HIV-1 Tat wiąże ludzką CyclinT1 i rekrutuje kompleks CDK9/P-TEFb do wirusowego TAR RNA na etapie, który łączy fosforylację C-końcowej domeny (CTD) polimerazy RNA II (RNAPII) Ser 2 z wydłużeniem transkrypcji. Poprzednie badania sugerowały związek między Tat a czynnikami splicingu pre-mRNA. Tutaj pokazujemy że związane ze splicingiem białko oddziałujące z c-Ski, SKIP, jest wymagane do transaktywacji Tat in vivo i Tat in vivo i stymuluje wydłużenie transkrypcji HIV-1, ale nie inicjację, in vitro. ale nie inicjację, in vitro. SKIP wiąże się z kompleksami CycT1:CDK9/P-TEFb i Tat:P-TEFb w ekstraktach jądrowych i oddziałuje z rekombinowanymi kompleksami Tat:P-TEFb:TAR RNA in vitro, wskazując, że może działać poprzez powstające RNA, aby przezwyciężyć przez RNAPII. SKIP wiąże się również z białkami U5snRNP i tri-snRNP110K w ekstraktach jądrowych i ułatwia rozpoznawanie alternatywnego, specyficznego dla Tat in vivo. Wpływ SKIP na elongację transkrypcji, wiązanie do P-TEFb i splicing są pośredniczone przez domenę SNW. Transaktywacji HIV-1 Tat towarzyszy rekrutacja P-TEFb, SKIP i tri-snRNP110K. tri-snRNP110K do zintegrowanego promotora HIV-1 in vivo, podczas gdy U5snRNPs wiążą się tylko z transkrybowanym regionem kodującym. Odkrycia te sugerują, że SKIP odgrywa niezależną rolę w wydłużaniu transkrypcji i splicingu pre-mRNA. --- Alternatywny splicing stał się kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do różnorodności proteomu, podkreślając znaczenie zrozumienia jego regulacji. W ostatnich latach stało się oczywiste, że splicing jest głównie kotranskrypcyjny, co pozwala na między tymi dwoma procesami jądrowymi. Omawiamy niektóre z powiązań między transkrypcją a splicingiem, ze szczególnym uwzględnieniem roli odgrywanej przez elongację transkrypcji w regulacji alternatywnych zdarzeń splicingowych, a w szczególności w szczególności kinetyczny model regulacji alternatywnego splicingu. Ten artykuł jest częścią wydania specjalnego zatytułowanego: RNA polymerase II Transcript Elongation. --- Kotranskrypcyjne ładowanie czynników przetwarzania RNA do powstającego RNA ułatwia wydajną ekspresję genów. Mechanizmy odpowiedzialne za sprzężenie transkrypcji i RNA nie są dobrze zdefiniowane, ale kompleks Saccharomyces cerevisiae TREX stanowi przykład. TREX składa się z subkompleksu THO, który wiąże się z polimerazą RNA II i jest wymagany do normalnej elongacji transkrypcji. wydłużania transkrypcji. THO wiąże się z białkami zaangażowanymi w splicing i eksport RNA, tworząc większy kompleks TREX. tworząc większy kompleks TREX. W związku z tym montaż TREX fizycznie łączy elongację transkrypcji z czynnikami przetwarzania RNA. Czy gatunki metazoiczne z długimi genami zawierającymi introny wykorzystują podobny mechanizm, nie zostało podobny mechanizm. Tutaj pokazujemy, że ludzki hHpr1/p84/Thoc1 wiąże się z elongującą polimerazą RNA II oraz czynnikiem splicingu i eksportu RNA UAP56 w nienaruszonych komórkach. Pozbawienie hHpr1/p84/Thoc1 powoduje defekty wydłużania transkrypcji i związane z tym fenotypy komórkowe podobne do powiązane fenotypy komórkowe podobne do tych obserwowanych u drożdży z niedoborem THO. Wnioskujemy, że hHpr1/p84/Thoc1 reguluje wydłużanie transkrypcji i może uczestniczyć w kompleksie białkowym funkcjonalnie analogicznym do drożdżowego TREX, fizycznie łączącym wydłużającą się polimerazę RNA II z czynnikami przetwarzania RNA. --- Sprzężenie między transkrypcją a przetwarzaniem RNA jest kluczowym mechanizmem regulacji genów. mechanizm regulacji genów. Tutaj używamy immunoprecypitacji chromatyny do wykrywania zależnej od transkrypcji akumulacji prekursorowych czynników splicingowych mRNA (pre-mRNA) hnRNP A1, U2AF65 oraz U1 i U5 snRNP na zawierającym intron ludzkim genie FOS gen. Czynniki te były słabo wykrywane na bezintronowych genach szoku cieplnego i histonów genach szoku termicznego i histonowych, co sprzeciwia się bezpośredniej rekrutacji przez