Mycobacterium tuberculosis, czynnik wywołujący gruźlicę, jest narażony na zwiększone ryzyko ryzyko gromadzenia uszkodzonych nukleotydów guaninowych, takich jak 8-okso-dGTP i 8-okso-GTP z powodu jego rezydencji w środowisku oksydacyjnym makrofagów gospodarza. makrofagów gospodarza. Poprzez hydrolizę utlenionych nukleotydów guaninowych przed ich włączeniem do kwasów nukleinowych, białka MutT odgrywają kluczową rolę w umożliwieniu organizmom organizmom uniknąć ich szkodliwych skutków. Mykobakterie posiadają kilka białek MutT białek. Tutaj oczyściliśmy rekombinowane białka M. tuberculosis MutT2 (MtuMutT2) i M. smegmatis MutT2 (MsmMutT2) z M. tuberculosis (wolno rosnącego) i M. smegmatis (szybko rosnące modelowe prątki), odpowiednio, w celu ich biochemicznej charakterystyki biochemicznej. W odróżnieniu od Escherichia coli MutT, która hydrolizuje 8-okso-DGTP i 8-okso-GTP, białka mykobakterii hydrolizują nie tylko 8-okso-dGTP i 8-okso-GTP, ale także dCTP i 5-metylo-dCTP. Określenie parametrów kinetycznych (Km i Vmax) wykazało, że podczas gdy MtuMutT2 hydrolizuje dCTP prawie cztery razy lepiej niż 8-okso-DGTP, MsmMutT2 hydrolizuje je prawie jednakowo. Ponadto MsmMutT2 jest około 14 razy bardziej wydajny niż MtuMutT2 w jego aktywność katalityczna hydrolizy 8-okso-dGTP. Zgodnie z tymi obserwacje, MsmMutT2, ale nie MtuMutT2, ratuje E. coli przed niedoborem MutT poprzez zmniejszając zarówno częstotliwość mutacji, jak i mutacje A do C (cecha charakterystyczna MutT ). Omawiamy te odkrycia w kontekście fizjologicznego znaczenia białek MutT. znaczenia białek MutT. --- Większość białek niosących 23-pozostałościową sekwencję związaną z MutT jest w stanie hydrolizowania związków o ogólnej strukturze difosforanu nukleozydu połączonej z inną cząsteczką X i są nazywane hydrolazami Nudix. Wśród 22 ludzkich białek Nudix (zidentyfikowanych na podstawie sygnatury sekwencji), niektóre pozostają niescharakteryzowane jako enzymy bez zdefiniowanego substratu. Tutaj ujawniamy, że białko NUDT18, którego substrat był nieznany, może degradować 8-okso-7,8-dihydroguaniny (8-okso-Gua) zawierających difosforany nukleozydów do monofosforanów. monofosforanów. Ponieważ enzym ten jest blisko spokrewniony z MTH1 (NUDT1) i MTH2 (NUDT15), proponujemy nadać mu nazwę MTH3. Chociaż te trzy ludzkie białka przypominają się nawzajem w swoich sekwencjach, ich specyficzność substratowa znacznie się różnią. MTH1 rozszczepia 8-okso-dGTP, ale nie 8-okso-dGDP, podczas gdy MTH2 może degradować zarówno 8-okso-dGTP, jak i 8-okso-dGDP, chociaż wewnętrzna aktywność enzymatyczna MTH2 jest znacznie niższa. aktywność enzymatyczna MTH2 jest znacznie niższa niż MTH1. Z drugiej strony, MTH3 jest specyficznie aktywny wobec 8-okso-dGDP i prawie nie rozszczepia 8-okso-dGTP. Inne typy utlenionych difosforanów nukleozydów, 2-hydroksy-dADP i 8-hydroksy-dADP, były również hydrolizowane przez MTH3. Inną godną uwagi cechą enzymu MTH3 jest jego działanie w kierunku odpowiednika rybonukleotydu. MTH3 może degradować 8-okso-GDP tak samo wydajnie jak 8-okso-dGDP, co kontrastuje z odkryciem, że że MTH1 i MTH2 wykazują ograniczoną aktywność wobec odpowiednika rybonukleotydowego, 8-okso-GDP. odpowiednika rybonukleotydu, 8-okso-GTP. Te trzy enzymy mogą funkcjonować razem, aby pomóc utrzymać wysoką wierność replikacji i transkrypcji DNA w warunkach stresu oksydacyjnego. stresie oksydacyjnym. --- Enzymy MutT zapobiegają uszkodzeniom DNA poprzez hydrolizę 8-oksodGTP, utlenionego substratu do syntezy DNA i przeciwutagennego substratu do syntezy DNA oraz antymutagenne, antyrakotwórcze i antyneurodegeneracyjne funkcje enzymów MutT są dobrze ugruntowane. antyneurodegeneracyjne funkcje enzymów MutT są dobrze ugruntowane. MutT został znaleziono w prawie wszystkich królestwach życia, w tym w wielu gatunkach bakterii, drożdży, roślin i ssaków. Jednak homolog MutT u Caenorhabditis elegans nie został wcześniej zidentyfikowany. nie został wcześniej zidentyfikowany. Tutaj pokazujemy, że NDX-4 wykazuje zarówno cechy charakterystyczne enzymu typu MutT ze zdolnością do hydrolizy 8-oksodGTP i tłumienia fenotypu mutatora mutT Escherichia coli. Co więcej, pokazujemy, że NDX-4 przyczynia się do stabilności genomu in vivo u C. elegans. Analizy fenotypowe analizy mutanta ndx-4 ujawniają, że utrata NDX-4 prowadzi do regulacji w górę kluczowych genów reagujących na stres, które prawdopodobnie kompensują rolę NDX-4 in vivo w ochronie przed szkodliwymi konsekwencjami stresu oksydacyjnego. To odkrycie umożliwi nam wykorzystanie tego niezwykle solidnego modelu genetycznego do dalszych badań nad udziałem oksydacyjnych uszkodzeń DNA w fenotypach związanych ze stresem oksydacyjnym. ze stresem oksydacyjnym. --- Białka związane z MutT, w tym Escherichia coli MutT i ludzkie MutT homolog 1 (MTH1), degradują trifosforan 