Makroautofagia (zwana dalej autofagią) jest ewolucyjnie konserwowanym procesem katabolicznym proces kataboliczny niezbędny do normalnego recyklingu składników komórkowych składników komórkowych i odpowiedniej odpowiedzi na stres komórkowy. Chociaż kilka genów genów należących do głównej maszynerii molekularnej zaangażowanej w tworzenie autofagosomów stosunkowo niewiele wiadomo o naturze sieci sygnałowych kontrolujących autofagię. sieci sygnalizacyjnych kontrolujących autofagię po bodźcach wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych. zewnątrzkomórkowych. Odkryliśmy białka podobne do ATG8 (MAP1LC3B, GABARAP i GABARAPL1) jako nowe nowe interaktory MAPK15/ERK8, kinazy MAP zaangażowanej w proliferację komórek i transformację komórek. Opierając się na roli tych białek w procesie autofagii w procesie autofagii, wykazaliśmy, że MAPK15 jest rzeczywiście zlokalizowana w przedziałach autofagicznych i zwiększa, w sposób zależny od kinazy, białka podobne do ATG8 lipidację, tworzenie autofagosomów i degradację SQSTM1, jednocześnie zmniejszając LC3B. Co ciekawe, zidentyfikowaliśmy również konserwowany region oddziałujący z LC3 (LIR) w MAPK15 odpowiedzialny za jego interakcję z białkami podobnymi do białkami podobnymi do ATG8, za jego lokalizację w strukturach autofagicznych i, w konsekwencji za stymulację tworzenia tych przedziałów. Ponadto wykazaliśmy, że aktywność MAPK15 była indukowana w odpowiedzi na głód surowicy i aminokwasów. głód aminokwasowy i że ten bodziec z kolei wymagał endogennego MAPK15 do indukcji procesu autofagii. W sumie wyniki te sugerują nową funkcję MAPK15 jako regulatora autofagii, działającego poprzez interakcję z białkami z rodziny ATG8. Ponadto, w oparciu o kluczową rolę tego w kilku chorobach człowieka, wyniki te wspierają wykorzystanie tej kinazy MAP jako potencjalnego nowego celu terapeutycznego. --- U drożdży fosfatydyloetanoloamina jest celem modyfikatora Atg8 w reakcjach reakcje podobne do ubikwitylacji niezbędne dla autofagii. Trzy ludzkie homologi Atg8 (hAtg8) LC3, GABARAP i GATE-16, zostały scharakteryzowane jako modyfikatory w reakcjach pośredniczonych przez hAtg8. reakcjach, w których pośredniczą hAtg7 (enzym podobny do E1) i hAtg3 (enzym podobny do E2), tak jak w lipidacji Atg8 drożdży, ale ich ostateczne cele nie zostały zidentyfikowane. Wyniki Wyniki niedawnego badania, w którym komórki COS7 inkubowano z [14C]etanoloaminą przez 48 godzin sugerowały, że fosfatydyloetanoloamina jest celem LC3. Jednak wyniki te nie były rozstrzygające ze względu na długi czas inkubacji. czas inkubacji. Aby zidentyfikować cele fosfolipidowe homologów Atg8, my odtworzyliśmy systemy koniugacji dla ssaczych homologów Atg8 in vitro przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych białek Atg i liposomów. Każdy oczyszczony zmutowany homolog Atg8 z odsłoniętym C-końcowym Gly tworzył pośredni substrat E1 z hAtg7 poprzez wiązanie tioestrowe w sposób zależny od ATP i tworzył substrat pośredni E2 z hAtg3 poprzez wiązanie tioestrowe zależne od ATP i hAtg7. A sprzężoną formę każdego homologa Atg8 obserwowano w obecności hAtg7, hAtg3, ATP i liposomów. Oprócz fosfatydyloetanoloaminy, eksperymenty koniugacji in vitro z wykorzystaniem syntetycznych liposomów fosfolipidowych wykazały, że fosfatydyloseryna jest również celem LC3, GABARAP i GATE-16. W przeciwieństwie do tego, chromatografia cienkowarstwowa fosfolipidów uwolnionych podczas trawienia hAtg4B z endogenny koniugat LC3-fosfolipid ujawnił, że fosfatydyloetanoloamina, ale nie fosfatydyloseryna, jest dominującym docelowym fosfolipidem LC3 in in vivo. Rozbieżność między reakcjami in vitro i in vivo sugeruje, że mogą istnieć selektywne czynniki zaangażowane