Epigenetyczna regulacja ekspresji genów poprzez kowalencyjną modyfikację histonów jest ważna dla rozwoju komórek linii zarodkowej. U ssaków, histon H3 lizyna 9 (H3K9)-specyficzne metylotransferazy histonowe (HMTases), takie jak G9a, SETDB1 i SUV39H, odgrywają kluczową rolę, ale udział HMTaz specyficznych dla H3K9 u Drosophila pozostaje do wyjaśnienia, zwłaszcza w męskich plemnikach. Tutaj przeprowadziliśmy analizy immunocytochemiczne z użyciem specyficznego przeciwciała dla dG9a, ortologa Drosophila G9a ortologa Drosophila G9a i wykazaliśmy lokalizację w cytoplazmie od etapu wzrostu do etapy wydłużania spermatogenezy. W późniejszym wczesnym stadium canoe, silne sygnały dG9a wykryto wyłącznie w jądrach, co sugeruje rolę regulacyjną rolę regulacyjną. Jednakże, mono-, di- i trimetylowane sygnały H3K9 nie były znacząco zmniejszone w homozygotycznym mutancie dG9a null na tych etapach. W przeciwieństwie do tego, mono- i trimetylowane sygnały H3K9 były znacznie zmniejszone w mutancie heterozygotycznym mutancie DmSetdb1 podczas spermatogenezy i podobnej redukcji w monometylowanych sygnałów H3K9 zaobserwowano u homozygotycznego mutanta Su(var)3-9. Dlatego DmSETDB1 jest prawdopodobnie odpowiedzialny głównie za mono- i trimetylację H3K9 podczas spermatogenezy. trimetylację H3K9 i SU(VAR)3-9 za monometylację H3K9 podczas spermatogenezy. spermatogenezy. Jednak zmniejszona metylacja H3K9 w premeiotycznych spermatocytach spermatocytach nie wpłynęła na rozłączenie chromosomów X-Y w mejozie męskiej, sugerując, że może nie być krytyczna dla spermatogenezy u Drosophila. --- Zależny od SAS3 kompleks acetylotransferazy histonowej NuA3 został pierwotnie zidentyfikowany na podstawie jego zdolności do acetylacji histonu H3 in vitro. Czy NuA3 jest zdolny do acetylowania histonów in vivo lub w jaki sposób kompleks jest ukierunkowany do nukleosomów, które modyfikuje, było nieznane. Aby odpowiedzieć na to pytanie zapytaliśmy, czy NuA3 jest związany z chromatyną in vivo i jak ten związek jest regulowane. Za pomocą testu pulldown chromatyny odkryliśmy, że NuA3 oddziałuje z amino-końcowym ogonem histonu H3, a utrata ogona H3 odtwarza fenotypy związane z utratą SAS3. Co więcej, mutacja lizyny histonu H3 14, preferowanego miejsca acetylacji przez NuA3 in vitro, fenokopiuje unikalny fenotyp sas3Delta, co sugeruje, że modyfikacja tej reszty jest ważna dla funkcji NuA3. Interakcja NuA3 z chromatyną jest zależna od histonów Set1p i Set2p metylotransferaz histonowych, a także ich substratów, histonów H3, odpowiednio lizyny 4 i 36. Wyniki te potwierdzają, że NuA3 funkcjonuje jako acetylotransferaza histonowa in vivo i że metylacja histonu H3 metylacja stanowi marker dla rekrutacji NuA3 do nukleosomów. --- Wirus Epsteina-Barr (EBV) w przeważającej mierze ustanawia utajone zakażenie w komórkach B a reaktywacja wirusa z latencji zależy od ekspresji wirusowego białka BZLF1. ekspresji wirusowego białka BZLF1. Promotor BZLF1 (Zp) normalnie wykazuje jedynie tylko niską aktywność podstawową, ale jest aktywowany w odpowiedzi na chemiczne lub biologiczne induktory, takie jak 12-O-tetradekanoiloforbol-13-octan (TPA), jonofory wapnia lub histony jonofory lub inhibitory deacetylazy histonowej (HDAC). W niektórych liniach komórkowych latentnie zakażonych EBV, sam inhibitor HDAC może indukować transkrypcję BZLF1 transkrypcję, podczas