8-okso-7,8-dihydrodeoksyguanozyny (8-okso-dGTP) do monofosforanu, zapobiegając w ten sposób mutacjom. trifosforan (8-okso-dGTP) do monofosforanu, zapobiegając w ten sposób mutacjom spowodowane błędną inkorporacją 8-oksoguaniny do DNA. Tutaj donosimy, że ludzkie komórki mają inny mechanizm oczyszczania puli nukleotydów, aby zapewnić dokładną replikację DNA. Ludzkie białko Nudix typu 5 (NUDT5) hydrolizuje 8-okso-dGDP do monofosforanu z K(m) wynoszącym 0,77 mikroM, co jest wartością znacznie niższą niż dla cukrów ADP. niższa niż dla cukrów ADP, które pierwotnie zidentyfikowano jako substraty NUDT5. substraty NUDT5. NUDT5 hydrolizuje 8-okso-dGTP tylko na bardzo niskich poziomach, ale jest w stanie zastąpić jest w stanie zastąpić MutT, gdy jest on uszkodzony. Gdy NUDT5 ulega ekspresji w komórkach E. coli mutT(-), zwiększona częstotliwość spontanicznych mutacji jest zmniejsza się do normalnego poziomu. Biorąc pod uwagę parametry enzymatyczne MTH1 i NUDT5 dla utlenionych nukleotydów guaninowych, NUDT5 może odgrywać znacznie większą rolę niż MTH1. niż MTH1 w zapobieganiu występowaniu mutacji, które są spowodowane przez błędną inkorporację 8-oksoguaniny w komórkach ludzkich. --- Mikroorganizmy hipermutowalne lub mutujące to takie, które mają zwiększoną spontaniczny wskaźnik mutacji w wyniku defektów w naprawie DNA lub systemach systemów unikania błędów. W ciągu ostatnich dwóch dekad kilka badań dostarczyło silnych dowodów na istotną rolę mutatorów w ewolucji naturalnych populacji bakterii. populacji bakterii, szczególnie w dziedzinie chorób zakaźnych. Wśród nich przewlekłe zakażenie układu oddechowego bakterią Pseudomonas aeruginosa u pacjentów z mukowiscydozą (CF). mukowiscydozą (CF) było pierwszym naturalnym środowiskiem, które ujawniło wysoką częstość występowania i ważną rolę mutatorów. Niezwykła pozytywna selekcja mutatorów w przebiegu przewlekłego zakażenia, głównie w wyniku pojawienia się w wyniku pojawienia się systemu naprawy niedopasowania DNA (mutS, mutL lub mutU), chociaż zaobserwowano również szczepy wadliwe w systemie GO (mutM, mutY i mutT). Wysokie częstotliwości mutatorów odnotowano również wśród innych patogenów w CF, w szczególności Staphylococcus aureus i Haemophilus influenzae. Zwiększony rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest najdokładniej zbadaną konsekwencją mutacji w mukowiscydozie i innych przewlekłych infekcjach. i innych przewlekłych infekcjach, chociaż ostatnie badania pokazują, że mutatory mogą mieć dodatkowo dodatkowo istotny wpływ na ewolucję wirulencji, adaptację genetyczną do dróg oddechowych pacjentów z mukowiscydozą, uporczywość kolonizacji, zdolność do przenoszenia i być może spadek czynności płuc. Dalsze prospektywne badania kliniczne są kliniczne są jednak nadal potrzebne do dogłębnej oceny wpływu mutatorów na postęp choroby i wyniki leczenia. na postęp choroby i jej wyniki. --- Bakterie Escherichia coli WP2 z auksotrofią aminokwasów ochry nie wykazują żadnych wzrostu w ciągu pierwszych kilku dni po umieszczeniu w zagęszczeniu powyżej 10(8) na płytkach pozbawionych wymaganego aminokwasu. Tracą żywotność na kilka dni, a następnie subpopulacja odzyskuje żywotność i następuje rotacja komórek. Przy bardzo niskiej gęstości (około 10(2) na płytkę), prawie każda komórka ostatecznie utworzy małą, ale widoczną kolonię. Przy pośrednich gęstościach (od 10(6) do 10(7) na płytkę), następuje natychmiastowy wzrost liczby żywotnych bakterii. bakterii. Wyniki są zgodne z modelem, który zakłada, że wzrost jest jest zależny od śladowych ilości tryptofanu lub substancji uzupełniającej tryptofan i że śmierć jest spowodowana pozakomórkowymi toksycznymi gatunkami w pożywce, w tym aktywne formy tlenu. Mutacje w bakteriach mutT w tych warunkach są wynikiem z włączenia 7,8-dihydro-8-okso-dGTP do DNA, a zatem w dużej mierze odzwierciedlają syntezę DNA związaną ze wzrostem liczby żywotnych komórek przy początkowej gęstości (10(7) na płytkę). Pokazujemy, że wzrost liczby komórek i znaczna część tej syntezy DNA może zostać wyeliminowana przez obecność 10(8) bakterii zmiataczy i przez usunięcie wcześnie powstających zmutowanych kolonii, które uwalniają wymagany aminokwas. wymagany aminokwas. Synteza, która pozostaje, jest równoważna mniej niż ćwierć genomu dziennie i jest nieznacznie zmniejszona, jeśli w ogóle, w pochodnej polA . Nie możemy wykluczyć, że ta szczątkowa synteza DNA jest charakterystyczna dla bakterii mutT z powodu nieszczelności transkrypcji, chociaż nie ma dowodów na to, że jest to poważny problem. nie ma dowodów na to, że jest to główny problem w tym szczepie. Jeśli taka synteza DNA występuje również u bakterii typu dzikiego, może ona być istotna dla mutacji adaptacyjnych. mutacji adaptacyjnej, ponieważ użycie bardziej wyrafinowanego agaru w płytkach selektywnych wyeliminowało zarówno początkowy