Geny apoptozy, takie jak TP53 i p16/CDKN2A, które pośredniczą w odpowiedzi na cytotoksyczną chemioterapię cytotoksyczną chemioterapię, są często niefunkcjonalne w czerniaku. Różnicowanie może być alternatywą dla apoptozy w indukowaniu wyjścia z cyklu komórkowego czerniaka. cyklu komórkowego czerniaka. Mechanizmy epigenetyczne regulują różnicowanie, a zmiany metylacji DNA są związane z nieprawidłowym różnicowaniem komórek czerniaka. Wpływ analogu deoksycytydyny - decytabiny (5-aza-2'-deoksycytydyny), który wyczerpuje metylotransferazę DNA 1 (DNMT1), na różnicowanie czerniaka zostały zbadane. Leczenie ludzkich i mysich komórek czerniaka in vitro za pomocą stężeniami decytabiny, które nie powodowały apoptozy, hamowało proliferację, której towarzyszyło różnicowanie komórkowe. Zmniejszenie metylacji promotora metylacji i wzrost ekspresji sterownika późnego różnicowania melanocytów SOX9, po którym następował wzrost inhibitorów kinazy zależnej od cyklin (CDKN) p27/CDKN1B i p21/CDKN1A, które pośredniczą w wyjściu z cyklu komórkowego przy różnicowaniem. Efekty były niezależne od TP53, p16/CDKN2A, a także statusu BRAF komórek czerniaka. Zaobserwowana oporność miała charakter farmakologiczny, charakteryzowała się zmniejszoną zdolnością decytabiny do usuwania DNMT1. Leczenie mysich modeli czerniaka in vivo z przerywaną, niską dawką decytabiny, podawaną podskórnie w celu ograniczenia wysokich szczytowych poziomów leku, które powodują cytotoksyczność i wydłużenie czasu ekspozycji na zubożenie DNMT1 oraz z tetrahydrourydyną w celu zmniejszenia metabolizmu decytabiny i dalszego zwiększenia czas ekspozycji, hamowały wzrost guza i zwiększały molekularne i zrębu guza czynników związanych z różnicowaniem melanocytów. Modyfikacja dawki dawki, harmonogramu i składu w celu różnicowania, a nie cytotoksycznego hamuje wzrost komórek czerniaka in vitro i in vivo. --- Opracowano test w czasie rzeczywistym dla aktywności metylotransferazy cytozyny-C5 specyficznej dla CpG. został opracowany. W teście zastosowano oligonukleotyd typu "break light", w którym metylacja niemetylowanego miejsca 5'-CG-3' jest enzymatycznie sprzężona z rozwojem sygnału fluorescencyjnego. rozwój sygnału fluorescencyjnego. Ten czuły test może mierzyć szybkość metylacji DNA do 0,34 +/- 0,06 fmol/s. Test jest powtarzalny, ze współczynnikiem zmienności współczynnik zmienności w sześciu niezależnych pomiarach wynosi 4,5%. Stężenie produktu zostało dokładnie zmierzone na podstawie sygnałów fluorescencji przy użyciu liniowej krzywej kalibracyjnej. krzywej kalibracyjnej, która osiągnęła dobroć dopasowania (R(2)) powyżej 0,98. Podłoże substrat oligonukleotydowy zawiera trzy C5-metylowane reszty cytozyny i jedną niemetylowane miejsce 5'-CG-3'. Metylacja daje oligonukleotyd zawierający optymalny substrat dla enzymu restrykcyjnego GlaI. Rozszczepienie w pełni metylowanego oligonukleotydu prowadzi do oddzielenia fluoroforu od wygaszacza, dając proporcjonalny wzrost fluorescencji. Metoda ta została wykorzystana do testowania aktywności DNMT1, głównej metylotransferazy konserwującej w ludzkich komórkach komórkach ludzkich oraz do kinetycznej charakterystyki bakteryjnej metylotransferazy cytozyny-C5 bakteryjnej metylotransferazy cytozyny-C5 M.SssI. Wykazano, że test jest odpowiedni do monitorowania aktywności DNMT1 w czasie rzeczywistym w formacie o wysokiej przepustowości, z niskim sygnał tła i zdolność do uzyskania