Bakterie rozwinęły kilka mechanizmów obronnych przeciwko bakteriofagom w czasie ewolucji. ewolucji, ale koncepcja prokariotycznej interferencji RNA, w której pośredniczy przeciwko fagom i innym inwazyjnym elementom genetycznym pojawiła się dopiero niedawno. dopiero niedawno. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) wraz ze ściśle powiązanymi genami (geny Cas) tworzą system CASS który, jak się uważa, zapewnia podobny do RNAi mechanizm obronny przeciwko bakteriofagom wewnątrz bakterii gospodarza. Jednak szlak podobny do RNAi, w którym pośredniczy CASS w patogenach jelitowych, takich jak Vibrio cholerae O395 lub Escherichia coli O157 nie zostały jeszcze zgłoszone. Niniejsze badanie zostało zaprojektowane w celu zbadanie możliwości i ewolucyjnego pochodzenia szlaku RNAi-podobnego, w którym pośredniczy CASS w genomie zestawu patogenów jelitowych, zwłaszcza V. cholerae. Wyniki Wyniki wykazały, że V. cholerae O395, a także inne pokrewne patogeny jelitowe mają niezbędne składniki CASS (geny CRISPR i cas) do pośredniczenia w szlaku podobnym do RNAi. RNAi. Funkcjonalne domeny białka Cas3 V. cholerae, które uważa się za działające jako prokariotyczny Dicer, zostały ujawnione i porównane z domenami eukariotycznych białek Dicer. Rozległa homologia w kilku funkcjonalnych domenach dostarcza znaczących dowodów na to, że białko Cas3 ma niezbędne domeny do odgrywać istotną rolę w szlaku RNAi w V. cholerae. Struktura drugorzędowa pre-siRNA dla V. cholerae O395 została określona, a jej termodynamiczna stabilność również wzmocniła poprzednie ustalenia i oznacza prawdopodobieństwo szlaku podobnego do RNAi w V. cholerae O395. --- Niezbite dowody wskazują, że system CRISPR-Cas chroni prokariota przed wirusami i innymi potencjalnymi najeźdźcami genomu. Ten adaptacyjny prokariotyczny adaptacyjny prokariotyczny układ odpornościowy wynika z klastra regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) występujących w genomach prokariotycznych, które zawierają krótkie sekwencje sekwencje pochodzące od najeźdźców oraz geny kodujące białka związane z CRISPR (Cas). Tutaj zidentyfikowaliśmy kompleks efektorowy CRISPR-Cas, który składa się z małych RNA celujących w najeźdźców z loci CRISPR (określanych jako prokariotyczne wyciszanie (psi)RNA) i modułu RAMP (lub Cmr) białek Cas. Kompleksy białek psiRNA-Cmr rozszczepiają komplementarne docelowe RNA w stałej odległości od końca 3' integralnego psiRNA. U Pyrococcus furiosus, psiRNA występują w dwóch formach wielkościowych które mają wspólny znacznik sekwencji 5', ale mają różne końce 3', które kierują rozszczepienie danego docelowego RNA w dwóch różnych miejscach. Nasze wyniki wskazują, że prokarionty posiadają unikalny system wyciszania RNA, który działa poprzez zależne od homologii rozszczepianie RNA najeźdźców. --- TŁO: Wszystkie genomy archeonów i wiele genomów bakterii zawiera klastrowane regularnie Interspaced Short Palindrome Repeats (CRISPR) i zmienne tablice genów związanych z CRISPR (cas). związanych z CRISPR (cas), które wcześniej były zaangażowane w nową formę naprawy DNA na podstawie naprawy DNA na podstawie analizy porównawczej sekwencji ich produktów białkowych. sekwencji produktów białkowych. Jednak bliskość genów CRISPR i cas zdecydowanie sugeruje, że że mają one powiązane funkcje, co jest trudne do pogodzenia z hipotezą naprawy hipotezą naprawy. WYNIKI: Sekwencje białkowe licznych produktów genów cas zostały sklasyfikowane w około 25 odrębnych rodzin białek. do około 25 różnych rodzin białek; opisano kilka nowych przewidywań funkcjonalnych i strukturalnych. funkcjonalnych i strukturalnych. Analiza porównawczo-genomiczna genów CRISPR i cas prowadzi do hipotezy, że system CRISPR-Cas (CASS) jest mechanizm obrony przed inwazją fagów i plazmidów, który funkcjonuje analogicznie do eukariotycznych systemów