TŁO: Szlak rozpadu mRNA za pośrednictwem nonsensu (NMD) promuje szybką degradację mRNA zawierającego przedwczesne kodony terminacyjne (PTC). degradację mRNA zawierającego kodony przedwczesnej terminacji (PTC). U drożdży Saccharomyces cerevisiae, aktywność szlaku NMD zależy od rozpoznania PTC przez maszynerię translacyjną. Czynniki terminacji translacji translacji eRF1 (Sup45) i eRF3 (Sup35) uczestniczą nie tylko w ostatnim etapie syntezy białek, ale także w degradacji mRNA i inicjacji translacji poprzez interakcję z takimi białkami jak Pab1, Upf1, Upf2 i Upf3. WYNIKI: W niniejszej pracy wykorzystaliśmy wcześniej wyizolowane mutanty sup45 S. cerevisiae do scharakteryzowania degradacji nieprawidłowego mRNA w warunkach, w których terminacja translacji jest zaburzona. Sekwencjonowaliśmy allele his7-1, lys9-A21 i trp1-289, które są często wykorzystywane do analizy supresji nonsensownej. Ustaliliśmy, że mutacje nonsensowne i missensowne sup45 prowadzą do akumulacji mRNA his7-1 i pre-mRNA CYH2. Co ciekawe, delecja genu UPF1 tłumi niektóre fenotypy sup45. W szczególności, podwójne mutanty sup45-n upf1Delta mutanty były mniej wrażliwe na temperaturę i bardziej odporne na paromomycynę niż pojedyncze mutanty sup45. Ponadto, delecja UPF2 lub UPF3 przywróciła żywotność podwójnych mutantów sup45-n. WNIOSEK: Jest to pierwsza demonstracja, że mutacje sup45 nie tylko nie tylko zmieniają wierność translacji, ale także powodują zmianę stabilności mRNA. --- W Saccharomyces cerevisiae, nonsensowny rozpad mRNA (NMD) wymaga Upf1p, Upf2p i Upf3p do przyspieszenia tempa rozpadu dwóch unikalnych klas transkryptów transkryptów: (1) nonsensownych mRNA, które powstają w wyniku błędów w ekspresji genów, i (2) naturalnie występujące transkrypty, które nie mają błędów kodowania, ale mają wbudowane funkcje, które ukierunkowują je na przyspieszony rozpad (bezbłędne mRNA). NMD może wyzwalać rozpad podczas każdej rundy translacji i może być ukierunkowany na transkrypty związane z Cbc lub transkrypty związane z eIF-4E. Niezwykle niskie stężenia białek Upf w stosunku do całkowitej puli transkryptów utrudniają zrozumienie, w jaki sposób nonsensowne transkrypty są selektywnie rekrutowane. Aby pobudzić debatę, proponujemy dwa alternatywne mechanizmy selekcji transkryptów nonsensownych dla NMD i dla montażu składników kompleksu nadzoru, jeden dla pierwszej (pionierskiej) rundy translacji, zwanej "znakowaniem jądrowym". rundy translacji, zwanej "znakowaniem jądrowym", a drugi dla kolejnych rund, zwanych "montażem odwrotnym". rund, zwanych "odwrotnym montażem". Model został zaprojektowany w celu uwzględnienia (1) niską obfitość czynników NMD, (2) rolę nukleocytoplazmatycznych białek wahadłowych białek w NMD, (3) niezależną i nieobligatoryjną kolejność montażu dwóch różnych subkompleksów czynników NMD oraz (4) zdolność NMD do jednoczesnego zmniejszania lub eliminowania syntezy skróconych białek produkowanych przez transkrypty nonsensowne, jednocześnie regulując w dół, ale nie całkowicie eliminując funkcjonalnych białek produkowanych z bezbłędnych transkryptów wrażliwych na NMD --- Transkrypty zawierające przedwczesne sygnały zakończenia translacji są rozpoznawane i szybko degradowane przez komórki eukariotyczne poprzez szlak znany jako nonsensowny rozpad mRNA (NMD). Oprócz ochrony komórek poprzez zapobieganie