gdy leczenie nie zwiększa ekspresji w innych liniach komórkowych, takich jak liniach komórkowych, takich jak B95-8 lub komórki Raji, co sugeruje nieznane mechanizmy supresyjne oprócz deacetylacji histonów w tych komórkach. Tutaj znaleźliśmy epigenetyczną modyfikację modyfikację promotora BZLF1 w utajonych komórkach Raji przez trimetylację lizyny histonu H3 27 (H3K27me3), H3K9me2/me3 i H4K20me3. Poziomy aktywnych markerów takich jak acetylacja histonów i H3K4me3 były niskie w utajonych komórkach, ale wzrosły po reaktywacji. Leczenie 3-deazaneplanocyną A (DZNep), inhibitorem H3K27me3 i H4K20me3, znacząco zwiększyło transkrypcję BZLF1 w komórkach Raji w połączeniu z inhibitorem HDAC, trichostatyną A (TSA). The knockdown Ezh2 lub Suv420h1, metylotransferaz histonowych dla H3K27me3 lub H4K20me3, dodatkowo udowodniło supresję Zp przez metylacje. metylacje. Podsumowując, wyniki wskazują, że metylacja H3K27 i H4K20 są zaangażowane, przynajmniej częściowo, w utrzymanie latencji, a acetylacja histonów i metylacja H3K4 korelują z reaktywacją wirusa w komórkach Raji. wirusa w komórkach Raji. --- Telomery ssaków mają cechy heterochromatyczne, w tym trimetylowane histonu H3 przy lizynie 9 (H3K9me3) i trimetylowany histon H4 przy lizynie 20 (H4K20me3). Ponadto subtelomerowe DNA jest hipermetylowane. Aktywności enzymatyczne odpowiedzialne za te modyfikacje w telomerach zaczynają być scharakteryzowane. W szczególności, H4K20me3 w telomerach może być katalizowany przez nowe metylotransferazy histonowe Suv4-20h1 i Suv4-20h2 (HMTases). W tym badaniu wykazaliśmy, że enzymy Suv4-20h są odpowiedzialne za modyfikację histonów w telomerach. modyfikację histonów w telomerach. Komórki z niedoborem Suv4-20h2 lub zarówno Suv4-20h1 i Suv4-20h2 wykazują obniżone poziomy H4K20me3 w telomerach i subtelomerach przy brak zmian w H3K9me3. Tym zmianom epigenetycznym towarzyszy przez wydłużenie telomerów, co wskazuje na rolę HMTaz Suv4-20h w kontroli długości telomerów. kontroli długości telomerów. Wreszcie, komórki pozbawione HMTaz Suv4-20h lub Suv39h wykazują zwiększoną częstotliwość rekombinacji telomerów przy braku zmian w subtelomerowej metylacji DNA. Wyniki te pokazują znaczenie architektury chromatyny w utrzymaniu homeostazy długości telomerów i ujawniają nową rolę metylacji lizyny histonów w kontrolowaniu rekombinacji telomerów. rekombinacji telomerów. --- Białka zawierające domenę SET reprezentują ewolucyjnie konserwowaną rodzinę regulatorów epigenetycznych regulatorów epigenetycznych, które są odpowiedzialne za większość metylacji histonów lizyny metylację histonów. Ponieważ niektóre z tych genów okazały się niezbędne dla rozwoju embrionalnego rozwoju embrionalnego, proponujemy, aby danio pręgowany, kręgowiec modelowy kręgowców, posiadający wiele zalet w badaniach rozwojowych, może być wykorzystany do badania biologicznych funkcji tych genów i związanych z nimi mechanizmów epigenetycznych podczas wczesnego rozwoju. mechanizmów epigenetycznych podczas wczesnego rozwoju. W tym celu przeprowadziliśmy badanie genomów domeny SET u danio pręgowanego. Łącznie zidentyfikowano 58 genów zidentyfikowanych. Chociaż zdarzenia duplikacji genów dają początek kilku paralogi specyficzne dla linii, wyraźne wzajemne relacje ortologiczne ujawniają wysoką konserwację między zebrafish i ludzkimi genami domeny