interferencji RNA (RNAi). Specyficzne funkcjonalne analogie między kilkoma składnikami CASS i białkami zaangażowanymi w eukariotyczne RNAi, w tym specyficzną dla dwuniciowego RNA (dicer), endonukleazą rozszczepiającą docelowe mRNA (slicer), oraz polimeraza RNA zależna od RNA. Jednak żaden ze składników CASS nie jest ortologiem swojego eukariotycznego funkcjonalnego odpowiednika. Proponuje się że unikalne wstawki CRISPR, z których niektóre są homologiczne do fragmentów bakteriofagów i genów plazmidowych, funkcjonują jako prokariotyczne siRNA (psiRNA), poprzez sparowanie z docelowymi mRNA i promowanie ich degradacji lub degradację lub zatrzymanie translacji. Opracowano konkretne hipotetyczne schematy dla funkcjonowania przewidywanego prokariotycznego systemu siRNA i tworzenia nowych jednostek nowych jednostek CRISPR z unikalnymi wstawkami kodującymi psiRNA nadającymi odporność na na nowo napotkane fagi lub plazmidy. Unikalne wstawki w CRISPR nie wykazują praktycznie żadnego podobieństwa nawet między blisko spokrewnionymi szczepami bakterii co sugeruje ich szybką rotację w skali ewolucyjnej. Następstwem tego jest to, że nawet wśród blisko spokrewnionych prokariotów, najczęściej spotykane fagi i plazmidy najczęściej spotykane fagi i plazmidy są różne i/lub że dominujące fagi i plazmidy szybko się zmieniają. WNIOSEK: Zaproponowaliśmy wcześniej, że białka Cas stanowią nowy system naprawy DNA. system naprawy DNA. Powiązanie genów Cas z CRISPR, a zwłaszcza obecność w jednostkach CRISPR obecność w jednostkach CRISPR unikalnych wstawek homologicznych do genów fagów i plazmidów skłania nas do porzucenia tej hipotezy. genami fagowymi i plazmidowymi sprawiają, że porzucamy tę hipotezę. Wydaje się najbardziej prawdopodobne, że CASS jest prokariotyczny system obrony przed fagami i plazmidami, który działa poprzez mechanizm mechanizm RNAi. Funkcjonowanie tego systemu wydaje się obejmować integrację fragmentów obcych genów do chromosomów archeonów i bakterii, co daje dziedziczną odporność na odpowiednie czynniki. Wydaje się jednak, że to dziedziczenie dziedziczenie jest niezwykle niestabilne w skali ewolucyjnej, tak że że repertuary unikalnych psiRNA są całkowicie zastępowane nawet u blisko spokrewnionych prokariotach, prawdopodobnie w odpowiedzi na szybko zmieniające się repertuary dominujących fagów i plazmidów. fagów i plazmidów. --- TŁO: U eukariontów interferencja RNA (RNAi) jest głównym mechanizmem obrony przed wirusami i elementami transpozycyjnymi, a także regulacji translacji endogennych mRNA. Systemy RNAi rozpoznają docelowe cząsteczki RNA poprzez małe RNA, które są całkowicie lub częściowo komplementarne do regionu docelowego. regionem celu. Kluczowymi składnikami systemów RNAi są białka z rodziny Argonaute-PIWI, z których niektóre funkcjonują jako slicery, nukleazy, które rozszczepiają docelowy RNA, który jest sparowany z przewodnim RNA. Liczne prokarionty posiadają system obrony przed fagami i plazmidami związany z CRISPR (CASS). plazmidom, który jest częściowo mechanistycznie analogiczny, ale nie homologiczny do eukariotycznych systemów RNAi. Wiele prokariotów koduje również homologi białek Argonaute-PIWI ale ich funkcje pozostają nieznane. WYNIKI: Przedstawiamy szczegółową analizę sekwencji białek Argonaute-PIWI i ich genomowego sąsiedztwa. sąsiedztwa genomowego odpowiednich genów u prokariotów. Natomiast eukariotyczne białka Ago/PIWI zawsze zawierają PAZ (wiązanie oligonukleotydów) i PIWI (aktywna lub nieaktywna nukleaza), prokariotyczne homologi Argonaute (pAgos) dzielą się na dwie główne grupy, w których domena PAZ jest albo obecna lub nieobecna. Monofiletyczność każdej grupy jest wspierana przez filogenetyczną analizę analiza konserwowanych domen PIWI. Prawie wszystkie pAgo, którym brakuje domeny PAZ wydają się być inaktywowane, a odpowiednie geny są związane