Ostatnie postępy w oprzyrządowaniu MS i postępy w wzbogacaniu fosfopeptydów fosfopeptydów, w połączeniu z bardziej wydajnymi narzędziami do analizy danych, ułatwiły ułatwiły bezstronną charakterystykę tysięcy specyficznych dla miejsca zdarzeń fosforylacji. W połączeniu ze stabilnym znakowaniem izotopowym przez aminokwasy w w hodowli komórkowej, techniki te umożliwiły ilościową ocenę zmian fosforylacji w różnych stanach fizjologicznych w stabilnych liniach komórkowych. Jednak ilościowa fosfoproteomika w pierwotnych komórkach i tkankach pozostaje głównym wyzwaniem technicznym ze względu na brak odpowiednich technik dokładnej kwantyfikacji. technik do dokładnej kwantyfikacji. Tutaj opisujemy zintegrowaną strategię pozwalającą na profilowanie ilościowe fosfopeptydów na dużą skalę w złożonych mieszaninach biologicznych. mieszaninach biologicznych. W tej technice mieszanina peptydów proteolitycznych została fosfopeptydów przy użyciu kolumny powinowactwa z tytanem, a oczyszczone fosfopeptydy były następnie oczyszczone fosfopeptydy były następnie znakowane odczynnikami iTRAQ. Po dalsze frakcjonowanie przez silną wymianę kationową, peptydy analizowano za pomocą LC-MS/MS na spektrometrze mas Orbitrap, który zbiera CID i wysokoenergetyczną dysocjację kolizyjną (HCD). widma dysocjacji kolizyjnej (HCD) sekwencyjnie w celu identyfikacji peptydów i kwantyfikacji. Wykazujemy, że bezpośrednie wzbogacanie fosfopeptydów białka przez chromatografię powinowactwa titanii znacznie poprawia wydajność i powtarzalność analizy proteomicznej fosfopeptydów i jest kompatybilne z dalszym znakowaniem iTRAQ. Warunki zostały zoptymalizowane dla HCD znormalizowanej energii kolizji, aby zrównoważyć ogólną identyfikację peptydów i kwantyfikacji przy użyciu względnych obfitości jonów reporterowych iTRAQ. Korzystając z tego podejścia podejście, byliśmy w stanie zidentyfikować 3557 różnych fosfopeptydów z lizatów komórek HeLa z których 2709 zostało również określonych ilościowo na podstawie skanów HCD. --- Zrozumienie szlaków sygnałowych regulujących pluripotencję i samoodnowę jest warunkiem wstępnym lepszego kontrolowania różnicowania komórek macierzystych do określonych komórek macierzystych. Odwracalna fosforylacja białek jest jedną z najważniejszych potranslacyjnych modyfikacji regulujących szlaki sygnałowe w procesach biologicznych. procesach biologicznych. Globalna analiza dynamicznych zmian w fosforylacji białek jest zatem kluczem do zrozumienia sygnalizacji na poziomie biologicznym, kluczowa dla zrozumienia sygnalizacji na poziomie systemowym. Tutaj opisujemy strategię fosfoproteomiki opartą na spektrometrii mas (MS) zastosowaną do monitorowania dynamiki fosforylacji po zastosowaniu białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC). Nasza metoda łączy w sobie zastosowanie silnej wymiany kationów (SCX) i dwutlenku tytanu (TiO(2)) do wzbogacania fosfopeptydów, MS o wysokiej rozdzielczości do identyfikacji peptydów i białek identyfikacja i stabilne znakowanie izotopowe aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) do kwantyfikacji. Takie podejście pozwala nam zidentyfikować tysiące miejsc fosforylacji i profilowanie ich względnej obfitości podczas różnicowania. To podejście oparte na biologii systemów zapewnia nowy wgląd w w jaki sposób ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste opuszczają stan