Wykazano, że inhibitor kinazy białkowej zależnej od kalmoduliny II (CaMK-II) KN-93 wykazano, że odwracalnie zatrzymuje komórki mysie i ludzkie w fazie G1 cyklu komórkowego cyklu komórkowego [Tombes, R. M., Westin, E., Grant. S., and Krystal, G. (1995) Cell Growth Differ. 6, 1073-1070; Rasmussen, G., and Rasmussen, C. (1995) Biochem. Cell Biol. 71, 201-207]. Stymulacja niezależnej od Ca(2+) (autonomicznej) aktywności enzymatycznej CaMK-II aktywność enzymatyczna, barometr aktywowanego in situ CaMK-II, została powstrzymana przez te same stężenia KN-93, które powodują zatrzymanie fazy G1. KN-93 powodował białko retinoblastoma pRB uległo defosforylacji, a aktywność zarówno cdk2 i cdk4, dwóch potencjalnych kinaz pRb, do zmniejszenia. Ani aktywność kinazy p42MAP, cząsteczki sygnalizacyjnej wczesnej odpowiedzi G1, ani fosforylacji status lub zdolność wiązania DNA czynników transkrypcyjnych odpowiedzi surowicy i białka wiążącego element reagujący na cAMP zostały zmienione podczas tego zatrzymania G1 zatrzymania. Poziomy białek kinazy zależnej od cykliny 2 (cdk2) i cdk4 były nie uległy zmianie podczas tego zatrzymania G1, a całkowite poziomy komórkowe inhibitorów cdk p21cip1 i p27kip1 nie zostały zwiększone. Zamiast tego, aktywność cdk4 wynikające z KN-93 były wynikiem 75% spadku poziomów cykliny D1 . W przeciwieństwie do tego, poziomy cykliny A i E były względnie stałe. Spadek aktywności cdk2 były przede wszystkim wynikiem zwiększonej asocjacji p27kip1 z cdk2/cykliną E. Na wszystkie te zjawiska nie miał wpływu nieaktywny analog KN-93, KN-92. KN-93, KN-92, i były odwracalne po wypłukaniu KN-93. Kinetyka odzyskiwania z zatrzymania cyklu komórkowego były podobne do tych opisanych dla innych blokerów fazy G1 blokerów fazy G1. Wyniki te sugerują mechanizm, za pomocą którego sygnały G1 Ca2+ mogą być poprzez fosforylacje zależne od kalmoduliny do mechanizmu kontrolującego cykl komórkowy poprzez cykliny i inhibitory cdk. --- Donieśliśmy, że jedna z pochodnych izochinolinosulfonamidu, KN-62, jest silnym i specyficznym inhibitorem kinazy białkowej II zależnej od Ca2+/kalmoduliny (CaMKII) (Tokumitsu, H., Chijiwa, T., Hagiwara, M., Mizutani, A., Terasawa, M. i Hidaka, H. (1990) J. Biol. Chem. 265, 4315-4320). Zbadaliśmy teraz właściwości hamujące nowo zsyntetyzowanego metoksybenzenosulfonamidu, KN-93, na aktywność CaMKII in situ i in vitro. KN-93 wywołał silne działanie hamujące wpływ na aktywność fosforylującą CaMKII ze stałą hamowania 0,37 microM, ale związek ten nie miał znaczącego wpływu na aktywność katalityczną kinazy białkowej zależnej od cAMP, kinazy białkowej zależnej od Ca2+ / fosfolipidów, kinazę łańcucha lekkiego miozyny i Ca(2+)-fosfodiesterazę. KN-93 hamował również autofosforylację podjednostek alfa i beta CaMKII. Analiza kinetyczna analiza wykazała, że KN-93 hamuje CaMKII w sposób konkurencyjny wobec kalmoduliny. kalmoduliny. Aby ocenić regulacyjną rolę CaMKII w metabolizmie katecholamin katecholamin, zbadaliśmy wpływ KN-93 na poziom dopaminy (DA) w komórkach PC12h komórkach. Poziomy DA zmniejszyły się w obecności