liniowych szybkości metylacji w długich okresach, co czyni go obiecującą metodą wysokoprzepustowego badania przesiewowego dla inhibitorów. --- Inhibitory metylotransferazy DNA (DNMTI), w tym decytabina (DAC) i azacytydyna (AZA), zostały ostatnio wyróżnione w leczeniu zespołu mielodysplastycznego wysokiego ryzyka (MDS). zespół mielodysplastyczny (MDS); jednak mechanizmy ich działania nie zostały jasno określone. jasno zdefiniowane. Dlatego zbadaliśmy wpływ DNMTI na linie komórkowe pochodzące z MDS linie komórkowe in vitro. Wykorzystano linię komórkową MDS MDS92 i jej podlinię blastyczną MDS-L i HL-60. Wszystkie trzy linie komórkowe były wrażliwe na DNMTI, ale MDS-L była najbardziej wrażliwa. Śmierć komórek wywołana przez DAC w MDS-L była poprzedzona przez G2 poprzez szlak niezależny od p53. AZA nie wpływała na cykl komórkowy, chociaż indukowała odpowiedź na uszkodzenie DNA. IC(50) DAC lub AZA na komórkach MDS-L był związany z dawką indukującą maksymalną hipometylację w teście metylacji LINE-1 (ang. long interspersed nuclear elements-1). test metylacji. AZA tłumiła poziom metylacji w sposób zależny od czasu sposób (dni 4, 7 i 10), podczas gdy DAC utrzymywał poziom metylacji od od dnia 4 do 11. Ekspresja białek DNMT1 i DNMT3a zmniejszyła się wraz z supresją wzrostu i metylacji. supresją wzrostu i metylacji. Wnioskujemy, że badanie to dostarcza modeli in vitro do zrozumienia wpływu DNMTI na wzrost komórek i regulację genów regulację genów, w tym różnice w możliwym mechanizmie działania DAC i AZA. --- Mechanizm hamowania (cytozyno-5-)-metylotransferaz DNA przez inhibitor 5-azacytozynę przez inhibitor 5-azacytozynę pozostawał niejasny, głównie z powodu niedostępność substratu, w którym inhibitor, ale nie normalna cytozyna, jest obecna w miejscu docelowym. Zsyntetyzowaliśmy dupleks oligonukleotydowy oligonukleotydowy zawierający pojedyncze miejsce docelowe dla metylotransferazy EcoRII, w którym w którym zasadą docelową jest 5-azacytozyna. Substrat ten tworzył stabilny kowalencyjny kompleks z metylotransferazą kompleks z metylotransferazą EcoRII pod nieobecność i w obecności kofaktora kofaktora S-adenozylometioniny. Kompleks utworzony w obecności kofaktora kofaktora był odporny na SDS i umiarkowaną obróbkę cieplną, a grupa metylowa została włączona do kompleksu. Miareczkowanie enzymu i badania kinetyczne inhibicji hamowania sugerują, że przeniesienie metylu do kompleksu nastąpiło tylko podczas pierwszego obrotu reakcji. Wyniki te sugerują, że gdy enzym wiąże się z 5-azacytozyną w obecności kofaktora, grupa metylowa jest do pozycji N-5 zasady, powodując inaktywację enzymu. enzymu. --- Wzmacniacz pluripotencji: RSC133, nowa syntetyczna pochodna kwasu indoloakrylowego kwasu indoloakrylowego/indolopropionowego, wykazuje podwójną aktywność poprzez hamowanie deacetylazy histonowej i metylotransferazy DNA. deacetylazę i metylotransferazę DNA. Ponadto silnie poprawia przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego i wspomaga wzrost i utrzymanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). --- Włączenie reszt 5-azacytozyny do DNA powoduje silne hamowanie metylotransferaz metylotransferaz DNA (cytozyna-C5). Synteza oligodeoksyrybonukleotydów zawierających pojedyncze lub wielokrotne reszty 5-aza-2'-deoksycytydyny w precyzyjnych miejscach podjęto w celu wygenerowania szeregu sekwencji zawierających reaktywną zasadę 5-azacytydyny jako specyficzne miejsca