Wdrożenie bioremediacji uranu wymaga zastosowania metod monitorowania i aktywności podpowierzchniowych społeczności drobnoustrojów, które są odpowiedzialnych za redukcję rozpuszczalnego U(VI) do nierozpuszczalnego U(IV). Tutaj przedstawiamy podejście oparte na proteomice do jednoczesnego dokumentowania członkostwa szczepu i fizjologii mikrobiologicznej dominujących członków społeczności Geobacter podczas in situ w zanieczyszczonej U warstwie wodonośnej Rifle, CO. Trzy próbki zdominowane przez planktoniczne Geobacter uzyskano z dwóch studni w dół gradientu dodawania octanu. Ponad 2500 białek z każdej z tych próbek próbek zidentyfikowano poprzez dopasowanie widm chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas do peptydów przewidywanych na podstawie siedmiu genomów izolatów Geobacter. Peptydy specyficzne dla genomu wskazują na wczesną proliferację wielu izolatów M21 i Geobacter bemidjiensis i późniejsze możliwe pojawienie się szczepów M21 i G. bemidjiensis bliżej spokrewnionych z Geobacter lovleyi. Przez cały czas biostymulacji, proteom jest zdominowany przez enzymy, które przekształcają octan do acetylo-koenzymu A i pirogronianu dla centralnego metabolizmu, podczas gdy obfite peptydy pasujące do białek cyklu kwasu trikarboksylowego i podjednostek syntazy ATP zostały również wskazujące na znaczenie wytwarzania energii w okresie szybkiego wzrostu po rozpoczęciu biostymulacji. Ewoluujący skład szczepu Geobacter może być powiązana ze zmianami w obfitości białek w trakcie biostymulacji i może odzwierciedlać zmiany biostymulacji i może odzwierciedlać zmiany w funkcjonowaniu metabolicznym. Zatem, proteogenomika niezależna od metagenomiki może być wykorzystana do diagnozowania stanu podpowierzchniowych konsorcjów Geobacter. stanu podpowierzchniowych konsorcjów, na których opiera się biotechnologia remediacyjna. --- Poprzednie badania terenowe dotyczące bioremediacji in situ skażonych uranem w warstwie wodonośnej w Rifle w Kolorado zidentyfikowano dwie odrębne fazy po dodaniu octanu w celu stymulacji oddychania drobnoustrojów. W fazie I, gatunki Geobacter są dominującymi organizmami, Fe(III) jest redukowany, a mikrobiologiczna redukcja rozpuszczalnego U(VI) do nierozpuszczalnego U(IV) usuwa uran z wód gruntowych. wód gruntowych. W fazie II, Fe(III) jest zubożone, siarczany są redukowane, a bakterie redukujące siarczany dominują. dominują bakterie redukujące siarczany. Długoterminowe monitorowanie ujawniło nieoczekiwaną trzecią fazę, podczas której usuwanie U(VI) trwa nawet po zaprzestaniu dodawania octanu. nawet po zaprzestaniu dodawania octanu. Wszystkie trzy fazy zostały z powodzeniem odtworzone w kolumnach osadowych przepływowych kolumnach osadów. Gdy osady z trzeciej fazy były sterylizowane termicznie sterylizowane termicznie, zdolność do usuwania U(VI) została utracona. W żywych osadach U(VI) usunięty z wód gruntowych został odzyskany jako U(VI) w osadach. To kontrastuje z odzyskiwaniem U(IV) w osadach wynikającym z redukcji U(VI) do U(IV) podczas fazy redukcji Fe(III) w osadach wzbogaconych octanem. Analiza sekwencji genów 16S rRNA w osadach, w których adsorbowany był U(VI) wskazywała, że dominującymi organizmami byli przedstawiciele Firmicutes. podczas gdy nie wykryto sekwencji Firmicutes w osadach tła, które nie nie miały zdolności do sorpcji U(VI), co sugeruje, że adsorpcja U(VI) może być być spowodowana obecnością tych żywych organizmów lub przynajmniej ich nienaruszonych składników komórkowych. komórkowych. Ta nieoczekiwana zwiększona adsorpcja U(VI) na osadach po stymulacji wzrostu drobnoustrojów w podpowierzchni może potencjalnie zwiększyć efektywność kosztową bioremediacji uranu in situ. --- Geochemia i mikrobiologia skażonego uranem środowiska podpowierzchniowego środowisko, które przeszło dwa sezony dodawania octanu w celu stymulacji aby stymulować mikrobiologiczną redukcję U(VI). Istniały wyraźne poziome i pionowe gradienty geochemiczne, które można w dużej mierze przypisać sposób, w jaki octan był rozprowadzany w warstwie wodonośnej, z większą redukcją Fe(III) i siarczanów zachodziła na większych głębokościach i bliżej punktu wtrysku octanu. wstrzyknięcia octanu. Biblioteki klonów genów 16S rRNA pochodzących z osadów i wód gruntowych wód podziemnych wykazały wzbogacenie bakterii redukujących siarczany z rzędu Desulfobacterales w próbkach osadów i wód gruntowych. Próbki te zostały pobrane najbliżej galerii zatłaczającej, gdzie mikrobiologicznie redukowalne tlenki Fe(III) mikrobiologicznie redukowalne tlenki Fe(III), stężenia siarczanów w wodach gruntowych były niskie, a w osadach zaobserwowano wzrost stężenia