Niedokrwistość Fanconiego (FA) jest rzadką chorobą autosomalną recesywną, charakteryzującą się niewydolnością szpiku kostnego i predyspozycją do raka. Do tej pory zidentyfikowano 8 grup komplementacyjnych zidentyfikowano, chociaż mutacje w FANCA odpowiadają za chorobę u większości pacjentów z FA. większości pacjentów z FA. W tym badaniu scharakteryzowaliśmy fenotyp hematopoetyczny i skorygowaliśmy główne cechy fenotypowe szpiku kostnego (BM). właściwości fenotypowe progenitorów szpiku kostnego (BM) przy użyciu wektorów retrowirusowych. Hematopoeza tych zwierząt charakteryzowała się umiarkowaną, choć znaczącą trombocytopenią. znaczną małopłytkowością, zgodną ze zmniejszoną liczbą progenitorów megakariocytów BM progenitorów megakariocytów. Jak zaobserwowano w innych modelach FA, progenitory hematopoetyczne hematopoetyczne myszy Fanca(-/-) były wysoce wrażliwe na mitomycynę C (MMC). Ponadto Ponadto, po raz pierwszy zaobserwowaliśmy w mysim modelu FA wyraźny defekt wzrostu in vitro wady wzrostu progenitorów Fanca(-/-), zarówno w przypadku całkowitego BM, jak i oczyszczonego Lin(-)Sca-1(+) zostały poddane stymulacji in vitro. Płynne kultury Fanca(-/-) BM, które były stymulowane czynnikiem komórek macierzystych i interleukiną-11 wytwarzały niską liczbę jednostek tworzących kolonie makrofagów granulocytarnych, zawierały wysoki odsetek komórek apoptotycznych i generowały zmniejszoną proporcję granulocytów w porównaniu z komórkami makrofagów, w porównaniu z normalnymi hodowlami BM. Dążąc do skorygować fenotyp progenitorów Fanca(-/-), oczyszczone komórki Lin(-)Sca-1(+) transdukowano wektorami retrowirusowymi kodującymi gen białka EGFP (enhanced green fluorescent białko (EGFP) i ludzkie geny FANCA. Komórki Lin(-)Sca-1(+) od myszy Fanca(-/-) myszy były transdukowane z wydajnością podobną do próbek pochodzących od myszy myszy typu dzikiego. Co ważniejsze, transdukcja wektorami FANCA skorygowała zarówno nadwrażliwość na MMC, jak i upośledzoną zdolność do ekspansji ex vivo. która charakteryzowała progenitory BM myszy Fanca(-/-). --- CEL: Niedokrwistość Fanconiego (FA) jest genetycznie heterogennym zaburzeniem związaną z defektami w co najmniej ośmiu genach. Funkcje biochemiczne białek białek FA są nieznane, ale razem definiują one szlak FA, który jest zaangażowany w odpowiedzi komórkowe na uszkodzenia DNA i inne procesy komórkowe. Obecnie Obecnie nie wiadomo, czy wszystkie białka FA są zaangażowane w kontrolowanie czy też niektóre z białek FA pełnią dodatkowe funkcje. Celem Celem tego badania było 1) określenie, czy geny FA grupy A i grupy C mają identyczne lub częściowo odrębne funkcje, oraz 2) uzyskanie lepszego modelu dla ludzkiego FA. MATERIAŁY I METODY: Wygenerowaliśmy myszy z ukierunkowaną mutacją w fanca i skrzyżowaliśmy je z zaburzeniami fancc. skrzyżowaliśmy je ze zwierzętami z mutacją fancc. Kilka fenotypów, w tym wrażliwość na łączniki krzyżowe DNA i promieniowanie jonizujące, wzrost kolonii hematopoetycznych wzrost i utratę komórek zarodkowych analizowano u fanca-/-, fancc-/-, fanca/fancc i kontrolnych. WYNIKI: Komórki fibroblastów i prekursory hematopoetyczne od myszy fanca/fancc nie były bardziej wrażliwe na MMC niż te z pojedynczego mutanta. Podwójne mutanty fanca/fancc nie miały dowodów na addytywny fenotyp na poziomie komórkowym lub organizmalnym. poziomie komórkowym lub organizmalnym. WNIOSKI: Wyniki te potwierdzają model, w którym zarówno FANCA, jak i FANCC są częścią wielobiałkowego jądrowego kompleksu FA o identycznej funkcji w komórkowych odpowiedzi na uszkodzenia DNA i przeżycie komórek zarodkowych. --- Pomimo sklonowania czterech genów związanych z chorobą niedokrwistości Fanconiego (FA), molekularna patogeneza FA pozostaje w dużej mierze