Ekspansja sekwencji powtórzeń tandemowych jest odpowiedzialna za ponad 20 ludzkich chorób. chorób. Zidentyfikowano kilka elementów cis i czynników trans zaangażowanych w niestabilność powtórzeń (ekspansję i kurczenie). Jednak żaden kompleksowy model wyjaśniającego duże międzypokoleniowe lub somatyczne zmiany długości sekwencji powtórzeń. powtarzających się sekwencji. Kilka linii dowodów, zgromadzonych z różnych badań modelowych wskazuje, że transkrypcja przez sekwencje powtórzone jest ważnym czynnikiem promującym ich niestabilność. Trwała interakcja między matrycą transkrypcyjną DNA a powstającym RNA (hybrydy RNA-DNA, pętle R) stymuluje niestabilność genomu. Niedawno wykazaliśmy, że kotranskrypcyjne hybrydy RNA-DNA są preferencyjnie tworzone na bogatych w GC trinukleotydowych i tetranukleotydowych sekwencjach powtórzonych in vitro, jak również w ludzkim genomowym DNA. genomowym DNA. Dodatkowo wykazaliśmy, że kotranskrypcyjne tworzenie hybryd RNA-DNA hybryd RNA-DNA przy powtórzeniach CTG-CAG i GAA-TTC stymuluje niestabilność tych sekwencji zarówno w komórkach E. coli, jak i ludzkich. Nasze wyniki sugerują, że trwałe hybrydy RNA-DNA mogą być również odpowiedzialne za inne skutki rozszerzonych powtórzeń trinukleotydowych. powtórzeń trójnukleotydowych, w tym wyciszanie genów. Biorąc pod uwagę zakres transkrypcji przez ludzki genom, a także obfitość bogatych w GC i / lub niekanonicznej struktury DNA tworzącej tandemowe powtórzenia, hybrydy RNA-DNA mogą reprezentować wspólną konformację mutagenną. Dlatego pętle R są potencjalnie atrakcyjnym celem terapeutycznym w chorobach związanych z niestabilnością genomu. --- Wewnętrzne sygnały terminacji dla wielopodjednostkowych bakteryjnych polimeraz RNA (RNAP) kodują bogatą w GC strukturę pętli macierzystej, po której następuje przewód poliurydynowy [poli(U)], i zaproponowano, że steryczne zderzenie pętli macierzystej z porem wyjściowym RNAP nakłada siłę ścinającą na RNA w dalszej hybrydzie RNA:DNA DNA, powodując niewspółosiowość miejsca aktywnego. Niespokrewniony strukturalnie T7 RNAP kończy się na podobnym typie sygnału (TΦ), co sugeruje wspólny mechanizm terminacji. mechanizm terminacji. W przypadku braku spinki do włosów (warunki pasywne), T7 RNAP ślizga się wydajnie zarówno w homopolimerycznym A, jak i U, a my odkryliśmy że zastąpienie traktu U w TΦ podatnym na poślizg traktem A nadal pozwala na wydajną terminację. W warunkach pasywnych, włączenie pojedynczej reszty G podążającej za traktem poli(U) (co ma miejsce podczas terminacji w TΦ) skutkuje "zablokowanym" kompleksem, który nie jest w stanie przedłużyć transkryptu. Nasze wyniki wspierają model, w którym przenoszenie siły ścinającej generowanej przez steryczne zderzenie spinki do włosów z porem wyjściowym jest promowane przez obecność śliskich szlaków, co skutkuje zmianami w miejscu aktywnym i tworzeniem zablokowanego kompleksu, który tworzenie zablokowanego kompleksu, który reprezentuje wczesny etap w ścieżce terminacji szlaku. --- Zakończenie transkrypcji przez bakteryjną polimerazę RNA (RNAP) występuje w sekwencjach kodujących bogatą w GC spinkę do włosów RNA, po której następuje szlak bogaty w U. Użyliśmy techniki pojedynczej cząsteczki do zbadania mechanizmu, za pomocą którego trzy reprezentatywne