Plazmid pXO1 Bacillus anthracis przenosi geny strukturalne dla trzech białek toksyny wąglika. białek toksyny wąglika, cya (czynnik obrzęku), lef (czynnik śmiertelny) i pag (antygen ochronny). Ekspresja genów toksyn przez B. anthracis jest zwiększona podczas wzrostu w warunkach podwyższonego poziomu CO2. Ten efekt CO2 jest obserwowany tylko w obecności innego genu pXO1, atxA, który koduje transaktywator syntezy toksyny wąglika. syntezy toksyny wąglika. Tutaj pokazujemy, że transkrypcja atxA nie wydaje się różni się w komórkach hodowanych w 5% CO2 w porównaniu z komórkami hodowanymi w powietrzu. Wykorzystując nową wydajną metodę zastępowania genów w B. anthracis, skonstruowaliśmy mutanta mutanta atxA-null, w którym sekwencja kodująca atxA na pXO1 jest zastąpiona kasetą omega km-2. Transkrypcja wszystkich trzech genów toksyn jest zmniejszona w przypadku nieobecności atxA. Gen pag posiada dwa widoczne miejsca startu transkrypcji, P1 i P2; tylko transkrypty z końcami 5' mapującymi do P1 są zmniejszone w mutancie mutanta atxA-null. Analiza delecji regionu promotora pag wskazuje, że region 111 bp przed miejscem P1 jest wystarczający do aktywacji tego transkryptu za pośrednictwem atxA. aktywacji tego transkryptu. Geny cya i lef mają po jednym widocznym miejscu startu transkrypcji. miejsce startu transkrypcji. Transkrypty z końcami 5' mapującymi do tych miejsc nie są wykrywane w mutancie atxA-null. Mutant atxA-null jest awirulentny u myszy. myszy. Co więcej, odpowiedź przeciwciał na wszystkie trzy białka toksyny jest zmniejszona u myszy zakażonych mutantem atxA-null. Dane te sugerują, że produkt genu atxA reguluje również ekspresję genów toksyn podczas infekcji. --- Dwa główne czynniki wirulencji Bacillus anthracis to toksyna trójdzielna i kapsułka poliglutaminianowa, które są kodowane przez geny na dużych plazmidach, pXO1 i pXO2. Geny atxA, zlokalizowany na pXO1, i acpA, zlokalizowany na pXO2, kodują pozytywnie działające białka trans, które są zaangażowane w regulację w regulację produkcji toksyn i kapsułek, w której pośredniczy wodorowęglan. A szczep pochodny wyleczony z pXO1 wytwarzał mniej substancji otoczkowej niż szczep macierzysty niosący zarówno pXO1, jak i pXO2, a elektroporacja szczepu wyleczonego z pXO1 z plazmidem zawierającym sklonowany gen atxA skutkowała zwiększonym poziomem produkcji kapsułek. poziom produkcji kapsułek. Mutant acpA-null został uzupełniony nie tylko przez acpA, ale także gen atxA. Region czapeczki, który jest niezbędny dla kapsułkowania, zawiera trzy geny capB, capC i capA, ułożone w tej kolejności. kolejności. Gen atxA stymulował syntezę kapsydu ze sklonowanego regionu kapsydu. Analiza transkrypcyjna cap poprzez hybrydyzację RNA slot-blot i analizę wykazała, że atxA aktywował ekspresję kapsydów na poziomie transkrypcyjnym. trans na poziomie transkrypcyjnym. Wyniki te wskazują, że występuje w którym gen zlokalizowany na pXO1, atxA, aktywuje transkrypcję genów regionu cap zlokalizowanych na pXO2. Zidentyfikowaliśmy dwa główne miejsca startu transkrypcji miejsca startu transkrypcji, oznaczone jako P1 i P2, zlokalizowane odpowiednio w pozycjach 731 bp i 625 bp, odpowiednio przed kodonem inicjującym translację capB. Transkrypcja zainicjowana z P1 i P2 była aktywowana zarówno przez atxA, jak i acpA, a aktywacja aktywacja wydawała się być stymulowana przez wodorowęglan. Analiza delecji regionu regionu upstream promotora cap ujawniła, że aktywacja zarówno przez atxA, jak i acpA wymagała odcinka DNA o długości 70 bp rozciągającego się przed miejscem P1. Te Wyniki te sugerują, że wzajemne oddziaływanie atxA z genami kodującymi syntezę kapsułek jest spowodowany interakcją produktu genu atxA z sekwencją regulatorową przed cap. --- Geny toksyn Bacillus anthracis, cya, lef i pag, mogą być postrzegane jako regulon. regulon, w którym transkrypcja wszystkich trzech genów jest aktywowana