Zmutowana kinaza zależna od cyklin 4 (CDK4) została zidentyfikowana jako antygen specyficzny dla nowotworu rozpoznawany przez HLA-A2. antygen rozpoznawany przez HLA-A2. 1-ograniczone autologiczne cytolityczne limfocyty T (CTL) w ludzkim czerniaku. Zmutowany allel CDK4 był obecny w autologicznych hodowanych komórkach czerniaka i tkance przerzutowej, ale nie w limfocytach pacjenta. limfocytach pacjenta. Mutacja, zamiana argininy na cysteinę przy reszcie 24, była częścią peptydu CDK4. była częścią peptydu CDK4 rozpoznawanego przez CTL i zapobiegała wiązaniu inhibitora CDK4 p16INK4a, ale nie p21 lub p27KIP1. Ta sama mutacja została znaleziona w jednym dodatkowym czerniaku spośród 28 analizowanych czerniaków. Wyniki te sugerują, że mutacja CDK4 może tworzyć antygen specyficzny dla guza i może zakłócać regulację cyklu komórkowego regulację cyklu komórkowego wywieraną przez supresor nowotworu p16INK4a. --- Szlak supresorowy nowotworu retinoblastoma (RB) jest prawdopodobnie ważny w prymitywnych guzach neuroektodermalnych (PNET) mózgu. prymitywnych guzach neuroektodermalnych (PNET) mózgu. W rzeczywistości u 10% do 15% dzieci urodzonych z mutacjami RB rozwija się PNET mózgu, zwykle w szyszynce. szyszynce. Cyklina D1, która w połączeniu z kinazą zależną od cyklin (Cdk) 4 i Cdk6 fosforyluje i inaktywuje białko RB, ulega ekspresji w 40% sporadycznych sporadycznych medulloblastoma, PNET móżdżku. Aby zrozumieć nowotworowe nowotworowych współpracujących z zaburzeniami szlaku RB w PNET mózgu, wygenerowaliśmy transgeniczną mysz, w której transgeniczną mysz, u której cyklina D1 ulegała ekspresji w komórkach szyszynki. Cyklina D1 zwiększała proliferację pinealocytów, powodując powiększenie szyszynki. Jednakże, proliferacja ustała po 2 tygodniach życia z odwróceniem fosforylacji Rb, w której pośredniczy Cdk4 pomimo ciągłej ekspresji transgenu, a komórki szyszynki wykazywały ogniska heterochromatyny. komórki wykazywały ogniska heterochromatyny sugerujące stan podobny do starzenia. W przypadku Brak supresora nowotworu p53, proliferacja komórek była kontynuowana, co skutkowało PNET szyszynki, który ograniczył przeżycie myszy do około 4 miesięcy. Co ciekawe, inhibitor Cdk p18(Ink4c) był indukowany w transgenicznych szyszynkach niezależnie od p53. niezależnie od p53, a u transgenicznych myszy pozbawionych Ink4c rozwinęły się inwazyjne PNET. inwazyjny PNET, chociaż w starszym wieku niż te pozbawione p53. Analogicznie do naszego stwierdziliśmy, że dzieci z dziedzicznym RB często miały bezobjawowe powiększenie szyszynki. bezobjawowe powiększenie szyszynki, które rzadko przechodziło w PNET. Nasze odkrycie, że inhibitor Cdk4 p18(Ink4c) jest supresorem nowotworu w PNET napędzanym cykliną D1 sugeruje, że interwencje farmakologiczne mające na celu zahamowanie aktywności Cdk4 mogą być użyteczną strategią chemoprewencyjną lub terapeutyczną w raku spowodowanym pierwotnym zaburzeniem szlaku RB zaburzeniem szlaku RB. --- Chociaż p27(Kip1) został uznany za ogólny inhibitor kinaz zależnych od cyklin w fazie G1 i S kinaz zależnych od cyklin, donosimy, że interakcja p27 z dwiema takimi kinazami, cykliną kinazami, cykliną A-Cdk2 i cykliną D-Cdk4, jest inna. W komórkach Mv1Lu zawierających indukowalny system p27, 6-krotny wzrost w stosunku do podstawowego poziomu p27 całkowicie hamował Cdk2 i progresję cyklu komórkowego. W przeciwieństwie do tego, taki sam lub większy wzrost poziomu p27 nie hamował Cdk4 ani jego homologu Cdk6, pomimo rozległego wiązania z tymi kinazami. Kompleks p27-cyklina A-Cdk2 utworzony in vitro był zasadniczo nieaktywny, podczas gdy