UZASADNIENIE: Analiza danych jest kluczowym krokiem w nieukierunkowanej metabolomice opartej na spektrometrii mas. metabolomice, począwszy od generowania ogólnych list pików z surowych danych chromatografii cieczowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas (LC/MS). Ze względu na stosowanie różnych algorytmów algorytmów przez różne przepływy pracy, wyniki różnych strategii wybierania pików często znacznie się różnią. METODY: Surowe dane LC/HRMS z dwóch rodzajów próbek biologicznych (żółć i mocz), jak również standardowa mieszanina 84 metabolitów, zostały przetworzone za pomocą czterech programów oprogramowania do wybierania pików: Peakview®, Markerview™, MetabolitePilot™ i XCMS Online. Następnie zbadano nakładanie się wyników każdej metody generowania pików. następnie zbadane. Aby ocenić znaczenie list pików, przeszukano bazę danych przy użyciu bazy danych METLIN online w celu określenia, które cechy miały dokładne masy pasujące do znanych metabolitów, a także filtrowanie wtórne na podstawie dopasowania widm MS/MS. WYNIKI: W tym badaniu tylko niewielka część wszystkich pików (mniej niż 10%) była wspólna dla wszystkich czterech programów. Porównanie wyników wyszukiwania w bazie danych wykazało, że piki znalezione unikalnie przez jeden przepływ pracy mają mniejszą szansę na znalezienie znalezienie w bazie danych metabolomiki METLIN i jest jeszcze mniej prawdopodobne, że zostaną potwierdzone przez MS/MS. WNIOSKI: Wykazano, że wydajność przepływów pracy generujących piki ma bezpośredni wpływ na wyniki nieukierunkowanej metabolomiki. Jak wykazano, że piki znalezione w więcej niż jednym przepływie pracy wykrywania pików mają większy potencjał być zidentyfikowane przez dokładną masę, jak również dopasowanie widma MS/MS, sugeruje się sugeruje się wykorzystanie nakładania się różnych przepływów pracy wybierania pików jako wstępnych listy pików do bardziej szczegółowej analizy statystycznej w globalnych badaniach metabolomiki badania. --- Opracowano szybką, czułą i wszechstronną metodę chromatografii cieczowej / jonizacji elektrorozpryskowej Metoda tandemowej spektrometrii mas (LC/ESI-MS/MS) została opracowana dla kompleksowych analiz składników chemicznych zawartych w chińskim leku medycynie chińskiej - Venenum Bufonis (VB, Chan' Su w języku chińskim). Analiza LC została przeprowadzona na kolumnie Agilent Eclipse plus C₁₈ RRHD (2,1 × 150 mm, 1,8 μm) z liniowym układem rozpuszczalników z gradientem gradientowym układem rozpuszczalników wody (0,1% kwasu mrówkowego) i acetonitrylu (0,1% kwas mrówkowy) jako faza ruchoma. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe przeprowadzono za pomocą wielokrotne monitorowanie reakcji (MRM) poprzez jonizację elektrorozpryskową (ESI) działającego w trybie jonizacji dodatniej. Poprzez "Molecular Feature Extraction" (MFE) wykryto ponad 900 cech z ekstraktów VB. Wśród nich Wśród nich zidentyfikowano łącznie 97 składników przy użyciu dokładnej bazy danych Agilent METLIN bazy danych dopasowania masy (DB) ustanowionej zgodnie z tymi opisanymi w literaturze. literaturze. Co więcej, 30 wysokiej jakości dopasowań uzyskano poprzez porównanie ich dokładnych mas i czasów retencji (AMRT) z tymi zaimportowanymi do opracowanej osobistej bazie danych (METLIN DB z AMRT). Zaproponowano charakterystyczne zaproponowano charakterystyczne ścieżki fragmentacji dla wstępnej charakterystyki czterech reprezentatywnych typów bufadienolidów w niniejszej pracy. Przeprowadzono ukierunkowany eksperyment MS/MS 30 głównych związków przeprowadzono w celu ich kwantyfikacji i półkwantyfikacji. półkwantyfikacji. 