docelowe dla enzymatycznej metylacji. Przygotowanie tych zmodyfikowanych oligonukleotydów wymaga użycia 2-(p-nitrofenylo)etyloksykarbonylu (NPEOC) do ochrony egzocyklicznych funkcji aminowych. funkcji aminowych. Grupy te są usuwane w łagodnych warunkach, unikając w ten sposób konwencjonalnych protokołów, które są szkodliwe dla integralności pierścienia pierścienia 5-azacytozyny. --- Gemcytabina jest wskazana w skojarzeniu z cisplatyną jako terapia pierwszego rzutu dla guzów litych, w tym niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC), raka pęcherza moczowego i międzybłoniaka. Gemcytabina jest analogiem pirymidyny cytozyny i działa jako antymetabolit. antymetabolit. Strukturalnie jednak gemcytabina ma podobieństwa do 5-aza-2-deoksycytydyny (decytabina/Dacogen®), inhibitora metylotransferazy DNA (DNMTi). Linie komórkowe NSCLC, międzybłoniaka i raka prostaty poddano działaniu dekitabiną i gemcytabiną. Reaktywacja epigenetycznie wyciszonych genów została badana metodą RT-PCR/qPCR. Aktywność metylotransferazy DNA w ekstraktach jądrowych i rekombinowanych białkach rekombinowanych białkach mierzono za pomocą testu metylotransferazy DNA, a zmiany w stanie metylacji DNA badano za pomocą specyficznej dla metylacji PCR (MS-PCR) i pirosekwencjonowania. Obserwujemy reaktywację kilku epigenetycznie wyciszonych genów, w tym GSTP1, IGFBP3 i RASSF1A. Gemcytabina funkcjonalnie hamowała aktywność metylotransferazy DNA zarówno w ekstraktach jądrowych i rekombinowanych białkach. Gemcytabina dramatycznie destabilizowała białko DNMT1. Jednak gemcytabina nie miała wpływu na metylację DNA CpG. Podsumowując Podsumowując, gemcytabina zarówno hamuje, jak i destabilizuje metylotransferazy DNA i reaktywuje epigenetycznie wyciszone geny o aktywności równoważnej do dekitabiny w stężeniach znacznie niższych niż te osiągane w leczeniu w leczeniu pacjentów z guzami litymi. Ta właściwość może przyczyniać się do aktywności przeciwnowotworowej gemcytabiny. --- Metylotransferazy DNA (DNMT) to rodzina enzymów, które metylują DNA w pozycji C5 reszt cytozyny. C5 reszt cytozyny, a ich hamowanie jest obiecującą strategią w leczeniu różnych chorób rozwojowych i proliferacyjnych. w leczeniu różnych chorób rozwojowych i proliferacyjnych, szczególnie nowotworów. W niniejszym badaniu model wiązania hydralazyny, z zatwierdzonym modelem homologicznym ludzkiej DNMT, został opracowany przy użyciu zautomatyzowanego dokowania molekularnego i symulacji dynamiki molekularnej. Protokół dokowania został zwalidowany poprzez przewidywanie sposobu wiązania 2'-deoksycytydyny, 5-azacytydyny i 5-aza-2'-deoksycytydyny. Aktywność hamująca hydralazyny wobec DNMT może być zracjonalizowana na poziomie molekularnym przez podobne interakcje w obrębie kieszeni wiążącej (np. przez podobny farmakofor), jak ustalone przez podobne do substratów analogi deoksycytydyny. Interakcje te obejmują złożoną sieć wiązań wodorowych z argininą i kwasem glutaminowym które również odgrywają główną rolę w mechanizmie metylacji DNA. Pomimo różnych rusztowań innych nienukleozydowych inhibitorów DNMT, takich jak prokaina i prokainamid, obecne prace modelowe ujawniają, że leki te wykazują podobne interakcje w miejscu wiązania DNMT1. Odkrycia te są cenne w prowadzeniu racjonalnego projektowania i wirtualnych badań przesiewowych nowych inhibitorów DNMT inhibitorów DNMT. --- Oparte na mechanizmach inhibitory enzymów, które naśladują reaktywne