Farmakologiczna różnorodność różnych izoform nikotynowego receptora acetylocholiny acetylocholiny wynika z różnorodności podjednostek, które łączą się, tworząc natywne receptory. tworząc natywne receptory. Celem tego badania było zbadanie działania środków zwiotczających mięśnie d-tubokuraryny, pankuronium i wekuronium na różne izoformy nikotynowych receptorów acetylocholiny (mięsień płodowy myszy, mięśni dorosłych myszy i neuronów szczura), przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus system. Oocytom wstrzyknięto cRNA dla podjednostek alfa, beta, gamma, delta (natywna kombinacja podjednostek mięśni płodowych) lub cRNA dla podjednostek alfa, beta, epsilon, delta (natywna kombinacja podjednostek mięśni dorosłych) lub z cRNA dla podjednostek alfa4beta2 (domniemana natywna kombinacja podjednostek neuronalnych). Acetylocholina miała podobną siłę działania we wszystkich trzech kombinacjach podjednostek (EC50 odpowiednio 11,6, 17,4 i 19,1 mikroM). We wszystkich trzech typach receptorów, d-tubokuraryna i pankuronium blokowały odpowiedzi wywołane przez acetylocholinę w sposób odwracalny. Ponadto, hamowanie prądów acetylocholiny dla płodowego i dorosłego nikotynowego receptora acetylocholiny przez pankuronium i d-tubokurarynę było niezależne od napięcia podtrzymującego w zakresie zakresie od -100 do -40 mV. W oocytach wyrażających nikotynowe receptory acetylocholiny mięśni płodu acetylocholiny hamowanie prądu w odpowiedzi na 100 mikroM acetylocholinę przez 10 nM d-tubokurarynę wynosiło 29 +/- 5% (średnia +/- S.E.M.; n = 7), a hamowanie przez 10 nM pankuronium wynosiło 39 +/- 6% (średnia +/- S.E.M.; n = 8; P > 0,05 vs. d-tubokuraryna). Jednak w dorosłej postaci mięśniowego nikotynowego receptora acetylocholiny receptor acetylocholiny, 10 nM d-tubokuraryna i 10 nM pankuronium były zarówno bardziej skuteczne w blokowaniu odpowiedzi na 100 mikroM acetylocholiny w porównaniu do nikotynowego receptora acetylocholiny mięśni płodu, z wartościami 55 +/- 5% (P < 0,01; n = 12) i 60 +/- 4% (P < 0,001; n = 10), odpowiednio. Tak więc przełącznik rozwojowy z podjednostki gamma na podjednostkę epsilon zmienia antagonizm nikotynowego receptora acetylocholiny zarówno dla pankuronium, jak i d-tubokuraryny. Wekuronium było silniejsze niż pankuronium. Jeden nM wekuronium zmniejszał odpowiedź na 100 mikroM acetylocholiny o 71 +- 6% (n = 10) dla płodu i 63 +/- 5% (n = 4) dla dorosłych nikotynowych receptorów acetylocholiny. W alfa4beta2 neuronalnych nikotynowych receptorów acetylocholiny, 10 nM pankuronium było skuteczniejszym antagonistą odpowiedzi na 100 mikroM acetylocholiny (69 +/- 6%, n = 6) niż 10 nM d-tubokuraryna (30 +/- 5%; n = 6; P < 0,05 w porównaniu do pankuronium). Kontrastuje to z nikotynowym receptorem acetylocholiny dorosłych mięśni gdzie pankuronium i d-tubokuraryna były równie skuteczne. Ekspresja ekspresja podjednostki beta2 z podjednostkami mięśni alfa, epsilon i delta tworzyła funkcjonalny receptor, który był blokowany przez pankuronium i d-tubokurarynę w podobny sposób jak podjednostka alfa1epsilondelta, co jest zgodne z hipotezą hipotezą, że podjednostka beta nie jest głównym czynnikiem determinującym działanie tego leku na nikotynowy receptor acetylocholiny dorosłych mięśni. --- Warunki równowagi stężenia neuroprzekaźnika i wiązania receptora nigdy nie są osiągane podczas transmisji synaptycznej w złączu nerwowo-mięśniowym. Dlatego ważne jest określenie kinetyki wiązania leków działających na tę synapsę. synapsę. Wcześniejsze oznaczenia szybkości dysocjacji (+)-tubokuraryny dały niespójne wyniki w zakresie od 0,1 do 4000/s. Tutaj