RanGTP pośredniczy w imporcie jądrowym i montażu wrzeciona mitotycznego poprzez dysocjację receptorów receptorów importu z białek niosących sygnał lokalizacji jądrowej (NLS). My zbadaliśmy wzajemne oddziaływanie między receptorami importu a transbłonową nukleoporyną nukleoporyną Pom121. Stwierdziliśmy, że Pom121 oddziałuje z importyną alfa/beta i grupą nukleoporyn w sposób zależny od NLS. In vivo, zastąpienie Pom121 zmutowaną wersją NLS skutkowało wadliwym transportem jądrowym, indukcję nieprawidłowych stosów błon cytoplazmatycznych i zmniejszoną żywotność komórek. Proponujemy, aby miejsca NLS Pom121 wpływały na jego funkcję w montażu NPC zarówno poprzez wpływ na interakcje nukleoporyn i strukturę błony porów. --- POM121 i gp210 były do tego momentu jedynymi znanymi nukleoporynami integralnymi z błoną. nukleoporyny (Nups) kręgowców, a tym samym jedynymi kandydatami na kotwice dla kompleksów porów jądrowych (NPC) w błonie jądrowej. W towarzyszącym badanie (Stavru i in.), dostarczyliśmy dowodów na to, że NPC mogą istnieć niezależnie od POM121 i gp210, i przewidzieliśmy, że NPC kręgowców zawierają dodatkowe składniki integralne z błoną. Zidentyfikowaliśmy takie dodatkowe białko błonowe w NPC ssaków, żab, owadów i nicieni jako ortolog drożdży Ndc1p/Cut11p. Ludzkie NDC1 (hNDC1) prawdopodobnie posiada sześć segmentów transbłonowych, i znajduje się na ścianie porów jądrowych. Pozbawienie hNDC1 ludzkich komórek HeLa z ludzkich komórek HeLa zakłóca gromadzenie się fenyloalaninowo-glicynowego powtórzenia Nups w NPC. Utrata funkcji NDC1 u Caenorhabditis elegans również powoduje poważne wady NPC oraz bardzo wysoką śmiertelność larw i zarodków. Nie jest to jednak ostatecznie śmiertelna. Zamiast tego, homozygotyczne robaki z niedoborem NDC1 mogą być rozmnażane. Wskazuje to, że żaden z integralnych błonowo Nups nie jest powszechnie niezbędny do montażu NPC i sugeruje, że biogeneza NPC jest niezwykle procesem odpornym na błędy. --- Jak dotąd, POM121 i gp210 są jedynymi znanymi miejscami kotwiczenia kręgowców kompleksów porów jądrowych (NPC) w dwuwarstwie lipidowej otoczki jądrowej (NE), a zatem są doskonałymi kandydatami do inicjowania procesu montażu NPC NPC. Rzeczywiście, wykazujemy, że POM121 może rekrutować kilka nukleoporyn, takich jak Nup62 lub Nup358, do ektopowych miejsc montażu. Wydaje się zatem działać jako miejsce zarodkowania dla montażu podstruktur NPC. Niemniej jednak zaobserwowaliśmy funkcjonalne NPC i nienaruszone NE w komórkach poważnie pozbawionych POM121. Podwójne knockdown gp210 i POM121 w komórkach HeLa, a także zubożenie POM121 z ludzkich fibroblastów, które nie wykazują ekspresji gp210, dodatkowo sugerują, że NPCs mogą gromadzić się lub przynajmniej utrzymywać w formie wolnej od POM121 i gp210. To wskazuje na rozległe redundancje w interakcjach białko-białko w obrębie NPC i sugeruje, że NPC kręgowców zawierają dodatkowe nukleoporyny integralne z błoną do zakotwiczenia w dwuwarstwie lipidowej NE. W pracy Stavru i wsp. opisaliśmy taką dodatkową nukleoporynę transmembranową jako ortolog drożdży metazoicznych Ndc1p. --- Błonowa glikoproteina gp210 jest głównym składnikiem jądrowego kompleksu porów. kompleksu porów jądrowych. Ta nukleoporyna zawiera dużą cysternalną domenę N-końcową, krótki C-końcowy ogon cytoplazmatyczny i pojedynczy segment transbłonowy. krótki C-końcowy ogon cytoplazmatyczny i pojedynczy segment transbłonowy. Pokazujemy tutaj, że dimery natywnego gp210 można izolować z