kompleks p27-cyklina D2-Cdk4 był aktywny jako kinaza retinoblastoma i służył jako substrat dla kinazy aktywującej Cdk-aktywującej kinazy Cak. Wysokie stężenia p27 hamowały cyklinę D2-Cdk4, najwyraźniej poprzez konwersję aktywnych kompleksów w nieaktywne poprzez wiązanie dodatkowych cząsteczek p27. dodatkowych cząsteczek p27. W przeciwieństwie do ich zróżnicowanej interakcji, cyklina A-Cdk2 i cyklina D2-Cdk4 były podobnie hamowane przez związane p21(Cip1/Waf1). Role cykliny A-Cdk2 jako celu p27 i cykliny D2-Cdk4 jako rezerwuaru rezerwuar p27 może wynikać z różnej zdolności związanego p27 do hamowania podjednostki kinazy w tych kompleksach. --- Geny inhibitorów CDK4 p15 i p16 mapują się w regionie chromosomu 9p21 często usuwanego w międzybłoniaku złośliwym i innych nowotworach. p16 został niedawno zidentyfikowany jako potencjalny cel delecji 9p21 w międzybłoniaku złośliwym. jako potencjalny cel delecji 9p21 w międzybłoniaku, ale rola tego genu jest niepewna. rola tego genu jest niepewna, ponieważ delecje były wykrywane częściej częściej w ustalonych liniach komórkowych niż w próbkach guza pierwotnego. Określiliśmy liczbę kopii p15 i p16 za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z kontigiem P1 w 50 pierwotnych międzybłoniakach. Kodelecję p15 i p16 stwierdzono w 72% międzybłoniaków, w tym we wszystkich międzybłoniaków, w tym we wszystkich przypadkach z komponentami wrzecionowatokomórkowymi (n = 21) i całkowitą delecję p15 i p16 stwierdzono w kilku międzybłoniakach, które nie miały cytogenetycznej delecji krótkiego ramienia chromosomu 9. Mutacje punktowe nie zostały w eksonie 2 zachowanych alleli p15 i p16 z siedmiu międzybłoniaków. międzybłoniaków. Odkrycia te pokazują, że p15, p16 i/lub blisko sąsiadujący gen sąsiedni gen są celami częstych delecji chromosomu 9p w pierwotnym międzybłoniaku złośliwym. międzybłoniaku złośliwym. --- Interakcje białko-białko zwykle obejmują dużą liczbę reszt; dlatego też jest trudne do wyjaśnienia funkcjonalnych i strukturalnych ról określonych reszt zlokalizowanych w interfejsie. Problem ten jest szczególnie trudny w przypadku białek ankyrin (AR), które składają się z liniowych tablic małych powtarzających się jednostek i odgrywają kluczową rolę w prawie każdym procesie życiowym poprzez interakcje białko-białko interakcje, ponieważ zaangażowane reszty są nieciągle rozproszone w zarówno w AR, jak i ich partnerach. Nasze poprzednie badania wykazały, że zarówno specyficzny inhibitor CDK4 p16INK4A (P16) i gankryna wiążą się z cyklinozależną kinazy 4 (CDK4) w podobny sposób, tylko P16 hamuje aktywność kinazową CDK4. Chociaż może to wyjaśniać, dlaczego P16 jest supresorem nowotworu, a gankyrin jest onkogenna, strukturalna podstawa tych kontrastujących właściwości była nieznana. Tutaj pokazujemy, że podwójny mutant gankyriny, L62H/I79D, hamuje aktywność kinazy aktywność kinazy CDK4, podobnie jak P16, a taka aktywność hamująca CDK4 jest związana z z mutacją I79D, ale nie L62H. Ponadto mutacje w I79 i L62 powodują umiarkowany spadek stabilności umiarkowany spadek stabilności gankyriny. Dalsze analizy strukturalne i analizy biofizyczne sugerują, że substytucja Ile79 przez Asp prowadzi do lokalnych zmian konformacyjnych w pętlach I-III gankyriny. Podsumowując, nasze wyniki pozwalają na rozcięcie funkcji "wiązania białko-białko" i "inhibicji CDK4 hamowania" funkcji P16, pokazują, że różnica między supresją nowotworu a onkogennymi funkcjami P16 i gankyrin, odpowiednio, głównie rezyduje w i zapewniają strukturalny wgląd w kontrastujące biologiczne funkcje obu białek AR. funkcje dwóch białek