Białka rusztowania dodają nową warstwę złożoności do dynamiki sygnalizacji komórkowej. sygnalizacji komórkowej. Poza ich podstawową funkcją łączenia kilku składników szlaku sygnalizacyjnego sygnalizacji, ostatnie badania eksperymentalne wykazały, że rusztowania wpływają na sygnalizację w znacznie bardziej złożony sposób: rusztowania mogą pełnić funkcję funkcję katalityczną, wpływać na sygnalizację poprzez mechanizmy allosteryczne, być regulowane sprzężeniem zwrotnym, lokalizować aktywność sygnalizacyjną w różnych regionach komórki lub zwiększać wierność szlaku. Tutaj dokonujemy przeglądu eksperymentalnych i teoretycznych które dotyczą funkcji dwóch rusztowań MAPK, Ste5, rusztowania szlaku kojarzenia drożdży i szlaku kojarzenia drożdży i KSR1/2, rusztowania klasycznego szlaku sygnałowego MAPK ssaków. ssaków. W przypadku drożdżowego rusztowania Ste5, szczegółowe modele mechanistyczne były były cenne dla zrozumienia jego funkcji. Dla rusztowań w sygnalizacji ssaków modele były raczej ogólne i pobieżne. Na przykład, modele te przewidywały wąskie optymalne stężenia rusztowań, ale kiedy przeglądając te modele, zakładając typowe stężenia, raczej zakres poziomów rusztowań optymalnie wspiera sygnalizację. Dlatego bardziej realistyczne modele są aby zrozumieć rolę rusztowań w transdukcji sygnału u ssaków, co otwiera duże możliwości dla biologii systemów. --- Ostatnie badania wskazują, że kinaza supresorowa Ras (KSR) jest białkiem rusztowania dla kaskady sygnalizacyjnej Ras/Raf/MEK/ERK u ssaków. Aby pomóc określić funkcję in vivo KSR, zbadaliśmy specyficzną dla tkanki dystrybucję tego białka białka w embrionalnej i dorosłej myszy przy użyciu szczurzego przeciwciała monoklonalnego podniesionego przeciwko mysiemu białku. Analiza Western blot wskazuje, że białko jest wyrażane na najwyższych poziomach w dorosłym mózgu. Jest również wyrażany na niskim poziomie w pęcherzu moczowym, jajnikach, jądrach i płucach, ale białko nie jest wykrywalne w żadnej innej dorosłej tkance. Jednak analiza odwrotnej transkrypcji-PCR pokazuje, że transkrypty Ksr są wykrywane we wszystkich dorosłych tkankach z wyjątkiem wątroby. Wariant zawierający różnicowo splicowany ekson w domenie CA4 jest obserwowany w mózgu, móżdżku, jajniku i jelicie. Białko ulega również ekspresji w zarodku E6.5 i na wysokim poziomie w neuroepitelium zarodka E10.5. Na tym stadium embrionalnym ekspresja jest również wykrywana na niższych poziomach w pąkach kończyn i pąkach ogonowych, a także w mięśniu sercowym. --- Beta-arrestyna pośredniczy w desensytyzacji i internalizacji receptorów beta-adrenergicznych (betaAR), ale działa również jako białko rusztowania w kaskadzie zewnątrzkomórkowej kaskadzie kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK). W związku z tym zbadaliśmy rolę beta-arrestin2 w szlakach sygnałowych ERK, w których pośredniczy betaAR. Stymulacja izoproterenolem w równym stopniu aktywowała cytoplazmatyczną i jądrową ERK w komórkach COS-7 wyrażających beta1AR lub beta2AR. Jednak aktywność jądrowej ERK była zwiększona przez współekspresję beta-arrestin2 w komórkach z ekspresją beta2AR, ale nie beta1AR. Leczenie toksyną krztuścową i blokada działania Gbetagamma hamowały wzmocniona przez beta-arrestynę2 aktywacja jądrowa ERK, co sugeruje, że beta-arrestin2 promuje jądrową lokalizację ERK w mechanizmie zależnym od Gbetagamma mechanizm po stymulacji receptora. beta2AR zawierający terminal karboksylowy region beta1AR utracił promowaną przez beta-arrestynę2 translokację jądrową. Ponieważ region terminalu karboksylowego jest ważny dla wiązania beta-arrestyny, wyniki te pokazują, że rekrutacja beta-arrestin2 do regionu karboksylo-końcowego beta2AR jest ważna dla lokalizacji ERK do jądra. --- Kinase suppressor of Ras (KSR) jest rusztowaniem molekularnym, które oddziałuje ze składnikami kaskady kinaz Raf/MEK/ERK i pozytywnie reguluje ERK. składnikami kaskady kinaz Raf/MEK/ERK i pozytywnie reguluje sygnalizację ERK i pozytywnie reguluje sygnalizację ERK. Fosforylacja KSR1, w szczególności przy Ser(392), jest krytycznym regulatorem lokalizacji subkomórkowej KSR1 i aktywacji ERK. Zbadaliśmy rolę rolę fosforylacji zarówno Ser (392), jak i Thr (274) w regulacji aktywacji ERK i proliferacji komórek. i proliferacji komórek. Postawiliśmy hipotezę, że fosforylacja KSR1 jest zaangażowana w generowanie specyficzności sygnalizacji poprzez kaskadę kinaz Raf/MEK/ERK w odpowiedzi na