Kompleksy remodelujące nukleosomy odgrywają kluczową rolę w aktywacji genów w odpowiedzi na zmiany środowiskowe na zmiany środowiskowe, napędzając chromatynę promotora, aby osiągnąć dostępną konfigurację konfiguracji. Pośredniczą również w organizacji chromatyny w całym genomie, chociaż ich rola w procesach innych niż remodelowanie chromatyny związane z aktywacją jest słabo poznane. Gen ADH2 Saccharomyces cerevisiae reprezentuje doskonały model do zrozumienia roli struktury chromatyny i w regulacji genów. Po wyczerpaniu glukozy, wysoko umiejscowione nukleosomy promotora nukleosomy promotora są destabilizowane, co prowadzi do ściśle regulowanej kinetyki aktywacji transkrypcyjnej. aktywacji transkrypcji. Niemniej jednak, żadna z aktywności remodelujących chromatynę odpowiedzialnych za tworzenie lub przebudowę struktury chromatyny ADH2. struktury chromatyny. Tutaj pokazujemy, że brak Isw1 i Chd1 ATP-zależnych aktywności remodelujących chromatynę opóźnia maksymalną ekspresję ADH2 bez upośledzania remodelowania chromatyny, które występuje po aktywacji. Zamiast tego, zdestabilizowana struktura chromatyny w regionie kodującym i terminacyjnym ADH2 obserwuje się przy braku Isw1 lub Chd1 w warunkach represyjnych. Specyficzny kompleks specyficzny kompleks Isw1 zaangażowany w to repozycjonowanie nukleosomu to Isw1b, ponieważ delecja Ioc2 i Ioc4, ale nie Ioc3, powoduje taki sam fenotyp jak delecja Isw1. delecja Isw1. Co więcej, brak Chd1 w połączeniu z brakiem Isw1 i Isw2 upośledza odstępy między nukleosomami wzdłuż genu ADH2 i całego genomu w S. cerevisiae. Tak więc czynniki remodelujące ISWI i Chd1 są zaangażowane nie tylko w remodelowanie chromatyny związane z transkrypcją, ale są również wymagane do utrzymania specyficznej konfiguracji chromatyny w całym genomie drożdży. --- Specyficzne modyfikacje potranslacyjne histonów wpływają na wiele procesów jądrowych, w tym na procesy, w tym regulację genów, naprawę DNA i replikację. Ostatnie badania zidentyfikowały białka efektorowe, które rozpoznają wzorce modyfikacji histonów modyfikacji histonów i przekazują ich funkcję w dalszych procesach. Na przykład, wykazano, że acetylotransferazy histonowe (HAT) uczestniczą w wielu istotnych procesach komórkowych, szczególnie tych związanych z aktywacją transkrypcji. Drożdżowa SAGA (acetylotransferaza Spt-Ada-Gcn5) i SLIK (SAGA-like) są dwoma wysoce homologicznymi i konserwowanymi wielopodjednostkowymi kompleksami HAT, które preferencyjnie acetylują histony H3 i H2B oraz deubikwitynują histon H2B. Tutaj identyfikujemy białko remodelujące chromatynę Chd1 (chromo-ATPase/helicase-DNA binding domain 1) jako składnik SAGA i SLIK. Nasze odkrycia wskazują, że jedna z dwóch chromodomen Chd1 specyficznie oddziałuje z metylowanym znacznikiem lizyny 4 na histonie H3, który jest związany z aktywnością transkrypcyjną. z aktywnością transkrypcyjną. Ponadto, kompleks SLIK wykazuje zwiększoną acetylację metylowanego substratu, a aktywność ta jest zależna od funkcjonalnej chromodomeny wiążącej metyl, zarówno in vitro, jak i in vivo. Nasze badanie identyfikuje pierwszą chromodomenę, która rozpoznaje metylowany histon H3 (Lys 4) i prawdopodobnie identyfikuje większą podrodzinę białek chromodomenowych o podobnych właściwościach właściwościach rozpoznawczych. --- Chromodomena z białka heterochromatyny 1 i białka polycomb jest znana jako metylowany lizyną moduł wiążący ogon histonu H3. Chromo-helikaza/ATPaza Białko wiążące DNA 1 (CHD1) jest zależnym od ATP czynnikiem remodelującym chromatynę, zawierającym dwie tandemowe chromodomeny. W ludzkim CHD1 oba chromodomeny są niezbędne do specyficznego wiązania z peptydem K4 metylowanego histonu H3 (H3 MeK4) i stwierdzono, że wiążą się one kooperatywnie w strukturze krystalicznej. Dla homologa homolog drożdży, Chd1, druga, ale nie pierwsza chromodomena była kiedyś wiązała się z peptydem H3 MeK4. Tutaj ujawniamy, że ani druga chromodomena ani region zawierający tandemowe chromodomeny z drożdży Chd1 wiążą się do jakichkolwiek peptydów histonowych metylowanych lizyną lub argininą, które badaliśmy. badane. Ponadto zbadaliśmy struktury chromodomen z Chd1 za pomocą NMR. Chociaż struktura trzeciorzędowa regionu zawierającego tandemowe chromodomeny chromodomeny nie mogła zostać uzyskana, struktura drugorzędowa wydedukowana z NMR jest dobrze zachowana w strukturach trzeciorzędowych odpowiadających pierwszej i drugiej chromodomeny chromodomen określonych indywidualnie przez NMR. Obie chromodomeny Chd1 wykazują strukturę podobną do struktury odpowiadającej im części CHD1, składającą się z trójpasmowego arkusza beta, po którym następuje C-końcowa helisa alfa. Jednak dodatkowa helisa między pierwszą i drugą beta-pasmą, która znajduje się w obu znajduje się w obu pierwszych chromodomenach Chd1 i CHD1, jest umieszczona w zupełnie inny sposób w zupełnie inny sposób w Chd1 i CHD1. W ludzkim CHD1 ta helisa tworzy miejsce wiązania peptydu miejsce wiązania peptydu. Sekwencje aminokwasowe chromodomen mogą być dobrze dopasowane na podstawie tych struktur. Dopasowanie wykazało, że drożdżowy Chd1 brakuje kilku kluczowych reszt funkcjonalnych, które są odpowiedzialne za specyficzne wiązanie z metylowaną lizą. wiązanie z metylowanymi resztami lizyny w innych chromodomenach. Chd1 prawdopodobnie nie ma powinowactwa wiązania do żadnego peptydu H3 MeK, jak stwierdzono w innych chromodomenach białek. --- Zdefiniowanie czynników białkowych, które bezpośrednio rozpoznają potranslacyjne, kowalencyjne modyfikacje histonów ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia wpływu tych "znaków" chromatyny na regulację genów. W bieżącym badaniu zidentyfikowaliśmy ludzkie CHD1, zależne od ATP białko remodelujące chromatynę, jako czynnik, który bezpośrednio i selektywnie rozpoznaje histon H3 metylowany na lizynie 4. Badania wiązania in vitro zidentyfikowali, że CHD1 rozpoznaje di- i trimetylo H3K4 ze stałą dysocjacji (Kd). stałą dysocjacji (Kd) około 5 mikrometrów, podczas gdy monometyl H3K4 wiąże CHD1 z 3-krotnie niższym powinowactwem. Co zaskakujące, ludzki CHD1 wiąże się z metylowany H3K4 w sposób, który wymaga obu jego tandemowych chromodomen. Analizy in analizy in vitro pokazują, że w przeciwieństwie do ludzkiego CHD1, drożdżowy Chd1 nie wiąże metylowanego H3K4. Nasze odkrycia wskazują, że drożdżowy i ludzki CHD1 różnią się w ich zdolności do rozróżniania kowalencyjnie zmodyfikowanych histonów i łączenia modyfikacji histonów rozpoznawania modyfikacji i niekowalencyjnego remodelowania chromatyny w obrębie pojedynczego ludzkiego białka. --- Molekularne białko motoryczne CHD1 zostało zaangażowane w regulację transkrypcji i w niezależnej od transkrypcji inkorporacji w całym genomie H3.3 do chromatyny ojcowskiej u Drosophila melanogaster. Kluczową cechą CHD1 jest obecność dwóch chromodomen, które mogą wiązać się z histonem H3 metylowanym przy lizyny 4 i w ten sposób mogą służyć do rekrutacji i/lub utrzymania CHD1 w chromatynie. Tutaj opisujemy genetyczne i biochemiczne podejścia do badania chromodomeny chromodomen CHD1 u Drosophila. Stwierdziliśmy, że ogólna lokalizacja CHD1 na chromosomach chromosomach polietylenowych nie zmienia się znacząco u muszek z mutantami chromodomen. W przeciwieństwie do tego, chromodomeny są ważne dla aktywności niezależnej od transkrypcji aktywności CHD1 podczas wczesnego rozwoju embrionalnego, jak również dla regulacji transkrypcji kilku genów szoku cieplnego. Jednak ani CHD1 ani jego chromodomeny nie są potrzebne do lokalizacji polimerazy RNA II i metylacji H3K4 metylacji, ale utrata CHD1 zmniejsza indukowaną transkrypcją eksmisję histonów w genie genu Hsp70 in vivo. Mutacje chromodomen negatywnie wpływają na aktywność składania chromatyny CHD1 in vitro i wydają się być zaangażowane w łączenie silnika zależnego od ATP silnika zależnego od ATP z funkcją składania chromatyny CHD1. --- Białka ISWI tworzą katalityczny rdzeń podzbioru ATP-zależnych aktywności remodelujących chromatynę u eukariontów od drożdży po człowieka. Wiele z tych kompleksów kompleksów repozycjonuje nukleosomy, ale w różnych kierunkach. Odkryliśmy, że enzymy drożdżowe Isw1a, Isw2 i Chd1 preferencyjnie przemieszczają nukleosomy w kierunku nukleosomy w kierunku bardziej centralnych lokalizacji na krótkich fragmentach DNA, podczas gdy Isw1b nie. Co ważne, nieodłączne właściwości pozycjonowania DNA odgrywają ważną rolę w określaniu, gdzie nukleosomy są przenoszone przez wszystkie te enzymy. enzymy. Jednak kluczową różnicą jest to, że enzymy Isw1a, Isw2 i Chd1 są nie są w stanie przemieścić nukleosomów do pozycji bliższych niż 15 bp od końca DNA, podczas gdy Isw1b może. Stwierdziliśmy również, że istnieje korelacja między niezdolnością enzymów do przemieszczania nukleosomów blisko końców DNA a preferencyjnym z nukleosomami niosącymi łącznik DNA. Obserwacje te sugerują, że dostępność DNA łącznikowego wraz z właściwościami pozycjonowania DNA odgrywają ważną rolę w określaniu wyniku przebudowy przez te enzymy. te enzymy. --- CHD1 jest konserwatywnym czynnikiem remodelującym chromatynę, który lokalizuje się do aktywnych genów i funkcjonuje w montażu i pozycjonowaniu nukleosomów, a także w obrocie histonów. obrotu. Mysz CHD1 jest wymagana do utrzymania pluripotencji komórek macierzystych podczas gdy ludzki CHD1 może funkcjonować jako supresor nowotworu. Aby zbadać działanie CHD1 na strukturę chromatyny wyższego rzędu w zróżnicowanych komórkach, zbadaliśmy konsekwencje utraty CHD1 i nadekspresji CHD1 na chromosomach polietylenowych z gruczołów ślinowych larw Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwoju. Zaobserwowaliśmy, że struktura chromosomów jest wrażliwa na ilość tego remodelera. remodelera. Utrata CHD1 spowodowała zmiany w strukturze chromosomów i wzrost heterochromatyny. wzrost białka heterochromatyny HP1a, podczas gdy nadekspresja CHD1 zaburzyła strukturę chromatyny wyższego rzędu i spowodowała spadek poziomów HP1a. Nadekspresja nieaktywnej formy ATPazy CHD1 nie skutkowała poważnymi defektami chromosomalnymi. poważnych defektów chromosomalnych, co sugeruje, że aktywność ATPazy jest wymagana dla tego fenotypu in vivo. tego fenotypu in vivo. Co ciekawe, zmiany w poziomach białka CHD1 nie korelują ze zmianami w poziomach znacznika euchromatyny H3K4me3 lub wydłużającej polimerazy RNA II. Tak więc, podczas gdy CHD1 jest zlokalizowany w regionach aktywnych transkrypcyjnie aktywnych regionów genomu, może działać w celu zmiany poziomów HP1a, być może poprzez zmiany w metylacji H3K9. --- Spt4-Spt5, ogólny czynnik elongacji transkrypcji dla polimerazy RNA II, również odgrywa rolę w regulacji chromatyny. Jednak relacje między tymi funkcjami nie są jasne. Wcześniej wyizolowaliśmy supresory mutacji Saccharomyces cerevisiae spt5 w genach kodujących członków kompleksu Paf1, który reguluje kilka kotranskrypcyjnych modyfikacji histonów i Chd1, enzymu remodelującego chromatynę enzym remodelujący chromatynę. Tutaj pokazujemy, że ta supresja spt5 może wynikać z utraty metylacji lizyny 4 lub 36 histonu H3 lub zmniejszonej rekrutacji Chd1 lub kompleksu Rpd3S. Te supresory spt5 również ratują syntetyczny wzrost wady obserwowane w mutantach spt5, którym również brakuje czynnika wydłużającego TFIIS. Używając genu reporterowego FLO8 stwierdziliśmy, że mutacja chd1 powodowała kryptyczną inicjację transkrypcji. transkrypcji. Ponadto zaobserwowaliśmy wzmocnienie kryptycznej inicjacji w mutantach chd1 isw1 i zwiększoną acetylację histonów w mutancie chd1. Sugerujemy że, jak wcześniej zaproponowano dla metylacji lizyny 36 H3 i kompleksu Rpd3S, metylacja lizyny H3 4 i funkcja Chd1 w celu utrzymania normalnej struktury chromatyny nad transkrybowanymi genami struktury chromatyny nad transkrybowanymi genami i że jedną z funkcji Spt4-Spt5 jest pomoc polimerazy RNA II w przezwyciężeniu represyjnego wpływu tych modyfikacji histonów i regulatorów chromatyny na transkrypcję.
Jaka jest funkcja molekularna białka Chd1?
Zależny od ATP enzym remodelujący chromatynę Chd1 jest białkiem o masie 168 kDa składającym się z podwójnej chromodomeny, domeny ATPazy związanej z Snf2 i C-końcowej domeny wiążącej DNA. Jedna z dwóch chromodomen Chd1 specyficznie oddziałuje z metylowanym znacznikiem lizyny 4 na histonie H3, który jest związany z aktywnością transkrypcyjną. Ludzki CHD1 jest zależnym od ATP białkiem remodelującym chromatynę, jako czynnik, który bezpośrednio i selektywnie rozpoznaje histon H3 metylowany na lizynie 4.