SET. Dane te zostały poddane dalszej analizie ewolucyjnej od drożdży do człowieka, co doprowadziło do do identyfikacji domniemanych klastrów grup ortologicznych (COG) tej rodziny genów. rodziny genów. Za pomocą strategii hybrydyzacji in situ całego mRNA, my przeprowadziliśmy również mapowanie ekspresji rozwojowej tych genów. Grupa matczynych genów domeny SET, które są zaangażowane w programowanie stanów modyfikacji histonów stanów modyfikacji histonów we wczesnym rozwoju, została zidentyfikowana i przewidziana jako odpowiedzialnych za wszystkie znane miejsca metylacji histonów za pośrednictwem domeny SET. Co więcej, niektóre geny wykazują specyficzne wzorce ekspresji w określonych tkankach na określonych etapach określonych etapach, co sugeruje zaangażowanie mechanizmów epigenetycznych w rozwój tych systemów. rozwój tych systemów. Wyniki te zapewniają globalny pogląd na zebrafish metylotransferaz histonowych w domenie SET w wymiarze ewolucyjnym i rozwojowym. ewolucyjnych i rozwojowych oraz torują drogę do wykorzystania danio pręgowanego do systematycznego badania roli tych genów podczas rozwoju. --- Nowa metylotransferaza histonów, określana jako Set9, została wyizolowana z ludzkich komórek. Set9 zawiera domenę SET, ale brakuje jej domen pre- i post-SET. Set9 metyluje specyficznie lizynę 4 (K4) histonu H3 (H3-K4) i nasila aktywację transkrypcji. aktywację transkrypcji. Ogon histonu H3 oddziałuje specyficznie z kompleksem deacetylazy histonowej NuRD. Metylacja histonu H3-K4 przez Set9 wyklucza powiązanie NuRD z ogonem H3. Co więcej, metylacja H3-K4 upośledza metylację K9 histonu H3 (H3-K9), w której pośredniczy Suv39h1. Wzajemne oddziaływanie między Set9 i metylotransferazami histonowymi Suv39h1 jest specyficzna, ponieważ metylacja H3-K9 przez metylotransferazę histonową G9a nie miała wpływu metylacja Set9 H3-K4. Nasze badania sugerują, że metylacja H3-K4 za pośrednictwem Set9 funkcjonuje w aktywacji transkrypcji aktywacji transkrypcji poprzez konkurowanie z deacetylazami histonów i przez wykluczając metylację H3-K9 przez Suv39h1. Nasze wyniki sugerują, że metylacja ogonów histonów może mieć różny wpływ na transkrypcję, w zależności od jego chromosomalnej lokalizacji, kombinacji potranslacyjnych i enzymu (lub kompleksu białkowego) zaangażowanego w daną modyfikację. modyfikację. --- TŁO: Tax jest onkoproteiną HTLV-1, która dereguluje szlaki transdukcji sygnału szlaki transdukcji sygnału, transkrypcję genów i regulację cyklu komórkowego komórek gospodarza komórek gospodarza. W transaktywującej funkcji Tax pośredniczą głównie jego interakcje białko-białko interakcje z czynnikami komórkowymi gospodarza. Jeśli chodzi o regulację ekspresji genów HTLV-1 i genów komórkowych, wykazano, że Tax reguluje acetylację histonów poprzez fizyczną interakcję z acetylazami i deacetylazami histonów. deacetylazami. Jednak funkcjonalna interakcja Tax z metylotransferazami histonów metylotransferazami histonowymi (HMTase) nie została zbadana. Tutaj zbadaliśmy zdolność Tax do interakcji z metylotransferazą histonową SUV39H1, która metyluje metyluje lizynę 9 histonu H3 (H3K9) i hamuje transkrypcję genów, a także zbadaliśmy funkcjonalne skutki interakcji na ekspresję genów HTLV-1. WYNIKI: Wykazano, że Tax wchodzi w interakcję z SUV39H1 in vitro, a interakcja jest w dużej mierze zależy od C-końcowej