Transpozon piggyBac (PB) specyficzny dla TTAA, pierwotnie wyizolowany z kapusty ćmy kapuścianej, Trichoplusia ni, został wykorzystany jako narzędzie mutagenezy insercyjnej w różnych organizmach eukariotycznych. Tutaj pokazujemy, że PB transponuje w drożdżach drożdży Schizosaccharomyces pombe i nie pozostawia prawie żadnych śladów. My opracowaliśmy system mutagenezy oparty na PB dla S. pombe poprzez skonstruowanie szczepu z selektywnym markerem wycięcia transpozonu i zintegrowanym genem transpozazy. Transpozycja PB w tym szczepie ma niskie odchylenie dystrybucji chromosomalnej, jak pokazano przez mapowanie miejsc insercji oparte na głębokim sekwencjonowaniu. Korzystając z tego systemu, uzyskaliśmy allele utraty funkcji klp5 i klp6 oraz allel wzmocnienia funkcji dam1 z badania przesiewowego mutantów opornych na lek destabilizujący mikrotubule tiabendazol. Z innego badania przesiewowego dla supresorów cdc25-22 uzyskaliśmy wiele alleli wee1, zgodnie z oczekiwaniami. Sukces tych dwóch badań przesiewowych wykazał przydatność tego narzędzia mutagenezy za pośrednictwem PB dla rozszczepienia drożdży. --- Transpozony są obiecującymi systemami integracji genów somatycznych, ponieważ mogą nie tylko nie tylko efektywnie integrować egzogenne geny, ale także być dostarczane do różnych narządów przy użyciu szeregu metod transfekcji. transpozon piggyBac (PB) ma wysoką transpozycyjność w komórkach ssaków in vitro i został wykorzystywany w badaniach genetycznych i przedklinicznych. Jednak transpozycyjność PB w w komórkach somatycznych ssaków in vivo nie została jeszcze wykazana. Tutaj wykazaliśmy trwałą ekspresję genów za pośrednictwem PB u dorosłych myszy. Skonstruowaliśmy PB plazmidowe DNA (pDNA) zawierające geny reporterowe [lucyferazę Firefly i Gaussia (Gluc)] geny. Myszy transfekowano przez wstrzyknięcie tych pDNA przy użyciu procedury opartej na procedury opartej na hydrodynamice, a warunki dla wysokiego poziomu trwałej ekspresji genów ekspresji genów. W konsekwencji ekspresja genów utrzymywała się przez 2 miesiące. miesięcy. Nasze wyniki sugerują, że PB jest przydatna do selektywnej somatycznej integracji narządów somatycznej i trwałej ekspresji genów u ssaków i przyczyni się do podstawowych badań genetycznych i terapii genowych. --- Przeprogramowanie komórek somatycznych do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pozwala na uzyskanie uzyskanie spersonalizowanych komórek macierzystych. Transgeneza transpozonowa jest nową i realną alternatywą dla metod transdukcji wirusowej w celu dostarczania czynników czynników reprogramujących (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) do komórek somatycznych. Ponieważ transpozony mogą być wprowadzane jako nagie DNA przy użyciu powszechnych protokołów transfekcji plazmidów protokoły transfekcji plazmidów, stanowią one bezpieczniejszą alternatywę dla metod wirusowych. są niezależne od czynników gospodarza i stabilnie integrują się z docelowym genomem. genomu, a jednocześnie korzystają z unikalnej cechy płynnego usuwania, w którym pośredniczy przez przejściową ekspresję transpozazy piggyBac. Zatem transpozycja piggyBac zapewnia skuteczny sposób generowania ludzkich iPSC wolnych od transgenów. Protokół opisuje produkcję iPSC z ludzkich fibroblastów embrionalnych, dostarczanie czynników przeprogramowujących poprzez transfekcję plazmidów i transpozycję piggyBac transpozycji. --- TŁO: Transpozony DNA stały się niezbędnymi narzędziami do manipulowania genomami kręgowców. genomów kręgowców z zastosowaniami od mutagenezy insercyjnej i transgenezę do terapii genowej. Aby w pełni zbadać potencjał dwóch wysoce aktywnych aktywnych transpozonów DNA, piggyBac i Tol2, jako narzędzi genetycznych ssaków, przeprowadziliśmy przeprowadziliśmy porównanie tych dwóch systemów transpozonowych w tym samym aby ocenić ich zalety i wady do zastosowania w terapii genowej i odkrywania genów. WYNIKI: Zaobserwowaliśmy, że (1) transpozon Tol2 (ale nie