CEL: Ludzki receptor naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2)/neu, topoizomeraza II alfa (TOP2A) i polisomia 17 mogą przewidywać reaktywność guza na terapię doksorubicyną (DOX). METODY: Zidentyfikowaliśmy pacjentki z rakiem piersi leczone neoadiuwantowo DOX/cyklofosfamidem w naszym rejestrze w latach 1997-2008 z wystarczającą ilością tkanki do badań (n = 34). Badanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) przeprowadzono na odparafinowanych skrawkach tkanek poddanych wstępnej obróbce przy użyciu standardowego protokołu dostawcy i inkubowano z zatwierdzonym przez amerykańską Agencję Żywności i Leków Abbott Diagnostics Vysis PathVysion™, w tym sondą sprzężoną ze Spectrum-Green do α-satelitarnego DNA zlokalizowanego w centromerze chromosomu 17 (17p11.1-q11.1) oraz sondę Spectrum-Orange sprzężoną z genem TOP2A. Analizę morfometryczną przeprowadzono przy użyciu systemu analizy obrazu MetaSystems. Ręczne zliczanie przeprowadzono na wszystkich próbkach, w których autofluorescencja i/lub artefakt artefakty uniemożliwiały zliczenie wystarczającej liczby komórek. Stosunek >2,0 był pozytywny dla amplifikacji TOP2A. Obecność polisomii 17 (PS17) była zdefiniowano jako sygnały ≥2,5. Wyniki obejmowały całkowitą odpowiedź patologiczną (pCR), częściowa odpowiedź (PR) i brak odpowiedzi (NR). WYNIKI: Spośród 34 przebadanych pacjentek, jedna miała amplifikację TOP2A (receptor hormonalny ujemny/HER2 ujemny, częściowa odpowiedź). Podzbiór bez amplifikacji TOP2A, HER2 ujemny i PS17 nieobecny (n = 23) pacjenci mieli odpowiedź na leczenie: pCR = 2 (9%), PR = 14 (61%) i NR = 7 (30%). Uwzględniając dwie obecne PS17 i HER2-dodatnich (n = 33), 76% pacjentów bez amplifikacji TOP2A miało pCR lub PR. WNIOSKI: Zaobserwowaliśmy znaczną odpowiedź na leczenie u pacjentów bez trzech postulowanych czynników prognostycznych, które trudno byłoby przypisać sam cyklofosfamid. Pacjenci, którzy są HER2 ujemni i nie mają amplifikacji TOP2A amplifikacji TOP2A i PS17 nie powinny być wykluczone z otrzymywania schematów zawierających DOX. zawierających DOX. --- Suramina jest prototypem nowej klasy leków przeciwnowotworowych. Zbadaliśmy działanie suraminy na szlaki transdukcji sygnału do topoizomerazy DNA II (Topo II). Suramina wykazała działanie hamujące wzrost ludzkiej linii komórek raka płuc (PC-9) z IC50 wynoszącym około 160 mikrogramów/ml. Suramina hamowała aktywność katalityczną Topo II z IC50 około 100 mikrogramów/ml bez stabilizacji rozszczepialnego kompleksu DNA i Topo II. Suramina zmniejszała fosforylację Topo II z IC50 175 mikrogramów / ml, ale nie zmienił stopnia ekspresji Topo II. Te wartości IC50 dla hamowania aktywności katalitycznej aktywności katalitycznej i fosforylacji Topo II były równoważne dawce hamującej wzrost dawce hamującej wzrost określonej w teście z barwnikiem tetrazolowym. Fosforylacja reszt tyrozynowych reszt Topo II nie została zmieniona przez suraminę. W obecności kwasu okadaikowego, silnego inhibitora fosfatazy białkowej seryny / treoniny, suramina również zmniejszyła fosforylację Topo II, co sugeruje, że lek nie działał na fosfatazy białkowe seryny/treoniny hamowane przez kwas okadaikowy. Suramina hamował również aktywność kinazy białkowej C (PKC) w komórkach PC-9. Wyniki te sugerują, że suramina zmniejsza fosforylację Topo II, w której pośredniczy PKC. Ten efekt suraminy może powodować hamowanie aktywności Topo II, co skutkuje w hamowaniu wzrostu komórek nowotworowych. --- Wpływ kombinacji antracykliny aklarubicyny i leków ukierunkowanych na topoizomerazę leki ukierunkowane na topoizomerazę II 4'-demetylepodofilotoksyna-9-(4,6-O-etyloideno-beta-D-glukopirynozyd) (VP-16) i 4'-(9-akrydynyloamino)metanosulfon-m-anizydek (m-AMSA) badano w klonogenezie badano w teście klonogennym. Cytotoksyczność VP-16 była prawie całkowicie antagonizowana przez preinkubację komórek z nietoksycznymi stężeniami aklarubicyną. Zahamowanie cytotoksyczności nie było widoczne, gdy komórki były wystawione na działanie aklarubicyny po ekspozycji na VP-16. Zahamowanie było znaczące w szerokim zakresie stężeń aklarubicyny (od 3 nM do 0,4 mikroM), powyżej których toksyczność powyżej którego toksyczność aklarubicyny stała się widoczna. Podobny efekt zaobserwowano na toksyczności m-AMSA. W przeciwieństwie do aklarubicyny, preinkubacja z Adriamycyna nie antagonizowała działania VP-16. Z oczyszczoną topoizomerazą II i nagim DNA, aklarubicyna nie stymulowała tworzenia rozszczepialnych kompleksów między topoizomerazą kompleksów między topoizomerazą II i DNA. Stężenia aklarubicyny powyżej 1 mikroM hamowały wyjściowe tworzenie rozszczepialnych kompleksów wywołanych samym enzymem samym enzymem. Niskie (od 1 do 10 nM) stężenia aklarubicyny zwiększały tworzenie rozszczepialnych kompleksów uzyskanych za pomocą VP-16 i m-AMSA; jednak w stężeniach aklarubicyny powyżej 1 mikroM uzyskano efekt antagonistyczny. W komórkach, indukowane przez m-AMSA i VP-16, ukryte w białku pęknięcia nici DNA były całkowicie hamowane przez preinkubację z aklarubicyną bez synergistycznej dawki poziomach. Nasze wyniki sugerują, że aklarubicyna hamuje rozszczepienie DNA za pośrednictwem topoizomerazy II. rozszczepienie DNA. To hamowanie może reprezentować mechanizm działania leku i wyjaśniać brak oporności krzyżowej na klasyczne antracykliny. Zaobserwowany antagonizm może mieć konsekwencje dla planowania aklarubicyny z lekami przeciwnowotworowymi działającymi na topoizomerazę II. --- CEL: Zawartość topoizomerazy II alfa, aktywność katalityczna topoizomerazy II i wrażliwość na inhibitory topoizomerazy II, doksorubinę i doksorubinę. wrażliwość na leki na inhibitory topoizomerazy II, doksorubicynę i etopozyd, zbadano w panelu 14 niewyselekcjonowanych ludzkich linii komórkowych raka płuc w celu określenia związku między topoizomerazą II a wrażliwością na leki a wrażliwością na inhibitory topoizomerazy II. METODY: Wrażliwość na leki określono za pomocą testu tetrazolowego w mikrohodowli. test. Poziomy topoizomerazy II alfa określono za pomocą analizy Western blot analizę, a aktywność katalityczną topoizomerazy II określono za pomocą testu dekatenacji kinetoplastowego DNA, przy użyciu białka jądrowego z komórek każdej linii komórkowej. linii komórkowej. WYNIKI: Testy wrażliwości na leki wykazały, że linie komórkowe drobnokomórkowego raka płuc (SCLC) były bardziej wrażliwe na leki niż linie komórkowe niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). linie komórkowe. Względne poziomy topoizomerazy II alfa i względna aktywność katalityczna topoizomerazy II z linii komórkowych SCLC (średnia +/- SD 0,89 +/- 0,54 i 5,3 +/- 3,4) były nieco wyższe niż w liniach komórkowych NSCLC (0,78 +/- 0,56 i 4,0 +/- 2,8, odpowiednio), ale różnice nie były statystycznie istotne i niewystarczające do uwzględnienia zmienności wrażliwości na leki. wrażliwości na leki. Ponadto nie zaobserwowano wyraźnego związku między poziomami topoizomerazy II alfa lub aktywnością katalityczną topoizomerazy II i wrażliwością na leki w badanych liniach komórkowych. WNIOSKI: Odkrycia te sugerują, że różnica w wrażliwości na leki na doksorubicynę i etopozyd w liniach komórkowych ludzkiego raka płuc może nie być wyjaśnione przez poziomy topoizomerazy II alfa i aktywność katalityczną topoizomerazy II. aktywność. Co więcej, nasze wyniki sugerują, że poziomy topoizomerazy II alfa i aktywność katalityczna topoizomerazy II mogą odgrywać niewielką rolę