Polaryzacja jest krytycznym mechanizmem dla prawidłowego funkcjonowania wielu typów komórek. typów komórek. W przypadku limfocytów ma ona zasadnicze znaczenie dla różnych procesów, w tym migracji z krwi do innych tkanek i odwrotnie. W komórkach NK i CTL mechanizm dostarczania granulek cytotoksycznych wymaga polaryzacji w celu przemieszczenia granulek do synapsy immunologicznej. do synapsy immunologicznej (IS), w zabijaniu komórek nowotworowych i zakażonych wirusem. komórek. Ostatnio okazało się, że endosomy są również zaangażowane w mechanizm cytotoksyczny. mechanizmie cytotoksycznym. Stosując metodę koniugacji in vitro, pokazujemy, że w komórkach w komórkach NK-92, endosomalna sortująca nexyna 27 (SNX27) polaryzuje się do IS podczas zaangażowania komórek nowotworowych w odrębnym przedziale w odrębnym przedziale sąsiadującym z granulkami cytotoksycznymi. My pokazujemy również, że SNX27 polaryzuje się do błony wierzchołkowej, naprzeciwko uropodu, podczas migracji komórek NK. Te wcześniej niepublikowane wyniki wskazują, że SNX27 jest uczestnikiem polaryzacji komórek NK, jako mediator lub cel tego mechanizmu. mechanizm. --- Receptor 5-hydroksytryptaminy typu 4 (5-HT4R) jest zaangażowany w uczenie się, karmienie, kontrolę oddychania i tranzyt żołądkowo-jelitowy. Receptor ten jest jednym receptorów sprzężonych z białkiem G, dla których alternatywny splicing mRNA generuje najwięcej wariantów różniących się C-końcowymi końcami. Niektóre warianty 5-HT4R (a, e i f) wyrażają kanoniczne ligandy PDZ na swoich C-końcach. Tutaj zbadaliśmy, czy niektóre mysie warianty 5-HT4R wiążą się z określonymi zestawami białkami, stosując podejście proteomiczne oparte na chromatografii powinowactwa peptydowego, dwuwymiarową elektroforezę i spektrometrię mas. Zidentyfikowaliśmy dziesięć białka, które oddziałują specyficznie z 5-HT4 (a) R i trzy, które tylko kojarzą się tylko z 5-HT4(e)R. Większość z nich to białka PDZ. Wśród białek które wiązały się specyficznie z wariantem 5-HT4 (a) R, NHERF znacznie zmodyfikował jego lokalizację subkomórkową. Co więcej, NHERF rekrutował 5-HT4 (a) R do mikrokosmków, gdzie lokalizował się z aktywowaną ezryną, zgodnie z rolą 5-HT4 (a) R w przebudowie cytoszkieletu. 5-HT4 (a) R oddziaływał również zarówno z konstytutywne i indukowalne (po leczeniu metamfetaminą) formy niedawno sklonowaną neksyną sortującą 27 (odpowiednio SNX27a i b). Stwierdziliśmy, że SNX27a przekierowała część 5-HT4(a)R do wczesnych endosomów. Interakcja Warianty splicingu 5-HT4R z różnymi zestawami białek PDZ mogą określać ich lokalizację komórkową, jak również ich właściwości transdukcji sygnału. --- Kanały potasowe bramkowane białkiem G (Kir3) są ważne dla kontrolowania pobudliwości neuronów w mózgu. pobudliwości neuronów w mózgu. Stosując podejście proteomiczne, zidentyfikowaliśmy unikalne wewnątrzkomórkowe białko unikalne białko wewnątrzkomórkowe gryzoni, sortującą nexynę 27 (SNX27), która reguluje przepływ kanałów Kir3. Podobnie jak większość nexyn sortujących, SNX27 posiada funkcjonalną domenę PX, która selektywnie wiąże fosfolipid błonowy fosfatydyloinozytolo-3-fosforan (PI3P) i jest ważna dla przemieszczania się do wczesnego