Replikacja genomu jest kluczowym i niezbędnym procesem dla ciągłości życia. U wszystkich organizmów rozpoczyna się w określonym regionie genomu znanym jako miejsce pochodzenia replikacji (Ori). miejsce pochodzenia replikacji (Ori). Liczba miejsc Ori różni się u prokariotów i eukariotów. i eukariontów. Replikacja rozpoczyna się w pojedynczym miejscu Ori u bakterii, ale u eukariontów eukariontów wiele miejsc Ori jest wykorzystywanych do szybkiego kopiowania we wszystkich chromosomach. Sytuacja staje się złożona w archeonach, gdzie niektóre grupy mają pojedyncze i inne mają wiele miejsc replikacji. Themococcales, są hipertermofilny rząd archeonów. Są to beztlenowce i heterotrofy - fermentatory peptydowe fermentatory, reduktory siarczanów, metanogeny to tylko niektóre z przykładów typów metabolicznych. typy metaboliczne. W tym artykule zastosowaliśmy kombinację wielu podejść in in silico - krzywej Z, lokalizacji genu cyklu podziału komórki (cdc6) oraz lokalizacji konsensusowych sekwencji ORB (ang. origin recognition box) dla lokalizacji miejsca pochodzenia replikacji u Thermococcus onnurineus, Thermococcus gammatolerans i innych Themococcales oraz innych Themococcales i porównał wyniki z dobrze udokumentowanym przypadkiem Pyrococcus abyssi. Motywacją stojącą za tym badaniem jest znalezienie liczby miejsc Ori w oparciu o dostępne dane dotyczące członków tego rzędu. Wyniki analizy in silico pokazują, że Themococcales mają pojedyncze źródło replikacji. replikacji. --- Replikacja chromosomów jest jednym z głównych wydarzeń w cyklu komórkowym. Replikacja chromosomów rozpoczyna się w określonych miejscach, zwanych początkami replikacji (oriCs). (oriCs), we wszystkich trzech domenach życia. Jednak początki replikacji wciąż pozostają nieznane w znacznie dużej liczbie genomów bakterii i archeonów. genomów bakterii i archeonów. Dostępność coraz większej liczby kompletnych genomów bakterii i archeonów stworzyła wyzwania i możliwości dla identyfikacji ich oriCs in silico, jak również in vivo. W oparciu o teorię teorii krzywej Z, opracowaliśmy internetowy system Ori-Finder do przewidywania oriCs w genomach bakterii z wysoką dokładnością i niezawodnością, wykorzystując genomikę porównawczą, a przewidywane regiony oriC zostały zorganizowane w internetowej bazie danych DoriC, która jest publicznie dostępna pod adresem http://tubic.tju.edu.cn/doric/ od 2007 roku. Pięć lat po stworzeniu bazy danych DoriC, baza danych osiągnęła znaczący postęp w stosunku do liczby genomów bakteryjnych, zwiększając się około 4-krotnie. genomów bakteryjnych, zwiększając się około 4-krotnie. Dodatkowo, regiony oriC w genomach archeonów zidentyfikowane przez eksperymenty in vivo, a także analizy in silico, zostały również dodane do bazy danych. W rezultacie najnowsza wersja DoriC zawiera oriCs odpowiednio dla >1500 genomów bakteryjnych i 81 genomów archeonów. --- TŁO: Replikacja chromosomów jest centralnym wydarzeniem w cyklu komórkowym bakterii. cyklu komórkowym bakterii. Identyfikacja początków replikacji (oriCs) jest konieczna dla prawie wszystkich nowo sekwencjonowanych genomów bakteryjnych. Biorąc pod uwagę rosnące tempo sekwencjonowania genomów sekwencjonowania genomów, obecnie dostępne oprogramowanie do przewidywania oriCs nadal pozostawia wiele do życzenia. pozostawia jednak wiele do życzenia. Dlatego też rosnąca dostępność sekwencji genomów wymaga ulepszonego oprogramowania do identyfikacji oriCs w nowo zsekwencjonowanych i niezanotowanych genomach bakteryjnych. nowo zsekwencjonowanych genomach bakteryjnych. WYNIKI: Opracowaliśmy Ori-Finder, system online do znajdowania oriCs w genomach bakteryjnych oparty na genomach bakteryjnych w oparciu o zintegrowaną metodę obejmującą