CEL: Leczenie padaczki u dzieci jest szczególnie trudne, gdy napady są oporne na leki przeciwpadaczkowe lub podlegają wielu zmianom w typ napadów w czasie lub mają współistniejące deficyty poznawcze, behawioralne lub ruchowe. deficyty poznawcze, behawioralne lub motoryczne. Pomimo wysiłków zmierzających do sklasyfikowania takich padaczek na podstawie kryteriów klinicznych i klinicznych i elektroencefalograficznych, wiele dzieci nigdy nie otrzymuje ostatecznej diagnozy ostatecznej diagnozy etiologicznej. Sekwencjonowanie całego egzomu (WES) okazuje się być wysoce skuteczną metodą skuteczną metodą identyfikacji wariantów de novo, które powodują zaburzenia zaburzenia neurologiczne, zwłaszcza te związane z nieprawidłowym rozwojem mózgu. Poniżej badamy użyteczność WES do identyfikacji kandydujących wariantów przyczynowych de novo w kohorcie dzieci z heterogennymi sporadycznymi padaczkami bez diagnozy etiologicznej. etiologicznych. METODY: Przeprowadziliśmy WES (średnie pokrycie około 40×) na 10 trio składających się z niezmienionych rodziców i dziecka z sporadyczną padaczką charakteryzującą się trudnymi do kontrolowania napadami i pewną kombinacją opóźnienia rozwojowego, encefalopatii padaczkowej, cech autystycznych, zaburzeń poznawczych lub deficytów ruchowych. deficytów motorycznych. Przetwarzanie sekwencji i wywoływanie wariantów przeprowadzono przy użyciu standardowych narzędzi bioinformatycznych. narzędzi bioinformatycznych. Niestandardowy system filtrowania został wykorzystany do priorytetyzacji wariantów de novo o możliwym znaczeniu funkcjonalnym do walidacji przez sekwencjonowanie Sangera. Sangera. KLUCZOWE WYNIKI: U 9 z 10 probantów zidentyfikowaliśmy jeden lub więcej wariantów de novo. które zgodnie z przewidywaniami mogą zmienić funkcję białka, w sumie 15. Czterech pacjentów miało mutacje de mutacje de novo w genach, w których wcześniej wykazano występowanie mutacji heterozygotycznych u pacjentów z ciężkimi padaczkami o wczesnym początku (dwie w SCN1A i po jednej w CDKL5 i EEF1A2). U trojga dzieci warianty de novo znajdowały się w genach o funkcjonalne role, które są prawdopodobnie istotne dla padaczki (KCNH5, CLCN4 i ARHGEF15). Wariant w KCNH5 zmienia jedną z wysoce konserwowanych reszt argininy w czujniku napięcia kodowanego kanału potasowego bramkowanego napięciem. Analizy in vitro z wykorzystaniem testów komórkowych wykazały, że mutacja CLCN4 znacznie upośledza transport jonów przez wymiennik ClC-4 2Cl(-) /H(+) i że mutacja w ARHGEF15 mutacja w ARHGEF15 zmniejszyła aktywność wymiany GEF produktu genu, Ephexin5, o około 50%. Co ciekawe, u wszystkich tych siedmiu probantów napady w ciągu pierwszych 6 miesięcy życia, a u sześciu z nich napady były nieuleczalne. napady. ZNACZENIE: Stwierdzenie, że 7 z 10 dzieci było nosicielami mutacji de novo w genach genach o znanym lub prawdopodobnym znaczeniu klinicznym dla pobudliwości neuronów sugeruje, że WES będzie przydatna w molekularnej diagnostyce genetycznej sporadycznych padaczek u dzieci, zwłaszcza padaczek u dzieci, zwłaszcza gdy napady mają wczesny początek i są trudne do trudne do kontrolowania. --- Zespół Ushera (USH) jest klinicznie i genetycznie heterogennym zaburzeniem charakteryzującym się upośledzeniem wzroku i słuchu. Klinicznie jest on podzielony na trzy podklasy na trzy podklasy z dziewięcioma zidentyfikowanymi do tej pory genami. W niniejszym badaniu, zbadaliśmy, czy obecnie dostępne technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) są już odpowiednie do diagnostyki molekularnej USH. Przeanalizowaliśmy łącznie 12 pacjentów, z których większość była negatywna dla wcześniej opisanych mutacji mutacji w znanych genach USH po genotypowaniu mikromacierzy opartym na przedłużaniu starterów. Wzbogaciliśmy szablon NGS albo przez przechwytywanie całego egzomu, albo przez Long-PCR znanych genów USH. znanych genów USH. Wykorzystano główne platformy sekwencjonowania NGS: SOLiD do sekwencjonowania całego sekwencjonowania egzomu, Illumina (Genome Analyzer II) i Roche 454 (GS FLX) do sekwencjonowania Long-PCR. Sekwencjonowanie Long-PCR. Sekwencjonowanie metodą Long-PCR było bardziej wydajne w przypadku do 94% regionów genów USH wykazując ogólne pokrycie wyższe niż 25×, podczas gdy sekwencjonowanie całego egzomu dało podobne pokrycie tylko dla 50% tych regionów. Ogólnie ta zintegrowana analiza doprowadziła do identyfikacji 11 nowych sekwencji w genach USH (2 homozygotyczne i 9 heterozygotycznych) z 18 wykrytych. Jednak co najmniej dwa przypadki nie zostały rozwiązane genetycznie. Nasz wynik podkreśla obecne ograniczenia w diagnostycznym zastosowaniu NGS u pacjentów z USH. Limit dla sekwencjonowania całego egzomu jest związane z potrzebą silnego pokrycia i do prawidłową interpretacją wariantów sekwencji o nieoczywistej, patogennej patogenną, podczas gdy podejście ukierunkowane cierpi z powodu wysokiej heterogenności genetycznej genetyczną USH, która może być również spowodowana obecnością dodatkowych genów sprawczych, które jeszcze nie zidentyfikowanych. --- Ostatnie postępy w technologiach sekwencjonowania zrewolucjonizowały badania genetyczne. Chociaż sekwencjonowanie o wysokim pokryciu może odkryć większość wariantów obecnych w sekwencjonowanej próbce sekwencjonowanej próbce, sekwencjonowanie o niskim pokryciu jest atrakcyjne ze względu na jego efektywność. Tutaj przedstawiamy AbCD (arbitralny projekt pokrycia), aby pomóc projektowanie badań opartych na sekwencjonowaniu. AbCD to przyjazny dla użytkownika interfejs zapewniający wstępnie oszacowane efektywne wielkości próbek, specyficzne dla każdej kategorii częstotliwości alleli podrzędnych dla projektów o dowolnym pokryciu (0,5-30×) i wielkości próby (20-10 000) oraz dla czterech głównych grup etnicznych (Europejczycy, Afrykanie, Azjaci i Afroamerykanie). Amerykanie). Ponadto prezentujemy również dwa narzędzia programowe: ShotGun i DesignPlanner, które zostały wykorzystane do wygenerowania szacunków dla AbCD. ShotGun jest elastyczny symulator krótkich odczytów dla dowolnej długości odczytu i średniej głębokości średnią głębokość, umożliwiając specyficzne dla cyklu poziomy błędów sekwencjonowania i realistyczne rozkłady głębokości odczytu. rozkłady głębokości odczytu. DesignPlanner to pełny potok, który wykorzystuje ShotGun do generowania danych sekwencyjnych i wykonuje wstępne wykrywanie SNP, wykorzystuje nasze wcześniej wcześniej przedstawioną metodę świadomą nierównowagi powiązań do wywoływania genotypów i wreszcie, zapewnia efektywne rozmiary próbek specyficzne dla częstotliwości alleli podrzędnych. ShotGun plus DesignPlanner może pomieścić efektywne oszacowanie wielkości próby dla dowolnej kombinacji danych o wysokiej i niskiej głębokości (na przykład, cały genom o niskiej głębokości plus egzonicznych o dużej głębokości) lub kombinacji danych sekwencji i genotypu [np, sekwencjonowanie całego eksomu plus genotypowanie z