Transformacja komórek roślinnych za pomocą T-DNA zjadliwych agrobakterii jest jednym z najbardziej ekstremalnych czynników najbardziej ekstremalnych czynników wywołujących zmiany rozwojowe u roślin wyższych. Dla szybkiego wzrostu i rozwoju powstałych guzów, wymagane są specyficzne zmiany w profilu ekspresji genów i adaptacje metaboliczne. ekspresji genów i wymagane są adaptacje metaboliczne. Zwiększony transport i przepływy metaboliczne są krytycznymi warunkami wstępnymi dla wzrostu i rozwoju guza. rozwoju guza. Funkcjonalne podejście genomiczne, wykorzystujące mikromacierz całego genomu Affymetrix (około 22 800 genów), zostało zastosowane do pomiaru zmian w ekspresji genów. ekspresji genów. Wzór substancji rozpuszczonej w guzach Arabidopsis thaliana i niezainfekowanych tkankach roślinnych tkanek roślinnych porównano z odpowiednim profilem ekspresji genów. Zwiększone poziomy anionów, cukrów i aminokwasów były skorelowane ze zmianami w ekspresji genów określonych enzymów. w ekspresji genów specyficznych enzymów i transporterów substancji rozpuszczonych. Profil ekspresji profil ekspresji genów kluczowych dla metabolizmu energetycznego, takich jak te zaangażowanych w fotosyntezę, mitochondrialny transport elektronów i fermentację, sugeruje, że guzy wytwarzają związki C i N heterotroficznie i pozyskują energię głównie beztlenowo. energię głównie beztlenowo. Tak więc, zrozumienie sieci gen-metabolit w guzach roślin sprzyja identyfikacji mechanizmów kontrolujących rozwój guza. rozwój guza. --- Agrobacterium tumefaciens powoduje chorobę żółciową korony poprzez przenoszenie i integrację bakteryjnego DNA (T-DNA) z genomem rośliny. Aby zbadać zmiany fizjologiczne i adaptacje podczas rozwoju guza indukowanego przez Agrobacterium porównaliśmy profile kwasu salicylowego (SA), etylenu (ET), kwasu jasmonowego (JA) i auksyny (kwasu indolo-3-octowego [IAA]) ze zmianami w transkryptomie Arabidopsis thaliana. Nasze dane wskazują, że odpowiedzi gospodarza były znacznie silniejsza w stosunku do onkogennego szczepu C58 niż do rozbrojonego szczepu GV3101 i że auksyna działa jako kluczowy modulator interakcji Arabidopsis-Agrobacterium interakcji. Na początku infekcji podwyższone poziomy IAA i ET były związane z indukcją genów gospodarza. związane z indukcją genów gospodarza zaangażowanych w sygnalizację IAA, ale nie ET . Po integracji T-DNA, SA jak również IAA i ET akumulowały się, ale JA nie. Nie korelowało to z kontrolowaną przez SA ekspresją genów związanych z patogenezą w gospodarzu. w gospodarzu, chociaż wysoki poziom SA w zmutowanych roślinach zapobiegał rozwojowi guza, podczas gdy niski poziom rozwój guza, podczas gdy niskie poziomy go promowały. Nasze dane są zgodne ze scenariuszem scenariuszem, w którym ET, a później SA kontrolują wirulencję agrobakterii, podczas gdy ET i auksyna stymulują neowaskularyzację podczas tworzenia guza. Sugerujemy że krzyżowanie między IAA, ET i SA równoważy obronę przed patogenami uruchamianą przez gospodarza i wzrost guza zainicjowany przez agrobakterie. --- Agrobacterium tumefaciens indukuje guzy żółciowe na roślinach poprzez przenoszenie kompleksu nukleoproteinowego kompleksu nukleoproteinowego, kompleksu T, z bakterii do komórki roślinnej. Kompleks T składa się z T-DNA, jednoniciowego segmentu DNA plazmidu indukującego nowotwór plazmidu wywołującego nowotwór, VirD2, endonukleazy związanej kowalencyjnie z końcem 5' T-DNA, oraz być może VirE2, jednoniciowe białko wiążące DNA. System dwuhybrydowy drożdży