Badania nad wirusem brodawczaka ludzkiego typu 16 wykazały, że produkt wczesnego genu E7, odgrywa kluczową rolę w immortalizacji i złośliwej transformacji komórek gospodarza. transformacji komórki gospodarza. Kilka biologicznych aktywności HPV16 E7 pośredniczy inaktywacja członków rodziny białek kieszonkowych, pRb, p107 i p130. W tym badaniu scharakteryzowaliśmy właściwości in vitro pięciu białek E7 z łagodnych i złośliwych typów HPV (10, 32, 48, 54, 77). My białka E7 wiążą się z pRb i p107 z różną wydajnością. wydajnością. Wszystkie E7 zwiększyły tempo proliferacji immortalizowanych fibroblastów gryzoni fibroblastów gryzoni hodowanych w pożywce zawierającej 10% surowicy cielęcej. Ta właściwość jest całkowicie niezależna od ich zdolności do łączenia się z białkami kieszeni. Ponadto, wszystkie E7, z wyjątkiem HPV10 E7, stymulują progresję G1/S i aktywują promotor cykliny E i cykliny A przy braku czynników wzrostu. Aktywność ta aktywność nie koreluje również z wydajnością wiązania białek kieszonkowych przez E7. białek. Łącznie dane te dostarczają dowodów na to, że różne E7 zmieniają regulację cyklu komórkowego poprzez różne mechanizmy. Wreszcie, ta porównawcza analiza porównawcza różnych białek E7 pokazuje, że onkogenność typu HPV nie jest określana przez zdolność E7 do łączenia się z białkami kieszonkowymi. białkami. --- Badania mutantów onkoproteiny E1A adenowirusa sugerują, że powiązanie białka E1A z białkiem retinoblastoma (pRB) jest niezbędne do transformacji, w której pośredniczy E1A. transformacji. Analiza mutacyjna E1A wskazuje, że dwa regiony pRB są wymagane dla E1A do tworzenia stabilnych kompleksów z białkiem retinoblastoma. W oprócz wiązania pRB, regiony te są niezbędne do asocjacji E1A z kilkoma innymi białkami komórkowymi, w tym p130, p107, cykliną A i p33cdk2. Tutaj pokazujemy, że krótkie syntetyczne peptydy zawierające sekwencje wiążące pRB E1A są wystarczające do interakcji z p107, cykliną A i p130. Białko E7 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 zawiera element, który wiąże się z pRB i wydaje się być funkcjonalnie homologiczne do sekwencji E1A. Peptydy zawierające ten region białka E7 były w stanie oddziaływać z p107, cykliną A i p130 oprócz pRB. Odkrycia te sugerują, że wspólny mechanizm transformacji wykorzystywany przez te wirusowe onkogeny obejmuje ich powiązanie z zestawem polipeptydów. --- Rozpoznanie związku przyczynowego między wirusem brodawczaka ludzkiego a rakiem prawie 30 lat temu doprowadziło do szybkiego rozwoju wiedzy w tej dziedzinie, w wyniku czego opisano główne mediatory kancerogenezy indukowanej przez HPV, wirusowe białka E6 i E7. kancerogenezy, wirusowych białek E6 i E7. Te onkoproteiny wykazują niezwykły plejotropizm w wiązaniu białek komórki gospodarza, z genami supresorowymi nowotworu geny supresorowe p53 i pRb jako ich główne cele. Interakcje te indukują proliferację, immortalizację i złośliwą transformację zainfekowanych komórek. Związek między HPV a rakiem szyjki macicy doprowadził do opracowania metod molekularnych, często opartych na wykrywaniu HPV. molekularnych, często opartych na wykrywaniu E6 i E7, do badań przesiewowych i diagnostyki. Szczepionki terapeutyczne i terapia genowa są ukierunkowane głównie na E6 i E7. Chociaż dostępne są szczepionki profilaktyczne, dalsze zrozumienie cyklu życia wirusa i mechanizmów i mechanizmów leżących u podstaw onkogenezy wywołanej przez HPV jest konieczne, aby stawić czoła wielu wyzwaniom w dziedzinie HPV i raka. --- Wirusy nowotworowe DNA zapewniają amplifikację genomu poprzez przejęcie komórkowej replikacji i zmuszając zainfekowane komórki do wejścia w fazę S. Białko białko retinoblastoma (Rb) kontroluje punkt kontrolny G1/S i jest ukierunkowane przez kilka wirusowych onkoprotein, w tym białko E7 z ludzkiego wirusa wirusów brodawczaka ludzkiego (HPV). Ilościowe badanie mechanizmu interakcji między białkiem E7 HPV16 a