Sarkolipina (SLN) i fosfolamban (PLN) są skutecznymi inhibitorami sarko(endo)plazmowej retikulum Ca(2+)-ATPazy (SERCA). Te homologiczne białka różnią się na swoich końcach N i C: C-końcowy Met-Leu-Leu w PLN jest zastąpiony przez Arg-Ser-Tyr-Gln-Tyr w SLN. Rola C-końcowej sekwencji SLN znakowanej N-końcowa sekwencja SLN znakowana epitopem FLAG (NF-SLN) w retikulum endoplazmatycznym (ER) retencji badano przez transfekcję ludzkich embrionalnych komórek nerki-293 z cDNA kodującym NF-SLN lub serią mutantów NF-SLN, w których C-końcowe aminokwasy były stopniowo usuwane. kwasy były stopniowo usuwane. Immunofluorescencja i immunoblotting transfekowanych komórek transfekowanych komórek przy użyciu przeciwciał anty-FLAG wykazały, że NF-SLN i PLN znakowane na swoim N-końcu epitopem FLAG, nawet w przypadku nadekspresji, były ograniczone do ER. Jednakże, C-końcowe delecje skrócenia SLN, które brakowało RSYQY, nie były zlokalizowane w ER i nie hamowały zależnego od Ca(2+) wychwytu Ca2+ przez SERCA. przez SERCA. Najkrótsze konstrukty delecyjne, NF-SLN 1-22 i NF-SLN 1-23, nie wyrażały stabilnych produktów białkowych. Jednak wszystkie konstrukty cDNA NF-SLN, w tym NF-SLN 1-22 i NF-SLN 1-23, ulegały stabilnej ekspresji i lokalizacji do ER, gdy były koeksprymowane z SERCA2a. Wyniki te pokazują, że subkomórkowa dystrybucja NF-SLN zależy od koekspresji SERCA i jego luminalu, C-końcowej sekwencji RSYQY. Przy użyciu immunoprecypitacji i MS, regulowane glukozą białko 78/BiP i regulowane glukozą białko 94 zostały zidentyfikowane jako białka, które oddziałują z NF-SLN poprzez sekwencję RSYQY. Tak więc, w przypadku braku SERCA, zatrzymanie NF-SLN w ER jest pośredniczone przez jego powiązanie z innymi składnikami poprzez C-końcową sekwencję RSYQY. --- Sarkolipina (SLN) hamuje pompy sarko(endo)plazmowej retikulum Ca(2+)-ATPazy (SERCA) pompy. Aby ocenić fizjologiczne znaczenie SLN w mięśniach szkieletowych, my porównaliśmy kurczliwość mięśni i aktywność SERCA między Sln-null i dzikim typem myszy. Ekspresja białka SLN u myszy typu dzikiego była obfita w mięśniu podeszwowym i czerwonym mięśniu brzuchatym łydki (RG). mięśnia brzuchatego łydki (RG), niska w prostowniku palców długich (EDL) i nieobecna w białego mięśnia brzuchatego łydki (WG). Wskaźniki aktywności SERCA były zwiększone w podeszwie i RG, ale nie w EDL lub WG, z mięśni Sln-null, w porównaniu z typem dzikim. Nie zaobserwowano różnic między mięśniami EDL typu dzikiego i Sln-null w krzywych siła-częstotliwość lub maksymalnych szybkości rozwoju siły (+dF/dt). Maksymalne szybkości relaksacji (-dF/dt) EDL były wyższe w Sln-null niż w typie dzikim w zakresie zakres submaksymalnych częstotliwości stymulacji, ale nie podczas skurczu lub szczytu skurczu tężcowego. W przypadku mięśnia podeszwowego nie zaobserwowano różnic między typem dzikim a Sln-null w szczytowej sile tężcowej lub +dF/dt; jednak krzywe siła-częstotliwość pokazały że szczytowa siła podczas skurczu i skurczu 10-Hz była niższa u Sln-null. Zmiany w krzywej siła-częstotliwość podeszwy odpowiadały szybszemu tempu relaksacji siły przy prawie wszystkich częstotliwościach