połowy SUV39H1 zawierającej domenę SET. Tax nie wpływa na aktywność metylotransferazy SUV39H1, ale przywiązuje SUV39H1 do kompleksu zawierającego Tax w jądrach. W testach genów reporterowych, koekspresja SUV39H1 hamuje transaktywację Tax promotora HTLV-1 LTR która była zależna od aktywności metylotransferazy SUV39H1. Ponadto, ekspresja SUV39H1 jest indukowana wraz z Tax w komórkach JPX9. Analiza immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) pokazuje lokalizację SUV39H1 na LTR po indukcji Tax, ale nie w przypadku braku indukcji Tax, w transformantach JPX9 transformantach zachowujących plazmid HTLV-1-Luc. Immunoblotting wykazuje wyższe poziomy ekspresji ekspresji SUV39H1 w transformowanych i latentnie zakażonych liniach komórkowych HTLV-1. WNIOSEK: Nasze badanie po raz pierwszy ujawniło interakcję między Tax i SUV39H1 oraz pozorne wiązanie SUV39H1 przez Tax do LTR HTLV-1. Jest to spekuluje się, że tethering SUV39H1 do LTR za pośrednictwem Tax i indukcja represyjnej modyfikacji histonów w chromatynie poprzez metylację H3 K9 może być podstawą zależnej od dawki represji transaktywacji LTR przez Tax przez SUV39H1. Ekspresja SUV39H1 indukowana przez Tax, interakcja Tax-SUV39H1 i tethering do LTR może stanowić wsparcie dla pomysłu, że powyższa sekwencja zdarzeń może tworzyć pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego, która samoogranicza ekspresję genów wirusa HTLV-1 ekspresję w zainfekowanych komórkach. --- Metylacja specyficznych dla pozycji reszt lizyny w zakończeniach N histonów jest centralną modyfikacją centralną modyfikacją regulującą przejścia epigenetyczne w chromatynie. Każda metylowana reszta lizyny może istnieć w stanie mono-, di- lub trimetylowanym, rozszerzając tym samym potencjał indeksowania tej konkretnej modyfikacji. Tutaj, badamy wszystkie możliwe stany metylacji lizyny 9 histonu H3 (H3-K9) i lizyny 27 histonu H3 (H3-K9). lizyny 27 (H3-K27) w chromatynie ssaków. Wykorzystując wysoce specyficzne przeciwciała wraz z ilościową spektrometrią mas, wykazujemy, że pericentryczna heterochromatyna heterochromatyna jest selektywnie wzbogacona o monometylację H3-K27 i trimetylację H3-K9 trimetylacji. Ten heterochromatyczny profil metylacji jest zależny od Suv39h metylotransferaz histonowych (HMTaz), ale niezależny od euchromatycznej HMTazy G9a. W komórkach z podwójną zerową Suv39h, pericentryczna heterochromatyna jest przekształcana w alternatywne odciski metylacji i gromadzi trimetylację H3-K27 i monometylację H3-K9. Nasze dane podkreślają selektywną obecność różnych stanów metylacji lizyny histonów w podziale subdomen chromosomalnych, ale także ujawniają zaskakującą plastyczność w propagowaniu wzorców metylacji w chromatynie eukariotycznej. --- CEL: Celem niniejszego badania było zbadanie zmian metylacji DNA i modyfikacji histonów w raku wątrobowokomórkowym (HCC). w rakach wątrobowokomórkowych (HCC). METODY: Metylację DNA w promotorach P16, RASSF1a, receptora progesteronu (PGR) i receptora estrogenowego alfa (ERalfa) określono za pomocą ilościowej techniką bisulfitopirosekwencjonowania u pacjentów z HCC. Histon H3-lizyna (K) 4, H3-K9 i H3-K27 we wszystkich tych czterech genach zostały zbadane przez immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w liniach komórkowych HCC. Ekspresja dwóch metylotransferaz DNA (DNMT1 i DNMT3b) i trzech