wzrost liczby komórek obserwowany przy niskiej gęstości (10(7) na płytkę) i zmniejszyło szybkość pojawiania się mutantów przy gęstościach powyżej 10(8) na płytkę. płytkę. --- Toksyczność Ni(II), Co(II) i Cu(II) u zwierząt oraz toksyczność Cd(II) w hodowanych komórkach w hodowanych komórkach, została powiązana z generowaniem promutagennej zmiany 8-okso-7,8-dihydroguaniny (8-oksoguaniny) w DNA. Jednym z możliwym źródłem tej zasady może być 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyno-5'-trifosforan (8-okso-dGTP), produkt oksydacyjnego uszkodzenia puli nukleotydów, z której jest włączany do DNA. Aby promować taką inkorporację, metale musiałyby hamować specyficzne komórkowe 8-okso-dGTPazy, które eliminują 8-okso-dGTP z puli nukleotydów. Badanie Niniejsze badanie zostało zaprojektowane w celu przetestowania takiego hamowania in vitro na 8-okso-dGTPazach z dwóch różnych gatunków, ludzkiego białka MTH1 i białka Escherichia coli MutT . W obecności Mg(II), naturalnego aktywatora 8-okso-dGTPaz, wszystkie cztery metale wszystkie cztery metale hamowały oba enzymy. Dla MTH1, wartości IC50 (+/- SE; n = 3-4) wynosiły 17 +/- 2 mikroM dla Cu(II), 30 +/- 8 mikroM dla Cd(II), 376 +/- 71 mikroM dla Co(II) i 801 +/- 97 mikroM dla Ni(II). Dla MutT wynosiły one 60 +/- 6 mikroM dla Cd(II), 102 +/- 8 mikroM dla Cu(II), 1461 +/- 96 mikroM dla Ni(II) i 8788 +/- 1003 mikroM dla Co(II). Tak więc, Cu(II) i Cd(II) okazały się być znacznie silniejszymi inhibitorami niż Ni(II) i Co(II), a MTH1 okazał się być ogólnie bardziej wrażliwy na inhibicję metali niż MutT. Co ciekawe, przy nieobecności Mg(II), aktywność enzymów mogła zostać przywrócona przez Co(II) do 73% tego z samym Mg(II) dla MutT i 34% dla MTH1, przy czym inne metale były znacznie mniej lub nieefektywne. Różnica we wrażliwości na inhibicję metali między tymi dwoma enzymami może odzwierciedlać różnice w ligandach aminokwasowych, zwłaszcza ligandu cysteinowego, poza ich ewolucyjnie konserwowanymi Miejsca aktywne wiążące Mg(II), co może wskazywać na przeważnie niekompetycyjny lub niekonkurencyjny mechanizm hamowania. Ogólne wyniki sugerują, że hamowanie 8-okso-dGTPaz może być zaangażowane w mechanizmy indukcji 8-oksoguaniny w DNA przez badane jony metali, zwłaszcza nieredoks-aktywny kation Cd(II). --- Wspólną strukturą substratową dla funkcjonalnie zróżnicowanej nadrodziny białek Nudix jest nukleotyd-difosforan-X, gdzie X jest dużą różnorodnością grup opuszczających grup. Specyficzność substratowa jest znana dla mniej niż 1% z 29 400 znanych członków. Większość aktywności skutkuje uwolnieniem nieorganicznego jonu fosforanowego lub produktu zawierającego końcową cząsteczkę fosforanową. Reakcje są zazwyczaj monitorowane przez modyfikację nieciągłego testu Fiske-SubbaRow, który jest stosunkowo niewrażliwy i powolny. Przedstawiamy tutaj rozwój ciągłego testu fluorescencji, który umożliwia szybkie i dokładne określenie specyficzności substratu w formacie 96-dołkowym. Wykorzystaliśmy ten nowy test do potwierdzenia opisanych charakterystyk substratowych MutT i NudD Escherichia coli oraz do scharakteryzowania DR_1025 z Deinococcus radiodurans i MM_0920 z Methanosarcina mazei. Nowe odkrycia umożliwione przez nowy test obejmują następujące. Po pierwsze, oprócz dobrze scharakteryzowanej hydrolizy 8-okso-dGTP w pozycji α-β, MutT rozszczepia wiązanie fosforanowe β-γ z szybkością 3% tej odnotowanej dla hydrolizy w pozycji α-β. zarejestrowanej dla hydrolizy w pozycji α-β. Po drugie, MutT katalizuje również hydrolizę 5-metylo-dCTP. Po trzecie, zaobserwowano, że 8-okso-dGTP jest najlepszym substratem dla DR_1025. substratem dla DR_1025 spośród 41 badanych związków. --- Szczegółowo zbadaliśmy interakcje między systemami zapobiegania błędom Escherichia coli mutT, mutM i mutY. Systemy te wspólnie chronią komórkę przed działaniem produktu stresu oksydacyjnego, 8-oksoguaniny (8-oxoG), analogu zasady o niejednoznacznych właściwościach parowania zasad, łączącego się w pary z Szczepy mutatora mutT wykazują specyficzny wzrost poziomu A.T-->C. A.T-->C.G, podczas gdy szczepy mutatorów mutM i mutY wykazują specyficzny wzrost G.C-->T.A. Aby bardziej szczegółowo zbadać przetwarzanie in vivo różnych pośrednich mutacji prowadzących do A.T-->C.G i G.C-->T.A przeanalizowaliśmy zdefiniowane zdarzenia A.T-->C.G i G.C-->T.A w szczepach zawierających wszystkie możliwe kombinacje tych zmutowanych alleli. Zgłosiliśmy trzy główne ustalenia. Po pierwsze, nie znaleźliśmy dowodów na to, że allel mutT  mutMmutY. Interpretujemy ten wynik jako wskazujący, że włączenie 8-oxodGTP naprzeciwko matrycy C może nie być częste w stosunku do inkorporacji  są znacznie zmniejszone w szczepach niosących niedobory mutY i mutMmutY co sugeruje, że 8-oxoG, gdy jest obecny w DNA, preferencyjnie błędnie paruje się z dATP. Po trzecie, niedobory