Struktura krystaliczna rybonukleazy A (RNazy A) w kompleksie z pdUppA-3'-p [5'-fosfo-2'-deoksyurydyno-3'-pirofosforan (P'-->5') adenozyno-3'-fosforan]. został określony w rozdzielczości 1,7 A. Ten dinukleotyd jest najsilniejszym niskocząsteczkowym inhibitorem RNazy A zgłoszonym do tej pory (K(i) = 27 nM) i jest również skuteczny przeciwko dwóm głównym niepankreatycznym RNazom: neurotoksynie pochodzącej z eozynofili neurotoksyna i RNaza-4; we wszystkich przypadkach ścisłe wiązanie w dużej mierze pochodzi z niezwykłe 3',5'-pirofosforanowe wiązanie międzynukleotydowe [Russo, N. i Shapiro, R. (1999) J. Biol. Chem. 274, 14902-14908]. Projekt pdUppA-3'-p został oparty na strukturze krystalicznej na strukturze krystalicznej RNazy A skompleksowanej z 5'-difosfoadenozyną 3'-fosforanem (ppA-3'-p) [Leonidas, D. D., Shapiro, R., Irons, L. I., Russo, N., i Acharya, K. R. (1997) Biochemistry 36, 5578-5588]. Adenozyna z pdUppA-3'-p przyjmuje nietypową konformację syn, której nie obserwuje się dla standardowych nukleotydów adenozynowych. nukleotydów adenozynowych związanych z RNazą A. Ta konformacja, która umożliwia rozległe interakcje z Asn 67, Gln 69, Asn 71 i His 119, jest związane z umieszczeniem z umieszczeniem 5'-beta-fosforanu adenylanu, a nie alfa-fosforan, w miejscu, w którym następuje rozszczepienie wiązania fosfodiestrowego substratu występuje. Kontakty części 5'-fosforanu deoksyurydyny pdUppA-3'-p wydają się być odpowiedzialne za 9-krotnie zwiększone powinowactwo tego związku w porównaniu do w porównaniu do ppA-3'-p: zasada uracylowa wiąże się z Thr 45 w taki sam sposób jak poprzednie inhibitory pirymidynowe, a końcowy 5'-fosforan jest ustawiony tak, aby tworzy interakcje kulombowskie średniego zasięgu z Lys 66. Pełna potencjalna korzyść tych dodanych interakcji nie jest realizowana z powodu kompensacyjnych strat wiązań wodorowych Lys 7 i Gln 11 z końcowym 3'-fosforanem i adenylan 5'-alfa-fosforan, które nie zostały przewidziane przez modelowanie. Wyniki przedstawione tutaj mają ważne implikacje dla projektowania ulepszonych inhibitorów RNazy A i dla rozwoju środków terapeutycznych do kontrolowania aktywności homologów RNazy, takich jak neurotoksyna pochodząca z eozynofili i angiogenina, które odgrywają rolę w ludzkich patologiach. --- W niniejszym artykule opisano izolację i charakterystykę dwóch białek z mleka bydlęcego białek: angiogeniny-1, niedawno odkrytej angiogeniny i laktogeniny, nowego białka. nowe białko. Oba białka były adsorbowane i eluowane ściśle z CM-Sepharose i Mono S. Laktogenina miała masę cząsteczkową (17 kDa) nieco wyższą niż angiogenina-1. nieco wyższą niż angiogenina-1 (15 kDa). Laktogenina miała wyższą aktywność rybonukleolityczną (RNazy) niż angiogenina-1 wobec drożdżowego transferowego RNA (tRNA). Wartości Km oszacowane dla aktywności RNazy angiogeniny-1 i laktogeniny wynosiły odpowiednio 51 mikroM i 40 mikroM. Obie były specyficzne dla poli-C. poli-C. Optymalne pH dla aktywności RNazy angiogeniny-1 i laktogeniny wynosiło odpowiednio 7,75 i 7,5 mikroM. wynosiło odpowiednio 7,75 i 7,5. Porównanie sekwencji aminokwasowych fragmentów fragmentów bromku cyjanogenu i N-końcowego fragmentu laktogeniny poddanego działaniu piroglutaminazy z sekwencją laktogeniny z sekwencją RNazy wątroby bydlęcej (RNaza BL4) ujawniło identyczność w resztach 3-22, 24, 26-27, 37, 41-44, 46-50, 54, 56, 63, 72-80 i 83. Stwierdzono również znaczne podobieństwo do N-końcowej sekwencji angiogeniny-2. angiogeniny-2. Zarówno laktogenina, jak i angiogenina-1 hamowały wolną od komórek