Monitorowanie syntezy białek jest niezbędne dla naszego zrozumienia regulacji ekspresji genów. regulacja ekspresji genów, ponieważ uważa się, że obfitość białek jest głównie kontrolowana na poziomie translacji. Metody spektrometrii masowej i sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania RNA zostały niedawno opracowane do badania translacji mRNA na poziomie na poziomie globalnym, ale nadal wiążą się one z ograniczeniami technicznymi i nie są powszechnie powszechnie stosowane. W tym badaniu opisujemy nowe podejście proteomiczne obejmujące cały system do bezpośredniego monitorowania translacji, określane mianem proteomiki łańcucha nasennego związanego z puromycyną proteomika (PUNCH-P), która opiera się na włączeniu biotynylowanej puromycyny do nowo zsyntetyzowanych białek w warunkach bezkomórkowych, a następnie oczyszczanie powinowactwa streptawidyny i chromatografia cieczowa-tandemowa analiza spektrometrii mas analiza spektrometrii mas. Używając PUNCH-P, zmierzyliśmy specyficzne dla cyklu komórkowego fluktuacje syntezy dla >5000 białek w komórkach ssaków, zidentyfikowaliśmy białek, które nie były wcześniej zaangażowane w procesy cyklu komórkowego i wygenerowaliśmy pierwszy profil translacyjny całego mózgu myszy. Ta prosta i ekonomiczna technika ma szerokie zastosowanie do każdego rodzaju komórek i tkanek, umożliwiając identyfikację i kwantyfikację szybkich reakcji proteomu w różnych warunkach biologicznych. warunkach biologicznych. --- Sekwencjonowanie transkryptomu pozwala na analizę dojrzałych RNA z rozdzielczością pary zasad rozdzielczości. Tutaj pokazujemy, że RNA-seq może być również wykorzystywane do badania powstających RNA w trakcie transkrypcji. Sekwencjonowaliśmy całkowity RNA z ludzkiego mózgu i wątroby i znaleźliśmy dużą frakcję odczytów (do 40%) w intronach. Intronowe RNA były obfite w tkance mózgowej, szczególnie dla genów zaangażowanych we wzrost aksonów i transmisję synaptyczną. transmisję synaptyczną. Ponadto wykryliśmy znaczące różnice w poziomach intronowego RNA między mózgami płodów i dorosłych. Pokazujemy, że wzór pokrycia sekwencji intronowych sekwencji jest wyjaśniony przez rodzącą się transkrypcję w połączeniu z ko-transkrypcyjnym splicingiem. ko-transkrypcyjnym splicingiem. Dalsza analiza ko-transkrypcyjnego splicingu wskazuje na korelację między wolno usuwanymi intronami a alternatywnym splicingiem. Nasze dane pokazują, że sekwencjonowanie całkowitego RNA zapewnia unikalny wgląd w procesy transkrypcyjne w komórce. procesy transkrypcyjne w komórce, o szczególnym znaczeniu dla prawidłowego rozwoju mózgu. rozwoju mózgu. --- Podczas późnego etapu infekcji adenowirusem 2, łańcuchy RNA są inicjowane w miejscu w pobliżu współrzędnej 16 (Evans i in., 1977) i transkrybowane w przybliżeniu 30 000 nukleotydów do odległego końca genomu we współrzędnej 100. Późne mRNA przetwarzane z tych transkryptów zawierają wspólny splicowany trójdzielny lider (Berget, Moore i Sharp, 1977; Chow i in., 1977a) kodowany na około 16, 20 i 27 oraz sekwencje kodujące białka, które mapują się w dół. Niniejszy raport mapuje późny promotor i zamknięty koniec 5' jądrowego i cytoplazmatycznego RNA z tej jednostki transkrypcji i analizuje i cytoplazmatycznego RNA z tej jednostki transkrypcyjnej i analizuje ich struktury. Pokazujemy, że powstające łańcuchy RNA znakowane pulsacyjnie in vivo są inicjowane we współrzędnej 16,5 +/- 0,5 i zawierają sekwencje interweniujące między segmentami liderowymi. Mapujemy zakończony 5' późnych transkryptów jądrowych w miejscu między 16.4 a 16.6 poprzez wyrównanie oligonukleotydów T1 RNAazy z jądrowego RNA z sekwencją DNA regionu promotora regionu promotora. Strukturę pierwszych jedenastu reszt zakończonego 5' późnego mRNA została określona przez bezpośrednie sekwencjonowanie RNA. Struktura ta odpowiada dokładnie sekwencji DNA we współrzędnej 16.4 i precyzyjnie pozycjonuje mRNA w regionie promotora. Wyniki te sugerują, że promotor i szablon czapeczki są zbieżne, a inicjujące reszty pierwotnego transkryptu