Utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie (FFPE) archiwa tkanek i związane z nimi zapisy diagnostyczne stanowią nieocenione źródło informacji proteomicznych na temat chorób, w przypadku których wyniki pacjentów są już znane. W ciągu ostatnich kilku lat postępy w metodologii umożliwiły odzyskanie peptydów z tkanek FFPE tkanek, które dają rozsądną reprezentację białek odzyskanych z identycznych identycznych świeżych lub mrożonych próbek. Te nowe metody, oparte w dużej mierze na technikach odzyskiwania antygenu indukowanego ciepłem, zapożyczonych z immunohistochemii, rozwinęły się wystarczająco, aby umożliwić przynajmniej jakościową analizę proteomu archiwalnych tkanek FFPE. proteomu tkanek archiwalnych FFPE. Niniejszy rozdział opisuje podejścia do analizy proteomicznej tkanek FFPE za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. spektrometrii mas. --- Globalne profilowanie spektrometrii mas (MS) i kwantyfikacja liczby widm są wykorzystywane do do identyfikacji unikalnych lub różnie wyrażonych białek i może pomóc w identyfikacji potencjalnych biomarkerów. MS rzadko była przeprowadzana w badaniach retrospektywnych, ponieważ historycznie dostępne próbki do analiz białek były ograniczone do utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) zarchiwizowanych próbek tkanek. Niezawodne metody uzyskiwania profili proteomicznych z próbek FFPE są potrzebne. Analiza proteomiczna analiza tych próbek została zakłócona przez sieciowanie białek wywołane formaliną. sieciowanie białek. Wydajność ekstrahowanych białek w chromatografii cieczowej tandemowej MS z próbek FFPE i ekstraktów z całych i laserowo wychwytywanych z mikrodyssekcji laserowej (LCM) FFPE i zamrożonych / osadzonych w optymalnej temperaturze cięcia (OCT) porównano dopasowane kontrolne próbki wątroby szczura. Ekstrakty z FFPE i mrożonych / osadzonych w OCT wątrobach szczurów leczonych atorwastatyną były dalej porównywane w celu oceny wydajności próbek FFPE w identyfikacji białek regulowanych atorwastatyną białka. Porównywalną reprezentację masy cząsteczkowej stwierdzono w ekstraktach z FFPE i OCT zamrożonych skrawków tkanek, podczas gdy wydajność białek była nieco mniejsza dla próbki FFPE. Liczba zidentyfikowanych wspólnych białek wskazuje, że solidna reprezentacja proteomiczna z tkanki FFPE i LCM nie miała negatywnego negatywnie na liczbę zidentyfikowanych białek z próbek mrożonych OCT lub FFPE. Reprezentacja subkomórkowa w próbkach FFPE była podobna do zamrożonej OCT, z zidentyfikowano głównie białka cytoplazmatyczne. Biologicznie istotne zmiany zmiany wykryto w próbkach wątroby FFPE poddanych działaniu atorwastatyny, a wybrane białka białka związane z atorwastatyną zidentyfikowane przez MS zostały potwierdzone przez analizę Western blot analiza. Odkrycia te pokazują, że utrwalanie w formalinie, obróbka parafinowa przetwarzanie parafiny i LCM nie wpływają negatywnie na jakość i ilość białek, jak określone przez MS i że próbki FFPE są podatne na globalną analizę proteomiczną analizy proteomicznej. --- Próbki tkanek w biobankach są zazwyczaj utrwalane w formalinie i zatapiane w parafinie (FFPE). (FFPE), w której to formie są przechowywane przez dziesięciolecia. Dopiero niedawno wykazano, że dopiero niedawno wykazano, że białka w tkankach FFPE można zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas opartej na proteomikę, ale analiza modyfikacji potranslacyjnych jest uważana za trudna lub niemożliwa. Metoda przygotowania próbki wspomagana filtrem (FASP) może analizować próbki proteomiczne solubilizowane w wysokich stężeniach SDS, a my używamy tę funkcję do opracowania prostego protokołu analizy FFPE. Połączenie z proste frakcjonowanie peptydów oparte na pipecie zidentyfikowało około 5000 białek wątroby myszy w ciągu 24 godzin - tyle samo, co w świeżej tkance. Wyniki z procedury FFPE-FASP nie wskazują na żadne zauważalne zmiany wynikające z czasu przechowywania, barwienia hematoksyliną lub mikrodysekcji