Zgłaszamy izolację nowego peptydu przeciwdrobnoustrojowego, hepcydyny basowej, ze skrzeli ze skrzeli hybrydy okonia pasiastego, okonia białego (Morone chrysops) x okonia pasiastego (M. saxatilis). Po dootrzewnowym wstrzyknięciu Micrococcus luteus i Escherichia coli, peptyd został oczyszczony z frakcji HPLC z aktywność przeciwdrobnoustrojowa przeciwko Escherichia coli. Sekwencjonowanie przez degradację Edmana ujawniło peptyd o długości 21 reszt (GCRFCCNCCPNMSGCGVCCRF) z ośmioma przypuszczalnymi cysteinami. cysteinami. Pomiary masy cząsteczkowej natywnego peptydu oraz zredukowanego i i alkilowanego peptydu potwierdziły sekwencję z czterema wewnątrzcząsteczkowymi mostkami dwusiarczkowymi. mostkami dwusiarczkowymi. Homologia sekwencji peptydu do ludzkiej hepcydyny i innych przewidywanych hepcydyn hepcidin, wskazuje, że peptyd jest nowym członkiem rodziny hepcidin. Sekwencje nukleotydów dla cDNA i genomowego DNA zostały określone dla labraksa. A przewidywany prepropeptyd (85 aminokwasów) składa się z trzech domen: peptydu sygnałowego (24 aminokwasy), prodomeny (40 aminokwasów) i dojrzałego peptydu (21 aminokwasów). aminokwasów). Gen ma dwa introny i trzy eksony. Pudełko TATA i kilka motywy wiążące czynniki transkrypcyjne, w tym C / EBP, jądrowy czynnik czynnik-kappaB i czynnik jądrowy hepatocytów znaleziono w regionie przed miejsca startu transkrypcji. W wątrobie labraksa ekspresja genu hepcydyny była indukowana 4500-krotnie po zakażeniu patogenem ryb, Streptococcus iniae, podczas gdy poziom ekspresji pozostawał niski we wszystkich innych badanych tkankach. Nowy peptyd peptyd przeciwdrobnoustrojowy ze skrzeli, hepcydyna basowa, jest głównie wyrażany w wątrobie i jest wysoce indukowalny przez ekspozycję na bakterie. --- Hepcydyna, 25-aminokwasowy hormon peptydowy zawierający złożoną sieć czterech wiązań disulfidowych, jest hormonalnym regulatorem homeostazy żelaza. wiązań dwusiarczkowych jest hormonalnym regulatorem homeostazy żelaza. Trzy mostki syntetyczne analogi peptydowe zostały przygotowane zgodnie z dwiema strategiami syntetycznymi i dwie procedury utleniania: i) synteza w fazie stałej wspomagana mikrofalami a następnie utlenianie powietrzem sześciu wolnych cystein ii) ręczna synteza w fazie stałej po której następowała stopniowa deprotekcja i utlenianie par cystein. Wszystkie peptydy o różnej łączliwości zostały scharakteryzowane za pomocą spektrometrii MALDI ToF i przetestowane pod kątem ich zdolności do degradacji komórkowego eksportera żelaza, ferroportyny. komórkowego eksportera żelaza, ferroportyny. Podczas gdy peptydy liniowe są nieaktywne, peptydy jedno- i dwumostkowe peptydy dwumostkowe zachowujące chronione cysteiny przez nieporęczne podstawniki są aktywne. Podobnie, peptydy trójmostkowe są aktywne niezależnie od ich połączeń dwusiarczkowych. --- Szczególnie w dziedzinie analizy peptydów i białek metodą middle- i top-down, mostki dwusiarczkowe mogą poważnie utrudniać fragmentację, a tym samym utrudniać analizę sekwencji (pokrycie). analizę sekwencji (pokrycie). Poniżej przedstawiamy podejście on-line/elektrochemia/ESI-FTICR-MS które zostało zastosowane do analizy pierwotnej struktury oksytocyny, zawierającej jeden mostek dwusiarczkowy, oraz hepcydyny, zawierającej cztery mostki dwusiarczkowe. mostki dwusiarczkowe. Przedstawiony przepływ pracy zapewnił do 80% (on-line) konwersję wiązań dwusiarczkowych w obu peptydach. Przy minimalnym przygotowaniu próbki, taka redukcja skutkowała większą liczbą rozszczepień szkieletu peptydu po CID lub fragmentacji ETD, a tym samym lepsze pokrycie sekwencji. Czasy cyklu