Prokariotyczne systemy CRISPR-Cas typu II można zaadaptować w celu umożliwienia ukierunkowanych modyfikacji genomu u wielu eukariontów. modyfikacje genomu u wielu eukariontów. Tutaj zaprojektowaliśmy ten system, aby umożliwić regulację genomu kierowaną przez RNA w ludzkich komórkach poprzez wiązanie domen aktywacji transkrypcji domen aktywacji transkrypcji bezpośrednio do białka Cas9 pozbawionego nukleazy lub do zmodyfikowanego aptamerem pojedynczego RNA (sgRNA). Wykorzystując tę funkcjonalność opracowaliśmy test oparty na aktywacji transkrypcyjnej w celu określenia krajobrazu wiązania kompleksów sgRNA:Cas9 i porównaliśmy go z aktywnością aktywnością efektorów podobnych do aktywatorów transkrypcji (TAL). Nasze wyniki ujawniają że profile specyficzności są zależne od sgRNA oraz że kompleksy sgRNA:Cas9 i 18-merowe efektory TAL mogą potencjalnie tolerować odpowiednio 1-3 i 1-2 niedopasowania docelowe, odpowiednio. Poprzez inżynierię wymogu kooperatywności poprzez offset w celu edycji genomu lub poprzez wiele synergistycznych sgRNA dla solidnej aktywacji transkrypcji aktywacji transkrypcji, sugerujemy metody łagodzenia zjawisk poza celem. Nasze wyniki rozszerzają wszechstronność narzędzia sgRNA:Cas9 i podkreślają krytyczną potrzebę krytyczną potrzebę zaprojektowania lepszej specyficzności. --- CRISPR-Cas koduje adaptacyjny układ odpornościowy, który broni prokariotów przed zakaźnymi wirusami i plazmidami. W odporności pośredniczą nukleazy Cas, które wykorzystują małe prowadnice RNA (crRNA), aby określić miejsce cięcia w genomie inwazyjnych kwasów nukleinowych. W systemach CRISPR-Cas typu II, aktywność cięcia DNA jest wykonywane przez pojedynczy enzym Cas9 prowadzony przez dupleks RNA. Używając syntetycznych pojedynczych prowadnic RNA, Cas9 może być przeprogramowany do tworzenia specyficznych dwuniciowego DNA w genomach różnych organizmów, od komórek ludzkich po bakterie. od komórek ludzkich po bakterie, a tym samym stanowi potężne narzędzie inżynierii genetycznej. inżynierii genetycznej. Tutaj opisujemy ostatnie postępy w naszym rozumieniu odporności typu II CRISPR-Cas i jak te badania doprowadziły do rewolucyjnych zastosowań edycji genomu. zastosowań. --- Inżynieria genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) jest bardzo obiecująca dla badań biomedycznych i medycyny regeneracyjnej. Niedawno szlak interferencyjny RNA, DNA z bakterii [klastrowy szlak interferencyjny typu II, regularnie rozmieszczone, krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) - szlak związany z CRISPR (Cas)]. (Cas)] został zaadaptowany do użytku w komórkach eukariotycznych, co znacznie ułatwiając edycję genomu. Tylko dwa systemy CRISPR-Cas (od Streptococcus pyogenes i Streptococcus thermophilus), każdy z własnymi odrębnymi wymaganiami i ograniczeniami. wymaganiami i ograniczeniami, zostały do tej pory opracowane do edycji genomu. Ponadto istnieją ograniczone informacje na temat naprawy ukierunkowanej homologicznie (HDR) (HDR) z wykorzystaniem długich szablonów DNA dawcy w hPSC z tymi systemami. systemów. Tutaj, wykorzystując odrębny system CRISPR-Cas od Neisseria meningitidis, wykazaliśmy skuteczne namierzanie endogennego genu w trzech liniach hPSC przy użyciu HDR. Kierująca się RNA endonukleaza Cas9 z N. meningitidis (NmCas9) rozpoznaje sąsiadujący motyw 5'-NNNNGATT-3' protospacer (PAM) różniący się od rozpoznawanych przez białka Cas9 z S. pyogenes i S. thermophilus (odpowiednio SpCas9 i