Wśród bogactwa informacji, które zebraliśmy na temat Ras w ciągu ostatniej dekady dekadzie, wprowadzenie koncepcji przestrzeni w tej dziedzinie stanowiło główną rewolucję, która umożliwiła rewolucję, która pozwoliła na ułożenie wielu elementów układanki Ras. miejsce. Na początku uważano, że Ras funkcjonuje wyłącznie w błonie plazmatycznej. błonie plazmatycznej. Dziś wiemy, że w obrębie błony plazmatycznej występują 3 izoformy Ras izoformy Ras - H-Ras, K-Ras i N-Ras - zajmują różne mikrodomeny i że te izoformy są również obecne i aktywne w endomembranach. Odkryliśmy również że białka Ras nie są statycznie związane z tymi lokalizacjami; zamiast tego dynamicznie przemieszczają się między przedziałami. I dowiedzieliśmy się, że w tych lokalizacjach Ras podlega mechanizmom regulacyjnym specyficznym dla danego miejsca, wyraźnie angażując szlaki efektorowe i włączając różne programy genetyczne w celu generowania różnych odpowiedzi biologicznych. programy genetyczne do generowania różnych odpowiedzi biologicznych. Wszystkie te procesy są możliwe w dużej mierze dzięki potranslacyjnym modyfikacjom, dzięki którym białka Ras Ras wiążą się z błonami i zdarzeniami regulacyjnymi, takimi jak fosforylacja i ubikwitynacja. ubikwitynacja, którym podlega Ras. Jako taka, przestrzeń i te mechanizmy kontroli mechanizmy działają w połączeniu, aby nadać sygnałom Ras ogromną zmienność sygnału, która umożliwia jego wielorakie role biologiczne. Dane te ustalono koncepcję, że sygnał Ras, zamiast być pojedynczym, jednorodną jednostką, wynika z integracji wielu, specyficznych dla miejsca podsygnałów, a Ras stał się paradygmatem tego, jak przestrzeń może różnie kształtować sygnalizację. sygnalizację. --- Białka Ras podlegają nie do końca poznanemu procesowi przemieszczania się w komórce. Rasosomy to nanocząsteczki białkowe o średnicy 80-100 nm, które przenoszą lipidowane izoformy Ras (H-Ras i N-Ras) oraz ich efektory przez cytoplazmę. izoformy Ras (H-Ras i N-Ras), jak również ich efektory przez cytoplazmę i w pobliżu błony plazmatycznej (PM). i w pobliżu błony plazmatycznej (PM). W tym badaniu zidentyfikowaliśmy subkomórkowe pochodzenie pochodzenie rasosomów i sposób, w jaki rozprzestrzeniają białka Ras w komórce. Stwierdziliśmy brak zależności tworzenia rasosomów od galektyn lub od stanu związanego z GDP-/GTP Ras. Stwierdziliśmy, że znacznie więcej rasosomów jest związanych z formami Ras, które są zlokalizowane w Golgim, a mianowicie N-Ras lub pojedynczo palmitoilowanym mutantem H-Ras (C181S). Aby zbadać możliwość, że rasosomy pochodzą z Golgiego, użyliśmy mutantów fotoaktywowalnych (PA) -GFP-H-Ras i wykazaliśmy, że rasosomy powstają z Golgiego w dwuetapowym mechanizmie. Nowo uwolnione rasosomy najpierw poruszają się w sposób ukierunkowany zależny od energii, a następnie przekształcają się w losowo dyfundujące rasosomy. Podwójne fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe ujawniło pojawienie się podwójnie znakowanych rasosomów, wskazując na dynamiczną wymianę cytoplazmatycznego i związanego z PM Ras z Rasosomem związanym z Ras. Wreszcie, wyższe poziomy rasosomów korelują z wyższymi poziomami fosforylacji ERK, kluczowego kluczowym markerem sygnalizacji Ras. Sugerujemy, że białka H-Ras i N-Ras wymieniają się z rasosomami, które mogą funkcjonować jako nośniki palmitoilowanego Ras i jego sygnałów. i jego sygnałów. --- H-ras, N-ras i K-ras są kanonicznymi członkami rodziny genów ras, często aktywowane przez mutacje punktowe w ludzkich nowotworach i kodujące 4 różne, wysoce izoform białkowych (H-Ras, N-Ras, K-Ras4A i K-Ras4B). Ich ekspresja jest prawie wszechobecna i szeroko konserwowana u gatunków eukariotycznych, chociaż istnieją ilościowe i jakościowe różnice w ekspresji w zależności od tkanki i/lub rozważanego etapu rozwoju. Szeroko zakrojone badania funkcjonalne badania wykazały w ciągu ostatniego ćwierćwiecza, że te produkty genów Ras są