Wirusowy gen dla zabójczego białka 4 (KP4) został zbadany pod kątem jego działanie przeciwgrzybicze w genetycznie zmodyfikowanej pszenicy, aby pokonać w szczególności choroby przenoszone przez nasiona. In vitro obie ważne choroby przenoszone przez nasiona pszenicy, luźna smoła (Ustilago tritici) i śmierdząca (Tilletia caries), są podatne na KP4, podczas gdy wszystkie inne organizmy do tej pory okazały się niewrażliwe na KP4. Do badań in planta wykorzystaliśmy jako grzyba modelowego. W eksperymentach szklarniowych, dwie linie pszenicy transgeniczne wobec KP4 wykazały do 30% niższy rozwój objawów w porównaniu z nietransgeniczną kontrolą. nietransgenicznej kontroli. Jako ostatni krok na drodze do udowodnienia słuszności koncepcji, testy polowe po raz pierwszy wykazały zwiększoną odporność transgenu na grzyby w pszenicy. pszenicy. Ze względu na swoją specyficzność wobec smutów i bułeczek, KP4 stanowi bardzo niskie ryzyko dla ludzi i środowiska. ryzyko dla ludzi i środowiska. Testy polowe w Szwajcarii są regulowane przez regulowane przez surowe prawo, które w przypadku badań jest akceptowalne, jeśli jest prawnie i naukowo prawidłowo stosowane. --- Zabójcze toksyny to polipeptydy wydzielane przez niektóre gatunki grzybów, które zabijają wrażliwe komórki tego samego lub pokrewnego gatunku. W najlepiej scharakteryzowanych przypadkach, działają poprzez tworzenie nowych porów w błonie komórkowej i zakłócanie jonów. Odporność lub odporność na toksyny jest nadawana przez preprotoksyny (lub ich produkty) lub przez geny oporności jądrowej. W kilku przypadkach toksyny są kodowane przez jeden lub więcej segmentów genomowych rezydentnych dwuniciowych wirusów RNA. RNA. Znane toksyny składają się z jednego do trzech polipeptydów, zwykle zazwyczaj w postaci multimerów. Dokonaliśmy dalszej charakterystyki zabójczej toksyny KP4 z kukurydzy Ustilago maydis. Toksyna ta jest również kodowana przez pojedynczy wirusowy dwuniciowy RNA, ale różni się od innych znanych toksyn zabójców pod kilkoma względami aspektach: nie ma glikozylacji związanej z N ani w prekursorze, ani w dojrzałym polipeptydzie. dojrzałym polipeptydzie, jest to pierwsza toksyna zabójcza wykazana jako pojedynczy polipeptyd i nie jest przetwarzany przez żadną ze znanych proteinaz wydzielniczych (innych niż peptydaza sygnałowa). Jest wydajnie wyrażany w heterologicznym systemie systemie grzybowym. --- CDNA kodujące białko przeciwgrzybicze KP4 z wirusa zakażającego Ustilago maydis wirusa został wstawiony za promotorem ubikwityny kukurydzy i genetycznie przenoszony do odmian pszenicy szczególnie podatnych na cuchnącą pleśń (Tilletia tritici). Transgen został zintegrowany i dziedziczony przez kilku pokoleń. Spośród siedmiu linii transgenicznych, trzy wykazały aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko U. maydis. Aktywność przeciwgrzybicza korelowała z obecnością transgenu KP4. Transgeniczne KP4, uprawiane w glebie rośliny pszenicy wykazują zwiększoną endogenną odporność na śmierdzącą pleśń. --- Niektóre szczepy chorobotwórczego dla roślin grzyba Ustilago maydis wydzielają toksyny (zabójcze toksyny), które są śmiertelne dla podatnych szczepów tego samego grzyba. Istnieją są trzy dobrze scharakteryzowane toksyny-zabójcy w U. maydis - KP1, KP4 i KP6 - które są wydzielane odpowiednio przez podtypy P1, P4 i P6. Te zabójcze toksyny są małymi polipeptydami kodowanymi przez segmenty endogennego, trwałego dwuniciowego RNA (dsRNA) wirusa w każdym podtypie U. maydis. W P4 i P6 segment M2 dsRNA koduje toksynę. W tej pracy toksyna zabójcy KP1 została oczyszczona do wewnętrznej analizy sekwencji aminokwasów, a P1M2 został zidentyfikowany jako segment kodujący toksynę KP1 poprzez analizę sekwencji klonów cDNA. Toksyna KP1 jest monomerem o przewidywanej masie cząsteczkowej 13,4 kDa i nie ma dużego podobieństwa sekwencji z innymi wirusowymi toksynami przeciwgrzybiczymi. Segment P1M2 różni się od segmentów dsRNA kodujących toksyny P4 i P6 tym, że niekodujący region 3' jego dodatniej nici nie ma homologii sekwencji do 3' końców nici dodatniej P1M1, P4M2 lub P6M2. --- Zabójcze białko 4 (KP4) jest dobrze zbadaną toksyną