Amplifikacja genomowych elementów Alu przez retropozycję, tj. przez reintegrację odwrotnie transkrybowanego RNA, sugeruje, że Alu RNA odgrywa ważną rolę w tym procesie. ważną rolę w tym procesie. Przedstawiamy badania enzymatyczne struktury drugorzędowej RNA transkrybowanego in vitro z dwóch niedawno retropozycjonowanych elementów Alu elementów. Eksperymenty te pokazują, że dimeryczna organizacja sekwencji Alu znajduje odzwierciedlenie w składaniu RNA. Podjednostki Alu fałdują się niezależnie, zachowując motywy struktury drugorzędowej swojej progenitorowej cząsteczki RNA 7 SL. Analiza minimalizacji energii wskazuje, że ten wzór fałdowania jest również charakterystyczny dla różnych sekwencji Alu i Alu-podobnych i został zachowany od czasu dywergencji naczelnych. Analogicznie do 7 SL RNA, fałdowanie Alu RNA może być ważne dla specyficznych interakcji z białkami. Może to wskazywać na fizjologiczną funkcję transkryptów Alu. Jednak może to być również postrzegane jako adaptacja strukturalna prowadząca do wydajnej retropozycji tych sekwencji elementów. --- TŁO: Zdecydowana większość z 1,1 miliona elementów Alu jest retrotranspozycyjnie nieaktywne, gdzie tylko kilka loci określanych jako "elementy źródłowe" może generować nowe insercje Alu. elementy" mogą generować nowe wstawki Alu. Pierwszym krokiem w identyfikacji aktywnych źródeł Alu jest określenie loci transkrybowanych przez polimerazę RNA III (pol III). Poprzednie analizy całego genomu z normalnych i transformowanych linii komórkowych zidentyfikowały wiele loci Alu zajmowanych przez czynniki pol III, czyniąc z nich kandydata elementy źródłowe. WYNIKI: Analiza danych z tych ogólnogenomowych badań wykazała, że większość Alu związanych z pol III należała do starszych podrodzin Alu S i Alu J, które różniły się między liniami komórkowymi od 62,5% do 98,7% zidentyfikowanych loci. loci. Alus związane z pol III były dalej oceniane pod kątem szacowanego potencjał retrotranspozycji (ERP) na podstawie nieobecności lub obecności wybranych cech sekwencji związanych ze zdolnością do retrotranspozycji Alu. Nasze analizy wskazują, że większość zidentyfikowanych kandydatów na loci Alu związanych z Pol III nie posiada cech sekwencji ważnych dla retrotranspozycji. WNIOSKI: Dane te sugerują, że ekspresja Alu prawdopodobnie różni się w zależności od typu komórki, warunków wzrostu i stanu transformacji. Ta zmienność może obejmować te same linie komórkowe w różnych laboratoriach prezentują różne wzory ekspresji Alu wzory. Zdecydowana większość loci Alu potencjalnie transkrybowanych przez RNA pol III brakuje ważnych cech sekwencji dla retrotranspozycji, a większość potencjalnie aktywnych loci potencjalnie aktywnych loci Alu w genomie (ocenionych wysoko ERP) należy do młodych podrodzin Alu podrodziny. Nasze obserwacje sugerują, że w scenariuszu in vivo udział aktywności Alu w somatycznych uszkodzeniach genetycznych może się znacznie różnić między osobnikami i tkankami. --- Genomy naczelnych i gryzoni są wypełnione setkami tysięcy kopii elementów Alu i B1. elementów Alu i B1 rozproszonych przez retropozycję, tj. przez reintegrację genomową ich odwrotnie transkrybowanego RNA. Te, jak również naczelne BC200 i gryzonie 4.5S RNA, są ancestralnie spokrewnione z końcowymi fragmentami sekwencji 7SL RNA. Struktura drugorzędowa 7SL RNA (integralny składnik cząsteczki