domeną RbAB w roztworze ujawniło, że że 90% energii wiązania jest określane przez motyw LxCxE, z dodatkowym determinantem wiązania (1,0 dodatkowym determinantem wiązania (1,0 kcal.mol(-1)) zlokalizowanym w C-końcowej domenie domeny E7, ustanawiając tryb podwójnego kontaktu. Stechiometria i subnanomolarne powinowactwo E7 wskazuje, że może on wiązać RbAB jako monomer. The HPV11 E7 wiązało 2,0 kcal.mol(-1) słabiej niż białko HPV16 i HPV18 wysokiego ryzyka. HPV16 i HPV18, ale modularność i sposób wiązania były zachowane. zachowane. Fosforylacja w konserwatywnym miejscu kinazy kazeinowej II w natywnie rozwiniętej N-końcowej domenie E7 wpłynęła na lokalną konformację poprzez zwiększenie zawartości zawartość poliproliny II i stabilizację wydłużonej konformacji, która co pozwoliło na ściślejszą interakcję z białkiem Rb. Zatem interakcja E7-RbAB obejmuje wiele motywów w obrębie N-końcowej domeny E7 i co najmniej dwie co najmniej dwie konserwowane powierzchnie interakcji w RbAB. Omówiliśmy mechanistyczny model model interakcji białka Rb z celem wirusowym w roztworze, zintegrowany z danymi strukturalnymi i analizą innych białek komórkowych i wirusowych. białek, który dostarczył informacji o równowadze interakcji z udziałem białka białko Rb i w jaki sposób determinują one progresję do normalnego cyklu komórkowego lub transformacji. cyklu komórkowego lub transformacji. --- Rak szyjki macicy jest jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu nowotworów u kobiet na całym świecie. Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) jest konieczne, ale niewystarczające do rozwoju raka szyjki macicy. rozwoju raka szyjki macicy. Niestabilność genomu spowodowana przez HPV umożliwia komórkom na nabycie dodatkowych mutacji wymaganych do złośliwej transformacji. Niestabilność genomowa Niestabilność genomowa w postaci poliploidii została uznana za przyczynę raka szyjki macicy. raka szyjki macicy. Poliploidia występuje nie tylko jako wczesne zdarzenie podczas raka szyjki macicy, ale także predysponuje komórki szyjki macicy do aneuploidii, która jest ważną cechą charakterystyczną ludzkich nowotworów. Progresja cyklu komórkowego jest regulowana w kilka punktów kontrolnych, których defekty przyczyniają się do niestabilności genomu. HPV wysokiego ryzyka kodują dwa onkogeny, E6 i E7, które są niezbędne do transformacji komórkowej w komórkach HPV-dodatnich. transformacji komórkowej w komórkach HPV-dodatnich. Zdolność białek E6 i E7 wirusa HPV wysokiego ryzyka do promowania degradacji odpowiednio p53 i pRb, została jako mechanizm, za pomocą którego onkogeny HPV indukują transformację komórkową. E6 i E7 znoszą punkty kontrolne cyklu komórkowego i indukują niestabilność genomu, która prowadzi do złośliwej konwersji. Chociaż profilaktyczna szczepionka przeciwko HPV stała się ostatnio dostępna, nie będzie ona skuteczna. profilaktyczna szczepionka przeciwko HPV stała się niedawno dostępna, nie będzie ona skuteczna w przypadku osób z obniżoną odpornością lub tych, które są już zakażone. osób, które są już zakażone. Dlatego też zrozumienie molekularnych podstaw HPV jest nadal istotne z klinicznego punktu widzenia. Badania nad niestabilnością genomową rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których HPV wywołuje raka i obiecują obietnicę identyfikacji celów dla rozwoju leków. --- Mutacyjna aktywacja onkogenu K-Ras jest dobrze znana jako kluczowy etap genetyczny w rozwoju raka trzustki. w rozwoju i wzroście gruczolakoraków trzustki. Jednakże, mechanizm mechanizm, za pomocą którego nieprawidłowa sygnalizacja Ras promuje niekontrolowany wzrost komórek guza trzustki. trzustki pozostaje w pełni wyjaśniony. Niedawne wykorzystanie pierwotnych ludzkich komórek do badania onkogenezy, w której pośredniczy Ras, zapewnia ważne modelowe systemy komórkowe do przeanalizować ten mechanizm. Wykorzystaliśmy model immortalizowanych telomerazą ludzkich komórek