Egzonizacja Alu, która jest ścieżką ewolucyjną, która tworzy specyficzną dla naczelnych różnorodność transkryptomiczną, jest potężnym narzędziem do badania regulacji alternatywnego splicingu regulacji. Dzięki analizom bioinformatycznym połączonym z metodologią eksperymentalną metodologią, zidentyfikowaliśmy zmiany mutacyjne potrzebne do utworzenia funkcjonalnych 5' w Alu. Ujawniliśmy złożony mechanizm, dzięki któremu sekwencja sekwencji miejsca splicingowego 5' i jego parowania zasad z małym jądrowym RNA RNA U1 regulują alternatywny splicing. Pokazujemy, że w intronach GC pochodzących od Alu siła parowania zasad między U1 snRNA i miejscem łączenia 5' kontroluje współczynnik pomijania/włączania alternatywnego splicingu. Na podstawie tych ustaleń, zidentyfikowaliśmy 7810 Alus w ludzkim genomie, które są podatne na egzonizację. Mutacje w tych Alus mogą powodować zaburzenia genetyczne lub przyczyniać się do różnorodności białek specyficznych dla człowieka. --- TŁO: Duplikacja genów i egzonizacja intronowych elementów transponowanych to dwa mechanizmy zwiększające różnorodność genomu. dwa mechanizmy, które zwiększają różnorodność genomową. Zbadaliśmy, czy istnieje mniejsza selekcja przeciwko egzonizacji elementów transponowanych w zduplikowanych genach niż w genach z pojedynczą kopią. WYNIKI: Analiza egzonizacji elementów transpozonowych w całym genomie ujawniła wyższy wskaźnik egzonizacji w zduplikowanych genach w stosunku do genów jednokopijnych geny. Gen dla TIF-IA, czynnika inicjacji transkrypcji polimerazy RNA I, uległ specyficznej dla humanoidów triplikacji, wszystkie trzy kopie genu są aktywne transkrypcyjnie, chociaż tylko jedna kopia zachowuje zdolność do generowania białka białka TIF-IA. Przed triplikacją TIF-IA do pierwszego intronu wstawiono element Alu. do pierwszego intronu. W jednej z kopii niekodujących białka, ten Alu jest egzonizowany. Zidentyfikowaliśmy pojedynczą mutację punktową prowadzącą do egzonizacji w jednym z duplikatów genu. duplikatów genu. Kiedy ta mutacja została wprowadzona do kopii kodującej TIF-IA kopia, egzonizacja została aktywowana, a poziom mRNA kodującego białko został znacznie obniżony. znacznie obniżony. Bardzo niski poziom egzonizacji wykryto w normalnych ludzkich komórkach. ludzkich komórkach. Jednak egzonizacja ta była obfita w większości ocenianych linii komórkowych białaczki. białaczkowych, chociaż sekwencja genomowa jest niezmieniona w tych komórkach nowotworowych w porównaniu z normalnymi komórkami. WNIOSEK: Definicja elementu Alu w obrębie genu TIF-IA jako eksonu jest ograniczona do niektórych typów nowotworów; element nie jest egzonizowany w normalnych komórkach ludzkich. ludzkich komórkach. Wyniki te pogłębiają nasze zrozumienie delikatnej interakcji między duplikacją genów i alternatywnym splicingiem oraz molekularnych mechanizmów ewolucyjnych prowadzących do innowacji genetycznych. ewolucyjnych mechanizmów prowadzących do innowacji genetycznych. Sugeruje to istnienie oczyszczającej selekcji przeciwko egzonizacji w pojedynczych kopiach genów, z zduplikowane geny są wolne od takich ograniczeń. --- Elementy transpozycyjne (TE) są głównym źródłem nowych eksonów u wyższych eukariontów. Prawie połowa ludzkiego genomu pochodzi z TE, a wiele rodzajów TE ma potencjał egzonizacji. potencjał do egzonizacji. W tej pracy przeprowadziliśmy analizę na dużą skalę ludzkich eksonów pochodzących z powtórzeń międzysekwencyjnych (MIR), klasy starych TE, które były aktywne przed starych TE, które były aktywne przed promieniowaniem ssaków łożyskowych. Wykorzystując dane macierzy eksonów 328 eksonów pochodzących z MIR i analizy RT-PCR 39 eksonów w 10 tkankach, zidentyfikowaliśmy 15 konstytutywnych eksonów. tkankach, zidentyfikowaliśmy 15 konstytutywnie splicowanych eksonów MIR i 15 eksonów MIR ze specyficznym dla tkanki przesunięciem wzorców splicingu. Analiza RNA od wielu gatunków sugeruje, że zdarzenia splicingowe wielu silnie włączonych eksonów MIR zostały ustalone przed dywergencją naczelnych i gryzoni, podczas gdy niewielki odsetek niewielki odsetek wynika z niedawnej egzonizacji podczas ewolucji naczelnych. Co ciekawe, dane z macierzy eksonów sugerują znacznie wyższą aktywność splicingową eksonów eksonów MIR w porównaniu z eksonami pochodzącymi z elementów Alu, klasy specyficznych dla naczelnych retrotranspozonów. Wydaje się, że jest to uniwersalna różnica między eksonami pochodzącymi z młodych i starych TE, ponieważ jest to również obserwowane przy porównując eksony Alu z eksonami pochodzącymi z LINE1 i LINE2, dwóch innych grup starych TE. Łącznie, badanie to znacznie poszerza obecną wiedzę na temat egzonizacji TE. Nasze dane sugerują, że przy wystarczającym czasie ewolucji, liczne nowe egzony mogą ewoluować poza ewolucyjny stan pośredni i wnieść funkcjonalne nowości do współczesnych genomów ssaków. --- Powtarzalne elementy Alu mogą być wstawiane do dojrzałych informacyjnych RNA poprzez proces proces zwany egzonizacją, w którym pośredniczy splicing. Aby zrozumieć podstawy molekularne i regulację procesu przekształcania intronowego Alu w nowe eksony, zebraliśmy i przeanalizowaliśmy skompilowaliśmy i przeanalizowaliśmy zestaw danych ludzkiego egzonizowanego Alus. Ujawniliśmy mechanizm który reguluje selekcję miejsca splicingu 3' w tych eksonach podczas alternatywnego splicingu. splicingu. Na podstawie tych ustaleń zidentyfikowaliśmy mutacje, które aktywowały egzonizację cichego intronowego Alu. --- W transkrybowanych regionach ludzkiego genomu znajduje się około 650 000 elementów Alu. Elementy te zawierają kryptyczne miejsca splicingu, więc są w ciągłym niebezpieczeństwie nieprawidłowe włączenie do dojrzałych transkryptów. Pomimo stwarzania poważnego zagrożenia dla integralności transkryptomu, niewiele wiadomo na temat mechanizmów molekularnych zapobiegających ich włączaniu. Tutaj przedstawiamy mechanizm ochrony ludzkiego transkryptomu przed ludzkiego transkryptomu przed nieprawidłową egzonizacją elementów transpozycyjnych. Ilościowe dane iCLIP pokazują, że białko wiążące RNA hnRNP C konkuruje z czynnikiem splicingowym czynnikiem splicingowym U2AF65 w wielu autentycznych i kryptycznych miejscach splicingowych. Utrata hnRNP C prowadzi do powstania wcześniej stłumionych eksonów Alu, które poważnie zaburzają funkcję transkryptu. Eksperymenty z minigenami wyjaśniają związane z chorobą mutacje w elementach Alu, które utrudniają wiązanie hnRNP C. Tak więc, zapobiegając U2AF65 do elementów Alu, hnRNP C odgrywa kluczową rolę jako ogólnogenomowy chroniąc transkryptom. Odkrycia te mają ważne implikacje dla ludzkiej ewolucji i chorób. --- Wykazano, że starożytne elementy Alu są włączane do dojrzałych transkryptów przez mutacje punktowe, które poprawiają ich miejsca splicingu 5' lub 3'. Zbadaliśmy wymagania dotyczące egzonizacji młodszego, związanego z chorobą AluYa5 w intronie 16 ludzkiego genu