NELF i DSIF współpracują w celu hamowania wydłużania przez polimerazę RNA IIa w ekstraktach z ludzkich komórek. Podjęto wieloaspektowe podejście w celu zbadania potencjalną rolę tych czynników w proksymalnej pauzie promotora na genie hsp70 u Drosophila. Immunodeplecja DSIF z ekstraktu jądrowego Drosophila zmniejszyła poziom polimerazy, która zatrzymała się w proksymalnym regionie promotora hsp70. Zubożenie jednej podjednostki NELF w gruczołach ślinowych przy użyciu interferencji RNA również obniżyła poziom zatrzymanej polimerazy. Sieciowanie białko-DNA in vivo wykazało, że że NELF i DSIF wiążą się z regionem promotora przed szokiem cieplnym. Analiza immunofluorescencyjna chromosomów polietylenowych potwierdziła wynik wynik sieciowania i wykazał, że NELF, DSIF i polimeraza RNA IIa kolokalizują w genach hsp70, małych genach szoku cieplnego i wielu innych chromosomalnych. Wreszcie, po indukcji szoku cieplnego, DSIF i polimeraza, ale nie NELF, były silnie rekrutowane do chromosomalnych puffów zawierających geny hsp70. Proponujemy, aby NELF i DSIF powodowały zatrzymanie polimerazy w regionie proksymalnym promotora hsp70. proksymalnym regionie promotora hsp70. Aktywator transkrypcyjny, HSF, może może powodować dysocjację NELF z kompleksu elongacyjnego. DSIF nadal wiąże się z kompleksem elongacyjnym i może odgrywać pozytywną rolę w elongacji. elongacji. --- Elongacja jest coraz częściej uznawana za krytyczny etap w eukariotycznej regulacji transkrypcji. regulacji transkrypcji. Chociaż tradycyjne badania genetyczne i biochemiczne zidentyfikowały głównych graczy elongacji transkrypcyjnej, nasze zrozumienie znaczenia i roli tych czynników szybko ewoluuje dzięki ostatnich postępów w technologiach obejmujących cały genom i pojedynczą cząsteczkę. Tutaj skupiamy się na tym, w jaki sposób elongacja może modulować wynik transkrypcji poprzez etap hamowania polimerazy RNA II (Pol II) w pobliżu promotorów i w jaki sposób zidentyfikowano uczestniczące w nim czynniki. Wśród opisanych przez nas czynników znajdują się NELF (negatywny czynnik elongacji) i DSIF (czynnik indukujący wrażliwość na DRB). oraz P-TEFb (pozytywny czynnik elongacji b), który jest kluczowym graczem w uwalnianiu pauzy. jest kluczowym graczem w uwalnianiu pauzy. Opisujemy również widok wysokiej rozdzielczości Pol II i proponujemy niewykluczające się modele tego, w jaki sposób osiągana jest pauza. My Następnie omawiamy elongację Pol II przez ciała genów i role FACT i SPT6, czynników umożliwiających Pol II przemieszczanie się przez nukleosomy. --- Ekspresja wielu genów metazoicznych jest regulowana poprzez kontrolowane uwalnianie polimerazy RNA II (Pol II), która została zatrzymana podczas wczesnej elongacji transkrypcji elongacji. Zatrzymanie jest wysoce wzbogacone w geny w szlakach reagujących na bodźce, gdzie zaproponowano, aby ustawić dalsze cele dla szybkiej aktywacji genów. aktywacji genów. Jednak to, czy jest to główna funkcja pauzy w tych szlakach, pozostaje do ustalenia. tych szlakach pozostaje do ustalenia. Aby odpowiedzieć na to pytanie, przeanalizowaliśmy pauzę w kilku sieciach reagujących na bodźce u Drosophila i odkryliśmy że wstrzymany Pol II jest znacznie bardziej rozpowszechniony w genach kodujących składniki i regulatorów kaskad transdukcji sygnału niż w indukowalnych celach niższego rzędu. W obrębie szlaków immunoreaktywnych odkryliśmy, że pauza utrzymuje podstawową ekspresję krytycznych węzłów sieci, w tym ekspresję krytycznych węzłów sieci, w tym kluczowego czynnika transkrypcyjnego NF-κB który wyzwala aktywację genów. W związku z tym utrata pauzy poprzez knockdown czynnika indukującego pauzę NELF prowadzi do szeroko osłabionej aktywacji genów odpornościowych. aktywacji genów odpornościowych. Badanie mysich embrionalnych komórek macierzystych wykazało, że pauzowanie jest podobnie rozpowszechnione w genach kodujących składniki sygnalizacyjne, które regulują samoodnowę, szczególnie w obrębie szlaku MAPK/ERK. Doszliśmy