w określaniu klinicznej lekooporności ludzkich nowotworów płuc. --- Próbując wyjaśnić rolę indukowanych przez leki pęknięć DNA związanych z białkami (tj. rozszczepienie DNA za pośrednictwem topoizomerazy II) w aktywności cytotoksycznej doksorubicyny i etopozydu, ich efekty komórkowe porównano w 2 ludzkich komórkach drobnokomórkowego raka płuca (SCLC), charakteryzujących się zróżnicowaną wrażliwością na inhibitory topoizomerazy II DNA. Leki te zostały wybrane do badań porównawczych ponieważ są one jednymi z najskuteczniejszych środków w leczeniu SCLC. Linie komórkowe H146 i N592 uzyskano z wysięku opłucnowego i aspiratu szpiku kostnego szpiku kostnego pacjentów poddanych wcześniejszej terapii. Obie linie komórkowe rosły jako pływające agregaty o podobnym czasie podwojenia (odpowiednio 30 i 33 godz. dla komórek N592 i H146), odpowiednio). Chociaż natychmiast po 1-godzinnej ekspozycji na równoważne poziomy leku poziomy, zakres rozszczepienia DNA wytwarzanego przez doksorubicynę był znacznie niższy niż ten wytwarzany przez etopozyd, uszkodzenia DNA wytwarzane przez doksorubicynę utrzymywały się a nawet wzrosły po usunięciu leku. W przeciwieństwie do tego, prawie całkowite zniknięcie pęknięć DNA wywołanych etopozydem odnotowano 1 godzinę po usunięciu leku. Ponowne uszczelnienie pęknięć nici było szybsze w komórkach N592 niż w komórkach H146. Wyniki te sugerują, że odwrócenie tych zmian odgrywa główną rolę w przeżyciu komórek a nie występowanie pęknięć DNA bezpośrednio po ekspozycji na lek. Ta obserwacja jest zgodna z poglądem, że hamowanie religacji DNA a nie stymulacja rozszczepienia DNA jest krytycznym etapem działania leku. Różna odpowiedź tych linii komórkowych na cytotoksyczne działanie inhibitorów topoizomerazy inhibitorów topoizomerazy jest związana z różnym wpływem leku na integralność DNA DNA (wykrywane jako pęknięcia podwójnej nici DNA i wiązania krzyżowe DNA-białko). Uszkodzenia DNA były jednak porównywalne, gdy komórki były narażone na ekwitoksyczne poziomy leku poziomy. Obserwacja, że indukowane etopozydem pęknięcia DNA były podobne w izolowanych jądrach z obu linii komórkowych sugeruje, że interakcja lek-cel jest modulowana w inny sposób w nienaruszonej komórce. Jak wskazano przez doksorubicynę doksorubicyny, farmakokinetyka komórkowa leku nie jest odpowiedzialna za różnej odpowiedzi na lek badanych linii SCLC, prawdopodobnie odzwierciedlając różny zakres tworzenia pęknięć DNA i / lub różne konsekwencje cytotoksyczne uszkodzenia DNA. --- TŁO: Uważa się, że kumulacyjna kardiotoksyczność antracyklin wynika z generowania wolnych rodników. Nowe inhibitory topoizomerazy DNA II, mniej podatne na reakcje redoks, takie jak mitoksantron, a ostatnio antrazole. antrapirazole, zostały opracowane w celu obejścia tej toksyczności. CEL: Dwa antrapirazole obecnie poddawane ocenie klinicznej, DuP 941 (Losoxantrone) i DuP 937, zostały porównane z innymi inhibitorami topoizomerazy II w odniesieniu do ich siły cytotoksycznej i selektywności oraz w odniesieniu do hamowania topoizomerazy II. METODY: Cytotoksyczność została przetestowana na 60 liniach komórkowych National Cancer Institute Instytut przedklinicznego odkrywania leków przeciwnowotworowych (ekran NCI). Potencjał antrapirazoli do hamowania oczyszczonej topoizomerazy II. The specyficzność indukowanego lekiem wzoru rozszczepienia topoizomerazy II, jednego z komórkowych wyznaczników cytotoksyczności, badano w ludzkim DNA c-myc. WYNIKI: Korzystając z analizy COMPARE, stwierdziliśmy, że najbardziej zbliżone do siebie profile cytotoksyczności profile cytotoksyczne w badaniu przesiewowym NCI były między antrapirazolami i mitoksantronem. Wśród inhibitorów topoizomerazy II siła działania