Ekspresja mysiego genu aktyny alfa-sercowej w mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym jest regulowana przez enhancery leżące 5' do proksymalnego promotora. Tutaj przedstawiamy charakterystykę specyficznego dla serca enhancera zlokalizowanego w obrębie -2.354/-1.36 kbp genu, który jest aktywny w kardiocytach, ale nie w komórkach mięśni szkieletowych C2. In vivo kieruje on ekspresję genu reporterowego do dorosłego serca, gdzie sam promotor sam promotor proksymalny jest nieaktywny. Region 85-bp w obrębie enhancera jest jest wysoce konserwatywny między człowiekiem a myszą i zawiera centralne miejsce bogate w AT, które jest niezbędne dla aktywności enhancera. Miejsce to wiąże czynniki wzmacniacza miocytów (MEF)2, głównie MEF2D i MEF2A w ekstraktach jądrowych kardiocytów. ekstraktach jądrowych kardiocytów. Wyniki te zostały omówione w kontekście aktywności MEF2 i regulacji regulacji locus aktyny alfa-sercowej. --- Scharakteryzowaliśmy specyficzne elementy regulacyjne DNA odpowiedzialne za funkcję wzmacniacza specyficznego dla mięśni ludzkiego genu troponiny C (cTnC) w komórkach miogennych komórkach miogennych. Wykorzystaliśmy funkcjonalne testy przejściowej transfekcji z delecją i mutagenezą specyficzną dla miejsca, aby ocenić rolę konserwatywnej sekwencji elementów. Testy przesunięcia ruchliwości elektroforezy żelowej (EMSA) wykazały zdolność funkcjonalnych miejsc do interakcji z białkami jądrowymi. My wykazać, że trzy różne miejsca wiązania aktywatora transkrypcji powszechnie występujące w enhancerach specyficznych dla mięśni (miejsce MEF-2, miejsce MEF-3 i co najmniej cztery nadmiarowe miejsca E-box) wszystkie przyczyniają się do pełnej aktywności wzmacniacza, ale CArG nie. Mutacja miejsc MEF-2 lub MEF-3 lub delecja miejsc E-box zmniejsza ekspresję o 70% lub więcej. Co więcej, miejsce MEF-2 i E-boxy wiążą się specyficznie, odpowiednio, z MEF-2 i miogennymi czynnikami determinującymi czynników pochodzących z ekstraktów jądrowych. Testy EMSA z użyciem oligonukleotydu zawierającego MEF-3 oligonukleotyd ujawniły nierozróżnialne wzory separacji z ekstraktami z komórek miogennych i niemiogennych. Dane te sugerują, że ekspresja genu cTnC w mięśniach szkieletowych wolnokurczliwych jest podtrzymywana przez złożone interakcje w enhancerze 3'Ile między specyficznymi dla mięśni i mięśniowymi i niespecyficznymi czynnikami transkrypcyjnymi: miogenny kompleks bHLH lub MEF-2 może aktywować transkrypcję, ale tylko w obecności trzeciego aktywatora transkrypcyjnego, który wydaje się nie być specyficzny dla mięśni. Wnioskujemy z tych obserwacji, że element cTnC 3'Ile jest złożonym wzmacniaczem, który funkcjonuje poprzez połączone interakcje co najmniej pięciu elementów regulatorowych i ich pokrewnych czynników wiążących: trzech lub czterech E-boksów, miejsca MEF-2 i miejsca MEF-3. Dane potwierdzają pogląd, że wszystkie te miejsca przyczyniają się do funkcji enhancera w systemach komórkowych w sposób addytywny, ale żadne z nich nie jest absolutnie wymagane do aktywności wzmacniacza. Dane sugerują, że poziomy transkrypcji cTnC w tkankach miogennych, w których brakuje aktywności jednego z czynników transkrypcyjnych czynników