StCas9, odpowiednio). Podobnie jak SpCas9, NmCas9 jest w stanie wykorzystać jednoprzewodowego RNA (sgRNA) do kierowania swoją aktywnością. Ze względu na swój odrębny sąsiadujący motyw protospacer, maszyneria CRISPR-Cas N. meningitidis zwiększa konteksty sekwencji podatne na edycję genomu kierowaną przez RNA. --- Nukleaza Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) może być skutecznie ukierunkowana na loci genomowe za pomocą loci genomowych za pomocą jednoprzewodowych RNA (sgRNA), aby umożliwić edycję genomu. Tutaj scharakteryzowaliśmy specyficzność celowania SpCas9 w ludzkich komórkach, aby poinformować wybór miejsc docelowych i uniknięcie efektów poza celem. Nasze badanie ocenia >700 przewodnich wariantów RNA i poziomów mutacji indel indukowanych przez SpCas9 w >100 przewidywanych genomowych loci poza celem w komórkach 293T i 293FT. Odkryliśmy, że SpCas9 toleruje niedopasowania między przewodnikiem RNA a docelowym DNA w różnych pozycjach w sposób w sposób zależny od sekwencji, wrażliwy na liczbę, położenie i rozkład niedopasowań. Pokazujemy również, że na rozszczepienie za pośrednictwem SpCas9 nie ma wpływu metylacja DNA metylacja DNA i że dawkę SpCas9 i sgRNA można miareczkować, aby zminimalizować modyfikacji poza celem. Aby ułatwić inżynierię genomu ssaków aplikacji, zapewniamy internetowe narzędzie programowe do prowadzenia selekcji i walidację sekwencji docelowych, a także analizy poza celem. --- Specyficzna dla sekwencji kontrola ekspresji genów w skali całego genomu jest ważne podejście do zrozumienia funkcji genów i inżynierii genetycznej systemów regulacyjnych. Niedawno opisaliśmy metodę opartą na RNA, interferencję CRISPR (CRISPRi) do ukierunkowanego wyciszania transkrypcji w bakteriach i ludzkich komórkach. ludzkich komórkach. System CRISPRi wywodzi się z bakterii Streptococcus pyogenes CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats), wymagając jedynie koekspresji katalizatora. wymaga jedynie koekspresji katalitycznie nieaktywnego białka Cas9 i pojedynczego RNA (sgRNA). Kompleks Cas9-sgRNA wiąże się z elementami DNA elementy komplementarne do sgRNA i powoduje blokadę steryczną, która zatrzymuje elongację transkryptu przez polimerazę RNA, co skutkuje represją docelowego genu. Tutaj przedstawiamy protokół projektowania, budowy i ekspresji sgRNA. ekspresji niestandardowych sgRNA do represji transkrypcji dowolnego genu interesującego. Przedstawiamy również szczegóły dotyczące testowania aktywności represyjnej CRISPRi przy użyciu ilościowych testów fluorescencyjnych i natywnego sekwencjonowania wydłużających się transkryptów. sekwencjonowania. CRISPRi zapewnia uproszczone podejście do szybkiej represji genów w ciągu 1-2 tygodni. Metoda ta może być również dostosowana do wysokoprzepustowego badania funkcji genów w całym genomie i interakcji genetycznych, zapewniając w ten sposób komplementarne podejście do zapewniając komplementarne podejście do interferencji RNA, która może być stosowana w szerszej gamie organizmów. --- System CRISPR/Cas typu II ze Streptococcus pyogenes i jego uproszczona pochodna pochodna, system Cas9/single guide RNA (sgRNA), stały się nowymi, skutecznymi narzędzia do celowego nokautowania genów w bakteriach, drożdżach, muszkach owocowych, danio pręgowanym i ludzkich komórkach. ludzkich komórkach. Tutaj opisujemy adaptacje tych systemów prowadzące do udanej ekspresji systemu Cas9/sgRNA w dwóch gatunkach roślin dwuliściennych, Arabidopsis i tytoniu oraz dwóch