kwaśnych lotnych siarczków. Dalej w dół gradientu, warunki redukcji metali były obecne, na co wskazują pośredni stosunek Fe(II)/Fe(całkowity), niższe wartości kwaśnych lotnych siarczków i zwiększona obfitość sekwencji genów 16S rRNA należących do dysymilacyjnego Fe(III)- i U(VI)-redukujących z rodziny Geobacteraceae. Maksymalna redukcja Fe(III) i U(VI) korelowała z maksymalnym odzyskiem sekwencji genów 16S rRNA Geobacteraceae zarówno w wodach gruntowych, jak i osadach. Geobacteraceae zarówno w wodach gruntowych, jak i osadach; jednak miejsca, w których wystąpiły te maksima były przestrzennie oddzielone w warstwie wodonośnej. Znacząca mikrobiologiczna i geochemiczna heterogeniczność w tym miejscu pokazuje, że próby należy podjąć próby dostarczenia octanu w bardziej jednolity sposób i że ściśle w odstępach poziomych i pionowych, zarówno w osadach, jak i wodach gruntowych. w osadach i wodach gruntowych, aby uzyskać bardziej dogłębne zrozumienie procesów mikrobiologicznych i procesów mikrobiologicznych i względnego udziału populacji przywiązanych i planktonicznych w bioremediacji uranu in situ. --- Ograniczenie składników odżywczych jest stresem środowiskowym, który może zmniejszyć skuteczność strategii bioremediacji, zwłaszcza gdy zanieczyszczenia są związkami organicznymi związki organiczne lub gdy związki organiczne są dodawane w celu promowania aktywności drobnoustrojów takich jak redukcja metali. Geny wskazujące na ograniczenie fosforanów zostały zidentyfikowane przez analizę mikromacierzy kultur chemostatowych Geobacter sulfureducens. Analiza ta ujawniła, że geny w operonie pst-pho, który jest związanego z systemem pobierania fosforanów o wysokim powinowactwie w innych mikroorganizmach, miały znacznie wyższą obfitość transkryptu w warunkach ograniczających fosforany warunki, przy czym geny pstB i phoU ulegały największej regulacji. Ilościowa analiza PCR poziomów transkryptów pstB i phoU u G. sulfurreducens hodowanych w chemostatach chemostatach wykazała, że ekspresja tych genów wzrosła, gdy fosforan został usunięty z pożywki hodowlanej. Transkrypty pstB i phoU w podpowierzchniowych gatunkach Geobacter dominujących podczas bioremediacji uranu in situ uranu i bioremediacji były bardziej obfite niż w hodowlach chemostat G. sulfurreducens, które nie były ograniczone dla fosforanów. Dodanie fosforanu do inkubacji osadów podpowierzchniowych nie stymulowało dysymilacyjnej redukcji metali. redukcji metali. Dodany fosforan był szybko adsorbowany na osadach. Wyniki pokazują, że gatunki Geobacter mogą skutecznie redukować U(VI) nawet nawet przy suboptymalnych stężeniach fosforanów i że zwiększenie fosforanów jest trudne do osiągnięcia ze względu na wysoką reaktywność tego związku. ze względu na wysoką reaktywność tego związku. To podejście oparte na transkrypcji opracowane w celu diagnozowania ograniczenia fosforanów powinno mieć zastosowanie do oceny potencjalnej potrzeby dodatkowego fosforanu w innych procesach bioremediacji. --- Rośnie zainteresowanie wykorzystaniem funkcjonalnych zdolności lokalnych społeczności drobnoustrojów do przekształcania i remediacji szerokiego zakresu zanieczyszczeń środowiska. Informacje o tym, którzy członkowie społeczności reagują na mogą pomóc w interpretacji i opracowaniu metod remediacji. podejścia. Aby kompleksowo określić członkostwo w społeczności i liczebność wśród zestawu próbek związanych z eksperymentami bioremediacji uranu zastosowaliśmy mikromacierz o wysokiej gęstości (PhyloChip). Próbki były niestymulowane, naturalnie redukujące lub zebrane podczas redukcji Fe(III) (wczesna) i siarczanu (późna biostymulacja). redukcji siarczanów (późna biostymulacja) z warstwy wodonośnej ponownie wzbogaconej octanem warstwy wodonośnej w Rifle, Kolorado, oraz z eksperymentów laboratoryjnych przy użyciu materiałów zebranych w terenie. Głębokie próbkowanie społeczności za pomocą PhyloChip zidentyfikowało od setek do tysięcy operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU) obecnych podczas i ujawniło bliskie podobieństwo między wysoce wzbogaconymi taksonami z rdzenia wiertniczego rdzeni i osadów kolumnowych z odwiertów wód gruntowych. Ogólnie rzecz biorąc, dane filogenetyczne sugerowały, że na członkostwo w stymulowanej społeczności największy wpływ miał efekt przeniesienia pomiędzy corocznymi wydarzeniami stymulacyjnymi. Niemniej jednak, OTU w obrębie linii Fe(III)- i redukujących siarczany, Desulfuromonadales i Desulfobacterales, były wielokrotnie stymulowane. wielokrotnie stymulowane. Mniej spójne, współwzbogacone taksony reprezentowały dodatkowe linie związane z redukcją Fe(III) i siarczanów (np. Desulfovibrionales; Syntrophobacterales; Peptococcaceae) i autotroficzne utlenianie siarki (Sulfurovum; Campylobacterales). Dane sugerują złożoną przynależność do wysoce stymulowanych taksonów i, przez wnioskowanie, biogeochemiczne reakcje na octan, niefermentowalny substrat. niefermentowalny substrat. --- Stymulowanie mikrobiologicznej redukcji rozpuszczalnego U(VI) do nierozpuszczalnego U(IV) pokazuje obiecującą strategię unieruchamiania uranu w zanieczyszczonych uranem środowiskach podpowierzchniowych. Aby dowiedzieć się więcej o tym, które mikroorganizmy mogą być zaangażowane w redukcję U(VI) in situ, zmiany w społeczności drobnoustrojów gdy redukcja U(VI) była stymulowana przez dodanie octanu, były monitorowane w osadach z trzech różnych miejsc skażonych uranem na terenach zalewowych rzeki San Juan w Shipro. rzeki San Juan w Shiprock, N.Mex. We wszystkich trzech osadach redukcji U(VI) towarzyszyła równoczesna redukcja Fe(III) i dramatyczne wzbogacenie mikroorganizmów z rodziny Geobacteraceae, które są znanymi reduktorami U(VI) i mikroorganizmami redukującymi U(VI) i Fe(III). W momencie, gdy redukcja U(VI) i Fe(III) były bliskie ukończenia, Geobacteraceae stanowiły ok. 40% 16S rybosomalnego DNA (rDNA) odzyskanego z osadów za pomocą starterów bakteryjnych starterami PCR, podczas gdy Geobacteraceae stanowiły mniej niż 5% sekwencji 16S rDNA w osadach kontrolnych, które nie zostały zmienione octanem i w których redukcja U(VI) i Fe(III) nie była stymulowana. Od 55 do 65% tych sekwencji Geobacteraceae było najbardziej podobnych do sekwencji Desulfuromonas a pozostałe były najbliżej spokrewnione z gatunkami Geobacter. Analiza ilościowa sekwencji Geobacteraceae za pomocą najbardziej prawdopodobnej liczby PCR i analizy TaqMan wykazały, że liczba sekwencji Geobacteraceae wzrosła z 2 do 4 rzędów wielkości w trakcie redukcji U(VI) i Fe(III) w osadach wzbogaconych octanem z trzech miejsc. Nie stwierdzono wzrostu liczby sekwencji Geobacteraceae nie zaobserwowano w osadach kontrolnych. W przeciwieństwie do przewagą sekwencji Geobacteraceae, nie zaobserwowano sekwencji związanych z innymi znanymi bakteriami W osadach nie wykryto sekwencji związanych z innymi znanymi mikroorganizmami redukującymi Fe(III). Wyniki te Wyniki te wypadają korzystnie w porównaniu z rosnącą liczbą badań, które wykazały, że że Geobacteraceae są ważnymi składnikami społeczności drobnoustrojów w różnorodności środowisk podpowierzchniowych, w których redukcja Fe(III) jest ważnym procesem. ważnym procesem. Połączenie tych wyników z odkryciem, że redukcja U(VI) ma miejsce podczas redukcji Fe(III) i przed redukcją siarczanów sugeruje, że że Geobacteraceae będą odpowiedzialne za większość redukcji Fe(III) i U(VI) podczas bioremediacji uranu. podczas bioremediacji uranu w tych osadach. --- Jako kluczowy element gospodarki wodnej w kopalni uranu Ranger (Terytorium Północne, Australia) Terytorium, Australia), woda spływająca ze składowisk (rudy i odpadów) została zastosowana do naturalne lasy na terenie kopalni zgodnie z wymogami prawnymi. W związku z tym gleba w tych obszarach stosowania gruntów (LAA) wykazuje szereg stężenia uranu. Próbki gleby pobrano z LAA o różnych stężeniach uranu i ekstraktów. o różnych stężeniach uranu, a ekstrakty umieszczono na pożywce LB nie zawierającej (0 ppm), niskie (3 ppm), średnie (250 ppm), wysokie (600 ppm) i bardzo wysokie (1500 ppm) stężenia uranu. stężenia uranu. Stężenia te były podobne do zakresu zmierzonych stężeń uranu w glebach LAA. Bakterie rosły na wszystkich płytkach z wyjątkiem bardzo wysokich stężeń uranu, gdzie występowały tylko grzyby. tylko grzyby. Identyfikacja na podstawie analizy sekwencji 16S rRNA bakterii wykazała, że że dominujące bakterie należały do rodzaju Bacillus. Członkowie rodzaju Paenibacillus, Lysinibacillus, Klebsiella, Microbacterium i Chryseobacterium. Chryseobacterium zostały również wyizolowane z próbek gleby LAA. Grzyby zostały zidentyfikowane na podstawie analizy sekwencji regionu międzygenowego, a członkowie Aspergillus, Cryptococcus, Penicillium i Curvularia były dominujące na płytkach z bardzo wysokim uranem. na płytkach o bardzo wysokim stężeniu uranu. Członkowie Paecilomyces i Alternaria byli również obecni, ale w mniejszej liczbie. Wyniki te wskazują, że grzyby mogą tolerować bardzo wysokie stężenia uranu i są bardziej odporne niż bakterie. niż bakterie. Bakterie i grzyby wyizolowane w Ranger LAA z gleb o z gleb o wysokim stężeniu uranu mogą mieć zdolność wiązania uranu, a tym samym potencjał bioremediacji uranu. --- Aby wyjaśnić potencjalne mechanizmy redukcji U(VI) w celu optymalizacji strategii