nieznana. Aby zbadać FA grupę komplementacyjną A przy użyciu myszy jako systemu modelowego, sklonowaliśmy i scharakteryzowaliśmy scharakteryzowaliśmy mysi homolog ludzkiego cDNA FANCA. Mysi cDNA (Fanca) koduje białko o masie 161 kDa, które wykazuje 65% identyczności sekwencji aminokwasów z ludzkim FANCA. ludzką FANCA. Fanca znajduje się w dystalnym regionie mysiego chromosomu 8 i ma wszechobecny wzór ekspresji w tkankach embrionalnych i dorosłych. Ekspresja mysiego cDNA w ludzkich komórkach FA-A przywraca wrażliwość komórek na leki do normalnego poziomu. normalnych poziomów. Zatem wzór ekspresji, struktura białka, lokalizacja chromosomalna lokalizacja i funkcja FANCA są zachowane u myszy. Wyizolowaliśmy również nowe białko palca cynkowego, Zfp276, które ma pięć domen C (2) H (2). Co ciekawe, Zfp276 znajduje się w locus Fanca, a 3'UTR jego cDNA pokrywa się z ostatnimi czterema eksonami. pokrywa się z ostatnimi czterema eksonami Fanca w sposób ogon do ogona. Zfp276 jest ulega ekspresji w tych samych tkankach co Fanca, ale nie uzupełnia mitomycyny C (MMC) komórek FA-A. Nakładająca się organizacja genomowa między Zfp276 i Fanca może mieć znaczenie dla fenotypu chorobowego FA. --- Członek kompleksu rdzenia niedokrwistości Fanconiego (FA) FANCM remodeluje syntetyczne widełki replikacyjne i intermediaty rekombinacji. Jak dotąd opisano tylko jednego pacjenta z FA z mutacjami FANCM ale znaczenie tych mutacji dla fenotypu FA jest niepewne. jest niepewne. Aby zapewnić dalszy eksperymentalny dostęp do grupy komplementarnej FA-M wygenerowaliśmy myszy z niedoborem Fancm poprzez usunięcie eksonu 2. Niedobór FANCM spowodował hipogonadyzm u myszy i nadwrażliwość na czynniki sieciujące w mysich zarodkowych fibroblastach (MEF), tym samym fenokopiując inne mysie modele FA. Jednak myszy Fancm(Delta2/Delta2) wykazały również unikalne cechy nietypowe dla myszy z FA, w tym niedostateczną reprezentację samic myszy Fancm(Delta2/Delta2) oraz zmniejszone przeżycie całkowite i wolne od nowotworów. Ta zwiększona zachorowalność na raka może być skorelowana z rolą FANCM w tłumieniu spontanicznej wymiany chromatyd siostrzanych, jak zaobserwowano w MEF. Ponadto Ponadto, FANCM wydaje się mieć raczej stymulującą niż istotną rolę w monoubikwitynacji FANCD2. Przedstawiony tutaj model myszy FA-M sugeruje, że FANCM funkcjonuje zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz kompleksu rdzenia FA, aby utrzymać stabilność genomu stabilności genomu i zapobiegania nowotworzeniu. --- Ewolucyjnie konserwowane białko SLX4, kluczowy regulator nukleaz, jest ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Kompleksy nukleazy SLX4 pośredniczą w naprawie podczas replikacji replikacji, a także mogą rozwiązywać złącza Hollidaya powstałe podczas rekombinacji homologicznej. rekombinacji. Tutaj opisujemy fenotyp myszy z nokautem Btbd12, mysiego ortologa mysiego ortologa SLX4, który odtwarza wiele kluczowych cech ludzkiej choroby genetycznej genetycznej niedokrwistości Fanconiego. Zwierzęta z niedoborem Btbd12 rodzą się w sub-Mendlowskie proporcje, mają znacznie zmniejszoną płodność, są rozwojowo rozwojowo i są podatne na cytopenie krwi. Komórki Btbd12(-/-) przedwcześnie starzeją się, spontanicznie gromadzą uszkodzone chromosomy i są szczególnie wrażliwe na czynniki sieciujące DNA. Komplementacja genetyczna ujawnia kluczowe wymóg dla Btbd12 (znanego również jako Slx4) do interakcji z specyficzną dla struktury endonukleazą Xpf-Ercc1 w celu promowania naprawy wiązań krzyżowych. Mysz Mysz z nokautem Btbd12 ustanawia zatem model choroby niedokrwistości Fanconiego i genetycznie łączy regulator kompleksów nacinających nukleazy ze szlakiem naprawy krzyżowej Fanconiego niedokrwistość szlak naprawy wiązań krzyżowych