endosomu. SNX27 jest jednak jedyną neksyną sortującą, która zawiera domenę PDZ domenę. Ta domena PDZ rozróżnia kanały o podobnych motywach wiążących PDZ klasy I PDZ, wiążąc się z C-końcowym końcem Kir3.3 i Kir3.2c (-ESKV), ale nie z Kir2.1 (-ESEI) lub Kv1.4 (-ETDV). SNX27 promuje endosomalny ruch kanałów Kir3, prowadząc do zmniejszonej ekspresji powierzchniowej, zwiększonej degradacji i mniejszych prądów potasowych Kir3. Regulacja endosomalnego przemieszczania się za pośrednictwem nexyn sortujących ujawnia nieznany wcześniej mechanizm do kontrolowania ekspresji powierzchniowej kanałów potasowych. --- CASP jest małym białkiem indukowanym cytokinami, wyrażanym głównie w komórkach hematopoetycznych. które wiąże się z członkami rodziny czynników wymiany nukleotydów guaninowych Cytohesin/ARNO. czynników wymiany nukleotydów guaninowych. Cytohezyny aktywują ARF, grupę GTPaz zaangażowanych w inicjację pęcherzykową. Funkcjonalnie, CASP jest białkiem adaptorowym zawierającym domenę PDZ, zwiniętą cewkę i potencjalny terminal karboksylowy motyw wiążący PDZ, który staraliśmy się tutaj scharakteryzować. Używając GST pulldowns i spektrometrii mas zidentyfikowaliśmy nową interakcję CASP i nexiny sortującej 27 (SNX27). W limfocytach motyw wiążący PDZ CASP oddziałuje z domeną PDZ domeny SNX27. Białko to jest unikalnym członkiem rodziny nexin sortujących białek, grupy ogólnie zaangażowanej w endocytarne i wewnątrzkomórkowe sortowanie maszyny. Endogenne SNX27 i CASP kolokalizują we wczesnym przedziale endosomalnym w limfocytach, a także w badaniach transfekcji. Wyniki te sugerują, że endosomalna SNX27 może rekrutować CASP do orkiestracji wewnątrzkomórkowego wewnątrzkomórkowych i/lub kompleksów sygnalizacyjnych. --- Kinaza diacyloglicerolowa zeta jest członkiem rodziny kinaz diacyloglicerolowych. enzymów, które generują kwas fosfatydowy poprzez fosforylację diacyloglicerolu fosforylację. Oprócz domen katalitycznych i bogatych w cysteinę występujących we wszystkich kinazach diacyloglicerolowych, kinaza diacyloglicerolowa zeta posiada domenę MARCKS, jak również a także region C-końcowy zawierający cztery powtórzenia ankyryny i motyw wiążący PDZ PDZ. Poprzednie doniesienia wykazały, że interakcja kinazy diacyloglicerolowej zeta z kilkoma białkami jest ważnym mechanizmem modulującym lokalizację i aktywność tego enzymu. i aktywność tego enzymu. Tutaj zastosowaliśmy podejście proteomiczne do poszukiwania nowych białek oddziałujących z kinazą diacyloglicerolową zeta i zidentyfikowaliśmy sortującą nexin 27 (SNX27), niedawno opisanego członka rodziny białek zaangażowanych w transport wewnątrzkomórkowy wewnątrzkomórkowy transport, który ma domenę PDZ oprócz domeny homologii phox charakterystyczną dla białek SNX. Badania koimmunoprecypitacji i analiza dwuhybrydowa potwierdziły fizyczną, zależną od PDZ asocjację między SNX27 i kinazą diacyloglicerolową zeta. Ponieważ kinaza diacyloglicerolowa zeta jest w limfocytach T, scharakteryzowaliśmy ekspresję SNX27 i subkomórkową lokalizację w tych komórkach. i lokalizację subkomórkową w tych komórkach. SNX27 kolokalizowała z pęcherzykami transferyny pozytywnymi pęcherzykami, wskazując na jego udział w recyklingu