cytostatycznego była następująca w kolejności malejącej: mitoksantron; doksorubicyna, która była nieco większa niż DuP 941, azatoksyna; DuP 937; i amsakryna, która była znacznie większa niż VP-16. Potencjał moc mitoksantronu i antrapirazoli do generowania podwójnej nici DNA przez indukcję kompleksów rozszczepialnych topoizomerazy II w ekstraktach jądrowych ekstraktach, była zgodna z cytotoksycznością. Sekwencjonowanie indukowanych lekiem topoizomerazy II w DNA c-myc wykazało wspólny wzór rozszczepiania dla antrapirazoli i mitoksantronu. Wzór ten różnił się od wzorów uzyskany z innymi inhibitorami topoizomerazy II. WNIOSEK: Na poziomie molekularnym i komórkowym antrapirazole są silnymi inhibitorami topoizomerazy II. inhibitorami topoizomerazy II blisko spokrewnionymi z mitoksantronem. WNIOSKI: Wyniki te potwierdzają analizę COMPARE przy użyciu ekranu NCI do przewidywania molekularnych mechanizmów działania leków. Antrapirazole, które są mało prawdopodobne, aby wytwarzały wolne rodniki, mogą być użyteczne w tych samych wskazaniach co mitoksantron, zwłaszcza u pacjentów z ryzykiem sercowym, u pacjentów pediatrycznych pacjentów pediatrycznych i pacjentów leczonych zintensyfikowanymi protokołami. --- Przygotowaliśmy pełnej długości Drosophila i ludzką topoizomerazę II oraz zawierające amino-końcową domenę ATPazy i przeanalizowaliśmy ich właściwości biochemiczne. przeanalizowaliśmy ich właściwości biochemiczne. Aktywność ATPazowa skróconych białek białek, podobnie jak białek pełnej długości, jest znacznie stymulowana przez obecność DNA. obecność DNA. Ta aktywność skróconych białek jest również wrażliwa na hamowanie przez lek bisdioksopiperazynę, ICRF-193, aczkolwiek na znacznie niższym poziomie niż białko pełnej długości. niższym poziomie niż białko pełnej długości. Dlatego bisdioksopiperazyna może bezpośrednio oddziaływać z NH (2) -końcową domeną ATPazy, ale lek-enzym może również obejmować inne domeny. Aktywność ATPazy domeny ATPase wykazywała kwadratową zależność od stężenia enzymu, co sugeruje że dimeryzacja NH(2)-końcowej domeny jest etapem ograniczającym szybkość. Używając zarówno sieciowanie białek, jak i analizę równowagi sedymentacyjnej, wykazaliśmy że domena ATPazy istnieje jako monomer pod nieobecność kofaktorów, ale może łatwo dimeryzować w obecności niehydrolizowalnego analogu ATP, 5'-adenylo-beta,gamma-imidodifosforanu. Co ciekawsze, zarówno ATP, jak i ADP mogą również promować dimeryzację białek. Wynik ten sugeruje zatem, że zacisk białkowy, w którym pośredniczy dimeryzacja domeny ATPazy, pozostaje zamknięty po hydrolizie ATP i otwiera się po dysocjacji ADP. --- Etopozyd jest skuteczny jako lek przeciwnowotworowy poprzez hamowanie eukariotycznej topoizomerazy DNA topoizomerazę II poprzez tworzenie kowalencyjnego kompleksu z DNA. Niestety, jego szerokie zastosowanie terapeutyczne jest często utrudnione przez oporność wielolekową (MDR), niska rozpuszczalność w wodzie i toksyczność. W naszych poprzednich badaniach, nowe pochodne benzoksazoli, benzimidazoli i pokrewnych połączonych związków heterocyklicznych, które wykazywały znaczącą aktywność hamującą topoizomerazę II eukariotycznego DNA, były i wykazywały lepszą aktywność hamującą w porównaniu z samym lekiem etopozydem. Aby ujawnić interakcje wiążące między eukariotyczną topoizomerazą topoizomerazą II i aktywnymi związkami heterocyklicznymi, przeprowadzono badania dokowania przy użyciu oprogramowania Discovery Studio 2.1, w oparciu o strukturę krystaliczną struktury krystalicznej DNA związanego z segmentem G Topo IIA (PDB ID: 2RGR). Badania zostały przeprowadzono na wybranym zestawie 31 połączonych związków heterocyklicznych o zróżnicowanej strukturze i aktywności. strukturze