z różnymi nukleazami w domniemanych operonach. Dodatkowa, niescharakteryzowana domena domena, która jest połączona z różnymi nukleazami, wydaje się być unikalną sygnaturą operonów kodujących krótką (pozbawioną PAZ) formę pAgo. Dla kontrastu, prawie wszystkie pAgo zawierające domenę PAZ są aktywnymi nukleazami. Niektóre białka z tej grupy (np. to z Aquifex aeolicus) zostały eksperymentalnie wykazane posiadają aktywność nukleazy i nie są zazwyczaj związane z genami dla innych (domniemanych) nukleaz. Biorąc pod uwagę te obserwacje, pozornie rozległy horyzontalny transfer genów pAgo i ich powszechną, statystycznie istotną nadreprezentację w genomie. nadreprezentację w genomowych sąsiedztwach wzbogaconych w geny kodujące białka zaangażowane w obronę przed fagami i / lub plazmidami, stawiamy hipotezę, że pAgos są kluczowymi składnikami nowej klasy systemów obronnych. Domena PAZ zawierające pAgosy mają bezpośrednio niszczyć kwasy nukleinowe wirusa lub plazmidu poprzez ich aktywność nukleazy. kwasy poprzez ich aktywność nukleazy, podczas gdy pozornie nieaktywne, pAgos pozbawione PAZ mogą być strukturalnymi podjednostkami kompleksów białkowych, które zawierają, jako aktywne cząsteczki, domniemane nukleazy, które według naszych przewidywań będą współeksprymowane z tymi pAgos. Przewiduje się, że wszystkie te nukleazy są endonukleazami DNA endonukleazami DNA, więc wydaje się najbardziej prawdopodobne, że przypuszczalna nowa system obrony przed fagami/plazmidami celuje raczej w DNA fagów niż w mRNA. Biorąc pod uwagę, że w eukariotycznych systemach RNAi, domena PAZ wiąże RNA prowadzące i pozycjonuje je na komplementarnym regionie celu, spekulujemy dalej, że pAgos działają na podobnej zasadzie (przewodnikiem jest albo DNA, albo RNA), i że domena niescharakteryzowana domena znaleziona w domniemanych operonach z krótkimi formami pAgos jest funkcjonalnym substytutem domeny PAZ. WNIOSEK: Hipoteza, że pAgos są kluczowymi składnikami nowego prokariotycznego systemu prokariotycznego układu odpornościowego, który wykorzystuje cząsteczki RNA lub DNA do degradacji kwasów nukleinowych inwazyjnych elementów mobilnych implikuje funkcjonalną analogię do prokariotycznego CASS i bezpośredni związek ewolucyjny z eukariotycznym RNAi. Przewidywania tej hipotezy, obejmujące zarówno aktywność pAgos, jak i związanych z nimi endonukleaz endonukleaz są łatwe do przetestowania eksperymentalnie. --- System CRISPR/Cas u prokariotów zapewnia odporność na inwazję wirusami i plazmidami. Można wyróżnić trzy odrębne etapy tego mechanizmu. Początkowo fragmenty DNA najeźdźcy są integrowane jako nowe dystanse do powtarzalnego locus CRISPR. Następnie CRISPR jest transkrybowany, a transkrypt jest transkrypt jest rozszczepiany przez białko Cas w obrębie powtórzeń, generując krótkie RNA (crRNA), które zawierają sekwencję dystansową. Wreszcie, crRNA kierują maszynerię białka Cas do komplementarnego celu najeźdźcy, DNA lub RNA, co skutkuje zahamowanie proliferacji wirusa lub plazmidu. W tym artykule omawiamy nasze obecne zrozumienie tego fascynującego adaptacyjnego i dziedzicznego systemu obronnego, oraz opisujemy funkcjonalne podobieństwa i różnice z RNAi u eukariontów.
Wyciszanie genów można osiągnąć poprzez interferencję RNA (RNAi) w organizmach eukariotycznych. Jak nazywa się analogiczny proces u organizmów prokariotycznych?
Bakterie rozwinęły kilka mechanizmów obronnych przeciwko bakteriofagom w czasie ewolucji, ale koncepcja prokariotycznego mechanizmu obronnego opartego na interferencji RNA przeciwko fagom i innym inwazyjnym elementom genetycznym pojawiła się dopiero niedawno. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) wraz ze ściśle powiązanymi genami (cas genes) tworzą system CASS, który, jak się uważa, zapewnia podobny do RNA mechanizm obrony przed bakteriofagami w bakterii gospodarza.