Leukodystrofia globoidalna (GCL lub choroba Krabbego) jest chorobą recesywną spowodowaną mutacjami enzymu lizosomalnego galaktocerebrozydazy (GALC) i twitcher jest mysim modelem GCL. Przygotowaliśmy retrowirusowe linie komórek do transdukcji genu GALC. Transdukcja retrowirusowa przywróciła aktywność GALC w fibroblastach GCL i zwiększyła tę aktywność do bardzo wysokich poziomów w immortalizowanych progenitorach neuronalnych. unieśmiertelnionych neuronalnych komórkach progenitorowych (komórki ST14A). Aktywność GALC była również znormalizowana w fibroblastach twitcher współhodowanych z komórkami ST14A z nadekspresją GALC, wykazując, że enzym ten jest wydzielany i może być skutecznie importowany przez komórki z niedoborem GALC. Wyniki te stanowią niezbędne tło do oceny terapeutycznego efektu przeszczepienia do mózgu neuronalnych komórek progenitorowych zmodyfikowanych w celu uwalniania wysokich poziomów GALC. --- Ludzka galaktocerebrozydaza, enzym z niedoborem w chorobie Krabbego, została oczyszczono poprzez kilka etapów kolumny hydrofobowej i filtrację żelową, 22 650-krotnie z ludzkich limfocytów. Wykorzystując informacje na temat jego N-końcowej i i wewnętrznych sekwencji aminokwasowych oraz metody reakcji łańcuchowej polimerazy, sklonowaliśmy c sklonowaliśmy pełnej długości cDNA dla enzymu. Wydedukowana sekwencja aminokwasowa pasowała do wszystkich ustalonych sekwencji aminokwasowych. Sekwencja 3780 nukleotydów zawierała 2007 nukleotydów, które kodowały jednołańcuchowy peptyd 669 reszt aminokwasowych z 26 resztami aminokwasowymi. reszt z 26-aminokwasowym N-końcowym peptydem sygnałowym i sześcioma potencjalnymi miejscami glikozylacji związanymi z asparaginą. W cDNA galaktocerebrozydazy wykryto pasmo mRNA o wielkości około 4 kb materiału pasma mRNA w ludzkich hodowanych fibroblastach skóry. Stwierdzono mutację nonsensowną mutację w kodonie 369 (GAA-->TAA) w sekwencji kodującej cDNA amplifikowanego z hodowanych fibroblastów skóry mRNA od pacjenta z typową chorobą Krabbego. Krabbego. --- Choroba Krabbego jest dziedziczoną autosomalnie recesywnie chorobą demielinizacyjną, która jest niedobór enzymu lizosomalnego, galaktocerebrozydazy. Patofizjologicznymi tej choroby jest skrajna demielinizacja w istocie białej i nerwach obwodowych, występowanie i nerwach obwodowych, istnienie komórek globoidalnych, brak akumulacji głównych substratów, tj. substratów, tj. galaktocerebrozydazy w tkankach i akumulacja psychozyny. Molekularne podstawy tej choroby, w tym izolacja cDNA dla ludzkiej i mysiej galaktocerebrozydazy. i mysiej galaktocerebrozydazy oraz klonowanie genomu tego genu. Próba terapii genowej terapii genowej na twitcherze, mysim modelu choroby Krabbego, może być przełomem w terapii tej postępującej choroby stanowić przełom w terapii tej postępującej choroby demielinizacyjnej. --- W niniejszym rozdziale szczegółowo opisano praktyczną procedurę przygotowania znakowanego radioaktywnie galaktocerebrozydu i jego zastosowanie w oznaczeniu galaktocerebrozydazy (GalCase), enzymu z niedoborem w leukodystrofii komórek globoidalnych (choroba Krabbego). Zakres referencyjny dla leukocytów i fibroblastów wynosi 0,9-4,4 i 8-36 moli substratu hydrolizowanego na godzinę na