KN-93. Ponadto, fosforylaza tyrozyny fosforylacja hydroksylazy tyrozynowej (TH) indukowana przez KCl lub acetylocholinę była znacząco tłumiona przez KN-93 w komórkach PC12h, podczas gdy zdarzenia indukowane przez forskolinę lub 8-Br-cAMP. Wyniki te sugerują, że KN-93 hamuje tworzenie DA poprzez modulowanie szybkości reakcji TH w celu zmniejszenia fosforylacji cząsteczki TH za pośrednictwem Ca(2+). --- Długotrwała blokada receptora AMPA w hodowlach neuronów hipokampa prowadzi zarówno do zwiększona ekspresja GluA1 postsynaptycznie i wzrost puli pęcherzyków wielkość i szybkość obrotu presynaptycznie, zmiany adaptacyjne, które wykraczają poza proste skalowanie synaptyczne. Jako korelat molekularny, ekspresja receptora β Ca(2+)/CaM-zależnej kinazy typu II (βCaMKII) jest zwiększona w odpowiedzi na brak aktywności synaptycznej. brak aktywności synaptycznej. Tutaj postanowiliśmy wyjaśnić rolę βCaMKII w różnych przejawach adaptacji. różnych przejawach adaptacji. Zablokowanie βCaMKII przez za pośrednictwem lentiwirusowej ekspresji shRNA zapobiegło synaptycznemu indukowany biernością wzrost GluA1, podobnie jak leczenie inhibitorem kinazy CaM KN-93, ale nie nieaktywnym analogiem KN-92. Wyniki te pokazują że pobudzona blokadą receptora AMPA, regulacja w górę βCaMKII promuje zwiększoną ekspresję GluA1. Rzeczywiście, transfekcja βCaMKII, ale nie mutanta mutant, zwiększona ekspresja GluA1 na dendrytach i podwyższony obrót pęcherzyków (wychwyt Syt-Ab), naśladując efekt braku aktywności synaptycznej po obu stronach synapsy. stronach synapsy. W komórkach z podwyższonym βCaMKII, złagodzenie blokady aktywności synaptycznej blokada aktywności synaptycznej ujawniła wzrost częstotliwości miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych, które mogą być szybko i całkowicie stłumione przez blokadę PhTx receptorów GluA1. Ta zwiększona częstotliwość mini obejmowała prawdziwe wzmocnienie presynaptyczne, a nie tylko zwiększoną liczbę synaps. Odkrycie to sugeruje, że przepływ Ca(2+) przez receptory GluA1 może wyzwalać ostre uwolnienie przekaźnika wstecznego. Podsumowując, nasze wyniki wskazują że indukowany biernością synaptyczną wzrost ekspresji βCaMKII wprawia w ruch serię zdarzeń, które kończą się serię zdarzeń, których kulminacją są skoordynowane adaptacje pre- i postsynaptyczne w transmisji synaptycznej. --- Po połknięciu przez komary, pasożyty malarii przechodzą złożone zmiany komórkowe. Obejmują one tworzenie zygoty, transformację zygoty do ookinetu oraz różnicowanie z ookinete do oocysty. Wewnątrz oocysty pasożyt rozmnaża się w liczne sporozoity. Modulatory wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia homeostazy wewnątrzkomórkowej, MAPTAM i TMB-8 blokowały rozwój ookinete, podobnie jak antagoniści kalmoduliny (CaM) W-7 i kalmodazol. Inhibitor kinazy białkowej zależnej od Ca(2+)/CaM KN-93 również blokował wydłużanie zygoty, podczas gdy jego nieskuteczny analog analog KN-92 nie miał takiego efektu. In vitro zarówno zygota, jak i ookinete skutecznie fosforylowały autokamtyd-2, klasyczny substrat kinazy CaM substratu kinazy CaM, który