Metylacja miejsc CpG w regionach kontrolnych genów supresorowych nowotworów może być ważnym mechanizmem ich dziedzicznej, ale odwracalnej inaktywacji transkrypcyjnej. transkrypcji. Te zmiany w metylacji mogą upośledzać prawidłową ekspresję i / lub funkcję genów regulujących cykl komórkowy i nadawać selektywną przewagę wzrostu przewagę wzrostową komórkom dotkniętym zmianami. Szczegółowa analiza metylacji przy użyciu sekwencjonowania z wykorzystaniem sekwencjonowania dwusiarczynowego przeprowadzono na serii podklonów linii komórkowej raka pęcherza moczowego. linii komórkowej raka pęcherza moczowego, w której hipermetylowany gen p16 został reaktywowany przez przejściowe leczenie 5-aza-2'-deoksycytydyną. Metylacja wyspy CpG w promotorze genu p16 promotora genu p16 w ludzkich komórkach raka pęcherza moczowego nie zatrzymuje powstawania transkryptu inicjowanego 20 kb w górę przez promotor p19, ale zapobiec ekspresji transkryptu p16. Ponadto pokazujemy, że reaktywne klony, które wyrażały p16 na różnych poziomach, zawierały heterogeniczne wzory metylacji wzory, co sugeruje, że ekspresja p16 może wystąpić nawet w obecności stosunkowo silnie metylowanego regionu kodującego. Przedstawiamy również pierwsze funkcjonalne dowody na to, że metylacja tylko niewielkiej liczby miejsc CpG może znacząco obniżyć aktywność promotora p16, zapewniając w ten sposób wsparcie dla model progresywnej inaktywacji tego genu supresorowego nowotworu przez metylację DNA metylację DNA. --- TŁO: Regulacja epigenetyczna, taka jak nieprawidłowa hipermetylacja wysp CpG w promotorze odgrywa kluczową rolę w procesie nowotworzenia. 5-Aza-2'-deoksycytydyna (5-aza-CdR), która jest silnym inhibitorem metylacji DNA, może odwrócić nieprawidłową hipermetylację wyciszonych genów supresorowych nowotworów (TSG). Zostało że cząsteczka adhezji komórek hepatocytów (hepaCAM) działa jako gen supresorowy nowotworu i ekspresja gen supresorowy, a ekspresja jego mRNA i białka była obniżona w raku pęcherza moczowego. raka pęcherza moczowego. Nadekspresja hepaCAM może hamować wzrost raka i zatrzymywać komórki raka nerki w fazie G0/G1. W tym badaniu zbadaliśmy stan metylacji genu hepaCAM, a także wpływ 5-aza-CdR na ekspresję genu hepaCAM. ekspresję genu hepaCAM w komórkach raka pęcherza moczowego. METODY: Wyspy CpG w promotorze hepaCAM i metprimery zostały przewidziane i zaprojektowane przy użyciu programu bioinformatycznego. Status metylacji promotora hepaCAM został oceniony w tkankach raka pęcherza moczowego i dwóch liniach komórkowych (T24 i BIU-87) metodą PCR specyficzny dla metylacji; Western blot i immunofluorescencja zostały użyte do wykryć ekspresję białka hepaCAM po leczeniu 5-aza-CdR; Test cytometrii przepływowej przeprowadzono w celu określenia skuteczności 5-aza-CdR w cyklu komórkowym profil. WYNIKI: Wyspa CpG w promotorze genu hepaCAM była hipermetylowana zarówno w tkankach tkankach raka pęcherza moczowego i liniach komórkowych (T24 i BIU-87). W przeciwnym razie, nieprawidłowa metylacja jego promotora była związana z jego obniżoną ekspresją. Hipermetylacja genu hepaCAM została odwrócona, a ekspresja jego mRNA i białka została ponownie aktywowana w dwóch białka zostały ponownie aktywowane w dwóch liniach komórkowych przez inhibitor metylotransferaz DNA 5-aza-CdR. Test cytometrii przepływowej wykazał, że 5-aza-CdR może hamować wzrost komórek nowotworowych poprzez zatrzymanie komórek nowotworowych w fazie G0/G1. WNIOSEK: Nieprawidłowa hipermetylacja w wyspie CpG promotora hepaCAM jest zaangażowana w brak ekspresji genu hepaCAM w przypadku raka pęcherza moczowego. Ponowna aktywacja genu hepaCAM przez 5-aza-CdR może hamować wzrost komórek nowotworowych i zatrzymywać komórki w fazie G0/G1. --- CEL: Naszym celem było zbadanie mechanizmów inaktywacji hepaCAM w przejściowokomórkowym raku pęcherza moczowego poprzez analizę metylacji eksonu hepaCAM 2. METODY: Metylacja eksonu 2 hepaCAM i ekspresja hepaCAM zostały określono za pomocą specyficznego dla metylacji testu restrykcyjnego PCR i RT-PCR w komórkach raka pęcherza moczowego komórek raka pęcherza moczowego (T24, BIU-87), a także w 55 sparowanych próbkach raka pęcherza moczowego. The metylowane komórki raka pęcherza moczowego traktowano 5-Aza-2'-deoksycytydyną (5-Aza-CdR), środkiem demetylującym. MTT wykorzystano do wykrycia proliferacji komórek komórek T24 i BIU-87. WYNIKI: Proliferacja komórek T24 i BIU-87 została zahamowana przez leczenie różnymi stężeniami 5-Aza-CdR; ekspresja hepaCAM była nieobecna w komórkach T24 i BIU-87 i stwierdziliśmy, że ekson 2 hepaCAM był metylowany w 2 komórkach. mRNA hepaCAM uległo ponownej ekspresji, a stan metylacji