Metylacja Lys79 na histonie H3 przez Dot1p jest ważna dla wyciszania genów. Wydłużona struktura Wydłużona struktura konserwowanego rdzenia Dot1p drożdży zawiera N-końcową domenę helikalną domenę helikalną i siedmiopasmową domenę katalityczną, która zawiera miejsce wiązania miejsce dla metylo-donoru i kieszeń w miejscu aktywnym z zachowanymi hydrofobowymi resztami. S-adenozylo-L-homocysteina wykazuje rozszerzoną konformację konformację różniącą się od konformacji złożonej obserwowanej w strukturach SET metylotransferaz lizyny histonów. Katalityczna asparagina (Asn479), zlokalizowana w dolnej części kieszeni w miejscu aktywnym, sugeruje mechanizm podobny do mechanizm podobny do tego stosowanego do metylacji aminokwasów w DNA i metylacji glutaminy w białkach. Kwaśna, wklęsła szczelina między dwiema domenami zawiera dwie podstawowe reszty kieszenie wiążące, które mogą pomieścić wystające na zewnątrz podstawowe łańcuchy boczne łańcuchy boczne wokół Lys79 histonu H3 na podobnej do dysku powierzchni nukleosomu. Badania biochemiczne sugerują, że rekombinowane białka Dot1 są aktywne na rekombinowanych nukleosomach, wolnych od jakichkolwiek modyfikacji. --- Metnase jest ludzkim białkiem SET i domeną transpozazy, która metyluje histon H3 i promuje naprawę podwójnych pęknięć nici DNA. Teraz pokazujemy, że Metnase fizycznie oddziałuje i kolokalizuje z topoizomerazą IIalfa (Topo IIalfa), kluczowym enzymem dekatenującym enzymem dekatenującym chromosomy. Metnase promuje postęp poprzez dekatenację i zwiększa oporność na inhibitory Topo IIalfa ICRF-193 i VP-16. Oczyszczona Metnase znacznie zwiększyła dekatenację Topo IIalfa kinetoplastowego DNA do zrelaksowanych form kolistych. Ekstrakty jądrowe zawierające Metnase dekatenowały kDNA szybciej niż te bez Metnazy, a neutralizujące neutralizujące przeciwciała przeciwko Metnase odwracały to wzmocnienie dekatenacji. Metnase autometyluje przy K485, a obecność donora metylu blokowała wzmocnienie dekatenacji Topo IIalfa przez metnazę, co sugeruje wewnętrzną hamowanie regulacyjne. Tak więc, Metnase zwiększa dekatenację Topo IIalfa i aktywność ta jest tłumiona przez autometylację. Wyniki te sugerują, że komórki nowotworowe komórki nowotworowe mogą obalić Metnazę, aby pośredniczyć w klinicznie istotnej oporności na inhibitory Topo IIalfa. --- Wcześniej wykazaliśmy, że S-adenozylometionina (SAMe) i jej metabolit metylotioadenozyna (MTA) blokowały indukowaną przez lipopolisacharyd (LPS) ekspresję czynnika martwicy nowotworu czynnik martwicy alfa (TNFalfa) w RAW (linia komórek makrofagów mysich) i komórkach Kupffera na poziomie transkrypcji bez wpływu na czynnik jądrowy kappa B. Jednak dokładny mechanizm molekularny lub mechanizmy hamujące były niejasne. Podczas gdy SAMe jest donorem metylu, MTA jest inhibitorem metylacji. inhibitorem metylacji. SAMe może spontanicznie przekształcić się w MTA, więc efekt egzogennego SAMe może być pośredniczony przez MTA. Celem naszej obecnej pracy jest zbadanie, czy mechanizm hamującego wpływu SAMe i MTA na mediatory prozapalne może obejmować modulację metylacji histonów. W komórkach W komórkach RAW stwierdziliśmy, że LPS indukował ekspresję TNFalfa zarówno przez mechanizmy transkrypcyjne, jak i posttranskrypcyjne. i mechanizmy potranskrypcyjne. Leczenie SAMe i MTA hamowało indukowany przez LPS wzrost transkrypcji genów. Wykorzystując test immunoprecypitacji chromatyny test immunoprecypitacji chromatyny, stwierdziliśmy, że LPS zwiększył wiązanie trimetylowanego histonu 3 lizyny 4 (H3K4) do promotora TNFalfa, a to było całkowicie blokowane przez SAMe lub MTA. Podobne efekty zaobserwowano zaobserwowano w przypadku indukcji indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) za pośrednictwem LPS. LPS zwiększał wiązanie metylotransferaz histonowych Set1 i białaczka szpikowa / limfoidalna do tych promotorów, na które nie miały wpływu SAMe lub MTA. Działanie MTA w komórkach RAW zostało potwierdzone in vivo u myszy leczonych LPS. Egzogenny SAMe jest niestabilny i spontanicznie przekształca się w MTA, który jest stabilny i przepuszczalny dla komórek. stabilny i przepuszczalny dla komórek. Leczenie SAMe podwoiło wewnątrzkomórkowe MTA i S-adenozylohomocysteiny (SAH). SAH hamowała również wiązanie H3K4 do promotorów TNFalfa i promotorów iNOS. WNIOSEK: Mechanizm farmakologicznego działania hamującego SAMe na mediatory prozapalne są głównie mediowane przez MTA i SAH na poziomie metylacji histonów. --- vSET (wirusowe białko z domeną SET) jest atrakcyjnym surogatem kompleksu represyjnego polycomb 2 (PRC2) do badania wpływu metylacji lizyny 27 histonu H3 (H3K27) na transkrypcję genów. na transkrypcję genów, ponieważ oba katalizują trimetylację histonu H3K27. Aby kontrolować aktywność enzymatyczną vSET in vivo za pomocą zmodyfikowanego analogiem S-adenozylo-l-metioniny (SAM) jako kofaktorem donora metylu, przeprowadziliśmy projektowanie, syntezę i charakterystykę ortogonalnych mutantów metylotransferazy vSET wykorzystując strategię "bump-and-hole". --- Dowody wskazują, że niepowodzenie transferu jądrowego (NT) zarodków do rozwoju można przypisać, przynajmniej częściowo, wykorzystaniu zróżnicowanego jądra komórkowego jako karioplastu dawcy. jądra komórkowego jako karioplastu dawcy. Postawiono hipotezę, że produkcja blastocysty blastocysty i rozwój sklonowanych zarodków może różnić się pomiędzy podwojeniami populacji (PD) tej samej linii komórkowej w wyniku zmian w metylacji DNA i acetonach histonów. metylacji DNA i acetylacji histonów podczas hodowli in vitro. Celem Celem tego badania było określenie wzorców ekspresji genów białek remodelujących chromatynę metylotransferazy DNA-1 (Dnmt1), metylu CpG białka wiążącego metyl CpG-2 (MeCP2) i deacetylotransferazy histonowej-1 (HDAC1), oprócz oprócz pomiaru poziomów metylacji DNA i acetylacji histonów komórek fibroblastów bydlęcych w różnych PD. Linie komórkowe fibroblastów bydlęcych zostały utworzono z czterech 50-dniowych płodów. Względne poziomy Dnmt1, MeCP2, HDAC1, metylowanego DNA i acetylowanego histonu analizowano w PD 2, 7, 15, 30, 45, i 70. Poziomy RNA Dnmt1, HDAC1 i MeCP2 zbadano za pomocą Q-PCR. Globalne metylowanego DNA i acetylowanego histonu określono przez inkubację komórek z utrwalonych komórek z przeciwciałem anty-5-metylocytydynowym i anty-acetylo-histonowym H3, odpowiednio. Komórki wyznakowano drugim przeciwciałem, wybarwiono jodkiem propidium i przeanalizowano. jodkiem propidium i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Dane te pokazują, że mRNA białek remodelujących chromatynę zaangażowanych w modyfikacje epigenetyczne są zmienione podczas hodowli in vitro. Wzory metylowanego DNA i acetylowanych histonów komórek in vitro zmieniają się wraz z czasem hodowli. Późniejsze wykorzystanie tych komórek do NT zapewni wgląd w to, jak te modyfikacje epigenetyczne wpływają na przeprogramowanie. --- Metylaza białkowa III (metylotransferaza S-adenozylometionina:proteinlyzyna; ED 2.1.1.25) i metylazy białkowej I (metylotransferazy S-adenozylometionina:białko-arginina (metylotransferaza S-adenozylometionina:białko-arginina; EC 2.1.1.23) zbadano odpowiednio w izolowanych jądrach i frakcji i frakcji cytozolu, odpowiednio, z różnych wątrobiaków o różnym tempie wzrostu. szybkości wzrostu. Aktywność enzymatyczna obu enzymów odpowiadała szybkości wzrostu