miligram białka. Ze względu na jego niską obfitość, enzym ten jest trudny do oznaczenia w niektórych sytuacjach, takich jak jak diagnostyka prenatalna poprzez pobieranie próbek kosmówki. Aby temu zapobiec, stosuje się zmodyfikowany test zmodyfikowany test, w którym tylko radioznakowany substrat jest zawarty w inkubacji. inkubacji. Zapewnia to wyraźne oddzielenie dotkniętych próbek od od próbek kontrolnych. Opisane tutaj metody powinny być powtarzalne w każdym laboratorium. laboratorium. --- Galaktocerebrozydaza (GALC) wykazuje niedobór we wszystkich tkankach ludzkich i zwierzęcych modeli modeli zwierzęcych z leukodystrofią globoidalną (GLD) lub chorobą Krabbego. Niedobór powoduje zmniejszony katabolizm lizosomalny niektórych galaktolipidów, w tym galaktozyloceramidu w tym galaktozyloceramidu i psychozyny, które są syntetyzowane maksymalnie podczas mielinizacji. Zgodnie z obecnymi teoriami, akumulacja psychozyny u ludzi i zwierząt z GLD indukuje degenerację oligodendrocytów i mielinizacja ustaje. Transdukcja oligodendrocytów myszy z drgawkami za pomocą wektora retrowirusowego retrowirusowym zawierającym cDNA GALC może skorygować niedobór enzymu w tych komórkach. w tych komórkach. Nasze dane pokazują, że astrocyty i oligodendrocyty twitcher mogą internalizować egzogenny GALC, a także przekazywać enzym zmutowanym komórkom glejowym. zmutowanym komórkom glejowym. Przeciwciała przeciwko ludzkiemu GALC zlokalizowały antygen GALC w komórkach transdukowanych retrowirusowo transdukowanych retrowirusowo komórkach i komórkach otrzymujących enzym poprzez wydzielanie i do frakcji lizosomalnej. W rzeczywistości badania immunocytochemiczne w transdukowanych oligodendrocytach wykazały, że GALC kolokalizuje w pęcherzykach białko błonowe związane z lizosomami-2 (LAMP2) (+). Ponadto, znakowanie komórek z anty-GALC i markerem dla oligodendrocytów wykazało, że po różnicowania, transdukowane oligodendrocyty twitcher osiągnęły normalną konfigurację rozgałęzioną konfigurację procesu, podczas gdy nietransdukowane komórki wykazują jedynie nieprawidłową morfologię. morfologię. Korekta fenotypu w zmutowanych oligodendrocytach była również zaobserwowano również po transferze enzymu. Badania te wskazują, że aktywność GALC dostarczana do hodowanych oligodendrocytów myszy twitcher różnymi metodami może skorygować patologiczny fenotyp tych komórek. --- Wykazano materiał reagujący krzyżowo z beta-galaktozydazą galaktozyloceramidu w fibroblastach mózgu, wątroby i skóry od pacjentów z chorobą Krabbego. Zmutowany enzym zmutowany enzym był antygenowo identyczny z normalnym enzymem i wykazywał podobną ruchliwość elektroforetyczną. Normalne ilości katalitycznie w tkankach pacjentów zmierzono za pomocą czułego testu immunodyfuzji promieniowej. promieniowy test immunodyfuzji, wskazując, że mutacja jest w genie strukturalnym dla białka enzymu. --- Leukodystrofia globoidalna (choroba Krabbego) jest autosomalnym recesywnym zaburzeniem wynikającym z niedoboru aktywności galaktocerebrozydazy (GALC). GALC jest GALC jest odpowiedzialna za lizosomalny katabolizm galaktozyloceramidu, głównego lipidu w mielinie, nerkach i komórkach nabłonkowych jelita cienkiego i okrężnicy. Opisujemy molekularne klonowanie