Prawidłowa klasyfikacja pacjentów z rakiem na podtypy jest warunkiem wstępnym dla szybkiej diagnozy i skutecznego leczenia. Obecnie klasyfikacja ta opiera się głównie na ocenie histologicznej, ale analiza ekspresji genów za pomocą mikromacierzy okazała się bardzo obiecująca. Tutaj pokazujemy, że wysoka dokładność, ilościowa proteomika może solidnie segregować podtypy raka bezpośrednio na poziomie wyrażonych białek. wyrażonych białek. Zbadaliśmy dwa histologicznie nierozróżnialne histologicznie nierozróżnialne podtypy chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL): aktywowane komórki B (ABC) i podtypy podobne do komórek B ośrodka zarodkowego (GCB), poprzez pierwsze opracowanie ogólnego chłoniaka stabilnego znakowania izotopowego aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) mieszanki z linii komórkowych znakowanych ciężkimi stabilnymi izotopami. Ta mieszanka super-SILAC została połączona z lizatami komórkowymi z pięciu linii komórkowych ABC-DLBCL i pięciu GCB-DLBCL. Analiza proteomiczna analiza proteomiczna na liniowym spektrometrze mas z pułapką jonową Orbitrap z wysoką dokładnością dokładnością mas na poziomach MS i MS/MS dała proteom zawierający ponad 7500 zidentyfikowanych białek. zidentyfikowanych białek. Wysoka dokładność kwantyfikacji pozwoliła na podtypów za pomocą analizy składowych głównych. Głównymi czynnikami przyczyniającymi się do klasyfikacji były białka, o których wiadomo, że ulegają różnej ekspresji pomiędzy między podtypami, takie jak czynniki transkrypcyjne IRF4 i SPI1/PU.1, markery powierzchni komórki markery powierzchni komórek CD44 i CD27, a także nowi kandydaci. Wyodrębniliśmy sygnaturę 55 białek, które segregowały podtypy i zawierały białka związane z funkcjonalnymi różnicami między funkcjonalnymi różnicami między podtypami ABC i GCB-DLBCL, w tym wieloma genów regulowanych przez NF-κB. Skrócenie czasu analizy do analizy pojedynczego strzału w połączeniu z wykorzystaniem nowego liniowego analizatora kwadrupolowego Orbitrap (Q Exactive) również wyraźnie rozróżniało podtypy. Wyniki te pokazują, że proteomika rozdzielczość proteomiki shotgun w połączeniu z kwantyfikacją opartą na super-SILAC jest obiecującą nową technologią do charakterystyki i klasyfikacji nowotworów. --- Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) jest coraz częściej stosowana w formacie ilościowym. w formacie ilościowym, często w oparciu o znakowanie próbek stabilnymi izotopami które są wprowadzane chemicznie lub metabolicznie. W stabilnym znakowaniu izotopowym przez aminokwasy w hodowli komórkowej (SILAC), dwie populacje komórek są hodowane w obecności ciężkich lub lekkich aminokwasów (zazwyczaj lizyny i/lub argininy), jedna z nich jest poddawana perturbacjom, a następnie obie są łączone i przetwarzane razem. W tym badaniu opisujemy inne podejście podejście - wykorzystanie SILAC jako standardu wewnętrznego lub "spike-in" - w którym SILAC jest używany tylko do produkcji ciężkich znakowanych białek referencyjnych lub proteomów. Są one dodawane do badanych proteomów po lizie komórek i przed trawieniem białek. trawieniem białek. Rzeczywisty eksperyment jest zatem całkowicie oddzielony od procedury znakowania. od procedury znakowania. Spike-in SILAC jest bardzo ekonomiczny, solidny i zasadniczo ma zastosowanie do wszystkich analiz proteomicznych opartych na komórkach lub tkankach. Zakres zastosowań od bezwzględnej kwantyfikacji pojedynczych białek do kwantyfikacji całych proteomów. proteomów. Spike-in SILAC jest szczególnie korzystny podczas analizy proteomów proteomów całych tkanek lub organizmów. Protokół opisuje ilościową próbki tkanki w odniesieniu do super-SILAC spike-in, mieszaniny pięciu linii komórkowych znakowanych SILAC. SILAC, która dokładnie reprezentuje tkankę. Obejmuje on wybór i przygotowanie standardu spike-in SILAC, procedurę przygotowania próbki oraz analizę i ocenę