Migracja neuronów jest podstawowym procesem podczas rozwoju kory mózgowej. kory mózgowej i jest regulowany przez składniki cytoszkieletu. Dynamika mikrotubul może być modulowana przez potranslacyjne modyfikacje podjednostek tubuliny podjednostek tubuliny. Acetylacja α-tubuliny przy lizynie 40 jest ważna w regulacji właściwości mikrotubul. właściwości mikrotubul, a proces ten jest kontrolowany przez acetylotransferazę i deacetylazy. MEC-17 jest nowo odkrytą acetylotransferazą α-tubuliny, która odgrywa główną rolę w acetylacji α-tubuliny u różnych gatunków in vivo. gatunków in vivo. Jednak fizjologiczna funkcja MEC-17 podczas rozwoju neuronalnego jest w dużej mierze nieznana. jest w dużej mierze nieznana. Tutaj donosimy, że MEC-17 ma kluczowe znaczenie dla migracji neuronów korowych u szczura. MEC-17 ulegał silnej ekspresji w korze mózgowej podczas rozwoju. Niedobór MEC-17 powodował wady migracyjne w korowych neuronach projekcyjnych i interneuronach, a także zaburzał przejście neuronów projekcyjnych ze stadium wielobiegunowego do stadium jednobiegunowego/dwubiegunowego w strefie pośredniej kory mózgowej. Ponadto, knockdown deacetylazy α-tubuliny HDAC6 lub nadekspresja tubuliny (K40Q) w celu naśladować acetylowaną α-tubulinę może zmniejszyć wady migracyjne i morfologiczne spowodowane niedoborem MEC-17 w korowych neuronach projekcyjnych. Zatem MEC-17, który reguluje acetylację α-tubuliny, wydaje się kontrolować migrację i morfologiczne neuronów korowych. Odkrycie to ujawnia znaczenie MEC-17 i acetylacji α-tubuliny w rozwoju kory mózgowej. --- Ludzka rodzina HDAC (deacetylaz histonowych), dobrze zwalidowany cel przeciwnowotworowy, odgrywa kluczową rolę w kontroli ekspresji genów poprzez regulację transkrypcji. Podczas gdy HDAC można podzielić na trzy główne klasy, HDAC klasy I, klasę II i klasę III HDAC (sirtuiny), obecnie nie jest jasne, czy hamowanie wielu HDAC przy użyciu inhibitorów pan-HDAC lub celowanie w określone izoform, które wykazują nieprawidłowe poziomy w guzach, okaże się bardziej skuteczną strategią przeciwnowotworową w klinice. strategia przeciwnowotworowa w klinice. Aby rozwiązać powyższe kwestie, przetestowaliśmy (inhibitorów HDAC) przeciwko panelowi rhHDAC (rekombinowanych ludzkich HDAC). (rekombinowanych ludzkich izoform HDAC). Osiem rhHDAC uległo ekspresji przy użyciu systemu przy użyciu systemu bakulowirusowego, a test HDAC ze znakiem Fluor de Lystrade (Biomol International) został zoptymalizowany dla każdej oczyszczonej izoformy. Siła działania i selektywność dziesięciu HDAC na izoformach klasy I (rhHDAC1, rhHDAC2, rhHDAC3 i rhHDAC8) i izoformach klasy II (rhHDAC4, rhHDAC6, rhHDAC7 i rhHDAC9). MS-275 był HDAC1-selektywny, MGCD0103 był HDAC1- i HDAC2-selektywny, apicydyna była HDAC2- i HDAC3-selektywna, a kwas walproinowy był specyficznym inhibitorem klasy I HDAC klasy I. Związki pochodne kwasu hydroksamowego (trichostatyna A, NVP-LAQ824, panobinostat, ITF2357, worinostat i belinostat) były silnymi inhibitorami pan-HDAC inhibitorami. Hamujący wzrost wpływ HDAC na komórki HeLa wykazał, że zarówno inhibitory pan-HDAC, jak i inhibitory specyficzne dla klasy I hamowały