Dwa aktywatory transkrypcyjne, Aft1 i Aft2, regulują homeostazę żelaza w Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae. Czynniki te indukują ekspresję genów regulujących żelazo w drożdżach z niedoborem żelaza, ale są inaktywowane w komórkach z niedoborem żelaza. Żelazo hamowanie Aft1/Aft2 jest zniesione w komórkach z defektem klastra Fe-S w obrębie macierzy mitochondrialnej (Chen, O. S., Crisp, R. J., Valachovic, M., Bard, M., Winge, D. R., and Kaplan, J. (2004) J. Biol. Chem. 279, 29513-29518). Aby ustalić, czy wykrywanie żelaza przez Aft1 / Aft2 wymaga funkcji mitochondrialnego eksportu Fe-S i cytozolowego montażu białek Fe-S oceniliśmy ekspresję regulonu żelaza w komórkach pozbawionych glutationu oraz w komórkach pozbawionych Atm1, Nar1, Cfd1 i Nbp35. Regulon żelaza jest indukowany w komórkach pozbawionych Atm1, przy czym Aft1 jest w dużej mierze odpowiedzialny za indukowaną ekspresję genów. indukowaną ekspresję genów. Aft2 jest aktywowany w późniejszym czasie w komórkach pozbawionych Atm1 komórkach. Podobnie, regulacja żelaza jest indukowana w komórkach pozbawionych glutationu. W przeciwieństwie do tego, represja NAR1, CFD1 lub NBP35 nie indukuje regulonu żelaza pomimo silnego hamowania cytozolowego/jądrowego montażu białek Fe-S. Tak więc, żelazo przez Aft1/Aft2 nie jest związane z dojrzewaniem cytozolowych/jądrowych białek Fe-S białek Fe-S, ale mitochondrialny transporter błony wewnętrznej Atm1 jest ważny dla transportu sygnału hamującego. Chociaż Aft1 i Aft2 wyczuwają sygnał pochodzący ze szlaku biogenezy klastrów Fe-S, nic nie wskazuje na to, że białka te są hamowane przez bezpośrednie wiązanie białka są hamowane przez bezpośrednie wiązanie klastra Fe-S. --- Czynnik transkrypcyjny Saccharomyces cerevisiae reagujący na żelazo, Aft1, ma dobrze ugruntowaną rolę w regulacji homeostazy żelaza poprzez transkrypcję indukcję genów regulujących poziom żelaza. Jednak ostatnie badania wskazują na udział Aft1 w inne procesy komórkowe niezależne od regulacji żelaza, takie jak stabilność chromosomu stabilność. Ponadto, rozprzestrzenianie się chromosomów i dane dwuhybrydowe sugerują, że Aft1 wchodzi w interakcje i kolokalizuje z białkami kinetochoru; jednak implikacje komórkowe implikacje tego nie zostały ustalone. Tutaj wykazujemy, że Aft1 wiąże się z kompleksem kinetochoru poprzez Iml3. Ponadto, podobnie jak Iml3, Aft1 jest wymagany do zwiększonej asocjacji kohezyny z pericentryczną chromatyną. chromatyną, która jest wymagana, aby wytrzymać napięcie mikrotubul, a komórki aft1Δ wykazują defekty segregacji chromosomów w mejozie. Nasza praca określa nową rolę dla Aft1 w stabilności i transmisji chromosomów. --- Patogen taki jak C. albicans potrzebuje skutecznego mechanizmu wychwytu żelaza w środowisku środowisku o ograniczonej zawartości żelaza, takim jak ludzkie ciało. Aktywność reduktazy żelazowej aktywność regulowana przez żelazo i miedź, analogiczna do tej w S. cerevisiae, została opisana u C. albicans. Opracowaliśmy protokół in-plate dla izolacji klonów, które uzupełniają mutację aft1 w S. cerevisiae, która która uzależnia wzrost komórek od żelaza. Po transformacji S. cerevisiae aft1 z biblioteką C. albicans, wyselekcjonowaliśmy klony, które rosną w warunkach niedoboru żelaza i dzielą identyczny plazmid, pIRO1, z insertem 4500 bp zawierającym gen URA3 i ORF (IRO1) odpowiedzialny za tłumienie zależności od żelaza. zależność od żelaza. IRO1 nie wykazuje homologii z AFT1 ani z innymi sekwencjami w bazach danych. sekwencjami w bazach danych. Analiza Northern wykazuje konstytutywną ekspresję IRO1. CAI4, szczep C. albicans wyizolowany jako Deltaura3, również ma delecję 3' połowy IRO1. delecję 3' połowy IRO1 i wykazuje w podłożu YNB podobne cechy fenotypowe do S. cerevisiae. charakterystykę fenotypową do szczepów mutantów S. cerevisiae aft1. Dlatego też uważamy IRO1 jako gen C. albicans zaangażowany w wykorzystanie żelaza. Jednak w ekstremalnych warunkach niedoboru żelaza, CAI4 wydaje się aktywować alternatywne mechanizmy pobierania żelaza, które pozwalają na lepszy wzrost niż dziki szczep SC5314. Analiza jego przewidywanej sekwencji białkowej jest zgodna z rolą Iro1p jako czynnika transkrypcyjnego. --- Czynnik transkrypcyjny Aft1 reguluje regulon żelaza w odpowiedzi na dostępność żelaza w Saccharomyces cerevisiae. Aft1 aktywuje baterię genów wymagane do pobierania żelaza w warunkach niedoboru żelaza, podczas gdy funkcja Aft1 jest inaktywowana w warunkach bogatych w żelazo. Wcześniej wykazaliśmy, że regulowane żelazem wiązanie DNA przez Aft1 jest odpowiedzialne za kontrolowaną ekspresję genów docelowych. Tutaj pokazujemy, że to regulowane żelazem wiązanie DNA przez Aft1 jest nie wynika ze zmiany całkowitego poziomu ekspresji Aft1 lub zmiany aktywności wiązania DNA aktywności wiązania DNA. Lokalizacja jądrowa Aft1 reaguje raczej na status żelaza, prowadząc do regulowanej żelazem ekspresji genów docelowych. Zidentyfikowaliśmy sekwencję podobną do sygnału eksportu jądrowego (NES) w otwartej ramce odczytu AFT1. Mutacja sekwencji podobnej do NES powoduje jądrową retencję Aft1 i konstytutywną aktywację Aft1. konstytutywną aktywację funkcji Aft1 niezależnie od statusu żelaza w komórkach. komórek. Wyniki te sugerują, że eksport jądrowy Aft1 jest krytyczny dla zapewnienie reagującej na żelazo aktywacji transkrypcyjnej regulonu Aft1 i że systemy importu/eksportu jądrowego są zaangażowane w wykrywanie żelaza przez Aft1 w S. cerevisiae. --- Drożdże Saccharomyces cerevisiae zawierają parę paralogicznych aktywatorów transkrypcji reagujących na żelazo aktywatorów transkrypcji, Aft1 i Aft2. Aft1 aktywuje systemy wychwytu żelaza w przypadku niedoboru żelaza, podczas gdy rola Aft2 pozostaje słabo poznana. słabo poznana. Niniejsze badanie porównuje funkcje Aft1 i Aft2 w regulacji transkrypcji genów transkrypcji genów zaangażowanych w homeostazę żelaza, w odniesieniu do obecności/braku paralogu. Analiza skupień danych z mikromacierzy DNA zidentyfikowała klasy genów regulowanych przez Aft1 lub Aft2, lub oba. Aft2 aktywuje transkrypcję genów zaangażowanych w wewnątrzkomórkowe wykorzystanie żelaza pod nieobecność Aft1. nieobecności Aft1. Analizy Northern blot w połączeniu z eksperymentami immunoprecypitacji chromatyny eksperymenty immunoprecypitacji na wybranych genach z każdej klasy, wykazały że Aft2 bezpośrednio aktywuje geny SMF3 i MRS4 zaangażowane w mitochondrialną i wakuolarną homeostazę żelaza. i wakuolarną homeostazę żelaza, podczas gdy Aft1 nie. Analiza komputerowa wykazała różne elementy cis-regulacyjne dla Aft1 i Aft2, a analiza transkrypcji przy użyciu wariantów promotora FET3 wykazała, że Aft1 jest bardziej specyficzny dla kanonicznego