bioremediacji, zbadano relacje struktura-funkcja społeczności drobnoustrojów badano w mikrokosmosach materiałów podpowierzchniowych zanieczyszczonych radionuklidami i azotanami. Zastosowano podejście polifazowe do do oceny różnorodności funkcjonalnej populacji drobnoustrojów, które mogą katalizować przepływ elektronów w warunkach proponowanych dla bioremediacji uranu in situ. Dodatek dodanie etanolu i glukozy jako dodatkowych donorów elektronów stymulowało mikrobiologiczną redukcję azotanów i Fe(III) jako dominujące końcowe procesy procesy przyjmowania elektronów (TEAP). Redukcja U(VI), Fe(III) i siarczanów nakładały się na siebie w traktowaniu glukozą, podczas gdy redukcja U(VI) była równoczesna z redukcją siarczanów, ale poprzedzała redukcję Fe(III). redukcją siarczanów, ale poprzedzała redukcję Fe(III) w obróbce etanolem. Wykazano, że gliny filokrzemianowe są głównym źródłem Fe(III) dla oddychania mikrobiologicznego. za pomocą zmiennotemperaturowej spektroskopii Mössbauera. Azotany i i bakterie redukujące Fe(III) (FeRB) były obfite podczas zmian w TEAPs obserwowanych w biostymulowanych mikrokosmosach i były powiązane z rodzajami Geobacter, Tolumonas, Clostridium, Arthrobacter, Dechloromonas i Pseudomonas. Zaobserwowano nawet o dwa rzędy wielkości wyższą liczbę FeRB i zwiększone usuwanie U(VI) zaobserwowano w zabiegach z dodatkiem etanolu w porównaniu z wynikami w z dodatkiem glukozy. Kwantyfikacja poziomów syntazy cytrynianowej (gltA) wykazała stymulację aktywności Geobacteraceae podczas redukcji metali w mikrokosmosach w mikrokosmosach z dodatkiem węgla, przy czym najwyższą ekspresję zaobserwowano w traktowaniu glukozą. z glukozą. Analiza filogenetyczna wykazała, że aktywne FeRB wykazują wysoką identyczność sekwencji z Geobacteraceae. identyczność sekwencji z członkami Geobacteraceae wyhodowanymi z zanieczyszczonych środowisk podpowierzchniowych. z zanieczyszczonych środowisk podpowierzchniowych. Nasze wyniki pokazują, że funkcjonalna różnorodność zdolnych do redukcji U(VI) zależy od wyboru donora elektronów. donora elektronów. --- Aby lepiej zrozumieć zmiany różnorodności funkcjonalnej drobnoustrojów w warunkach podpowierzchniowych warunki redoks podczas bioremediacji uranu in situ, kluczowe geny funkcjonalne badano za pomocą GeoChip, kompleksowej funkcjonalnej mikromacierzy genowej, w terenie w eksperymentach terenowych na terenie działań naprawczych odpadów z młyna uranu (UMTRA) (Rifle, CO). Wyniki wskazały, że funkcjonalne społeczności drobnoustrojów zmieniły się wraz z przesunięciem w dominującym procesie metabolicznym, co zostało udokumentowane przez hierarchiczne klastry i analizy hierarchiczne analizy skupień i porządkowania wszystkich wykrytych genów funkcjonalnych. Obfitość genów dsrAB (geny dysymilacyjnej reduktazy siarczynowej) oraz genów mcr (geny kodujące reduktazę metylo-koenzymu M) wzrosła, gdy warunki redoks zmieniły się z redukujących Fe na redukujące siarczany. Wykryte geny cytochromów pochodziły głównie z Geobacter sp. i zmniejszały się wraz z niższymi podpowierzchniowymi warunkami redoks. warunkach redoks. Analiza statystyczna parametrów środowiskowych i funkcjonalnych genów wykazała, że octan, U(VI) i potencjał redoks (E(h)) były najbardziej znaczącymi zmiennymi geochemicznymi powiązanymi ze strukturami genów funkcjonalnych drobnoustrojów struktury, a zmiany w różnorodności funkcjonalnej drobnoustrojów były silnie związane z dominującym końcowym procesem przyjmowania elektronów po dodaniu octanu. Badanie wskazuje, że geny funkcjonalne drobnoustrojów wyraźnie odzwierciedlają warunki redoks in situ i dominujące procesy przyjmowania elektronów końcowych po dodaniu octanu. warunki redoks in situ i dominujące procesy mikrobiologiczne, które z kolei wpływają na bioredukcję uranu. wpływają na bioredukcję uranu. Geny funkcjonalne drobnoustrojów mogą być zatem bardzo przydatne do śledzenia struktury i dynamiki społeczności drobnoustrojów podczas bioremediacji. bioremediacji. --- Wersafilne szczepy Anaeromyxobacter dehalogenans zaangażowane w redukcję uranu sześciowartościowego i immobilizacji uranu są obecne w szczelinowym środowisku podpowierzchniowym saprolitu w środowisku podpowierzchniowym w Zintegrowanym Badaniu Podpowierzchniowym w Skali Polowej Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (U.S. Department of Energy Integrated Field-Scale Subsurface Research Challenge (IFC) w pobliżu Oak Ridge, TN. Aby zapewnić wgląd w rozmieszczenie in situ szczepów Anaeromyxobacter w tym systemie z nierównomiernym przepływie wód gruntowych, startery ukierunkowane na gen 16S rRNA i liniowa hybrydyzacja i sondy