Selen jest biologicznie aktywny poprzez funkcje selenoprotein, które zawierają aminokwas selenocysteinę. Aminokwas ten jest tłumaczony w odpowiedzi na na wbudowane kodony UGA w mRNA, które zawierają element SECIS w jego 3' a proces ten wymaga unikalnego tRNA, określanego jako tRNA([Ser]Sec). Tłumaczenie UGA jako selenocysteiny, a nie jej użycie jako sygnał zakończenia, jest kandydującym punktem restrykcyjnym dla regulacji syntezy selenoprotein. syntezy selenoprotein przez selen. Zastosowano wyspecjalizowany konstrukt reporterowy który pozwala na ocenę translacji UGA kierowanej przez SECIS w celu zbadania mechanizmów regulacji translacji selenoprotein. Wykorzystując elementy SECIS z pięciu różnych selenoproteinowych mRNA, translacja UGA została określona ilościowo w odpowiedź na suplementację selenem i zmiany w poziomach tRNA([Ser]Sec) i dystrybucji izoform. Chociaż każdy z ocenianych elementów SECIS wykazywał różnice w ich aktywności wyjściowej, każdy z nich był stymulowany do w podobnym stopniu przez zwiększony poziom selenu lub tRNA([Ser]Sec) i był hamowany przez zmniejszone poziomy metylowanej izoformy tRNA([Ser]Sec) osiągnięte przy użyciu tRNA([Ser]Sec). Stwierdzono, że tRNA([Ser]Sec) jest ograniczający dla translacji UGA w warunkach ograniczające translację UGA w warunkach wysokiego selenoproteinowego mRNA zarówno w zarówno w przejściowym teście reporterowym, jak i w komórkach z podwyższonym mRNA GPx-1. To i dane wskazujące na zwiększone ilości metylowanej izoformy tRNA([Ser]Sec) podczas selenoproteiny wskazują, że to właśnie ta izoforma jest aktywna translacyjnie i że indukowana selenem metylacja tRNA jest mechanizmem regulacji syntezy selenoprotein. --- Mikroelement selen występuje w białkach jako selenocysteina (Sec), 21. aminokwas wprowadzony kotranslacyjnie w odpowiedzi na kodon UGA. 21. aminokwas kotranslacyjnie wstawiony w odpowiedzi na kodon UGA. Badania in vitro in vitro u archeonów i myszy wykazały, że tworzenie Sec-tRNA(Sec) jest 3-etapowym procesem rozpoczynającym się od serylacji tRNA(Sec). procesem rozpoczynającym się od serylacji tRNA(Sec) przez syntetazę serylo-tRNA (SerRS), fosforylacji seryny w celu utworzenia fosfoseryny (Sep)-tRNA(Sec) przez kinazę fosfoserylo-tRNA(Sec) (PSTK) i konwersję do Sec-tRNA(Sec) przez syntazę Sep-tRNA:Sec-tRNA (SepSecS). Jednak pełne badanie eukariotycznej syntezy selenoprotein syntezy selenoprotein. Tutaj przedstawiamy analizę Sec-tRNA(Sec) u pasożytniczego pierwotniaka Trypanosoma brucei in vivo. Null mutanty PSTK lub SepSecS zniosły syntezę selenoprotein, wykazując niezbędność obu enzymów do tworzenia Sec-tRNA(Sec). Wzrost 2 znokautowanych szczepów nie był zaburzony; tak więc, w przeciwieństwie do ssaków, trypanosomy nie wymagają selenoprotein do przeżycia. Analiza warunkowych szczepów RNAi wykazała, że SerRS, syntaza selenofosforanowa i czynnik elongacji czynnik elongacji specyficzny dla Sec, EFSec, są również niezbędne do syntezy selenoprotein. syntezy selenoprotein. Te wyniki z T. brucei sugerują, że eukarionty mają pojedynczą ścieżkę szlak syntezy Sec-tRNA(Sec), który wymaga Sep-tRNA(Sec) jako półproduktu pośredniego. --- Selenocysteina (Sec), 21. aminokwas w białku, jest kodowana przez UGA. Sekwencja insercyjna Sec (SECIS), który jest strukturą pętli łodygi obecną w 3' regionach nieulegających translacji (UTR). 