produkty pośrednie w szlaku reakcji reakcji, zostały szeroko wykorzystane w analizie szlaków metabolicznych i jako kandydaci na leki. szlaków metabolicznych i jako kandydaci na leki. Hamowanie metylotransferaz DNA specyficznych dla cytozyny[C5] metylotransferaz DNA (C5 MTases) przez oligodeoksynukleotydy zawierające oligodeoksynukleotydy zawierające 5-azadeoksycytydynę (AzadC) i 5-fluorodeoksycytydynę (FdC). dobrze udokumentowany przykład opartego na mechanizmie hamowania enzymów centralnych dla metabolizmu kwasów nukleinowych. Tutaj opisujemy interakcję między MTazą C5 z Haemophilus haemolyticus (M.HhaI) i dupleksem oligodeoksynukleotydowym zawierającym 2-H pirymidynon, analog często określany jako zebularina i o którym wiadomo, że tworzy kompleksy o wysokim powinowactwie z MTazami. Krystalografia rentgenowska wykazała tworzenie wiązania kowalencyjnego między M.HhaI i 2-H zawierającym pirymidynon oligodeoksynukleotydem. Ta obserwacja umożliwia porównanie mechanizmów działania 2-H pirymidynonu z innymi inhibitorami opartymi na mechanizmie inhibitorami opartymi na mechanizmach, takimi jak FdC. Ten nowy kompleks zapewnia molekularne molekularne wyjaśnienie mechanizmu działania leku przeciwnowotworowego zebulariny. --- 5-Azacytydyna hamuje syntezę DNA i w mniejszym stopniu syntezę RNA u S. antibioticus. Nie ma to wpływu na biosyntezę białek. Główny hamujący wpływ 5-azacytydyny na syntezę DNA i RNA jest prawdopodobnie spowodowany przez jej inkorporację do nowo zsyntetyzowanego DNA lub RNA i tworzenie kowalencyjnych kompleksów między metylotransferazami specyficznymi dla cytozyny a zmodyfikowanymi szablonami DNA lub RNA. DNA lub RNA. Aby przeanalizować, czy takie efekty mogą wystąpić w regionie oriC S. antibioticus przeanalizowaliśmy status metylacji tego regionu przy użyciu metody sekwencjonowania genomowego wspomaganego bisiarczynem. Jedna z reszt cytozyny częściowo metylowana była zawarta w unikalnej sekwencji NaeI (GCCGGC) w oriC. Późniejsza analiza wykazała, że chromosomalne DNA z S. antibioticus jest odporny na restrykcję R.NaeI, co wskazuje, że ten szczep zawiera specyficzną dla NaeI aktywność metylotransferazy cytozyny C5. Po traktowanie 5-azacytydyną miejsce NaeI w regionie oriC staje się częściowo demetylowane. Nasze wyniki sugerują, że niektóre z efektów 5-azacytydyny na syntezę DNA i RNA mogą być rzeczywiście związane z tworzeniem kompleksów i hamowaniem metylotransferazy DNA specyficznej dla cytozyny. --- Metylotransferaza DNA 1 (DNMT1) jest nowym celem w leczeniu raka, zaburzeń mózgu i innych chorób. Obecnie istnieje tylko kilka inhibitorów inhibitorów DNMT1 o potencjalnym zastosowaniu jako środki terapeutyczne lub narzędzia badawcze. narzędzi badawczych. Kwas 5,5-metylenodisalicylowy jest nowym rusztowaniem zidentyfikowanym wcześniej przez wirtualne badania przesiewowe z wykrywalną, choć słabą aktywnością hamującą DNMT1 w testach biochemicznych. W niniejszym raporcie opisujemy hamowanie enzymu przez strukturalnie strukturalnie pokrewnego związku, kwasu trimetyloaurynotrikarboksylowego (NSC97317), który wykazywał niskie mikromolarne hamowanie DNMT1 (IC(50) = 4,79 μM). Badania dokowania nowego inhibitora inhibitora z domeną katalityczną DNMT1 sugerują, że NSC97317 może wiązać się do miejsce katalityczne. Interakcje z resztami aminokwasowymi, które uczestniczą w mechanizmie metylacji DNA mechanizmie metylacji DNA przyczyniają się do rozpoznania