Użyteczność immunohistochemii (IHC) jako metody przesiewowej do identyfikacji osób z mutacjami w genach naprawy niedopasowania DNA (MMR) w dziedzicznym niepolipowatym raku jelita grubego (HNPCC) pozostaje do zdefiniowania. W W tym badaniu przeanalizowaliśmy wartość IHC w porównaniu z testami niestabilności mikrosatelitarnej (MSI) niestabilności mikrosatelitarnej (MSI) w przewidywaniu statusu mutacji genów MLH1, MSH2 i MSH6 w rakach i gruczolakach jelita grubego, a także zbadaliśmy częstotliwość i znaczenie znaczenie zmienności barwienia immunohistochemicznego. Badane próbki obejmowały 83 raki i 29 gruczolaków pochodzących od 110 pacjentów, którzy mieli silną raka jelita grubego w rodzinie. Nasze wyniki wykazały, że IHC prawidłowo prawidłowo przewidziała status MSI w 76% przypadków ze swoistością 100%. Ogólna czułość IHC w przewidywaniu mutacji linii zarodkowej wynosiła 79% (30 z 38) przy specyficzności 89% (48 z 54), podczas gdy test MSI wynosił 97% (30 z 31) ze swoistością 83% (35 z 42). Sześć z 31 analizowalnych przypadków, które miały mutację powodującą chorobę i wykazywało MSI wykazało prawidłowy wynik IHC. Niższa czułość czułość IHC była spowodowana głównie niską czułością w wykrywaniu mutacji genu MLH1 (4 z 9). Współistniejące gruczolaki i raki obserwowane na tym samym (n=12) wykazywały podobny lub identyczny wzór barwienia dla wszystkich trzech białek. białek. Nie wykryto znaczącej różnicy w czułości IHC lub MSI w wykrywaniu mutacji linii zarodkowej między izolowanymi gruczolakami i rakami. W przypadkach IHC-dodatnich, niejednorodne barwienie odnotowano w 30% do 40% przypadków z trzema różnymi przeciwciałami. przypadków z trzema różnymi przeciwciałami, a barwienie cytoplazmatyczne w 5% do 13%. Słabe IHC (zdefiniowane jako dodatnie barwienie w <10% guza o słabej intensywności) odnotowano w 14 guzach. intensywności) odnotowano w 14 guzach: 5 dla przeciwciała MLH1, 1 dla MSH2 i 8 dla MSH6. Jeden z 5 przypadków MLH1 wykazywał MSI i miał mutację germinalną MLH1. germinalną MLH1. Pięć z 8 przypadków MSH6 wykazywało MSI i miało mutacje germinalne MSH2. mutacje. Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że 1) IHC identyfikuje znaczną część część guzów jelita grubego pochodzących od nosicieli mutacji germinalnych genu MMR i może być stosowana jako środek pomocniczy w identyfikacji rodzin HNPCC, ale IHC nie może zastąpić testów MSI; 2) gruczolaki mają podobne wzorce ekspresji białka MMR MMR i mogą służyć jako odpowiednia próbka do celów przesiewowych w identyfikacji pacjentów z HNPCC. do celów przesiewowych w identyfikacji pacjentów z mutacjami MMR; 3) nie wszystkie przypadki nie wszystkie IHC-dodatnie przypadki wykazują jednolitą pozytywność w całym guzie; i 4) słabe i ogniskowe barwienie i ogniskowe barwienie białka MMR może być związane z MSI lub mutacją genu lub obydwoma, co sugeruje potrzebę uwzględnienia intensywności barwienia w dalszych badaniach IHC w dalszych badaniach IHC. --- IgA jest najobficiej produkowanym przeciwciałem i odgrywa ważną rolę w układzie odpornościowym śluzówkowym układzie odpornościowym. Ludzka IgA jest reprezentowana przez dwa izotypy, IgA1 i IgA2. Główną różnicą strukturalną między tymi dwiema podklasami jest obecność dziewięciu potencjalnych miejsc O-glikozylacji w regionie zawiasowym między pierwszą i drugą domeną regionu stałego łańcucha ciężkiego. Thr(225), Thr(228), Ser(230), Ser(232) i Thr(236) zostały zidentyfikowane jako dominujące miejsca przyłączenia O-glikanu. O-glikanu. Zakres i rozmieszczenie łańcuchów O-glikanu w każdym miejscu w kontekście sąsiednich miejsc w tym zgrupowanym regionie tworzą złożoną heterogeniczność epitopów powierzchniowych, która jest niekompletnie zdefiniowana. Wcześniej opisaliśmy analizę heterogeniczności O-glikanu IgA1 przy użyciu wysokiej rozdzielczości LC-MS i tandemowej dysocjacji wychwytu elektronów, aby jednoznacznie zlokalizować wszystkie aminokwasów w białku szpiczaka IgA1 (Ale). Tutaj przedstawiamy identyfikację i wyjaśnienie izomerów strukturalnych O-glikopeptydu IgA1, które występują w oparciu o pozycję aminokwasową przyłączonych glikanów (izomery pozycyjne) oraz struktury łańcuchów O-glikanu w poszczególnych miejscach (izomery glikanu). Izomery te są obecne w modelowym białku szpiczaka IgA1 (Mce1) i występują naturalnie w normalnej ludzkiej surowicy IgA1. naturalnie w normalnej ludzkiej surowicy IgA1. Zmienne łańcuchy O-glikanu przyłączone do Ser(230), Thr(233) lub Thr(236) wytwarzają dominujące izomery pozycyjne, w tym O-glikany złożone z pojedynczej reszty GalNAc. Odkrycia te reprezentują pierwszą ostateczną identyfikację strukturalnych izomerycznych IgA1 O-glikanów IgA1, definiują heterogeniczność pojedynczego miejsca dla wszystkich miejsc O-glikanów w w pojedynczej próbce i mają implikacje dla definiowania epitopów w oparciu o klastry O-glikanu. --- Zależna od glutationu dehydrogenaza formaldehydowa (dehydrogenaza alkoholowa klasy III) dehydrogenaza) została scharakteryzowana z Arabidopsis thaliana. Ten roślinny wykazuje właściwości kinetyczne i molekularne wspólne z formami klasy III z ssakami, z K(m) dla S-hydroksymetyloglutationu wynoszącym 1,4 mikroM, anodową ruchliwością elektroforetyczną anodową ruchliwością elektroforetyczną (pI: 5,3-5,6) i reakcją krzyżową z (szczurzą dehydrogenazą alkoholową klasy III). Struktura enzymu, wydedukowana z sekwencji cDNA, pasuje do złożonego systemu dehydrogenaz alkoholowych dehydrogenaz alkoholowych i pokazuje, że wszystkie formy życia dzielą typ białka klasy III. Odpowiadający mu mRNA ma długość 1,4 kb i jest obecny we wszystkich organach roślinnych; pojedyncza kopia genu genu znajduje się w genomie. Zmienność strukturalna klasy III jest różni się od typów enzymów aktywnych w etanolu zarówno u kręgowców (klasa I) i roślin (klasa P), chociaż klasa P zachowuje więcej właściwości klasy III niż klasa I. niż klasa I. Również właściwości enzymatyczne różnią się między dwie klasy etanolu. Zmienność miejsca aktywnego i wymiany w istotnych reszty (Leu/Gly57, Asp/Arg115) mogą wyjaśniać odmienną kinetykę. Te wzorce są zgodne z dwiema różnymi rolami metabolicznymi dla enzymów aktywnych na etanol, bardziej stałą funkcją, redukcją aldehydu octowego podczas niedotlenienia, dla klasy P, i bardziej zmienną funkcją, detoksykacją detoksykacja alkoholi i udział w przemianach metabolicznych, dla klasy I. motyw sekwencji, Pro-Xaa-Ile/Val-Xaa-Gly-His-Glu-Xaa-Xaa-Gly, wspólny dla wszystkich średniołańcuchowych dehydrogenaz alkoholowych. dehydrogenaz alkoholowych. --- Patogeny układu oddechowego, takie jak Neisseria meningitidis, wydzielają specyficzne dla miejsca proteazy zdolne do rozszczepiania ludzkiej immunoglobuliny A1 (IgA1), pierwszej linii obrony na błonach śluzowych. Izolaty bakteryjne wykazują dużą zmienność w aktywności proteazy IgA1 a te wyizolowane od pacjentów z infekcją kliniczną mają najwyższy poziom aktywności. posiadają najwyższy poziom aktywności. Cechą tego enzymu jest cechą tego enzymu jest samorozszczepienie wymagane do wydzielania dojrzałej formy zewnątrzkomórkowej. Znane cele rozszczepienia zawierają bogatą w prolinę sekwencję rozpoznawania konsensusu, Pro-Pro-Ser-Pro, rezydującą w zmiennym regionie łącznikowym, który łączy domeny proteazy i proteazy i domeny translokatora. Tutaj przedstawiamy sekwencję proteazy NMB IgA1 oraz nieoczekiwaną samolikwidację i późniejsze uwalnianie zewnątrzkomórkowe dojrzałej proteazy IgA1 z mutantów pozbawionych wcześniej zdefiniowanego konsensusu miejsca rozszczepienia. Zbadaliśmy możliwy związek między wydzielaniem enzymu a zmiennością w segmencie sekwencji łącznika przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej na miejsce i w celu skonstruowania zmutowanych i chimerycznych form proteazy IgA1 ze szczepu N. meningitidis NMB. Zaobserwowana zmiana w wydzielanych w porównaniu do klonu typu dzikiego wskazuje, że dokładna sekwencja aminokwasowa sekwencji aminokwasowej regionu pośredniego między dojrzałą proteazą IgA1 a domeną translokatora beta-rdzeniową domeną translokatora, wpływa na skuteczność autoproteolitycznego przetwarzania. Szersza specyficzność odkryta dla proteazy NMB IgA1 sugeruje że może ona rozszczepiać znacznie szerszy zakres ludzkich białek niż wcześniej doceniane. --- Projektowanie białek, które odzwierciedlają naturalną zmienność patogenu, jest niezbędne do opracowania nowych szczepionek i leków. Flawiwirusy, w tym denga (DENV) i wirus Zachodniego Nilu (WNV), szybko ewoluują i mogą "uciec" neutralizującym przeciwciałom monoklonalnym poprzez mutację. neutralizujących przeciwciał monoklonalnych poprzez mutację. Projektowanie antygenów reprezentujących wiele różnych szczepów jest ważne w przypadku DENV, gdzie zakażenie szczepem jednego z czterech serotypów z czterech serotypów może prowadzić do ciężkiej choroby krwotocznej przy późniejszym zakażeniu zakażenie szczepem z innego serotypu. Tutaj, fizykochemiczne właściwości DENV (PCP) właściwość (PCP) - sekwencja konsensusu została wyprowadzona z 671 unikalnych sekwencji z bazy danych Flavitrack. Białka zgodne z PCP dla domeny 3 białka otoczki (EdomIII) zostały wyrażone z syntetycznych genów w Escherichia coli. Zdolność oczyszczonych białek konsensusowych do wiązania przeciwciał poliklonalnych generowanych w odpowiedzi na infekcję odpowiedzi na zakażenie szczepami z każdego z czterech serotypów DENV. serotypów DENV. Początkowe białko konsensusowe wiązało przeciwciała z DENV-1-3 w testach ELISA i testach Western blot. Sekwencja ta została zmieniona w 3 krokach, aby włączyć regiony maksymalnej zmienności, zidentyfikowane jako znaczące zmiany w PCP, charakterystyczne dla szczepów DENV-4. Ostateczne białko zostało rozpoznane przez przeciwciała przeciwko wszystkim czterem serotypom. Dwa aminokwasy niezbędne do skutecznego wiązania ze wszystkimi przeciwciałami DENV są częścią nieciągłego epitopu wcześniej zdefiniowanego wcześniej dla neutralizującego przeciwciała monoklonalnego. Metoda konsensusu PCP może znacznie zmniejszyć liczbę eksperymentów wymaganych do zdefiniowania wielowartościowego antygenu, co jest szczególnie ważne w przypadku patogenów, które muszą być być