Kilka mutacji jest wymaganych do rozwoju raka, a sekwencjonowanie genomu ujawniło, że wiele nowotworów, w tym rak piersi, ma somatyczne mutacje zdominowane przez przejścia C-T. Większość z tych mutacji występuje w hydrolitycznie niefaworyzowanych niemetylowanych cytozynach w całym genomie, i czasami są zgrupowane. Tutaj pokazujemy, że deaminaza cytozyny DNA APOBEC3B jest prawdopodobnym źródłem tych mutacji. RNA informacyjny APOBEC3B jest regulowany w górę w większości pierwotnych guzów piersi i liniach komórkowych raka piersi. Guzy, które wyrażają wysoki poziom APOBEC3B mają dwa razy więcej mutacji niż te, które wyrażają niskie poziomy i jest bardziej prawdopodobne, że mają mutacje w TP53. Endogenne APOBEC3B jest głównie białkiem jądrowym i jedynym wykrywalnym źródłem aktywności edycji DNA DNA w ekstraktach linii komórkowych raka piersi. Eksperymenty eksperymenty pokazują, że endogenne APOBEC3B koreluje ze zwiększonym poziomem genomowego uracylu, zwiększoną częstotliwością mutacji i przejściami C-T. Ponadto indukowana nadekspresja APOBEC3B powoduje odchylenia w cyklu komórkowym, śmierć komórki, fragmentację DNA, γ-H. śmierć komórek, fragmentację DNA, akumulację γ-H2AX i mutacje C-to-T. Nasze dane sugerują model, w którym katalizowana przez APOBEC3B deaminacja stanowi przewlekłe źródło uszkodzeń DNA w raku piersi. źródło uszkodzeń DNA w rakach piersi, które mogą selekcjonować inaktywację TP53 i wyjaśnić, w jaki sposób niektóre nowotwory szybko ewoluują i wykazują heterogenność. --- Najczęstszy transpozycyjny element genetyczny u ludzi, long interspersed element 1 (L1), stanowi około 20% genomu. Aktywność L1 i transpozonów, takich jak elementy Alu, powoduje choroby i przyczynia się do specjacji. specjacji. Niewiele wiadomo na temat mechanizmów komórkowych, które kontrolują ich rozprzestrzenianie się. rozprzestrzenianie się. Pokazujemy, że ekspresja ludzkich APOBEC3B lub APOBEC3F zmniejszyła szybkość retrotranspozycji retrotranspozycji L1 o 5-10 razy. Ekspresja dwóch pokrewnych białek, APOBEC3D lub APOBEC3G, miała niewielki wpływ. Mechanizm hamowania L1 nie korelował z oczywistą subkomórkową dystrybucją białek, ponieważ APOBEC3B wydawał się głównie jądrowe, a APOBEC3F było głównie cytozolowe. Dwie linie dowodów wskazują, że te białka APOBEC3 wykorzystują mechanizm niezależny od deaminacji do hamowania L1. Po pierwsze, katalitycznie nieaktywny mutant APOBEC3B zachował aktywność hamowania L1 aktywność hamującą. Po drugie, specyficzne dla nici cDNA hipermutacje C --> T nie były nie wykryto wśród elementów L1, które replikowały się w obecności APOBEC3B lub APOBEC3F. Ponadto, niższe poziomy retrotranspozowanego DNA L1 gromadziły się w obecności w obecności APOBEC3B i APOBEC3F. Łącznie dane te sugerują model, w którym APOBEC3B lub APOBEC3F stanowią barierę preintegracyjną dla retrotranspozycji L1 retrotranspozycję. Szczególnie wysoki poziom białka APOBEC3F w ludzkich jądrach jądrach i odwrotna korelacja między aktywnością L1 a liczbą genów APOBEC3 sugeruje znaczenie tego mechanizmu dla ssaków. --- Członkowie rodziny białek APOBEC (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polipeptydopodobne) katalizują deaminację cytozyny DNA i stanowią podstawę różne mechanizmy obrony immunologicznej. Na przykład, kilku członków rodziny, w tym APOBEC3B (A3B), wywołują silne działanie ograniczające retrotranspozony i retrowirusy. retrowirusów. Jednak w przeciwieństwie do