wiązania. Ponadto Ponadto NSC97317 dobrze pasował do opartego na strukturze modelu farmakoforowego niedawno opracowanym dla inhibitorów DNMT1. Kwas trimetyloaurynotrikarboksylowy może być być cennym narzędziem biochemicznym do badania hamowania DNMT1 w raku i innych chorobach związanych z metylacją DNA. --- TŁO: Metylacja DNA wysp CpG w promotorach określonych genów może odgrywać rolę w inicjacji i progresji nowotworu. genów może odgrywać rolę w inicjacji i progresji nowotworu. Sugeruje się, że takie zdarzenia mogą służyć jako krytyczne punkty kontrolne. METODY: W niniejszym badaniu przeanalizowano stan metylacji wysp CpG w obrębie promotorów promotorów wydzielanych białek związanych z frizzled (SFRP) u 87 pacjentów z ostrą białaczką (AL), 20 zdrowych osób z grupy kontrolnej i czterech linii komórkowych AL. 5-aza-2'- deoksycytydyna (5-Aza-CdR), inhibitor metylacji DNA, została zastosowana do określić jego wpływ na ekspresję SFRP. WYNIKI: Metylację co najmniej jednego promotora SFRP zaobserwowano u 69% analizowanych pacjentów z AL analizowanych pacjentów. Ponadto, metylacja wszystkich czterech promotorów SFRP była zaobserwowano w komórkach Molt-4, Jurkat, HL60 i NB4. W komórkach Jurkat poziomy metylacji czterech promotorów SFRP zmniejszyły się w sposób zależny od dawki po leczeniu 5-Aza-CdR, co zbiegło się ze zwiększoną ekspresją mRNA. Przy zwiększenie stężenia 5-Aza-CdR, ekspresja metylotransferaz DNA, DNMT3A i DNMT3B, znacząco zmniejszyła się w sposób zależny od dawki. WNIOSEK: Niniejsze badanie wykazało, że metylacja genu SFRP może być zaangażowana w progresję AL, z możliwym mechanizmem epigenetycznym wpływającym na sygnalizację Wnt na sygnalizację Wnt. --- Nieprawidłowa metylacja DNA jest krytycznym procesem epigenetycznym zaangażowanym w ekspresję genów w komórkach nowotworowych. ekspresję genów w komórkach nowotworowych. Zróżnicowane inhibitory metylotransferazy DNA są obecnie badane jako potencjalne leki przeciwnowotworowe i istnieje zainteresowanie opracowaniem nowych i bardziej skutecznych DNMTI. Oceniliśmy zebularynę, stabilny i niskotoksyczny analog cytydyny analog cytydyny, wpływ na linie komórkowe ludzkiej białaczki promielocytowej, NB4 i KG1. Zebularina powodowała zależny od dawki i czasu wzrost komórek NB4 i KG1 hamowanie, nie indukowała różnicowania szpikowego, ale wywoływała apoptozę zależną od stężenia, objawiającą się rozszczepieniem prokaspazy-3 i PAR-1 i PAR-1 oraz występowanie wczesnej apoptozy wykrywanej przez jodek propidyny aneksyny-V jodkiem. Zebularine jednoczesne leczenie kwasem all-trans retinowym (RA) w dawce farmakologicznej dawce farmakologicznej (1 μM dla komórek NB4) i wyższej (3 μM dla komórek KG1) zwiększyło różnicowanie granulocytów w obu liniach komórkowych. Wstępne leczenie przez 24 lub 48 h z zebulariną przed leczeniem różnymi dawkami samego RA lub RA z inhibitorami deacetylazy histonów, fenylomaślanem i BML-210, spowodowało w znacznym przyspieszeniu i wzmocnieniu różnicowania i cyklu komórkowego zatrzymanie cyklu komórkowego w punkcie G0/1. Zebularina sama lub w sekwencyjnej kombinacji z RA zmniejszała ekspresję DNMT1, powodowała ekspresję DNMT1, powodowała szybką i zależną od czasu ekspresję pan-kadheryny oraz częściową demetylację E-kadheryny, ale nie supresora nowotworu p15. W przypadku stosowania w połączeniu z RA, zebularyna zwiększała ekspresję transkryptu obu genów i białka. Zebularina indukowała