istniejącego Genomewide Association Study (GWAS)]. Genomewide Association Study (GWAS)]. --- Sekwencjonowanie całego eksomu (Exome-seq) zostało z powodzeniem zastosowane w kilku ostatnich badaniach. Tutaj zsekwencjonowaliśmy eksomy 15 linii komórkowych guza trzustki i dopasowanych do nich normalnych próbek. Przechwyciliśmy 162 073 eksony 16 954 genów i zsekwencjonowaliśmy i zsekwencjonowaliśmy docelowe regiony ze średnim 56-krotnym pokryciem. Badanie to zidentyfikowano łącznie 1517 mutacji somatycznych i zweryfikowano 934 mutacje za pomocą sekwencjonowania transkryptomu. sekwencjonowanie transkryptomu. Wykryliśmy powtarzające się mutacje w 56 genach. Wśród nich wśród nich 41 nie zostało opisanych. Wskaźniki mutacji różniły się znacznie między liniami komórkowymi. linii komórkowych. Różnorodność wskaźników mutacji była istotnie skorelowana z różnym statusem liczby kopii różnym statusem liczby kopii MLH1. Exome-seq ujawnił intensywną niestabilność genomową niestabilność genomową w linii komórkowej z homozygotyczną delecją MLH1, wskazaną przez dramatycznie podwyższony wskaźnik substytucji somatycznych, małych insercji/delecji (indels), a także indels w mikrosatelitach. W szczególności stwierdziliśmy, że ekspresja MLH1 była zmniejszona o prawie połowę w liniach komórkowych z alleliczną utratą MLH1. Podczas gdy te linie komórkowe były ujemne w konwencjonalnym teście niestabilności mikrosatelitarnej w konwencjonalnym teście niestabilności mikrosatelitarnej, wykazały one 10,5-krotny wzrost wskaźnika somatycznych w TP53 i TGFBR2, co wskazuje na haploinsuficjencję MLH1 w nowotworach złośliwych. haploinsufficiency w korekcji błędów indel DNA. Następnie przeanalizowaliśmy egzomy 15 raków nerkowokomórkowych i potwierdziliśmy haploinsuficjencję MLH1. Zaobserwowaliśmy zaobserwowaliśmy znacznie wyższy wskaźnik mutacji indel w dotkniętych przypadkach i w kilku genach nowotworowych, takich jak VHL, PBRM1 i JARID1C. Łącznie nasze dane sugerują, że hemizygotyczna delecja MLH1, poprzez zwiększenie częstości mutacji indel, może napędzać rozwój i progresję sporadycznych nowotworów. rozwój i progresję sporadycznych nowotworów. --- Postawiono hipotezę, że rzadkie warianty w regionach kodujących genów wyjaśniają znaczną część dziedziczności powszechnych chorób. genów wyjaśniają znaczną część odziedziczalności powszechnych chorób. My zsekwencjonowaliśmy egzomy 1000 duńskich przypadków z powszechnymi postaciami cukrzycy typu 2 (w tym wskaźnik masy ciała > 27,5 kg/m(2) i nadciśnienie) oraz 1000 zdrowych osób z grupy zdrowych do średniej głębokości 56×. Nasze symulacje sugerują, że nasze badanie miało moc statystyczną do wykrycia co najmniej jednego genu przyczynowego (genu zawierającego mutacje mutacje przyczynowe), jeśli odziedziczalność tych powszechnych chorób została wyjaśniona przez rzadkimi wariantami w regionach kodujących ograniczonej liczby genów. Zastosowaliśmy serię testów opartych na genach w celu wykrycia takich genów podatności. Jednak żaden gen nie wykazał istotnego związku z ryzykiem choroby po skorygowaniu liczby analizowanych genów. liczbę analizowanych genów. W ten sposób mogliśmy odrzucić model genetyczny cukrzycy typu 2, w którym rzadkie warianty niesynonimiczne skupiały się w niewielkiej liczbie genów (mniej niż 20) są odpowiedzialne za większość ryzyka choroby. ryzyko choroby. --- Wstęp: Śródnabłonkowa dyskeratoza rogówki jest niezwykle rzadkim schorzeniem. Klasyczna