może być blokowany przez antagonistów kalmoduliny W-7 i kalmodazol i inhibitor kinazy CaM KN-93. Wyniki te wykazały obecność aktywności kinazy CaM zależnej od kalmoduliny w pasożycie. Pasożyty traktowane KN-93 wyrażały jednak enzym specyficzny dla ookinet chitynazę i antygen powierzchniowy ookinete Pgs28, co sugeruje, że morfologicznie nietransformowane pasożyty morfologicznie nietransformowane pasożyty są biochemicznie dojrzałymi ookinetami. W u komarów, pasożyty poddane działaniu KN-93 nie rozwijały się jako oocysty, podczas gdy pasożyty poddane działaniu KN-92 wytworzyły podobną liczbę oocyst, jak pasożyty kontrolne. Te dane sugerują, że u Plasmodium gallinaceum rozwój morfologiczny zygoty do oocysty, ale nie jej dojrzewanie biochemiczne, zależy od Ca(2+)/CaM-zależnej aktywności kinazy białkowej i wykazały, że morfologiczne jest niezbędne dla dalszego rozwoju pasożyta w zakażonej krwi pasożyta u zakażonych komarów karmionych krwią. --- Zbadaliśmy udział kinazy białkowej zależnej od Ca2+/kalmoduliny kinaza białkowa II (kinaza CaM II) i kinaza białkowa aktywowana mitogenami (kinaza MAP) w indukowane noradrenaliną (NE) uwalnianie kwasu arachidonowego (AA) w aorcie królika komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC). NE zwiększał uwalnianie AA poprzez aktywację cytozolowej fosfolipazy A2 (cPLA2), ale nie wydzielniczej PLA2 w VSMC wstępnie znakowanych z [3H]AA. NE (10 mikroM) zwiększał aktywność kinazy CaM II i kinazy MAP. W komórki przejściowo transfekowane antysensownymi oligonukleotydami komplementarnymi do miejsca inicjacji translacji kinazy CaM II i kinazy MAP, indukowane przez NE uwalnianie AA było hamowane odpowiednio o 100 i 35%. Leczenie komórek za pomocą PD-098059, inhibitorem kinazy MAP, lub antysensownym oligonukleotydem kinazy MAP oligonukleotydem zmniejszało indukowaną NE aktywację kinazy MAP i cPLA2. Indukowana NE aktywacja kinazy MAP i cPLA2 była również hamowana w komórkach traktowanych inhibitorem kinazy CaM II, KN-93, lub antysensownym oligonukleotydem kinazy CaM II oligonukleotydem. Z drugiej strony, zahamowanie kinazy MAP za pomocą PD-098059 lub kinazy MAP z antysensownymi oligonukleotydami nie zmieniło indukowany NE wzrost aktywności kinazy CaM II. Fosforylacja kinazy MAP i kinazy CaM II przez NE, badana przez inkorporację 32P i kinazę kompleksu immunologicznego były hamowane przez KN-93. Łącznie dane te sugerują, że kinaza CaM II może aktywować kinazę MAP, która z kolei aktywuje cPLA2 do uwalniania AA do syntezy prostacykliny syntezy prostacykliny w VSMC królika. Ta nowa ścieżka aktywacji MAP przez kinazę CaM II wydaje się być pośredniczona przez stymulację kinazy MAP kinazy MAP. Aktywacja receptorów adrenergicznych za pomocą NE w VSMC spowodowała translokację kinazy CaM II, kinazy MAP i cPLA2 do otoczki jądrowej tylko w obecności zewnątrzkomórkowego Ca2+. Kwas okadaikowy, który zwiększał fosforylację i aktywność, nie powodował translokacji tych enzymów. W związku z tym wydaje się, że w VSMC królika, NE, poprzez promowanie zewnątrzkomórkowego napływu Ca2+, zwiększa aktywność kinazy