Zdolność glukokortykoidów do indukowania apoptozy lub zaprogramowanej śmierci komórek w mysich tymocytach jest dobrze znana. mysich tymocytach jest dobrze ugruntowana. Pomiar związanej z apoptozą fragmentacji międzynukleosomalnego DNA poprzez określenie procentu pofragmentowanego DNA za pomocą elektroforezy lub wirowania lizatów całych komórek jest zdecydowanie najczęstszym sposobem ilościowego określania apoptozy. Ponieważ metody te mierzą fragmentację DNA w lizatach całych komórek, a nie w nienaruszonych komórkach, mają one poważne ograniczenia. poważne ograniczenia, szczególnie w przypadku heterogenicznych populacji komórek. Kiedy mysie tymocyty inkubowano z glikokortykoidami, utrwalano, barwiono jodkiem propidyny i analizowano w cytometrii przepływowej. jodkiem propidium i analizowano cytometrycznie pod kątem rozkładu cyklu komórkowego, zaobserwowano odrębną subpopulację komórek. zaobserwowano, że subpopulacja komórek tworzy się poniżej regionu G0/G1, oznaczonego jako region region A0. Obecność komórek w tym regionie była zgodna z obecność międzynukleosomalnych fragmentów DNA, jak określono za pomocą elektroforezy żelowej. Inhibitory transkrypcji, translacji i aktywności endonukleazy oraz antagonista receptora glukokortykoidowego zapobiegały akumulacji komórek w tym regionie. regionie. Napromieniowanie mysich tymocytów również wytworzyło populację w regionie A0 . Uważa się, że komórki w tym regionie zostały poddane fragmentacji DNA indukowanej glukokortykoidami. Metoda ta stanowi użyteczną alternatywę dla testów lizatu całych komórek, ponieważ apoptozę można oceniać na poszczególnych komórek. --- TŁO: Elektroforeza żelowa pojedynczych komórek lub test kometowy, technika szeroko stosowana do analizy uszkodzeń DNA, została ostatnio wykorzystana do wykrywania fragmentacji DNA w komórkach ulegających apoptozie. Jednakże, liczba wariantów tego testu wykrywała przede wszystkim późne etapy fragmentacji DNA. fragmentacji DNA. Dlatego też monitorowanie postępu fragmentacji DNA, które może znacznie poprawić analizę indukcji i progresji śmierci komórkowej na poziomie pojedynczej komórki. na poziomie pojedynczej komórki, nie było możliwe przy użyciu tego testu. METODY: W niniejszym badaniu, modyfikacja oryginalnego testu neutralnego komety opracowanego przez Ostlinga i Johansona (Biochem Biophys Res Commun 123: 291-298, 1984) do wykrywania różnych etapów fragmentacji DNA. Test ten obejmuje lizę komórek detergentami anionowymi przy prawie neutralnym pH (9,5) i nie obejmuje nie zawiera wysokiego stężenia soli, w przeciwieństwie do większości innych opublikowanych metod. BMG-1 ludzkie komórki glejaka indukowano do zaprogramowanej śmierci komórkowej poprzez leczenie z dużą dawką (100 mikroM) etopozydu, a komety przygotowano po różnym czasie trwania (1-24 h) leczenia. WYNIKI: W przeciwieństwie do wyników wcześniej opublikowanych badań, komety z różnych kształtach odzwierciedlających postępujące etapy fragmentacji DNA fragmentacji DNA. Spośród nich zidentyfikowano sześć różnych kształtów i podzielono je na trzy różne kategorie w oparciu o stopień fragmentacji. Komety typu A miały dużą głowę oddzieloną wąskim obszarem "szyi" od owalnego, wybrzuszonego ogona, który wskazywał na rozpoczęcie fragmentacji. Komety typu B i C miały stale stale zmniejszającą się głowę związaną z odpowiednim rozszerzeniem ogona i odzwierciedlały odpowiednio pośrednie i późne etapy fragmentacji. Komety typu A i B pojawiały się z dużą częstotliwością we wczesnych punktach czasowych (1-6 h), podczas gdy komety typu C, które wskazywały na późne etapy fragmentacji, były obserwowane zaobserwowano dopiero po dłuższym leczeniu (24 h). W rezultacie, rozbudowana kinetyka postępu fragmentacji DNA. WNIOSEK: Obecny test elektroforezy żelowej pojedynczych komórek oferuje znaczną poprawę w monitorowaniu kinetyki fragmentacji DNA indukowanej podczas programowanej śmierci komórki. W połączeniu z jego prostotą i zdolnością do wykrywania odpowiedzi małych subpopulacji komórek, metoda ta może być stosowana do wiarygodnej i czułej analizy progresji śmierci komórek w różnych typach komórek i warunkach leczenia. --- Ameloblasty odpowiedzialne za tworzenie szkliwa zębów są podzielone na dwie różne fazy różne fazy: wydzielania i dojrzewania. Na przejściu między etapami wydzielania i dojrzewania, znaczna liczba komórek umiera. W niniejszym badaniu zbadaliśmy morfologię degenerujących ameloblastów za pomocą konwencjonalnej mikroskopii elektronowej mikroskopii elektronowej i rozszczepienie DNA w degenerujących jądrach ameloblastów za pomocą testu terminalnej transferazy in situ. w teście terminalnej transferazy in situ. Wyniki sugerują, że apoptoza (zaprogramowana śmierć komórki) w ameloblastach, w tym ligacja DNA, jest indukowana na etapie przejściowym. etapie przejściowym. Fragmenty jądrowe, kondensacja chromatyny i relokacja DNA w jądrach apoptotycznych zostały zbadane ilościowo za pomocą immunozłotego mikroskopii elektronowej z immunogoldem anty-DNA