in trans przez ten sam gen regulatorowy ten sam gen regulatorowy, atxA, w odpowiedzi na ten sam sygnał, CO2. W szczepach atxA+ ekspresja genu toksyny jest zwiększona 5- do 20-krotnie w komórkach hodowanych w 5% CO2 w porównaniu do komórek hodowanych w powietrzu. CO2 w stosunku do komórek hodowanych w powietrzu. Transkrypcja genu toksyny wzmocniona CO2 nie jest obserwowana u mutantów atx4-null. Tutaj wykorzystaliśmy dwie niezależne techniki, aby uzyskać dowody na dodatkowe geny regulowane przez atxA pod wpływem CO2. Po pierwsze, całkowite preparaty białkowe z izolatów atxA4+ i atxA hodowanych w 5% CO2 i w powietrzu zostały zbadane za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy. Porównanie uzyskanych wzorów wzorów białek wskazało, że synteza białek nietoksynowych jest pod wpływem wzrost w podwyższonym CO2 i regulator genu toksyny, atxA. Po drugie, wygenerowaliśmy losowe fuzje transkrypcyjne lacZ w B. anthracis z transpozonem Tn917-LTV3. Biblioteki insercji transpozonów zostały przebadane pod kątem mutantów wyrażających beta-geny zależne od CO2 aktywność beta-galaktozydazy zależną od atxA. Analiza sekwencji DNA miejsc insercji transpozonu w 17 mutantach niosących fuzje regulowane przez CO2 i atxA ujawniła 10 mutantów niosących niezależne insercje na 185-kb plazmidzie toksyny pXO1 które nie mapowały się do genów toksyn. Mutanty fuzyjne tcr-lacZ (tcr dla toksyny Tox+, wskazując, że geny te mogą nie być zaangażowane w aktywację genów toksyny wąglika. aktywację genu toksyny wąglika. Nasze dane wskazują na wyraźny związek atxA z ekspresją genów wzmocnioną CO2 u B. anthracis i dostarczają dowodów na to, że atxA reguluje geny inne niż geny strukturalne dla białek toksyny wąglika. --- Ekspresja genów toksyny Bacillus anthracis i czynników wirulencji kapsułki jest zależna od czynnika transkrypcyjnego AtxA. Mechanizm, za pomocą którego AtxA reguluje transkrypcję genów docelowych jest nieznany. Tutaj donosimy, że analizy bioinformatyczne sugerują obecność w AtxA dwóch PTS (fosfoenolopirogronian: system fosfotransferazy cukrowej) domen regulacyjnych (PRD) ogólnie regulowanych przez fosforylację/defosforylację w konserwowanych resztach histydynowych resztach histydyny. Za pomocą podstawień aminokwasowych, które naśladują fosforylację (H do D) lub niefosforylowany (H do A) stan białka, wykazaliśmy, że fosforylacja H199 PRD1 jest prawdopodobnie niezbędna do aktywacji AtxA podczas gdy fosforylacja H379 w PRD2 hamuje transkrypcję genu toksyny. Eksperymenty znakowania in vivo radioaktywnym fosforanem pozwoliły nam zaproponować że H199 i H379 są resztami AtxA podlegającymi regulowanej fosforylacji. Na wykazaliśmy również, że delecja ptsHI, kodującego enzym pośredni HPr i enzymy EI PTS, lub wzrost w obecności glukozy wpływają odpowiednio pozytywnie i negatywnie na aktywność AtxA. Nasze wyniki łączą produkcję czynników wirulencji u B. anthracis z metabolizmem węglowodanów i po raz pierwszy metabolizmem węglowodanów i po raz pierwszy dostarczają mechanistycznego wyjaśnienia aktywności transkrypcyjnej AtxA aktywności transkrypcyjnej. --- Transkrypcja głównych genów wirulencji Bacillus anthracis jest wyzwalana przez CO2, sygnał naśladujący środowisko gospodarza. Plazmid 182-kb, pXO1, przenosi geny toksyny geny toksyny wąglika i geny odpowiedzialne za ich regulację transkrypcji, a mianowicie a mianowicie atxA i pagR, drugi gen operonu pag. AtxA ma znaczący wpływ na fizjologię B. anthracis. Koordynuje aktywację transkrypcji aktywację transkrypcji genów toksyny z aktywacją operonu operonu enzymu biosyntezy kapsułki, zlokalizowanego na drugim plazmidzie wirulencji, pXO2. W B. anthracis syntetyzuje alternatywnie dwa białka warstwy S (Sap i EA1). W fazie wykładniczej "warstwa Sap" jest następnie zastępowana przez faza stacjonarna "warstwa EA1". Transkrypcja genów warstwy S jest kontrolowana przez alternatywne