Fosfolamban (PLB) hamuje Ca(2+)-ATPazę retikulum sarkoplazmatycznego (SR) (SERCA), a hamowanie to jest łagodzone przez fosforylację białka zależnego od kalmoduliny Ca(2+) kinaza białkowa II (kinaza CaM II) fosforylacja. Wcześniej zgłaszaliśmy znaczące różnice w kurczliwości, uwalnianiu SR Ca (2 +) i aktywności kinazy CaM II w mięśniach gładkich dna żołądka w wyniku fosforylacji PLB przez kinazę CaM II. W tym badaniu wykorzystaliśmy myszy z nokautem PLB (PLB-KO), aby bezpośrednio zbadać wpływ nieobecności PLB na kurczliwość, aktywność kinazy CaM II i wewnątrzkomórkowe fale Ca(2+) w mięśniach gładkich antrum żołądka. Częstotliwości i amplitudy spontanicznych skurczów fazowych były podwyższone w paskach mięśni gładkich antrum mięśni gładkich od myszy PLB-KO. Bethanecol zwiększał amplitudę skurczów fazowych w mięśniach gładkich w mięśniach gładkich antrum zarówno od myszy kontrolnych, jak i PLB-KO. Kofeina zmniejszyła, a kwas cyklopiazonowy (CPA) zwiększył podstawowy ton pasków mięśni gładkich antrum od myszy PLB-KO, ale efekty były mniej mniej wyraźne w porównaniu z paskami kontrolnymi. Inhibitor kinazy CaM II KN-93 był mniej skuteczny w hamowaniu relaksacji indukowanej kofeiną w mięśniach gładkich antrum od myszy PLB-KO. Autonomiczna aktywność kinazy CaM II była podwyższona, a nie dalej zwiększana przez kofeinę w mięśniach gładkich antrum od myszy PLB-KO. Podobnie, wewnątrzkomórkowa częstotliwość fali Ca(2+) była podwyższona, a nie dalej zwiększona przez kofeinę w mięśniach gładkich antrum od myszy PLB-KO. Wyniki te sugerują, że PLB jest ważnym modulatorem mięśni gładkich antrum żołądka poprzez modulację uwalniania SR Ca(2+) i aktywności kinazy CaM II. --- Fosfolamban (PLB) jest integralnym białkiem błonowym regulującym transport Ca(2+) poprzez hamującą interakcję z ATPazą wapniową retikulum sarko(endo)plazmatycznego (SERCA). Wykazano, że mutacja Asn27 do Ala (N27A) PLB działa jako superinhibitor superinhibitor powinowactwa SERCA do Ca(2+) i kurczliwości serca in vivo. Wpływ tej mutacji N27A na łańcuch boczny i szkielet dynamikę PLB badano za pomocą spektroskopii (2) H i (15) N w stanie stałym NMR w fosfolipidowych pęcherzykach wielokomórkowych (MLV). Widma (2)H i (15)N NMR wskazują, że mutacja N27A nie zmienia znacząco dynamiki łańcucha bocznego lub szkieletu łańcucha bocznego lub dynamiki szkieletu domen transbłonowych i cytoplazmatycznych w porównaniu do PLB typu dzikiego. Jednakże, dynamiczne zmiany są obserwowane dla region zawiasu, w którym obserwuje się większą ruchliwość dla znakowanego CD(3) Ala24 N27A-PLB. Zwiększona dynamika w regionie zawiasowym PLB po mutacji N27A może pozwolić helisie cytoplazmatycznej na łatwiejsze oddziaływanie z Ca(2+)-ATPazą; wykazując w ten sposób zwiększone hamowanie Ca(2+)-ATPazy. --- 1. Fosfolamban (PLB) jest inhibitorem retikulum sarkoplazmatycznego (SR) Ca2+-ATPazy (SERCA). Jego obecność i/lub znaczenie funkcjonalne w kurczliwości pęcherza moczowego, tkanki mięśni gładkich szczególnie zależnej od funkcji SR jest nieznana. Zbadaliśmy to, mierząc wpływ karbacholu (CCh) na siłę i [Ca2+]i w pęcherzu od myszy, u których gen PLB był ablowany (myszy PLB-KO). W pęcherzu PLB-KO maksymalny wzrost [Ca2+]i i siły były znacznie zmniejszone (41,5 i 47,4% WT), a wartości EC50 wzrosły. 