Przedstawiamy charakterystykę genu kodującego nową flokulinę spokrewnioną z genami genami STA drożdży, które kodują wydzielaną glukoamylazę. Geny STA obejmują sekwencje, które są homologiczne do specyficznej dla sporulacji glukoamylazy SGA i do dwóch innych sekwencji, S2 i S1. Odkryliśmy, że S2 i S1 są częścią jednego genu, który nazwaliśmy pojedynczego genu, który nazwaliśmy FLO11. Sekwencja FLO11 ujawnia 4,104-bp otwartą ramkę odczytu na chromosomie IX, której przewidywany produkt jest podobny w ogólnej strukturze do klasy drożdżowych białek ściany komórkowej bogatych w serynę/treoninę zakotwiczonych w GPI białek ściany komórkowej. Domena amino-końcowa zawierająca sekwencję sygnałową i domenę karboksy-końcową domena karboksy-końcowa z homologią do GPI (glikozylo-fosfatydyloinozytolu) białka zawierające kotwicę są oddzielone centralną domeną zawierającą wysoce powtarzającą się sekwencję bogatą w treoninę i serynę. Komórki drożdży, które wyrażają FLO11 agregują się w zależnym od wapnia procesie flokulacji. Flokulacja jest zniesiona, gdy FLO11 jest zakłócony. Wykazano również, że produkt STA1 ma aktywność flokulacyjną. Kiedy fuzja FLO11 z zielonym białkiem fluorescencyjnym była z promotora FLO11 na plazmidzie z pojedynczą kopią, fluorescencja była obserwowano in vivo na obrzeżach komórek. Proponujemy, aby FLO11 kodował flokulinę ze względu na jej wykazaną rolę we flokulacji, jej strukturalne podobieństwo do innych podobieństwo do innych członków rodziny genów FLO oraz lokalizację produktu na powierzchni komórki. powierzchni komórki. Sekwencje genu FLO11 są obecne we wszystkich szczepach drożdży testowanych, w tym we wszystkich standardowych szczepach laboratoryjnych, w przeciwieństwie do genów STA, które są obecne tylko w wariancie szczepu Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. FLO11 różni się od wszystkich innych flokulin drożdżowych tym, że znajduje się w pobliżu centromeru, a nie telomeru, a jego ekspresja jest regulowana przez typ kojarzenia. Represja flokulacji zależnej od FLO11 w diploidach jest przekazywana przez represor typu kojarzenia al/alfa2. --- Neureguliny (NRG) odgrywają ważną rolę w rozwoju i homeostazie zwierząt. homeostazy, a ich deregulacja została powiązana z chorobami takimi jak rak i schizofrenia. NRG należą do rodziny naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) przezbłonowych czynników wzrostu. Chociaż NRG mogą być syntetyzowane jako przezbłonowe (pro-NRG), niektórym z nich brakuje N-końcowej sekwencji sygnałowej, co rodzi pytanie, w jaki sposób te podnosząc pytanie, w jaki sposób te pro-NRG są kierowane do błony plazmatycznej. błony plazmatycznej. Tutaj zbadaliśmy domeny pro-NRG, które są wymagane dla ich zakotwiczenia w błonie, ekspozycji na powierzchni komórki i aktywności biologicznej. My pokazujemy, że wewnętrzny region hydrofobowy działa jako domena kotwicząca błonę, ale inne regiony pro-NRG są wymagane do prawidłowego sortowania do plazmy do błony plazmatycznej. Używając mutantów, które znajdują się w różnych przedziałach subkomórkowych, pokazujemy, że tylko pro-NRG eksponowany na błonę plazmatyczną jest biologicznie aktywny. W pro-NRG mogą działać jako cząsteczki transautokrynne (tj. jako czynniki błonowe zdolne do aktywacji receptorów). czynniki błonowe zdolne do aktywacji receptorów obecnych w komórkach, które są w fizycznym kontakcie z komórkami produkującymi pro-NRG (in trans) lub zdolnymi do aktywacji receptorów obecnych w komórkach produkujących pro-NRG (in cis)). --- thi1 został niedawno wyizolowany z Arabidopsis thaliana i jest prawdopodobnie zaangażowany zarówno w biosyntezę tiaminy, jak i ochronę organellarnego DNA przed uszkodzeniami. Badania biosyntezy tiaminy w roślinach sugerują lokalizację plastydów dla szlaku, co jest zgodne z przewidywanym N-końcowym THI1 chloroplastowego peptydu tranzytowego (TP). Z drugiej strony, tiamina jest syntetyzowana w mitochondriach w komórkach drożdży. Co ciekawe, A. thaliana thi1 cDNA uzupełnia szczep drożdży zaburzony pod względem homologicznego genu. Analiza sekwencji aminokwasowej THI1 aminokwasów THI1 ujawniła obecność domniemanej amfifilowej alfa-helisy, która jest typowa dla mitochondrialnych presekwencji, zlokalizowana za chloroplastowym peptydem tranzytowym peptydu tranzytowego chloroplastu. Aby zdefiniować domniemaną rolę dwóch przewidywanych sekwencji docelowych w tandemie, wyprodukowaliśmy dwa geny chimeryczne obejmujące chloroplastową THI1 TP i 4 lub 27 (w tym domniemaną mitochondrialną N-końcowe reszty dojrzałego THI1, oba połączone z genem reporterowym (gusA). Analiza dystrybucji GUS we frakcjach subkomórkowych transgenicznych roślin ujawniła, że w konstrukcie zachowującym tylko 4 reszty dojrzałego THI1, GUS znajdował się we frakcji chloroplastowej. Rozszerzenie peptydu tranzytowego THI1 do 27 reszt dojrzałego białka umożliwiło import i przetwarzanie GUS zarówno do mitochondriów, jak i chloroplastów. Bezpośrednia analiza przez znakowanie immunologiczne przeciwciałem poliklonalnym anty-THI1 zidentyfikowało THI1 w obu organellach Arabidopsis. Dostarczyliśmy również dowodów na to, że prekursory obu izoform organellarnych są kodowane przez pojedynczy transkrypt jądrowy. Zatem THI1 jest kierowany jednocześnie do mitochondriów i chloroplastów przez mechanizm posttranskrypcyjny. mechanizm transkrypcyjny. --- Niedawno scharakteryzowana ludzka proteaza serynowa, Testisin, ulega ekspresji na premeiotycznych komórkach zarodkowych jąder i jest kandydatem na supresor nowotworu typu II dla raka jąder. Tutaj opisujemy klonowanie, charakterystykę i ekspresję genu kodującego mysią testisynę, Prss21. Gen mysiej testisiny składa się z sześć eksonów i pięć intronów i obejmuje około 5 kb genomowego DNA o niemal identycznej strukturze jak niemal identyczną strukturę jak ludzki gen testisin, PRSS21. Gen został zlokalizowany na mysim chromosomie 17 A3.3-B; region synteniczny z lokalizacją PRSS21 na ludzkim chromosomie 16p13.3. Analizy Northern blot RNA z szeregu tkanek tkanek dorosłych myszy wykazały transkrypt mRNA o wielkości 1,3 kb obecny tylko w jądrach. CDNA mysiej testisin wykazuje 65% identyczności z cDNA ludzkiej testisin i koduje przypuszczalną pre-proteinę 324 aminokwasów z 80% podobieństwem do ludzkiej Testisin. Przewidywana sekwencja aminokwasowa obejmuje N-końcową sekwencję sygnałową 27 aminokwasów, 27 aminokwasowy pro-region, 251 aminokwasów domenę katalityczną typową dla proteazy serynowej o specyficzności podobnej do trypsyny oraz C-końcowe rozszerzenie hydrofobowe, które ma funkcjonować jako kotwica błonowa. kotwicy. Immunobarwienie mysiej testozyny w jądrze myszy wykazało specyficzne barwienie w cytoplazmie i na błonie plazmatycznej okrągłych i wydłużających się spermatydów. spermatyd. Badanie ekspresji mRNA mysiej testisiny w rozwijających