Izolacja określonych regionów genomu, w których zachodzą interakcje molekularne jest jest niezbędna do kompleksowej identyfikacji cząsteczek związanych z regionami genomowymi. regionami genomowymi. Niedawno opracowaliśmy immunoprecypitację chromatyny z udziałem cząsteczek wiążących DNA za pośrednictwem immunoprecypitacji chromatyny (enChIP) do oczyszczania określonych regionów genomowych. oczyszczania określonych regionów genomowych. Tutaj opracowaliśmy retrowirusowy system ekspresji system ekspresji dla enChIP przy użyciu CRISPR. Wykazaliśmy, że docelowy genomowy locus można oczyścić z wysoką wydajnością przy użyciu tego systemu. Wykazaliśmy również że zanieczyszczenie potencjalnych miejsc pozacelowych jest znikome przy użyciu tego systemu. RNA (gRNA) dla miejsca docelowego ma wystarczająco długą unikalną sekwencję w swojej sekwencji wyjściowej. enChIP w połączeniu ze stabilnym znakowaniem izotopowym przy użyciu aminokwasów w komórce. izotopowym przy użyciu analizy aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC) zidentyfikował białka których związek z promotorem czynnika regulacyjnego interferonu (IFN)-1 (IRF-1) wzrasta w odpowiedzi na stymulację IFNγ. Lista powiązanych białek zawierała wiele nowych białek w kontekście ekspresji genów indukowanych przez IFNγ jak również białka związane z kompleksami deacetylaz histonowych, których udział zaangażowanie zostało zasugerowane w ekspresję genów za pośrednictwem IFNγ. Wreszcie potwierdziliśmy indukowane przez IFNγ zwiększone wiązanie zidentyfikowanych białek z promotorem IRF-1 przez ChIP. Tak więc, nasze wyniki pokazały, że retrowirusowy system enChIP przy użyciu CRISPR byłby przydatny do biochemicznej analizy funkcji genomu w tym transkrypcji i regulacji epigenetycznej. --- Analiza biochemiczna interakcji molekularnych w określonych regionach genomu wymaga ich izolacji przy jednoczesnym zachowaniu interakcji molekularnych in vivo. Tutaj, zgłaszamy izolację telomerów za pomocą zmodyfikowanej cząsteczki wiążącej DNA immunoprecypitację chromatyny (enChIP) przy użyciu aktywatora transkrypcji podobnego do (TAL) rozpoznającego powtórzenia telomerowe. Telomery rozpoznawane przez znakowane białko białko TAL poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem przeciwko znacznikowi i poddano identyfikacji cząsteczek wiążących telomery. enChIP-spektrometria masowa (enChIP-Mass spektrometria (enChIP-MS) ukierunkowana na telomery zidentyfikowała znane i nowe białka wiążące telomery. Dane zostały zdeponowane w ProteomeXchange z identyfikatorem PXD000461. Ponadto wykazaliśmy, że RNA związane z telomerami może być izolowane przez enChIP. Zidentyfikowane cząsteczki wiążące telomery mogą odgrywać ważną rolę w biologii telomerów. enChIP z wykorzystaniem białek TAL byłby użytecznym narzędziem do analizy biochemicznej telomerów. użytecznym narzędziem do analizy biochemicznej określonych regionów genomowych. --- Izolacja określonych regionów genomowych zachowujących interakcje molekularne jest jest niezbędna do ich analizy biochemicznej. Tutaj opracowaliśmy nową metodę, immunoprecypitację chromatyny z udziałem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP), do oczyszczania określonych regionów genomowych zachowujących interakcje molekularne. Wykazaliśmy, że enChIP przy użyciu systemu CRISPR skutecznie izoluje określone regiony genomowe. regiony genomowe. W tej formie enChIP, specyficzne regiony genomowe są immunoprecypitowane z przeciwciałem przeciwko znacznikowi(om), który jest połączony z katalitycznie nieaktywną formą Cas9 (dCas9), która jest współeksprymowana z przewodnikiem RNA (gRNA) i rozpoznaje endogenną sekwencję DNA w interesujących regionach genomowych. Spektrometria masowa enChIP (enChIP-MS) ukierunkowana na endogenne loci zidentyfikowała powiązane białka. enChIP wykorzystujący system CRISPR byłby wygodnym i użytecznym narzędziem do analizy endogennych loci. wygodnym i użytecznym narzędziem do badania struktury chromatyny regionów genomowych regionów genomowych.
Czym jest enCHIP?
Immunoprecypitacja chromatyny z udziałem cząsteczek wiążących DNA (enChIP) to nowatorska metoda oczyszczania specyficznych regionów genomowych zachowujących interakcje molekularne. EnChIP przy użyciu systemu CRISPR skutecznie izoluje określone regiony genomowe. W tej formie enChIP określone regiony genomowe są immunoprecypitowane przeciwciałem przeciwko znacznikowi (znacznikom), który jest połączony z katalitycznie nieaktywną formą Cas9 (dCas9), która jest współeksprymowana z przewodnim RNA (gRNA) i rozpoznaje endogenną sekwencję DNA w interesujących regionach genomowych. Spektrometria masowa enChIP (enChIP-MS) ukierunkowana na endogenne loci zidentyfikowała powiązane białka. enChIP przy użyciu systemu CRISPR byłby wygodnym i użytecznym narzędziem do badania struktury chromatyny w interesujących regionach genomowych.