stymulację przez różne czynniki wzrostu. W fibroblastach, stymulacja płytkowym czynnikiem wzrostu indukuje trwałą aktywację ERK i promuje wejście w fazę S. Leczenie naskórkowym czynnikiem wzrostu indukuje przejściową aktywację aktywację ERK, ale nie prowadzi komórek do fazy S. Mutacja Ser(392) i Thr(274) (KSR1.TVSA) promuje trwałą aktywację ERK i cykl komórkowy z płytkowym czynnikiem wzrostu lub naskórkowym czynnikiem wzrostu. leczenie czynnikiem. Fibroblasty mysich zarodków KSR1(-/-) wyrażające KSR1.TVSA proliferują dwa razy szybciej i rosną do większej gęstości niż komórki wyrażające ten sam poziom KSR1 typu dzikiego. Ponadto, KSR1.TVSA jest bardziej stabilny niż KSR1 typu dzikiego. Dane te pokazują, że fosforylacja i stabilność rusztowania molekularnego rusztowania molekularnego KSR1 są krytycznymi regulatorami specyficznych dla czynnika wzrostu odpowiedzi, które promują proliferację komórek. --- Transdukcja sygnału zachodzi poprzez odwracalne łączenie oligomerycznych kompleksów białkowych które zawierają zarówno białka enzymatyczne, jak i białka bez znanej aktywności aktywności enzymatycznej. Te nieenzymatyczne składniki mogą służyć jako rusztowania lub kotwice i regulują wydajność, specyficzność i lokalizację szlaku sygnalizacyjnego. szlaku sygnałowego. W tym miejscu przedstawiamy identyfikację MORG1 (mitogen-activated kinazy białkowej 1), członka rodziny białek WD-40, który został wyizolowany jako wiążący partner kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) białka MP1. MORG1 specyficznie wiąże się z kilkoma składnikami szlaku ERK, w tym MP1, Raf-1, MEK i ERK, a także stabilizuje ich połączenie w kompleks oligomeryczny. MORG1 ułatwia aktywację ERK aktywację ERK, gdy komórki są stymulowane kwasem lizofosfatydowym, phorbolem 12-myristate 13-acetate lub surowicą, ale nie w odpowiedzi na naskórkowy czynnik wzrostu czynnik. Tłumienie MORG1 przez krótkie interferujące RNA prowadzi do znacznego zmniejszenie aktywności ERK, gdy komórki są stymulowane surowicą. Proponujemy, aby MORG1 jest składnikiem modułowego systemu rusztowania, który uczestniczy w regulacji regulacji specyficznej dla agonisty sygnalizacji ERK. --- Nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1), choroba genetyczna, która dotyka 1 na 3000 osób, jest spowodowana jest utratą dużego, konserwowanego ewolucyjnie białka, które służy jako GTPaza białko aktywujące (GAP) dla Ras. Wśród fenotypów mutantów null Drosophila melanogaster Nf1 (dNf1) fenotypy mutantów, deficyty uczenia się/pamięci i zmniejszony ogólny wzrost przypominają ludzkie objawy NF1. Te i inne defekty dNf1 są stosunkowo niewrażliwe na manipulacje, które zmniejszają siłę sygnalizacji Ras, ale są tłumione przez zwiększając sygnalizację poprzez 3'-5' cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP) zależny szlak kinazy białkowej A (PKA) lub fenokopiowany przez hamowanie tego szlaku szlaku. Jednak to, czy dNf1 wpływa na sygnalizację cAMP/PKA bezpośrednio czy pośrednio pozostaje kontrowersyjne. Aby rzucić światło na tę kwestię, zbadaliśmy 486 chromosomów 1(st) i 2(nd), które odkryły >80% genów z adnotacjami dla dominujących modyfikatorów dNf1. modyfikatorów defektu wielkości poczwarki dNf1, identyfikując odpowiedzialne geny w krzyżówkach ze zmutowanymi allelami lub przez specyficzną tkankowo interferencję RNA (RNAi) knockdown. Zidentyfikowane supresory, potwierdzające wyniki badań przesiewowych, obejmują wcześniej kinazę tyrozynową dAlk, jej aktywujący ligand jelly belly (jeb), dwa inne geny inne geny zaangażowane w transdukcję sygnału Ras/ERK i kilka zaangażowanych w sygnalizację cAMP/PKA. sygnalizację cAMP/PKA. Nowe modyfikatory, które wiążą się z defektami synaptycznymi w niedoborze wzrostu dNf1 obejmują białko rusztowania synaptycznego związane z intersektynami Dap160 i receptor drosulfakininy CCKLR-17D1 związany z receptorem cholecystokininy receptor. Dostarczając mechanistycznych wskazówek, pokazujemy, że dAlk, jeb i CCKLR-17D1 są wśród mutantów wśród mutantów, które również tłumią niedawno zidentyfikowany dNf1 nerwowo-mięśniowy fenotyp przerostu złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ) i że manipulacje, które zwiększają sygnalizację sygnalizacja cAMP / PKA w komórkach wytwarzających hormon adipokinetyczny (AKH) u podstawy neuroendokrynnego gruczołu pierścieniowego przywracają niedobór wzrostu dNf1. Wreszcie, potwierdzając nasze wcześniejsze