krytycznymi składnikami szlaków sygnałowych, które kontrolują proliferację komórek eukariotycznych proliferację, przeżycie i różnicowanie komórek eukariotycznych. Jednakże, ze względu na ich homologię i częstą koekspresję w różnych kontekstach komórkowych, pozostawało to niejasne. niejasne, czy różne białka Ras odgrywają specyficzne lub nakładające się na siebie funkcjonalne role w procesach fizjologicznych i patologicznych. Początkowo ich wysoki stopień homologii sekwencji i obserwacja, że wszystkie izoformy Ras dzielą wspólne zestawy efektorów downstream i aktywatorów upstream sugerowały, że są one w większości były w większości zbędne funkcjonalnie. W przeciwieństwie do tego, pojęcie funkcjonalnej specyficzności dla każdej z różnych izoform Ras jest obecnie wspierana przez coraz więcej obserwacji eksperymentalnych, w tym 1) fakt, że różne izoformy Ras są preferencyjnie zmutowane w określonych typach nowotworów lub rozwojowych; 2) różny potencjał transformacyjny transfekowanych genów transfekowanych genów ras w różnych kontekstach komórkowych; 3) różną wrażliwość wykazywaną przez różne przez różnych członków rodziny Ras na modulację przez różne GAP lub GEF; 4) wykazanie, że różne izoformy Ras podążają różnymi wewnątrzkomórkowymi ścieżkami przetwarzania wewnątrzkomórkowe i lokalizują się w różnych mikrodomenach błonowych lub subkomórkowych; 5) różne fenotypy wykazywane przez genetycznie genetycznie zmodyfikowane szczepy zwierząt dla każdego z 3 loci ras; oraz 6) specyficzne sieci transkrypcyjne kontrolowane przez każdą izoformę w różnych ustawieniach komórkowych. komórkowych. --- Mutacje w izoformach Ras, takich jak K-Ras, N-Ras i H-Ras, przyczyniają się odpowiednio do około 85, 15 i 1% nowotworów u ludzi. odpowiednio 85, 15 i 1% nowotworów u ludzi. Prawidłowe ukierunkowanie błonowe tych izoform Ras, warunek wstępny dla aktywności Ras, wymaga farnezylacji lub geranylgeranylacji na C-końcowym polu CAAX. Opracowaliśmy strategię badań przesiewowych in vivo opartą na monitorowaniu aktywacji Ras i fenotypowych wyników fizjologicznych do badania syntetycznych inhibitorów funkcji Ras (RFI). Aktywność Ras była przez translokację RBD Raf1 -GFP do aktywowanego Ras w błonie plazmatycznej. w błonie plazmatycznej. Korzystając z tej strategii, zbadaliśmy jeden syntetyczny substrat farnezylu (AGOH) wraz z dziewięcioma przypuszczalnymi inhibitorami i stwierdziliśmy, że tylko m-CN-AGOH hamował aktywację Ras. Analiza fenotypowa głodujących komórek może być wykorzystana do monitorować polaryzację, ruchliwość i niezdolność tych leczonych komórek do prawidłowej agregacji podczas formowania owocnika. Inkorporacja AGOH i m-CN-AGOH do białek komórkowych wykryto metodą western blot. Te testy przesiewowe testy można włączyć do formatu przesiewowego o wysokiej przepustowości przy użyciu Dictyostelium discoideum i zautomatyzowanej mikroskopii w celu określenia skutecznych RFI. Kandydaci na RFI mogą być następnie dalej testowani w systemach ssaków. --- Białka Ras są małymi GTPazami funkcjonującymi jako przełączniki molekularne, które w odpowiedzi na w odpowiedzi na określone sygnały zewnątrzkomórkowe, takie jak czynniki wzrostu, aktywują zróżnicowany wachlarz wewnątrzkomórkowych kaskad efektorowych regulujących proliferację komórek, różnicowanie i apoptozę. Ludzkie nowotwory często wykazują ekspresję białek Ras (Ha-, Ki-, N-Ras) aktywowane przez mutacje punktowe, które przyczyniają się do złośliwego fenotypu, w tym inwazyjności i złośliwego fenotypu, w tym inwazyjności i angiogenezy. Pomimo wspólnych szlaków sygnałowych prowadzących do podobnych odpowiedzi komórkowych, badania wyraźnie wykazują unikalne role członków rodziny Ras w normalnych i patologicznych stanach i patologicznych, a brak redundancji funkcjonalnej wydaje się być wytłumaczalny, przynajmniej częściowo przynajmniej częściowo, przez zdolność izoform Ras do lokalizacji w różnych