ludzkiego cDNA GALC i jego ekspresję w komórkach COS-1. Zdegenerowane startery PCR, pochodzące z N-końcowej sekwencji aminokwasowej z pasma 51 kDa z ludzkiego mózgu, zostały użyte do amplifikacji RNA kocich jąder, a uzyskany produkt a uzyskany produkt wykorzystano do badań przesiewowych bibliotek ludzkich jąder i mózgu. Dwa nakładające się klony zawierały całkowity region kodujący białko, podczas gdy dodatkowe klony i amplifikacja PCR były potrzebne do uzyskania pełnego końca 3' cDNA. cDNA. Uzyskane 3795 bp zawiera 47 bp 5' do miejsca startu inicjacji, 2007 bp otwartej ramki odczytu (kodującej 669 aminokwasów) i 1741 bp sekwencji 3' sekwencji nieulegającej translacji. Modyfikacja sekwencji otaczającej kodon do bardziej korzystnej dla ekspresji, spowodowała 6-krotny wzrost aktywności GALC w transfekowanych GALC w transfekowanych komórkach COS-1. Izolacja tego klonu pozwoli pozwoli na zbadanie przyczyn niedoboru GALC u ludzi i dostępnych modeli zwierzęcych dostępnych modeli zwierzęcych, opracowanie dokładniejszych testów identyfikacji pacjentów i nosicieli oraz ocenę metod identyfikacji pacjentów i nosicieli oraz ocenę metod skutecznego leczenia niedoboru GALC początkowo z wykorzystaniem modeli zwierzęcych. --- TŁO: Choroba Krabbego (leukodystrofia globoidalna; GLD) jest spowodowana mutacjami genu GALC. mutacje w genie GALC. Beta-galaktocerebrozydaza (GALC) jest specyficzną beta-galaktozydazą, która jest wadliwa w GLD. Około 90% pacjentów z GLD ma przebieg śmiertelnej demielinizacji mózgu, ale 10% ma późniejszy początek objawów (LOGLD) i przeżywa. (LOGLD) objawów i przeżywa jedną lub kilka dekad. METODY: Aktywność GALC w stosunku do galaktozyloceramidu (GC) i galaktozylosfingozyny (psychozyny; PS) określono w białych krwinkach i hodowanych fibroblastach pochodzących od pacjentów z GLD i kontroli przy użyciu naturalnych substratów znakowanych trytem. W galaktozylofingozynie (psychozynie) beta-galaktozydazy (GALC-PS) zastosowano technikę chromatografii cienkowarstwowej w celu zastosowano do oddzielenia enzymatycznie uwalnianej radioaktywnej galaktozy. WYNIKI: Zarówno aktywność beta-galaktozydazy galaktozyloceramidowej (GALC-GC), jak i GALC-PS były zmniejszone o co najmniej 85% normy u wszystkich z wyjątkiem 2 z 10 pacjentów z GLD badanych pacjentów. W szczególności jeden 23-letni pacjent z ciężką demielinizacją LOGLD miał silny niedobór (11% normy) w GALC-GC, ale najwyraźniej normalny dla aktywności GALC-PS. Genotyp GALC tego pacjenta to 30-kb zdelecji/502T w połączeniu z allelem typu dzikiego na tle 1637C o którym wiadomo, że nieznacznie zmniejsza aktywność GALC-GC. Ponadto, spośród sześciu pacjentów z LOGLD pacjentów, obaj 62- i 63-letni bracia mieli usunięty allel w połączeniu ze zmutowanym allelem 1637C 809G>A. Rodzeństwo miało silnie obniżoną aktywność GALC-GC i GALC-PS, ale stały się klinicznie niezwykłe dopiero w wieku 50 lat z z ciężkim upośledzeniem umysłowym u jednego z nich. WNIOSKI: Genotyp GALC z jednym usuniętym i jednym polimorficznym allelem GALC redukującym aktywność może prowadzić do enzymatycznych i klinicznych objawów LOGLD przy przy braku wyraźnego niedoboru GALC-PS. Jeśli aktywna hydroliza PS w fibroblastach w fibroblastach pacjenta z