Określono nowy motyw fosforylacji dla kinazy kazeinowej 1 (CK1) w odpowiedzi na dwa siarczanowane lipidy [sulfatyd i 3-siarczan cholesterolu (SCS)], przy użyciu trzech funkcjonalnych białek [podstawowe białko mieliny (MBP), białko tau (TP) i RhoA (mała GTPaza)] oraz pięciu syntetycznych peptydów MBP jako akceptorów fosforanu jako akceptory fosforanów dla kinazy in vitro. Stwierdzono, że (i) MBP, p8 (pozycje 38-118) odszczepione od MBP i syntetyczny peptyd M103 były skutecznie fosforylowane przez CK1delta w obecności SCS; (ii) sulfatyd w porównaniu do z CH-3S wysoce zwiększona autofosforylacja CK1delta; (iii) SCS miał wysokie powinowactwo wiązania z MBP i peptydem powinowactwo wiązania z MBP i peptydem M103, ale nie z innymi peptydami MBP pozbawionymi K-G-R; oraz (iv) nowy konsensusowy motyw fosforylacji (K/R-X-K/R-X-X-S/T) dla CK1 został zidentyfikowany wśród kilku białek wiążących SCS (SCS-BP) i trzech CK1 (delta, epsilon i gamma). Wiązanie SCS z dwoma podstawowymi białkami mózgu białek mózgu (MBP i TP) skutkowało wysoką stymulacją ich fosforylacji przez trzy izoformy CK1 (alfa, delta i epsilon), ale nie CK1gamma. W przeciwieństwie do tego, kwaśne białko (RhoA) było skutecznie fosforylowane przez CK1delta w obecności obecności SCS, a także silnie fosforylowane przez CK1gamma w obecności sulfatydu. sulfatydu. Przedstawione przez nas wyniki sugerują, że (i) sulfatyd może funkcjonować jako skuteczny stymulator autofosforylacji CK1; oraz (ii) komórkowe białka wiążące białka wiążące SCS, zawierające nowe motywy fosforylacji dla CK1, mogą być preferencyjnie fosforylowane przez CK1 ze specyficznością izoformy na wysoce poziomie SCS w mózgu. --- Kinaza białkowa kazeiny 1 (CK1) fosforyluje Ser-45 beta-kateniny, "gruntując" późniejszą fosforylację przez syntazę glikogenu-3 reszt 41, 37 i 33. Ta skoordynowana fosforylacja beta-kateniny sygnalizuje jej degradację i zapobiega jej funkcji w wyzwalaniu podziału komórek. Sekwencja wokół Ser-45 nie jest zgodna z kanonicznym konsensusem dla substratów CK1, który zaleca albo fosfoaminokwasy, albo kwaśne reszty w pozycji n-3 od docelowej seryny. Jednak sekwencja beta-kateniny poniżej Ser-45 jest bardzo podobna do sekwencji Ser-45 jest bardzo podobna do sekwencji rozpoznawanej przez CK1 w czynniku jądrowym dla aktywowanych komórek T 4. aktywowanych limfocytów T 4. Wspólne cechy obejmują motyw SLS, po którym następuje od dwóch do od dwóch do pięciu reszt przez klaster reszt kwaśnych. Syntetyczne peptydy odtwarzające reszty 38-65 beta-kateniny badano z oczyszczoną wątrobą szczura CK1 lub rekombinowanymi CK1 alfa i CK1 alfa L z danio pręgowanego. Wyniki pokazują, że SLS i kwaśne motywy klastrowe są kluczowe dla rozpoznawania CK1. Pro-44 i Pro-52 są również ważne dla wydajnej fosforylacji. Podobne wyniki uzyskano dla różnych izoform CK1. Fosforylacja mutantów pełnej długości rekombinowanej beta-kateniny z danio pręgowanego potwierdziła znaczenie motywów SLS i kwaśnego klastra. Poszukiwanie białek z z podobnymi motywami dało między innymi białka gruczolakowatej polipowatości coli, wcześniej fosforylowane przez CK1. Istnieje silna korelacja mutacji beta-kateniny z motywami rozpoznawanymi przez CK1 w tym białku. w tym białku. --- Kinaza białkowa CK1 fosforyluje reszty serynowe, które znajdują się blisko innej fosfoseryny w konsensusie pSer-Xaa-Xaa-Ser. fosfoseryny w konsensusie pSer-Xaa-Xaa-Ser. Ta specyficzność generuje regiony w białkach docelowych zawierające dwie lub więcej sąsiadujących reszt fosfoseryny, określane tutaj jako wielomiejscowe domeny fosforylacji (MPD). W W tym artykule wykazaliśmy, że D4476 jest silnym i raczej selektywnym inhibitorem CK1 in vitro i w komórkach. W komórkach wątrobiaka H4IIE, D4476 specyficznie hamuje fosforylację endogennego czynnika transkrypcyjnego forkhead box O1a (FOXO1a) na Ser322 i Ser325 w obrębie jego MPD, bez wpływu na fosforylację innych