w endogenny system koniugacji LC3 system. --- ATG12, modyfikator podobny do ubikwityny wymagany do makroautofagii, ma pojedynczy znany cel koniugacji, inny regulator autofagii o nazwie ATG5. Tutaj zidentyfikowaliśmy ATG3 jako substrat dla koniugacji ATG12. ATG3 jest enzymem podobnym do E2 niezbędnym do lipidacji ATG8/LC3 podczas autofagii. Tworzenie kompleksu ATG12-ATG3 wymaga ATG7 jako enzymu E1 i autokatalitycznej aktywności ATG3 jako E2, co skutkuje kowalencyjnym połączeniem ATG12 z pojedynczą lizyną na ATG3. Co zaskakujące, zakłócenie koniugacji ATG12 z ATG3 nie wpływa na autofagię indukowaną głodem. Przeciwnie, brak tworzenia kompleksu ATG12-ATG3 powoduje wzrost masy mitochondriów i hamuje śmierć komórek, w której pośredniczą szlaki mitochondrialne. szlaki mitochondrialne. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te ujawniają rolę ATG12-ATG3 w homeostazie mitochondriów i implikują system koniugacji ATG12 w komórkach funkcje różne od wczesnych etapów tworzenia autofagosomów. --- Autofagia chroni homeostazę komórkową poprzez wychwytywanie składników cytozolowych i inwazyjne patogeny do degradacji lizosomalnej. Receptory autofagii kierują ładunek do autofagii poprzez wiązanie ATG8 na błonach autofagosomalnych. Ekspansja rodziny ATG8 u wyższych eukariontów sugeruje, że specyficzne interakcje z receptorami autofagii receptorami autofagii ułatwiają zróżnicowaną obsługę ładunku. Jednakże, selektywne interaktory ortologów ATG8 są nieznane. Tutaj pokazujemy, że selektywność receptora autofagii NDP52 dla LC3C ma kluczowe znaczenie dla odporności wrodzonej, ponieważ komórki pozbawione któregokolwiek z białek nie mogą chronić swojej cytoplazmy przed Salmonellą. LC3C jest wymagane do autofagii przeciwbakteryjnej, ponieważ pod jego nieobecność pozostałe ortologi ATG8 nie wspierają skutecznej autofagii przeciwbakteryjnej. Analiza strukturalna Analiza strukturalna ujawniła, że selektywność NDP52 dla LC3C jest zapewniana przez niekanoniczny LIR, w którym brak reszty aromatycznej jest równoważony przez interakcje specyficzne dla LC3C. Nasz raport ilustruje, że specyficzność w interakcji między receptorami autofagii a maszynerią autofagii ma funkcjonalne znaczenie dla znaczenie dla przeprowadzenia selektywnej autofagii. --- Atg4 jest wymagany do rozszczepienia Atg8, umożliwiając jego koniugację do fosfatydyloetanoloaminy na błonach fagoforów, co jest kluczowym krokiem w biogenezie autofagosomów. biogenezy autofagosomów. Dekoniugacja Atg8 z błon autofagosomalnych może być również etapem regulacyjnym w kontrolowaniu autofagii. Dlatego aktywność Atg4 jest ważna dla autofagii i może być celem interwencji terapeutycznej. W W tym badaniu zastosowano czułą i specyficzną metodę pomiaru aktywności dwóch homologów Atg4 homologów Atg4 w komórkach ssaków, Atg4A i Atg4B, opracowano przy użyciu fluorescencji podejście oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji (FRET). W ten sposób LC3B i GATE-16, dwa substraty substraty, które mogą być różnie rozszczepiane przez Atg4A i Atg4B, zostały połączone z CFP i YFP odpowiednio na N- i C-końcu, umożliwiając wystąpienie FRET. Sygnały FRET zmniejszyły się proporcjonalnie do rozszczepienia za pośrednictwem Atg4, które oddzieliło dwa białka fluorescencyjne. Metoda ta jest wysoce skuteczna do pomiaru aktywności enzymatycznej i kinetyki Atg4A i Atg4B w warunkach in vitro warunkach in vitro. Zastosowania testu wykazały, że aktywność Atg4B była zależna od jego katalitycznej cysteiny i poziomu ekspresji, ale wykazała niewielkie zmiany w kilku typowych warunkach autofagii. Ponadto, testy wykazały doskonałą wydajność w formacie o wysokiej przepustowości i są odpowiednie do badań przesiewowych i