3' regionach nieulegających translacji (UTR) eukariotycznych genów kodujących selenoproteiny, jest niezbędna do rozpoznania UGA jako kodonu dla Sec, a nie jako sygnału stop sygnał. Obecnie donosimy o identyfikacji nowej eukariotycznej selenoproteiny, oznaczonej jako selenoproteina M (SelM). Ludzki gen kodujący SelM o długości 3 kb ma pięć eksonów eksonów i znajduje się na chromosomie 22, ale nie został poprawnie zidentyfikowany przez ani Celera, ani publiczny Human Genome Project. Scharakteryzowaliśmy ludzkie i SelM i mysie sekwencje cDNA i wyraziliśmy selenoproteinę w różnych liniach komórkowych ssaków. liniach komórkowych ssaków. W 3" UTR ludzkich, mysich i szczurzych genów kodujących SelM brakuje kanonicznego elementu SECIS. kanonicznego elementu SECIS. Zamiast tego Sec jest włączany w odpowiedzi na konserwatywną strukturę strukturę mRNA, w której cytydyny są obecne zamiast adenozyny wcześniej uważane za niezmienne. Zastąpienie adenozyny cytydyną nie nie zmieniło inkorporacji Sec; jednak inne zmutowane struktury nie wspierały syntezy selenoprotein, wykazując, że ta nowa forma elementu SECIS jest funkcjonalna. SelM ulega ekspresji w różnych tkankach, ze zwiększonym poziomem w mózgu. mózgu. Jest zlokalizowany w strukturach okołojądrowych, a jego N-końcowy peptyd sygnałowy jest niezbędny do syntezy białka. peptyd sygnałowy jest niezbędny do translokacji białka. --- Gen patufet koduje homolog Drosophila melanogaster syntetazy selenofosforanu. syntetazy selenofosforanowej, enzymu wymaganego do syntezy selenoprotein i wydaje się odgrywać rolę w proliferacji komórek. W tym artykule analizujemy wzór ekspresji patufetu podczas rozwoju dysków imaginalnych i mózgu a także funkcję tego genu w odniesieniu do proliferacji komórek. Organizmy typu dzikiego wykazywały wysoce dynamiczny wzór ekspresji mRNA ptufet podczas rozwoju larwalnego i poczwarkowego. Analiza ko-lokalizacji ekspresji mRNA ptuf i inkorporacji BrdU wykazała wysoki poziom mRNA ptuf w dzielących się komórkach komórkach i niski lub niewykrywalny poziom w komórkach nie dzielących się. Ponadto, Ponadto inkorporacja [(75)Se] ujawniła główne pasmo selenoproteiny o masie 42 kDa. Mutanty nie wykazywały syntezy selenoprotein, niższy poziom proliferacji komórek, wyższy odsetek komórek zatrzymanych w fazie G(2), co można zaobserwować na podstawie znakowania cykliny B i zwiększony poziom reaktywnych form tlenu (ROS). Ponieważ większość selenoprotein zidentyfikowanych do tej pory jest przeciwutleniaczami, rola ptuf w proliferacji komórek poprzez kontrolę komórkowej równowagi redoks. --- Syntetaza selenofosforanowa (SelD) generuje donor selenu do biosyntezy selenocysteiny u eubakterii. biosyntezy selenocysteiny u eubakterii. Jednym z homologów SelD u eukariontów jest SPS1 (syntetazy selenofosforanu 1), a drugi, SPS2, został zidentyfikowany jako selenoproteina u ssaków. Wcześniejsze badania in vitro wykazały, że SPS2, ale nie SPS1, syntetyzuje selenofosforan z selenku, podczas gdy SPS1 może wykorzystywać inny substrat. substrat. Rola tych enzymów w syntezie selenoprotein in vivo pozostaje nieznana. nieznana. Aby zająć się ich funkcją in vivo, znokautowaliśmy SPS2 w komórkach NIH3T3 przy użyciu małego interferującego RNA i stwierdziliśmy, że biosynteza selenoprotein była