forma, dotykająca rdzennych Amerykanów z plemienia Haliwa-Saponi, jest nazywana jest dziedziczną łagodną dyskeratozą śródnabłonkową (HBID). Poniżej przedstawiamy nową formę śródnabłonkowej dyskeratozy rogówki, dla której zidentyfikowaliśmy zidentyfikowaliśmy gen sprawczy przy użyciu technologii głębokiego sekwencjonowania. METODY I WYNIKI: Siedmioosobowa francuska rodzina rasy kaukaskiej z dwoma z dyskeratozą śródnabłonkową rogówki (6-letni probant i jego matka). matka). U probanta stwierdzono obustronne całkowite zmętnienie rogówki i dyskeratozę. zmętnienie rogówki i dyskeratozę. Hiperkeratoza dłoniowo-podeszwowa i dyskeratoza krtani i dyskeratoza krtani były związane z fenotypem. Badania histopatologiczne rogówki i biopsji strun głosowych wykazały dyskeratotyczne rogowacenie. Ilościowa PCR wykluczył duplikację 4q35, klasycznie opisywaną w przypadkach HBID. Sekwencjonowanie sekwencjonowanie następnej generacji ze średnim pokryciem 50× przy użyciu Illumina Hi Seq i przeprowadzono przetwarzanie całego egzomu. Odczyty sekwencji zostały wyrównane i sprawdzono pod kątem wariantów pojedynczych nukleotydów i wywołań insercji/delecji. Wewnętrzne przeprowadzono analizy filtrowania potoku i porównania z dostępnymi bazami danych. przeprowadzono. Odkryto nową mutację missense M77T dla genu NLRP1 który mapuje się na chromosomie 17p13.2. Była to mutacja de novo u matki probanta. u matki probanta, po segregacji w rodzinie i nie znaleziono jej w 738 kontrolnych próbkach DNA. kontrolnych próbkach DNA. Ekspresję NLRP1 określono w dorosłym nabłonku rogówki. Stwierdzono, że zmiana aminokwasu aminokwasów znacząco destabilizuje strukturę białka. WNIOSKI: Opisujemy nową śródnabłonkową dyskeratozę rogówki i sposób, w jaki zidentyfikowaliśmy jej gen sprawczy. Produkt genu NLRP1 jest zaangażowany w zapaleniu, zaburzeniach autoimmunologicznych i apoptozie, w której pośredniczy kaspaza. POLIMORFIZMY NLRP1 są związane z różnymi chorobami. --- Testowanie powiązań przy użyciu macierzy SNP Affymetrix 6.0 zmapowało locus choroby w TCD-G, irlandzkiej rodzinie z autosomalnym dominującym barwnikowym zapaleniem siatkówki (adRP), do 8,8 Mb regionu na 1p31. Spośród 50 znanych genów w regionie, 11 kandydatów, w tym RPE65 i PDE4B, zsekwencjonowano przy użyciu di-deoksykapilarnej elektroforezy elektroforezy kapilarnej. Jednocześnie, podzbiór członków rodziny został przeanalizowany przy użyciu Agilent SureSelect All Exome, a następnie sekwencjonowanie na platformie Illumina GAIIx. Sekwencjonowanie genów kandydujących i egzomu doprowadziło do identyfikację mutacji Asp477Gly w eksonie 13 genu RPE65 śledzącego z chorobą w TCD-G. Wszystkie kodujące eksony genów, które nie zostały zsekwencjonowane do zostały zsekwencjonowane za pomocą sekwencjonowania di-deoksy. Nie innych potencjalnych wariantów powodujących chorobę, które segregowałyby z chorobą w TCD-G. TCD-G. Mutacja Asp477Gly nie była obecna w irlandzkich grupach kontrolnych, ale została znaleziona w drugiej irlandzkiej rodzinie. w drugiej irlandzkiej rodzinie, u której wstępnie zdiagnozowano choroideremię, przynosząc łączny maksymalny dwupunktowy wynik LOD do 5,3. Mutacje w RPE65 są znaną przyczyną przyczyną recesywnej wrodzonej amaurozy Lebera (LCA) i recesywnej RP, ale nie odnotowano mutacji dominujących. dominujących mutacji. Modelowanie białek sugeruje, że mutacja Asp477Gly może destabilizować fałdowanie białka, a zmutowane białko RPE65 migruje marginalnie szybciej