piggyBac) jest wysoce wrażliwy na inżynierię molekularną. wysoce wrażliwa na inżynierię molekularną; (2) dawca piggyBac z tylko 40 bp 3'- i 67 bp 5'-końcowa domena powtórzenia jest wystarczająca do skutecznej transpozycji; oraz transpozycji; oraz (3) niewielka ilość transpozaz piggyBac skutkuje solidną transpozycji, co sugeruje, że transpozaza piggyBac jest wysoce aktywna. Przeprowadzenie profilowanie docelowe w całym genomie na zestawach danych uzyskanych przez pobieranie chromosomalnych sekwencji docelowych z poszczególnych klonów, zidentyfikowaliśmy kilka hotspotów piggyBac i Tol2 i zaobserwowaliśmy, że (4) piggyBac i Tol2 wykazują wyraźną różnicę w preferencjach różnicę w preferencjach docelowych w ludzkim genomie. Wreszcie, zaobserwowaliśmy zaobserwowaliśmy, że (5) tylko miejsca o określonym kontekście sekwencji mogą być celem przez piggyBac lub Tol2. WNIOSKI: Nienakładające się preferencje celowania piggyBac i Tol2 sprawiają, że z nich komplementarne narzędzia badawcze do manipulowania genomami ssaków. PiggyBac jest najbardziej obiecującym systemem wektorowym opartym na transpozonach do osiągnięcia specyficznego dla miejsca ukierunkowanie genów terapeutycznych ze względu na elastyczność jego transpozazy dla molekularnej inżynierii. Spostrzeżenia z tego badania zapewnią podstawę dla inżynierii transpozaz piggyBac w celu osiągnięcia specyficznego dla miejsca genu terapeutycznego terapeutycznych. --- Skuteczna terapia genowa wymaga solidnego dostarczenia pożądanych genów do do odpowiednich komórek docelowych, długotrwałej ekspresji genów i minimalnego ryzyka wtórnych skutków. efektów. Opracowanie skutecznych i bezpiecznych wektorów niewirusowych znacznie ułatwiłoby kliniczne badania nad terapią genową. znacznie ułatwiłoby kliniczne badania nad terapią genową. Jednak niewirusowe metody transferu genów zwykle skutkuje jedynie ograniczoną stabilną skutecznością transferu genów w większości komórek pierwotnych. większości komórek pierwotnych. Zastosowanie niewirusowych metod dostarczania genów w połączeniu z technologią transpozonów najnowszej generacji opartą na transpozonach Sleeping Beauty (SB) lub transpozonach piggyBac może potencjalnie przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń. W szczególności W szczególności, zakrojone na szeroką skalę badania genetyczne w komórkach ssaków przyniosły nowość nadaktywną transpozazę SB, skutkującą silnym i stabilnym znakowaniem genów in vivo po hematopoetycznej rekonstytucji za pomocą hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych CD34(+) w modelach mysich. w modelach mysich. Co więcej, niedawno zatwierdzono pierwsze badanie kliniczne zostało zatwierdzone do stosowania przekierowanych limfocytów T zmodyfikowanych za pomocą SB do terapii genowej chłoniaka chłoniaka z komórek B. Wreszcie, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być generowane po przeprogramowaniu genetycznym za pomocą transpozonów piggyBac kodujących czynniki przeprogramowujące czynniki reprogramujące. Te ostatnie osiągnięcia podkreślają pojawiający się potencjał transpozonów w zastosowaniach terapii genowej i generowaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej. --- Transpozony są obiecującymi elementami do integracji genów, a system Sleeping System Sleeping Beauty (SB) był głównym systemem przez wiele lat, chociaż istniało dostępnych jest kilka innych systemów transpozonów, na przykład Tol2. Jednakże, Ostatnio jednak wprowadzono i opracowano inny system znany jako PiggyBac (PB). do tych samych celów, na przykład mutagenezy, transgenezy i terapii genowej. terapię genową, a w niektórych przypadkach z lepszą wydajnością transpozycji i przewagę nad systemem transpozonowym Sleeping Beauty, chociaż ulepszona hiperaktywna transpozaza znacznie zwiększyła skuteczność transpozycji SB. Systemy PB były wykorzystywane w wielu różnych dziedzinach badań naukowych; Dlatego celem tego przeglądu jest opisanie niektórych z tych wszechstronnych