Aspergillus terreus jest z powodzeniem stosowany do przemysłowej produkcji kwasu itakonowego. kwasu itakonowego. Kwas ten powstaje z cis-akonianu, związku pośredniego cyklu cyklu trikarboksylowego (TCA), poprzez katalityczne działanie dekarboksylazy cis-akonianu. Można założyć, że silne reakcje anaplerotyczne, które uzupełniają pulę produktów pośrednich cyklu TCA zwiększyłyby syntezę i szybkość wydalania kwasu itakonowego. kwasu itakonowego. U filogenetycznie bliskiego krewnego Aspergillus niger, regulowany w górę metaboliczny poprzez glikolizę, który działał jako silna reakcja anaplerotyczna. reakcja anaplerotyczna. Deregulacja strumienia glikolitycznego była spowodowana przez potranslacyjną modyfikacją 6-fosfofrukto-1-kinazy (PFK1), która skutkowała w tworzeniu wysoce aktywnej, odpornej na inhibicję cytrynianu krótszej formy enzymu krótszej formy enzymu. W celu uniknięcia złożonej modyfikacji potranslacyjnej, natywny enzym A. niger pfkA został zmodyfikowany w celu kodowania aktywnego krótszego fragmentu PFK1 . Poprzez wprowadzenie zmodyfikowanych genów A. niger pfkA do szczepu A. terreus, udokumentowano zwiększoną specyficzną produktywność kwasu itakonowego i końcową wydajność. wydajności zostały udokumentowane przez transformanty w odniesieniu do szczepu rodzicielskiego. Z drugiej strony z drugiej strony, tempo wzrostu wszystkich transformantów pozostało stłumione, co jest z powodu niskiej początkowej wartości pH pożywki, jednego z warunków wstępnych dla akumulacji kwasu itakonowego. akumulacji kwasu itakonowego przez grzybnię A. terreus. --- Kilka gatunków Aspergillus jest dobrze znanych z produkcji różnych kwasów organicznych. W tym badaniu zastosowano podejście transkryptomiczne oparte na klonowaniu do identyfikacji genów kluczowych w szlaku biosyntezy jednego z tych kwasów, kwasu itakonowego. Z wielu różnych kontrolowanych fermentacji wsadowych Aspergillus terreus fermentacji, te kultury z największą różnicą w mianie kwasu itakonowego i produktywności zostały wybrane do izolacji mRNA. cDNA pochodzące z tych próbek mRNA zostały wykorzystane do późniejszej hybrydyzacji tablic szklanych szkiełek w oparciu o kolekcję 5000 klonów cDNA. kolekcji 5000 klonów cDNA. Wybrano 13 klonów cDNA skutkujących zidentyfikowano najsilniejsze (> 10-krotne) sygnały hybrydyzacji różnicowej i następnie wstawki tych klonów zostały zsekwencjonowane. Analiza sekwencji ujawniła obecność w sumie pięciu różnych wstawek genowych wśród sekwencjonowanych klonów. Z jednej z tych sekwencji, kodującej gen z rodziny MmgE-PrpD wykazano, że region kodujący o pełnej długości koduje jeden z kluczowych enzymów szlaku kwasu enzymów szlaku kwasu itakonowego, dekarboksylazę cis-akonianu, poprzez heterologiczną ekspresję w Escherichia coli. ekspresji w Escherichia coli. Ekspresja tego genu w Aspergillus niger, który jest naturalnym producentem kwasu cytrynowego, spowodowała produkcję itakonianu. Analiza genomu sugeruje, że u A. terreus gen dekarboksylazy cis-akonianu jest częścią klastra genów związanych z kwasem itakonowym, w tym genów kodujących dwa specyficzne dla szlaku transportery i białko palca cynkowego. Co ciekawe, ten jest bezpośrednio powiązany z dużym klastrem genów lovastatyny. --- Skrobia sago została zhydrolizowana przy użyciu środków chemicznych lub enzymów przy różnych stężeniach i pH. pH i stężeniach. Hydroliza przy użyciu 5000 AUN/ml (0,5% w/v) glukoamylazy wykazała najwyższą