w tym odzyskiwanie elektrody, były szybkie i dlatego mogą być bardzo dobrze być połączony z chromatografią cieczową do separacji białek lub peptydów, co ma ogromny potencjał do analizy o wysokiej przepustowości. --- Hepcydyna, bogaty w cysteinę kationowy peptyd przeciwbakteryjny, odgrywa ważną rolę w obronie człowieka przed infekcją patogenami. rolę w obronie człowieka przed infekcją patogenami. Jednak jej rola w odpowiedzi immunologicznej gadów odpowiedzi immunologicznej gadów i to, czy jest zaangażowany w odporność przeciwbakteryjną, nie zostało jeszcze nie zostało jeszcze udowodnione. W celu zbadania aktywności przeciwbakteryjnej hepcydyny Crocodylus siamensis (Cshepc), pospolitego gada, który żyje w regionie tematycznym Azji Południowo-Wschodniej, sklonowano sekwencję cDNA Cshepc, która obejmowała otwartą ramkę odczytu (ORF) ramkę odczytu (ORF) 300 bp kodującą 99 aminokwasową preprohepcydynę. Cshepc ma osiem cystein tworzących cztery konserwowane mostki dwusiarczkowe, podobnie jak ludzkiej. Analiza sekwencji wykazała, że dojrzały peptyd Cshepc był bardziej konserwowany niż preprohepcidin. Analiza ekspresji tkankowej wykazała, że Transkrypty Cshepc ulegały wysokiej ekspresji w wątrobie, mięśniach i sercu C. siamensis. Rekombinowana hepcydyna może znacząco hamować wzrost bakterii Gram-ujemnych. bakterii Gram-ujemnych Escherichia coli i Aeromonas sobria, jak również Gram-dodatnich bakterii Staphylococcus aureus i Bacillus subtilis in in vitro, co sugeruje, że Cshepc, podobnie jak ludzka hepcydyna, może odgrywać rolę w funkcję przeciwbakteryjną we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. --- Hepcydyna została po raz pierwszy zidentyfikowana jako peptyd przeciwdrobnoustrojowy obecny w ludzkiej surowicy i moczu. i moczu. Później wykazano, że hepcydyna jest długo poszukiwanym hormonem który reguluje homeostazę żelaza u ssaków. Natywny peptyd o długości 25 aminokwasów (Hepc25) zawiera cztery mostki dwusiarczkowe, które utrzymują motyw β-spinki do włosów. Celem Celem niniejszego badania była ocena, czy wewnątrzcząsteczkowe mostki dwusiarczkowe są niezbędne dla aktywności przeciwdrobnoustrojowej Hepc25. Wykazaliśmy, że syntetyczny peptyd odpowiadający ludzkiemu Hepc25 i zawierający cztery mostki disulfidowe mostki dwusiarczkowe, ma aktywność przeciwbakteryjną przeciwko kilku szczepom bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Wręcz przeciwnie, syntetyczny peptyd w którym wszystkie cysteiny zostały zastąpione alaninami (Hepc25-Ala) nie miał wykrywalnej aktywności przeciwko tym samym szczepom bakterii. W kolejnym kroku, sposób działania Hepc25 na Escherichia coli. Do oceny integralności błony bakteryjnej wykorzystano wychwyt SYTOX Green. do oceny integralności błony bakteryjnej. Nie zaobserwowano permeabilizacji błony przy zaobserwowano w przypadku Hepc25, co wskazuje, że peptyd ten nie zabija bakterii poprzez niszcząc ich błony. Test opóźnienia żelu wykazał, że Hepc25 wiąże się z DNA z wysoką wydajnością i że do DNA z wysoką wydajnością i że ta zdolność wiązania zależy od obecność wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych. Redukcja Hepc25 lub zastąpienie ośmiu cystein przez reszty alaninowe prowadziło do peptydów, które nie były już w stanie wiązać DNA w teście in vitro. W sumie wyniki te pokazują, że Hepc25 powinien przyjąć trójwymiarową strukturę stabilizowaną przez wewnątrzcząsteczkowe mostki dwusiarczkowe, aby mieć aktywność przeciwbakteryjną.
Ile mostków dwusiarczkowych ma białko hepcydyna?
Hepcydyna zawiera osiem reszt cysteinowych, które tworzą cztery mostki dwusiarczkowe.