do wniosku że rola pauzy wykracza daleko poza geny indukowalne do aktywacji i proponujemy, że podstawową funkcją wstrzymanego Pol II jest ustanowienie podstawowej aktywności sieci reagujących na sygnał. --- Eukariotyczny czynnik elongacji transkrypcji DSIF [DRB (5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranozylobenzimidazol) czynnik indukujący wrażliwość] składa się z dwóch podjednostek, hSpt4 i hSpt5, które są homologiczne do czynników drożdżowych czynników Spt4 i Spt5 drożdży. DSIF jest zaangażowany w regulację procesywności polimerazy RNA polimerazy II i odgrywa istotną rolę w aktywacji transkrypcyjnej eukariontów. W kilku promotorach eukariotycznych DSIF, wraz z NELF (negatywny czynnik elongacji) czynnik elongacji), prowadzi do zatrzymania proksymalnej promotora polimerazy RNA II. W opisujemy strukturę krystaliczną hSpt4 w kompleksie z regionem dimeryzacji hSpt4. regionem dimeryzacji hSpt5 (aminokwasy 176-273) w rozdzielczości 1,55 A (1 A=0.1 nm). Heterodimer wykazuje wysokie podobieństwo strukturalne do swojego homologa z Saccharomyces cerevisiae. Ponadto, hSpt5-NGN jest strukturalnie podobny do NTD (N-końcowa domena) bakteryjnego czynnika transkrypcyjnego NusG. A homolog dla hSpt4 nie został jeszcze znaleziony w bakteriach. Jednak archealny czynnik transkrypcyjny czynnik transkrypcyjny RpoE" wydaje się być daleko spokrewniony. Chociaż porównanie NusG-NTD Escherichia coli z hSpt5 ujawniło podobieństwo trójwymiarowych struktur, interakcja struktur trójwymiarowych, interakcja E. coli NusG-NTD z hSpt4 nie można było zaobserwować w eksperymentach miareczkowania NMR. Konserwowana reszta glutaminianowa reszta, która okazała się kluczowa dla dimeryzacji w drożdżach, jest również zaangażowany w ludzki heterodimer, ale jest zastąpiony przez resztę glutaminy w Escherichia coli NusG. Jednak wymiana glutaminy na glutaminian okazała się nie była wystarczająca do indukcji wiązania hSpt4. --- Negatywny czynnik wydłużający (NELF) i 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranozylobenzimidazolowy czynnik indukujący wrażliwość (DSIF) są zaangażowane w zatrzymywanie polimerazy RNA II (Pol II) w promotora proksymalnego regionu genu hsp70 u Drosophila, przed indukcją szoku cieplnego indukcją szoku cieplnego. Takie bloki w elongacji są szeroko rozpowszechnione w genomie Drosophila. Jednak mechanizm, za pomocą którego DSIF i NELF uczestniczą w tworzeniu Pol II pozostaje niejasny. Przeanalizowaliśmy interakcje między DSIF, NELF, i zrekonstruowanym kompleksem elongacyjnym Drosophila Pol II, aby uzyskać wgląd w mechanizm zatrzymania. Nasze wyniki pokazują, że DSIF i NELF wymagają powstającego transkryptu dłuższego niż 18 nt. transkryptu dłuższego niż 18 nt, aby stabilnie łączyć się z kompleksem elongacyjnym Pol II elongacji Pol II. Sieciowanie białko-RNA ujawnia, że Spt5, największa podjednostka DSIF, kontaktuje się z powstającym RNA, gdy RNA wyłania się z kompleksu elongacyjnego. Podsumowując, wyniki te dostarczają możliwego modelu, w którym DSIF wiąże kompleks wydłużający kompleks elongacyjny poprzez asocjację z powstającym transkryptem, a następnie a następnie rekrutuje NELF. Chociaż DSIF i NELF były wymagane do hamowania transkrypcji, nie wykryliśmy transkrypcji, nie wykryliśmy kontaktu NELF-RNA, gdy powstający transkrypt miał długość od 22 do 31 nt, co obejmuje region, w którym promotor-proksymalna pauza występuje w wielu genach u Drosophila. Rodzi to możliwość możliwość, że wiązanie RNA przez NELF nie jest konieczne w proksymalnym promotorze pauzie. --- Rozbieżna transkrypcja występuje w większości promotorów polimerazy RNA II (RNAPII) promotorów w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (mESC), a aktywność ta koreluje z wyspami CpG. W niniejszym raporcie przedstawiamy charakterystykę antysensownej transkrypcji w regionach kodujących RNA związane z miejscem startu transkrypcji (TSSa-RNA) w czterech rozbieżnych promotorach wysp CpG: Isg20l1, Tcea1, Txn1 