Neurotoksyny botulinowe (BoNT) to proteazy, które rozszczepiają specyficzne białka komórkowe białka komórkowe niezbędne do uwalniania neuroprzekaźników. Istnieje siedem serotypów BoNT (A-G) istnieją; 4 zwykle powodują zatrucie jadem kiełbasianym u ludzi (A, B, E i F). Opracowaliśmy szybką, metodę opartą na spektrometrii mas (Endopep-MS) do wykrywania i różnicowania aktywnych BoNT A, B, E i F. Metoda ta wykorzystuje wysoce specyficzną aktywność proteazy toksyn z peptydami docelowymi. toksyn z docelowymi peptydami specyficznymi dla każdego serotypu toksyny. Produkt peptydy pochodzące z aktywności endopeptydazy BoNT są wykrywane przez spektrometrii masowej czasu przelotu z jonizacją laserową wspomaganą matrycą. W buforze, metoda ta może wykryć równoważniki toksyn wynoszące zaledwie 0,01 mysiej dawki śmiertelnej (MLD). mysiej dawki śmiertelnej (MLD)50 i stężenia tak niskiego jak 0,62 MLD50/mL. A metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas do aktywnej toksyny, w której ilość toksyny może być skorelowana z ilością peptydów produktu. ilość peptydów produktu. --- Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) i amerykańskie Centra Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) uznały toksyny botulinowe za priorytetowe zagrożenie biologiczne. Zapobiegania i Kontroli Chorób (CDC) oznaczyły toksyny botulinowe jako czynnik biologiczny o wysokim priorytecie. biologiczny, który może zostać wykorzystany w atakach terrorystycznych na żywność. Ze względu na to zagrożenie zagrożenie istnieje zwiększona potrzeba opracowania szybkich i skutecznych metod wykrywania aktywnych neurotoksyn botulinowych (BoNT). W niniejszym badaniu opisano udane zastosowanie testu enzymatycznego wykorzystującego wewnętrznie wygaszony peptyd fluorogeniczny jako szybkiej, prostej i niedrogiej alternatywy dla testu biologicznego na myszach. W czasie krótszym niż niż 15 minut test może wykryć 0,25 nM BoNT-A w płynnych próbkach żywności. Poziom poziom wykrywania jest znacznie poniżej śmiertelnej dawki doustnej dla dorosłego człowieka wynoszącej 70 mikrogów toksyny. Kulki immunomagnetyczne pokryte przeciwciałami monoklonalnymi IgG, które celują w ciężki łańcuch toksyny łańcuch ciężki toksyny mogą skoncentrować toksynę bez neutralizowania jej aktywności enzymatycznej, przezwyciężając efekty matrycy spowodowane przez endogenne inhibitory proteazy i peptydazy. inhibitory proteaz i peptydazy. Ten szybki i skuteczny system testowy może być stosowany do badań przesiewowych na dużą skalę w celu wykrycia BoNT-A. --- Neurotoksyny botulinowe są jednymi z najsilniejszych toksyn znanych człowiekowi. Obecne metody wykrywania obejmują kwantyfikację toksyny, ale nie uwzględniają pod uwagę procent toksyny, która jest aktywna. Obecnie test do monitorowania aktywności toksyny jest test biologiczny na myszach, który jest długotrwały i wiąże się z kwestiami etycznymi ze względu na wykorzystanie żywych zwierząt. Niniejszy raport demonstruje nowy test, który wykorzystuje aktywność endopeptydazy toksyny do wykrywania neurotoksyny botulinowej w próbce farmaceutycznej. Rozszczepienie SNAP-25 jest monitorowane za pomocą spektroskopii UV-Visible z granicą wykrywalności wynoszącą 373 fg/ml i została dalej rozwinięta w metodę o wysokiej przepustowości przy użyciu czytnika mikropłytek czytnika mikropłytek wykrywającego