translację w system lizatu retikulocytów królika z IC (50) poniżej 100 nM. --- Powikłania infekcyjne są częste i często śmiertelne u pacjentów z mocznicą. Poważne zmiany w funkcji neutrofili, np. fagocytoza, aktywacja komórek jednojądrzastych, produkcja cytokin, aktywacja dopełniacza, funkcja limfocytów T i mocznica. jednojądrzastych, produkcji cytokin, aktywacji dopełniacza, funkcji limfocytów T i ekspresji cząsteczek adhezyjnych. ekspresji cząsteczek adhezyjnych, zostały udokumentowane u pacjentów z mocznicą. Mocznica per se jest przyczyną niektórych z tych zaburzeń, ale obecnie istnieje wiele dowodów na to, że że interakcja krew-błona podczas dializy jest odpowiedzialna za wiele z tych nieprawidłowości. nieprawidłowości. Jest to szczególnie prawdziwe, gdy stosowane są biokompatybilne błony celulozowe. celulozowych. U wielu z tych pacjentów nowo opisane białka hamujące granulocyty białka hamujące granulocyty (GIP). Te dwa białka, GIP I i II (o masie cząsteczkowej odpowiednio 28 kD i 9,5 kD), blokują skuteczne zabijanie bakterii, chemotaksję oraz zabijanie bakterii, chemotaksję i metabolizm tlenu. Wydaje się, że GIP I jest członkiem rodziny rodziny łańcuchów lekkich, a GIP II jest produktem końcowym zaawansowanej glikozylacji beta 2-mikroglobuliny. Inne białko hamujące, białko hamujące degranulację (DIP) białko hamujące degranulację (DIP). Białko to ma masę cząsteczkową 14 kD i jest identyczne z białkiem jest identyczne z czynnikiem angioplastycznym angiogeniną. Poziomy DIP są znacząco podwyższone u pacjentów poddawanych dializie. Wiele pozostaje jeszcze do odkrycia na temat interakcji tych białek hamujących z innymi rozpuszczalnymi mediatorami stanu zapalnego, a w szczególności rozpuszczalnymi mediatorami stanu zapalnego, a w szczególności cytokinami. Oczywiste jest jednak, że głębokie zaburzenia funkcji immunologicznych mają miejsce podczas mocznicy i terapii dializacyjnej. Takie zaburzenia mogą odgrywać ważną rolę w określaniu tempa powrotu funkcji nerek i dializ. odzyskiwania funkcji nerek i zdolności pacjenta do reagowania na septyczne urazy. septyczne. Dalszy wgląd w patogenezę zaburzeń odporności w przebiegu dializy mocznicowej już przynoszą poprawę zarządzania pacjentami i zmniejszają wskaźniki infekcji. zakażeń. --- Sekwencję aminokwasową i mostki dwusiarczkowe bydlęcej angiogeniny pochodzącej z osocza angiogeniny określono za pomocą analizy sekwencyjnej nienaruszonego białka i fragmentów uzyskanych przez trawienie enzymatyczne i chemiczne. Bydlęca angiogenina jest jednołańcuchowe białko 125 aminokwasów; zawiera sześć cystein i ma obliczoną masę cząsteczkową 14,595. W przeciwieństwie do ludzkiego białka koniec aminowy jest odblokowany. Ma następującą sekwencję: H2N-Ala1-Gln-Asp-Asp-Tyr-Arg-Tyr-Ile-His-Phe10-Leu-Thr-Gln-His-Tyr -Asp-Ala-Lys- Pro-Lys20-Gly-Arg-Asn-Asp-Glu-Tyr-Cys-Phe-Asn-Met30-Met-Lys- Asn-Arg-Arg-Leu-Thr - Arg-Pro-Cys40-Lys-Asp-Arg-Asn-Thr-Phe-Ile-His-Gly-Asn50-Lys- Asn-Asp-Ile-Lys-Ala- Ile-Cys-Glu-Asp60-Arg-Asn-Gly-Gln-Pro-Tyr-Arg-Gly-Asp-Leu70- Arg-Ile-Ser-Lys-Ser - Glu-Phe-Gln-Ile-Thr80-Ile-Cys-Lys-His-Lys-Gly-Ser-Ser-Arg90- Pro-Pro-Cys-Arg-Tyr - Gly-Ala-Thr-Glu-Asp100-Ser-Arg-Val-Ile-Val-Val-Gly-Cys-Glu-Asn1 10-Gly-Leu-Pro- Val-His-Phe-Asp-Glu-Ser-Phe120-Ile-Thr-Pro-Arg-His-OH. Wiązania disiarczkowe łączą Cys(27)-Cys(82), Cys(40)-Cys(93) i Cys(58)-Cys(108). Bydlęca angiogenina jest w 64% identyczny z ludzką angiogeniną; podobnie jak ludzkie białko, jest homologiczny do rybonukleaz trzustkowych, z zachowaniem reszt w miejscu aktywnym. Dwa