Eukariotyczny replikosom jest kluczowym czynnikiem determinującym stabilność genomu, ale jego struktura jest wciąż słabo poznana. struktura jest wciąż słabo poznana. Wcześniej odkryliśmy, że wiele białek regulatorowych białek regulacyjnych gromadzi się wokół helikazy MCM2-7 w widełkach replikacyjnych drożdży, tworząc kompleks progresji replikomu (RPC), który może łączyć MCM2-7 z innymi składnikami replikomu. składnikami replikomu. Tutaj pokazujemy, że RPC wiąże się z polimerazą DNA alfa, która przygotowuje każdy fragment Okazaki podczas syntezy opóźnionej nici. Nasze dane wskazują, że kompleks składników GINS i Ctf4 RPC jest kluczowy dla połączenia MCM2-7 z polimerazą DNA alfa. Inni odkryli niedawno że podjednostka Mrc1 RPC wiąże polimerazę DNA epsilon, która syntetyzuje nić wiodącą w widełkach replikacyjnych DNA. Pokazujemy, że komórki pozbawione zarówno Ctf4 i Mrc1 doświadczają przewlekłej aktywacji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA podczas replikacji chromosomu replikacji chromosomów i nie kończą cyklu komórkowego. Wyniki te wskazują, że sprzężenie MCM2-7 z polimerazami replikacyjnymi jest ważną cechą regulacji replikacji chromosomów u eukariontów i podkreśla kluczową rolę rolę Ctf4 w tym procesie. --- Komórki drożdży pozbawione Ctf18, głównej podjednostki alternatywnego kompleksu czynnika replikacji C, mają liczne problemy ze stabilnością genomu. Aby zrozumieć funkcję kompleksu Ctf18 in vivo, przeanalizowaliśmy skład chromatyny w mutancie mutancie ctf18Δ przy użyciu ilościowej techniki proteomicznej stabilnego izotopu znakowania aminokwasami w hodowli komórkowej. Trzysta siedem z 491 opisanych białek chromosomalnych. Najbardziej wyraźne nieprawidłowości wystąpiły, gdy komórki zostały poddane działaniu inhibitora replikacji hydroksymocznika. W porównaniu z typem dzikim, komórki ctf18Δ poddane działaniu hydroksymocznika wykazywały zwiększoną asocjację chromatynową składników kompleksu progresji replikomu, w tym Cdc45, Ctf4 i podjednostek kompleksu GINS, zacisku procesywności polimerazy PCNA oraz jednoniciowego kompleksu wiążącego DNA RPA. Skład chromatyny zaobserwowane w komórkach ctf18Δ były bardzo podobne do tych występujących w mutancie mrc1Δ który jest wadliwy w aktywacji kinazy punktu kontrolnego Rad53 w odpowiedzi na stres replikacyjny DNA. odpowiedzi na stres replikacyjny DNA. Odkryliśmy, że komórki ctf18Δ są również wadliwe w aktywacji Rad53, ujawniając, że kompleks Ctf18 jest wymagany do zaangażowania punktu kontrolnego replikacji DNA. Niewłaściwa inicjacja replikacji w późnych genach, z powodu utraty punktu kontrolnego, prawdopodobnie powoduje podwyższony poziom białek replikonu związanych z chromatyną w mutancie ctf18Δ. Rola Ctf18 w aktywacji punktu kontrolnego nie jest wspólna dla wszystkich kompleksów czynnika replikacji C. czynnika C, ponieważ analiza proteomiczna wykazała, że komórki pozbawione Elg1 (głównej podjednostki innego kompleksu podobnego do czynnika replikacji C) wykazują inne spektrum nieprawidłowości chromatyny. Identyfikacja Ctf18 jako białka punktu kontrolnego podkreśla przydatność analizy proteomicznej chromatyny do zrozumienia funkcji in vivo białek, które pośredniczą w transakcjach chromatyny. transakcje chromatynowe. --- Tożsamość helikazy DNA zaangażowanej w replikację eukariotycznego DNA jest wciąż przedmiotem dyskusji. nadal przedmiotem dyskusji, ale białka utrzymujące mini-chromosomy (MCM) są głównym kandydatem. Sześć konserwowanych białek MCM, Mcm2-7, jest niezbędnych dla etapów etapów inicjacji i wydłużania replikacji DNA, zawierają kieszenie wiążące ATP i mogą tworzyć heksameryczną strukturę przypominającą strukturę znanych prokariotycznych i wirusowych helikaz. prokariotycznych i wirusowych helikaz. Jednak biochemiczny dowód ich domniemanej funkcji pozostał pozostawał nieuchwytny. Kilka ostatnich doniesień potwierdza, że kompleks MCM jest częścią komórkowej odpowiedzialnej za odwijanie DNA podczas fazy S. W jednym z tych doniesień, aktywność helikazowa Mcm2-7 została ostatecznie ujawniona, gdy są oczyszczane w połączeniu z dwoma partnerami: czynnikiem inicjacji Cdc45 i czteropodjednostkowym kompleksem kompleksem czterech podjednostek o nazwie GINS. Kompleks