terminatory (his, t500 i tR2) destabilizują kompleks elongacyjny (EC). (EC). W przypadku terminatorów his i tR2, obciążenia wywierane w celu tendencyjnej translokacji nie miały wpływu na wydajność terminacji (TE). Jednakże, zależna od siły kinetyka uwalniania i zależna od siły TE mutanta sugerują mechanizm translokacji do przodu mechanizm translokacji do przodu dla terminatora t500. Napięcie na izolowanych odcinkach U indukowało uwalnianie transkryptu w sposób zgodny z hybrydowym ścinaniem RNA:DNA. Wnioskujemy, że różne mechanizmy, obejmujące hipertranslację lub ścinanie, działają na terminatorach z różnymi U-traktami. Napięcie zastosowane do RNA w terminatorach w terminatorach sugeruje, że zamknięcie końcowych 2-3 zasad spinki do włosów destabilizuje destabilizuje hybrydę i że konkurujące struktury RNA modulują TE. Proponujemy ilościowy, energetyczny model, który przewiduje zachowanie tych terminatorów i zmutowanych wariantów. --- Sklonowany ludzki cDNA apo-C-II został użyty jako sonda hybrydyzacyjna do identyfikacji ludzkiego genu apo-C-II w bibliotece genomowej skonstruowanej w naszym laboratorium. ludzkiego genu apo-C-II w bibliotece genomowej skonstruowanej w naszym laboratorium. Wyizolowany Wyizolowane DNA apo-C-II badano zarówno za pomocą mikroskopii elektronowej, jak i bezpośredniej analizy sekwencji. analizę sekwencji. Ultrastrukturalna analiza morfologiczna hybryd RNA-DNA ujawniła, że gen apo-C-II ma złożoną strukturę z powodu regionów odwróconych sekwencji komplementarnych w genie i wokół niego, tworzących struktury łodygi i pętli które zakłócają tworzenie stabilnych hybryd RNA:DNA. Obszerna analiza morfologiczna ujawniła co najmniej 3 sekwencje interferujące (IVS), a ich długości zostały zmierzone. Bezpośrednia analiza sekwencji sklonowanego genu potwierdziła obecność 3 IVS. W IVS-I znajdują się 4 sekwencje typu Alu. Sekwencjonowaliśmy 4340 nukleotydów, w tym 545 nukleotydów w regionie 5' flankującym region, cały gen, który obejmuje 3320 nukleotydów i 475 nukleotydów w regionie 3', który obejmuje również dodatkową sekwencję Alu. Koniec 5' genu został zidentyfikowany przez wydłużenie startera i sekwencjonowanie startera przedłużonego cDNA. Strukturę mRNA Apo-C-II wydedukowano z sekwencji cDNA, eksperymentów wydłużania primerów i i sekwencji genomowej. Jego długość wynosi 494 nukleotydy długości. Jego sekwencja różni się od wcześniej opublikowanych sekwencji tym, że 7 dodatkowych nukleotydów przed ogonem poliadenylanowym. W regionie flankującym 5' region, nukleotydy -234 do -213 obejmują region bogaty w GC, który wykazuje wysoką homologię (większą niż 70%) do regionów flankujących 5' genów wszystkich apolipoprotein opublikowanych do tej pory, a mianowicie apo-A-II (-497 do -471), apo-A-I (około -196 do -179), apo-E (-409 do -391) i apo-C-III (około -116 do -103). Ten wysoce konserwowany region może reprezentować pewne ewolucyjnie ewolucyjnie zachowane sekwencje z tych powiązanych genów i / lub może reprezentować region z funkcją regulacyjną.
Czy hybrydy RNA:DNA preferencyjnie tworzą się w regionach o wysokiej lub niskiej zawartości GC?
Transkrypcja przez region bogaty w GC sprzyja tworzeniu pętli R, przy czym powstający (bogaty w G) RNA tworzy stabilną hybrydę RNA:DNA z matrycową nicią DNA.