2. Zahamowanie SERCA kwasem cyklopiazonowym (CPA) zniosło te różnice między pęcherzem WT i PLB-KO, lokalizując efekty na SR. 3. Aby ustalić, czy te efekty były specyficzne dla PLB, wygenerowaliśmy myszy z ekspresją PLB specyficzną dla mięśni gładkich (myszy PLB-SMOE), używając promotora alfa-aktyny SMP8. Analiza Western blot myszy PLB-SMOE wykazała około ośmiokrotną nadekspresję PLB, podczas gdy SERCA była regulowana w dół 12-krotnie. 4. Natomiast w pęcherzach PLB-SMOE odpowiedź [Ca2+]i i siła na CCh była znacznie zwiększona, a wartości EC50 były zmniejszone. CPA miał niewielki wpływ na indukowany CCh wzrost [Ca2+]i i siły w PLB-SMOE pęcherz. 5. Wyniki te pokazują, że zmiana stosunku PLB: SERCA może znacząco modulować [Ca2+]i mięśni gładkich. Co ważne, nasze dane pokazują, że PLB może odgrywać główną rolę w modulacji kurczliwości pęcherza moczowego. --- Fosfolamban (PLN) jest białkiem błonowym typu II, które hamuje retikulum sarkoplazmatyczne Ca(2+)-ATPazy (SERCA). (SERCA), regulując w ten sposób homeostazę wapnia w mięśniu sercowym. mięśnia sercowego. W błonach PLN tworzy pentamery, które zostały zaproponowane do funkcjonować jako magazyn aktywnych monomerów lub jako kanały jonowe. Tutaj zgłaszamy strukturę pentamerycznego PLN w stanie T rozwiązaną za pomocą hybrydowego roztworu i NMR w stanie stałym. W dwuwarstwach lipidowych, PLN przyjmuje topologię wiatraczka z wąskim hydrofobowym porem, który wyklucza transport jonów. W stanie T cytoplazmatyczne amfipatyczne helisy (domeny Ia) są wchłaniane do dwuwarstwy lipidowej z domenami transmembranowymi ułożonymi w lewoskrętną konfigurację coiled-coil konfiguracja, przecinająca dwuwarstwę z kątem nachylenia około 11 ° w stosunku do normalnej błony w odniesieniu do normalnej błony. Różnica kąta nachylenia między monomerem i pentamerem wynosi około 13 °, co pokazuje, że wewnątrzbłonowe siły asocjacji helisa-helisa dominują nad niedopasowaniem hydrofobowym, napędzając ogólną topologię montażu topologię zespołu transbłonowego. Nasze dane ujawniają, że zarówno topologia, jak i funkcja PLN są kształtowane przez interakcje z lipidami, które precyzyjnie dostrajają regulację SERCA. --- Transport wapnia przez błonę siateczki sarkoplazmatycznej (SR) odgrywa ważną rolę w regulacji skurczu mięśnia sercowego. odgrywa ważną rolę w regulacji skurczu i rozkurczu mięśnia sercowego. ATPaza sarko(endo)plazmocytarna Ca(2+) (SERCA) 2a jest odpowiedzialna za wychwyt Ca(2+) przez tę organellę. wychwyt Ca(2+) przez tę organellę i jest hamowana w sposób odwracalny przez fosfolamban, inne białko błonowe SR. Zatem złagodzenie hamowanie SERCA2a za pośrednictwem fosfolambanu jest potencjalną opcją terapeutyczną dla niewydolności serca i kardiomiopatii. Obecnie zastosowaliśmy systematyczną ewolucję ligandów przez wykładniczy protokół wzbogacania do biblioteki jednoniciowych cząsteczek DNA zawierających randomizowaną 40-nukleotydową sekwencję do wyizolować aptamery