stymulacji w Sln-null w porównaniu z typem dzikim. Powtarzana tężcowa stymulacja mięśnia płaszczkowatego powodowała wzrost (-dF/dt) w typie dzikim, ale nie w typie Sln-null. w typie dzikim, ale nie w Sln-null. Nie wykryto odpowiedzi kompensacyjnych w analiza innych białek regulatorowych Ca(2+) przy użyciu Western blotting i immunohistochemii lub ekspresji łańcucha ciężkiego miozyny przy użyciu immunofluorescencji. Wyniki te pokazują, że 1) SLN reguluje aktywność Ca(2+)-ATPazy, tym samym regulując kinetykę kurczliwości w co najmniej niektórych mięśniach szkieletowych, 2) funkcjonalne znaczenie SLN jest stopniowane do endogennego poziomu ekspresji SLN, i 3) hamujący wpływ SLN na funkcję SERCA jest łagodzony w odpowiedzi na powtarzające się skurcze, zwiększając w ten sposób szybkość relaksacji. --- Sarkolipina jest nowym regulatorem sercowej sarkoplazmatycznej retikulum Ca2+ ATPazy 2a (SERCA2a) i jest wyrażana obficie w przedsionkach. W tym badaniu zbadaliśmy fizjologiczne znaczenie sarkolipiny w sercu poprzez wygenerowanie modelu myszy model myszy z niedoborem sarkolipiny. Myszy pozbawione sarkolipiny nie wykazują żadnych nieprawidłowości rozwojowych ani patologii serca. Brak sarkolipiny nie modyfikuje poziomu ekspresji innych białek obsługujących Ca2+, w szczególności w szczególności fosfolambanu i jego stanu fosforylacji. Badania wychwytu wapnia wykazały, że w przedsionkach ablacja sarkolipiny spowodowała wzrost powinowactwa pompy SERCA. powinowactwa pompy SERCA do Ca2+ i maksymalnej prędkości wychwytu Ca2+. . Ważnym odkryciem jest to, że ablacja sarkolipiny spowodowała wzrost amplitudy przedsionkowych stanów przejściowych Ca2+, co skutkowało zwiększoną kurczliwością przedsionków. kurczliwości przedsionków. Co więcej, przedsionki myszy pozbawionych sarkolipiny wykazywały stępioną odpowiedź na stymulację izoproterenolem, implikując sarkolipinę jako mediatora odpowiedzi beta-adrenergicznej w przedsionkach. Nasze badanie udokumentowało, że sarkolipina jest kluczowym regulatorem SERCA2a w przedsionkach. Co ważne, nasze dane wykazują istnienie odrębnych modulatorów dla pompy SERCA w przedsionkach i komorach serca. --- Aktywność pompy sarko(endo)plazmowej retikulum Ca(2+)ATPazy (SERCA) jest modulowana przez fosfolamban (PLB) i sarkolipinę (SLN) w mięśniu sercowym i szkieletowym. Ostatnie dane sugerują, że SLN może odgrywać rolę w termogenezie mięśni poprzez promowanie odłączenie pompy SERCA (Lee, A.G. (2002) Curr. Opin. Struct. Biol. 12, 547-554 i Bal, N. C., Maurya, S. K., Sopariwala, D. H., Sahoo, S. K., Gupta, S. C., Shaikh, S. A., Pant, M., Rowland, L. A., Bombardier, E., Goonasekera, S. A., Tupling, A. R., Molkentin, J. D., and Periasamy, M. (2012) Nat. Med. 18, 1575-1579), ale szczegóły mechanistyczne są nieznane. Aby lepiej zdefiniować, w jaki sposób wiązanie SLN do SERCA promuje rozprzęganie SERCA, porównaliśmy SLN i SERCA1 z interakcją PLB w szczegółach. Homo-bifunkcyjny środek sieciujący (1,6-bismaleimidoheksan) zastosowano do wykrycia dynamicznej interakcji białek podczas cyklu SERCA. Nasze badania wykazały, że SLN znacznie różni się od PLB: 