Karbamylacja jest ogólnym procesem zaangażowanym w starzenie molekularne białek z powodu nieenzymatycznego wiązania kwasu izocyjanowego, generowanego głównie przez mocznik do wolnych grup aminowych. Eksperymenty in vitro i badania kliniczne sugerują potencjalny udział karbamylowanych białek (CP) w przewlekłej chorobie nerek (CKD). powikłaniach przewlekłej choroby nerek (CKD), takich jak miażdżyca, ale ich ich metaboliczny los in vivo jest wciąż nieznany. Aby rozwiązać tę kwestię, oceniliśmy karbamylację białek w osoczu i tkankach kontrolnych i 75% nefrektomizowanych myszy C57BL/6J za pomocą testu LC-MS/MS homocitruliny, głównego produktu pochodzącego z karbamylacji (CDP). Podstawowy poziom karbamylacji został we wszystkich warunkach, pokazując, że karbamylacja jest fizjologicznym procesem modyfikacji białek in vivo. procesem modyfikacji białek in vivo. Stężenie CP w osoczu wzrosło u nefrektomizowanych w porównaniu do myszy kontrolnych w ciągu 20 tygodni eksperymentu (np. 335 ± 43 vs. 167 ± 19 μmol homocitruliny/mol lizyny (p<0,001) 20 tygodni po nefrektomii). nefrektomii). Jednocześnie zawartość CP wzrosła w przybliżeniu dwukrotnie we wszystkich tkankach podczas całego eksperymentu. tkankach przez cały czas trwania eksperymentu. Postępująca akumulacja CP została szczególnie w długo żyjących białkach macierzy zewnątrzkomórkowej, zwłaszcza w kolagenu (np. 1264 ± 123 vs. 726 ± 99 μmol homocitruliny/mol lizyny (p<0,01) w skórze myszy poddanych nefrektomii w porównaniu do myszy kontrolnych po 20 tygodniach ewolucji). Wyniki te pokazują, że przewlekły wzrost mocznika, obserwowany w CKD, zwiększa szybkość szybkość karbamylacji białek osocza i tkanek. Wyniki te mogą być rozważane w perspektywie szkodliwych skutków CP wykazanych in in vitro i korelacji wykazanej ostatnio między CP w osoczu a ryzykiem sercowo-naczyniowym lub śmiertelnością u pacjentów z CKD. --- Karbamylacja (karbamoilacja) reszt lizyny i N-końcówek białek jest nieenzymatyczną PTM związaną ze starzeniem się białek. nieenzymatycznym PTM, który został powiązany ze starzeniem się białek. W przeciwieństwie do innych PTM, takich jak fosforylacja, karbamylację można sztucznie wprowadzić podczas przygotowywania próbki z mocznikiem, wpływając w ten sposób na badania ukierunkowane na karbamylację in karbamylacji in vivo. W roztworze wodnym mocznik - powszechnie stosowany do denaturacji białek białek - jest w równowadze z amonem i izocyjanianem. W warunkach alkalicznych W warunkach alkalicznych ten ostatni może reagować z pierwszorzędowymi aminami wolnych N-końcówek i ε-aminami lizyn, tworząc pochodne karbamylu. Pomimo tego, że jest to stosunkowo powolnym procesem, który jest przyspieszany w podwyższonych temperaturach, przedłużona inkubacja próbek białek/peptydów w buforach mocznikowych może indukować niepożądaną karbamylację, utrudniając nie tylko trawienie proteolityczne trypsyną trypsyną i identyfikację peptydów za pomocą MS, ale także zakłócanie stabilnych technik znakowania izotopowego, takich jak techniki znakowania izotopowego, takie jak iTRAQ, tandemowe znaczniki masy i znakowanie izotopowe białek. znakowanie białek. Tutaj oceniliśmy zakres karbamylacji indukowanej mocznikiem w powszechnie stosowanych warunkach przygotowania próbek. Z naszych wyników możemy wywnioskować, że karbamylacja zachodzi we wszystkich przypadkach z udziałem mocznika, jednak w różnym stopniu. różnym stopniu: np. karbamidometylacja w obecności 8,0 M mocznika indukowała karbamylację 17% N-końcówek i 4% reszt Lys. Dodatkowo, badanie niedawno opublikowanego zbioru danych na dużą skalę ujawniło