wydajność kwasu itakonowego do 0,36 g/g skrobi sago, podczas gdy hydroliza przy użyciu kwasu azotowego przy pH 2,0 dała 0,35 g/g skrobi sago. Podłoże zostało zoptymalizowane, a jego skład wynosił (g/l) 140 g skrobi sago, 1,8 g kukurydzy 1,2 MgSO(4).7H(2)O i 2,9 NH(4)NO(3). Gdy zastosowano optymalne warunki hydrolizy i składu pożywki zastosowano do produkcji kwasu itakonowego w 3-litrowym fermentorze słoikowym, produkcja kwasu itakonowego wyniosła 48,2 g/l z wydajnością 0,34 g/g skrobi sago. Został on przefiltrowany z bulionu hodowlanego i 37,1 g kwasu itakonowego o czystości 97,2%. Wynik ten pokazał, że skrobia sago można przekształcić w produkt o wartości dodanej za pomocą jedynie prostej obróbce wstępnej. --- Biotechnologicznie wytwarzany kwas itakonowy (IA) jest obiecującym kwasem organicznym o o szerokim zakresie zastosowań i potencjale do otwarcia nowych obszarów zastosowań w dziedzinie chemii polimerów, farmacji i rolnictwa. W niniejszym badaniu przeprowadzono systematyczna optymalizacja procesu została przeprowadzona przy użyciu własnego wyizolowanego szczepu Aspergillus terreus i przeniesiono go ze skali 250 ml do 15 litrów. Stężenie IA o stężeniu 86,2 g / l osiągnięto w ciągu 7 dni przy ogólnej produktywnością 0,51 g/(L h), maksymalną produktywnością 1,2 g/(L h) i wydajnością 86 mol%. Hodowla innych dobrze znanych szczepów A. terreus z opracowanym procesem nie wykazała znaczących różnic. Na tej podstawie opracowano proces zapewniający wysokie końcowe stężenie IA niezależnie od użytego szczepu w połączeniu z wysoką powtarzalnością. w połączeniu z wysoką powtarzalnością. --- Aspergillus niger ma niezwykły potencjał do produkcji kwasów organicznych, co zostało w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego. Wcześniej wykazano, że ekspresja genu dekarboksylazy cis-akonianu (cadA) z Aspergillus terreus przekształciła A. niger w producenta kwasu itakonowego. Aspergillus terreus przekształciła A. niger w producenta kwasu itakonowego (Li et al., Fungal Genet Bio 48: 602-611, 2011). Po kilku początkowych etapach produkcji optymalizacji w poprzednich badaniach (Li et al., BMC biotechnol 12: 57, 2012), badania te mają na celu modyfikację szczepów gospodarza i warunków fermentacji w celu dalszej poprawy produkcji kwasu itakonowego. Ekspresja dwóch wcześniej zidentyfikowanych wcześniej genów A. terreus kodujących domniemane transportery kwasów organicznych (mttA, mfsA) zwiększyła produkcję kwasu itakonowego w szczepie A. niger wyrażającym dekarboksylazę cis-akonianu wyrażającym dekarboksylazę. Co zaskakujące, produkcja nie wzrosła dalej, gdy oba transportery były wyrażane razem. Tymczasem kwas szczawiowy był gromadzony jako produkt uboczny w hodowli transformantów mfsA. W celu w celu dalszego zwiększenia produkcji kwasu itakonowego i wyeliminowania powstawania produktów ubocznych, nie zakwaszającego szczepu D15#26 i acetylohydrolazy szczawiooctanu (oahA) AB 1.13 ∆oahA #76 zostały przeanalizowane pod kątem produkcji kwasu itakonowego. kwasu itakonowego. Podczas gdy ekspresja cadA w AB 1.13 ∆oahA #76 skutkowała wyższą produkcją kwasu itakonowego niż w szczepie AB 1.13 ∆oahA #76. kwasu itakonowego niż szczep CAD 10.1, nie miało to miejsca w przypadku szczepu D15#26. Zgodnie z oczekiwaniami, produkcja kwasu szczawiowego została wyeliminowana w obu szczepach. W dalszej próbie zwiększenia poziomu kwasu itakonowego, ulepszony podstawowy szczep