Zakończenie widełek replikacyjnych na naturalnych końcach rDNA u Saccharomyces cerevisiae jest kontrolowane w sposób specyficzny dla sekwencji i biegunowy przez oddziaływanie białka terminatora replikacji Fob1p z tandemowymi miejscami Ter zlokalizowanymi w nietranskrybowanych odstępach. Tutaj pokazujemy, zarówno przez analizy żelu 2D analizy i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), że istnieje drugi poziom globalnej kontroli poziom globalnej kontroli, w której pośredniczy kompleks białkowy punktu kontrolnego w fazie S Tof1p i Csm3p, które chronią zablokowane widełki w miejscach Ter przed aktywnością helikazy Rrm3p ("sweepase"). Sweepaza ma tendencję do uwalniania zatrzymanych widelców prawdopodobnie poprzez przejściowe przemieszczenie Fob1p związanego z Ter. Zgodnie z tym mechanizmem, bardzo niewiele widełek replikacyjnych zostało zatrzymanych na naturalnych białek punktu kontrolnego. W przypadku brak helikazy Rrm3p, nastąpiło nieznaczne wzmocnienie zatrzymania widełek w miejscach w miejscach Ter. Jednoczesne delecje genów TOF1 (lub CSM3) i RRM3 przywróciły zatrzymanie widełek poprzez usunięcie zarówno uwalniania widełek, jak i ochrony widełek aktywności. Inne geny, takie jak MRC1, WSS1 i PSY2, które są również zaangażowane w szlak punktu kontrolnego MRC1 nie były zaangażowane w tę globalną kontrolę. Ta obserwacja sugeruje, że Tof1p-Csm3p funkcjonuje inaczej niż MRC1 i inne wyżej wymienione geny. Mechanizm ten nie ogranicza się do naturalnych miejsc Ter ale został również zaobserwowany przy zatrzymaniu widełek replikacyjnych spowodowanym spotkaniem widełek replikacyjnych z transkrypcją zbliżającą się z przeciwnego kierunku. --- Helikaza DNA Rrm3 promuje progresję widełek replikacyjnych przez >1000 dyskretne regiony genomowe i hamuje mobilność retrotranspozonu Ty1 za pośrednictwem cDNA. retrotranspozonu. Zbadaliśmy związek między replikacją DNA a retromobilnością Ty1 poprzez zbadanie podstaw zwiększonej retromobilności w mutancie rrm3 mutanta. Mimo że poziomy cDNA Ty1 są zwiększone pod nieobecność RRM3, ani poziom, ani specyficzność miejsca docelowego integracji cDNA nie uległy zmianie. Zamiast tego, cDNA został włączony do genomu przez mechanizm zależny od Rad52 który nie obejmował konwersji genów genomowych sekwencji Ty1. W izolatach rrm3, włączone cDNA było często obecne w tandemowych macierzach. Multimeryczne tablice cDNA prawdopodobnie powstają podczas naprawy pęknięć chromosomalnych, ponieważ ich pojawienie się było silnie skorelowane z powstawaniem dużych rearanżacji chromosomalnych. Co więcej, multimery Ty1 były niezmiennie zlokalizowane na rearanżowanych chromosomach, gdy były obecne. obecne. Nadekspresja komórkowej RNazy H, która degraduje RNA w hybrydzie RNA:DNA DNA, całkowicie tłumiła wzrost tworzenia multimerów Ty1 w mutancie rrm3 mutanta. Proponujemy, aby regiony hybrydowe RNA:DNA w obrębie powstającej retrotranspozycji zdarzenia blokują replikację w mutancie rrm3, prowadząc do pęknięć chromosomów w sekwencjach sekwencji Ty1. Wiele pozagenomowych cząsteczek cDNA Ty1 jest następnie wykorzystywanych jako dawcy w rekombinacyjnej naprawie pęknięcia, zanim zostanie ono wyleczone. --- Rozwidlenia replikacji napotykają wiele przeszkód, które spowalniają ich postęp. Według dwuwymiarowej analizy żelowej, widełki drożdżowe zatrzymują się na stabilnych kompleksach białek DNA, a to zatrzymanie jest znacznie zwiększone w przypadku braku helikazy Rrm3. My Zastosowaliśmy podejście obejmujące cały genom, aby zidentyfikować 96 miejsc bardzo wysokiego wiązania polimerazy DNA w komórkach typu dzikiego. w