wirusową wydzielaną przez grzyb kukurydzy Ustilago maydis. kukurydzy Ustilago maydis, która zabija wrażliwe szczepy Ustilago, a także hamuje Fusarium i wzrost korzeni roślin poprzez hamowanie wychwytu wapnia. Liczne małe, wykazano, że białka bogate w cysteinę odgrywają kluczową rolę w związkach grzyb-roślina-bakteria. Odkrycie sześciu genów podobnych do KP4 u F. verticillioides przyspieszyło wysiłki mające na celu zrozumienie ich funkcji i pochodzenia ewolucyjnego. ewolucyjnego pochodzenia. Analiza publicznie dostępnych sekwencji genomowych zidentyfikowała 31 dodatkowych genów podobnych do KP4 z szeregu Ascomycota, Basidiomycota i mchu Physcomitrella. mchu Physcomitrella patens. Porównanie sekwencji i analiza filogenetyczna wskazują, że wirusowy KP4 oraz geny podobne do KP4 mchu i grzybów wyewoluowały od wspólnego przodka, dostarczając dowodów na boczny transfer genów między królestwami. Przewiduje się, że sześć genów z 37 całkowitych genów koduje białko z dwoma, nieidentycznymi domenami podobnymi do KP4 w tandemie oddzielonymi 29-56 aminokwasami. Wyniki Wyniki sugerują, że dwa niezależne zdarzenia doprowadziły do powstania dwudomenowych genów KP4 obecnych w różnych liniach Ascomycota. Zrozumienie natury i funkcji białek podobnych do KP4 w gatunkach produkujących mikotoksyny, takich jak Fusarium, może pomóc w ograniczeniu chorób roślin i zwiększeniu bezpieczeństwa żywności oraz jej produkcji. --- Defensyny roślinne to małe, wysoce stabilne, bogate w cysteinę białka przeciwdrobnoustrojowe które uważa się za ważny składnik obrony roślin przed patogenom grzybowym. Istnieje wiele takich defensyn, które ulegają ekspresji w różnych tkankach roślinnych. tkankach roślinnych o różnej aktywności przeciwgrzybiczej i spektrum działania. Stosunkowo niewiele wiadomo o sposobach działania i biologicznych rolach tych białek. Nasze poprzednie prace nad kodowaną wirusowo toksyną grzybową KP4 z Ustilago maydis i a następnie z roślinną defensyną MsDef1 z Medicago sativa wykazały, że niektóre z tych białek że niektóre z tych białek specyficznie blokowały kanały wapniowe zarówno u grzybów, jak i zwierząt. i zwierząt. Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że KP4 i trzy roślinne roślinne, MsDef1, MtDef2 i RsAFP2, wszystkie hamują wzrost korzeni w kiełkujących nasionach Arabidopsis w niskich stężeniach mikromolarnych. Wcześniej wykazaliśmy, że białko fuzyjne składające się z GTPazy Rab (RabA4b) i wzmocnionego żółte białko fluorescencyjne (EYFP) jest zależne od gradientów wapnia dla lokalizacji na końcach rosnących włośników u Arabidopsis thaliana. Wykorzystując to białko fuzyjne zlokalizowane w wierzchołkach, wykazaliśmy, że wszystkie cztery białka szybko depolaryzują rosnące włośniki i blokują wzrost w odwracalny sposób. sposób. Ta hamująca aktywność na korzeniach i włośnikach nie jest bezpośrednio skorelowana z aktywnością przeciwgrzybiczą tych białek i sugeruje, że rośliny najwyraźniej wyrażają cele dla tych białek przeciwgrzybiczych. Dane przedstawione tutaj sugerują, że defensyny roślinne mogą odgrywać rolę w regulacji wzrostu i rozwoju roślin. wzrostu i rozwoju roślin. --- Grzyb Ustilago maydis jest globalnym patogenem odpowiedzialnym za rozległe straty w rolnictwie. rozległe straty w rolnictwie. Zwalczanie zgnilizny kukurydzy przy użyciu tradycyjnej hodowli odniosło ograniczony sukces, ponieważ naturalna odporność na U. maydis jest organo i obejmuje liczne geny kukurydzy. Tutaj przedstawiamy transgeniczne podejście poprzez konstytutywną ekspresję przeciwgrzybiczego białka KP4 Totivirusa w kukurydzy. kukurydzy. Transgeniczne rośliny kukurydzy wyrażały wysoki poziom KP4 bez widocznego negatywny wpływ na rozwój roślin i wykazywały silną odporność na U. maydis zarówno na tkanki łodygi, jak i ucha w szklarni. Więcej szerzej, wyniki te pokazują, że wysoki poziom niezależnej od narządów odporności na grzyby odporność może być zapewniona przez transgeniczną ekspresję tej rodziny białek przeciwgrzybiczych. białek.
Jaką funkcję pełni wirusowe białko KP4?
Kodowana wirusowo toksyna grzybicza KP4 specyficznie blokuje kanały wapniowe typu L bramkowane napięciem.