mutY i mutMmutY również zmniejszają konwersje A.T-->C.G na tle mutT(+), co sugeruje, że nawet w obecności funkcjonalnego białka  błędnej inkorporacji. --- Poszukiwanie kandydatów na funkcjonalnego homologa Escherichia coli MutT w drożdżach Saccharomyces cerevisiae drożdżach Saccharomyces cerevisiae przeprowadzono w bazie danych NCBI-BLAST przy użyciu pola Nudix box, krótkiej sekwencji aminokwasowej konserwowanej wśród E.coli MutT, Pseudomonoas vulgaris MutT oraz ludzkiej, szczurzej i mysiej MTH1. Spośród pięciu kandydatów skupiliśmy się na otwartej ramce odczytu YLR151c, ponieważ miał on region o około 76% podobieństwa do N-końcowej połowy MutT, w tym Nudix box. W ten sposób oceniliśmy zdolność YLR151c jako funkcjonalnego homologa E.coli MutT w S.cerevisiae. Ekspresja YLR151c była w stanie stłumić konwersję z A:T do C:G spowodowaną błędną inkorporacją utlenionego nukleotydu 8-oxo-dGTP w szczepie E.coli z niedoborem mutT. Zakłócenie YLR151c w szczepie drożdży spowodowało około 14-krotny wzrost częstotliwości spontanicznych mutacji w porównaniu do typu dzikiego. Dodatkowo, analiza biochemiczna wykazała, że białko fuzyjne GST-YLR151c posiadało aktywność pirofosfatazy zarówno dla 7,8-dihydro-8-okso-2'-deoksyguanozynotrifosforanu (8-okso-dGTP) i 1,2-dihydro-2-hydroksy-2'-deoksyadenozynotrifosforanu (2-OH-dATP). Specyficzna aktywność GST-YLR151c dla 8-okso-dGTP wynosiła 5,6 x 10(-3) mikroM(-1) s(-1), który była podobna do aktywności RibA, enzymu zapasowego dla MutT w E. coli, ale była 150-krotnie niższy niż w przypadku hMTH1. Z tych wyników wnioskujemy, że YLR151c ma zdolność zapobiegania spontanicznej mutagenezie poprzez sanityzację utlenionych nukleotydów i że może być funkcjonalnym homologiem E.coli MutT w S.cerevisiae. --- Białka związane z MutT degradują trifosforan 8-okso-7,8-dihydrodeoksyguanozyny (8-okso-dGTP), mutagenny substrat do syntezy DNA, w puli nukleotydów, zapobiegając w ten sposób błędom replikacji DNA. Podczas przeszukiwania bazy GenBank EST znaleźliśmy nowego członka białka związanego z MutT, MTH2, który posiada 23-aminokwasowy moduł MutT. Sklonowany mysi cDNA MTH2 (mMTH2) został wyrażony w komórkach Escherichia coli mutT(-), a białko oczyszczono. mMTH2 białko hydrolizuje 8-okso-dGTP do 8-okso-dGMP, z Km wynoszącym 32 mikroM. Ekspresja cDNA dla mMTH2 dla mMTH2 znacznie zmniejszyła podwyższony poziom spontanicznej mutacji częstotliwości mutacji spontanicznych komórek E. coli mutT(-). Tak więc, MTH2 ma potencjał do ochrony materiału genetycznego przed materiału genetycznego przed niepożądanym działaniem endogennych rodników tlenowych. MTH2 może działać jako czynnik redundancji MTH1. --- Utlenione prekursory nukleotydów 7,8-dihydro-8-okso-dGTP (8-okso-dGTP) i 1, 2-dihydro-2-okso-dATP (2-okso-dATP) są łatwo włączane do powstających nici DNA podczas replikacji, co może powodować mutacje podstawienia zasad. E. coli MutT i ludzki homolog hMTH1 hydrolizują 8-okso-dGTP, zapobiegając w ten sposób mutacjom. mutacjom. W tym badaniu poszukiwaliśmy homologów hMTH1 u ascydiów Ciona intestinalis przy użyciu bazy danych NCBI-BLAST. Wśród kilku kandydatów skupiliśmy się na jednej otwartej ramce odczytu, oznaczonej jako CiMutT, ze względu na jej wysoki stopień identyczności (41,7%). identyczności (41,7%) i podobieństwa (58,3%) do ogólnej sekwencji aminokwasowej hMTH1, w tym ramki Nudix. CiMutT znacząco tłumił aktywność mutatora aktywność mutatora mutT E. coli. Oczyszczona CiMutT miała aktywność pirofosfohydrolazy która hydrolizowała 8-okso-dGTP do 8-okso-dGMP i pirofosforanu nieorganicznego. Miała optymalne pH 9,5 i zapotrzebowanie na Mg(++) z optymalną aktywnością przy 5 mM. Aktywność CiMutT dla 8-okso-dGTP była porównywalna z aktywnością hMTH1, podczas gdy była 100-krotnie niższa dla 2-okso-dATP niż hMTH1. Fakty te wskazują, że CiMutT jest funkcjonalnym homologiem E. coli MutT. Ponadto, enzym hydrolizował wszystkie cztery nieutlenione trifosforany nukleozydów, z preferencją dla dATP. Aktywność specyficzna dla 8-okso-dGTP była większa niż aktywność dla nieutlenionego dATP i dGTP. Wyniki te sugerują, że CiMutT ma potencjał potencjał zapobiegania mutacjom przez 8-okso-dGTP u C. intestinalis. --- Białko MutT bakterii Escherichia coli zapobiega występowaniu transwersji A:T --> C:G poprzez hydrolizę utlenionej formy dGTP, 8-okso-7, 8-dihydro-2'-deoksyguanozyny 5'-trifosforanu (8-okso-dGTP), który jest wytwarzany przez aktywne formy tlenu. W poszukiwaniu genów związanych z mutT odkryliśmy, że gen ribA, kodujący cyklohydrolazę GTP II, jest w stanie zmniejszyć zwiększony poziom częstotliwości mutacji mutT. częstotliwości mutacji szczepu mutT do prawie normalnego poziomu, pod warunkiem, że produkt genu jest nadprodukowany że produkt genu jest nadprodukowany. Oczyszczone preparaty Escherichia coli białka cyklohydrolazy GTP