LOGLD odzwierciedla również taką hydrolizę w mózgu, hipoteza hipoteza psychozyny dla GLD może wymagać rewizji. --- Wykazano, że 6-heksadekanoiloamino-4-metylobelliferylo-beta-D-galaktopiranozyd (HMGal) wykazano, że jest specyficznym fluorogennym substratem galaktocerebrozydazy i że ułatwić prostą diagnostykę enzymatyczną choroby Krabbego u ludzi i u myszy twitcher. Hydroliza HMGal przy pH 4,5 jest optymalnie stymulowana przez taurocholan sodu (0,25%) i kwas oleinowy (0,05%) z Km wynoszącym 0,150, 0,04 i 0,03 mM, odpowiednio dla kontrolnej mysiej nerki, ludzkich fibroblastów i leukocytów. leukocytów. W próbkach kontrolnych aktywność specyficzna (nmol/mg prot./h) dla HMGal jest wyższa niż dla naturalnego substratu, galaktocerebrozydu, i jest u myszy z drgawkami i u pacjentów z chorobą Krabbego. Badanie porównawcze aktywności galaktocerebrozydazy w fibroblastach, leukocytach i mózgu z substratami radioaktywnymi i fluorogennymi ujawnia dobrą zgodność między wynikami obu metod. Galaktocerebrozyd (Gal-Cer) jest konkurencyjnym inhibitorem hydrolizy HMGal w homogenatach nerek myszy, podczas gdy GM1-gangliozyd nie ma działania hamującego w tym samym systemie testowym. Czułość czułość i specyficzność tego fluorogenicznego substratu dla galaktocerebrozydazy zapewnia prostą i szybką metodę diagnozowania choroby Krabbego oraz Krabbego oraz do oczyszczania tego enzymu z normalnych tkanek. --- Galaktocerebrozydaza (GALC) jest enzymem lizosomalnym, którego niedobór występuje u ludzi i niektórych gatunków zwierząt niektórych gatunków zwierząt z leukodystrofią globoidalną (GLD) lub chorobą Krabbego. Katalizuje hydrolizę specyficznych galaktolipidów, w tym galaktozyloceramidu i psychozyny. Białko GALC występuje w bardzo małych ilościach we wszystkich tkankach, co opóźniło jego oczyszczenie i późniejsze sklonowanie jego cDNA i genu. cDNA i genu. Wcześniej opublikowaliśmy organizację ekson-intron ludzkiego genu ale nie analizowaliśmy funkcjonalnie regionu flankującego 5'. Teraz przedstawiamy opis tego bogatego w GC regionu, który zawiera jeden potencjalny element YY1 i jedno potencjalne miejsce wiązania SP1. W pierwszych 150 bp poprzedzających inicjację znajduje się 13 trinukleotydów GGC. 150 bp poprzedzających kodon inicjacyjny. Koniec 5' intronu 1 zawiera sześć potencjalnych miejsc wiązania Sp1, jedno miejsce wiązania AP1 i osiem miejsc wiązania AP2. Konstrukt zawierający nukleotydy od -176 do -24 miał najsilniejszy promotor przy użyciu wektora zawierającego acetylotransferazę chloramfenikolu gen reporterowy. Dostarczyliśmy również dowodów na obecność sekwencji hamujących zlokalizowanych bezpośrednio przed regionem promotora oraz w obrębie pierwszych 234 nukleotydów intronu. nukleotydów intronu 1. Elementy te wraz z nieoptymalnym nukleotydem w pozycji pozycji +4 mogą wyjaśniać niski poziom białka GALC we wszystkich typach komórek. --- Galaktocerebrozydaza (GALC, EC 3.2.1.46) została oczyszczona z ludzkiego moczu przez serii etapów chromatografii kolumnowej powinowactwa hydrofobowego. Aktywność była wzbogacona 176 000-krotnie ze stężonego moczu za pomocą tylko czterech kolumn, w tym oktylosepharose, hydroxylapatite, butylosepharose i ethyl-agarose. Ogólny odzysk odzysk