endocytarnym limfocytów T. recyklingu. Ekspresja mutantów delecyjnych ujawniła, że oprócz domeny homologii phox domena PDZ SNX27 przyczyniła się do lokalizacji tego białka w pęcherzykach. białka, co sugeruje, że interakcja z kinazą diacyloglicerolową zeta reguluje lokalizację SNX27. SNX27. Analiza komórek z knockdownem za pośrednictwem interferencji RNA kinazy diacyloglicerolowej zeta wykazała przyspieszone wyjście receptora transferyny z z przedziału recyklingu endocytarnego limfocytów z powrotem do błony plazmatycznej, dalsze potwierdzenie zależnej od kinazy diacyloglicerolowej zeta kontroli pęcherzyków pęcherzyków. Dane te potwierdzają wcześniej nieopisaną rolę kinazy diacyloglicerolowej kinazy zeta w modulacji transportu błonowego, co może również pomóc w zdefiniować funkcję SNX27. --- Nexin sortujący 27 (SNX27) należy do rodziny białek nexin sortujących, które uczestniczą w transporcie pęcherzykowym i białkowym. Podobnie jak wszystkie białka białka, SNX27 ma funkcjonalną domenę PX, która jest ważna dla wiązania endosomu ale jest to jedyna neksyna sortująca z domeną PDZ. Zidentyfikowaliśmy SNX27 jako partnera kinazy diacyloglicerolowej ζ (DGKζ), negatywnego regulatora funkcji komórek T który metabolizuje diacyloglicerol w celu uzyskania kwasu fosfatydowego. SNX27 oddziałuje z motywem wiążącym PDZ DGKζ we wczesnych/recyklingowych endosomach w spoczynkowych komórkach T. spoczynkowych limfocytów T; jednak dynamika i mechanizmy leżące u podstaw lokalizacji subkomórkowej SNX27 podczas aktywacji komórek T są nieznane. Wykazaliśmy, że że w komórkach T, które napotykają pulsujące komórki prezentujące antygen, SNX27 w tranzycie na wczesnych/recyklingowych endosomach polaryzują się do synapsy immunologicznej. Frakcja SNX27 gromadzi się w dojrzałej synapsie immunologicznej w procesie, który jest zależnym od transportu pęcherzykowego, wiązania domeny PX do fosfatydyloinozytolu 3-fosforanu i obecności regionu PDZ. Obniżenie ekspresji SNX27 lub DGKζ skutkuje zwiększoną podstawową i fosforylacji ERK wyzwalanej przez antygen. Wyniki te identyfikują SNX27 jako zawierający PDZ składnik synapsy immunologicznej komórek T i wykazują rolę tego białka w regulacji szlaku Ras-ERK, sugerując funkcjonalny związek między SNX27 i DGKζ. --- Neoksyny sortujące (SNX) zawierające domenę Phox (PX) stają się ważnymi regulatorami transportu endocytarnego. regulatory transportu endocytarnego. Seksyna sortująca 27 (SNX27) jest wyjątkowa, ponieważ zawiera domenę PDZ (Psd-95/Dlg/ZO1). Pokazujemy tutaj, że SNX27 jest przede wszystkim ukierunkowana na wczesny endosom poprzez interakcję jej domeny PX z PtdIns(3)P. Chociaż ukierunkowana ablacja genu SNX27 u myszy nie wpłynęła znacząco wpływać na wzrost i przeżycie podczas rozwoju embrionalnego, SNX27 odgrywa istotną rolę we odgrywa istotną rolę w postnatalnym wzroście i przeżyciu. Receptor N-metylo-d-asparaginianu (NMDA) receptor 2C (NR2C) został zidentyfikowany jako nowe białko oddziałujące z SNX27, a ta w interakcji pośredniczy domena PDZ SNX27 i C-końcowy motyw wiążący PDZ NR2C. motyw wiążący PDZ NR2C. Zwiększone poziomy ekspresji NR2C, wraz z upośledzona endocytoza NR2C w neuronach SNX27 (-/-) wskazuje, że SNX27 może może regulować endocytozę i/lub sortowanie endosomalne NR2C. Jest to zgodne z rolą SNX27 jako ogólnego regulatora sortowania białek błonowych białek błonowych zawierających motyw wiążący PDZ, a jego brak może zmienić może zmieniać przemieszczanie się tych białek, prowadząc do defektów wzrostu i przeżycia. --- Bramkowane białkiem G kanały potasowe prostujące do wewnątrz (Kir3) są zaangażowane w regulując pobudliwość błon w mózgu. Wykazano, że kanały Kir3 odgrywają rolę w uczeniu się, analgezji i uzależnieniu od narkotyków. Niewiele wiadomo na temat regulacji regulacji kanałów Kir3 na powierzchni komórki. Stosując podejście proteomiczne niedawno odkryliśmy, że neksyna sortująca 27 (SNX27) wiąże się z podzbiorem kanałów Kir3. kanałów Kir3. Neoksyny sortujące są zaangażowane w przemieszczanie białek przez przedziały endosomalne. Pojedyncza domena PDZ SNX27 wiąże się bezpośrednio do motyw wiązania PDZ kanałów Kir3, prowadząc do ich obniżenia. Tutaj zbadaliśmy funkcjonalny wpływ ekspresji SNX27b na różne kombinacje podjednostek rodziny Kir3. podjednostek rodziny Kir3. Nasze wyniki pokazują, że regulacja kanałów Kir3 przez SNX27 zależy krytycznie od kombinacji podjednostek Kir3. Ten regulacja specyficzna dla podjednostki może być ważna dla określenia zakresu hamowania Kir3 w stanach normalnych i chorobowych, takich jak uzależnienie od narkotyków. uzależnienie od narkotyków. --- Sortowanie nexin 27 (SNX27), białko domeny PDZ wzbogacone o mózg, reguluje endocytarne sortowanie i transport. Tutaj pokazujemy, że myszy Snx27(-/-) mają poważne deficyty neuronalne w hipokampie i korze mózgowej. Chociaż myszy Snx27(+/-) mają rażąco normalną neuroanatomię, stwierdziliśmy wady funkcji synaptycznej, uczenia się i pamięci i zmniejszenie ilości jonotropowych receptorów glutaminianu (NMDA i AMPA) u tych myszy. SNX27 oddziałuje z tymi receptorami poprzez domenę domenę PDZ, regulując ich recykling do błony plazmatycznej. My wykazujemy jednoczesną zmniejszoną ekspresję SNX27 i wiązania CCAAT / enhancer białka β (C/EBPβ) w mózgach z zespołem Downa i identyfikujemy C/EBPβ jako czynnik transkrypcyjny dla SNX27. czynnik transkrypcyjny dla SNX27. Zespół Downa powoduje nadekspresję miR-155, mikroRNA kodowanego przez chromosom 21, który negatywnie reguluje C/EBPβ, zmniejszając w ten sposób ekspresję SNX27 i powodując dysfunkcję synaptyczną. Regulacja SNX27 w hipokampie myszy z zespołem Downa ratuje deficyty synaptyczne i poznawcze. i deficyty poznawcze. Nasza identyfikacja roli SNX27 w funkcji synaptycznej ustanawia nowy molekularny mechanizm patogenezy zespołu Downa. --- Bramkowane białkiem G kanały potasowe prostujące do wewnątrz (GIRK) odgrywają ważną rolę w regulacji pobudliwości neuronów. odgrywają ważną rolę w regulacji pobudliwości neuronów. Sortowanie nexin 27b (SNX27b), które zmniejsza ekspresję powierzchniową kanałów GIRK poprzez interakcję domeny PDZ, zawiera domniemaną domenę asocjacji Ras (RA) o nieznanej funkcji. Usunięcie domeny RA w SNX27b (SNX27b-ΔRA) zapobiega regulacji w dół kanałów GIRK2c/GIRK3. Podobnie, mutacja punktowa (K305A) w domenie RA zakłóca regulację kanałów GIRK2c/GIRK3 i zmniejsza wiązanie