ACE. Pojedyncza konwersja G>C w pozycji -3 nowego eksonu Alu była niewystarczająca do egzonizacji Alu, a znaczące włączenie do mRNA zaobserwowano tylko podczas ulepszania kilku potencjalnych miejsc dawców splicingu w obecności w obecności 3' CAG. Ponieważ całkowita egzonizacja Alu nie została osiągnięta przez optymalizacji tradycyjnych sygnałów splicingowych, w tym miejsca rozgałęzienia, przetestowaliśmy czy elementy pomocnicze w AluYa5 były wymagane do konstytutywnego włączenia. Egzonizacja była promowana przez przewidywany przez SELEX heptamer w sekwencji konsensusowej Alu 222-228, a mutacje punktowe w wysoce konserwatywnych nukleotydach tego heptameru zmniejszały inkluzję Alu. Ponadto pokazujemy, że egzonizacja Alu była ułatwiona przez podzbiór białek bogatych w serynę/argininę (SR) poprzez aktywację zoptymalizowanego miejsca splicingu 3'. Wreszcie, specyficzne dla haplotypów i alleli ACE generowały podobne wzorce splicingu zarówno w komórkach z ekspresją, jak i bez ekspresji ACE i komórkach bez ekspresji ACE, co sugeruje, że wcześniej zgłaszane powiązania alleliczne z aktywnością ACE w osoczu i chorobą sercowo-naczyniową nie można przypisać różnicowemu splicingowi intronów 16 i 17. --- TŁO: Elementy transpozycyjne (TE) mają znaczący wpływ na ewolucję ssaków. i są zaangażowane w liczne choroby genetyczne. Porównaliśmy wpływ TE na transkryptom człowieka i myszy. WYNIKI: Zebraliśmy zestaw danych wszystkich TE w genomach człowieka i myszy, identyfikując odpowiednio 3 932 058 i 3 122 416 TE. Następnie wyodrębniliśmy TE zlokalizowane w ludzkich i mysich genach i, co zaskakujące, odkryliśmy, że 60% TEs zarówno u ludzi, jak i myszy znajduje się w sekwencjach intronowych, mimo że introny stanowią tylko 24% ludzkiego genomu. Wszystkie rodziny TE zarówno u ludzi, jak i myszy mogą egzonizować. Rodziny TE, które są wspólne dla człowieka i myszy, wykazują ten sam procent egzonizacji TE u obu gatunków, ale poziom egzonizacji Alu, retroelementu specyficznego dla naczelnych, jest znacznie wyższy niż w przypadku inne TE w ludzkim genomie, co prowadzi do wyższego poziomu egzonizacji TE u ludzi niż u myszy (odpowiednio 1 824 eksony w porównaniu z 506 eksonami). My wykryliśmy specyficzny dla naczelnych mechanizm wzmocnienia intronów, w którym insercja Alu do eksonu tworzy nowy intron zlokalizowany w 3' regionie nieulegającym translacji (określany jako "intronizacja"). Wreszcie, insercja TE do pierwszego i ostatniego eksonu genu genu jest częstsze u ludzi niż u myszy, co prowadzi do dłuższych eksonów u ludzi. u ludzi. WNIOSEK: Nasze odkrycia ujawniają wiele efektów TE na te dwa transkryptomy. Efekty te są znacznie większe u ludzi niż u myszy, co wynika z obecność elementów Alu u człowieka. --- Element Alu był głównym źródłem nowych eksonów podczas ewolucji naczelnych. Tysiące ludzkich genów zawiera splicowane eksony pochodzące z elementów Alu. Jednak identyfikacja eksonów Alu, które uzyskały prawdziwe funkcje biologiczne pozostaje dużym wyzwaniem. Zbadaliśmy tworzenie i powstawanie eksonów Alu w ludzkich genach, wykorzystując profile transkryptomu ludzkich tkanek generowane przez sekwencjonowanie RNA o wysokiej przepustowości (RNA-Seq) w połączeniu z obszerną analizą RT-PCR analizą. Ponad 25% eksonów Alu analizowanych przez RNA-Seq ma szacowane poziomy włączenia transkryptu wynoszące co najmniej 50% w ludzkim móżdżku, co wskazuje na powszechne występowanie eksonów Alu w ludzkich