się plemnikach potwierdziło, że początek ekspresji mRNA mysiej testisiny wystąpił w około 18 dnia po urodzeniu, co odpowiada pojawieniu się spermatyd w jądrze, w przeciwieństwie do ekspresji ludzkiej Testisin w spermatocytach. Dane te identyfikują mysiego ortologa ludzkiej Testisin i wykazują, że mysi gen Testisin jest czasowo regulowany podczas mysiej spermatogenezy. --- Przejściowa glikoproteina aksonalna (TAG-1) jest cząsteczką adhezji komórkowej, która promuje wzrost neurytów i należy do nadrodziny immunoglobulin. My wyizolowaliśmy cDNA kodujące TAX1, ludzkiego homologa TAG-1. Ludzki TAX1 wykazuje wysoki stopień homologii do szczurzego TAX1 i mniejszy do jego odpowiednika u kurcząt, aksoniny-1, z odpowiednio 91 i 75% identycznością na poziomie aminokwasów. Liczba liczby domen immunoglobulinowych (IgC2) i powtórzeń fibronektyny obecnych w TAG-1 są zachowane między trzema gatunkami. Najwyższy stopień zachowania występuje w drugiej domenie IgC2 (98% u szczura i 82% u pisklęcia). Ludzki homolog ludzki homolog zawiera również przypuszczalną N-końcową sekwencję sygnałową i C-końcową sekwencję hydrofobową, sugerującą powiązanie z błoną komórkową poprzez fosfatydyloinozytol. Ponadto, dwa białka TAG-1 ssaków mają wspólny trójpeptyd RGD, motyw znany z pośredniczenia w rozpoznawaniu fibronektyny przez integryny. integryny. Hybrydyzacja in situ do ludzkich chromosomów metafazowych mapuje gen TAX1 kodujący ludzkie TAG-1 do pojedynczej lokalizacji na chromosomie 1q32. --- Domena transbłonowa (TMD) na N-końcu białka błonowego jest sekwencją sygnałową sekwencja sygnałowa, która kieruje białko do błony retikulum endoplazmatycznego (ER). Prolina występuje częściej w helisach TM w porównaniu z helisami rozpuszczalnymi w wodzie. rozpuszczalnych w wodzie. Aby zbadać wpływ proliny na translokację i integrację białek w komórkach ssaków integrację w komórkach ssaków, dokonaliśmy podstawień proliny w TMD peptydazy dipeptydylowej IV, proteazy błonowej typu II z pojedynczą TMD na jej N-końcu. Białka uległy ekspresji, a ich zdolność do celowania i integracji z błoną mierzono zarówno w komórkach ssaków, jak i w systemach translacji in vitro. systemach translacji in vitro. Trzy podstawienia proliny w centralnym regionie TMD TMD spowodowały różne defekty w celowaniu i/lub integracji z błoną. Zastąpienie zastąpienie proliny innymi aminokwasami o podobnej hydrofobowości uratowało zarówno defekty translokacji, jak i kotwiczenia wszystkich trzech mutantów prolinowych, wskazując, że zmiana konformacyjna spowodowana przez prolinę jest czynnikiem determinującym. Zwiększenie hydrofobowości TMD poprzez zastąpienie innych reszt bardziej hydrofobowymi również skutecznie odwróciło defekty translokacji i integracji. defekty translokacji i integracji. Co ciekawe, zwiększenie hydrofobowości na C-końcowym końcu TMD TMD znacznie skuteczniej niż na N-końcu. Tak więc wpływ proliny na translokację i integrację TMD nie jest determinowany wyłącznie przez jego konformację i hydrofobowość, ale także przez lokalizację proliny w TMD, położenie wysoce hydrofobowych reszt oraz względne położenie proliny do innych reszt proliny w TMD. --- Mechanizmy homeostazy jonów metali w przenoszonym przez żywność ludzkim patogenie Campylobacter jejuni są słabo poznane. Produkt genu Cj1516 jest homologiczny do oksydazy wielomiedziowej CueO, o której wiadomo, że przyczynia się do tolerancji