polimerazę RNA II (Pol II) lub kompleks wiążący czapeczkę in vivo. Jednakże, zaobserwowano interakcję zależną od RNA między U2AF65 i aktywnymi formami Pol II może stabilizować wiązanie U2AF65 do RNA zawierającego introny. Przeprowadzamy immunoprecypitację chromatyna-RNA i pokazujemy, że pre-mRNA FOS ulega kotranskrypcyjnemu splicingowi. W szczególności, inhibitor inhibitor topoizomerazy I kamptotecyna, która zatrzymuje wydłużanie Pol II, zwiększa akumulację kotranskrypcyjnego czynnika splicingowego i równolegle splicing równolegle. Stanowi to bezpośredni dowód na kinetyczne powiązanie między transkrypcją, rekrutacją czynników splicingowych i katalizą splicingu. --- Ekspresja genów eukariotycznych obejmuje ścisłą koordynację między transkrypcją i splicingiem pre-mRNA; jednak czynniki odpowiedzialne za tę koordynację pozostają pozostają niekompletnie zdefiniowane. Tutaj zbadaliśmy genetyczne, funkcjonalne i biochemiczne interakcje interakcje prawdopodobnego koordynatora, Npl3, białka podobnego do SR w Saccharomyces cerevisiae, które, jak niedawno wykazaliśmy, jest wymagane do skutecznej ko-transkrypcji rekrutacji maszynerii splicingowej. Zbadaliśmy przestrzeń interakcji genetycznych NPL3 i zaobserwowaliśmy znaczące wzbogacenie genów zaangażowanych w modyfikację histonów i przebudowę chromatyny. modyfikację histonów i przebudowę chromatyny. W szczególności odkryliśmy, że Npl3 genetycznie oddziałuje zarówno z Bre1, który mono-ubikwitynuje histon H2B jako jako część kompleksu RAD6, oraz Ubp8, de-ubikwitynazą kompleksu SAGA. Na Na poparcie tych danych genetycznych pokazujemy, że Bre1 fizycznie oddziałuje z Npl3 w sposób niezależny od RNA. Ponadto, stosując mikromacierz splicingową obejmującą cały genom mikromacierzy, odkryliśmy, że znany defekt splicingu szczepu pozbawionego Npl3 jest zaostrzony przez delecję BRE1 lub UBP8, zjawisko fenokopiowane przez mutację punktową mutacja w H2B, która znosi ubikwitynację. Co ciekawe, nawet w obecności obecności NPL3 typu dzikiego, delecja BRE1 wykazuje łagodny defekt splicingu i wywołuje defekt wzrostu w połączeniu z delecjami wczesnych i późnych czynników splicingowych. czynników. Podsumowując, nasze dane ujawniają związek między Npl3 a szeroką gamą czynników chromatynowych i rozległą gamą czynników chromatynowych i opisują nieoczekiwany funkcjonalny związek między ubikwitynacją histonu H2B a splicingiem pre-mRNA. --- Ostatnie eksperymenty ChIP wskazują, że składanie spliceosomu i splicing mogą zachodzić kotranskrypcyjnie w S. cerevisiae. Jednak tylko kilka genów zostało i wszystkie mają długie drugie eksony. Aby rozszerzyć te badania, przeanalizowaliśmy geny zawierające introny o różnych długościach drugiego eksonu przy użyciu ChIP, a także a także tablice kafelkowania całego genomu (ChIP-CHIP). Dane wskazują, że rekrutacja U1 snRNP jest niezależna od długości eksonu. Rekursywne konstrukty splicingowe, które odłączają rekrutację U1 od transkrypcji, sugerują, że kotranskrypcyjna rekrutacja U1 przyczynia się do optymalnej wydajności splicingu. W przeciwieństwie do tego, rekrutacja U2 snRNP jak również splicing kotranskrypcyjny, jest niewystarczający w przypadku genów z krótkim drugim eksonem. eksonach genów. Szacujemy, że > lub =90% endogennego splicingu drożdży jest potranskrypcyjny, co jest zgodne z analizą potranskrypcyjnych związanego z snRNP pre-mRNA. --- Alternatywny splicing pre-mesjańskiego RNA jest kluczową cechą ekspansji transkryptomu w komórkach eukotycznych. w komórkach eukariotycznych, ale jego regulacja jest słabo poznana. Montaż spliceosomu zachodzi współtranskrypcyjnie, co stwarza możliwość, że struktura DNA może bezpośrednio wpływać na alternatywny splicing. Wspierając taki związek ostatnie doniesienia zidentyfikowały różne wzorce metylacji histonów wzorce, podwyższone obłożenie nukleosomów i wzbogaconą metylację DNA w eksonach w stosunku do intronów. Co więcej, szybkość wydłużania transkrypcji