Motywy sekwencyjne w obrębie niestrukturalnego białka NS3 członków rodziny Flaviviridae sugerują, że białko to posiada aktywność nukleozydowej trifosfatazę (NTPazę) i aktywność helikazy RNA. Aktywność NTPazy stymulowana przez RNA tego białka od prototypowych członków rodzajów Pestivirus i Flavivirus została niedawno ustalona i scharakteryzowana enzymologicznie. scharakteryzowana enzymatycznie. Tutaj eksperymentalnie wykazujemy, że białko NS3 od członka trzeciego rodzaju Flaviviridae, ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), również posiada również aktywność NTPazy stymulowaną polinukleotydami. Charakterystyka aktywności NTPazy HCV wykazała, że wykazuje ona optymalne warunki reakcji w odniesieniu do pH, MgCl2 i soli identyczne jak w przypadku reprezentatywnych enzymów enzymów pestiwirusów i flawiwirusów. Jednak każda NTPaza posiadała również kilka unikalne właściwości w porównaniu ze sobą. W szczególności, profil polinukleotydowej stymulacji aktywności NTPazy był odmienny dla trzech enzymów. enzymów. NTPaza HCV była jedyną, której aktywność była znacząco zwiększona przez dezoksyrybopolinukleotyd. Dodatkowe cechy wyróżniające wśród trzy enzymy odnoszące się do właściwości kinetycznych ich aktywności NTPazy zostały omówione. Badania te stanowią podstawę do zbadania domniemanej aktywności helikazy RNA tych białek i do dalszych badań nad roli białek NS3 członków Flaviviridae w cyklu replikacji tych wirusów. tych wirusów. --- W ramach kontynuacji projektu anty-Flaviviridae, zsyntetyzowano nową serię różnych podstawionych 2-styrylo-benzimidazoli została zsyntetyzowana i przetestowana in vitro pod kątem aktywności biologicznej. Związki zostały przetestowane w testach komórkowych przeciwko wirusom reprezentatywnych dla: i) dwóch z trzech rodzajów rodziny Flaviviridae, tj. Pestiviruses i Flaviviruses; ii) innych rodzin wirusów RNA, takich jak Retroviridae, Picornaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae i Reoviridae; iii) dwie rodziny wirusów DNA (Herpesviridae i Poxviridae), jak również do testów testy cytotoksyczności, prowadzone równolegle z testami przeciwwirusowymi, przeciwko MDBK, BHK i Vero 76. W badanej serii pojawiły się nowe tropy przeciwko BVDV, CVB-2 i RSV. Związki 11, 12, 17, 18, 24, 31 wykazywały aktywność przeciw BVDV w zakresie stężeń zakresie stężeń 1,7-16 mikroM; wśród nich związek 17 był najbardziej aktywny, Związki 18 i 21 były równie aktywne przeciwko CVB-2, z EC(50) = 1,7 mikroM. CVB-2, z wartościami EC(50) 7 - 8 mikroM, podczas gdy pochodna 30 była aktywna przeciwko RSV z EC(50)= 1 mikroM i reprezentuje nowy związek wiodący. --- TŁO: Wirus Usutu należy do rodziny wirusów Flaviviridae i stanowi ważny patogen. ważny patogen. Wirusowa helikaza jest idealnym celem dla inhibitora ponieważ enzym ten jest niezbędny do przetrwania, proliferacji i przenoszenia wirusa. przenoszenia wirusa. WYNIKI: W kierunku podejścia do projektowania leków zaprojektowano model 3D struktury helikazy wirusa Usutu helikazy wirusa Usutu został zaprojektowany przy użyciu konwencjonalnych technik modelowania homologii techniki i znana struktura 3D wirusa zapalenia mózgu doliny Murray należącego do tej samej rodziny wirusów. Model został następnie poddany rozszerzonym symulacjom