1) SLN wpływa przede wszystkim na Vmax wychwytu Ca(2+) za pośrednictwem SERCA, ale nie na powinowactwo pompy do Ca(2+); 2) SLN może wiązać się z SERCA w obecności wysokiej Ca(2+), ale PLB może oddziaływać tylko ze stanem E2 wolnym od Ca(2+) związanego z ATP; i 3) w przeciwieństwie do PLB, SLN oddziałuje z SERCA przez cały cykl kinetyczny i promuje odłączenie pompy SERCA. Używając mutantów transmembranowych SERCA, dodatkowo wykazać, że PLB i SLN mogą wiązać się z tym samym rowkiem, ale oddziałują z innym zestaw reszt na SERCA. Dane te łącznie sugerują, że SLN jest funkcjonalnie różni się od PLB; jego zdolność do interakcji z SERCA w obecności obecność Ca (2+) powoduje odłączenie pompy SERCA i zwiększoną produkcję ciepła i zwiększoną produkcję ciepła. --- Sarkolipina (SLN) jest inhibitorem sarko(endo)plazmowych retikulum Ca(2+)-ATPazy (SERCA) (SERCA) in vitro, ale jej funkcja in vivo nie została zdefiniowana. NF-SLN cDNA (SLN znakowany N-końcowo epitopem FLAG) wprowadzono do mięśnia podeszwowego szczura w jednej kończynie tylnej poprzez wstrzyknięcie plazmidu i elektrotransfer. Western blotting wykazał ekspresję, a koimmunoprecypitacja wykazała fizyczną interakcję między NF-SLN i SERCA2a. Właściwości skurczowe i SERCA2a zostały ocenione i porównane z przeciwległymi mięśniami podeszwowymi, którym wstrzyknięto wektor. mięśni. NF-SLN zmniejszył zarówno szczytową siłę skurczu (P(t)) (123,9 +/- 12,5 w porównaniu do 69,8 +/- 8,9 miliniutonów) i siłę tężcową (P(o)) (562,3 +/- 51,0 vs. 300,7 +/- 56,9 milinewtonów) i zmniejszyły zarówno szybkość skurczu, jak i tężca (+dF/dt) i relaksacji (-dF/dt). Powtarzalna stymulacja (750-ms z częstotliwością 50 Hz raz na 2 s przez 3 min) wykazała, że NF-SLN zwiększała podatność na zmęczenie. podatność na zmęczenie. Te zmiany w funkcji skurczowej zaobserwowano przy braku endogennego fosfolambanu, a NF-SLN nie miał wpływu ani na SERCA2a lub SERCA1a. NF-SLN zmniejszył również maksymalną aktywność transportu Ca(2+) przy pCa 5 o 31% bez znaczącej zmiany pozornego powinowactwa Ca(2+) (6,36 +/- 0,07 w porównaniu do 6,39 +/- 0,08 jednostek pCa). Wyniki te pokazują, że ekspresja NF-SLN upośledza funkcję skurczową mięśni poprzez hamowanie funkcji SERCA i zmniejszając zapasy Ca(2+) w retikulum sarkoplazmatycznym. --- Sarkolipina (SLN) jest kluczowym regulatorem sarko(endo)plazmowej retikulum (SR) Ca(2+)-ATPazy (SERCA), a jej ekspresja jest zmieniona w chorym mięśniu przedsionkowym. mięśnia sercowego. Aby określić dokładną rolę SLN w przedsionkowej homeostazie Ca(2+), opracowaliśmy model myszy z nokautem SLN (sln-/-) i wykazaliśmy, że ablacja SLN zwiększa aktywność pompy SERCA w przedsionkach. Niniejsze badanie ma na celu określenie długoterminowych skutków zwiększonej aktywności SERCA na przebudowę przedsionków u myszy sln-/-. Pomiary transjentów wapnia wykazują wzrost obciążenia przedsionkowego SR Ca(2+) w przedsionku i skurczowych stanów przejściowych Ca(2+). Eksperymenty z zaciskaniem plastrów wykazują aktywację trybu przedniego wymiennika sodowo-wapniowego, zwiększoną aktywność kanału Ca(2+) typu L Ca(2+) i wydłużenie czasu