została z alternatywnym splicingiem. Tutaj przedstawiamy pierwsze dowody na to, że białko wiążące białko wiążące DNA, czynnik wiążący CCCTC (CTCF), może promować włączenie słabego w górę eksonów poprzez pośredniczenie w lokalnej pauzie polimerazy RNA II zarówno w ssaczym modelowym systemie alternatywnego splicingu, CD45, jak i w całym genomie. Dalej pokazujemy że wiązanie CTCF do eksonu 5 CD45 jest hamowane przez metylację DNA, co prowadzi do wzajemnego wpływu na integrację eksonu 5. Odkrycia te dostarczają mechanistycznych podstawę dla rozwojowej regulacji wyniku splicingu poprzez dziedziczne znaki epigenetyczne. --- Montaż spliceosomu i / lub splicing powstającego transkryptu może mieć kluczowe znaczenie dla prawidłowej ekspresji izoform i regulacji genów u wyższych eukariontów. Niedawno wykazaliśmy, że splicing kotranskrypcyjny zachodzi wydajnie u Drosophila, ale ale nie ma porównywalnych danych dotyczących splicingu powstającego w całym genomie od ssaków. Aby zapewnić to porównanie, analizujemy niedawno wygenerowany, wysokoprzepustowy zestaw danych sekwencjonowania zestaw danych sekwencjonowania RNA powstającego w wątrobie myszy, pierwotnie badany pod kątem regulacji transkrypcji okołodobowej. regulacji transkrypcji. Kotranskrypcyjny splicing jest około dwukrotnie mniej wydajne w wątrobie myszy niż u Drosophila, tj. poziomy powstających intronów w stosunku do poziomów eksonów wynosi ∼0,55 u myszy w porównaniu do 0,25 u muchy. Dodatkową różnica między gatunkami polega na tym, że tylko splicing kotranskrypcyjny myszy jest optymalne, gdy długość 5'-egzonu wynosi od 50 do 500 bp, a długość intronu nie koreluje z wydajnością splicingu, zgodnie z definicją eksonu. Podobna analiza zależności długości intronu i eksonu u muchy jest bardziej spójna z definicją intronu. definicją intronu. Z tymi różnicami kontrastuje wiele podobieństw między tymi dwoma systemami: Alternatywnie adnotowane introny są mniej wydajnie splicowane kotranskrypcyjnie niż introny konstytutywne, a introny genów geny z pojedynczym intronem są mniej wydajnie splicowane niż introny z genów z wieloma intronami. niż introny genów wielointronowych. Najbardziej uderzającą wspólną cechą jest pozycja intronu: Kotranskrypcyjne jest znacznie bardziej wydajne, gdy introny znajdują się daleko od końców 3' ich genów. genów. Dodatkowo, bezwzględna długość genu koreluje pozytywnie z z wydajnością splicingu kotranskrypcyjnego niezależnie od lokalizacji i położenia intronów i pozycji intronu, zarówno u much, jak i u myszy. Efekty długości genu i odległości wskazują, że więcej "czasu rodzenia się" prowadzi do większej kotranskrypcji w obu systemach. --- Aby określić częstość występowania kotranskrypcyjnego splicingu u Drosophila, zsekwencjonowaliśmy sekwencjonowaliśmy powstające transkrypty RNA z komórek S2 Drosophila, a także z głów głowy Drosophila. Osiemdziesiąt siedem procent badanych intronów wykazuje >50% kotranskrypcyjnego splicingu. kotranskrypcyjny splicing. Pozostałe 13% jest splicingiem kotranskrypcyjnym słabo lub powoli, przy czym ∼3% jest prawie całkowicie zatrzymywane w powstającym pre-mRNA. Chociaż poszczególne introny wykazywały niewielkie, ale statystycznie istotne różnice w wydajności splicingu, zaobserwowano podobne globalne poziomy splicingu z obu źródeł. Co ważne, introny o niskiej kotranskrypcyjnej wydajności splicingu są obecne w tym samym pierwotnym transkrypcie z wydajnie splicingowanymi intronami, co wskazuje na intronami, co wskazuje, że splicing jest specyficzny dla intronów. Analiza wskazuje również wskazuje również, że splicing kotranskrypcyjny jest mniej wydajny w przypadku pierwszych intronów, dłuższych intronów i intronów oznaczonych jako alternatywne. Wreszcie, komórki S2 wyrażające powolny mutant RpII215(C4) wykazują znacznie mniejszą retencję intronów niż komórki S2 typu dzikiego. --- Tutaj przedstawiamy rozwój i wdrożenie genetycznego badania przesiewowego