DNA. --- Niedokrwistość Fanconiego (FA) jest rzadkim recesywnym zaburzeniem charakteryzującym się nieprawidłowościami rozwojowymi rozwojowymi, niewydolnością szpiku kostnego i wysokim ryzykiem rozwoju białaczki i guzów litych. białaczki i guzów litych. Inaktywacja genów FA, w szczególności FANCF, została również udokumentowana w sporadycznych nowotworach u pacjentów bez FA. Aby zbadać czy istnieje związek przyczynowy między defektami szlaku FA a rozwojem nowotworu a rozwojem nowotworu, wygenerowaliśmy model mysi z ukierunkowanym zaburzeniem mysie zarodkowe fibroblasty z niedoborem Fancf wykazywały fenotyp typowy dla komórek FA. wykazywały fenotyp typowy dla komórek FA: wykazywały nieprawidłową odpowiedź na środki czynniki sieciujące DNA, co objawia się zatrzymaniem G(2), aberracjami chromosomalnymi, zmniejszoną przeżywalnością i niezdolnością do monoubikwitynacji FANCD2. Myszy homozygotyczne Fancf myszy były żywotne, rodziły się zgodnie z normalnym rozkładem mendlowskim i nie wykazywały opóźnienia wzrostu ani nieprawidłowości rozwojowych. Gonady zmutowanych myszy Fancf myszy funkcjonowały nieprawidłowo, wykazując upośledzony rozwój pęcherzyków i spermatogenezę, co zaobserwowano w innych mysich modelach FA i u pacjentów z FA. pacjentów. W kohorcie myszy z niedoborem Fancf zaobserwowaliśmy zmniejszone całkowite przeżywalność i zwiększoną częstość występowania nowotworów. W szczególności u siedmiu samic myszy rozwinęło się sześć guzów jajnika guzów jajnika: pięć guzów komórek ziarnistych i jeden luteoma. U jednej myszy rozwinęły się guzy w obu jajnikach. Porównawcza hybrydyzacja genomowa Porównawcza hybrydyzacja genomowa o wysokiej rozdzielczości (aCGH) na tych guzach sugeruje, że zwiększona częstość występowania guzów jajnika koreluje z niepłodnością u myszy z niedoborem Fancf i niestabilnością genomową charakterystyczną dla niedoboru szlaku FA. --- Zbadaliśmy fenotyp hematopoetyczny myszy z hipomorficzną mutacją genu Brca2/Fancd1 (mutacja Brca2(Delta27/Delta27)). mutacją w genie Brca2/Fancd1 (mutacja Brca2(Delta27/Delta27)). W przeciwieństwie do do obserwacji poczynionych w innych mysich modelach niedokrwistości Fanconiego (FA), niska liczba hematopoetycznych komórek tworzących kolonie (CFC) odnotowano u myszy Brca2(Delta27/Delta27) zarówno u młodych, jak i dorosłych myszy. Dodatkowo, zaobserwowano wysoką częstość występowania spontanicznej niestabilności chromosomalnej zaobserwowano w komórkach szpiku kostnego (BM) Brca2(Delta27/Delta27), ale nie w komórkach Brca2(Delta27/Delta27) ale nie w komórkach BM Brca2(+/Delta27) lub Fanca(-/-). Chociaż CFC Brca2(Delta27/Delta27) nie były nadwrażliwe na promieniowanie jonizujące, wystąpił u nich bardzo ciężki zespół hematopoetyczny zaobserwowano w napromieniowanych Brca2(Delta27/Delta27). Konwencjonalne eksperymenty konkurencji BM wykazały wyraźny defekt repopulacji w hematopoetycznych komórkach macierzystych Brca2(Delta27/Delta27) (HSC), w porównaniu do HSC typu dzikiego. Co więcej, po raz pierwszy zaobserwowaliśmy po raz pierwszy w modelu choroby naprawy DNA bardzo znaczący defekt proliferacji w Brca2(Delta27/Delta27) HSC utrzymywanych w ich naturalnym środowisku fizjologicznym. środowisku. Stopniowa repopulacja HSC typu dzikiego przeszczepionych do nieuwarunkowanych biorców Brca2(Delta27/Delta27) przypomina zjawisko somatycznego mozaicyzm obserwowany w wielu chorobach genetycznych, w tym w FA. Fenotyp fenotyp hematopoetyczny związany z mutacją Brca2(Delta27/Delta27) sugeruje, że ten mysi model FA-D1 będzie stanowił ważne narzędzie do rozwoju nowych terapii FA, w tym terapii genowej. --- Niedokrwistość Fanconiego (FA) jest dziedzicznym recesywnym zaburzeniem naprawy DNA, charakteryzującym się głównie