elementu reagującego na żelazo TGCACCC niż Aft2. Wreszcie, brak Aft1 lub Aft2 wykazała zależny od żelaza wzrost ilości pozostałego paralogu. pozostałego paralogu. Może to zapewnić dodatkową kontrolę nad komórkową homeostazy komórkowej. --- Wychwyt żelaza o wysokim powinowactwie w Saccharomyces cerevisiae obejmuje zewnątrzcytoplazmatyczną redukcję jonów żelaza przez reduktazy FRE1 i FRE2. Jony żelaza są następnie transportowane przez błonę plazmatyczną przez permeazę FET3 oksydazy-FTR1. Ekspresja genów wychwytu żelaza o wysokim powinowactwie jest indukowana przy niedoborze żelaza. Wykazaliśmy, że AFT1 jest w różnym stopniu zaangażowany w taką regulację. Białko Aft1 jest wymagane do utrzymania wykrywalnego nieindukowanego poziomu ekspresji FET3 i do indukcji FRE2 w warunkach głodu żelaza. warunkach głodu żelaza. Wręcz przeciwnie, indukcja mRNA FRE1 jest normalna w warunkach nieobecności Aft1, chociaż istnienie mutacji punktowych AFT1 powodujących konstytutywną ekspresję FRE1 (Yamaguchi-Iwai et al., EMBO J. 14: 1231-1239, 1995) wskazuje, że Aft1 może również uczestniczyć w ekspresji FRE1 w sposób zbędny sposób. Zmiany w podstawowych poziomach ekspresji genów geny wychwytu żelaza o wysokim powinowactwie mogą wyjaśniać, dlaczego mutant AFT1 nie jest w stanie rosnąć na respirabilnych źródłach węgla. Nadekspresja AFT1 prowadzi do zatrzymania wzrostu w fazie G1 cyklu komórkowego. Aft1 jest aktywatorem transkrypcyjnym, który byłby częścią różnych kompleksów transkrypcyjnych oddziałujących z promotorem promotorem genów wychwytu żelaza o wysokim powinowactwie. Aft1 wykazuje fosforylację modyfikacje fosforylacji w zależności od etapu wzrostu komórek i może łączyć indukcję genów wychwytu żelaza z innymi metabolicznie dominującymi wymaganiami dla wzrostu komórek. --- Odpowiedź Saccharomyces cerevisiae na cisplatynę została zbadana przez badanie zmian w ekspresji genów przy użyciu mikromacierzy cDNA i potwierdzenie wyniki za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Poziomy Wykazano, że poziomy mRNA 14 białek zaangażowanych w homeostazę żelaza są zwiększone przez cisplatynę. Co ciekawe, ekspresja wszystkich 14 genów jest regulowana przez regulowana przez Aft1, czynnik transkrypcyjny aktywowany w odpowiedzi na niedobór żelaza. żelaza. Promotor jednego z tych genów, FET3, został stosunkowo dobrze zbadany. dobrze zbadany, więc przeprowadziliśmy test reporterowy przy użyciu promotora FET3 i i wykazaliśmy, że miejsce wiązania Aft1 w regionie promotora jest niezbędne do indukcji transkrypcji przez cisplatynę. Aktywna domena Aft1 niezbędna do aktywacji promotora FET3 przez cisplatynę jest identyczna z tą wymaganą do aktywacji przez sulfonian difenantroliny, inhibitor komórkowego wychwytu żelaza komórkowego żelaza. Ponadto odkryliśmy, że cisplatyna hamuje wychwyt (55)Fe(II) do komórek drożdży. Odkrycia te sugerują, że cisplatyna aktywuje Aft1 poprzez hamowanie wychwytu żelaza do komórek, po czym ekspresja genów docelowych Aft1 zaangażowanych w pobieranie żelaza może być indukowana. --- Aft1 jest aktywatorem transkrypcyjnym w Saccharomyces cerevisiae, który odpowiada na dostępność żelaza i reguluje ekspresję genów w regulonie żelaza, takich jak FET3, FTR1 i rodzina ARN. Stosując ekran dwuhybrydowy, odkryliśmy, że Aft1 fizycznie oddziałuje z transporterem FOB (ferrioksamina