genach. Geny kodujące czynniki transkrypcyjne mają znacznie wyższy poziom egzonizacji Alu. Co ważne, eksony Alu o wysokiej aktywności splicingowej są silnie wzbogacone w 5'-UTR, a dwie trzecie (10/15) egzonów 5'-UTR Alu testowanych za pomocą testów reporterowych lucyferazy znacząco zmienia wydajność translacji mRNA. Analiza mutacji ujawnia specyficzne mechanizmy molekularne, za pomocą których nowo utworzone eksony 5'-UTR Alu modulują wydajność translacji, takie jak tworzenie lub wydłużanie ORF, które hamują translację pierwotnych ORF. Niniejsze badanie przedstawia genomiczne dowody na to, że główną funkcjonalną konsekwencją egzonizacji Alu jest specyficzna dla linii ewolucja regulacji translacji. Ponadto preferencyjne tworzenie i ustanawianie eksonów Alu w genach palców cynkowych sugerują, że egzonizacja Alu mogła globalnie wpłynąć na ewolucję transkryptomów naczelnych i ludzkich transkryptomów poprzez regulację produkcji białek głównych regulatorów transkrypcji w określonych liniach. --- Niedawno badania asocjacyjne obejmujące cały genom zidentyfikowały silny związek między locus ZBTB38 a wzrostem człowieka. W badaniu funkcjonalnym wykryliśmy dwa produkty RT-PCR ZBTB38, amplifikowane ze starterami w eksonach 7 i 8 z linii komórkowej chondrocytów linii komórkowej chondrocytów, C-28/I2. Sekwencjonowanie ujawniło, że dłuższy produkt zawierał segment Alu w intronie 7 ZBTB38, który zawierał potencjalne miejsce akceptora splicingu, które prawdopodobnie miejsce akceptora splicingu, które prawdopodobnie zostało użyte do wygenerowania alternatywnego transkryptu. transkryptu. Wstawienie segmentu Alu zmieniło konsensus sekwencji Kozaka transkryptu ZBTB38. transkryptu ZBTB38, potencjalnie zmieniając wydajność translacji. My RT-PCR przy użyciu 16 próbek tkanek od ludzi i 8 próbek tkanek od naczelnych, aby określić naczelnych, aby określić jakąkolwiek specyficzność tkankową lub ewolucyjną konserwację alternatywnego splicingu. alternatywnego splicingu. Chociaż nie udało nam się zidentyfikować żadnej różnicy między tkanek, wszystkie próbki naczelnych wyrażały tylko krótszy segment Alu (brak transkryptu), co sugeruje transkryptu), co sugeruje, że zdarzenie alternatywnego splicingu jest specyficzne dla hominidów specyficzne dla naczelnych. --- Większość z ponad miliona specyficznych dla naczelnych elementów Alu mapuje się na niefunkcjonalnych części intronów lub sekwencji międzygenowych. Po zintegrowaniu mają potencjał, aby zostać zaadaptowanymi jako moduły funkcjonalne, np. jako domeny kodujące białka poprzez alternatywny splicing. Ten szczególny proces jest również nazywany jest również egzonizacją i zwiększa wszechstronność białek. Tutaj badamy 153 ludzkie loci chromosomalne, w których elementy Alu mogły ulec egzonizacji. W czterech wybranych przykładach wygenerowaliśmy, z pomocą przedstawicieli wszystkich naczelnych naczelnych, rekonstrukcje filogenetyczne etapów ewolucji prawdopodobnie prowadzące do egzonizacji elementów Alu. Zaobserwowaliśmy różne możliwe scenariuszy, w których elementy Alu prowadziły do nowych form splicingu mRNA i które, podobnie jak jak większość procesów ewolucyjnych, miały różny przebieg w różnych liniach. Nasze dane pokazują, że po nabyciu niektóre egzonizacje zostały ponownie utracone w niektórych liniach. liniach. Ogólnie rzecz biorąc, egzonizacja Alu wystąpiła w różnych punktach czasowych w ciągu ewolucyjnej linii naczelnych, a potencjał