innych białek, A3B jest jedynym członkiem rodziny z lokalizacją jądrową w stanie ustalonym. Tutaj pokazujemy, że import jądrowy A3B jest aktywnym procesem wymagającym co najmniej jednego aminokwasu (Val54) w obrębie N-końcowego motywu motywu analogicznego do determinanta lokalizacji jądrowej genu przeciwciała AID (indukowana aktywacją deaminaza cytozyny). Mechanistyczna konserwacja z AID jest dodatkowo sugerowana przez zdolność A3B do interakcji z z tym samym podzbiorem białek importynowych. Pomimo tych mechanistycznych podobieństw, wymuszona ekspresja A3B nie może zastąpić genów przeciwciał zależnych od AID przez rekombinację przełączników klasowych. Różnice regulacyjne między A3B i AID są również widoczne podczas progresji cyklu komórkowego. Nasze badania sugerują że współczesny enzym A3B zachował mechanizm importu jądrowego przodka białka AID podczas ekspansji locus APOBEC3 u naczelnych. Nasze badania podkreślają również prawdopodobieństwo, że po imporcie jądrowym istnieją wyspecjalizowane istnieją wyspecjalizowane mechanizmy kierujące te enzymy do ich odpowiednich substratów fizjologicznych substratów i zapobiegają nieuzasadnionym uszkodzeniom chromosomalnego DNA. --- Ludzie posiadają siedem deaminaz cytozyny DNA APOBEC3. Aktywność tych enzymów pozwala im ograniczać różne retrowirusy i retrotranspozony, ale może również również powodować pro-mutagenne genomowe zmiany uracylu. Podczas interfazy białka APOBEC3 mają różne lokalizacje subkomórkowe: w całej komórce, cytoplazmatyczne lub jądrowe. jądrową. Oznacza to, że tylko podzbiór APOBEC3 ma kontakt z jądrowym DNA. DNA. Jednak podczas mitozy otoczka jądrowa rozpada się, a białka cytoplazmatyczne białka cytoplazmatyczne mogą wejść do tego, co wcześniej było strefą uprzywilejowaną. Aby odnieść się do hipotezę, że wszystkie białka APOBEC3 mają dostęp do genomowego DNA, przeanalizowaliśmy lokalizację białek APOBEC3 podczas mitozy. Wykazaliśmy, że APOBEC3A, APOBEC3C i APOBEC3H są wykluczone ze skondensowanych chromosomów, ale stają się w całej komórce podczas telofazy. Jednakże, APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F i APOBEC3G są wykluczone z chromatyny podczas mitozy. Po mitozie APOBEC3B staje się jądrowa, a APOBEC3D, APOBEC3F i APOBEC3G stają się cytoplazmatyczne. Zarówno strukturalne motywy strukturalne, jak i rozmiar mogą być czynnikami regulującymi wykluczenie chromatyny. Aktywność deaminazy nie była zależna od fazy cyklu komórkowego. Przeanalizowaliśmy również indukowane przez APOBEC3 zaburzenia cyklu komórkowego jako miarę zdolności każdego enzymu do powodowania uszkodzeń genomowego DNA. AID, APOBEC3A i APOBEC3B zmieniły profil cyklu komórkowego. i nieoczekiwanie APOBEC3D również powodował zmiany. Wnioskujemy, że kilku członków rodziny APOBEC3 ma dostęp do przedziału jądrowego i może hamować cykl komórkowy, najprawdopodobniej poprzez deaminację DNA i wynikającą z niej odpowiedź na uszkodzenia DNA. odpowiedź na uszkodzenie DNA. Takie uszkodzenia genomu mogą przyczyniać się do karcynogenezy, co AID w nowotworach z komórek B, a ostatnio APOBEC3B w nowotworach piersi. --- Ludzki APOBEC3B (A3B) został opisany jako silny inhibitor infekcji retrowirusowej infekcji i retrotranspozycji. Stwierdziliśmy jednak, że głównie jądrowy A3B tylko słabo ograniczał infekcję HIV-1, HIV-1Δvif i ludzkim wirusem białaczki typu wirus białaczki limfocytów T typu 1 (HTLV-1), jednocześnie znacząco hamując retrotranspozycję