Analizy proteomu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przeprowadzono przeprowadzono w systemie chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas przy użyciu monolitycznych krzemionkowych kolumn kapilarnych C18 bez wstępnej frakcjonowania. Peptydy tryptyczne peptydy z pięciu różnych lizatów iPSC i trzech różnych lizatów fibroblastów (4 μg każdy) wstrzyknięto bezpośrednio na monolityczną kolumnę krzemionkową C18 o długości 200 cm i średnicy wewnętrznej 100 μm. i 8-godzinny gradient stosowano z prędkością 500 nL/min przy ciśnieniu mniejszym niż 20 MPa. MPa. Zidentyfikowaliśmy 98 977 nieredundantnych peptydów tryptycznych z 9510 białek (odpowiadających 8712 genom), w tym grup białek o niskiej liczebności (takich jak 329 kinaz białkowych) z potrójnych pomiarów w ciągu 10 dni. Uzyskane profile profile proteomu ośmiu lizatów komórkowych podzielono na dwie grupy, iPSC i fibroblastów, za pomocą hierarchicznej analizy skupień. Dalsza analiza ilościowa analiza ilościowa oparta na wykładniczo zmodyfikowanym indeksie obfitości białek w połączeniu z analizą wzbogacenia słów kluczowych UniProt ujawniła, że grupa iPSC zawiera więcej białek związanych z "regulacją transkrypcji", podczas gdy grupa fibroblastów zawierała więcej białek związanych z "transportem". Nasze wyniki wskazują, że że to uproszczone podejście proteomiczne z długimi monolitycznymi kolumnami jest korzystne dla szybkiej, dogłębnej, czułej i powtarzalnej analizy proteomu. --- Tutaj opisujemy zbudowany we własnym zakresie system ultra-wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (UHPLC), charakteryzujący się niewielką złożonością konstrukcji i wysoką mocą separacji w połączeniu z wygodą obsługi. System ten umożliwia stosowanie długich kolumn o długości 40 cm wypełnionych cząstkami 1,8 μm generującymi ciśnienie poniżej 1000 bar. Co więcej, system może być obsługiwany przy natężeniach przepływu od 50 do 200 nL min(-1) przy jednoczesnym zachowaniu mocy separacji. Zoptymalizowano kilka gradientów w zakresie od 23 do 458 minut. Przy najdłuższym gradiencie zidentyfikowaliśmy ponad 4500 grup białek i ponad 26 000 unikalnych peptydów z 1 μg lizatu ludzkich komórek nowotworowych w pojedynczym przebiegu przy użyciu Orbitrap Velos - jest to poziom wydajności często obserwowany wyłącznie przy użyciu wielowymiarowych strategii separacji strategie. Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem spektrometru mas z szybszymi prędkościami sekwencjonowania sekwencjonowania, jak TripleTOF 5600, pozwoliły nam zidentyfikować ponad 1400 grup białek w gradiencie trwającym 23 minuty. TripleTOF 5600 wypadł szczególnie dobrze w porównaniu do Orbitrap Velos, dla zastosowanych krótszych gradientów. Nasze dane pokazują, że że połączenie UHPLC ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości przy zwiększonej prędkości sekwencjonowania prędkości sekwencjonowania umożliwia obszerną analizę proteomu w pojedynczych przebiegach. --- W tym badaniu zademonstrowano wysokowydajne separacje LC-MS/MS złożonych proteolitycznych proteolitycznych przy użyciu monolitycznych kolumn kapilarnych o długości 50 mm, 250 mm i 1m poli(styren-co-diwinylobenzen) monolitycznych kolumn kapilarnych. Wydajność wydajność chromatograficzna monolitów 50 i 250 mm została porównana przy tej samej stromości gradientu dla czasów trwania gradientu od 5 do 150 minut. Maksymalna Maksymalna pojemność pików 400 uzyskana przy użyciu kolumny 50 mm, wzrosła do 485, gdy przy użyciu kolumny o długości 250 mm i skalowaniu czasu trwania gradientu zgodnie z długością kolumny. długości kolumny. Przy 5-krotnym wzroście długości