wiążące fosfolamban. Jeden z otrzymanych aptamerów, oznaczony jako Apt-9, wiązał się specyficznie z cytoplazmatycznym regionem fosfolambanu in vitro z wysokim powinowactwem (stała dysocjacji, ok. 20 nM). Apt-9 zwiększał zależną od Ca(2+) aktywność ATPazy pęcherzyków SR pęcherzyków, ale nie pęcherzyków SR z mięśni szkieletowych w sposób sposób zależny od stężenia. Przesunęła również krzywą stężenie-odpowiedź Ca(2+) dla tej aktywności ATPazy w lewo. Te efekty Apt-9 nie były naśladowane przez oligonukleotyd z zakodowaną wersją sekwencji Apt-9. Zatem nasze wyniki wskazują, że Apt-9 aktywuje SERCA2a poprzez łagodząc hamujący wpływ fosfolambanu na tę ATPazę, a także sugerują, że aptamery specyficzne dla fosfolambanu uzasadniają dalsze badania jako jako potencjalne środki terapeutyczne w niewydolności serca i kardiomiopatii. --- Regulacja sarko(endo)plazmowej retikulum Ca2+-ATPazy (SERCA 2a) zależy od stanu fosforylacji stanu fosforylacji fosfolambanu (PLB). Kiedy PLB jest fosforylowany, jego hamujący wpływ na SERCA 2a zostaje złagodzony, co prowadzi do zwiększenia wydajności mięśnia sercowego. Proces ten jest odwracany przez retikulum sarkoplazmatyczne (SR) fosfataza białkowa typu 1 (PP1) składająca się z podjednostki katalitycznej PP1C i podjednostki regulatorowej GM. Ludzkie GM i PLB zostały wyprodukowane w systemie transkrypcji/translacji in System transkrypcji / translacji in vitro i używany do koimmunoprecypitacji i eksperymentów z biosensorami. Wykryta interakcja między dwoma partnerami sugeruje, że sercowy PPI jest ukierunkowany na PLB poprzez GM i uważamy, że ten proces proces zachodzi z udziałem zidentyfikowanych domen transmembranowych obu białek. Zatem interakcja między PLB i GM może stanowić specyficzny sposób modulować funkcję SR w ludzkim mięśniu sercowym. --- Przejściowe wzrosty wewnątrzkomórkowego Ca2+ odgrywają rolę sygnalizacyjną w takich złożonych funkcjach komórkowych, takich jak skurcz, wydzielanie, zapłodnienie, proliferacja, metabolizm, bicie serca i pamięć. Jednak długotrwałe podniesienie Ca2+ powyżej około 10 mikroM jest szkodliwe dla komórki i może aktywować apoptozę. W mięśniach istnieje wąskie okno dysregulacji Ca2+, w którym nieprawidłowości w białkach regulatorowych Ca2+ mogą prowadzić do choroby, a nie apoptozy. Kluczowe białkami w regulacji Ca2+ w mięśniach są białka zależne od napięcia, wrażliwe na dihydropirydynę, kanały Ca2+ typu L zlokalizowane w kanaliku poprzecznym i kanały uwalniania Ca2+ w połączonych cysternach końcowych retikulum sarkoplazmatycznego. Nieprawidłowości w tych białkach odgrywają kluczową rolę w hipertermii złośliwej (MH), toksycznej odpowiedzi na środki znieczulające, oraz w centralnej chorobie rdzenia (CCD). (CCD), miopatii mięśniowej. ATPazy Ca2+ retikulum sarko(endo)plazmatycznego (SERCA) (SERCA) zwracają sarkoplazmatyczny Ca2+ do światła retikulum sarkoplazmatycznego. Utrata funkcji pompy SERCA1a Ca2+ jest jedną z przyczyn indukowanego wysiłkiem upośledzenia rozluźnienia mięśni szkieletowych w chorobie Brody'ego. Fosfolamban wyrażony w mięśniu sercowym i sarkolipina wyrażana w mięśniach