rozpoznającej sygnał) jest zachowana od rozpoznawania sygnału) jest zachowana od prokariotów do odległych gatunków eukariotycznych. gatunków eukariotycznych. Jednak tylko u naczelnych i gryzoni cząsteczka ta dała początek retropozycyjne RNA Alu i B1 oraz pozornie funkcjonalne RNA BC200 i 4.5S. Aby zrozumieć to przejście i leżące u jego podstaw zdarzenia molekularne, zbadaliśmy, poprzez analiza porównawcza, ewolucja struktury RNA w tej rodzinie cząsteczek pochodzących od 7SL RNA. Sekwencje RNA różnych sympatycznych (głównie ludzkich) i podrodziny Alu, a także powtórzenia B1 gryzoni zostały wyprowadzone z ich genomowych sekwencji konsensusowych genomowych sekwencji konsensusowych zaczerpniętych z literatury i naszych niepublikowanych wyniki (prosimian i New World Monkey). Struktury drugorzędowe RNA zostały określono za pomocą badań enzymatycznych (przedstawiono nowe dane dotyczące 4.5S RNA) i/lub analizy minimalizacji energii, a następnie porównanie filogenetyczne. Chociaż, z wyjątkiem wyjątkiem 4.5S RNA, wszystkie gatunki RNA pochodzące z 7SL zachowują strukturę krzyżową strukturę swojego progenitora, szczegóły domen fałdowania 7SL RNA są modyfikowane w różnym stopniu w różnych grupach RNA. Nowe motywy znalezione w retropozycyjnie aktywnych RNA są konserwowane wśród podrodzin Alu i B1 w różnych genomach. różnych genomach. W RNA, które nie proliferują przez retropozycję, motywy te są dalej modyfikowane. Wskazuje to na strukturalną adaptację cząsteczek RNA 7SL-like do nowych funkcji, w których prawdopodobnie pośredniczą specyficzne interakcje z białkami. białkami; funkcje te były albo użyteczne dla gospodarza, albo służyły samolubnej propagacji szablonów RNA w genomie gospodarza. --- Wcześniej wykazaliśmy, że pseudogeny komplementarne do małych jądrowych RNA RNA U1, U2 i U3 są rozproszone i obfite w ludzkim genomie. Tutaj my donosimy, że trzy pseudogeny (U1.101, U2.13 i U3.5) są otoczone doskonałymi krótkimi bezpośrednimi powtórzeniami o długości od 16 do 19 par zasad. We wszystkich trzech pseudogenach. upstream bezpośrednie powtórzenie przylega do sekwencji DNA odpowiadającej 5' końcowi dojrzałego snRNA; w U2.13 i U3.5, bezpośrednie powtórzenie w dół natychmiast podąża za obciętym końcem 3' sekwencji snRNA, podczas gdy w U1.101, bezpośrednie powtórzenie bezpośrednie powtórzenie jest oddzielone od 3, końca pełnej długości sekwencji snRNA przez krótki region bogaty w A. Uważamy, że bezpośrednie powtórzenia są że te trzy pseudogeny zostały utworzone przez wstawienie informacji snRNA do nowego locus chromosomalnego. Aby wyjaśnić, dlaczego powtórzenie przylega do sekwencji DNA komplementarnej do końca 5' dojrzałego snRNA, proponujemy model insercji, który wykorzystuje odwrotną transkrypcję snRNA jako pośredni. Ponadto zauważamy podobieństwa między strukturą wszystkich trzech loci pseudogenów i rodziną Alu środkowych powtarzalnych sekwencji DNA. Podobieństwa te sugerują, że niektóre sekwencje z rodziny Alu są mobilnymi elementami genetycznymi elementy genetyczne, które mogą transponować do nowych loci chromosomalnych przy użyciu pośredniej kopii cDNA RNA transkrybowanego z elementu rodziny Alu przez polimerazę RNA. III. --- Elementy Alu są najliczniej występującymi elementami powtarzalnymi w ludzkim genomie. powstały z genu RNA cząsteczki rozpoznającej sygnał i składają się z dwóch