Produkt genu dcm jest jedyną metylotransferazą DNA cytozyna-C5 w Escherichia coli K-12. Escherichia coli K-12; katalizuje przeniesienie grupy metylowej z S-adenozylo metioniny (SAM) do pozycji C-5 wewnętrznej reszty cytozyny w sekwencji sekwencji CCA/TGG. Specyficzne dla sekwencji, kowalencyjne sieciowanie enzymu do syntetycznych oligonukleotydów zawierających 5-fluoro-2'-deoksycytydynę. wykazano. Reakcja ta jest zniesiona, jeśli seryna zastępuje cysteinę przy reszcie #177 enzymu. reszcie #177 enzymu. Wyniki te stanowią silne wsparcie dla mechanizmu katalitycznego mechanizm, w którym enzymatyczna grupa sulfhydrylowa ulega addycji Michaela do podwójnego wiązania podwójnego wiązania C5-C6, aktywując w ten sposób pozycję C-5 reszty cytozyny DNA substratu do ataku elektrofilowego przez donor metylu SAM. Enzym jest zdolny do metylacji w reakcji niezależnej od DNA, wymagającej SAM i obecności cysteiny w pozycji #1. cysteiny w pozycji 177. --- Metylotransferaza DNA (cytozyna-5) (m5C-MTaza) M.BspRI jest w stanie zaakceptować grupę metylową z donora grupę metylową z donora metylu S-adenozylo-L-metioniny (AdoMet) przy nieobecności DNA. Przeniesienie grupy metylowej do enzymu jest powolną reakcją w porównaniu do metylacji DNA. Samometylacja jest zależna od natywnej konformacji enzymu i jest konformacji enzymu i jest hamowana przez S-adenozylo-L-homocysteinę, DNA i odczynniki sulfhydrylowe. Sekwencjonowanie aminokwasów peptydów proteolitycznych uzyskanych z M.BspRI, które zostały zmetylowane za pomocą [metylo-3H]AdoMet i chromatografii cienkowarstwowej zmodyfikowanych aminokwasów. chromatografia zmodyfikowanego aminokwasu zidentyfikowała dwie cysteiny, Cys156 i Cys181, które wiążą grupę metylową w postaci S-metylocysteiny. Jedna z reszt akceptorowych, Cys156 jest wysoce konserwatywną cysteiną, która odgrywa rolę rolę katalitycznego nukleofila m5C-MTazy. --- W przypadku braku substratu DNA, metylotransferaza DNA (MTaza) M.BspRI może metylować się przy użyciu donora metylu S-adenozylo-L-metioniny (AdoMet). Grupa grupa metylowa jest przenoszona na dwie reszty Cys MTazy. --- Właściwości metylo-5-)-metylotransferazy DNA (EC 2.1.1.37) sugerują, że jest to enzym, który utrzymuje wzorce metylacji w ludzkim genomie. Propozycje mechanizmu działania enzymu sugerują, że 5-metylodeoksycytydyna jest wytwarzana z deoksycytydyny poprzez dihydrocytozynę pośredniej dihydrocytozyny. Użyliśmy oligodeoksynukleotydu zawierającego 5-fluorodeoksycytydynę jako substrat samobójczy do wychwytywania enzymu i półproduktu dihydrocytozyny. Eksperymenty opóźniania żelu wykazują tworzenie oczekiwanego kowalencyjnego kompleksu między dupleksowym DNA zawierającym 5-fluorodeoksycytydynę i ludzki enzym. Tworzenie kompleksu było zależało od obecności donora metylu S-adenozylometioniny, co sugeruje że obejmuje on związaną z enzymem 5-podstawioną cząsteczkę dihydrocytozyny w DNA. Pochodne dihydrocytozyny są niezwykle labilne w stosunku do deaminacji hydrolitycznej w roztworze wodnym. Ponieważ mutacje przejścia C do T są szczególnie są szczególnie rozpowszechnione w miejscach CG w ludzkim DNA, zastosowaliśmy wysokosprawną chromatografię cieczową do poszukiwania chromatografię cieczową do poszukiwania tymidyny, która może być generowana przez hydrolizę podczas reakcji transferu metylu. Pomimo potencjału deaminacji deaminacji, metylotransferaza nie wytwarzała wykrywalnych ilości tymidyny. nie wytwarzała wykrywalnych ilości tymidyny. Dane sugerują, że zdolność ludzkiej metylotransferazy do zachowania informacji genetycznej podczas kopiowania wzoru metylacji (tj. wzoru metylacji (tj. jej