Nukleotydy w domenie patogeniczności wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd) odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji objawów, ale mechanizm molekularny leżący u jej podstaw jest nieznany. W celu dokładniejszego określenia dokładnie, w jaki sposób cechy strukturalne w domenie patogeniczności regulują ekspresję objawów, scharakteryzowaliśmy serię mutacji, które stopniowo stabilizują region 1 i resztę regionu "modulującego wirulencję". region modulujący wirulencję. Efekty strukturalne tych mutacji były monitorowane przez elektroforezę żelową w gradiencie temperatury kolistylizowanych transkryptów RNA, a ich efekty biologiczne oceniano za pomocą ilościowych testów biologicznych na pomidorach. Zamknięcie 4-nukleotydowej pętli w regionie wstępnego topnienia 1 praktycznie praktycznie znosiło infekcyjność PSTVd, zwłaszcza gdy pobliska pętla 2-nukleotydowa była również zamknięta. Chociaż transkrypty RNA zawierające mniej stabilizujące mutacje były łatwo zakaźne, żadna z czterech pojedynczych i jednej podwójnej substytucji nie były stabilnie utrzymywane in vivo. Wzór spontanicznych, pozornie kompensacyjnych zmian sekwencji obserwowanych u potomstwa sugeruje, że warianty PSTVd z mniej stabilnymi strukturami drugorzędowymi cieszą się selektywną przewagą. Mutacje, które stabilizują domenę patogenności PSTVd in vitro, również tłumiły ekspresję objawów, ale co najmniej jedna inna mutacja nie mająca oczywistych efektów strukturalnych strukturalnych była związana z podobnym fenotypem. Stabilność konformacyjna stabilność wydaje się być tylko jednym z kilku czynników regulujących replikację PSTVd i patogeniczność. --- Na podstawie homologii sekwencji zaproponowano model pięciu strukturalnych i funkcjonalnych domen funkcjonalnych domen w wiroidach. Domeny te obejmują (i) konserwowany region centralny region zdolny do tworzenia dwóch alternatywnych struktur, które mogą regulować dwie fazy cyklu replikacji wiroidów, (ii) region związany z patogennością, (iii) domenę o dużej zmienności sekwencji, (iv i v) dwie domeny końcowe, które są wymienne między wiroidami. To, że ewolucja wiroidów wiązała się z rearanżacją domen RNA jest wspierana przez częściową częściowa duplikacja wiroida kokosowego cadang cadang, który powstaje de novo podczas każdej infekcji. infekcji. Podobne rearanżacje RNA zostały ustalone dla wirusów zwierzęcych RNA, które powstają w wyniku pewnej formy nieciągłej transkrypcji. nieciągłej transkrypcji. Mechanizm ten może wyjaśniać pochodzenie wiroidów, a także wirusów RNA, w których moduły informacji genetycznej mogły podlegać wielokrotnej wymianie między patogenami RNA a RNA ich gospodarzy. --- Wiriony replikują się poprzez mechanizm toczącego się koła, a rozszczepienie/ligacja wymaga rozległej rearanżacji wysoce sparowanej struktury natywnej. W przypadku wiroida wrzecionowatego wiroida bulw ziemniaka (PSTVd), przejście od rozszczepienia do ligacji jest napędzane przez zmianę z wieloramiennej struktury tetraloop na konformację pętli E. Tutaj przedstawiamy dowody na to, że przetwarzanie wirusa Citrus viroid III (CVd-III), członka członek pokrewnej grupy wiroidów, które również replikują się w jądrze, może przebiegać odrębną ścieżką. Sondowanie chemiczne miniRNA PSTVd i CVd-III z DMS i CMCT ujawniły, że motywy pętli E tych dwóch wiroidów mają zupełnie inne struktury trzeciorzędowe. Jak wykazała elektroforeza w gradiencie temperatury elektroforezy, obecność dwóch prawdopodobnych par GC Watson-Crick skutkuje znaczną ogólną stabilizację motywu podobnego do pętli E CVd-III. W przeciwieństwie do PSTVd, górna nić motywu podobnego do pętli E CVd-III nie może złożyć się w tetralopę GNRA tetraloop, a porównanie suboptymalnych struktur wskazuje, że początkowe zdarzenie rozszczepienie może wystąpić po stronie 5' jedynej pary wobble GU w helisie z udziałem pobliskiej pary odwróconych powtórzeń. Zgodnie z naszym modelem, rearanżacja sekwencji 3' w łodygę spinki do włosów zawierającą identyczne identyczny układ par zasad GC, GU i CG, po czym następuje drugie rozszczepienie. przez utworzenie pętli E, która służy do wyrównania końcówek 5' i 3' monomeru CVd-III przed ligacją. Ponieważ ligacja zachodzi w samej pętli E stabilizacja tego motywu może być potrzebna, aby utrzymać końce 5' i 3' CVd-III w pozycji dla ligazy gospodarza. --- Wirusy, ze względu