do 600 fg/ml aktywnej toksyny. Wyniki pokazują wyraźne różnice między produktem toksyny a placebo, które zawiera farmaceutyczną albuminę surowicy ludzkiej i laktozę, pokazując, że test test wykrywa aktywną formę toksyny. --- Toksyna Clostridium botulinum typu A jest najczęstszą przyczyną naturalnie występujących ognisk zatrucia jadem kiełbasianym u ludzi na świecie. naturalnie występujących ognisk zatrucia jadem kiełbasianym u ludzi na świecie. Aktywna cząsteczka neurotoksyny neurotoksyny składa się z łańcucha ciężkiego (łańcucha H) o masie ~100 kDa, którego karboksy-końcowym końcem składającym się z domeny wiążącej receptor (HC), podczas gdy domena domena amino-końcowa (HN) jest połączona krytycznym wiązaniem dwusiarczkowym z lekkim łańcuch (łańcuch L) o masie ~50 kDa. Chociaż test biologiczny na myszach (MBA) jest tradycyjnie tradycyjnie stosowany w celu potwierdzenia obecności toksyny w surowicy lub żywności, jego czułość jest niewystarczająca do wykrycia niskiego poziomu toksyny u około 30-60% pacjentów z zatruciem jadem kiełbasianym. pacjentów. Nowatorska płytka mikrotitracyjna FDC (funkcjonalna podwójna powłoka) test immunobiochemiczny, który określa ilościowo toksyczność botuliny poprzez pomiar domeny domeny HC związanej z aktywnością endopeptydazy łańcucha L, został zmodyfikowany, aby umożliwić ludzką surowicę (lizowaną lub nielizowaną) do testowania bez zakłóceń z matrycy matrycy, z wykrywaniem toksyny do 0,03 mysiego LD50 na ml surowicy lub 0,13 pg ml(-1) przy użyciu zaledwie 100 µl próbek klinicznych. Test był specyficzny dla toksyny typu A i może być dodatkowo stosowany do próbek krwi pełnej i żywności. Niskie od 1 do 2 mysich LD50 na ml surowicy toksyny typu A oznaczono ilościowo po raz pierwszy przy użyciu zmodyfikowanego testu po raz pierwszy przy użyciu zmodyfikowanego testu FDC u dwóch poważnie zatrutych pacjentów z Wielkiej Brytanii którzy wymagali wentylacji mechanicznej i antytoksyny. Wykryto również poziomy toksyn w odzyskanych wykryto również ekstrakty próbek żywności, a jedna próbka MBA-ujemna zawierała zawierała 0,32 LD50 na ml ekstraktu. Test FDC stanowi realną alternatywę dla laboratoriów dla laboratoriów zdrowia publicznego, aby jednoznacznie potwierdzić wszystkie przypadki zatrucia jadem kiełbasianym typu A. oraz, ze względu na swoją czułość, obiecujące nowe narzędzie w badaniach farmakokinetycznych toksyn. toksyny. --- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są bardzo obiecującym źródłem różnych zróżnicowanych modeli komórkowych do testowania toksyczności in vitro. Dla Wykrywanie neurotoksyny Clostridium botulinum (BoNT) i badania mechanistyczne, Obecnie istnieje kilka modeli komórkowych, ale żaden z nich nie bada funkcji toksyny z funkcji toksyny, wykazując jednocześnie wysoką czułość. Najbardziej czułymi modele komórkowe to pierwotne komórki myszy lub szczura oraz neurony pochodzące z mysich embrionalnych komórek macierzystych. mysich embrionalnych komórek macierzystych, z których oba wymagają znacznej wiedzy technicznej wiedzy technicznej do przygotowania kultury. Niniejsze badanie po raz pierwszy opisuje wykorzystanie neuronów pochodzących z hiPSC do wykrywania BoNT. Neurony użyte w tym badaniu zostały zróżnicowane i poddane kriokonserwacji przez Cellular Dynamics International (Madison, WI) i składają się z prawie czystej