wzrost komórek. Wyniki wykazały również, że zarówno leczenie pan-HDAC, jak i inhibitorami specyficznymi dla klasy I skutkowało w zwiększonej acetylacji histonów, ale tylko leczenie inhibitorem pan-HDAC skutkowało zwiększoną acetylacją tubuliny, co jest zgodne z ich aktywnością wobec izoformy HDAC6. --- TŁO: Tubulina jest głównym substratem cytoplazmatycznej deacetylazy histonowej klasy II deacetylazy HDAC6. Zahamowanie HDAC6 skutkuje wyższym poziomem acetylowanej tubuliny i zwiększone wiązanie białka motorycznego kinezyny-1 z tubuliną, co promuje transport ładunków wzdłuż mikrotubul. Zależny od mikrotubul transport wewnątrzkomórkowy może być zatem regulowany przez modulowanie aktywności HDAC6. Wcześniej wykazaliśmy, że neuromodulator serotonina zwiększa ruch mitochondriów w neuronach hipokampa poprzez szlak sygnałowy Akt-GSK3beta. szlak sygnałowy. Tutaj wykazujemy rolę HDAC6 w tym szlaku sygnałowym. METODOLOGIA/GŁÓWNE ODKRYCIA: Odkryliśmy, że obecność tubacyny, specyficznego inhibitora specyficznego inhibitora HDAC6, dramatycznie zwiększyła ruch mitochondriów w neuronach hipokampa. neurony hipokampa, podczas gdy niltubacyna, nieaktywny analog tubacyny, nie miał wpływu. W porównaniu do hodowli kontrolnych, wyższe poziomy acetylowanej tubuliny w neuronach leczonych tubacyną, a więcej kinezyny-1 było związanych z mitochondriami izolowanymi z tych neuronów. Zahamowanie GSK3beta zmniejszyło aktywność deacetylazy cytoplazmatycznej i zwiększało acetylację tubuliny, podczas gdy blokada Akt, który fosforyluje i reguluje w dół GSK3beta, zwiększała zwiększa aktywność deacetylazy cytoplazmatycznej i zmniejsza acetylację tubuliny. Zgodnie z tym, podawanie 5-HT, 8-OH-DPAT (specyficzny agonista receptora 5-HT1A agonisty) lub fluoksetyny (inhibitora wychwytu zwrotnego 5-HT) zwiększało acetylację tubuliny acetylację. Stwierdzono, że GSK3beta kolokalizuje się z HDAC6 w neuronach hipokampa neuronach hipokampa, a hamowanie GSK3beta skutkowało zmniejszonym wiązaniem przeciwciała do fosfoseryny-22, potencjalnego miejsca fosforylacji GSK3beta w HDAC6. GSK3beta może zatem regulować aktywność HDAC6 poprzez fosforylację. WNIOSKI/ZNACZENIE: Badanie to pokazuje, że HDAC6 odgrywa ważną rolę w modulacji mitochondriów. rolę w modulacji transportu mitochondrialnego. Związek między HDAC6 i GSK3beta, ma ważne implikacje dla naszego zrozumienia zaburzeń neurodegeneracyjnych. zaburzeń neurodegeneracyjnych. W szczególności, nieprawidłowy transport mitochondrialny, który został zaobserwowany w takich zaburzeniach, jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona może wynikać z nieprawidłowej regulacji HDAC6 przez GSK3beta. HDAC6 może stanowić atrakcyjny cel w leczeniu tych zaburzeń. --- Przebudowa cytoszkieletu jest niezbędnym etapem morfologicznego przejścia z preadipocytów do dojrzałych adipocytów. Chociaż mikrotubule odgrywają kluczową rolę w w organizowaniu struktury komórkowej, regulacja dynamiki mikrotubul podczas adipogenezy pozostaje niejasna. adipogenezy pozostaje niejasna. W niniejszym artykule wykazaliśmy, że acetylacja α-tubuliny jest regulowana w górę podczas adipogenezy, a rozwój adipocytów jest