zastosowań systemu PiggyBac. zastosowań systemu PiggyBac, aby dać czytelnikom przegląd wykorzystania systemu PiggyBac system. --- Dokładne i skuteczne wycięcie pozytywnego markera jest niezbędne do wprowadzenia pożądanych mutacji do genomu roślinnego poprzez ukierunkowanie genów (GT) przy użyciu pozytywnego/negatywnego systemu selekcji. U ssaków, pochodzący od ćmy system transpozonów piggyBac został z powodzeniem wykorzystany do wyeliminowania selektywnego markera z locus GT. selektywnego markera z locus GT bez pozostawiania śladu. Tutaj przedstawiamy dowody na to, że transpozon piggyBac funkcjonuje również w komórkach roślinnych. Aby zademonstrować wykorzystanie transpozonu piggyBac do skutecznego wycinania markerów w roślinach. roślin, zaprojektowaliśmy system testowy transpozycji, który pozwala na wizualizację transpozycji piggyBac na wizualizację transpozycji jako luminescencji szmaragdowej lucyferazy (Eluc) w komórkach ryżu. komórkach ryżu. Sygnał Eluc pochodzący z wycięcia piggyBac zaobserwowano w hiperaktywnych kalli ryżu z ekspresją transpozazy piggyBac. Łańcuch polimerazy reakcja łańcuchowa polimerazy, analizy Southern blot i sekwencjonowanie ujawniły wydajną i precyzyjną transpozycję piggyBac w tych kalli. Ponadto wykazaliśmy wycięcie markera selekcyjnego z locus reportera w roślinach T0 bez jednoczesnej reintegracji transpozonu i z wysoką częstotliwością (44% wycięć). częstotliwości (44,0% przypadków wycięcia), nawet przy braku selekcji negatywnej. --- Generowanie hodowanych ludzkich komórek stabilnie wyrażających jedną lub więcej sekwencji rekombinowanych genów sekwencji genów jest szeroko stosowanym podejściem w badaniach biomedycznych, biotechnologii, i opracowywaniu leków. Konwencjonalne metody nie są wydajne i mają poważne ograniczenia, zwłaszcza w przypadku inżynierii komórek w celu koekspresji wielu transgenów lub kompleksów wielobiałkowych. W tym raporcie wykorzystaliśmy wysoce wydajne, niewirusowy i oparty na plazmidzie system transpozonów piggyBac, aby umożliwić jednoczesną integrację genomową wielu niezależnych transpozonów zawierających różne sekwencje DNA sekwencje DNA kodujące białka. Cytometria przepływowa klonów komórkowych pochodzących z wykazała około 60% (trzy transpozony) lub około 30% (trzy transpozony). transpozony) lub około 30% (cztery transpozony) stabilną koekspresję wszystkich dostarczonych transgenów z selekcją dla pojedynczego transpozonu markerowego. Zweryfikowaliśmy multipleksowe dostarczanie transpozonów piggyBac poprzez koekspresję dużych transgenów kodujących wielopodjednostkowy neuronalny kanał sodowy bramkowany napięciem (SCN1A) zawierający podjednostkę tworzącą pory i dwie podjednostki pomocnicze, przy użyciu dwóch dodatkowych genów geny do selekcji. Wcześniej nieosiągalny silny prąd sodowy został wykazano w 38 pasażach, odpowiednich do stosowania w zautomatyzowanej zautomatyzowanej platformie elektrofizjologicznej o wysokiej przepustowości. Kotransfekcja trzech dużych (do 10,8 kb) transpozonów piggyBac wygenerowała heterozygotyczną stabilną linię komórkową SCN1A wyrażającą dwa oddzielne allele podjednostki tworzącej pory i dwie dodatkowe podjednostki podjednostek (łącznie cztery podjednostki kanału sodowego) z silną ekspresją funkcjonalną. ekspresją. Wnioskujemy, że system transpozonów piggyBac może być stosowany do wykonywania multipleksowanego stabilnego transferu genów w hodowanych ludzkich komórkach, a ta technologia technologia może być cenna w zastosowaniach wymagających jednoczesnej ekspresji kompleksów kompleksów wielobiałkowych. --- Synteza DNA jest uważana za cechę definiującą ruch elementów transpozycyjnych. elementów. Określając mechanizm transpozycji piggyBac, transpozonu owadów transpozonu owadów, który jest coraz częściej wykorzystywany do manipulacji genomem w różnych systemach, w tym w komórkach ssaków. systemach, w tym w komórkach ssaków, odkryliśmy, że synteza DNA może być uniknąć podczas transpozycji