są reszty pierwotnego transkryptu są prekursorami czapeczki 5' końca mRNA. Zidentyfikowano reszty usunięte z transkryptów przez splicing. Te plus czapeczki wykryto w dużym poliadenylowanym jądrowym RNA, wskazując, że czapeczki i poliadenylacja może zachodzić na niesplicingowanych cząsteczkach. Reszty zachowane w mRNA zawierają dziewięcio resztową sekwencję przylegającą do czapeczki, która jest komplementarna do 3' końca 18S rRNA, co sugeruje, że pierwszy lider funkcjonuje w wiązaniu rybosomu. Sekwencje nukleotydów z regionu promotora są porównano z odpowiednikami komórkowymi. Silne homologie w miejscach czapeczek i punktach sugerują, że w odnotowanych przypadkach wirus i komórka mają blisko spokrewnione mechanizmy ściśle powiązane mechanizmy syntezy końca 5' mRNA i splicingu. --- Polimerazy RNA są wysoce regulowanymi maszynami molekularnymi. Przedstawiamy metodę (globalne sekwencjonowanie run-on, GRO-seq), która mapuje pozycję, ilość i orientację orientację transkrypcyjnie zaangażowanych polimeraz RNA w całym genomie. W tej metodzie metoda, jądrowe cząsteczki RNA są poddawane równoległemu sekwencjonowaniu na dużą skalę sekwencjonowaniu i mapowaniu do genomu. Pokazujemy, że szczyty promotora-proksymalnego polimerazy znajdują się na około 30% ludzkich genów, transkrypcja rozciąga się poza rozszczepienie 3' pre-messenger RNA, a transkrypcja antysensowna jest powszechna. Dodatkowo, większość promotorów ma zaangażowaną polimerazę przed i w orientacji przeciwnej do orientacji przeciwnej do przypisanego genu. Ta rozbieżna polimeraza jest związana z aktywnymi genami, ale nie wydłuża się skutecznie poza promotor. promotora. Wyniki te sugerują, że wzajemne oddziaływanie między polimerazami i regulatorami regulatorami w szerokich regionach promotora dyktuje orientację i wydajność wydajnej transkrypcji. --- Opisano technikę bezpośredniego pomiaru trwającej transkrypcji z poszczególnych genów w permeabilizowanych komórkach pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae lub rozszczepionych drożdży Schizosaccharomyces pombe. Analiza przebiegu transkrypcji (TRO) jest wykorzystywana do porównywania względnych szybkości syntezy syntezy określonych transkryptów w komórkach hodowanych w różnych warunkach środowiskowych warunkach środowiskowych lub zebranych na różnych etapach rozwoju. Ponieważ ilość RNA obecnego w danym czasie jest określona przez jego szybkość netto syntezy i degradacji, dokładny obraz transkrypcji per se może być można uzyskać tylko poprzez bezpośredni pomiar syntezy de novo RNA (jeśli jesteś degradacji RNA, patrz Metoda pomiaru szybkości rozpadu mRNA w Saccharomyces cerevisia. Saccharomyces cerevisiae). Większość technik stosowanych do pomiaru zmian względnych poziomów poszczególnych transkryptów obecnych w różnych warunkach, w tym analiza Northern (zob. Northern blotting), RT-PCR (zob. PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)), testy ochrony przed nukleazą (patrz Objaśnienia Rozdział: Testy ochrony przed nukleazą) oraz testy obejmujące cały genom, takie jak analiza mikromacierzy analiza mikromacierzy i sekwencjonowanie RNA o wysokiej przepustowości, mierzą zmiany w stanie ustalonym transkryptu, które mogą, ale nie muszą odzwierciedlać rzeczywiste zmiany w transkrypcji genu. transkrypcji genu. Ostatnie badania przeprowadzone na drożdżach rozszczepialnych wykazały, że wzrost poziomu w stanie stacjonarnym (akumulacja) wielu mRNA występuje bez znaczących zmian w szybkości transkrypcji (McPheeters i in. (McPheeters et al., 2009), podkreślając ważną rolę regulowanej stabilności RNA w określaniu programów ekspresji genów (McPheeters et al., 2009). w określaniu programów ekspresji genów (Harigaya i in., 2006). --- W kompensacji dawki u Drosophila pośredniczy kompleks MSL, który zwiększa ekspresję męskich genów sprzężonych z chromosomem X około 2-krotnie. Kompleks MSL preferencyjnie wiąże ciała aktywnych genów na męskim X, osadzając H4K16ac z odchyleniem 3'. Zaproponowano dwa modele wpływu kompleksu MSL na transkrypcję: jeden oparty na rekrutacji promotora polimerazy RNA polimerazy RNA II (Pol II), a drugi na zwiększonej elongacji transkrypcji. wydłużenie transkrypcji. Tutaj wykorzystujemy sekwencjonowanie powstającego RNA, aby udokumentować kompensację dawki kompensację podczas wydłużania transkrypcji. Porównujemy również X i autosomy z opublikowanych danych dotyczących wstrzymanej i wydłużającej się polimerazy w celu oceny roli rekrutacji Pol II. Nasze wyniki potwierdzają model zróżnicowanej regulowanej elongacji, rozpoczynającej się od uwolnienia z pauzy 5' i wzrastającej przez ciała genowe związane z chromosomem X. Nasze wyniki podkreślają ułatwioną elongację transkrypcyjną jako kluczowy mechanizm skoordynowanej regulacji zróżnicowanego zestawu genów. genów. --- Tutaj proponujemy nową ogólną metodę bezpośredniego określania sekwencji RNA w oparciu o na wykorzystaniu zależnej od RNA polimerazy RNA z bakteriofaga phi6 i terminatorów łańcucha (sekwencjonowanie RdRP). terminatorów łańcucha (sekwencjonowanie RdRP). Następujące właściwości polimerazy sprawiają, że jest ona odpowiednia do tego zastosowania: (1) polimeraza phi6 może replikować wiele jednoniciowych szablonów RNA in vitro. (2) W przeciwieństwie do polimerazy DNA zależnej od primera wykorzystywanej w procedurze sekwencjonowania przez Sangera i wsp. (Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74: 5463-5467), inicjuje syntezę nici nascent nici bez startera, rozpoczynając polimeryzację na samym 3'-końca matrycy. (3) Polimeraza może zawierać analogi nukleotydów kończących łańcuch do powstającego łańcucha RNA, aby wytworzyć zestaw produktów terminacji specyficznych dla danej zasady. W konsekwencji, 3' proksymalna lub nawet a nawet pełną sekwencję wielu docelowych cząsteczek RNA można szybko wydedukować bez wcześniejszych informacji o sekwencji. Nowa technika okazała się przydatna do sekwencjonowania kilku syntetycznych szablonów ssRNA. Ponadto, wykorzystując segmenty genomowe wirusa choroby niebieskiego języka pokazujemy, że sekwencjonowanie RdRP może być również stosowane do naturalnie występujących naturalnie szablonów dsRNA. Sugeruje to możliwe zastosowania metody w badaniach i diagnostyce wirusów RNA w badaniach i diagnostyce wirusów RNA. --- Wcześniej wykazaliśmy, że białko αCP z domeną KH wiąże się z motywem 3' regionu nieulegającego translacji (3'UTR) motywu bogatego w C powstającej ludzkiej alfa-globiny (hα-globina) i zwiększa wydajność przetwarzania 3'. Tutaj my oceniamy ogólnogenomowy wpływ kompleksów αCP RNA-białko (RNP) na przetwarzanie 3' ze szczególnym uwzględnieniem jego roli w alternatywnej poliadenylacji (APA). Główne izoformy αCP zostały ostro usunięte z ludzkiej linii komórek hematopoetycznych, a wpływ na reprezentację mRNA i wykorzystanie miejsca poli(A) określono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania RNA (DRS). Analiza bioinformatyczna analiza ujawniła 357 znaczących zmian w wykorzystaniu miejsca poli(A), które które mogą być specyficznie powiązane z ubytkiem αCP. Te zdarzenia APA korelowały silnie korelowały z obecnością sekwencji bogatych w C w pobliżu miejsc addycji poli(A). Najbardziej znaczącym powiązaniem była obecność motywu bogatego w C w oknie od 30 do 40 zasad 5' do sygnałów poli(A) (AAUAAA) które były tłumione po zubożeniu αCP. To powiązanie jest zgodne z ogólną rolą αCP jako wzmacniaczy przetwarzania 3'. Odkrycia te przewidują rolę αCP w ścieżkach kontroli potranskrypcyjnej, które mogą zmieniać kodowanie potencjał i / lub poziomy ekspresji podgrup mRNA w transkryptomie ssaków transkryptomie ssaków.
Czy RNASeq może być używany do analizy powstających transkryptów?
Wydajne frakcjonowanie komórkowe poprawia analizę sekwencjonowania RNA dojrzałych i powstających transkryptów z ludzkich tkanek. Tutaj pokazujemy, że sekwencjonowanie RNA może być również wykorzystywane do badania powstających RNA w trakcie transkrypcji.  Wykorzystujemy sekwencjonowanie powstającego RNA do dokumentowania kompensacji dawki podczas wydłużania transkrypcji.