Zdolność do osiągnięcia specyficznej dla miejsca manipulacji genomem ssaków ma szerokie implikacje dla badań podstawowych i stosowanych. Ukierunkowanie genów jest proces, w którym cząsteczka DNA wprowadzona do komórki zastępuje odpowiedni segment chromosomalny przez homologiczną rekombinację, a tym samym przedstawia precyzyjny sposób manipulowania genomem. W przeszłości zastosowanie targetowania genów do komórek ssaków było ograniczone przez niską wydajność. Nukleazy z palcem cynkowym nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) są obiecujące w poprawie wydajności celowania w geny poprzez wprowadzanie dwuniciowych pęknięć DNA w genach docelowych, które następnie stymulują endogenną maszynerię rekombinacji homologicznej komórki. Ostatnie wyniki wykazały że ZFN mogą być wykorzystywane do tworzenia częstotliwości celowania do 20% w ludzkim genie genów powodujących choroby. Przyszłe prace będą potrzebne, aby przełożyć te odkrycia in vitro do zastosowań in vivo i określenia, czy nukleazy z palcem cynkowym powodują niepożądaną niestabilność genomu. --- Ostatnie prace wykazały, że możliwe jest ukierunkowanie elementów regulatorowych na sekwencje DNA sekwencji DNA wybranych przez badacza, zwiększając armamentarium do do badania funkcji genów. W tym przeglądzie omawiamy rozwój i wykorzystanie projektantów białek z palcem cynkowym (ZFP) jako narzędzi specyficznych dla sekwencji. Podczas gdy głównym głównym celem tego przeglądu jest omówienie przyłączania nukleazy FokI do ZFPs i zdolności powstałego białka fuzyjnego (zwanego nukleazą z palcem cynkowym (ZFN)) do genomicznego manipulowania interesującym genem, omówimy również użyteczność innych domen funkcjonalnych, takich jak użyteczność innych domen funkcjonalnych, takich jak aktywatory i represory transkrypcji. i represory transkrypcji oraz podkreślimy, w jaki sposób są one wykorzystywane jako narzędzia odkrywcze i terapeutyczne. narzędzia terapeutyczne. --- TŁO: Wielolekooporny Plasmodium jest obecnie głównym powodem do niepokoju. Skuteczne szczepionki lub skuteczne zastosowania strategii opartych na RNAi do leczenia malarii są obecnie niedostępne. Niezbadanym obszarem w dziedzinie badań nad malarią malarii jest rozwój leków ukierunkowanych na DNA, które mogą specyficznie oddziaływać z pasożytniczym DNA i wprowadzać szkodliwe zmiany, prowadzące do utraty istotnych funkcji genomu i śmierci pasożyta. PREZENTACJA HIPOTEZY: Postępy w rozwoju nukleazy z palcem cynkowym (zinc finger nukleazy (ZFN) ze zmodyfikowanymi domenami rozpoznającymi DNA pozwalają nam projektować i nukleazy o wysokiej specyficzności sekwencji docelowej z mega rozpoznawalnym które zazwyczaj występuje tylko raz w genomie. Co więcej, peptydy penetrujące komórki peptydy (CPP) mogą przekraczać błonę plazmatyczną komórki i dostarczać sprzężone białko, kwas nukleinowy lub inny ładunek do cytoplazmy, jądra lub mitochondriów. mitochondriów. W niniejszym artykule zaproponowano, że lek z połączenia systemów CPP i ZFN może skutecznie dostać się do wewnątrzkomórkowego pasożyta, wprowadzić szkodliwe zmiany w jego genomie i wyeliminować pasożyta z zainfekowanych komórek. komórek. SPRAWDZENIE HIPOTEZY: Dostępność motywu wiążącego DNA dla ponad 45 trójek i jego modularny charakter, ze swobodą zmiany liczby palców w cząsteczce ZFN, sprawia, że rozwój niestandardowych ZFN przeciwko zróżnicowanej docelowej sekwencji DNA dowolnego genu. Ponieważ genom Plasmodium jest bardzo bogaty w AT, istnieje znaczna różnorodność miejsc sekwencji nawet dla strukturalnie i funkcjonalnie strukturalnie i funkcjonalnie enzymów między Plasmodium i ludźmi. CPP może być stosowany do dostarczania ZFN do wewnątrzkomórkowego jądra pasożyta. Oparta na peptydach sygnałowych