został użyty do przesiewania białek oddziałujących z VirD2 i VirE2 w celu zidentyfikować składniki Arabidopsis thaliana, które oddziałują z kompleksem T. Zidentyfikowano trzy białka oddziałujące z VirD2 i dwa białka oddziałujące z VirE2. Tutaj scharakteryzować interakcje VirD2 z dwiema izoformami cyklofilin Arabidopsis Arabidopsis zidentyfikowanymi przy użyciu tej analizy. Domena VirD2 oddziałująca z cyklofilinami różni się od endonukleazy, omega i domeny sygnału lokalizacji jądrowej. domeny sygnału lokalizacji jądrowej. Interakcja VirD2-cyklofilina jest zakłócana in in vitro przez cyklosporynę A, która również hamuje transformację za pośrednictwem Agrobacterium transformację Arabidopsis i tytoniu. Dane te silnie sugerują, że cyklofiliny gospodarza cyklofiliny gospodarza odgrywają rolę w transferze T-DNA. --- Guzy żółciowe korony rozwijają się po integracji T-DNA wirulentnych szczepów Agrobacterium tumefaciens do genomu rośliny. Ekspresja onkogenów T-DNA wyzwala proliferację i różnicowanie transformowanych komórek roślinnych. transformowanych komórek roślinnych. Wiadomo, że rozwojowi żółci koronowej towarzyszą globalne zmiany w transkrypcji, poziomach metabolitów i procesach fizjologicznych. Wysoki poziom kwasu abscysynowego (ABA) w galasach koronowych reguluje ekspresję genów reagujących na stres suszy geny reagujące na stres suszy i pośredniczą w aklimatyzacji stresu suszy, co jest niezbędny dla wzrostu guza typu dzikiego. Wpływ procesów epigenetycznych takich jak metylacja DNA na rozwój żółci korony; jednak, nie został jeszcze kompleksowo zbadany. W tym badaniu, wzór metylacji Arabidopsis thaliana został przeanalizowany w skali całego genomu jak również na poziomie pojedynczego genu. Analiza sekwencjonowania bisulfitowego ujawniła, że onkogeny Ipt, IaaH i IaaM były niemetylowane w galasach koronowych. Niemniej jednak, onkogeny były podatne na metylację za pośrednictwem siRNA, co hamowało ich ekspresję, a następnie wzrost galasów korony. Tablice genomowe hybrydyzowane z metylowanym DNA uzyskanym przez immunoprecypitację, ujawniły globalnie hipermetylowany genom żółci korony, podczas gdy promotory były raczej hipometylowane. Mutanty ze zmniejszoną metylacją non-CG rozwinęły większe guzy niż kontrole typu dzikiego, co wskazuje, że hipermetylacja hamuje wzrost guza rośliny. wzrost guza. Zróżnicowany wzór metylacji galasów korony i tkanki łodygi, z której pochodzą z której pochodzą, korelował ze zmianami transkrypcyjnymi. Geny o których wiadomo, że są hamowane transkrypcyjnie przez ABA i metylowane w galasach koronowych uległy metylacji promotora po potraktowaniu A. thaliana ABA. Sugeruje to że wysokie poziomy ABA w galasach korony mogą pośredniczyć w metylacji DNA i regulować ekspresję genów zaangażowanych w ochronę przed stresem suszy. Podsumowując, nasze badania dostarczają dowodów na to, że procesy epigenetyczne regulują ekspresję genów, procesy fizjologiczne i rozwój guzów żółciowych. --- Agrobacterium tumefaciens Chry5, który jest szczególnie zjadliwy dla soi, indukuje guzy, które wytwarzają rodzinę opioidów typu Amadori, która obejmuje deoksyfruktozylo glutaminę (Dfg) i jej lakton, chryzopinę (Chy). Klony Cosmid mapujące na prawo od znanego onkogennego regionu T pTiChry5 nadawały Amadori produkcję opiny w guzach indukowanych przez szczep nopalinowy C58. Analiza sekwencji DNA wspólnego dla tych kosmidów zidentyfikowano dwa bezpośrednie powtórzenia 25-bp flankujące 8,5-kb segment pTiChry5. Te prawdopodobne sekwencje