szkieletowych regulują aktywność SERCA aktywność. Badania na znokautowanych i transgenicznych myszach pokazują, że wzmocnienie hamującej funkcji fosfolambanu hamującej funkcji fosfolambanu zmienia kurczliwość mięśnia sercowego i może być przyczyną w niektórych kardiomiopatiach. Kalsekwestryna, kalretikulina i szereg innych innych kwaśnych, lumenalnych białek wiążących Ca2+ zapewniają bufor dla Ca2+ przechowywanego w retikulum sarkoplazmatycznym. retikulum sarkoplazmatycznym. Nadekspresja kalsekwestryny sercowej prowadzi do kardiomiopatii, a ablacja kalretikuliny zmienia rozwój serca. --- Fosfolamban (PLN) jest endogennym inhibitorem sarko(endo)plazmowej retikulum Ca(2+)-ATPazy (SERCA), integralnego enzymu błonowego odpowiedzialnego za 70% usuwania Ca(2+) z cytozolu, indukując rozluźnienie mięśnia sercowego u ludzi. mięśnia sercowego u ludzi. Dysfunkcje w interakcjach SERCA:PLN zostały odgrywają kluczową rolę w chorobach serca, a ukierunkowanie transportu Ca(2+) wykazano, że jest to obiecująca droga w leczeniu niewydolności serca. niewydolności serca. Tutaj zaprojektowaliśmy serię nowych mutantów zdolnych do dostrojenia funkcji SERCA celując w sekwencję pętli, która łączy helisę transbłonową i cytoplazmatyczną. cytoplazmatyczne helisy PLN. Odkryliśmy, że zmienny stopień utraty hamowania jest osiągalny poprzez inżynierię mutacji glicyny wzdłuż domeny pętli PLN. domeny pętli. Co ciekawe, podwójna mutacja glicyny skutkuje całkowitą utratą funkcji mutanta. mutanta, w pełni naśladującego fosforylowany stan PLN. Używając spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego, zracjonalizowaliśmy efekty tych mutacji w kategoriach entropii mutacji w kategoriach entropijnej kontroli funkcji PLN, której hamująca funkcja może być modulowana poprzez zwiększenie jej dynamiki konformacyjnej. Jednakże, jeśli mutacje PLN przekraczają próg ustalony przez stan fosforylacji, przerywają one strukturalne sprzężenie między domenami transbłonowymi i cytoplazmatycznymi, w wyniku czego powstaje gatunek, który zachowuje się jak hamująca domena transmembranowa samodzielnie. Badania te dostarczają nowych potencjalnych kandydatów do terapii genowej w celu odwrócenia skutków niewydolności serca. --- Regulacja pompy wapniowej SERCA przez fosfolamban (PLB) jest w dużej mierze spowodowana interakcji między ich odpowiednimi domenami transmembranowymi. Pomimo mutagenezy i badań kinetycznych, wciąż nie mamy jasnego mechanistycznego obrazu tego, jak PLB wpływa na cykl transportu wapnia SERCA. W tym celu stworzyliśmy mutanty alaninowe dla każdej reszty w domenie transbłonowej PLB. domeny PLB, dokonaliśmy ko-rekonstytucji tych mutantów z SERCA do proteoliposomy i przeprowadziliśmy symulacje kinetyczne aktywności ATPazy izotermy aktywności ATPazy zależnej od wapnia. Mutanty transbłonowe PLB miały zmienny wpływ na zmienny wpływ na powinowactwo do wapnia, maksymalną aktywność i kooperatywność SERCA, tak że zaobserwowano zakres wartości. Symulacje kinetyczne wykorzystujące dobrze ugruntowany schemat reakcji dla SERCA pozwolił nam skorelować na aktywność SERCA ze zmianami stałych szybkości