Metaproteomika jest nową dziedziną w ramach nauki "omicznej", która bada ekspresję białek ze złożonego systemu biologicznego i dostarcza bezpośrednich dowodów na aktywności fizjologicznej i metabolicznej. Charakterystyka metaproteomu zwiększy nasze zrozumienie świata drobnoustrojów i połączy społeczności drobnoustrojów z funkcjami ekologicznymi. społeczności drobnoustrojów z funkcjami ekologicznymi. Ostatnio dostępność obszernych sekwencji metagenomicznych z różnych morskich społeczności drobnoustrojów rozszerzyła erę postgenomiczną na obszar erę postgenomiczną do dziedziny oceanografii. Chociaż wciąż w powijakach, metaproteomika wykazała swój potężny potencjał w odniesieniu do funkcjonalnej ekspresji genów ekspresji genów funkcjonalnych w siedliskach drobnoustrojów i ich interakcji ze środowiskiem środowiskiem, a także ich funkcji biogeochemicznych. Jednak zastosowanie metaproteomiki do złożonych próbek morskich wciąż stoi przed znacznymi wyzwaniami. wyzwaniami. Niniejszy przegląd podsumowuje ostatnie postępy w metaproteomice morskiej oraz omawia ograniczenia i perspektywy tego podejścia w badaniu ekosystemu morskiego. ekosystemu morskiego. Artykuł ten jest częścią wydania specjalnego zatytułowanego: Trendy w proteomice drobnoustrojów. --- Podejścia systemowe mające na celu wyjaśnienie funkcjonowania ekosystemu stanowią nowy obszar badań w ekologii drobnoustrojów. badań w ekologii drobnoustrojów. Takie podejścia mają na celu zbadanie wszystkich poziomów informacji biologicznej (DNA, RNA, białka i metabolity), aby uchwycić funkcjonalnych interakcji zachodzących w danym ekosystemie i śledzenie cech, do których nie można uzyskać dostępu poprzez badanie izolowanych składników. W tym kontekście badanie białek wspólnie wyrażanych przez wszystkie mikroorganizmy obecne w ekosystemie przez wszystkie mikroorganizmy obecne w ekosystemie (metaproteomika) jest nie tylko kluczowe ale może również zapewnić wgląd w funkcjonalność drobnoustrojów. Ogólnie rzecz biorąc, sukces metaproteomiki jest ściśle powiązany z metagenomiką, a wraz z wykładniczym wzrostem dostępności metagenomu wykładniczym wzrostem dostępności sekwencji metagenomu, ta dziedzina badań jest zaczyna generować przytłaczającą ilość danych, które wymagają systematycznej analizy. wymaga systematycznej analizy. Metaproteomika została zastosowana w bardzo zróżnicowanych środowiskach. środowiskach, a niniejszy przegląd omawia ostatnie postępy osiągnięte w kontekście kontekście biologii człowieka, gleby, środowiska morskiego i słodkowodnego, jak również systemów naturalnych i bioinżynieryjnych. --- Metagenomika zrewolucjonizowała mikrobiologię, torując drogę do niezależną od uprawy ocenę i wykorzystanie społeczności drobnoustrojów obecnych w złożonych ekosystemach. Metagenomika obejmująca budowę i badania przesiewowe bibliotek metagenomicznego DNA okazały się potężnym narzędziem do izolowania nowych enzymów i leków o znaczeniu przemysłowym. Jak dotąd, większość metagenomicznych siedlisk obejmowała środowiska umiarkowane, takie jak gleba i środowiska morskie. gleba i środowiska morskie. Ostatnio metagenomy środowisk ekstremalnych zostały zostały również wykorzystane jako źródła nowych biokatalizatorów. Zastosowanie technik sekwencjonowania technik sekwencjonowania nowej generacji dla metagenomiki zaowocowało generowanie dużych zbiorów danych sekwencyjnych pochodzących z różnych środowisk, takich jak takich jak gleba, ludzkie ciało i woda oceaniczna. Analizy tych zbiorów danych otworzyły okno na ogromną różnorodność taksonomiczną i funkcjonalną środowisk społeczności drobnoustrojów. Aby ocenić dynamikę funkcjonalną społeczności drobnoustrojów opracowano metatranskryptomikę i metaproteomikę. Połączenie połączenie analiz opartych na DNA, mRNA i białkach społeczności drobnoustrojów społeczności drobnoustrojów obecnych w różnych środowiskach jest sposobem na wyjaśnienie skład, funkcje i interakcje społeczności drobnoustrojów oraz powiązanie ich z procesami środowiskowymi. z procesami