metylotransferaz histonowych (SUV39H1, G9a i EZH2) u pacjentów z HCC mierzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. w czasie rzeczywistym. WYNIKI: U wszystkich pacjentów z HCC wykryto nieprawidłową metylację DNA. Pacjenci z metylacją DNA DNA w promotorach RASSF1a, PGR i ERalfa w nowotworach mieli również znaczną metylację DNA w nienowotworowych tkankach wątroby, podczas gdy metylacja DNA metylacja DNA w promotorze P16 była specyficzna dla raka. Stany epigenetyczne w liniach komórkowych HCC wykazały, że wyciszenie P16 i RASSF1a zależało od metylacji DNA i metylacji histonów H3-K9. Jednakże, wyciszenie genów PGR i ERalfa było bardziej związane z metylacją H3-K27 niż metylacją DNA. Zgodnie ze zmianą statusu histonów, wyższą ekspresję G9a i EZH2 stwierdzono w HCC niż w nienowotworowych tkankach wątroby (P < 0,01). WNIOSEK: Dane te sugerują, że wiele mechanizmów wyciszania epigenetycznego jest nieprawidłowo aktywne w komórkach HCC. --- Na transkrypcję genów krytyczny wpływ ma struktura chromatyny i stan modyfikacji status modyfikacji ogonów histonów. Metylacja reszt lizyny w ogonach histonów jest dynamicznie regulowana przez przeciwstawne aktywności metylotransferaz histonowych i demetylaz histonowych. metylotransferaz i demetylaz histonowych. Tutaj pokazujemy, że JARID1C/SMCX, a białko zawierające domenę JmjC związane z upośledzeniem umysłowym sprzężonym z chromosomem X i padaczką. posiada aktywność tri-demetylazy H3K4 i funkcjonuje jako represor transkrypcji. represor transkrypcji. Kompleks SMCX wyizolowany z komórek HeLa zawiera dodatkowe modyfikatory chromatyny (deacetylazy histonowe HDAC1 i HDAC2, oraz metylotransferazę histonów H3K9 G9a) oraz represor transkrypcyjny REST, sugerując bezpośrednią rolę SMCX w dynamice chromatyny i represji, w której pośredniczy REST. represję. Immunoprecypitacja chromatyny ujawnia, że SMCX i REST współzajmują ograniczające neurony elementy wyciszające w promotorach podzbioru genów docelowych REST genów docelowych. Zubożenie SMCX za pomocą interferencji RNA powoduje derepresję kilku tych celów i jednocześnie zwiększa trimetylację H3K4 w kanale sodowym kanału sodowego typu 2A (SCN2A) i promotorów synapsyny I (SYN1). Proponujemy, aby utrata aktywności SMCX upośledza regulację genów neuronalnych za pośrednictwem REST, tym samym przyczyniając się do związanego z SMCX opóźnienia umysłowego sprzężonego z chromosomem X. --- Kowalencyjna modyfikacja ogonów histonów odgrywa rolę regulacyjną w różnych procesach jądrowych, takich jak kontrola transkrypcji i chromosomów mitotycznych. procesach jądrowych, takich jak kontrola transkrypcji i mitotyczna kondensacja chromosomów kondensacji mitotycznych chromosomów. Wśród różnych grup enzymów, o których wiadomo, że katalizują kowalencyjną modyfikację, najnowszymi dodatkami są metylotransferazy histonowe (histone metylotransferazy histonów (HMTases), których funkcje są obecnie charakteryzowane. Tutaj pokazujemy, że białko zawierające domenę SET, G9a, jest nowym ssakiem preferującą lizynę HMTazą ssaków. Podobnie jak Suv39 h1, pierwsza zidentyfikowana HMTaza ssaków preferująca lizynę HMTaza ssaków, G9a przenosi grupy metylowe na reszty lizyny histonu H3, ale z 10-20-krotnie wyższą aktywnością. Doniesiono, że lizyny 4, 9, i 27 w histonie H3 są metylowane w komórkach ssaków. G9a był w stanie dodawać grupy