Junctate jest nowo zidentyfikowanym integralnym białkiem wiążącym wapń w błonie ER/SR, które jest alternatywną formą splicingu tego samego genu generującego aspartyl beta-hydroksylazę i junktynę. Przesiewanie biblioteki cDNA serca myszy przy użyciu cDNA psiej cDNA junktyny jako sondy dało trzy kompletne cDNA serca myszy. Jeden z cDNA jest homologiczny do wcześniej opisanego ludzkiego junktyny. Trzy mysie białka junctate składają się z 270, 259 i 215 aminokwasów (nazwaliśmy je junctate-1, -2 i -3). Pozorne masy cząsteczkowe mysich junktatów w SDS-PAGE mieściły się w zakresie od 40 do 53 kDa. Analizy Northern i Western blot wskazują, że mysie junktyny ulegają ekspresji w sercu, mózgu, śledzionie, płucach, wątrobie, nerkach i żołądku, ale nie w mięśniach szkieletowych. Pozorna masy cząsteczkowe junktatów z serca i mózgu różniły się nieco od z innych badanych tkanek, co sugeruje, że istnieją specyficzne dla tkanki wzorce ekspresji różnych izoform junktatu. Badania immunohistochemiczne wykazały, że junktyny ulegały ekspresji zarówno w tkankach komorowych, jak i przedsionkowych. tkankach. Jest to pierwsze badanie, które wykazało obecność 3 różnych izoform izoformy junctate ulegają ekspresji w różnych tkankach ssaków. --- Pojedynczy locus genomowy, AbetaH-J-J, koduje trzy funkcjonalnie różne białka białka beta-hydroksylazę aspartylową, junktynę i junktat poprzez alternatywny splicing. Spośród tych trzech białek, junktyna i junktynian mogą odgrywać ważną rolę w regulacji role w regulacji wewnątrzkomórkowego Ca(2+) poprzez regulację albo Ca(2+) z wewnątrzkomórkowych magazynów Ca(2+) lub napływ Ca(2+) w różnych procesach biologicznych. procesach biologicznych. Tutaj dokonujemy przeglądu ostatnich ustaleń dotyczących regulacji ekspresji i proponowanych funkcji junktyny i junktyny. --- Alternatywny splicing locus AbetaH-J-J generuje trzy funkcjonalnie odrębne białka: enzym, AbetaH (aspartyl-beta-hydroksylaza), białko strukturalne białko strukturalne błony siateczki sarkoplazmatycznej (junktyna) i integralne białko wiążące wapń (junktyna). błonowe białko wiążące wapń (junctate). Junktyna i junktyna to dwa ważne białka zaangażowane w regulację wapnia w komórkach eukariotycznych. Aby zrozumieć regulację tych dwóch białek, zidentyfikowaliśmy i funkcjonalnie scharakteryzowaliśmy jedną z dwóch sekwencji promotorowych locus AbetaH-J-J. My Wykazaliśmy, że promotor P2 locus AbetaH-J-J zawiera (i) minimalną sekwencję sekwencję zlokalizowaną w regionie -159 bp od miejsca inicjacji transkrypcji która jest wystarczająca do aktywacji transkrypcji obu mRNA; (ii) sekwencje, które wiążą znane sekwencje, które wiążą znane czynniki transkrypcyjne, takie jak te należące do czynnika wzmacniającego miocyty 2 (MEF-2), MEF-3 i rodziny białek NF-kappaB; oraz (iii) sekwencje wiązane przez nieznane białka. Funkcjonalna charakterystyka minimalnego promotora w komórkach C2C12 i w mięśniu podeszwowym szczura in vivo wskazuje na istnienie elementów cis mających pozytywny i negatywny wpływ na transkrypcję. wpływ na transkrypcję. Ponadto, nasze dane pokazują, że w komórkach mięśni prążkowanych mięśni prążkowanych zależny od wapnia czynnik transkrypcyjny MEF-2 jest kluczowy dla aktywności transkrypcyjnej kierowanej przez promotor P2. aktywności transkrypcyjnej kierowanej przez promotor P2. Transkrypcja kierowana przez promotor AbetaH-J-J P2 jest indukowana przez wysoką ekspresję MEF-2, dalej stymulowana przez kalcyneurynę i kinazę białkową I zależną od Ca2+/kalmoduliny, oraz hamowana przez deacetylazę histonową 4. --- Ludzki locus AbetaH-J-J jest sekwencją genomową, która