i testem terminalnej transferazy in situ połączonym z mikroskopią elektronową. w połączeniu z mikroskopią elektronową. Analiza numeryczna wykazała, że gęstość znakowania immunogold w skondensowanej chromatynie jąder apoptotycznych była średnio średnio porównywalna do tej w okołojądrowej heterochromatynie normalnych jąder, a poszczególne jądra i że poszczególne apoptotyczne fragmenty jądrowe wykazywały wysoce zmienne w stosunku do normalnej heterochromatyny, do fragmentów o gęstości dwa razy większej niż normalna heterochromatyna. wyższe niż w normalnej heterochromatynie. Test terminalnej transferazy in situ w połączeniu z mikroskopią elektronową wykrył końce DNA odsłonięte przez ultracienkie jak również rozszczepienie DNA przez domniemaną endonukleazę. Podsumowując, stan DNA, w tym jego ligacja i degeneracja, zmienia się stopniowo podczas kondensacji chromatyny i fragmentacji jądrowej apoptozy. --- Programowana śmierć komórki (PCD) lub apoptoza stała się ważnym regulatorem rozwoju i homeostazy organizmów wielokomórkowych. regulator rozwoju i homeostazy w organizmach wielokomórkowych, opracowano metody apoptozy i odróżnienia jej od nekrozy. Martwica odnosi się do morfologii zwykle związanej z przypadkową śmiercią komórki, podczas gdy apoptoza jest obserwowana, gdy śmierć komórki jest zaprogramowana lub fizjologicznie regulowana. regulowana fizjologicznie. Ta jednostka przedstawia zestaw testów do tych celów, z których wiele jest technicznie bardzo prostych. jest technicznie bardzo prostych. Wyróżniona w tej jednostce jest metoda TUNEL wykrywania komórek, które wykazują fragmentację DNA, która może być również wykonywana na skrawkach tkanek w celu zlokalizowania komórek apoptotycznych in situ. --- Komórki apoptotyczne posiadają specyficzne markery morfologiczne i biochemiczne. Opracowano różne opracowano różne metody wykrywania apoptozy w oparciu o te markery. Jedną z najczęstszych jest fragmentacja genomowego DNA. Oprócz elektroforezy w celu identyfikacji charakterystycznych 200 par zasad drabiny i końcowego dezoksyrybonukleotydylotransferazy za pośrednictwem dUTP-biotyny nick często stosuje się analizę zawartości DNA. Technika ta opiera się na na fakcie, że permeabilizowane komórki apoptotyczne uwalniają pofragmentowane DNA, co skutkuje Zawartość DNA jest mniejsza niż w żywych komórkach diploidalnych. Chociaż jest szeroko stosowana, stwierdziliśmy, że liczba komórek apoptotycznych wykrytych za pomocą analizy zawartości DNA jest często niższa niż wykrywana innymi metodami. Opracowaliśmy uproszczoną wersję protokołu opartego na cytometrii przepływowej, który wykrywa liczbę komórek komórek apoptotycznych bliższą tej wykrywanej innymi metodami i która wymaga wymaga znacznie mniejszej liczby komórek. Ponadto, ten uproszczony protokół pozwala na przygotowanie dużej liczby próbek w tym samym czasie. --- Programowana śmierć komórki (PCD) lub apoptoza stała się ważnym regulatorem rozwoju i homeostazy organizmów wielokomórkowych. regulator rozwoju i homeostazy w organizmach wielokomórkowych, opracowano metody apoptozy i odróżnienia jej od nekrozy. Ten przedstawia zestaw testów do tych celów, z których wiele jest technicznie bardzo proste technicznie i idealnie nadają się do badania komórek krwiotwórczych. Pierwszy podstawowy protokół pozwala na jakościową i ilościową ocenę apoptozy w hodowlach komórek limfocytów przy użyciu mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Kolejne trzy protokoły, które są przeznaczone do wykrywania fragmentacji jądrowego DNA i protokoły pomocnicze opisują metody radioznakowania DNA i cytoplazmy badanych komórek. i cytoplazmy badanych komórek. Następnie opisano techniki ilościowego oznaczania komórek apoptotycznych przy użyciu cytometrii przepływowej. za pomocą cytometrii przepływowej, a protokoły pomocnicze zapewniają metody primingu klonów komórek T i świeżo wyizolowanych komórek węzłów chłonnych, odpowiednio dla receptorów komórek T receptora (TCR). Opisano również ilościowe wykrywanie fragmentacji DNA w apoptotycznych komórkach. Pośredniczone przez TdT znakowanie nickiem dUTP-biotyny (TUNEL) (TUNEL) do wykrywania komórek apoptotycznych, wraz z procedurami procedury ilościowego oznaczania komórek apoptotycznych metodą cytometrii przepływowej przy użyciu TUNEL, i TUNEL, barwienie skrawków tkanek w celu identyfikacji komórek apoptotycznych. Ponieważ wiele pozostaje niekompletnie zrozumianych na temat molekularnych szlaków zaprogramowanej śmierci programowanej śmierci i prawdopodobnie najlepiej jest wykonać więcej niż jeden z podstawowych protokołów aby potwierdzić obserwację apoptotycznej śmierci komórki. --- Apoptoza odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych i patogenezie różnych nowotworów złośliwych i chorób układu odpornościowego. W niniejszym artykule opisaliśmy nowatorską metodę czułego wykrywania apoptozy indukowanej lekami przez przy użyciu spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). Zasada działania tej metody opiera