laserowej. Porównaliśmy świeżą tkankę z FFPE przy użyciu myszy SILAC i nie stwierdziliśmy znaczących różnic jakościowych lub ilościowych między tymi próbkami na poziomie białek lub peptydów. poziomie peptydów. Zastosowanie naszego protokołu FFPE-FASP do fosforylacji i N-glikozylacji wskazało prawie 5000 miejsc fosforylacji i 1500 miejsc N-glikozylacji. miejsc. Analiza tkanki FFPE myszy SILAC wykazała, że te potranslacyjne modyfikacje modyfikacje potranslacyjne zostały ilościowo zachowane. W ten sposób materiał FFPE może być analizowany przez proteomikę ilościową na poziomie białek i modyfikacji posttranslacyjnych. białek i modyfikacji potranslacyjnych. --- Obrazowanie spektrometrii mas (IMS) jest potężną technologią do mapowania rozkładów cząsteczek biologicznych, takich jak białka i peptydy w tkankach tkanek. Jest zatem potencjalnie niezwykle przydatna do analizy stanów patologicznych, takich jak choroby nowotworowe. stanów patologicznych, takich jak choroby nowotworowe. Zastosowanie IMS jest zazwyczaj ograniczone do świeżo zamrożonych próbek tkanek. Istnieje jednak duże zainteresowanie możliwość analizy proteomu tkankowego utrwalonych w formalinie utrwalonych w formalinie próbek zatopionych w parafinie (FFPE), które były przechowywane wraz z kliniczno-patologicznymi pacjentów w ogromnych archiwach przez wiele dziesięcioleci. Dlatego opracowaliśmy protokół odzyskiwania antygenu przy użyciu buforu kwasu cytrynowego o wysokiej temperaturze bufor kwasu cytrynowego o wysokiej temperaturze, aby umożliwić częściowe odwrócenie sieciowania białek FFPE białek FFPE. W połączeniu ze zautomatyzowanym osadzaniem trypsyny i matrycy, nasza metoda metoda pozwala na generowanie znaczących obrazów rozkładu jonów peptydowych. Fragmentacja peptydów in Fragmentacja peptydów in situ zapewniła identyfikację białek o wysokiej obfitości takich jak aktyna i kolagen. Ponadto, zastosowanie trzech trzech różnych strategii HPLC-MS pozwoliło na identyfikację maksymalnie 106 białek, z których 67 było skorelowanych masowo z jonami z analizy IMS zarchiwizowanej tkanki jajnika FFPE. zarchiwizowanej tkanki jajnika FFPE. Przedstawiona tutaj metoda CAAR uzupełnia wcześniej opisane protokoły odzyskiwania antygenu i jest ważnym krokiem w możliwości pełnej analizy proteomu zarchiwizowanej tkanki FFPE. --- Utrwalone w formalinie próbki tkanek zatopione w parafinie (FFPE) stanowią potencjalnie cenny zasób zarówno dla prospektywnego, jak i retrospektywnego odkrywania biomarkerów. Odblokowanie profilu proteomicznego kliniczno-patologicznych tkanek FFPE jest kluczowym krokiem do krytycznie istotnym krokiem dla adnotacji wyników klinicznych i przewidywania biomarkerów dla ostatecznego rokowania choroby i obserwacji terapeutycznej. --- Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. śmierci, głównie z powodu przerzutów. Aby lepiej zrozumieć przerzuty PDAC i zidentyfikować nowe cele terapeutyczne, przeanalizowaliśmy proteom guzów pierwotnych i przerzutów do węzłów chłonnych (LN). Ponieważ zamrożone próbki przerzutów są rzadkie, zbadaliśmy utrwalone w formalinie tkanki zatopione w parafinie (FFPE). Stanowi to wyzwanie techniczne ze względu na wiązania krzyżowe indukowanych przez utrwalanie. Wykorzystując mikrodysekcję laserową (system PALM), wyizolowaliśmy wyizolowaliśmy złośliwy nabłonek z siedmiu pierwotnych guzów PDAC FFPE i dopasowanych przerzutów LN przerzutów. Po przeprowadzeniu dysekcji, próbki zostały przeanalizowane w dwóch egzemplarzach przy użyciu wielowymiarowej technologii identyfikacji białek (MudPIT); doprowadziło to do identyfikację 1504 białek, z których 854 były wspólne dla wszystkich analizowanych próbek. analizowanych próbek. Porównanie uzyskanych białek z danymi z poprzednich badań proteomicznych proteomicznych na tkance trzustki, soku trzustkowym, surowicy i moczu dało wynik mniej niż 30% nakładania się, co wskazuje, że nasze badanie znacznie rozszerzyło obecną bazę obecną bazę danych białek ulegających ekspresji