Choroby serca pozostają główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności w zachodnim świecie. świecie. Obecne terapie mają na celu leczenie objawów, a nie mechanizmów mechanizmów subkomórkowych leżących u podstaw etiologii i patologicznej przebudowy w niewydolności serca. niewydolności serca. Uniwersalną cechą, przyczyniającą się do zmniejszenia kurczliwości w ludzkich i eksperymentalnych niewydolnych sercach, jest upośledzone sekwestracja wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej (SR). Wychwyt wapnia przez SR jest przez Ca(2+)-ATPazę (SERCA2), której aktywność jest odwracalnie regulowana przez fosfolamban (PLN). Fosforylowany PLN jest inhibitorem SERCA, a fosforylacja PLN fosforylacja PLN łagodzi to hamowanie. Jednak początkowy prosty widok kompleksu regulacyjnego PLN/SERCA został zmodyfikowany przez nasze ostatnie identyfikację SUMO, S100 i bogatego w histydynę białka wiążącego Ca jako regulatorów aktywności SERCA. regulatorów aktywności SERCA. Ponadto, aktywność PLN jest regulowana przez 2 fosfoproteiny, inhibitor-1 fosfatazy białkowej 1 i małe białko szoku cieplnego szoku cieplnego 20, które wpływają na ogólny transport Ca za pośrednictwem SERCA. Niniejszy przegląd podkreśli mechanizmy regulacyjne kurczliwości serca przez SERCA/PLN i potencjał nowych metod terapeutycznych ukierunkowanych na ten kompleks przy użyciu małych cząsteczek. terapeutycznych ukierunkowanych na ten kompleks przy użyciu małych cząsteczek i metod transferu genów. --- Wykorzystaliśmy rezonans magnetyczny do mapowania powierzchni interakcji integralnego białka błonowego białka błonowego z jego celem regulacyjnym, integralnym enzymem błonowym. Fosfolamban (PLN) reguluje kurczliwość serca poprzez modulację sarko(endo)plazmocytowej ATPazy wapniowej (SERCA). Upośledzenie tego powoduje niewydolność serca. Aby zmapować molekularne szczegóły interakcji PLN/SERCA, funkcjonalnie odtworzyliśmy SERCA ze znakowanym PLN w micelach dodecylofosfocholiny do spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości oraz w zarówno w micelach, jak i dwuwarstwach lipidowych do spektroskopii EPR. Różnicowe perturbacje w szerokościach linii NMR i przesunięciach chemicznych, mierzone jako funkcja w sekwencji PLN, zapewniają żywy obraz rozległych kontaktów SERCA zarówno w domenach cytoplazmatycznych, jak i transmembranowych PLN i zapewniają strukturalny wgląd we wcześniej zgłoszone dane dotyczące mutagenezy funkcjonalnej. Dane NMR i EPR pokazują wyraźne i uzupełniające się dowody na dynamiczną (mikros-ms) równowagi między dwoma stanami konformacyjnymi w cytoplazmatycznej domenie PLN. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że SERCA przyciąga domenę cytoplazmatyczną PLN z dala od powierzchni lipidów, przesuwając istniejącą wcześniej równowagę konformerów PLN w kierunku struktury, która jest gotowa do interakcji z regulatorem cel. EPR pokazuje, że ten przełącznik konformacyjny zachowuje się podobnie w micelach i błonach lipidowych. Opierając się na danych strukturalnych i dynamicznych, proponujemy model w którym PLN ulega aktywacji allosterycznej po napotkaniu SERCA. --- Fosfolamban (PLN) jest białkiem błonowym typu II, które hamuje retikulum sarkoplazmatyczne Ca(2+)-ATPazy (SERCA). (SERCA), regulując w ten sposób homeostazę wapnia w mięśniu sercowym. mięśnia sercowego. W błonach PLN tworzy pentamery, które zostały zaproponowane do funkcjonować jako magazyn aktywnych monomerów lub jako kanały jonowe. Tutaj zgłaszamy strukturę pentamerycznego PLN w stanie T rozwiązaną za pomocą hybrydowego roztworu i NMR w stanie