liniowe do hybrydyzacji (TaqMan) zostały zaprojektowane dla izolatów Anaeromyxobacter FRC-D1 i FRC-W, wraz z sondą i zestawem starterów ukierunkowanych na rodzaj Anaeromyxobacter. i zestawem starterów. Multipleksowy ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (mqPCR) został zastosowany do próbek pobranych z obszarów 1 i 3 Oak Ridge IFC, które nie są połączone przez główne ścieżki przepływu wód gruntowych; jednak transport między nimi przez jednak zakłada się transport między nimi przez pęknięcia poprzeczne. Odkształcenie FRC-W stanowiło ponad 10% całkowitej ilościowo oznaczalnej społeczności Anaeromyxobacter w glebach obszaru 1, podczas gdy szczep FRC-D1 nie został wykryty. W hodowlach wzbogaconych FeOOH pochodzących z materiałów pochodzących z obszaru 1, szczep FRC-D1 stanowił od 30 do 90% całkowitej Anaeromyxobacter, wykazując, że szczep ten był obecny in situ w obszarze 1. Całkowita liczebność Anaeromyxobacter w obszarze 3 przekroczyła liczebność w obszarze 1 o 3 do 5 rzędów wielkości, ale ani szczep FRC-W-, ani sekwencje podobne do FRC-D1 nie były oznaczalne ilościowo w żadnej z 33 badanych próbek wód gruntowych lub osadów z obszaru 3. badanych próbkach. Społeczność bakterii Anaeromyxobacter w obszarze 3 wzrosła z <10(5) komórek/g osadu poza strefą biostymulacji etanolem do 10(8) komórek/g osadu w pobliżu studni iniekcyjnej, a analiza biblioteki klonów genów 16S rRNA ujawniła, że dominowali przedstawiciele nowego klastra filogenetycznego w obszarze 3 społeczności Anaeromyxobacter wewnątrz pętli oczyszczania. Połączone zastosowania metod mqPCR na poziomie rodzaju i szczepu wraz z bibliotekami klonów biblioteki dostarczyły nowych informacji na temat wzorców zmienności drobnoustrojów w obrębie grupy bakterii istotnych dla bioremediacji uranu. --- Chociaż stymulacja dysymilacyjnej redukcji metali w celu promowania redukcyjnego uranu skutecznie usuwa uran z niektórych osadów warstwy wodonośnej, organizmy z rodziny Geobacteraceae osadów warstwy wodonośnej, organizmy z rodziny Geobacteraceae, które zostały związane z redukcją metali w poprzednich badaniach nie są znane z tego, że rosną przy wysokim zasoleniu występującym w niektórych wodach gruntowych zanieczyszczonych uranem. Badania z wysoce zasolonym osadem warstwy wodonośnej zanieczyszczonej uranem wykazały że dodanie octanu może stymulować usuwanie U(VI) z wód gruntowych. z wód gruntowych. Usuwanie to było związane ze wzbogaceniem mikroorganizmów najbardziej zbliżonych do gatunków Pseudomonas i Desulfosporosinus. --- Shewanella oneidensis jest ważnym organizmem modelowym w badaniach nad bioremediacją ze względu na jego zróżnicowane zdolności oddechowe, częściowo nadawane przez wieloskładnikowe, rozgałęzione systemy transportu elektronów. Poniżej przedstawiamy sekwencjonowanie genomu S. oneidensis, który składa się z 4 969 803 par zasad z 4 758 przewidywanymi otwartymi ramkami odczytu kodującymi białka (CDS) i 161 803 parami zasad. (CDS) i plazmidu o długości 161 613 par zasad ze 173 CDS. Zidentyfikowaliśmy pierwszy faga podobnego do Shewanella lambda, zapewniając potencjalne narzędzie do dalszej inżynierii genomu. inżynierii genomu. Analiza genomu ujawniła 39 cytochromów typu c, w tym 32 wcześniej niezidentyfikowane w S. oneidensis, oraz nową peryplazmatyczną [Fe] które są integralnymi członkami systemu transportu elektronów. Ta sekwencja sekwencja genomu stanowi krytyczny krok w wyjaśnianiu szlaków do redukcji (i bioremediacji) zanieczyszczeń, takich jak uran (U) i chrom (Cr). chrom (Cr) i stanowi punkt wyjścia do zdefiniowania złożonych systemów transportu elektronów i jonów metali tego organizmu. systemów transportu elektronów i zdolności redukcji jonów metali. --- Proponowane badania obejmą dwie społeczności drobnoustrojów, które są bezpośrednio bezpośrednio związane z interesami Departamentu Energii. Jedną z nich jest społeczność drobnoustrojów związane z bioremediacją in situ wód gruntowych skażonych uranem. wód gruntowych zanieczyszczonych uranem. Druga to społeczność drobnoustrojów, która pozyskuje energię z odpadów materii organicznej w postaci energii elektrycznej. Badania te zaspokoją potrzeby DOE w zakresie na (1) remediację metali i radionuklidów w miejscach DOE oraz (2) rozwój czystszych form energii i biomasy. rozwoju czystszych form energii i konwersji biomasy na energię. Nasze poprzednie badania wykazały, że społeczności drobnoustrojów zaangażowane w bioremediacji uranu i pozyskiwaniu energii są zdominowane przez mikroorganizmy z rodziny mikroorganizmy z rodziny Geobacteraceae i że organizmy z tej rodziny są odpowiedzialne za bioremediację uranu. są