piggyBac, zarówno w miejscu dawcy po transpozonu, jak i w miejscu insercji po integracji transpozonu. Wykazaliśmy, że wycięcie transpozonu piggyBac następuje poprzez utworzenie przejściowych spinek do włosów na końcach transpozonu i że łączenie docelowe piggyBac następuje poprzez bezpośredni atak końców 3'OH transpozonu na docelowy DNA. Jest to ta sama strategia łączenia docelowego stosowana przez członków nadrodziny transpozonów DDE i integrazy retrowirusowe. Analiza zmutowanych transpozonów piggyBac in vitro i in vivo przy użyciu systemu transpozycji piggyBac który stworzyliśmy w Saccharomyces cerevisiae sugeruje, że transpozaza piggyBac jest członkiem nadrodziny rekombinaz DDE, co jest nieoczekiwanym wynikiem ze względu na brak podobieństwa sekwencyjnego wynik z powodu braku podobieństwa sekwencji między piggyBac i DDE rodziny rekombinaz. --- Transpozon DNA piggyBac jest szeroko stosowany jako narzędzie w eksperymentalnych systemach do transgenezy, mutagenezy i inżynierii genomu ssaków. Scharakteryzowaliśmy scharakteryzowaliśmy preferencje miejsca insercji piggyBac w całym genomie poprzez sekwencjonowanie duży zestaw miejsc integracji wynikających z transpozycji z dwóch oddzielnych genomowych loci i plazmidu-dawcy w mysich zarodkowych komórkach macierzystych. Odkryliśmy, że piggyBac preferencyjnie integruje się lokalnie z miejscem wycięcia, gdy jest mobilizowany z lokalizacji chromosomalnej i zidentyfikowaliśmy inne nielokalne regiony genomu z podwyższonymi częstotliwościami insercji. insercje piggyBac były związane z ekspresją genów i markerami otwartego genomu. ekspresją genów i markerami otwartej struktury chromatyny i zostały wykluczone z heterochromatyny. heterochromatyny. Na poziomie nukleotydów, piggyBac preferuje insercje do regionów regionów bogatych w TA w szerszym kontekście bogatym w GC. Odkryliśmy również, że piggyBac może wstawiać się do miejsc innych niż znane miejsce insercji TTAA z niską częstotliwością (2%). częstotliwości (2%). Takie insercje wprowadzają niedopasowania, które są naprawiane za pomocą sygnaturami szlaków naprawczych komórki gospodarza. Transpozony mogą być mobilizowane z plazmidów plazmidów z obserwowanymi niekanonicznymi regionami bocznymi, co wskazuje, że piggyBac może generować mutacje punktowe w genomie. --- Przedstawiono tutaj oparty na transpozonie piggyBac system ekspresji do generowania indukowalnych doksycykliną, stabilnie transfekowanych kultur komórek ssaków do produkcji białek na dużą skalę. System działa z powszechnie stosowanymi adherentnymi i przystosowanymi do zawiesiny liniami komórek ssaków i wymaga tylko jednego etapu transfekcji. etapu transfekcji. Co więcej, wysoki jednolity poziom ekspresji obserwowany wśród klonów pozwalają na wykorzystanie stabilnych masowych kultur komórkowych, eliminując w ten sposób czasochłonne etapy klonowania. W warunkach ciągłej indukcji doksycykliną, poziomy ekspresji białka wykazano, że poziomy ekspresji białka są stabilne przez co najmniej 2 miesiące przy braku selekcji leków. Wysoka wydajność systemu pozwala również na generowanie stabilnych masowych kultur komórkowych w formacie 96-dołkowym, co prowadzi do możliwości do możliwości generowania stabilnych kultur komórkowych dla całych rodzin błonowych lub wydzielanych białek. Wreszcie, demonstrujemy użyteczność systemu poprzez produkcję na dużą skalę (skala 140-750 mg) endoplazmatycznego rezydentnej w retikulum endoplazmatycznym fukozylotransferazy i dwóch potencjalnych białek przeciwnowotworowych przeciwnowotworowych. --- System transpozonów piggyBac jest naturalnie aktywny i pierwotnie pochodzi od ćmy kapuścianej. Ten niewirusowy system jest oparty na plazmidzie, najczęściej wykorzystujący dwa plazmidy z jednym wyrażającym enzym transpozazy piggyBac i plazmidem transpozonowym Plazmid transpozonowy zawierający gen(y) będący(e) przedmiotem zainteresowania między odwróconymi powtórzeniami które są wymagane do aktywności transferu genów. PiggyBac