kolumny zaobserwowano jedynie 20% wzrost wydajności piku. co można wytłumaczyć większym rozmiarem makroporów monolitu o długości 250 mm. monolitu o długości 250 mm. Biorąc pod uwagę całkowity czas analizy, w tym czas przebywania, czas gradientu i czas wyrównania kolumny, monolit o długości 50 mm monolit zapewniał lepszą separację peptydów niż monolityczna kolumna o długości 250 mm dla czasów gradientu poniżej 80 min (n(c)=370). Dla bardziej wymagających separacji monolit o długości 250 mm zapewniał najwyższą szybkość produkcji pików i w konsekwencji wyższe pokrycie sekwencji. Do analizy proteolitycznego trawienia białek Escherichia coli zastosowano monolityczną kolumnę kapilarną o długości 1m. monolitycznej kolumny kapilarnej o długości 1 m, uzyskując wydajność piku 1038 przy zastosowaniu gradientu 600 min. --- Drożdże pozostają ważnym modelem dla biologii systemów i oceny strategii proteomicznych. strategii proteomicznych. Dogłębne badania proteomiczne typu shotgun osiągnęły prawie i opracowano szybkie, ukierunkowane podejścia dla tego organizmu. dla tego organizmu. Niedawno wykazaliśmy, że pojedyncza analiza LC-MS/MS przy użyciu długich kolumn i gradientów połączonych z liniową pułapką jonową Orbitrap. nieoczekiwanie duży zakres dynamiczny identyfikacji białek (Thakur, S. S., Geiger, T., Chatterjee, B., Bandilla, P., Frohlich, F., Cox, J. i Mann, M. (2011). (2011) Głębokie i bardzo czułe pokrycie proteomu przez LC-MS/MS bez prefrakcjonowania. Mol. Cell Proteomics 10, 10.1074/mcp.M110.003699). Tutaj my połączyliśmy ultra wysokociśnieniowy system chromatografii cieczowej z nowatorskim spektrometrem mas Orbitrap Spektrometr masowy Orbitrap (Q Exactive) w celu prawie kompletnej, szybkiej, i solidnej analizy proteomu drożdży. Pojedyncze przebiegi próbki wspomaganej filtrem przygotowanie (FASP) - przygotowane i LysC trawione lizaty komórek drożdży zidentyfikowały średnio 3923 białka. Połączona analiza sześciu pojedynczych przebiegów poprawiła te wartości do ponad 4000 zidentyfikowanych białek / przebieg, zbliżonych do całkowitej liczby białek wyrażonych w standardowych warunkach. białek wyrażonych w standardowych warunkach, z medianą pokrycia sekwencji wynoszącą 23%. Ze względu na brak etapów frakcjonowania, wymagane są jedynie niewielkie ilości próbki. próbki. W ten sposób modelowy proteom drożdży może być teraz w dużej mierze pokryty w ciągu kilku godzin pomiaru i przy wysokiej czułości. Mediana pokrycia białek w ścieżkach Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes z co najmniej 10 członkami wyniosła 88%, a szlaki nieobjęte pomiarem nie powinny być aktywne w zastosowanych warunkach. w zastosowanych warunkach. Aby zbadać perturbacje proteomu drożdży, opracowaliśmy zewnętrzny, ciężki, znakowany lizyną standard SILAC dla drożdży reprezentujący różne stany proteomu. stany proteomu. Ten standard spike-in został wykorzystany do pomiaru odpowiedzi proteomu drożdży na szok termiczny. odpowiedzi proteomu drożdży na szok termiczny. Analiza bioinformatyczna odpowiedzi na szok cieplny ujawniła, że funkcje związane z translacją były regulowane w dół w tym procesy jąderkowe. I odwrotnie, szlaki związane ze stresem były regulowane w górę. Opisana tutaj technologia proteomiczna jest prosta, szybka i solidna, potencjalnie umożliwiając szerokie zastosowanie w drożdżach i innych społecznościach zajmujących się badaniami biologicznymi.
Jakie są zalety stosowania długich nanokolumn w proteomice?
Im dłuższe kolumny, tym dłuższe gradienty są stosowane i ostatecznie więcej białek (zwiększona pojemność pików) jest identyfikowanych w złożonym eksperymencie proteomicznym