heterologiczna białka do RBC zakażonych Plasmodium (iRBC) i różnych organelli Plasmodium. organelli Plasmodium. Dzięki udanej fuzji CPP z peptydami ukierunkowanymi na mitochondria i jądro, fuzja CPP z 1 więcej Peptyd translokacji błony komórkowej Plasmodium wydaje się osiągalny. ZAŁOŻENIA HIPOTEZY: Ukierunkowanie genomu Plasmodium za pomocą ZFN ma ogromny potencjał dla rozwoju leków przeciwmalarycznych. Pozwala to na rozwój pojedynczego leku przeciwko wszystkim infekcjom malarycznym, w tym szczepy wielolekooporne. Dostępność wielu miejsc docelowych ZFN w jednym genie w jednym genie zapewni alternatywne miejsca docelowe dla leków w celu zwalczania rozwoju oporności w przyszłości. --- Selektywna degradacja zmutowanych cząsteczek mitochondrialnego DNA (mtDNA) jest potencjalną strategią potencjalną strategią ponownego zasiedlania komórek cząsteczkami mtDNA typu dzikiego (wt) i w ten sposób w ten sposób złagodzić wadliwą funkcję mitochondriów, która leży u podstaw chorób mtDNA choroby. Nukleazy z palcem cynkowym (ZFN), które są nukleazami sprzężonymi z peptydem nukleazami sprzężonymi z peptydem z palcem cynkowym (ZFP) zaprojektowanym do wiązania określonej sekwencji DNA, mogą być przydatne do selektywnej degradacji określonych sekwencji mtDNA. Zazwyczaj, stosuje się pary komplementarnych ZFN, które heterodimeryzują na docelowej sekwencji DNA. DNA; jednak konwencjonalne ZFN były nieskuteczne w naszym systemie. Aby przezwyciężyć stworzyliśmy jednołańcuchowe ZFN poprzez sprzężenie dwóch domen nukleazy FokI, połączone elastycznym łącznikiem, do ZFP z N-końcową mitochondrialną sekwencją docelową. sekwencją celującą. Tutaj pokazujemy, że te ZFN są skutecznie transportowane do mitochondriów w komórkach i wiążą mtDNA w sposób specyficzny dla sekwencji rozróżniając dwie sekwencje o długości 12 pz, które różnią się jedną parą zasad parą zasad. Ze względu na ich selektywne wiązanie rozszczepiają dsDNA w przewidywanych miejscach sąsiadujących z mutacją. Po ekspresji w komórkach heteroplazmatycznych zawierających mieszankę zmutowanego i zmodyfikowanego mtDNA, te ZFN selektywnie degradują zmutowane mtDNA, zwiększając w ten sposób proporcję cząsteczek wt mtDNA w komórce. Dlatego, ukierunkowane na mitochondria jednołańcuchowe ZFN są obiecującym kandydatem do leczenia chorób mtDNA. w leczeniu chorób mtDNA. --- Inżynieria genetyczna stała się potężnym mechanizmem pozwalającym zrozumieć systemy systemów biologicznych i potencjalne podejście do leczenia chorób wrodzonych. Wraz z pojawieniem się tych technologii w ostatnich dziesięcioleciach wzrosła uzupełniająca analiza etycznych implikacji technik i zastosowań inżynierii genetycznej. technik i zastosowań inżynierii genetycznej. Chociaż podejścia za pośrednictwem wirusów zdominowały początkowe wysiłki w zakresie metod transferu genów (GT), pojawiająca się technologia obejmująca enzymów restrykcyjnych znanych jako nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) stała się potężną nową metodologią edycji genów. Biorąc pod uwagę korzyści zapewniane przez ZFN dla bardziej specyficznych i zróżnicowanych podejść do edycji genów w naukach podstawowych i zastosowaniach klinicznych. i zastosowań klinicznych, omawiamy, w jaki sposób badania ZFN mogą rozwiązać niektóre z etycznych i naukowych, które zostały postawione w odniesieniu do innych technik GT. Ma to szczególne znaczenie, biorąc pod uwagę rozmach, z jakim ZFN przechodzą obecnie do I fazy badań klinicznych. w przechodzeniu do I fazy badań klinicznych. Niniejsze badanie przedstawia historyczny opis genezy technologii ZFN, analizę obecnych technik i zastosowań oraz analizę zastosowań oraz analizę kwestii etycznych mających zastosowanie do inżynierii genetycznej ZFN we wczesnej