ekstraktów komórkowych przez immunoprecypitację oraz z oczyszczonych otoczek jądrowych wątroby szczura przez prędkość sedymentacji i filtracji żelowej. Sieciowanie białek w izolowanych błonach przed solubilizacją dramatycznie zwiększa udział dimerów. Dimery są odporne na SDS, jak wcześniej zaobserwowano dla niektórych integralnych białek błonowych cis-GG. integralnych białek błonowych cis-Golgi i białek błon plazmatycznych, w tym glikoforyny A. Większe oligomery gp210 można również uzyskać przez filtrację żelową i elektroforezę denaturującą. i elektroforezę denaturującą, ale w przeciwieństwie do dimerów są dysocjowane przez redukcję i ogrzewanie w obecności SDS. Proponujemy, aby gp210 był zorganizowany w błonie porów jako duża tablica dimerów gp210, które mogą stanowić luminalny podbłonowy szkielet białkowy. --- Kompleks porów jądrowych (NPC) jest dużym kanałem, który obejmuje dwie dwuwarstwy lipidowe dwuwarstwową otoczkę jądrową i pośredniczy w transporcie między cytoplazmą a jądrem. cytoplazmą a jądrem. Tylko kilka składników NPC to białka transmembranowe, a rola tych białek w funkcjonowaniu i montażu NPC pozostaje słabo poznana. słabo poznana. Badamy funkcję trzech integralnych nukleoporyn błonowych nukleoporyn, którymi są Ndc1p, Pom152p i Pom34p, w montażu i transporcie NPC w Saccharomyces cereves. transportu w Saccharomyces cerevisiae. Odkryliśmy, że Ndc1p jest ważna dla prawidłowej lokalizacji ładunków transportu jądrowego i składników NPC. Jednak rola Ndc1p w montażu NPC jest częściowo redundantna z Pom152p, ponieważ komórki pozbawione obu tych białek wykazują zwiększone zaburzenia NPC. Badania badania mikroskopowe ujawniają, że brak Ndc1p i Pom152p skutkuje nieprawidłowe pory, które mają powiększone średnice i nie zawierają materiału białkowego, co prowadzi do zwiększonej dyfuzji między cytoplazmą a jądrem. --- Kompleksy porów jądrowych (NPC) są dużymi białkowymi kanałami osadzonymi w otoczce jądrowej (NE). otoczce jądrowej (NE), przez które zachodzi wymiana cząsteczek między jądrem i cytozolem. Biogeneza NPC jest złożona i słabo poznana. W szczególności W szczególności prawie nic nie wiadomo o tym, jak NPC są zakotwiczone w NE. Tutaj, scharakteryzowaliśmy NDC1 kręgowców - transbłonową nukleoporynę konserwowaną między drożdżami i metazoanami. drożdżami i metazoanami. Pokazujemy za pomocą interferencji RNA (RNAi) i biochemicznego że NDC1 odgrywa ważną rolę w montażu NPC i NE in vivo i in vitro. Eksperymenty RNAi sugerują funkcjonalny związek między NDC1 a rozpuszczalnymi nukleoporynami Nup93, Nup53 i Nup205. Co ważne, NDC1 współdziała z Nup53 in vitro. Sugeruje to, że funkcja NDC1 obejmuje tworzenie połączenia między błoną NE i rozpuszczalnymi nukleoporynami, zakotwiczając w ten sposób NPC w błonie. błonie. --- Kompleks porów jądrowych jest dominującą strukturą w otoczce jądrowej która obejmuje podwójne błony jądrowe wszystkich eukariontów. Drożdże mają jedną dodatkową organellę, która jest również osadzona w otoczce jądrowej: wrzeciono które funkcjonuje jako centrum organizacyjne mikrotubul. Jedyne białko białko, o którym wiadomo, że lokalizuje się i jest ważne w montażu obu tych struktur drożdży struktur drożdży jest integralne białko błonowe, Ndc1p. Jednakże, żaden homolog Ndc1p nie został jednak scharakteryzowany u metazoa. Tutaj identyfikujemy i analizujemy homologi NDC1 które są konserwowane przez całą ewolucję. Pokazujemy, że ogólna topologia topologia tych homologów jest zachowana. Każdy