schematu reakcji. Obecność PLB miała wpływ tylko na trzy etapy schematu reakcji, mianowicie wiązanie pierwszego jonu wapnia, późniejsza zmiana konformacyjna w SERCA i wiązanie drugiego jonu wapnia. SERCA i wiązanie drugiego jonu wapnia. Zdolność dzikiego typu i zmutowane formy PLB do zmiany pozornego powinowactwa wapnia SERCA skorelowane ze zmniejszoną szybkością wiązania drugiego jonu wapnia. Ponadto zdolność typu dzikiego i zmutowanych form PLB do zmiany maksymalnej aktywności SERCA korelowała ze zmianą stałej szybkości do przodu dla powolnej zmiana konformacyjna w SERCA po związaniu pierwszego jonu wapnia. --- Fosforylacja przez kinazę białkową A i defosforylacja przez fosfatazę białkową 1 modulują hamującą aktywność fosfolambanu (PLN), endogennego regulatora endogennego regulatora sarko(endo)plazmocytowej ATPazy wapniowej Ca(2+) (SERCA). Ten cykliczny mechanizm stanowi siłę napędową wychwytu wapnia z cytoplazmy do mięśnia sercowego. z cytoplazmy do światła mięśnia sercowego, regulując kurczliwość serca. PLN przechodzi przejście konformacyjne między stanem zrelaksowanym (R) i napiętym (T), równowaga zaburzona przez dodanie SERCA. Tutaj pokazujemy, że pojedynczy przeniesienie fosforylu na Ser16 indukuje bardziej wyraźne przejście konformacyjne do stanu R w fosforylowanym PLN (pPLN). Powinowactwo wiązania PLN do SERCA nie ulega zmianie (wartości K(d) dla domen transmembranowych pPLN i PLN wynoszą około 60 mikroM), wspierając hipotezę, że fosforylacja przy Ser16 nie powoduje dysocjacji PLN z SERCA. Jednak powierzchnia wiązania i dynamika dynamika w domenie Ib (reszty 22-31) zmieniają się znacząco po fosforylacji. Ponieważ PLN może być pojedynczo lub podwójnie fosforylowany w Ser16 i Thr17, proponujemy, aby te miejsca zdalnie kontrolowały konformację domeny Ib. Odkrycia te stanowią paradygmat dla tego, w jaki sposób potranslacyjne modyfikacje modyfikacje, takie jak fosforylacja w cytoplazmatycznej części białek błonowych białek błonowych kontrolują wewnątrzbłonowe interakcje białko-białko. --- Wykorzystaliśmy spektroskopię EPR do bezpośredniego badania interakcji między fosfolambanem (PLB) i jego celem regulacyjnym, sarkoplazmatyczną retikulum Ca-ATPazą (SERCA). Syntetyczny monomeryczny PLB przygotowano z pojedynczą cytoplazmatyczną cysteiną przy reszcie 11. resztę 11, którą następnie znakowano spinowo. PLB odtworzono w błonach w obecności obecności lub nieobecności SERCA, a mobilność i dostępność etykiety spinowej były dostępność. Etykieta spinowa była dość ruchliwa rotacyjnie pod nieobecność SERCA, ale stała się bardziej ograniczona w obecności SERCA. SERCA również zmniejszyła zależność ruchliwości etykiety spinowej od stężenia PLB w błonie, wskazując, że SERCA zmniejsza interakcje PLB-PLB. Etykieta spinowa MTSSL, przyłączony do Cys11 na PLB przez wiązanie disiarczkowe, był stabilny w pozycji 11 w nieobecności SERCA. W obecności SERCA etykieta spinowa została uwolniona, a wiązanie kowalencyjne wiązanie kowalencyjne zostało utworzone między PLB i SERCA, wskazując na bezpośrednią interakcję cysteiny SERCA z Cys11 na PLB. Dostępność związanej