się na badaniu fragmentacji DNA w procesie apoptozy indukowanej lekami. apoptozy. FCS jest metodą jednocząsteczkową i może być stosowana do czułego i selektywnego testu fragmentacji DNA bez separacji. Jako pierwsi opracowaliśmy wysoce czułą metodę charakterystyki fragmentów DNA przy użyciu domowego systemu FCS i SYBR Green I jako fluorescencyjnego barwnika interkalującego DNA, a następnie ustanowiliśmy model apoptozy indukowanej lekami przy użyciu ludzkiego raka trzustki komórek raka trzustki i lidamycyny. Ponadto, opracowana metoda FCS została wykorzystana do bezpośrednio wykryć fragmentację DNA wyekstrahowanego z komórek apoptotycznych lub w lizacie komórek apoptotycznych. W teście FCS zastosowano model jednoskładnikowy i wieloskładnikowy. model wieloskładnikowy zostały wykorzystane do dopasowania surowych danych FCS. Charakterystyczny czas dyfuzji charakterystyczny czas dyfuzji fragmentów DNA został wykorzystany jako ważny parametr do rozróżnienia statusu apoptotycznego komórek. Uzyskane dane udokumentowały, że charakterystyczny czas dyfuzji fragmentów DNA z komórek apoptotycznych apoptotycznych znacząco zmniejszał się wraz ze wzrostem stężenia lidamycyny, co co sugeruje, że fragmentacja DNA wystąpiła w apoptozie indukowanej lidamycyną. Wyniki FCS są zgodne z danymi uzyskanymi z cytometru przepływowego i elektroforezy żelowej. elektroforezy. W porównaniu z obecnymi metodami, opisana tutaj metoda jest czuła i prosta, a co ważniejsze, nasza objętość detekcji jest mniejsza niż 1 fL, a zapotrzebowanie na próbkę można łatwo zmniejszyć do poziomu nL przy użyciu technologii kropelkowej. W związku z tym nasza metoda prawdopodobnie staje się wydajną platformą detekcji do wczesnego wykrywania apoptozy komórek i badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych opartych na apoptozie. --- Zaprogramowana śmierć komórki lub apoptoza jest procesem fizjologicznym, dzięki któremu genetycznie uszkodzone komórki lub niepożądane komórki mogą zostać wyeliminowane. Różne zmiany morfologiczne i molekularne zachodzące podczas procesu apoptozy to tworzenie się apoptotycznych pęcherzyków błony komórkowej, kurczenie się komórek, kondensacja chromatyny i rozpad kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) na typowe fragmenty wielokrotności 180 par zasad. Zmiany te można wykryć na wiele sposobów. Tworzenie drabiny DNA, które obserwuje się po zastosowaniu techniki elektroforezy żelowej jest powszechnie akceptowane, ale nie odzwierciedla rozpadu DNA w poszczególnych komórkach i może również rozpadu DNA w poszczególnych komórkach, a także może pominąć wkład z małych subpopulacji w heterogenicznej populacji komórek. Alkaliczny test kometowy jako mierzony za pomocą elektroforezy żelowej pojedynczej komórki, z drugiej strony, dokładnie mierzy fragmentację DNA na poziomie pojedynczej komórki i umożliwia analizę subpopulacji komórek. subpopulacji komórek. Test został pierwotnie opracowany do pomiaru uszkodzeń DNA komórek narażonych na działanie dowolnego czynnika genotoksycznego. Jednak obraz komety wygenerowany przez komórkę apoptotyczną różni się od tego uzyskanego z komórki traktowanej przez krótki czas czynnikiem genotoksycznym. Korelacja powstawania komet z różnymi innymi ustalonymi parametrami apoptozy jest bardzo ważna. Niniejsze Niniejsze badanie ma na celu skorelowanie różnych cech apoptozy z tworzeniem ogona komety w ludzkich komórkach białaczki K-562 przy użyciu ekstraktów z herbaty. Apoptoza mierzona przez tworzenie ciałek apoptotycznych, analizę cytometrii przepływowej analiza, aktywacja kaspazy 3 i 8 oraz ekspresja genów związanych z apoptozą, takich jak geny takie jak bcl-2 i bax wykazały wysoki stopień korelacji z momentem ogona komety moment. Wskazuje to, że test kometowy może dokładnie odzwierciedlać miarę fragmentacji DNA a tym samym może być stosowany do wykrywania komórek przechodzących apoptozę. --- Narażenie na pył krzemionkowy może powodować zapalenie płuc, które może prowadzić do zwłóknienia. zwłóknienia, na które nie ma skutecznego leczenia klinicznego. Mechanizmy zaangażowane w rozwój krzemicy płuc nie zostały dobrze zdefiniowane; jednak większość obecnych dowodów wskazuje na centralną rolę makrofagów pęcherzykowych (AM) w tym procesie. makrofagów pęcherzykowych (AM) w tym procesie. Proponujemy, aby potencjał zwłóknieniowy cząsteczek zależy od jego zdolności do wywoływania apoptozy w AM. W tym badaniu, ludzkie AM traktowano fibrogennymi, słabo fibrogennymi i niefibrogennymi cząstkami modelowymi, takimi jak krzemionka. modelowymi cząstkami stałymi, takimi jak krzemionka (133 mikrogramy/ml), krzemionka amorficzna (80 (80 mikrogramów/ml) i dwutlenek tytanu (60 mikrogramów/ml). Komórki były traktowane tymi cząstkami in vitro przez 6 i 24 godziny i badane pod kątem apoptozy za pomocą analizy morfologicznej, fragmentacji DNA i poziomów cytozolowych fragmentów DNA związanych z histonem (testy ELISA na śmierć komórki). Leczenie krzemionką spowodowało zmiany morfologiczne typowe