komórek pochodzących z przewodu trzustkowego (E6/E7/st) do badania mechanizmów wzrostu Ras transformacji. Po pierwsze, odkryliśmy, że onkogeny wirusa brodawczaka ludzkiego E6 i E7, które blokują funkcję odpowiednio supresorów nowotworów p53 i Rb, oraz antygen SV40 small t były wymagane, aby umożliwić wzrost zmutowanego K-Ras(12D) transformacji. Po drugie, K-Ras(12D) powodował transformację wzrostu in vitro, w tym zwiększoną szybkość wzrostu i utratę zależności wzrostu od gęstości, niezależność od zakotwiczenia i inwazję przez odtworzoną błonę podstawną białka i transformację nowotworową in vivo. Po trzecie, ustaliliśmy, że Raf, 3-kinaza fosfatydyloinozytolu (PI3K) i czynnik wymiany nukleotydów guaninowych Ral zostały aktywowane. zostały aktywowane, chociaż aktywność kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) była kinaza (ERK) nie była trwale regulowana w górę. Wreszcie, farmakologiczne hamowanie kinazy białkowej aktywowanej mitogenem Raf / ERK i sygnalizacji PI3K upośledzało indukowany przez K-Ras wzrost i inwazję niezależną od zakotwiczenia. Podsumowując, nasze badania ustanowiły, scharakteryzowały i zweryfikowały komórki E6/E7/st do badania onkogenezy indukowanej przez Ras. --- Utrata aktywności supresorowej nowotworu p53, albo przez mutację, albo przez interakcję z białkiem E6 wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV), jest uważana za ważnym mechanizmem w kancerogenezie raka szyjki macicy. Zbadaliśmy cytologiczną dystrybucję tych białek w ludzkich liniach komórkowych raka szyjki macicy przy użyciu poliklonalnych przeciwciał anty-p53 i monoklonalnych przeciwciał anty-E6. Swoistość przeciwciał specyficzność przeciwciał została potwierdzona przez analizy immunoblot i immunokompetycji. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja wewnątrzkomórkową lokalizację p53 i E6 wykryto przy użyciu technik konwencjonalnej i trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. W zintegrowanych liniach komórkowych HPV-18 lub -16 zintegrowanych liniach komórkowych, HeLa, CaSki i SiHa, wirusowa onkoproteina E6 i endogenne białko supresorowe nowotworu białko supresorowe nowotworu, p53, były obserwowane przez immunofluorescencję w cytoplazmie. cytoplazmie; p53 miało również słabe punktowe zabarwienie w jądrach komórek HeLa i CaSki komórek. W liniach komórkowych raka szyjki macicy HPV-ujemnych, C-33A i HT-3, które zmutowany p53, p53 był zlokalizowany głównie w jądrze, przy czym komórki C-33A miały podwyższony poziom p53 w porównaniu z innymi liniami komórkowymi. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przestrzennej, przy użyciu mikroskopii konfokalnej, przeprowadzono na komórkach po po podwójnym barwieniu fluorescencyjnym dla p53 (fluoresceina) i E6 (rodamina). Obrazy wykazały, że zarówno p53, jak i E6 miały podobne rozkłady cytoplazmatyczne. co sugeruje, że te dwa białka mogą istnieć jako kompleks cytoplazmatyczny. kompleks cytoplazmatyczny. Aby uzasadnić tę implikację, przeprowadzono mikroskopię transferu energii rezonansu fluorescencji przeprowadzono mikroskopię rezonansu energii fluorescencji, która dostarczyła bezpośrednich dowodów na bliskie związku między p53 i E6 w poszczególnych komórkach HeLa. Wyniki tego badania potwierdzają teorię, że białko p53 wiąże białko E6 wirusa HPV-16/18 w cytoplazmie komórek, zapobiegając w ten sposób cytoplazmie komórki, zapobiegając w ten sposób wywieraniu przez p53 funkcji supresora nowotworu w jądrze komórkowym. W związku z tym inaktywacja p53 typu dzikiego przez tworzenie kompleksu p53-E6 w raku szyjki macicy może być krytycznym etapem transformacji nowotworowej. --- Wirusy brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka typu 16 (HPV-16) i HPV-18 są związane z większością ludzkich raków szyjki macicy. z większością ludzkich raków szyjki macicy, a dwa geny wirusowe, HPV E6 i E7, powszechnie ulegają ekspresji w tych nowotworach. Obecność