Zmniejszona obsługa Ca w kardiomiocytach jest często przypisywana upośledzonej funkcji retikulum sarkoplazmatycznego (SR) w ludzkiej i eksperymentalnej niewydolności serca. Fosfolamban (PLN) jest kluczowym regulatorem SR i funkcji serca, a mutacje PLN u ludzi są związane z kardiomiopatią rozstrzeniową (DCM). My wcześniej donosiliśmy o delecji wysoce konserwatywnej reszty aminokwasowej argininy 14 (kwasy nukleinowe 39, 40 i 41) u pacjentów z DCM. Ten podstawowy aminokwas jest ważny w utrzymaniu sekwencji konsensusu dla fosforylacji PKA fosforylacji Ser 16 w PLN. Aby ocenić funkcję tego zmutowanego PLN, wprowadziliśmy wprowadziliśmy PLN-R14Del do miocytów serca myszy bez PLN. Transgeniczne linie wyrażające zmutowany PLN-R14Del na podobnych poziomach białka jak typy dzikie nie wykazywały zahamowania początkowego tempa wychwytu Ca z SR ułatwionego przez szczawiany w porównaniu do PLN-knockouts (PLN-KO). Parametry kurczliwości i kinetyka Ca również pozostawały silnie stymulowane w kardiomiocytach PLN-R14Del, podobnie jak w PLN-KO, a izoproterenol nie stymulował dalej tych hiper-skurczowych parametrów podstawowych. parametry. Zgodnie z brakiem zahamowania transportu SR Ca i kurczliwości, mikroskopia konfokalna kurczliwości, mikroskopia konfokalna wykazała, że PLN-R14Del nie udało się kolokalizować z SERCA2a. Co więcej, PLN-R14Del nie współimmunoprecypitował z SERCA2a (podobnie jak WT-PLN), ale raczej koimmunoprecypitował z sarkolemmalną Na/K-ATPazą (NKA) i stymulował aktywność NKA. Ponadto badania na komórkach HEK wykazały znaczący transfer energii rezonansu fluorescencji między PLN-R14Del-YFP i NKAα1-CFP, ale nie z regulatorem NKA fosfolemmanem. Pomimo zwiększonej funkcji serca w sercach PLN-R14Del (podobnie jak w sercach PLN-knockouts), wystąpił przerost mięśnia sercowego (w przeciwieństwie do PLN-KO) w połączeniu z aktywacją Akt i szlaków MAPK. Zatem ludzki PLN-R14Del jest nieprawidłowo kierowany do sarkolemma, przy braku endogennego PLN, i zmienia aktywność NKA, prowadząc do przebudowy serca. --- Molekularna etiologia niewydolności serca, wyłaniającej się epidemii sercowo-naczyniowej dotykającą 4,7 miliona Amerykanów i kosztującą 17,8 miliarda dolarów rocznie. rocznie, pozostają słabo poznane. Tutaj donosimy, że dziedziczna ludzka kardiomiopatia rozstrzeniowa z oporną na leczenie zastoinową niewydolnością serca jest spowodowana przez dominującą mutację typu missense Arg --> Cys w pozycji 9 (R9C) w fosfolambanie (PLN), przezbłonowej fosfoproteinie, która hamuje sarkoplazmatyczną sercową sarkoplazmatyczną pompę Ca2+-adenozynotrifosfatazy (SERCA2a). Transgeniczne myszy PLN(R9C) odtworzyły ludzką niewydolność serca z przedwczesną śmiercią. Badania komórkowe i biochemiczne badania wykazały, że w przeciwieństwie do PLN typu dzikiego, PLN(R9C) nie hamuje bezpośrednio SERCA2a. Zamiast tego, PLN(R9C) uwięził kinazę białkową A (PKA), która zablokowała fosforylację PLN typu dzikiego za pośrednictwem PKA, co z kolei opóźniało zanik wapnia w miocytach. Wyniki te wskazują, że dysregulacja może inicjować niewydolność serca u ludzi - odkrycie, które może prowadzić do możliwości terapeutyczne. --- TŁO: Fosfolamban jest endogennym inhibitorem ATPazy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego. o działaniu regulującym sprzężenie skurczu/relaksacji mięśnia sercowego. Mutacje w genie fosfolambanu (PLN) są związane z pierwotnymi kardiomiopatiami. kardiomiopatiami. CELE: Badanie przesiewowe w kierunku mutacji PLN w naszej populacji pacjentów z pierwotnymi kardiomiopatiami kardiomiopatiami i przeprowadzenie analizy funkcjonalnej zidentyfikowanych mutacji. METODY: Przeprowadziliśmy badania przesiewowe mutacji SSCP i sekwencjonowanie DNA genu PLN u 186 pacjentów