trwania potencjału czynnościowego przy 90% repolaryzacji w przedsionkach. repolaryzacji w miocytach przedsionków myszy sln-/-. Spontaniczne fale Ca(2+), opóźniona depolaryzacja następcza i aktywność wyzwalana są częste w miocytach przedsionków myszy sln-/-. miocytów myszy sln-/-. Ponadto utrata SLN w przedsionkach jest związana z zwiększonym zwłóknieniem śródmiąższowym i zmienioną ekspresją genów kodujących kolagenu i innych białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Nasze wyniki pokazują również, że myszy sln-/- są podatne na arytmie przedsionkowe po starzeniu. Wszystkie te odkrycia wskazują, że ablacja SLN skutkuje zwiększoną aktywnością SERCA i SR Ca(2+), co z kolei może powodować nieprawidłowe wewnątrzkomórkowe Ca(2+) i przebudowę przedsionków. --- ATPaza wapniowa siateczki sarko(endo)plazmatycznej (SERCA) jest regulowana w sposób sposób zależny od tkanki poprzez interakcję z krótkimi integralnymi białkami błony fosfolambanem (PLN) i sarkolipiną (SLN). Chociaż defekty w aktywności SERCA powodują niewydolność serca, mechanizmy regulacyjne narzucane przez PLN i SLN mogą mieć implikacje kliniczne zarówno dla chorób serca, jak i mięśni szkieletowych. i mięśni szkieletowych. PLN i SLN mają znaczną homologię sekwencji w swoich regionach regionach transmembranowych, co sugeruje podobny sposób wiązania z SERCA. Jednakże, w przeciwieństwie do PLN, SLN ma konserwowany C-końcowy ogon luminalny składający się z pięciu aminokwasów ((27)RSYQY), który może przyczyniać się do odrębnego mechanizmu regulacyjnego SERCA. My funkcjonalnie scharakteryzowaliśmy mutanty alaninowe C-końcowego ogona SLN przy użyciu ko-rekonstytuowanych proteoliposomów SERCA i SLN. Odkryliśmy, że Arg(27) i Tyr(31) są niezbędne dla funkcji SLN. Przetestowaliśmy również efekt skróconego wariantu SLN (Arg(27)stop) i rozszerzonych chimer PLN z pięcioma resztami luminalnymi SLN. pięcioma luminalnymi resztami SLN dodanymi do jego C-końca. Forma Arg(27)stop SLN spowodowała utratę funkcji, podczas gdy chimery PLN spowodowały superinhibicją z cechami zarówno PLN, jak i SLN. Na podstawie naszych wyników, proponujemy, aby C-końcowy ogon SLN był odrębną, istotną domeną w regulacji SERCA i że właściwości funkcjonalne ogona SLN mogą być mogą zostać przeniesione do PLN. --- Rola mięśni szkieletowych w termogenezie bez drżenia (NST) nie jest dobrze poznana. dobrze poznana. Tutaj pokazujemy, że sarkolipina (Sln), nowo zidentyfikowany regulator pompy sarko/endoplazmatycznej retikulum Ca(2+)-ATPazy (Serca), jest niezbędna do termogenezy mięśniowej. termogenezy mięśniowej. Po wystawieniu na ostre zimno (4 ° C) myszy Sln(-/-) nie były w stanie utrzymać podstawowej temperatury ciała (37 ° C) i rozwinęły się hipotermia. Chirurgiczna ablacja brązowej tkanki tłuszczowej i funkcjonalne knockdown Ucp1 pozwoliły nam podkreślić rolę mięśni w NST. Nadekspresja Sln w tle Sln-null w pełni przywróciła termogenezę opartą na mięśniach, sugerując, że że Sln jest podstawą produkcji ciepła za pośrednictwem Serca. Pokazujemy, że receptor ryanodynowy receptor 1 (Ryr1) - pośredniczy w wycieku Ca (2+) jest ważnym