na SDS-PAGE w porównaniu z typem dzikim. Terapia genowa dla pacjentów z LCA z mutacjami RPE65 okazała się bardzo obiecująca, podnosząc możliwość powiązanych terapii dla dominujących mutacji w tym genie. --- Ostatnie badania wykazały moc głębokiego sekwencjonowania całego genomu lub egzomu. genomu lub egzomu w zrozumieniu genomów nowotworowych. Jednak ukierunkowane przechwytywanie wybranych regionów całego genomu, a nie całego egzomu, ma kilka zalet kilka zalet: 1) geny mogą być wybierane na podstawie biologii lub hipotezy 2) można badać mutacje w regionach promotorowych i intronowych, które odgrywają ważną rolę regulacyjną. regulacyjne, mogą być badane; oraz 3) są tańsze niż sekwencjonowanie całego genomu lub całego egzomu. lub sekwencjonowanie całego egzomu. Dlatego zaprojektowaliśmy niestandardowe mikromacierze oligonukleotydowe o wysokiej gęstości mikromacierze oligonukleotydowe (NimbleGen Inc.), aby uchwycić około 1,7 Mb regionów docelowych obejmujących regiony genomowe 28 genów związanych z rakiem jelita grubego raka jelita grubego, w tym genów należących do szlaku sygnałowego WNT, jak również ważne czynniki transkrypcyjne lub geny specyficzne dla okrężnicy, które ulegają nadmiernej ekspresji w raku jelita grubego (CRC). Docelowe regiony o wielkości 1,7 Mb zostały zsekwencjonowane z pokryciem w zakresie od 32× do 45× dla 28 genów. Zidentyfikowaliśmy łącznie 2342 warianty sekwencji w CRC i odpowiadających im sąsiednich normalnych tkankach. Wśród nich 738 z nich to nowe warianty sekwencji oparte na porównaniach z bazą SNP (dbSNP135). Zweryfikowaliśmy 56 z 66 SNP w oddzielnej kohorcie 30 tkanek CRC tkanek CRC przy użyciu platformy Sequenom MassARRAY iPLEX, co sugeruje wskaźnik walidacji na poziomie co najmniej 85% (56/66). Wśród wariantów egzonowych znaleźliśmy 15 mutacji missense egzonicznych, 21 synonimicznych SNP, które zgodnie z przewidywaniami zmieniały egzoniczne motywy splicingu motywy splicingowe, 31 SNP UTR, które zgodnie z przewidywaniami mogą wystąpić w miejscach wiązania czynnika transkrypcyjnego w miejscach wiązania czynników transkrypcyjnych, 20 intronowych SNP zlokalizowanych w pobliżu miejsc splicingu, 43 SNP w konserwowanych miejscach wiązania czynników transkrypcyjnych i 32 w wyspach CpG. Wreszcie ustaliliśmy, że rs3106189, zlokalizowany w 5' UTR antygenu prezentującego tapasynę białko wiążące tapasynę (TAPBP) i rs1052918, zlokalizowany w 3' UTR czynnika transkrypcyjnego czynnika transkrypcyjnego 3 (TCF3), były związane z całkowitym przeżyciem pacjentów z CRC. --- Zmiany genetyczne w określonych genach motorycznych prowadzą do zakłócenia szlaków komórkowych i są krytycznymi zdarzeniami w inicjacji i progresji raka wątrobowokomórkowego (HCC). raka wątrobowokomórkowego (HCC). Jako warunek wstępny dla zindywidualizowanego leczenia raka leczenia raka, staraliśmy się scharakteryzować krajobraz nawracających mutacji somatycznych mutacji w HCC. Przeprowadziliśmy sekwencjonowanie całego eksomu na 87 HCC i dopasowanych normalnych sąsiednich tkankach do średniego pokrycia 59×. Ogólny wskaźnik mutacji wynosił około dwóch mutacji na Mb, z medianą 45 mutacji niesynonimicznych które zmieniały sekwencję aminokwasów (zakres, 2-381). Znaleźliśmy powtarzające się mutacje w kilku genach o wysokim poziomie transkrypcji: TP53 (18%); CTNNB1 (10%); KEAP1 (8%); C16orf62 (8%); MLL4 (7%); i RAC2 (5%). Znacząco rodziny genów obejmują domenę wiążącą nukleotydy i rodzinę