Cdc45-MCM-GINS może stanowić rdzeń większej struktury makromolekularnej, która została określona jako "kompleks progresji replikomu". --- Odwijanie DNA w eukariotycznych widełkach replikacyjnych wypiera macierzyste histony, które muszą zostać ponownie umieszczone na powstającym DNA w celu zachowania struktury chromatyny. Systematycznie badając składniki replikosomu, które wychwytują histony uwolnione z chromatyny do ekstraktu komórek drożdży, odkryliśmy, że podjednostka helikazy Mcm2 wiąże histony kooperatywnie z kompleksem FACT (ułatwiającym transkrypcję chromatyny). transkrypcji chromatyny), który pomaga przywrócić chromatynę podczas transkrypcji. transkrypcji. FACT nie wiąże się z helikazą Mcm2-7 w miejscach replikacji replikacji podczas fazy G1, ale jest następnie włączany do kompleksu progresji replikomu niezależnie od wiązania histonów i wyjątkowo wśród chaperonów histonowych. chaperonów. Aminokońcowy ogon Mcm2 wiąże histony poprzez konserwatywny motyw który jest zbędny dla syntezy DNA per se, ale pomaga zachować subtelomeryczną chromatynę chromatyny, zachować 2-mikronowy minichromosom i wspierać wzrost pod nieobecność Ctf18-RFC. Nasze dane wskazują, że eukariotyczne mechanizmy replikacji i transkrypcji i transkrypcji wykorzystują analogiczne zespoły wielu chaperonów do zachowania integralności chromatyny. --- TŁO: Dia2 jest białkiem F-box występującym u pączkujących drożdży S. cerevisiae. Wraz ze Skp1 i Cul1, Dia2 tworzy determinującą substrat część kompleksu ligazy ubikwityny E3 kompleksu ligazy ubikwityny E3, inaczej znanego jako SCF. Dia2 była wcześniej zaangażowany w kontrolę replikacji i stabilności genomu poprzez jego interakcję z kompleksem progresji replikomu. GŁÓWNE USTALENIA: Zidentyfikowaliśmy składniki kompleksu remodelującego chromatynę RSC jako genetyczne interaktory z Dia2, co sugeruje dodatkową rolę Dia2 w regulacji transkrypcji. Pokazujemy, że Dia2 jest zaangażowana w kontrolowanie kompleksu RSC. RSC należy do grupy zależnych od ATP kompleksów remodelujących nukleosomy, które kontrolują repozycjonowanie nukleosomów. Kompleks RSC ulega obfitej ekspresji, a jego 17 podjednostek jest rekrutowanych do chromatyny w odpowiedzi zarówno na aktywację, jak i represję transkrypcji. W przypadku brak Dia2, regulacja transkrypcji za pośrednictwem RSC była upośledzona, z z towarzyszącymi nieprawidłowościami w pozycjonowaniu nukleosomów. WNIOSKI: Nasze odkrycia sugerują, że Dia2 jest wymagany do prawidłowego montażu i funkcjonowania kompleksu RSC. Dia2, kontrolując remodeler chromatyny RSC remodelera, dostraja transkrypcję poprzez kontrolowanie pozycjonowania nukleosomów podczas aktywacji i represji transkrypcji. --- Składniki replikomu, które zachowują stabilność genomu poprzez kontrolowanie eukariotycznych widełek replikacyjnych DNA są słabo poznane. Tutaj, pokazujemy, że kompleks GINS (go ichi ni san) pozwala helikazie MCM (minichromosome utrzymanie) helikazy do interakcji z kluczowymi białkami regulatorowymi w dużych kompleksach progresji replikomu (RPC), które są montowane podczas inicjacji i demontowane pod koniec fazy S. Składniki RPC obejmują niezbędny czynnik inicjacji i wydłużania, Cdc45, mediator punktu kontrolnego Mrc1, kompleks Tof1-Csm3, który umożliwia zatrzymanie widełek replikacyjnych na barierach białko-DNA białko-DNA, chaperon histonowy FACT (ułatwia transkrypcję chromatyny) i Ctf4, który pomaga ustanowić kohezję chromatyd siostrzanych. RPC oddziałują również z Mcm10 i topoizomerazą I. Podczas inicjacji GINS jest niezbędny dla określonego podzbioru białek RPC. specyficznego podzbioru białek RPC do interakcji z MCM. GINS jest również ważny dla normalnej progresji widełek replikacyjnych DNA i pokazujemy, że jest to wymagane po inicjacji, aby utrzymać związek między MCM i Cdc45 w RPC.
Wymień składniki kompleksu progresji replikomu (RPC).
Składniki RPC obejmują niezbędny czynnik inicjacji i wydłużania, Cdc45, mediator punktu kontrolnego Mrc1, kompleks Tof1-Csm3, który umożliwia zatrzymanie widełek replikacyjnych na barierach białko-DNA, chaperon histonowy FACT (ułatwia transkrypcję chromatyny) i Ctf4, który pomaga ustanowić spójność chromatyd siostrzanych. RPC oddziałują również z Mcm10 i topoizomerazą I.