Hormon steroidowy progesteron (P) jest krytycznym regulatorem podczas implantacji blastocysty. Hormon ten działa poprzez jądrowe receptory P (PR), modulując ekspresję określonych sieci genów w różnych typach komórek macicy. typach komórek macicy. Aby zidentyfikować szlaki regulowane przez P leżące u podstaw macicy wrażliwość, wcześniej używaliśmy mikromacierzy oligonukleotydowych do analizy macicy mRNA w czasie implantacji w odpowiedzi na RU486, antagonistę PR. Donieśliśmy, że mRNA odpowiadający genowi odpowiedzi immunologicznej 1 (Irg1), wcześniej opisany gen indukowany lipopolisacharydem, jest jednym z kilku mRNA, które są znacznie regulowane w dół przez RU486 w macicy przedimplantacyjnej. W niniejszym badaniu przeprowadziliśmy hybrydyzację in situ, aby wykazać, że P stymuluje syntezę mRNA Irg1 w komórkach nabłonka luminalnego macicy myszy typu dzikiego, ale nie myszy z nokautem PR. Donosimy również, że mRNA Irg1 było indukowane w nabłonku luminalnym ciężarnej macicy między d 3 i 5, nakładając się na okno implantacji. Aby zbadać funkcję Irg1 podczas implantacji, podaliśmy sensowne lub antysensowne oligodeoksynukleotydy do macicy myszy przed implantacją. Leczenie antysensownymi oligodeoksynukleotydami doprowadziło do zahamowania ekspresji mRNA Irg1 bez wpływu na niepowiązane mRNA w ciężarnej macicy. ciężarnej macicy. Interwencji tej towarzyszyło również upośledzenie implantacji zarodka. implantacji zarodka, wskazując, że fenotyp jest związany z supresją mRNA Irg1. Podsumowując, nasze badania zidentyfikowały Irg1 jako nowy cel PR w ciężarnej macicy, a także ujawniły, że jest on krytycznym regulatorem wczesnych zdarzeń prowadzących do implantacji. --- Murine immune-responsive gene 1 (IRG1) odgrywa znaczącą rolę w embrionalnej implantacji i neurodegeneracji. implantacji i neurodegeneracji. Wzór ekspresji ludzkiego genu IRG1 IRG1 nie został jednak jeszcze ustalony, a przewidywana sekwencja genu była została kilkakrotnie zmieniona zgodnie z obliczonymi znacznikami sekwencji wyrażonej (EST). Aby określić profil ekspresji ludzkiego genu IRG1, próbki ludzkich tkanek płodowych, komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych osób oraz linii komórkowych ludzkich linii komórkowych białaczki THP-1 i K-562 poddanych działaniu lipopolisacharydu (LPS) poddano RT-PCR przy użyciu zdegenerowanych starterów. Wyniki wskazały że gen IRG1 ulega zróżnicowanej ekspresji w ludzkich płodowych PBMC i dorosłych PBMC stymulowanych LPS. Amplifikowany fragment genu został sklonowany do wektora pET32a(+) i poddany fuzji z tagiem His w systemie prokariotycznym. Po chromatografii powinowactwa, ludzkie białka fuzyjne IRG1h zostały wyizolowane przez SDS-PAGE i zidentyfikowane za pomocą analizy spektrometrycznej mas do zastosowania jako immunogen do immunizacji królików. Miano i swoistość oczyszczonej króliczej surowicy odpornościowej były wystarczające do pomiaru ekspresji ludzkiego genu IRG1 w różnych tkankach i kulturach. kulturach. Ta oczyszczona surowica poliklonalna pozwoli nam rozpocząć badania w celu wyjaśnienia biologicznej roli ludzkiego genu IRG1. --- Implantacja rozwijającej się blastocysty jest regulowana przez wiele czynników, takich jak hormony steroidowe, czynniki wzrostu i cytokiny. Aby zrozumieć, w jaki sposób te różnorodne szlaki sygnałowe współdziałają w celu modulowania ekspresji genów macicy, my zastosowaliśmy technikę ekranowania ekspresji genów, aby zidentyfikować cząsteczki, które są indukowane w okołoimplantacyjnej macicy szczura. Tutaj zgłaszamy izolację komplementarnego DNA reprezentującego nowy gen, gen regulowany interferonem 1 (IRG1). Gen ten wykazuje znaczną