dynamiki molekularnej w periodycznym pudełku wypełnionym cząsteczkami wody przez 10 nanosekund. cząsteczkami wody przez 10 nanosekund. Wiarygodność modelu została potwierdzona poprzez uzyskanie akceptowalnych wyników z różnych narzędzi punktacji in silico, w tym Procheck i Verify3D. WNIOSEK: [poprawiony] Model 3D helikazy wirusa Usutu wykazuje in silico wszystkie znane cechy strukturalne rodziny wirusów Flaviviridae enzymów helikazy i może stanowić platformę do dalszego de novo opartego na strukturze projektowania nowych środków anty-Usutu. --- Czterdzieści trzy 2-[(benzotriazol-1/2-ylo)metylo]benzimidazole, zawierające albo liniowe (dialkiloamino)alkilowe lub większe (chinolizydyn-1-ylo)alkilowe ugrupowania w pozycji 1, oceniano w testach komórkowych pod kątem cytotoksyczności i aktywności przeciwwirusowej przeciwko wirusom reprezentatywnym dla dwóch z trzech rodzajów rodziny Flaviviridae Flaviviridae, tj. flawiwirusów (wirus żółtej gorączki (YFV)) i pestiwirusów (wirus biegunki bydła wirus biegunki bydła (BVDV)), ponieważ Hepacivirusy nie mogą być stosowane w rutynowych testach komórkowych. w rutynowych testach komórkowych. Związki testowano również przeciwko przedstawicielom innych rodzin wirusów. Wśród wirusów ssRNA+ znalazł się retrowirus (ludzki wirus niedoboru odporności Wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1)), dwa pikornawirusy (wirus Coxsackie typu B2 (CVB2), oraz Poliowirus typu 1, szczep Sabin (Sb-1)); wśród wirusów ssRNA były Paramyxoviridae (Respiratory Syncytial Virus (RSV)) i Rhabdoviridae (wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV)). Wśród dwuniciowych wirusów RNA (dsRNA) był przedstawiciel Reoviridae (Reo-1). Dwóch przedstawicieli rodzin wirusów DNA: Herpes Simplex typu 1, (HSV-1; Herpesviridae) i Vaccinia Virus (VV; Poxviridae). Większość związków wykazywała silną aktywność przeciwko RSV, z wartościami EC(50) tak niskimi jak 20 nM. Co więcej, niektóre związki, w szczególności zawierające resztę (chinolizydyno-1-ylo)alkilową, były również również umiarkowanie aktywne wobec BVDV, YFV i CVB2. --- Wiele wirusów z rodzaju Flavivirus powoduje poważne choroby u ludzi; Jednak skuteczne leki przeciwwirusowe przeciwko tym wirusom nie są obecnie dostępne. Wcześniej wykazaliśmy, że lek tiopurynowy, rybozyd 6-metylomerkaptopuryny (6MMPr), hamuje replikację daleko spokrewnionych wirusów z rodziny rodziny Flaviviridae w hodowli komórkowej, w tym wirusa wirusowej biegunki bydła i replikon wirusa zapalenia wątroby typu C. Tutaj dalej zbadaliśmy potencjalne działanie przeciwwirusowe wpływ 6MMPr na kilka różnych flawiwirusów. W hodowli komórkowej 6MMPr hamował produkcję wirusa żółtej gorączki, wirusa dengi-2 (DENV-2) i wirusa Zachodniego Nilu (WNV) w sposób zależny od dawki, a DENV-2 był znacznie bardziej wrażliwy na leczenie 6MMPr. bardziej wrażliwy na leczenie 6MMPr niż WNV. Następnie zbadaliśmy zastosowanie 6MMPr jako przeciwwirusowego przeciwko WNV w immunokompetentnym modelu mysim. Leczenie raz dziennie myszy dawką 0,5 mg 6MMPr było tuż poniżej dawki toksycznej w naszym modelu mysim, i dawka ta była stosowana w kolejnych badaniach. Myszy leczono 6MMPr natychmiast po podskórnej inokulacji WNV przez osiem kolejnych dni. Leczenie 6MMPr nasiliło utratę masy ciała