środowiskowymi. --- TŁO: Naturalne społeczności drobnoustrojów są niezwykle złożonymi i dynamicznymi pod względem struktury i funkcji populacji. Jednak niewiele jest niewiele wiadomo na temat funkcji in situ społeczności drobnoustrojów. WYNIKI: Niniejsze badanie opisuje zastosowanie podejść proteomicznych (metaproteomiki) do obserwacji profili białek ekspresyjnych naturalnych społeczności drobnoustrojów (metaproteomów). społeczności drobnoustrojów (metaproteomów). Technika została zweryfikowana przy użyciu skonstruowanej a następnie wykorzystana do analizy społeczności drobnoustrojów Zatoki Chesapeake (0,2 do 3,0 mikrometrów) metaproteomów. Metaproteomy z zatoki Chesapeake zawierały białka o pI 4-8 i pozornej masie cząsteczkowej pomiędzy 10-80 kDa. Powielone metaproteomy środkowej zatoki dzieliły około 92% wszystkich wykrytych wykrytych plam, ale dzieliły tylko 30% i 70% wspólnych plam białkowych z metaproteomami górnej i dolnej zatoki. metaproteomami górnej i dolnej zatoki. Analiza MALDI-TOF białek o wysokiej ekspresji nie wykazała znaczących dopasowań do znanych białek. Trzy białka z Zatoki Chesapeake zostały wstępnie zidentyfikowane przez sekwencjonowanie LC-MS/MS połączone z wyszukiwaniem MS-BLAST. Zidentyfikowane białka pochodziły z drobnoustrojów morskich i korelowały z obfitymi liniami drobnoustrojów Zatoki Chesapeake, Bacteroides i alfa-proteobakterie. WNIOSEK: Nasze wyniki stanowią pierwsze metaproteomiczne badanie zespołów drobnoustrojów wodnych zespołów drobnoustrojów i demonstrują potencjał podejść metaproteomicznych do powiązania danych metagenomicznych, różnorodności taksonomicznej, różnorodności funkcjonalnej i procesów biologicznych w środowiskach naturalnych. --- Obecna wiedza na temat fizjologii i filogenezy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) degradujących węglowodorów aromatycznych (WWA) często opiera się na wzbogaceniach i izolacjach laboratoryjnych. izolacjach. W niniejszym badaniu, mikrokosmosy in situ składające się z granulek węgla aktywnego węgla aktywnego (BACTRAP®s) zostały obciążone (13) C-naftalenem lub (13) C-fluorenem, a następnie wystawiono na działanie w obszarze źródła zanieczyszczenia i pióropusza zanieczyszczonej WWA warstwie wodonośnej. Analiza metaproteomiczna i analiza metaproteomiczna i sondowanie izotopów stabilnych białek ujawniły Burkholderiales, Actinomycetales i Rhizobiales jako najbardziej aktywne mikroorganizmy w zbiorowiskach wód podziemnych. Białka zidentyfikowane w szlaku degradacji naftalenu wykazały względną (13) C wynoszącą około 50 atom%, co wskazuje, że że zidentyfikowane bakterie degradujące naftalen pozyskały co najmniej 80% swojego węgla poprzez degradację WWA. Chociaż społeczność drobnoustrojów wyhodowana na fluorenie-BACTRAPs wykazywała strukturę podobną do BACTRAP-ów naftalenowych, identyfikacja bakterii degradatorów fluorenu i szlaków degradacji nie powiodła się in situ. W uzupełniających laboratoryjnych mikrokosmosach, wyraźne wzbogacenie w białka związane z Rhodococcus i zaobserwowano możliwe enzymy degradujące fluor. Wynik ten pokazuje warunków laboratoryjnych na strukturę społeczności drobnoustrojów i aktywność niektórych gatunków gatunków i podkreśla potrzebę badania in situ funkcji społeczności drobnoustrojów. funkcji społeczności drobnoustrojów. Mikrokosmosy in situ w połączeniu z sondowaniem izotopów stabilnych białek izotopami białkowymi mogą być istotnym narzędziem do identyfikacji in situ kluczowych graczy metabolicznych, a także szlaków degradacji. --- Heterotroficzne bakterie morskie odgrywają kluczową rolę w remineralizacji materii organicznej generowanej z produkcji pierwotnej. Jednak znacznie więcej wiadomo o tym, które grupy są dominujące niż o procesach komórkowych, które wykonują, aby stać się dominujące. W Oceanie Południowym dominującymi producentami pierwotnymi są fitoplankton eukariotyczny. producenci pierwotni. W tym badaniu wykorzystaliśmy metagenomikę i metaproteomikę do określić, w jaki sposób dominujący plankton