odpowiedzialne za bioremediację uranu i transfer elektronów do elektrod. do elektrod. Wstępne cele tego badania to (1) opisanie potencjału genetycznego genetycznego Geobacteraceae, które dominują w interesujących nas środowiskach. (2) zidentyfikowanie zachowanych wzorców ekspresji genów w obrębie rodziny Geobacteraceae w odpowiedzi na szereg warunków środowiskowych; (3) rozpocząć identyfikację mechanizmów kontrolujących ekspresję kluczowych genów związanych z z przetrwaniem, wzrostem i aktywnością w środowiskach podpowierzchniowych i na elektrodach; oraz (4) wykorzystanie wyników z podcelów 1-3 do opracowania modelu koncepcyjnego do przewidywania ekspresji genów Geobacteraceae w środowiskach będących przedmiotem zainteresowania. Model ten posłuży jako podstawa dla późniejszego modelu symulacyjnego wzrostu i aktywności Geobacteraceae w środowiskach zainteresowania. wzrostu i aktywności Geobacteraceae w podpowierzchni i na elektrodach. --- Uważa się, że ograniczenia dostępności Fe(III) jako akceptora elektronów odgrywają ważną rolę w ograniczaniu wzrostu i aktywności gatunków Geobacter Geobacter podczas bioremediacji zanieczyszczonych środowisk podpowierzchniowych, ale możliwość, że organizmy te mogą być również ograniczone w podpowierzchni przez dostępność żelaza do celów asymilacyjnych nie była wcześniej brana pod uwagę ponieważ duże ilości Fe(II) są produkowane w wyniku redukcji Fe(III) redukcji. Analiza wielu genomów Geobacteraceae ujawniła obecność klastra trzech genów składającego się z homologów dwóch regulatorów zależnych od żelaza, fur i dtxR (ideR), oddzielonych homologiem feoB, który koduje białko wychwytu Fe(II) białko wychwytu Fe(II). Klaster ten wydaje się być konserwowany wśród członków rodziny Geobacteraceae i został wykryty w kilku środowiskach. Ekspresja fur-feoB-ideR zmniejszała się wraz ze wzrostem stężenia Fe(II) w hodowlach chemostatycznych. w hodowlach chemostatycznych. Liczba transkryptów Geobacteraceae feoB w próbkach wód gruntowych z terenu poddawanego bioremediacji uranu in situ była stosunkowo wysoka do momentu, gdy stężenie rozpuszczonego Fe(II) wzrastało pod koniec eksperymentu terenowego. eksperymentu. Wyniki te sugerują, że ponieważ znaczna część Fe(II) jest sekwestrowana w fazach stałych, gatunki Geobacter, które mają wysokie wymagania na żelazo dla białek żelazowo-siarkowych, mogą być ograniczone ilością żelaza dostępnego do celów asymilacyjnych. Wyniki te pokazują zdolność analizy transkryptów do ujawniania wcześniej niepodejrzewanych aspektów fizjologii in situ fizjologii mikroorganizmów w środowiskach podpowierzchniowych. --- Opracowano system do hodowli Geobacter sulfurreducens w warunkach beztlenowych w chemostatach. w chemostatach został opracowany w celu zbadania fizjologii tego organizmu w warunkach warunkach, które mogą być bardziej zbliżone do tych występujących w podpowierzchniowych niż hodowle okresowe. Geobacter sulfurreducens może być hodowany w warunkach warunkach ograniczających octan z fumaranem lub Fe(III)-cytrynianem jako akceptorem elektronów przy szybkości wzrostu od 0,04 do 0,09 h(-1). Molowa wydajność wzrostu była trzykrotnie wyższa z fumaranem jako akceptorem elektronów niż z Fe(III), pomimo niższego potencjału środkowego pary redoks fumaran/bursztynian. Gdy wzrost był ograniczony dostępnością fumaranu, wykryto wysokie stężenia w stanie stacjonarnym stężenia, co sugeruje, że jest mało prawdopodobne, aby fumaran był ważnym akceptorem elektronów w środowiskach osadowych. Stała półnasycenia stała, Ks, dla octanu w hodowlach Fe(III) (10 mikroM) sugeruje, że wzrost gatunków że wzrost gatunków Geobacter jest prawdopodobnie ograniczony do octanu w większości osadów podpowierzchniowych. osadach podpowierzchniowych, ale gdy dodawane są milimolarne ilości octanu do osadów podpowierzchniowych w celu promowania wzrostu Geobacter w zastosowaniach bioremediacji bioremediacji, powinno to wystarczyć do przezwyciężenia wszelkich ograniczeń octanowych. Gdy dostępność akceptorów elektronów, a nie octanu, ograniczała wzrost, G. sulfurreducens był mniej wydajny we włączaniu octanu do biomasy, ale miał wyższe tempo oddychania, co jest pożądaną cechą fizjologiczną przy dodawaniu octanu w celu stymulowania aktywności gatunków Geobacter podczas bioremediacji uranu in situ. bioremediacji. Wyniki te pokazują, że zdolność do badania wzrostu G. sulfurreducens w warunkach stanu ustalonego może zapewnić wgląd w jego fizjologiczne, które mają znaczenie dla jego aktywności w różnych środowiskach osadowych. różnorodności środowisk osadowych. --- Wysokowydajne oprzyrządowanie MS w połączeniu z ulepszonymi