Mutacje wywołane stresem, które występują w nie dzielących się komórkach (mutacje adaptacyjne) zostały silnie zaangażowane w powodowanie zmienności genetycznej, a także w przetrwanie gatunków i procesy ewolucyjne. Uszkodzenia DNA wywołane stresem oksydacyjnym było związane z generowaniem adaptacyjnych His(+) i Met(+), ale nie Leu(+) w szczepie Bacillus subtilis YB955 (hisC952 metB5 leuC427). Tutaj my donoszą, że wzajemne oddziaływanie między MutY i MutSL (system naprawy niedopasowania [MMR]) odgrywa kluczową rolę w produkcji adaptacyjnych revertantów Leu(+). Zasadniczo, genetyczne zakłócenie MutY dramatycznie zmniejszyło rewersję do allelu Leu w tym systemie modelowym. Co więcej, zwiększona częstość adaptacyjnych rewersantów Leu(+) wytwarzanych przez szczep z nokautem MutSL był znacznie zmniejszona po zakłóceniu mutY. Co ciekawe, chociaż ekspresja ekspresja mutY miała miejsce podczas wzrostu i fazy stacjonarnej i nie była pod kontrolą RecA, PerR lub σ(B), mutacja zerowa w operonie mutSL kilkakrotnie zwiększała ekspresję mutY. Tak więc, w głodzonych komórkach, nasycenie systemu MMR może indukować ekspresję mutY, zaburzając równowagę między białkami MutY i MMR. równowagę między białkami MutY i MMR oraz wspomagając produkcję typów mutacji wykrywanych przez rewersję do mutacji wykrywanych przez powrót do prototrofii leucyny. Podsumowując, nasze wyniki potwierdzają koncepcję, że regulacja MMR mutagennych / antymutagennych właściwości MutY promuje mutagenezę w fazie stacjonarnej w komórkach B. subtilis. --- YqjH i YqjW są homologami Bacillus subtilis z nadrodziny UmuC/DinB lub Y polimeraz DNA, które są zaangażowane w mutagenezę indukowaną przez SOS w Escherichia coli. Podczas gdy funkcje YqjH i YqjW w B. subtilis są nadal niejasne, porównanie struktur białek pokazuje, że porównanie struktur białkowych wykazało, że YqjH ma 36% identyczności z polimerazą DNA IV E. coli polimerazy DNA IV (białko DinB), a YqjW ma 26% identyczności do E. coli polimerazy DNA V (białko UmuC). W tym raporcie wykazujemy, że zarówno YqjH, jak i produkty operonu yqjW są zaangażowane w mutagenezę indukowaną promieniowaniem UV w tej bakterii. bakterii. Co więcej, odporność na uszkodzenia wywołane promieniowaniem UV jest znacznie zmniejszona w komórkach pozbawionych funkcjonalnego białka YqjH. Analiza mutagenezy w fazie stacjonarnej mutagenezy w fazie stacjonarnej wskazuje, że brak YqjH, ale nie YqjW, zmniejsza zdolność B. subtilis do generowania revertantów w allelu hisC952 za pośrednictwem tego systemu. system. Dane te sugerują rolę YqjH w generowaniu przynajmniej niektórych rodzajów mutagenezy indukowanej fazą stacjonarną. --- Mutageneza adaptacyjna (w fazie stacjonarnej) występuje u bakterii Gram-dodatnich Bacillus subtilis. Ponadto, wykorzystując B. subtilis jako paradygmat do badania prokariotycznego różnicowania i rozwoju, wykazaliśmy, że ten typ mutagenezy podlega ten rodzaj mutagenezy podlega regulacji obejmującej co najmniej dwa z genów genów, które są zaangażowane w regulację prokariotycznego różnicowania w fazie posteksponencjalnej, tj. różnicowania prokariotycznego, tj. comA i comK. Z drugiej strony, funkcjonalne białko RecA nie było wymagane do tego typu mutagenezy. Wyniki wydają się sugerują, że niewielka subpopulacja (subpopulacje) kultury jest zaangażowana w adaptacyjną mutagenezę mutagenezę i że ta subpopulacja (subpopulacje) jest hipermutowalna. Istnienie takiej hipermutowalnej subpopulacji (subpopulacji) rodzi ważne rozważania dotyczące w odniesieniu do ewolucji, rozwoju specyficznych mutacji, natury populacji bakterii i poziomu populacji bakterii i poziomu komunikacji między bakteriami w niszy ekologicznej. bakterii w niszy ekologicznej. --- Zakłócenie ung, unikalnego genu kodującego uracylo-DNA-glikozylazę u Bacillus subtilis, nieznacznie zwiększyło częstotliwość