u myszy zaszczepionych WNV i nie wpłynęło znacząco na śmiertelność. znacząco wpływać na śmiertelność. Postawiliśmy hipotezę, że 6MMPr ma niską biodostępność w ośrodkowym układzie nerwowym. biodostępność w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i zbadaliśmy efekt wstępnego leczenia 6MMPr na miano wirusa na obwodzie i w OUN. Wstępne leczenie 6MMPr nie miało znaczącego wpływu na wiremię lub miana wirusa na obwodach, ale spowodowało znacznie wyższe miana wirusa w mózgu, co sugeruje, że działanie 6MMPr jest zależne od tkanki. Podsumowując, pomimo będąc silnym inhibitorem flawiwirusów w hodowli komórkowej, 6MMPr nie był skuteczny przeciwko chorobie Zachodniego Nilu u myszy; jednak dalsze badania są w celu zmniejszenia toksyczności i/lub poprawy biodostępności tego potencjalnego leku przeciwwirusowego. potencjalnego leku przeciwwirusowego. --- Rodzina Flaviviridae obejmuje trzy rodzaje wirusów RNA o dodatniej nici, a mianowicie Flavivirus, Hepacivirus (np. wirus zapalenia wątroby typu C [HCV]) i Pestivirus. Pestiwirusy, takie jak wirus wirusowej biegunki bydła (BVDV), wykazują uderzający stopień podobieństwo do HCV w zakresie organizacji, przetwarzania i funkcji poliprotein. Wzdłuż tej linii, w obu systemach, uwalnianie niestrukturalnego białka 3 (NS3) jest niezbędne do replikacji wirusowego RNA. Jednak oba wirusy różnią się znacząco w odniesieniu do wydajności przetwarzania w miejscu rozszczepienia NS2/3 i obfitości a także funkcjonalnym znaczeniem nieprzetworzonego NS2-3. W komórkach zakażonych BVDV, znaczne ilości NS2-3 gromadzą się w późnych punktach czasowych po zakażeniu i odgrywają istotną, ale źle zdefiniowaną rolę w produkcji zakaźnych wirionów. W przeciwieństwie do tego, odnotowano całkowite rozszczepienie odpowiednika NS2-3 wirusa HCV, a nieprzetworzony NS2-3 nie jest wymagany przez cały cykl życia HCV, przynajmniej w hodowli komórkowej. Tutaj opisujemy selekcję i charakterystykę pierwszego genomu pierwszego genomu pestiwirusa ze zdolnością do ukończenia produktywnej infekcji przy w nieobecności nieprzetworzonego NS2-3. Pomimo wstawienia genu ubikwityny lub lub wewnętrznego miejsca wejścia rybosomalnego między sekwencje kodujące NS2 i NS3, wybrany chimeryczny wybrane chimeryczne genomy BVDV-1 dały początek zakaźnemu potomstwu wirusa. W tym kontekście kontekście, mutacja w N-końcowej trzeciej części NS2 została zidentyfikowana jako krytyczna determinantę skutecznej produkcji zakaźnych wirionów przy braku NS2-3. Odkrycia te podważają wcześniej przyjęty dogmat dotyczący replikacji replikacji pestiwirusów i dostarczają nowych implikacji dla morfogenezy wirionów pestiwirusów i HCV. --- W ramach realizacji projektu anty-Flaviviridae zsyntetyzowano nową serię różnych podstawionych 2-difenylo-benzimidazoli zsyntetyzowano i przetestowano in vitro dla aktywności przeciwwirusowej i antyproliferacyjnej. Związki testowano w testach komórkowych przeciwko wirusom reprezentatywnym dla: i) dwóch z trzech rodzajów rodziny Flaviviridae, tj. Flawiwirusy i Pestiwirusy; ii) inne rodziny wirusów RNA, takie jak wirusów RNA, takich jak Retroviridae, Picornaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae i Reoviridae; iii) dwie rodziny wirusów DNA (Herpesviridae i Poxviridae). The 