z kardiomiopatią przerostową lub rozstrzeniową. Aby zbadać siłę promotora, skonstruowaliśmy plazmidy reporterowe zawierające gen lucyferazy i przeprowadziliśmy analizę transfekcji przejściowej w liniach komórkowych C6 i C2C12 liniach komórkowych. WYNIKI: Mutacja PLN -42 C>G została znaleziona u jednego pacjenta z późnym początkiem rodzinną wierzchołkową kardiomiopatią przerostową. Mutacja ta zmniejszyła aktywność promotora fosfolambanu o 43% i 47%, odpowiednio w liniach komórkowych C6 i C2C12 odpowiednio. Jeden syn miał łagodną kardiomiopatię przerostową wierzchołkową i był nosicielem mutacji. mutację, inny syn z prawidłowym EKG i echokardiogramem również miał tę mutację. mutację. WNIOSEK: Mutacja PLN -42 C>G jest związana z łagodną postacią wierzchołkowej kardiomiopatii przerostowej. kardiomiopatii przerostowej w tej rodzinie, chociaż obecność zdrowego dorosłego nosiciela zdrowego dorosłego nosiciela sugeruje, że mogą być zaangażowane inne czynniki genetyczne i środowiskowe. czynniki genetyczne i środowiskowe. W przeciwnym razie mutacje w genie PLN nie są częstą przyczyną kardiomiopatii w naszej rodzinie. częstą przyczyną kardiomiopatii w naszej populacji. --- CELE: Zbadanie, czy mutacje genu fosfolambanu (PLN) leżą u podstaw u pacjentów ze zdiagnozowaną arytmogenną kardiomiopatią prawej komory (ARVC) lub idiopatyczną kardiomiopatią rozstrzeniową (DCM). METODY I WYNIKI: Przebadaliśmy kohortę 97 niespokrewnionych pacjentów z ARVC i 257 pacjentów z DCM pod kątem mutacji PLN pod kątem mutacji PLN i oceniliśmy ich charakterystykę kliniczną. PLN R14del zidentyfikowano u 12 (12%) pacjentów z ARVC i u 39 (15%) pacjentów z DCM pacjentów. Analiza haplotypów ujawniła wspólnego założyciela, którego wiek szacuje się na między 575 a 825 lat. Elektrokardiogram niskonapięciowy występował u 46% nosicieli R14del. nosicieli R14del. W porównaniu z pacjentami z DCM R14del, pacjenci z DCM R14del+ częściej częściej wykazywali odpowiednie wyładowanie wszczepialnego kardiowertera-defibrylatora (47% vs. 10%, P < 0,001), przeszczep serca (18% vs. 2%, P < 0,001), i nagły zgon sercowy (SCD) w wywiadzie rodzinnym w wieku < 50 lat (36% vs. 16%, P , P = 0.007). Zaobserwowaliśmy podobny wzorzec u pacjentów z ARVC, chociaż nie był istotny statystycznie. Średni wiek 26 członków rodziny, którzy zmarli zmarłych z powodu SCD wynosił 37,7 roku. Immunohistochemia w dostępnych próbkach mięśnia sercowego ujawniła brak/obniżony poziom plakoglobiny w krążkach międzykomorowych w pięciu z siedmiu (71%) próbek R14del+ ARVC, ale tylko w jednej z dziewięciu (11%) próbek R14del+ DCM (P = 0,03). WNIOSKI: Mutacja założycielska PLN R14del jest obecna u znacznej liczby pacjentów, u których klinicznie zdiagnozowano DCM lub ARVC. Pacjenci R14del+, u których zdiagnozowano z DCM wykazywali fenotyp arytmogenny, a SCD w młodym wieku może być objawem prezentującym objawem. Wyniki te potwierdzają koncepcję "arytmogennej kardiomiopatii". kardiomiopatii arytmogennej". --- Pompa wapniowa siateczki sarkoplazmatycznej (SERCA) i jej regulator, fosfolamban, są niezbędnymi składnikami kurczliwości serca. Fosfolamban moduluje kurczliwość poprzez hamowanie SERCA, a proces ten jest dynamicznie regulowany przez stymulację β-adrenergiczną i fosforylację fosfolambanu. W niniejszym artykule ujawniamy mechanistyczny wgląd w to, w jaki sposób cztery dziedziczne mutanty fosfolambanu, Arg(9) do Cys, Arg(9) do Leu, Arg(9) do His i Arg(14) zmieniają regulację SERCA. Delecja Arg(14) zakłóca motyw rozpoznawania kinazy białkowej motyw rozpoznawania kinazy białkowej A, który znosi fosforylację fosfolambanu i skutkuje konstytutywnym hamowaniem SERCA. Mutacja Arg(9) powoduje bardziej złożone zmiany w funkcji, gdzie podstawienia