Metodologia krystalografii białek zapewnia szereg potencjalnych wąskich gardeł. wąskich gardeł. Tutaj przedstawiono podejście do udanego rozwiązania struktury trudnego kompleksu heterodimerycznego heterodimerycznego kompleksu dwóch ludzkich białek, paraspeckle component 1 (PSPC1) i białka wiążącego oktamer (NONO), które są zaangażowane w regulację genów i integralność strukturalną. regulację genów i integralność strukturalną ciał jądrowych określanych jako paraspeckles. Z pomocą prognoz bioinformatycznych i systematycznych badań przesiewowych panelu konstruktów, wąskich gardeł białka rozpuszczalności białka, krystalizacji, jakości kryształów i pseudosymetrii krystalograficznej w celu wytworzenia kryształów, które ostatecznie ujawniły strukturę. strukturę. --- Receptor progesteronu (PR) odgrywa ważną rolę w ustanowieniu i utrzymaniu ciąży. Poprzez dynamiczne interakcje z koregulatorami, PR hamuje ekspresję genów, które zwiększają aktywność skurczową myometrium i przyczyniają się do rozpoczęcia porodu. Wcześniej wykazaliśmy że czynnik splicingowy RNA związany z PTB (PSF) może funkcjonować jako korepresor PR. W niniejszym raporcie wykazaliśmy, że partner heterodimeru PSF, p54nrb (białko wiążące oktamer, niezawierające domeny POU), może również funkcjonować jako p54nrb oddziałuje bezpośrednio z PR, niezależnie od progesteronu. niezależnie od progesteronu. W przeciwieństwie do PSF, p54nrb nie zwiększa degradacji białka PR ani nie blokuje wiązania PR z DNA. Raczej p54nrb rekrutuje mSin3A poprzez swój koniec N do kompleksu PR-DNA, co skutkuje zahamowaniem PR pośredniczy w transaktywacji elementu odpowiedzi progesteronu-lucyferazy genu reporterowego. PR hamował również transkrypcję genu koneksyny 43 (Gja1), efekt zależny od obecności miejsca białka aktywatora 1 w proksymalnym promotorze Gja1. proksymalnego promotora Gja1. Mutacja tego miejsca zniosła represję za pośrednictwem PR i zmniejszała rekrutację PR i p54nrb do promotora Gja1. Ponadto, obniżenie ekspresji p54nrb przez małe interferujące RNA złagodziło represja transkrypcji Gja1 za pośrednictwem PR, podczas gdy nadekspresja p54nrb wzmocniła ją. W fizjologicznym kontekście ciąży poziomy białka p54nrb zmniejsza się wraz ze zbliżaniem się porodu w myometrium szczura. Wnioskujemy, że p54nrb jest transkrypcyjnym korepresorem PR. Zmniejszona ekspresja p54nrb w czasie czas porodu może działać w celu osłabienia hamowania ekspresji koneksyny 43 za pośrednictwem PR i przyczyniać się do rozpoczęcia porodu. --- P54nrb jest białkiem zaangażowanym w wiele procesów jądrowych, których specyficzne funkcje funkcje mogą korelować z jego obecnością w różnych lokalizacjach jądrowych. Tutaj scharakteryzowaliśmy paraspeckles, domenę subjądrową zawierającą p54nrb i inne białka wiążące RNA, w tym PSP1, białko o podobieństwie sekwencji do p54nrb, które działa jako marker dla paraspeckles. Pokazujemy, że PSP1 oddziałuje in vivo z podzbiorem całkowitej puli komórkowej p54nrb. Mapujemy domenę w PSP1, która pośredniczy w tej interakcji i pokazujemy, że jest ona wymagana do prawidłowej lokalizacji PSP1 do paraspekli. Ta interakcja jest konieczna, ale ale niewystarczająca do ukierunkowania paraspeckle przez PSP1, co wymaga również RRM zdolnego do wiązania RNA. Blokowanie reinicjacji transkrypcji RNA Pol II na koniec mitozy z DRB zapobiega tworzeniu się paraspeckle, które wznawia się po usunięciu DRB, co wskazuje, że tworzenie paraspeckle jest zależne od transkrypcji RNA Polimerazy II. Tak więc paraspeckle są miejscami, w których podzbiór całkowita pula komórkowa p54nrb jest