transkrypcyjnych byłaby częściowo, ale nie całkowicie stłumiona. Nasze dane potwierdzają krytyczną rolę miejsc E-box w połączeniu z sąsiednimi elementami. sąsiadującymi elementami. W związku z tym przypisujemy regulację genów CTnC do kategorii "zwykłej" niż do "nowej" kategorii regulacji transkrypcji podczas miogenezy szkieletu. miogenezy szkieletowej. --- Elementy MCAT są niezbędne do ekspresji genów serca podczas rozwoju. Ptasie białka czynnika wzmacniającego transkrypcję-1 (TEF-1) są wzbogacone o mięśnie i przyczyniają się do aktywności wiązania MCAT. Jednak bezpośrednia aktywacja promotorów MCAT przez białka związane z TEF-1 nie została jednak jednolicie osiągnięta. Rozbieżne TEF (DTEF)-1 jest unikalnym członkiem wielogenowej rodziny TEF-1 z obfitymi transkryptów w sercu, ale nie w mięśniach szkieletowych. Tutaj pokazujemy, że białka DTEF-1 ulegają wysokiej ekspresji w sercu. Ekspresja białka jest aktywowana na bardzo wczesnych etapach embriogenezy piskląt (stadium Hamburger-Hamilton 4, 16-18 h), po czym DTEF-1 staje się obfity w zatoce żylnej i ulega ekspresji w w beleczkowanym komorowym mięśniu sercowym i komorowych drogach odpływu. Przez immunoprecypitację chromatyny immunoprecypitacji, DTEF-1 oddziałuje z promotorem sercowej troponiny T (cTnT) in vivo. DTEF-1 oddziałuje również z MEF-2 poprzez koimmunoprecypitację oraz niezależnie lub kooperatywnie (z MEF-2) transaktywuje promotor cTnT. Izoformy DTEF-1 nie aktywują promotora cTnT w fibroblastach lub mięśniach szkieletowych. mięśni szkieletowych. Ekspresja DTEF-1 występuje bardzo wcześnie w embriogenezie kurcząt (16-18 h), poprzedzając ekspresję białek sarkomerycznych i aktywuje promotory sercowe. Jako DTEF-1 może być wczesnym markerem fenotypu mięśnia sercowego. DTEF-1 trans-aktywuje promotor cTnT w sposób specyficzny dla tkanki, niezależnie od bogatych w AT, MEF-2 lub GATA. Zaobserwowany wzór przestrzenny sugeruje malejące poziom ekspresji od wlotu serca do dróg odpływu komorowego, co może oznaczać kardiogenną lub różnicującą ścieżkę, która jest równoległa do kierunek przepływu przez rozwijające się serce pisklęcia. --- Aby zrozumieć sieć regulacji transkrypcji w komórkach eukariotycznych, konieczne jest zidentyfikować funkcjonalne sekwencje cis-regulacyjne, które oddziałują z czynnikami czynnikami trans-działającymi. Opracowano szereg algorytmów do przewidywania wspólnych elementów cis-regulacyjnych dla współregulowanych genów o podobnych wzorcach ekspresji. wzorcami ekspresji. Jednak poprzednie metody zwykle dotyczą rozłącznych grup genów podzielone lub zgrupowane według arbitralnych punktów odcięcia, co może powodować utratę informacji. straty informacji. Aby wykluczyć etap definiowania zestawu genów, przyjęliśmy analizę wzbogacania i nazwaliśmy tę metodę analizą wzbogacenia miejsc wiązania (BSEA). BSEA została najpierw zastosowana do publicznie dostępnych danych ChIP-on-chip czynników transkrypcyjnych c-MYC, MAX i E2F czynników transkrypcyjnych, identyfikując znaczące wzbogacenie dla sygnatur odpowiednich czynników i potencjalnych koaktywatorów. Wykorzystując skalowaną w czasie ekspresję adipogenezy 3T3-L1, zaobserwowaliśmy wzbogacenie sygnatur znanych czynników