pośredniczy w przenoszeniu genów poprzez mechanizm "wytnij i wklej", w którym transpozaza integruje segment transpozonu z genem segment transpozonu do genomu komórki docelowej (komórek docelowych). PiggyBac wykazał skuteczną aktywność dostarczania genów w szerokiej gamie owadów, ssaków i komórek ludzkich6, w tym pierwotnych ludzkich limfocytów T. Ostatnio hiperaktywna transpozaza piggyBac została wygenerowana poprawiając transfer genów transfer genów. Ludzkie limfocyty T mają znaczenie kliniczne dla adoptywnej immunoterapii nowotworów. immunoterapii nowotworów. Warto zauważyć, że pierwsze badanie kliniczne obejmujące modyfikację transpozonów ludzkich limfocytów T przy użyciu systemu transpozonowego Sleeping beauty. zostało zatwierdzone. Wcześniej ocenialiśmy użyteczność piggyBac jako jako niewirusowej metody modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów T. Stwierdziliśmy, że piggyBac jest skuteczny w genetycznej modyfikacji ludzkich limfocytów T za pomocą genem reporterowym i nieimmunogennym indukowalnym genem samobójczym. Analiza genomowych miejsc integracji miejsc integracji ujawniła brak preferencji dla integracji do lub w pobliżu znanych protoonkogenów. Użyliśmy piggyBac do modyfikacji genów cytotoksycznych limfocytów T do przenoszenia chimerycznego receptora antygenowego skierowanego przeciwko antygenowi nowotworowemu HER2, i stwierdziliśmy, że zmodyfikowane genowo limfocyty T pośredniczyły w celowanym zabijaniu HER2-dodatnich komórek nowotworowych in vitro i in vivo w ortotopowym modelu mysim. Wykorzystaliśmy również piggyBac do wytworzenia ludzkich limfocytów T opornych na rapamycynę, co powinno być przydatne w terapiach przeciwnowotworowych, w których stosowana jest rapamycyna. W niniejszym dokumencie opisujemy metodę wykorzystania piggyBac do genetycznej modyfikacji pierwotnych ludzkich limfocytów T. Obejmuje to obejmuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z ludzkiej krwi, a następnie hodowlę, modyfikację genów i aktywację limfocytów T. Dla celu niniejszego raportu, limfocyty T zostały zmodyfikowane genem reporterowym (eGFP) w celu analizy i kwantyfikacji ekspresji genów za pomocą cytometrii przepływowej. PiggyBac może być może być stosowany do modyfikowania ludzkich limfocytów T różnymi interesującymi genami. Chociaż piggyBac do kierowania limfocytów T na antygeny nowotworowe, użyliśmy również piggyBac, aby dodać indukowalny wyłącznik bezpieczeństwa w celu wyeliminowania komórek zmodyfikowanych genami w razie potrzeby. w razie potrzeby. Duża pojemność ładunkowa piggyBac umożliwiła również transfer genów transfer dużej cząsteczki mTOR odpornej na rapamycynę (15 kb). Dlatego też przedstawiamy niewirusową metodologię stabilnej modyfikacji genów pierwotnych ludzkich limfocytów T do wielu różnych celów. --- Mutageneza przez nieprecyzyjne wycięcie za pośrednictwem transpozonu jest najszerzej stosowaną techniką mutagenezy. stosowaną techniką mutagenezy u Drosophila. Chociaż element P jest najczęściej szeroko stosowanym transpozonem u Drosophila do generowania mutantów delecyjnych, jest on ograniczony przez przez zimne miejsca insercji w genomie, gdzie elementy P są rzadko spotykane. Transpozon transpozon piggyBac został opracowany jako alternatywny wektor mutagenny do mutagenezy genów innych niż P-elementy u Drosophila, ponieważ transpozon piggyBac może bardziej losowo integrować się z genomem. Poprzednie badania sugerowały, że transpozon piggyBac zawsze wycina się dokładnie z miejsca insercji bez inicjowania delecji. bez inicjowania delecji lub pozostawiania dodatkowego śladu. śladu. Ta unikalna cecha transpozonu piggyBac ułatwia odwracalny transfer genów w kilku badaniach, takich jak generowanie indukowanych pluripotencjalnych macierzy indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) z fibroblastów. Jednak podniósł również potencjalne ograniczenie potencjalne ograniczenie jego użyteczności w generowaniu mutantów delecyjnych u