7 z nich zostało oznaczonych ilościowo w zakresie stężeń 5,0-500 ppm. zakresie stężeń 5,0-500 pg/μL. Najniższa granica wykrywalności i kwantyfikacji wynosiły odpowiednio 0,25-0,50 i 1,25-0,25 pg/μL. Odzysk odzyski wahały się od 83 do 106% w zależności od typów chemicznych i różnych rozpuszczalników ekstrakcyjnych. Pozostałe 23 bufosteroidy zostały jednocześnie półilościowe przy użyciu trzech reprezentatywnych związków standardowych jako ich standardowych odniesienia. --- CEL: Określenie, czy profile metaboliczne osocza mogą wykryć różnice między pacjentami z neowaskularnym zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (NVAMD) i w podobnym wieku. METODY: Analiza metabolomiczna z wykorzystaniem chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas z transformacją Fouriera (LC-FT) spektrometrią mas z transformacją Fouriera (LC-FTMS) przeprowadzono na próbkach osocza od 26 pacjentów z NVAMD i 19 osób z grupy kontrolnej. Dane zostały zebrane od stosunku masa/ładunek (m/z) 85 do 850 na spektrometrze mas Thermo LTQ-FT i wyodrębniono cechy metaboliczne przy użyciu pakietu oprogramowania do przetwarzania adaptacyjnego. Zarówno nietransformowane, jak i log2 zostały skorygowane przy użyciu Benjamini i Hochberg False Discovery (FDR) w celu uwzględnienia wielokrotnego testowania. Ortogonalna analiza Analiza dyskryminacyjna została przeprowadzona w celu określenia cech metabolicznych, które odróżniały pacjentów z NVAMD od grupy kontrolnej. Poszczególne cechy m/z zostały dopasowane do bazy danych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes i bazy danych Metlin bazy danych metabolomiki, a szlaki metaboliczne związane z NVAMD zostały zidentyfikowane przy użyciu MetScape. WYNIKI: Spośród 1680 całkowitych cech m/z wykrytych przez LC-FTMS, 94 unikalne cechy m/z znacząco różniły się między pacjentami z NVAMD i grupą kontrolną przy użyciu FDR (q = 0,05). Porównanie tych cech z tymi znalezionymi z danymi log2 log2 (n = 132, q = 0,2) ujawniło 40 wspólnych cech, potwierdzając zaangażowanie niektórych metabolitów. Takie metabolity obejmowały di- i i tripeptydy, kowalencyjnie zmodyfikowane aminokwasy, kwasy żółciowe i metabolity związane z witaminą D metabolity związane z witaminą D. Analiza korelacji ujawniła powiązania między niektórymi istotnych cech, a analiza ścieżek wykazała szersze zmiany w metabolizmie tyrozyny, metabolizmu aminokwasów siarkowych i aminokwasów związanych z metabolizmem mocznika. metabolizm mocznika. WNIOSKI: Dane te sugerują, że analiza metabolomiczna może zidentyfikować panel poszczególnych metabolitów, które różnią się między przypadkami NVAMD a grupą kontrolną. Ścieżka może ocenić zaangażowanie niektórych szlaków metabolicznych, takich jak metabolizm tyrozyny i mocznika, i może zapewnić dalszy wgląd w patofizjologię AMD. patofizjologii AMD. --- Malaria jest globalną chorobą zakaźną, która zagraża życiu milionów ludzi. ludzi. Badania transkryptomiki, proteomiki i genomiki funkcjonalnej, a także sekwencjonowanie genomów Plasmodium falciparum i Homo sapiens sekwencjonowania genomów Plasmodium falciparum i Homo sapiens, rzuciły nowe światło na relację żywiciel-pasożyt. światło na tę relację żywiciel-pasożyt. Ostatnie postępy w dokładnej spektrometrii spektrometrii masowej, zaawansowanego oprogramowania do analizy danych oraz