w tym nowotworze złośliwym. Analiza statystyczna statystyczna wykazała, że 115/854 białek (13,5%) uległo znaczącej ekspresji (wartość g ≥ 3,8). Dwa białka, S100P i 14-3-3 sigma, z wysoce znaczącymi wartościami g istotnymi wartościami g zostały potwierdzone jako ulegające istotnej ekspresji (S100P: p = 0,05 i 14-3-3 sigma: p < 0,001) w większej serii 55 przypadków PDAC i przerzutów do LN przy użyciu immunohistochemii. Tak więc, laserowa laserowa mikrodysekcja tkanki FFPE połączona z dalszą analizą proteomiczną jest właściwym podejściem do badania przerzutowego PDAC. Jest to pierwsze badanie mające na celu ustalenie i porównanie składu białek pierwotnego PDAC i dopasowanych przerzutów LN, i doprowadziło do identyfikacji kilku potencjalnych celów terapeutycznych specyficznych dla nabłonka, w tym 14-3-3 sigma i S100P. --- Utrwalone w formalinie próbki tkanek zatopione w parafinie (FFPE) stanowią potencjalnie cenne zasoby do retrospektywnych badań nad odkrywaniem biomarkerów, a ostatnie prace wskazują na wykonalność zastosowania proteomiki shotgun do scharakteryzowania białek tkankowych FFPE białek tkankowych. Krytycznym pytaniem w tej dziedzinie jest to, czy proteomy scharakteryzowane w próbkach FFPE są równoważne z proteomami w odpowiadających im w odpowiadających im świeżych lub mrożonych próbkach tkanek. Tutaj porównaliśmy analizy proteomiczne shotgun próbek mrożonych i FFPE przygotowanych z tych samych tkanek gruczolaka okrężnicy. Po deparafinizacji, nawodnieniu i trawieniu tryptycznym w łagodnych warunkach, próbki FFPE odpowiadające warunkach, próbki FFPE odpowiadające 200 mikrogom białka dały około 400 pewnych identyfikacji białek w jednowymiarowej odwróconej w jednowymiarowej analizie chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Główna różnica Główną różnicą między proteomami zamrożonymi i FFPE było zmniejszenie proporcji C-końcowych peptydów lizyny do C-końcowych peptydów argininy, ale różnice te miały niewielki wpływ na zidentyfikowane białka. Brak kowalencyjnych kowalencyjne modyfikacje peptydów przypisywane chemii formaldehydu zostały wykryte przez analizy zbiorów danych MS/MS, co sugeruje, że niewykryte, usieciowane peptydy peptydy stanowią główną klasę modyfikacji w tkankach FFPE. Utrwalanie tkanek przez okres do 2 dni w neutralnej zbuforowanej formalinie nie miało negatywnego wpływu na identyfikację białek. identyfikację białek. Analiza archiwalnych próbek FFPE gruczolaka okrężnicy wykazała równoważną liczbę zliczeń widm MS/MS i identyfikacji grup białek białek z próbek przechowywanych przez 1, 3, 5 i 10 lat. Połączenie peptydowej separacji opartej na ogniskowaniu izoelektrycznym z odwróconą fazą LC-MS/MS zidentyfikowało 2554 grupy białek w 600 ng białka z zamrożonej tkanki i 2302 grup białek z tkanki FFPE z co najmniej dwoma różnymi peptydami identyfikacji na białko. Analiza połączonych danych zamrożonych i FFPE wykazała 92% pokrywanie się zidentyfikowanych grup białek. Porównanie kategorii ontologii genów zidentyfikowanych białek nie wykazało stronniczości w identyfikacji białek na podstawie lokalizacji subkomórkowej. identyfikacji białek na podstawie lokalizacji subkomórkowej. Chociaż status modyfikacji potranslacyjnych nie został zbadany w tym badaniu, próbki archiwalne wykazywały niewielki wzrost utleniania metioniny, z około 17% po roku przechowywania do około 25% po 10 latach. Dane te wykazują równoważność inwentaryzacji proteomu uzyskanych z FFPE i zamrożonych próbek tkanek i zapewniają wsparcie dla retrospektywnej analizy proteomicznej analizy proteomicznej tkanek FFPE w celu odkrycia biomarkerów. --- Repozytoria tkanek utrwalonych formaldehydem i zatopionych w parafinie (FFPE) stanowią cenne źródło cenne zasoby do retrospektywnego badania progresji choroby i odpowiedzi na terapię. odpowiedzi na terapię. Jednak analiza proteomiczna tkanek FFPE została utrudniona przez modyfikacje białek wywołane formaldehydem, które zmniejszają wydajność ekstrakcji białek