adipogenicznych, takich jak adipogennych, takich jak C/EBPalpha, C/EBPbeta i PPARgamma, czasowo zbieżnych z wcześniejszymi doniesieniami. czasowo zbieżne z wcześniejszymi doniesieniami. BSEA została również zastosowana do specyficznych ekspresji u ludzi i myszy, identyfikując dobrze znane tkankowo-specyficzne czynniki transkrypcyjne, takie jak czynniki transkrypcyjne, takie jak HNF-4 w wątrobie i MEF-2 w sercu, wraz z innymi przypuszczalnymi regulatorami specyficznymi dla tkanek. Dzięki rozszerzonej wszechstronności radzenia sobie z różnymi rodzajami zbiorów danych mikromacierzy, BSEA może identyfikować kluczowe regulatory dla globalnych danych mikromacierzy, w których główną rolę odgrywa regulacja transkrypcji. Jako uogólniona metoda, BSEA pomogłaby w wyjaśnieniu transkrypcyjnych sieci regulacyjnych transkrypcyjnych, co stanowi główne wyzwanie w genomice funkcjonalnej. --- Wiążący heparynę czynnik wzrostu podobny do EGF (HB-EGF) jest członkiem rodziny EGF. który wiąże się i aktywuje receptor EGF. Transaktywowany przez angiotensynę II, ET-1 i różne czynniki wzrostu w kardiomiocytach, HB-EGF indukuje przerost mięśnia sercowego poprzez przerost mięśnia sercowego za pośrednictwem szlaków PI3K-Akt, kinazy MAP i JAK-STAT. Jednak niewiele wiadomo na temat potencjalnego zaangażowania szlaku ERK5 w przerost serca indukowany przez HB-EGF. W niniejszym raporcie zidentyfikowaliśmy i scharakteryzować nowy szlak MEK5-ERK5, który jest zaangażowany w indukowany przez HB-EGF przerost kardiomiocytów. HB-EGF (10ng/ml) znacząco zwiększył inkorporację [(3)H]-leucyny i ekspresję mRNA przedsionkowego czynnika natriuretycznego (ANF) w komórkach H9c2. w komórkach H9c2. Ponadto HB-EGF aktywował szlak MEK5-ERK5. Wstępne leczenie z inhibitorem EGFR AG1478 osłabiło aktywację ERK5. Blokada sygnału sygnalizacji MEK5-ERK5 przy użyciu siRNA MEK5 zmniejszyła zdolność HB-EGF do zwiększania wielkość komórek i ekspresję mRNA ANF, co sugeruje zaangażowanie szlaku EGFR-ERK5. EGFR-ERK5 w indukowanym przez HB-EGF przeroście kardiomiocytów. Dalej analizowaliśmy cyklooksygenazę-2 (COX-2). HB-EGF zwiększał ekspresję COX-2, odpowiedź odpowiedź za pośrednictwem sygnalizacji MEK5-ERK5, podczas gdy inhibitor COX-2 rofekoksyb osłabiał indukowaną przez HB-EGF ekspresję mRNA ANF, co sugeruje, że COX-2 jest również związany z przerostem kardiomiocytów indukowanym przez HB-EGF. Wiadomo, że ERK5 aktywuje rodzinę czynników transkrypcyjnych MEF 2 (myocyte enhancer factor). Następnie sprawdziliśmy, czy aktywacja MEF2A przyczynia się do ekspresji COX-2 indukowanej przez HB-EGF. ekspresję COX-2. Zahamowanie MEF2A za pomocą siRNA osłabiło indukowaną przez HB-EGF COX-2, ekspresję ANF i wielkość komórek. Podsumowując, HB-EGF indukuje przerost kardiomiocytów poprzez szlak EGFR-ERK5-MEF2A-COX-2. Nasze odkrycia pomogą nam lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne stojące za indukowanym przez HB-EGF przerost kardiomiocytów. --- Element promotorowy muscle-CAT (M-CAT) znajduje się w promotorach większości genów sercowych specyficznych dla mięśni genów serca, ale jego rola w patologii serca jest słabo słabo poznana. Tutaj badaliśmy, czy element M-CAT jest zaangażowany