i Sf3b1. Odkryliśmy, że antysensowne RNA (uaRNA) mają różne końce 5' i są heterogeniczne. i heterogeniczne niepoliadenylowane końce 3'. uaRNA są krótkotrwałe ze średnim okresem półtrwania 18 minut. średnim okresem półtrwania wynoszącym 18 minut i są obecne w 1-4 kopiach na komórkę, w przybliżeniu jeden RNA na matrycę DNA. Zubożenie egzosomów stabilizuje uaRNA. Te uaRNA są prawdopodobnie produktami inicjacji, ponieważ ich zamknięte końce korelują ze szczytami wstrzymanego RNAPII. Czynniki wstrzymujące NELF i DSIF są związane z tymi antysensownymi polimerazami i ich sensownymi partnerami. Zablokowanie NELF lub DSIF powoduje wzrost poziomów uaRNA. Zgodnie z tym, że P-TEFb kontroluje uwalnianie z pauzy, leczenie jego inhibitorem, flawopiranolem inhibitorem, flawopiridolem, zmniejsza uaRNA i powstające transkrypty mRNA z podobną kinetyką. podobną kinetyką. Wreszcie, indukcja Isg20l1 ujawnia równoważne wzrosty w aktywności transkrypcyjnej w kierunku sensownym i antysensownym. Wszystkie te dane pokazują, że rozbieżne polimerazy są regulowane po rekrutacji P-TEFb z uaRNA kontrolowanym przez egzosom. --- Czynnik wydłużający transkrypcję 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranozylobenzimidazol (DRB) indukujący wrażliwość czynnik (DSIF) reguluje procesywność polimerazy RNA II (RNAPII) poprzez promowanie, w koncert z ujemnym czynnikiem wydłużającym (NELF), wstrzymanie promotora proksymalnego RNAPII. DSIF jest również podobno zaangażowany w aktywację transkrypcji. Jednakże, rola DSIF w aktywacji transkrypcji przez aktywatory wiążące DNA jest jednak jest niejasna. Tutaj pokazujemy, że DSIF działa kooperatywnie z aktywatorem wiążącym DNA, Gal4-VP16, w celu promowania aktywacji transkrypcyjnej. Pod nieobecność DSIF, transkrypcja aktywowana przez Gal4-VP16 powodowała częste zatrzymywanie RNAPII podczas elongacji in vitro. wydłużania in vitro. Obecność DSIF zmniejszała pauzę, wspierając w ten sposób aktywację za pośrednictwem Gal4-VP16. Stwierdziliśmy, że DSIF wywiera pozytywny wpływ w krótkich ramach czasowych od inicjacji do elongacji i że NELF nie wpływa na pozytywną funkcję regulacyjną DSIF. Zablokowanie genu kodującego dużą podjednostkę DSIF, ludzki Spt5 (hSpt5), w komórkach HeLa zmniejszony aktywację genu reporterowego za pośrednictwem Gal4-VP16, ale nie miało wpływu na ekspresję przy braku aktywatora. ekspresję przy braku aktywatora. Łącznie wyniki te dostarczają dowodów że transkrypcja na wyższym poziomie ma silniejszy wymóg dla DSIF i że DSIF przyczynia się do skutecznej aktywacji transkrypcji poprzez zapobieganie RNAPII podczas wydłużania transkrypcji. --- Eukariotyczny czynnik elongacji transkrypcji czynnik indukujący wrażliwość na 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranozylobenzimidazol (DRB) (DSIF), jest zaangażowany w regulację procesywności polimerazy RNA II. (DSIF), jest zaangażowany w regulację procesywności polimerazy RNA II. DSIF odgrywa również rolę w aktywacji transkrypcji, a w połączeniu z ujemnym czynnikiem wydłużającym NELF powoduje proksymalną pauzę promotora polimerazy RNA polimerazy RNA II. Co więcej, DSIF jest również zaangażowany w regulację transkrypcji prowirusowego DNA ludzkiego wirusa niedoboru odporności. Ludzki DSIF jest składa się z dwóch podjednostek, hSpt4 (p14) i hSpt5 (p160), odpowiadających drożdżowym homologom Spt4 i Spt5. Tutaj pokazujemy oczyszczanie i charakterystykę małej podjednostki, hSpt4. Byliśmy w stanie oczyścić białko w postaci rozpuszczalnej oddzielnie od większej podjednostki hSpt5. Spektroskopia CD i NMR pokazują, że oczyszczone białko hSpt4 wykazuje topologię alfa/beta z dobrze zdefiniowaną strukturą trzeciorzędową. strukturą trzeciorzędową. Ponadto analiza metali metodą ICP-OES wskazuje, że białko białko zawiera funkcjonalny palec Zn 4-Cys.
Jakie czynniki odgrywają rolę w wstrzymywaniu proksymalnego promotora polimerazy RNA II?
NELF (negatywny czynnik wydłużający) i DSIF (czynnik indukujący wrażliwość DRB)