kodowania białek został nabywany stosunkowo szybko po integracji lub miliony lat później. później. Przebieg tych ścieżek można prawdopodobnie uogólnić na egzonizacji również innych elementów. --- Surwiwina jest członkiem rodziny inhibitorów apoptozy, która ulega nadekspresji w wielu nowotworach złośliwych. wielu nowotworach złośliwych. Ma pięć znanych alternatywnych form splicingu, z których niektóre różnią się właściwościami antyapoptotycznymi i poziomem ekspresji w ludzkich nowotworach. Tutaj opisujemy nowe miejsce splicingu dawcy (DSS), 2B + 32 DSS, które jest używane w połączeniu z alternatywnym eksonem w połączeniu z alternatywnym eksonem 2B surwiwiny, co skutkuje włączeniem 32 dodatkowych nukleotydów z intronu 2 na końcu 3' tego eksonu. Analiza sekwencji wykazała, że zarówno klasyczny egzon 2B DSS, jak i 2B + 32 są dostarczane przez sekwencję Alu, która jest wstawiana do intronu 2 za funkcjonalnym akceptorem prowadząc do egzonizacji części elementu repetytywnego. Mniejsze transkrypty, w tym alternatywny ekson 2B + 32, lub zachowujące całość region intronowy zawarty między eksonami 2B i 3, wykryto w kilku ludzkich liniach komórkowych liniach komórkowych i w niektórych tkankach ludzkich. Warianty zawierające Survivin 2B+32 nabywają przedwczesny kodon stop (PTC) i dlatego mogą być degradowane przez nonsensowny pośredniczy szlak rozpadu. Implikacja tych nowych izoform, jak również innych wariantów PTC+ surwiwiny, w ogólnej regulacji ekspresji surwiwiny w ogólnej regulacji ekspresji surwiwiny. Analiza sekwencji intronu 2, który zawiera element Alu Y, została na różnych gatunkach naczelnych w celu prześledzenia jego insercji i egzonizacji podczas ewolucji naczelnych. egzonizacji podczas ewolucji naczelnych. --- Uważa się, że insercja elementów transpozycyjnych w obrębie genów ssaków jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do ewolucji i specjacji ssaków. Wstawienie do intronów może prowadzić do ich aktywacji jako alternatywnie jako alternatywnie splicingowane eksony kasetowe, co nazywane jest egzonizacją. Wyjaśnienie ewolucyjnych ograniczeń, które ukształtowały fiksację transponowanych elementów w obrębie ludzkich i mysich genów kodujących białka i późniejszej egzonizacji jest ważne dla zrozumienia, w jaki sposób proces egzonizacji wpłynął na złożoność transkryptomu i proteomu. złożoność transkryptomu i proteomu. Tutaj pokazujemy, że egzonizacja transponowanych elementów jest w kierunku początku sekwencji kodującej zarówno w genach ludzkich, jak i mysich. genach. Analiza polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) ujawniła, że egzonizacja elementów transponowanych może być specyficzna dla populacji, co sugeruje, że egzonizacje mogą zwiększać dywergencję i prowadzić do specjacji. Analiza gęstości SNP ujawniła różnice między Alu i innymi elementami transpozycji. Wreszcie zidentyfikowaliśmy przypadki elementów Alu specyficznych dla naczelnych, które zależą od edycji RNA dla ich egzonizacji. Wyniki te rzuciły światło na utrwalanie TE i proces egzonizacji w ludzkich i mysich genach.
Czy eksony kodujące białka mogą pochodzić z sekwencji ALU?
Tak. Introniczne ALU mogą ewoluować w egzony poprzez aktywację sygnałów splicingowych znajdujących się w sekwencji ALU. Podczas gdy większość eksonów ALU nie dodaje ani nie modyfikuje zdolności kodowania wynikowego transkryptu, zidentyfikowano przykłady eksonów ALU, które stają się białkami kodującymi.