Junktyna jest białkiem błonowym o masie 26 kDa, które wiąże się z sekwestryną, triadyną i receptorami receptorami ryanodynowymi (RyRs) w obrębie łączącego retikulum sarkoplazmatycznego jednostek uwalniania wapnia. Sekwencja junktyny obejmuje krótką N-końcową domenę cytoplazmatyczną domenę cytoplazmatyczną, pojedynczą domenę transbłonową i wysoce naładowaną domenę C-końcową domenę zlokalizowaną w świetle retikulum sarkoplazmatycznego. Psie i mysie są wysoce konserwatywne w domenach transbłonowych, ale domeny luminalne są bardziej rozbieżne. domeny są bardziej rozbieżne. Aby zbadać udział junktyny w architekturze architekturę jednostek uwalniania wapnia w sercu, zaprojektowaliśmy transgeniczne myszy transgeniczne myszy z nadekspresją junktyny i zbadaliśmy mięsień sercowy lewej komory za pomocą mikroskopii elektronowej. mikroskopii elektronowej. Ogólna architektura jednostek uwalniania wapnia jest podobna w kontrolnym mięśniu sercowym i mięśniu sercowym z nadekspresją junktyny o 5-10 razy. W w obu miokardiach, cisterna SR są ściśle związane z zewnętrznymi błonami zewnętrznymi (plazmalemma i kanaliki poprzeczne). Cisternae są płaskie; zawierają zawierają sznur kuleczek kalsekwestryny i są wyłożone rzędem nóżek lub RyR, po stronie zwróconej do błon zewnętrznych. Gęstość powierzchni kanalików T, mierzona jako obwód profili kanalików T na powierzchnię przekroju, jest taka sama w transgenicznych i kontrolnych mięśniach sercowych (305 i kontrolnych miokardiach (305 vs 289 nm/nm(2)). Trzy zmiany wpływające na architekturę junctional SR są widoczne w mięśniu sercowym z nadekspresją junktyny. Jedną z nich jest ściślejszy zamek błyskawiczny cystern łączących SR cisternae. Szerokość połączenia SR jest węższa i mniej zmienna w mięśniu sercowym z nadekspresją nadekspresji niż w kontrolnym mięśniu sercowym, a zawartość kalsekwestryny jest bardziej bardziej zwarta. Drugą zmianą jest rozszerzenie zapinanych na zamek błyskawiczny domen SR na do regionów niefunkcjonalnych, które nazywamy "sfrustrowanymi" łączącymi SR. Trzecią zmianą jest zwiększenie zakresu asocjacji między SR i kanalikami T. W junktynie w mięśniu sercowym z nadekspresją junktyny cisternae SR pokrywają około 45% powierzchni wszystkich profili kanalików T. powierzchni wszystkich profili kanalików T, podczas gdy w kontrolnym mięśniu sercowym pokrycie to wynosi około 30%. Połączenia między kanalikami SR i T są zwiększony rozmiar. Wnioskujemy, że wzrost ekspresji junktyny wpływa na upakowanie kalsekwestryny w łączących się SR i ułatwia połączenie kanalików SR i T. --- Domena łącząca siateczki sarkoplazmatycznej (jSR) jest wyspecjalizowana do odbierania sygnałów z kanalików poprzecznych plazmalemmy i uwalniania Ca2+ podczas aktywacji mięśni. podczas aktywacji mięśni. Powierzchnia łącząca jSR, skierowana w stronę kanalików poprzecznych jest zajęta przez kompleks molekularny złożony z przezbłonowych kanałów uwalniania Ca2+ (receptorów ryanodynowych); białka luminalnego kalsekwestryny (CSQ); 2 białek błonowych, junktyny (Jct) i triadyny (Tr), które pośredniczą w uwalnianiu Ca CSQ-receptor ryanodynowy; oraz kilka innych składników. W warunkach warunkach panujących w świetle retikulum sarkoplazmatycznego (fizjologiczna siła jonowa, głównie z powodu jonów K + i Ca2 +), CSQ tworzy długie liniowe polimery a utrwalony żel białkowy jest wyraźnie widoczny w mikroskopie elektronowym. Domeny luminalne domeny luminalne Jct i Tr są wykrywalne, ale ogólnie 2 cząsteczki są nie są wyraźnie odgraniczone. Mięśnie serca z nadekspresją lub mutacjami null mutacje dla 3 białek kompleksu łączącego (CSQ, Jct i Tr) ujawniają udział tych 3 składników w ogólnej architekturze jSR. --- UZASADNIENIE: W komórkach mięśnia sercowego Ca2+ bezpośrednio kontroluje bramkowanie receptorów ryanodynowych (RyRs). receptorów ryanodynowych (RyR), a sam jest zdominowany przez uwalnianie Ca2+ za pośrednictwem RyR z retikulum sarkoplazmatycznego. Istniejące sondy nie rejestrują takich lokalnych sygnałów Ca2+ z powodu dyfuzji sondy, więc czujnik Ca2+ ukierunkowany na złącze powinien ujawnić