i aktywności. Analizy strukturalne wskazują na oddziaływania wiązania wodorowe, oddziaływania van der Waalsa i oddziaływania hydrofobowe między ligandami a białkiem, ponieważ DNA związane z segmentem G Topo IIA jest odpowiedzialne za preferencję inhibicji i siłę działania. Podsumowując, wyniki pokazują, że związki 1a, 1c, 3b, 3c, 3e i 4a są znaczącymi kandydatami na leki kandydatami na leki przeciwnowotworowe, które powinny być dalej badane. --- Rak żołądka słabo reaguje na powszechnie stosowane leki przeciwnowotworowe. których skuteczność jest uważana za związaną ze zdolnością do wywoływania apoptozy. Proces ten wymaga szeregu produktów genowych, w tym w tym funkcjonalnego białka p53. Przetestowaliśmy działanie dwóch trucizn topoizomerazy DNA II etopozydu i doksorubicyny na linie komórkowe raka żołądka z różnymi zmianami genetycznymi. zmianami genetycznymi. Scharakteryzowaliśmy komórki MKN74 i MKN28 pod kątem statusu genu p53 oraz ekspresji białek p53 i p21, a także izoform alfa i beta topoizomerazy II. i izoform beta topoizomerazy II. Po zastosowaniu leków, komórki analizowano pod kątem cytotoksyczności, zdolności do tworzenia kolonii, rozkładu cyklu komórkowego i obecności cech apoptotycznych. cech apoptotycznych. Nasze wyniki wykazały, że zarówno etopozyd, jak i doksorubicyna mają silne działanie antyproliferacyjne na komórki raka żołądka. Kinetyka śmierci komórkowej była różna w obu liniach komórkowych, przy czym komórki MKN74 były bardziej bardziej wrażliwe niż MKN28. Komórki MKN74, chociaż posiadały gen p53 nie były w stanie przejść masowej apoptozy po leczeniu etopozydem. Odpowiedź tej linii komórkowej może być związana z izozymem topoizomerazy II beta którego ekspresja okazała się niewykrywalna. --- Dwadzieścia uprzednio zsyntetyzowanych związków hamujących topoizomerazę DNA II (Topo II) pod kątem ich potencjalnej skuteczności w różnych ludzkich liniach komórkowych raka różnych ludzkich liniach komórkowych raka, które pochodziły z różnych jednostek nowotworowych. Ponadto zbadano różne wielolekooporne warianty tych linii komórek rakowych z z obniżoną ekspresją Topo II. W rodzicielskich, wrażliwych na lek związki BD3 i G35 wykazały skuteczność w zakresie mikroM, które były podobne do klasycznego inhibitora Topo II - etopozydu. Z drugiej strony Z drugiej strony, większość badanych związków heterocyklicznych okazała się bardziej skuteczna w komórkach lekoopornych niż w macierzystych, wrażliwych na leki, a niektóre związki wykazały wysoką skuteczność przeciwnowotworową w kilku lekoopornych modelach komórek modelach komórkowych. Związki BD13, BD14 i BD16 wykazywały wysoką aktywność przeciwnowotworową wobec lekoopornych podlinii EPG85-257RNOV i EPG85-257RDB pochodzących z raka żołądka, EPP85-181RNOV i EPP85-181RDB pochodzących z trzustki raka trzustki, MCF-7/Adr pochodzącego z raka piersi, D79/86RNOV pochodzącego z włókniakomięsaka i MeWoETO1 pochodzącego z czerniaka. Ponadto, związek D23 okazał się okazał się wysoce skuteczny w wielolekoopornych wariantach HT-29RNOV i HT-29RDB pochodzących z raka okrężnicy, a związek D24 wykazywał najwyższą aktywność przeciwnowotworową wśród aktywność przeciwnowotworową wśród badanych związków w lekoopornej podlinii MDA-MB-231ROV pochodzącej z raka piersi. Podsumowując, związki BD 13, BD 14, BD 16, D 23 i D 24 mogą być użyteczne w leczeniu różnych wielolekoopornych komórek nowotworowych z opornością krzyżową na "klasyczne" leki ukierunkowane na Topo II. --- Wpływ kombinacji antracyklin aklarubicyny i daunorubicyny badano w teście klonogennym z wykorzystaniem linii komórkowej ludzkiego drobnokomórkowego raka płuca linii komórkowej OC-NYH i wielolekoopornej (MDR) mysiej podlinii guza