w całym genomie genetycznego w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae, który łączy wysokowydajny wzrost szczepu, zrobotyzowaną izolację RNA i syntezę cDNA oraz ilościową PCR, aby umożliwić solidne określenie poziomu prawie każdego komórkowego RNA na tle ~5 500 różnych mutantów. Jako wstępny test tego podejścia, staraliśmy się zidentyfikować pełny zestaw czynników, które wpływających na splicing pre-mRNA. Coraz więcej dowodów sugeruje związek między splicingiem pre-mRNA a innymi szlakami komórkowymi, w tym chromatyną chromatyną, transkrypcją i przetwarzaniem końca 3', jednak w wielu przypadkach specyficzne białka białka odpowiedzialne za funkcjonalne łączenie tych szlaków pozostają niejasne. Co więcej, nie jest jasne, czy wszystkie szlaki sprzężone ze splicingiem zostały zidentyfikowane. zostały zidentyfikowane. Zgodnie z oczekiwaniami, nasze podejście z dużą czułością wykrywa akumulację pre-mRNA w zdecydowanej większości szczepów zawierających mutacje w znanych czynnikach splicingowych. czynnikach splicingowych. Co ciekawe, znaleziono jednak kilku dodatkowych kandydatów powodujących wzrost poziomu pre-mRNA podobny do tego obserwowanego dla kanonicznych mutantów mutantów splicingowych, z których żaden nie był wcześniej zaangażowany w szlak splicingowy. szlaku splicingowym. Zamiast tego, kilka z tych czynników zostało wcześniej przypisanych do odgrywać role w przebudowie chromatyny, przetwarzaniu końca 3' i innych nowych kategoriach. kategoriach. Dalsza analiza tych czynników przy użyciu mikromacierzy wrażliwych na splicing mikromacierzy potwierdza, że delecja Bdf1, czynnika, który łączy transkrypcję inicjację transkrypcji i przebudowę chromatyny, prowadzi do globalnego defektu splicingu, dostarczając dowodów na nowy związek między splicingiem pre-mRNA a tym składnikiem kompleksu SWR1. Dla kontrastu, mutacje w czynnikach przetwarzania końca 3' takich jak Cft2 i Yth1 również skutkują defektami splicingu pre-mRNA, chociaż tylko dla podzbioru transkryptów, co sugeruje, że montaż spliceosomu w S. cerevisiae może bardziej przypominać modele definiowania eksonów u ssaków. Więcej szerzej, nasza praca demonstruje zdolność tego podejścia do identyfikacji nowych regulatorów różnych komórkowych RNA. --- Splicing jest ważnym procesem regulacji ekspresji genów u eukariontów eukariontów i ma ważne powiązania funkcjonalne z innymi etapami ekspresji genów. ekspresji genów. Dwa przykłady tych powiązań obejmują Ceg1, składnik enzymu zamykającego mRNA i czynniki elongacji chromatyny Spt4-5, z których oba odgrywają rolę w ekspresji genów. niedawno wykazano, że odgrywają rolę w normalnym splicingu kilku genów w drożdżach Saccharomyces drożdży Saccharomyces cerevisiae. Wykorzystując podejście genomowe do scharakteryzowania roli Spt4-5 w splicingu, wykorzystaliśmy mikromacierze DNA wrażliwe na splicing do zidentyfikować określone zestawy genów, które są nieprawidłowo splicingowane w mutantach ceg1, spt4 i spt5 mutantach. W kontekście złożonego, zagnieżdżonego projektu eksperymentalnego obejmującego 22 hybrydyzacje macierzy dye-swap, obejmujące zarówno biologiczne, jak i techniczne replikacje, zastosowaliśmy pięć odpowiednich modeli statystycznych do oceny różnicowej ekspresji między typem dzikim a mutantami. Aby udoskonalić wybór genów o zróżnicowanej ekspresji, następnie zastosowaliśmy solidne podejście do syntezy modeli podejście, Ekspresja różnicowa poprzez syntezę odległości, aby zintegrować wszystkie pięć modeli. modeli. Wynikowa lista genów o zróżnicowanej ekspresji została następnie przeanalizowana pod kątem wybranych atrybutów: stwierdziliśmy, że geny o wysokiej transkrypcji geny z długimi intronami były najbardziej wrażliwe na mutacje spt. Potwierdzenie QPCR różnicowej ekspresji zostało ustalone dla ograniczonej liczby genów ocenianych. W tym artykule przedstawiamy technologię macierzy splicingowych, a także potężną, ale ogólną metodologię