graniczne są blisko spokrewnione z sekwencjami innych znanych regionów T i definiują drugi region T-region pTiChry5, zwany T-prawym (TR), który nadaje produkcję Amadoriopiny. Onkogenny region T-lewy (TL) został dokładnie zlokalizowany poprzez identyfikując i sekwencjonując prawdopodobne powtórzenia graniczne definiujące ten segment. Dwa regiony T dwa regiony T są oddzielone około 15 kb plazmidowego DNA. Na podstawie Na podstawie tych wyników przewidzieliśmy, że pKYRT1, plazmid pomocniczy wirusa pochodzący z pTiChry5, nadal zawiera cały TR i skrajne 9 kb TL. Zgodnie z z tą hipotezą, transgeniczne rośliny Arabidopsis thaliana wyselekcjonowane za pomocą markera markerem kodowanym przez plazmid binarny po transformacji KYRT1 współdziedziczyły wytwarzanie opin Amadori z wysoką częstotliwością. Wszystkie opine-pozytywne rośliny transgeniczne zawierały również TR-DNA, podczas gdy te rośliny, które pozbawione TR-DNA nie produkowały opin. Co więcej, A. thaliana zakażona wirusem KYRT1, w którym gen nptII napędzany promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora został wstawiony bezpośrednio do plazmidu pomocniczego wirusa, dając transformanty transformanty odporne na kanamycynę z niską, ale wykrywalną częstotliwością. Te Wyniki te pokazują, że pKYRT1 nie jest rozbrojony i może przenosić DNA plazmidu Ti do roślin. Nowy plazmid pomocniczy vir został skonstruowany z pTiChry5 przez dwie rundy selekcji selekcji za pośrednictwem sacB dla zdarzeń delecji. Plazmid ten, nazwany pKPSF2, nie zawiera obu znanych regionów T i ich granic. pKPSF2 nie przeniósł DNA plazmidu Ti do roślin. DNA plazmidu Ti do roślin, ale mobilizował region T plazmidu binarnego z wydajnością z wydajnością nieodróżnialną od pKYRT1 i wirusa typu nopalinowego plazmidu pomocniczego pMP90. --- Import jądrowy T-DNA jest centralnym wydarzeniem w genetycznej transformacji komórek roślinnych przez Agrobacterium. Uważa się, że w tym wydarzeniu pośredniczą dwa bakteryjne białka VirD2 i VirE2, które są związane z transportowaną cząsteczką T-DNA . Podczas gdy VirD2 jest importowane do jąder komórek roślinnych, zwierzęcych i drożdży komórek roślinnych, zwierzęcych i drożdży, wychwyt jądrowy VirE2 zachodzi najskuteczniej w komórkach roślinnych. Aby lepiej zrozumieć mechanizm działania VirE2, zidentyfikowano komórkowy interaktor VirE2 i sklonowano jego gen kodujący z Arabidopsis. Zidentyfikowane białko roślinne, oznaczone jako VIP1, specyficznie wiązało VirE2 i umożliwiało jego jądrowy import w systemach nieroślinnych. W roślinach VIP1 był wymagany do importu jądrowego VirE2 i nowotworowości Agrobacterium, uczestnicząc we wczesnych etapach ekspresji T-DNA ekspresji T-DNA. --- Fitopatogen glebowy Agrobacterium tumefaciens powoduje chorobę żółciową korony u wielu gatunków roślin. szerokiej gamie gatunków roślin. Wzrost nowotworowy w miejscach infekcji jest spowodowany przenoszeniem, integracją i ekspresją transferowego DNA (T-DNA) z A. tumefaciens do komórek roślinnych. Gen syntetyzujący trans-zeatynę (tzs) znajduje się w plazmidzie indukującym nowotwory typu nopalinowego i powoduje produkcję trans-zeatyny w A. tumefaciens. Podobnie do znanych białek wirulencji (Vir), które są indukowane przez induktor genu wirusa acetosyringon (AS) przy kwaśnym pH 5,5, białko Tzs jest wysoce indukowane przez AS w tych warunkach wzrostu, ale także konstytutywnie wyrażane i umiarkowanie regulowane przez AS przy neutralnym pH 7,0. Stwierdziliśmy, że aktywność promotora i poziomy białek kilku