dostępność baz danych ścieżek biologicznych, zbiegły się, aby ułatwić nasze globalne, nieukierunkowane badanie profilowania biochemicznego in vitro P. falciparum (IRBC) i niezakażonych (NRBC) erytrocytów. W celu zwiększyć liczbę wykrywalnych metabolitów, zoptymalizowano kilka kluczowych etapów analitycznych w naszych przepływach pracy. zostało zoptymalizowanych. Nieukierunkowana i ukierunkowana eksploracja danych zaowocowała wykrycie ponad tysiąca cech lub jednostek chemicznych. Nieukierunkowane zostały przypisane poprzez dopasowanie do bazy danych metabolitów METLIN. Dla ukierunkowanej eksploracji danych, przeszukaliśmy dane przy użyciu bazy danych związków pochodzących z rekonstrukcji metabolicznej genomu P. falciparum. W sumie ponad sto pięćdziesiąt zaobserwowano ponad sto pięćdziesiąt metabolitów z adnotacjami różnicowymi. Aby potwierdzić reprezentację znanych szlaków biochemicznych z naszych danych, zastosowano strategię analizy wykorzystano strategię analizy ścieżek wnioskowania do mapowania metabolitów z adnotacjami na BioCyc. To podejście generujące hipotezy zaowocowało nadreprezentacją wielu metabolitów na kilku szlakach IRBC, najbardziej przede wszystkim glikolizę. Ponadto, składniki "rozgałęzionego" cyklu TCA, częściowego cyklu mocznikowego oraz metabolizmu nukleotydów, aminokwasów, chorismatu, sfingolipidów i kwasów tłuszczowych. kwasów tłuszczowych. Co ciekawe, wykryliśmy i potwierdziliśmy wykryliśmy i potwierdziliśmy podwyższone poziomy cyklicznej rybozy ADP i fosforybozylu AMP w IRBC, co jest nową obserwacją. Metabolity te mogą odgrywać rolę w regulowaniu uwalniania wewnątrzkomórkowego Ca(2+) podczas infekcji P. falciparum. Nasze wyniki wspierają strategię globalnego profilowania metabolitów poprzez nieukierunkowane pozyskiwanie danych. akwizycji danych. Nieukierunkowane i ukierunkowane przepływy pracy eksploracji danych, gdy są używane razem do wykonywania metabolomiki opartej na ścieżkach, mają tę zaletę, że eliminują MS/MS dla każdego wykrytego związku. --- Metabolomika oparta na spektrometrii mas stanowi nowy obszar rozwoju technologii bioinformatycznych. rozwój technologii. Podczas gdy obecnie dostępne narzędzia obliczeniowe, takie jak takie jak XCMS statystycznie oceniają i klasyfikują cechy LC-MS, nie dostarczają one informacji o ich tożsamości strukturalnej. XCMS(2) to pakiet oprogramowania open source który został opracowany w celu automatycznego przeszukiwania tandemowej spektrometrii mas (MS/MS). tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) względem wysokiej jakości eksperymentalnych danych MS/MS z znanych metabolitów zawartych w bibliotece referencyjnej (METLIN). Punktacja trafień jest opiera się na metodzie "wspólnej liczby pików", która identyfikuje masy jonów fragmentów wspólne dla analitycznych i referencyjnych widm MS/MS. Innym funkcjonalnym funkcjonalnym XCMS(2) jest możliwość dostarczania informacji strukturalnych dla nieznanych metabolitów, które nie znajdują się w bazie danych METLIN. Ten algorytm algorytm został opracowany w celu wykrywania możliwych motywów strukturalnych w w nieznanym metaboliźmie, które mogą wytwarzać charakterystyczne jony fragmentów i neutralne do powiązanych związków referencyjnych zawartych w METLIN, nawet jeśli masy prekursorów nie są takie same. masy prekursorów nie są takie same. --- W ciągu ostatnich 5 lat endogenne metabolity zyskały coraz większe zainteresowanie głównie ze względu na ich implikacje w biomarkerach