zastosowaliśmy bezpośrednie podejście do pomiaru szybkości asocjacji (l(on)) i dysocjacji (l(on)) dla dwóch konkurencyjnych antagonistów (klinicznie stosowanych jako niedepolaryzujące mięśnie zwiotczające mięśnie), pankuronium i (+) -tubokuraryny, na nikotynowych receptorach acetylocholiny (nAChR). Wykonaliśmy makroskopowe rejestracje prądu z zewnętrznych komórek BC3H-1 wyrażających embrionalny mysi nAChR. Użyliśmy system szybkiej perfuzji z trzema rurkami do wykonywania aplikacji antagonistów i acetylocholiny do plastra. Dokonaliśmy niezależnych pomiarów równowagi hamowanie (IC(50)) oraz kinetykę początku i powrotu do normy antagonisty w temperaturze od 20 do 23 stopni C. Stałe szybkości zostały obliczone na podstawie przewidywań pojedynczego (wysokoafa przewidywania pojedynczego (o wysokim powinowactwie) modelu inhibicji kompetycyjnej. Dla pankuronium: IC(50) = 5,5 +/- 0,5 nM (średnia +/- S.D.), l(on) = 2,7 +/- 0,9 x 10(8) M(-1) s(-1), l(off) = 2,1 +/- 0,7/s [skorygowane] x 10(8)/s. Dla (+)-tubokuraryna: IC(50) = 41 +/- 2 nM, l(on) = 1,2 +/- 0,2 x 10(8) M(-1) s(-1), l(off) = 5,9 +/- 1,3/s. Wyniki kinetyczne są zgodne z wynikami równowagi, ponieważ wyniki w tym, że l(off)/l(on) jest w dobrej zgodności z wartościami IC(50). Wszystkie różnice między antagonistami są istotne na poziomie p < 0,001. Wyższe powinowactwo wyższe powinowactwo pankuronium jest spowodowane szybszą szybkością asocjacji (2,2-krotnie) w połączeniu z wolniejszą szybkością dysocjacji (2,8 razy). Wskaźniki asocjacji obu antagonistów są porównywalne lub większe niż szybkość asocjacji dla acetylocholiny wiążącej się z nAChR. --- CELE: Celem tego badania było zbadanie mechanizmu odwrócenia wpływ NF449 (analog suraminy) na blok nerwowo-mięśniowy wywołany przez d-tubokuraryną (d-TC). GŁÓWNE METODY: Stymulowane nerwem skurcze mięśni i potencjały płytki końcowej były przeprowadzono w preparatach przepony nerwu przeponowego myszy. Acetylocholina (ACh) skurcze mięśni przeprowadzono w preparatach szyjki macicy pisklęcia biventer preparaty. Presynaptyczne zapisy przebiegu terminala nerwowego przeprowadzono w preparatach preparaty triangularis sterni myszy. KLUCZOWE USTALENIA: Spośród analogów suraminy w tym badaniu tylko NF449 i suramina były w stanie odwrócić efekt blokady wywołany przez d-TC na stymulowanych nerwowo skurczach mięśni. Każdy z tych analogów suraminy (NF007, NF023, NF279 i NF449) sam nie ma znaczącego wpływu na amplitudę stymulowanych nerwowo skurczów mięśni. NF449 i suramina wykazały również antagonistyczny wpływ na hamowanie potencjałów płytki końcowej indukowanych przez d-TC. Ponadto, wstępne leczenie NF449 może antagonizować hamowanie d-TC w skurczach mięśnia dwubrzuścowego szyjki macicy wywołanych przez ACh. NF449 spowodował większe przesunięcie w prawo krzywej hamowania dawka-odpowiedź dla d-TC niż w przypadku suramina. Ponieważ inni antagoniści receptora purynergicznego 2X (P2X), NF023 i NF279, nie mają odwrotnego wpływu na blokadę nerwowo-mięśniową d-TC, efekt NF449 wydaje się nieistotny dla hamowania receptorów P2X. ZNACZENIE: Dane te sugerują, że NF449 był w stanie konkurować z wiązaniem d-TC na nikotynowych receptorach ACh, a efekt NF449 był silniejszy niż suramina w zmniejszaniu hamowania d-TC. Struktura NF449 może dostarczyć przydatnych informacji do projektowania silnych odtrutek na toksyny nerwowo-mięśniowe. toksyn nerwowo-mięśniowych. --- TŁO: Niedepolaryzujące środki blokujące przewodnictwo nerwowo-mięśniowe (NMBA) są są szeroko stosowane w praktyce anestezjologicznej i intensywnej terapii. Ich głównym miejscem działania jest postsynaptyczny nikotynowy receptor