ukierunkowana w sposób zależny od polimerazy RNA II sposób. --- Komponent paraspeckle 1 (PSPC1) i heterodimer zawierający domenę non-POU heterodimer białka wiążącego oktamer (NONO) jest istotnym składnikiem strukturalnym paraspeckles, ciał rybonukleoproteinowych znajdujących się w przestrzeni międzychromatynowej jąder komórkowych ssaków. PSPC1 i NONO należą do grupy Drosophila behaviour i ludzkiej rodziny białek splicingowych (DBHS), która jest powiązana z wieloma aspektach przetwarzania RNA. Heterodimer rdzenia DBHS konserwowanego regionu PSPC1 i NONO, składający się z dwóch tandemowo ułożonych motywów rozpoznawania RNA (RRM), motywu domena NONA/paraspeckle (NOPS) i część przewidywanej domeny coiled-coil została skrystalizowana w grupie przestrzeni C2. został skrystalizowany w grupie przestrzennej C2, z parametrami komórki elementarnej a = 90.90, b = 67.18, c = 94.08 Å, β = 99.96°. Kryształ zawierał jeden heterodimer w jednostce asymetrycznej i dyfraktowany z rozdzielczością 1,9 Å przy użyciu promieniowania synchrotronowego. --- RNF43 jest onkogennym białkiem palca RING ulegającym nadekspresji w raku jelita grubego. Aby przeanalizować jego funkcje biologiczne, zbadaliśmy białka oddziałujące z RNF43 przez test pull-down i MS. Zidentyfikowaliśmy heterodimer, p54nrb i PSF, jako partnerów wiążących RNF43 RNF43 i potwierdziliśmy ich fizyczną interakcję in vivo w eksperymencie eksperyment koimmunoprecypitacji. Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że koekspresja PSF przenosi RNF43 z peryferii jądra do nukleoplazmy. nukleoplazmy. Tak więc, proteomiczna identyfikacja białek związanych z RNF43 rzuca światło na jego dynamiczną sieć interakcji w zdarzeniach jądrowych. --- Białka z rodziny Drosophila behavior/human splicing (DBHS) obejmują SFPQ (PSF) ssaków, NONO (p54nrb), PSPC1 oraz bezkręgowce NONA i Hrp65. Białka DBHS są głównie jądrowe i są zaangażowane w transkrypcyjną i posttranskrypcyjną regulację genów. transkrypcyjne i posttranskrypcyjne funkcje regulacyjne genów, a także naprawę DNA. BIAŁKA DBHS wpływają na szeroką gamę procesów biologicznych, w tym na regulację rytmu okołodobowego, kancerogenezę i progresję raka. Dodatkowo, białka DBHS ssaków wiążą się z architektonicznym długim niekodującym RNA NEAT. niekodującym RNA NEAT1 (Menε/β), tworząc paraspeckles, ciała subjądrowe, które zmieniają ekspresję genów poprzez jądrową retencję ekspresję genów poprzez jądrową retencję RNA. Tutaj opisujemy strukturę krystaliczną strukturę heterodimeru wielodomenowego konserwatywnego regionu białek DBHS PSPC1 i NONO. Białka te tworzą intensywnie spleciony dimer, zgodny z obserwacją, że różne białka DBHS są zazwyczaj kopuryfikowane z komórek ssaków, co sugeruje, że działają one jako obligatoryjne heterodimery. heterodimery. Heterodimer PSPC1/NONO ma prawoskrętną antyrównoległą antyrównoległą cewkę, która pozycjonuje dwie z czterech domen motywu rozpoznawania RNA w bezprecedensowym układzie po obu stronach 20-Å kanału. Ta konfiguracja jest wspierana przez interakcję białko:białko obejmującą domenę NONA/paraspeckle która jest charakterystyczna dla rodziny DBHS. Badając różne mutanty i skrócenia w hodowli komórkowej, stwierdziliśmy, że białka DBHS wymagają dodatkowej antyrównoległej zwiniętej cewki emanującej z obu końców dimeru dla do tworzenia ciał podjądrowych paraspeckle. Wyniki te sugerują, że paraspeckle mogą potencjalnie tworzyć się poprzez samoasocjację dimerów DBHS w struktury wyższego rzędu struktury.
Białko NONO tworzy heterodimery. Z jakimi białkami?
Białko NONO tworzy heterodimery z PSPC1, SFPQ.