pokrewnych, ale odrębnych monomerów (lewe i prawe ramię). Alu RNA transkrybowane z tych elementów są obecne na niskim poziomie przy normalnym wzroście komórek, ale różne warunki stresowe warunki stresowe zwiększają ich obfitość. Wiadomo, że Alu RNA wiążą białka kognatyczne białka SRP9/14. Oczyściliśmy syntetyczny Alu RNP, składający się z Alu RNA w kompleksie kompleks z SRP9/14 i zbadaliśmy wpływ Alu RNP i nagiego Alu RNA na translację białek. Stwierdziliśmy, że dimeryczny Alu RNP i monomeryczny lewy i prawy Alu RNP mają ogólny zależny od dawki efekt hamujący na białko translację białek. W przypadku braku SRP9/14, Alu RNA ma stymulujący wpływ na wszystkie reporterowe mRNA. reporterowe mRNA. Niestabilna struktura sRight RNA sugeruje, że zróżnicowana aktywność że zróżnicowana aktywność Alu RNP i Alu RNA może być wyjaśniona przez zmiany konformacyjne w RNA. Pokazujemy, że Alu RNP i Alu RNA nie wiążą się stabilnie z rybosomami. nie wiążą się stabilnie z rybosomami podczas translacji i na podstawie analizy profili polisomów i zsynchronizowanej translacji, pokazujemy, że Alu RNP i Alu RNA regulują translację na poziomie inicjacji. --- Ludzki genom jest bogaty w sekwencje, które są strukturalnie powiązane ze składnikiem 7SL składnikiem RNA cząsteczki rozpoznającej sygnał. Rodzina sekwencji DNA 7SL składa się z czterech genów 7SL, 500 pseudogenów 7SL (które są skrócone na jednym lub obu końcach sekwencji 7SL) i 500 000 sekwencji Alu. Zarówno geny 7SL, jak i elementy Alu są transkrybowane przez polimerazę RNA III i pokazujemy tutaj, że wewnętrzny promotor 7SL wewnętrzny promotor 7SL znajduje się w podobnej do Alu części genu 7SL. Dlaczego zatem polimeraza RNA III transkrybuje kilka genów 7SL tak wydajnie, podczas gdy transkrypty ze znacznie liczniejszych elementów Alu nie są łatwo wykrywalne? Odkryliśmy, że ludzki gen 7SL i pochodząca z niego syntetyczna sekwencja Alu są wyrażane 50-100 razy wydajniej in vitro niż reprezentatywny element Alu lub dwa pseudogeny 7SL. Mutanty delecyjne i insercyjne 5' genu 7SL pokazują, że w połączeniu z wewnętrznym promotorem, pierwsze 37 nukleotydów nukleotydów przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji są niezbędne dla wydajnej i dokładnej inicjacji in vitro. Sugerujemy, że sekwencje genomowe sekwencje przed większością elementów Alu i pseudogenów 7SL nie zawierają tego elementu. tego elementu, a w konsekwencji tylko niewielki podzbiór takich sekwencji może być transkrybowane in vivo. Może to pomóc wyjaśnić jednorodność rodziny Alu w obrębie każdego genomu ssaków, a także specyficzne dla gatunku różnice między rodzinami Alu ssaków. --- Elementy Alu są najliczniej występującymi elementami powtarzalnymi w ludzkim genomie. zostały wzmocnione przez retrotranspozycję, aby osiągnąć obecną liczbę ponad milion kopii. Elementy Alu mogą być transkrybowane na dwa różne sposoby, przez dwie niezależne polimerazy. "Wolne Alu RNA" są transkrybowane przez Pol III z własnego promotora, podczas gdy "wbudowane Alu RNA" są transkrybowane przez Pol II jako część RNA kodującego białka i niebiałka. Ostatnie badania wykazały, że zarówno wolne, jak i wbudowane Alu RNA odgrywają główną rolę w posttranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów. regulacji ekspresji genów, na przykład poprzez wpływ na translację białek, alternatywny splicing i stabilność