poważnie upośledzona, podczas gdy knockdown SPS1 nie miał żadnego wpływu. Transfekcja SPS2 do komórek z knockdownem SPS2 przywróciła biosyntezę selenoprotein, ale SPS1 nie, wskazując, że SPS1 nie może uzupełniać funkcji SPS2. Te badania in vivo wskazują, że SPS2 jest niezbędny do generowania donora selenu dla biosyntezy selenocysteiny biosyntezy selenocysteiny u ssaków, podczas gdy SPS1 prawdopodobnie ma bardziej wyspecjalizowaną, nieistotną rolę w biosyntezie selenu. wyspecjalizowaną, nieistotną rolę w metabolizmie selenoprotein. --- Synteza selenoprotein jest zachowana od bakterii do człowieka. Obejmuje ona różnicowe dekodowanie kodonu stop UGA jako selenocysteiny. Proteomy zarówno prokariotów, jak i eukariotów, z wyjątkiem drożdży, zawierają tylko kilka selenoprotein. selenoprotein. Tę niską liczbę tłumaczy się kontrselekcją łatwo utlenianej selenocysteiny. utlenionej selenocysteiny po wprowadzeniu tlenu do atmosfery oraz potrzebą zachowania selenoenzymów, które kontrolują homeostazę redoks komórek. Brak syntezy selenoprotein u kręgowców upośledza obronę przed stresem oksydacyjnym i powoduje śmiertelność. Tutaj pokazujemy, że mutanty Drosophila, którym brakuje czynnika elongacji translacji czynnika elongacji translacji SelB/eEFsec nie dekodują kodonu UGA jako selenocysteiny, ale są żywotne i płodne. Reakcje na stres oksydacyjny i nie wpływają na długość życia tych much. Ochrona komórek przed stresem oksydacyjnym stresem nie może zatem odpowiadać za presję selekcyjną, która zachowuje biosyntezę selenoprotein w toku ewolucji. --- Selenoproteiny zawierają aminokwas selenocysteinę, który jest kodowany przez kodon UGA Sec. Rekodowanie UGA Sec wymaga złożonego mechanizmu, obejmującego cis-działającą spinkę do włosów SECIS RNA w 3'UTR mRNA selenoprotein, oraz czynniki trans-działające. Wśród nich białko wiążące SECIS 2 (SBP2) ma kluczowe znaczenie dla mechanizmu. w tym mechanizmie. SBP2 zostało do tej pory funkcjonalnie scharakteryzowane tylko u szczurów i ludzi. W tej pracy przedstawiamy charakterystykę Drosophila melanogaster SBP2 (dSBP2). Pomimo krótszej długości, zachował tę samą możliwości promowania syntezy selenoprotein, jak jego odpowiednik u ssaków. Jednak główna różnica polega na wzorze rozpoznawania SECIS: podczas gdy ludzki SBP2 (hSBP2) wiąże różne formy 1 i 2 SECIS RNA z podobnymi dSBP2 wykazuje wysokie powinowactwo tylko do formy 2. Ponadto zgłaszamy identyfikację domeny bogatej w K (lizynę) we wszystkich SBP2, niezbędnej dla wiązania SECIS i podjednostki rybosomalnej 60S, różniącą się od dobrze scharakteryzowanej domeny wiążącej RNA L7Ae. Zamiana tylko pięciu aminokwasów między dSBP2 i hSBP2 w domenie bogatej w K nadała białkom odwrócone właściwości wiązania SECIS właściwości do białek, odsłaniając w ten sposób ważną sekwencję dla wiązania formy 1 wiązania. --- Selenocysteina (Sec) jest współtranslacyjnie włączana do selenoprotein w kodonie przeprogramowanym kodonie UGA. U ssaków wymaga to dedykowanej maszynerii obejmującej strukturę pętli macierzystej w 3' UTR RNA (element SECIS) i specyficzne białko wiążące SECIS SECIS Binding Protein 2. W niniejszym raporcie metody przewidywania zaburzeń i kilka technik biofizycznych i kilka technik biofizycznych wykazały, że ok. 70% sekwencji SBP2 jest nieuporządkowana, podczas gdy domena