mikrodomenach mikrodomen do błony plazmatycznej i organelli wewnątrzkomórkowych. Ta różna wewnątrzkomórkowa kompartmentalizacja może pomóc izoformom Ras w kontakcie z różnymi z różnymi efektorami, co ostatecznie prowadzi do różnych wyników biologicznych. Co ciekawe, wykazano również, że Ha- i Ki-Ras odgrywają przeciwną rolę w regulacji wewnątrzkomórkowego statusu redoks. W związku z tym sugerujemy, że H-Ras specyficzna indukcja produkcji ROS (reaktywnych form tlenu) może być jednym z głównych determinantów głównych determinantów fenotypu inwazyjnego, który charakteryzuje komórki nowotworowe posiadające mutacje H-Ras. Zgodnie z naszą hipotezą, podczas gdy K-Ras (niezdolny do promować stresu oksydacyjnego) może głównie przyczyniać się do progresji raka i inwazyjności inwazyjności poprzez aktywację MAPK i PI3K, stres oksydacyjny, w którym pośredniczy H-Ras może odgrywać wyjątkową rolę w modulacji kontaktów międzykomórkowych, prowadząc do utraty adhezji komórek, a ostatecznie także do rozprzestrzeniania się przerzutów. --- H-Ras, K-Ras i N-Ras regulują wzrost i przeżycie komórek i są często są często aktywowane przez mutacje somatyczne w ludzkich nowotworach. Chociaż zmiany onkogenne występują w pojedynczej izoformie Ras w obrębie poszczególnych guzów, nie jest jasne, czy pozostałe izoformy pozostałe izoformy typu dzikiego odgrywają rolę pomocniczą we wzroście guza. Tutaj że onkogenne i dzikie izoformy Ras odgrywają niezależne i nieredundantne role w komórce. role w komórce. Onkogenny Ras reguluje podstawową sygnalizację szlaku efektorowego, podczas gdy Ras typu dzikiego pośredniczy w sygnalizacji za aktywowanym receptorem kinazy tyrozynowe (RTK). Pokazujemy, że oba są niezbędne do wykładniczego wzrostu linii komórkowych z mutacją Ras. Ponadto pokazujemy, że onkogenny Ras desensytyzuje sygnalizację z receptora EGF (EGFR). Pozbawienie onkogennego Ras oligonukleotydów siRNA oligonukleotydów łagodzi to ujemne sprzężenie zwrotne, prowadząc do hiperaktywacji EGFR i sygnalizacji Ras typu dzikiego. Zgodnie z tym modelem, połączenie onkogennego Ras z hamowaniem EGFR silnie zwiększa śmierć komórek. ZNACZENIE: Wyniki tego badania podkreślają nową rolę sygnalizacji dzikiego typu Ras w komórkach nowotworowych zawierających onkogenne mutacje RAS. Co więcej, te odkrycia ujawniają, że terapeutyczne ukierunkowanie na samą onkogenną sygnalizację Ras może być może być nieskuteczne ze względu na aktywację sprzężenia zwrotnego RTK i sugerują, że blokowanie RTK w połączeniu ze ścieżkami efektorowymi niższego szczebla może być korzystne w leczeniu nowotworów z mutacją Ras. --- Białka Ras są protoonkogenami, które są często mutowane w ludzkich nowotworach. Trzy blisko spokrewnione izoformy, HRAS, KRAS i NRAS, ulegają ekspresji we wszystkich komórkach i mają nakładające się, ale różne funkcje. Ostatnie prace ujawniły, w jaki sposób różnice między izoformami Ras w ich transporcie, lokalizacji i i orientacji białkowo-błonowej umożliwiają określenie specyficzności sygnalizacji. My przegląd różnych strategii stosowanych do scharakteryzowania przedziałowej lokalizacji i sygnalizacji Ras i sygnalizacji. Lokalizacja jest ważnym kontekstowym modyfikatorem sieci sygnalizacyjnych, a spostrzeżenia z systemu Ras mają szerokie znaczenie dla badaczy zainteresowanych sygnalizacją inicjowaną z błon. --- Wszystkie komórki ssaków wyrażają 3 blisko spokrewnione białka Ras, określane jako H-Ras, K-Ras, i N-Ras, które promują onkogenezę, gdy są mutacyjnie aktywowane w kodonach 12, 13 lub 61. kodonie 12, 13 lub 61. Chociaż istnieje wysoki stopień podobieństwa między izoformami izoform, mutacje K-Ras są znacznie częściej obserwowane w nowotworach, a każda izoforma wykazuje preferencyjne sprzężenie z określonymi typami nowotworów. Zbadaliśmy widma mutacyjne izoform Ras wyselekcjonowane z profilowania nowotworów na dużą skalę i odkryliśmy, że każda izoforma wykazuje zaskakująco