5-Acetylo-2-(4'-nitrobifenylo-4-ylo)-1H-benzimidazol (24) pojawił się jako silny aktywny związek wiodący przeciwko wirusowi żółtej gorączki (flawiwirusowi) (EC(50) = 0,5 mikroM) i CVB-2 przy 1 mikroM i nie był cytotoksyczny, podczas gdy inny tytuł benzimidazole nie wykazywały aktywności przeciwwirusowej w stężeniach nie cytotoksycznych dla monowarstwy komórek w stanie spoczynku. Spośród badanych serii, najbardziej cytotoksyczne pochodne pochodne (11,12,14,16,18,19,20,21,23,25-30) przeciwko komórkom MT-4 zakażonym mockami (CC50 < 8,0 mikroM) oceniano przeciwko panelowi ludzkich linii komórkowych pochodzących z guzów hematologicznych i litych, stosując 6-merkaptopurynę (6-MP) i etopozyd jako leki referencyjne. W szczególności związki 26 i 28 wykazały podobną siłę działania 6-MP i etopozydu. --- Wirusy z rodzaju Flavivirus z rodziny Flaviviridae są przenoszone przez stawonogi. przenoszone przez stawonogi i przyczyniają się do oszałamiającej liczby infekcji u ludzi i znacznej liczby zgonów rocznie na całym świecie. Aby zidentyfikować czynniki komórkowe z aktywnością przeciwwirusową przeciwko flawiwirusom, zbadaliśmy bibliotekę cDNA przy użyciu podejście iteracyjne. Zidentyfikowaliśmy białko opiekuńcze Hsp40 ssaków (DNAJC14), które po nadekspresji było w stanie pośredniczyć w ochronie przed wirusem żółtej gorączki (YFV). wirusem żółtej gorączki (YFV). Dalsze badania wykazały, że DNAJC14 hamuje YFV na etapie replikacji wirusowego RNA. Ponieważ replikacja wirusa wirusowej biegunki bydła (BVDV), członka pokrewnego rodzaju Pestivirus, jest również jest również modulowana przez DNAJC14, przetestowaliśmy wpływ tego czynnika gospodarza na różnych członków rodziny Flaviviridae. Flawiwirusy, w tym patogenny szczep Asibi YFV, Kunjin i przenoszony przez kleszcze wirus Langat, jak również Hepacivirus, wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wszystkie były hamowane przez nadekspresję DNAJC14. Mutageneza wykazała, że zarówno domena J, jak i domena C-końcowa, która pośredniczy w auto-interakcji, są wymagane do aktywności anty-FYV. Stwierdziliśmy że DNAJC14 nie blokuje rozszczepiania YFV ani HCV NS2-3, a przy użyciu mutantów niehamujących mutanty wykazują, że DNAJC14 jest rekrutowany do kompleksów replikacyjnych YFV. Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że endogenny DNAJC14 ulega rearanżacji podczas infekcji i znajduje się w kompleksach replikacyjnych zidentyfikowanych przez barwienie dsRNA . Co ciekawe, wyciszenie endogennego DNAJC14 powoduje upośledzoną replikację YFV sugerując wymóg DNAJC14 w kompleksie replikacyjnym YFV replikacji YFV. Wreszcie, aktywność przeciwwirusowa nadeksprymowanego DNAJC14 występuje w sposób sposób zależny od czasu i dawki. Nadekspresja DNAJC14 może zakłócać właściwą stechiometrię skutkującą inhibicją, którą można przezwyciężyć po przywróceniu optymalnych proporcji z powodu akumulacji wirusowych białek niestrukturalnych. Nasze odkrycia, wraz z wcześniej opublikowanymi pracami, sugerują, że członkowie rodziny rodziny Flaviviridae ewoluowały w unikalny i ważny sposób, aby wchodzić w interakcje z cząsteczką chaperonu gospodarza Hsp40.
Z ilu rodzajów składa się rodzina Flaviviridae?
Rodzina Flaviviridae składa się z trzech rodzajów: Flavivirus, Pestivirus i Hepacivirus.