homologię do indukowalnych przez interferon (IFN) alfa/beta ludzkimi genami p27 i 6-16, wskazując, że geny te mogą należeć do tej samej rodziny. rodziny. Zgodnie z tym odkryciem, ekspresja informacyjnego RNA (mRNA) IRG1 w macicy szczura w macicy szczura wzrosła około 20-krotnie w odpowiedzi na IFNalfa. Ekspresja macicy IRG1 była również stymulowana przez estrogen i była częściowo hamowana przez antyestrogen, ICI 182,780. U ciężarnych szczurów ekspresja IRG1 była wysoka w dniu 1, ale spadła w dniach 2 i 3. Poziom mRNA IRG1 ponownie wzrósł przejściowo w dniu 4 bezpośrednio poprzedzającym implantację. bezpośrednio przed implantacją. Analiza hybrydyzacji in situ zlokalizowała ekspresję mRNA IRG1 w nabłonku endometrium i otaczającym zrębie. otaczającym zrębie. Co ciekawe, ekspresja p27, która wykazuje wysoką homologię do IRG1, była silnie zwiększona w ludzkim endometrium podczas środkowej fazy cyklu miesiączkowego, nakładając się na domniemane okno implantacji. implantacji. Zarówno IRG1, jak i p27 mRNA są zatem indukowane w endometrium w sposób specyficzny dla etapu implantacji. Zaobserwowaliśmy również synergistyczną interakcję między IFNalfa i szlakami sygnałowymi receptora estrogenowego, która doprowadziła do do maksymalnej indukcji mRNA p27 w komórkach Ishikawa. Chociaż funkcjonalne role IRG1 i p27 pozostają niejasne, opisujemy po raz pierwszy, identyfikację rodziny genów regulowanych przez IFNalfa zarówno w macicy gryzoni, jak i ludzi. macicy. Co ważniejsze, nasze badania ujawniają, że złożona interakcja między hormon steroidowy i szlaki IFN regulują ekspresję tych genów w endometrium w czasie implantacji. --- Aktywacja receptorów dla czynnika hamującego białaczkę (LIF) i IL-11 jest jest niezbędna do przyłączenia zarodka i decidualizacji u myszy. Oba receptory indukują aktywację rodziny transduktorów sygnału Stat poprzez szlak Jak/Stat . Naszym celem było ustalenie, czy aktywacja Stat3 w endometrium matki endometrium matki jest niezbędna do udanej implantacji. Funkcjonalna blokada Stat3 przed implantacją, poprzez wstrzyknięcie do światła macicy przepuszczalnego dla komórek inhibitora peptydu Stat3, specyficznie zmniejszyła implantację zarodka o 70% (P < 0,001). Stat3 jest fosforylowany w nabłonku luminalnym (LE) w odpowiedzi na LIF, a ta fosforylacja w odpowiedzi na LIF, a fosforylacja ta była znacząco zmniejszona zarówno in in vitro i in vivo przez inhibitor Stat3. Inhibitor blokował również indukcję przez LIF kilku genów regulowanych przez LIF w LE, w tym Irg1, który był wykazano wcześniej, że jest on niezbędny do implantacji. Pomyślna implantacja jest zależna od fosforylacji i aktywacji Stat3 w endometrium przed implantacją. endometrium przed implantacją. Odkrycie to stanowi cel dla antykoncepcyjny, oparty na selektywnej blokadzie szlaków transdukcji sygnału szlaków niezbędnych do implantacji. Badanie to pokazuje, że przepuszczalne dla komórek inhibitory peptydowe peptydowe mogą być skutecznie stosowane do celowania w wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacji szlaki sygnałowe w macicy LE. --- Implantacja wymaga koordynacji między rozwojem blastocysty a regulowanym przez hormony płciowe a regulowanym przez hormony płciowe różnicowaniem macicy. Pod wpływem tych hormonów nabłonek światła macicy staje się podatny na przyłączenie wyklutej blastocysty. W tym badaniu staraliśmy się zidentyfikować geny regulowanych przez progesteron (P4) w nabłonku macicy. Doprowadziło to do identyfikacji jednego nowego genu regulowanego przez P4, który został wcześniej znaleziony w makrofagach stymulowanych lipopolisacharydem i nazwany genem odpowiedzi immunologicznej-1 (Irg1) i