na to, że nie kodują żadnych białek, są niezwykle zależne od swoich gospodarzy. od swoich gospodarzy. Replikacja tych minimalnych genomów, składających się wyłącznie z kolistego RNA o długości 246-401 nt, zachodzi w jądrze (rodzina Pospiviroidae) lub w chloroplaście (rodzina chloroplaście (rodzina Avsunviroidae) przez oparty na RNA mechanizm toczącego się koła z trzema etapami: (1) synteza nici dłuższych niż pojedyncze, katalizowana przez polimery RNA zależne od DNA gospodarza. zależne od DNA polimerazy RNA rekrutowane i przekierowywane do transkrypcji szablonów RNA (2) rozszczepienie do długości jednostkowej, które w rodzinie Avsunviroidae jest w którym pośredniczą rybozymy młotkowe, oraz (3) kolistylizację przez ligazę RNA lub autokatalitycznie. Ten spójny, ale wciąż fragmentaryczny obraz wyłonił się z połączenia badań z systemami in vitro (analiza preparatów RNA z zakażonych roślin, testy transkrypcji z frakcjami jądrowymi i chloroplastowymi, charakterystyka i chloroplastowych, charakterystyka enzymów i rybozymów pośredniczących w rozszczepianie i ligację nici wiroidów, rozcięcie 5' końcowych grup nici wiroidów oraz hybrydyzacja in situ i mikroskopia frakcji subkomórkowych i tkanek), a także frakcji subkomórkowych i tkanek) oraz systemy in vivo (badania infiltracji tkanek, protoplastów, badania in planta i wykorzystanie roślin transgenicznych wyrażających RNA wiroidów). RNA). --- Replikacja wielu patogenów wirusowych i subwirusowych, a także amplifikacja niektórych genów komórkowych amplifikacja niektórych genów komórkowych przebiega za pośrednictwem mechanizmu toczącego się koła. W przypadku wrzecionowatej bulwy ziemniaka (PSTVd) i pokrewnych wiroidów, możliwa rola (-)nici RNA jako matrycy do syntezy (+)nici potomnej jest niejasna. niejasna. Zainfekowane rośliny wydają się zawierać tylko multimeryczne liniowe (-) nici RNA, a próby zainicjowania infekcji multimerycznymi (-)RNA PSTVd generalnie na ogół kończyły się niepowodzeniem. Aby krytycznie zbadać zakaźność monomerycznych (-) nici wiroidów RNA, opracowaliśmy oparty na rybozymie system ekspresji do produkcji dokładnie pełnej długości (-) nici RNA, których końce są zdolne do przechodzenia łatwej kolonizacji in vitro. Mechaniczna inokulacja sadzonek pomidorów z elektroforetycznie oczyszczonym (-)PSTVd RNA doprowadziła do zakażenia niewielkiej części roślin. roślin, podczas gdy równoległe testy z analogicznym pomidorowym planta macho (-)RNA wiroida pomidora skutkowały znacznie większą frakcją zainfekowanych roślin. Produkcja (-)PSTVd RNA za pośrednictwem rybozymu w roślinach transgenicznych doprowadziła do pojawienia się monomerycznego kolistego (-)PSTVd RNA i dużych ilości (+)PSTVd potomstwa. W naturalnie zakażonych roślinach nie można było wykryć monomerycznego, kolistego (-) RNA PSTVd. zakażonych roślinach przy użyciu ochrony przed rybonukleazą lub elektroforezy w warunkach w warunkach częściowo denaturujących. Chociaż nie jest to składnik normalnego szlaku replikacyjnego, dokładnie pełnej długości (-)PSTVd RNA wydaje się zawierać wszystkie elementów strukturalnych i regulacyjnych niezbędnych do zainicjowania replikacji wiroida replikacji. --- Genom RNA wirusa wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTV) jest transkrybowany in vitro do komplementarnego DNA i RNA przez zależną od DNA polimerazę DNA I i polimerazę RNA z Escherichia coli. Synteza in vitro RNA wytwarza odrębne transkrypty o długości większej niż jednostka, co odzwierciedlając mechanizm replikacji wiroidów in vivo. Wpływ różnych na proces transkrypcji; stwierdzono, że aktynomycyna D drastycznie zmniejsza syntezę komplementarnego RNA z matrycy RNA PSTV przez polimerazę RNA. przez polimerazę RNA. --- Chociaż niektóre wirusopodobne satelitarne RNA posiadają aktywność samozniszczenia i samoligacji aktywności, pokazujemy, że wiroid utajonej mozaiki brzoskwini (PLMVd) jest unikalny wśród wszystkich znanych wiroidów, ponieważ również posiada takie aktywności. Te aktywności katalityczne powinny odgrywać ważną rolę w replikacji PLMVd. Zgodnie z proponowanym mechanizmem, samozniszczenie multimerycznych nici następuje poprzez struktury młotkowe wytwarzające monomery posiadające 2',3'-cykliczny fosforanowe i 5'-hydroksylowe. W najbardziej stabilnej przewidywanej strukturze drugorzędowej dla PLMVd te dwa krańce są zestawione ze sobą, w celu