technikami ekstrakcji białek techniki umożliwiają metaproteomikę w celu identyfikacji aktywnych członków gleby i społeczności drobnoustrojów w glebie i wodach gruntowych. Przepływy pracy metaproteomiki zostały zastosowane do zbadać początkowe reakcje (tj. 4 dni po leczeniu) rodzimej mikroflory warstwy mikrobioty warstwy wodonośnej na biostymulację zemulgowanym olejem roślinnym (EVO) w miejscu zanieczyszczonym uranem. Członkowie Betaproteobacteria (tj. Dechloromonas, Ralstonia, Rhodoferax, Polaromonas, Delftia, Chromobacterium) oraz Firmicutes zdominowały biostymulowaną społeczność warstwy wodonośnej. Charakterystyka proteomu ujawniła wyraźne różnice między biomasą drobnoustrojów pobraną z wód gruntowych pod wpływem biostymulacji i wód gruntowych zebranymi w kierunku punktów wtrysku EVO. W szczególności, białka zaangażowane w asymilację amonu, degradację EVO i tworzenie granulek polihydroksymaślanu były widoczne po biostymulacji. Co ciekawe nietypowy NosZ z Dechloromonas spp. był bardzo obfity, co sugeruje aktywny cytochromy typu c były ledwo wykrywalne, podobnie jak syntazy cytrynianowej, biomarkera aktywności redukcji sześciowartościowego uranu, co sugeruje, że redukcja uranu nie rozpoczęła się 4 dni po wprowadzeniu poprawki EVO. Metaproteomika środowiskowa zidentyfikowała odpowiedzi społeczności drobnoustrojów na biostymulację i wyjaśniła aktywne szlaki, demonstrując wartość tej techniki jako narzędzia jako narzędzie monitorowania i uzupełnienie metod opartych na kwasach nukleinowych. kwasów nukleinowych. --- Monitorowanie aktywności docelowych mikroorganizmów podczas stymulowanej bioremediacji jest kluczowym problemem dla rozwoju skutecznych strategii remediacji. strategii remediacji. W ośrodku Integrated Field Research Challenge (IFRC) Departamentu Energii USA w Rifle, CO (IFRC) w Rifle, CO, stymulacja wzrostu i aktywności bakterii Geobacter poprzez podpowierzchniową prowadzi do wytrącania się U(VI) z wód gruntowych jako U(IV). Syntaza cytrynianowa (gltA) jest kluczowym enzymem w centralnym metabolizmie Geobacter. który kontroluje przepływ do cyklu TCA. Tutaj wykorzystujemy metody proteomiczne shotgun metody, aby wykazać, że pomiar peptydów gltA może być wykorzystany do śledzenia aktywności Geobacter i ewolucji szczepu podczas biostymulacji in situ. Obfitości konserwowanych peptydów gltA śledziły redukcję Fe(III) i zmiany w stężeniach U(VI) podczas biostymulacji, podczas gdy zmieniające się wzorce unikalnych peptydów między próbkami sugerowały specyficzne dla próbki zmiany szczepu w populacji Geobacter. Obfitość unikalnych peptydów wskazywała na potencjalne różnice na poziomie szczepu między populacjami redukującymi Fe(III) stymulowanymi podczas eksperymentów biostymulacji in situ przeprowadzonych w odstępie roku w Rifle IFRC. w Rifle IFRC. Wyniki te oferują nowatorską technikę szybkiego badania przesiewowego dużej liczby próbek proteomicznych dla gatunków Geobacter i pomogą w monitorowaniu podpowierzchniowych działań bioremediacyjnych, które opierają się na redukcji metali w celu uzyskania pożądanych wyników. wyniki. --- Rosnąca dostępność sekwencji genomów mikroorganizmów zaangażowanych w ważne procesy bioremediacji w ważnych procesach bioremediacji sprawia, że możliwe jest rozważenie opracowania w skali genomu, które mogą pomóc w przewidywaniu prawdopodobnych wyników potencjalnych strategii bioremediacji podpowierzchniowej. podpowierzchniowych strategii bioremediacji. Poprzednie badania dotyczące bioremediacji wód gruntowych skażonych uranem wykazały, że Gatunki Geobacter są często dominującymi członkami społeczności wód gruntowych podczas aktywnej bioremediacji i głównymi organizmami katalizującymi redukcję U(VI) . W związku z tym, oparty na ograniczeniach model metabolizmu w skali genomu Geobacter sulfurreducens został połączony z modelem transportu reaktywnego HYDROGEOCHEM w celu modelowania bioremediacji uranu in situ. W celu uproszczenia modelowania, uwzględniono wpływ tylko trzech czynników wzrostu tylko trzech czynników wzrostu: octanu, donora elektronów dodanego w celu stymulacji redukcji U(VI); Fe(III), akceptor elektronów głównie wspierający wzrost Geobacter; oraz amon, kluczowy składnik odżywczy. Model oparty na ograniczeniach przewidywał, że wydajność wzrostu Geobacter różnił się znacząco w zależności od dostępności tych trzech czynników wzrostu trzech czynników wzrostu i że istnieją minimalne progi octanu i Fe(III), poniżej których wzrost i aktywność nie są możliwe. Kontrastuje to z typowymi, empirycznymi modelami mikrobiologicznymi, które zakładają stałą wydajność wzrostu i możliwość całkowitego metabolizmu