twierdzenie, że ALK może być celem terapeutycznym w NF1. NF1, donosimy, że ludzka ALK ulega ekspresji w komórkach, które dają początek guzom NF1 i że sygnalizacja ALK/RAS/ERK regulowana przez NF1 wydaje się być zachowana u człowieka. --- KSR-1 jest białkiem rusztowania, które jest niezbędne do aktywacji indukowanej przez Ras wysoce konserwatywnego modułu kinazy RAF-MEK-ERK. Wcześniej zidentyfikowaliśmy bliskiego KSR-1, zwane KSR-2, poprzez strukturalną eksplorację danych opartą na homologii. W celu dalszego zrozumienia roli KSR-2 w sygnalizacji MAPK, podjęliśmy się funkcjonalne podejście proteomiczne w celu wyjaśnienia dynamicznego składu kompleksu funkcjonalnego funkcjonalnego kompleksu KSR-2 w komórkach HEK-293 w warunkach ze stymulacją TNF-alfa i bez niej. stymulacją TNF-alfa. Znaleźliśmy prawie 100 białek, które były potencjalnie związane z kompleksem KSR-2 i 43 białka, które prawdopodobnie zostały zrekrutowane do kompleksu super molekularnego kompleksu po leczeniu TNF-alfa. Nasze wyniki wskazują, że KSR-2 może działać jako białko rusztowania podobne do KSR-1, pośrednicząc w rdzeniu MAPK (RAF-MEK-ERK), ale z odmienną specyficznością izoformy RAF, a mianowicie KSR-2 może pośredniczyć tylko w sygnalizacji A-RAF, podczas gdy KSR-1 jest odpowiedzialny za przekazywanie sygnałów tylko z c-RAF. Ponadto KSR-2 może być zaangażowany w aktywację wielu cząsteczek sygnałowych MAPK, takich jak p38 MAPK, IKAP, AIF i białek zaangażowanych w ubikwitynę-proteasom, apoptozę, kontrolę cyklu komórkowego oraz szlaki syntezy i naprawy DNA, a także pośredniczy w krzyżowaniu się między MAPK a kilkoma innymi szlakami sygnalizacyjnymi, w tym PI3K i insuliną i insuliną. Podczas gdy interakcje z tymi cząsteczkami nie są znane dla KSR-1, to Rozsądne jest postawienie hipotezy, że KSR-1 może również odgrywać podobną rolę w mediowaniu tych dalszych szlaków sygnałowych. --- Kinase Suppressor of Ras (KSR) jest rusztowaniem molekularnym, które oddziałuje z podstawowymi składnikami kinazy podstawowymi składnikami kinazy kaskady ERK, Raf, MEK, ERK, aby zapewnić przestrzenną i czasową regulację zależnej od Ras sygnalizacji kaskady ERK. Przerwanie tego mechanizmu może mieć duży wpływ na hamowanie dalszej sygnalizacji zmutowanej kinazy tyrozynowej. zmutowanej receptorowej kinazy tyrozynowej po związaniu ligandu. Nadal żadne z badań badań ukierunkowanych na zapobieganie wiązaniu Raf, wiązaniu MEK z kinazą supresora RAS. W tej perspektywie bogata w cysteinę domena C1 rusztowania białka supresora kinazy Ras-1 była ukierunkowana raczej niż jego wiązanie ATP z małymi cząsteczkami ligandów, takimi jak flawony i antocyjanidyny i analizowane poprzez badania dokowania insilico. Ocena energii wiązania pokazuje znaczenie grup hydroksylowych w różnych pozycjach jądra flawonu i antocyjanidyny. jądrze antocyjanidyny. Wszystkie interakcje wiązania pokazują, że ligandy te zajmowały potencjalne miejsca w bogatej w cysteinę domenie C1 białka rusztowania KSR. --- Białko rusztowania IQGAP1 reguluje sygnalizację komórkową poprzez szlak RAF/MEK/ERK szlak. Ostatnie dane pokazują, że komórki nowotworowe, w których szlak RAF/MEK/ERK jest są szczególnie wrażliwe na zaburzenia funkcji IQGAP1. LEKI IQGAP mogą być szczególnie skuteczne w nowotworach, które rozwijają oporność na istniejące leki na ten szlak. --- Białka 14-3-3 mogą funkcjonować jako białka adapterowe lub rusztowania w szlakach transdukcji sygnału szlakach transdukcji sygnału. Wcześniej donosiliśmy, że kilka izotypów 14-3-3 wiąże się z z kinazą białkową C (PKC)-zeta i ułatwiają sprzęganie PKC-zeta z Raf-1 [van der Hoeven, van der Wal, Ruurs, van Dijk i van Blitterswijk (2000) Biochem. J. 345, 297-306], zdarzenie, które wzmacnia kinazę białkową aktywowaną mitogenami (ERK) w fibroblastach Rat-1. W niniejszej pracy zbadano, czy związany 14-3-3 wpływa na aktywność PKC-zeta. Wykorzystując rekombinowane białka 14-3-3 i oczyszczoną PKC-zeta w wygodnym, nowo opracowanym teście kinazowym in vitro, stwierdziliśmy, że białka 14-3-3 stymulowały aktywność PKC-zeta w sposób zależny od dawki do ok. 2,5-krotnie. Aktywacja PKC-zeta przez izotypy 14-3-3 była niezwiązana z ich wzajemnym powinowactwem, oszacowanym przez koimmunoprecypitację z lizatów komórek COS lizatów komórek COS. Odpowiednio, PKC-zeta z wadliwym (zmutowanym punktowo) miejscem wiązania 14-3-3 wykazała taką samą aktywność stymulowaną 14-3-3 jak PKC-zeta typu dzikiego. Ponieważ 