zależy od acetylacji α-tubuliny, ponieważ ekspresja odpornej na acetylację α-tubuliny znacząco hamuje adipogenezę. Co więcej, acetylacja α-tubuliny jest pod kontrolą acetylotransferazy MEC-17 i deacetylaz SIRT2 (Sirtuina 2) i HDAC6 (deacetylaza histonowa 6). Rozwój adipocytów jest zahamowany w komórkach pozbawionych MEC-17, ale wzmocniony w komórkach z nadekspresją MEC-17 komórkach. Wreszcie, pokazujemy, że katanina, białko rozszczepiające mikrotubule z o zwiększonej aktywności na acetylowanej α-tubulinie, jest aktywnie zaangażowana w adipogenezę. Proponujemy, aby skoordynowana regulacja w górę acetylacji α-tubuliny inicjowała remodelowanie cytoszkieletu poprzez promowanie odcinania α-tubuliny przez kataninę, co z kolei z kolei umożliwia ekspansję kropelek lipidów i przyspiesza morfologiczne przejście w kierunku dojrzałych adipocytów. --- Neurotensyna (NT), peptyd jelitowy wydzielany z komórek N w jelicie cienkim, reguluje różne funkcje fizjologiczne w jelicie cienkim, reguluje szereg funkcji fizjologicznych przewodu pokarmowego, w tym wydzielanie przewodu pokarmowego, w tym wydzielanie, motorykę jelit i wzrost jelit. Klasa IA 3-kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3K), która składa się z katalitycznego p110 (α, β i δ) i podjednostek regulatorowych p85, została zaangażowana w regulację wydzielania hormonów z komórek endokrynnych. Jednak podstawowe mechanizmy pozostają słabo poznane. W szczególności rola PI3K w wydzielaniu peptydów jelitowych nie jest znana. nie jest znana. Tutaj pokazujemy, że podjednostka katalityczna PI3K, p110α, negatywnie reguluje wydzielanie NT in vitro i in vivo. Wykazaliśmy, że hamowanie p110α, ale nie p110β, indukuje uwalnianie NT w BON, ludzkiej linii komórek endokrynnych linia komórkowa, która wyraża mRNA NT i wytwarza peptyd NT w sposób analogiczny do komórek do komórek N i QGP-1, linii komórek endokrynnych trzustki, która wytwarza peptyd NT peptyd. Natomiast nadekspresja p110α zmniejsza wydzielanie NT. Konsekwentnie, inhibicja p110α zwiększa poziom NT w osoczu u myszy. Aby dalej określić mechanizmy przyczyniające się do tego efektu, wykazujemy, że p110α zwiększa przemieszczanie się ziarnistości NT poprzez regulację w górę acetylacji α-tubuliny acetylację; wydzielaniu NT zapobiega nadekspresja HDAC6, deacetylazy α-tubuliny. deacetylazy. Ponadto, białko związane z rasą Rab27A (małe białko G) i kinaza D o masie 220 kDa (Kidins220), które są związane z granulkami NT granulkami, odgrywają odpowiednio negatywną i pozytywną rolę w wydzielaniu NT indukowanym inhibicją p110α. Nasze odkrycia identyfikują krytyczną rolę i nowe mechanizmy szlaku sygnałowego PI3K w kontroli transportu i uwalniania granulek hormonów jelitowych. transport i uwalnianie granulek hormonalnych. --- Angiotensyna II jest związana z przebudową naczyń krwionośnych. Mikrotubule złożone z z tubulin reguluje kształt, migrację i przeżywalność komórek. Acetylacja tubuliny odgrywa ważną rolę w kontroli struktury mikrotubuli i funkcji komórkowych opartych na mikrotubulach. W tym badaniu angiotensyna II indukowała demontaż i deacetylację α-tubuliny, które były blokowane przez wstępne