w proces proces hipertroficzny aktywowany przez mechaniczne rozciąganie i zidentyfikowaliśmy wewnątrzkomórkowe szlaki pośredniczące w odpowiedzi. Kiedy model rozciągania in vitro hodowanych kardiomiocytów noworodków szczurów i konstruktu reporterowego lucyferazy napędzanego przez promotor szczurzego peptydu natriuretycznego typu B (BNP), mutacja elementu M-CAT hamowała nie tylko podstawową aktywność reportera (88%), ale także transkrypcję BNP aktywowaną rozciąganiem (58%, p < 0,001). Aktywacja promotora BNP była związana ze wzrostem wiązania transkrypcyjnego czynnika wzmacniającego czynnika transkrypcyjnego-1 (TEF-1) po 24 godzinach mechanicznego rozciągania (p < 0,05). Zahamowanie kinaz białkowych aktywowanych mitogenami ERK, JNK lub p38 osłabiło aktywację BNP indukowaną rozciąganiem. aktywację BNP indukowaną rozciąganiem. Co ciekawe, w przeciwieństwie do p38 i JNK, zahamowanie ERK nie miało dodatkowego wpływu na aktywność transkrypcyjną promotora BNP promotora zawierającego mutację M-CAT, co sugeruje kluczową rolę ERK w regulacji transkrypcji BNP indukowanej rozciąganiem poprzez miejsce wiązania M-CAT. Wreszcie, badania immunoprecypitacji wykazały, że mechaniczne rozciąganie indukowało miocyty czynnik wzmacniający miocyty-2 (MEF-2) wiążący się z TEF-1. Dane te sugerują centralną rolę dla elementu M-CAT w regulacji odpowiedzi hipertroficznej indukowanej mechanicznym rozciąganiem odpowiedź poprzez aktywację ERK. --- Ostatnie badania zidentyfikowały konserwatywny element 28-bp (HF-1) w obrębie szczurzego genu MLC-2, który nadaje specyficzną dla mięśnia sercowego i indukowalną ekspresję podczas przerostu komórek mięśnia sercowego. ekspresję podczas przerostu komórek mięśnia sercowego. Wykorzystując kombinację niezależnych podejść eksperymentalnych, w niniejszym badaniu scharakteryzowano dwa czynniki jądrowe czynniki jądrowe, które wiążą się z HF-1, wszechobecny czynnik (HF-1a) i czynnik wiążący bogaty w A + T (HF-1a). T-bogaty czynnik wiążący (HF-1b), który jest preferencyjnie wyrażany w zróżnicowanych komórkach mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych. Miejsce wiązania HF-1a jest znajduje się w regionie rdzeniowym konserwowanego elementu 28-bp, bezpośrednio przed od bogatego w A + T miejsca HF-1b, które jest homologiczne do miejsca MEF-2 występującego w wielu genach mięśni. wielu genach mięśni. Według wielu odrębnych kryteriów (przesunięcie ruchliwości żelu, konkurencja i badania mutagenezy), HF-1b i MEF-2 wydają się być nierozróżnialne, a zatem są identyczne lub blisko spokrewnione z czynnikami mięśniowymi. czynniki. Testy przejściowe genów reporterowych lucyferazy zawierających mutacje punktowe mutacje w całym 28-bp elemencie regulatorowym HF-1 dokumentują znaczenie zarówno miejsca HF-1a, jak i HF-1b w testach przejściowych w komórkach mięśni komorowych. komórkach mięśnia komorowego. W natywnym 250-bp fragmencie promotora MLC-2, mutacje w pojedynczym polu E miały niewielki wpływ na specyficzność mięśnia sercowego, podczas gdy mutacje punktowe w w miejscu wiązania HF-1a lub HF-1b znacząco zmniejszały aktywność promotora, podkreślając znaczenie zarówno miejsc HF-1a, jak i HF-1b w aktywacji transkrypcyjnej