dla komórek apoptotycznych, zwiększoną fragmentację DNA fragmentacja DNA (charakterystyczna cecha zaprogramowanej śmierci komórki) i znaczącą apoptozę makrofagów pęcherzykowych, obserwowaną w testach ELISA na śmierć komórkową. testy. Natomiast amorficzna krzemionka i dwutlenek tytanu nie wykazywały znaczącego potencjału apoptotycznego. Aby wyjaśnić możliwy mechanizm, za pomocą którego krzemionka powoduje apoptozę, zbadaliśmy rolę receptora zmiatacza (SR) w apoptozie indukowanej krzemionką. Komórki traktowano wstępnie inhibitorem wiązania ligandu SR inhibitorem wiązania SR, kwasem poliinozynowym (poli (I), 500 mikrogramów / ml), przez 10 minut przed traktowaniem krzemionką. Wstępne traktowanie poli (I) spowodowało całkowite zahamowanie apoptozy indukowanej krzemionką, mierzonej testem ELISA na śmierć komórki. Ponadto, zbadaliśmy zaangażowanie enzymu konwertującego interleukinę (ICE) w apoptozę apoptozie, w której pośredniczy krzemionka, stosując inhibitor ICE, Z-Val-Ala-Asp-fluorometylo keton. Keton Z-Val-Ala-Asp-fluorometylowy hamował apoptozę indukowaną krzemionką i uwalnianie IL-1 beta. uwalnianie IL-1 beta. Wyniki te sugerują, że cząstki fibrogenne, takie jak krzemionka, powodowały apoptozę makrofagów pęcherzykowych i że ten potencjał apoptotyczny apoptotyczny cząstek fibrogennych może być krytycznym czynnikiem w inicjowaniu odpowiedzi odpowiedzi zapalnej skutkującej zwłóknieniem. Dodatkowo, indukowana krzemionką apoptoza makrofagów pęcherzykowych może być spowodowana interakcją cząstek krzemionki cząstek krzemionki z SR, inicjując jeden lub kilka szlaków sygnałowych z udziałem ICE, co ostatecznie prowadzi do apoptozy. --- Zdolność żabiego wirusa 3 (FV3), gatunku z rodziny Iridoviridae, do wywoływania apoptozy badano poprzez monitorowanie rozszczepienia DNA, kondensacji chromatyny kondensację chromatyny i ekspresję fosfotydyloseryny (PS) na powierzchni komórek u strzebli tłuszczowej minnow (FHM) i komórkach nerki chomika (BHK). W produktywnie zainfekowanych komórkach FHM fragmentacja DNA została po raz pierwszy odnotowana po 6-7 godzinach od zakażenia i była wyraźnie widoczne przez 17 godzin po zakażeniu, podczas gdy kondensacja chromatyny została wykryta po 8,5 godziny po zakażeniu. po infekcji. Podobnie jak w przypadku niektórych innych wirusów, apoptoza indukowana przez FV3 nie wymagała ekspresji genów wirusowych de novo, ponieważ zarówno wirus inaktywowany termicznie, jak i UV łatwo wywoływał fragmentację DNA w komórkach FHM. Co więcej, indukowana przez FV3 apoptoza była blokowana w komórkach FHM przez inhibitor pan-kazpazy Z-VAD-FMK, sugerując, że infekcja wirusowa wyzwala zaprogramowaną śmierć komórki poprzez aktywację kaskady kaspaz. Infekcja FV3 wywołała również apoptozę w komórkach BHK monitorowaną za pomocą testów wiązania TUNEL i aneksyny V. Aby ustalić, czy FV3, podobnie jak inne duże wirusy DNA, koduje białka, które blokują lub opóźniają apoptozę. apoptozę, komórki FHM zakażone mockami i FV3 poddano szokowi osmotycznemu i poddano analizie na fragmentację DNA 3 godziny później. Fragmentacja DNA była wyraźnie widoczna niezależnie od tego, czy wstrząśnięte komórki były wcześniej zakażone FV3, co wskazuje, że infekcja FV3 nie blokowała apoptozy indukowanej szokiem osmotycznym w komórkach FHM komórkach. Powyższe wyniki pokazują, że irydowirusy wywołują apoptozę i że indukcja zaprogramowanej śmierci komórki nie wymagała ekspresji genów wirusowych. ekspresji genów wirusowych. Pozostaje jednak do ustalenia, czy przyłączenie wirionu do komórek docelowych jest wystarczające do wywołania śmierci komórki, lub czy apoptoza jest wyzwalana bezpośrednio lub pośrednio przez jedno lub więcej białek związanych z wirionem. --- Celem tej pracy eksperymentalnej było zbadanie, czy apoptoza przyczynia się do przebudowy tkanek podczas gojenia kości metodą dystrakcji. W króliczym modelu modelu osteogenezy dystrakcyjnej żuchwy, przeanalizowaliśmy ilościowo apoptotycznej w odniesieniu do różnych obciążeń mechanicznych. obciążenia mechanicznego. Komórki apoptotyczne zidentyfikowano za pomocą testu wykrywania in situ dla fragmentacji jądrowego DNA przy użyciu zmodyfikowanej procedury TUNEL i za pomocą mikroskopii elektronowej mikroskopii pod kątem typowych cech morfologicznych zaprogramowanej śmierci komórki. śmierci komórki. Komórki TUNEL-dodatnie były często wykrywane w próbkach rozproszonych przy wyższych wartościach odkształcenia. Ultrastrukturalnie, te apoptotyczne komórki wykazywały skondensowaną chromatynę i pofragmentowane jądra, podczas gdy ciągłość ich błon plazmatycznych pozostała nienaruszona. błony plazmatycznej pozostała nienaruszona. Nasze wyniki wyraźnie wskazują, że nieciągła trakcja osteotomizowanych żuchw indukowała nasiloną apoptozę. W przeciwieństwie do próbek niepoddanych dystrakcji i żuchw poddanych dystrakcji przy niskich wartościach odkształcenia, w których w których wykryto jedynie minimalne oznaki apoptotycznej śmierci komórek, zastosowanie zastosowanie hiperfizjologicznych