produkujący kwas cytrynowy, N201, został użyty do ekspresji cadA. Wyselekcjonowany transformant (N201CAD) produkował więcej kwasu itakonowego niż szczep CAD 10.1, pochodzący z ze szczepu A. niger AB1.13. Następnie skupiliśmy się na wpływie rozpuszczonego tlenu (D.O.) na produkcję kwasu itakonowego. Co ciekawe, obniżone poziomy D.O. (10-25%) zwiększyło produkcję kwasu itakonowego przy użyciu szczepu N201 CAD. Podobne wyniki uzyskano w przypadku szczepu AB 1.13 CAD + HBD2.5 (HBD 2.5), który z nadekspresją domeny hemoglobiny grzybów. Nasze wyniki wykazały, że nadekspresja domeny hemoglobiny zwiększyła produkcję kwasu itakonowego w A. niger na niższych poziomach D.O. D.O. Najwyraźniej niższe poziomy D.O. mają pozytywny wpływ na produkcję kwasu itakonowego w A. niger. produkcję kwasu itakonowego w szczepach A. niger. --- TŁO: W ostatnich latach biotechnologiczna produkcja platformowych związków chemicznych dla komponentów paliwowych stała się głównym przedmiotem zainteresowania. Chociaż materiał lignocelulozowy jest uważany za odpowiedni surowiec, prawie nieunikniona obróbka wstępna tego opornego materiału może zakłócać kolejne etapy fermentacji. kolejne etapy fermentacji. W niniejszym badaniu grzyb Ustilago maydis został do produkcji kwasu itakonowego jako platformy chemicznej do syntezy potencjalnych biopaliw, takich jak potencjalnych biopaliw, takich jak 3-metylotetrahydrofuran. Żadne badania nie jak wstępna obróbka biomasy lignocelulozowej precyzyjnie wpływa na późniejszą fermentację późniejszą fermentację przez U. maydis. W związku z tym, niniejsze badanie ma na celu scharakteryzować U. maydis w kolbach wstrząsanych, a następnie ocenić wpływ na hodowlę i produkcję kwasu itakonowego przez tego grzyba. kwasu itakonowego. Celuloza hydrolizowana enzymatycznie w wodzie morskiej i jako substraty badano celulozę katalizowaną kwasami organicznymi. Wreszcie, jako substrat zastosowano zhydrolizowaną hemicelulozę z frakcjonowanego drewna bukowego. jako substrat. WYNIKI: U. maydis został scharakteryzowany na poziomie kolby wstrząsowej pod kątem produkcji kwasu itakonowego na glukozie. kwasu itakonowego na glukozie. Wykazano, że ograniczenie azotu jest kluczowym warunkiem warunkiem dla produkcji kwasu itakonowego. Dla stężenia kwasu itakonowego powyżej 25 g/L, zaobserwowano znaczącą inhibicję produktu. Przeprowadzenie eksperymenty, które symulowały wpływ możliwych metod obróbki wstępnej, U. maydis był tylko nieznacznie dotknięty wysokimi osmolarnościami do 3,5 osmol/L, jak również jak również 0,1 M kwas szczawiowy. Produkcja kwasu itakonowego została osiągnięta na celulozę poddaną obróbce wstępnej w wodzie morskiej i na hydrolizowanej frakcji hemicelulozowej poddanego obróbce wstępnej drewna bukowego. WNIOSKI: Grzyb U. maydis jest obiecującym producentem kwasu itakonowego, ponieważ rośnie jako pojedyncze komórki (podobne do drożdży) w uprawach zanurzonych i jest niezwykle wytrzymały w podłożach o wysokiej osmotyczności i prawdziwej wodzie morskiej. Co więcej, U. maydis może rosnąć na frakcji hemicelulozowej wstępnie obrobionego drewna bukowego. Tym samym grzyb ten łączy w sobie ważne zalety drożdży i grzybów strzępkowych. Niemniej jednak, wstępna obróbka biomasy rzeczywiście wpływa na późniejszą produkcję kwasu itakonowego. produkcję kwasu itakonowego. Chociaż U. maydis jest niewrażliwy na większość możliwych zanieczyszczeń zanieczyszczenia z obróbki wstępnej, duże ilości