Białko NS5 wirusa Zachodniego Nilu (WNV) zawiera domenę metylotransferazy (MTase) domenę zaangażowaną w ograniczanie RNA i domenę polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp) niezbędną do replikacji wirusa. Struktury krystaliczne poszczególnych domen WNV MTase i RdRp zostały rozwiązane; jednak struktura pełnej długości NS5 nie została nie została określona. Aby uzyskać lepszy wgląd w strukturę NS5 i interakcje między domenami MTazy i RdRp, wygenerowaliśmy panel siedmiu przeciwciał monoklonalnych monoklonalnych (mAbs) do białka NS5 wirusa WNV (szczep Kunjin) i zmapowaliśmy ich miejsca wiązania przy użyciu serii miejsca wiązania przy użyciu serii skróconych białek NS5 i syntetycznych peptydów. Miejsca wiązania czterech mAbs (5D4, 4B6, 5C11 i 6A10) zostały zmapowane do reszt 354-389 w subdomenie palców RdRp. Jest to zgodne ze zdolnością zdolność tych mAbs do hamowania aktywności RdRp in vitro i sugeruje, że ten region region stanowi potencjalny cel dla inhibitorów RdRp. Używając serii syntetycznych peptydów syntetycznych peptydów, zidentyfikowaliśmy również liniowy epitop (związany przez mAb 5H1), który zmapowany do odcinka 13 aa otaczającego reszty 47 i 49 w domenie MTazy, region region przewidywany do interakcji z subdomeną palmową RdRp. Niepowodzenie jednego mAb (7G6) do wiązania zarówno N-, jak i C-końcowo skróconych rekombinantów NS5 wskazuje, że przeciwciało rozpoznaje epitop konformacyjny, który wymaga obecności reszt w domenach MTazy i RdRp. Dane te potwierdzają model strukturalny cząsteczki NS5 o pełnej długości, który przewiduje fizyczną interakcję między domenami MTazy i RdRp. --- Genom wirusa Zachodniego Nilu (WNV) zawiera pojedynczy gen polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp), który jest odpowiedzialny za replikację genomu wirusa i jako taki jest ważnym celem terapii przeciwwirusowej. jest ważnym celem terapii przeciwwirusowej. Wiadomo, że wirusowe RdRps brak możliwości korekty, w wyniku czego wirusy takie jak WNV istnieją jako mieszanka genotypów wirusowych w obrębie infekcji, umożliwiając wirusowi łatwe i adaptację do nowych środowisk gospodarza. Aby przetestować konsekwencje subtelnych zmian strukturalnych oddalonych od miejsca aktywnego RdRp, wprowadzono następujące pojedyncze mutacje mutacje punktowe w regionie kodującym WNV NS5 RdRp: T363N, A365N, i T537I; mutacje te zostały wybrane w celu ustabilizowania drugorzędowych elementów strukturalnych elementy strukturalne w pobliżu kieszeni wiążącej rNTP RdRp. Zmutowane wirusy testowano in vitro na typach komórek Vero, C6/36, Culex tarsalis i DF-1 oraz in in vivo na jednodniowych kurczakach i komarach Culex pipiens. Morfologia płytki była przez każdą mutację, a kinetyka wzrostu i replikacji RNA została zmieniona. również. Nasze wyniki pokazują, że subtelne zmiany w białku RdRp z dala od od miejsca aktywnego może mieć znaczący ogólny wpływ biologiczny na kondycję WNV i że efekt ten może być zależny od gospodarza. --- Białko niestrukturalne 5 (NS5) wirusa dengi (DENV) składa się z dwóch domen kulistych oddzielonych 10-rezydukcyjnym łącznikiem. domen oddzielonych 10-pozostałościowym łącznikiem. Domena N-końcowa uczestniczy w syntezie syntezie struktury czapeczki 1 mRNA ((7Me)GpppA(2'OMe)) na końcu 5' genomu wirusowego i posiada guaninę. genomu wirusowego i posiada guanylotransferazę, guanino-N7-metylotransferazę, i aktywność nukleozydo-2'O-metylotransferazy. Domena C-końcowa jest polimerazą RNA zależną od RNA odpowiedzialną za syntezę wirusowego RNA. Chociaż uzyskano struktury krystaliczne dwóch wyizolowanych domen, nie ma danych strukturalnych dla pełnej długości NS5. Nie jest również jasne, czy dwie domeny NS5 wchodzą ze sobą w interakcje, tworząc stabilną strukturę, w której w której względna orientacja dwóch domen jest stała. Aby zbadać strukturę i dynamikę DENV typu 3 NS5 w roztworze, przeprowadziliśmy eksperymenty z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem z białkiem o pełnej długości. Stwierdzono, że NS5 jest monomeryczne i dobrze sfałdowane w badanych warunkach. Wyniki tych eksperymentów sugerują również, że NS5 przyjmuje wiele konformacji w roztworze, od zwartych do bardziej wydłużonych form, w których dwie domeny nie wydają się nie oddziałują ze sobą. Interpretujemy wiele konformacji NS5 obserwowane w roztworze jako wynikające ze słabych interakcji między dwiema domenami NS5 i elastyczności łącznika przy braku innych składników kompleksu replikacyjnego. kompleksu replikacyjnego. --- Białko 1 indukowane chemoatraktantem monocytów (MCPIP1), należące do rodziny MCPIP z wysoce konserwatywnym palcem cynkowym typu CCCH i domenami nukleazy Nedd4-BP1, YacP Domeny nukleazy, zostały zaangażowane w negatywną regulację komórkowych odpowiedzi zapalnych. odpowiedzi zapalnych. W tym raporcie po raz pierwszy wykazaliśmy, że ta nukleaza wiążąca RNA jest również ukierunkowana na wirusowe RNA i ma silne działanie przeciwwirusowe aktywność przeciwwirusową. Nadekspresja ludzkiego MCPIP1, ale nie MCPIP2, MCPIP3 lub MCPIP4, hamowała replikację wirusa japońskiego zapalenia mózgu (JEV) i wirusa dengi (DEN). replikację. Analiza funkcjonalna MCPIP1 ujawniła, że aktywność RNazy, wiązania RNA i oligomeryzacji, ale nie deubiqutinazy, są wymagane dla jego potencjał przeciwwirusowy. Ponadto, zakażenie innymi wirusami RNA o dodatnim sensie wirusów, takich jak wirus sindbis i wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego, oraz wirus RNA o ujemnym znaczeniu, taki jak wirus grypy, a także wirus DNA, taki jak adenowirus, mogą być również blokowane przez MCPIP1. Co więcej, endogenny gen MCPIP1 ekspresja była indukowana przez infekcję JEV i DEN, a obniżenie ekspresji MCPIP1 zwiększało replikację JEV i DEN w ludzkich komórkach. Zatem MCPIP1 może działać jako wrodzona obrona gospodarza poprzez aktywność RNazy do celowania i degradacji wirusowego RNA.
Czy istnieje struktura krystaliczna pełnej długości polimerazy RNA zależnej od RNA (NS5) flaviviridae?
Tak, istnieje struktura krystaliczna pełnej długości NS5 wirusa japońskiego zapalenia mózgu (Flaviviridae) - PDB:4K6M