na miedź u Escherichia coli. Tutaj pokazujemy, za pomocą absorbancji optycznej i spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego spektroskopii rezonansu elektronowego, że oczyszczona rekombinowana Cj1516 zawiera zarówno T1, jak i które są charakterystyczne dla oksydaz wielomiedziowych. Spektrometria mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną ujawniła, że białko zawierało około sześciu atomów miedzi na polipeptyd. Obecność N-końcowego "podwójnej argininy" sugeruje peryplazmatyczną lokalizację Cj1516, co zostało potwierdzone przez obecność oksydazy p-fenylenodiaminy (p-PD) we frakcjach peryplazmatycznych komórek typu dzikiego, ale nie zmutowanych Cj1516. Badania kinetyczne wykazały, że czyste białko wykazywało aktywność p-PD, ferroksydazy i oksydazy miedziowej. aktywność oksydazy miedziowej i było zdolne do utleniania analogu bakteryjnego bakteryjnego antracheliny (3,4-dihydroksybenzoesan), chociaż nie zaobserwowano upośledzenia wychwytu żelaza w C w mutancie Cj1516. Mutant ten był jednak bardzo wrażliwy na zwiększone poziomy miedzi w minimalnych pożywkach, co sugeruje rolę w tolerancji na miedź. tolerancji na miedź. Zostało to poparte zwiększoną ekspresją genu Cj1516 w podłożach bogatych w miedź. Mutacja w drugim genie, genie Cj1161c, kodującym przypuszczalnego homologa przypuszczalny homolog CopA, również powodowała nadwrażliwość na miedź, a podwójny mutant Cj1516 Cj1161c okazał się bardziej wrażliwy na miedź niż pojedynczy mutant. niż pojedynczy mutant. Te obserwacje i pozorny brak alternatywnych systemy tolerancji miedzi sugerują, że Cj1516 (CueO) i Cj1161 (CopA) są głównymi białkami zaangażowanymi w homeostazę miedzi u C. jejuni. --- Kompletna pierwotna struktura mysiego łańcucha kolagenu typu XIII została określona przez klonowanie cDNA. Porównanie sekwencji aminokwasów mysich z sekwencjami ludzkimi sekwencjami wykazało wysoką identyczność na poziomie 90%. Co zaskakujące, mysie cDNA rozciągało się dalej w kierunku 5' niż wcześniej zidentyfikowane ludzkie klony. wcześniej zidentyfikowane ludzkie klony. Sekwencje 5' zawierały nowy kodon in-frame ATG do inicjacji translacji, co skutkowało wydłużeniem N-końcowej domeny niekolagenowej o 81 reszt. Te N-końcowe sekwencje nie mają typowej sekwencji sygnałowej, ale zawierają wysoce hydrofobowy segment, który wyraźnie spełnia kryteria domeny transbłonowej. Dane dotyczące sekwencji nieoczekiwanie zasugerowały, że kolagen typu XIII może znajdować się na błonie plazmatycznej z krótką cytozolową częścią N-końcową i długą kolagenową częścią zewnątrzkomórkową. częścią zewnątrzkomórkową. Te dane dotyczące sekwencji skłoniły nas do wygenerowania przeciwciał antypeptydowych przeciwciał przeciwko kolagenowi typu XIII w celu zbadania białka i jego lokalizacji subkomórkowej. i jego lokalizacji subkomórkowej. Western blotting ekstraktu z komórek ludzkiego guza HT-1080 ujawniło prążki o masie ponad 180 kDa. Wydaje się, że reprezentują one związane disiarczkiem multimeryczne formy polipeptydowe, które rozpuszczają się po redukcji do pasm 85-95 kDa które prawdopodobnie reprezentują mieszaninę form splicingowych monomerycznych łańcuchów kolagenu typu XIII łańcuchów kolagenu typu XIII. Wykazano, że łańcuchy te zawierają przewidywane N-końcowe rozszerzenie a zatem także przypuszczalny segment transmembranowy. Immunoprecypitacja biotynylowanego kolagenu typu XIII ze