pluripotencjalny. --- Limfopoetyna zrębu grasicy (TSLP) jest cytokiną, która odgrywa różne role w regulacji odpowiedzi immunologicznej. regulacji odpowiedzi immunologicznych. TSLP wymaga heterodimerycznego receptora składającego się z podjednostki α receptora IL-7 i unikalnego receptora TSLP (symbol genu CRLF2) do przekazywania sygnałów w komórkach. Nieprawidłowa sygnalizacja TSLP (np. nadekspresja TSLP lub jego unikalnego receptora TSLPR) przyczynia się do rozwoju wielu chorób, w tym astmy. rozwoju wielu chorób, w tym astmy i białaczki. Jednakże, szczegółowe zrozumienie szczegółowe zrozumienie szlaków sygnałowych aktywowanych przez TSLP pozostaje nieuchwytne. W tym badaniu przeprowadziliśmy globalną ilościową analizę fosfoproteomiczną sieci sygnalizacyjnej TSLP przy użyciu stabilnego znakowania izotopowego aminokwasami w hodowli komórkowej. w hodowli komórkowej. Stosując dwutlenek tytanu jako dodatek do przeciwciała antyfosfotyrozynowe jako metody wzbogacania, zidentyfikowaliśmy 4164 fosfopeptydów na 1670 fosfoproteinach. Stosując stabilne znakowanie izotopowe aminokwasami aminokwasami w hodowli komórkowej, ustaliliśmy, że status fosforylacji 226 białek był modulowany przez stymulację TSLP. Nasza analiza zidentyfikowała aktywację kilku członków rodzin kinaz Src i Tec w tym Btk, Lyn i Tec przez TSLP po raz pierwszy. Ponadto zgłaszamy indukowaną przez TSLP fosforylację fosfataz białkowych, takich jak Ptpn6 (SHP-1) i Ptpn11 (Shp2), co również nie zostało wcześniej zgłoszone. Testy koimmunoprecypitacji wykazały, że Shp2 wiąże się z białkiem adaptorowym Gab2 w sposób zależny od TSLP. Jest to pierwsza demonstracja indukowalnego kompleksu białkowego kompleksu białkowego w sygnalizacji TSLP. Badanie przesiewowe inhibitorów kinaz ujawniło, że farmakologiczne hamowanie kinazy PI-3, kinaz z rodziny Jak, kinaz z rodziny Src kinaz lub Btk hamowało proliferację komórkową zależną od TSLP, czyniąc z nich kandydatami na cele terapeutyczne w chorobach wynikających z nieprawidłowej sygnalizacji TSLP sygnalizacji. Nasze badanie jest pierwszą analizą fosfoproteomiczną szlaku sygnałowego TSLP która znacznie rozszerza nasze zrozumienie sygnalizacji TSLP i dostarcza nowych celów terapeutycznych dla TSLP. dostarcza nowych celów terapeutycznych dla chorób związanych z TSLP/TSLPR u ludzi. --- Przedstawiamy globalne ilościowe badanie fosfoproteomiczne krwiobiegu i formy procyklicznej Trypanosoma brucei przy użyciu znakowania SILAC każdego etapu cyklu życiowego. Wzbogacanie fosfopeptydów przez SCX i TiO2 doprowadziło do identyfikacji łącznie 10096 miejsc fosforylacji na 2551 grupach białek i ilościowo określiła stosunki 8275 miejsc fosforylacji między dwoma etapami cyklu życia. Ponad 9300 z tych miejsc (92%) nie zostało wcześniej zgłoszonych. Analiza wzbogacenia genów analiza wzbogacenia genów zidentyfikowała nadreprezentację terminów Gene Ontology odnoszących się do wici, aktywności kinazy białkowej i regulacji ekspresji genów. ekspresji genów. Dane ilościowe ujawniają, że zróżnicowana fosforylacja białek fosforylacja jest szeroko rozpowszechniona między trypanosomami krwiobiegu i procyklicznymi trypanosomów, ze znaczącą wewnątrzbiałkową zróżnicowaną fosforylacją. Pomimo braku dedykowanych kinaz tyrozynowych, zidentyfikowano 234 reszty fosfotyrozyny. i były one 3-4-krotnie nadreprezentowane wśród miejsc zmieniających się >10-krotnie między