Aktywny kompleks replikacyjny wiroida cytrusowego exocortis (CEV) został wyizolowany jako wzbogacona w chromatynę frakcja zainfekowanego liścia pomidora z aktywnością syntezy RNA CEV aktywność. Aktywność ta była solubilizowana z chromatyny za pomocą siarczanu amonu siarczanem amonu, ale nie sarkozylem. Kompleksy nukleoproteinowe we frakcji rozpuszczalnej które wiązały się z przeciwciałem monoklonalnym do karboksylowej domeny końcowej największej podjednostki polimerazy RNA II (8WG16) zostały oczyszczone przez powinowactwo i zawierały plus- i minus-sensowny CEV RNA. Wyniki potwierdzają rolę RNA polimerazy RNA II w replikacji wiroidów i dostarczają pierwszych bezpośrednich dowodów na związek in vivo między polimerazą RNA II gospodarza a CEV. --- Zależna od RNA polimeraza RNA ze zdrowej tkanki roślinnej pomidora akceptuje wirus RNA wrzecionowatego wiroida bulw ziemniaka (PSTV) jako matrycę do syntezy in vitro pełnej długości kopii RNA genomu PSTV. Transkrypcja wiroida wymaga obecności jonów Mn2+ i / lub Mg2+ i nie jest hamowana przez stężenia 10(-5) M alfa-amanityny. Jest to pierwsze doniesienie o dobrze zdefiniowanym produkcie syntetyzowanego in vitro przez zależną od RNA polimerazę RNA ze zdrowych roślin. --- Analiza za pomocą hybrydyzacji molekularnej RNA transkrybowanego przez frakcję bezkomórkową z awokado zakażonego wirusem plamistości słonecznej awokado (ASBV) wykazała obecność nowo zsyntetyzowanych sekwencji specyficznych dla wiroida, z których większość była o tej samej polarności co dojrzały RNA wirusa zakaźnego. Traktowanie frakcji frakcji wolnej od komórek DNazą znacznie zmniejszyło całkowitą syntezę RNA, ale nie miało to wpływu na RNA specyficzne dla ASBV, co wskazuje, że te ostatnie były transkrybowane na matrycy RNA. Badania hamowania za pomocą alfa-amanityną wykazały, że na syntezę RNA specyficznego dla ASBV nie miały wpływu przez stężenia 1 i 200 mikrogramów/ml leku, które zazwyczaj hamują odpowiednio polimerazę RNA II i III w większości systemów zwierzęcych i roślinnych. systemy. Wyniki te sugerują, że albo polimeraza RNA I, albo niezidentyfikowana aktywność polimerazy Aktywność polimerazy RNA odporna na alfa-amanitynę, działająca na matrycę RNA, odgrywa rolę w replikacji ASBV, podczas gdy dla pozostałych wirusów badanych do tej pory wydaje się, że zaangażowana jest polimeraza RNA II. Analiza przez elektroforezę w żelu polikrylamidowym w warunkach częściowo i całkowicie denaturujących specyficznego dla ASBV RNA syntetyzowanego in vitro wykazała, że zawierają nici wiroida o długości jednostkowej i dłuższej niż jednostkowa, prawdopodobnie związane w kompleksach z kompleksy z regionami jedno- i dwuniciowymi. Właściwości strukturalne strukturalne są podobne do właściwości RNA gromadzącego się in vivo w tkankach zakażonych wirusem w tkankach zakażonych wiroidem, które są postulowanymi replikacyjnymi produktami pośrednimi mechanizmu toczącego się koła zaproponowanego dla syntezy wiroidów. --- Wirus wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd) jest małym, jednoniciowym, kolistym, niekodującym patogenem RNA. Zależna od DNA gospodarza polimeraza RNA II (RNAP II) została zaproponowano jako krytyczną dla jego replikacji, ale nie ma miejsca interakcji dla RNAP II na genomie RNA PSTVd. Stosując strategię koimmunoprecypitacji obejmującej mAb specyficzne dla konserwatywnego heptapeptydu (tj. YSPTSPS) zlokalizowanego w domenie karboksy-końcowej największej podjednostki RNAP II, ustaliliśmy interakcję RNAP II pomidora z RNA PSTVd i wykazaliśmy, że RNAP II wiąże się z lewą domeną terminalną PSTVd (+) RNA. RNAP II nie oddziaływał z żadnym z kilku testowanych RNA PSTVd (-). Delecja i mutageneza mutageneza skróconego modelowego fragmentu RNA PSTVd (+) zostały wykorzystane do identyfikacji roli określonych nukleotydów i motywów strukturalnych w tej interakcji. Nasze wyniki dostarczają dowodów na interakcję kompleksu RNAP II z naturalnym gospodarza z prętową konformacją lewej domeny terminalnej PSTVd (+) RNA. --- Bezkomórkowa synteza wiroida cytrusowego exocortis (CEV) w bogatych w jądra preparatach z zakażonej Gynura aurantiaca była optymalna w temperaturze 18-24 stopni C. Inkubacja mieszanin