mRNA. Odkrycia te ilustrują, w jaki sposób część "śmieciowego DNA" w ludzkim genomie została zrekrutowana do ważnych funkcji w regulacji ekspresji genów. funkcji w regulacji ekspresji genów. --- Sekwencje genów RNA Alu i 7SL zostały przetestowane pod kątem potencjału do regulacji wzrostu komórek ssaków poprzez wprowadzenie tych sekwencji do komórek HeLa w systemie w sprzężonym systemie transfekcji DEAE-dekstranem/sortowania komórek metodą powinowactwa. Zarówno geny Alu, jak i 7SL RNA pośredniczyły w hamowaniu inkorporacji [3H]tymidyny i [35S]metioniny w komórkach biorcy. Ponadto przeprowadzono krótkoterminowe krzywe wzrostu na fosforan wapnia/DNA kotransfekowane, oczyszczone przez powinowactwo komórki. Ten drugi test ujawniło, że transfekowane RNA Alu i 7SL może również powodować supresję proliferacji komórek HeLa proliferacji komórek HeLa. Aby zbadać, czy transkrypcja lub wiązanie czynnika transkrypcyjnego polimerazy III (pol III) było wymagane do aktywności hamującej, mutacje wprowadzono do elementów promotora bloku RNA pol III B w każdym z tych genów. tych genów. Tłumienie inkorporacji [3H]tymidyny było zależne od obecności tego elementu pol III w obu genach; podobnie, supresja wzrostu za pośrednictwem 7SL RNA wzrost wymagał obecności elementu promotora bloku pol III B element. Wyniki tego badania wskazują, że sekwencje genów Alu i 7SL RNA oddziałują z czynnikami komórkowymi, które są ważne dla proliferacji komórek HeLa i sugerują, że te elementy transkrybowane przez pol III mogą być zaangażowane w regulację wzrostu komórkowego. --- Ponad milion kopii elementu Alu o długości około 300 pz jest w ludzkim genomie, przy czym do 75% wszystkich znanych genów posiada wstawki Alu w obrębie intronów i/lub UTR. Transkrybowane sekwencje Alu mogą zmieniać wzorce splicingu poprzez generowanie nowych eksonów, ale inne wpływy intragenicznych elementów Alu na ich RNA gospodarza są w dużej mierze niezbadane. Ostatnio, powtarzające się elementy obecne w intronach lub 3'-UTR 15 ludzkich RNA mózgu zostały wykazano, że są celami wielokrotnej edycji adenozyny do inozyny (A-to-I). Stosując podejście statystyczne, odkryliśmy, że edycja transkryptów z wbudowanymi sekwencjami Alu jest zjawiskiem globalnym w ludzkim transkryptomie, obserwowanym w 2674 (około 2%) wszystkich publicznie dostępnych pełnometrażowych ludzkich cDNA (n = 128,406), z >250 bibliotek i >30 źródeł tkankowych. W zdecydowanej większości edytowanych RNA, substytucje A-to-I są skupione w transkrybowanych sekwencjach sensownych lub antysensownych antysensownych sekwencji Alu. Edytowane zasady są przede wszystkim związane z zachowanymi intronami, wydłużonymi UTR lub transkryptami, które nie mają odpowiedniego znanego genu. genu. W związku z tym edycja RNA związana z Alu może być mechanizmem znakowania niestandardowych transkryptów, które nie są przeznaczone do translacji.
Czy elementy Alu są transkrybowane?
Wykazano, że znaczny procent z ponad 1 miliona kopii elementów Alu ulega transkrypcji. Wiadomo, że wolne RNA Alu są transkrybowane przez Pol III z ich własnego promotora. Z drugiej strony, wbudowane RNA Alu są transkrybowane przez Pol II jako część RNA kodujących białka i niebiałka. Ostatnie badania wykazały, że zarówno wolne, jak i wbudowane Alu RNA odgrywają główną rolę w posttranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów.