HER2-dodatni rak piersi charakteryzuje się agresywnym wzrostem i złym rokowaniem. rokowaniem. Kobiety z przerzutowym rakiem piersi z nadmierną ekspresją białka HER2 lub nadmierną obecnością kopii genu HER2 są potencjalnymi kandydatkami na Herceptin (Trastuzumab), który wiąże się z receptorami HER2 na komórkach nowotworowych i hamuje wzrost komórek nowotworowych. i hamuje wzrost komórek nowotworowych. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest jedną z najczęściej stosowanych metod określania statusu HER2. Zazwyczaj, ocena obrazów FISH obejmuje ręczne zliczanie sygnałów FISH na wielu obrazów, co jest czasochłonną i podatną na błędy procedurą. Niedawno opracowaliśmy nowe oprogramowanie do zautomatyzowanej oceny obrazów FISH, a w niniejszym badaniu przedstawiamy pierwsze testy tego oprogramowania na obrazach z dwóch oddzielnych klinik badawczych. klinik. Zgodnie z naszą wiedzą, jest to pierwsza jednoczesna ocena jakiegokolwiek oprogramowania do analizy obrazów FISH w dwóch różnych klinikach. Ocena pokazuje, że FISH może przyspieszyć ocenę statusu HER2 w większości przypadków raka piersi. w większości przypadków raka piersi. --- Fosforylacja białka H2AX jest wczesnym etapem w szlaku naprawy podwójnego pęknięcia nici (DSB). (DSB); dlatego fosforylowane ogniska histonów (γH2AX) są szeroko stosowane jako jest szeroko stosowana jako miara dla DSB. Ocena ognisk jest wykonywana ręcznie lub półautomatycznie przy użyciu ręcznego oprogramowania do przechwytywania i analizy obrazu. Ogólnie Ogólnie rzecz biorąc, obie techniki są pracochłonne i podatne na artefakty związane z ręcznym punktowaniem. Chociaż w literaturze opisano kilka w pełni zautomatyzowanych metod w literaturze, żadna z nich nie została wykorzystana do ilościowego określenia ognisk γH2AX w połączeniu z analizą fazy cyklu komórkowego. Dodanie tej funkcji do szybkiej zautomatyzowanej metody kwantyfikacji ognisk γH2AX zmniejszyłoby niepewność punktacji, która wynika z wahań poziomu tła i fazy cyklu komórkowego. zmienności poziomu tła sygnału γH2AX w całym cyklu komórkowym. cyklu komórkowego. Metoda została skonfigurowana do pomiaru uszkodzeń DNA indukowanych w ludzkich komórkach nabłonka sutka przez napromieniowanie pod urządzeniem mammograficznym. Zaadaptowaliśmy metodę FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) system zliczania plamek, który ma slajd z automatycznym skanowaniem i systemem przechwytywania komórek na całej grubości każdej komórki (z-stack), aby spełnić nasze wymagania testowe. Podczas skanowania próbki, system klasyfikuje wybrane jądra zgodnie z wzorcami sygnału wzorców sygnału opisanych wcześniej przez użytkownika. Dla naszych celów przeprowadzono podwójne barwienie immunofluorescencję przeprowadzono z przeciwciałami do wykrywania γH2AX i pericentryny, integralnego składnika centrosomu. W ten sposób mogliśmy rozróżnić zarówno liczbę ognisk γH2AX na komórkę, jak i fazę cyklu komórkowego. Ponadto, restrykcyjne ustawienia klasyfikatora programu zredukowały problem "dotykających się jąder" opisany w innych programach do analizy obrazu. Automatyczna ocena była szybsza i równie czuła jak jej ręcznie wykonywany odpowiednik. Ten system jest niezawodnym narzędziem do zliczania ognisk γH2AX indukowanych radiowo i dostarcza istotnych informacji o etapie cyklu komórkowego. W ten sposób oferuje bardziej kompletną i szybką ocenę uszkodzeń DNA. --- 1. --- Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest molekularną techniką diagnostyczną, w której fluorescencyjnie znakowana sonda w której znakowana fluorescencyjnie sonda hybrydyzuje z docelową sekwencją nukleotydową kwasu nukleinowego dezoksyrybozy kwasu nukleinowego. Po wzbudzeniu, każdy chromosom zawierający docelową sekwencję wytwarza sygnał fluorescencyjny (plamkę). Ponieważ liczenie plamek fluorescencyjnych jest żmudne i często subiektywne, pożądane są zautomatyzowane algorytmy cyfrowe do zliczania plamek. pożądane. Nowa technologia zapewnia stos obrazów na wielu płaszczyznach ogniskowych w całej próbce tkanki. Obrazowanie wieloogniskowe pomaga przezwyciężyć stronniczości i niedokładności nieodłącznie związanych z metodami jednoogniskowymi. W niniejszym artykule zaproponowano algorytm globalnego zliczania plamek na trójwymiarowych trójwymiarowych obrazach FISH bez konieczności segmentacji jąder. Został on zaprojektowany do pracy w złożonym tle, gdy występują aglomerowane jądra i w obecności gradientów oświetlenia. obecności gradientów oświetlenia. Opiera się na morfologicznej transformacie top-hat która lokalizuje skoki intensywności na nieregularnych tłach. Po w obrazach przekrojów, algorytm grupuje je, tworząc trójwymiarowe plamki. trójwymiarowe plamki. Filtry są stosowane w celu oddzielenia prawidłowych plam od fluorescencyjnego szumu. Algorytm jest osadzony w kompleksowym zestawie narzędzi, który zapewnia wizualizację i możliwości analityczne. Zawiera oprogramowanie symulacyjne, które umożliwia badanie wydajności algorytmu dla różnych ustawień parametrów obrazu i algorytmu, w tym algorytmu, w tym rozmiaru sygnału, gęstości sygnału i liczby plasterków. plasterków. --- TŁO: Jednoczesne wykrywanie ekspresji białek i zmian liczby kopii genów w próbkach pacjentów, takich jak skrawki tkanek zatopione w parafinie, jest wyzwaniem, ponieważ procedury immunohistochemii (IHC) i fluorescencji in situ (FISH) negatywnie wpływają na siebie nawzajem, co często skutkuje w nieoptymalnym barwieniu. Dlatego opracowaliśmy nowy zautomatyzowany algorytm oparty na relokacji, który umożliwia późniejsze wykrywanie zawartości białka i zmiany liczby kopii genów w tej samej komórce. METODY: Skrawki tkanek raka jelita grubego zatopione w parafinie zostały wybarwione na ekspresję dla ekspresji CD133. Uzyskano obrazy IHC i zarejestrowano współrzędne obrazu. Skrawki poddano następnie hybrydyzacji z fluorescencyjnie znakowanymi sondami DNA. OBRAZY FISH zostały wykonane w uprzednio zarejestrowanych pozycjach, co pozwoliło na bezpośrednie porównanie ekspresji białka i sygnałów liczby kopii genów w tych samych komórkach/obszarach tkanki. komórek/obszarów tkanek. Relokacja, akwizycja obrazów IHC i FISH oraz sygnałów FISH w immunofenotypowanych obszarach guza zostały wykonane w sposób zautomatyzowany sposób. WYNIKI: Zautomatyzowana analiza FISH została przeprowadzona na 13 różnych próbkach raka okrężnicy które zostały wybarwione na obecność CD133; każda próbka została oceniona pod kątem MYC, ZNF217 i chromosomu 6 w gruczołach CD133 dodatnich i ujemnych. Z 13 przypadków cztery (31%) wykazywały amplifikację onkogenu MYC, a siedem z 13 (54%) przypadków było amplifikację dla ZNF217. Nie było znaczącej różnicy między guzem CD133 dodatnim i CD133 ujemnymi komórkami nowotworowymi. WNIOSEK: Przedstawiona tutaj technika i algorytm umożliwiają łatwe i powtarzalne połączenie IHC i FISH w oparciu o nowatorski zautomatyzowany algorytm wykorzystującym relokację i automatyczne zliczanie plamek. --- Multipleksowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (M-FISH) to niedawno opracowana technologia technologia, która umożliwia wielobarwne kariotypowanie chromosomów do analizy molekularnej analizy cytogenetycznej. Każdy zestaw obrazów M-FISH składa się z wielu wyrównanych obrazów tej samej próbki chromosomu wykonanych przy różnej długości fali optycznej. Niniejszy artykuł przedstawia wbudowane kodowanie obrazu M-FISH (EMIC), w którym obiekty pierwszoplanowe obiekty/chromosomy i obiekty/obrazy tła są kodowane oddzielnie. My najpierw zastosować krytycznie próbkowaną całkowitą transformatę falkową zarówno do pierwszego planu, jak i tła. i tła. Następnie używamy kodowania bitowego opartego na obiektach do kompresji każdego obiektu i generujemy oddzielne osadzone strumienie bitów, które umożliwiają ciągłą bezstratną kompresję pierwszego planu i tła. Dla wydajnego kodowania arytmetycznego płaszczyzn bitowych, proponujemy metodę projektowania optymalnego modelu kontekstowego, który w szczególności wykorzystuje charakterystykę statystyczną statystyczne obrazów M-FISH w domenie falkowej. Nasze eksperymenty pokazują, że EMIC osiąga prawie dwukrotnie większą kompresję niż kodowanie Lempel-Ziv-Welch. EMIC działa również znacznie lepiej niż JPEG-LS i JPEG-2000 w przypadku kodowania bezstratnego. Wydajność stratnego EMIC jest znacznie lepsza niż w przypadku kodowania każdego obrazu M-FISH za pomocą JPEG-2000. --- Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) jest główną techniką cytogenetyczną służącą do klinicznej diagnostyki genetycznej zarówno dziedzicznych, jak i nabytych nieprawidłowości chromosomalnych. nieprawidłowości chromosomowych. Chociaż techniki FISH ewoluowały i są często stosowane razem z innymi metodami cytogenetycznymi, takimi jak z innymi metodami cytogenetycznymi, takimi jak CGH, PRINS i PNA-FISH, proces ten jest nadal nadal jest ręczną, pracochłonną, kosztowną i czasochłonną techniką, często trwającą ponad 3,5 dnia. czasochłonną techniką, często trwającą ponad 3-5 dni, nawet w wyspecjalizowanych laboratoriach. Opracowaliśmy nowatorskie urządzenie microFISH do wykonywania metafazowej FISH na chipie, które przezwycięża wiele niedociągnięć obecnych protokołów laboratoryjnych. Ta praca wprowadza również nowatorskie urządzenie do rozpryskiwania do przygotowywania metafaz na szkiełku mikroskopowym. szkiełku mikroskopowym, a następnie szybki protokół klejenia oparty na taśmie klejącej, prowadzący do szybkiej produkcji urządzenia microFISH. Urządzenie microFISH pozwala na zoptymalizowany protokół metafazowej FISH na chipie z ponad 20-krotną redukcją objętości odczynnika objętości odczynnika. Jest to pierwsza demonstracja metafazowej FISH na urządzeniu mikroprzepływowym i oferuje możliwość automatyzacji i znacznej redukcji kosztów wielu rutynowych testów diagnostycznych wielu rutynowych testów diagnostycznych anomalii genetycznych. --- MOTYWACJA: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służy do badania organizacji i położenia określonych sekwencji DNA w komórce. i pozycjonowania określonych sekwencji DNA w jądrze komórkowym. jądra komórkowego. Analiza danych z obrazów FISH jest żmudnym procesem, który wywołuje element subiektywności. element subiektywności. Zautomatyzowana analiza obrazów FISH zapewnia oszczędność czasu a także korzyści płynące z obiektywnej analizy danych. Podczas gdy opracowano kilka narzędzi zostało opracowanych kilka narzędzi programowych do analizy obrazów FISH, często wykorzystują one algorytm segmentacji jądra oparty na progach. Ponieważ intensywność sygnału fluorescencji intensywność sygnału fluorescencji może się znacznie różnić w zależności od eksperymentu, od od komórki do komórki i w obrębie komórki, segmentacja progowa jest nieelastyczna i często niewystarczająca do automatycznej analizy obrazu. często niewystarczająca do automatycznej analizy obrazu, prowadząc do dodatkowej ręcznej ręcznej segmentacji i potencjalnej subiektywnej stronniczości. Aby przezwyciężyć te problemy graficzne o nazwie FISH Finder do automatycznej analizy obrazów FISH, które znacząco się różnią. FISH, które znacznie się różnią. Stawiając segmentację jądra jako problem jako problem klasyfikacyjny, zastosowano złożony klasyfikator Bayesa, dzięki czemu informacje kontekstowe, co skutkuje niezawodną klasyfikacją i ekstrakcją granic. wiarygodną klasyfikację i ekstrakcję granic. Umożliwia to wydajną i obiektywną analizę obrazów FISH i obiektywną analizę obrazów FISH bez konieczności dostosowywania parametrów wejściowych. Dodatkowo, FISH Finder został zaprojektowany do analizy odległości między różnie wybarwionymi sondami FISH FISH. DOSTĘPNOŚĆ: FISH Finder jest samodzielną aplikacją MATLAB i niezależnym od platformy oprogramowaniem. niezależną od platformy. Program jest dostępny bezpłatnie na stronie: http://code.google.com/p/fishfinder/downloads/list. --- Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) ekspresji genów regulowanych aktywnością neuronalną, natychmiastowo wczesnej ekspresji genów (IEG) zapewnia metodę funkcjonalnego obrazowania mózgu z rozdzielczością komórkową. mózgu z rozdzielczością komórkową. Umożliwia to identyfikację, w jednym mózgu, których określone główne neurony były aktywne podczas każdej z dwóch odrębnych epok behawioralnych. Bezprecedensowy potencjał tej metody różnicowej dla analizy funkcjonalnych obwodów neuronalnych na dużą skalę jest jednak ograniczony przez czasochłonny charakter ręcznej analizy obrazu. Kompleksowe narzędzie programowe do przetwarzania trójwymiarowych, wielospektralnych stosów obrazów konfokalnych jest które wspiera automatyzację tej analizy. Jądra barwione konwencjonalnymi barwnikami DNA i sygnałami FISH wskazującymi na subkomórkową dystrybucję specyficznych gatunków RNA IEG są obrazowane przy użyciu różnych kanałów spektralnych. kanałów spektralnych. Dane kanału DNA są segmentowane na poszczególne jądra przez trójwymiarowy algorytm wieloetapowy, który koryguje zależne od głębokości zależne od głębokości tłumienie, nieizotropowe woksele i szum obrazowania. Sygnały wewnątrzjądrowe i cytoplazmatyczne sygnały FISH są powiązane przestrzennie z segmentacją jądrową w celu wygenerowania szczegółowej tabeli/bazy danych i reprezentacji graficznej. Tutaj przedstawiamy kompleksową walidację danych wygenerowanych przez zautomatyzowane oprogramowanie oprogramowanie w porównaniu z ręczną kwantyfikacją przez ludzkich ekspertów w hipokampie i ciemieniowych (96,5% zgodności z konsensusem wielu ekspertów). Wysoka wysoki stopień niezawodności i dokładności sugeruje, że oprogramowanie będzie dobrze uogólnić na wiele obszarów mózgu i ostatecznie na analizę mózgu na dużą skalę. analizy.
Czy istnieje oprogramowanie do automatycznej analizy obrazów FISH?
FISH jest popularną metodą cytogenetyki molekularnej. Wynikiem pojedynczej analizy FISH jest zestaw kilkudziesięciu lub kilkuset obrazów mikroskopowych - pojedyncza oceniana próbka ma średnicę około 20 mm. Celem zautomatyzowanej oceny jest zastąpienie subiektywnej oceny obrazów przez technika laboratoryjnego w celu uzyskania większej jednorodności wyników. Po wyjaśnieniu zasady metody i typowej zawartości obrazów, opisano przebieg przetwarzania segmentacji obrazów i przedstawiono wyniki na kilku przykładowych obrazach. Na podstawie wyników opracowano oprogramowanie do automatycznej analizy obrazów FISH.