analizę asymetrii składu zasad z wykorzystaniem metody krzywej Z, dystrybucję skrzynek DnaA i występowanie genów często znajdujących się w pobliżu występowanie genów często znajdujących się w pobliżu oriCs. Program może również radzić sobie z nieanotowanymi sekwencjami genomu poprzez integrację programu do wyszukiwania genów ZCURVE 1.02. Dane wyjściowe przewidywanych wyników są eksportowane do raportu HTML, który oferuje wygodne widoki wyników zarówno w formacie graficznym, jak i tabelarycznym. WNIOSEK: Przedstawiono internetowy system do przewidywania pochodzenia replikacji genomów bakteryjnych. genomów bakteryjnych. W oparciu o ten system, regiony oriC zostały dla genomów bakteryjnych dostępnych obecnie w GenBank. Mamy nadzieję, że że Ori-Finder stanie się użytecznym narzędziem do identyfikacji i analizy regionów oriC zarówno w genomach bakterii, jak i archeonów. --- TŁO: Replikacja chromosomalnego DNA u bakterii rozpoczyna się w miejscu pochodzenia (ori) a dwie replikozy rozprzestrzeniają się w przeciwnych kierunkach aż do regionu terminus (ter) region. Postawiliśmy hipotezę, że dwie replikozy muszą dotrzeć do ter w tym samym czasie, aby utrzymać równowagę fizyczną. aby utrzymać równowagę fizyczną; insercja DNA zakłóciłaby taką równowagę, wymagając rearanżacji chromosomów w celu przywrócenia równowagi. Aby przetestować tę hipotezę, musieliśmy wykazać, że ori i ter są w fizycznej równowadze w chromosomach bakteryjnych. Korzystając z analizy falkowej, udokumentowaliśmy skośność GC, AT skew, nadmiar puryn i nadmiar keto na opublikowanych sekwencjach genomowych bakterii aby zlokalizować punkty zwrotne (minimalne i maksymalne) na krzywych. Wcześniej, punkt minimalny miał korelować z ori, a maksymalny z ter. korelować z ter. WYNIKI: Zaobserwowaliśmy silną tendencję chromosomów bakteryjnych w kierunku równowagi fizycznej, z minimami i maksimami odpowiadającymi znanym lub ori i ter i są oddalone od siebie o około połowę chromosomu u większości badanych bakterii. badanych bakterii. Nieparametryczna metoda oparta na transformacji falkowej została do przeprowadzenia testów istotności dla przewidywanych loci. WNIOSKI: Podejście falkowe może wiarygodnie przewidywać regiony ori i ter a chromosomy bakteryjne mają silną tendencję do fizycznej równowagi między ori i ter. --- Precyzyjna replikacja DNA ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności genetycznej we wszystkich organizmach. wszystkich organizmach. We wszystkich trzech domenach życia replikacja DNA rozpoczyna się w wyspecjalizowanym locus, zwanym wyspecjalizowanym locus, określanym jako początek replikacji, oriC lub ORI, a jego identyfikacja identyfikacja jest niezbędna do zrozumienia złożonego procesu replikacji. U u bakterii i eukariontów replikacja rozpoczyna się odpowiednio od pojedynczego i wielu genów, podczas gdy archeony mogą przyjąć jeden z dwóch trybów. Metoda krzywej Z została z powodzeniem wykorzystana do identyfikacji miejsc inicjacji replikacji w genomach różnych gatunków, w tym wielu oriC w niektórych archeonach. W oparciu o metodę krzywej Z i analizie genomiki porównawczej, opracowaliśmy system internetowy, Ori-Finder, do znajdowania oriCs w genomach bakterii z wysoką dokładnością. Przewidywane regiony oriC w genomach bakterii są zorganizowane w internetowej bazie danych DoriC. Ostatnio regiony oriC archeonów zidentyfikowane zarówno metodami in vivo, jak i in silico zostały również włączone do bazy danych. Tutaj podsumowujemy ostatnie postępy przewidywania in silico oriC w genomach bakterii i archeonów przy użyciu metody opartej na krzywej Z. metody opartej na krzywej Z. --- Chromosomy bakteryjne są wysoce spolaryzowane pod względem składu nukleotydów poprzez selekcję