spontanicznych mutacji do oporności na ryfampinę (Rif(r)), co sugeruje, że dodatkowe ścieżki naprawy przeciwdziałają mutagennemu działaniu uracylu w tym mikroorganizmie. Alternatywny szlak naprawy alternatywny szlak naprawy przez wycięcie jest zaangażowany w ten proces, ponieważ utrata YwqL, domniemanej homologu przypuszczalnego homologa endonukleazy V, znacznie zwiększyła częstotliwość mutacji mutanta ung null, co sugeruje, że Ung i YwqL zmniejszają mutagenne efekty deaminacji zasad. efekty deaminacji zasad. Zgodnie z tym poglądem, wodorosiarczyn sodu (SB) zwiększał częstotliwość mutacji Rif(r) w szczepach z pojedynczym ung i podwójnym ung ywqL a brak Ung i / lub YwqL zmniejszył zdolność B. subtilis do eliminacji uracylu z DNA. Co ciekawe, częstotliwość mutacji Rif(r) szczepów pojedynczych mutantów ung i mutSL (system naprawy niedopasowania [MMR]) była dramatycznie zwiększona w szczepie z nokautem ung, który miał również niedobór MutSL, co sugeruje, że że szlak MMR również przeciwdziała mutagennemu działaniu uracylu. Ponieważ częstotliwość mutacji szczepu ung mutSL była znacznie zwiększona przez SB, oprócz oprócz Ung, mutagenne efekty promowane przez deaminację zasad w rosnących komórkach B. subtilis są hamowane nie tylko przez YwqL, ale także przez MMR. Co ważne, w niedzielących się komórkach B. subtilis, akumulacja mutacji w trzech allelach chromosomalnych chromosomalnych były znacznie zmniejszone po zakłóceniu działania ung i ywqL. Tak więc, w warunkach stresu żywieniowego, przetwarzanie deaminowanych zasad w B. subtilis może normalnie zachodzić w sposób podatny na błędy, aby promować mutagenezę adaptacyjną. --- Naprawa niedopasowania po syntezie jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do unikania mutacji i stabilności genomu u bakterii, drożdży i ludzi. Regulacja jego aktywności pozwoliłaby organizmom regulować ich zdolność do ewolucji. Ta naprawa niedopasowania może być regulowana w dół w fazie stacjonarnej Escherichia coli zostało zasugerowane przez spektrum sekwencji niektórych mutacji w fazie stacjonarnej ("adaptacyjnych") oraz przez obserwacje obserwacje, że poziomy MutS i MutH spadają podczas fazy stacjonarnej. My że nadprodukcja MutL hamuje mutację w fazie stacjonarnej, ale nie podczas wzrostu. podczas wzrostu. Nadprodukcja MutS nie ma takiego efektu, a nadprodukcja MutL nie zapobiega spadkowi poziomu MutS lub MutH w fazie stacjonarnej. Wyniki te sugerują, że MutS i MutH spadają do poziomów odpowiednich dla zmniejszonej syntezy DNA syntezy DNA w fazie stacjonarnej, podczas gdy funkcjonalna MutL ogranicza naprawę niedopasowania w fazie stacjonarnej. Modulacja szybkości mutacji i stabilności genetycznej w odpowiedzi na sygnały środowiskowe lub rozwojowe, takie jak faza stacjonarna i stres, może być ważna w ewolucji, rozwoju, patogenności drobnoustrojów i powstawaniu nowotworów. --- W rosnących komórkach, miejsca apurynowe/apirymidynowe (AP) generowane spontanicznie lub wynikające z enzymatycznej eliminacji utlenionych zasad muszą zostać przetworzone przez endonukleazy AP, zanim zagrożą integralności komórki. Tutaj zbadaliśmy jak miejsca AP i przetwarzanie tych niekodujących zmian przez endonukleazy AP endonukleazy Nfo, ExoA i Nth przyczyniają się do powstawania mutacji (hisC952, metB5 i leuC427) w głodzonych komórkach szczepu Bacillus subtilis YB955 szczepu. Co ciekawe, komórki tego szczepu z niedoborem Nfo, ExoA, i Nth gromadziły większą ilość miejsc AP w fazie stacjonarnej niż podczas wzrostu wykładniczego. Co więcej, w warunkach ograniczających wzrost, szczep potrójny nokaut nfo exoA nth znacząco zwiększył ilości adaptacyjnych revertantów his, met i leu produkowanych przez rodzicielski szczep B. subtilis YB955. szczep rodzicielski. Warto zauważyć, że liczba rewersji związanych z fazą stacjonarną w allelach w