Domeny zmienne łańcucha ciężkiego przeciwciała (VH) pozbawione partnera w postaci łańcucha lekkiego (VL) są głównymi kandydatami do projektowania immunoreagentów o minimalnych rozmiarach. Aby uzyskać informacje strukturalne o izolowanych domenach VH, ludzki VH był znakowany znakowany 15N lub podwójnie znakowany zarówno 15N, jak i 13C i był badany przez heterojądrową spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego. Większość (90%) sygnałów 1H i 15N zostały przypisane poprzez dwuwymiarowe eksperymenty TOCSY i NOESY na nieznakowanym VH i trójwymiarowej heterojądrowej wielokrotnej korelacji kwantowej TOCSY i NOESY. korelacji kwantowej TOCSY i NOESY na znakowanym 15N VH. Cztery krótkie odcinki łańcucha polipeptydowego można było przypisać tylko na podstawie trójwymiarowych eksperymentów HNCA i HN(CO)CA na białku znakowanym 13C-/15N białku. Dalekozasięgowe NOE szkieletu międzypasmowego sugerują obecność dwóch sąsiednich beta-sheetów utworzonych przez dziewięć antyrównoległych beta-nitek. 3JNHC alfa H i lokalizacja wolno wymieniających się amidów szkieletowych wspierają tę interpretację. Struktura drugorzędowa izolowanego VH jest identyczna z domenami zmiennymi łańcucha ciężkiego w nienaruszonych przeciwciałach, gdzie domeny VH są upakowane względem domeny VL. Przypisanie szkieletu VH umożliwiło umożliwiło zlokalizowanie miejsca wiązania białka A. Ruchy przesunięcia chemicznego po kompleksowanie z fragmentem wiążącym IgG białka A wskazuje na wiązanie przez jeden z dwóch arkuszy beta VH. Ten arkusz beta jest odsłonięty przez rozpuszczalnik w nienaruszonych przeciwciałach. Miejsce wiązania białka A oczywiście różni się od tego w części Fc immunoglobulin. Fc immunoglobulin i jest unikalne dla członków ludzkiej podgrupy genu VHIII. podgrupy. --- 1. Zbadano funkcję temperatury szpiczakowej IgG(K) IVA, białka Bence-Jonesa (typu K) IVA i jego fragmentów (Fab(t), Fc'(t), VL i CL) badano za pomocą spektroskopii różnicowej perturbacji termicznych i dichroizmu kołowego. spektroskopię różnicową perturbacji termicznych i dichroizm kołowy. 2. IgG i białko Bence-Jonesa okazały się zdolne do w pełni odwracalnych zmian strukturalnych w temperaturach od 25 do 35°C. zmian strukturalnych w temperaturach od 25 do 35 stopni C. Zmianom zachodzącym w wyższej temperaturze towarzyszy wzrost temperatury. zachodzące w wyższej temperaturze towarzyszą przesiewaniu znacznej części odsłoniętych reszt tyrozyny. znacznej części odsłoniętych reszt tyrozynowych. Przejściu nie towarzyszą znaczącej zmianie w głównej strukturze drugorzędowej IgG - arkuszu plisowanym beta, zgodnie z danymi CD. 3. Stwierdzono, że zmiany zależne od temperatury IgG zachodzą w jej fragmentach Fab, zmiany białka Bence-Jonesa zachodzą w jego zmiennej części (domeny VL). jego zmiennej części (domeny VL). 4. Zmiany temperatury w przedziale 25-35 C są wyjaśnione przez elastyczność łańcuchów bocznych aminokwasów składających się na hiperzmienne pętle. hiperzmiennych pętli wyznaczających "boki" wnęki między zmiennymi domenami. --- Amyloidoza łańcucha lekkiego (AL) jest stanem patologicznym wynikającym z ogólnoustrojowego pozakomórkowego odkładania monoklonalnych łańcuchów lekkich immunoglobulin w postaci nierozpuszczalnych włókien amyloidowych, szczególnie w nerkach. nerkach. Istotne dowody sugerują, że tworzenie włókien amyloidowych z natywnych białek białek zachodzi poprzez zmianę konformacyjną prowadzącą do częściowo sfałdowanej konformacji pośredniej. konformacji pośredniej, której późniejsze połączenie jest kluczowym etapem fibrylacji. fibrylacji. W niniejszym badaniu zbadaliśmy właściwości rekombinowanego amyloidu. rekombinowanej domeny zmiennej amyloidogennego łańcucha lekkiego, SMA, w celu ustalenia, czy częściowo sfałdowane produkty pośrednie mogą być wykryte i skorelowane z agregacją. Wyniki