Kilka cDNA kodujących białko H, składnik systemu rozszczepiania glicyny, sklonowano z bibliotek cDNA wątroby kurczaka z przeciwciałem podniesionym przeciwko szczurzego białka H lub z cDNA z nickiem translacyjnym klonu immunoreaktywnego. Struktura Struktura cDNA białka H składającego się z 910 par zasad została określona przy użyciu klonów z pozornym nakładaniem się sekwencji nukleotydów. CDNA koduje formę prekursorową białka H, która składa się z 39 reszt aminokwasowych reszt aminokwasowych dla mitochondrialnej sekwencji wstępnej i 125 reszt aminokwasowych dla dojrzałe białko, po 5' nieulegającym translacji regionie 13 par zasad. Istnieją dwie prawdziwe sekwencje konsensusowe dla rozszczepienia/poliadenylacji prekursorowego mRNA białka H w 3' nieulegającym translacji regionie sekwencji cDNA. My wykazaliśmy przez porównanie z genem syntazy delta-aminolewulinianu, że tylko jedna kopia cRNA białka H kopia cDNA białka H występuje w haploidalnym genomie kurczaka. Niemniej jednak, dwa typy mRNA białka H, które różnią się długością ich 3' nieulegającego translacji regionu 3', są produkowane w wątrobie. Gen białka H kurczaka rozciąga się na ponad 8 par kilobazowych genomu i zawiera 5 eksonów, które kodują całą sekwencję cDNA. całą sekwencję cDNA. Dwa motywy AATAAA są kodowane w ostatnim eksonie tego genu, sugerując, że różnej wielkości mRNA białka H są wytwarzane przez alternatywne wykorzystanie tych motywów. --- Pojedyncze U prowadzi do konwersji G w 3' sekwencji konsensusowej AAUAAA genu wczesnego regionu 1A adenowirusa. skonstruowano gen wczesnego regionu 1A adenowirusa i przeanalizowano wpływ tej mutacji na przetwarzanie końca 3' jądrowego RNA wczesnego regionu 1A. Wyniki pokazują, że nienaruszony AAUAA nie jest wymagany do poliadenylacji RNA poliadenylacji RNA, ale jest wymagana do etapu rozszczepienia poprzedzającego poliadenylację poliadenylację. --- Funkcjonalne miejsca poliadenylacji [poly(A)] składają się z dwóch elementów sekwencji, sygnałów AAUAAA i sygnały G/U box, które ściśle otaczają miejsce 3'-końca mRNA mRNA. Zgodnie z wcześniejszymi wynikami, losowe wstawki sekwencji między sygnałami AAUAAA i G/U box zaobserwowano hamowanie funkcji miejsca poli(A) . Jednakże, wstawki sekwencji o podobnej wielkości, które przewidywano do struktury pętli macierzystej RNA miały niewielki wpływ na wydajność poliadenylacji i zamiast tego indukowały przesunięcie o 3' w miejscu poliadenylacji które było równe długości wstawionej pętli macierzystej. Wykorzystanie in vivo miejsca poli(A) zawierającego wewnętrzną strukturę pętli macierzystej RNA było hamowane przez mutacje, które destabilizowały przewidywany trzon, ale były przywracane przez mutacje kompensacyjne. mutacje kompensacyjne. Wyniki te silnie wspierają hipotezę, że odpowiednie odstępy między sygnałami AAUAAA i G/U box są krytyczne dla funkcji miejsca poli(A). Wstawki sekwencji, które są w stanie tworzyć drugorzędowe struktury RNA, które utrzymują prawidłowe odstępy między tymi dwoma sekwencjami docelowymi RNA są dobrze tolerowane, podczas gdy wstawki sekwencji, które zakłócają ten odstęp, hamują rozpoznawanie miejsca poli(A) rozpoznanie. Proponuje się, aby wpływ wstawek sekwencyjnych na funkcję miejsca poli(A) może być wystarczająco przewidywalny, aby umożliwić opracowanie testu dla struktury drugorzędowej RNA in vivo, która wykorzystuje wybór miejsca poli(A) jako odczyt jako odczyt. --- Określiliśmy sekwencję nukleotydową mysiej immunoglobuliny gamma 2a (1413 nukleotydów) i około 679 nukleotydów sekwencji następczej. nukleotydów sekwencji downstream. Dwie sekwencje heksanukleotydowe AATAAA są obecne w przedziale 2092 nukleotydów. Pierwsza z nich funkcjonuje jako główny sygnał sygnał polyA, kierujący rozszczepieniem i poliadenylacją w miejscu 20 nukleotydów poniżej. W odległości 41 nukleotydów za głównym błonowym sygnałem polyA znajdują się dwie sekwencje o 75% homologii do sekwencji konsensusowej, (C/T)GTGTT(C/T)(C/T), zidentyfikowanej przez McLauchlan et al. [Nucl. Acids Res. 13, 1347-1365 (1985)]. 