II, jak również znakowanego histydyną heksameru rekombinowane białko cyklohydrolazy GTP II wydajnie hydrolizują 8-okso-dGTP i 8-okso-GTP, wytwarzając odpowiednio 8-okso-dGMP i 8-okso-GMP. dGTP nie był hydrolizowany przez te preparaty. hydrolizowany przez te preparaty. Cyklohydrolaza GTP II katalizuje konwersję GTP do 2,5-diamino-6-hydroksy-4-(5-fosforybozyloamino)-pirymidyny, która stanowi pierwszy etap syntezy ryboflawiny. Wartości Km dla trzech nukleotydów guaninowych, GTP, 8-okso-GTP i 8-okso-dGTP, były prawie takie same. takie same. Na tle mutT-, komórki ribA- wykazywały wyższą częstotliwość spontanicznych mutacji w porównaniu z komórkami mutT-. w porównaniu z komórkami ribA+. Zatem cyklohydrolaza GTP II, produkt genu ribA, ma potencjał do ochrony materiału genetycznego przed niepożądanymi skutkami endogennych rodników tlenowych. --- Enzymy odkażające pulę nukleotydów Dut (dUTPaza), RdgB (dITPaza) i MutT (8-okso-dGTPaza) Escherichia coli hydrolizują niekanoniczne prekursory DNA, aby zapobiec włączeniu analogów zasad do DNA. Poprzednie badania wykazały dramatyczną mutagenezę AT-->CG w mutantach mutT, co sugeruje znaczną gęstość 8-okso-G w DNA, która powinna powodować częste wycięcie i chromosomalną fragmentację, nieodwracalną w przypadku braku naprawy katalizowanej przez RecBCD i podobną do do letalności podwójnych mutantów dut recBC i rdgB recBC. W przeciwieństwie do tego stwierdziliśmy, że mutanty mutT recBC są żywotne i nie wykazują oznak fragmentacji chromosomów. fragmentacji. Nadprodukcja glikozylaz DNA MutM i MutY, działających zarówno na DNA na DNA zawierającym 8-okso-G, nadal nie powoduje letalności u podwójnych mutantów mutT recBC. mutantów. Plazmidowe DNA, wyekstrahowane z komórek mutantów mutT mutM i poddane działaniu z MutM in vitro, nie wykazuje zwiększonej relaksacji, co wskazuje na brak dodatkowych modyfikacji 8-okso-G. modyfikacje 8-okso-G. Nasz allel DeltamutT zwiększa szybkość konwersji AT-->CG 27 000-krotnie, co jest zgodne z opublikowanymi raportami. Jednak szybkość AT-->CG w naszym szczepie progenitorowym mutT(+) jest o dwa rzędy wielkości niższa niż w poprzednich badaniach. niższa niż w poprzednich badaniach, co obniża bezwzględną szybkość mutagenezy w Deltamut. mutagenezy w pochodnych DeltamutT, przekładając się na mniej niż cztery modyfikacje 8-oxo-G na ekwiwalent genomu, który jest zbyt niski, aby wywołać oczekiwane efekty. efektów. Wprowadzenie różnych dodatkowych mutacji w szczepie DeltamutT lub nie zwiększyło mutagenezy nawet dwukrotnie. Wnioskujemy, że w przeciwieństwie do poprzednich badań, nie ma wystarczającej ilości 8-okso-G w DNA mutantów mutT, aby spowodować podwyższoną naprawę wycięcia, która mogłaby spowodować fragmentację chromosomów. --- Silna przewlekła indukcja systemu odpowiedzi SOS występuje u E. coli BW535, szczepu szczepie z defektem genów nth, nfo i xth, a tym samym z poważnym niedoborem genów naprawy miejsc abazy w DNA. Zostało to tutaj pokazane poprzez wizualizację nitkowatego wzrostu szczepu BW535 i poprzez pomiar poziomu beta-galaktozydazy wyrażonej w BW535/pSK1002 w porównaniu do AB1157/pSK1002. Plazmid pSK1002 zawiera fuzję umuC::lacZ, w której lacZ znajduje się pod kontrolą promotora umuC i jest regulowany przez SOS regulon. Wzrost ekspresji beta-galaktozydazy występuje w BW535 bez żadnego egzogennego induktora SOS. Przewlekła indukcja odpowiedzi SOS była zaobserwowano wcześniej u szczepów E. coli z mutacjami w niektórych genach, które mają aktywność mutatora, a BW535 jest szczepem o umiarkowanej aktywności mutatora. Jednak nie wszystkie mutatory wykazują tę właściwość, ponieważ przewlekłej indukcji SOS nie zaobserwowano u mutatorów mutatorach mutT lub mutY. Białka MutT i MutY, gdy są aktywne, chronią bakterie przed mutacjami indukowanymi przez zmiany 8-oksoG w DNA. Sugeruje to, że akumulacja miejsc abazy, ale nie reszt 8-oksoG w DNA, indukuje odpowiedź SOS. --- Około jedna trzecia światowej populacji jest zakażona Mycobacterium tuberculosis, czynnikiem wywołującym gruźlicę. Lepsze zrozumienie biologii patogenu ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych narzędzi/strategii walki z jego rozprzestrzenianiem się i leczeniem. i leczenia. W makrofagach gospodarza patogen jest narażony na działanie reaktywnych reaktywne formy tlenu, o których wiadomo, że uszkadzają dGTP i GTP do 8-okso-dGTP i 8-okso-GTP, odpowiednio. Włączenie uszkodzonych nukleotydów do kwasów nukleinowych jest szkodliwe dla organizmów. szkodliwe dla organizmów. Białka MutT, należące do klasy hydrolaz Nudix hydrolizują trifosforany/difosforany nukleozydów 8-okso-G do odpowiadających im monofosforanów nukleozydów monofosforanów nukleozydów i odkażają pulę nukleotydów. Mykobakterie posiadają kilka białek MutT. Jednakże, funkcjonalny homolog Escherichia coli MutT nie został zidentyfikowany. Tutaj