tego mięśnia sercowego. aktywacji transkrypcyjnej tego genu mięśnia sercowego. Tak więc, to badanie dostarcza dowodów na to, że nowy, wszechobecny czynnik (HF-1a) i czynnik mięśniowy (HF-1b/MEF-2) mogą tworzyć nową, niezależną od E-box ścieżkę dla specyficznej dla mięśni ekspresji w komórkach mięśnia sercowego komory. --- UZASADNIENIE: Szlaki kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) zapewniają krytyczne połączenie między zewnętrznymi i wewnętrznymi sygnałami do przerostu serca. Kinaza białkowa regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK)5, nietypowa MAPK jest aktywowana w sercu przez przeciążenie ciśnieniowe. Jednakże, rola ERK5 odgrywa w w regulowaniu wzrostu przerostowego i apoptozy indukowanej przerostem nie jest do końca poznana. do końca poznana. CEL: W niniejszym badaniu zbadaliśmy rolę in vivo i mechanizm sygnalizacyjny w którym ERK5 reguluje przerost serca i apoptozę indukowaną przerostem. METODY I WYNIKI: Wygenerowaliśmy i zbadaliśmy fenotypy myszy z specyficzną dla kardiomiocytów delecją genu ERK5 (ERK5(cko)). W odpowiedzi na stres hipertroficzny, myszy ERK5(cko) rozwinęły mniejszy wzrost hipertroficzny i zwłóknienie niż w grupie kontrolnej. Jednakże, zwiększona apoptoza wraz z podwyższonym poziomem ekspresji Poziomy ekspresji p53 i Bad zaobserwowano w zmutowanych sercach. Konsekwentnie, stwierdziliśmy, że wyciszenie ekspresji ERK5 lub specyficzne zahamowanie aktywności kinazy jego aktywności kinazowej przy użyciu BIX02189 w kardiomiocytach noworodków szczurów (NRCM) zmniejszona aktywność transkrypcyjna czynnika wzmacniającego miocyty (MEF) 2 i stępiona odpowiedzi hipertroficzne. Ponadto, hamowanie aktywności MEF2 w NRCMs przy użyciu formy mutanta MEF2 nie wiążącego DNA stwierdzono osłabienie ERK5. WNIOSKI: Wyniki te ujawniają ważną funkcję ERK5 w przebudowie przerostowej serca przebudowie przerostowej serca i przeżyciu kardiomiocytów. Rola ERK5 w przebudowie przerostowej jest prawdopodobnie pośredniczona przez regulację aktywności MEF2 aktywność. --- Ograniczona do mięśnia sercowego ekspresja genu łańcucha ciężkiego alfa-miozyny (alfa-MHC) jest regulowana przez wiele elementów w proksymalnym enhancerze/promotorze. W obrębie tego regionu, miejsce M-CAT i miejsce bogate w A zostały zidentyfikowane jako potencjalne elementy regulacyjne. Mutacje specyficzne dla miejsca w każdym miejscu, indywidualnie, zmniejszały aktywność promotora typu dzikiego o około 85% w sercu dorosłego szczura wykazując, że miejsca te były pozytywnymi elementami regulacyjnymi. Miejsca M-CAT alfa-MHC, beta-MHC i troponiny sercowej T (cTnT) kurczaka oddziaływały z czynnikiem wiążącym M-CAT (MCBF) z ekstraktów jądrowych serca szczura który był immunologicznie związany z transkrypcyjnym czynnikiem wzmacniającym 1, czynnikiem który wiąże się w obrębie enhancera simian virus 40. Czynnik, który wiązał region bogaty w A (ARF) był antygenowo związany z rodziną białek RSRF, ARF był różnił się od specyficznego dla miocytów czynnika wzmacniającego 2 (MEF-2) na podstawie specyficzności wiązania DNA i ekspresji rozwojowej. Podobnie jak MEF-2, ARF aktywność wiązania DNA była obecna w sercu i mózgu; jednak nie wykryto