regionalną przebudowę chromatyny poprzez miejscową acetylację histonu H4 i metylację histonów H3-K4 w miejscach promotorowych metylowanej E-kadheryny, a także w promotorze niezmetylowanego p21, o czym świadczy test immunoprecypitacji chromatyny. Nasze wyniki rozszerzają spektrum działania działania zebularyny i ocenę jej użyteczności w terapii ostrej białaczki szpikowej opartej na epigenetyce. opartej na epigenetyce. --- Zebularine jest nowym silnym inhibitorem zarówno deaminazy cytydyny, jak i metylacji DNA metylacji. Zbadaliśmy wpływ zebulariny na wzrost guza sutka u myszy transgenicznych genetycznie zmodyfikowanych myszach transgenicznych MMTV-PyMT, u których rozwijają się guzy sutka w wieku 60 dniu życia ze 100% penetracją. Myszy transgeniczne MMTV-PyMT były randomizowane w wieku 46 dni do grupy kontrolnej (n = 25) i grupy leczonej zebularyną (n = 25) i monitorowano pod kątem parametrów wzrostu guza. Zebularyna była podawana w dawce 5 mg/ml w wodzie pitnej. Zaobserwowaliśmy znaczne opóźnienie wzrostu guzów sutka u myszy leczonych zebularyną ze statystycznie istotne zmniejszenie (P = 0,0135) całkowitego obciążenia guzem w wieku 94 dni, kiedy myszy zostały uśmiercone. Po 48 dniach leczenia zebularyną guzy były głównie martwicze w porównaniu ze zwierzętami nieleczonymi. Ponadto, wysoki wskaźnik wskaźnik apoptotyczny w teście znakowania nicią dUTP, w którym pośredniczyła terminalna deoksynukleotydylotransferaza zaobserwowano już 13 dni po leczeniu. Analiza immunoblot analiza wykazała zubożenie DNMT1 i częściowe zubożenie DNMT3b po leczeniu zebulariną. Analizy mikromacierzy globalnej ekspresji genów zidentyfikowały w górę dwunastu genów regulowanych metylacją, a także zestaw genów kandydujących genów nowotworowych, które uczestniczą we wzroście komórek i apoptozie. Podsumowując, zebularyna hamuje wzrost spontanicznych guzów sutka i powoduje wczesne początek martwicy i apoptozy komórek nowotworowych w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu raka piersi. modelu raka piersi. Zdefiniowanie parametrów hamowania nowotworu za pośrednictwem zebularyny może w przyszłości przyczynić się do rozwoju inhibitorów metylotransferazy DNA jako skutecznych leków przeciwnowotworowych. jako skutecznej terapii przeciwnowotworowej. --- Nieprawidłowa metylacja cytozyny w regionach promotorowych prowadzi do wyciszenia genów związanego z progresją raka. Szereg inhibitorów metylotransferazy DNA są znane z reaktywacji wyciszonych genów; w tym 5-azacytydyna i rybozyd 2-(1H)-pirymidynonu (zebularyna). Zebularina jest bardziej stabilnym, mniej cytotoksycznym inhibitorem w porównaniu do 5-azacytydyny. Aby określić mechanistyczne mechanistyczną dla tej różnicy, przeprowadziliśmy szczegółowe porównanie interakcji między oczyszczonymi metylotransferazami DNA i oligodeoksyrybonukleotydami (ODN) zawierającymi 5-azacytydynę lub 2-(1H)-pirymidynon w miejsce cytozyny przeznaczonej do metylacji. Kiedy włączone do małych ODN, szybkość hamowania metylotransferazy DNA C5 przez oba nukleozydy są zasadniczo identyczne. Jednakże, stabilność i i odwracalność kompleksu enzymatycznego w nieobecności i obecności kofaktora różni się. ODN 5-azacytozyny tworzą kompleksy z metylotransferazami DNA C5, które są nieodwracalne, gdy pierścień 5-azacytozyny jest nienaruszony. ODN zawierające 2-(1H)-pirymidynon w enzymatycznym miejscu docelowym są konkurencyjnymi inhibitorami zarówno prokariotycznych, jak