scharakteryzowaliśmy białka MtuMutT1 i białka Rv1700 M. tuberculosis. W przeciwieństwie do innych białek MutT, MtuMutT1 konwertuje 8-okso-dGTP do 8-okso-dGDP i 8-okso-GTP do 8-okso-GDP. Rv1700 następnie przekształca je w odpowiednie monofosforany nukleozydów. Ta obserwacja sugeruje obecność dwuetapowego mechanizmu detoksykacji 8-okso-dGTP/8-okso-GTP u prątków gruźlicy. MtuMutT1 konwertuje 8-okso-dGTP do 8-okso-dGDP z Km ∼50 μM i Vmax ∼0,9 pmol/min na ng białka, a Rv1700 przekształca 8-okso-dGDP do 8-okso-dGMP z Km ∼9,5 μM i Vmax ∼0,04 pmol/min na ng białka. białka. Razem, MtuMutT1 i Rv1700 oferują maksymalny ratunek dla E. coli dla jego niedobór MutT poprzez zmniejszenie mutacji A do C (cecha charakterystyczna MutT ). Sugerujemy, że skoordynowane działanie MtuMutT1 i Rv1700 odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu bakterii przed stresem oksydacyjnym. --- Ekspozycja na promieniowanie słoneczne może powodować śmiertelność w naturalnych zbiorowiskach fitoplanktonu, zarówno na powierzchni, jak i na głębokości co najmniej 30 m. Uszkodzenia DNA jest istotną przyczyną śmierci, głównie z powodu tworzenia się dimerów cyklobutanopirymidynowych. które mogą być śmiertelne, jeśli nie zostaną naprawione. Podczas opracowywania protokołu mutagenezy UV protokół mutagenezy dla morskich cyjanobakterii Prochlorococcus, wyizolowaliśmy wyizolowaliśmy odporny na promieniowanie UV wariant szczepu MED4 przystosowanego do wysokiego natężenia światła. Ten był konstytutywnie regulowany w kierunku ekspresji operonu mutT-phrB. operonu mutT-phrB, kodującego hydrolazę nudix i fotolazę, z których oba są zaangażowane w naprawę uszkodzeń DNA, które mogą być spowodowane przez światło UV. Fotoliza (PhrB) rozbija dimery pirymidynowe zwykle spowodowane ekspozycją na promieniowanie UV, wykorzystując energię ze światła widzialnego w procesie znanym jako fotoreaktywacja. Hydrolaza Nudix (MutT) hydrolizuje 8-okso-dGTP, nieprawidłową formę GTP, która powstaje w wyniku warunków utleniających, w tym promieniowania UV, utrudniając w ten sposób nieprawidłowe parowanie i mutagenezę poprzez zapobieganie włączaniu nieprawidłowej formy do DNA. Te są wolne od błędów, w przeciwieństwie do podatnych na błędy ciemnych systemów naprawy SOS które są szeroko rozpowszechnione w bakteriach. Szczep odporny na promieniowanie UV zawierał tylko mutację: delecję 1 bp w regionie międzygenowym bezpośrednio przed operatorem mutT-phrB. operonu mutT-phrB. Dwa kolejne wzbogacenia dla szczepów MED4 opornych na promieniowanie UV z kultur typu dzikiego MED4 dały początek szczepom zawierającym tę samą delecję 1 bp, potwierdzając jego związek z hiper-odpornym fenotypem. Te mają wpływ na mechanizmy naprawy DNA Prochlorococcus, stabilność genomu i prawdopodobnie lizogenezę. stabilności genomu i prawdopodobnie lizogenezy. --- Zapobieganie i korygowanie oksydacyjnych uszkodzeń DNA u Pseudomonas aeruginosa jest przez system naprawy oksydacyjnej DNA (GO). Pojedyncza inaktywacja mutT, mutY i mutM zaangażowanych w GO prowadziła do podwyższonych wskaźników mutacji (MR), które koreluje ze zwiększonym rozwojem oporności na antybiotyki. W tym badaniu, skonstruowaliśmy podwójnego mutanta w mutY i mutM (PAOMY-Mgm) i scharakteryzowaliśmy fenotyp i profil ekspresji genów przy użyciu mikromacierzy i RT-PCR. PAOMY-Mgm wykazał 28-krotny wzrost MR w porównaniu z referencyjnym szczepem PAO1. szczepu PAO1. Dla porównania, pojedynczy mutant PAOMYgm (mutY) wykazał tylko pięciokrotny wzrost, podczas gdy pojedynczy mutant PAOMMgm (mutM) wykazał nieistotny wzrost MR w porównaniu z PAO1 i pojedynczymi mutantami. Mutacje w regulatorze nfxB prowadzące do nadekspresji pompy wypływu MexCD-OprJ stwierdzono jako mechanizm oporności na cyprofloksacynę w podwójnym mutancie. mutancie. Lepszą kondycję mutanta w porównaniu z PAO1 stwierdzono w eksperymentach konkurencji wzrostu w obecności cyprofloksacyny w stężeniach tuż poniżej minimalnego stężenia hamującego. poniżej minimalnego stężenia hamującego. Zwiększona regulacja genu antymutatora pfpI, który, jak wykazano, zapewnia ochronę przed stresem oksydacyjnym, stwierdzono w PAOMY-Mgm w porównaniu z PAO1. Podsumowując, wykazaliśmy, że MutY i MutM są współpracują w GO P. aeruginosa i że oksydacyjne uszkodzenia DNA mogą stanowić stres oksydacyjny dla bakterii. --- Reaktywne formy tlenu są wytwarzane jako produkty uboczne wykorzystania tlenu i mogą prowadzić do utleniania kwasów nukleinowych i ich prekursorów nukleotydów. Spośród różnych utlenionych zasad, 8-okso-7,8-dihydroguanina wydaje się być najbardziej krytyczna podczas przenoszenia informacji genetycznej, ponieważ może łączyć się w pary. krytyczna podczas transferu informacji genetycznej, ponieważ może łączyć się w pary z zarówno z cytozyną, jak i adeniną. Podczas syntezy de novo nukleotydów