guza w szybko i umiarkowanie rosnących wątrobiakach. Równoległość była bardziej bardziej widoczna w przypadku metylazy białkowej I niż metylazy białkowej III. Podczas gdy aktywność aktywność metylazy białkowej III była podwyższona w szybko i umiarkowanie rosnących wątrobiakach. enzymu odpowiedzialnego za demetylację białek, epsilon-alkilolizynaza (epsilon-slkyl-L-lizyna:oksydoreduktaza tlenowa; EC 1.5.3.4), miała odwrotny związek z szybkością wzrostu guza, a zatem sugerując możliwy fizjologiczny antagonizm. Gdy izolowane jądra wątroby szczura były metylowane in vitro za pomocą S-adenozylo-L-[metylo-14 C]metioniny jako donora metylu jako donora metylu, nierozpuszczalne w H2SO4 białko i histony miały prawie równe ilości metylo-14 C. Jednak analiza aminokwasów wykazała, że metylowane argininy są dominującą formą radioaktywności w białku nierozpuszczalnym w H2SO4 białka (produkt metylazy białkowej I), podczas gdy metylowane lizyny są głównymi metylowane aminokwasy w histonach (produkt metylazy białkowej III). Ponadto hydrolizat białka nierozpuszczalnego w H2SO4 wykazał cztery nieznane piki radioaktywności pików radioaktywności na analizatorze aminokwasów oprócz znanych metylowanych pochodnych argininy i lizyny. --- Metylotransferazy lizyny białkowej są ważnymi regulatorami sygnalizacji epigenetycznej. sygnalizacji epigenetycznej. Enzymy te katalizują transfer donorowych grup metylowych z S-adenozylometioniny do specyficznych akceptorowych lizyn na histonach, co prowadzi do zmian w strukturze chromatyny i regulacji transkrypcji. Enzymy te również metylują substraty białek niehistonowych, ujawniając dodatkowy mechanizm regulujący fizjologię komórkową. Onkogenne białko SMYD2 hamuje funkcjonalną aktywność funkcjonalną aktywność białek supresorowych nowotworów p53 i Rb, czyniąc z niego atrakcyjnym celem dla leków. Tutaj donosimy o odkryciu AZ505, silnego i selektywnego inhibitora SMYD2. selektywnego inhibitora SMYD2, który został zidentyfikowany na podstawie wysokoprzepustowego ekranu chemicznego chemicznych. Przedstawiamy również struktury krystaliczne SMYD2 z peptydami substratu i produktu p53. peptydami, a zwłaszcza w kompleksie z AZ505. Ten substratowo konkurencyjny inhibitor jest związany w rowku wiążącym peptyd SMYD2. Wyniki te mają implikacje dla rozwoju inhibitorów SMYD2 i wskazują na potencjał do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na tę klasę docelową. --- Niektóre reszty lizyny na ogonach histonów mogą być metylowane przez metylotransferazy lizyny białkowej (PKMT) (PKMT) przy użyciu S-adenozylo-L-metioniny (AdoMet) jako donora metylu. donora metylu. Ponieważ stany metylacji docelowych lizyn odgrywają fundamentalną rolę w regulacji odgrywają fundamentalną rolę w regulacji struktury chromatyny i ekspresji genów, ważne jest ważne jest zbadanie właściwości PKMT, która pozwala na określoną liczbę grup metylowych (jedną, dwie lub trzy). (jedną, dwie lub trzy) (określane jako specyficzność produktu). Zostało wykazano, że specyficzność produktu PKMT może być częściowo kontrolowana przez istnienie specyficznych reszt w miejscu aktywnym. Jednym z najlepszych przykładów jest przełącznik Phe/Tyr występujący w wielu PKMT. Tutaj mechanika kwantowa/molekularna mechaniczna (QM/MM) dynamika molekularna (MD) i symulacje energii swobodnej są przeprowadzono na dzikim typie białka podobnego do G9a (GLP) oraz jego mutantach F1209Y i Y1124F w celu zrozumienia energetycznego pochodzenia specyficzności produktu i przyczyny zmiany specyficzności produktu w wyniku mutacji pojedynczych reszt mutacje w przełączniku Phe/Tyr, jak również w innych pozycjach. Energia swobodna procesów