populacji pan-neuronalnej głównie neuronów gamma-aminomasłowych i glutaminergicznych. Western blot i ilościowe dane PCR pokazują, że neurony te wyrażają wszystkie niezbędne receptory i substraty do zatrucia BoNT. Badania zatrucia BoNT/A pokazują, że neurony pochodzące z hiPSC odtwarzalnie i ilościowo wykrywają biologicznie aktywne BoNT/A z wysoką czułością (EC(50) ∼0,3 U). Dodatkowo wykazano ilościowe wykrywanie serotypów BoNT B, C, E i kompleksu BoNT/A i kompleksu BoNT/A, a swoistość BoNT/A została potwierdzona w badaniach ochrony przed przeciwciałami. przeciwciał. Bezpośrednie porównanie wykrywania BoNT przy użyciu pierwotnych komórek rdzenia kręgowego szczura komórek rdzenia kręgowego szczura i neuronów pochodzących z hiPSC wykazało równą lub zwiększoną czułość, bardziej stromą krzywą dawka-odpowiedź i bardziej kompletne rozszczepienie docelowego białka SNARE dla hiPSC. dla neuronów pochodzących z hiPSC. Podsumowując, dane te sugerują, że neurony pochodzące z hiPSC stanowią idealną i wysoce czułą platformę do BoNT, wykrywania przeciwciał neutralizujących i badań mechanistycznych. badań mechanistycznych. --- Neurotoksyny botulinowe (BoNT) są najsilniejszymi znanymi ludzkimi toksynami i czynnikiem czynnikiem wywołującym zatrucie jadem kiełbasianym i są szeroko stosowane jako cenne farmaceutyki. BoNT są białkami modułowymi składającymi się z łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego połączonych wiązaniem dwusiarczkowym. Odurzanie komórek neuronalnych przez BoNT jest wieloetapowym procesem obejmującym wieloetapowy proces obejmujący specyficzne wiązanie z komórką, endocytozę, konformacyjną w endosomie, translokację enzymatycznego łańcucha lekkiego do cytozolu komórki komórek do cytozolu i rozszczepienie docelowe SNARE. Ilościowe i wiarygodne określenie siły działania w pełni funkcjonalnych BoNT produkowanych jako aktywny składnik farmaceutyczny (API) wymaga składnik farmaceutyczny (API) wymaga testu, który uwzględnia wszystkie etapy ścieżki zatrucia. szlaku intoksykacji. Test biologiczny in vivo na myszach od lat jest "złotym standardem" stosowanym w tym celu. stosowanym w tym celu, ale wymaga użycia dużej liczby myszy, a tym samym co wiąże się z kosztami i wątpliwościami etycznymi. Testy komórkowe są obecnie jedyną alternatywą in vitro, która wykrywa w pełni funkcjonalne BoNT w jednym i od lat są wykorzystywane do celów badawczych. W ciągu ostatnich 5 lat opracowano kilka testów wykrywania BoNT opartych na komórkach, które są w stanie w stanie ilościowo określić siłę działania BoNT z podobną lub większą czułości niż test biologiczny na myszach. Testy te oferują obecnie alternatywną metodę określania siły działania BoNT. Takie ilościowe i wiarygodne oznaczanie siły działania BoNT jest kluczowym krokiem w badaniach podstawowych, w opracowywaniu farmaceutycznych BoNT oraz w ilościowym wykrywaniu neutralizujących przeciwciał. przeciwciał neutralizujących.
Jak wykrywa się aktywną neurotoksynę Clostridium botulinum?
Aktywna neurotoksyna Clostridium botulinum może być wykryta przez:
test śmiertelności myszy
spektrometria masowa
test biologiczny
zróżnicowane modele komórkowe
test rozszczepienia peptydu
test immunobiochemiczny FDC (funkcjonalna podwójna powłoka) na płytce mikrotitracyjnej
aktywność endopeptydazy monitorowana za pomocą spektroskopii UV-Visible