z nich zawiera sześć segmentów segmentów w swojej N-końcowej połowie i ma dużą rozpuszczalną C-końcową połowę około 300 aminokwasów. Analiza rozkładu ładunku wskazuje, że N- i C-końce są wystawione na działanie cytoplazmy. Ograniczona proteoliza drożdżowego Ndc1p w błonach komórkowych potwierdza orientację jego C-końca. Chociaż nie wiadomo nie wiadomo, czy białko NDC1 kręgowców lokalizuje się w porach jądrowych, tak jak jego drożdżowy odpowiednik. drożdżowy odpowiednik, ludzki homolog zawiera trzy powtórzenia FG w C-końcu, co jest cechą wielu białek porów jądrowych. Co więcej, mały region zawierający mutacje, które wpływają na montaż porów jądrowych u drożdży, jest wysoce konserwowany przez całą ewolucję. Wreszcie, zebraliśmy dane z innego badania badania, aby wykazać, że ludzki homolog NDC1 jest znanym wewnętrznym białkiem błony jądrowej, NET3. białko wewnętrznej błony jądrowej, NET3. --- Kompleks porów jądrowych (NPC) ułatwia transport nukleocytoplazmatyczny, kluczowy proces kluczowy proces dla różnych aktywności komórkowych. NPC składa się z ~30 nukleoporyn i jest dobrze scharakteryzowany u kręgowców i drożdży. Jednak tylko jednak tylko osiem nukleoporyn roślinnych zostało zidentyfikowanych, a niewiele informacji jest dostępnych na temat pełnej struktury molekularnej roślinnych NPC. W tym badaniu, zastosowano interaktywne podejście proteomiczne do identyfikacji nukleoporyn Arabidopsis thaliana nukleoporyn Arabidopsis thaliana. Seria pięciu cykli interaktywnej analizy proteomicznej została przeprowadzono przy użyciu nukleoporyn znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Zidentyfikowane nukleoporyny zidentyfikowane nukleoporyny zostały następnie sklonowane i przeprowadzono analizy lokalizacji subkomórkowej lokalizacji subkomórkowej. Stwierdziliśmy, że roślinny NPC zawiera co najmniej 30 nukleoporyn, z których 22 nie zostały wcześniej przypisane. Co zaskakujące, roślinne nukleoporyny miały podobną organizację domenową do nukleoporyn kręgowców (człowieka) i drożdży (Saccharomyces cerevisiae). Co więcej, roślinne nukleoporyny wykazywały wyższą homologię sekwencji do nukleoporyn kręgowców niż do nukleoporyn drożdży. nukleoporyn drożdży. Roślinnym NPC brakowało siedmiu składników (NUCLEOPORIN358 [Nup358], Nup188, Nup153, Nup45, Nup37, NUCLEAR DIVISION CYCLE1 i PORE MEMBRANE PROTEIN 121 kD), które były obecne w NPC kręgowców. Jednak rośliny posiadały nukleoporynę, Nup136/Nup1, która zawierała powtórzenia Phe-Gly, a analiza sekwencji nie zidentyfikowała homologa tego białka u kręgowców. Co ciekawe, Nup136-GFP wykazywał większą mobilność na otoczce jądrowej niż inne nukleoporyny. nukleoporyny, a niedobór Nup136/Nup1 powodował różne defekty w rozwoju roślin. rozwoju roślin. Odkrycia te dostarczają cennych nowych informacji na temat struktury i funkcji NPC roślin. struktury i funkcji. --- TŁO: Glikoproteina 210 (GP210) jest transmembranowym składnikiem jądrowego kompleksu porów metazoanów. kompleksu porów jądrowych metazoanów, z krótkim karboksyterminusem wystającym w kierunku cytoplazmy. Jego funkcja jest nieznana, ale jest uważany za główny strukturalny składnik porów jądrowych metazoan. Jednak nasze poprzednie odkrycia wykazały wyraźne różnice w poziomach ekspresji w embrionalnych tkankach myszy i liniach komórkowych. Aby zidentyfikować czynniki regulujące GP210, przeanalizowano organizację genomową organizacja ludzkiego GP210 została przeanalizowana in silico. WYNIKI: Ludzki gen został