charakterystyczne mutacje kodonowe i podstawienia aminokwasów. Odkrycia te były nieoczekiwane, biorąc pod uwagę, że te mutacje występują w regionach, które mają 100% identyczności sekwencji aminokwasów między 3 izoform. Co ważne, wiele z tych tendencyjności mutacyjnych nie było spowodowanych różnic w ekspozycji na mutageny, ponieważ wzorce były nadal widoczne w porównaniu z określonymi typami nowotworów. Omawiamy potencjalne mechanizmy genetyczne i mechanizmy genetyczne i epigenetyczne, a także specyficzne dla izoform różnice w strukturze i sygnalizacji białka struktura i sygnalizacja, które mogą promować te różne wzorce mutacji i różnicowe sprzężenie z określonymi nowotworami. --- Oprócz roli onkogenów, GTPazy Ras są kluczowymi regulatorami funkcji komórek. funkcji komórek. Istnieje udowodniony związek między szlakami sygnalizacyjnymi transformującego czynnika wzrostu-β1 (TGF-β1) a GTPazami Ras. Każda z izoform Ras (H, N i K) wykazuje specyficzną aktywność modulującą na różnych szlakach komórkowych. szlakach komórkowych. Naszym celem było zbadanie niektórych mechanizmów zaangażowanych w rozwój włóknienia nerek. w rozwój zwłóknienia nerek, oceniając indywidualną rolę N-Ras w podstawo podstawową i zależną od TGF-β1 syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), proliferację, i migracji w unieśmiertelnionych fibroblastach z niedoborem N-Ras (N-ras(-/-)). W porównaniu do normalnych odpowiedników, fibroblasty z niedoborem N-Ras wykazywały wyższe poziomy aktywności podstawowej poziomy aktywności kinazy fosfatydyloinozytolu-3 (PI3K)/Akt i MEK/Erk, towarzyszyła zwiększona synteza kolagenu i zmniejszone wskaźniki proliferacji i migracji. wskaźniki migracji. Stwierdziliśmy, że brak N-Ras nie wpłynął na indukowaną przez TGF-β1 proliferację i migrację, które wymagały aktywacji PI3K/Akt, ale nie aktywacji Erk1/2. Podobną zależność od szlaku efektorowego stwierdzono dla ekspresji fibronektyny i ekspresji kolagenu typu I. Nasze wyniki wskazują, że N-Ras może przyczyniać się do zwłóknienia nerek poprzez regulację w dół syntezy ECM i regulację w górę proliferacji i migracji, modulując aktywację Akt. N-Ras reguluje również indukowaną przez TGF-β1 ekspresję kolagenu I i fibronektyny poprzez szlaki niezależne od Erk ścieżki. --- Zmutowane formy KRas, NRas i HRas napędzają inicjację i progresję wielu ludzkich nowotworów, ale mniej wiadomo o roli alleli i izoform WT (typu dzikiego) alleli i izoform Ras w nowotworach. Użyliśmy nukleaz cynkowo-palcowych ukierunkowanych na HRas i NRas do modyfikacji obu alleli tych genów w zmutowanej linii komórkowej raka endometrium Hec1A linii komórkowej raka endometrium, która normalnie wykazuje ekspresję kopii WT tych genów. Zakłócenie którejkolwiek z izoform WT Ras naruszyło zależną od czynników wzrostu sygnalizację poprzez szlak ERK (kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym). Ponadto Ponadto zakłócenie HRas utrudniało aktywację Akt i późniejszą sygnalizację i późniejszą sygnalizację. Było to związane ze zmniejszoną proliferacją, zwiększoną apoptozą i zmniejszonym wzrostem niezależnym od zakotwiczenia w komórkach komórek z uszkodzonym HRas. Jednak wzrost guza ksenoprzeszczepu nie był znacząco wpływ zaburzenie NRas lub HRas. Zgodnie z oczekiwaniami, usunięcie zmutowanego allelu KRas znosiło wzrost guza, podczas gdy usunięcie pozostałej kopii WT KRas zwiększała właściwości nowotworowe tych komórek; usunięcie pojedynczej kopii pojedynczej kopii HRas lub NRas nie naśladowało tego efektu. Niniejsze badanie pokazuje, że kopie WT HRas, NRas i KRas odgrywają unikalną rolę w kontekście kontekście nowotworów wywołanych mutacją KRas.
Jacy są różni członkowie/izoformy onkogenów Ras?
Białka Ras są protoonkogenami, które są często mutowane w ludzkich nowotworach. Trzy blisko spokrewnione izoformy, HRAS, KRAS i NRAS, są wyrażane we wszystkich komórkach i mają nakładające się, ale różne funkcje.