soli lub pozostałości kwasów organicznych mogą spowolnić wzrost drobnoustrojów i zmniejszyć produkcję. W związku z tym etap obróbki wstępnej musi spełniać warunki wstępne określone przez rzeczywiste mikroorganizmy mikroorganizmy stosowane do fermentacji. --- Kwas itakonowy jest nienasyconym kwasem dikarbonowym, który ma wysoki potencjał jako biochemiczny blok jako biochemiczny blok budulcowy, ponieważ może być stosowany jako monomer do produkcji wielu produktów, w tym żywic, tworzyw sztucznych, farb i włókien syntetycznych. włókien syntetycznych. Niektóre gatunki Aspergillus, takie jak A. itaconicus i A. terreus, wykazują zdolność do syntezy tego kwasu organicznego, a A. terreus może wydzielać znaczne jego ilości do pożywki (>80%). znaczne ilości do podłoża (>80 g/L). Jednak w porównaniu z procesem produkcji kwasu kwasu cytrynowego (miana >200 g/L) osiągane miana są nadal niskie, a cały proces jest kosztowny, ponieważ a cały proces jest kosztowny, ponieważ oczyszczone substraty są wymagane dla optymalnej wydajności. Itakonian powstaje w wyniku aktywności enzymatycznej dekarboksylazy cis-akonianu (CadA) kodowanej przez gen cadA w A. terreus. Klonowanie genu cadA do produkującego kwas cytrynowy grzyba A. niger wykazało, że możliwa jest produkcja itakonianu. że możliwe jest wytwarzanie kwasu itakonowego również w innym organizmie gospodarza. W niniejszym przeglądzie opisany zostanie aktualny status i ostatnie postępy w procesów molekularnych prowadzących do biotechnologicznej produkcji kwasu itakonowego. biotechnologicznej produkcji kwasu itakonowego. --- Wyizolowano silny szczep Aspergillus terreus SKR10 wytwarzający kwas itakonowy. z odpadów ogrodniczych. Odpady rynkowe, jabłka i banany, zostały zbadane jako nowe jako nowe substraty do produkcji kwasu itakonowego z wydajnością odpowiednio 20+/-2,0 i 20,0+/-1,0 g l(-1), odpowiednio. Wydajność kwasu itakonowego na poziomie 28,5+/-2,2 i 31,0+/-1,7 g l(-1) uzyskano z hydrolizowanej kwasem i alfa-amylazą skrobi kukurydzianej. Wydajność produkcji kwasu itakonowego przez ten szczep typu dzikiego została poprawiona przez ultrafioletowe, chemiczne i mieszane zabiegi mutagenne. Dwa mutanty o wysokiej N45 i UNCS1 zostały uzyskane przez posiew gradientowy. Te dwa mutanty były zdolne do produkcji dwukrotnie większej ilości kwasu itakonowego niż szczep macierzysty. szczep macierzysty. --- Komórki Aspergillus terreus, wolne i unieruchomione w piance poliuretanowej, zostały zastosowano w procesach fermentacji kwasu itakonowego na pożywkach na bazie glicerolu. Celem Celem była ocena ich przydatności do solubilizacji węgla kostnego zwierząt i rozwój biotechnologicznej alternatywy dla nawozów P produkowanych chemicznie z fosforanu produkowanych chemicznie z fosforanu skalnego. Kości zwierzęce stanowią odnawialne źródło P które może zastąpić tradycyjnie stosowany skończony, nieodnawialny fosforyt skalny jako źródło P. źródło P. Glicerol był doskonałym substratem do wzrostu (10,2 g biomasy L(-1)) i produkcji kwasu itakonowego (26,2 g biomasy L(-1)). i produkcji kwasu itakonowego (26,9 g L(-1)) przez wolne komórki grzybów po 120-godzinnej fermentacji. fermentacji. Jednocześnie A. terreus rozpuszczał nierozpuszczalny fosforan z wydajnością 23-50%. z wydajnością od 23 do 50%, w zależności od wielkości cząstek i stężenia. Pianka poliuretanowa pocięta na kostki o boku 0,5-0,6 cm, o wielkości porów 0,3 mm i zastosowana w stężeniu 