komórkach typu dzikiego. Większość z tych miejsc wiązania nie była wcześniej wcześniej zidentyfikowanymi miejscami pauzy. Najliczniej reprezentowaną kategorią genomową wśród miejsc wysokiego wiązania polimerazy DNA były otwarte ramki odczytu (ORF) wysoko transkrybowanych genów polimerazy RNA II. Zidentyfikowano dwa razy więcej miejsc zidentyfikowano w rrm3 w porównaniu z komórkami typu dzikiego, ponieważ pauza w tym szczepie wystąpiła zarówno w genach polimerazy RNA II o wysokim stopniu transkrypcji, jak i wcześniej zidentyfikowanych białkowych kompleksach DNA. ORFy wysoce transkrybowanych genów polimerazy RNA II są klasą naturalnych miejsc pauzy, które nie są nasilone w komórkach rrm3. --- Gen RRM3 Saccharomyces cerevisiae koduje helikazę DNA od 5' do 3'. Podczas gdy replikacja większości genomu drożdży nie była zależna od Rrm3p, w przypadku jego braku nieobecności, widełki replikacyjne zatrzymywały się i często pękały w około 1400 dyskretnych miejscach, w tym genach tRNA, centromerach, nieaktywnych źródłach replikacji i tłumiki transkrypcyjne. Te defekty replikacji były związane z aktywacją punktu kontrolnego wewnątrz fazy S. Aktywacja punktu kontrolnego była krytyczna dla żywotności komórek rrm3Delta, szczególnie w niskich temperaturach. Każde którego replikacja została zaburzona przez Rrm3p, jest połączony w nienukleosomalny kompleks białko-DNA. kompleks białko-DNA. W genach tRNA i loci typu cichego kojarzenia, zakłócenie tych kompleksów wyeliminowało zależność od Rrm3p. Dane te wskazują, że helikaza DNA Rrm3p pomaga widełkom replikacyjnym przechodzić przez kompleksy białko-DNA, naturalnie występujące przeszkody napotykane w każdej fazie S. --- W jaki sposób komórkowa ilość mitochondrialnego DNA (mtDNA) jest regulowana w normalnych warunkach i w obecności stresu genotoksycznego? warunkach i w obecności stresu genotoksycznego jest mniej zrozumiały. My wykazujemy, że nieefektywny proces replikacji mtDNA w zmutowanych komórkach drożdży pozbawionych helikazy DNA PIF1 jest częściowo ratowany przy braku helikazy DNA RRM3. Efekt ratunkowy jest prawdopodobnie spowodowany wzrostem stężenia trifosforanu deoksynukleozydu. trifosforanów dezoksynukleozydów (dNTP) spowodowany brakiem RRM3. W przeciwieństwie do tego, zależne od Pif1p pęknięcie mtDNA w obecności i przy braku stresu genotoksycznego nie jest tłumione, jeśli brakuje RRM3, co sugeruje, że ten fenotyp fenotyp jest prawdopodobnie niezależny od puli dNTP. Stwierdzono, że białko Pif1 (Pif1p) stymuluje włączanie dNTP do nowo syntetyzowanego mtDNA z mitochondriów oczyszczonych metodą gradientową. Proponujemy, aby Pif1p, który działa prawdopodobnie jako helikaza DNA DNA w mitochondriach wpływa bezpośrednio na replikację mtDNA. Możliwe role Pif1p obejmują rozdzielczość wtórnego DNA i / lub struktur DNA / RNA, tymczasowe przemieszczenie tymczasowe przemieszczenie ściśle związanych białek wiążących mtDNA lub stabilizację mitochondrialnego kompleksu replikacyjnego podczas replikacji mtDNA.
Jaki jest efekt braku Saccharomyces cerevisiae Rrm3p?
Gen RRM3 Saccharomyces cerevisiae koduje helikazę DNA od 5' do 3'. Podczas gdy replikacja większości genomu drożdży nie była zależna od Rrm3p, w przypadku jego braku, widełki replikacyjne zatrzymywały się i często pękały w około 1400 dyskretnych miejscach, w tym w genach tRNA, centromerach, nieaktywnych źródłach replikacji i tłumikach transkrypcji. Te defekty replikacji były związane z aktywacją punktu kontrolnego w fazie wewnątrz-S. Aktywacja punktu kontrolnego była krytyczna dla żywotności komórek rrm3Delta, szczególnie w niskich temperaturach.