testowane na wyższych poziomach bezpieczeństwa biologicznego. --- TŁO I CELE: Szeroko reaktywne przeciwciała neutralizujące (nAbs) oraz wielospecyficzne odpowiedzi limfocytów T są generowane podczas przewlekłego zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV), a mimo to nie udaje się usunąć wirusa. W niniejszym badaniu zbadano rozwój autologicznych nAb i odpowiedzi komórek T specyficznych dla glikoprotein HCV oraz ich wpływ na ewolucję sekwencji wirusa podczas przewlekłej infekcji w celu zrozumieć przyczyny braku ich skuteczności. METODY: Liczne sekwencje E1E2 zostały amplifikowane i sekwencjonowane z próbek surowicy zebranych w ciągu 26 lat od pacjenta H, wyjątkowo dobrze scharakteryzowanego, przewlekle zakażonego osobnika. Pseudocząsteczki HCV (HCVpp) wyrażające glikoproteiny glikoproteiny pochodzące od pacjenta zostały wygenerowane i przetestowane pod kątem ich wrażliwości na neutralizację przez neutralizację przez autologiczne i heterologiczne przeciwciała w surowicy. WYNIKI: Odpowiedź nAb specyficzna dla szczepu rozwinęła się na wczesnym etapie zakażenia (8 tygodni po zakażeniu). po zakażeniu), podczas gdy przeciwciała reagujące krzyżowo zdolne do neutralizacji HCVpp-nośnik heterologicznych glikoprotein rozwinął się późno w infekcji (>33 tk po zakażeniu). Odpowiedź humoralna stale nie neutralizowała wirusów niosących autologiczne sekwencje glikoprotein, które były obecne w surowicy w danym czasie. danym czasie. Amplifikowane sekwencje glikoprotein wykazywały dużą zmienność, szczególnie w regionach odpowiadających zdefiniowanym liniowym epitopom komórek B. Mutacje w zdefiniowanych epitopach neutralizujących były związane z utratą przez przeciwciała monoklonalne przeciwko tym epitopom i ze zmniejszoną neutralizacją neutralizacją odpowiedniego HCVpp. Ucieczkę wirusa przed odpowiedzią komórek T CD4 i CD8 wykazano również dla kilku nowych epitopów w całym regionie glikoproteiny regionu glikoproteiny. WNIOSKI: Podczas przewlekłego zakażenia HCV podlega presji selekcyjnej zarówno z odporności humoralnej, jak i komórkowej, co skutkuje ciągłym generowaniem wariantów wariantów ucieczki. --- Przeanalizowaliśmy unikalny epitop dla szeroko neutralizującego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwciała monoklonalnego (MAb) 2G12 na glikoproteinie powierzchniowej gp120 ludzkiego wirusa wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Analiza sekwencji, koncentrująca się na konserwacja odpowiednich pozostałości w wielu izolatach HIV-1, udoskonaliła epitop, który został wcześniej zdefiniowany przez mutagenezę substytucyjną (A. Trkola, M. Purtscher, T. Muster, C. Ballaun, A. Buchacher, N. Sullivan, K. Srinivasan, J. Sodroski, J. P. Moore i H. Katinger, J. Virol. 70:1100-1108, 1996). W badaniu W badaniu biochemicznym trawiliśmy rekombinowany gp120 różnymi enzymami glikozydazowymi enzymami o znanej specyficzności i wykazaliśmy, że epitop 2G12 jest tracony, gdy gp120 jest traktowany mannozydazami. Analizy obliczeniowe zostały wykorzystane do pozycjonowania epitopu w kontekście kompleksu glikoprotein otoczki wirionu, w celu określenia zmienności kompleksu, do określenia zmienności otaczającej powierzchni oraz do obliczyć dostępność powierzchniową możliwych składników epitopu glikanu i polipeptydu składników. Łącznie analizy te sugerują, że epitop 2G12 jest wyśrodkowany na wysokomannozowych i / lub hybrydowych glikanach reszt 295, 332 i 392, z peryferyjnymi glikanami z 386 i 448 na obu bokach. Epitop jest zależny od mannozy zależny od mannozy i składa się głównie z węglowodanów, prawdopodobnie bez bezpośredniego zaangażowanie powierzchni polipeptydu gp120. Znajduje się na powierzchni ortogonalnej do powierzchni wiążącej CD4, na powierzchni proksymalnej, ale różnej od tej zaangażowany w wiązanie coreceptora. Jego zachowanie pośród wysoce zmiennej powierzchni gp120 sugeruje funkcjonalną rolę miejsca wiązania 2G12, być może związane z zależnym od mannozy przyłączaniem HIV-1 do DC-SIGN lub pokrewnych lektyn, które ułatwiają wnikanie wirusa do podatnych komórek docelowych. --- Ponad 20,8 miliona ludzi jest zarażonych wirusem HIV w Afryce Subsaharyjskiej, przy czym Republika Południowej Afryki ma jedną z najszybciej rozwijających się epidemii HIV-1, gdzie szacuje się, że zakażonych jest 2,4 miliona osób. Trzydzieści dwie surowice od 25 pacjentów przetestowano pod kątem ich zdolności do neutralizacji HTLV-IIIB (IIIB) i czterech pierwotnych izolatów izolatów reprezentujących podtypy B, C, D i rekombinowany gag typu C/env B. A Zastosowano test oparty na linii komórkowej CEM-SS, a miano neutralizujące zdefiniowano jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia dającego 50% redukcję produkcji antygenu p24. p24. Wszystkie izolaty były lepiej neutralizowane przez surowice specyficzne dla podtypu, z wyjątkiem szczepu C4714, który był neutralizowany zarówno przez surowice podtypu B, jak i C. C4714 został zneutralizowany przez 18/25 (72%) surowic, IIIB przez 19/32 (59%) surowic, D482 przez 7/31 (23%) surowic, B3245 przez 6/29 (21%) surowic, a rekombinowany izolat B/C1491 przez 4/25 (16%) surowic. Pięć surowic nie było w stanie zneutralizować żadnego z izolatów. Region V3 izolatów użytych w teście neutralizacji został amplifikowany metodą PCR, bezpośrednio sekwencjonowany i analizowany w celu ujawnienia zmienności między sekwencjami konsensusu HIV-1 a izolatami. Szczep HIV-1 C4714 był neutralizowany bardziej skuteczniej neutralizowany przez testowane surowice niż szczep laboratoryjny IIIIB. Zmienność w sekwencji aminokwasowej regionu V3, która może zmieniać konformację struktury wtórnej pętli pętli V3, może wpływać na neutralizację określonego izolatu wirusa. konkretnego izolatu wirusa. Formuły szczepionek powinny zostać poszerzone o wiele podtypów, zwłaszcza podtyp C, który szybko rozprzestrzenia się na całym świecie. --- Patogen riketsji Anaplasma marginale wyraża zmienne immunodominujące białko błony zewnętrznej białko błony zewnętrznej, główne białko powierzchniowe 2 (MSP2), zaangażowane w antygenową antygenową i długotrwałym utrzymywaniem się organizmu u zwierząt-nosicieli. MSP2 zawiera centralny hiperzmienny region około 100 aminokwasów, który koduje immunogenne epitopy komórek B, które indukują przeciwciała specyficzne dla wariantu podczas infekcji. infekcji. Wcześniej wykazaliśmy, że MSP2 jest kodowany przez polikistroniczny transkrypt mRNA w erytrocytach. mRNA w stadiach erytrocytów A. marginale i zdefiniowaliśmy strukturę genomowego miejsca ekspresji genomowego miejsca ekspresji tego transkryptu. W tym badaniu wykazaliśmy, że to samo miejsce ekspresji jest wykorzystywane w stadiach A. marginale zarażających kleszcze gruczoły ślinowe. Przeanalizowaliśmy również zmienność tego genomowego