zmapowany do chromosomu 3 i składa się z 40 eksonów rozłożonych na 102 kb. Wydedukowany 1887 aminokwas wykazał wysoki stopień homologii do wcześniej opisanych ortologów. Eksperymentalnie zdefiniowaliśmy dwa miejsca inicjacji transkrypcji, 18 i 29 bp przed kodonem startowym ATG. ATG. Region promotora charakteryzuje się wyspą CpG i kilkoma motywów wiążących czynniki transkrypcyjne regulujące geny, w tym skupione miejsca związane ze Sp1 i białkiem palca cynkowego genu supresorowego nowotworu Wilmsa białko palca cynkowego (WT1). Ponadto, dystalnie do początku translacji znaleźliśmy sekwencję powtarzalną (GT)n, element znany ze swojej zdolności do wiązania WT1. Homologi tych motywów można było zidentyfikować w odpowiednim regionie genomu myszy. regionie genomu myszy. Jednakże, eksperymentalna indukcja WT1 zależna od tetracykliny w SAOS nie miała wpływu na transkrypcję GP210. WNIOSEK: Chociaż mysi GP210 został zidentyfikowany jako gen wczesnej odpowiedzi podczas indukowanego rozwoju nerki metanefrycznej, a miejsca wiązania WT1 zostały zidentyfikowane w regionie promotora region promotora ludzkiego genu GP210, eksperymentalna modulacja ekspresji WT1 nie miała wpływu na ekspresję GP210. Dlatego WT1 prawdopodobnie nie jest reguluje ekspresję GP210. Zamiast tego sugerujemy, że zidentyfikowane miejsca wiązania Sp są zaangażowane. --- Pacjenci z pierwotną marskością żółciową wątroby (PBC) często mają autoprzeciwciała przeciwko 210-kD integralnej glikoproteinie błony porów otoczki jądrowej. Białko to, określane jako gp210, ma 1,783-aminokwasową domenę aminokwasową zlokalizowaną w przestrzeni okołojądrowej, 20-aminokwasowy segment transbłonowy i 58-amino cytoplazmatyczny karboksy-końcowy ogon. Obecnie wykazaliśmy, że autoprzeciwciała od 25 pacjentów z PBC, które rozpoznają gp210, reagują z cytoplazmatycznym cytoplazmatycznym karboksy-końcowym ogonem, podczas gdy żadne nie reagują z niezmodyfikowanymi epitopami liniowymi w domenie domenie amino-końcowej. Epitop(y) rozpoznawany(e) przez autoprzeciwciała od wszystkich 25 pacjentów pacjentów jest zawarty w odcinku 15 aminokwasów. Rozpoznawana sekwencja aminokwasów sekwencja aminokwasowa jest homologiczna do produktów białkowych genu mutY Escherichia coli i Salmonella typhaloma. i genu mutB Salmonella typhimurium z dokładną identycznością sześciu kolejnych aminokwasów. kolejnych aminokwasów, co sugeruje, że przeciwciała anty-gp210 mogą powstawać przez molekularną mimikrę bakteryjnych determinantów antygenowych. --- Rezydentne integralne białka wewnętrznej błony jądrowej (INM) są syntetyzowane jako białka zintegrowane z błoną na obwodowym retikulum endoplazmatycznym (ER) i są transportowane do INM przez całą interfazę przy użyciu nieznanego mechanizmu transportu nieznanego mechanizmu transportu. Aby zbadać ten transport, opracowaliśmy test na żywych komórkach, który mierzy ruch reporterów transmembranowych z ER do INM przez uwięzienie w blaszce jądrowej za pośrednictwem rapamycyny. Konstrukty reporterowe z z małymi (<30 kD) domenami cytozolowymi i lumenalnymi szybko gromadziły się w INM. Jednak zwiększenie rozmiaru którejkolwiek z domen o 47 kD silnie hamowało ruch ruch. Obniżona temperatura i niedobór ATP również hamowały ruch, który co jest charakterystyczne dla mechanizmów fuzji błonowej, ale farmakologiczne hamowanie transportu pęcherzykowego nie miało wpływu. Ponieważ akumulacja reportera w INM była hamowana przez przeciwciała przeciwko białku błony porów jądrowych