mutacyjną związaną z replikacją. Używając skośnych składów takich jak pochylenie GC, początek i koniec replikacji można przewidzieć in silico obserwując punkty przesunięcia. Jednak na sekwencję genomu wpływają niezliczone wymagania funkcjonalne i selekcja wielu cech subgenomowych, a eliminacja tego "szumu" powinna prowadzić do lepszych przewidywań. Tutaj podejście do redukcji szumów, które wykorzystuje filtrowanie dolnoprzepustowe za pomocą szybkiej Fouriera w połączeniu ze skumulowanymi wykresami skośności. Zwiększa to dokładność przewidywania terminów replikacji w porównaniu z wcześniej udokumentowanymi metodami opartymi na składzie bazy genomowej. --- TŁO: Opatrzone adnotacjami genomy dwóch blisko spokrewnionych szczepów wewnątrzkomórkowej bakterii Wolbachia pipientis zostały zgłoszone bez identyfikacji domniemanego źródła replikacji (ori). Identyfikacja ori tych bakterii i pokrewnych alfa-proteobakterii, a także ich wzorców ewolucji sekwencji ewolucji sekwencji pomoże w badaniach nad replikacją komórek i gęstością komórek, a także a także potencjalną manipulację genetyczną tych szeroko rozpowszechnionych wewnątrzkomórkowych bakterii. bakterii. WYNIKI: Wykorzystując cechy, które zostały wcześniej eksperymentalnie zweryfikowane u alfa-Proteobacterium Caulobacter crescentus, zidentyfikowano regiony pochodzenia replikacji DNA (ori) (ori) zostały zidentyfikowane in silico dla szczepów Wolbachia i jedenastu innych pokrewnych bakterii należących do rodzajów Ehrlichia, Anaplasma i Rickettsia. Te cechy obejmują miejsca wiążące DnaA, CtrA i IHF, a także geny flankujące geny w C. crescentus. Stwierdzono, że geny graniczne ori Wolbachia to hemE i białko COG1253 (białko domeny CBS). Porównania domniemanego regionu ori między spokrewnionymi szczepami Wolbachia wykazały większą konserwację zasad w obrębie miejsc wiązania. WNIOSEK: Sekwencje opisanych tutaj regionów ori są podobne tylko wśród blisko spokrewnionych bakterii, podczas gdy podstawowe cechy, takie jak obecność jak obecność miejsc wiązania DnaA i IHF, a także genów granicznych, są szerzej szerzej konserwowane. Względny brak miejsc wiązania CtrA w regionach ori, jak również brak kluczowych enzymów a także brak kluczowych enzymów związanych z replikacją DNA w odpowiednich genomach w odpowiednich genomach, sugerują, że kilka z tych obligatoryjnych wewnątrzkomórkowych bakterii bakterii może mieć zmienione mechanizmy replikacji. Na podstawie tych analiz, określono kryteria identyfikacji regionu ori w projektach sekwencjonowania genomów. projektów. --- Mycoplasma pulmonis jest naturalnym patogenem gryzoni, uważanym za uprzywilejowany model do badania mykoplazmozy układu oddechowego. Kompletny genom tej bakterii, która należy do klasy Mollicutes, został niedawno zsekwencjonowany, ale badanie roli określonych genów wymaga ulepszonych narzędzi genetycznych. In silico analiza porównawcza zsekwencjonowanych genomów mollicute wykazała brak zachowania kolejności genów w regionie zawierającym przewidywane źródło replikacji (oriC i oriC). replikacji (oriC) i istnienie, w większości badanych genomów mollicute, domniemanych pól DnaA leżących przed i za genem dnaA. The przewidywany region oriC M. pulmonis okazał się funkcjonalny po sklonowaniu go do sztucznego plazmidu i po transformacji mykoplazmy, która została uzyskano z częstotliwością 3 x 10(-6) transformantów/CFU/mikrog DNA plazmidu. DNA. Jednak po kilku pasażach in vitro plazmid ten zintegrował się z chromosomalnym regionem oriC. chromosomalnego regionu oriC. Redukcja tego regionu oriC przez eksperymenty subklonowania do regionu przed lub za dnaA skutkowała plazmidami, które nie replikowały się w M. pulmonis, z wyjątkiem sytuacji, gdy te dwa regiony