HPV-16 E7 jest wystarczająca do wywołania hiperplazji naskórka i guzów nabłonkowych u transgenicznych myszy. transgenicznych myszy. W tym badaniu przeprowadziliśmy eksperymenty na transgenicznych myszach aby określić, które domeny E7 przyczyniają się do tych właściwości in vivo. Promotor ludzki promotor keratyny 14 został użyty do skierowania ekspresji zmutowanych genów E7 do warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego u myszy. Wybrane mutanty E7 miały albo delecję delecję w konserwowanej domenie regionu 2 (CR2), która jest wymagana do wiązania retinoblastoma. wiązania białka supresorowego nowotworu retinoblastoma (pRb) i białek podobnych do pRb lub delecję w domenie E7 CR1. Domena CR1 przyczynia się do transformacji komórkowej na poziomie innym niż wiązanie pRb. Cztery linie zwierząt transgenicznych dla HPV-16 E7 z delecją CR1 i pięć linii z delecją CR2. z delecją CR2, które obserwowano pod kątem jawnych i histologicznych fenotypów. fenotypów histologicznych. Przeprowadzono szczegółową analizę przebiegu czasowego w celu monitorować ostre skutki dzikiego typu w porównaniu ze zmutowanym E7 na naskórek, miejsce ekspresji na wysokim poziomie. U myszy transgenicznych z genem E7 typu dzikiego, zależna od wieku ekspresja HPV-16 E7 korelowała z nasileniem hiperplazji naskórka. naskórka. Podobne, zależne od wieku wzorce ekspresji zmutowanych genów E7 nie skutkowały żadnymi fenotypami. Ponadto, transgeniczne myszy ze zmutowanym genem zmutowanym genem E7 nie rozwinęły guzów. Eksperymenty te wskazują, że wiązanie i inaktywacja pRb i białek podobnych do pRb przez domenę CR2 E7 są niezbędne do indukcji hiperplazji naskórka i kancerogenezy u myszy skóry, a także sugerują rolę domeny CR1 w indukcji tych fenotypów poprzez fenotypów poprzez jeszcze nie scharakteryzowane mechanizmy. --- Transformacja przez wczesne produkty genowe wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV), E6 i E7, obejmuje ich interakcję z białkami komórkowymi p53 i Rb. Wykorzystując fuzję glutationu S-transferazy (GST), stwierdziliśmy, że HPV E6 wiązał ludzkie p53 i że względna wydajność wiązania zmieniała się tak, że białko GST-HPV typu 16 E6 (16E6) wiązało p53 z najwyższym powinowactwem, a następnie GST-31E6, GST-18E6, i GST-11E6. Białka fuzyjne GST-E6 były wystarczające do wiązania p53 oczyszczone z systemu ekspresji bakulowirusów, jak również ze źródeł translacji in vitro. źródła, podczas gdy nie zaobserwowano asocjacji z GST-18E7 lub mutantem GST-16E6 z delecją pięciu aminokwasów w E6. Kiedy aktywność wiązania DNA DNA w obecności białek GST-E6, zaobserwowano zahamowanie wiązania DNA. wiązania DNA. Stopień zahamowania korelował ze względnym powinowactwem względnym powinowactwem różnych białek E6 do p53; w ten sposób GST-16E6 był najsilniejszym inhibitorem DNA p53. najsilniejszym inhibitorem aktywności wiązania DNA p53, a GST-11E6 był najmniej najmniej skuteczny. Zapobieganie wiązaniu DNA p53 prawdopodobnie odgrywa rolę w zniesienie aktywności transkrypcyjnej p53 przez HPV E6 i zapewnia dalszy mechanizm zakłócania przez E6 funkcji supresora wzrostu p53 w oprócz jego roli w kierowaniu specyficzną degradacją p53 poprzez za pośrednictwem szlaku ubikwityny. Różnice w hamowaniu wiązania DNA obserwowane w przypadku różnych białek E6 może zatem przyczyniać się do różnic w potencjale onkogennym potencjału onkogennego obserwowanego wśród typów HPV. --- Wirusy brodawczaka ludzkiego (HPV) wysokiego ryzyka są związane z rakiem szyjki macicy i innymi nowotworami narządów płciowych. Poprzednie badania zidentyfikowały dwie wirusowe onkoproteiny E6 i E7, które ulegają ekspresji w większości nowotworów związanych z HPV. związanych z HPV. Zdolność białka E6 wirusa HPV wysokiego ryzyka do unieśmiertelniania ludzkich komórek nabłonka sutka do unieśmiertelniania ludzkich komórek nabłonkowych sutka zapewniła model pojedynczego genu do badania mechanizmów