czynniki sigma i Sap działający jako represor transkrypcji eag. Ponadto, in vitro w obecności CO2 i in vivo, AtxA jest częścią sieci regulacyjnej Sap i eag. Tylko eag ulega znaczącej ekspresji w tych warunkach i jest to spowodowane aktywacją eag przez AtxA i represją transkrypcji soku transkrypcję. PagR, a nie sama AtxA, jest bezpośrednim efektorem tej regulacji poprzez wiązanie się z regionami promotorowymi sap i eag. Dlatego PagR pośredniczy wpływ AtxA na eag i sap i jest najbardziej downstreamowym elementem kaskady sygnalizacyjnej zainicjowanej przez AtxA. kaskady sygnalizacyjnej zainicjowanej przez AtxA. Podsumowując, wyniki te wskazują że regulator transkrypcji B. anthracis AtxA kontroluje syntezę trzech składników toksyny. syntezę trzech składników toksyny i elementów powierzchniowych (kapsułka i warstwa S-layer). W ten sposób AtxA jest głównym regulatorem, który koordynuje odpowiedź na sygnały gospodarza gospodarza poprzez orkiestrację pozytywnych i negatywnych kontroli nad genami zlokalizowanymi na wszystkich elementach genetycznych. --- AtxA, unikalne białko regulatorowe o nieznanej funkcji molekularnej, pozytywnie kontroluje ekspresję głównych genów wirulencji Bacillus anthracis. Sekwencja 475 aminokwasów AtxA ujawnia motywy wiążące DNA i regiony podobne do białek związanych z układem fosfoenolopirogronian: węglowodan fosfotransferazą węglowodanową (PTS). Użyliśmy szczepów produkujących natywne i funkcjonalne znakowane epitopem białka AtxA do badania interakcji białko-białko w lizatach komórkowych i roztworach lizatach komórkowych i w roztworach oczyszczonego białka. Oczyszczanie metodą powinowactwa, elektroforeza w niedenaturującym żelu poliakrylamidowym i bis(maleimido)heksan (BMH) ujawniły homo-multimery AtxA. Dimery były najbardziej obfite gatunki. BMH sieciuje dostępne cysteiny w obrębie 13 Å. Aby zlokalizować miejsca interakcji miejsc interakcji, sześć mutantów AtxA zawierających różne podstawienia Cys→Ser przetestowano pod kątem multimeryzacji i sieciowania. Wszystkie mutanty uległy multimeryzacji, ale jedna mutacja, C402S, uniemożliwiała sieciowanie. Zatem BMH wykorzystuje C402 do tworzenia wiązania międzycząsteczkowego wiązania międzycząsteczkowego między białkami AtxA, ale C402 nie jest wymagane do interakcji białko-białko. interakcji białko-białko. C402 znajduje się w regionie wykazującym podobieństwo aminokwasowe do białek enzymu IIB PTS. Motyw AtxA EIIB może funkcjonować w oligomeryzacji białka oligomeryzacji. Wreszcie, kultury hodowane z podwyższonym poziomem CO(2) / wodorowęglanu wykazywały zwiększony stosunek dimerów/monomerów AtxA i zwiększoną aktywność AtxA, w stosunku do kultur hodowanych bez dodanego CO(2) / wodorowęglanu, co sugeruje, że ten sygnał związany z gospodarzem wzmacnia funkcję AtxA poprzez przesunięcie dimeru / monomeru w kierunku stanu dimerycznego. --- TŁO: Po zakażeniu żywiciela ssaków Bacillus anthracis reaguje na gospodarza, a zwłaszcza na podwyższoną temperaturę (37°C) i stężenie wodorowęglanów/CO2 ze zwiększoną ekspresją czynników wirulencji, które obejmują toksyn wąglika i zewnątrzkomórkowej warstwy otoczki. Ta odpowiedź wymaga obecność plejotropowego regulatora AtxA kodowanego przez plazmid wirulencji pXO1. Aby lepiej zrozumieć genetyczne podstawy tej odpowiedzi, wykorzystaliśmy kontrolowany system system in vitro i sekwencjonowanie nowej generacji w celu określenia i porównania profili ekspresji RNA profile ekspresji szczepu rodzicielskiego i izogenicznego szczepu z niedoborem AtxA w układzie czynnikowym 2 × 2 ze środowiskami wzrostu zawierającymi lub pozbawionymi dwutlenku węgla. WYNIKI: Znaleźliśmy 15 genów kodowanych przez pXO1 i 3 geny chromosomalne, które były silnie regulowane przez oddzielne lub synergistyczne działanie AtxA i dwutlenku węgla i dwutlenku węgla. Większość regulowanych genów reagowała zarówno na AtxA, jak i dwutlenek