regiony regiony, 6-22 i 65-75, są wysoce konserwowane między angiogeninami, ale są znacznie różnią się od tych z rybonukleaz, co sugeruje możliwą rolę w aktywności biologicznej cząsteczek. --- Angiogenina jest silnym polipeptydem indukującym naczynia krwionośne o masie cząsteczkowej 14 000, który ma unikalną aktywność rybonukleolityczną. Po raz pierwszy wyizolowany z komórek nowotworowych, angiogenina została oczyszczona z normalnego osocza. normalnego osocza, co sugeruje, że jej skłonność do indukowania neowaskularyzacji powinna być ściśle kontrolowana. Modulacja tej aktywności może obejmować interakcję angiogeniny z receptorami na powierzchni komórek i macierzą zewnątrzkomórkową komórek śródbłonka, ścisłe wiązanie hamujące zarówno jej aktywność rybonukleolityczną i właściwości wiązania komórek przez inhibitor rybonukleazy, jak również ogólny wpływ miedzi dwuwartościowej, modulatora angiogenezy. --- Ludzka angiogenina jest białkiem osocza o masie 14 kDa o aktywności angiogennej i rybonukleolitycznej. aktywności. Angiogenina wiąże się specyficznie z komórkami mięśni gładkich aorty, aktywuje szlaki drugiego przekaźnika i hamuje ich proliferację. Ludzkie i ludzkie i bydlęce komórki mięśni gładkich aorty były używane do badania internalizacji i wewnątrzkomórkowego losu ludzkiej angiogeniny w temperaturze 37 stopni C. Stosując specyficzne przeciwciało przeciwko angiogeninie, zastosowano przeciwciało przeciwko angiogeninie. przeciwciała przeciwko angiogeninie, stwierdziliśmy, że internalizowane natywne białko było zlokalizowane w regionie okołojądrowym po 30 minutach, a następnie rozproszone w cytoplazmie. cytoplazmie. W warunkach sprzyjających endocytozie za pośrednictwem receptora, internalizacja jodowanej angiogeniny wykazywała pierwszy szczyt po 5 minutach, a następnie dalej wzrastała do 24 godzin. Okres półtrwania cząsteczki, obliczony na 12 godzin w eksperymentach pościgowych, może przyczyniać się do jej wewnątrzkomórkowej internalizacji. może przyczyniać się do jej wewnątrzkomórkowej akumulacji. W ekstraktach komórkowych w ekstraktach komórkowych, oprócz białka o masie 14 kDa, zaobserwowano fragment o masie 8,7 kDa przy 24 h, a trzy fragmenty o masie cząsteczkowej 10,5, 8,7 i 6. 1 kDa były Nasze dane wskazują na specyficzną internalizację i przetwarzanie ludzkiej angiogeniny przez aortę. ludzkiej angiogeniny przez komórki mięśni gładkich aorty. --- Pierwsze ludzkie białko pochodzenia nowotworowego o aktywności angiogennej in vivo w czystej postaci zostało wyizolowane z pozbawionych surowicy supernatantów linii komórkowej ludzkiego gruczolakoraka (HT-29) i nazwane angiogeniną. Została ona oczyszczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wymianą kationów i odwróconą fazą Wydajność wynosiła około 0,5 mikrograma / l pożywki. Aktywność biologiczna angiogeniny była monitorowana podczas oczyszczania przy użyciu test błony chorioallantoicznej zarodka kurczaka. Ocena statystyczna wykazuje, że wykazuje aktywność w tym systemie z zaledwie 35 fmolami na jajo. Co więcej, tylko 3,5 pmol jest wymagane do wywołania rozległego naczynia krwionośnego wzrost w rogówce królika. Skład aminokwasowy tego podstawowego (punkt izoelektryczny większy niż 9,5), jednołańcuchowego białka o masie cząsteczkowej o masie cząsteczkowej około 14 400. Końcówka aminowa jest zablokowana, a reszta resztę karboksylowo-końcową stanowi prolina.
Jaka jest masa cząsteczkowa białka angiogeniny?
Masa cząsteczkowa angiogeniny wynosi 14 120 Da. Masa cząsteczkowa angiogeniny bydlęcej wynosi 14 595 Da