międzygenowe zostały sklonowane z determinantą tetM jako przekładką pomiędzy nimi. Wewnętrzny fragment genu hemolizyny A M. pulmonis (hlyA) został sklonowany do tego plazmidu oriC a powstały konstrukt wykorzystano do transformacji M. pulmonis. Ukierunkowana integracja tego elementu genetycznego z chromosomalnym hlyA przez pojedyncze krzyżowanie, co skutkuje przerwaniem genu, może być udokumentowane. Te mykoplazmatyczne plazmidy oriC mogą zatem stać się cennymi narzędziami do badania roli określonych genów, w tym tych potencjalnie zaangażowanych w patogenezę. --- Obliczeniowe przewidywanie pochodzenia replikacji jest trudnym problemem i cieszy się ogromnym zainteresowaniem biologów. Zaproponowano kilka metod identyfikacji miejsca replikacji dla różnych klas organizmów. Jednakże, te mają jednak ograniczone zastosowanie, ponieważ mechanizm replikacji jest różny w różnych organizmach. Proponujemy miarę korelacji i pokazujemy, że jest ona w stanie przewidzieć miejsce replikacji w większości genomów bakteryjnych. genomów bakteryjnych. Po zastosowaniu do Methanocaldococcus jannaschii, Plasmodium falciparum apikoplastu i plastydów Nicotiana tabacum, ta metoda oparta na korelacji jest w stanie poprawnie przewidzieć pochodzenie replikacji, podczas gdy ogólnie stosowana miara GC zawodzi. Zatem ta miara oparta na korelacji jest nowatorskim i obiecującym narzędziem do przewidywania pochodzenia replikacji w szerokiej klasie organizmów. organizmów. Może to mieć istotne implikacje nie tylko dla głębszego zrozumienie mechanizmu replikacji u organizmów wyższych, ale także dla odkrywania leków. --- Replikacja DNA jest jednym z najbardziej podstawowych procesów we wszystkich trzech domenach życia komórkowego. komórkowych. Wraz z nadejściem ery postgenomicznej, rosnąca liczba kompletnych genomów archeonów kompletnych genomów archeonów stworzyła okazję do zbadania mechanizmów molekularnych inicjujących replikację DNA komórkowego poprzez eksperymenty in vivo eksperymenty in vivo, a także analizę in silico. Jednak lokalizacja źródeł replikacji (oriCs) w wielu sekwencjonowanych genomach archeonów pozostaje nieznana. Przedstawiamy narzędzie internetowe Ori-Finder 2 do przewidywania oriCs w genomach archeonów automatycznie, w oparciu o zintegrowaną metodę obejmującą analizę asymetrii składu zasad z wykorzystaniem metody krzywej Z, rozkładu pól rozpoznawania pochodzenia zidentyfikowanych przez narzędzie FIMO oraz występowanie genów często w pobliżu oriCs. Serwer internetowy jest również w stanie analizować nieanotowanych sekwencji genomu poprzez integrację z potokami przewidywania genów i oprogramowaniem BLAST do identyfikacji genów i adnotacji funkcji. Wynik przewidywanych oriCs jest wyświetlany jako tabela HTML, która oferuje intuicyjny sposób intuicyjny sposób przeglądania wyników w formie graficznej i tabelarycznej. Przedstawione tutaj oprogramowanie jest dokładne dla genomów z pojedynczym oriC, ale niekoniecznie znajduje niekoniecznie znajduje wszystkie miejsca replikacji dla genomów z wieloma oriC. Ori-Finder 2 ma na celu stać się użyteczną platformą do identyfikacji i analizy oriC w genomach archeonów. w genomach archeonów, co zapewni wgląd w mechanizmy replikacji u archeonów. mechanizmy replikacji u archeonów. Serwer internetowy jest dostępny bezpłatnie pod adresem http://tubic.tju.edu.cn/Ori-Finder2/. --- Caulobacter crescentus (CB15) inicjuje replikację chromosomów tylko w komórkach łodygowych, a nie w rojach. a nie w rojach. Aby lepiej zrozumieć tę dimorficzną kontrolę replikacji chromosomów replikacji chromosomów, wyizolowaliśmy źródła replikacji (oris) od słodkowodnych Caulobacter (FWC) i morskich gatunków Caulobacter (MCS). Poprzednie badania wskazywały na