statystyczną do oceny ekspresji różnicowej w kontekście rzeczywistego, złożonego projektu eksperymentalnego. Nasze wyniki sugerują, że kompleks Spt4-Spt5 może pomóc koordynować splicing z transkrypcją w warunkach, które stanowią wyzwanie kinetyczne dla spliceosomu spliceosomu. --- Transkrypcja i splicing pre-mRNA są niezwykle złożonymi procesami wielocząsteczkowymi procesy, które obejmują interakcje białko-DNA, białko-RNA i białko-białko interakcje. Splicing zachodzi w bliskim sąsiedztwie genów i często jest często kotranskrypcyjny. Jest to zgodne z dowodami na to, że oba procesy są skoordynowane, a w niektórych przypadkach funkcjonalnie sprzężone. Niniejszy przegląd koncentruje się na cis- i trans-czynników regulujących transkrypcję, na konstytutywnym i alternatywnym splicingu. konstytutywnego i alternatywnego splicingu. Omawiamy również możliwe funkcje splicingu domeny C-końcowej (CTD) największej podjednostki polimerazy RNA II (pol II). największej podjednostki, której udział w innych kluczowych reakcjach przetwarzania pre-mRNA (zamykanie i rozszczepianie/poliadenylacja) jest dobrze udokumentowany. Najnowsze dowody wskazują, że na wydłużenie transkrypcji i splicing można wpływać wzajemnie: Szybkość elongacji kontroluje alternatywne splicingi, a czynniki splicingowe mogą z kolei modulować elongację Pol II. Obecność czynników transkrypcyjnych w spliceosomie i istnienie białek, takich jak koaktywator PGC-1, o podwójnej aktywności w splicingu i transkrypcji może wyjaśnić powiązania między procesami i dodać nowy poziom złożoności do regulacji ekspresji genów u eukariontów. ekspresji genów u eukariontów. --- Splicing i alternatywny splicing są zaangażowane w ekspresję większości ludzkich genów. genów, odgrywając kluczową rolę w różnicowaniu, progresji cyklu komórkowego i rozwoju. rozwoju. Nieprawidłowa regulacja splicingu jest często związana z chorobami, co wymaga lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw regulacji splicingu. regulacji splicingu. Zgromadzone dowody sugerują, że wiele czynników trans-działających i i elementów regulujących cis działają razem, aby określić specyficzne dla tkanki wzorce splicingu specyficzne dla tkanki. Ponadto, ponieważ splicing jest często kotranskrypcyjny, wyłania się złożony obraz, w którym regulacja splicingu w którym regulacja splicingu zależy nie tylko od równowagi wiązania czynnika splicingowego czynników splicingowych z ich docelowymi miejscami pre-mRNA, ale także od związanych z transkrypcją, takich jak rekrutacja białek do mechanizmów i kinetyka elongacji. Dodając więcej złożoności do sieci regulacji splicingu, najnowsze dowody wskazują, że struktura chromatyny jest kolejną warstwą regulacji, która może działać poprzez różne mechanizmy. Obejmują one od regulacji elongacji polimerazy RNA II, która ostatecznie determinuje decyzje o splicingu, do do rekrutacji czynników splicingowych przez specyficzne znaczniki histonowe. Chromatyna może być zaangażowana nie tylko w alternatywną regulację splicingu, ale także w ale także w konstytutywne rozpoznawanie eksonów. Co więcej, stwierdzono, że splicing jest niezbędny do prawidłowego "zapisu" określonych sygnatur chromatyny, dając dalsze wsparcie mechanistyczne dla funkcjonalnych powiązań między splicingiem, transkrypcją i strukturą chromatyny. Te powiązania między konfiguracją chromatyny a splicingiem podnoszą intrygującą możliwość istnienia pamięci dla wzorców splicingu, które mogą być dziedziczone poprzez modyfikacje epigenetyczne.
Czy transkrypcja i splicing są ze sobą powiązane?
Tak. Istnieją mocne dowody na to, że splicing i transkrypcja są ściśle powiązane u metazoanów, a badania całego genomu pokazują, że większość splicingu zachodzi podczas transkrypcji. Struktura chromatyny, dynamika polimerazy RNA i rekrutacja czynników splicingowych przez maszynerię transkrypcyjną to czynniki, które wyjaśniają rolę transkrypcji w regulacji splicingu.