80% zgodności homologicznej z sekwencją konsensusu Berget, CA(C/T)TG, zaczyna się pięć nukleotydów 3' od głównego miejsca polyA (używane 20 razy więcej niż drugie, niższe miejsce polyA) [Berget Nature 309, 179-182 (1984)]. Drugi AATAAA, zlokalizowany 73 nukleotydy 3' od pierwszego, kieruje kieruje rozszczepieniem i poliadenylacją 18 nukleotydów poniżej w mniejszym miejscu polyA. Jedno dopasowanie z 75% homologią do sekwencji konsensusu McLauchlana zaczyna się 17 nukleotydów 3' od drugiego (słabszego) miejsca polyA. Żadne dopasowanie do sekwencji konsensusu Berget nie znajdują się w pobliżu tego drugiego, słabszego miejsca polyA. --- Zestawienie końców pre-mRNA genów mitochondrialnych białek kodowanych jądrowo białek mitochondrialnych dało w wyniku sekwencję konsensusową typu (T/A)NTTNNNNNTTTNAATAAA. Pozycje nukleotydów +8, +13, +14, +16 i +17 poniżej sekwencji AATAAA wykazują również przewagę nukleotydu T. Ta sekwencja konsensusowa sugeruje znaczenie bezpośredniego otoczenia kanonicznej sekwencji sygnałowej poliadenylacji sekwencji sygnałowej AATAAA na wydajność cięcia i poliadenylacji tej specyficznej grupy pre-mRNA. tej specyficznej grupy pre-mRNA. --- Większość wirusowych mRNA w mysich komórkach C127 transformowanych przez bydlęcy wirus brodawczaka typu brodawczaka typu 1 (BPV) ma wspólny koniec 3' we wczesnym miejscu poliadenylacji który znajduje się 23 nukleotydy (nt) za kanonicznym sygnałem konsensusu poli(A) sygnału. Dwadzieścia procent BPV mRNA z produktywnie zainfekowanych komórek omija miejsce wczesne miejsce poliadenylacji i wykorzystuje późne miejsce poliadenylacji w przybliżeniu 3,000 nt poniżej. Aby dezaktywować wczesne miejsce poliadenylacji BPV, sygnał konsensusu wczesnego sygnał konsensusu poli(A) został zmutowany z AAUAAA do UGUAAA. Co zaskakujące, ta mutacja mutacja nie spowodowała znaczącej ekspresji RNA w dalszej części łańcucha. RNA. Eksperymenty mapowania RNA i klonowania cDNA pokazują raczej, że praktycznie cały zmutowany RNA jest rozszczepiany i poliadenylowany w heterogenicznych miejscach około 100 nt przed miejscem wczesnej poliadenylacji typu dzikiego. Ponadto Ponadto, komórki transformowane przez BPV typu dzikiego zawierają niewielką populację mRNA z końcami 3' zlokalizowanymi w tym regionie. Eksperymenty te pokazują, że że inaktywacja głównego sygnału poli(A) indukuje preferencyjne użycie w przeciwnym razie bardzo pomniejszych miejsc poli(A). Analiza mutacji sugeruje, że poliadenylacja w mniejszych miejscach jest kontrolowana, przynajmniej częściowo, przez UAUAUA, nietypowy wariant sygnału konsensusu poli(A) około 25 nt w górę rzeki mniejszych miejsc poliadenylacji. Eksperymenty te wskazują, że inaktywacja głównego sygnału wczesnej poliadenylacji nie jest wystarczająca do wywołania ekspresji późnych genów późnych genów BPV w transformowanych komórkach myszy.
Jaka jest najbardziej widoczna zgodność sekwencji dla miejsca poliadenylacji?
Funkcjonalne miejsca poliadenylacji [poly(A)] składają się z dwóch elementów sekwencji, sygnałów AAUAAA i G/U box, które ściśle otaczają miejsce formowania 3'-końca mRNA. Kanoniczna sekwencja sygnału poliadenylacji AATAAA