aktywności ARF w ekstraktach z mięśni szkieletowych lub miotub C2C12. MCBF i ARF były regulowane rozwojowo z poziomami szczytowymi w 1- do 2-dniowym sercu noworodka. Aktywność obu czynników wzrosła prawie pięciokrotnie w sercach dorosłych szczurów poddanych przeciążeniu ciśnieniowemu. Dla porównania, poziomy czynnika wiążącego alfa-MHC 2 nie zmieniły się podczas przerostu. Miejsca wiązania dla MCBF i ARF są obecne w kilku genach, które są regulowane w górę podczas przerostu mięśnia sercowego. Nasze wyniki sugerują, że czynniki te uczestniczą w zmianach ekspresji genów, które występują podczas rozwoju i przerostu serca. przerostu mięśnia sercowego. --- W celu analizy regulacji transkrypcji podjednostki specyficznej dla mięśni podjednostki ludzkiego genu mutazy fosfoglicerynianowej (PGAM-M), geny chimeryczne składające się z regionu upstream genu PGAM-M i bakteryjnego bakteryjnej acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) zostały skonstruowane i transfekowane do miocytów szkieletowych C2C12, pierwotnie hodowanych komórek mięśnia sercowego i fibroblastów C3H10T1/2. Ekspresja chimerycznych genów reporterowych była ograniczona w komórkach mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego. W miotubach C2C12 i pierwotnie hodowanych komórkach mięśnia sercowego komórek mięśnia sercowego, odcinek między nukleotydami -165 i +41 względem od miejsca inicjacji transkrypcji był wystarczający do nadania maksymalnej aktywności CAT. Region ten zawiera dwa pola E i jeden motyw MEF-2. Analiza delecji i substytucji mutacji wykazały, że pojedynczy motyw MEF-2, ale nie pola E, miał istotny wpływ na istotny wpływ na aktywność enhancerową specyficzną dla mięśni szkieletowych i sercowych oraz że specyficzny dla mięśnia sercowego negatywny region regulatorowy znajdował się pomiędzy nukleotydami -505 i -165. Kiedy konstrukty genu PGAM-M były kotransfekowane MyoD do C3H10T1/2, profil aktywności CAT był podobny do obserwowanego w miotubach C2C12. obserwowany w miotubach C2C12. Analiza przesunięcia ruchliwości żelu wykazała, że gdy ekstrakty jądrowe z komórek mięśni szkieletowych i sercowych, miejsce PGAM-M MEF-2 generowało specyficzne pasmo, które było hamowane przez nieznakowane PGAM-M MEF-2 i oligomery mięśniowej kinazy kreatynowej MEF-2, ale nie przez zmutowany oligomer PGAM-M MEF-2. Obserwacje te definiują enhancer PGAM-M jako jedyny enhancer specyficzny dla serca i mięśni szkieletowych scharakteryzowany do tej pory, który jest aktywowany głównie przez MEF-2. --- Element MEF-2 bogaty w AT odgrywa ważną rolę w utrzymaniu ekspresji specyficznej dla mięśni ekspresji wielu genów mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych. W MLC-2, element bogaty w AT (HF-1b), który zawiera konsensusowe miejsce MEF-2 jest wymagany do ekspresji specyficznej dla tkanki serca. W niniejszym badaniu opisano izolację i charakterystykę cDNA, który koduje nowy palec cynkowy C2H2 palec cynkowy C2H2 (HF-1b), który wiąże się w sposób specyficzny dla sekwencji z miejscem HF-1b/MEF-2 w promotorze MLC-2. Szereg niezależnych kryteriów sugeruje, że białko palca cynkowego HF-1b białko palca cynkowego jest składnikiem endogennego wiązania HF-1b/MEF-2 