LINE-1 retrotranspozycję. Chimeryczny konstrukt A3G/B, w którym pierwsze 60 aminokwasów pierwszych 60 aminokwasów A3B zastąpiono tymi z A3G, ograniczając zakażenie HIV-1, HIV-1Δvif i HTLV-1, jak również retrotranspozycję LINE-1. W przeciwieństwie do wyłącznie cytoplazmatycznego A3G, który jest nieaktywny wobec retrotranspozycji LINE-1 retrotranspozycja, białko A3G/B, chociaż zlokalizowane głównie w cytoplazmie, było również obecne w jądrze. Dalsza analiza mutacyjna ujawniła, że reszty 18, 19, 22 i 24 w A3B były głównymi determinantami jądrowej w stosunku do lokalizacji cytoplazmatycznej i aktywności antyretrowirusowej. Pakiety HIV-1Δvif A3G, A3B i A3G/B w cząsteczki o skuteczności zbliżonej do równej. Mutacja E68Q lub E255Q w centrach aktywnych A3G/B spowodowała utratę aktywności hamującej aktywność przeciwko HIV-1Δvif, nie wpływając jednocześnie na aktywność przeciwko LINE-1 retrotranspozycji. Niskie hamowanie HIV-1Δvif przez A3B korelowało z niską szybkością hipermutacji G-to-A. W przeciwieństwie do tego, wirusy, które zostały wystawione na działanie A3G/B wykazywały wysoką liczbę przejść G do A. Wzorzec mutacji był podobny do wcześniej opisanego dla A3B, z preferencją dla kontekstu GA kontekst. Podsumowując, obserwacje te sugerują, że zmiana 4 reszt w aminowym A3B nie tylko przenosi białko z jądra do cytoplazmy, ale także zwiększa cytoplazmy, ale także zwiększa jego zdolność do ograniczania HIV przy zachowaniu hamowania retrotranspozycji. --- APOBEC3G ogranicza replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1, innych retrowirusów i retrotranspozonów. retrowirusów i retrotranspozonów. Lokalizuje się głównie w cytoplazmie komórek. komórek, co jest zgodne z modelem, w którym cytozolowe pakiety APOBEC3G do gromadzących się wirionów, gdzie wywiera działanie przeciwwirusowe poprzez deaminację wirusowe cytozyny cDNA podczas odwrotnej transkrypcji. Aby zdefiniować domeny APOBEC3G, które określają lokalizację cytoplazmatyczną, dokonano porównań z APOBEC3B, który jest głównie jądrowy. Chimeryczne białka APOBEC3G/APOBEC3B zmapowały główny determinant lokalizacji subkomórkowej do regionu w obrębie pierwszych 60 reszt każdego białka. Panel 25 mutantów APOBEC3G, każdy z resztą reszta zastąpiona odpowiednim aminokwasem APOBEC3B, ujawniła, że kilka pozycji w tym regionie było szczególnie ważnych, z Y19D wykazując największy efekt. Fenotyp błędnej lokalizacji tych mutantów był widoczny tylko w kontekście amino-końcowej połowy APOBEC3G, a nie białka o pełnej długości białka, co sugeruje istnienie dodatkowej determinanty lokalizacji. determinanta lokalizacji. Rzeczywiście, panel pięciu pojedynczych substytucji aminokwasowych w regionie od aminokwasów 113 do 128 od aminokwasów 113 do 128 miał niewielki wpływ sam w sobie, ale w połączeniu z w połączeniu z Y19D, dwie substytucje - F126S i W127A - spowodowały, że pełna długość APOBEC3G do redystrybucji w całej komórce. Krytyczne reszty determinujące lokalizację zostały przewidziane do skupienia na wspólnej powierzchni eksponowanej na rozpuszczalniki, co sugeruje model, w którym te dwa regiony APOBEC3G łączą się, aby pośredniczyć w interakcji międzycząsteczkowej, która kontroluje lokalizację subkomórkową. lokalizację subkomórkową.
Czy białko APOBEC3B jest głównie cytoplazmatyczne czy jądrowe?
W przeciwieństwie do innych członków rodziny APOBEC, stwierdzono, że APOBEC3B koncentruje się głównie w jądrze komórkowym.