diagnostycznych i farmaceutycznych diagnostycznych i farmaceutycznych. METLIN (http://metlin.scripps.edu), ogólnodostępne internetowe repozytorium danych repozytorium danych, zostało opracowane, aby pomóc w szerokim zakresie badań nad metabolitami i ułatwić identyfikację metabolitów poprzez analizę masy. METLIN zawiera adnotowaną listę znanych informacji strukturalnych metabolitów, które łatwo skorelować z katalogiem wysokorozdzielczej spektrometrii mas z transformacją Fouriera (FTMS). transformacji Fouriera (FTMS), widmami tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) i danymi LC/MS. i danymi LC/MS. --- LC-MS z gradientem w odwróconej fazie wykorzystano do przeprowadzenia nieukierunkowanej analizy metabonomicznej na ekstraktach ludzkich linii komórkowych raka jelita grubego (CRC) (COLO 205, HT-29, HCT 116 i SW620) wszczepionych podskórnie do dopasowanych wiekowo athymicznych myszy nagich samce myszy w celu zbadania profili metabolicznych małych cząsteczek i zbadania możliwych korelacje z biopsjami ludzkich nowotworów. Po analizie danych o wysokiej dokładności przy użyciu MS i MS/MS, metabolity zostały zidentyfikowane poprzez przeszukiwanie głównych baz danych metabolitów, w tym METLIN, MASSBANK, The Human Metabolome Baza danych, PubChem, Biospider, LipidMaps i KEGG. Ksenografty nowotworów HT-29 i COLO 205 wykazały rozkład metabolitów, który różnił się od ksenograftów SW620 i HCT 116 (głównie na podstawie względnych różnic w ilościach aminokwasów i lipidów). ilości wykrytych aminokwasów i lipidów). Odkrycie to jest zgodne z Analiza oparta na NMR ludzkiej tkanki jelita grubego, gdzie profile metabolitów guzów HT-29 wykazują największe podobieństwo do ludzkiej tkanki raka odbytnicy z w odniesieniu do zmian we względnych ilościach lipidów i związków zawierających cholinę związki. Ponieważ sygnatury metaboliczne komórek nowotworowych wynikają z przeprogramowania metabolicznego ukierunkowanego przez onkogeny, ksenografty HT-29 u myszy mogą okazać się przydatnym modelem do dalszego badania mikrośrodowiska guza i biologii raka. biologii raka. --- Nieukierunkowana metabolomika zapewnia kompleksową platformę do identyfikacji metabolitów, których poziomy są zmienione między dwiema lub więcej populacjami. Wykorzystując chromatografii cieczowej kwadrupolowej spektrometrii mas czasu przelotu (LC-Q-TOF-MS), setki do tysięcy pików z unikalnym stosunkiem m/z i czasem retencji są rutynowo wykrywane z większości próbek biologicznych w nieukierunkowanym eksperymencie profilowania eksperymentu. Każdy pik, określany jako cecha metabolomiczna, można scharakteryzować na podstawie na podstawie jego dokładnej masy, czasu retencji i tandemowego widma masowego tandemowego widma masowego. Tutaj zaproponowano siedmioetapowy protokół dla takiej charakterystyki przy użyciu bazy danych metabolitów METLIN. Protokół rozpoczyna się od nieukierunkowanych danych metabolomicznych LC-Q-TOF-MS, które zostały przeanalizowane za pomocą programu bioinformatycznego bioinformatycznym XCMS i opisuje strategię wyboru interesujących cech, a także interesujących cech, a także wykonywanie kolejnych ukierunkowanych tandemowych MS. Siedem opisanych kroków Siedem opisanych kroków będzie wymagało 2-4 godzin na wykonanie każdej cechy, w zależności od związku. --- Metabolity w wysepkach Langerhansa i szczepie Escherichia coli DH5-alpha zostały analizowano przy użyciu trybu ujemnego, wspomaganej matrycą desorpcji laserowej / jonizacji czasu przelotu (MALDI-TOF-MS). Do analizy anionowych metabolitów przez MALDI, 9-aminoakrydyna jako matryca dała znacznie lepszy sygnał w porównaniu z kwasem alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowym, 2,5-dihydrobenzoesowym kwasu 2,4,6,-trihydroksyacetofenonu i kwasu 3-hydroksypikolinowego. Granice wykrywalności wykrywalności dla wzorców metabolitów wynosiły zaledwie 15 nM dla GDP, GTP, ADP i ATP i aż 1 muM dla bursztynianu w próbkach o objętości 1 ml. Analiza ekstraktów pozwoliła na wykrycie 44 metabolitów, z których 29 zostało wstępnie zidentyfikowane przez dopasowanie masy cząsteczkowej do związków w bazach danych METLIN i KEGG baz danych METLIN i KEGG. Względna kwantyfikacja została wykazana przez porównanie stosunku wybranych di- i trifosforylowanych nukleotydów dla wysepek inkubowanych z różnymi stężeniami glukozy. różnymi stężeniami glukozy. Dla wysepek przy stężeniu glukozy 3 mM, stężenie ATP/ADP, GTP/GDP i UTP/UDP wynosiły 1,9 +/- 1,39, 1,12 +/- 0,50 i 0,79 +/- 0,35, a przy stymulacji glukozą 20 mM stosunki te wzrosły do 4,13 +/- 1,89, 5,62 +/-4,48 i 4,30 +/- 4,07 (n = 3). Analiza przeprowadzono również poprzez umieszczenie pojedynczych, nienaruszonych wysepek na płytce docelowej MALDI z matrycą i uderzając laserem bezpośrednio w wysuszoną wysepkę. Bezpośrednia analiza pojedynczych wysepek pozwoliła na wykrycie 43 metabolitów, z których 28 było identyfikowalnych w bazie danych. możliwe do zidentyfikowania. Łącznie 43% wykrytych metabolitów z bezpośredniej analizy wysepek różniło się od tych wykrytych w ekstraktach z wysepek. Metoda została rozszerzona na komórek prokariotycznych poprzez analizę ekstraktów z E. coli. Wykryto sześćdziesiąt metabolitów wykryto 60 metabolitów, z których 39 pasowało do związków w bazie danych MetaCyc. Łącznie 27% metabolitów wykrytych z prokariotów pokrywało się z tymi znalezionymi w wysepkach. Wyniki te pokazują, że MALDI może być stosowany do wykrywania metabolitów w złożonych próbkach biologicznych. złożonych próbkach biologicznych. --- W celu uproszczenia i usprawnienia identyfikacji związków z danych danych metabolomicznych generowanych przez chromatografię cieczową czasu przelotu spektrometrii mas, stworzyliśmy oprogramowanie do konstruowania spersonalizowanych baz danych metabolitów z zawartością ponad 15 000 związków pobranych z publicznej bazy danych METLIN (http://metlin.scripps.edu/). Co więcej, dodaliśmy dodatkowe funkcjonalności do bazy danych, które (a) pozwalają na dodanie zdefiniowanych przez użytkownika czasów retencji jako ortogonalnego parametru wyszukiwania w celu uzupełnienia dokładnych dane masowe; oraz (b) umożliwiają połączenie z oddzielnym oprogramowaniem, generatorem wzorów molekularnych (Molecular Formula Molecular Formula Generator (MFG), które ułatwia niezawodną interpretację dowolnej bazy danych z dokładnych danych widma masowego. Aby przetestować użyteczność tej strategii identyfikacji, dodaliśmy czasy retencji do podzbioru mas w tej bazy danych, reprezentującej mieszaninę 78 syntetycznych wzorców moczu. Syntetyczna mieszanina mieszanina została przeanalizowana i sprawdzona pod kątem tej bazy danych moczu METLIN, w wyniku czego 46 dokładnych dopasowań masy i czasu retencji. Próbki ludzkiego moczu zostały następnie analizowane w tych samych warunkach analitycznych i porównywane z tą bazą danych. tej bazy danych. W ludzkim moczu wykryto łącznie 1387 jonów; 16 z tych jonów jonów odpowiadało