w komórkach mięśnia sercowego i może służyć jako aktywator transkrypcji aktywator transkrypcji promotora MLC-2 w testach przejściowych. Badania te sugerują, że, oprócz wcześniej opisanych białek RSRF, strukturalnie rozbieżne czynniki transkrypcyjne mogą wiązać się z miejscami podobnymi do MEF-2 w promotorach mięśni. Te wyniki podkreślają złożoność regulacji programu genów mięśniowych poprzez te bogate w AT elementy w mięśniu sercowym i szkieletowym. --- Hormon tarczycy (T3) zwiększa transkrypcję genu retikulum sarkoplazmatycznego Ca2+ adenozynotrifosfatazy (ATPazy) (SERCA 2) poprzez trzy elementy odpowiedzi na hormon tarczycy elementy odpowiedzi na hormon tarczycy. Istnienie powtarzających się elementów cis z różnych konfiguracjach może pełnić określone funkcje, takie jak interakcje z jądrowymi czynnikami transkrypcyjnymi. Ponadto, obecność różnych izoform receptora T3 (T3R) może przyczyniać się do innego poziomu złożoność w zapewnianiu specyficzności działania T3. W tym badaniu zbadaliśmy interakcje T3R alfa 1-vs. T3R beta 1-specyficzne z miocytem czynnikiem specyficznym dla wzmacniacza miocytów-2 (MEF-2) na ekspresję genu SERCA 2 w testach transfekcji przejściowej w testach przejściowej transfekcji w embrionalnych komórkach H9c2 pochodzących z serca. MEF-2a w połączeniu z izoformami T3R alfa 1 lub T3R beta 1 spowodowało 2,5-krotny wzrost ekspresji transgenu SERCA 2 przy braku T3. Dodanie T3 nie wywołało dalszego wzrostu ekspresji SERCA 2, gdy wektory ekspresji T3R alfa 1 i MEF-2a były kotransfekowane. W przeciwieństwie do tego, w obecności T3R beta 1 i MEF-2, dodanie T3 zwiększyło aktywność acetylotransferazy chloramfenikolu aktywność acetylotransferazy o dodatkowe 2,2-krotne do całkowitego 5,5-krotnego wzrostu. wzrost. Interakcja między MEF-2a i T3R jest czynnikiem transkrypcyjnym specyficzny, ponieważ inny czynnik, który wiąże się z miejscami konsensusu MEF-2 (serce czynnik 1b) nie był w stanie oddziaływać z T3R. Ponadto MEF-2a nie był w stanie interakcji z innymi czynnikami jądrowymi (białko wiążące element odpowiedzi cAMP i Egr-1), które stymulują transkrypcję genu SERCA 2. Ponadto odkryliśmy, że pojedynczy homologiczny element odpowiedzi na hormon tarczycy nie jest w stanie pośredniczyć w interakcji między MEF-2a i T3R w celu zwiększenia transkrypcji genu SERCA 2. Nasze odkrycia wskazują na interakcje specyficzne dla izoformy T3R z czynnikiem transkrypcyjnym specyficznym dla typu komórki czynnikiem transkrypcyjnym (MEF-2) w regulacji ekspresji genu SERCA 2. --- Region międzygenowy między mysim łańcuchem ciężkim miozyny alfa-sercowej a genem łańcucha ciężkiego beta-miozyny wykazano wcześniej, że kieruje ekspresją bakteryjnego genu reporterowego acetylotransferazy chloramfenikolu u transgenicznych myszy. bakteryjnego genu reporterowego acetylotransferazy chloramfenikolu u transgenicznych myszy w sposób specyficzny dla tkanki. Analizy sekwencji zlokalizowały domniemany specyficzny dla miocytów czynnik wiążący enhancer (MEF-2) zlokalizowany w regulacyjnym regionu tego genu proksymalnie do miejsca startu transkrypcji. Rola tego elementu w kierowaniu specyficzną dla przedziału serca ekspresją transgenu. transgenu. Reakcja