i mogą prowadzić do ich błędnej identyfikacji. Tutaj demonstrujemy zastosowanie ciepła wzmocnionego wysokim ciśnieniem hydrostatycznym (40,000 psi) jako nowej metody odzyskiwania nienaruszonych białek z mysiej wątroby FFPE wątroby myszy. Gdy wątroba myszy FFPE została wyekstrahowana przy użyciu ciepła i podwyższonego ciśnienia, nastąpił 4-krotny wzrost wydajności ekstrakcji białek, 3-krotny wzrost w ekstrakcji nienaruszonych białek i do 30-krotnego wzrostu liczby nieredundantnych białek zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas, w porównaniu do dopasowanych tkanki ekstrahowanej samym ciepłem. Co ważniejsze, liczba nieredundantnych białek zidentyfikowanych w tkance FFPE była niemal identyczna jak w przypadku dopasowanej świeżo zamrożonej tkanki. --- Klinicznie istotne tkanki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE) nie były szeroko stosowane w badaniach neuroproteomicznych. były szeroko stosowane w badaniach neuroproteomicznych, ponieważ zakłada się, że wiele białek ulega degradacji podczas przechowywania tkanek. Ostatnie ulepszenia w technologiach proteomicznych technologii proteomicznych, od analizy nienaruszonych białek w żelu 2D do "shotgun" kwantyfikację peptydów i stosowanie znaczników izobarycznych do bezwzględnej i względnej kwantyfikacji (iTRAQ). względnej kwantyfikacji (iTRAQ), umożliwiły analizę tkanek FFPE. tkanek FFPE. W ostatnich latach iTRAQ była jedną z głównych metod z wyboru dla wysokoprzepustowej ilościowej analizy proteomicznej, która umożliwia jednoczesne porównanie do ośmiu próbek w jednym eksperymencie. Naszym celem była ocena względnych zalet analizy iTRAQ świeżo mrożonych tkanek nerwowych w porównaniu z FFPE tkanek nerwowych poprzez porównanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) - indukowanego zmiany proteomiczne w rdzeniach kręgowych szczurów FFPE i zamrożonych tkankach. Wywołane przez EAE zmiany proteomiczne w tkankach FFPE były dodatnio skorelowane z tymi znalezionymi w zamrożonych tkankach, aczkolwiek z ∼50% mniejszym pokryciem proteomu. Późniejsza walidacja wzbogacenia aktywatora immunoproteasomu (IP) 1 w rdzeniu kręgowym EAE doprowadziła nas do oceny innych białek specyficznych dla proteasomu i IP. Odkryliśmy odkryliśmy, że wiele specyficznych dla IP (w przeciwieństwie do konstytutywnych) białek proteasomalnych białek zostało wzbogaconych w rdzeniach kręgowych szczurów z EAE, a indukowana przez EAE akumulacja IP wystąpiła również w rdzeniach kręgowych niezależnego mysiego modelu EAE w sposób sposób zależny od stopnia niepełnosprawności. Dlatego też doszliśmy do wniosku, że możliwe jest generowanie użytecznych informacji z analizy neuroproteomiki opartej na iTRAQ zarchiwizowanych tkanek FFPE do badania tkanek chorób neurologicznych. --- Tkanka utrwalona w formalinie zatopiona w parafinie (FFPE) zyskała ostatnio zainteresowanie jako alternatywa dla świeżych/mrożonych tkanek do retrospektywnego odkrywania biomarkerów białkowych biomarkerów białkowych. Jednakże, podczas procesu utrwalania, białka ulegają degradacji i sieciowaniu, co sprawia, że konwencjonalne technologie analizy białek problematyczne. W tym badaniu porównaliśmy kilka metod ekstrakcji i separacji do analizy białek w tkankach FFPE. Inkubacja skrawków tkanek w wysokiej temperaturze z nowym buforem ekstrakcyjnym (20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 2% SDS, 1% beta-oktyloglukozyd, 200 mM DTT, 200 mM glicyna i mieszanina inhibitorów proteazy) inhibitorów proteazy) spowodowało lepsze odzyskiwanie białka. Białko separacja przez 1-DE, a następnie analiza LC-ESI MS/MS była najskuteczniejszym podejście do identyfikacji białek, w oparciu o liczbę peptydów niezawodnie zidentyfikowanych peptydów. Co ciekawe, wiele peptydów zostało zidentyfikowanych w regionach 1DE nie odpowiadających ich natywnym masom cząsteczkowym. Jest to wskazanie na tworzenie kompleksów białko-białko przez sieciowanie i fragmentacji białka z powodu przedłużonego przechowywania