wyników. oraz analizę i ocenę wyników. --- Rozwój przerzutów jest złożonym, wieloetapowym procesem, który pozostaje słabo zdefiniowany. słabo zdefiniowany. Aby zidentyfikować białka zaangażowane w fazę kolonizacji procesu przerzutów, porównaliśmy proteom guzów pochodzących z inokulacji panelu izogenicznych ludzkich linii komórkowych raka o różnych zdolnościach przerzutowych przerzutowych do gruczołu sutkowego myszy z niedoborem odporności. Używając białka wygenerowanego przez znakowanie SILAC, zidentyfikowano łącznie 675 białek a 30 z nich uległo różnej ekspresji między co najmniej dwoma guzami. Standard Standard białkowy zawierał proteomy siedmiu linii komórkowych z wielu histogenicznych i wykazywał lepsze cechy w porównaniu do standardowego super-SILAC. Ekspresja niektórych białek korelowała z przerzutami przerzutami, takich jak miozyna-9 (niemięśniowa miozyna II A) i dehydrogenaza L-mleczanowa dehydrogenaza A, podczas gdy ekspresja czynnika elongacji tu korelowała odwrotnie odwrotnie do zdolności przerzutowych. Ekspresja tych białek została biochemicznie, a ekspresję miozyny-9 w próbkach klinicznych raka piersi wykazano, że jest ona zmieniona w guzach pierwotnych w porównaniu z odpowiadającymi im przerzutami do węzłów chłonnych. przerzuty do węzłów chłonnych. Nasze badanie demonstruje ulepszoną strategię ilościowego porównania nieograniczonej liczby tkanek nowotworowych i zapewnia wgląd w kluczowe białka związane z fazą kolonizacji tworzenia przerzutów. tworzenia przerzutów. --- Opisujemy metodę dokładnej kwantyfikacji proteomów ludzkich nowotworów poprzez połączenie mieszaniny pięciu stabilnych izotopów znakowanych aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) z ludzką tkanką nowotworową. Wygenerowało to setki setki tysięcy izotopowo znakowanych peptydów w odpowiednich ilościach, aby służyć jako wewnętrznych standardów dla analizy opartej na spektrometrii mas. Poprzez oddzielenie znakowania od pomiaru, ta metoda super-SILAC poszerza zakres proteomiki opartej na SILAC. proteomiki opartej na SILAC. --- Komórki wydzielają dużą liczbę białek, aby komunikować się z otoczeniem. Ponadto, białka błony plazmatycznej i białka wewnątrzkomórkowe mogą być uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poprzez regulowane lub nieregulowane procesy. Tutaj profilowaliśmy supernatant 11 linii komórkowych, które są reprezentatywne dla różnych etapy rozwoju raka piersi poprzez specyficzne wychwytywanie peptydów N-glikozylowanych peptydów przy użyciu technologii N-glyco FASP. Dla dokładnej kwantyfikacji opracowaliśmy mieszaninę super-SILAC z kilku znakowanych linii komórkowych raka piersi i wykorzystaliśmy jako wzorzec wewnętrzny dla wszystkich próbek. W sumie, 1398 unikalnych miejsc N-glikozylacji zostało zidentyfikowanych i oznaczonych ilościowo. Wzbogacanie dla N-glikozylowanych peptydów skoncentrowało analizę na klasycznie wydzielanych i białkach błonowych. Profile N-glikozylowanych peptydów sekrecyjnych prawidłowo grupowały różne linie komórkowe do odpowiedniego stadium raka, co sugeruje, że wykryto wykryto istotne biologicznie różnice. Pięć różnych profili wykryto pięć różnych profili dynamiki glikoprotein podczas rozwoju raka, które zawierały kilka białek o znanej roli w raku piersi. Następnie użyliśmy super-SILAC w osoczu, co doprowadziło do ilościowego oznaczenia dużej liczby wcześniej zidentyfikowanych N-glikopeptydów w tym ważnym płynie ustrojowym. Połączenie Połączenie kwantyfikacji sekretomu linii komórek nowotworowych i ludzkiego osocza osocza z podejściem super-SILAC wydaje się być obiecującym nowym podejściem do znalezienia markerów choroby.
Super-SILAC to metoda stosowana w proteomice ilościowej. Co to jest mieszanka super-SILAC?
(SILAC: stabilne znakowanie izotopowe aminokwasami w hodowli komórkowej)
Mieszanka Super-SILAC składa się z kombinacji wielu linii komórkowych znakowanych SILAC.