AR. --- Inhibitory kinazy zależnej od cyklin (CDK) należące do rodziny INK4 specyficznie wiążą i hamują specyficzne dla G1 cząsteczki CDK CDK4 i CDK6. Jedna cząsteczek INK4, p16, jest również znana jako wielokrotny supresor nowotworu i została jest zmutowana lub usunięta w różnych nowotworach i liniach komórkowych. Zidentyfikowaliśmy wcześniej zidentyfikowaliśmy p18 jako członka rodziny INK4. Aby określić molekularne podstawy hamującej funkcji p18, wprowadziliśmy 11 mutacji missense mutacji konserwatywnych reszt, które zostały zidentyfikowane w p16 linii komórek nowotworowych do p18. Wpływ tych mutacji na zdolność p18 do wiązania i hamowania CDK4 i CDK6 lub hamowania wzrostu komórek. Nasze wyniki wskazują, że trzecie powtórzenie ankyryny i NH2-końcowa część czwartego powtórzenia stanowią istotny element niezbędny dla zdolności p18 do wiązania i hamowania CDK4 i CDK6. Oprócz tego podstawowego elementu interakcji, p18 wydaje się wykorzystywać dodatkowe, odrębne reszty do różnicowego wiązania i hamowania CDK4 i CDK6, odpowiadając za znaną skłonność p18 do preferencyjnego interakcji z CDK6. --- W niniejszym badaniu przeanalizowaliśmy linie komórkowe ludzkiego raka jajnika pod kątem nieprawidłowości w genie supresorowym nowotworu Rb (retinoblastoma) oraz w genach inhibitorów geny inhibitorów kinazy zależnej od cyklin 4 (CDK4) (p16INK4 i p15INK4B) przy użyciu technik biologii molekularnej. technik biologii molekularnej. W przypadku genu Rb, we wszystkich sześciu liniach komórkowych (PA-1, (PA-1, Caov-3 i -4, OVCAR-3, SK-OV-3 i Kuramochi), nieprawidłowości genu Rb nie wykryto metodą Southern blot. wykryte przy użyciu Southern blotting. W linii komórkowej Caov-3 transkrypty nie były wykrywalne ani metodą Northern blot, ani za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy. Analiza sekwencji analiza całego regionu kodującego genu Rb ujawniła mutacje punktowe (AAC do GAC) skutkujące zmianami kodonu 123 (Asn do Asp) w linii komórkowej Caov-4. linii komórkowej Caov-4. W linii komórkowej PA-1 zarówno Rb typu dzikiego, jak i Rb typu zmutowanego (kodon 798: CGG do TGG) uległy ekspresji, a w linii komórkowej OVCAR-3 zarówno Rb typu dzikiego, jak i Rb typu dzikiego (kodon 704: ATG do GTG). W czterech z sześciu ludzkich linii komórkowych raka jajnika wykryto nieprawidłowości genu Rb. W przypadku genów p16INK4 i p15INK4B, tylko linia komórkowa SK-OV-3 wykazywała nieprawidłowości. Występowała rearanżacja genu lub niewielka delecja genu p16INK4 w linii komórkowej SK-OV-3, podczas gdy gen p15INK4B był nieprawidłowy. linii komórkowej SK-OV-3, podczas gdy gen p15INK4B został usunięty w tej linii komórkowej. W linii komórkowej SK-OV-3 nie ulegały ekspresji mRNA p16INK4 i p15INK4B. W punkcie inaktywacji genu Rb możemy wyjaśnić pięć z sześciu linii komórkowych: cztery linie komórkowe miały nieprawidłowości w samym genie Rb, co jest kolejnym mechanizmem, za pomocą którego gen Rb jest inaktywowany, podczas gdy jedna linia komórkowa (SK-OV-3) miała nieprawidłowości w genach inhibitorów CDK4 co jest kolejnym mechanizmem inaktywacji genu Rb. Te dane sugerują, że nieprawidłowości w genach inhibitorów Rb i CDK4 (p16INK4, p15INK4B) mogą być zaangażowane w raka jajnika u ludzi. --- Gen inhibitora kinazy zależnej od cyklin 4 (cdk4) (p16INK4/MTS1/CDKN2) został niedawno zidentyfikowany jako gen został niedawno zidentyfikowany jako przypuszczalny gen supresorowy guza ze względu na wysoką częstotliwość częstotliwość homozygotycznej delecji obserwowanej w wielu ludzkich liniach komórek nowotworowych, w tym w białaczkach. Jednak wyniki uzyskane z