bogatą w leucynę bogatą w leucynę, podjednostki kanału wapniowego i metylotransferazy histonów. metylotransferazy. W szczególności, rodzina MLL metylotransferaz dla histonu H3 lizyny 4 były zmutowane w 20% guzów. WNIOSEK: Szlaki NFE2L2-KEAP1 i MLL są wielokrotnie zmutowane w wielu kohortach HCC. wielu kohortach HCC. --- Rak wątrobowokomórkowy, jeden z najczęstszych nowotworów związanych z wirusami, jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie. jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Poprzez masowe równoległe sekwencjonowanie pierwotnego raka wątrobowokomórkowego z dodatnim wirusem zapalenia wątroby typu C raka wątrobowokomórkowego (36-krotne pokrycie) i dopasowanych limfocytów (>28-krotne pokrycie) od tej samej osoby. osobnika, zidentyfikowaliśmy ponad 11 000 substytucji somatycznych w genomie guza w genomie nowotworu, które wykazały przewagę przejścia T>C/A>G i zmniejszenie substytucji T>C na nici transkrybowanej, co sugeruje preferencyjną naprawę DNA. Gen Analiza wzbogacenia adnotacji 63 zwalidowanych substytucji niesynonimicznych ujawniła wzbogacenie fosfoprotein. Następnie zweryfikowaliśmy 22 rearanżacje chromosomalne rearanżacje chromosomalne, generując cztery transkrypty fuzyjne, które zmieniły regulację transkrypcji (BCORL1-ELF4) lub aktywność promotora. Sekwencjonowanie całego eksomu sekwencjonowanie przy większej głębokości sekwencji (> 76× pokrycie) ujawniło nonsensowną substytucję TSC1 w subpopulacji komórek nowotworowych. Ta pierwsza wysokiej rozdzielczości charakterystyka genomu nowotworu związanego z wirusem zidentyfikowała wcześniej niescharakteryzowane wzorce mutacji, rearanżacje wewnątrzchromosomalne i geny fuzyjne, a także heterogenność genetyczną. geny, a także heterogenność genetyczną w obrębie guza. --- TŁO: Tworzenie limfoblastoidalnych linii komórkowych (LCL) poprzez transformację wirusem wirusa Epsteina-Barr (EBV) limfocytów B może skutkować powstaniem cenny biomateriał do badań nad biologią komórkową i odnawialne źródło DNA. Podczas gdy LCL były szeroko stosowane w badaniach komórkowych i genetycznych, proces transformacji i ekspansji komórek podczas hodowli proces transformacji i ekspansji komórek podczas hodowli może wprowadzić zmiany genomowe, które mogą wpływać na ich wykorzystanie i interpretację późniejszych wyników genetycznych. genetycznych. WYNIKI: Przeprowadziliśmy sekwencjonowanie całego egzomu na rodzinie tetrad przy użyciu DNA pochodzącego z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i LCL od każdego osobnika. osobnika. Wygenerowaliśmy ponad 4,7 GB sekwencji możliwej do zmapowania do 125-krotnego pokrycia odczytu na próbkę. na próbkę. Zidentyfikowano średnio 19 354 wariantów genetycznych. Porównanie dwóch źródeł DNA od każdej osoby wykazało średnią zgodność na poziomie 95,69%. Obniżając parametry wywoływania wariantów, uzyskano współczynnik zgodności między sparowanymi próbkami wzrósł do 99,82%. Sekwencjonowanie Sangera sekwencjonowanie podzbioru pozostałych niezgodnych wariantów potwierdziło obecność mutacji de novo powstających w LCL. WNIOSKI: Zmieniając parametry rygorystyczności oprogramowania, zidentyfikowaliśmy 99% między sekwencjami DNA pochodzącymi z dwóch różnych źródeł od tych samych dawców. tych samych dawców. Wyniki te sugerują, że LCL są odpowiednią reprezentacją materiału genetycznego dawcy i sugerują, że transformacja EBV może skutkować generowaniem mutacji de novo na niskim poziomie. W