dwoma etapami cyklu życiowego. Znaczna część kinomu T. brucei była fosforylowana, co dowodzi, że szlaki MAPK są funkcjonalne na obu etapach cyklu życiowego. Regulacja ekspresji genów u T. brucei jest wyłącznie posttranskrypcyjna, a obserwowana rozległa fosforylacja białek wiążących RNA białek wiążących RNA może być istotna dla kontroli stabilności mRNA w tym organizmie. tym organizmie. --- Obecne metody analizy fosfoproteomów mają kilka ograniczeń. Po pierwsze, większości metod wzbogacania fosfopeptydów brakuje specyficzności, aby naprawdę oczyścić fosfopeptydów. Po drugie, widma fragmentacji fosfopeptydów, w szczególności w szczególności peptydów zawierających fosfoserynę i fosfotreoninę, są często często zdominowane przez utratę grupy (grup) fosforanowej (fosforanowych) i dlatego nie zawierają informacji wymaganych do zidentyfikowania sekwencji peptydu i miejsca fosforylacji. fosforylacji, a po trzecie, wyszukiwarki baz danych sekwencji i modele statystyczne modele statystyczne do walidacji danych nie są zoptymalizowane pod kątem specyficznych właściwości fragmentacji właściwości fosforylowanych peptydów. W konsekwencji, dane fosfoproteomiczne charakteryzują się fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych miejsc fosforylacji. miejsc fosforylacji. Tutaj przedstawiamy zintegrowaną chemiczną, masową spektrometryczną i obliczeniową w celu poprawy wydajności, specyficzności i pewność w identyfikacji fosfopeptydów i ich miejsca (miejsc) fosforylacji. Fosfopeptydy zostały wyizolowane z wysoką specyficznością poprzez prostą procedurę derywatyzacji opartą na chemii fosforoamidów. Identyfikację fosfopeptydów, ich miejsc fosforylacji i odpowiadających im fosfoprotein odpowiadających im fosfoprotein została osiągnięta poprzez optymalizację procedury pozyskiwania danych ze spektrometrii mas procedury akwizycji danych spektrometrycznych, narzędzi obliczeniowych do bazy danych narzędzi obliczeniowych do przeszukiwania bazy danych i przetwarzania danych. Strategia została zastosowana do mapowania miejsc fosforylacji oczyszczonego czynnika transkrypcyjnego, dFOXO i dla globalnej analizy fosforylacji białek w komórkach Drosophila melanogaster Kc167 komórek. --- TŁO: Inhibitor proteasomu bortezomib stanowi ważny postęp w leczeniu szpiczaka mnogiego (MM). w leczeniu szpiczaka mnogiego (MM). Bortezomib hamuje aktywność proteasomu proteasomu 26S i indukuje śmierć komórek w różnych komórkach nowotworowych; jednak, mechanizm cytotoksyczności nie jest dobrze poznany. METODOLOGIA/GŁÓWNE USTALENIA: Zbadaliśmy zróżnicowany fosfoproteom po zahamowaniu proteasomu przy użyciu stabilnego znakowania izotopowego aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) w połączeniu z wzbogacaniem fosfoprotein i analizą LC-MS/MS analiza. W sumie zidentyfikowano 233 fosfoproteiny, a 72 fosfoproteiny wykazały 1,5-krotną lub większą zmianę po leczeniu bortezomibem. Fosfoproteiny fosfoproteiny ze zmianami ekspresji obejmują wszystkie główne klasy białek, w tym dużą liczbę białek wiążących kwasy nukleinowe. Specyficzne dla miejsca fosfopeptydów ujawniła, że fosforylacja Ser38 na stathminie wzrosła po leczeniu bortezomibem, sugerując nowe mechanizmy związane z apoptozą indukowaną bortezomibem w komórkach MM. Dalsze badania wykazały, że profil fosforylacji stathminy został zmodyfikowany w odpowiedzi na leczenie bortezomibem a