miejsca ekspresji w szczepie A. marginale z Oklahomy przenoszonym z kultur in vitro do bydła oraz między bydłem a kleszczami. Struktura miejsca ekspresji i regionów i regionów flankujących była zachowana, z wyjątkiem sekwencji kodującej region hiperzmienny MSP2 region hiperzmienny. Co najmniej trzy różne warianty MSP2 były kodowane w każdej populacji każdej populacji A. marginale. Główne warianty sekwencji nie zmieniły się podczas A. marginale między kulturami, ostrymi infekcjami erytrocytarnymi i gruczołami ślinowymi kleszcza. gruczołami ślinowymi kleszcza, ale zmieniały się podczas uporczywych infekcji bydła. Warianty warianty znalezione w gruczołach ślinowych kleszcza najbardziej przypominały te obecne w krwi bydła w momencie nabycia infekcji, niezależnie od tego, czy infekcja została z ostrej lub przetrwałej riketsemii. Te różnice w struktury miejsca ekspresji głównego, immunoprotekcyjnego białka błony zewnętrznej białka błony zewnętrznej mają ważne implikacje dla rozwoju szczepionek i uzyskania lepszego zrozumienia mechanizmów utrzymywania się infekcji ehrlichialnych u ludzi, zwierząt domowych i żywicieli rezerwuarowych. --- Zdefiniowano i zmapowano pięć epitopów mysich w obrębie proteazy IgA1 wytwarzanej przez Neisseria meningitidis. Epitopy 1 i 2 były obecne w proteazie IgA1 ze wszystkich szczepów szczepów i od Neisseria gonorrhoeae. Epitopy od 3 do 5 różniły się między podgrupami meningokoków serogrupy A, ale pozostawały niezmienne przez dziesięciolecia w obrębie podgrup, z wyjątkiem epitopu 4, który zmienił się w latach 1983-1987 podczas rozprzestrzeniania się meningokoków podgrupy III z Azji do Afryki. Wiązanie przeciwciał monoklonalnych do epitopów 1, 4 i 5 neutralizowało funkcję enzymatyczną. Surowice ludzkie zawierające przeciwciała przeciwko proteazie IgA1 w wyniku naturalnej infekcji zakażenia hamowały wiązanie przeciwciał monoklonalnych do epitopu 4, ale nie do innych epitopów. innych epitopów. --- Glikoproteina otoczkowa lentiwirusów małych przeżuwaczy (SRLV) jest głównym celem humoralnej odpowiedzi immunologicznej i zawiera kilka liniowych epitopów komórek B epitopów. Dokonaliśmy amplifikacji i sekwencjonowania segmentu genomowego kodującego miejsce antygenowe SU5 glikoproteiny otoczkowej kilku izolatów terenowych SRLV. Z syntetyczne peptydy oparte na wydedukowanych sekwencjach aminokwasowych SU5 w w teście immunoenzymatycznym (ELISA), (i) udowodniliśmy immunodominację tego regionu niezależnie od (i) udowodniliśmy immunodominację tego regionu niezależnie od jego dużej zmienności, (ii) zdefiniowaliśmy (ii) zdefiniowaliśmy epitopy obejmowane przez SU5, (iii) zilustrowaliśmy szybką i osobliwą kinetykę serokonwersji do tego miejsca antygenowego oraz (iv) wykazano szybkie i silne dojrzewanie silne dojrzewanie awidności przeciwciała anty-SU5. Wreszcie wykazaliśmy modułowy potencjał diagnostyczny peptydów SU5. W szwajcarskich warunkach terenowych wykazano, że test SU5 ELISA wykrywa większość zakażonych zwierząt a po zastosowaniu w molekularnym kontekście epidemiologicznym, aby umożliwić szybką klasyfikację filogenetyczną zakażającego wirusa.
Jak definiowana jest zmienność sekwencji w przeciwciałach?
Zmienność w każdej pozycji łańcucha polipeptydowego definiuje się jako:
Zmienność = liczba różnych aminokwasów w danej pozycji / częstość występowania najczęstszego aminokwasu w danej pozycji.