charakteryzuje się głównie niewydolnością szpiku kostnego i predyspozycją do raka. Badania u pacjentów z mozaikową FA wykazały, że rewersja jednej odziedziczonej mutacji linii zarodkowej skutkująca funkcjonalnym allelem w jednej lub kilku hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC) może prowadzić do przewagi proliferacyjnej skorygowanych komórek, a tym samym z czasem normalizując stan hematologiczny pacjenta. W przeciwieństwie do tych obserwacji, nadal nie jest jasne, czy korekta genetyczna ex vivo FA HSCs również zapewnia podobną przewagę proliferacyjną do FA HSCs. Wykorzystując mysi model FA FA z wyraźnym fenotypem hematopoetycznym, myszy FA-D1 (Brca2(Delta27/Delta27)). myszy, wykazujemy, że terapia genowa HSCs FA za pośrednictwem lentiwirusa skutkuje postępującą ekspansją genetycznie skorygowanych klonów w łagodnie kondycjonowanych biorców FA-D1. Zgodnie z tymi danymi, progenitory hematopoetyczne hematopoetyczne od biorców FA stopniowo stawały się odporne na mitomycynę C i ich niestabilność chromosomalna została odwrócona. Brak dowodów na mielodysplazję, białaczki lub nieprawidłowej repopulacji klonalnej zaobserwowano w wielu punktach czasowych u biorców pierwotnych lub wtórnych. Nasze wyniki pokazują, że ektopowa ekspresja BRCA2 nadaje korzystną przewagę proliferacyjną in vivo do HSCs FA-D1, która umożliwia pełną repopulację krwiotwórczą biorców FA z genetycznie poprawionymi komórkami. --- Niedokrwistość Fanconiego jest rzadką chorobą dziedziczną charakteryzującą się wrodzonymi anomalie, opóźnienie wzrostu, niedokrwistość aplastyczną i zwiększone ryzyko ostrej białaczki szpikowej i raka płaskonabłonkowego. białaczki szpikowej i raka płaskonabłonkowego. Choroba jest spowodowana mutacją w genach kodujących białka wymagane dla szlaku niedokrwistości Fanconiego, mechanizmu odpowiedzi na stres replikacyjny. na stres replikacyjny, w tym wywołany przez genotoksyny, które powodują Wiązania międzypasmowe DNA. Wady w szlaku niedokrwistości Fanconiego prowadzą do niestabilności genomu i apoptozy proliferujących komórek. Do tej pory zidentyfikowano 13 grup komplementacyjnych niedokrwistości Fanconiego. Pięć z tych genów zostało usuniętych lub zmutowanych u myszy, a także szósty kluczowy gen regulatorowy, aby stworzyć mysie modele w celu stworzenia mysich modeli niedokrwistości Fanconiego. Niniejszy przegląd podsumowuje fenotyp każdego z mysich modeli niedokrwistości Fanconiego i podkreśla, w jaki sposób badania genetyczne genetyczne i badania interwencyjne z wykorzystaniem tych szczepów dały nowy wgląd w strategie terapeutyczne dla niedokrwistości Fanconiego i w jaki sposób szlak niedokrwistości Fanconiego chroni przed niestabilnością genomu. --- Niedokrwistość Fanconiego (FA) to zespół niestabilności chromosomalnej charakteryzujący się występowaniem pancytopenią, wadami wrodzonymi i predyspozycją do nowotworów. Sześć genów związanych z tym zaburzeniem zostało sklonowanych, a myszy z ukierunkowanymi myszy z ukierunkowanymi zaburzeniami kilku genów FA. Te mysie modele wykazują charakterystyczną dla FA cechę nadwrażliwości komórkowej na czynniki sieciujące DNA czynniki sieciujące DNA. Chociaż nie rozwijają się u nich spontanicznie rozwojowych, naśladują pacjentów z FA w ich obniżonej płodności. obniżoną płodność. Badania z wykorzystaniem tych modeli zwierzęcych zapewniają cenny wgląd w zaangażowanie szlaków apoptotycznych w FA i pomagają scharakteryzować wady komórek krwiotwórczych FA. Ponadto modele mysie są również przydatne do testowania metod leczenia FA.
Czy istnieje mysi model niedokrwistości Fanconiego?
Wygenerowano już szereg modeli mysich z ukierunkowanym zaburzeniem kilku genów niedokrwistości Fanconiego, takich jak FANCA, FANCF, FANCM, FANCD1 itp.