regulacja stathminy poprzez fosforylację na specyficznych resztach Ser/Thr uczestniczyła w odpowiedzi komórkowej indukowanej przez bortezomib. WNIOSKI/ZNACZENIE: Nasze systematyczne profilowanie zmian fosforylacji w odpowiedzi na leczenie bortezomibem odpowiedzi na leczenie bortezomibem nie tylko przyspieszyło globalne mechanistyczne zrozumienie działania bortezomibu na komórki szpiczaka, ale także zidentyfikowaliśmy wcześniej niescharakteryzowane białka sygnałowe w komórkach szpiczaka. --- Zdarzenia fosforylacji-defosforylacji białek odgrywają podstawową rolę w regulacji regulacji prawie wszystkich aspektów funkcjonowania komórek, w tym transdukcji sygnału, cyklu komórkowego lub apoptozy. Do tej pory fosfoproteomika komórek T koncentrowała się na fosfotyrozyny, a niewiele wiadomo na temat roli fosforylacji seryny i treoniny. fosforylacji seryny/treoniny we wczesnej aktywacji receptora komórek T (TCR). Dlatego przeprowadziliśmy ilościową analizę opartą na spektrometrii mas globalnego fosfoproteomu ludzkich pierwotnych limfocytów T w odpowiedzi na 5 min. aktywację TCR przeciwciałem anty-CD3. Łącząc immunoprecypitację z przeciwciałem przeciwciałem antyfosfotyrozynowym, wzbogacanie fosfopeptydów dwutlenkiem tytanu, izobarycznego znacznika dla metodologii względnej i bezwzględnej kwantyfikacji oraz silnej kationowym, byliśmy w stanie zidentyfikować 2814 fosfopeptydów. Te unikalne miejsca zostały wykorzystane do zbadania specyficznej dla miejsca fosforylacji fosforylacji. Pięćset siedemnaście miejsc fosforylacji wykazało zmiany reagujące na TCR. zmiany. Stwierdziliśmy, że po 5 minutach stymulacji TCR, specyficzne motywy kinazy serynowej i motywy kinazy serynowej i treoninowej są nadreprezentowane w zestawie reagujących miejsc fosforylacji. miejsca fosforylacji. Te zdarzenia fosforylacji dotyczyły białek o wielu różnych aktywnościach i są obecne w różnych lokalizacjach subkomórkowych. Wiele z tych białek tych białek jest zaangażowanych w wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne związane głównie z z reorganizacją cytoszkieletu i regulacją transdukcji sygnału za pośrednictwem małych GTPaz. prawdopodobnie zaangażowanych w tworzenie synapsy immunologicznej. --- Komórkowy protoonkogen c-Src jest niereceptorową kinazą tyrozynową zaangażowaną we wzrost komórek i regulację cytoszkieletu. Pomimo dysregulacji w różnych ludzkich nowotworach, jego dokładne funkcje nie są w pełni poznane. Identyfikacja substratów c-Src pozostaje dużym wyzwaniem, ponieważ nie ma prostego prostego sposobu na bezpośrednie stymulowanie jego aktywności. Tutaj połączyliśmy chemiczne ratowanie zmutowanego c-Src i globalną ilościową fosfoproteomikę, aby uzyskać pierwsze zdjęcie o wysokiej rozdzielczości. wysokiej rozdzielczości migawki zakresu zdarzeń fosforylacji tyrozyny, które występują w komórce natychmiast po specyficznej stymulacji c-Src. Po wzbogaceniu przez przeciwciałami antyfosfotyrozynowymi, zidentyfikowaliśmy 29 potencjalnych nowych białek substratowych c-Src białek substratowych. Mapowanie fosfopeptydów tyrozyny pozwoliło na identyfikację 382 nieredundantnych fosfopeptydów tyrozyny na 213 fosfoproteinach. Stabilne znakowanie izotopowe aminokwasów w kwantyfikacji opartej na hodowli komórkowej pozwoliło na wykrycie 97 nieredundantnych fosfopeptydów tyrozynowych, których poziom fosforylacji jest zwiększony przez c-Src. Duża