14-13-3 są kwaśne, przetestowaliśmy kilka innych kwaśnych białek, które okazały się stymulować aktywność PKC-zeta w podobny sposób, podczas gdy białka neutralne lub zasadowe białka nie. Efekty te nie były ograniczone do nietypowego PKC-zeta, ale stwierdzono je również dla klasycznej PKC. Łącznie wyniki sugerują że stymulacja aktywności PKC przez białka 14-3-3 jest niespecyficzna i wyłącznie ze względu na kwasową naturę tych białek, dość podobną do tej znanej dla kwaśnych lipidów. --- Kaskady kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) są ewolucyjnie konserwowanymi szlakami transdukcji zaangażowanymi w wiele procesów komórkowych. szlaki transdukcji zaangażowane w wiele procesów komórkowych. Moduły kinazowe są związane z białkami rusztowania, które regulują sygnalizację, zapewniając krytyczną specyficzność przestrzenną i czasową. Niektóre z tych białek rusztowania zostały wykazano, że są konserwowane, zarówno pod względem sekwencji, jak i funkcji. U myszy rusztowanie MP1 (MEK Partner 1) tworzy kompleks sygnalizacyjny z MEK1 i ERK1. W tej pracy skupiamy się na Drosophila MP1 (dMP1). Pokazujemy, że dMP1 ulega wszechobecnej ekspresji podczas rozwoju embrionalnego i larwalnego. Dzięki eksperymentom in vitro i in vivo pokazujemy, że dMP1 jest zlokalizowany w cytoplazmie i jądrach oraz że oddziałuje z MEK i ERK. Badania genetyczne z transgenicznymi liniami Drosophila umożliwiające nadekspresję dMP1 lub obniżenie regulacji dMP1 przez interferencję RNA podkreślają funkcję dMP1 w kontroli różnicowania komórek podczas rozwoju skrzydła Drosophila. --- Aktywacja ERK jest wzmacniana przez białka rusztowania KSR i MP1, zlokalizowane odpowiednio w pobliżu błony komórkowej i późnych endosomów. odpowiednio w pobliżu błony komórkowej i późnych endosomów, ale niewiele wiadomo o ich dynamicznej interakcji. Opracowaliśmy tutaj model matematyczny z równań różniczkowych zwyczajnych, aby opisać dynamiczną aktywację sygnalizacji EGFR-ERK w konwencjonalnym szlaku bez rusztowań, szlaku z rusztowaniami KSR i szlaku z rusztowaniem MP1, a ich wpływ został zbadany pod wpływem wpływ regulatorów endosomalnych, Cbl-CIN85 i Endophilin A1. Ten nowy zintegrowany model, zweryfikowany względem wyników eksperymentalnych i obliczeniowych ograniczeniami obliczeniowymi, pokazuje, że zmiany aktywacji ERK i endocytozy EGFR w odpowiedzi na stężenia odpowiedzi na stężenia EGF (tj. wrażliwość na ligand) zależą od tych białek rusztowania i regulatorów. białka i regulatory. Białka rusztowania KSR i konwencjonalne szlaki działają synergistycznie i są wrażliwe na ligand. synergistycznie i są wrażliwe na stymulację EGF. Gdy poziom KSR jest wysoki, wrażliwość aktywacji ERK z tego połączonego szlaku pozostaje niska gdy poziom Cbl-CIN85 jest niski. Ale taka wrażliwość może być zwiększona przy zwiększając poziom endofiliny, jeśli poziom Cbl-CIN85 staje się wysoki. Jednakże, obniżone poziomy KSR już wykazują wysoką wrażliwość niezależnie od poziomów Endophilin poziomów. W przeciwieństwie do tego, aktywacja ERK przez MP1 jest addytywna do aktywacji KSR, ale wykazuje niewielką wrażliwość na ligand przy wysokich poziomach EGF. Może to być częściowo odwrócone przez zwiększenie poziomu endofiliny przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego poziomu Cbl-CIN85. Dalsze analizy wykazały, że wysokie poziomy KSR wpływają na wrażliwość na ligand endocytozy EGFR, podczas gdy MP1 zapewnia odporność endosomalnej aktywacji ERK. Symulacje te stanowią wielowymiarową eksplorację tego, w jaki sposób endocytoza EGFR zależna od EGF i aktywacja ERK są dynamicznie zależne od rusztowania KSR i MP1, współregulowane przez Cbl-CIN85 i endofilinę A1. Razem, te wyniki zapewniają szczegółową i ilościową demonstrację tego, jak regulatory i rusztowania mogą współpracować w celu dostrojenia zależnej od ligandu wrażliwości endocytozy EGFR i aktywacji ERK, co może leżeć u podstaw różnice podczas normalnej fizjologii, stanów chorobowych i odpowiedzi na leki. --- Specyficzność w transdukcji sygnału można osiągnąć poprzez rusztowania, kotwice i adaptery, i adaptery, które łączą ogólne składniki transdukcji sygnału w określonych kombinacjach i lokalizacjach. MEK Partner-1 (MP1) został zidentyfikowany jako potencjalny białko "rusztowania" dla szlaku kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) ssaków. szlaku. Aby uzyskać wgląd w interakcje MP1 ze szlakiem ERK, my przeanalizowaliśmy