i ssaczych metylotransferaz DNA C5. Ustaliliśmy, że trójskładnikowe kompleksy między enzymami, inhibitorem 2-(1H)-pirymidynonu i kofaktorem kofaktorem S-adenozylometioniną są utrzymywane poprzez tworzenie odwracalnej interakcji kowalencyjnej. Różna stabilność i odwracalność wiązań kowalencyjnych mogą częściowo wyjaśniać obserwowane różnice w cytotoksyczności cytotoksyczności między inhibitorami zebularyny i 5-azacytydyny. --- Metylotransferazy DNA (DNMT) są odpowiedzialne za metylację DNA, epigenetyczną modyfikację epigenetyczną modyfikację zaangażowaną w regulację genów. Rodziny koniugatów prokainamidu, inhibitora DNMT1, zostały opracowane i wyprodukowane za pomocą szybkich syntetycznych. Sześć związków okazało się silnymi inhibitorami mysiej katalitycznego kompleksu Dnmt3A/3L i ludzkiego DNMT1, co najmniej 50 razy większe niż związków macierzystych. Inhibitory wykazywały selektywność wobec metylotransferaz C5 DNA metylotransferaz DNA. Cytotoksyczność inhibitorów została potwierdzona na dwóch liniach komórek nowotworowych liniach komórek nowotworowych (DU145 i HCT116) i skorelowano z siłą hamowania DNMT. DNMT. Siła hamowania prokainamidu sprzężonego z ftalimidem poprzez łączniki alkilowe zależała od długości łącznika; łącznik dodekanowy był najlepszy. --- Obecność reszt 5-azacytozyny (ZCyt) w DNA prowadzi do silnego hamowania metylotranferaz DNA (cytozyna-C5) (C5-MTases) in vivo i in vitro. Enzymatyczna metylacja cytozyny w DNA ssaków jest modyfikacją epigenetyczną. która może zmieniać aktywność genów i stabilność chromosomalną, wpływając zarówno na różnicowanie i nowotworzenie. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć krytyczne mechanistyczne determinanty hamującego działania ZCyt. Chociaż kilka DNA C5-MTazy ulegają zasadniczo nieodwracalnemu wiązaniu z ZCyt w DNA. ZCyt w DNA, istnieje niewielka zgoda co do roli AdoMet i / lub transferu metylu w stabilizowaniu interakcji enzymu z ZCyt. Nasze wyniki pokazują że tworzenie stabilnych kompleksów między metylotransferazą HhaI (M.HhaI) i oligodeoksyrybonukleotydami zawierającymi ZCyt w pozycji docelowej dla metylacji (ZCyt-ODNs) występuje zarówno w nieobecności, jak i obecności kofaktorów, AdoMet i AdoHcy. Zarówno kompleksy binarne, jak i trójskładnikowe przeżywają SDS-PAGE w warunkach redukujących warunkach i przyjmują zwartą konformację, która zwiększa ich ruchliwość elektroforetyczną w porównaniu do wolnej M.HhaI. Ponieważ transfer metylu może zachodzić tylko w obecności AdoMet, wyniki te sugerują (1), że zdolność hamująca zdolność hamująca ZCyt w DNA opiera się na jego zdolności do indukowania stabilnego, ściśle zamkniętej konformacji M.HhaI, która zapobiega uwalnianiu DNA i kofaktora oraz (2) że metylacja ZCyt w DNA nie jest wymagana do hamowania M.HhaI. --- 4'-Thio-2'-deoksycytydyna została zsyntetyzowana jako 5'-chroniony fosforoamidyt kompatybilny z syntezą DNA w fazie stałej. Po włączeniu jako cel cytozyny (C*) w sekwencji rozpoznawania GC*GC dla metylotransferazy DNA M. HhaI, transfer metylu był silnie hamowany. W przeciwieństwie do tego, te same oligonukleotydy były normalnymi substratami dla pokrewnej endonukleazy restrykcyjnej R. HhaI i jej izoschizomeru R. Hin P1I. M. HhaI była w stanie wiązać zarówno 4'-tio-modyfikowane DNA i niezmodyfikowane DNA do równoważnych zakresów w warunkach równowagi warunkach równowagi. Jednak obecność 4'-tio-2'-deoksycytydyny zmniejszała okres