który jest ortologiem ssaków genu bakteryjnego kodującego dehydratazę metylocytrynianową. U dorosłych myszy ekspresja Irg1 była ograniczona do nabłonka światła macicy, gdzie ulega ekspresji tylko w czasie ciąży z szczyt zbiega się z implantacją. Ekspresja mRNA Irg1 jest regulowana synergistycznie przez P4 i estradiol (E2), ale nie przez sam E2. W makrofagach Irg1 jest indukowany przez lipopolisacharyd poprzez szlak regulowany przez kinazę białkową C (PKC). (PKC). Teraz wykazujemy, że szlak PKC jest indukowany w nabłonku macicy nabłonka macicy podczas implantacji przez synergistyczne działanie P4 i E2 i jest odpowiedzialny za hormonalną indukcję Irg1. Wyniki te sugerują, że szlak Szlak PKC odgrywa ważną rolę w modulowaniu wrażliwości na hormony steroidowe w nabłonku światła macicy podczas okna implantacji i że Irg1 będzie ważnym markerem tego okna i może odgrywać ważną rolę w implantacji. implantacji. --- Interleukina-10 (IL-10) moduluje odpowiedzi zapalne wywoływane in vitro i in in vivo przez Borrelia burgdorferi, krętka choroby z Lyme. W jaki sposób IL-10 moduluje te odpowiedzi zapalne wciąż pozostaje nieuchwytny. Postawiliśmy hipotezę, że IL-10 hamuje funkcje efektorowe wielu genów indukowanych przez B. burgdorferi w makrofagach makrofagach w celu kontrolowania jednocześnie wywołanego stanu zapalnego. Ponieważ makrofagi są niezbędne w inicjacji stanu zapalnego, użyliśmy mysich makrofagów J774 i żywe krętki B. burgdorferi jako modelową komórkę docelową i stymulant, odpowiednio. Najpierw zastosowaliśmy profilowanie transkryptomu, aby zidentyfikować geny, które były indukowane przez stymulację komórek żywymi krętkami i które były zaburzone przez dodanie IL-10 do hodowli krętków. Krętki znacząco indukowały regulację w górę 347 genów zarówno w 4-godzinnym, jak i 24-godzinnym punkcie czasowym. IL-10 hamowała poziomy ekspresji odpowiednio 53 i 65 genów w ciągu 4 i 24 godzin. genów i nasilała, odpowiednio, po 4 i 24 godzinach, 65 i 50 genów. Wśród nowych zidentyfikowanych genów hamowanych przez IL-10, które zostały również zweryfikowane przez ilościowym PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) były receptory Toll-podobne 1 (TLR1), TLR2, IRAK3, TRAF1, IRG1, PTGS2, MMP9, IFI44, IFIT1 i CD40. Analiza proteomu przy użyciu multipleksowego enzymatycznego testu immunosorbcyjnego (ELISA) ujawniła modulację / lub nasilenie IL-10 modulację/i lub nasilenie RANTES/CCL5, makrofagowego białka zapalnego 2 (MIP-2)/CXCL2, IP-10/CXCL10, MIP-1α/CCL3, czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF)/CSF3, CXCL1, CXCL5, CCL2, CCL4, IL-6, czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α), IL-1α, IL-1β, interferon gamma (IFN-γ) i IL-9. Podobne wyniki uzyskano uzyskano przy użyciu sonikowanych spirochetów lub lipoprotein jako stymulantów. Nasze dane pokazują że IL-10 zmienia efektory indukowane przez B. burgdorferi w makrofagach, aby kontrolować jednocześnie wywoływane odpowiedzi zapalne. Co więcej, po raz pierwszy, to badanie zapewnia globalny wgląd w potencjalne mechanizmy wykorzystywane przez IL-10 do kontrolować stan zapalny związany z boreliozą. --- Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) powoduje przewlekłe zapalenie jelit u przeżuwaczy. u przeżuwaczy. Ponadto MAP jest obecnie najbardziej preferowanym patogenem związanym z chorobą Crohna. chorobą Leśniowskiego-Crohna. W tym badaniu byliśmy zainteresowani analizą mechanizmów molekularnych mechanizmów aktywacji lub dezaktywacji makrofagów po zakażeniu MAP. Poprzez subtraktywnej hybrydyzacji cDNA, zidentyfikowaliśmy gen immunoreaktywny 1 (IRG1), którego ekspresja była znacznie wyższa w stymulowanych