metylowe do lizyny do lizyny 27, a także 9 w H3, w porównaniu z Suv39 h1, który był tylko zdolny do metylacji lizyny 9. Nasze dane wyraźnie wykazały, że G9a ma charakter enzymatyczną naturę odmienną od Suv39 h1 i jego homologa h2. Wreszcie, wykazano, że znakowany białkiem fluorescencyjnym G9a jest zlokalizowany w jądrze, ale nie w represyjnych domenach chromatyny loci centromerycznych, w których zlokalizowane były białka rodziny Suv39 h1 białka z rodziny Suv39 h1. To odkrycie wskazuje, że G9a może przyczyniać się do organizacji struktury chromatyny wyższego rzędu loci niecentromerowych loci. --- TŁO: Szybkość transkrypcji genomu wirusa HIV-1 jest zależna od interakcji wirusowego białka Tat z LTR i innymi mechanizmami transkrypcyjnymi. maszynerią transkrypcyjną. Na te specyficzne interakcje może mieć wpływ stan potranslacyjnych modyfikacji Tat. Wcześniej wykazaliśmy, że Tat może być fosforylowany i acetylowany in vivo, co skutkuje wzrostem szybkości transkrypcji. transkrypcji. W niniejszym badaniu zbadaliśmy, czy Tat może być metylowany na resztach lizyny, w szczególności na lizynie 50 i 51, i czy ta modyfikacja ta modyfikacja spowodowała zmniejszenie transkrypcji wirusa z LTR. WYNIKI: Przeanalizowaliśmy związek Tat z metylotransferazami histonowymi z rodziny rodziny SUV39 białek zawierających domenę SET in vitro. Stwierdzono, że Tat z SETDB1 i SETDB2, dwoma enzymami, które wykazują aktywność metylotransferazy. siRNA przeciwko SETDB1 transfekowane do systemów komórkowych z zarówno przejściowymi, jak i zintegrowanymi genami reporterowymi LTR spowodowało wzrost transkrypcji HIV-LTR w obecności suboptymalnych poziomów Tat. Testy metylacji in testy metylacji in vitro z peptydami Tat zawierającymi mutacje punktowe w lizynach 50 i 51 wykazały zwiększoną inkorporację grup metylowych na lizynie 51, jednak obie reszty wykazywały podatność na metylację. WNIOSEK: Związek Tat z metylotransferazami histonowymi i zdolność Tat do metylacji zdolność Tat do metylacji sugeruje interesujący mechanizm regulacji transkrypcji poprzez rekrutację białek remodelujących chromatynę białek do promotora HIV-1. --- Metylotransferazy histonowe katalizują specyficzne dla miejsca odkładanie grup metylowych, umożliwiając rekrutację regulatorów transkrypcji. U ssaków trimetylacja lizyny 4 w histonie H3, modyfikacja zlokalizowana w miejscach startu transkrypcji jest katalizowana przez sześć enzymów (SET1a i SET1b, MLL1-MLL4), których specyficzne funkcje są w dużej mierze nieznane. których specyficzne funkcje są w dużej mierze nieznane. Stosując podejście genomiczne odkryliśmy, że w makrofagach MLL4 (znany również jako Wbp7) był wymagany do ekspresji ekspresji Pigp, niezbędnego składnika transferazy GPI-GlcNAc, enzymu katalizującego enzymu katalizującego pierwszy etap syntezy kotwicy glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI). syntezy kotwicy glikozylofosfatyloinozytolu (GPI). Upośledzona ekspresja Pigp w makrofagach Wbp7(-/-) znosiła zależne od kotwicy GPI zależne od kotwicy ładowanie białek na błonę komórkową. Konsekwentnie, utrata zakotwiczonego w GPI CD14, rdzennego receptora dla lipopolisacharydu (LPS) i innych cząsteczek bakteryjnych bakteryjnych, znacznie osłabiła sygnały wewnątrzkomórkowe wyzwalane przez LPS i zmiany ekspresji genów. zmiany ekspresji genów. Dane te łączą enzym modyfikujący