zdolność MP1 do wiązania się z MEK1, ERK1 i samym sobą oraz regulację tych interakcji. regulację tych interakcji. Filtracja żelowa lizatów komórkowych ujawniła dwa główne piki MP1: szeroki pik o wysokiej masie cząsteczkowej i kompleks 28 kDa. Mutant MP1 który utracił wiązanie MEK1, nie zwiększał już aktywności ERK1 stymulowanej przez RasV12 i funkcjonował jako dominujący negatywny, zgodnie z koncepcją że funkcja MP1 zależy od ułatwiania tych oligomeryzacji. Aktywacja szlaku szlaku ERK przez surowicę lub RasV12 nie wpłynęła wykrywalnie na dimeryzację MP1-MP1 dimeryzację lub interakcje MP1-MEK1, ale spowodowała dysocjację kompleksu MP1-ERK1. MP1-ERK1. Co zaskakujące, farmakologiczne hamowanie aktywacji ERK nie nie przywróciło kompleksu, co sugeruje, że regulacja tworzenia kompleksu zachodzi niezależnie od fosforylacji ERK. Wyniki te potwierdzają koncepcję, że MP1 funkcjonuje jako regulator sygnalizacji kinazy MAP poprzez wiązanie się z MEK1 i regulując jego asocjację z większym kompleksem sygnalizacyjnym, który może sekwencyjnie obsługiwać wiele cząsteczek ERK. --- Wcześniej opisaliśmy nowy modulator cytoszkieletu aktynowego, który reguluje również aktywność Ras i kinazy białkowej aktywowanej mitogenami w komórkach nabłonka w komórkach nabłonkowych wrażliwych na TGFβ. Tutaj zbadaliśmy funkcjonalną rolę tego sygnalizacyjnego białka regulatorowego (km23-1) w pośredniczeniu w migracji, inwazji i wzrost guza ludzkich komórek raka jelita grubego (CRC). Wykazaliśmy, że małe interferujące RNA (siRNA) pozbawienie km23-1 w ludzkich komórkach CRC hamowało konstytutywną aktywację kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), jak również proinwazyjne funkcje efektorowe ERK, które obejmują fosforylację Elk-1, konstytutywną regulację wiązania c-Fos-DNA, transaktywację promotora TGFβ1, i wydzielanie TGFβ1. Ponadto, knockdown km23-1 zmniejszył parakrynne efekty działanie czynników wydzielanych przez komórki CRC w pożywce kondycjonowanej i w ko-kulturach fibroblastów. ko-kulturach fibroblastów. Co więcej, zubożenie km23-1 w ludzkich komórkach CRC zmniejszyło migrację i inwazję komórek, a także migrację i inwazję, a także ekspresję regulowanego przez ERK, związanego z przerzutami białka rusztowania Ezrin. Wreszcie, inhibicja km23-1 znacząco hamowało powstawanie guzów in vivo. Tak więc, nasze wyniki wskazują km23-1 jako nowy cel przeciwprzerzutowy dla ludzkich komórek raka okrężnicy, zdolny do zmniejszenia wzrostu guza i inwazji poprzez mechanizm obejmujący tłumienie różnych pro-migracyjnych cech CRC. Obejmują one zmniejszenie w sygnalizacji ERK, zmniejszoną produkcję TGFβ1, zmniejszoną ekspresję błony plazmatycznej-cytoszkieletu Ezrin, jak również osłabienie parakrynnego działania raka okrężnicy. parakrynnych efektów czynników wydzielanych przez raka okrężnicy na migrację fibroblastów i mitogenezę. Jako takie, inhibitory km23-1 mogą stanowić realną strategię terapeutyczną strategię terapeutyczną w celu zakłócenia progresji i inwazji raka okrężnicy. --- Sieci transdukcji sygnału umożliwiają komórkom rozpoznawanie i reagowanie na zmiany w środowisku zewnątrzkomórkowym. Wszystkie komórki eukariotyczne posiadają szlaki MAPK (mitogen-activated kinazy białkowej), które uczestniczą w różnych funkcjach komórkowych, w tym różnicowanie, przeżycie, transformację i ruch. Pięć różnych grup MAPK zostało scharakteryzowanych u ssaków, z których najszerzej badane są Ras/Raf/MEK [MAPK/ERK (extracellular-signal-regulated kinase) - kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym]/ERK. kinaza]/ERK. Liczne bodźce, w tym czynniki wzrostu i estry forbolu estry, aktywują sygnalizację MEK/ERK. Jak różne sygnały zewnątrzkomórkowe są tłumaczone przez MEK/ERK na różne funkcje komórkowe pozostaje niejasne. Pierwotnie zidentyfikowane w drożdżach, białka rusztowania są obecnie uznawane za przyczyniają się do specyficzności szlaków MEK/ERK w komórkach ssaków. Te rusztowania obejmują KSR (supresor kinazy Ras), beta-arrestynę, partnera MEK-1, Sef i IQGAP1. Rusztowania organizują wielobiałkowe kompleksy sygnalizacyjne. To MEK/ERK do określonych substratów i ułatwia komunikację z innymi szlakami, pośrednicząc w ten sposób w różnych funkcjach. Białka adaptorowe regulują kinetykę, amplitudę i lokalizację sygnalizacji MEK/ERK, zapewniając skuteczny mechanizm umożliwiający skuteczny mechanizm, który umożliwia indywidualnemu bodźcowi zewnątrzkomórkowemu