acetylocholiny acetylocholiny (nAChR) w złączu nerwowo-mięśniowym, ale ich działanie na neuronalne receptory nAChR nAChR nie zostało w pełni ocenione. Ponadto, obserwowane niekorzystne skutki niedepolaryzujących NMBA mogą wynikać z interakcji z neuronalnymi nAChR. Celem tego badania było zbadanie wpływu klinicznie stosowanych niedepolaryzujących NMBA na podtypy nAChR mięśni i neuronów. METODY: Oocytom Xenopus laevis wstrzyknięto informacyjny RNA kodujący podjednostki podjednostki zawarte w ludzkim alfa1beta1epsilondelta, alfa3beta2, alfa3beta4, alfa4beta2 i alfa7 nAChR. Interakcje między każdy z tych podtypów nAChR i atrakurium, cisatrakurium, d-tubokuraryna, miwakurium, pankuronium, rokuronium i wekuronium badano przy użyciu ośmiokanałowego dwuelektrodowego zacisku napięciowego. Odpowiedzi mierzono jako wartość szczytową prąd i ładunek netto. WYNIKI: Wszystkie niedepolaryzujące NMBA hamowały zarówno mięśniowe, jak i neuronalne nAChR. Neuronalne nAChR były odwracalnie i zależnie od stężenia hamowane w zakresie niskich mikromoli. niskim zakresie mikromolarnym. Mechanizm (tj. konkurencyjny vs. niekonkurencyjny) bloku na neuronalnych nAChR był zależny zarówno od podtypu, jak i NMBA testowanego. Autorzy nie zaobserwowali aktywacji podtypów nAChR przez żaden z testowanych NMBA. testowane NMBA. WNIOSKI: Autorzy doszli do wniosku, że niedepolaryzujące NMBA zależnie od stężenia hamują ludzkie neuronalne nAChR. Hamowanie presynaptycznego podtypu alfa3beta2 nAChR wyrażonego na zakończeniu nerwu ruchowego zapewnia możliwe molekularne wyjaśnienie zaniku tetanicznego i pociągu czterech obserwowanego podczas niedepolaryzującego bloku nerwowo-mięśniowego. --- 1. Chociaż (+)-tubokuraryna (Tc) jest klasycznie uważana za konkurencyjnego antagonistę antagonistę na złączu nerwowo-mięśniowym, szczegóły kinetyczne interakcji pozostają niejasne. 2. Zbadaliśmy konkurencyjne działanie Tc na receptor nikotynowy receptor w złączu nerwowo-mięśniowym żaby przy użyciu analizy ilościowej fazy generacji miniaturowych prądów płytki końcowej (m.e.p.cs) zarejestrowanych w roztworze Ringera (20 stopni C) pod zaciskiem napięciowym (-90 mV) w nieobecności lub obecności 1-5 mikroM Tc. W warunkach kontrolnych cztery parametry neurotransmisji oszacowano za pomocą regresji nieliniowej przy użyciu matematycznego modelu transmisji synaptycznej obejmującego uwalnianie przekaźnika, dyfuzję, hydrolizę, wiązanie receptora i bramkowanie kanału. wiązanie receptora i bramkowanie kanału. Parametry te zostały następnie wykorzystane w dalszej regresji w celu oszacowania stałych szybkości wiązania dla Tc na tej samej płytce końcowej. Uwzględniono blokadę otwartego kanału przez Tc, która w warunkach tego badania to badanie było tylko niewielkim składnikiem całkowitej blokady. 3. Wyniki sugerują że Tc wiąże się z dwoma miejscami rozpoznawania agonistów na receptorze nikotynowym z równym powinowactwem (stechiometryczne KD wynoszące 2,2 i 8,8 mikroM) i że większość blokada funkcjonalna w stężeniach do 5 mikroM jest spowodowana zajęciem tylko jednego miejsca. 4. Stała szybkości asocjacji dla wiązania Tc z miejscami na nikotynowego receptora acetylocholiny wydaje się być bardzo szybka (k+D = 8,9 x 10(8) M-1 s-1) i porównywalna do tej dla acetylocholiny (ACh). 