wielkości naprężeń skutkowało zwiększonym wskaźnikiem apoptozy. apoptozy. Zatem obciążenie mechaniczne wydaje się być czynnikiem wyzwalającym zmiany apoptotyczne w komórkach osteoblastycznych. Odkrycia te sugerują patofizjologiczną rolę apoptotycznej śmierci komórek w kontroli integralności tkanek podczas osteoporozy dystrakcyjnej. integralności tkanek podczas osteogenezy dystrakcyjnej. --- Apoptoza lub zaprogramowana śmierć komórki jest genetycznie kontrolowaną reakcją komórek na popełnienie samobójstwa i jest związana z fragmentacją lub drabinowaniem DNA. Do powszechne induktory apoptozy obejmują Ca2+i i wolne rodniki tlenowe / stres oksydacyjny, które są również zaangażowane w patogenezę stres, które są również zaangażowane w patogenezę miopatii indukowanej wysiłkiem fizycznym. miopatii wywołanych wysiłkiem fizycznym. Aby zbadać apoptozę wywołaną treningiem, konie pełnej krwi angielskiej zostały poddano 3-miesięcznemu programowi treningowemu na bieżni. Pod koniec programu treningowego pobrano próbki krwi żylnej do oznaczenia kinazy kreatynowej (CK) (CK). Ponadto pobrano próbki biopsji mięśni do pomiaru peroksydacji lipidów błonowych metodą peroksydacji lipidów błonowych za pomocą testu dialdehydu malonowego (MDA) i do wykrywania apoptozy. wykrywania apoptozy. Apoptozę badano poprzez wizualizację apoptotycznych miocytów na skrawkach parafinowych za pomocą zmodyfikowanej metody TUNEL. Drabinowanie DNA zostało ocenione przez poddając DNA uzyskane z biopsji elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym. elektroforezie. Zaobserwowano znaczący wzrost (P<0,05) MDA związanego z białkami, i nieistotny trend (P = 0,14) dla grupy kontrolnej, aby mieć wyższe poziomy wyższy poziom CK w porównaniu do grupy trenującej. Pod mikroskopem świetlnym odsetek pozytywnych komórek TUNEL był wyższy (P<0,001) w grupie treningowej. Wynik ten wynik został potwierdzony wynikami fragmentacji DNA za pomocą żelu elektroforezy, która wykazała wyższe drabiny pasma DNA w tej samej grupie. Podsumowując Podsumowując, wyniki te wyraźnie pokazują, że istnieje indukowana treningiem apoptoza w mięśniach szkieletowych. Jest prawdopodobne, że apoptoza umożliwia cykl praca/regeneracja/odbudowa/superkompensacja, kiedy nieprzyzwyczajone komórki mięśniowe aktywują zaprogramowaną śmierć komórkową i są zastępowane przez nowe i silniejsze komórki, co jest mechanizmem indukowanego treningiem wzrostu wydolności. --- Embrionalny przewód odpływowy jest prostą strukturą rurową, która łączy z workiem aortalnym i tętnicami łuku aorty. Ta Struktura ta przechodzi złożoną sekwencję procesów morfogenetycznych, aby stać się serca, która łączy prawą i lewą komorę z tętnicą płucną i aortą. tętnicą płucną i aortą. Nieprawidłowości drogi odpływu są zaangażowane w w wielu klinicznie istotnych wrodzonych wadach serca; jednak procesy komórkowe i molekularne regulujące rozwój i molekularne procesy rządzące rozwojem tej ważnej struktury są nie do końca poznane. Badania histologiczne i znakowania tkanek wskazują, że wskazują, że tkanki dróg odpływu zagęszczają się i są włączane głównie do obszaru prawej komory. regionu prawej komory. Hipoteza testowana w bieżącym badaniu była następująca że śmierć komórek lub apoptoza w mięśniowej części drogi odpływu jest ważnym mechanizmem komórkowym ważnym mechanizmem komórkowym skracania się dróg odpływu. Mięsień sercowy został specyficznie oznaczony przez zainfekowanie miocytów serca zarodka kurczaka zarodka kurzego rekombinowanym adenowirusem z defektem replikacji wyrażającym beta-galaktozydazę (beta-gal) pod kontrolą promotora wirusa cytomegalii. Histochemiczne wykrywanie znakowanych beta-galami miocytów dróg odpływu ujawniło że struktura kanalikowa skróciła się, aby stać się zwartym pierścieniem na poziomie pierścienia na poziomie infundibulum płucnego w ciągu kilku dni rozwoju (stadia 25-32, dni embrionalne 4-8). Pojawienie się apoptotycznych kardiomiocytów było skorelowane z ze skróceniem OFT za pomocą dwóch testów histologicznych, znakowania TUNEL fragmentów DNA i wiązanie aneksynyV. Wzrost i spadek liczby apoptotycznych miocytów wykryty w analizach histologicznych odpowiadał zmianie poziomów aktywności kaspazy-3, proteazy w kaskadzie apoptotycznej, mierzonej w homogenatach dróg odpływu homogenatach. Wyniki te sugerują, że eliminacja miocytów przez zaprogramowaną śmierć komórkową jest jednym z mechanizmów, za pomocą których mięsień sercowy drogi odpływu remodeluje się, tworząc prawidłowe połączenie między komorami komorowymi a odpowiednimi pniami tętniczymi. --- Wstęp: Zakażenie Helicobacter pylori wywołuje przewlekłe zapalenie żołądka u praktycznie wszystkich zakażonych osób. praktycznie u wszystkich zakażonych osób, a takie zapalenie żołądka wiąże się ze zwiększonym ryzykiem rozwoju raka żołądka. Ryzyko to jest dodatkowo zwiększone w przypadku cagA+ (pozytywny dla genu związanego z cytotoksyną A) szczepów H. pylori i może być konsekwencją indukowanej proliferacji komórek żołądka. może być