próbki. Badanie to ułatwi rozwój przyszłej analizy proteomicznej tkanki FFPE i zapewni narzędzie do walidacji biomarkerów narażenia w próbkach archiwalnych, prognozy i choroby. --- Opatrzone adnotacjami, utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie (FFPE) archiwa tkanek stanowią cenny zasób do retrospektywnego odkrywania biomarkerów. Jednakże, proteomiczna eksploracja tkanki archiwalnej jest utrudniona przez rozległe kowalencyjne wiązania formalinowe kowalencyjne sieciowanie. Potrzebna jest solidna metodologia umożliwiająca profilowanie proteomiczne zasobów archiwalnych. archiwalnych jest pilnie potrzebna. Ostatnie prace zaczynają wspierać wykonalność odkrywania biomarkerów w tkankach archiwalnych, ale dalszy rozwój w metodach ekstrakcji, które są kompatybilne z podejściami ilościowymi są są pilnie potrzebne. Przedstawiamy opłacalną metodologię ekstrakcji pozwalającą na ilościowe analizy proteomiczne niewielkich ilości tkanek FFPE do badania biomarkerów. biomarkerów. To podejście oparte na środkach powierzchniowo czynnych/cieplnych skutkuje skuteczną i powtarzalna ekstrakcja białek w blokach tkankowych FFPE. W połączeniu z chromatografią cieczową i spektrometrią mas opartą na bezznakowej proteomice ilościowej metodologią, protokół umożliwia solidną reprezentatywną i ilościową analizę archiwalnego proteomu. analizy archiwalnego proteomu. Wstępne badania walidacyjne w tkankach raka nerki tkankach raka nerki zidentyfikowały zazwyczaj 250-300 białek na 500 ng tkanki za pomocą 1D LC-MS/MS z porównywalną ekstrakcją w FFPE i świeżo zamrożonych blokach tkanek blokach i zachowaniu wzorców ekspresji różnicowej guz/normalny (205 białek, r = 0,682; p < 10(-15)). Przedstawiona tutaj wstępna metodologia zapewnia ilościowe podejście do oceny potencjalnej przydatności rozległych archiwów tkanek FFPE jako alternatywnego zasobu do odkrywania biomarkerów i pozwoli na zbadanie metod zwiększających głębokość pokrycia i zbadanie wpływ czynników przedanalitycznych. --- Ta jednostka opisuje metodę izolacji białek z tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) do analizy spektrometrii mas. tkanki zatopionej w parafinie (FFPE) do analizy spektrometrii mas. Wywołane ciepłem jest podstawą strategii ekstrakcji białek przedstawionej w tym protokole. w tym protokole. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji białek jądrowych, cytozolowych i białek błonowych z tkanek FFPE wyekstrahowanych z bloków tkankowych lub szkiełek. --- To urządzenie zapewnia solidną, niezawodną i łatwą w użyciu metodę opartą na zestawie do ekstrakcji nienaruszonych, niezdegradowanych białek z tkanki utrwalonej formaliną, utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) tkanek i ich późniejszego wykorzystania do analizy metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii masowej (LC/MS). chromatografii cieczowej/spektrometrii masowej (LC/MS). Po odparafinowaniu, białka są ekstrahowane z niebarwionych skrawków tkanki wątroby szczura FFPE. Po prostym etapie oczyszczania przy użyciu ekstrakcji organicznej, próbka jest przenoszona do buforu zoptymalizowanego do trawienia trypsyną wyekstrahowanych białek. Następnie, LC/MS służy do identyfikacji białek, które dały początek peptydom tryptycznym. Porównując utrwalone formaliną i zamrożone tkanki, obserwuje się dobrą korelację w masowej przypisywanej peptydom tryptycznym i liczbie zidentyfikowanych białek. zidentyfikowanych białek. Ponieważ tkanki FFPE są ogólnie dostępne w praktyce klinicznej praktyce klinicznej, metoda ta może być stosowana do analizy biomarkerów w różnych sytuacjach patologicznych (np. patologicznych (np. zdrowych vs. chorych). Metoda może być również stosowana do ekstrakcji białek ze świeżo zamrożonych tkanek.
Czy możliwe jest określenie proteomu tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE)?
Tak, postępy w przygotowywaniu próbek umożliwiły analizę proteomiczną tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.