H-Ras in vitro. Wreszcie, dominująco-ujemny H-Ras (S17N) blokuje zależne od SNX27b spadek ekspresji powierzchniowej kanałów GIRK2c/GIRK3. Zatem obecność funkcjonalnej domeny funkcjonalna domena RA i interakcja z białkami G podobnymi do Ras obejmują nowy mechanizm modulowania kontroli SNX27b ekspresji powierzchniowej kanałów GIRK i pobudliwości komórkowej. --- Motywy oddziałujące z domeną postsynaptyczną 95/discs large/zonus occludens-1 (PDZ), oprócz dobrze ugruntowanej roli rusztowania białkowego motywy, oprócz ich dobrze ugruntowanej roli w rusztowaniu białkowym na powierzchni komórki, proponuje się, aby działały jako determinanty cis kierujące molekularnego sortowania ładunku transmembranowego z endosomów do błony plazmatycznej. Hipoteza ta wymaga istnienia specyficznego trans-działającego białka PDZ które pośredniczy w proponowanej operacji sortowania w błonie endosomu. Tutaj pokazujemy, że nexin sortujący 27 (SNX27) jest wymagany do wydajnego, ukierunkowanego na PDZ recyklingu beta(2)-adrenoreceptora (beta(2)AR) z wczesnych endosomów. SNX27 pośredniczy w tej funkcji sortowania, gdy ulega ekspresji na poziomach endogennych, a jego aktywność recyklingu wymaga zarówno zależnego od domeny PDZ rozpoznawania cytoplazmy beta (2) AR ogon cytoplazmatyczny i zależne od domeny Phox homology (PX) skojarzenie z błoną endosomu. Wyniki te identyfikują dyskretną rolę SNX27 w PDZ-kierowany recykling fizjologicznie ważnego receptora sygnalizacyjnego i rozszerzają koncepcję sortowania molekularnego specyficznego dla ładunku w szlaku recyklingu. --- Sorting nexin 27 (SNX27) jest białkiem o masie 62 kDa zlokalizowanym we wczesnych endosomach i reguluje wewnątrzkomórkowy transport kanałów jonowych i receptorów. Oprócz domeny PX, SNX27 jest jedynym członkiem rodziny sortującej, który zawiera domenę PDZ. Aby zidentyfikować nowych partnerów wiążących SNX27-PDZ, my przeprowadziliśmy badanie proteomiczne w komórkach kory zbiorczej nerki głównej myszy wykorzystując konstrukt fuzyjny GST-SNX27 jako przynętę. Odkryliśmy, że β-Pix (p21-activated kinase-interactive exchange factor), czynnik wymiany nukleotydów guaniny czynnik wymiany dla rodziny małych GTPaz Rho, o których wiadomo, że regulują ruchliwość komórek bezpośrednio oddziaływał z SNX27. Powiązanie β-Pix i SNX27 jest specyficzna dla izoform β-Pix zakończonych motywem wiążącym PDZ typu 1 (ETNL). W tym samym badaniu zidentyfikowaliśmy również Git1/2 jako potencjalne białko oddziałujące z SNX27. białko. Interakcja między SNX27 i Git1/2 jest pośrednia i odbywa się za pośrednictwem β-Pix. Ponadto wykazaliśmy rekrutację kompleksu β-Pix-Git do miejsc endosomalnych w sposób zależny od SNX27. Wreszcie, testy migracji wykazały, że SNX27 z komórek HeLa i mysiego głównego korowego przewodu zbiorczego nerki znacząco zmniejsza ruchliwość komórek. znacząco zmniejsza ruchliwość komórek. Proponujemy model, w którym SNX27 reguluje przemieszczanie się β-Pix do ogniskowych przyczepów, a tym samym wpływa na ruchliwość komórek. ruchliwość komórek.
Jakie są funkcje sortowania nexin 27?
Sorting nexin 27 (SNX27) reguluje sortowanie/recykling endocytarny i wewnątrzkomórkowy ruch kanałów jonowych i receptorów.