Wcześniejsza analiza genu hsp26 u Drosophila melanogaster wykazała, że oprócz oprócz pola TATA oraz proksymalnych i dystalnych elementów szoku cieplnego (HSE) (wyśrodkowanych na -59 i -340, względem miejsca rozpoczęcia transkrypcji), segmentu powtórzeń segment powtórzeń (CT) n przy -135 do -85 jest wymagany do pełnego szoku cieplnego (R.L. Glaser, G.H. Thomas, E.S. Siegfried, S.C.R. Elgin i J.T. Lis, J. Mol. Biol. 211:751-761, 1990). Ten element (CT) n wydaje się przyczyniać do tworzenia struktury chromatyny typu dzikiego hsp26, zorganizowanego macierz nukleosomów, która pozostawia HSE w wolnych od nukleosomów, nadwrażliwych na DNazę I (DH) (Q. Lu, L.L. Wallrath, B.D. Allan, R.L. Glaser, J.T. Lis i S.C.R. Elgin, J. Mol. Elgin, J. Mol. Biol. 225:985-998, 1992). Inspekcja sekwencji poprzedzających hsp26 ujawniła dodatkowy element (CT)n przy -347 do -341, przylegający do dystalnego HSE. Przeanalizowaliśmy udział tego dystalnego elementu (CT)n (-347 do -341), proksymalnego elementu (CT)n (-135 do -85) i dwóch HSE zarówno do tworzenia struktury chromatyny i indukowalności szoku cieplnego. hsp26 zawierające mutacje ukierunkowane na miejsce, delecje, substytucje lub rearanżacje tych elementów sekwencji zostały połączone w ramce z Escherichia coli lacZ i ponownie wprowadzone do genomu D. melanogaster przez transformację linii zarodkowej za pośrednictwem elementu P. Struktura chromatyny transgenów transgenów analizowano (przed aktywacją genu) za pomocą DNazy I lub restrykcji traktowanie enzymem izolowanych jąder i monitorowano ekspresję indukowaną ciepłem poprzez pomiar aktywności beta-galaktozydazy. Wyniki wskazują, że mutacje, delecje lub substytucje dystalnego lub proksymalnego elementu (CT) n wpływają na strukturę chromatyny i indukowaną ciepłem ekspresję transgenów. Te powtórzenia (CT) n są związane z niehistonowym białkiem (białkami) in vivo i są związane przez oczyszczone białko Drosophila, czynnik GAGA, in vitro. W przeciwieństwie do tego, HSE są wymagane do ekspresji indukowanej ciepłem, ale odgrywają tylko niewielką rolę w tworzeniu struktury chromatyny transgenów. Poprzednia analiza wskazuje, że przed szokiem cieplnym te HSE wydają się być wolne od białka. Nasze wyniki sugerują, że czynnik GAGA, obfity czynnik białkowy wymagany do normalnej ekspresji wielu genów Drosophila i czynnik szoku cieplnego, specyficzny czynnik transkrypcyjny aktywowany podczas szoku cieplnego. czynnik transkrypcyjny aktywowany po szoku cieplnym, odgrywają różne role w regulacji genów. czynnik GAGA ustanawia i/lub utrzymuje miejsca DH przed indukcją szoku cieplnego, podczas gdy aktywowany czynnik transkrypcyjny indukcji szoku cieplnego, podczas gdy aktywowany czynnik szoku cieplnego rozpoznaje i wiąże HSE zlokalizowane w miejscach DH, aby uruchomić transkrypcję. --- W opisywanej pracy podjęliśmy się funkcjonalnej analizy elementu odpowiedzi Polycomb (PRE) z domeny regulacyjnej iab-7. Element odpowiedzi Polycomb (PRE) z domeny cis-regulacyjnej iab-7 kompleksu bithorax (BX-C) Drosophila melanogaster bithorax complex (BX-C). Poprzednie badania mapowały iab-7 PRE do fragmentu 860-bp zlokalizowanego tuż za granicą Fab-7. W obrębie tego fragmentu znajduje się około 230-bp specyficznej dla chromatyny region nadwrażliwy na nukleazę o nazwie HS3. Wykazaliśmy, że HS3 jest zdolny do funkcjonować jako zależny od Polycomb wyciszacz in vivo, indukując zależne od parowania wyciszanie mini-białego reportera. Sekwencja HS3 zawiera miejsca wiążące dla czynnika GAGA, białka zaangażowanego w tworzenie regionów wolnych od nukleosomów. wolnych od nukleosomów regionów chromatyny, oraz Pleiohomeotic (Pho), białka z grupy Polycomb które jest związane z czynnikiem transkrypcyjnym ssaków YY1. Wykazaliśmy, że GAGA i Pho oddziałują z tymi sekwencjami in vitro i że konsensus miejsca wiązania dla tych dwóch białek są krytyczne dla aktywności wyciszającej iab-7 PRE in vivo. --- Struktura chromatyny w promotorze Drosophila hsp26 in vivo jest charakteryzuje się dwoma miejscami nadwrażliwymi na DNazę I (DH) zawierającymi elementy regulatorowe elementy regulatorowe. Proksymalne i dystalne miejsca DH są oddzielone pozycjonowanym nukleosomem. Aby zbadać udział czynników transkrypcyjnych w tworzeniu tej specyficznej konfiguracji chromatyny, zmontowaliśmy nukleosomy na promotorze hsp26 przy użyciu bezkomórkowego systemu rekonstytucji pochodzącego z zarodków muchy. Oba miejsca DH zostały łatwo odtworzone ze składników ekstraktu. Były one oddzielone nukleosomem nukleosomem, który był mniej ściśle umiejscowiony niż jego odpowiednik in vivo. Interakcje czynnika GAGA i czynnika szoku cieplnego z ich miejscami wiązania w chromatynie chromatynie zachodziły w dwóch trybach. Ich interakcje z miejscami wiązania w regionach regionach wolnych od nukleosomów nie wymagało ATP. W obecności ATP oba czynniki oddziaływały również z miejscami wiązania nukleosomów, powodując rearanżacje nukleosomów i udoskonalenie rearanżacje nukleosomów i udoskonalenie pozycji nukleosomów. Podczas gdy chromatyna po interakcji z czynnikiem transkrypcyjnym była wcześniej interpretowana jako nukleosomów, dane sugerują, że nukleosom zależny od energii jako główną zasadę reorganizacji chromatyny.
Czy GAGA jest związana z regionami wolnymi od nukleosomów (NFR)?
Czynnik GAGA jest białkiem, o którym wiadomo, że bierze udział w tworzeniu i/lub utrzymywaniu wolnych od nukleosomów regionów chromatyny. Interakcje czynnika GAGA i czynnika szoku cieplnego z ich miejscami wiązania w chromatynie zachodziły w dwóch trybach. Ich interakcje z miejscami wiązania w regionach wolnych od nukleosomów nie wymagały ATP. W obecności ATP oba czynniki oddziaływały również z miejscami wiązania nukleosomów, powodując rearanżacje nukleosomów i udoskonalenie pozycji nukleosomów. Podczas gdy przebudowa chromatyny po interakcji z czynnikiem transkrypcyjnym była wcześniej interpretowana jako obejmująca rozerwanie nukleosomów, dane sugerują, że zależne od energii przesuwanie nukleosomów jest główną zasadą reorganizacji chromatyny.