traktowanie z blokerem receptora angiotensyny II typu 1 losartanem i inhibitorem deacetylazy sirtuiny klasy inhibitora deacetylazy sirtinolu, a także przez zubożenie deacetylazy SIRT2 przy użyciu interferencji interferencji RNA. Zbadaliśmy udział SIRT2 w indukowanym angiotensyną II indukowanej przez angiotensynę migracji komórek śródbłonka przy użyciu metody komory Boydena. Angiotensyna II powodowała znaczny wzrost migracji komórek, który był zablokowany przez wstępne leczenie sirtinolem i zubożenie SIRT2. Doniesiono, że że angiotensyna II jest zaangażowana w reorganizację cytoszkieletu stymulowaną przez mechaniczne rozciąganie komórek śródbłonka. Wykazaliśmy również, że komórki śródbłonka komórki śródbłonka poddane 10% jednoosiowemu rozciąganiu wykazywały pionowe ustawienie w kierunku kierunku rozciągania i deacetylację tubuliny w obwodowej części komórek, w porównaniu z kontrolnymi komórkami statycznymi. Zmiany mikrotubul wywołane mechanicznym rozciąganiem mikrotubul były blokowane przez wstępne traktowanie sirtinolem i zubożenie SIRT2. Mikroskopia immunofluorescencyjna wykazała, że acetylowana tubulina była zmniejszona w komórkach adhezyjnych płytek krwi i komórek śródbłonka-1-dodatnich w błonie wewnętrznej ściany aorty u myszy obciążonych angiotensyną II, w porównaniu z myszami obciążonych nośnikiem kontrolnym. Dane te pokazują, że angiotensyna II i mechaniczne stymulują redystrybucję mikrotubul i deacetylację poprzez SIRT2 w komórkach śródbłonka. komórkach śródbłonka, sugerując pojawiającą się rolę SIRT2 w indukowanej nadciśnieniem remodelingu naczyń krwionośnych. --- Wykazano, że degeneracja Wallera, zwyrodnienie aksonów po przecięciu jest znacznie opóźniona u zmutowanej myszy zwanej powolną degeneracją Walleriana (Wld(S)). (Wld(S)). Myszy te wykazują również odporność na degenerację aksonów spowodowaną przez leki depolimeryzujące mikrotubule, co sugeruje, że mikrotubule aksonalne są stabilizowane. Tutaj skupiliśmy się na acetylacji tubuliny, potranslacyjnej modyfikacji potranslacyjnej modyfikacji związanej ze stabilnością mikrotubul. Stwierdziliśmy że podstawowy poziom acetylacji mikrotubul był zwiększony w hodowanych komórkach ziarnistych móżdżku od myszy Wld(S). Nikotynamid, ale nie 3-aminobenzamid, inhibitor polimerazy poli(ADP)rybozy, zwiększał acetylację tubuliny acetylację i odporność na degenerację aksonalną w hodowanych komórkach ziarnistych móżdżku komórek od myszy typu dzikiego (WT), co sugeruje, że białko związane z Sir2 ssaków (SIRT) 2, zależna od dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD) tubulina może modulować odporność na degenerację aksonów. Rzeczywiście, poziomy poziomy NAD i SIRT2 były obniżone w cytoplazmie komórek ziarnistych Wld(S) Wld(S). Co więcej, nadekspresja SIRT2 znosiła hiperacetylację mikrotubul i odporność na zwyrodnienie aksonalne w komórkach ziarnistych Wld(S). odporność na degenerację aksonalną w tych komórkach. I odwrotnie, nokaut SIRT2 przez przy użyciu wektora lentiwirusowego wyrażającego małe interferujące RNA, zwiększone mikrotubule acetylację mikrotubul i odporność na degenerację aksonalną w komórkach ziarnistych WT. Podsumowując