Ehrlicha Ehrlicha (EHR2/DNR+). Stwierdzono, że cytotoksyczność daunorubicyny w komórkach OC-NYH była antagonizowana przez jednoczesną ekspozycję na nietoksyczne stężenia aklarubicyny. Koordynacyjnie, aklarubicyna hamowała powstawanie indukowanych daunorubicyną białkowych ukrytych pęknięć jednoniciowych DNA i DNA-białko w komórkach OC-NYH, gdy badano je techniką elucji alkalicznej. Aklarubicyna nie miała wpływu na akumulację daunorubicyny w tych komórkach. W przeciwieństwie do tego, akumulacja daunorubicyny w komórkach EHR2/DNR+ była zwiększona o ponad 300%, gdy komórki były jednocześnie inkubowane z modulatorem MDR modulatorem MDR werapamilem, aklarubicyną lub dwoma środkami łącznie. Jednak cytotoksyczność daunorubicyny była znacznie zwiększona tylko przez werapamil. Zwiększona cytotoksyczność daunorubicyny w obecności werapamilu była całkowicie antagonizowana, gdy aklarubicyna była stosowana razem z modulatorem MDR modulatorem. Wreszcie, wpływ daunorubicyny na aktywność rozszczepiania DNA oczyszczonej topoizomerazy II w obecności i nieobecności aklarubicyny. aklarubicyny. Stwierdzono, że daunorubicyna stymulowała rozszczepianie DNA przez topoizomerazę II w określonych miejscach DNA. Dodanie aklarubicyny całkowicie hamowało indukowaną daunorubicyną stymulację rozszczepiania DNA. Podsumowując, dane te wskazują, że hamowanie indukowanej daunorubicyną cytotoksyczności, w którym pośredniczy aklarubicyna cytotoksyczności wynika głównie z interakcji leku z enzymem jądrowym topoizomerazą II. Ten antagonizm na poziomie jądrowym wyjaśnia, dlaczego aklarubicyna jest słabym modulatorem oporności na daunorubicynę, mimo że aklarubicyna jest w stanie zwiększyć wewnątrzkomórkową akumulację daunorubicyny w linii komórkowej MDR. --- Jako podejście do racjonalnego projektowania skojarzonej chemioterapii z udziałem przeciwnowotworową truciznę topoizomerazy DNA II etopozyd (VP-16), zbadaliśmy dynamiczne zmiany zachodzące w populacjach komórek drobnokomórkowego raka płuc (SCLC) podczas przedłużonej ekspozycji na VP-16. Metody cytometryczne zostały wykorzystane do analizy zmiany w dostępności enzymów docelowych i progresji cyklu komórkowego w linii komórek SCLC linii komórkowej SCLC, zmutowanej dla genu supresorowego nowotworu p53 i wadliwej w zdolności do zatrzymania na granicy faz G1/S. W stężeniach do 0,25 mikroM VP-16, komórki zostały zatrzymane w fazie G2 po 24 godzinach ekspozycji, podczas gdy w stężeniach 0,25-2 microM zatrzymanie G2 było poprzedzone zależnym od dawki opóźnieniem wczesnej fazy S, potwierdzonym przez inkorporację bromodeoksyurydyny. Potencjał regeneracyjny został określony przez analizę stathmokinetyczną i był dalej badany w zsynchronizowanych z mszycą kulturach uwolnionych z fazy G1/S, a następnie poddanych działaniu VP-16 we wczesnej fazie S. Komórki, które nie doświadczyły opóźnienia fazy S wywołanego przez VP-16, weszły w opóźnienie G2 zależne od ciągłej obecności VP-16. od ciągłej obecności VP-16. Komórki te mogły przejść do mitozy w okresie 6-24 godzin po usunięciu leku. Komórki doświadczające wczesnej fazy S pozostawały w długotrwałym zatrzymaniu G2 ze znacznie zmniejszoną zdolnością do wejścia w mitozy do 24 godzin po usunięciu VP-16. Nieodwracalne zatrzymanie G2 było ograniczone przez indukcję znacznych poziomów rozszczepienia lub fragmentacji DNA, nie związane z jawną apoptozą, w większości komórek. Western blotting preparatów całokomórkowych wykazało wzrost poziomu topoizomerazy II (do 4-krotny) przypisywany redystrybucji cyklu komórkowego, podczas gdy jądra z komórek odzyskiwanie z opóźnienia fazy S wykazało zwiększoną immunoreaktywność z przeciwciałem przeciwko topoizomerazie II alfa. Wyniki sugerują, że przejście