Danio pręgowany (Danio rerio) jest coraz częściej wykorzystywany do badania podstawowej biologii kręgowców. kręgowców i chorób człowieka za pomocą bogatego zestawu narzędzi genetycznych i molekularnych in vivo. narzędzi. Jednak niezdolność do łatwej modyfikacji genomu w ukierunkowany sposób była wąskim gardłem w tej dziedzinie. Tutaj pokazujemy, że ulepszenia w sztucznych nukleazach efektorowych podobnych do aktywatorów transkrypcji (TALEN) zapewniają potężne nowe podejście do ukierunkowanej edycji genomu danio pręgowanego i funkcjonalnych zastosowań genomicznych. funkcjonalnych zastosowań genomicznych. Korzystając ze zmodyfikowanego rusztowania GoldyTALEN i systemu dostarczania zebrafish pokazujemy, że ten ulepszony zestaw narzędzi TALEN ma wysoką skuteczność w w indukowaniu specyficznych dla danego miejsca pęknięć DNA w tkankach somatycznych i zarodkowych. W niektórych loci, skuteczność ta zbliża się do 100%, w tym konwersja bialleliczna w tkankach somatycznych tkankach, która naśladuje fenotypy obserwowane przy użyciu ukierunkowanych genów opartych na morfolinach nokautów. Dzięki temu zaktualizowanemu systemowi TALEN z powodzeniem wykorzystaliśmy jednoniciowe oligonukleotydy oligonukleotydy DNA do precyzyjnej modyfikacji sekwencji w predefiniowanych lokalizacjach w genomie genomu danio pręgowanego poprzez naprawę ukierunkowaną homologicznie, w tym wprowadzenie niestandardowo zaprojektowanego miejsca EcoRV i zmodyfikowanej sekwencji loxP (mloxP) do tkanki somatycznej in vivo. Ponadto pokazujemy udaną transmisję przenoszenie zarówno chromosomów EcoRV, jak i mloxP. To połączone podejście oferuje potencjał do modelowania zmienności genetycznej, a także do generowania ukierunkowanych alleli warunkowych. --- Rozwój technologii zawsze był jedną z sił napędzających przełomy w badaniach biomedycznych. Od czasów Thomasa Morgana, Drosophilists krok po kroku, krok po kroku opracowali potężne narzędzia genetyczne do manipulowania i funkcjonalnego i funkcjonalnego analizowania genomu Drosophila, ale pole do ulepszenia tych technologii i opracowania nowych technik jest wciąż duże. rozwój nowych technik jest nadal duży, zwłaszcza dziś, gdy biolodzy zaczynają systematycznie badać funkcjonalną genomikę różnych organizmów modelowych, w tym ludzi, w tym ludzi, w sposób wysokoprzepustowy. Tutaj po raz pierwszy opisujemy po raz pierwszy w Drosophila, szybką, łatwą i wysoce specyficzną metodę modyfikacji genomu genom Drosophila z bardzo wysoką wydajnością za pomocą ulepszonego nukleazy podobnej do aktywatora transkrypcji (TALEN). Wykorzystaliśmy wykorzystaliśmy niedawno opracowaną strategię "unit assembly", aby zmontować dwie pary specyficznych TALEN-ów zaprojektowanych do modyfikacji żółtego genu (na chromosomie płci) chromosomie płci) i nowy gen autosomalny. MRNA TALENów zostały następnie wstrzyknięte do zarodków Drosophila. U 31,2% wstrzykniętych płodnych much F(0), wykryliśmy dziedziczną modyfikację obejmującą żółty gen. Cały proces od konstrukcji specyficznych TALEN do wykrywania dziedzicznych modyfikacji modyfikacji można przeprowadzić w ciągu jednego miesiąca. Potencjalne zastosowania tej metody modyfikacji genomu za pośrednictwem TALEN u Drosophila. --- Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) to programowalne nukleazy nukleazy, które łączą endonukleazę FokI z modułową domeną wiążącą DNA TALE. Chociaż nukleazy z palcem cynkowym umożliwiają różnorodne modyfikacje genomu, ich zastosowanie w inżynierii genetycznej zwierząt gospodarskich zostało spowolnione przez ograniczenia techniczne związane z wstrzykiwaniem zarodków, hodowlą komórek pierwotnych i trudności w produkcji niezawodnych odczynników przy ograniczonym budżecie. W przeciwieństwie do tego, my stwierdziliśmy, że TALEN można łatwo wyprodukować i że ponad połowa (23/36, 64%) wykazuje wysoką aktywność w komórkach pierwotnych. Cytoplazmatyczne iniekcje TALEN mRNA do zygot zwierząt gospodarskich były zdolne do indukowania KO genów w 75% analizowanych zarodków. analizowanych zarodków, z których część zawierała modyfikację bialleliczną. Opracowaliśmy również opracowaliśmy prostą strategię selekcji transpozonów dla modyfikacji genów za pośrednictwem TALEN w pierwotnych fibroblastach, która umożliwiła zarówno wzbogacenie zmodyfikowanych komórek komórek i skuteczną izolację zmodyfikowanych kolonii. Selekcja po leczeniu z pojedynczą parą TALEN umożliwiła izolację kolonii z modyfikacją mono- i bialleliczną odpowiednio w 54% i 17% kolonii. Selekcja po traktowaniu dwiema parami TALEN skierowanymi przeciwko temu samemu chromosomowi umożliwiła izolację kolonii zawierających duże chromosomalne delecje i inwersje (odpowiednio 10% i 4% kolonii). i 4% kolonii). Zmodyfikowane przez TALEN płodowe fibroblasty świni Ossabaw były skutecznymi dawcami jądrowymi do klonowania, co skutkowało stworzeniem miniaturowych świń zawierających mono- i bialleliczne mutacje genu receptora LDL jako modele rodzinnej hipercholesterolemii. TALENy wydają się zatem stanowić bardzo łatwą platformę do modyfikacji genomów zwierząt gospodarskich zarówno dla biomedycznych i rolniczych.
Jaka jest funkcja enzymów TALEN?
 Te chimeryczne enzymy mogą być wykorzystane do wprowadzenia podwójnego przerwania nici w określonym miejscu genomu, które następnie może stać się substratem dla podatnego na błędy niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), generując mutacje w miejscu rozszczepienia. Sztuczne nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) zapewniają nowe, potężne podejście do ukierunkowanej edycji genomu danio pręgowanego i funkcjonalnych zastosowań genomicznych. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) składają się z domeny nukleazy połączonej z domeną wiążącą DNA, która została zaprojektowana tak, aby wiązać się z dowolną sekwencją genomową. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) to programowalne nukleazy, które łączą endonukleazę FokI z modułową domeną wiążącą DNA TALE.