razem, wyniki te sugerują, że deacetylacja tubuliny za pośrednictwem SIRT2 jest zaangażowana zarówno w hiperacetylację mikrotubul, jak i odporność na aksonalną degenerację w komórkach ziarnistych Wld(S). --- TŁO: Acetylacja histonów w chromatynie odgrywa kluczową rolę w promowaniu dynamicznych odpowiedzi transkrypcyjnych w neuronach. dynamicznych odpowiedzi transkrypcyjnych w neuronach, które wpływają na neuroplastyczność związane ze zdolnościami poznawczymi, ale specyficzne acetylotransferazy histonowe (HAT) które tworzą takie znaki epigenetyczne, pozostają do wyjaśnienia. METODY I USTALENIA: Tutaj używamy połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ) jako dobrze scharakteryzowany model synapsy do identyfikacji HAT, które kontrolują synaptyczny przebudowę i strukturę synapsy. Pokazujemy, że HAT dTip60 jest skoncentrowany zarówno pre i postsynaptycznie w obrębie NMJ. Presynaptyczne ukierunkowane zmniejszenie aktywności dTip60 HAT powoduje znaczny wzrost liczby boutonów synaptycznych, które szczególnie wpływa na boutony typu Is. Nadmiar boutonów wykazuje tłumienie markera funkcji synaptycznej strefy aktywnej bruchpilot, co sugeruje defekty w funkcji neurotransmisji. Analiza organizacji mikrotubul w obrębie tych nadmiar boutonów przy użyciu barwienia immunohistochemicznego na białko futsch związane z mikrotubulami białko futsch ujawnia znaczny wzrost rearanżacji architektury pętli mikrotubul, która jest architektury pętli mikrotubul, która jest wymagana do podziału boutonu. Ponadto, poziomy acetylacji α-tubuliny mikrotubul specyficznie rozciągających się do końcowe boutony synaptyczne są zmniejszone w odpowiedzi na redukcję dTip60 HAT. WNIOSKI: Nasze wyniki są pierwszymi, które wykazują przyczynową rolę dla HAT dTip60 w kontroli plastyczności synaptycznej, która jest osiągana, przynajmniej w częściowo poprzez regulację cytoszkieletu mikrotubul synaptycznych. Odkrycia te mają implikacje dla zależnych od dTip60 HAT mechanizmów epigenetycznych leżących u podstaw funkcji poznawczych. funkcji poznawczych. --- Potranslacyjna modyfikacja tubuliny wydaje się być wysoce kontrolowanym mechanizmem mechanizm, który reguluje funkcjonowanie mikrotubul. Acetylacja grupy ε-amino grupy Lys-40 α-tubuliny oznacza stabilne mikrotubule, chociaż związek przyczynowy związek między acetylacją tubuliny a stabilnością mikrotubul pozostaje słabo poznany. HDAC6, deacetylaza tubuliny, odgrywa kluczową rolę w w utrzymaniu typowej dystrybucji acetylowanych mikrotubul w komórkach. Tutaj, poprzez przy użyciu tubastatyny A, inhibitora specyficznego dla HDAC6, oraz za pomocą siRNA zubożenia HDAC6, zbadaliśmy, czy acetylacja tubuliny odgrywa rolę w regulacji stabilności mikrotubul. stabilność mikrotubul. Odkryliśmy, że podczas gdy zarówno farmakologiczne hamowanie HDAC6, jak i jego zubożenie zwiększają acetylację mikrotubul, tylko farmakologiczne hamowanie aktywności HDAC6 prowadzi do wzrostu stabilności mikrotubul stabilności mikrotubul w warunkach depolimeryzacji indukowanej zimnem i nokodazolem. Leczenie tubastatyną A hamowało dynamikę poszczególnych mikrotubul w komórkach MCF-7 i opóźniało ponowny