Rodzina deaminaz deoksycytydyny APOBEC3 funkcjonuje jako czynniki restrykcyjne gospodarza które mogą blokować replikację wirionów HIV-1 z niedoborem Vif (czynnika zakaźności wirusa) wirionów HIV-1 w różnym stopniu poprzez deaminację cytozyny do uracylu w jednoniciowym DNA (-)HIV-1. Po replikacji (-)DNA do (+)DNA, odwrotna transkryptaza odwrotna transkryptaza HIV-1 włącza adeniny naprzeciwko uracyli, tym samym indukując mutacje C/G→T/A, które mogą funkcjonalnie inaktywować HIV-1. Chociaż zarówno APOBEC3F i APOBEC3G ulegają ekspresji w typach komórek infekowanych przez HIV-1 i są przez Vif, nie przeprowadzono wcześniej analizy biochemicznej APOBEC3F, w przeciwieństwie do APOBEC3G. w przeciwieństwie do APOBEC3G. Wykorzystując syntetyczne substraty DNA, scharakteryzowaliśmy APOBEC3F i stwierdziliśmy, że podobnie jak APOBEC3G; jest to enzym procesywny i może deaminować deaminować co najmniej dwie cytozyny w pojedynczym kontakcie enzym-substrat. Jednak ruch skanujący APOBEC3F ruch skanujący różni się od APOBEC3G i polega raczej na skakaniu niż zarówno na skakaniu, jak i ślizganiu. Ruchy skokowe APOBEC3F również różniły się od APOBEC3G. Brak ruchu ślizgowego z APOBEC3F wynika z motywu ¹⁹⁰NPM¹⁹² ponieważ wstawienie tego motywu do APOBEC3G zmniejsza jego ruchy ślizgowe. ruchy. Mutant APOBEC3G NPM indukował znacznie mniej mutacji w porównaniu do w porównaniu do APOBEC3G typu dzikiego w modelowym teście replikacji HIV-1 in vitro i teście infekcyjności w pojedynczym cyklu, co wskazuje, że różnice w skanowaniu DNA były istotne dla restrykcji HIV-1. I odwrotnie, mutacja APOBEC3F ¹⁹¹Pro do ¹⁹¹Gly umożliwia ruchy ślizgowe APOBEC3F. Chociaż APOBEC3F ¹⁹⁰NGM¹⁹² mógł się ślizgać, enzym nie indukował więcej mutagenezy niż typ dziki APOBEC3F, wykazując, że unikalny mechanizm przeskakiwania APOBEC3F znosi wpływ poślizgu na mutagenezę. Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy kluczowe różnice w wpływie mutagenezy indukowanej przez APOBEC3F i APOBEC3G na HIV-1, które wspiera model, w którym zarówno procesywny mechanizm skanowania DNA, jak i preferowany motyw deaminacji (APOBEC3F, 5'TTC; APOBEC3G 5'CCC) wpływa na mutagenność i inaktywację genów. mutagenny i potencjał inaktywacji genów przez enzym APOBEC3. --- Deaminacja reszt cytydyny w wirusowym DNA jest głównym mechanizmem, za pomocą którego APOBEC3G (A3G) hamuje replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). (HIV-1). Przejście dC do dU po aktywności RNase-H prowadzi do degradacji wirusowego cDNA, produkcji niefunkcjonalnych białek, powstawania niepożądanych kodonów stop i zmniejszonej syntezy białek wirusowych. Tutaj że A3G zapewnia dodatkową warstwę obrony przed infekcją HIV-1 zależną od hamowania transkrypcji prowirusa. Transkrypcja HIV-1 jest regulowana przez element TAR (trans-activation response), krótką strukturę RNA typu łodyga-pętla krótką strukturę RNA wymaganą do wiązania czynników wydłużających. Komórki z niedoborem Vif Komórki zakażone HIV-1 gromadzą krótkie transkrypty wirusowe i produkują mniejszą transkryptów HIV-1 o pełnej długości z powodu deaminacji A3G elementu TAR podkreślając wymóg integralności pętli TAR w transkrypcji HIV-1. transkrypcji HIV-1. Ponadto wykazaliśmy, że wolne jednoniciowe DNA (ssDNA) nie są niezbędne dla aktywności A3G, a luka motywu CCC zablokowana przez DNA lub RNA na obu końcach lub na końcach 3'+5' jest wystarczająca do deaminacji A3G. Wyniki te identyfikują A3G jako wydajny mutator i że deaminacja (-)SSDNA powoduje wczesny blok transkrypcji HIV-1. --- Deaminaza cytydyny gospodarza, APOBEC3G (A3G), hamuje replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) poprzez wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) poprzez włączenie do wirionów w brak kodowanego wirusowo białka Vif (wiriony Deltavif), przynajmniej