substratów. możliwość całkowitego metabolizmu substratów. Sprzężony model w skali genomu i model transportu reaktywnego przewidywały stężenia octanu i współczynniki redukcji U(VI) w próbie terenowej bioremediacji uranu in situ, które były porównywalne z przewidywaniami porównywalne z przewidywaniami skalibrowanego modelu konwencjonalnego, ale bez potrzeby kalibracji empirycznej. potrzeby empirycznej kalibracji, innej niż określenie początkowej biomasy Geobacter. Geobacter. Wyniki te sugerują, że połączenie modeli metabolicznych w skali genomu z modelami transportu reaktywnego może być dobrym podejściem do opracowywania modeli, które może być prawdziwie predykcyjne, bez empirycznej kalibracji, w celu oceny prawdopodobnej reakcji mikroorganizmów podpowierzchniowych na możliwe metody bioremediacji przed ich wdrożeniem. bioremediację przed jej wdrożeniem. --- Biomineralizacja uranu przez odporny na metale szczep Pseudomonas aeruginosa wyizolowany z odpadów z kopalni uranu został scharakteryzowany pod kątem jego potencjału w bioremediacji. Określono oporność na uran, jego lokalizację komórkową i chemiczną naturę interakcji uran-bakterie. charakter interakcji uran-bakteria zostały wyjaśnione. Przeżywalność i biomineralizacja uranu i biomineralizacja uranu z wody kopalnianej zostały zbadane za pomocą eksperymentów w mikrokosmosie. Wybrana bakteria wykazała odporność i akumulację U (maksymalnie 275 mg U g(-1)suchej masy komórki) po inkubacji w 100 mg U L(-1), pH 4,0, przez 6 godzin. Analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej i dyfrakcji rentgenowskiej wykazały, że bioakumulowany uran został zdeponowany w otoczce komórkowej w postaci związków U-fosforanowych w kształcie igieł. związki U-fosforanowe, które osiągają krystaliczność tylko przy pH 4,0. Synergistyczny udział zdeprotonowanych cząsteczek fosforanowych i karboksylowych w ułatwianiu bioprecypitacji uranu. bioprecypitacji uranu był oczywisty na podstawie analizy FTIR. Na podstawie tych przypisujemy zlokalizowaną sekwestrację U przez tę bakterię jako jako nieszkodliwy kompleks do możliwego mechanizmu odporności na uran. Dane z mikrokosmosu dane potwierdziły, że szczep może usuwać rozpuszczalny uran (99%) i sekwestrować go jako tlenek U i minerały fosforanowe, zachowując przy tym swoją żywotność. Badanie wykazało, że rodzime bakterie ze skażonego miejsca, które mogą przetrwać uran i inne toksyczne metale ciężkie oraz sekwestrują rozpuszczalny uran jako biominerały mogą odgrywać ważną rolę w bioremediacji uranu. --- Narzędzia molekularne, które mogą zapewnić oszacowanie tempa wzrostu in situ gatunków Geobacter Geobacter mogą poprawić zrozumienie dysymilacyjnej redukcji metali w różnych środowiskach. Analizy mikromacierzy całego genomu podpowierzchniowego izolatu izolatu Geobacter uraniireducens, hodowanego w różnych warunkach, zidentyfikowano szereg genów, które ulegają różnej ekspresji przy różnych określonym tempie wzrostu. Ekspresja dwóch genów kodujących białka rybosomalne, rpsC i rplL, była dalej oceniana za pomocą ilościowej reakcji odwrotnej transkrypcji-PCR (qRT-PCR) w komórkach o czasie podwojenia od 6,56 h do 89,28 h. Obfitość transkryptu rpsC najlepiej korelowała (r(2) = 0,90) z określonymi szybkościami wzrostu. szybkością wzrostu. Dlatego wzorce ekspresji rpsC zostały wykorzystane do oszacowania specyficznych wzrostu gatunków Geobacter podczas bioremediacji uranu in situ w terenie w którym do wód gruntowych dodano octan w celu promowania dysymilacyjnej redukcji metali. dysymilacyjnej redukcji metali. Początkowo zwiększona dostępność octanu w wodach gruntowych w wodach gruntowych spowodowała wyższą ekspresję Geobacter rpsC, a wzrost liczby a wzrost liczby komórek Geobacter oszacowany za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w porównaniu ze specyficznym tempem wzrostu szacowanym na podstawie poziomu ekspresji rpsC in situ. in situ ekspresji rpsC. Jednak w późniejszych fazach wzrost liczby komórek był znacznie niższy niż przewidywany na podstawie obfitości transkryptu rpsC. Ta zmiana zbiegła się z rozkwitem pierwotniaków i zwiększonym przywiązaniem gatunków Geobacter do fazy stałej. Wyniki te sugerują, że monitorowanie ekspresji rpsC może lepiej odzwierciedlać rzeczywistą szybkość metabolizowania i wzrostu gatunków Geobacter podczas bioremediacji uranu in situ niż zmiany w liczebności komórek.
Wymień bakterie, które mogą być przydatne w bioremediacji uranu.
Głównymi bakteriami badanymi w bioremediacji uranu są Geobacteraceae. Inne bakterie to:
Firmicutes,
Shewanella oneidensis
Pseudomonas aeruginosa
Anaeromyxobacter dehalogenans
szczep Rf4T