wynosił około 20%, ale uzyskano tylko niewielkie ilości ze względu na niską obfitość. Szacowana końcowa aktywność właściwa kilku partii wynosiła między 1 a 2 mmol/h na mg białka. Ostatecznie oczyszczone frakcje były zasadniczo wolne od innych aktywności enzymów lizosomalnych. Najbardziej czyste frakcje wykazywały serię prążków między 50 a 53 kDa na dodecylosiarczanie sodu elektroforezie w żelu dodecylosiarczanowo-poliakryloamidowym, które zostały określone jako mające identyczną N-końcową sekwencję aminokwasową. Ponadto, filtracja żelowa częściowo oczyszczonego GALC po dysocjacji wykazała jeden pik aktywności o masie cząsteczkowej zbliżonej do 50 kDa. GALC został również oczyszczony z ludzkiego mózgu i ludzkiego łożyska przy użyciu tych samych metod, wykazując użyteczność tej procedury w uzyskiwaniu GALC ze stałych tkanek ludzkich. W Oprócz pasm migrujących w pobliżu 50 kDa z moczu, występowały również pasma przy 80 kDa i 30 kDa w niektórych preparatach. Poprzez sekwencjonowanie N-końcowe i zastosowanie przeciwciał antypeptydowych przeciwciał antypeptydowych, wykazano, że pasmo 80 kDa ma te same N-końcowe aminokwasy jak pasma 50-53 kDa. Pasmo 30 kDa miało unikalną sekwencję sekwencję. Związek między różnymi gatunkami o masie cząsteczkowej pozostaje do ustalenia. Oczyszczenie GALC i zabezpieczenie informacji o sekwencji aminokwasów informacji o sekwencji aminokwasów pomoże w klonowaniu genu GALC. Enzym ten jest niedobór u ludzi z chorobą Krabbego i kilku gatunków zwierząt. --- Tratwy lipidowe (LR) to obszary błon charakteryzujące się wysokim stężeniem cholesterolu i sfingolipidów. cholesterolu i sfingolipidów. Często są one przedstawiane jako rusztowania, na których wiele różnych cząsteczek sygnalizacyjnych może tworzyć swoje kaskady. Pomysł jako rusztowania przyciąga znaczną uwagę, ponieważ wykazano, że konsekwencje zaburzeń LR przejawiają się w wielu szlakach sygnałowych. W W tym badaniu, LR w mózgu myszy twitcher (TWI), modelu bona-fide dla niemowlęcych wariantów ludzkiej leukodystrofii globoidalnej lub choroby Krabbego. badano. Mysz ta ma niedobór aktywności GALC (beta-galaktozyloceramidazy), co prowadzi do postępującej akumulacji niektórych galaktozylo-sphingolipidów w mózgu. Postawiliśmy hipotezę, że akumulacja psychozyny (galaktozylo-sfingozyny) w TWI CNS może skutkować zaburzeniem tratw w różnych populacjach komórek, takich jak neurony i oligodendrocyty, oba cele komórkowe podczas choroby. W niniejszym komunikacie wykazaliśmy, że psychozyna specyficznie gromadzi się w LR w mózgu TWI i nerwie kulszowym oraz w próbkach z mózgów ludzkich pacjentów z chorobą Krabbego. Wykazano również, że tej towarzyszy wzrost cholesterolu w tych domenach i zmiany w dystrybucji markerów LR. zmiany w dystrybucji markerów LR flotyliny-2 i kaweoliny-1. Wreszcie, pokazujemy dowody na to, że zjawisko to może stanowić mechanizm, za pomocą którego psychozyna może wywierać swój znany hamujący wpływ na kinazę białkową C. To badanie dostarcza wcześniej nieopisanego biofizycznego aspektu dla mechanizmu patogenezy w chorobie Krabbego. --- Leukodystrofia globoidalna (choroba Krabbego) charakteryzuje się akumulacją toksycznego metabolitu nagromadzeniem toksycznego metabolitu, psychozyny (galaktozylofingozyny), która jest substratem niedoboru enzymu substratem dla niedoboru enzymu (beta-galaktozydazy galaktocerebrozydowej). Badanie to podkreśla możliwą rolę psychozyny w działaniu indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) w patofizjologii tej choroby demielinizacyjnej. tej choroby demielinizacyjnej. Po raz pierwszy dostarczamy dowodów na ekspresję ekspresji iNOS w OUN pacjentów z chorobą Krabbego i pokazujemy, że komórki z ekspresją iNOS w OUN były astrocyty. Psychozyna nasilała indukowaną przez LPS produkcję cytokin prozapalnych (IL-1beta, IL-6 i TNF-alfa) w pierwotnych astrocytach szczura pierwotnych astrocytach szczura i regulowała produkcję NO za pośrednictwem cytokin w glejaku C6 i pierwotnych astrocytach szczura. Psychozyna indukowała za pośrednictwem cytokin translokację jądrową AP-1 i C/EBP poprzez nasilenie ekspresji Fra-1 i białek C/EBP-delta. Sugeruje to, że psychozyna utrzymywała lub podtrzymywała ekspresję iNOS stymulowaną cytokinami poprzez dalsze nasilanie jądrowej translokację AP-1 i C / EBP bez modulowania aktywności transkrypcyjnej NF-kappa aktywność transkrypcyjna NF-kappaB. Badanie to stawia hipotezę, że nagromadzona psychozyna prowadzi do produkcji cytokin i ekspresji iNOS. Wynikająca z tego nadmierna produkcja NO i ONOO- może odgrywać rolę w patogenezie choroby Krabbego. Krabbego. --- Leukodystrofia globoidalna (GLD) jest dziedziczonym autosomalnie recesywnie zaburzeniem spowodowane niedoborem galaktocerebrozydazy, enzymu lizosomalnego odpowiedzialnego za degradację galaktocerebrozydu glikolipidu mieliny. Chociaż najczęstszą postacią choroby jest klasyczna postać dziecięca (choroba Krabbego) (choroba Krabbego), opisano również formy o późniejszym początku. Przeanalizowaliśmy gen galaktocerebrozydazy u 17 pacjentów (dziewięć rodzin) z późną postacią GLD i u 1 pacjenta z klasyczną chorobą Krabbego. Połowa pacjentów była heterozygotyczna dla dużej delecji genu związanej z polimorfizmem 502C-->T polimorfizmem, najczęstszą mutacją u pacjentów w wieku dziecięcym. Kilka nowych mutacji, które powodują niedobór aktywności galaktocerebrozydazy. zidentyfikowanych u tych pacjentów. Obejmują one mutacje missense R63H, G95S, M101L, G268S, Y298C i I234T; mutację nonsensowną S7X; delecję jednej zasady (805delG); mutacja, która zakłóca splicing intronu 1; oraz 34-nt w RNA, spowodowaną nieprawidłowym splicingiem intronu 6. Wszystkie te defekty genetyczne są skupione w pierwszych 10 eksonach genu galaktocerebrozydazy a zatem wpływają na podjednostkę 50-kD dojrzałego enzymu. Badania nad dystrybucji i aktywności enzymatycznej polimorficznych alleli 1637T/C (I546/T546) dostarczyły wsparcia dla wcześniejszych danych, które wskazywały na istnienie dwóch form galaktocerebrozydazy o różnych aktywnościach katalitycznych w populacji ogólnej. ogólnej populacji. Nasze dane wskazują również, że mutacje występują preferencyjnie w allelu 1637C o "niskiej aktywności".
Którego enzymu brakuje w chorobie Krabbego?
Galaktocerebrozydaza jest enzymem, którego niedobór występuje w chorobie Krabbego (znanej również jako leukodystrofia globoidalna). Prowadzi to do akumulacji psychozyny (galaktozylosfingozyny) głównie w oligodendrocytach.