transferu metylu obliczone na podstawie naszych symulacji są zgodne z danymi eksperymentalnymi, wspierając sugestię, że względne bariery bariery energii swobodnej mogą określać, przynajmniej częściowo, specyficzność produktu PKMT. Zmiany barier energii swobodnej w wyniku mutacji są również na podstawie informacji strukturalnych uzyskanych z symulacji. symulacji. Wyniki sugerują, że przestrzeń i interakcje w miejscu aktywnym wokół grupy ε-aminowej docelowej lizyny dostępnej dla addycji metylu wydają się być jednymi z kluczowych czynników strukturalnych w kontrolowaniu produktu specyficzność i aktywność PKMT. --- Grzyb strzępkowy Aspergillus nidulans posiada pojedynczy gen dla syntetazy S-adenozylometioniny (SAM) SasA. syntetazy S-adenozylometioniny (SAM) SasA, podczas gdy wiele innych organizmów posiada wiele syntetazy SAM. Ten konserwowany enzym katalizuje reakcję metioniny i ATP do wszechobecnego donora grupy metylowej SAM. SAM jest głównym donorem grup metylowych dla metylotransferaz modyfikujących DNA, RNA, białka, metabolity lub docelowe substraty fosfolipidowe. Pokazujemy tutaj, że pojedyncza syntetazy SAM A. nidulans kodujący gen syntetazy SAM sasA jest niezbędny. Nadekspresja sasA, kodującego głównie białko cytoplazmatyczne, doprowadziła do upośledzenia rozwoju w tym tylko małych sterylnych owocników, które są otoczone niezwykle pigmentowane pomocnicze komórki Hülle. Komórki Hülle są jedynym typem komórek grzyba, który nie zawierają znaczących ilości SasA. Produkcja sterigmatocystyny jest zmieniona, gdy sasA ulega nadekspresji, co sugeruje wady w koordynacji rozwoju i metabolizmu wtórnego. rozwoju i metabolizmu wtórnego. SasA wchodzi w interakcje z różnymi białkami metabolicznymi białka, w tym metionina lub mitochondrialne enzymy metaboliczne, jak również białkami zaangażowanymi w morfogenezę grzybów. Interakcja SasA z histonem-2B może odzwierciedlać przypuszczalne epigenetyczne powiązanie z ekspresją genów. Nasze dane sugerują odrębną rolę SasA w koordynowaniu wtórnego metabolizmu i rozwoju grzybów. rozwoju. --- Wiele białkowych metylotransferaz argininowych jest zaangażowanych w transkrypcyjną aktywację receptorów jądrowych. aktywacji receptorów jądrowych. Metylotransferaza argininowa 1 (CARM1) związana z koaktywatorem Metylotransferaza 1 (CARM1) - za pośrednictwem metylacji histonów wykazano, że aktywuje transkrypcję zależną od receptora jądrowego; jednak niewiele wiadomo o regulacji jego aktywności enzymatycznej. Tutaj donosimy, że aktywność aktywność metylotransferazy CARM1 jest negatywnie regulowana przez fosforylację na konserwowanej reszcie serynowej. Kiedy reszta serynowa jest zmutowana do kwasu glutaminowego, który naśladuje fosforylowaną resztę serynową, zmutowana CARM1 mutant CARM1 wykazuje zmniejszoną zdolność wiązania donora metylu adenozylometioniny i zmniejszoną aktywność metylacji histonów. Co więcej, taka mutacja prowadzi do zahamowania transaktywacji CARM1 transkrypcji zależnej od receptora estrogenowego. transkrypcji zależnej od receptora estrogenowego. Nasze wyniki stanowią przykład regulacji aktywności metylotransferazy argininowej białek przez fosforylację. Jako CARM1 jest silnym koaktywatorem transkrypcji receptora estrogenowego, nasze wyniki sugerują, że fosforylacja CARM1 służy jako unikalny mechanizm dla inaktywacji regulowanej przez CARM1 ekspresji genów zależnych od estrogenu. --- Białko Ezh2 (Enhancer of zeste homolog 2) jest enzymatycznym składnikiem kompleksu represyjnego Polycomb 2 (PRC2). kompleksu represyjnego Polycomb 2 (PRC2), który hamuje ekspresję genów poprzez metylację lizyny 27 histonu H3 (H3K27) i reguluje proliferację i różnicowanie