konsekwencją indukowanej proliferacji komórek żołądka i/lub zmian w apoptozie (zaprogramowanej śmierci komórki) w nabłonku żołądka. CEL: Określenie, czy genotyp cagA H. pylori i inna cecha cecha związana ze zjadliwością, genotyp vacA (wakuolująca cytotoksyna A) s1a genotyp, w różny sposób wpływają na proliferację komórek nabłonkowych, apoptozę i parametry histologiczne zapalenia. histologiczne parametry stanu zapalnego i urazu, określiliśmy ilościowo te u osób zakażonych i niezakażonych. METODY: Pięćdziesięciu pacjentów poddano endoskopii górnego odcinka przewodu pokarmowego i pobrano próbki biopsji. pobrano próbki biopsji. Komórki apoptotyczne w próbkach oznaczono ilościowo po końcowej transferazy deoksynukleotydylowej znakowania fragmentów DNA za pomocą digoksygeniną - trifosforanem deoksyurydyny; proliferację komórek nabłonkowych oceniano przez analizę immunohistochemiczną antygenu Ki-67 związanego z proliferacją. Przeciwciała skierowane przeciwko H. pylori i białku CagA zostały zmierzone w surowicy w surowicy pacjentów za pomocą enzymatycznych testów immunosorbcyjnych. Analiza genomowego DNA H. pylori, przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy, została przeprowadzona w celu określenia genotypów cagA i vacA. Ostre i przewlekłe zapalenie, zwyrodnienie komórek nabłonka, zubożenie mucyny, metaplazja jelitowa, zanik gruczołów i wakuolizacja. i wakuolizacja były oceniane w sposób zaślepiony. Podane wartości P są dwustronne. WYNIKI: Osoby będące nosicielami szczepów cagA+ (n = 20) miały istotnie wyższą proliferację nabłonka żołądka. wyniki proliferacji nabłonka żołądka niż osoby zakażone szczepami cagA (n = 9) lub osoby niezakażone (n = 21) (odpowiednio P = .025 i P<.001), ale różnica w proliferacji komórek różnica w proliferacji komórek między dwiema ostatnimi grupami nie była statystycznie istotna. Liczba komórek apoptotycznych na 100 komórek nabłonka (wskaźnik apoptotyczny) komórek nabłonka (wskaźnik apoptotyczny) u osób zakażonych szczepami cagA+ była niższa niż u osób zakażonych szczepami niż u osób zakażonych szczepami cagA (P = .05). Wskaźniki apoptotyczne w grupie cagA+ były podobne do tych w grupie niezakażonej (P = .2). Proliferacja komórek nabłonkowych komórek nabłonkowych była istotnie skorelowana z ostrym zapaleniem żołądka, ale tylko w grupie cagA+ (r = .44; P = .006). Stwierdzono, że genotypy cagA+ i vacA s1a okazały się zgodne, potwierdzając ścisły związek między tymi genotypami genotypami związanymi z wirulencją. WNIOSKI: Proliferacja błony śluzowej żołądka była istotnie skorelowana z nasileniem nasileniem ostrego zapalenia błony śluzowej żołądka u osób zakażonych szczepami cagA+ vacA s1a H. pylori. Tej zwiększonej proliferacji nie towarzyszył równoległy wzrost apoptozy. wzrost apoptozy. WNIOSKI: Zwiększona proliferacja komórek przy braku odpowiedniego apoptozy może wyjaśniać zwiększone ryzyko zachorowania na raka żołądka, które jest związane z zakażeniem szczepami cagA+ vacA s1a H. pylori. --- Apoptoza jest zorganizowanym, zależnym od energii procesem, który prowadzi do śmierci komórki. Jego definicja opiera się na odrębnych cechach morfologicznych [10] i wykazaniu degradacji międzynukleosomalnego DNA [27], wykonywanej przez selektywnie aktywowane DNAzy [4, 22]. Morfologiczne cechy charakterystyczne apoptozy obejmują chromatyczna marginalizacja, kondensacja i fragmentacja jądra oraz kondensacja komórki z zachowaniem organelli. Po tym procesie następuje fragmentacja komórki na ciała apoptotyczne związane z błoną, które ulegają fagocytozie przez pobliskie komórki bez towarzyszącego stanu zapalnego [10, 11]. Apoptoza charakterystycznie występuje w izolowanych pojedynczych komórkach. Czas trwania apoptozy apoptozy szacuje się na od 12 do 24 godzin, ale w hodowli komórkowej widoczne zmiany morfologiczne zmiany morfologiczne zachodzą w czasie krótszym niż dwie godziny [10, 16]. Nieapoptotyczna śmierć komórki śmierć komórek nieapoptotycznych, której prototypem jest śmierć komórek spowodowana niedokrwieniem (onkoza), charakteryzuje się charakteryzuje się wyczerpaniem wewnątrzkomórkowych zapasów ATP, obrzękiem komórki z rozerwaniem organelli i pęknięciem błony plazmatycznej [15]. Grupy W tkankach stwierdza się grupy komórek martwiczych i stan zapalny [10, 15]. Znaczenie apoptozy badano głównie przy użyciu testu TUNEL, który wykrywa pęknięcia nici DNA DNA w wycinkach tkanek i pozwala na ilościową ocenę komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii świetlnej [6]. mikroskopii świetlnej [6]. Powszechne doświadczenie wydaje się być takie, że test TUNEL jest podatny na wyniki fałszywie dodatnie lub ujemne. Zostało to wyjaśnione przez zależnością kinetyki barwienia od stężenia odczynnika [17], utrwalenia tkanki [2] oraz tkanki [2] i stopnia proteolizy [17]. Aktywna synteza RNA [12] i uszkodzenia DNA w komórkach martwiczych [17, 19] mogą powodować niespecyficzne barwienie. Aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki, test TUNEL powinien być starannie