związku z tym zaleca się stosowanie PBMC lub komórek we wczesnym stadium transformacji EBV. Odkrycia te mają szeroko zakrojone implikacje, ponieważ w publicznych biorepozytoriach znajdują się tysiące LCL w publicznych biorepozytoriach i indywidualnych laboratoriach. --- Odkrywanie przyczynowych wariantów genetycznych w indywidualnych przypadkach podejrzewanej choroby mitochondrialnej choroby mitochondrialnej wymaga zbadania zarówno mitochondrialnego (mtDNA) i genomów jądrowych. Sekwencjonowanie całego eksomu może wspierać jednoczesną analizę dwóch genomów. chociaż obecnie dostępne zestawy do wychwytywania nie są ukierunkowane na genom mtDNA mtDNA i zapewniają niewystarczające wychwytywanie niektórych genów mitochondrialnych kodowanych jądrowo. mitochondrialnych. Aby zoptymalizować badanie genów jądrowych i mtDNA istotnych dla biologii mitochondriów i chorób, stworzono niestandardową bibliotekę całych eksomów SureSelect "Mito-Plus". została utworzona przez zmieszanie "przynęt" RNA z trzech oddzielnych projektów: (A) Agilent Technologies SureSelectXT 50 Mb All Exon PLUS Targeted Enrichment Kit, (B) 16-genowy panel jądrowy ukierunkowany na sekwencje znanych białek MitoCarta nie w projekcie 50 Mb All Exon i (C) sekwencje ukierunkowane na cały genom mtDNA. mtDNA. Ostateczne niestandardowe preparaty składały się z przynęt jądrowych w stosunku 1:1. przynęt jądrowych, do których zmieszano przynęty genomowe mtDNA rozcieńczone w stosunku 1 do 1000 razy. zmieszane. Biblioteki próbek pacjentów były sekwencjonowane w parach na urządzeniu Illumina HiSeq 2000 przy użyciu chemii SBS v3.0. Pokrycie genomu mtDNA różniło się w zależności od mtDNA. różniło się w zależności od stosunku mtDNA do mieszanki jądrowej, gdzie stosunek 1:100 zapewniał optymalne pokrycie dwóch genomów z 10-krotnym pokryciem dla ponad 97,5% wszystkich docelowych regionów jądrowych i 1000-krotnym pokryciem 99,8% genomu mtDNA. mtDNA mutacje zostały niezawodnie wykryte do co najmniej 8% poziomu heteroplazmii, jako odróżnić zarówno od błędów sekwencjonowania, jak i potencjalnego zanieczyszczenia przez jądrowych transkryptów mtDNA (Numts). Zestaw do wychwytywania "1:100 Mito-Plus Whole-Exome" Agilent Agilent oferuje zoptymalizowane narzędzie do analizy całego eksomu genów jądrowych i mtDNA istotnych dla oceny diagnostycznej chorób mitochondrialnych. --- TŁO: Tętniak aorty brzusznej (AAA) jest chorobą wieloczynnikową, a jego patogeneza pozostaje słabo poznana. patogeneza pozostaje słabo poznana. CEL: Naszym celem jest poszukiwanie podstawowej etiologii AAA przy użyciu sekwencjonowania całego egzomu i analizy ekspresji genów. sekwencjonowanie i analizę ekspresji genów. MATERIAŁY I METODY: Przeprowadziliśmy sekwencjonowanie całego egzomu dla AAA i sąsiedniej normalnej tkanki aorty brzusznej od jednego mężczyzny z AAA. Dalsza analiza ekspresji genów przy użyciu pobranego zbioru danych z bazy danych GEO w celu zbadać podstawowe mechanizmy molekularne. WYNIKI: Dla dwóch próbek wygenerowano łącznie 5,97 Gb czystych danych, osiągając średnią głębokość pokrycia 31,96 i 32,88 odpowiednio dla AAA i normalnych próbek. Zidentyfikowaliśmy 203 warianty somatyczne i potwierdziliśmy 34 mutacje somatyczne zmieniające białko w 25 genach. Wśród potwierdzonych wariantów, 11 mutacji nie zostało wcześniej zgłoszonych w bazie danych dbSNP. Zgodnie z Zgodnie z przeglądem literatury, żaden z tych 25 genów nie był powiązany z AAA. WNIOSKI: Nasze