gatunkach roślin jednoliściennych, ryżu i sorgo. Agrobacterium tumefaciens wykorzystano do dostarczenia genów kodujących Cas9, sgRNA i niefunkcjonalnego, zmutowanego białka zielonej fluorescencji (GFP) do Arabidopsis i tytoniu. tytoniu. Zmutowany gen GFP zawierał miejsca docelowe w swoich regionach kodujących 5' które zostały pomyślnie rozszczepione przez kompleks CAS9/sgRNA, który wraz z naprawa DNA podatna na błędy, doprowadziła do powstania funkcjonalnych genów GFP. SEKWENCJONOWANIE DNA DNA potwierdziło mutagenezę za pośrednictwem Cas9/sgRNA w miejscu docelowym. Ryż transformowane konstruktami Cas9/sgRNA ukierunkowanymi na region promotora genów podatności na zarazę bakteryjną, OsSWEET14 i OsSWEET11, zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie DNA, aby zawierały zmutowane sekwencje DNA w miejscach docelowych. docelowych. Udana demonstracja systemu Cas9/sgRNA w roślinach modelowych i gatunkach uprawnych dobrze wróży jego krótkoterminowemu wykorzystaniu jako łatwego i skutecznego środka inżynierii genetycznej roślin do zastosowań naukowych i rolniczych. inżynierii genetycznej roślin do zastosowań naukowych i rolniczych. --- Systemy CRISPR/Cas pośredniczą w bakteryjnej adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, która wyewoluowała w celu chronić bakterie przed bakteriofagami i innymi horyzontalnie przenoszonymi elementami genetycznymi. elementami genetycznymi. Istnieje kilka systemów CRISPR/Cas, ale najprostszy wariant, określany jako jako typ II, ma pojedynczą efektorową endonukleazę DNA, zwaną Cas9, która jest prowadzona do celu wirusowego DNA przez dwa małe RNA, crRNA i tracrRNA. Początkowe wysiłki mające na celu dostosowanie systemu CRISPR/Cas do edycji DNA w komórkach ssaków, które skupiały się na białku Cas9 ze Streptococcus pyogenes (Spy), wykazały, że Spy Cas9 może być kierowany do celów DNA w komórkach ssaków przez transkrypty fuzyjne tracrRNA:crRNA zwane pojedynczym RNA (sgRNA). Po związaniu, Cas9 indukuje rozszczepienie DNA prowadzące do mutagenezy w wyniku podatnego na błędy łączenia niehomologicznych łączenia końców (NHEJ). Niedawno system Spy Cas9 został zaadaptowany do wysokoprzepustowego badań przesiewowych genów w ludzkich komórkach pod kątem ich znaczenia dla określonego fenotypu fenotypu i, bardziej ogólnie, do ukierunkowanej inaktywacji określonych genów, w liniach komórkowych i in vivo w wielu organizmach modelowych. Ten ostatni cel wydaje się prawdopodobnie zostanie znacznie wzmocniony przez niedawny rozwój białek Cas9 z gatunków bakterii, takich jak gatunków bakterii, takich jak Neisseria meningitidis i Staphyloccus aureus, które są wystarczająco małe, aby ulegać ekspresji przy użyciu wektorów adenoasocjacyjnych (AAV), które które można łatwo przygotować w bardzo wysokich mianach. Rozwijające się systemy edycji DNA oparte na Cas9 systemy wydają się zatem nie tylko wpływać na wirusologię, umożliwiając naukowcom naukowcom na badanie ludzkich genów, które wpływają na replikację patogennych ludzkich wirusów wszystkich typów, ale także na uzyskanie klonalnych ludzkich linii komórkowych, w których brakuje poszczególnych produktów genowych, które ułatwiają lub ograniczają replikację wirusów. Co więcej, wektory o wysokim mianie oparte na AAV oferują możliwość bezpośredniego ukierunkowane na wirusy DNA, które infekują określone miejsca w ludzkim ciele, takie jak wirus opryszczki pospolitej i wirus zapalenia wątroby typu B, z nadzieją, że cała populacja