standaryzowany przy użyciu skrawków tkanek poddanych działaniu DNAzy (pozytywna kontrola apoptozy). Kwantyfikacja apoptozy powinna obejmować wystarczającą liczbę pól mikroskopowych i identyfikację typu komórek ulegających apoptozie. Specyficzność wyników może być potwierdzona przez połączenie innych metod z TUNEL, takich jak ocena wzoru fragmentacji DNA lub ocena cech morfologicznych. cech morfologicznych. Chociaż istnieje duża zmienność wyników uzyskanych w kolejnych badaniach w tych samych okolicznościach, coraz więcej dowodów dowodów wskazuje, że kardiomiocyty TUNEL-dodatnie i fragmentacja międzynukleosomalnego DNA są związane z różnymi chorobami serca, w tym ostrym zawałem mięśnia sercowego i mięśnia sercowego i niewydolnością serca [przegląd w 5, 9]. Niektóre cechy morfologiczne morfologiczne apoptozy zaobserwowano w kardiomiocytach TUNEL-dodatnich przy użyciu mikroskopii mikroskopii świetlnej (Rysunek 1) lub mikroskopii konfokalnej [20]. Mikroskopia elektronowa dowody apoptozy znaleziono w degenerującym się układzie przewodzącym [7], w eksperymentalnej niewydolności serca [23] oraz w ludzkim hibernującym mięśniu sercowym [3]. W w ostrym niedokrwieniu mięśnia sercowego interpretacja wyników pozostaje kontrowersyjna, ponieważ w mikroskopii elektronowej stwierdzono jedynie nieapoptotyczną morfologię komórek mikroskopii elektronowej [8, 19]. Jednym z wyjaśnień może być przerwanie programu apoptotycznego z powodu braku ATP, zanim cechy morfologiczne są w pełni widoczne [14]. [14]. Innym wyjaśnieniem jest możliwość, że nieapoptotyczna śmierć komórki i apoptoza apoptoza mają wspólne mechanizmy we wczesnych fazach tych procesów [14, 19]. Dokładne mechanizmy śmierci komórek niedokrwiennych pozostają do wyjaśnienia, a klasyfikacja klasyfikacji pomiędzy apoptozą i nieapoptotyczną śmiercią komórki. Ostatnio aktywacja kaspaz pojawiła się jako centralne zdarzenie molekularne prowadzące do apoptozy, poprzedzające do apoptozy, poprzedzająca degradację DNA i rozwój morfologii apoptotycznej [22, 25]. apoptotycznej [22, 25]. Opracowano nowe metody w celu wykazania aktywacji kaspaz [1, 13]. [1, 13]. Hamowanie kaspaz może być skutecznym sposobem zapobiegania apoptotycznej śmierci kardiomiocytów, a także zdefiniować i szczegółowo zbadać znaczenie apoptotycznej śmierci komórek w chorobach serca. --- TŁO: Zaprogramowana śmierć komórki jest istotnym wydarzeniem podczas morfogenezy ssaków. morfogenezy, które eliminuje niepotrzebne komórki w celu osiągnięcia histogenezy i organogenezy. organogenezy. Śmierć komórek w przestrzeniach międzypalcowych rozwijającej się kończyny jest klasycznym przykładem klasycznym przykładem morfogenetycznej śmierci komórek. Zbadaliśmy, czy klasyczna zaprogramowana śmierć komórki w tkance międzypalcowej rozwijającej się kończyny u myszy jest apoptozą z fragmentacją jądrowego DNA, a także zbadaliśmy sekwencyjnie występowanie zaprogramowanej śmierci komórki i proliferacji komórek w rozwijającej się kończynie płodów myszy. kończyny płodów myszy, aby przeanalizować ich wzajemne powiązania. METODY: Zbadaliśmy występowanie apoptotycznej śmierci komórek w rozwijających się kończynach płodów myszy. kończyn płodów myszy przy użyciu barwienia siarczanem błękitu Nilu, żelu agarozowego elektroforezy do wykrywania drabinkowego DNA i cytochemicznego znakowania fragmentacji DNA. fragmentacji DNA. Oznaczyliśmy również komórki proliferujące przy użyciu immunohistochemii BrdU/anty-BrdU immunohistochemii i zbadaliśmy współzależność między apoptotyczną zaprogramowaną apoptotyczną i proliferacją komórek. WYNIKI: Drabiny DNA, biochemiczny dowód apoptozy, wykryto w ekstraktach DNA z tkanki międzypalcowej 13-dniowych płodów myszy metodą elektroforezy w żelu agarozowym. elektroforezy. Zaprogramowana śmierć komórki i fragmentacja DNA zostały wykryte przez Barwienie błękitem Nilu i cytochemiczne znakowanie fragmentacji DNA, w mezodermie międzypalcowej i w regionach przypuszczalnych stawów cyfry. Immunohistochemia BrdU/anty-BrdU w celu identyfikacji proliferujących komórek fazy S ujawniła, że międzypalcowe komórki mezenchymalne zaprzestają syntezy DNA przed programowaną śmiercią komórki i rozpoczyna się fragmentacja DNA. WNIOSKI: Potwierdziliśmy, że zarówno cytologiczne zmiany apoptotyczne, jak i fragmentacja jądrowego DNA występują w tkance międzypalcowej i przypuszczalnych obszarach stawowych kończyn płodowych myszy i wydaje się, że odgrywają one znaczącą rolę w w oddzielaniu się palców, jak również w tworzeniu się jam stawowych. --- Apoptoza, czyli zaprogramowana śmierć komórki, jest fizjologiczną formą śmierci komórki, która odgrywa kluczową rolę w rozwoju i utrzymaniu organizmów wielokomórkowych. organizmów wielokomórkowych. Apoptoza jest charakteryzowana na podstawie kryteriów morfologicznych i biochemicznych. kryteria morfologiczne i biochemiczne. Cechy morfologiczne obejmują kurczenie się komórek, kondensację cytoplazmatyczną, segregację chromatyny i kondensacja, segregacja i kondensacja chromatyny, pękanie