gp210, nasze wyniki wyniki wspierają model, w którym transport białek integralnych do INM obejmuje dyfuzję boczną w dwuwarstwie lipidowej wokół porów jądrowych w połączeniu z aktywną restrukturyzacją kompleksu porów jądrowych. --- Otoczka jądrowa zawiera >100 białek transmembranowych, które nieustannie wymieniają się z retikulum endoplazmatycznym i poruszają się w obrębie błon jądrowych. Aby lepiej zrozumieć organizację i dynamikę tego systemu, porównaliśmy przemieszczanie się 15 integralnych białek otoczki jądrowej przy użyciu FRAP. A zaobserwowano zaskakujący 30-krotny zakres ruchliwości. Dynamiczne zachowanie kilku z tych białek zostało również przeanalizowane po wyczerpaniu ATP i/lub Ran, dwóch funkcji zaangażowanych w retikulum endoplazmatyczne - wewnętrzną błonę jądrową wewnętrznej błony jądrowej. Ujawniło to, że mechanizmy translokacji zależne od ATP i Ran są różne i nie są wykorzystywane przez wszystkie białka wewnętrznej błony jądrowej. Mechanizm Mechanizm zależny od Ran wymaga nukleoporyny fenyloalanina-glicyna (FG) Nup35, co jest zgodne z wykorzystaniem peryferyjnych kanałów kompleksu porów jądrowych kanałów. Co ciekawe, dodanie FG do białek błonowych zmniejsza czas regeneracji FRAP i zależy to również od Nup35. Modelowanie trzech białek, które na które nie miało wpływu ani zubożenie ATP, ani Ran wskazuje, że szeroki zakres w ruchliwości można wyjaśnić różnicami w powinowactwie wiązania w wewnętrznej błonie jądrowej. błonie jądrowej. --- U pacjentów z pierwotną żółciową marskością wątroby często rozwijają się autoprzeciwciała skierowane przeciwko gp210, głównej glikoproteinie kompleksu porów jądrowych. To zawiera dużą glikozylowaną domenę cysternalną, pojedynczy segment transbłonowy i krótki segment cytoplazmatyczny. segment i krótki ogon cytoplazmatyczny. Wcześniej wykazano, że autoprzeciwciała od pacjentów z pierwotną marskością żółciową reagują wyłącznie z cytoplazmatycznym ogonem. ogonem cytoplazmatycznym. Wykazujemy, że autoprzeciwciała przeciwko gp210 rozpoznają co najmniej dwa różne epitopy. co najmniej dwa różne epitopy. 4 z 12 pozytywnych surowic anty-gp210 zareagowało z fragmentem składającym się z ogona cytoplazmatycznego, a 8 surowic celowało w nowy epitop nowy epitop zlokalizowany w dużej glikozylowanej domenie lumenalnej. Ponadto, nasze dane dowodzą, że ugrupowania węglowodanowe są istotną częścią tego nowego epitopu. epitopu. Proponujemy zatem, aby przyszłe testy przesiewowe były wykonywane z antygenami posiadającymi oba epitopy w celu wykrycia wszystkich surowic o swoistości anty-gp210. specyficzność. --- Przetestowaliśmy hipotezę, że gp210, integralne białko błony jądrowej kompleksów porów jądrowych (NPC), pośredniczy w tworzeniu porów jądrowych. Gp210 ma dużą domenę lumenalną i mały końcowy ogon COOH wystawiony na działanie cytoplazmy. Badaliśmy odsłonięty ogon. Dodaliśmy rekombinowane polipeptydy ogona do ekstraktów jądrowych Xenopus lub zahamowaliśmy endogenne ogony gp210 za pomocą przeciwciał anty-ogonowych przeciwciał. Obie strategie nie miały wpływu na tworzenie spłaszczonych spłaszczonych błon jądrowych, ale blokowały montaż NPC i wzrost jądra. Zahamowane jądra gromadziły gp210 i niektóre nukleoporyny p62, ale nie przyłączały nup214/CAN, nup153 lub nup98 i były wadliwe pod względem importu jądrowego laminu B3. Skanowanie i transmisja EM ujawniły brak "ściśle przylegających" wewnętrznych i błon wewnętrznych i zewnętrznych oraz nagromadzenie nowych zatrzymanych