genów wirusa indukowanych przez AS wzrosły w mutancie delecyjnym mutancie delecyjnym tzs, mutancie o obniżonej skuteczności nowotworzenia i przejściowej w korzeniach Arabidopsis. Podczas indukcji AS i infekcji infekcji korzeni Arabidopsis, mutant delecyjny tzs powodował upośledzony wzrost, który można było uratować. wzrost, który można było uratować poprzez komplementację genetyczną i uzupełnienie egzogennej cytokininy. Egzogenna cytokinina tłumiła również aktywność promotora vir i akumulację białka Vir zarówno u bakterii typu dzikiego, jak i mutanta tzs z indukcją AS. Zatem gen tzs lub jego produkt, cytokinina, może być zaangażowany w w regulację ekspresji genu vir indukowanego przez AS, a tym samym wpływać na wzrost bakterii i wirulencję A. wzrost i wirulencję bakterii podczas infekcji A. tumefaciens. --- Agrobacterium tumefaciens infekuje rośliny i indukuje powstawanie guzów zwanych "galasami koronowymi" poprzez integrację regionu transferowanego DNA (T-DNA) plazmidu plazmidu Ti do genomu jądrowego rośliny. Guzy powstają, ponieważ T-DNA koduje enzymy, które modyfikują syntezę dwóch roślinnych hormonów wzrostu, auksyny i cytokininy (CK). Tutaj pokazujemy, że enzym biosyntezy CK, Tmr, który jest kodowany przez region T-DNA Agrobacterium, jest ukierunkowany na i funkcjonuje w plastydach zainfekowanych komórek roślinnych, pomimo braku typowej sekwencji ukierunkowanej na plastyd sekwencji. Istnieją dowody na to, że Tmr jest adenozynomonofosforanem fosforanowo-izopentenylo-transferazą (IPT), która tworzy nowe obejście biosyntezy CK poprzez wykorzystanie 1-hydroksy-2-metylo-2-(E)-butenyl 4-difosforanu (HMBDP) jako substratu. W przeciwieństwie do konwencjonalnego szlaku biosyntezy CK w roślinach, CK typu trans-zeatyny CK są produkowane bezpośrednio, bez konieczności stosowania monooksygenazy P450 hydroksylacji, w której pośredniczy monooksygenaza P450. Zgodnie z lokalizacją w plastydach Tmr, HMBDP jest produktem pośrednim w szlaku fosforanu metyloerytrytolu, biosyntezy zlokalizowanej w plastydach. zlokalizowanym w plastydach szlaku biosyntezy uniwersalnych prekursorów izoprenoidów. Te wyniki pokazują, że A. tumefaciens modyfikuje biosyntezę CK, wysyłając kluczowy enzym do plastydów kluczowy enzym do plastydów rośliny gospodarza w celu promowania nowotworzenia. --- Pokazujemy, że wśród ekotypów Arabidopsis istnieje znaczne zróżnicowanie w ich podatności na chorobę żółciową korony. Różnice w podatności są dziedziczne i, w jednym ekotypie, segregują jako pojedynczy główny przyczyniający się locus. W kilku ekotypach, oporność na nowotworzenie wynika ze zmniejszonego wiązania Agrobacterium do inokulowanych eksplantatów korzeniowych. Odwracalność innego ekotypu występuje na późnym etapie transferu T-DNA. Przejściowa ekspresja kodowanego przez T-DNA genu beta-glukuronidazy gusA jest wydajna, ale ekotyp jest w nowotworzeniu żółci korony, transformacji do oporności na kanamycynę, i stabilnej ekspresji GUS. Ekotyp ten jest również bardziej wrażliwy na promieniowanie gamma niż ekotyp podatny. Analiza DNA w żelu wykazała, że po infekcji przez Agrobacterium, mniej T-DNA zostało zintegrowane z genomem niż do genomu wysoce podatnego ekotypu. ekotypu.
Jaki jest mechanizm wykorzystywany przez bakterie do wywoływania nowotworów u Arabidopsis?
Bakteria Agrobacterium tumefaciens infekuje Arabidopsis, a także inne rośliny, i indukuje powstawanie guzów poprzez integrację regionu transferowanego DNA (T-DNA) plazmidu Ti- z genomem jądrowym rośliny.