promowanie specyficzną odpowiedź biologiczną. --- TŁO: Białka rusztowania modulują sygnalizację komórkową poprzez ułatwianie montaż określonych szlaków sygnałowych. Jednak obecnie istnieje niewiele informacji, czy i jak białka rusztowania funkcjonalnie oddziałują ze sobą. WYNIKI: Tutaj pokazujemy, że dwa białka rusztowania, kaweolina-1 i IQGAP1, są wymagane do fosforylacji związanej z aktyną puli zewnątrzkomórkowej regulowanej sygnałem kinazy 1 i 2 (ERK1/2) w odpowiedzi na aktywację kinazy białkowej C aktywację. Wykazaliśmy za pomocą immunofluorescencji i testów ligacji zbliżeniowej, że IQGAP1 wiąże ERK1/2 z filamentami aktynowymi. Co więcej, eksperymenty siRNA pokazują, że IQGAP1 jest wymagany do aktywacji ERK1/2 związanego z aktyną. Kaweolina-1 jest również niezbędna do fosforylacji ERK1/2 związanej z aktyną w odpowiedzi na kinazę białkową C, ale odpowiedź na kinazę białkową C, ale jest zbędna dla asocjacji ERK1/2 z aktyną. Jednoczesne znokautowanie kaweoliny-1 i IQGAP1 zmniejsza całkowitą liczbę forbolu fosforylację ERK1/2 indukowaną estrem do tego samego stopnia, co pojedynczy knock down caveolin-1 lub IQGAP1, co wskazuje, że caveolin-1 i IQGAP1 działają w tym samym szlaku aktywacji ERK tym samym szlaku aktywacji ERK. Dalej pokazujemy, że znokautowanie caveolin-1, ale nie ale nie IQGAP1, zmniejsza fosforylację C-Raf w odpowiedzi na stymulację forbolem ester. WNIOSKI: Na podstawie naszych danych sugerujemy, że kaweolina-1 i IQGAP1 tworzą odrębne moduły sygnalizacyjne, które są następnie połączone w hierarchicznym układzie aby wygenerować funkcjonalny szlak aktywacji ERK1/2. --- Białka rusztowania regulują wewnątrzkomórkową sygnalizację kinazy MAP, zapewniając krytyczną specyficzność przestrzenną i czasową. Wcześniej wykazaliśmy, że białko białko rusztowania partnera MEK1 (MP1) jest zlokalizowane w późnych endosomach przez białko adaptorowe p14. białko adaptorowe p14. Stosując warunkowe zaburzenie genu p14 w wątrobach myszy (p14(Δhep) ) przeanalizowaliśmy sygnatury białek i transkryptów w próbkach tkanek. Dalsza analiza sieci biologicznej wykazała, że różnie wyrażone transkrypty i białka transkrypty i białka są zaangażowane w progresję cyklu komórkowego i regulację proliferacji komórkowej. Chociaż niektóre z tutaj zidentyfikowanych sygnatur były wcześniej powiązane z aktywnością fosfo-ERK, większość z nich była nowymi celami późnego endosomalnego modułu sygnałowego p14/MP1/MEK/ERK. Wreszcie, defekt proliferacji została potwierdzona w chemicznie indukowanym modelu regeneracji wątroby w myszy z nokautem p14(Δhep). --- Uważa się, że białka rusztowania są kluczowymi składnikami szlaków sygnałowych, ich dokładna funkcja jest nieznana. Poprzez wstępny montaż wielu składników kaskad sygnalizacyjnych, przewiduje się, że rusztowania wpływają na wydajność i/lub specyficzność zdarzeń sygnalizacyjnych. Tutaj analizujemy potencjalne rusztowanie szlaku Ras / kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), kinazę supresorową Ras (KSR), poprzez generowanie myszy z niedoborem KSR. Myszy z niedoborem KSR były zasadniczo normalne nawet jeśli aktywacja kinazy ERK została osłabiona w stopniu wystarczającym do zablokowania aktywacji komórek T i zahamowania rozwoju nowotworu. Zgodnie z jego rolą jako rusztowanie, kompleksy o wysokiej masie cząsteczkowej zawierające KSR, MEK i ERK zostały utracone pod nieobecność KSR. Dowodzi to, że KSR jest bona fide rusztowaniem, które nie jest wymagane, ale wzmacnia sygnalizację poprzez szlak sygnałowy Ras/MAPK. --- Komórki eukariotyczne wykorzystują kaskadę kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) do łączenia receptorów na powierzchni komórki z celami wewnątrzkomórkowymi. Chociaż różne sygnały sygnały są kierowane przez szlak ERK, komórki reagują odpowiednio na dany bodziec. bodziec. Aby regulować prawidłową transdukcję sygnału, stosowane są rusztowania i adaptory. wykorzystywane do organizowania określonych jednostek sygnalizacyjnych. Białko rusztowania MP1 (partner MEK1 partner MEK1) tworzy kompleks rusztowania w kaskadzie ERK. Pokazujemy, że p14 funkcjonuje jako białko adaptorowe, które jest wymagane i wystarczające do lokalizacji MP1 do endosomów. Obniżenie poziomu białka MP1 lub p14 przez siRNAi skutkuje skutkuje wadliwą transdukcją sygnału. Dlatego nasze wyniki sugerują, że endosomalna lokalizacja lokalizacja kompleksu rusztowania p14/MP1-MAPK jest kluczowa dla