2,0 g L(-1) okazała się doskonałym nośnikiem komórek. W powtarzanej fermentacji wsadowej, unieruchomiona grzybnia wykazała wysoką zdolność do rozpuszczania węgla kostnego pochodzenia zwierzęcego, co skutkowało średnio 168,8 mg L(-1) rozpuszczalnego fosforanu na 48-godzinny cykl i 59 mg L(-1) rozpuszczalnego fosforanu na 48-godzinny cykl. fosforanu na 48-godzinny cykl i 59,4% wydajność (procent całkowitego fosforanu) zarejestrowany w czwartej partii. --- Zebrano produkty fermentacji Aspergillus terreus ATCC 20542 (szczep macierzysty do produkcji lovastatyny). lovastatyny), a współistnienie kwasu itakonowego (IA) z lovastatyną zostało potwierdzone w tym badaniu. Przy użyciu pożywki na bazie laktozy (LBM), produkcja lovastatyny wynosiła 873 mg/l w dniu 10, ale produkcja IA wynosiła tylko 22-28 mg/l podczas hodowli. Kiedy laktoza w LBM została zastąpiona glukozą, produkcja IA została znacznie zwiększona o 20 razy (491 mg / l w dniu 5), co wykazało wzorzec związany ze wzrostem. Wyniki wskazują, że zastosowane źródło węgla (glukoza lub laktoza) kontrolowało szlak biosyntezy. Wydajność netto produkcji lovastatyny przy użyciu laktozy obliczono na 25,1 mg/g (5,1-krotnie) w porównaniu do stosowania glukozy w hodowlach. Ponadto, produkcja lovastatyny została dodatkowo zwiększona o 9,2% po dodaniu IA (0,5 g/l) do LBM. do LBM. Po dodaniu IA w ilości 5 g/l, bulion fermentacyjny stał się ciemnobrązowy, a produkcja lowastatyny została zmniejszona o 18,0%. Stąd te dwa metabolity (IA i lovastatyna) produkowane przez grzyby mogą być ze sobą powiązane. --- Ciągła produkcja kwasu itakonowego z sacharozy przy użyciu Aspergillus terreus TKK 200-5-3 unieruchomionej na kostkach z pianki poliuretanowej została zoptymalizowana w w bioreaktorach kolumnowych z wykorzystaniem statystycznego projektowania eksperymentalnego i modelowania empirycznego. modelowanie empiryczne. Najwyższe stężenie produktu kwasu itakonowego obliczone na podstawie uzyskanego modelu na podstawie uzyskanego modelu wynosiło 15,8 g l-1 w badanym obszarze doświadczalnym, gdy stężenie sacharozy eksperymentalnym, gdy stężenie sacharozy wynosiło 13,5%, szybkość napowietrzania 150 ml min-1 i czas przebywania 178 h. czas przebywania 178 h. Z sacharozy z immobilizowaną A. terreus TKK 200-5-3 produkcja kwasu itakonowego była stabilna przez co najmniej 4,5 miesiąca w ciągłych bioreaktorach kolumnowych. Dla porównania, przy użyciu glukozy jako substratu i unieruchomionej grzybni A. terreus TKK 200-5-1 jako biokatalizatora uzyskano podobną stabilność przy wyższym stężeniu produktu. przy wyższym stężeniu produktu. Pominięcie siarczanu miedzi z pożywki z pożywki produkcyjnej dało najwyższe stężenie produktu kwasu itakonowego (26 g l-1) z 9% glukozy z 0,25% azotanu amonu i 0,095% siarczanu magnezu.
Które gatunki mogą być wykorzystywane do biotechnologicznej produkcji kwasu itakonowego?
W 1955 roku produkcja kwasu itakonowego została po raz pierwszy opisana dla Ustilago maydis. Niektóre gatunki Aspergillus, takie jak A. itaconicus i A. terreus, wykazują zdolność do syntezy tego kwasu organicznego, a A. terreus może wydzielać znaczne ilości do pożywki. Kwas itakonowy jest dostarczany głównie w procesach biotechnologicznych z udziałem grzyba Aspergillus terreus. Klonowanie genu cadA do produkującego kwas cytrynowy grzyba A. niger wykazało, że możliwe jest wytwarzanie kwasu itakonowego również w innym organizmie gospodarza.