generuje trzy funkcjonalnie różne białka, enzym aspartyl-beta-hydroksylazę (AbetaH), białko strukturalne junktyny retikulum sarkoplazmatycznego i białko wiążące wapń białko wiążące wapń. Pierwszy i drugi ekson wzajemnie się wykluczają wykluczają się, gdy produkowane są dojrzałe mRNA. Ponadto wykazano, że stosowanie różnych Ponadto wykazano, że stosowanie różnych dawców splicingu jest zaangażowane w generowanie różnorodności białek przez alternatywny splicing. Jeśli chodzi o regulację transkrypcji, zidentyfikowano dwa promotory (P1 i P2) zostały zidentyfikowane. Kiedy sekwencje promotorów P1 i P2 są porównywane, istotne różnice są wyraźnie wykrywalne. Najbardziej interesujący wynik wyłaniającym się z badań skupionych na promotorze P2 jest to, że zależny od wapnia czynnik transkrypcyjny MEF-2 aktywuje transkrypcję junktyny, junktyny, i AbetaH w tkankach pobudliwych i, w mniejszym stopniu, w nerkach. Żadne miejsca wiązania Sp1 są obecne w promotorze P2. W przeciwieństwie do tego, promotor P1 zawiera sekwencje bogate w GC, które wykazują homologię z miejscem wiązania konsensusu Sp1. --- Mysi gen beta-hydroksylazy aspartylowej (Asph, BAH) został sklonowany i scharakteryzowany. scharakteryzowany. Mysi gen BAH obejmuje 200 par kilobaz genomowego DNA i zawiera 24 eksony. zawiera 24 eksony. Z trzech głównych transkryptów związanych z BAH, dwa największe (6,629 i 4,419 par zasad) kodują białko pełnej długości i różnią się jedynie użyciem alternatywnych sygnałów poliadenylacji. Najmniejszy transkrypt związany z BAH (2,789 par zasad) wykorzystuje alternatywny końcowy ekson 3', co skutkuje białkiem pozbawione domeny katalitycznej. Ewolucyjna konserwacja tej niekatalitycznej izoformy BAH (humbug) wykazano u myszy, człowieka i Drosophila. Odczynniki przeciwciał monoklonalnych zostały wygenerowane, zmapowane epitopowo i użyte do ostatecznie skorelować pasma RNA na Northern blots z gatunkami białek na Western blot. Gen dla mysiej junktyny, białka wiążącego kalsekwestrynę, został sklonowany i scharakteryzowany. sklonowany i scharakteryzowany oraz wykazano, że jest kodowany z tego samego locus. Kiedy ekspresji w tkance serca, BAH/humbug korzystnie wykorzystują pierwszy ekson i często często czwarty ekson junktyny, zachowując ramkę odczytu. W ten sposób trzy geny mają wspólne eksony i otwarte ramki odczytu i używają oddzielnych promotorów do osiągnięcia zróżnicowanej ekspresji. promotory, aby osiągnąć zróżnicowaną ekspresję, splicing i funkcję w różnych tkankach. różnych tkankach. Ta niezwykła forma współdzielenia eksonów sugeruje, że funkcje sugeruje, że funkcje junktyny, BAH i humbug mogą być ze sobą powiązane.
Jakie są różne białka/izoformy kodowane przez gen ASPH (beta-hydroksylaza asparaginianowa) u ludzi?
Alternatywny splicing locus AbetaH-J-J (asparetylo-beta-hydroksylaza) generuje trzy funkcjonalnie różne białka: enzym, AbetaH (asparaginylo-beta-hydroksylaza), białko strukturalne błony retikulum sarkoplazmatycznego (junktyna) i białko wiążące wapń integralnej błony (junktyna). Aspartyl (asparaginyl)-beta-hydroksylaza (AAH) ma również dwa powiązane transkrypty, Humbug i Junctin, które nie mają domen katalitycznych.  Najmniejszy transkrypt związany z BAH (2,789 par zasad) wykorzystuje alternatywny końcowy ekson 3', co skutkuje białkiem pozbawionym domeny katalitycznej. Ewolucyjną konserwację tej niekatalitycznej izoformy BAH (humbug) wykazano u myszy, człowieka i Drosophila. Zidentyfikowano i scharakteryzowano również ludzką izoformę junktyny (izoforma 1, 225 aa). Izoforma 1 ma wstawkę 15 aa przy reszcie aminokwasowej 55 ludzkiej junktyny.