czynnik integracyjny gospodarza (IHF) i miejsca metylacji DNA CcrM w kontroli replikacji. kontroli replikacji. Jednak miejsca ori IHF i CcrM zidentyfikowane w modelu FWC CB15 były konserwowane tylko wśród blisko spokrewnionych FWC. Pola DnaA i miejsca wiązania CtrA są ustalonymi komponentami ori CB15. CtrA jest dwuskładnikowym regulatorem który selektywnie blokuje replikację chromosomów u rojów CB15. Pola DnaA i miejsca CtrA znaleziono w pięciu ori FWC i trzech ori MCS. Zazwyczaj pole DnaA i miejsce CtrA, co sugeruje, że wiązanie CtrA reguluje aktywność DnaA. My przetestowaliśmy tę hipotezę poprzez ukierunkowaną mutagenezę ori MCS10, który zawiera tylko jedno miejsce wiązania CtrA nakładające się na krytyczne pole DnaA. To nakładające się miejsce jest unikalne w całym genomie MCS10. Selektywne mutacje DnaA box zmniejszały replikację, podczas gdy selektywne mutacje miejsca wiązania CtrA zwiększały replikację plazmidów MCS10 ori. Dlatego zarówno FWC, jak i MCS oris wykorzystują CtrA do represji replikacji. Pomimo tego podobieństwa, analiza filogenetyczna nieoczekiwanie pokazuje, że wykorzystanie CtrA ewoluowało oddzielnie wśród tych Caulobacter oris. Omawiamy konsensus oris i zbieżną ewolucję ori u różnicujących się bakterii. bakterii. --- Inicjacja replikacji DNA, która rozpoczyna się w określonym miejscu chromosomu (znanym jako Początki replikacji), jest kluczowym etapem regulacyjnym replikacji chromosomów. Archaea, trzecia domena życia, używają pojedynczego lub wielu genów do replikacji swoich kolistych chromosomów. Podstawowa struktura replikacji jest zachowana wśród archeonów, zazwyczaj obejmując bogaty w AT region odwijania otoczony kilkoma konserwatywnymi powtórzeniami (origin recognition box, ORB), które znajdują się w sąsiedztwie genu inicjującego replikację. Zarówno sekwencja ORB jak i sąsiadujący gen inicjujący są znacznie zróżnicowane wśród różnych źródeł replikacji, podczas gdy analizy in silico i genetyczne wykazały specyficzność między genami inicjującymi i ich genami poznawczymi. Te pary replikator-inicjator przypominają system oriC-dnaA w bakteriach bakterii, a model negatywnej regulacji aktywności pochodzenia przez w dół klastra elementów ORB został niedawno zaproponowany w haloarchaea. Co więcej, porównawcze analizy genomiczne ujawniły, że mozaiki par replikator-inicjator mozaiki par replikator-inicjator w chromosomach archeonów powstały w wyniku integracji elementów pozachromosomalnych. Niniejszy przegląd podsumowuje badania w zrozumieniu pochodzenia replikacji archeonów, ze szczególnym uwzględnieniem na wykorzystaniu, kontroli i ewolucji wielu genów replikacyjnych u haloarchaea.
Jakie są metody przewidywania in silico pochodzenia replikacji (ori) wśród bakterii?
Kilka metod in silico zostało zastosowanych do przewidywania pochodzenia replikacji (ori). Asymetria składu zasad DNA, taka jak skośność GC, jest podstawą wielu metod in silico stosowanych do wykrywania ori u prokariotów. Analiza krzywej Z jest również wykorzystywana do identyfikacji ori. Genomika porównawcza, poprzez analizy BLAST sekwencji międzygenowych w porównaniu do gatunków pokrewnych, została zastosowana w przewidywaniu ori. Znalezienie genu dnaA i jego miejsc wiązania, pudełek DnaA, a także znalezienie miejsc wiązania innych białek, takich jak CtrA i IHF, są podstawowymi cechami wykorzystywanymi do przewidywania ori in silico. Do wykrywania ori wykorzystano również lokalizację genów granicznych, takich jak gen cyklu podziału komórki (cdc6) i konsensusowe sekwencje origin recognition box (ORB). Badanie kolejności genów wokół sekwencji pochodzenia i rozkładu genów kodowanych w nici wiodącej i opóźnionej są również wykorzystywane do wykrywania ori in silico.