Drosophila. W tym badaniu opisujemy wiele nieprecyzyjnych wycięć transpozonu transpozonu piggyBac w locus reduktazy sepiapteryny (SR) u Drosophila. Poprzez nieprecyzyjne wycięcie transpozonu piggyBac wstawionego w 5'-UTR genu SR, wygenerowaliśmy genu SR, wygenerowaliśmy hipomorficzny zmutowany allel genu SR, który wykazał znacznie obniżony poziom ekspresji SR. Nasze odkrycie sugeruje, że możliwe jest generowanie mutantów delecyjnych za pośrednictwem transpozonu piggyBac nieprecyzyjne wycięcie u Drosophila. Sugeruje to jednak również ograniczenie odwracalny transfer genów za pośrednictwem transpozonu piggyBac do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). --- Transfer genów do komórek somatycznych umożliwił indukowalną ekspresję genów in vivo poprzez koinfekcję wielu wirusów. Postawiliśmy hipotezę, że wysoce wydajny oparty na plazmidzie system transpozonu piggyBac umożliwiłby długoterminową indukowalną ekspresję genów u myszy in vivo. Wykorzystaliśmy strategię dostarczania wielu transpozonów aby stworzyć indukowalny tetracykliną system ekspresji in vitro w ludzkich komórkach, dostarczając dwa geny na oddzielnych transpozonach do indukowalnej ekspresji genu reporterowego ekspresji genu reporterowego wraz z oddzielnym selektywnym markerem transpozonowym. Ocena stabilnych linii komórkowych wykazała, że 100% wybranych klonów wykazywało indukowalną ekspresję poprzez stabilną ekspresję z trzech oddzielnych transpozonów jednocześnie. Następnie przetestowaliśmy i stwierdziliśmy, że transfer genów za pośrednictwem piggyBac do wątroby lub płuc może osiągnąć stabilną ekspresję genu reporterowego u myszy in vivo w u zwierząt immunokompetentnych lub z niedoborem odporności. Pojedyncze wstrzyknięcie transpozonów transpozonów piggyBac może osiągnąć długotrwałą indukowalną ekspresję genów w wątroby myszy in vivo, potwierdzając naszą strategię wielu transpozonów stosowaną w hodowanych komórkach. hodowanych komórkach. Oparty na plazmidzie system transpozonów piggyBac umożliwia konstytutywną lub indukowalną ekspresję genów in vivo dla potencjalnych zastosowań terapeutycznych i zastosowań terapeutycznych i biologicznych bez użycia wektorów wirusowych. --- Rozwój technologii umożliwiających stabilne dostarczanie dużych fragmentów genomowego DNA w systemach ssaków jest ważny dla badań genetycznych, jak również do zastosowań w terapii genowej. Transpozony DNA pojawiły się jako elastyczne i elastyczne i wydajne nośniki molekularne do pośredniczenia w stabilnym przenoszeniu ładunku. Jednakże zdolność do przenoszenia fragmentów DNA >10 kb jest ograniczona w większości transpozonów DNA. Tutaj, pokazujemy, że transpozon DNA piggyBac może mobilizować 100-kb fragmenty DNA w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ES), co czyni go jedynym znanym transpozonem z tak dużą pojemnością ładunkową. Integralność ładunku jest utrzymywana podczas transpozycji, liczba kopii może być kontrolowana, a wstawione gigantyczne transpozony transpozony wyrażają ładunek genomowy. Co więcej, te 100-kb transpozony mogą być mogą być również wycinane z genomu bez pozostawiania śladu. Rozwój piggyBac jako dużego wektora ładunku ułatwi szerszy zakres zastosowań genetycznych i genomicznych. zastosowań genetycznych i genomicznych.
Czym są transpozony piggyBAC?
Transpozony piggyBAC to niewirusowe metody dostarczania genów, które zostały opracowane jako narzędzia do mutagenezy insercyjnej. Mogą one mobilizować 100-kb fragmenty DNA w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ES), co czyni je jedynymi znanymi transpozonami o tak dużej pojemności ładunku. Integralność ładunku jest utrzymywana podczas transpozycji, liczba kopii może być kontrolowana, a wstawione gigantyczne transpozony wyrażają ładunek genomowy. Co więcej, te 100-kb transpozony mogą być również wycinane z genomu bez pozostawiania śladu. Rozwój piggyBac jako dużego wektora ładunku ułatwi szerszy zakres zastosowań genetycznych i genomicznych.