lipopolisacharydem (LPS) niż w liniach komórkowych mysich makrofagów zakażonych MAP. Test transkrypcji jądrowej test transkrypcji jądrowej ujawnił, że gen IRG1 był aktywowany transkrypcyjnie w makrofagach stymulowanych LPS i zakażonych MAP z wyższą ekspresją w komórkach stymulowanych LPS. Analiza regulacji potranskrypcyjnej wykazała, że stabilność mRNA IRG1 była zwiększona w makrofagach stymulowanych LPS, ale nie w makrofagach makrofagach zakażonych MAP. Ponadto, ekspresja genu IRG1 w makrofagach zakażonych niepatogennymi Mycobacterium smegmatis różniła się od ekspresji genów makrofagów stymulowanych LPS i zakażonych MAP. W 2 h po zakażeniu, M. smegmatis ekspresja genu IRG1 była tak niska jak w makrofagach zakażonych MAP, a po 8 h po zakażeniu wzrosła prawie do poziomu w makrofagach stymulowanych LPS. Eksperymenty przejściowej transfekcji ujawniły podobną aktywność promotora IRG1 w MAP i komórkach zakażonych M. smegmatis. Analiza Northern wykazała zwiększoną stabilność mRNA IRG1 w makrofagach zakażonych M. smegmatis. Stabilizacja mRNA IRG1 była niezależna od kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p38. Zahamowanie syntezy białek ujawniło, że konstytutywnie wyrażane czynniki wydają się być odpowiedzialne za destabilizację mRNA IRG1. Tak więc, nasze dane pokazują, że mechanizmy transkrypcyjne i potranskrypcyjne są odpowiedzialne za zróżnicowaną ekspresję genu IRG1 w mysich makrofagach poddanych działaniu LPS, MAP, i M. smegmatis. --- Interferon-gamma (IFN-gamma) i czynnik martwicy nowotworów (TNF) są niezbędnymi cytokinami do skutecznego usuwania infekcji bakteryjnych. cytokinami niezbędnymi do skutecznego usuwania infekcji bakteryjnych. Aktywacja makrofagów przez synergistyczne działanie tych cytokin prowadzi do indukcji przeciwdrobnoustrojowych systemów efektorowych, takich jak reaktywne formy tlenu i reaktywne formy azotu pośrednie. Uderzające jest to, że myszy IFN-gammaR(-/-) i TNFRp55(-/-) są znacznie bardziej podatne na infekcje niż indukowany tlenek azotu indukowany tlenek azotu(-/-) i myszy p47phox(-/-). Dlatego zastosowaliśmy profilowanie transkryptomu badania w celu identyfikacji genów synergistycznie regulowanych przez IFN-gamma i TNF w makrofagach, które są potencjalnie zaangażowane w obronę przed wewnątrzkomórkowymi patogenami. patogenami wewnątrzkomórkowymi. Spośród 234 regulowanych genów znaleźliśmy 35 genów, które były regulowane w górę przez połączone działanie IFN-gamma i TNF i były co najmniej 2-krotnie indukowane. Większość z tych genów jest zaangażowana w transdukcję sygnału i regulację transkrypcji. regulację transkrypcji. Stwierdziliśmy jednak, że kilka genów było słabo scharakteryzowanych w odniesieniu do funkcji immunologicznych. Jako prototypowy gen regulowany przez TNF- i i IFN-gamma scharakteryzowaliśmy ekspresję i subkomórkową lokalizację lokalizację genu immunorepresyjnego 1 (IRG1) w mysich makrofagach. IRG1 jest silnie regulowany w mysich makrofagach ANA-1 przez kilka prozapalnych cytokiny i agonistów receptora Toll-podobnego (TLR), a także w śledzionie i płucach myszy zakażonych Listeria monocytogenes lub Toxoplasma gondii. Co więcej, w badaniu tym zidentyfikowano 35 genów, które stanowią sekwencję program efektorowy wyzwalany przez IFN-gamma/TNF w odporności wrodzonej.
Jaką funkcję pełni gen Irg1 u ssaków?
Ludzki IRG1 i mysi Irg1 pośredniczą w przeciwwirusowych i przeciwbakteryjnych odpowiedziach immunologicznych, ale ich dokładna rola nie została wyjaśniona. Sugeruje się, że Irg1 odgrywa rolę w apoptozie i odgrywa znaczącą rolę w implantacji zarodka. Irg1 jest zgłaszany jako ortolog dehydratazy metylocytrynianowej ssaków.