guaninowych, Najpierw powstaje GMP, który jest przekształcany w GDP przez kinazę guanylanową. Enzym ten prawie nie działa na utlenioną formę GMP (8-okso-GMP) utworzoną przez utlenianie GMP lub przez rozszczepienie 8-okso-GDP i 8-okso-GTP przez białko MutT. Chociaż 8-okso-GDP z 8-okso-GMP jest w ten sposób zapobiegane, sam 8-okso-GDP może być wytwarzany przez utlenianie GDP przez reaktywne formy tlenu. Utworzony w ten sposób 8-okso-GDP może być przekształcony w 8-okso-GTP, ponieważ kinaza nukleozydo-difosforanowa i kinaza adenylanowa, z których obie katalizują konwersję GDP do GTP, nie odróżniają 8-okso-GDP od normalnego GDP. Wytworzony w ten sposób 8-okso-GTP i przez utlenianie GTP może być wykorzystany do syntezy RNA. Ta błędna inkorporacja jest przez białko MutT, które ma potencjał do rozszczepiania 8-okso-GTP, jak również jak również 8-okso-GDP do 8-okso-GMP. Gdy znakowany (14)C 8-okso-GTP został zastosowany do CaCl2 zmutowanego szczepu mutT(-), można go było włączyć do RNA w 4% szybkości do RNA w 4% szybkości dla GTP. Komórki Escherichia coli wydają się posiadać mechanizmy zapobiegające błędnej inkorporacji 8-okso-7,8-dihydroguaniny do RNA. --- 8-Oxo-dGTP (trifosforan 8-okso-7,8-dihydrodeoksyguanozyny) jest silnie mutagennym substratem syntezy DNA. substratem do syntezy DNA. Nagromadzenie 8-okso-dGTP w puli nukleotydów w puli nukleotydów indukuje konwersję G:C-->T:A, jak również konwersję A:T-->C:G, i Komórki Escherichia coli posiadają mechanizmy zapobiegające takim mutacjom. Produkt genu mutT specyficznie hydrolizuje 8-okso-dGTP do formy monofosforanowej. podczas gdy produkty genów mutM i mutY działają w celu skorygowania błędnych par spowodowanych przez przez inkorporację 8-oksoguaniny do DNA. Z analiz mutacji typu forward indukowanych w komórkach pozbawionych 8-okso-dGTPazy (białka MutT) i/lub enzymów naprawczych, które które tłumią mutacje wywołane przez 8-oksoguaninę w DNA (białka MutM i MutY), kooperacyjne funkcje tych białek w kontroli spontanicznej mutagenezy stały się oczywiste. mutagenezy stały się oczywiste. W szczepach mutatorów pozbawionych białek MutT i/lub MutM białka, 8-oksoguanina w DNA wzrosła do stężenia oczekiwanego od zwiększonej szybkości mutacji. --- Białko MutT Escherichia coli hydrolizuje 8-okso-7,8-dihydro-2'-dGTP (8-okso-dGTP) do monofosforanu, unikając w ten sposób włączenia 8-okso-7,8-dihydroguaniny (8-okso-G) do powstającego DNA. Bakteryjne i ssaków homologi białka MutT mają wspólny moduł fosfohydrolazy (MutT: Gly37-->Gly59). Poprzez mutagenezę nasycającą konserwowanych reszt w module MutT cztery z 10 konserwowanych reszt (Gly37, Gly38, Glu53 i Glu57) zostały okazały się niezbędne do tłumienia spontanicznej mutacji konwersji A: T ---> C: G w szczepie mutatora mutT(-). Dla pozostałych sześciu reszt (Lys39, Glu44, Thr45, Arg52, Glu56 i Gly59) uzyskano wiele pozytywnych mutantów, które mogą tłumić spontaniczną mutację. spontaniczną mutację; jednak wszystkie pozytywne mutanty dla Glu44 i Arg52 częściowo lub nieefektywnie tłumiły mutację, wskazując, że te dwie reszty są również ważne dla funkcji MutT. Kilka pozytywnych mutantów dla Lys39, Thr45, Glu56 i Gly59 skutecznie zmniejszyło podwyższony wskaźnik mutacji spontanicznych, jak zaobserwowano w przypadku typu dzikiego, stąd te cztery reszty nie są niezbędne dla funkcji MutT. Ponieważ Lys38 i Glu55 w ludzkim MTH1, odpowiadające nieistotnym resztom Lys39 i Glu56 w MutT, mogłyby nie mogły zostać zastąpione żadnymi innymi resztami bez utraty funkcji, różne cechy strukturalne między dwoma modułami białek MTH1 i MutT są widoczne. --- Opisano antybakteryjne działanie nanocząstek srebra (AgNP) na bakterie Gram-ujemne (komórki planktoniczne i biofilmy). AgNP o średnicy 8,3 nm stabilizowane przez hydrolizowane peptydy kazeinowe silnie hamowały tworzenie biofilmów tworzenie biofilmów Escherichia coli AB1157, Pseudomonas aeruginosa PAO1 i Serratia proteamaculans 94 w stężeniach 4-5 μg/ml, 10 μg/ml i 10-20 μg/ml, odpowiednio. Żywotność komórek E. coli AB1157 w biofilmach była znacznie zmniejszona przez stężenia AgNP powyżej 100 do -150 μg/ml. Szczepy E. coli z mutacjami w genach odpowiedzialnych za naprawę DNA zawierającego zmiany oksydacyjne (mutY, mutS). (mutY, mutS, mutM, mutT, nth) były mniej odporne na AgNP niż szczepy typu dzikiego. niż szczepy typu dzikiego. Sugeruje to, że geny te mogą być zaangażowane w naprawę uszkodzeń DNA uszkodzeń DNA spowodowanych przez AgNP. Mutanty E. coli z niedoborem naprawy przez wycięcie, SOS-response oraz w syntezie globalnych regulatorów RpoS, białka CRP i proteazy Lon wykazują podobną odporność na AgNP jak komórki typu dzikiego. Systemy LuxI/LuxR Quorum Sensing nie uczestniczyły w kontroli wrażliwości na AgNP bakterii Pseudomonas i Serratia. Zmutowane szczepy E. coli z niedoborem porin OmpF lub OmpC były 4-8 razy