translacji potencjalnie szkodliwych skróconych peptydów, badania sugerują, że NMD odgrywa szerszą rolę w regulacji poziomów transkryptów fizjologicznych. W Saccharomyces cerevisiae, trzy czynniki trans-działające (Upf1p do Upf3p) są wymagane do NMD. Ortologi Upf1p zostały zidentyfikowane u wielu gatunków, pokazując, że maszyneria NMD, przynajmniej częściowo, jest zachowana w toku ewolucji. W tym badaniu wykazaliśmy dodatkową funkcjonalną konserwację szlaku NMD poprzez identyfikację homologów Upf2p u Schizosaccharomyces pombe i ludzi (rent2). Zakłócenie S. pombe UPF2 ustalono, że gen ten jest wymagany do NMD w rozszczepieniu drożdży. Wykazano, że rent2 oddziałuje bezpośrednio z rent1, znanym trans-efektorem NMD. trans-efektorem NMD w komórkach ssaków. Dodatkowo wykazano, że fragmenty rent2 wykazano, że posiadają aktywność celowania jądrowego, chociaż natywne białko lokalizuje się w przedziale cytoplazmatycznym. Wreszcie, nowe funkcjonalne domeny Upf2p i rent2 z homologią do eukariotycznego czynnika inicjacji 4G (eIF4G) i innych białek regulujących translację. innymi białkami regulującymi translację. Ukierunkowane mutacje w tych tak zwanych domenach homologii eIF4G (4GH) były wystarczające do zniesienia funkcji S. pombe Upf2p. Ponadto, przy użyciu systemu dwuhybrydowego uzyskaliśmy dowody na bezpośrednią interakcję między rent2 a ludzkim eIF4AI i Sui1, obydwoma składnikami kompleksu inicjacji translacji. Na podstawie tych Odkrycia, nowy model, w którym efekty Upf2p i rent2 zmniejszyły translację i przyspieszały rozpad transkryptów nonsensownych poprzez konkurencyjne interakcje z partnerami wiążącymi eIF4G. --- W Saccharomyces cerevisiae transkrypty mRNA z przedwczesnymi kodonami terminacji są ukierunkowane na niezależne od deadenylacji odkapslowanie i rozpad od 5' do 3' w szlaku kontroli jakości zwanym w szlaku kontroli jakości określanym jako rozpad za pośrednictwem nonsensu (NMD). Krytyczne czynniki w NMD obejmują Upf1, Upf2 i Upf3, a także enzym dekapujący, Dcp2/Dcp1. Utrata Upf2 lub Upf3 prowadzi do akumulacji nie tylko Upf1 i Dcp2 w P-bodies, ale także P, ale także aktywatorów dekappingu Pat1, Dhh1 i Lsm1. Interakcja zidentyfikowano interakcję między Upf1 i Dcp2, która może rekrutować Dcp2 do kompleksu dekapującego NMD. Aby określić charakter i znaczenie interakcji Dcp2-Upf1, wykorzystaliśmy test dwuhybrydowy drożdży do oceny Upf1 z różnymi czynnikami decappingu mRNA. Odkryliśmy, że chociaż Dcp2 może oddziaływać z Upf1, interakcja ta jest pośrednia i w dużej mierze zależy od białka Edc3, które oddziałuje z N-końcową domeną Upf1 w sposób Nakładające się, ale nie identyczne, miejsce jak Upf2. Odkryliśmy również, że Pat1 ma niezależną interakcję dwuhybrydową z N-końcem Upf1. Ocena zarówno reporterowych, jak i endogennych transkryptów NMD sugeruje, że stymulatory dekapowania stymulatory, w tym Edc3 i Pat1, a także Edc1 i Edc2, nie są niezbędne dla NMD w normalnych warunkach. Ta praca definiuje większy kompleks decapping zaangażowany w NMD, ale wskazuje, że składniki tego kompleksu nie są wymagane do ogólnego NMD i mogą albo regulować podzbiór transkryptów NMD lub być niezbędne do prawidłowego NMD w różnych warunkach środowiskowych. --- Nonsensowny rozpad mRNA (NMD) jest mechanizmem nadzoru, który przyspiesza degradację mRNA zawierających przedwczesne kodony