CaM II, prowadząc do aktywacji kinazy MAP i cPLA2 i translokacji do otoczki jądrowej, powodując uwolnienie AA z otoczki jądrowej dla prostacykliny. do syntezy prostacykliny. --- KN-93, przepuszczalny przez błonę inhibitor kinazy zależnej od wapnia / kalmoduliny indukuje apoptozę w niektórych liniach ludzkich komórek nowotworowych. Zbadaliśmy działanie KN-93 w linii komórek raka kosmówki BeWo. Komórki BeWo były traktowane różnymi stężeniami KN-93, a zmiany we wzroście komórek, cyklu komórkowym, apoptozie i cyklu komórkowego, apoptozy i powiązanych parametrów. Test WST-1 wykazał, że komórki BeWo były wrażliwe na hamujące wzrost działanie KN-93. Analiza cyklu komórkowego wykazała, że ekspozycja na KN-93 zmniejszyła odsetek komórek w fazie komórek w fazie S i zwiększyła proporcję w fazach G0/G1 cyklu komórkowego. cyklu komórkowego. Indukcja apoptozy została potwierdzona przez barwienie aneksyną V eksternalizowanej fosfatydyloseryny, przez utratę mitochondrialnego potencjału transmembranowego i przez przeciwciała skierowane przeciwko histonom z pofragmentowanego DNA. Indukcja ta indukcja wystąpiła w połączeniu ze zmienioną ekspresją genów związanych z ze wzrostem komórek, złośliwym fenotypem i apoptozą. Wyniki te sugerują, że KN-93 może służyć jako środek terapeutyczny w leczeniu raka kosmówki. --- Cel: Zbadanie wpływu KN-93, selektywnego inhibitora CaMKII na proliferację komórek proliferację i ekspresję białka p53 lub p21 w ludzkich komórkach gwiaździstych wątroby komórkach gwiaździstych wątroby. METODY: Ludzkie komórki gwiaździste wątroby (LX-2) inkubowano z różnymi stężeniami (0-50 mikromoli) KN-93. stężeniami (0-50 mikromoli/l) KN-93 lub jego nieaktywnej pochodnej KN-92. Proliferację komórek mierzono za pomocą testu CCK-8 i ekspresji dwóch regulatorów cyklu komórkowego regulatorów cyklu komórkowego, p53 i p21, określono za pomocą SDS-PAGE i Western blotting. WYNIKI: KN-93 (5-50 mikromoli / L) zmniejszył proliferację ludzkich komórek wątrobowych komórek gwiaździstych w sposób zależny od dawki od 81,76% (81,76% +/- 2,58% vs 96,63% +/- 2,69%, P < 0,05) do 27,15% (27,15% +/- 2,86% vs 96,59% +/- 2,44%, P < 0,01) po 24 godzinach leczenia. Inkubacja 10 mikromoli / L KN-93 indukowała komórkę redukcję wzrostu w sposób zależny od czasu od 78,27% po 8 godzinach do 11,48% po 48 godzinach. h. Jednak KN-92, nieaktywna pochodna KN-93, nie hamowała skutecznie proliferacji komórek. proliferacji komórek. Co więcej, analiza ekspresji regulatorów cyklu komórkowego wykazała, że KN-93 zamiast KN-92 zmniejszał ekspresję p53 i p21. WNIOSEK: KN-93 ma silny wpływ hamujący na proliferację komórek LX-2 poprzez modulując ekspresję dwóch specjalnych regulatorów cyklu komórkowego, p53 i p21. --- Wykazano, że ATP, agonista receptorów purynergicznych, bierze udział w syntezie DNA komórek mięśni gładkich syntezę DNA komórek mięśni gładkich (VSM) i proliferację komórek podczas rozwoju embrionalnego i rozwoju postnatalnego, po urazie oraz w miażdżycy. Jednym z mechanizmów wykorzystywanym przez ATP do regulacji funkcji komórkowych jest aktywacja ERK1/2. W niniejszym badaniu przedstawiamy dowody na to, że zależna od ATP aktywacja ERK1/2 w komórkach VSM wykorzystuje specyficzne izoformy wielofunkcyjnej kinaz serynowo-treoninowych, PKC i kinazy białkowej zależnej od Ca(2+)/kalmoduliny II (CaMKII) jako produkty pośrednie. Selektywne hamowanie aktywności PKC-delta za pomocą rottlerynę lub adenowirusową nadekspresję kinazy ujemnej PKC-delta, osłabione aktywację ERK1/2 stymulowaną ATP i 12,13-dibutyratem forbolu (PDBu). Zahamowanie aktywności PKC-alfa za pomocą Gö-6976 lub nadekspresja adenowirusowa nadekspresja adenowirusowa PKC-alfa była nieskuteczna. Alternatywnie, leczenie KN-93, selektywnym inhibitorem aktywacji CaMKII lub adenowirusową nadekspresją nadekspresja adenowirusowa CaMKII-delta(2), hamowała zależną od ATP aktywację ERK1/2 ale nie miały wpływu na ERK1/2 stymulowaną PDBu lub PDGF. Ponadto, adenowirusowa nadekspresja dominującego ujemnego ras (Ad.HA-Ras(N17)) częściowo hamowała indukowana ATP i PDBu aktywacja ERK1/2 i zablokowana jonomycyna- i ERK1/2, a także hamowanie kinaz tyrozynowych za pomocą AG-1478, inhibitora EGFR lub inhibitorem kinazy z rodziny src PP2 osłabiło stymulowaną ATP aktywację ERK1/2. Podsumowując, dane te wskazują, że PKC-delta i CaMKII-delta(2) koordynują zależną od ATP transaktywację receptora EGF co skutkuje zwiększoną aktywnością ERK1/2 w komórkach VSM. --- Wielofunkcyjna kinaza białkowa II zależna od Ca++/kalmoduliny (kinaza CaM) pośredniczy w indukowanym przez Ca++ zwiększeniu prądu Ca++ typu L (ICa); dlatego też może działać jako proarytmiczna cząsteczka sygnalizacyjna podczas wczesnych następczych depolaryzacji (EAD) z powodu ICa. Aby zbadać hipotezę, że EAD zależne od ICa są są faworyzowane przez aktywację kinazy CaM, EAD indukowano klofilium w izolowanych sercach królików. sercach królików. Wszystkie EAD zostały szybko zakończone za pomocą antagonistów ICa. Serca traktowano wstępnie inhibitorem kinazy CaM KN-93 lub nieaktywnym analogiem KN-92 (0,5 mikroM) przez 10 minut przed ekspozycją na clofilium. EAD były znacząco tłumione przez KN-93 (EAD obecne w 4/10 sercach) w porównaniu do KN-92 (EAD obecne w 10/11 sercach) (P =.024). Nie było znaczących różnic w parametry sprzyjające EAD, takie jak monofazowy czas trwania potencjału czynnościowego lub częstość akcji serca w sercach traktowanych KN-93 lub KN-92. Aktywność kinazy CaM in situ wzrosła 37% w sercach z EAD w porównaniu do serc bez EAD (P =.015). Ten wzrost w aktywności kinazy CaM zapobiegało wstępne leczenie KN-93. In vitro, KN-93 silnie hamował aktywność kinazy CaM w mięśniu sercowym królika (obliczone Ki </= 2,58 microM), ale nieaktywny analog KN-92 nie (Ki > 100 microM). Działania KN-93 i KN-92 na ICa i inne repolaryzujące prądy K + nie wyjaśniały preferencyjnego tłumienia EAD przez KN-93. Dane te pokazują nowy związek między aktywacją kinazy CaM i EAD i są zgodne z hipotezą że ICa i aktywacja kinazy CaM przyczyniają się do EAD w tym modelu. --- Nowy inhibitor kinazy białkowej II zależnej od Ca2+/kalmoduliny (CaM Kinase II), KN-93 silnie hamuje wydzielanie kwasu żołądkowego