z PLB związanej z PLB etykiety spinowej IPSL do środków paramagnetycznych, zlokalizowanych w różnych fazach membrany, wskazuje, że SERCA znacznie zmniejsza poziom interakcji etykiety spinowej z powierzchnią błony. Proponujemy, aby cytoplazmatyczna domena domena PLB wiąże się z powierzchnią lipidową, a asocjacja z SERCA indukuje główną zmianę konformacyjną w PLB, w której domena cytoplazmatyczna jest odciągana od powierzchni lipidów przez SERCA. --- Komórki śródbłonka naczyniowego regulują napięcie mięśni gładkich naczyń poprzez zależną od Ca2+ produkcję i uwalnianie cząsteczek wazoaktywnych. Fosfolamban (PLB) jest fosfoproteiną o masie 24-27 kDa, która moduluje aktywność sarko(endo)plazmocytów. sarko(endo)plazmocytarnej ATPazy Ca2+ (SERCA). Ekspresja PLB jest podobno ograniczona do mięśnia sercowego, wolnokurczliwych mięśni szkieletowych i gładkich, w których PLB jest ważnym regulatorem [Ca2+]i i kurczliwości w tych mięśniach. W W niniejszym badaniu donosimy o istnieniu PLB w śródbłonku naczyniowym, a nie-mięśniowej tkance i dostarczamy funkcjonalnych danych na temat regulacji PLB naczyń krwionośnych poprzez jego działanie w śródbłonku. Zależna od śródbłonka relaksacja acetylocholiny była osłabiona w aorcie myszy z niedoborem PLB (PLB-KO) myszy w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego (WT). Efekt ten nie był spowodowany działaniem tlenku azotu na mięśnie gładkie, ponieważ nitroprusydek sodu pośredniczył w relaksacja w aortach pozbawionych lub nienaruszonych śródbłonka nie była zmieniona przez ablację PLB ablacja. W porównaniu do naczyń pozbawionych śródbłonka, relaksacja do forskoliny była zwiększona w WT aortach nienaruszonych przez śródbłonek. Zależny od śródbłonka składnik tego był osłabiony w aortach PLB-KO. Aby zbadać, czy te zmiany były spowodowane przez PLB, wyizolowano komórki śródbłonka aorty myszy WT. Zarówno odwrotna reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy-polimerazy i analizy Western blot ujawniły obecność PLB w komórkach śródbłonka, które wykazano jako >98% czyste przez wychwyt diI-acetylowanego LDL i barwienie jądrowe. Dane te wskazują, że PLB jest obecny i moduluje funkcję naczyniową w wyniku swoich działań w komórkach śródbłonka komórkach śródbłonka. Obecność PLB w komórkach śródbłonka otwiera nowe pola dla badania szlaków regulacyjnych Ca2+ w komórkach niemięśniowych i modulacji interakcji śródbłonek-naczynia.
Czy fosfolamban jest białkiem regulującym/hamującym ATPazę Ca SERCA?
Fosfolamban (PLB) jest fosfoproteiną o masie 24-27 kDa, która moduluje aktywność ATPazy Ca2+ siateczki sarko(endo)plazmatycznej (SERCA). Ekspresja PLB jest podobno ograniczona do mięśnia sercowego, wolnokurczliwych mięśni szkieletowych i gładkich, w których PLB jest ważnym regulatorem [Ca2+]i i kurczliwości w tych mięśniach. Kompleks białek błonowych między sarkoplazmatyczną retikulum Ca(2+)-ATPazą (SERCA) i fosfolambanem (PLN) kontroluje transport Ca(2+) w kardiomiocytach, modulując w ten sposób kurczliwość serca. Stymulowana β-adrenergicznie fosforylacja PLN w Ser-16 zwiększa aktywność SERCA poprzez nieznany mechanizm.