutowanymi fenotypami zidentyfikowanymi w poprzednim badaniu przesiewowym, jak również prawie taką samą liczbę nowych genów. Wyniki pokazują zatem skuteczność metody Tn-seq w definiowaniu genetycznych podstaw złożonej cechy oporności P. aeruginosa i wskazują, że można ją wykorzystać do analizy różnych procesów związanych ze wzrostem. procesów związanych ze wzrostem. --- Szczepy pozajelitowych patogennych Escherichia coli (ExPEC) wykazują szereg strategii wirulencji i są główną przyczyną zakażeń dróg moczowych. strategii wirulencji i są główną przyczyną infekcji dróg moczowych, posocznicy i zapalenia opon mózgowych. Wysiłki mające na celu zrozumienie patogenezy ExPEC są kwestionowane przez wysoki stopień zmienności genetycznej i fenotypowej, która występuje wśród izolatów. Określenie, które cechy wirulencji są powszechne, a które specyficzne dla szczepu specyficzne dla szczepu, przyniesie znaczne korzyści w projektowaniu skuteczniejszych terapii. W tym celu wykorzystaliśmy technikę ilościowego śladu genetycznego znaną jako sekwencjonowanie insercji transpozonów (Tn-seq) w połączeniu z patogenomiką porównawczą, aby funkcjonalnie przeanalizować repertuar genetyczny referencyjnego izolatu ExPEC. Wykorzystując Tn-seq i wysokoprzepustowe modele infekcji danio pręgowanego śledziliśmy zmiany w obfitości wariantów ExPEC w nasyconych bibliotekach mutantów transpozonowych po bibliotek mutantów transpozonowych po selekcji w różnych niszach gospodarza. Stwierdzono, że dziewięćset siedemdziesiąt genów bakteryjnych (18% genomu) w sposób zależny lub niezależny od niszy. Aby zidentyfikować geny o największym potencjale terapeutycznym i diagnostycznym, zastosowano nowatorską metodę algorytm analizy wzbogacenia cech (TEA) został opracowany w celu ustalenia rozkład filogenetyczny genów kandydujących. TEA ujawniła, że znaczna 970 genów zidentyfikowanych przez Tn-seq ma homologi częściej częściej zawarte w genomach ExPEC i innych znanych patogenów, co, jak jak sugeruje pierwszy aksjomat molekularnych postulatów Kocha, jest uważany za kluczową cechą prawdziwych determinantów wirulencji. Trzy z tych genów pochodzących z Tn-seq związane z patogenami - represor transkrypcji, przypuszczalna toksyna metaloendopeptydazy toksyna metaloendopeptydazowa i hipotetyczne białko wiążące DNA - zostały usunięte i wykazano, że niezależnie wpływają na kondycję ExPEC w zebrafish i mysich modelach infekcji infekcji. Łącznie, podejścia i obserwacje przedstawione w niniejszym dokumencie zapewniają zasoby dla przyszłych badań opartych na patogenomice i podkreślają różnorodność czynników wymaganych przez pojedynczy izolat ExPEC do przetrwania w różnych środowiskach gospodarza. środowiska.
Co to jest Tn-seq?
Mutageneza transpozonowa i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (Tn-seq) to technika, która pozwala na ilościową ocenę poszczególnych mutantów w bibliotece mutantów transpozonowych poprzez sekwencjonowanie połączeń transpozon-genom, a następnie zestawianie obecności mutantów poprzez mapowanie do genomu bazowego. Korzystając z Tn-seq, możliwe jest szybkie zdefiniowanie wszystkich mutantów insercyjnych w bibliotece, a tym samym zidentyfikowanie nieistotnych genów w warunkach, w których biblioteka została wyprodukowana. Identyfikacja kondycji poszczególnych mutantów w określonych warunkach może być przeprowadzona poprzez poddanie biblioteki presji selektywnej.