indukowanej przez E6 transformacji onkogennej. W ostatnich latach stało się jasne, że oprócz indukowanej przez E6 degradacji białka supresorowego nowotworu p53, inne E6 są wymagane do immortalizacji komórek nabłonka sutka. Używając drożdżowego systemu dwuhybrydowego zidentyfikowaliśmy nową interakcję HPV16 E6 z kinazą białkową PKN, aktywowaną przez kwasy tłuszczowe i małe białko G Rho serynowo-treoninową z domeną katalityczną wysoce homologiczną do kinazy białkowej C. Wykazaliśmy bezpośrednie wiązanie HPV16 E6 z kinazą białkową PKN. Wykazaliśmy bezpośrednie wiązanie białek wysokiego ryzyka HPV E6 z PKN w lizacie kiełków pszenicy in vitro. lizacie kiełków pszenicy in vitro i w komórkach 293T in vivo. Co ważne, białka E6 HPV wysokiego ryzyka, ale nie HPV niskiego ryzyka, były zdolne do wiązania PKN. Ponadto, wszystkie mutanty E6 zdolne do immortalizacji i wiele mutantów E6 niezdolnych do immortalizacji wiązały PKN. wiązały PKN. Dane te sugerują, że wiązanie z PKN może być wymagane, ale nie wystarczające do immortalizacji normalnych komórek nabłonka sutka. Wreszcie, pokazujemy że PKN fosforyluje E6, wykazując po raz pierwszy, że HPV E6 jest fosfoproteiną. fosfoproteiną. Nasze odkrycie sugeruje nowy związek między onkogenezą, w której pośredniczy HPV E6 a regulacją dobrze znanej kaskady fosforylacji. --- Rak szyjki macicy powstaje w wyniku transformacji komórkowej przez onkogeny (HPV) E6 i E7, które ulegają konstytutywnej ekspresji w komórkach rakowych. komórkach nowotworowych. Onkogen E6 degraduje p53, modulując w ten sposób duży zestaw genów docelowych p53 jak wykazano wcześniej w linii komórkowej raka szyjki macicy HeLa. Tutaj pokazujemy, że izoforma TAp63β czynnika transkrypcyjnego p63 jest również celem E6. E6. Gen p63 odgrywa istotną rolę w homeostazie skóry i ulega ekspresji w co najmniej sześciu izoformach. jako co najmniej sześć izoform. Jedną z tych izoform, ΔNp63α, stwierdzono nadekspresję w raku płaskonabłonkowym i wykazano tutaj, że ulega konstytutywnej w komórkach Caski związanych z HPV16. Dlatego też zbadaliśmy rolę p63 w tych komórkach, wykonując analizy mikromacierzy po stłumieniu ekspresji endogennej ekspresji E6/E7. Po represji onkogenów, duży zestaw genów docelowych p53 został aktywowany wraz z wieloma genami docelowymi p63 związanymi z adhezją komórek. z adhezją komórek. Jednak poprzez wyciszanie siRNA i ektopową ekspresję różnych izoform p63 różnych izoform p63 wykazaliśmy, że TAp63β jest zaangażowany w aktywację tego szlaku adhezji komórkowej zamiast w aktywację tego szlaku adhezji komórkowej zamiast konstytutywnie wyrażanych ΔNp63α i β. Ponadto wykazaliśmy w eksperymentach kotransfekcji, w połączeniu z wyciszeniem siRNA E6AP wyciszenie, że E6 indukuje przyspieszoną degradację TAp63β, chociaż nie poprzez ligazę ubikwityny E6AP wykorzystywaną do degradacji p53. Represja transkrypcji E6 indukuje również stabilizację endogennego TAp63β w komórkach raka szyjki macicy, co prowadzi do w komórkach raka szyjki macicy, co prowadzi do zwiększonego stężenia zrostów ogniskowych na powierzchni komórek. powierzchni komórek. W konsekwencji, TAp63β jest jedyną izoformą p63 hamowaną przez E6 w raku szyjki macicy, jak wykazano wcześniej dla p53. Zmniejszenie modulacji zrostów ogniskowych poprzez zakłócenie TAp63β pojawia się zatem jako nowy E6-zależny szlak w transformacji. Odkrycia te identyfikują główną fizjologiczną rolę TAp63β w niezależnym od zakotwiczenia wzroście, który może reprezentować nowy krytyczny szlak w ludzkiej kancerogenezie.
Jaki jest główny mechanizm, za pomocą którego białka E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego przyczyniają się do transformacji komórek?
Chociaż mogą mieć inne cele, białka E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego oddziałują i blokują funkcję odpowiednio p53 i pRb, rozregulowując w ten sposób cykl komórkowy i prowadząc do transformacji komórkowej.