bakteryjny i archeologiczny przetwarzał materiał zakwitu materiał. Zbadaliśmy skład społeczności drobnoustrojów w 14 metagenomach i stwierdziliśmy, że względna liczebność Flavobacteria (zdominowana przez Polaribacter) była dodatnio skorelowana z fluorescencją chlorofilu a, a względna obfitość SAR11 była odwrotnie skorelowana zarówno z fluorescencją, jak i obfitością Flavobacteria. Wykonując metaproteomikę na próbce o najwyższej najwyższą względną liczebnością Flawobakterii (Zatoka Newcomb, Antarktyda Wschodnia) zdefiniowaliśmy, w jaki sposób Flavobacteria przyłączają się i degradują zróżnicowany złożony materiał organiczny organicznych, w jaki sposób udostępniają one labilne związki Alphaproteobacteria (zwłaszcza SAR11) i Gammaproteobacteria oraz w jaki sposób te heterotroficzne Proteobakterie celują i wykorzystują te składniki odżywcze. Obecność białek metylotroficznych dla archeonów i bakterii również wskazywała na znaczenie specjalistów metabolicznych. Ogólnie rzecz biorąc, badanie dostarcza danych funkcjonalnych dla mikrobiologicznych mechanizmów obiegu składników odżywczych na powierzchni przybrzeżnego Oceanu Południowego. Oceanu Południowego. --- Postępy w tandemowej spektrometrii mas (tandem MS) i sekwencjonowaniu umożliwiły rozwój proteomiki społeczności. dziedzinę proteomiki środowiskowej, która ma na celu identyfikację wyrażonych białek, ich sekwencji i fizjologicznych odpowiedzi organizmów na zmienne warunki środowiskowe. warunki środowiskowe. Metody proteomiki środowiskowej oparte na tandemowym MS generują widma fragmentacji peptydów. Widma fragmentacji są następnie przeszukiwane pod kątem genomowych lub metagenomowych baz danych w celu wywnioskowania sekwencji aminokwasów peptydów. sekwencji aminokwasowych peptydów, zapewniając pozytywną identyfikację białek. Badania proteomiczne społeczności morskich zweryfikowały znaczenie transportu składników odżywczych, wytwarzania energii i wiązania węgla. transport składników odżywczych, wytwarzanie energii i funkcje wiązania węgla w bakteriach i bakterii i archeonów oraz ujawniły przestrzenne i czasowe zmiany w wyrażanych funkcjach społeczności. społeczności. Tutaj omawiamy pobieranie, przygotowanie i przetwarzanie próbek metody dla proteomiki społeczności opartej na planktonicznym tandemie MS. --- Badania metaproteomiczne całych społeczności drobnoustrojów z próbek środowiskowych (np. gleby, osadów, wody słodkiej, wody morskiej itp.) gwałtownie wzrosły w ostatnich latach dzięki wielu postępom technologicznym w ostatnich latach ze względu na wiele postępów technologicznych w spektrometrii mas (MS). A pojedynczy 24-godzinny pomiar chromatografem cieczowym z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) może potencjalnie wykryć i określić ilościowo tysiące białek z wielu dominujących i subdominujących naturalnie występujących mikroorganizmów. i subdominujących naturalnie występujących populacji drobnoustrojów. Co ważne, sekwencje aminokwasów sekwencje aminokwasów i informacje o względnej obfitości dla wykrytych peptydów są peptydów, co pozwala na scharakteryzowanie funkcji wyrażonych białek w społecznościach i konkretne dopasowania do linii drobnoustrojów, z potencjalną rozdzielczością podgatunków. potencjalną rozdzielczością podgatunkową. Ciągła optymalizacja ekstrakcji białek i protokołów frakcjonowania, rozwój metod kwantyfikacji i postępy w oprzyrządowaniu do spektrometrii mas umożliwiają dokładniejsze i bardziej i kompleksowe wykrywanie peptydów w próbkach, co prowadzi do szerszego zastosowania w badaniach badań, większej łatwości użytkowania i ogólnej dostępności. Niniejszy rozdział zawiera krótki przegląd opcji eksperymentalnych metaproteomiki, w tym ogólny protokół obsługi próbek i pomiarów LC-MS/MS.
Definicja metaproteomiki morskiej
Metaproteomika morska to badanie aktywności całych społeczności drobnoustrojów morskich. Analizy proteomiczne są stosowane bezpośrednio, bez potrzeby wcześniejszej hodowli drobnoustrojów. Próbkami mogą być osady, woda morska itp.