Metody spisu sekwencji redukują pomiary molekularne, takie jak obfitość transkryptu i interakcje białko-kwas nukleinowy do problemów związanych z liczeniem poprzez sekwencjonowanie DNA sekwencjonowanie. Skupiamy się na nowym teście wykorzystującym to podejście, zwanym selektywną 2'-hydroksylową acylację analizowaną przez sekwencjonowanie z wydłużaniem starterów (SHAPE-Seq), która można wykorzystać do scharakteryzowania drugorzędowej i trzeciorzędowej struktury RNA. Opisujemy w pełni zautomatyzowany potok analizy danych dla analizy SHAPE-Seq, który obejmuje odczyt przetwarzanie, mapowanie i wnioskowanie strukturalne w oparciu o model eksperymentu. eksperymentu. Nasze metody opierają się na rozwiązaniu szeregu wypukłych problemów optymalizacyjnych dla których opracowaliśmy wydajne i skuteczne algorytmy numeryczne. Nasze wyniki można łatwo rozszerzyć na inne chemiczne sondy struktury RNA, a także również uogólnione na modelowanie zaniku polimerazy w innych eksperymentach opartych na spisie sekwencji. eksperymentach. --- Nadal pojawiają się nowe role regulacyjne zarówno dla naturalnych, jak i zmodyfikowanych niekodujących RNA, z których wiele ma specyficzne struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe istotne dla ich funkcji. W związku z tym istnieje rosnąca potrzeba opracowania technologii, które umożliwiają szybką charakterystykę cech strukturalnych w obrębie złożonych populacji RNA. Opracowaliśmy technikę o wysokiej przepustowości, SHAPE-Seq, która może jednocześnie mierzyć ilościowe, pojedyncze nukleotydów o rozdzielczości drugorzędowej i trzeciorzędowej informacji strukturalnej dla setek cząsteczek cząsteczek RNA o dowolnej sekwencji. SHAPE-Seq łączy selektywną 2'-hydroksylową acylację analizowaną przez wydłużanie starterów (SHAPE) z multipleksowanym głębokim sekwencjonowaniem multipleksowanym głębokim sekwencjonowaniem produktów wydłużania starterów. Generuje to miliony sekwencjonowania, które są następnie analizowane przy użyciu w pełni zautomatyzowanego potoku analizy danych analizy danych, w oparciu o rygorystyczny model maksymalnego prawdopodobieństwa eksperymentu SHAPE-Seq eksperymentu. Demonstrujemy zdolność SHAPE-Seq do dokładnego wnioskowania o drugorzędowych i trzeciorzędowych informacji strukturalnych, wykrywania subtelnych zmian konformacyjnych subtelnych zmian konformacyjnych spowodowanych mutacjami pojedynczych nukleotydów i jednoczesnego pomiaru struktury złożonej puli różnych cząsteczek RNA. SHAPE-Seq stanowi zatem stanowi potężny krok w kierunku uczynienia badania drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur RNA i trzeciorzędowych struktur RNA w sposób wysokoprzepustowy i dostępny dla szerokiej gamy badań naukowych naukowych, od fundamentalnych badań biologicznych po inżynierię RNA dla syntetycznych systemów biologicznych. --- Znajomość struktury RNA ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zarówno ważnych funkcjonalnych ról RNA w biologii, jak i inżynierii RNA w celu kontrolowania systemów biologicznych. Niniejszy artykuł zawiera protokół selektywnej 2'-hydroksylo acylacji analizowanej przez wydłużanie starterów i sekwencjonowanie (SHAPE-Seq), który poprzez połączenie zależnego od struktury sondowania chemicznego i technologii sekwencjonowania nowej generacji technologii sekwencjonowania, osiąga charakterystykę strukturalną setek RNA w pojedynczym eksperymencie. Protokół ten ma zastosowanie w różnych warunkach i stanowi ważne narzędzie do zrozumienia biologii RNA. Protokół Protokół obejmuje metody projektowania i syntezy mieszanin RNA do badania badania oraz budowę i analizę zależnych od struktury bibliotek sekwencjonowania bibliotek, które ujawniają informacje strukturalne RNA w mieszaninach. Metody metody mają ogólne zastosowanie do badania struktury i interakcji RNA in in vitro w różnych warunkach i pozwalają na szybką charakterystykę struktur Struktury RNA w sposób wysokowydajny. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4:275-297 © 2012 by John Wiley & Sons, Inc. --- Struktura RNA jest głównym wyznacznikiem jego funkcji, a metody łączące sondowanie chemiczne z sekwencjonowaniem nowej generacji chemiczne z sekwencjonowaniem następnej generacji stworzyły przełom w przepustowości i skali charakteryzacji struktury RNA. Jednakże, niewiele pracy w celu zbadania wpływu przygotowania biblioteki i sekwencjonowania na zmierzone reaktywności sond chemicznych, które kodują informacje strukturalne RNA. Tutaj przedstawiamy pierwszą analizę i optymalizację tych efektów dla selektywnej acylacji 2'-hydroksylowej analizowanej przez sekwencjonowanie z wydłużaniem starterów (SHAPE-Seq). Najpierw zoptymalizowaliśmy SHAPE-Seq i pokazaliśmy, że zapewnia on wysoce powtarzalne dane dotyczące reaktywności w szerokim zakresie kontekstów strukturalnych RNA z bez widocznych błędów. W ramach tej optymalizacji przedstawiamy SHAPE-Seq v2.0, "uniwersalną" metodę, która może uzyskać "uniwersalną" metodę, która może uzyskać informacje o reaktywności dla każdego nukleotydu RNA bez konieczności stosowania lub wprowadzania specyficznej odwrotnej transkryptazy w obrębie RNA. Pokazujemy, że SHAPE-Seq v2.0 jest wysoce powtarzalny, z danymi dotyczącymi reaktywności, które można wykorzystać jako ograniczenia w algorytmach składania RNA do przewidywania struktur na równi z tymi generowanymi przy użyciu danych z innych metod SHAPE metod. Przewidujemy, że SHAPE-Seq v2.0 będzie miał szerokie zastosowanie do zrozumienia relacji sekwencja-struktura RNA w sercu niektórych z najbardziej fundamentalnych procesów.
Co to jest SHAPE-Seq?
SHAPE-Seq to technika o wysokiej przepustowości, która może jednocześnie mierzyć ilościowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe informacje strukturalne o rozdzielczości pojedynczego nukleotydu dla setek cząsteczek RNA o dowolnej sekwencji. SHAPE-Seq łączy selektywną acylację 2'-hydroksylową analizowaną za pomocą chemii wydłużania starterów (SHAPE) z multipleksowanym, sparowanym sekwencjonowaniem głębokich produktów wydłużania starterów. Generuje to miliony odczytów sekwencjonowania, które są następnie analizowane przy użyciu w pełni zautomatyzowanego potoku analizy danych, opartego na rygorystycznym modelu maksymalnego prawdopodobieństwa eksperymentu SHAPE-Seq. SHAPE-Seq ma możliwość dokładnego wnioskowania o drugorzędowych i trzeciorzędowych informacjach strukturalnych, wykrywania subtelnych zmian konformacyjnych spowodowanych mutacjami punktowymi pojedynczych nukleotydów i jednoczesnego pomiaru struktur złożonej puli różnych cząsteczek RNA. SHAPE-Seq stanowi zatem potężny krok w kierunku uczynienia badania drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur RNA wysoce wydajnym i dostępnym dla szerokiego zakresu badań naukowych, od podstawowych badań biologicznych po inżynierię RNA dla syntetycznych systemów biologicznych. SHAPE-Seq v2.0 jest "uniwersalną" metodą, która może uzyskać informacje o reaktywności dla każdego nukleotydu RNA bez konieczności stosowania lub wprowadzania specyficznego miejsca primingu odwrotnej transkryptazy w RNA. Jest to wysoce powtarzalna metoda, z danymi dotyczącymi reaktywności, które mogą być wykorzystywane jako ograniczenia w algorytmach składania RNA w celu przewidywania struktur na równi z tymi generowanymi przy użyciu danych z innych metod SHAPE. Oczekuje się, że SHAPE-Seq v2.0 będzie miał szerokie zastosowanie w zrozumieniu relacji sekwencja-struktura RNA w sercu niektórych z najbardziej fundamentalnych procesów życiowych.