mechanizmem dla wytwarzanie ciepła aktywowane przez Serca. Tutaj przedstawiamy dane sugerujące, że Sln może nadal oddziaływać z Serca w obecności Ca(2+), co może promować odłączenie pompy Serca i spowodować daremne cykle. Dalej pokazujemy, że utrata Sln predysponuje myszy do otyłości wywołanej dietą, co sugeruje, że NST, w którym pośredniczy Sln, jest rekrutowany podczas przeciążenia metabolicznego. Dane te łącznie sugerują, że SLN jest ważnym mediatorem termogenezy mięśni i całego ciała metabolizm energetyczny całego ciała. --- Sarkolipina (SLN) jest integralnym białkiem błonowym, które ulega ekspresji zarówno w mięśniach szkieletowych, jak i sercowych. mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym, gdzie hamuje SERCA (ATPazę wapniową) poprzez obniżając jego pozorne powinowactwo do Ca2+ w sposób podobny do jego homologa fosfolambanu (PLN). Używamy roztworu NMR do mapowania zmian strukturalnych zachodzących w SLN po interakcji z celem regulacyjnym, SERCA, współrekonstytuując dwa białka w detergentowych micelach dodecylofosfocholiny (DPC), systemie który zachowuje natywną strukturę SLN i aktywność SERCA, z celem porównania tych interakcji z wcześniej badanymi kompleksu PLN-SERCA. Nasza analiza dynamiki strukturalnej SLN w micelach DPC pokazuje, że ten polipeptyd jest podzielony na cztery subdomeny: krótki niestrukturalny koniec N (reszty 1-6), krótką dynamiczną helisę (reszty 7-14), bardziej sztywną helisę (reszty 7-14) oraz bardziej sztywna helisa (reszty 15-26) i nieustrukturyzowany koniec C (reszty 27-31). Po dodaniu SERCA, różne domeny zachowują się zgodnie z ich dynamiką dynamiki, formując się na powierzchni enzymu. Co ciekawe, każda domena SLN zachowuje się w sposób podobny do odpowiednich domen w PLN, wspierając hipotezę, że zarówno SLN, jak i PLN wiążą SERCA w tym samym rowku i za pomocą podobnych mechanizmów. --- W zwierzęcych modelach wad serca typu conotruncal stwierdzono nieprawidłową wrażliwość na wapń aparatu kurczliwego i obniżony prąd wapniowy typu L zostały opisano. ATPaza Ca(2+) retikulum sarkoplazmatycznego (SR) (SERCA) jest białkiem błonowym, które katalizuje zależny od ATP transport Ca(2+). białkiem błonowym, które katalizuje zależny od ATP transport Ca(2+) z cytozolu do cytozolu do SR. Aktywność SERCA jest hamowana przez fosfolamban (PLN) i sarkolipinę (SLN), a wszystkie te białka uczestniczą w utrzymaniu prawidłowej wewnątrzkomórkowej gospodarki wapniowej. Receptory ryanodynowe (RyR) są głównymi kanałami uwalniania wapnia SR kanały uwalniania wapnia wymagane do sprzężenia pobudzenie-skurcz w mięśniach szkieletowych i sercowych. mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego. Naszym celem była ocena SERCA2a (tj. izoformy SERCA serca). SERCA), PLN, SLN i RyR2 (tj. izoformy RyR wzbogaconej w sercu) ekspresji genów w mięśniu sercowym. w sercu) w tkance mięśnia sercowego pacjentów z tetralogią Fallota. tetralogią Fallota (TOF), wadą serca typu conotruncal. Ekspresję genów genów docelowych oceniano półilościowo metodą RT-PCR przy użyciu kalsekwestryny (CASQ, gen gospodarza) RNA jako wewnętrznego standardu w przedsionkowym