analizy potencjalnych modulatorów. Podsumowując, test oparty na FRET jest prosty i łatwy w użyciu, jest czuły i specyficzny oraz nadaje się zarówno do rutynowych pomiarów aktywności Atg4, jak i wysokoprzepustowych badań przesiewowych. --- Autofagia jest ważnym procesem katabolicznym odgrywającym rolę w przetrwaniu i śmierci komórek. śmierci komórki. Polega on na sekwestracji cytozolu i organelli w obrębie dwubłonowych które dostarczają swoją zawartość do lizosomów w celu degradacji. Biogeneza autofagosomów jest koordynowana przez białko związane z autofagią 4 (Atg4) z rodziny endopeptydaz C54 (Atg4A-Atg4D). Enzymy te przygotowują, a następnie a następnie delipidują marker autofagosomu, Atg8. Tutaj pokazujemy, że jeden z członków rodziny Atg4D, jest rozszczepiany przez kaspazę-3 in vitro i w komórkach apoptotycznych. Atg4D jest słabym enzymem primingu i delipidacji in vitro, ale skrócony DeltaN63 Atg4D wykazuje zwiększoną aktywność wobec paralogu Atg8, receptora kwasu gamma-aminomasłowego białko podobne do receptora kwasu gamma-aminomasłowego 1 (GABARAP-L1). W żywych komórkach DeltaN63 Atg4D stymuluje delipidację GABARAP-L1, podczas gdy wyciszenie siRNA genu ekspresji Atg4D znosi tworzenie autofagosomów GABARAP-L1 i uwrażliwia komórki na komórki na głód i śmierć komórkową indukowaną staurosporyną. Co ciekawe, nadekspresja Atg4D indukuje apoptozę, która jest poprzedzona niezależną od kaspaz rekrutacją Atg4D do mitochondriów. rekrutacja Atg4D do mitochondriów i jest ułatwiona przez przypuszczalną C-końcową domenę BH3 (Bcl-2 homology 3). Atg4D nabywa również powinowactwo do uszkodzonych mitochondria w komórkach poddanych działaniu nadtlenku wodoru. Dane te sugerują, że Atg4D jest regulatorem autofagii, który łączy dysfunkcję mitochondriów z apoptozą. apoptozą. --- Glikogen, rozgałęziony polimer glukozy, działa jako wewnątrzkomórkowa rezerwa węgla i energii w wielu typach komórek. w wielu tkankach i typach komórek. Ważnym szlakiem jego degradacji jest transport do lizosomów w procesie podobnym do autofagii. Zaproponowano zaproponowano, że białko 1 zawierające domenę wiążącą skrobię (Stbd1) może może uczestniczyć w tym mechanizmie poprzez kotwiczenie glikogenu do błon wewnątrzkomórkowych. Ponadto stwierdzono, że Stbd1 oddziałuje ze znanym białkiem autofagii, GABARAPL1, członkiem rodziny Atg8. Tutaj potwierdzamy tę interakcję i zidentyfikować motyw interakcji Atg8 (AIM) w Stbd1 niezbędny do wiązania GABARAPL1 wiązania, jak oceniono przez koimmunoprecypitację z ekstraktów komórkowych i kolokalizację w komórkach, o czym świadczy mikroskopia immunofluorescencyjna. Sekwencja AIM Stbd1 (200)HEEWEMV(206) leży w przewidywanym nieuporządkowanym regionie cząsteczki i pasuje do konsensusu cząsteczki i pasuje do konsensusu innych sekwencji AIM w białkach określających ładunek białek, takich jak p62 i Nix. Mutacja AIM, w tym mutacje jednopunktowe mutacje W203 lub V206, wyeliminowały kolokalizację Stbd1 zarówno z białkiem zarówno nadekspresją, jak i endogennym GABARAPL1. Stbd1 może zatem funkcjonować jako białko wiążące ładunek, które dostarcza glikogen do lizosomów w szlaku autofagii, który można by nazwać "szlakiem autofagii". szlaku, który można nazwać "glikofagią".
Jakie są homologi Atg8 u ludzi?
Autofagia (białko związane z autofagią 8 lub Atg8p lub APG8 lub AUT7 lub CVT5) jest białkiem drożdży zaangażowanym w transport cytoplazmy do pęcherzyków wakuoli (Cvt) i tworzenie autofagosomów. U drożdży jest reprezentowane przez pojedynczy gen, rodzina ATG8 u ludzi zawiera 6 członków (białko związane z mikrotubulami-1 łańcuch lekki 3A (MAP1LC3A), MAP1LC3B, MAP1LC3C, białko związane z receptorem GABA(A) (GABARAP), GABARAPL1 i GABARAPL2/GATE-16).