struktur, w tym "mini-porów". Wnioskujemy, że gp210 odgrywa wczesną rolę w tworzeniu porów jądrowych, i że w rozszerzaniu porów pośredniczy gp210 i jego partner(zy) wiążący(i) ogon. My proponujemy, aby fuzja błon i rozszerzanie porów były sprzężone, działając jako mechanizm mechanizm kontrolujący wielkość porów jądrowych. --- RNA podlegający eksportowi jądrowemu najpierw napotyka koszyk porów jądrowych. Dwa białka koszyka, Nup98 i Nup153, są niezbędne do eksportu mRNA, ale ich molekularni partnerzy w porach molekularni partnerzy w obrębie porów są w dużej mierze nieznani. Ponieważ mechanizm RNA będzie kwestionowany tak długo, jak długo znaczące białka porów kręgowców pozostaną nieodkryte, postanowiliśmy znaleźć ich partnerów. Fragmenty Nup98 i Nup153 zostały wykorzystane do eksperymentów pulldown z ekstraktów jaj Xenopus, które zawierają obfite zdemontowane pory jądrowe. Co uderzające, Nup98 i Nup153 wiązały te same cztery duże białka. wiązały te same cztery duże białka. Oczyszczanie i analiza sekwencji ujawniły że dwa są znanymi nukleoporynami kręgowców, Nup96 i Nup107, podczas gdy dwa zmapowane do ORF o nieznanej funkcji. Geny kodujące nowe białka zostały sklonowano i wyprodukowano przeciwciała. Immunofluorescencja ujawniła, że są to nowe nukleoporyny, oznaczone jako Nup160 i Nup133, które są dostępne po stronie koszyka. stronie porów. Nukleoporyny Nup160, Nup133, Nup107 i Nup96 istnieją jako kompleks w ekstraktach z jaj Xenopus i w zmontowanych porach, obecnie określanych jako kompleks Nup160 kompleks. Sec13 jest widoczny w pulldowns Nup98 i Nup153 i okazuje się, że jest to członkiem kompleksu Nup160. Zmapowaliśmy miejsca, które są wymagane do wiązania subkompleksu Nup160 i odkryliśmy, że w Nup98 miejsce wiązania jest używane do wiązania Nup98 do jądra; w Nup153 miejsce wiązania kieruje Nup153 do porów jądrowych. Dzięki transfekcji i testom transportu in vivo stwierdziliśmy, że że specyficzne fragmenty Nup160 i Nup133 blokują eksport poli[A]+ RNA, ale nie import lub eksport białek. Wyniki te pokazują, że dwie nowe nukleoporyny kręgowców nukleoporyny kręgowców, Nup160 i Nup133, nie tylko oddziałują z Nup98 i Nup153, ale odgrywają rolę w eksporcie mRNA. --- Biogeneza jądrowych kompleksów porowych (NPC) stanowi paradygmat dla montażu struktur makromolekularnych o wysokiej złożoności. Jak dotąd, tylko trzy integralne białka błonowe porów działają redundantnie w NPC zakotwiczonych w otoczce jądrowej. Tutaj opisujemy identyfikację i funkcjonalną charakterystykę Pom33, nowego białka transmembranowego dynamicznie związane z NPC pączkujących drożdży. Pom33 staje się krytyczne dla żywotności drożdży w przypadku braku funkcjonalnego kompleksu Nup84 lub sieci interakcji Ndc1, które są dwoma podstawowymi subkompleksami NPC i wiąże się z retikulonem Rtn1. Ponadto, Utrata funkcji POM33 upośledza dystrybucję NPC, odczyt dla podzbioru genów wymaganych do biogenezy porów, w tym członków kompleksu Nup84 i RTN1. Konsekwentnie pokazujemy, że Pom33 jest wymagany dla normalnej gęstości NPC w jądrze potomnym i dla prawidłowej biogenezy porów. jądrze potomnym oraz do prawidłowej biogenezy i / lub stabilności NPC pod nieobecność Nup170. Stawiamy hipotezę, że poprzez modyfikację lub stabilizację interfejsu otoczka jądrowa NPC, Pom33 może przyczyniać się do prawidłowej dystrybucji i/lub wydajnego montażu porów jądrowych. --- gp210 jest głównym składnikiem kompleksu porów jądrowych (NPC) z możliwymi role strukturalne i