pomiarów spektroskopowych i hydrodynamicznych, w tym dichroskopii kołowej w dalekiej i bliskiej dichroizm kołowy, FTIR, NMR i wewnętrzną fluorescencję tryptofanu oraz małokątowe rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego. rozpraszanie promieni rentgenowskich pod małym kątem, ujawniają nagromadzenie dwóch częściowo zwiniętych pośrednich stanów konformacyjnych w miarę obniżania pH (niskie pH destabilizuje destabilizuje białko i przyspiesza kinetykę agregacji). Względnie względnie natywny stan pośredni, I(N), zaobserwowano między pH 4 i 6, z niewielką utratą struktury drugorzędowej, ale ze znacznymi zmianami struktury trzeciorzędowej i zwiększone wiązanie ANS, co wskazuje na odsłonięte powierzchnie hydrofobowe. Przy pH poniżej 3 zaobserwowaliśmy stosunkowo rozwinięty, ale zwarty, pośredni, I (U), który był charakteryzował się zmniejszoną strukturą trzeciorzędową i drugorzędową. Półprodukt I(U) łatwo tworzy fibryle amyloidowe, podczas gdy I(N) preferencyjnie prowadzi do amorficznych agregatów. amorficznych agregatów. Z wyjątkiem pH 2, gdzie powstaje znikomy agregat amorficzny amorficzne agregaty tworzyły się znacznie szybciej niż fibryle. fibryle. Jest to pierwsza wskazówka, że różne częściowo sfałdowane pośrednie mogą być odpowiedzialne za różne ścieżki agregacji (amorficzne i fibrylarne). Dane te potwierdzają hipotezę, że tworzenie włókien amyloidowych wiąże się z uporządkowanym samoorganizowaniem się częściowo sfałdowanych gatunków, które są krytycznymi rozpuszczalnymi prekursorami fibryli. --- Struktura roztworu wyizolowanej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała (VH)-P8 została określona za pomocą spektroskopii NMR. Domena VH została wcześniej zmodyfikowana (camelised) w trzech pozycjach w jego dawnej zmiennej domenie łańcucha lekkiego przeciwciała (VL) w celu zmniejszenia hydrofobowości poprzez naśladowanie ciężkich łańcuchów wielbłądowatych naturalnie pozbawionych łańcuchów lekkich. Architektura dwóch plisowanych arkuszy beta i konformacja pętli H1 i H2 w VH-P8 są bardzo podobne do tych w niekamelizowanych domenach VH związanych z VL. Główne różnice dotyczą pętli H3 pętla, która nie wskazuje już w kierunku nieobecnego VL i trzech reszt w dawnym interfejsie VL. Łańcuchy boczne Val37 i Trp103 są zakopane, a łańcuch boczny Łańcuch boczny Arg38 jest odsłonięty w VH-P8. W niekarmelizowanych domenach VH związanych z VL łańcuchy boczne Val37 i Trp103 są w kontakcie z VL, podczas gdy łańcuch boczny Arg38 jest zakopany wewnątrz VH. Reorientacja Trp103 jest spowodowana lokalną strukturą struktura w beta-pęczku nici G. Reorientacja Val37 i Arg38 jest spowodowana jest spowodowana zaburzeniem regularnej struktury beta w nici C naprzeciwko beta w nici C'. Zmiany te, w połączeniu z bardziej hydrofilowymi łańcuchy boczne camelised reszt, zmniejszają hydrofobowość i zapobiegają niespecyficznemu wiązaniu wielbłądzich domen VH, co okazało się krytyczne dla ich jako małych jednostek rozpoznających. Struktura VH-P8 wskazuje również na strukturalne dla dwóch innych mutacji specyficznych dla immunoglobin wielbłąda pozbawionych łańcucha lekkiego. immunoglobin wielbłąda. Brak typowego dla VH mostka solnego Arg94/Asp101 u podstawy pętli pętli H3 w VH-P8 może wyjaśniać, dlaczego dodatnio naładowana reszta w pozycji 94 nie jest konserwowana u wielbłądów. Reorientacja Val37 sugeruje funkcję specyficznej dla wielbłąda reszty fenyloalaniny w tej pozycji w hydrofobowym rdzeniu łańcuchów ciężkich wielbłądów pozbawionych łańcucha lekkiego. --- TŁO: Przeciwciała są prototypami białek multimerycznych i składają się z strukturalnie podobnych domen. Dwie zmienne domeny przeciwciała (VH i VL) oddziałują przez duży hydrofobowy interfejs i mogą być wyrażone jako kowalencyjnie połączone jednołańcuchowe fragmenty Fv (scFv). Fałdowanie in vitro fragmentów scFv po długotrwałej denaturacji w chlorku guanidyny jest powolne. powolne. W celu określenia charakteru etapu ograniczającego szybkość, fałdowanie fragmentu fragmentu scFv przeciwciała po krótkotrwałej denaturacji. denaturacji. WYNIKI: Tworzenie struktury drugorzędowej, mierzone przez ochronę przed wymianą H/D, zmutowanego fragmentu scFv zmutowanego fragmentu scFv przeciwciała po krótkiej inkubacji w 6 M chlorku guanidinium wykazano, że jest wielofazowe. Analiza NMR pokazuje, że związek pośredni z istotną ochroną protonową obserwuje się w czasie martwym eksperymentów ręcznego mieszania. eksperymentów mieszania ręcznego. Następnie reakcja fałdowania przebiega poprzez reakcję reakcja dwufazowa i analizy spektrometrii mas eksperymentów wymiany potwierdzają istnienie dwóch równoległych ścieżek. W obecności cyklofiliny, jednak szybsza z dwóch faz zanika (gdy następuje wewnętrzna fluorescencja tryptofanu). fluorescencja tryptofanu), podczas gdy wolniejsza faza nie jest znacząco wzmocniona przez równomolową cyklofilinę. WNIOSKI: Tworzenie wczesnego intermediatu, który wykazuje ochronę przed wymianą amid-proton jest niezależne od izomeryzacji proliny. Następnie reakcja izomeryzacji cis-trans proliny w szybko utworzonym związku pośrednim, wytwarzanie "nierodzimych" izomerów konkuruje z szybkim tworzeniem się rodzimych gatunków. Tworzenie interfejsu w składanym półprodukcie fragmentu scFv jest aby zapobiec izomeryzacji wstecznej tych prolin z bycia skutecznie katalizowanej przez cyklofilinę. --- TŁO: Daleko spokrewnione białka przyjmują i zachowują podobne strukturalne rusztowania rusztowania strukturalne pomimo różnic długości, które mogą być nawet dwukrotne w niektórych nadrodzinach białek. W tym artykule opisujemy analizę regionów indel które uwzględniają różnice długości wśród spokrewnionych białek. Opracowaliśmy algorytm CUSP do badania wieloczłonowych dopasowań nadrodziny PASS2 w celu zidentyfikować regiony indel w sposób zautomatyzowany. Ponadto wykorzystaliśmy tę metodę do scharakteryzowania długości, typu strukturalnego i cech biochemicznych indeli w powiązanych domenach białkowych. WYNIKI: CUSP, analizuje strukturalne wyrównania domen białkowych w celu rozróżnienia regionów o zachowanej strukturze wspólnej dla pokrewnych białek od strukturalnie niezachowanych regionów, które różnią się długością i typem struktury. Na nieredundantnym zbiorze danych 353 uliniowień nadrodziny domen z PASS2, stwierdzamy, że że superrodziny białek "odbiegające długością" wykazują > 30% odchylenia długości od ich średniej długości domeny. 60% dodatkowych długości występujących w indelach to struktury o krótkiej długości (< 5 reszt), podczas gdy 6% indeli ma długość > 15 reszt. długości. Typy strukturalne w indelach również wykazują tendencje specyficzne dla danej klasy. WNIOSEK: Zakres zmienności długości różni się w różnych nadrodzinach a indele wykazują specyficzne dla klasy trendy dla preferowanych długości i typów strukturalnych. strukturalnych. Takie wcięcia o różnych długościach nawet w obrębie jednej domeny białkowej mogą mieć strukturalne i funkcjonalne konsekwencje, które napędzają ich selekcję. selekcję, co leży u podstaw ich znaczenia w wykrywaniu podobieństwa i modelowaniu obliczeniowym. modelowaniu obliczeniowym. Dostępność systematycznych algorytmów, takich jak CUSP, powinna umożliwić podejmowanie decyzji w sposób specyficzny dla nadrodziny domen.
Jaka jest podstawowa struktura drugorzędowa zmiennych domen typowego przeciwciała?
Zmienne domeny ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciał składają się z dwóch arkuszy β. Pierwsza z nich składa się z czterech nici, A, B, E i D, a druga z sześciu nici, nazwanych A', G, F, C, C' i C''. Miejsce wiązania antygenu jest utworzone przez połączenia międzypasmowe BC, C′C″ i FG z każdej domeny.