komórek podczas rozwoju embrionalnego. różnicowanie podczas rozwoju embrionalnego. Niedawno zidentyfikowano mutacje hot-spot Ezh2 zidentyfikowano w rozlanych chłoniakach z dużych komórek B i chłoniakach pęcherzykowych. chłoniakach grudkowych. Aby zbadać, czy wzrost guza jest zależny od aktywności enzymatycznej Ezh2, opracowaliśmy silny i selektywny małocząsteczkowy inhibitor, EI1, który hamuje aktywność enzymatyczną Ezh2 poprzez bezpośrednie wiązanie z enzymem z enzymem i konkurowanie z donorem grupy metylowej S-adenozylometioniną. Komórki traktowane EI1 wykazują utratę metylacji H3K27 w całym genomie i aktywację genów docelowych genów docelowych PRC2. Co więcej, hamowanie Ezh2 przez EI1 w rozproszonych dużych komórkach chłoniaków B niosących mutacje Y641 skutkuje zmniejszoną proliferacją, zatrzymaniem cyklu komórkowego proliferację, zatrzymanie cyklu komórkowego i apoptozę. Wyniki te zapewniają silne Ezh2 jako potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu nowotworów. raka. --- Enzymy z klasy metylotransferaz histonowych (HMT)(1), które metylują reszty lizyny histonów lub białek zawierają konserwowany rdzeń katalityczny określany jako domena SET który dzieli homologię sekwencji z niezależnie opisanym motywem sekwencji, domeną motywem sekwencyjnym, domeną PR. Nienaruszona sekwencja PR lub SET jest wymagana dla funkcji funkcji supresji nowotworów, ale pozostaje niejasne, czy to aktywność metylotransferazy histonów aktywność metylotransferazy histonów, która leży u podstaw supresji nowotworów. Teraz pokazujemy, że supresor nowotworów RIZ1 (PRDM2) metyluje histon H3 na lizynie 9, a aktywność ta jest zmniejszona przez mutacje w sekwencji aktywność jest zmniejszona przez mutacje w domenie PR występujące w ludzkich nowotworach. Również, S-adenozylohomocysteina lub niedobór donora metylu hamuje RIZ1 i inne aktywności metylacji H3 aktywność metylacji lizyny 9. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że aktywność metylacji lizyny 9 H3 aktywność metylacji lizyny 9 domeny PR/SET ma funkcje supresji nowotworu i mogą leżeć u podstaw kancerogenezy związanej z dietetycznym niedoborem metylo-dawców w diecie. --- Białka SET i MYND Domain (SMYD) stanowią unikalną rodzinę wielodomenowych metylotransferaz histonowych SET. SET, które są zaangażowane w progresję nowotworów u ludzi. Tutaj przedstawiamy analizę struktury krystalicznej pełnej długości ludzkiego białka SMYD3 w kompleksie z analogiem kofaktora donora metylu S-adenozylometioniny (SAM). kofaktorem. Struktura ujawniła ogólną zwartą architekturę, w której domena "split-SET" przyjmuje kanoniczny fałd domeny SET i ściśle łączy się z wiążącą Zn domeną MYND i C-końcową superhelikalną wiązką 9 α-helikalną podobny do tego obserwowanego dla mysiej struktury SMYD1. Razem te strukturalnie połączone domeny nakładają wysoce ograniczoną kieszeń wiążącą dla substratów histonowych dla substratów histonowych, sugerując regulowany mechanizm jego aktywności enzymatycznej. Nasze analizy mutacyjne i biochemiczne potwierdzają regulacyjną rolę unikalnych elementów strukturalnych elementów strukturalnych zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz domeny rdzenia SET i ustalają wcześniej niewykrytą preferencję dla trimetylacji H4K20. --- Rośliny syntetyzują S-metylometioninę (SMM) z S-adenozylometioniny (AdoMet), i metioniny (Met) poprzez unikalną reakcję i, podobnie jak inne organizmy, używają SMM jako jako donor metylu do syntezy Met z homocysteiny (Hcy). Te reakcje składają się na cykl SMM. Dwa cDNA Arabidopsis określające enzymy pośredniczące w reakcji w reakcji SMM --> Met (SMM:Hcy S-metylotransferaza, HMT) zostały