5. W krótkim czasie, podczas którego w którym generowany jest m.e.p.c. (około 200 mikrosekund, odwrócenie blokady Tc przez przejściowo wysokie stężenia ACh wydaje się być kinetycznie ograniczone. ograniczone. --- Badaliśmy hamowanie płodowego (gamma-nAChR) i dorosłego (epsilon-nAChR) nikotynowych receptorów acetylocholiny typu mięśniowego przez dwa nowe niedepolaryzujące zwiotczające mięśnie (NDMR) rokuronium i rapakuronium, metabolit 3-dezacetylu rapakuronium (Org 9488) i pięć innych, dłużej stosowanych NDMR (pankuronium, wekuronium, miwakurium, d-tubokuraryna i gallamina). Receptory uległy ekspresji w oocytach Xenopus laevis przez cytoplazmatyczne wstrzyknięcie komplementarnych podjednostek RNA. Funkcjonalne kanały aktywowano acetylocholiną 10 mikroM, samą lub w połączeniu z różnymi stężeniami NDMR. Prądy były rejestrowane za pomocą techniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego w całej komórce. Wszystkie NDMR odwracalnie hamowały prądy aktywowane acetylocholiną w sposób zależny od dawki. Potencjały rapakuronium i Org 9488 nie różniły się statystycznie przy gamma-nAChR (odpowiedź półmaksymalna = odpowiednio 58,2 i 36,5 nM) lub epsilon-nAChR (odpowiedź półmaksymalna = odpowiednio 80,3 i 97,7 nM). Kolejność kolejność potencjałów na epsilon-nAChR (pankuronium> wekuronium podobne miwakurium > rokuronium podobne d-tubokuraryna > rapakuronium podobne Org 9488 > gallamina) korelowały w wysokim stopniu z dawkami klinicznymi potrzebnymi do wytworzenia 50% 50% depresji drgawek mięśnia przywodziciela u dorosłych. Blokada nerwowo-mięśniowa blokada nerwowo-mięśniowa przez rapakuronium może być wzmocniona przez jego metabolit Org 9488. Różne powinowactwa badanych NDMR do receptorów lekowych przyczyniają się do różnic w klinicznych dawek tych leków potrzebnych do osiągnięcia odpowiedniego rozluźnienia mięśni. rozluźnienia mięśni. WNIOSKI: Potencjały niedepolaryzujących środków zwiotczających mięśnie, badane w mięśniach nikotynowych receptorów acetylocholiny wyrażonych w rekombinowanym systemie ekspresji, korelują wysoce z dawkami klinicznymi potrzebnymi u dorosłych do wytworzenia 50% skurczu w mięśniu przywodziciela pollicis. --- Lotne środki znieczulające zwiększają blokadę nerwowo-mięśniową wytwarzaną przez niedepolaryzujące środki zwiotczające mięśnie (NDMR). Połączenie nerwowo-mięśniowe jest postulowanym miejscem tej interakcji. Przetestowaliśmy hipotezę, że lotne wzmocnienie znieczulenia zwiotczenia mięśni jest wynikiem połączonego leku wpływ na nikotynowy receptor acetylocholiny. Mięsień dorosłej myszy nikotynowy receptor acetylocholiny myszy (alfa (2), beta, delta, epsilon) był heterologicznie wyrażony w oocytach Xenopus laevis. Krzywe stężenie-efekt dla hamowania prądów indukowanych acetylocholiną ustalono dla wekuronium, d-tubokuraryny, izofluranu i sewofluranu. Następnie, hamujące działanie NDMR badano w obecności lotnych znieczulających w stężeniu równoważnym połowie stężenia powodującego 50% inhibicji. Wszystkie indywidualnie testowane związki powodowały szybkie i łatwo odwracalne hamowanie zależne od stężenia. Obliczone wartości stężenia hamującego 50% stężenia hamującego wynosiły 9,9 nM (95% przedział ufności [CI], 8,4-11,4 nM), 43,4 nM (95% CI, 33,6-53,3 nM), 897 mikroM (95% CI, 699-1150 mikroM) i 818 mikroM (95% CI, 685-1001 mikroM) dla wekuronium, d-tubokuraryny, izofluranu i sewofluranu. Jednoczesne stosowanie izofluranu lub sewofluranu znacząco wzmocniło działanie hamujące wekuronium i d-tubokuraryny, szczególnie w małych stężeniach NDMR. Lotne środki znieczulające zwiększają siłę działania NDMR, prawdopodobnie poprzez zwiększenie antagonisty w miejscu receptora. Efekt ten może przyczyniać się do klinicznie obserwowalne wzmocnienie blokady nerwowo-mięśniowej przez lotne środki znieczulające. środki znieczulające. IMPLIKACJE: Izofluran i sewofluran wzmacniają działanie blokujące receptory niedepolaryzujących środków zwiotczających mięśnie na nikotynowych