z komórek okładzinowych. Jak wcześniej zgłaszane (1), leczenie komórek okładzinowych selektywnym inhibitorem kinazy CaM II, KN-62 spowodowało zahamowanie stymulowanego cholinergicznie wydzielanie komórek okładzinowych królika, podczas gdy nie hamowało odpowiedzi histaminy i odpowiedź na forskolinę. W przeciwieństwie do efektów karbacholu, histaminy i forskoliny były znacząco hamowane przez KN-93 z IC50 0,15, 0,3 i 1 mikroM, odpowiednio; efekty te wystąpiły bez żadnych zmian w wewnątrzkomórkowych poziomach cyklicznego AMP i poziomach Ca2+. W niniejszym badaniu zbadaliśmy mechanizm, za pomocą którego KN-93 działa na maszynerię wydzielającą kwas w komórkach okładzinowych żołądka. Ani ani redystrybucja aktywności pompy protonowej, ani transformacja morfologiczna. nie zostały zmienione przez KN-93. Lek tylko słabo hamował aktywność H+, K(+)-ATPazy ale silnie rozpraszał gradient protonowy utworzony w pęcherzykach błony żołądkowej i zmniejszał i zmniejszał objętość przestrzeni luminalnej. Tak więc KN-93 działa na tworzenie gradientu pH podczas gdy KN-62 działa tylko na kinazę CaM II. --- Wcześniej wykazaliśmy, że stymulacja ludzkich limfocytów T jonoforami wapnia indukowała fosforylację i enzymatyczną aktywację ERK2. Teraz mechanizm, za pomocą którego indukowana jonoforami wapnia aktywacja ERK1 i 2 zachodzi w tych komórkach. Aktywacja ERK1 i 2 przez wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia wewnątrzkomórkowego wapnia była hamowana przez kalmodazol sugerujący udział kalmoduliny w tej odpowiedzi. Aby dokładniej wyjaśnić mechanizm, za pomocą którego aktywacja ERK indukowana wapniem, użyliśmy inhibitora kinazy CaM KN-93 i nieaktywnego analogu KN-93 (KN-92). KN-93, ale nie KN-92, blokował indukowaną jonomycyną aktywację ERK1 i 2 w ludzkich limfocytach T. Wcześniej wykazaliśmy, że stymulacja limfocytów T jonomycyną lub A23187 skutkowała w zależnym od kinazy CaM przesunięciu ruchliwości p56(Lck). Aby ustalić, czy p56(Lck) był zaangażowany w aktywację ERK indukowaną wapniem, stymulowaliśmy p56(Lck) ujemne pochodne komórek Jurkat, J.CaM1.6 i J.CaM1/Rep3, z jonomycyną. W tych p56(Lck) ujemnych liniach komórkowych, aktywacja ERK1 i 2 w odpowiedzi na jonomycynę w odpowiedzi na jonomycynę była tylko minimalnie wykryta. Kiedy komórki J.CaM1 zostały p56(Lck), jonomycyna indukowała aktywację ERK1 i 2. Leczenie komórek Jurkat z PP2, inhibitorem p56(Lck), hamowało indukowaną wapniem, ale nie indukowaną przez PMA aktywację ERK1 i 2. Leczenie komórek Jurkat inhibitorem MEK PD98059 blokowało indukowaną jonomycyną aktywację ERK, ale nie przesunięcie mobilności p56(Lck). Nasze dane sugerują, że wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia indukuje aktywację ERK1 i 2 w ludzkich limfocytach T poprzez sekwencyjną aktywację kinazy CaM i fosforylację p56(Lck).
Która kinaza jest hamowana przez małą cząsteczkę KN-93?
Kinaza białkowa zależna od wapnia/kalmoduliny II (CaMK-II) jest hamowana przez małą cząsteczkę KN-93. KN-93 jest selektywnym inhibitorem kinazy zależnej od wapnia/kalmoduliny II (CaMK-II) przenikającym przez błonę.