miejsc. Nasze wyniki wskazują, że te reszty są ukierunkowane przez CK1 in vivo i że fosforylacja MPD za pośrednictwem CK1 jest wymagane do przyspieszonego wykluczenia jądrowego FOXO1a w odpowiedzi na IGF-1 i insulinę. D4476 jest znacznie silniejszy i bardziej specyficzny niż IC261 lub CKI-7, a zatem jest dlatego jest najbardziej użytecznym inhibitorem CK1 dostępnym obecnie do identyfikacji fizjologicznych substratów CK1. --- U eukariontów fosforylacja reszt serynowych, treoninowych lub tyrozynowych przez kinazy białkowe przez kinazy białkowe odgrywa ważną rolę w wielu procesach komórkowych. Członkowie rodziny kinaz białkowych CK1 zazwyczaj fosforylują reszty seryny, które są blisko innych fosfoseryn w zgodnym motywie pS-X-X-S, i są one są zaangażowane w regulację różnych procesów fizjologicznych, jak również w patologiach takich jak rak i choroba Alzheimera. Wykorzystując oparte na strukturze zidentyfikowaliśmy dwa antrachinony jako nowe inhibitory CK1delta. inhibitory CK1delta. Te analogi amino-antrachinonu (pochodne 1 i 2) są wśród najsilniejszych i najbardziej selektywnych inhibitorów CK1delta znanych obecnie (IC(50)=0,3 i 0,6 mikroM, odpowiednio). --- Głównym miejscem fosforylacji zarówno kinazy kazeinowej-2 (CK2), jak i kinazy kazeinowej-1 (CK1) w inhibitorze fosfatazy białkowej-1 (PP-1) inhibitor-2 (I-2) jest Ser86. Mniejsze miejsca fosforylacji dotknięte przez CK2 lub CK1 to Ser120/Ser121 i Ser174, odpowiednio. Syntetyczny peptyd o długości 25 aminokwasów obejmujący reszty 67-93 I-2 jest fosforylowany przez CK2 lub CK1 w jego reszcie serylowej odpowiadającej Ser86 z wyższym poziomem fosforylacji. odpowiadającej Ser86 z wyższymi wartościami Vmax i Km podobnymi do tych nienaruszonego białka (9 vs 7,2 mikroM i 14,2 vs 5,3 mikroM z CK2 i CK1, odpowiednio). Brak wykrywalnej fosforylacji tego peptydu, który obejmuje również miejsce kinazy syntazy glikogenu-3 (GSK-3) (Thr72), można było zaobserwować za pomocą kinazy GSK-3 lub p34cdc2, niezależnie od tego, czy jego reszta serylowa równoważna Ser86 była wcześniej fosforylowana przez CK2. Krótsze pochodne I-2(67-93), obejmujące reszty 72-93 i 78-93, są również łatwo fosforylowane zarówno przez CK1, jak i CK2, z wydajnością fosforylacji podobną do peptydu macierzystego. Syntetyczny heptadecapeptyd odtwarzający miejsce miejsce fosfoakceptorowe wokół Ser120/Ser121 jest fosforylowany przez CK2, ale nie do żadnym wykrywalnym stopniu przez CK1, z wartością Km pięciokrotnie wyższą niż w przypadku odpowiadającego pentadekapeptydu zawierającego Ser86 (78-93). Syntetyczny pentadekapeptyd (166-180) odtwarzający miejsce fosfoakceptora wokół Ser174 jest fosforylowany przez CK1 mniej wydajnie niż pentadekapeptyd zawierający jego główne miejsce fosforylacji (78-93) (Km 280 mikroM vs 33 mikroM). Ten peptyd jest łatwo fosforylowany również przez CK2, chociaż brakuje mu kanonicznego konsensusu sekwencji dla CK2, a jego Ser174 jest prawie niezmieniony przez CK2 w nienaruszonym I-2. Te dane zapewniają wyraźne wykazanie, że sekwencja konsensusu z N-końcowe prefosforylowane reszty, SerP/ThrP-Xaa-Xaa-Ser/Thr, [Flotow, H., Graves, P. R., Wang, A., Fiol, C. J., Roeske, R. W. & Roach, P. J. (1990) J. Biol. Chem. 265, 14264-14269; Meggio, F., Perich, J. W., Reynolds, E. C. & Pinna, L. A. (1991) FEBS Lett. 283, 303-306] nie zawsze jest wymagane do osiągnięcia wydajnej fosforylacji o wysokim powinowactwie przez CK1. Pokazują również, że determinanty specyficzności dla fosforylacji I-2 przez CK2 lub CK1, ale nie przez GSK3, są całkowicie oparte na lokalnych cechach strukturalnych strukturalnych miejsca fosfoakceptorowego, na które tylko w niewielkim stopniu wpływa ogólna struktura I-2.
Lista zgodnych motywów fosforylacji dla kinazy kazeinowej 1 (CK1)?
Najczęstszymi motywami konsensusowymi dla CK1 są: pSer-Xaa-Xaa-Ser, K/R-X-K/R-X-X-S/T, SLS i motywy klastra kwasowego oraz SerP/ThrP-Xaa-Xaa-Ser/Thr.