nowe informacje na temat sprzężenia pobudzenie-skurcz serca i jego modyfikacji w stanach chorobowych. i jego modyfikacji w stanach chorobowych. CEL: Zbadanie sygnalizacji Ca2+ w nanoskopowej przestrzeni diad serca poprzez ukierunkowanie nowego czułego biosensora Ca2+ (GCaMP6f) na przestrzeń złącza przestrzeń. METODY I WYNIKI: Poprzez przyłączenie GCaMP6f do N-końca triadyny 1 lub junktyny, GCaMP6f-triadin 1/junctin został skierowany do połączeń diadycznych, gdzie kolokalizował się z t-tubulami i RyR po transferze genów za pośrednictwem adenowirusa. Ten znakowany białkiem błonowym biosensor wykazywał ≈4× szybszą kinetykę niż natywny GCaMP6f. GCaMP6f. Obrazowanie konfokalne ujawniło transjenty Ca2+ w złączu (nanosparki Ca2+) które były ≈50× mniejsze w objętości niż konwencjonalne iskry Ca2+ (mierzone za pomocą dyfuzyjnymi wskaźnikami). Obecność biosensora nie zakłócała normalnej sygnalizacji Ca2+. sygnalizacji Ca2+. Ponieważ nie wystąpiła dyfuzja wskaźnika, amplituda i pomiary uwalniania amplitudy i czasu uwalniania zostały poprawione, pomimo małej objętości zapisu. objętości. Mogliśmy również wizualizować koaktywację subklastrów RyRs w obrębie w obrębie pojedynczego obszaru złącza, a także zdarzenia uwalniania kwarkowego Ca2+. WNIOSKI: Ten nowy, ukierunkowany biosensor umożliwia selektywną wizualizację i pomiar pomiar dynamiki nanodomen Ca2+ w nienaruszonych komórkach i może być wykorzystany do zapewnienia mechanistycznego wglądu w działanie diad RyR w zdrowiu i w stanach chorobowych takich jak osierocenie RyR. --- Junktyna, wewnątrzsarkoplazmatyczne białko retikulum (SR) o masie 26 kDa, tworzy czwartorzędowy kompleks z triadyną, kalsekwestryną i receptorem ryanodyny (RyR) na kompleks z triadyną, kalsekwestryną i receptorem ryanodyny (RyR) w błonie błonie łączącej SR. Fizjologiczna rola junktyny w luminalnej regulacji regulacji uwalniania RyR Ca(2+) pozostaje nierozwiązana, ale wydaje się być niezbędna dla prawidłowej funkcji serca, ponieważ ablacja junktyny skutkuje zwiększa automatyzm komór. Biorąc pod uwagę, że poziomy junktyny są poważnie zmniejszone w ludzkich niewydolnych sercach, przeprowadziliśmy dogłębne badanie mechanizmów wpływających na wewnątrzkomórkową homeostazę Ca(2+) w kardiomiocytach z niedoborem junktyny. kardiomiocytach. W połączeniu z iskrami, kardiomiocyty JCN-KO wykazują zwiększoną amplitudę transjentów Ca(2+), wynikającą ze zwiększonego SR [Ca(2+)] ([Ca(2+)](SR)). Wydaje się, że ablacja Junctin wpływa na sposób, w jaki RyRs "wyczuwają" obciążenie SR Ca(2+) co skutkuje zmniejszonym rozkurczowym wyciekiem SR Ca(2+) pomimo podwyższonego poziomu [Ca(2+)](SR). [Ca(2+)](SR). Co zaskakujące, β-adrenergiczne wzmocnienie [Ca(2+)](SR) odwraca spadek aktywności RyR i prowadzi do spontanicznego uwalniania Ca(2+), o czym świadczy rozwój spontanicznych skurczów następczych. Pojedynczy kanał RyR z SR serca WT i JCN-KO wskazują, że brak junktyny wywołuje podwójny efekt na normalnie liniową odpowiedź RyRs na Ca(2+)]: przy niskim poziomie [Ca(2+)] (<1 mmol l(-1)), pozbawione junktyny kanały RyR są mniej wrażliwe na luminal [Ca(2+)]; odwrotnie, wysoki luminal [Ca(2+)] czyni je nadwrażliwymi na tę formę modulacji kanału. Zatem, junktyna wywołuje złożony wpływ na iskry Ca(2+), stany przejściowe i wyciek, ale luminal [Ca(2+)]-zależna podwójna odpowiedź RyRs pozbawionych junktyny pokazuje że junktyna normalnie działa jako aktywator kanałów RyR przy niskim świetle [Ca(2+)] i jako inhibitor przy wysokim poziomie [Ca(2+)]. Ponieważ crossover występuje przy [Ca(2+)](SR), który jest zbliżony do tego obecnego w komórkach spoczynkowych, jest to możliwe, że rola aktywatora-inhibitora junktyny może być wywierana pod okresach dominującej aktywności przywspółczulnej i współczulnej.
Czy istnieje związek między junktyną a receptorami ryanodynowymi?
Tak, junktyna wiąże się z receptorami ryanodynowymi w obrębie połączonego retikulum sarkoplazmatycznego jednostek uwalniających wapń i zwykle działa jako aktywator kanałów RyR przy niskim poziomie [Ca(2+)] i jako inhibitor przy wysokim poziomie [Ca(2+)].