montaż zdepolimeryzowanych mikrotubul. Co ciekawe, zarówno lokalizacja HDAC6 na mikrotubulach, jak i ilość HDAC6 związanej z polimeryczną frakcją tubuliny stwierdzono wzrost w komórkach traktowanych tubastatyną A w porównaniu z komórkami kontrolnymi, co sugeruje, że farmakologiczne hamowanie HDAC6 zwiększa wiązanie HDAC6 z mikrotubulami. mikrotubul. Dowody przedstawione w tym badaniu wskazują, że zwiększone wiązanie HDAC6, a nie wiązanie HDAC6, a nie acetylacja per se, powoduje stabilność mikrotubul. stabilność mikrotubul. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że oprócz funkcji deacetylazy deacetylazy, HDAC6 może funkcjonować jako MAP, który reguluje dynamikę mikrotubul w pewnych warunkach. dynamikę mikrotubul w określonych warunkach. --- Używaliśmy spolaryzowanych, wątrobowych komórek WIF-B do badania indukowanego etanolem uszkodzenie wątroby. Komórki te polaryzują się w hodowli i zachowują liczne aktywność specyficzną dla wątroby, w tym zdolność do metabolizowania alkoholu. Wcześniej odkryliśmy, że mikrotubule były bardziej acetylowane i bardziej stabilniejsze w komórkach WIF-B traktowanych etanolem i że zwiększona acetylacja mikrotubul wymagała metabolizmu etanolu i była prawdopodobnie mediowana przez aldehyd octowy. Badanie to miało na celu identyfikację mechanizmu odpowiedzialnego za zwiększoną acetylację mikrotubul. acetylację mikrotubul. Zbadaliśmy ekspresję dwóch znanych deacetylaz mikrotubul, deacetylazy histonowej 6 (HDAC6) i Sirtuiny T2 (SirT2), w komórkach WIF-B. Immunoblotting, mikroskopia immunofluorescencyjna i testy z użyciem inhibitora SirT2 wykazały, że komórki WIF-B nie wykazują ekspresji SirT2. W W przeciwieństwie do tego, HDAC6 ulegał wysokiej ekspresji w komórkach WIF-B. Dodanie trichostatyny A (TSA), inhibitora HDAC6, indukowało acetylację mikrotubuli w takim samym stopniu jak w komórkach traktowanych etanolem (około trzykrotnie). Chociaż znakowanie immunofluorescencyjne ujawniło, że dystrybucja HDAC6 nie zmieniła się w komórkach traktowanych etanolem komórki, immunoblotting wykazał, że poziom białka HDAC6 nieznacznie spadł. ROZPUSZCZALNOŚĆ HDAC6 była zwiększona w komórkach leczonych nokodazolem, co sugeruje upośledzone wiązanie mikrotubul. wiązanie mikrotubul. Bezpośrednie testy wiązania mikrotubul potwierdziły tę hipotezę. hipotezę. Zmniejszonemu wiązaniu mikrotubul częściowo zapobiegał 4-metylopirazol, wskazując, że efekt był częściowo mediowany przez aldehyd octowy. Co ciekawe, HDAC6 z komórek traktowanych etanolem był w stanie wiązać i deacetylować egzogenną tubulinę w takim samym stopniu jak kontrola, co sugeruje, że modyfikacje tubuliny wywołane etanolem modyfikacje tubuliny zapobiegały wiązaniu HDAC6 z endogennymi mikrotubulami. WNIOSEK: Proponujemy, aby niższe poziomy HDAC6 w połączeniu ze zmniejszonym wiązaniem mikrotubul wiązanie mikrotubul prowadzi do zwiększonej acetylacji tubuliny w komórkach traktowanych etanolem komórkach.
Które enzymy biorą udział w kontroli acetylacji tubuliny?
Acetylotransferaza MEC-17 oraz deacetylazy SIRT2 (Sirtuina 2), HDAC6 (deacetylaza histonowa 6) i dTip60 są znane z kontrolowania poziomu acetylacji tubuliny.