transdukcji sygnału. transdukcji sygnału. --- TŁO: Kaskady kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) (szlaki p38, JNK, ERK ) są zaangażowane w nabywanie losów komórek podczas rozwoju. Te moduły kinaz są związane z białkami rusztowania, które kontrolują ich aktywność. U Drosophila, dMP1, które koduje białko rusztowania ERK, reguluje sygnalizację ERK podczas rozwoju skrzydeł i przyczynia się do różnicowania komórek i komórek żylnych. Funkcjonalne relacje podczas rozwoju skrzydeł między regulatorem chromatyny, Enhancer of Trithorax i Polycomb Corto, ERK i jego białkiem rusztowania dMP1. białkiem rusztowania dMP1. WYNIKI: Interakcje genetyczne pokazują, że corto i dMP1 działają razem, aby antagonizować rolled (który koduje ERK) w przyszłych komórkach międzypęcherzykowych, tym samym promowanie losu międzywęźla. Chociaż corto, ERK i dMP1 są obecne zarówno w zarówno w cytoplazmie, jak i jądrze, oddziałują wyłącznie w ekstraktach z jądra. ekstraktach. Co więcej, Corto, ERK i dMP1 kolokalizują w kilku miejscach na chromosomach chromosomach polietylenowych, co sugeruje, że regulują one ekspresję genów bezpośrednio na chromatynie. Wreszcie, Corto jest fosforylowany. Co ciekawe, jego wzór fosforylacji różni się między cytoplazmą a jądrem i zmienia się po aktywacji ERK. WNIOSKI: Nasze dane sugerują zatem, że Enhancer of Trithorax i Polycomb Corto mogą uczestniczyć w regulacji genów żył i międzywęźli podczas rozwoju tkanki skrzydła w odpowiedzi na sygnalizację ERK. --- Interakcje, w których pośredniczy kadheryna, są integralną częścią tworzenia synaps i potencjalizacji. Tutaj pokazujemy, że N-kadheryna jest wymagana do tworzenia pamięci i regulacji podzbioru podstawowych procesów biochemicznych. N-kadheryna peptyd antagonistyczny zawierający motyw His-Ala-Val (HAV-N) przejściowo zaburzał dimeryzację N-kadheryny w hipokampie i upośledzał tworzenie się długoterminową kontekstową pamięć strachu, jednocześnie oszczędzając pamięć krótkotrwałą, odzyskiwanie i wygaszanie. HAV-N upośledzał indukowaną uczeniem się fosforylację charakterystyczna, związana cytoszkieletowo frakcja hipokampalnego Erk-1/2 i zmienił dystrybucję IQGAP1, białka rusztowania łączącego adhezję komórek z cytoszkieletem za pośrednictwem kadheryny adhezję komórek do cytoszkieletu. Efektowi temu towarzyszyło zmniejszenie interakcji N-kadheryna/IQGAP1/Erk-2. Podobnie w pierwotnych hodowlach neuronów, HAV-N zapobiegał indukowanej przez NMDA dendrytycznej fosforylacji Erk-1/2 i powodował relokację IQGAP1 z kolców dendrytycznych do trzonów. Dane te sugerują że nowo zidentyfikowana rola hipokampalnej N-kadheryny w konsolidacji pamięci może być pośredniczona, przynajmniej częściowo, przez cytoszkieletową sygnalizację IQGAP1/Erk. --- Rusztowania białkowe stały się ważnymi regulatorami kaskad MAPK, ułatwiając aktywację kinazy i zapewniając kluczową kontrolę przestrzenno-czasową do ich sygnalizacji. Wykorzystując podejście proteomiczne do porównania wiązania partnerów dwóch rusztowań KSR ssaków, stwierdzamy, że zarówno KSR1, jak i KSR2 oddziałują ze składnikami kinazy kaskady ERK i mają wspólną funkcję w promowaniu funkcję w promowaniu sygnalizacji ERK za pośrednictwem RTK. Co uderzające, odkryliśmy, że fosfataza białkowa kalcyneuryna selektywnie oddziałuje z KSR2 i że KSR2 w wyjątkowy sposób przyczynia się do sygnalizacji ERK za pośrednictwem Ca2+. Kalcyneuryna defosforyluje KSR2 w określonych miejscach w odpowiedzi na sygnały Ca2+, tym samym regulując lokalizację i aktywność KSR2. Co więcej, stwierdziliśmy, że pozbawienie endogennego KSR2 upośledza aktywację ERK za pośrednictwem Ca2 + i sygnalizację zależną od ERK w komórkach beta trzustki INS1 i komórkach neuroblastoma NG108. Te odkrycia identyfikują KSR2 jako regulowane przez Ca2+ rusztowanie ERK i ujawniają nowy mechanizm, w którym Ca2+ wpływa na sygnalizację szlaku Ras do ERK. --- Nrf2 odgrywa kluczową rolę w regulacji komórkowego stresu oksydacyjnego. Wykazano, że aktywacja MEK-ERK jest jedną z głównych ścieżek prowadzących do aktywację Nrf2 i indukcję dalszych celów Nrf2, w tym fazy II w odpowiedzi na stres oksydacyjny i ksenobiotyki. ksenobiotyki. W tym badaniu, IQGAP1 (IQ motif-containing GTPase-activating białko 1), nowy partner interakcji Nrf2, który opublikowaliśmy wcześniej, stwierdzono, że moduluje aktywację Nrf2 za pośrednictwem MEK-ERK i indukcję fazy II genów detoksykacyjnych/antyoksydacyjnych. Nrf2 