fazy G1/S i wczesnej fazy S w obecności specyficznej trucizny topoizomerazy II powoduje prowadzi do stopniowego wychwytywania topoizomerazy II alfa na niskim poziomie, zwiększonego dostępność topoizomerazy II alfa i późniejsze nieodwracalne zatrzymanie w G2 komórek wykazujących ograniczoną fragmentację DNA. Sugerujemy, że długotrwałe, niskie dawki schematy chemioterapeutyczne zawierające VP-16 są preferencyjnie aktywne wobec komórek komórek próbujących przejścia G1/S i mają potencjał do zwiększenia późniejszego działania innych środków ukierunkowanych na topoizomerazę II poprzez modulację enzymu. Kombinacje modalności, które zapobiegają takim dynamicznym zmianom działałyby w celu zmniejszenia skuteczności składnika VP-16. --- Leki bisdioksopiperazynowe, takie jak ICRF-187, są katalitycznymi inhibitorami topoizomerazy DNA topoizomerazy II, z co najmniej dwoma efektami na enzym: mianowicie, blokując go w formie zamkniętego zacisku i hamując jego aktywność ATPazy. Jest to w przeciwieństwie do trucizn topoizomerazy II, takich jak etopozyd i amsakryna (m-AMSA), które działają poprzez stabilizując kompleksy enzym-DNA-lek na etapie, w którym nić bramkująca DNA jest a białko jest kowalencyjnie przyłączone do DNA. Ludzki drobnokomórkowy rak płuc wyselekcjonowane pod kątem oporności na ICRF-187 (NYH/187) wykazywały 25% wzrost topoizomerazy II. wzrost poziomu topoizomerazy IIalfa i brak zmian w ekspresji izoformy beta izoformy. Sekwencjonowanie całego cDNA topoizomerazy IIalfa z komórek NYH/187 wykazało homozygotyczną mutację punktową G-->A w nukleotydzie 485, prowadzącą do konwersji R162Q w konsensusowym miejscu wiązania ATP Walker A (reszty 161-165 w izoformie alfa). izoformie alfa), jest to pierwsza wybrana przez lek mutacja opisana w tym miejscu. w tym miejscu. Western blotting po inkubacji z ICRF-187 nie wykazał zubożenia izoformy alfa izoformy alfa w komórkach NYH/187 w przeciwieństwie do komórek typu dzikiego (wt), podczas gdy równe zubożenie izoformy beta zaobserwowano w dwóch podliniach. Test elucji alkalicznej wykazał brak hamowania indukowanych etopozydem jednoniciowych pęknięć DNA w komórkach NYH/187, podczas gdy to zahamowanie było łatwo widoczne w komórkach NYH. Mutageneza ukierunkowana na miejsce w ludzkiej topoizomerazie IIalfa wprowadzona do szczepu drożdży Saccharomyces cerevisiae z mutacją drożdżowym mutantem TOP2 wykazała, że R162Q nadaje oporność na bisdioksopiperazyny ICRF-187 i -193, ale nie na etopozyd lub m-AMSA. Zarówno etopozyd, jak i m-AMSA indukowały więcej rozszczepień DNA z oczyszczonym enzymem R162Q Enzym R162Q ma o 20-25% zmniejszoną zdolność katalityczną w porównaniu do wt. w porównaniu do wt i był prawie nieaktywny przy <0,25 mM ATP w porównaniu do Dekatenacja kinetoplastowego DNA przez enzym R162Q przy 1 mM ATP nie była odporny na ICRF-187 w porównaniu do wt, podczas gdy był wyraźnie mniej wrażliwy niż wt na ICRF-187 przy niskich stężeniach ATP. Sugeruje to, że jest to przesunięcie w równowagi do stanu otwartego zacisku w cyklu katalitycznym enzymu spowodowane przez zmniejszone wiązanie ATP przez zmutowany enzym, który jest odpowiedzialny za oporność na bisdioksopiperazynę. --- Zbadaliśmy, czy stres cieplny może zwiększyć wrażliwość ludzkich komórek raka okrężnicy WiDr na środki przeciwnowotworowe ukierunkowane na topoizomerazę II, etopozyd (VP-16) i tenipozyd (VM-26), a także określiliśmy najbardziej efektywny czas dla podania leku po ekspozycji na hipertermię. Zarówno zawartość topoizomerazy II, jak i aktywność topoizomerazy II były znacząco zwiększone w komórkach WiDr 3 do 12 godzin po stresie cieplnym w temperaturze 43 stopni C przez 1 godzinę, w porównaniu z komórkami bezpośrednio po stresie