bardziej oporne na AgNP w porównaniu do szczepu typu dzikiego. szczepu typu dzikiego. Sugeruje to, że poriny pełnią ważną funkcję związaną z przeciwbakteryjnym działaniem AgNP działaniem przeciwbakteryjnym. --- W Escherichia coli gen mutT jest jednym z kilku, które działają w celu zminimalizowania mutagenezę przez reaktywne formy tlenu. Wykazano, że bakteryjne białko MutT i jego ssaków katalizują in vitro hydrolizę utlenionych nukleotydów deoksyguanozynowych. utlenionego nukleotydu deoksyguanozyny, 8-okso-dGTP, do odpowiadającego mu monofosforanu. Uważa się zatem, że białko "oczyszcza" pulę nukleotydów poprzez pozbawiając komórkę nukleotydu, którego włączenie do DNA byłoby intensywnie mutagenne. Jednakże, ponieważ inni wykazali, że mutacje mutT są mutagenne w niektórych warunkach wzrostu beztlenowego i wykazały, że 8-okso-dGTP jest słabym substratem polimerazy DNA, istnieje powód, aby kwestionować ten model. Opracowaliśmy opracowaliśmy test dla 8-okso-dGTP w ekstraktach bakteryjnych. Używając tego testu, który obejmuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconą fazą i wykrywanie elektrochemiczne, nie byliśmy w stanie wykryć 8-okso-dGTP w ekstraktach trzech różnych mutantów mutT E. coli, nawet po wzroście bakterii w obecności nadtlenku wodoru bakterii w obecności nadtlenku wodoru. Szacowana przez nas górna granica zawartości 8-okso-dGTP w tych bakteriach wynosi około 200 cząsteczek/komórkę, co odpowiada stężeniu stężeniu około 0,34 mikrometra. Gdy 8-okso-DGTP został dodany w stężeniu 0,34 mikrometra do systemu replikacji DNA in vitro zagruntowanego matrycą DNA, która pozwala na punktację błędów replikacji i z czterema normalnymi dNTP w ich szacowanych wewnątrzkomórkowych stężeniach, nie było wykrywalnego wpływu na częstotliwość błędów replikacji. Odkrycia te prowadzą nas do zakwestionowania wniosku, że 8-okso-dGTP jest najważniejszym fizjologicznym substratem dla białka MutT. --- Białko MutT bakterii Escherichia coli hydrolizuje utlenione nukleotydy guaninowe, 8-okso-DGTP i 8-oksoGTP, do odpowiednich monofosforanów, zapobiegając w ten sposób błędnej inkorporacji 8-oksoguaniny odpowiednio do DNA i RNA. Chociaż biologiczne znaczenie MutT zostało ustalone, jak białko MutT faktycznie działa in vivo, pozostaje do wyjaśnienia. Obecne badanie pokazuje molekularne zachowanie białka MutT in vivo i in vitro ze szczególnym ze szczególnym uwzględnieniem kontroli spontanicznej mutagenezy. Pojedyncza komórka E. coli zawiera około 70-75 cząsteczek białka MutT i że liczba ta nie zmienia się nawet gdy komórki były hodowane w warunkach beztlenowych i hiperoksydacyjnych. Analizy warunkowego wyciszania genów ujawniły, że około połowa liczby cząsteczek MutT jest potrzebna do utrzymania częstotliwości spontanicznych mutacji na normalnym poziomie. normalnym poziomie. Funkcje MutT nie są potrzebne w warunkach beztlenowych, jednak poziom białka MutT w komórce jest utrzymywany na stałym poziomie, prawdopodobnie w celu przygotowania do nagłych zmian ciśnienia tlenu. Istnieje możliwość, że MutT funkcjonuje w ścisłym powiązaniu z innymi białkami i przedstawiono dowody na to, że białko MutT że białko MutT może oddziaływać z niektórymi białkami in vivo.
Za pomocą jakiego mechanizmu białka MutT działają przeciwko uszkodzeniom DNA u bakterii?
Białka MutT należą do klasy hydrolaz Nudix. Wspólną strukturą substratową dla białek funkcjonalnie zróżnicowanej nadrodziny Nudix jest nukleotyd-difosforan-X, gdzie X jest dużą różnorodnością grup opuszczających. Aktywność hydrolaz Nudix zwykle skutkuje uwolnieniem nieorganicznego jonu fosforanowego lub produktu zawierającego końcową cząsteczkę fosforanową. Białka MutT hydrolizują trifosforany/difosforany 8-okso-G nukleozydów do odpowiednich monofosforanów nukleozydów i oczyszczają pulę nukleotydów. Białka MutT rozszczepiają 8-okso-dGTP (8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyno-5'-trifosforan) w pozycji α-β; rozszczepiają również 8-okso-dGTP w wiązaniu fosforanowym β-γ z szybkością 3% tej zarejestrowanej dla hydrolizy w pozycji α-β.  W ten sposób białka MutT zapobiegają oksydacyjnym uszkodzeniom DNA, jako część systemu GO. Utlenione nukleotydy mogą wystąpić, gdy bakterie są narażone na reaktywne formy tlenu. Ponadto reaktywne formy tlenu są wytwarzane jako produkty uboczne wykorzystania tlenu, co prowadzi do utleniania kwasów nukleinowych i ich prekursorów nukleotydów. W odróżnieniu od Escherichia coli MutT, która hydrolizuje 8-okso-dGTP i 8-okso-GTP, białka prątków hydrolizują nie tylko 8-okso-dGTP i 8-okso-GTP, ale także dCTP i 5-metylo-dCTP. Co więcej, hydroliza 8-okso-dGTP i 8-okso-GTP u prątków wydaje się być katalizowana w mechanizmie dwuetapowym, ponieważ MutT przekształca te utlenione trifosforany nukleozydów w odpowiadające im difosforany nukleozydów, a nie w monofosforany.