błony oraz tworzenie ciał apoptotycznych związanych z błoną, podczas gdy biochemiczną cechą charakterystyczną apoptozy jest międzynukleosomalne rozszczepienie DNA na fragmenty o długości oligonukleosomu fragmenty o długości oligonukleosomu. Wiele badań ma na celu zdefiniowanie mechanizmów molekularnych odgrywających rolę w apoptozie. mechanizmów, które odgrywają rolę w apoptozie. Ponieważ jednym ze wspólnych punktów końcowych eksperymentów związanych z apoptozą jest w rzeczywistości śmierć komórki, stało się to ważne stało się opracowanie wiarygodnych testów do pomiaru śmierci komórki, które można porównać między różnymi badanymi systemami. W niniejszym rozdziale dokonano przeglądu wielu metod stosowanych do pomiaru apoptotycznej śmierci komórki i wskazuje mocne i słabe strony każdego podejścia w odniesieniu do badanego systemu i zadawanych pytań. badanego systemu i zadawanych pytań. Tradycyjne metody oparte na komórkach, w tym mikroskopia mikroskopię świetlną i elektronową, barwniki witalne i barwniki jądrowe. Metody biochemiczne metody biochemiczne, takie jak drabinowanie DNA, uwalnianie enzymu dehydrogenazy mleczanowej i aktywność enzymu MTT/XTT aktywność enzymatyczna. Dodatkowo, terminalna deoksynukleotydylo deoksynukleotydylowej (TUNEL) i znakowanie fragmentów DNA in situ (ISEL). in situ (ISEL), które w połączeniu ze standardowym barwieniem cytometrycznym w przepływie w połączeniu ze standardowymi metodami barwienia cytometrii przepływowej mogą dostarczać informacji dane odnoszące śmierć komórki do różnych parametrów komórkowych, w tym cyklu komórkowego i fenotypem komórkowym. Zastosowanie jednej lub więcej metod opisanych w tym rozdziale do pomiaru śmierci komórek powinno umożliwić badaczom dokładną ocenę apoptozy w kontekście ocenę apoptozy w kontekście różnych badanych modeli i pomóc w określeniu związków przyczynowo-skutkowych między mechanizmami zdefiniować związki przyczynowe między mechanizmami regulującymi apoptozę a samym zdarzeniem śmierci komórki. a samą śmiercią komórki. --- TŁO I CEL: Pole elektryczne i towarzyszące mu ciepło (elektrohipertermia) (elektrohipertermia) mogą synergistycznie indukować śmierć komórek w tkance nowotworowej z powodu podwyższonej glikolizy, stężenia jonów i przenikalności w tkankach złośliwych w porównaniu z tkankami niezłośliwymi. Tutaj zbadaliśmy mechanizm i czas mechanizm i czas niszczenia guza przez elektrohipertermię. MATERIAŁ I METODY: Obustronne wszczepy raka jelita grubego HT29 w okolice kości udowych udowych myszy Balb/c (nu/nu) poddano działaniu pojedynczego 30-minutowego zastrzyku modulowanej elektrohipertermii o częstotliwości radiowej 13,56 MHz (mEHT). Guzy w 0, 1, 4, 8, 14, 24, 48 i 72 h po leczeniu badano pod kątem morfologii, fragmentacji DNA i białek związanych z odpowiedzią na śmierć komórki za pomocą mikromacierzy tkankowych, immunohistochemii, zachodnich immunoblotów, i testy końcowego znakowania deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL). WYNIKI: Modulowane leczenie EHT indukowało znaczne zniszczenie guza w ksenograftach HT29 ksenografty ze szczytem siedmiokrotnego wzrostu w porównaniu z nieleczonymi kontroli. Znaczący wzrost fragmentacji DNA związany z leczeniem fragmentacji DNA - wykrywane za pomocą testu TUNEL - i ciał apoptotycznych między 24 a 72 h po leczeniu było dowodem zaprogramowanej odpowiedzi na śmierć komórki. Było to związane ze znaczną mitochondrialną akumulacją bax i mitochondrialnego do cytoplazmatycznego uwalniania białek cytochromu c między 8 a 14 h. h. Poziomy rozszczepionej kaspazy-3 były niskie i zlokalizowane głównie w komórkach zapalnych. Znaczna translokacja czynnika indukującego apoptozę (AIF) z cytoplazmy do jądra czynnika indukującego apoptozę (AIF) i jego aktywowanego fragmentu 57-kDa wykrytego między 14 a 24 godziną po leczeniu wskazał AIF jako efektor fragmentacji DNA. WNIOSEK: Modulowane leczenie EHT może indukować zaprogramowane zniszczenie guza związane ze śmiercią komórki zniszczenie guza w ksenograftach gruczolakoraka jelita grubego HT29, który dominuje podąża za podprogramem niezależnym od kaspaz.
Które testy mogą być stosowane do wykrywania fragmentacji DNA wynikającej z zaprogramowanej śmierci komórki (apoptozy)?
Biochemiczną cechą charakterystyczną apoptozy jest rozszczepienie międzynukleosomalnego DNA na fragmenty o długości oligonukleosomów. Pomiar fragmentacji międzynukleosomalnego DNA związanej z apoptozą poprzez określenie procentu pofragmentowanego DNA za pomocą elektroforezy lub wirowania lizatów całych komórek jest zdecydowanie najpowszechniejszym sposobem ilościowego określania apoptozy. Fragmentację DNA spowodowaną apoptozą można również zidentyfikować za pomocą znakowania fragmentów DNA za pomocą terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej z nickiem dUTP-biozyny (TUNEL), znakowania in situ (ISEL) genomowego DNA w pofragmentowanych jądrach oraz pomiaru cytozolowych fragmentów DNA związanych z histonami (testy ELISA na śmierć komórki).