wiążąca RNA wydaje się być zwinięta i funkcjonalna. Wyniki te są zgodne z niedawnym doniesieniem o roli chaperonu Hsp90 w fałdowaniu SBP2 i innych funkcjonalnie niepowiązanych białek posiadających domenę wiążącą RNA homologiczną do SBP2. --- Selenoproteiny są centralnymi regulatorami komórkowej homeostazy redoks. Inkorporacja selenocysteiny (Sec) do selenoprotein wykorzystuje unikalny mechanizm mechanizm dekodowania kodonu stop UGA. Proces ten wymaga wstawienia sekwencji Sec (SECIS), tRNASec oraz czynników białkowych, w tym białka wiążącego SECIS białko wiążące SECIS 2 (SBP2). Tutaj przedstawiamy charakterystykę motywów w obrębie SBP2, które regulują jego subkomórkową lokalizację i funkcję. Pokazujemy, że SBP2 przemieszcza się między jądrem a cytoplazmą poprzez wewnętrzny, funkcjonalny sygnał lokalizacji jądrowej sygnał lokalizacji jądrowej i motywy sygnału eksportu jądrowego oraz że jego eksport jądrowy jest zależny od szlaku CRM1. Stres oksydacyjny indukuje akumulację jądrową SBP2 poprzez utlenianie reszt cysteinowych w domenie wrażliwej na redoks domeny bogatej w cysteinę. Modyfikacje te są skutecznie odwracane in vitro przez ludzką tioredoksynę i glutaredoksynę, co sugeruje, że te systemy antyoksydacyjne mogą regulować status redoks SBP2 in vivo. Zubożenie SBP2 w liniach komórkowych przy użyciu małego interferującego RNA powoduje spadek inkorporacji Sec, dostarczając bezpośrednich dowodów na jego zapotrzebowanie na syntezę selenoprotein. Co więcej, inkorporacja Sec jest znacznie zmniejszona po leczeniu komórek z czynnikami powodującymi stres oksydacyjny, co sugeruje, że sekwestracja jądrowa SBP2 w takich warunkach może stanowić mechanizm regulujący ekspresji selenoprotein. --- Synteza eukariotycznych selenoprotein obejmuje przekodowanie wewnętrznego kodonu UGA jako miejsca inkorporacji selenocysteiny. To zdarzenie rekodowania jest przez sekwencję insercji selenocysteiny w regionie 3'-nietranslowanym. Ponieważ UGA działa również jako sygnał do hydrolizy peptydylo-tRNA, zbadaliśmy zbadaliśmy, w jaki sposób szybkość zakończenia translacji i włączenia selenocysteiny odnoszą się do cis-działających elementów w mRNA, jak również do czynnikami trans w cytoplazmie. Użyliśmy cis-elementów z fosfolipidowego genu peroksydazy glutationowej jako podstawy tej pracy z powodu stosunkowo wysoką wydajność inkorporacji selenocysteiny. Ostatnie dwa kodony kodony poprzedzające UGA miały znacznie większy wpływ na znacznie większy wpływ na inkorporację selenocysteiny niż nukleotydy za nim. Wydajność włączania selenocysteiny była na ogół znacznie mniejsza niż 100%, ale mogła być częściowo zwiększona przez jednoczesną nadekspresję genu tRNA(Sec). Kombinacja kombinacja dwóch lub trzech kodonów UGA w jednej ramce odczytu prowadziła do dramatycznego zmniejszenie wydajności białka pełnej długości. Jest zatem mało prawdopodobne, że że wielokrotne inkorporacje selenocysteiny są procesywne w odniesieniu do sposób działania kompleksu rybosomalnego wiążącego się z miejscem UGA. Te obserwacje są omawiane pod kątem mechanizmu syntezy selenoprotein i jego zdolności do konkurowania z terminacją w kodonach UGA.
Nazwa czynników wymaganych do syntezy selenoprotein u eukariontów
eFSec, SBP2, SECp43, PSTK, syntaza Sec (Sec S, SLA/LP), SPS2 (SelD), tRNASec, element SECIS, (L30), SPS1