genomów DNA wirusa że cała populacja genomów wirusowego DNA może zostać zniszczona. Podsumowując, uważamy, że że ciągła, szybka ewolucja technologii CRISPR/Cas będzie miała wkrótce poważny, być może rewolucyjny, wpływ na dziedzinę wirusologii. --- Bakteryjny system CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) (CRISPR)-Cas9 do edycji genomu znacznie rozszerzył zestaw narzędzi dla genetyki ssaków. genetyki ssaków, umożliwiając szybkie generowanie izogenicznych linii komórkowych i myszy ze zmodyfikowanymi allelami. myszy ze zmodyfikowanymi allelami. Tutaj opisujemy metodę przesiewowego badania genetycznego z utratą funkcji podejście przesiewowe odpowiednie zarówno do selekcji pozytywnej, jak i negatywnej, które wykorzystuje Biblioteka lentiwirusowego jednoprzewodowego RNA (sgRNA) na skalę genomu. zostały stabilnie zintegrowane z genomem, co umożliwiło śledzenie złożonej puli mutantów za pomocą masowej na śledzenie złożonej puli mutantów poprzez masowe równoległe sekwencjonowanie. Użyliśmy biblioteki zawierającą 73 000 sgRNA do wygenerowania kolekcji nokautów i przeprowadziliśmy badania przesiewowe w dwóch ludzkich liniach komórkowych. Badanie pod kątem oporności na analog nukleotydu 6-tioguaninę zidentyfikował wszystkich oczekiwanych członków szlaku naprawy niedopasowania DNA podczas gdy inny dla trucizny topoizomerazy DNA II (TOP2A) etopozydu zidentyfikował TOP2A, zgodnie z oczekiwaniami, a także kinazę zależną od cykliny 6, CDK6. A selekcji negatywnej dla niezbędnych genów zidentyfikowano liczne zestawy genów odpowiadające fundamentalnym procesom. Na koniec pokazujemy, że skuteczność sgRNA jest z określonymi motywami sekwencji, umożliwiając przewidywanie bardziej skutecznych sgRNA. skutecznych sgRNA. Łącznie, wyniki te ustanawiają ekrany Cas9/sgRNA jako potężne narzędzie do systematycznej analizy genetycznej w komórkach ssaków. --- Zaprojektowane białka wiążące DNA, które manipulują ludzkim genomem i transkryptomem umożliwiły szybki postęp w badaniach biomedycznych. W szczególności, kierowany przez RNA system CRISPR/Cas9 został ostatnio zaprojektowany do tworzenia do tworzenia specyficznych dla miejsca dwuniciowych pęknięć w celu edycji genomu lub bezpośredniej regulacji transkrypcji. Unikalną zdolnością systemu CRISPR/Cas9 jest multipleksowa inżynieria genomu poprzez dostarczanie pojedynczego enzymu Cas9 i dwóch lub więcej RNA (sgRNA) ukierunkowanych na różne miejsca genomu. Podejście to może być wykorzystywane do jednoczesnego tworzenia wielu pęknięć DNA lub do kierowania wielu aktywatorów transkrypcyjnych do pojedynczego promotora w celu synergistycznego wzmocnienia indukcji genów. indukcji genów. Aby zaspokoić potrzebę jednolitego i trwałego dostarczania narzędzi inżynierii genomu opartych na CRISPR/Cas9, opracowaliśmy pojedynczy system system lentiwirusowy do ekspresji wariantu Cas9, genu reporterowego i do czterech sgRNA z niezależnych promotorów polimerazy RNA III, które są włączane do wektora wektora za pomocą wygodnej metody klonowania Golden Gate. Każdy sgRNA jest wydajnie ekspresji i może pośredniczyć w multipleksowej edycji genów i trwałej transkrypcji w unieśmiertelnionych i pierwotnych komórkach ludzkich. Ten system dostarczania będzie znaczący dla wykorzystania potencjału multipleksowej inżynierii genomu opartej na CRISPR/Cas9 w różnych typach komórek.
Czy jednoprzewodnikowe RNA było używane na ludzkich komórkach?
Tak, sgRNA był stosowany w ludzkich liniach komórkowych.