liczba wcześniej wcześniej niescharakteryzowanych domniemanych celów białkowych i miejsc fosforylacji c-Src. fosforylacji, z których większość odgrywa kluczową rolę w sygnalizacji i sieciach cytoszkieletowych, szczególnie w adhezji komórek. cytoszkieletu, szczególnie w adhezji komórek. Sygnalizacja integryn i szlak sygnalizacji ogniskowej adhezji i szlak sygnałowy kinazy ogniskowej to dwa z najbardziej zmienionych szlaków po aktywacji c-Src poprzez aktywację chemiczną. W tym kontekście nasze badanie ujawniło czasowy związek między aktywacją c-Src a GTPazą Rap1, o której wiadomo, że stymuluje adhezję zależną od integryny. Chemiczne ratowanie c-Src dostarczyło narzędzia do analizy czasoprzestrzennego mechanizmu aktywacji czynnika wymiany guaniny Rap1, C3G. czynnika wymiany guaniny Rap1, C3G, jednego ze zidentyfikowanych potencjalnych substratów c-Src, który odgrywa rolę w sygnalizacji ogniskowej adhezji. Oprócz ujawnienia roli c-Src w komórce, a w szczególności w szlaku Crk-C3G-Rap1, wyniki te stanowią przykład strategii uzyskiwania stanowią przykład strategii uzyskiwania kompleksowego zrozumienia funkcji niereceptorowych tyrozyn funkcji niereceptorowych kinaz tyrozynowych o wysokiej specyficzności i rozdzielczości kinetycznej. rozdzielczości kinetycznej. --- Chociaż fosfatazy białkowe są kluczowymi regulatorami transdukcji sygnału, ich komórkowe mechanizmy działania są słabo poznane. Tutaj przeprowadziliśmy badanie proteomiczne na dużą skalę w celu zidentyfikowania celów białek komórkowych fosfatazy serynowo-treoninowej. Użyliśmy ilościowego MS opartego na SILAC do pomiaru różnic w ekspresji białek i fosforylacji po ablacji fosfatazy fosfatazy serynowo-treoninowej Ppt1 w Saccharomyces cerevisiae. Fosfopeptyd frakcjonowanie za pomocą silnej chromatografii kationowymiennej w połączeniu z unieruchomioną chromatografią powinowactwa do metalu chromatografią powinowactwa do metalu (IMAC) umożliwiło kwantyfikację ponad ponad 8000 różnych miejsc fosforylacji w Ppt1 typu dzikiego w porównaniu z komórkami drożdży z niedoborem Ppt1 komórkach drożdży. Następnie określiliśmy ilościowo względną ekspresję 1897 białek drożdży białek drożdży i nie wykryliśmy większych zmian białkowych towarzyszących niedoborowi Ppt1. W szczególności znaleźliśmy 33 miejsca fosforylacji, które były znacząco i powtarzalnie regulowane w górę, podczas gdy żadne zdarzenia fosforylacji nie były tłumione w komórkach pozbawionych Ppt1. Ppt1 działał na swoje komórkowe białka docelowe w sposób sekwencyjny i i specyficzny dla miejsca. Kilka z regulowanych fosfoprotein było zaangażowanych w w odpowiedzi na stres cieplny, zgodnie ze znanymi funkcjami Ppt1. Dodatkowo, enzymy biosyntetyczne były szczególnie widoczne wśród fosfoprotein regulowanych przez Ppt1. fosfoprotein regulowanych przez Ppt1, wskazując na niedocenianą rolę Ppt1 w kontroli różnych funkcji metabolicznych. kontroli różnych funkcji metabolicznych. Wyniki te pokazują użyteczność wielkoskalowej i ilościowej fosfoproteomiki do identyfikacji komórkowych miejsc fosfatazy serynowo-treoninowej w sposób bezstronny.
Pojawiają się globalne ilościowe analizy fosfoproteomiczne. Wymień preferowane technologie wzbogacania fosforylowanych peptydów?
Istnieje wiele różnych metod wzbogacania w fosforylowane peptydy: dwutlenek tytanu, IMAC, prosta derywatyzacja za pomocą chemii fosforoamidów i przeciwciał.