receptorach acetylocholiny. --- Badania przeprowadzono w celu ustalenia czasowego i zależnego od dawki wpływu ekspozycji na ligand nikotynowy na aktywność funkcjonalną różnych podtypów nikotynowych receptorów podtypów receptora acetylocholiny (nAChR), wyrażanych przez komórki PC12 szczura pheochromocytoma (nAChR typu zwojowego) lub ludzkiej linii klonalnej TE671/RD (nAChR typu mięśniowego). linia klonalna. Przewlekłe (3-72-godzinne) leczenie agonistą (nikotyną lub karbamylocholiną) komórek doprowadziło do całkowitej (TE671) lub prawie całkowitej (PC12) utraty funkcjonalnych odpowiedzi nAChR, co jest określane jako "funkcjonalna inaktywacja". Niektóre inaktywację funkcji nAChR zaobserwowano również dla ligandów nikotynowych d-tubokuraryny (d-TC), mekamylaminy i deksametonium. Półmaksymalna inaktywacji funkcji nAChR zaobserwowano w ciągu 3 minut dla komórek TE671 i w ciągu 10 minut dla komórek PC12 poddanych działaniu ligandów inaktywujących. Funkcjonalna funkcjonalna inaktywacja wystąpiła z zależnościami od dawki, których nie zawsze można było pogodzić z tymi uzyskanymi dla ostrej aktywacji agonistycznej funkcji nAChR lub dla ostrego hamowania tych odpowiedzi przez d-TC, deksametonium lub mekamyloaminę. Leczenie komórek TE671 lub PC12 z nikotynowym antagonistą pankuronium lub alcuronium nie miało wpływu na poziom ekspresji funkcjonalnych nAChR. Jednakże, uzyskano dowody, że którykolwiek z tych antagonistów chronił nAChR typu mięśniowego komórek TE671 lub PC12. nAChR typu mięśniowego lub nAChR typu zwojowego komórek PC12 przed funkcjonalną inaktywacją podczas długotrwałego leczenia agonistami. Odzyskiwanie funkcji nAChR komórek TE671 po leczeniu karbamylocholiną, nikotyną lub d-TC nastąpiło po czasie 1-3 dni, niezależnie od tego, czy komórki były utrzymywane in situ, czy zebrane i replikowane po usunięciu ligandu. Dla kontrastu, 50% odzysk funkcjonalnych nAChRs na komórkach PC12 nastąpiło w ciągu 2-6 godzin po usunięciu leku. W obu przypadkach czas odzyskanie funkcjonalnej inaktywacji nAChR jest znacznie wolniejsze niż odzyskiwanie z "funkcjonalnej desensytyzacji" nAChR, która jest procesem odwracalnym który występuje przy krótszej (0-5 minut) ekspozycji komórek na agonistę. Wyniki te wskazują, że nAChR typu zwojowego i mięśniowego są podobne w ich wrażliwości na funkcjonalną inaktywację przez ligandy nikotynowe, ale różnią się pod względem ale różnią się szybkością powrotu do stanu wyjściowego i wystąpienia tych efektów. Zdolność leków takich jak agoniści d-TC, deksametonium i mekamylamina do wywoływania funkcjonalnej inaktywacji inaktywacji może odnosić się do ich aktywności jako częściowych/pełnych agonistów, blokerów kanału blokery i/lub regulatory allosteryczne. Działanie leków takich jak pankuronium i alcuronium prawdopodobnie odzwierciedlają proste konkurencyjne hamowanie wiązania pierwotnego ligandu w funkcjonalnych miejscach aktywacji. (ABSTRAKT SKRÓCONY DO 400 SŁÓW)
Czy d-tubokuraryna (d-TC) indukuje nieodwracalne hamowanie nikotynowego receptora acetylocholiny (nAChR) w złączu nerwowo-mięśniowym?
D-tubokuraryna jest niedepolaryzującym środkiem blokującym przewodnictwo nerwowo-mięśniowe (niedepolaryzującym środkiem zwiotczającym mięśnie - NDMR). Niedepolaryzujące środki zwiotczające mięśnie działają poprzez blokowanie nikotynowych receptorów acetylocholiny złącza nerwowo-mięśniowego. Działanie tubokuraryny blokujące przewodnictwo nerwowo-mięśniowe jest odwracalne i zależne od stężenia. Hamowanie prądów indukowanych acetylocholiną przez d-tubokurarynę może być odwrócone przez środki antycholinesterazowe, takie jak edrofonium i metamidofos.