samoligacji. Aby ustalić charakter wiązania fosfodiestrowego wytworzonego przez samoligację, zastosowaliśmy klasyczną procedurę pełnej enzymatycznej hydrolizy RNA połączonej z frakcjonowaniem metodą chromatografii cienkowarstwowej. Korzystając z tej procedury, donosimy, że samoligacja transkryptów PLMVd wytwarza prawie wyłącznie izomer 2',5' (>96%). Testy wydłużania starterów ujawniły również, że odwrotna transkryptaza może odczytać to wiązanie 2', 5', co sugeruje, że nie zapobiega to dalszej replikacji wiroida. Ponadto, zaobserwowaliśmy, że to wiązanie 2',5' jest odporne na aktywność debranchingu aktywność zawartą w ekstraktach jądrowych, a także jest w stanie zapobiegać dalszemu samorozszczepianiu się wiroidów. Tak więc, jeśli wiroidy rzeczywiście ulegają samolikwidacji in vivo, powstałe wiązanie 2', 5'-fosfodiestrowe może przyczynić się do stabilności tych gatunków RNA. Wreszcie, analiza zarówno sekwencji, jak i wymagań strukturalnych wymagań dla samolikwidacji i samoligacji młotka sugeruje, że te dwa procesy RNA mogą być ze sobą powiązane. Stawiamy hipotezę, że wewnątrzcząsteczkowa samoligacja, która wytwarza konformery kołowe, może przyczyniać się do etapu etapu kolimacji replikacji toczącego się koła, podczas gdy międzycząsteczkowa nieenzymatyczna ligacja jest potencjalnym mechanizmem reasortacji sekwencji wiroidów i gatunków wiroidopodobnych. --- Wbrew wcześniejszym przekonaniom, wirusy nie są najmniejszymi czynnikami wywołującymi choroby zakaźne. chorób zakaźnych. Jednoniciowe RNA o wielkości zaledwie 246 nukleotydów występuje w niektórych roślinach wyższych i powodują kilkanaście chorób roślin uprawnych. Te RNA zostały zostały nazwane wiroidami. Pomimo ich niezwykle ograniczonej zawartości informacyjnej, wiroidy replikują się autonomicznie w podatnych komórkach - to znaczy, że nie nie wymagają funkcji pomocniczych od jednocześnie replikujących się konwencjonalnych wirusów. Wiroidy są kowalencyjnie zamkniętymi okrągłymi cząsteczkami o charakterystycznej pręcikowej w której krótkie regiony spiralne są przerywane przez wewnętrzne pętle i wybrzuszenia. i pętle wybrzuszenia. Wiroidy nie podlegają translacji; są replikowane przez enzym (lub enzymy) gospodarza. gospodarza (lub enzymy) (prawdopodobnie polimerazę RNA II) poprzez oligomeryczne RNA przez oligomeryczne RNA pośrednie za pomocą mechanizmu toczącego się koła. Satelitarne RNA podobne do wiroidów przypominają wiroidy pod względem wielkości i struktury molekularnej, ale znajdują się w kapsydzie specyficznych wirusów pomocniczych, od których zależy ich własna replikacja. Te RNA są bardzo interesujące dla biologii molekularnej z co najmniej dwóch powodów: 1) są one najmniejszymi i najprostszymi znanymi replikującymi się cząsteczkami, oraz 2) mogą one mogą reprezentować żywe skamieniałości ewolucji przedkomórkowej w hipotetycznym świecie RNA. --- Zależna od DNA polimeraza RNA II oczyszczona ze zdrowej tkanki roślinnej jest zdolna do syntezy liniowych kopii (-)-viroid RNA o pełnej długości z (+)-viroid RNA in vitro. Wraz ze specyficzną wrażliwością na alfa-amanitynę wiroidów obserwowaną in vivo, odkrycia te sugerują, że wiroidy replikują się przez całkowicie nowy mechanizm, w którym infekujące cząsteczki RNA wiroidów są kopiowane przez enzym gospodarza, który normalnie jest odpowiedzialny za syntezę jądrowych prekursorów informacyjnego RNA.
Jaki jest mechanizm replikacji wirusów?
Replikacja wielu patogenów wirusowych i subwirusowych, a także amplifikacja niektórych genów komórkowych przebiega za pośrednictwem mechanizmu toczącego się koła. Replikacja wiroidów zachodzi poprzez mechanizm toczącego się koła z wykorzystaniem symetrycznej lub asymetrycznej ścieżki w trzech etapach, transkrypcji RNA, przetwarzania i ligacji. Replikacja tych minimalnych genomów, składających się wyłącznie z kolistego RNA o długości 246-401 nt, zachodzi w jądrze (rodzina Pospiviroidae) lub w chloroplaście (rodzina Avsunviroidae) za pomocą opartego na RNA mechanizmu toczącego się koła z trzema etapami: (1) synteza dłuższych niż jednostkowe nici katalizowana przez zależne od DNA gospodarza polimerazy RNA rekrutowane i przekierowywane do transkrypcji szablonów RNA, (2) rozszczepienie do długości jednostkowej, w którym w rodzinie Avsunviroidae pośredniczą rybozymy młotkowe, oraz (3) kolimeryzacja przez ligazę RNA lub autokatalitycznie.