B) Arn3. Ta moduluje zdolność Arn3 do pobierania FOB. Interakcja między Arn3 i Aft1 została potwierdzona przez beta-galaktozydazę, testy koimmunoprecypitacji i SPR (powierzchniowy rezonans plazmonowy). Skrócony Aft1 miał silniejszą interakcję z Arn3 i powodował wyższy wychwyt FOB niż Aft1 pełnej długości. Co ciekawe, tylko pełnej długości Aft1 indukował prawidłową lokalizację Arn3 w odpowiedzi na FOB. Ponadto stwierdziliśmy, że Aft1 wpływał na ubikwitynację Arn3. Wyniki te sugerują, że Aft1 oddziałuje z Arn3 i może regulować ubikwitynację Arn3 w przedziale cytozolowym. --- Saccharomyces cerevisiae może importować żelazo poprzez system o wysokim powinowactwie składający się ze szlaku redukcyjnego, w którym pośredniczy Ftr1/Fet3, oraz szlaku nieredukcyjnego nieredukcyjnego, w którym pośredniczy siderofor. Ekspresja składników systemu jest kontrolowana przez czynnik transkrypcyjny Aft1. W tym badaniu wykazaliśmy, że po stresie oksydacyjnym Aft1 jest przejściowo internalizowany do jądra, po czym następuje aktywacja transkrypcji składników jego regulonu. regulonu. W tych warunkach poziomy mRNA genów szlaku nieredukcyjnego wzrasta, podczas gdy poziomy FTR1 i FET3 pozostają niskie z powodu destabilizacji mRNA. destabilizacji mRNA. W konsekwencji odpowiednie poziomy białek również pozostają niskie. W takiej destabilizacji mRNA pośredniczy ogólny szlak rozpadu 5'-3' mRNA i jest niezależna od białka wiążącego RNA Cth2. Komórki drożdży są nadwrażliwe na nadtlenki w warunkach wzrostu, w których tylko tylko szlak redukcyjny o wysokim powinowactwie jest funkcjonalny dla asymilacji żelaza. Wręcz przeciwnie przeciwnie, nadtlenek nie wpływa na wzrost, gdy wychwyt żelaza zachodzi wyłącznie wyłącznie przez szlak nieredukcyjny. Wzmacnia to koncepcję, że po stresie oksydacyjnym stresie komórki S. cerevisiae przekierowują asymilację żelaza przez nieredukcyjny aby zminimalizować uszkodzenia oksydacyjne przez jony żelaza, które powstają podczas importu żelaza przez kompleksy Ftr1/Fet3. --- Niedobór żelaza w Saccharomyces cerevisiae indukuje transkrypcję genów wymaganych do wychwytu żelaza o wysokim powinowactwie. AFT1 pośredniczy w tej transkrypcji kontrolę. W niniejszym raporcie, region 5'-flanking genu FET3, który koduje oksydazę oksydazę zależną od miedzi wymaganą do transportu żelaza, został przeanalizowany i stwierdzono, że zawiera sekwencję DNA odpowiedzialną za ekspresję genu regulowaną przez AFT1. AFT1 był zdolny do specyficznej interakcji z tą sekwencją DNA. Główny element w tej sekwencji DNA niezbędny do wiązania AFT1. In vivo footprinting wykazał zajęcie miejsca wiązania AFT1 w komórkach pozbawionych żelaza, a nie w komórkach hodowanych w obecności żelaza. Tak więc sygnał środowiskowy wynikający z niedoboru żelaza był przekazywany przez regulowane wiązanie AFT1 do promotora FET3, a następnie aktywację transkrypcji. transkrypcji. Można było zdefiniować regulon genów pod kontrolą AFT1. AFT1 był w stanie związać się z konsensusowym miejscem wiązania (PyPuCACCCPu) w regionie 5' FRE1, FRE2, FTR1, FTH1 i CCC2. --- Stwierdziliśmy, że czynniki architektoniczne związane z chromatyną HMG-box drożdży Nhp6a/b i korepresor Ssn6 (Cyc8) są kluczowymi koaktywatorami transkrypcyjnymi genu FRE2. FRE2 kodujący reduktazę żelaza błony plazmatycznej jest indukowany przez reagujący na żelazo, wiążący DNA, aktywator transkrypcyjny Aft1. Wykazaliśmy, że Nhp6 oddziałuje bezpośrednio z N-połową Aft1, w tym z regionem wiążącym DNA, aby ułatwić wiązanie Aft1 w FRE2 UAS. Ssn6 również oddziałuje bezpośrednio z połówką N Aft1 N-half i jest rekrutowany na promotorze FRE2 tylko w obecności zarówno Aft1 i Nhp6. Ta rola Nhp6/Ssn6 w transkrypcji za pośrednictwem Aft1 jest promotorem FRE2 specyficzny dla kontekstu, a oba regulatory są wymagane do zależnej od aktywacji remodelowania chromatyny. Nasze wyniki dostarczają pierwszych biochemicznych dowodów in vivo na niespecyficzną sekwencyjnie rekrutację białka HMG-box przez transaktywator specyficzny dla genu drożdży specyficznego dla genów drożdży transaktywatora do jego miejsca docelowego DNA oraz rekrutacji promotora Ssn6 za pośrednictwem Nhp6. rekrutację promotora. Ssn6 ma wyraźnie koaktywującą rolę na promotorze FRE2 tylko po indukcji. Dlatego aktywacja transkrypcji w odpowiedzi na dostępność żelaza obejmuje wiele interakcji białkowych między Aft1 reagującym na żelazo czynnikiem wiążącym DNA i globalnymi regulatorami, takimi jak Nhp6 i Ssn6. --- Czynniki transkrypcyjne Aft1 i Aft2 z Saccharomyces cerevisiae regulują ekspresję genów zaangażowanych w homeostazę żelaza. Czynniki te indukują geny regulonu żelaza w drożdżach z niedoborem żelaza, ale są inaktywowane w komórkach komórkach bogatych w żelazo. Wcześniej wykazano, że hamowanie Aft1/Aft2 przez żelazo jest zależne od składników mitochondrialnych wymaganych do biogenezy cytozolowego białka siarki żelaza biogenezy. Obecnie pokazujemy, że jądrowe monotiolowe glutaredoksyny Grx3 i Grx4 są krytyczne dla hamowania żelaza Aft1 w komórkach drożdży. Komórki pozbawione obu glutaredoksyn wykazują konstytutywną ekspresję genów regulujących żelazo. Nadekspresja Grx4 osłabia aktywność Aft1 typu dzikiego. Domena podobna do tioredoksyny w Grx3 i Grx4 jest zbędna w pośredniczeniu w hamowaniu aktywności Aft1 przez żelazo, podczas gdy konserwowana cysteina, która jest częścią konserwowanego motywu CGFS w monotiolu glutaredoksyny jest niezbędna dla tej funkcji. Grx3 i Grx4 oddziałują z Aft1 jak wykazały interakcje dwuhybrydowe i testy koimmunoprecypitacji. Interakcja interakcja między glutaredoksynami i Aft1 nie jest modulowana przez status żelaza komórek, ale zależy od konserwowanej reszty Cys domeny glutaredoksyny. Tak więc Grx3 i Grx4 są nowymi składnikami wymaganymi do regulacji żelaza Aft1, która najprawdopodobniej zachodzi w jądrze.
Jaka jest funkcja białka drożdżowego Aft1?
Czynnik transkrypcyjny Aft1 reguluje regulon żelaza w odpowiedzi na dostępność żelaza w Saccharomyces cerevisiae. Aft1 aktywuje baterię genów wymaganych do pobierania żelaza w warunkach niedoboru żelaza, podczas gdy funkcja Aft1 jest inaktywowana w warunkach niedoboru żelaza. Aft1 oddziałuje z transporterem FOB (ferrioksamina B) Arn3 i może regulować ubikwitynację Arn3 w przedziale cytozolowym. Aft1 jest zaangażowany w liczne procesy komórkowe, w tym progresję cyklu komórkowego i stabilność chromosomów.  Wykazano również, że Aft1 wpływa na różnorodne procesy komórkowe, w tym szlak pH RIM101, stabilność ścian komórkowych, uszkodzenia DNA, transport białek, stabilność chromosomów, funkcje mitochondriów, a ostatnio wykazano, że oddziałuje z białkiem kinetochoru Iml3 i promuje kohezynę pericentromeryczną.