allelach his, met i leu wytwarzanych przez szczep nfo exoA nth była znacząco zmniejszona po zakłóceniu polX. W przeciwieństwie do tego, podczas wzrostu w trzech badanych allelach były znacząco zwiększone w komórkach szczepu nfo exoA nth. komórek szczepu nfo exoA nth z niedoborem polimerazy X (PolX). Dlatego postulujemy, że mutacje adaptacyjne w B. subtilis mogą być generowane poprzez nowy mechanizm, w którym pośredniczy podatne na błędy przetwarzanie miejsc AP nagromadzonych w fazie stacjonarnej przez polimerazę DNA PolX. --- Wcześniej, przy użyciu systemu testowania rewersji chromosomalnej, ustaliliśmy, że adaptacyjny proces mutagenny adaptacyjny proces mutagenny występuje w nierosnących komórkach Bacillus subtilis pod i wykazaliśmy, że w generowanie tych mutacji zaangażowanych jest wiele mechanizmów (41, 43). tych mutacji (41, 43). Próbując określić, w jaki sposób te mutacje są generowane, rozpoczęliśmy badanie, czy transkrypcja i białka związane z transkrypcją białka związane z transkrypcją wpływają na mutagenezę adaptacyjną. U B. subtilis, białko Mfd (czynnik sprzęgający naprawę transkrypcji) ułatwia usuwanie polimerazy RNA zatrzymanej w blokadach transkrypcyjnych i rekrutację białek naprawczych białek naprawczych do uszkodzeń DNA na transkrybowanej nici. Tutaj pokazujemy że utrata Mfd ma depresyjny wpływ na mutagenezę w fazie stacjonarnej. Związek omówiono związek między mutagenezą Mfd a aspektami transkrypcji. --- Poprzednie badania wykazały, że szczep Bacillus subtilis z niedoborem operonu naprawy niedopasowania naprawy (MMR; kodowany przez operon mutSL) promował produkcję mutacji mutacji indukowanych przez fazę stacjonarną. Jednak nadekspresja operonu mutSL nie tłumiła całkowicie tego procesu, co sugeruje, że dodatkowe mechanizmy naprawy DNA DNA są zaangażowane w generowanie mutantów związanych z fazą stacjonarną w tej bakterii. Zgodnie z tą hipotezą, wyniki przedstawione w niniejszej pracy tej pracy ujawniły, że głodzone komórki B. subtilis pozbawione funkcjonalnego mechanizmu zapobiegania błędom GO (8-oxo-G) (złożonego z YtkD, MutM i YfhQ) miały dramatyczną skłonność do zwiększania liczby mutantów związanych z fazą stacjonarną. skłonność do zwiększania liczby revertantów indukowanych fazą stacjonarną. Te wyniki silnie sugerują, że występowanie mutacji jest zaostrzane przez reaktywne formy tlenu w niepodzielnych komórkach B. subtilis posiadających nieaktywny system GO. GO. Co ciekawe, nadekspresja systemu MMR znacząco znacznie zmniejszyła akumulację mutacji w komórkach z niedoborem systemu naprawy GO w fazie stacjonarnej. Wyniki te sugerują, że system MMR odgrywa odgrywa ogólną rolę w korygowaniu nieprawidłowej naprawy zasad indukowanej przez stres oksydacyjny w fazie stacjonarnej. w fazie stacjonarnej. Zatem brak lub depresja zarówno systemu MMR, jak i GO przyczynia się do produkcji mutantów fazy stacjonarnej u B. subtilis. Podsumowując Podsumowując, nasze wyniki potwierdzają koncepcję, że stres oksydacyjny jest mechanizmem który generuje różnorodność genetyczną w wygłodzonych komórkach B. subtilis, promując mutagenezę indukowaną fazą stacjonarną u tego mikroorganizmu glebowego. --- System testowania rewersji wcześniej wdrożony w celu wykazania istnienia adaptacyjnej lub mutagenezy indukowanej fazą stacjonarną w Bacillus subtilis był wykorzystany w tym raporcie do zbadania wpływu systemu naprawy niedopasowanego DNA (MMR) na ten typ mutagenezy. Wyniki wykazały, że szczep z niedoborem MutSL wykazywał znaczną skłonność do generowania zwiększonej liczby revertantów indukowanych fazą stacjonarną. Wyniki te sugerują, że brak lub MMR jest ważnym czynnikiem w mutagenezie nierosnących komórek B. subtilis ze względu na rolę MMR w naprawie uszkodzeń DNA. Zgodnie z tą sugestią, znaczący spadek liczby adaptacyjnych kolonii rewersyjnych dla trzech