wierność) jest porównywalna ze zdolnością polimerazy DNA ssaków do zachowania informacji genetycznej podczas kopiowania sekwencji DNA. sekwencji DNA. Zatem wysoka częstotliwość przejść C do T w miejscach CG w ludzkim DNA nie wydaje się być spowodowana normalnym enzymatycznym utrzymaniem wzorów metylacji wzorców. --- Aktywność enzymu metylazy deoksycytozyny (Dcm) powoduje mutagenezę in vitro albo bezpośrednio przez indukowaną enzymatycznie deaminację cytozyny do uracylu pod nieobecność donora metylu, S-adenozylometioniny (SAM), lub pośrednio poprzez spontaniczne deaminację [5-metylo]cytozyny do tyminy. Używając testu rewersji Lac, zbadaliśmy zbadaliśmy udział pierwszego mechanizmu w mutagenezie Dcm in vivo poprzez obniżenie poziomu SAM. Poziomy SAM u Escherichia coli zostały obniżone przez zmniejszając aktywność syntetazy SAM poprzez wprowadzenie allelu metK84 lub poprzez hydrolizę SAM przy użyciu hydrolazy SAM bakteriofaga T3. Szczepy metK84 wykazywały zwiększoną mutagenezę C-to-T. Ekspresja genu hydrolazy T3 SAM, pod kontrolą promotora P(BAD) indukowanego arabinozą, skutecznie skutecznie zmniejszała metylację genomowego DNA za pośrednictwem Dcm. Jednakże, zwiększona mutageneza była mutageneza nie była obserwowana, dopóki nie zastosowano ekstremalnie wysokich stężeń arabinozy i genomu metylacja w miejscach Dcm była znikoma. --- Obrót nukleotydu DNA lub RNA z podwójnej helisy do kieszeni białkowej ("przerzucanie zasad") ("przerzucanie zasad") jest mechanistyczną cechą wspólną dla niektórych białek wiążących DNA/RNA białek wiążących DNA/RNA. Tutaj przedstawiamy strukturę metylotransferazy HhaI w kompleksie z DNA zawierającym ograniczony do południa abasowy cukier karbocykliczny w miejscu docelowym w obecności produktu ubocznego donora metylu AdoHcy. Nieoczekiwanie, pseudocukier zablokowany południowy pseudocukier wydaje się być uwięziony w środku ścieżki odwracania przez główny rowek DNA, utrzymywany w miejscu głównie przez kontakty Van der Waalsa z zestawem niezmiennych z zestawem niezmiennych aminokwasów. Symulacje dynamiki molekularnej wskazują, że stabilizacja strukturalna obserwowana w przypadku pseudocukru ograniczonego do południa pseudocukrem nie wystąpi w przypadku pseudocukru ograniczonego do północy, co wyjaśnia jego niższe powinowactwo wiązania. Co więcej, porównanie przejść strukturalnych cukru i szkieletu fosfodiestrowego obserwowanych podczas badań obliczeniowych przerzucania zasad w trójskładnikowym kompleksie M.HhaI-DNA-AdoHcy wskazują, że pseudocukier pseudocukier indukuje konformację szkieletu fosfodiestrowego, która odpowiada konformacji szkieletu fosfodiestrowego. która odpowiada konformacji dyskretnego intermediatu szlaku przerzucania zasad. szlaku przerzucania zasad. Ponieważ poprzednie struktury krystaliczne trójskładnikowego kompleksu M.HhaI z DNA wykazywały odwróconą cząsteczkę cukru w antypodalnej konformacji północnej, sugerujemy, że konwersja pucker cukru z południa na północ poza w środku ścieżki jest istotną częścią mechanizmu, przez który przerzucanie musi postępować, aby dotrzeć do ostatecznego miejsca przeznaczenia. Omawiamy również możliwość, że pseudocukier ograniczony do południa naśladuje stan przejściowy w fosfodiestrowym i cukrowym, który występuje podczas przerzucania zasad DNA w obecności w obecności M.HhaI.
Jaki jest dawca metylu dla metylotransferaz DNA (cytozyny-5)?
S-adenozylo-L-metionina (AdoMet, SAM) jest donorem metylowym metylotransferaz DNA (cytozyno-5). Metylotransferazy DNA (cytozyny-5) katalizują przeniesienie grupy metylowej z S-adenozylo-L-metioniny do pozycji C-5 reszt cytozyny w DNA.