mięśniu sercowym 23 pacjentów pediatrycznych poddawanych chirurgicznej korekcji TOF, u 10 dopasowanych wiekowo pacjentów z ubytkiem przegrody międzykomorowej (VSD) i u 13 dzieci z ubytkiem przegrody międzyprzedsionkowej. z ubytkiem przegrody międzyprzedsionkowej (ASD). Zaobserwowaliśmy znacząco niższą ekspresję PLN i SLN u pacjentów z TOF, podczas gdy nie było różnicy między ekspresją ekspresją SERCA2a i RyR2 w TOF i VSD. Dane te sugerują złożony mechanizm mechanizm mający na celu zwiększenie wewnątrzkomórkowej rezerwy Ca(2+) u dzieci dotkniętych tetralogią tetralogią Fallota. --- Sarkolipina, homolog fosfolambanu, reguluje wychwyt Ca2+ poprzez interakcję z ATPazą Ca2+ siateczki sarkoplazmatycznej (SERCA) i jest głównie ekspresji w mięśniu przedsionkowym. Chociaż ekspresja specyficzna dla komory przedsionkowej sarkolipiny może być regulowana przede wszystkim na poziomie transkrypcji, regulacja transkrypcji pozostaje słabo poznana. regulacja transkrypcyjna pozostaje słabo poznana. Ponieważ stres mechaniczny odgrywa ważną rolę w transkrypcyjnej regulacji genu zaangażowanego w przerost i przebudowę serca, wygenerowaliśmy modele lewostronnego lub prawostronnego modele przeciążenia ciśnieniowego przez poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy ddY lub odpowiednio przez podanie monokrotaliny szczurom Wistar. TAC znacząco zmniejszył ekspresję mRNA sarkolipiny, SERCA2a i fosfolambanu w lewym przedsionku (LA) niż lewym przedsionku (LA) niż w prawym przedsionku (RA). Natomiast podawanie monokrotaliny znacząco zmniejszyło ekspresję mRNA sarkolipiny, SERCA2a, i fosfolambanu w RA niż w LA. Dwa niezależne komplementarne eksperymenty jednoznacznie wykazały, że stres mechaniczny obniża transkrypcję genu sarkolipiny. --- Sarkolipina (SLN) jest białkiem błonowym o masie 3 kD występującym w retikulum sarkoplazmatycznym (SR). Ma 31 reszt aminokwasowych; SLN i phopholamban (PLB) należą do tej samej rodziny białek, więc pełnią podobne funkcje fizjologiczne. do tej samej rodziny białek, więc pełnią podobne funkcje fizjologiczne. SLN hamuje aktywność ATPazy Ca(2+) siateczki sarkoplazmatycznej (SERCA) i zmniejsza jej powinowactwo do Ca(2+). powinowactwo do Ca(2+), powodując dysfunkcję skurczu mięśnia sercowego i niewydolność serca. niewydolność serca. Jednak wiele pozostaje jeszcze do wyjaśnienia. SLN niezależnie lub w lub w połączeniu z PLB wpływa na aktywność SERCA, zaburzając homeostazę wewnątrzkomórkowego wapnia homeostazę i zmniejszając kurczliwość mięśnia sercowego; efekty te promują rozwój niewydolności serca. rozwój niewydolności serca.
Czy sarkolipina jest białkiem regulującym/hamującym ATPazę Wapniową SERCA?
Sarkolipina (SLN) jest białkiem błonowym o masie 3 kD występującym w siateczce sarkoplazmatycznej (SR) i jest nowo zidentyfikowanym regulatorem pompy sarko/endoplazmatycznej Ca(2+)-ATPazy (SERCA).  SLN hamuje aktywność ATPazy Ca(2+) siateczki sarkoplazmatycznej (SERCA) i zmniejsza jej powinowactwo do Ca(2+), powodując dysfunkcję skurczu mięśnia sercowego i niewydolność serca. Sarkolipina jest kluczowym regulatorem SERCA2a w przedsionkach.