wiąże się bezpośrednio z domeną IQ (aminokwasy 699-905) IQGAP1. Zablokowanie IQGAP1 znacząco osłabiło fenetyl izotiocyjanian lub aktywację szlaku MEK-ERK-Nrf2 za pośrednictwem MEK. Zablokowanie IQGAP1 osłabiło również zwiększoną stabilność Nrf2 za pośrednictwem MEK, co z kolei było związane ze zmniejszeniem translokacji jądrowej Nrf2 i spadkiem ekspresji genów detoksykujących/antyoksydacyjnych fazy II. Podsumowując, wyniki te sugerują, że IQGAP1 może odgrywać ważną rolę w szlaku sygnałowym MEK-ERK-Nrf2. --- Chociaż mechanizmy leżące u podstaw neurodegeneracji prążkowia są słabo neurodegeneracji prążkowia są słabo poznane, wykazaliśmy, że patogeneza prążkowia może być inicjowana przez wysokie synaptyczne poziomy zewnątrzkomórkowej dopaminy (DA). Tutaj zbadaliśmy w szczurzych pierwotnych neuronach prążkowia mobilizację białka aktywowanego mitogenem kinazy (MAPK) po leczeniu DA. Zamiast obserwować podwyższenie archetypowych procytotoksycznych MAPK, p-JNK i p-p38 MAPK, stwierdziliśmy, że odkryliśmy, że DA, działając poprzez receptory D1 DA, indukowała trwałą stymulację fosforylowanej formy kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (p-ERK) poprzez szlak cAMP/kinazy białkowej A (PKA)/Rap1/B-Raf/kinazy MAPK/ERK (MEK). Blokada receptorów D2 DA, receptorów beta-adrenergicznych lub receptorów N-metylo-D-asparaginianu z antagonistami specyficznymi dla receptora nie miała znaczącego wpływu na ten proces. proces. Aktywacja receptorów D1 DA i PKA przez DA spowodowała fosforylację i fosforylację i inaktywację fosfatazy tyrozynowej wzbogaconej w prążkowiu, ważnej fosfataza do defosforylacji i późniejszej inaktywacji p-ERK w prążkowiu. prążkowiu. Co ciekawe, p-ERK był przede wszystkim zatrzymywany w cytoplazmie, z tylko niewielkie ilości zostały przeniesione do jądra. Białko rusztowania beta-arrestin2 oddziaływało zarówno z p-ERK, jak i receptorem D1 DA, wyzwalając cytozolową retencję p-ERK i indukując apoptotyczną śmierć neuronów prążkowia. Dane te zapewniają unikalny wgląd w nową rolę p-ERK w neurodegeneracji prążkowia. neurodegeneracji. --- Kinazy receptorowe sprzężone z białkiem G (GRK) są najbardziej znane ze swojej roli w fosforylacji i desensytyzacji receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). fosforylacji i desensytyzacji receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). Kinazy GRK regulują również sygnalizację za innymi rodzinami receptorów i mają szereg niereceptorowych substratów i partnerów wiążących. Tutaj identyfikujemy RhoAGTP i Raf1 jako nowych partnerów wiążących GRK2 i zgłaszamy wcześniej nieoczekiwaną funkcję tej kinazy. funkcję dla tej kinazy. GRK2 jest efektorem RhoA, który służy jako aktywowane przez RhoA białko rusztowania dla kaskady kinazy ERK MAP. Zdolność GRK2 do wiązania się z Raf1, MEK1 i ERK2 zależy od wiązania RhoAGTP z domeną katalityczną domeny katalitycznej kinazy. Wcześniej wykazano, że egzogenna GRK2 zwiększają aktywację ERK za receptorem naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR). Tutaj odkrywamy, że aktywacja ERK za pośrednictwem GRK2 za EGFR jest Rho-zależne i że leczenie EGF promuje wiązanie RhoAGTP i ERK przez GRK2. Pozbawienie ekspresji GRK2 przez RNAi ujawnia, że GRK2 jest wymagane do indukowanej przez EGF, zależnej od Rho i ERK inkorporacji tymidyny w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC). Dlatego też postawiliśmy hipotezę, że Zależne od Rho rusztowanie ERK MAPK przez GRK2 za EGFR może mieć ważną rolę w układzie naczyniowym, gdzie zwiększone poziomy zarówno GRK2, jak i RhoA są związane z nadciśnieniem tętniczym.
Lista białek rusztowania szlaku sygnałowego ERK.
Pierwotnie zidentyfikowane w drożdżach, białka rusztowania są obecnie uznawane za przyczyniające się do specyficzności szlaków MEK/ERK w komórkach ssaków. Rusztowania te obejmują kinazę supresorową Ras (KSR), beta-arrestynę, partnera MEK-1 (MP-1), Sef i białko aktywujące GTPazę 1 zawierające motyw IQ (IQGAP1). Homolog ludzkiego dużego dysku (hDlg) działa jako białko rusztowania specyficzne dla MEK2 dla szlaku sygnałowego ERK. Dwa białka rusztowania, kaweolina-1 i IQGAP1, są wymagane do fosforylacji związanej z aktyną puli kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym 1 i 2 (ERK1/2). Kilka izotypów 14-3-3 wiąże się z kinazą białkową C (PKC)-zeta i ułatwia sprzęganie PKC-zeta z Raf-1, co wzmacnia szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (ERK).