wysoki stopień karbamylacji indukowanej mocznikiem w obecnych próbkach proteomicznych. --- Roztwór mocznika jest jednym z najczęściej stosowanych denaturantów białek w badaniach proteomicznych. w badaniach proteomicznych. Jednak od dawna wiadomo, że roztwór mocznika że roztwór mocznika może powodować karbamylację na końcach N białek/peptydów oraz na grupach aminowych łańcucha bocznego reszt lizyny i argininy. Karbamylacja białek/peptydów blokuje trawienie proteazami i wpływa na białko identyfikację i kwantyfikację białek w analizie spektrometrii mas poprzez blokowanie grup aminowych peptydu przed znakowaniem izotopowym/izobarycznym i zmieniającym się ładunkiem peptydu peptydów, czasy retencji i masy. Ponadto, karbamylacja białek podczas utrudnia badanie karbamylacji białek in vivo. W W tym badaniu porównaliśmy karbamylację peptydów w roztworach mocznika różnych buforów buforów i stwierdziliśmy, że bufory zawierające amon były najskuteczniejszymi buforami hamującymi karbamylację białek w roztworze mocznika. Możliwy mechanizm hamowania karbamylacji przez bufory zawierające amon jest mocznika i buforów zawierających amon, a także zrewidowaną procedurę trawienia białek proteazą w moczniku i buforach zawierających amon, aby ułatwić jej zastosowanie w badaniach proteomicznych. w badaniach proteomicznych. --- Cel: Ostatnie prace wykazały, że ludzie są w znacznym stopniu narażeni na działanie kwasu izocyjanowego/cyjanianu. który powstaje podczas spalania węgla, biomasy lub tytoniu. In cyjanian jest tworzony przez mieloperoksydazę białka fagocytów i przez rozkład mocznika. rozkład mocznika. Wykazano, że karbamylacja białek przez cyjanian ryzyko sercowo-naczyniowe i uważa się, że promuje dysfunkcję naczyń krwionośnych. dysfunkcję naczyń krwionośnych; jednak podstawowe mechanizmy pozostają niejasne. WYNIKI: Tutaj pokazujemy, że cyjanian indukuje międzykomórkową adhezję komórek cząsteczka-1 (ICAM-1) z późniejszą zwiększoną adhezją neutrofili w ludzkich komórkach śródbłonka tętnic wieńcowych. Cyjanian wyzwala ekspresję ICAM-1 poprzez mechanizm zależny od aktywacji białka aktywowanego mitogenem kinazy p38 i czynnika jądrowego-kappaB. Śródbłonkowa ekspresja ICAM-1 nie była indukowana, gdy substancje o niskiej masie cząsteczkowej zostały usunięte z pożywki pożywki, wykluczając w ten sposób rolę karbamylowanych (lipo)białek w indukcji ICAM-1 indukcji. U myszy doustne podawanie cyjanianu indukowało wyraźną ekspresję śródbłonka ICAM-1 w aorcie. Co więcej, u pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek choroby, stopień karbamylacji białek osocza (marker ekspozycji na cyjanian ekspozycji) istotnie korelował z poziomem rozpuszczalnej ICAM-1 w osoczu. INNOWACJA: Tutaj po raz pierwszy wykazujemy, że cyjanian, a nie karbamylowane lipoproteiny, indukuje ekspresję naczyniową ICAM-1 in vivo. WNIOSEK: Łącznie nasze dane zwiększają możliwość, że cyjanian wzmacnia zapalenie naczyń krwionośnych, łącząc stan zapalny, palenie tytoniu i mocznicę. --- Uważa się, że potranslacyjna modyfikacja i funkcjonalne upośledzenie białek poprzez Uważa się, że karbamylacja sprzyja dysfunkcji naczyń w schyłkowej fazie choroby nerek. choroby nerek. Cyjanian, reaktywny gatunek w równowadze z mocznikiem, karbamyluje białkowe reszty lizyny, tworząc epsilon-karbamylozynę (homocitrulinę), zmieniając strukturę i funkcję białka. Obecnie donosimy o odkryciu alternatywnego i ilościowo dominującego mechanizmu tworzenia cyjanianu i karbamylacji białek w miejscach zapalenia i blaszki miażdżycowej: katalizowane przez mieloperoksydazę utlenianie tiocyjanianu, anionu obficie