regulacyjne. Wchodzi w interakcje ze składnikami NPC poprzez swoją C-końcową domenę (CTD), która podąża za domeną transmembranową i masywnym ( około 200 kDa) region N-końcowy, który znajduje się w świetle przestrzeni okołojądrowej przestrzeni okołojądrowej. Tutaj przedstawiamy strukturę roztworu CTD ludzkiego gp210 określoną za pomocą różnych technik spektroskopowych. W wodzie CTD przyjmuje rozszerzoną, w dużej mierze nieuporządkowaną konformację, która zawiera znaczną ilość lewoskrętnej struktury helikalnej poliproliny typu II (PII). Konformacja CTD jest zmieniana przez wysokie pH, naładowane detergenty i odczynnik promujący wiązania wodorowe odczynnik trifluoroetanol (TFE), które zmniejszają frakcję PII fragmentu. TFE indukuje również zmianę konformacyjną w regionie zawierającym motyw SPXX którego seryna ulega specyficznej fosforylacji podczas mitozy. Proponujemy, aby elementy PII w CTD mogą odgrywać rolę w jego interakcji z NPC i mogą służyć jako miejsca rozpoznawania białek regulatorowych zawierających WW lub inne, nieznane motywy wiążące motywy wiążące PII. --- Kompleksy porów jądrowych (NPC) łączą dwie błony otoczki jądrowej (NE) w pory (NE) do porów, łącząc cytoplazmę i nukleoplazmę oraz umożliwiając wymianę makrocząsteczek między tymi przedziałami. makrocząsteczek między tymi przedziałami. Większość białek NPC nie zawiera integralnych domen błonowych, a zatem w dużej mierze nie jest jasne, w jaki sposób NPC są osadzone i zakotwiczone w NE. i zakotwiczone w NE. Tutaj pokazujemy, że ewolucyjnie konserwowane jądrowe białko porów białko porów jądrowych Nup53 wiąże się niezależnie od innych białek z błonami, co jest właściwość, która jest kluczowa dla montażu NPC i zachowana między drożdżami i kręgowców. Białko kręgowców zawiera dwa miejsca wiążące błonę, z których z których domena C-końcowa ma zdolność odkształcania błony i jest jest szczególnie wymagane do montażu NPC de novo i wstawienia do nienaruszonego NE podczas interfazy. Dimeryzacja Nup53 przyczynia się do jego interakcji z błoną i ma kluczowe znaczenie dla jego funkcji w montażu NPC. --- NDC1 jest nukleoporyną transmembranową, która jest wymagana do montażu NPC i transportu transportu nukleocytoplazmatycznego. Pokazujemy tutaj, że NDC1 bezpośrednio oddziałuje z nukleoporyną nukleoporyną ALADIN, której mutacje są odpowiedzialne za zespół triple-A, i że ta interakcja jest wymagana do kierowania ALADIN do kompleksów porów jądrowych (NPC). kompleksów porów jądrowych (NPC). Ponadto pokazujemy, że NDC1 jest wymagany do selektywnego importu jądrowego. importu jądrowego. Nasze odkrycia sugerują, że za pośrednictwem NDC1 lokalizacja ALADIN do NPC jest niezbędna do selektywnego importu białek jądrowych i że abrogacja interakcji między ALADIN i NDC1 może być ważne dla rozwoju zespołu potrójnego A.
Jakie są znane ludzkie nukleoporyny transmembranowe?
Transbłonowe nukleoporyny (NUP) są integralnymi składnikami błonowymi eukariotycznych porów jądrowych, odgrywającymi ważną rolę w montażu kompleksu porów jądrowych (NPC). Mimo że NPC jest cechą konserwatywną wszystkich eukariontów, różne linie posiadają różne podjednostki transbłonowe NUP. Obecnie scharakteryzowano cztery ludzkie przezbłonowe NUP, a mianowicie: NDC1 (znany również jako TMEM48 lub NET3 lub hNDC1), POM121 (znany również jako Nup121), GP210 (znany również jako Nuclear pore membrane glycoprotein 210 lub Nuclear envelope pore membrane protein POM 210, POM210 lub Nup210) i TMEM33 (lub DB83).