reakcyjnych w wyższych temperaturach (30-36 stopni C) skutkowała mieszanin reakcyjnych w wyższych temperaturach (30-36 stopni C) spowodowała wzrost liniowych cząsteczek CEV i odzyskanie niekompletnych lub naciętych nowo nowo zsyntetyzowanych gatunków RNA. Chociaż optymalne stężenie Mg(2+) (2,5-5 mM) dla syntezy CEV było niższe niż dla całkowitej inkorporacji [(32)P]CMP (10 mM), odpowiedź na odpowiedź na jon Mn(2+) była wyraźnie inna. Podczas gdy maksymalną całkowitą aktywność zaobserwowano w 1 mM Mn(2+) z wyraźną redukcją (80%) w 5 mM Mn(2+), Synteza CEV była utrzymywana w 1-15 mM Mn(2+). Zahamowanie syntezy CEV wrażliwej na alfa-amanitynę w 200 mM (NH(4))(2)SO(4) przypomina reakcję reakcję polimerazy RNA II na wolnej matrycy kwasu nukleinowego. Jednakże, wykrywanie śladowych poziomów aktywności syntezy CEV opornej na alfa-amanitynę hamowanej przez niskie stężenia (NH(4))(2)SO(4) (25 mM) sugeruje możliwość zaangażowanie aktywności podobnej do polimerazy RNA I- i/lub III. --- Genom RNA wirusa wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTV) jest transkrybowany in vitro do komplementarnego DNA i RNA przez zależną od DNA polimerazę DNA I i polimerazę RNA z Escherichia coli. Synteza in vitro RNA wytwarza odrębne transkrypty o długości większej niż jednostka, co odzwierciedlając mechanizm replikacji wiroidów in vivo. Wpływ różnych na proces transkrypcji; stwierdzono, że aktynomycyna D drastycznie zmniejsza syntezę komplementarnego RNA z matrycy RNA PSTV przez polimerazę RNA. przez polimerazę RNA. --- Replikacja RNA jest niezbędna do zakażenia wirusem lub wiroidem, a także do regulacji ekspresji genów komórkowych. a także do regulacji ekspresji genów komórkowych. Specyficzne motywy RNA prawdopodobnie regulują różne aspekty tej replikacji. Wiroidy z rodziny Pospiviroidae reprezentowane przez wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd), replikują się w jądrze poprzez wykorzystanie w jądrze poprzez wykorzystanie zależnej od DNA polimerazy RNA II. Zbadaliśmy rolę motywu pętli E (sarcyna/rycyna) genomowego RNA PSTVd w replikacji. Trzeciorzędowy model strukturalny tego motywu, wywnioskowany na podstawie analizy sekwencji porównawczej i porównanie z jądrowym rezonansem magnetycznym i kryształami rentgenowskimi struktury motywów pętli E w innych RNA, w którym rdzeń nie-Watsona-Cricka są precyzyjnie określone. Analiza macierzy izosteryczności tych par zasad wykazała, że model ten uwzględnia zgłaszane naturalne zmiany sekwencji i realne mutacje eksperymentalne w motywach pętli E PSTVd i innych wiroidów. Co więcej, analiza macierzy izosteryczności pozwoliła nam na zaprojektowanie destrukcyjnych, a także kompensacyjnych mutacji pętli E PSTVd. Analizy funkcjonalne takich mutantów w eksperymentach in vitro i in vivo wykazały, że integralność strukturalna pętli E ma kluczowe znaczenie dla replikacji, szczególnie podczas transkrypcji. Nasze wyniki sugerują, że motyw E pętli PSTVd istnieje i funkcjonuje in vivo oraz dostarcza genetycznych dowodów utraty funkcji dla istotnej roli trójwymiarowego motywu RNA wiroida w replikacji toczącego się koła replikacji. Wykorzystanie analizy macierzy izosteryczności zasad innych niż Watson-Crick do racjonalizacji mutagenezy motywów trzeciorzędowych i systematycznych testów funkcjonalnych in vitro i in vivo i in vivo mutantów oferuje nowatorskie, kompleksowe podejście do wyjaśnienia relacji trzeciorzędowych struktura-funkcja dla motywów RNA o ogólnego znaczenia biologicznego. --- Zależna od DNA polimeraza RNA II oczyszczona ze zdrowej tkanki roślinnej jest zdolna do syntezy liniowych kopii (-)-viroid RNA o pełnej długości z (+)-viroid RNA in vitro. Wraz ze specyficzną wrażliwością na alfa-amanitynę wiroidów obserwowaną in vivo, odkrycia te sugerują, że wiroidy replikują się przez całkowicie nowy mechanizm, w którym infekujące cząsteczki RNA wiroidów są kopiowane przez enzym gospodarza, który normalnie jest odpowiedzialny za syntezę jądrowych prekursorów informacyjnego RNA. --- Wiroidy to jednoniciowe, koliste RNA o długości od 250 do 400 zasad, które replikują się autonomicznie w swoich roślinach-gospodarzach, ale nie kodują białek. Wiroidy z rodziny