stałym. W dwuwarstwach lipidowych, PLN przyjmuje topologię wiatraczka z wąskim hydrofobowym porem, który wyklucza transport jonów. W stanie T cytoplazmatyczne amfipatyczne helisy (domeny Ia) są wchłaniane do dwuwarstwy lipidowej z domenami transmembranowymi ułożonymi w lewoskrętną konfigurację coiled-coil konfiguracja, przecinająca dwuwarstwę z kątem nachylenia około 11 ° w stosunku do normalnej błony w odniesieniu do normalnej błony. Różnica kąta nachylenia między monomerem i pentamerem wynosi około 13 °, co pokazuje, że wewnątrzbłonowe siły asocjacji helisa-helisa dominują nad niedopasowaniem hydrofobowym, napędzając ogólną topologię montażu topologię zespołu transbłonowego. Nasze dane ujawniają, że zarówno topologia, jak i funkcja PLN są kształtowane przez interakcje z lipidami, które precyzyjnie dostrajają regulację SERCA. --- Regulacja pompy wapniowej SERCA przez fosfolamban (PLB) jest w dużej mierze spowodowana interakcji między ich odpowiednimi domenami transmembranowymi. Pomimo mutagenezy i badań kinetycznych, wciąż nie mamy jasnego mechanistycznego obrazu tego, jak PLB wpływa na cykl transportu wapnia SERCA. W tym celu stworzyliśmy mutanty alaninowe dla każdej reszty w domenie transbłonowej PLB. domeny PLB, dokonaliśmy ko-rekonstytucji tych mutantów z SERCA do proteoliposomy i przeprowadziliśmy symulacje kinetyczne aktywności ATPazy izotermy aktywności ATPazy zależnej od wapnia. Mutanty transbłonowe PLB miały zmienny wpływ na zmienny wpływ na powinowactwo do wapnia, maksymalną aktywność i kooperatywność SERCA, tak że zaobserwowano zakres wartości. Symulacje kinetyczne wykorzystujące dobrze ugruntowany schemat reakcji dla SERCA pozwolił nam skorelować na aktywność SERCA ze zmianami stałych szybkości schematu reakcji. Obecność PLB miała wpływ tylko na trzy etapy schematu reakcji, mianowicie wiązanie pierwszego jonu wapnia, późniejsza zmiana konformacyjna w SERCA i wiązanie drugiego jonu wapnia. SERCA i wiązanie drugiego jonu wapnia. Zdolność dzikiego typu i zmutowane formy PLB do zmiany pozornego powinowactwa wapnia SERCA skorelowane ze zmniejszoną szybkością wiązania drugiego jonu wapnia. Ponadto zdolność typu dzikiego i zmutowanych form PLB do zmiany maksymalnej aktywności SERCA korelowała ze zmianą stałej szybkości do przodu dla powolnej zmiana konformacyjna w SERCA po związaniu pierwszego jonu wapnia.
W jaki sposób fosfolamban wpływa na aktywność biologiczną ATPazy wapniowej SERCA?
W wychwycie wapnia SR pośredniczy Ca(2+)-ATPaza (SERCA2), której aktywność jest odwracalnie regulowana przez fosfolamban (PLN). Fosforylowany PLN jest inhibitorem SERCA, a fosforylacja PLN łagodzi to hamowanie. Fosfolamban (PLN) jest małym integralnym białkiem błonowym, które wiąże i hamuje w nieznany jeszcze sposób Ca(2+)-ATPazę (SERCA) w retikulum sarkoplazmatycznym. Na podstawie danych strukturalnych i dynamicznych zaproponowano model, w którym PLN ulega allosterycznej aktywacji po napotkaniu SERCA. Regulacja allosteryczna SERCA zależy od równowagi konformacyjnej PLN, którego cytoplazmatyczna domena regulatorowa przechodzi między trzema różnymi stanami: stanem podstawowym T (helikalnym i związanym z błoną), stanem wzbudzonym R (rozwiniętym i odłączonym od błony) oraz stanem B (rozciągniętym i związanym z enzymem), który nie jest hamujący. Fosforylacja PLN przesuwa populacje w kierunku stanu B, zwiększając aktywność SERCA. Fosfolamban (PLN) reguluje kurczliwość serca poprzez modulację aktywności ATPazy wapniowej siateczki sarko(endo)plazmatycznej (SERCA). Upośledzenie tego procesu regulacyjnego powoduje niewydolność serca.