częściowo powodując hipermutację G do A. Aby uzyskać wgląd w funkcję antyretrowirusową funkcję A3G, określiliśmy ilości cząsteczek A3G, które są włączone do wirionów Deltavif. Połączyliśmy trzy podejścia eksperymentalne podejścia - wysokociśnieniową chromatografię cieczową w odwróconej fazie (HPLC), scyntylacyjny test bliskości (SPA) i ilościowe immunoblotting - w celu określenie stosunku molowego A3G do białka kapsydu HIV-1 w wirionach Deltavif. Nasze badania wykazały, że ilość A3G włączonego do wirionów Deltavif do wirionów Deltavif była proporcjonalna do poziomu jego ekspresji w komórkach produkujących wirusy. komórki, a stosunek A3G do Gag w wirionach Deltavif wytwarzanych z aktywowanych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) wynosił około 1:439. Na podstawie wcześniejszych szacunków stechiometrii HIV-1 Gag w wirionach (1400-5000), doszliśmy do wniosku, że około 7 (+/-4) cząsteczek A3G jest do wirionów Deltavif wytwarzanych z ludzkich PBMC. Wyniki te wskazują, że włączenie do wirionu tylko kilku cząsteczek A3G jest wystarczające do zahamowania replikacji HIV-1. --- Białko Vif ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) promuje replikację wirusa poprzez replikację wirusa poprzez obniżenie poziomu kodowanych przez komórki, antywirusowych białek APOBEC3. Białka te wywierają swoje działanie supresyjne poprzez hamowanie odwrotnej transkrypcji wirusa, jak również indukcję odwrotnej transkrypcji, a także indukcję deaminacji cytydyny w obrębie powstającego wirusowego cDNA. Co ważne, te dwa efekty nie zostały szczegółowo scharakteryzowane szczegółowo w ludzkich komórkach T CD4 (+), co prowadzi do kontrowersji dotyczących ich możliwego wkład w hamowanie wirusa w naturalnych celach komórkowych replikacji HIV-1 replikacji. Tutaj używamy wirusów typu dzikiego i wirusów z niedoborem Vif pochodzących z komórek T CD4(+) T wielu dawców, aby zbadać konsekwencje funkcji białka APOBEC3 na naturalnych poziomach ekspresji. Wykazaliśmy, że białka APOBEC3 powodują głęboki niedobór odwrotnej transkrypcji od początkowych etapów syntezy cDNA, a także cDNA, a także nadmierną deaminację cytydyny (hipermutację) syntetyzowanego DNA. DNA, które są syntetyzowane. Eksperymenty z wykorzystaniem wirusów z transfekowanych komórek i do mapowania końców 3' cDNA wskazują, że hamowanie odwrotnej transkrypcji nie ogranicza się do odwrotnej transkrypcji nie jest ograniczone do kilku określonych miejsc, argumentując, że białka APOBEC3 zaburzają procesywność enzymatyczną. Szczegółowe analizy widm mutacji w wirusowym cDNA silnie sugerują, że jedno konkretne białko APOBEC3, APOBEC3G, zapewnia większość fenotypu przeciwwirusowego w komórkach T CD4(+), z efekty APOBEC3F i APOBEC3D są mniej znaczące. Podsumowując wnioskujemy, że podwójne mechanizmy działania białek APOBEC3 łączą się, aby skuteczniej ograniczają rozprzestrzenianie się wirusa HIV-1 niż każda z tych funkcji sama.
Jaki jest mechanizm działania deaminazy cytydyny APOBEC3G w hamowaniu replikacji wirusa HIV-1?
Podczas odwrotnej transkrypcji APOBEC3G deaminuje dC do dU w powstającym wirusowym DNA o nici ujemnej, powodując hipermutację G do A w DNA o nici dodatniej w celu zahamowania replikacji HIV-1, z powodu degradacji wirusowego cDNA, produkcji niefunkcjonalnych białek, tworzenia niepożądanych kodonów stop i zmniejszonej syntezy białek wirusowych. W dodatkowej linii obrony przeciwwirusowej, APOBEC3G indukuje deaminację wierzchołkowej pętli cytydyny elementu odpowiedzi na transaktywację (TAR), krótkiej struktury RNA z pętlą macierzystą wymaganej do wiązania czynników elongacyjnych podczas wydłużania transkrypcji HIV-1, co skutkuje akumulacją krótkich transkryptów wirusowych i produkcją mniejszych ilości transkryptów HIV-1 o pełnej długości w komórkach zakażonych HIV-1 z niedoborem Vif.