łańcuchowa polimerazy została wykorzystana do przeprowadzenia mutagenezy substytucyjnej mutagenezę substytucyjną miejsca wiązania MEF-2, a brak wiązania MEF-2 został potwierdzony przez testy opóźniania żelu. Wynikowy konstrukt został użyty do myszy transgenicznych. Co zaskakujące, ekspresja transgenu nie była w dół, ale była znacznie zwiększona w sercach myszy z mutacją MEF-2 zmutowanych myszy. Ponadto, specyficzna dla serca ekspresja transgenu była zaburzona ze znacznym poziomem ektopowej ekspresji występującej w aorcie. --- Molekularne determinanty, które kierują ekspresję genów do komór serca, są w większości nieznane. serca są w większości nieznane. Ponadto dostępnych jest niewiele danych na temat w jaki sposób określana jest przednia/tylna oś rurki serca i czy lewy i prawy przedsionek i komora są przypisane jako część tego procesu. procesu. Wykorzystując komorowy promotor łańcucha lekkiego miozyny-2 / transgen reporterowy beta-galaktozydazy transgenów reporterowych, określiliśmy minimalne sekwencje cis-działające wymagane do ekspresji genów specyficznych dla komór. W wielu niezależnych transgenicznych liniach myszy stwierdziliśmy, że zarówno 250-parowy łańcuch lekki miozyny-2 jak i dimeryzowany podelement 28 bp (HF-1) zawierający miejsca wiązania dla HF1a zawierający miejsca wiązania dla czynników HF1a i HF1b/MEF2, kierowany specyficzną dla komór ekspresję reporterową już od endogennego genu, w 7,5-8,0 dniu po porodzie. Podczas gdy endogenny gen jest wyrażany równomiernie w obu komorach, transgeny ulegały ekspresji w prawej dominujący sposób, co sugeruje, że zawierają one tylko podzbiór elementów, które reagują na informacje o położeniu w rozwijającym się przewodzie rurce serca. Ekspresja transgenu była autonomiczna komórkowo, a jego a jego charakterystyka czasowo-przestrzenna nie była zależna od szczepu myszy/stanu metylacji genomu. genomu. Aby określić, czy specyficzna dla komór ekspresja transgenu była zależna od genów regulatorowych wymaganych do prawidłowego różnicowania komór różnicowania komór, transgen o długości 250 par zasad został wyhodowany zarówno w receptorze retinoidu X i Nkx2-5. Transgen ulegał ekspresji w obu zmutowanych środowiskach, pomimo braku endogennego łańcucha lekkiego miozyny-2 w zarodkach Nkx2-5 null. Specyfikacja komór, jak na podstawie ekspresji transgenu, wydaje się zachodzić normalnie u obu mutantów. Tak więc, element HF-1 kieruje transkrypcją specyficzną dla komory transgenu niezależnie od receptora retinoidu X i Nkx2-5, i definiuje minimalną kombinatoryczną ścieżkę minimalną kombinatoryczną ścieżkę dla ekspresji genów komory komorowej. Wzorcowa ekspresja wzorzysta ekspresja tego transgenu może zapewnić modelowy system, w którym zbadać wskazówki, które dyktują przednio-tylne (prawa komora / lewa komora) gradienty podczas komory) podczas rozwoju serca ssaków.
Które geny są regulowane przez MEF-2 w sercu?
COX-2, ANF, gen receptora estrogenowego (ER) alfa, gen sekwestryny, casq2, cTnT, MCK, aktyna alfa-sercowa, sarko(endo)plazmowa retikulum Ca2+-ATPazy, SERCA, MLC-2, gen łańcucha ciężkiego miozyny alfa-sercowej, mutaza fosfoglicerynianowa i PGAM-M są regulowane przez MEF-2 w sercu.