Opisaliśmy zastosowanie prostego podejścia do znakowania biotynylacją w celu bezpośredniego oczyszczania znakowanych kompleksów czynników transkrypcyjnych, w oparciu o użyciu sztucznych krótkich znaczników peptydowych, które są specyficznie i wydajnie biotynylowane przez bakteryjną ligazę biotynową BirA, która jest współeksprymowana w komórkach z oznaczonym czynnikiem. Wykorzystaliśmy to podejście do wstępnego scharakteryzowania kompleksy utworzone przez hematopoetyczny czynnik transkrypcyjny GATA-1 w komórkach erytroidalnych. komórkach erytroidalnych. GATA-1 jest niezbędny do różnicowania erytroidalnego, a jego funkcje obejmujące regulację w górę genów erytroidalnych, represję alternatywnych programów programów transkrypcyjnych i hamowanie proliferacji komórek. Jednakże, nie było nie było jasne, w jaki sposób wszystkie te funkcje GATA-1 są mediowane. Nasza praca opisuje, po raz pierwszy, różne interakcje GATA-1 z istotnym czynnikiem hematopoetycznym czynnikiem hematopoetycznym Gfi-1b, represyjnym kompleksem MeCP1 i chromatyną remodelującym kompleksem ACF/WCRF, oprócz znanych kompleksów GATA-1/FOG-1 i GATA-1/TAL-1. Dostarczamy również dowodów na to, że różne kompleksy GATA-1 są związane z określonymi funkcjami GATA-1 w różnicowaniu erytroidalnym, na przykład na przykład GATA-1/Gfi-1b z tłumieniem proliferacji komórek i GATA-1/FOG-1/MeCP1 z tłumieniem innych hematopoetycznych programów transkrypcyjnych programów transkrypcyjnych. Następnie zastosowaliśmy znacznik biotynylacji do Ldb-1, znanego partnera GATA-1 i scharakteryzowaliśmy szereg nowych partnerów interakcji, którzy są istotne w rozwoju erytroidalnym, w szczególności Eto-2, Lmo4 i CdK9. Na koniec, jesteśmy w trakcie stosowania tej samej technologii do scharakteryzowania czynników czynników, które są związane z tłumionym promotorem gamma-globiny in vivo. --- TŁO: Testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) połączone z macierzami genomowymi (Chip-on-chip) lub masowym sekwencjonowaniem równoległym (ChIP-seq) prowadzą do identyfikacji genomowych identyfikacji miejsc wiązania białek związanych z chromatyną. Jednakże wysoce zmienna jakość przeciwciał i dostępność epitopów w chromatynie usieciowanej usieciowanej chromatynie może negatywnie wpływać na wyniki genomowego ChIP. Znaczniki epitopowe są były często używane jako bardziej niezawodne alternatywy. Ponadto zastosowaliśmy znakowanie biotynylacją białek in vivo jako alternatywę o bardzo wysokim powinowactwie do przeciwciał. przeciwciał. W tym artykule opisujemy optymalizację znakowania biotynylacją dla ChIP i jego sprzężenie ze znanym znacznikiem epitopowym w celu zapewnienia niezawodnej i niezawodną i wydajną alternatywę dla przeciwciał. WYNIKI: Na przykładzie znakowanego biotyną czynnika transkrypcyjnego erytroidalnego GATA-1 opisujemy kilka etapów optymalizacji dla zastosowania streptawiny biotynowej o wysokim powinowactwie. powinowactwa biotyny do streptawidyny w ChIP. Stwierdzamy, że pominięcie SDS podczas sonikacji, zastosowanie żelatyny ze skóry ryb jako środka blokującego i wybór kulek perełek streptawidyny może prowadzić do znacznie lepszego wzbogacenia ChIP i niższego tła w porównaniu do przeciwciał. Pokazujemy również, że znacznik epitopowy V5 działa równie dobrze w warunkach równie dobrze w warunkach opracowanych dla ChIP ze streptawidyną i że może mniej cierpieć z powodu skutków sieciowania formaldehydem. WNIOSEK: Połączone zastosowanie znacznika biotynowego o bardzo wysokim powinowactwie z mniej wrażliwym na sieciowanie znacznikiem V5 zapewnia elastyczną platformę ChIP z potencjalne implikacje w wynikach sekwencjonowania ChIP. --- GATA-1 jest niezbędny do tworzenia linii erytroidalnej, megakariocytarnej, eozynofilowych i komórek tucznych. Działa jako aktywator i represor różnych genów docelowych, np. różnych genów docelowych, na przykład w komórkach erytroidalnych hamuje proliferację komórek proliferację komórek i wczesne geny hematopoetyczne, jednocześnie aktywując geny erytroidalne, jednak nie jest jasne, w jaki sposób pośredniczą obie te funkcje. Używając znakowanie biotynylacji / podejście proteomiczne w komórkach erytroidalnych, opisujemy różne interakcje GATA-1 z niezbędnym czynnikiem hematopoetycznym Gfi-1b, kompleksem represyjnym kompleksem MeCP1 i remodelującym chromatynę kompleksem ACF/WCRF, oprócz oprócz znanych kompleksów GATA-1/FOG-1 i GATA-1/TAL-1. Co ważne, my pokazujemy, że FOG-1 pośredniczy w interakcjach GATA-1 z kompleksem MeCP1, tym samym zapewniając wyjaśnienie nakładających się funkcji tych dwóch czynników w erytropoezie. erytropoezie. Pokazujemy również, że podzbiory docelowych genów GATA-1 są wiązane in vivo przez różne kompleksy, łącząc w ten sposób specyficznych partnerów GATA-1 z różnymi aspektami jego funkcji. Opierając się na tych odkryciach, sugerujemy model dla różnych ról GATA-1 w różnicowaniu erytroidalnym.
Lista partnerów interakcji GATA-1 odkrytych za pomocą metody znakowania biotyną.
Nasza praca po raz pierwszy opisuje różne interakcje GATA-1 z niezbędnym czynnikiem hematopoetycznym Gfi-1b, represyjnym kompleksem MeCP1 i kompleksem remodelującym chromatynę ACF/WCRF, oprócz znanych kompleksów GATA-1/FOG-1 i GATA-1/TAL-1