odkrycia mogą stanowić potencjalne cele dla skutecznego zapobiegania rozwojowi i progresji AAA u ludzi. --- Tutaj przedstawiamy adaptację sekwencjonowania macierzy NimbleGen 2.1M do sekwencjonowania całego egzomu przy użyciu platformy Illumina Genome Analyzer (GA). sekwencjonowania całego egzomu przy użyciu platformy Illumina Genome Analyzer (GA). Protokół protokół obejmuje dwuetapową konstrukcję biblioteki. Specyficzność wzbogacania egzomu wyniosła około 80% przy 95,6% równomiernym pokryciu regionu docelowego 34 Mb przy średniej głębokości sekwencjonowania 33 razy. Porównanie naszych wyników z wynikami resekwencjonowania całego genomu wykazało, że wywołania SNP egzomu dały tylko 0,97% fałszywie dodatnich i 6,27% fałszywie ujemnych wariantów. Nasz protokół jest również dobrze nadaje się do stosowania z amplifikowanym DNA całego genomu. Przedstawione wyniki tutaj wskazują, że istnieje obiecująca przyszłość dla genomiki populacyjnej na dużą skalę genomiki populacyjnej i badań medycznych z wykorzystaniem sekwencjonowania całego egzomu. --- Wstęp: Gruczolakorak żołądka jest rzadką diagnozą w dzieciństwie. A 14-letni pacjent z przerzutowym gruczolakorakiem żołądka i silnym wywiadem rodzinnym w kierunku raka jelita grubego. silną rodzinną historią raka jelita grubego. Sekwencjonowanie kliniczne CDH1 i APC było negatywne. negatywne. W związku z tym zastosowano sekwencjonowanie całego egzomu, aby uchwycić większość regionów kodujących białka w celu identyfikacji wariantów pojedynczych nukleotydów, małych insercji/delecji i nieprawidłowości liczby kopii w linii zarodkowej pacjenta w linii zarodkowej pacjenta, jak również w guzie pierwotnym. MATERIAŁY I METODY: DNA wyekstrahowano z krwi pacjenta, guza pierwotnego i niezmienionego nowotworu. guza pierwotnego i krwi matki pacjenta. Biblioteki DNA zostały skonstruowane i sekwencjonowane na aparacie Illumina HiSeq2000. Dane zostały przetworzone przy użyciu Picard i Samtools, a następnie analizowane za pomocą Genome Analysis Toolkit. Warianty zostały adnotowane przy użyciu wewnętrznego programu opartego na Ensembl. Liczba kopii została oceniona przy użyciu ExomeCNV. WYNIKI: Każda próbka została zsekwencjonowana do średniej głębokości pokrycia większej niż 120×. Rzadki niesynonimiczny kodujący wariant pojedynczego nukleotydu (SNV) w TP53 został zidentyfikowany w linii zarodkowej. Istniało 10 somatycznych wariantów uszkadzających białko nowotworowe które nie zostały zaobserwowane w niezmienionym genomie matki. ExomeCNV porównując guz z linią zarodkową pacjenta, zidentyfikowano nieprawidłową liczbę kopii, obejmującą 6 946 genów. WNIOSKI: Przedstawiamy niezwykły przypadek Li-Fraumeni wykryty za pomocą sekwencjonowania całego egzomu. sekwencjonowania całego egzomu. Istniały również prawdopodobne mutacje somatyczne w gruczolakoraku żołądka. gruczolakoraku żołądka. Wyniki te podkreślają potrzebę dokładniejszych i szerzej zakrojonych analiz dokładniejszych i szeroko zakrojonych analiz linii zarodkowej i nowotworów, aby dokładnie informować pacjentów o odziedziczonym ryzyka zachorowania na raka i identyfikacji mutacji somatycznych.
Jakie jest akceptowalne pokrycie sekwencji (głębokość) wymagane do sekwencjonowania całych ludzkich eksomów?
Średnią głębokość można uznać za 8x, podczas gdy najczęstsze wartości wahają się od 30x do 60x. Wartości większe niż 75x lub nawet do 125x mogą być brane pod uwagę przy badaniu rzadkich wariantów chorobowych.