eksonu 2 hepaCAM został odwrócony po exon 2 został odwrócony po leczeniu 5-Aza-CdR. Ekspresja hepaCAM mRNA w tkankach raka pęcherza moczowego była znacznie niższa niż w sąsiednich tkankach. tkankach. Metylacja eksonu 2 hepaCAM była znacząco wyższa w tkankach raka pęcherza moczowego niż w tkankach sąsiednich. tkankach raka pęcherza moczowego niż w tkankach sąsiednich. Metylacja eksonu hepaCAM 2 była związana z ekspresją hepaCAM w tkankach raka pęcherza moczowego. WNIOSKI: Obniżenie ekspresji hepaCAM odgrywa ważną rolę w i rozwoju raka pęcherza moczowego. Metylacja DNA może być ważna dla obniżenia ekspresji hepaCAM w raku pęcherza moczowego. --- TŁO: Komórki raka pęcherza moczowego wykazują poważne zaburzenia we wzorcach metylacji DNA wzorce metylacji w porównaniu z normalnymi. Autorzy mieli na celu zidentyfikowanie epigenetycznych markerów molekularnych w moczu w celu wczesnego wykrywania raka pęcherza moczowego. MATERIAŁY I METODY: Przeanalizowaliśmy retrospektywnie status metylacji genów RARβ(2) i genów APC w próbkach moczu od 210 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego, 61 pacjentów z łagodnymi chorobami urologicznymi i 49 zdrowych ochotników przy użyciu PCR specyficznego dla metylacji. WYNIKI: Metylacja RARβ(2) i APC była znacząco wyższa u pacjentów z rakiem pęcherza moczowego (62,8%, 59,5%) niż łagodnych (16,4%, 5%), ale nie wykryto ich u zdrowych ochotników (0%). ochotników (0%) przy (P < 0,0001). Oba metylowane geny nie wykazywały istotnej różnic między czynnikami kliniczno-patologicznymi; jednak zostały wykryte we wszystkich stopniach i stadiach zaawansowania. Wśród 128 pacjentów z obustronnym rakiem pęcherza moczowego, 94 (73,4%) wykazywało metylację RARβ(2), a 86 (67,2%) wykazywało metylację APC. Homoplazmatyczny wzór metylacji obu genów wykryto tylko w przypadkach raka pęcherza moczowego. przypadkach raka pęcherza moczowego. Zarówno czułość, jak i swoistość metylowanych genów w wykrywaniu raka pęcherza moczowego były lepsze niż w przypadku cytologii moczu, a gdy łącznie, czułości poprawiły się do (91,8%), (93,5%), (91,9%), i (80,9%) w wykrywaniu: raka pęcherza moczowego, nieinwazyjnego raka pęcherza moczowego, nowotworów o niskim stopniu złośliwości i raka pęcherza moczowego. WNIOSEK: Zatem metylowane geny RARβ(2) i APC mogą być cennymi markerami molekularnymi moczu markerami molekularnymi do wczesnego wykrywania raka pęcherza moczowego związanego i niezwiązanego z bilharcjozą. raka. --- Rola metylacji promotora w procesie przerzutów komórek nowotworowych nie została jednak jeszcze zbadana, jednak nie została jeszcze zbadana. Niedawno metylacja genu TPEF (transmembranowe białko białka zawierającego naskórkowy czynnik wzrostu i domenę folistatyny) została w ludzkich komórkach raka okrężnicy, żołądka i pęcherza moczowego. Używając testu Methylight oceniono metylację genu TPEF/HPP1 w pierwotnych rakach jelita grubego (n = 47), dopasowanej prawidłowej błonie śluzowej okrężnicy, a także w przerzutach do wątroby 24 pacjentów z rakiem jelita grubego i porównano ze statusem metylacji genów TIMP-3, APC, DAPK, caveolin-2 i p16. TPEF był często metylowany w pierwotnych rakach jelita grubego (36 z 47) w porównaniu do prawidłowej błony śluzowej okrężnicy (1 z 21) (P < .0001), a ekspresja mRNA TPEF w liniach komórkowych raka okrężnicy była przywrócona po leczeniu 5-aza-2'-deoksycytydyną. Geny p16 i APC były również często metylowane w pierwotnych rakach jelita grubego (P < .02) w porównaniu do normalnej błony śluzowej okrężnicy. Co ciekawe, metylacja promotora była znacząco częściej w proksymalnych, nie odbytniczych nowotworach (P < .05). Co więcej, wysoki wysoki stopień metylacji genu TPEF zaobserwowano również w przerzutach do wątroby (19 z 24). Podsumowując, zaobserwowaliśmy częstą metylację TPEF w pierwotnych rakach jelita grubego i przerzutach do wątroby. jelita grubego i przerzutach do wątroby, wskazując, że zmiany epigenetyczne są obecne nie tylko we wczesnych fazach obecne nie tylko we wczesnych fazach kancerogenezy, ale są również powszechne w zmianach przerzutowych. zmianach przerzutowych. Wysoka częstotliwość metylacji TPEF w tej serii raka jelita grubego podkreśla znaczenie zmian epigenetycznych jako celów dla rozwoju testów molekularnych do diagnostyki raka.
Które geny są metylowane w komórkach raka pęcherza moczowego?
W raku pęcherza moczowego stwierdzono metylację genów hepaCAM (cząsteczka adhezji komórek hepatocytów), RARβ(2), APC, TPEF (białko transmembranowe zawierające naskórkowy czynnik wzrostu i domenę folistatyny), RASSF1A, p14(ARF) i p16. Wykazano, że te zdarzenia metylacji wiążą się z obniżeniem ekspresji genów.