Pospiviroidae, których typem jest wiroid wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd), są replikowane przez szczep szczepem, są replikowane przez zależną od DNA polimerazę RNA II gospodarza w jądrze. gospodarza. Aby przeanalizować miejsce inicjacji transkrypcji z (+)-nici do (-)-niciowych intermediatów replikacyjnych, użyliśmy ekstraktu jądrowego z niezainfekowanej kultury komórkowej rośliny gospodarza S. tuberosum. The (-)-nici, które zostały de novo-syntetyzowane w ekstrakcie po dodaniu (+)-PSTVd, zostały oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa. To oczyszczanie uniknięto zanieczyszczenia kwasami nukleinowymi gospodarza, które spowodowały błędne przypisanie miejsca startu we wcześniejszym badaniu. Analiza wydłużenia primerów de (-)-strandów ujawniła pojedyncze miejsce startu zlokalizowane w pętli hairpin pętli lewego regionu terminalnego w strukturze drugorzędowej PSTVd. To jest dodatkowo wspierane przez analizę infekcyjności i replikacji i replikacji mutantów in planta. --- Pospiviroidae, z ich głównym przedstawicielem wiroidem wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd), są replikowane poprzez mechanizm toczącego się koła przez kodowaną przez gospodarza zależną od DNA polimerazę RNA II (pol II). W pierwszym etapie (+)-niciowy kolisty wiroid jest transkrybowany do (-)-niciowego oligomeru pośredniego. Jak dotąd nie wiadomo, czy transkrypcja jest inicjowana przez promotory w określonych czy jest rozprowadzana niespecyficznie po całym okręgu. Ekstrakt transkrypcyjny in ekstrakt transkrypcyjny in vitro został przygotowany z niezainfekowanej kultury komórek ziemniaka który wykazywał aktywność transkrypcyjną przy użyciu dodanej kolistej nici PSTVd (+) RNA jako matrycy. Zgodnie z aktywnością pol II, transkrypcja może być hamowana przez alfa-amanitynę. RT-PCR ujawniło istnienie co najmniej dwóch różnych miejsc startu, a wydłużenie starterów zidentyfikowało je jako nukleotydy A(111) i A(325). Sekwencje pierwszych 7 nt transkrybowanych nukleotydów są bardzo podobne, (105)GGAGCGA(111) i (319)GGGGCGA(325). GC-boxy znajdują się w odległości odpowiednio 15 i 16 nt w górę rzeki, odpowiednio, w natywnej strukturze wiroida, co może działać w celu ułatwienia inicjacji. GC-boxy mogą pełnić podobną funkcję do bogatej w GC spinki do włosów II w (-)-nici pośredniej, jak opisano wcześniej. Wyniki Wyniki porównano z odpowiednimi cechami wirusa plamistości słonecznej awokado który należy do innej rodziny wiroidów i wykazuje inne właściwości inicjacji transkrypcji. właściwości inicjacji transkrypcji. --- Polimeraza RNA II jest zaangażowana w syntezę RNA podczas replikacji wirusów i wirusa zapalenia wątroby typu Delta (HDV). replikacji wiroidów i wirusa zapalenia wątroby typu Delta (HDV); jednak ani matryca RNA, ani wymagania dotyczące czynnika białkowego dla tego procesu ani wymagania dotyczące czynnika białkowego dla tego procesu nie są dobrze zdefiniowane. My opracowaliśmy system transkrypcji in vitro oparty na ekstrakcie jądrowym komórek HeLa (NE), w którym (NE), w którym segment antygenomowego RNA odpowiadający regionowi lewego regionu końcówki struktury podobnej do pręta HDV służy jako szablon do wydajnej i wysoce specyficznej syntezy RNA. Akumulacja unikalnego produktu RNA jest wysoce wrażliwa na alfa-amanitynę w HeLa NE i tylko częściowo wrażliwy na ten lek w NE z komórek PMG, które zawierają allel odporny na alfa-amanitynę podjednostki pol II, silnie sugerując zaangażowanie pol II w tej reakcji. Szczegółowa analiza produktu RNA ujawniła, że że reprezentuje on chimeryczną cząsteczkę złożoną z nowo zsyntetyzowanego transkryptu kowalencyjnie przyłączonego do 5' połowy matrycy RNA. Wybór miejsca startu do transkrypcji jest niezwykle specyficzny i zależy od drugorzędowej struktury matrycy struktury matrycy RNA, a nie od jej pierwotnej sekwencji. Niektóre cechy tej reakcji przypominają proces rozszczepiania-rozciągania RNA obserwowany dla kompleksów pol II in vitro. Omówiono możliwy udział opisanej reakcji w replikacji HDV.
Która polimeraza RNA jest używana do replikacji wirusów?
Zależna od DNA polimeraza RNA II pochodzenia roślinnego transkrybuje RNA wiroidów do kopii o pełnej długości