histony ze szlakiem biosyntezy szlakiem biosyntezy i wskazują na wyspecjalizowaną rolę biologiczną Wbp7 w funkcji makrofagów i odpowiedzi przeciwdrobnoustrojowej. --- Metylacja lizyn histonowych specyficzna dla reszty i stopnia wraz z innymi modyfikacjami epigenetycznymi epigenetycznymi organizuje chromatynę w odrębne domeny i reguluje niemal każdy aspekt metabolizmu niemal każdy aspekt metabolizmu DNA. Identyfikacja metylotransferaz metylotransferaz i demetylaz, a także białek rozpoznających metylowane lizyny metylowane lizyny, wyjaśniła rolę każdego zdarzenia metylacji w w regulacji różnych szlaków biologicznych. Metylacja lizyny 20 histonu H4 (H4K20me) (H4K20me) odgrywa kluczową rolę w różnych procesach komórkowych, takich jak ekspresja genów, progresja cyklu komórkowego i DNA. ekspresja genów, progresja cyklu komórkowego i naprawa uszkodzeń DNA, z każdym z trzech stopni metylacji (mono stopni metylacji (mono-, di- i tri-metylacja) wnosi unikalny wkład. wkład. Tutaj omawiamy ostatnie badania nad H4K20me, które znacznie poprawiły nasze zrozumienie regulacji i funkcji tej fascynującej modyfikacji histonu. modyfikacji histonów. --- Jądrowe DNA w komórkach eukariotycznych jest łączone w hierarchiczną strukturę chromatyny poprzez proces, na który dynamicznie wpływa kombinatoryczny zestaw potranslacyjnych modyfikacji (PTM) histonów w dynamiczny sposób reagujący na zmiany fizjologiczne i środowiskowe. Precyzyjna precyzyjna kwantyfikacja tych złożonych modyfikacji stanowi wyzwanie. Tutaj przedstawiamy solidną, opartą na MS metodę proteomiki ilościowej do badania PTM histonów przy użyciu (15)N metabolicznie znakowanych histonów jako wewnętrznego odniesienia. Stosując to podejście podejście, zidentyfikowaliśmy Tetrahymena trithorax related 1 (Txr1p) jako metylotransferazę histonów metylotransferazy w Tetrahymena thermophila i scharakteryzowaliśmy relacje metylotransferaz Txr1p i Ezl2p z modyfikacją histonu H3. My zidentyfikowaliśmy 32 PTM w ponad 60 peptydach tryptycznych z histonu H3 modelowego organizmu orzęsków Tetrahymena thermophila i określiliśmy je ilościowo (średni współczynnik zmienności: 13%). Zbadaliśmy zaburzenia wzorów modyfikacji histonów w dwóch znokautowanych szczepach metylotransferaz histonowych zawierających domenę SET metylotransferaz (HMT). Nokaut TXR1 doprowadził do stopniowego zmniejszenia mono-, di- i tri-metylacji H3K27 i pozornie zmniejszonej monometylacji H3K36 in vivo. W przeciwieństwie do tego, nokaut EZL2 spowodował dramatyczne zmniejszenie zarówno di-, jak i tri-metylacji H3K27 in vivo. i tri-metylacji H3K27 in vivo, podczas gdy poziomy monometylacji H3K27 znacznie wzrosły. To nagromadzenie monometylowego H3K27 jest zgodne z jego rolą jako substratu dla Ezl2p. Wyniki te zostały zweryfikowane poprzez immunoblotting z użyciem przeciwciał specyficznych dla miejsca modyfikacji. Podsumowując, nasze badania definiują Txr1p jako HMT specyficzną dla monometylacji H3K27, która ułatwia gromadzenie di- i trimetylacji H3K27 przez kanoniczną H3K27-specyficzną HMT, Ezl2p. Nasze badania określają również niektóre współzależności między różnymi modyfikacjami H3. modyfikacjami H3, ponieważ zaobserwowano również kompensacyjny wzrost monometylacji w H3K4, H3K23, i H3K56 zaobserwowano również dla mutantów TXR1 i ELZ2. --- SU(VAR)3-9 jak metylotransferazy histonowe