hydrofobowe, takie jak cysteina i leucyna leucyna eliminują zarówno hamowanie SERCA, jak i fosforylację fosfolambanu, podczas gdy podstawienie aromatyczne, takie jak histydyna, selektywnie zakłóca fosforylację. Wykazaliśmy, że rola Arg(9) w funkcji fosfolambanu jest wielopłaszczyznowa: jest ważna dla hamowania SERCA, zwiększa wydajność fosforylacji i ma kluczowe znaczenie dla kinazy białkowej A w kontekście pentameru fosfolambanu. Biorąc pod uwagę synergistyczne konsekwencje dla kurczliwości, nie jest zaskakujące, że mutanty powodują śmiertelną, dziedziczną kardiomiopatię rozstrzeniową. --- Regulacyjne oddziaływanie fosfolambanu (PLN) z Ca(2+)-ATPazą kontroluje wychwyt wapnia do retikulum sarkoplazmatycznego, modulując kurczliwość mięśnia sercowego kurczliwość mięśnia sercowego. Mutacja missense w domenie cytoplazmatycznej PLN (R9C) wywołuje kardiomiopatię kardiomiopatię rozstrzeniową u ludzi, prowadzącą do przedwczesnej śmierci. Wykorzystując technik biochemicznych i biofizycznych zarówno in vitro, jak i w żywych komórkach. komórkach, wykazujemy, że mutacja R9C zwiększa stabilność pentamerycznego zespołu PLN poprzez tworzenie mostków dwusiarczkowych, zapobiegając jego wiązaniu do Ca(2+)-ATPazy, jak również fosforylacji przez kinazę białkową A. Efekty te są wzmocnione w warunkach utleniających. w warunkach utleniających, co sugeruje, że stres oksydacyjny może nasilać kardiotoksyczne działanie mutanta PLN(R9C). Wyniki te ujawniają regulacyjną rolę pentameru PLN w homeostazie wapnia, wykraczającą poza wcześniej hipotezowaną rolę pasywnego magazynowania aktywnych monomerów. --- W chorobach ludzkich i eksperymentalnych modelach zwierzęcych, upośledzona obsługa Ca(2+) w kardiomiocytach kardiomiocytach jest powszechnie przypisywane upośledzonej funkcji retikulum sarkoplazmatycznego (SR). (SR). U myszy zaburzenie genu PLN kodującego fosfolamban (PLN) lub ekspresja dominująco-ujemnych mutantów PLN poprawia funkcję SR i serca, ale skutki mutacji PLN u ludzi są nieznane. Tutaj, mutacja punktowa T116G mutacja, zastępująca kodon zakończenia dla Leu-39 (L39stop), została zidentyfikowana w dwóch rodzinach z dziedziczną niewydolnością serca. Osoby heterozygotyczne wykazywały przerost bez zmniejszonej kurczliwości. Co uderzające, u obu osób homozygotycznych dla L39stop rozwinęła się kardiomiopatia rozstrzeniowa i niewydolność serca. niewydolność serca, wymagająca przeszczepu serca w wieku 16 i 27 lat. Ponad 50% mRNA PLN i brak wykrywalnego białka PLN odnotowano w jednym eksplantowanym sercu. sercu. Ekspresja rekombinowanego PLN-L39stop w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK) 293 i kardiomiocytach dorosłych szczurów nie wykazała hamowania przez PLN SR Ca(2+)-ATPazy i praktycznie brak stabilnej ekspresji PLN; gdzie PLN był ekspresji PLN, była ona błędnie kierowana do cytozolu lub błony plazmatycznej. Wyniki te opisują naturalnie występującą mutację utraty funkcji ludzkiego PLN (PLN null). W przeciwieństwie do zgłaszanych korzyści z ablacji PLN w niewydolności serca u myszy, u ludzi pozbawieni PLN rozwijają śmiertelną kardiomiopatię rozstrzeniową. --- Arytmogenna dysplazja prawej komory / kardiomiopatia (ARVD / C) jest często jest często związana z mutacjami desmosomalnymi. Jednakże, mogą być w nią zaangażowane mutacje nondesmosomalne. zaangażowane. Celem tego badania była ocena udziału mutacji mutacji genu fosfolambanu (PLN) do rozpoznania ARVD/C zgodnie ze zmienionymi kryteriami grupy zadaniowej 2010 (TFC). U 142 holenderskich pacjentów (106 mężczyzn, średni wiek 51 ± 13 lat) z potwierdzoną ARVD/C (spełnienie 2010 TFC dla diagnozy), 5 znanych genów desmosomalnych (PKP2, DSP, DSC2, DSG2 i JUP) oraz niedesmosomalnego genu PLN. zostały