zakończenia translacji. Ten szlak kontroli jakości zależy od czynników specyficznych dla NMD, Upf1p, Upf2p/Nmd2p i Upf3p, a także dwóch czynników uwalniających, eRF1 i eRF3 (odpowiednio oznaczone jako Sup45p i Sup35p u drożdży). Aktywacja NMD jest również przez brak białka wiążącego poli(A), Pab1p, za zdarzeniem terminacji. terminacji. Ponieważ Sup35p oddziałuje zarówno z Upf1p, jak i Pab1p, rozważaliśmy możliwość rozważaliśmy możliwość, że zróżnicowane wiązanie tych ostatnich czynników do Sup35p może być krytycznym wyznacznikiem wrażliwości NMD dla mRNA. Tutaj opisujemy trzy podejścia do oceny tej hipotezy. Po pierwsze, związaliśmy fragmenty lub zmutowane formy Sup35p za przedwczesnym kodonem terminacji w nonsensownym mRNA zawierającym mini-pgk1 i wykazaliśmy, że hamowanie NMD przez tethered Sup35p nie zależy od domeny niezbędnej do rekrutacji Pab1p. Po drugie, zbadaliśmy właściwości interakcji Sup35p z Upf1p i Pab1p in vitro i wykazaliśmy, że te dwa białka wiążą się różnie z Sup35p. Wreszcie, zbadaliśmy konkurencyjne wiązanie między trzema białkami i zaobserwowaliśmy, że że Upf1p hamuje wiązanie Pab1p do Sup35p, podczas gdy interakcja między Upf1p i Sup35p jest względnie niezmieniona przez Pab1p. Dane te wskazują, że wiązanie Upf1p i Pab1p do Sup35p może być bardziej złożone niż przewidywano i że aktywacja NMD może obejmować coś więcej niż tylko prostą konkurencję między tymi czynnikami. Wnioskujemy, że aktywacja NMD w kodonie przedwczesnej terminacji kodonu nie opiera się wyłącznie na braku Pab1p i sugerujemy, że specyficzny etap rekrutacji etap rekrutacji musi zaangażować Upf1p w proces i mRNA związane z Upf1p do NMD. --- Wśród dużej kolekcji nonsensownych (terminacyjnych) supresorów Saccharomyces cerevisiae, kilka pozostało niejasnych ze względu na ich naturę molekularną. Spośród nich, grupa słabych i recesywnych supresorów, sup111, sup112 i sup113, jest szczególnie szczególne zainteresowanie ze względu na ich zależność od [PSI+], prionu drożdżowego. Z faktów że te supresory mapują się w pozycjach dość podobnych do genów UPF2, UPF3 i UPF1 i UPF1, oraz że niektóre mutacje w genach UPF nadają aktywność supresorową zakończenia aktywność supresorową, podejrzewaliśmy, że sup111, sup112 i sup113 będą bardzo dobrze być zmutowanymi allelami genów UPF. Przetestowaliśmy nasze spekulacje i odkryliśmy, że sup113, sup111 i sup112 były w rzeczywistości uzupełnione allelami typu dzikiego odpowiednio UPF1, UPF2 i UPF3. Ponadto uzyskaliśmy dowody na to, że UPF1, UPF2 i UPF3 szczepów niosących odpowiednio sup113, sup111 i sup112, miały mutacje punktowe. Z tych wyników wnioskujemy, że sup111, sup112 i sup113 są zmutowanymi allelami odpowiednio UPF2, UPF3 i UPF1, a tym samym przypisujemy aktywność supresorową tych mutacji defektom w NMD (nonsensowny rozpad mRNA).
Jakie są główne czynniki NMD w Saccharomyces cerevisiae?
Nonsensowny rozpad mRNA (NMD) jest mechanizmem nadzoru, który przyspiesza degradację mRNA zawierających przedwczesne kodony zakończenia translacji. Ten szlak kontroli jakości zależy od czynników specyficznych dla NMD, Upf1p, Upf2p/Nmd2p i Upf3p, a także dwóch czynników uwalniających, eRF1 i eRF3 (odpowiednio oznaczonych jako Sup45p i Sup35p u drożdży). Aktywacja NMD jest również możliwa dzięki nieobecności białka wiążącego poli(A), Pab1p, za zdarzeniem terminacji