zidentyfikowane na podstawie homologii i uwierzytelniono przez uzupełnienie mutanta Escherichia coli yagD i wykrywając aktywność HMT w uzupełnionych komórkach. Analizy żel-blot wskazują, że te enzymy, AtHMT-1 i -2, są kodowane przez geny jednokopijne. Wydedukowane polipeptydy mają podobną wielkość (36 kDa), mają wspólny motyw wiążący cynk, brak oczywistych sekwencji docelowych i są oczywistych sekwencji docelowych i są w 55% identyczne ze sobą. Rekombinowane enzymy rekombinowane enzymy istnieją jako monomery. AtHMT-1 i -2 wykorzystują l-SMM lub (S,S)-AdoMet jako donor metylu in vitro i mają wyższe powinowactwo do SMM. Oba enzymy wykorzystują również dowolny donor metylu in vivo, ponieważ oba przywracają zdolność do wykorzystywać AdoMet lub SMM do mutanta HMT drożdży. Jednakże, AtHMT-1 jest silnie hamowany przez Met, podczas gdy AtHMT-2 nie jest, różnica, która może mieć kluczowe znaczenie dla kontroli przepływu przez reakcję HMT i cykl SMM. Roślinna HMT jest wiadomo, że przenosi grupę metylową pro-R SMM. Umożliwiło nam to wykorzystanie rekombinowanego AtHMT-1 w celu ustalenia, że drugi enzym cyklu SMM, AdoMet:Met S-metylotransferaza, wprowadza grupę metylową pro-S. Te przeciwstawne stereoselektywności sugerują sposób pomiaru przepływu in vivo przez cykl SMM. SMM. --- Rośliny okrytozalążkowe syntetyzują S-metylometioninę (SMM) z metioniny (Met) i S-adenozylometioniny (AdoMet) w unikalnej reakcji katalizowanej przez Met S-metylotransferazę (MMT). SMM służy jako donor metylu do syntezy Met z homocysteiny, katalizuje homocysteiny, katalizowanej przez S-metylotransferazę homocysteiny (HMT). MMT i HMT razem stanowią daremny cykl SMM, który powstrzymuje pulę wolnej Met przed wyczerpaniem przez nadmierną syntezę AdoMet. Arabidopsis i kukurydza mają jeden gen MMT i co najmniej trzy geny HMT, które należą do dwóch klas i kodują enzymy o różnych właściwościach i wzorcach ekspresji. właściwościach i wzorcach ekspresji. SMM i przypuszczalnie jego cykl musiały zatem musiał zatem powstać przed rozdzieleniem się linii roślin dwuliściennych i jednoliściennych. Liście Arabidopsis, korzenie i rozwijające się nasiona wyrażają MMT i HMT i mogą metabolizować [35S]Met do [35S]SMM i odwrotnie. Cykl SMM działa zatem w całej roślinie. Wydaje się, że jest to ogólna cecha roślin okrytozalążkowych, ponieważ cyfrowe profile ekspresji genów profile ekspresji pokazują, że MMT i HMT są współeksprymowane w liściach, korzeniach i tkankach reprodukcyjnych kukurydzy i innych gatunków. Model in silico cyklu SMM w dojrzałych liściach Arabidopsis został opracowany na podstawie pomiarów kinetyki radioznacznika i danych dotyczących wielkości puli. Model ten wskazuje, że cykl SMM zużywa połowę wyprodukowanego AdoMet i sugeruje, że cykl służy do zatrzymania akumulacji AdoMet. akumulacji AdoMet, a nie do zapobiegania wyczerpywaniu się wolnego Met. Ponieważ roślinom brakuje pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego, które regulują wielkość puli AdoMet u innych eukariontów, cykl SMM może być głównym mechanizmem, dzięki któremu rośliny osiągają krótkoterminową kontrolę poziomu AdoMet. --- Metylaza białkowa III odpowiedzialna za specyficzną metylację cytochromu c w Neurospora crassa została częściowo scharakteryzowana przy użyciu niezmetylowanego końskiego cytochromu końskiego cytochromu c jako substratu. Enzym ten wykorzystuje S-adenozylo-L-metioninę jako donor metylu. Analiza rozkładu grup [14C]metylowych w peptydach peptydów otrzymanych przez trawienie chymotrypsyną enzymatycznie metylowanego cytochromu c wykazała, że całą radioaktywność można odzyskać w ramach pojedynczego piku po chromatografii. Wskazuje