występującego we krwi. którego poziom jest podwyższony u palaczy. Wykazaliśmy również, że katalizowana przez mieloperoksydazę karbamylacja lipoprotein ułatwia wiele działań działania pro-miażdżycowe, w tym konwersję lipoprotein o niskiej gęstości w ligand do rozpoznawania receptora zmiatacza makrofagów A1, akumulację cholesterolu i tworzenie komórek piankowatych. akumulację cholesterolu i tworzenie komórek piankowatych. W dwóch oddzielnych badaniach klinicznych (łącznie n = 1000 osób), poziomy homocitruliny związanej z białkami w osoczu niezależnie przewidywało zwiększone ryzyko choroby wieńcowej, przyszłego zawału mięśnia sercowego, udaru i zgonu. zawału mięśnia sercowego, udaru mózgu i śmierci. Proponujemy, aby karbamylacja białek była mechanizmem mechanizm łączący stan zapalny, palenie tytoniu, mocznicę i chorobę wieńcową patogenezę. --- Karbamylacja białek jest jedną z ważnych modyfikacji potranslacyjnych, która odgrywa kluczową rolę w wielu stanach biologicznych, takich jak choroby, przewlekła niewydolność nerek i miażdżyca. Dlatego też rozpoznawanie i i identyfikacja miejsc karbamylowanych białek są niezbędne do leczenia chorób i zapobiegania im. i zapobiegania chorobom. Jednak mechanizm działania karbamylowanych miejsc lizyny jest wciąż nie został poznany. Dlatego jego odkrycie pozostaje w dużej mierze nierozwiązanym wyzwaniem, czy to eksperymentalnie, czy teoretycznie. Aby rozwiązać ten problem przedstawiliśmy ramy obliczeniowe do teoretycznego przewidywania i analizowania karbamylowanych miejsc lizyny w oparciu zarówno o jednoklasową metodę k-najbliższego sąsiada i dwuetapową selekcję cech. Jednoklasowa metoda k-najbliższych sąsiadów nie wymaga negatywnych próbek w treningu. Wyniki eksperymentalne wykazały, że przy użyciu 280 optymalnych cech, prezentowana metoda osiągnęła obiecujące wyniki SN=82,50% dla testu jackknife na zbiorze treningowym i SN=66,67%, SP=100,00% i MCC=0,8097 dla niezależnego testu na zbiorze testowym, odpowiednio. Dalsza analiza optymalnych cech zapewniła wgląd w mechanizm działania karbamylowanych miejsc lizyny. Przewiduje się, że nasza metoda metoda może być potencjalnie użytecznym i niezbędnym narzędziem dla biologów do teoretycznie badać karbamylowane miejsca lizyny. --- Karbamylacja opisuje nieenzymatyczną potranslacyjną modyfikację białek w której pośredniczy cyjanian, produkt dysocjacji mocznika. Kiedy czynność nerek nerek i gromadzi się mocznik, obciążenie karbamylacją naturalnie wzrasta. Wolne aminokwasy mogą chronić białka przed karbamylacją. karbamylacji białek u pacjentów z mocznicą i niedoborem aminokwasów. z niedoborem aminokwasów. Reakcje karbamylacji mogą zmieniać strukturę i właściwości funkcjonalne niektórych białek. i właściwości funkcjonalne niektórych białek i zostały bezpośrednio powiązane z mechanizmach leżących u podstaw różnych stanów chorobowych. Szeroki zakres badań badań wykazał, w jaki sposób nieodwracalne wiązanie cyjanianu pochodzącego z mocznika z białkami białkami w organizmie człowieka powoduje niewłaściwe reakcje komórkowe prowadzące do niekorzystne skutki, takie jak przyspieszona miażdżyca i stany zapalne. Biorąc pod uwagę związek karbamylacji z mocznikiem i dowody na to, że przyczynia się ona do patogenezy patogenezy choroby, pomiary karbamylowanych białek mogą służyć jako użyteczne ilościowe biomarkery uśrednionych w czasie stężeń mocznika, oferując jednocześnie ocenę ryzyka u pacjentów z chorobami nerek. Co więcej, związek między karbamylowanymi białkami i patofizjologią choroby tworzy kuszący cel terapeutyczny dla zmniejszenia szybkości karbamylacji. Niniejszy