zarówno dokładnym parametrom masy, jak i czasu retencji dla 78 wzorców moczu w bazie danych. w bazie danych. Kolejne 374 miały tylko dokładne dopasowanie masy do bazy danych. z bazą danych, przy czym 163 z tych mas miało również najwyższy wynik MFG. Ponadto MFG obliczył wzór dla kolejnych 849 jonów, które nie pasowały do bazy danych. do bazy danych. Podsumowując, wyniki te sugerują, że baza danych METLIN Personal baza danych metabolitów i oprogramowanie MFG oferują solidną strategię potwierdzania formuły dopasowań do bazy danych. W przypadku braku zgodności z bazą danych, sugeruje również możliwe formuły, które mogą być pomocne w interpretacji wyników eksperymentalnych. --- TŁO: Metabolomika jest prawdziwym wyzwaniem ze względu na złożoność i niejednorodność chemiczną próbek biologicznych. niejednorodności chemicznej próbek biologicznych. W tym badaniu przeprowadzono porównawczą analizę profilowania metabolitów przy użyciu dziesięciu technik ekstrakcji metabolitów zbadano na zbiorczej próbce osocza, a następnie przeprowadzono analizę ESI-MS w trybie pozytywnym i negatywnym. zarówno w trybie pozytywnym, jak i negatywnym. Metodologia i wyniki: Metabolity z połączonej próbki 50 zdrowych ochotników rozdzielono jedno- i dwuwymiarowo przy użyciu dwuwymiarowo z wykorzystaniem wytrącania rozpuszczalnika, ekstrakcji do fazy stałej i frakcjonowanie masy cząsteczkowej. Liczba unikalnych metabolitów, które są specyficzne do konkretnego podejścia do przygotowania próbki zostały również zidentyfikowane przez online dostępna baza danych, Metlin. Badanie (1) H NMR różnych procedur ekstrakcji procedury zostały również zarejestrowane w celu opracowania profilowania porównawczego różnych procedur frakcjonowania. WNIOSEK: Wyniki tego badania sugerują, że procedury ekstrakcji metabolitów oparte na 1- i 2-wymiarach, a następnie bezpośrednia infuzja ESI-MS były w stanie wykryć endogenne metabolity należące do różnych klas chemicznych. klas chemicznych. --- Autonomiczny metabolomiczny przepływ pracy łączący analizę spektrometrii mas z akwizycją danych tandemowej spektrometrii mas tandemową spektrometrią mas został zaprojektowany w celu umożliwienia jednoczesnego przetwarzanie danych i charakterystykę metabolitów. Chociaż wcześniej dane tandemowej spektrometrii mas tandemowej spektrometrii mas były generowane w locie, eksperymenty opisane tutaj w niniejszym dokumencie łączą tę technologię z zasobami bioinformatycznymi XCMS i METLIN. W wyniku tej unikalnej integracji możemy analizować duże zbiory danych profilowania i jednocześnie uzyskiwać identyfikacje strukturalne. Walidacja przepływu pracy na próbkach bakteryjnych pozwoliła na profilowanie rzędu tysiąca cech cech metabolitów z jednoczesną akwizycją danych tandemowych widm masowych. Metoda Akwizycja danych tandemowej spektrometrii mas umożliwiła automatyczne wyszukiwanie i dopasowywanie z bazą danych tandemowej spektrometrii mas METLIN, skracając obecny przepływ pracy z dni do godzin. przepływ pracy z dni do godzin. Ogólnie rzecz biorąc, autonomiczne podejście do nieukierunkowanej metabolomiki zapewnia skuteczny sposób profilowania metabolomicznego i będzie ostatecznie umożliwić szybszą integrację analiz porównawczych, identyfikacji metabolitów identyfikację metabolitów i analizę danych na poziomie biologii systemów.
Jaka jest zawartość bazy danych METLIN?
METLIN to baza danych metabolitów zawierająca dane tandemowej spektrometrii mas dla każdego metabolitu.