półtrwania kompleksu o okres półtrwania kompleksu o >10 razy. Struktura krystaliczna trójskładnikowego kompleksu M. HhaI, AdoMet i DNA zawierającego 4'-tio-2'-deoksycytydynę została rozwiązana w rozdzielczości 2,05 A z krystalograficznym współczynnikiem R równym 0,186 i R-free równym 0,231. Struktura nie różni się znacząco od wcześniej rozwiązanych kompleksów trójskładnikowych zawierających M. HhaI, DNA i AdoHcy. Różnica gęstości elektronowej sugeruje częściową metylację przy C5 odwróconego celu 4'-tio-2'-deoksycytydyny. Hamujący hamujący wpływ 4'atomu siarki na aktywność enzymatyczną można przypisać zakłócenie etapu w reakcji metylacji po związaniu DNA, ale przed do przeniesienia metylu. Ten efekt hamujący można częściowo przezwyciężyć po znacznie długim czasie w środowisku krystalicznym, gdzie upakowanie zapobiega dysocjacji kompleksu, a cel jest dokładnie umieszczony w miejscu aktywnym. miejscu. --- Inhibitory deacetylazy histonowej (HDACi) są obiecującymi lekami przeciwnowotworowymi działającymi poprzez reaktywację wyciszonych genów supresorowych nowotworów. Kilka HDACi jest obecnie obecnie w badaniach klinicznych zarówno w nowotworach hematologicznych, jak i tkanek litych. nowotworów złośliwych. Odnotowano kooperacyjne działanie HDACi i inhibitorów metylacji DNA (DNMTi) i inhibitorów metylacji DNA (DNMTi), co czyni leczenie skojarzone atrakcyjnym wyborem w terapii nowotworów. terapii. Istnieją pewne dowody na to, że synergistyczne działanie HDACi i DNMTi jest osiąga się poprzez ich działanie na wspólne cele, w tym metylotransferazę DNA 1 (DNMT1). Aby dokładniej przeanalizować tę interakcję, zbadaliśmy wpływ HDACi trichostatyny A na globalną i specyficzną dla genu metylację DNA i zastosowaliśmy metody o czułości pojedynczej cząsteczki, konfokalną laserową mikroskopię skaningową z detektorami fotodiod lawinowych (obrazowanie APD) i spektroskopią korelacji fluorescencji (FCS), spektroskopią spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS), aby zbadać jego wpływ na dynamikę jądrową DNMT1 w żywych komórkach. komórkach. Nasze dane pokazują, że leczenie trichostatyną A zmniejsza globalną metylację DNA metylację DNA i poziom białka DNMT1 oraz zmienia dynamikę jądrową DNMT1 i interakcje z chromatyną. Mechanizmy leżące u podstaw tych efektów są najwyraźniej różnią się od mechanizmów działania inhibitora DNMT 5-azacytydyny. Nasze badanie rzuca światło na mechanizmy molekularne leżące u podstaw synergistyczne działanie HDACi i DNMTi, a także może pomóc w zdefiniowaniu ulepszonych polityki leczenia raka.
Jakie są inhibitory (cytozyno-5-)-metylotransferaz DNA?
Metylotransferazy DNA (cytozyno-5-)- są rodziną enzymów, które metylują DNA w pozycji C5 reszt cytozyny. Biorąc pod uwagę, że metylacja promotorów genów supresorowych nowotworów prowadzi do kancerogenezy, hamowanie metylotransferaz DNA (cytozyno-5-)jest obiecującą strategią leczenia raka. Istnieje kilka inhibitorów (cytozyno-5-)-metylotransferaz DNA, które wykorzystują różne sposoby działania: 5-azacytydyna (5-aza-CR, Vidaza®), 5-azadeoksycytydyna (5-aza-CdR, decytabina, Dacogen®), 5-azacytydyna (ZCyt), 5-fluorodeoksycytydyna (FdC), 5,6-dihydro-5-azacytydyna (DZCyt), 4'-tio-2'-deoksycytydyna, hydralazyna, rybozyd 2-(1H)-pirymidynonu (zebularyna), 2-(1H)-pirymidynon (aglikon zebularyny), prokaina, prokainamid, psammaplina A i RSC133, nowa syntetyczna pochodna kwasu indoloakrylowego/indolopropionowego.