to, że enzym metyluje specyficzną sekwencję aminokwasów w cytochromie c. Na hydrolizie radioaktywnego chymotryptoproteiny c. radioaktywnego peptydu chymotryptowego, epsilon -N-mono-metylo-lizyna znakowana Me-14C, epsilon-N-dimetylo-lizynę i epsilon-N-trimetylo-lizynę. Enzym enzym można łatwo wyekstrahować z podkładek grzybni N. crassa i został oczyszczony około 30-krotnie. --- Wyciszanie genów Polycomb wymaga aktywności metylotransferazy histonowej kompleksu represyjnego Polycomb 2 (PRC2), która metyluje lizynę 27 histonu H3. Informacje na temat działania PRC2 są ograniczone przez brak danych strukturalnych na temat podjednostki katalitycznej podjednostki katalitycznej, Enhancer of zeste (E(Z)), oraz niedostateczną liczbą mutantów E(z) które zmieniają jego domenę SET. Tutaj analizujemy allele missense Drosophila E(z), wybrane do badań molekularnych ze względu na ich dominujące efekty genetyczne. efekty genetyczne. Cztery allele missense identyfikują kluczowe reszty domeny SET E(Z), a piąty znajduje się w sąsiedniej domenie C a piąty znajduje się w sąsiedniej domenie CXC. Analiza zmutowanych kompleksów PRC2 in vitro i metylacji H3-K27 in vivo pokazuje, że każda mutacja domeny SET zaburza metylotransferazę histonów PRC2. W oparciu o znane struktury domeny SET, mutacje prawdopodobnie wpływają albo na kieszeń wiążącą lizynę-substrat, albo na miejsce wiązania dawcy metylu adenozylometioniny lub krytyczną tyrozynę przewidywanej do interakcji z grupą epsilon-aminową lizyny substratu. Natomiast mutant CXC zachowuje aktywność katalityczną, specyficzność Lys-27 i zdolność trimetylacji. zdolność trimetylacji. Analiza delecji ujawnia również wymóg funkcjonalny dla konserwowanej domeny E (Z) N-końcowej do CXC i SET. Wyniki te identyfikują krytyczne reszty domeny SET potrzebne do funkcjonowania enzymu PRC2, a także podkreślają funkcjonalny wkład spoza domeny SET. --- Metylacja lizyny białkowej występuje powszechnie w Crenarchaeota, głównym królestwie Archaea. królestwie Archaea. Jednak enzymy odpowiedzialne za ten typ modyfikacji potranslacyjnej posttranslacyjne nie zostały znalezione. Tutaj przedstawiamy identyfikację i charakterystykę pierwszej białkowej metylotransferazy lizyny metylotransferazy lizyny, oznaczonej jako aKMT, z hipertermofilnego krenarchaeona Sulfolobus islandicus. Enzym ten był zdolny do przenoszenia grup metylowych na wybranych reszt lizyny w białku substratowym przy użyciu S-adenozylo-l-metioniny (SAM) jako donora metylu. aKMT, białko niebędące domeną SET, jest wysoce konserwowane wśród crenarchaea, a daleko spokrewnione homologi istnieją również u Bacteria i aKMT była aktywna w szerokim zakresie temperatur, od ~25 do 90 °C. Optymalna temperatura wynosiła od ~60 do 90 °C, z optymalną temperaturą przy ~60 do 70 °C. Reszty aminokwasowe Y9 i T12 na na końcu N wydają się być kluczowymi resztami w domniemanym miejscu aktywnym aKMT, na co wskazuje zachowanie sekwencji i mutageneza ukierunkowana na miejsce. Chociaż aKMT została zidentyfikowana na podstawie jej aktywności metylującej na Cren7, białko chromatyny cren7, białku chromatyny crenarchaeal, wykazywała ona szeroką specyficzność substratową i była zdolny do metylowania wielu rekombinowanych białek Sulfolobus nadprodukowanych w Escherichia coli. Odkrycie aKMT pomoże wyjaśnić mechanizmy podkreślających rozległą metylację lizyny białek i funkcjonalne znaczenie potranslacyjnej metylacji białek. funkcjonalnego znaczenia potranslacyjnej metylacji białek u crenarchaea.
Co jest donorem metylu dla metylotransferaz histonowych?
Głównym donorem metylu dla metylotransferaz histonowych (HMT) jest S-adenozylo-L-metionina (SAM, AdoMet).