znakowanych powierzchniowo komórek HT-1080, frakcjonowanie subkomórkowe i barwienie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do że cząsteczki kolagenu typu XIII rzeczywiście znajdują się w błonach plazmatycznych tych komórek. w błonach plazmatycznych tych komórek. --- Monooksygenaza amoniaku (AMO) Nitrosomonas europaea jest metaloenzymem, który katalizuje utlenianie amoniaku do hydroksyloaminy. Badanie to pokazuje, że AMO znajduje się w cytoplazmie bakterii, oprócz jego lokalizacji w błonie błonie i jest rozmieszczona w przybliżeniu równomiernie w obu frakcjach subkomórkowych. AMO w obu frakcjach katalizuje utlenianie amoniaku i wiąże [(14)C] acetyloaminę. [(14)C]acetylen, inhibitor oparty na mechanizmie, który specyficznie oddziałuje z katalitycznie aktywną AMO. katalitycznie aktywną AMO. Rozpuszczalna AMO została oczyszczona 12-krotnie do elektroforetycznej jednorodności z wydajnością 8%. AMO ma masę cząsteczkową około 283 kDa z podjednostkami około 27 kDa (podjednostka alfa, AmoA), około 42 kDa (podjednostka beta, AmoB) i ok. 24 kDa (podjednostka gamma, cytochrom c(1)) w układzie alfa(3)beta(3)gamma(3) struktura podjednostki. Różni się od podjednostki beta błonowej AMO, AmoB rozpuszczalnej AMO posiada N-końcową sekwencję sygnałową. AMO zawiera Cu (9,4+/-0,6 mol na mol AMO), Fe (3,9+/-0,3 mol na mol AMO) i Zn (0,5 do 2,6 mol na mol AMO). Po redukcji widzialne widmo absorpcyjne AMO ujawnia pasma absorpcji charakterystyczne dla cytochromu c. Elektronowy rezonans paramagnetyczny spektroskopia rezonansu paramagnetycznego utlenionego powietrzem AMO w temperaturze 50 K pokazuje sygnał paramagnetyczny pochodzący od Cu(2+) i przy 10 K sygnał paramagnetyczny charakterystyczny dla hemu-Fe. --- 605-aminokwasowe białko E1 wirusa brodawczaka bydlęcego typu 1 (BPV-1) jest wielofunkcyjnym białkiem jądrowym wymaganym do replikacji wirusowego DNA. Sekwencja sygnału lokalizacji jądrowej Sekwencja sygnału lokalizacji jądrowej (NLS) została wcześniej zdefiniowana przez mutacje punktowe w w trzech krótkich sąsiadujących klastrach podstawowych aminokwasów zlokalizowanych w amino-końcowym regionie białka E1. W tym badaniu wykorzystaliśmy podejście białka fuzyjnego do ocenić udział innych regionów białka E1 w transporcie jądrowym transportu jądrowego. Prawie pełnej długości gen E1 i sześć nienakładających się podfragmentów zostały połączone w ramce z genem lacZ w eukariotycznym wektorze ekspresyjnym. Każdy klon został elektroporowany do komórek COS-1, a wewnątrzkomórkowa lokalizacja białek fuzyjnych E1-beta-galaktozydazy określono metodą immunofluorescencji. immunofluorescencji. Tylko konstrukty zawierające E1 pełnej długości lub lub pojedynczy podregion (E1-259; aminokwasy 84 do 166) wytwarzały białka fuzyjne, które przedostawały się do jądra. Mutacje punktowe w sekwencjach NLS konstruktu E1-259-lacZ zapobiegały translokacji jądrowej odpowiedniego białka fuzyjnego. Potwierdza to poprzedni wynik, że klaster podstawowych aminokwasów jest krytyczny dla transportu jądrowego. Ponadto dane uzyskane w tym badaniu badania wykazały, że region E1 zawierający sekwencję NLS był nie tylko konieczny, ale także wystarczający do lokalizacji jądrowej. Żaden inny region E1 zawierał niezależną aktywność lokalizacji jądrowej.
Gdzie w białku można znaleźć sekwencję sygnałową?
Białka mają sekwencje sygnałowe zwykle znajdujące się na najbardziej N-końcowym końcu.