W tym badaniu przeprowadziliśmy pierwszą na dużą skalę identyfikację N-końcowych peptydów peptydów z zielonej bakterii siarkowej Chlorobaculum tepidum. Połączona frakcyjna chromatografia diagonalna (COFRADIC) została użyta do izolacji białek N-końcowe peptydy z trzech różnych preparatów proteomu, a następnie Analiza LC-MS / MS, ponad 621 różnych białek zostało zidentyfikowanych przez ich N-końcowe peptydy. Nasze dane stanowią największy obecnie zestaw danych dostępny dla N-końców białek prokariotycznych organizmów fotosyntetyzujących. --- Przedstawiamy tutaj nowatorski projekt proteomiki do systematycznej identyfikacji zdarzeń rozszczepienia proteazy przez ilościową proteomikę N-końcową, omijając potrzebę czasochłonnej ręcznej walidacji. Omijamy problem wykrywania singletonów peptydów neo-N-końcowych generowanych przez proteazy poprzez wprowadzenie różnicowe znakowanie izotopowe proteomu, dzięki czemu te substratowe peptydy reporterowe są łatwo odróżniane od wszystkich innych peptydów N-końcowych. Nasze podejście podejście zostało zweryfikowane przy użyciu kanonicznej ludzkiej proteazy kaspazy-3 i dalej zastosowane do przetwarzania substratów mysich katepsyn D i E w proteomie mysich komórek dendrytycznych proteomu komórek dendrytycznych, identyfikując największy zestaw substratów proteaz białkowych w historii i uzyskanie nowego wglądu w różnice w specyficzności substratowej tych katepsyn. tych katepsyn. --- N-końcowa acetylacja białek jest jedną z najczęściej występujących modyfikacji współ- i potranslacyjnie na białkach eukariotycznych lub prokariotycznych. Jednakże, w porównaniu do innych modyfikacji białek, fizjologiczna rola N-końcowej acetylacji białek jest stosunkowo niejasna. Aby zbadać biologiczne funkcje N-końcowej acetylacji białek, solidna i wielkoskalowa metoda analizy jakościowej i ilościowej tej modyfikacji. jakościowej i ilościowej analizy tej modyfikacji. Wzbogacenie N(α)-acetylowanych peptydów lub usunięcie wolnych N-końcowych i wewnętrznych peptydów tryptycznych przed analizą. wewnętrznych peptydów tryptycznych przed analizą za pomocą spektrometrii mas są konieczne. w oparciu o obecne technologie. W niniejszym badaniu zademonstrowano prostą frakcjonację kationowym (SCX) do selektywnego wzbogacania N(α)-acetylowanych peptydów tryptycznych poprzez dimeryzację N(α)-acetylowane peptydy tryptyczne poprzez znakowanie dimetylem bez konieczności stosowania żmudnych procedur ochronnych etykietowania i zubożania procedur. Metoda ta została wprowadzona dla kompleksowej analizy N-końcowych acetylowanych białek z komórek HepG2. Kilkaset N-końcowych miejsc acetylacji zostało łatwo zidentyfikowanych w pojedynczej frakcji przepływowej SCX. SCX. Co więcej, N(α)-acetylowane peptydy niektórych izoform białka izoform białkowych były jednocześnie obserwowane we frakcji przepływowej SCX, co wskazuje, że podejście to może być wykorzystane do rozróżnienia izoform białkowych izoform o bardzo podobnych pełnych sekwencjach, ale różnych sekwencjach N-końcowych, takich jak β-aktyna/γ-aktyna, ERK1/ERK2, α-centraktyna/β-centraktyna oraz ADP/ATP 2 i 3. W porównaniu z innymi metodami, metoda ta jest stosunkowo prosta i może być bezpośrednio zaimplementowana w schemacie dwuwymiarowej separacji (SCX-RP) i spektrometrii masowej schemat spektrometrii dla ilościowej proteomiki N-końcowej przy użyciu stabilnego izotopu stabilnego izotopu dimetylu.
Dlaczego używamy terminu "proteomika N-końcowa"?
N-końcowa proteomika pozwala na systematyczną identyfikację zdarzeń rozszczepienia proteazy/peptydazy, ujawniając specyficzność rozszczepienia substratu.