artykuł zawiera przegląd biochemii reakcji karbamylacji, jej roli w określonych chorobach, oraz potencjalne implikacje diagnostyczne i terapeutyczne tych ustaleń w oparciu o najnowsze osiągnięcia. --- Wykazano, że karbamylacja białek poprzez reaktywny cyjanian przewidywać zwiększone ryzyko sercowo-naczyniowe. Cyjanian powstaje in vivo w wyniku rozpadu mocznika mocznika i w miejscach zapalenia przez białko fagocytów mieloperoksydazę. Ponieważ mieloperoksydaza (MPO) wiąże się z lipoproteinami o wysokiej gęstości (HDL) w ludzkiej miażdżycowej błonie wewnętrznej, zbadaliśmy w niniejszym badaniu, czy cyjanian specyficznie celuje w HDL. Analiza spektrometrii mas wykazała, że białko karbamylacja jest główną potranslacyjną modyfikacją HDL. Zawartość zawartość karbamylozyny w HDL pochodzącym z uszkodzenia była ponad 20-krotnie wyższa w porównaniu z w porównaniu z poziomem 3-chlorotyrozyny, specyficznego produktu utleniania MPO. Warto zauważyć, że zawartość karbamylozyny w HDL pochodzącym ze zmian chorobowych była pięcio- do ośmiokrotnie wyższa wyższa w porównaniu z pochodzącymi ze zmian lipoproteinami o niskiej gęstości (LDL) lub całkowitym białkiem i wzrastała wraz z nasileniem uszkodzenia. Zawartość karbamylozyny w HDL, ale nie LDL, korelowała z poziomami 3-chlorotyrozyny, sugerując, że MPO pośredniczy w karbamylacji w ścianie naczynia. Co ciekawe, jedna reszta karbamylozyny na apolipoproteinę A-I związaną z HDL była wystarczająca do wywołania akumulację cholesterolu i tworzenie kropli lipidowych w makrofagach poprzez szlak wymagający receptora zmiatacza HDL klasy B, typ I. Obecne wyniki wskazują na możliwość, że karbamylacja HDL przyczynia się do powstawania komórek piankowatych w miażdżycy. komórek piankowatych w zmianach miażdżycowych. --- Karbamylacja białek jest potranslacyjną modyfikacją, która może zachodzić w obecności mocznika. obecności mocznika. W roztworze mocznik znajduje się w równowadze z cyjanianem amonu, a karbamylacja zachodzi, gdy jony cyjanianu reagują z grupami aminowymi lizyn, arginin, N-końcówek białek, a także grup sulfhydrylowych cystein. Stężenie mocznika mocznika jest podwyższone w rdzeniu wewnętrznym nerek w porównaniu z innymi tkankami. tkanek. Ze względu na wysokie stężenie mocznika postawiliśmy hipotezę, że karbamylacja może zachodzić endogennie w rdzeniu wewnętrznym szczura. Stosując immunoblotting szczurzej homogenatów korowych i rdzeniowych nerek szczura z przeciwciałem specyficznym dla karbamylo-lizyny wykazaliśmy, że karbamylacja jest obecna w dużej liczbie wewnętrznych białek rdzenia. białek rdzeniastych. Wykorzystując spektrometrię masową białek (LC-MS/MS) rdzenia wewnętrznego nerki szczura szczura, zidentyfikowaliśmy 456 unikalnych miejsc karbamylowanych w 403 białkach, w tym wielu, które odgrywają ważną rolę fizjologiczną w rdzeniu nerkowym [Dane są dostępne pod adresem https://helixweb.nih.gov/ESBL/Database/Carbamylation/Carbamylation_peptide_sorted.html]. Wnioskujemy, że karbamylacja białek występuje endogennie w nerkach, modyfikując wiele fizjologicznie ważnych białek.
Czym jest karbamylacja białek?
Karbamylacja białek jest potranslacyjną modyfikacją, która może zachodzić w obecności mocznika. W roztworze mocznik jest w równowadze z cyjanianem amonu, a karbamylacja zachodzi, gdy jony cyjanianu reagują z grupami aminowymi lizyn, arginin, N-końcówek białek, a także grupami sulfhydrylowymi cystein. Karbamylacja białek jest jedną z ważnych modyfikacji potranslacyjnych, która odgrywa kluczową rolę w wielu stanach biologicznych, takich jak choroby, przewlekła niewydolność nerek i miażdżyca.