markerów dla trzech testowanych markerów, wystąpił w komórkach B. subtilis, które nadeksprymowały składnik systemu MMR. Co ciekawe, pojedyncza nadekspresja mutS, ale nie mutL, była wystarczająca do obniżenia poziomu mutantów adaptacyjnych w rewersji. mutantów adaptacyjnych w systemie testu rewersji B. subtilis. Wyniki przedstawione w tej pracy, jak również w naszych poprzednich badaniach, wydają się sugerować że niedobór MMR, przypuszczalnie przypisywany inaktywacji lub nasyceniu z uszkodzeniem DNA MutS, może wystąpić w podzbiorze komórek B. subtilis, które różnicują się do stanu hipermutowalnego. --- Naukowcy od wielu lat są świadomi istnienia programów genetycznych, które są aktywowane pod wpływem stresu i wytwarzają warianty genetyczne w komórkach, które uciekają przed nieproliferacją warunki. Programy te są dobrze zachowane we wszystkich organizmach i poszerzają nasz pogląd na ewolucję. pogląd na ewolucję. Pośredniczą one w niestabilności genomu, tworzą różnorodność w tworzeniu przeciwciał przeciwciał, rozszerzają metabolizm i zwiększają sprawność patogenów w środowisku gospodarza. środowiska. Podatne na błędy replikacja i naprawa DNA są genetycznymi genetyczne, które są stymulowane przez początek stresu komórkowego. komórkowych. Osadzona w tych programach jest zdolność do ograniczania mutagenezy do określonych regionów genomu i czasu, zapewniając integralność większości genomu. Najnowsze dowody sugerują, że czynniki zaangażowane w polimerazę RNA (RNAP) lub derepresję transkrypcyjną przyczyniają się do generowania mutacji indukowanych stresem. mutacji wywołanych stresem. U Bacillus subtilis wykazano, że mutageneza związana z transkrypcją wykazano, że mutageneza związana z transkrypcją jest niezależna od naprawy zależnej od rekombinacji oraz, w niektórych przypadkach, od polimeraz DNA Y. Centralna dla mutagenezy w fazie stacjonarnej mutagenezy w fazie stacjonarnej u B. subtilis jest wymóg Mfd, czynnika naprawy sprzężenia transkrypcji czynnika naprawy transkrypcji, co sugeruje nowy mechanizm od tych opisanych w innych systemach modelowych. modelowych.
Jakie mechanizmy leżą u podstaw mutagenezy adaptacyjnej (mutagenezy w fazie stacjonarnej) u Bacillus subtilis?
Zwiększone poziomy transkrypcji wzmacniają mutagenezę adaptacyjną. Centralnym elementem mutagenezy w fazie stacjonarnej u B. subtilis jest wymóg obecności białka Mfd (czynnika sprzęgającego naprawę transkrypcji). Zdolność B. subtilis do akumulacji mutacji chromosomalnych w warunkach głodu zależy od różnicowania komórek i derepresji transkrypcyjnej, a także od białek homologicznych do czynników transkrypcyjnych i naprawczych. W warunkach stresu żywieniowego przetwarzanie deaminowanych zasad w B. subtilis może normalnie zachodzić w sposób podatny na błędy w celu promowania mutagenezy adaptacyjnej. Funkcjonalne białko RecA nie jest wymagane do mutagenezy adaptacyjnej, która wydaje się być niezależna od naprawy zależnej od rekombinacji oraz, w niektórych przypadkach, od polimeraz DNA Y. Uszkodzenia DNA wywołane stresem oksydacyjnym są związane z mutagenezą adaptacyjną. Występowanie takich mutacji jest nasilane przez reaktywne formy tlenu. Zagłodzone komórki B. subtilis pozbawione funkcjonalnego systemu zapobiegania błędom GO (8-oxo-G) (składającego się z YtkD, MutM i YfhQ) miały dramatyczną skłonność do zwiększania liczby revertantów indukowanych fazą stacjonarną. MMR (kodowany przez operon mutSL) chroni B. subtilis przed mutacjami w fazie stacjonarnej. Modulacja przez MMR mutagennych/antymutagennych właściwości MutY reguluje mutagenezę w fazie stacjonarnej. Dwa z genów zaangażowanych w regulację różnicowania prokariotycznego w fazie posteksponencjalnej, comA i comK, są zaangażowane w mutagenezę adaptacyjną. Również YqjH, homolog białka DinB, odgrywa rolę w mutagenezie fazy stacjonarnej.