cieplnym. bezpośrednio po stresie cieplnym. Cytotoksyczność VP-16 była najbardziej znacznie zwiększona 3 do 12 godzin po ekspozycji na 43 stopnie C przez 1 godzinę, ale nie zaobserwowano efektu synergistycznego, gdy lek podawano bezpośrednio po stresie cieplnym. Połączenie VM-26 ze stresem cieplnym, ale nie z kombinacją topoizomerazy I, pochodnej kamptotecyny (CPT-11) lub winkrystyny, wykazało synergistyczny efekt cytotoksyczny na komórki WiDr. Sam VP-16 indukował akumulację komórek w fazie G2 + M, podczas gdy połączenie VP-16 i stres cieplny dodatkowo zwiększał populację komórek w fazie G2 + M i zmniejszyła liczbę komórek w fazie S. Możliwe zastosowanie kombinacji VP-16 i hipertermii hipertermii w zastosowaniach klinicznych. --- System transportu poliamin (PTS) jest maszynerią często zależną od energii. często nadmiernie aktywowany w komórkach nowotworowych o wysokim zapotrzebowaniu na poliaminy. Wykorzystaliśmy PTS do selektywnego dostarczania leku zawierającego poliaminy do komórek rakowych. komórek nowotworowych. F14512 łączy rdzeń epipodofilotoksyny ukierunkowany na topoizomerazę II z cząsteczką sperminy wprowadzoną jako wektor dostarczający lek do komórek. Ogon poliaminowy obsługuje trzy uzupełniające się funkcje: (a) ułatwia formułowanie związku rozpuszczalnego w wodzie rozpuszczalnego w wodzie związku, (b) zwiększenie wiązania DNA w celu wzmocnienia inhibicji topoizomerazy II oraz (c) ułatwiają selektywny wychwyt przez komórki nowotworowe za pośrednictwem PTS. F14512 jest 73-krotnie bardziej cytotoksyczny dla komórek jajnika chomika chińskiego w porównaniu z komórkami CHO-MG o zmniejszonej aktywności PTS. Zmniejszona wrażliwość komórek białaczki L1210 na F14512 zaobserwowano w obecności putrescyny, spermidyny i sperminy, i sperminy. Równolegle, cząsteczka sperminy znacznie zwiększa interakcję lek-DNA, prowadząc do interakcję lek-DNA, prowadząc do wzmocnionego hamowania topoizomerazy II. Ogon sperminy F14512 służy jako nośnik dostarczania komórek, a także kotwica DNA kotwicy DNA, a ta właściwość przekłada się na poziomie komórkowym na odrębny profil farmakologiczny. profil farmakologiczny. Dwadzieścia dziewięć ludzkich stałych lub hematologicznych linii komórkowych zostało do scharakteryzowania wysokiego potencjału cytotoksycznego F14512 (mediana IC50 0,18 mikromol/l). Wreszcie, silna aktywność przeciwnowotworowa F14512 in vivo została udowodnione w modelu ksenoprzeszczepu ludzkiego guza piersi MX1, z częściową i całkowitą regresją guza. Praca ta wspiera rozwój kliniczny F14512 jako nowego ukierunkowanego leku cytotoksycznego i rzuca światło na koncepcję selektywnego dostarczania leków do komórek nowotworowych wyrażających PTS.
Które leki przeciwnowotworowe są ukierunkowane na ludzką topoizomerazę II?
Etopozyd (VP-16) i tenipozyd (VM-26) są skuteczne jako leki przeciwnowotworowe poprzez hamowanie topoizomerazy II eukariotycznego DNA poprzez tworzenie kowalencyjnego kompleksu z DNA. Doksorubicyna, daunorubicyna i aklarubicyna to antracykliny, które działają jako inhibitory topoizomerazy II DNA i mogą być stosowane w połączeniu. Benzoksazole, benzimidazole i pokrewne połączone związki heterocykliczne, które wykazywały znaczącą aktywność hamującą topoizomerazę II eukariotycznego DNA. F14512 jest pochodną epipodofilotoksyny zawierającą poliaminę, która działa jako inhibitor topoizomerazy DNA II. Leki bisdioksopiperazynowe, takie jak ICRF-187, są katalitycznymi inhibitorami topoizomerazy II DNA.
Wśród inhibitorów topoizomerazy II, siła działania cytostatycznego była w kolejności malejącej: mitoksantron; doksorubicyna, która była nieco większa niż DuP 941, azatoksyna; DuP 937; i amsakryna, która była znacznie większa niż VP-16