niehodowanych próbek guza doprowadziły do dyskusji na temat znaczenia tych ustaleń. Stosując odwrotną reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) i analizy Southern blot, my zbadaliśmy gen p16INK4A zarówno na poziomie RNA, jak i genomowym w różnych typach białaczek białaczek: ostra białaczka szpikowa (AML) (n = 23); ostra białaczka limfocytowa (ALL) (n = 22) i przewlekłych zaburzeń limfoproliferacyjnych z komórek B (CLPD) (n = 33). Ekspresji mRNA p16INK4A nie stwierdzono tylko w 1/20 próbek AML i 2/23 CLPD. I odwrotnie, mRNA p16INK4A nie wykryto w 5/17 przypadkach ALL, a intensywność produktów PCR była ledwo wykrywalna. produktów PCR była ledwo wykrywalna w siedmiu dodatkowych przypadkach, prawdopodobnie związanych z z zanieczyszczeniem normalnymi komórkami w niektórych przypadkach. Przez Southern blotting, homozygotyczna delecja homozygotyczną delecję genu p16INK4A stwierdzono w 6/17 przypadkach ALL (35%), z których wśród których 4/6 było ujemnych lub słabo dodatnich w teście RT-PCR. Żadna z pięciu próbek AML i 20 badanych próbek CLL nie stwierdzono delecji p16INK4A. Analiza sekwencji p16INK4A nie wykazała mutacji punktowej w dwóch z tych przypadków pozbawionych ekspresji mRNA. ekspresji mRNA. Nasze dane dostarczają dalszych dowodów na to, że wśród nowotworów hematologicznych nowotworów złośliwych, ALL są najprawdopodobniej związane z inaktywacją p16INK4A głównie poprzez homozygotyczną delecję genu. Ponieważ większość hematologicznych nowotworów złośliwych - z wyjątkiem ALL - jest rzadko związana z p16INK4A i retinoblastoma (Rb), wydaje się, że warto zbadać ekspresję cdk4 i cdk6 w celu ustalenia, czy zakłócenie układu p16INK4A/Rb/cdk4/cdk6 może odgrywać rolę w ich patogenezie. --- Zależna od cyklu komórkowego fosforylacja białka supresorowego nowotworu RB jest za pośrednictwem rodziny kinaz zależnych od cykliny G1 (cdks) i cyklin, w tym aktywowany kompleks cdk4:cyklina D. Identyfikacja inhibitora cdk4, p16INK4, jako celu mutacji w hodowanych liniach nowotworowych i guzach pierwotnych sugeruje, że aktywność RB może być zaburzona w tych komórkach. Przebadaliśmy 88 linii raka płuc pod kątem ekspresji białka p16INK4 i zaobserwowaliśmy uderzającą odwrotną korelację między obecnością p16INK4 a dzikim RB. Wykazaliśmy wykazaliśmy, że tylko 6/55 (11%) próbek drobnokomórkowego raka płuca (SCLC) miało nieobecne białko p16INK4, a wszystkie 6 należało do rzadkiego podzbioru SCLC z ekspresją dziką ekspresją RB. I odwrotnie, z 48 próbek SCLC z nieobecnym lub zmutowanym RB, wszystkie wykazywały wykrywalne poziomy białka p16INK4. W przeciwieństwie do tego zaobserwowaliśmy, że 23/33 (70%) próbek innych niż SCLC miało utratę p16INK4. Dwadzieścia dwie z 26 linii nie-SCLC z dzikim typem RB było nieobecnych p16INK4, podczas gdy 6 z 7 linii nie-SCLC z nieobecnym lub zmutowanym RB miało wykrywalne p16INK4. Odwrotna korelacja ekspresji RB i p16INK4 oraz brak inaktywacji p16INK4 w liniach RB (-/-) SCLC (0/48) potwierdza wspólny szlak supresora wzrostu p16INK4/RB w ludzkich nowotworach nowotworach i dostarcza dowodów na to, że p16INK4, a nie sąsiedni gen na a nie sąsiedni gen na chromosomie 9p, jest specyficznym celem mutacji.
Które geny/białka hamują kinazę zależną od cyklin 4 (CDK4)?
Geny inhibitora CDK4 p15 (ink4b) i p16 (ink4a) są mapowane w regionie chromosomu 9p21, który często ulega delecji w różnych nowotworach. Inhibitor Cdk4 p18 (Ink4c) jest supresorem nowotworu. Ostatnie badania nad cykliną D1/Cdk4 sugerują, że p21 (Waf1/Cip1/Sdi1) odgrywa kluczową rolę jako silny inhibitor Cdk4. p27KIP1 jest również inhibitorem cdk4.