kontrolują domeny heterochromatyczne u eukariontów. W Arabidopsis, 10 genów SUVH koduje homologi SU(VAR)3-9, gdzie SUVH1, SUVH2 i SUVH4 (KRYPTONITE) reprezentują odrębne podgrupy genów SUVH. Utrata SUVH1 i SUVH4 powoduje słabą redukcję heterochromatycznej dimetylacji histonu H3K9 dimetylacji, podczas gdy w roślinach bez SUVH2 mono- i dimetyl H3K9, mono- i dimetylu H3K27, oraz monometyl H4K20, znaki metylacji histonów heterochromatyny Arabidopsis są znacznie zmniejszone. Podobnie jak zwierzęce białka SU(VAR)3-9 białka SUVH2 wykazują silne efekty zależne od dawki. Utrata funkcji tłumi, podczas gdy nadekspresja wzmacnia wyciszanie genów, powoduje ektopową heterochromatyzację i znaczące defekty wzrostu. Ponadto, modyfikacja wyciszania transgenów przez SUVH2 jest częściowo przenoszona na rośliny potomne. rośliny. Ta stabilność epigenetyczna koreluje z dziedzicznymi zmianami w metylacji DNA metylacji DNA. Mutacyjna sekcja SUVH2 wskazuje na znaczenie jego N-końca i domeny YDG w kierowaniu metylacji DNA do sekwencji docelowych, co jest metylacji histonów. Wyciszanie genów przez SUVH2 zależy od MET1 i DDM1, ale nie od CMT3. W Arabidopsis, SUVH2 z jego histonami H3K9 i H4K20 odgrywa centralną rolę w wyciszaniu genów heterochromatycznych. wyciszaniu genów heterochromatycznych. --- Niedawno opracowane techniki biochemiczne umożliwiły naukowcom łatwiejsze i dokładniejsze badanie modyfikacji histonów. łatwiejsze i dokładniejsze badanie modyfikacji histonów. Jedna z tych modyfikacji, metylacja lizyny histonów, okazała się być wysoce stabilna i reprezentować zmianę epigenetyczną. Szeroko zakrojone analizy biochemiczne doprowadziły do odkrycia o naturze i funkcjach tej modyfikacji, przyspieszając w ten sposób nasze zrozumienie tego kluczowego zdarzenia epigenetycznego. Tutaj opisujemy podstawowe metody oczyszczania i analizy biochemicznej metylotransferaz histonowych ukierunkowanych na lizynę metylotransferaz z ekstraktów pochodzących z komórek HeLa. W sekcji dotyczącej przygotowania substratu substratów, opisujemy prostą metodę przygotowania rekombinowanych substratów. substratów, chociaż zalecamy stosowanie natywnych substratów do wstępnego wykrywania aktywności. aktywności. Protokoły oczyszczania dla kilku metylotransferaz histonowych metylotransferaz histonowych zostały uproszczone, aby badacze z podstawowym zrozumieniem biochemii. Opisujemy również wiele wskazówek i sugestie, aby uniknąć typowych pułapek w analizie biochemicznej metylotransferaz histonowych. metylotransferaz histonowych.
W jaki sposób metylotransferazy histonowe powodują modyfikację histonów?
Metylotransferazy histonowe (HMT) są odpowiedzialne za specyficzne dla miejsca dodawanie kowalencyjnych modyfikacji na ogonach histonów, które służą jako markery do rekrutacji kompleksów organizacji chromatyny. Istnieją dwa główne typy HMT: N-metylotransferazy histon-lizyna i N-metylotransferazy histon-arginina. Te pierwsze metylują specyficzne reszty lizyny (K), takie jak 4, 9, 27, 36 i 79 na histonie H3 oraz resztę 20 na histonie H4. Te drugie metylują reszty argininy (R), takie jak 2, 8, 17 i 26 na histonie H3 oraz resztę 3 na histonie H4. W zależności od tego, która reszta jest modyfikowana i stopnia metylacji (mono-, di- i tri-metylacja), metylacja lizyny histonów jest związana z aktywną lub cichą chromatyną transkrypcyjną.