fazie badań klinicznych. --- Nukleazy Zinc Finger (ZFN) zostały wykorzystane do stworzenia precyzyjnych modyfikacji genomu. w częstotliwościach, które mogą być terapeutycznie użyteczne w terapii genowej. terapii genowej. Stworzyliśmy mysi model ogólnej recesywnej choroby genetycznej, aby stworzyć przedkliniczny system do rozwoju wykorzystania korekcji genów za pośrednictwem ZFN w terapii genowej. do terapii genowej. Wprowadziliśmy zmutowany gen GFP do locus ROSA26 w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ES) i wykorzystaliśmy te komórki do stworzenia transgenicznej myszy. myszy. Wykorzystaliśmy ZFN do określenia częstotliwości korekcji genów przez w różnych pierwotnych komórkach z tego modelu. Osiągnęliśmy częstotliwości od 0,17 do 6% w różnych typach komórek, w tym w pierwotnych fibroblastach i astrocytach. fibroblastach i astrocytach. Wykazaliśmy, że fibroblasty skorygowane genami ex vivo mogą być przeszczepione z powrotem do myszy, gdzie zachowują skorygowany fenotyp. skorygowany fenotyp. Ponadto, osiągnęliśmy częstotliwości celowania powyżej 1% w komórkach ES, a docelowe komórki ES zachowały zdolność do różnicowania się w typy komórek ze wszystkich trzech linii zarodkowych. Podsumowując, potencjalnie terapeutycznie istotne częstotliwości celowania w geny za pośrednictwem ZFN mogą być osiągnąć w różnych komórkach pierwotnych, a komórki te mogą być następnie przeszczepione z powrotem do biorcy. --- Nukleazy cynkowo-palcowe (ZFN) są potężnym narzędziem, które można wykorzystać do edycji ludzkiego genomu ad libitum. Technologia ta doświadczyła znacznego rozwoju w ciągu ostatnich kilku lat w odniesieniu zarówno do specyficzności miejsca docelowego, jak i platform inżynieryjnych platform inżynieryjnych wykorzystywanych do generowania białek typu zinc-finger. W rezultacie przeprowadzono dwa badania kliniczne fazy I mające na celu wyeliminowanie receptora CCR5 w limfocytach T wyizolowanych od pacjentów z HIV w celu ochrony tych limfocytów przed zakażeniem wirusem. wirusem. Co więcej, ZFN zostały z powodzeniem zastosowane do znokautowania lub skorygowania genów związanych z chorobą w ludzkich komórkach macierzystych, w tym hematopoetycznych komórkach prekursorowych i indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych. Ukierunkowane inżynierii genomu w multipotencjalnych i pluripotencjalnych komórkach macierzystych wielkie nadzieje na przyszłe strategie ukierunkowane na korektę wrodzonych mutacji dla spersonalizowanych terapii zastępujących komórki. Niniejszy przegląd opisuje, w jaki sposób ZFN zostały zastosowane w modelach terapii genowej, omówiono możliwości i ryzyko związane z tą nowatorską technologią i sugeruje przyszłe kierunki ich bezpiecznego zastosowania w terapeutycznej inżynierii genomu. --- Stworzyliśmy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) od pacjenta z przewlekłą chorobą ziarniniakową sprzężoną z chromosomem X (X-CGD), defektem neutrofili generowania reaktywnych form tlenu (ROS) wynikających z niedoboru gp91(phox) niedobór. Wykazaliśmy, że dojrzałe neutrofile zróżnicowane z iPSC X-CGD iPSC nie wytwarzają ROS, odtwarzając patognomoniczny fenotyp komórkowy CGD. Ukierunkowany transfer genów do iPSCs, z późniejszą selekcją i pełną charakterystyką, aby zapewnić brak zmian poza celem, obiecuje korektę chorób monogenowych bez mutagenezy insercyjnej spowodowanej wielomiejscową integrację wektorów wirusowych lub plazmidowych. Gen za pośrednictwem nukleazy palca cynkowego ukierunkowanie pojedynczej kopii terapeutycznego minigenu gp91(phox) do jednego allelu "bezpiecznej przystani" locus AAVS1 w X-CGD iPSC bez wstawek poza celem spowodowało w trwałej ekspresji gp91(phox) i znacząco przywróciło produkcję neutrofilowych