przebadane. Po analizie genetycznej porównano cechy fenotypowe nosicieli mutacji desmosomalnych w porównaniu z nosicielami mutacji PLN. U 59 ze 142 pacjentów z ARVD/C (42%) nie stwierdzono mutacji desmosomalnej. U 19 ze 142 pacjentów (13%) stwierdzono mutację założycielską PLN PLN zidentyfikowano mutację założycielską c.40_42delAGA (p.Arg14del). Nosiciele mutacji PLN częściej mieli niskonapięciowe elektrokardiogramy (p = 0,004), odwrócone załamki T w odprowadzeniach od V4 do V6 (p <0,001) oraz dodatkowe zaburzenia strukturalne (p = 0,007) lub funkcjonalne (p = 0,017) upośledzenie lewej komory, podczas gdy nosiciele mutacji desmosomalnej nosiciele mutacji desmosomalnych mieli więcej pojedynczych nieprawidłowości prawej komory. Zmieniona TFC obejmowała 21 ze 142 pacjentów z potwierdzoną ARVD/C, którzy nie spełniali wymagań TFC z 1994r, w tym 7 nosicieli mutacji PLN. Podsumowując, istnieje znaczny znaczny udział mutacji PLN w diagnozie ARVD/C według TFC z 2010 roku. U 32% pacjentów (19 z 59) z genetycznie niewyjaśnionym potwierdzonym ARVD/C, ta mutacja nondesmosomalną mutację. Nosiciele mutacji PLN mają cechy ARVD/C cechy charakterystyczne dla ARVD/C, w tym istotne zajęcie prawej komory i dodatkowo częściej elektrokardiogramy niskonapięciowe, odwrócone załamki T w lewym odprowadzeniu przedsercowym i w lewym odprowadzeniu przedsercowym i zajęcie lewej komory. --- Białka cyklu Ca(2+) siateczki sarkoplazmatycznej są kluczowymi regulatorami kurczliwości serca. kurczliwości serca, a zmiany we właściwościach cyklu Ca(2+) retikulum sarkoplazmatycznego wykazano, że są przyczyną rodzinnych kardiomiopatii. Poprzez badania genetyczne pacjentów z kardiomiopatią rozstrzeniową, zidentyfikowaliśmy wcześniej delecję argininy 14 (PLN-R14Del) w regionie kodującym fosfolamban (PLN). fosfolambanu (PLN) w dużej rodzinie z dziedziczną niewydolnością serca. Nie zidentyfikowano zidentyfikowano osób homozygotycznych. W średnim wieku u osób heterozygotycznych rozwinęło się poszerzenie lewej komory, dysfunkcja skurczowa i epizodyczne arytmie komorowe, a w niektórych przypadkach jawna niewydolność serca. Transgeniczne myszy nadeksprymujące zmutowany PLN-R14Del odwzorowywały ludzką kardiomiopatię wykazując podobne nieprawidłowości histopatologiczne i przedwczesną śmierć. Koekspresja normalnego i zmutowanego PLN-PLN w komórkach HEK-293 powodowała sarkoplazmatycznego retikulum Ca(2+)-ATPazy. Dominujący efekt mutacji PLN-R14Del nie mógł być w pełni usunięty, nawet po fosforylacji przez kinazę białkową A. Tak więc, przez przewlekłą supresję retikulum sarkoplazmatycznego Ca(2+)-ATPazy, nieodwracalna superinhibicyjna funkcja mutanta PLN-R14Del może prowadzić do dziedzicznej kardiomiopatii rozstrzeniowej i przedwczesnej śmierci zarówno u ludzi, jak i myszy. zarówno u ludzi, jak i myszy.
Jakie mutacje phopspholamban wykryto u pacjentów z kardiomiopatią?
Mutację PLN R14del [lub c.40_42delAGA(p.Arg14del)] zidentyfikowano u 12 (12%) pacjentów z ARVC i u 39 (15%) pacjentów z DCM. Inną mutacją PLN jest mutacja punktowa T116G, zastępująca kodon zakończenia dla Leu-39 (L39stop) i została zidentyfikowana w dwóch rodzinach z dziedziczną niewydolnością serca. Dziedziczne mutacje fosfolambanu, takie jak Arg(9) na Cys, Arg(9) na Leu, Arg(9) na His, powodują śmiertelną, dziedziczną kardiomiopatię rozstrzeniową. W szczególności u dwóch pacjentów stwierdzono mutację G-T missense w nukleotydzie G26, która koduje podstawienie Arg-Leu w kodonie 9 (R9L), a u jednego pacjenta mutację G-A missense w tym samym nukleotydzie, która koduje podstawienie Arg-His w kodonie 9 (R9H). Mutacja missense w domenie cytoplazmatycznej PLN (R9C) wywołuje kardiomiopatię rozstrzeniową u ludzi, prowadząc do przedwczesnej śmierci.