węgla. dwutlenek węgla, a nie tylko na jeden z tych czynników. Co ciekawe, zidentyfikowaliśmy dwa wcześniej nierozpoznane małe RNA, które ulegają wysokiej ekspresji w warunkach fizjologicznych stężeniach dwutlenku węgla w sposób zależny od AtxA. Stwierdzono, że poziomy ekspresji tych dwóch małych RNA były wyższe niż poziomy ekspresji jakiegokolwiek innego genu. innych genów ulegających ekspresji w odpowiedzi na te warunki. Struktura drugorzędowa struktura i przewidywania dotyczące wiązania małych RNA-mRNA dla dwóch małych RNA sugerują że mogą one pełnić ważne funkcje w regulacji wirulencji B. anthracis. WNIOSKI: Większość genów na plazmidzie wirulencji pXO1, które są regulowana przez obecność CO2 lub AtxA oddzielnie, jest również regulowana synergistycznie w obecności obu. Wyniki te wyjaśniają również nowe małe RNA kodowane przez pXO1, które są związane z warunkami wirulencji. --- Ekspresja genu toksyny wąglika u Bacillus anthracis jest zależna od obecności atxA, trans-działającego genu regulatorowego zlokalizowanego na rezydującym plazmidzie 185-kb pXO1. W szczepach atxA+ ekspresja genów toksyn (pag, lef i cya) jest przez dwa fizjologicznie istotne sygnały: podwyższony poziom CO2/węglanu i temperaturę. Aby ustalić, czy zwiększona ekspresja genów toksyn w odpowiedzi na te sygnały odpowiedź na te sygnały jest związana ze zwiększoną ekspresją atxA, my monitorowaliśmy poziomy atxA mRNA i białka AtxA w komórkach hodowanych w różnych warunkach. różnych warunkach. Oczyściliśmy AtxA znakowane histydyną [AtxA(His)] z Escherichia coli i użyliśmy surowicy anty-AtxA(His) do wykrycia AtxA w preparatach białkowych w preparatach białkowych z komórek B. anthracis. AtxA zostało zidentyfikowane jako białko o o pozornej wielkości 56 kDa we frakcjach cytoplazmatycznych komórek B. anthracis. Nasze dane wskazują, że na ekspresję atxA nie ma wpływu poziom CO2/węglanu. Jednak poziom mRNA atxA w stanie stacjonarnym w komórkach hodowanych w podwyższonym stężeniu CO2/węglan w 37 stopniach C jest pięcio- do sześciokrotnie wyższy niż obserwowany w komórkach hodowanych w tych samych warunkach w 28 stopniach C. w tych samych warunkach w temperaturze 28 stopni C. Odpowiednią różnicę zaobserwowano również w białku AtxA. w białku AtxA zaobserwowano również w różnych temperaturach wzrostu. Kiedy atxA został sklonowany na wielokopijnym plazmidzie w B. anthracis, poziomy AtxA odpowiadające liczbie kopii genu atxA. Jednakże, szczep ten produkował znacznie mniej pag mRNA i białka antygenu ochronnego niż szczep rodzicielski szczep rodzicielski zawierający atxA w pojedynczej kopii na pXO1. Wyniki te wskazują, że zwiększona ekspresja AtxA nie prowadzi do odpowiedniego wzrostu ekspresji pag ekspresji. Nasze dane zdecydowanie sugerują, że dodatkowy czynnik (czynniki) jest zaangażowany w regulację pag i że względne ilości takiego czynnika (czynników) i AtxA są ważne dla optymalnej ekspresji genu toksyny.
Który metabolit aktywuje AtxA?
Po zakażeniu ssaków Bacillus anthracis reaguje na sygnały gospodarza, a zwłaszcza na podwyższoną temperaturę (37°C) i stężenie wodorowęglanów/CO2, ze zwiększoną ekspresją czynników wirulencji, które obejmują toksyny wąglika i zewnątrzkomórkową warstwę otoczki. Kultury hodowane z podwyższonym stężeniem CO(2) / wodorowęglanu wykazywały zwiększony stosunek dimeru/monomeru AtxA i zwiększoną aktywność AtxA w porównaniu z kulturami hodowanymi bez dodatku CO(2) / wodorowęglanu, co sugeruje, że ten sygnał związany z gospodarzem wzmacnia funkcję AtxA poprzez przesunięcie równowagi dimeru/monomeru w kierunku stanu dimerycznego. Transkrypcja genu toksyny wzmocniona przez CO2 nie jest obserwowana u mutantów atx4-null. Ogólne dane wskazują na wyraźny związek atxA z ekspresją genów wzmocnioną CO2 u B. anthracis i dostarczają dowodów na to, że atxA reguluje geny inne niż geny strukturalne dla białek toksyny wąglika.