ROS neutrofili. Nasze odkrycia pokazują, w jaki sposób można zastosować precyzyjne ukierunkowanie genów do korekcji X-CGD przy użyciu nukleazy palca cynkowego i iPSC pacjentów. --- Trwała modyfikacja ludzkiego genomu in vivo jest niepraktyczna ze względu na niską częstotliwość rekombinacji homologicznej w ludzkich komórkach. niskiej częstotliwości rekombinacji homologicznej w komórkach ludzkich, co utrudnia badania biomedyczne i postęp w kierunku bezpiecznej i skutecznej terapii genowej. Tutaj przedstawiamy ogólne rozwiązanie wykorzystujące dwa podstawowe procesy biologiczne: ROZPOZNAWANIE DNA DNA przez białka C2H2 zinc-finger i ukierunkowaną homologicznie naprawę pęknięć dwuniciowych DNA. pęknięć podwójnej nici DNA. Białka cynkowo-palcowe zaprojektowane do rozpoznawania unikalnego miejsca chromosomalnego miejsce chromosomalne mogą być połączone z domeną nukleazy, a pęknięcie podwójnej nici indukowane przez powstałą nukleazę cynkowo-palcową może tworzyć określoną sekwencję zmiany poprzez stymulowanie homologicznej rekombinacji między chromosomem a pozachromosomalnym dawcą DNA. Pokazujemy, że nukleazy cynkowo-palcowe zaprojektowane przeciwko sprzężonej z chromosomem X mutacji ciężkiego złożonego niedoboru odporności (SCID) w genie IL2Rgamma dały ponad 18% zmodyfikowanych genowo komórek ludzkich bez selekcji. selekcji. Co ciekawe, około 7% komórek uzyskało pożądaną modyfikację genetyczną na obu chromosomach X. na obu chromosomach X, z genotypem komórki dokładnie odzwierciedlonym na poziomie na poziomie informacyjnego RNA i białka. Obserwujemy porównywalnie wysokie częstotliwości w ludzkich limfocytów T, podnosząc możliwość strategii opartych na nukleazach cynkowo-palcowych w leczeniu chorób. --- Wykorzystanie zmodyfikowanych nukleaz, takich jak Zinc Finger Nucleases (ZFNs) lub Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN), aby dokonać ukierunkowanych modyfikacji genomu modyfikacji genomu stało się powszechną techniką tworzenia nowych modeli organizmów i niestandardowych linii komórkowych. organizmów modelowych i niestandardowych linii komórkowych i okazała się bardzo obiecująca w leczeniu chorób. leczenia chorób. Jednak te nukleazy mają potencjał do rozszczepiania poza celem które mogą zmylić interpretację wyników eksperymentalnych i być szkodliwe dla zastosowań terapeutycznych. Tutaj opisujemy metodę testowania rozszczepienia nukleazy w potencjalne miejsca poza celem przewidywane przez modele bioinformatyczne. --- Nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) są związane ze śmiercią komórki i apoptozą poprzez wiązanie w niezliczonych niepożądanych miejscach. Ta cytotoksyczność jest związana z ze zdolnością do wiązania odmiennych sekwencji DNA z wysokim powinowactwem. sekwencji DNA z wysokim powinowactwem. Ogólnie rzecz biorąc, preferencje wiązania czynników transkrypcyjnych są związane ze znaczną zdegenerowaną różnorodnością i złożonością co utrudnia projektowanie i inżynierię precyzyjnych domen wiążących DNA. Sukces ewolucyjny naturalnych białek palca cynkowego świadczy jednak o tym, że natura stworzyła specyficzne cechy i strategie ewolucyjne, takie jak modularność i rozpoznawanie specyficzne dla rangi, aby poradzić sobie ze złożonością wiązania, które są krytyczne do tworzenia klinicznie opłacalnych narzędzi do precyzyjnej modyfikacji ludzkiego genomu. Nasze odkrycia wskazują na zachowanie ogólnej modułowości i znaczącą zmianę specyficznych dla rangi preferencji wiązania trójpalczastej domeny wiążącej czynnika transkrypcyjnego SP1 podczas wymiany aminokwasów w drugim palcu.
Czy nukleazy z palcem cynkowym mogą być wykorzystywane do zwalczania chorób?
Tak, nukleazy z palcem cynkowym są użytecznym narzędziem w leczeniu chorób.