Wirus dengi typu 2 (DEN2), należący do rodziny Flaviviridae, jest powracającym ludzkim patogenem o globalnym znaczeniu. Białko niestrukturalne DEN2 3 (NS3) ma domenę proteazy serynowej (NS3-pro) i wymaga domeny hydrofilowej domeny hydrofilowej NS2B (NS2BH) do aktywacji. NS3 jest również stymulowaną przez RNA trifosfatazą nukleozydową (NTP). trifosfatazą nukleozydową (NTPazą)/helikazą RNA i trifosfatazą 5'-RNA (RTPazą). W W tym badaniu przedstawiono pierwsze właściwości biochemiczne i kinetyczne pełnej długości NS3 (NS3FL) przedstawiono NTPazę, RTPazę i helikazę RNA. NS3FL wykazał zwiększoną aktywność helikazy RNA w porównaniu z NS3-pro-minus NS3, która została dodatkowo wzmocniona przez obecność NS2BH (NS2BH-NS3FL). Aktywna aktywna triada katalityczna proteazy nie jest wymagana do efektu stymulującego, co sugeruje że ogólne fałdowanie N-końcowej domeny proteazy przyczynia się do tego wzmocnienie. W komórkach ssaków zakażonych DEN2, NS3 i NS5, wirusowe 5'-RNA wirusowa metylotransferaza/polimeraza, istnieją jako kompleks. Dlatego wpływ NS5 na aktywność NTPazy NS3. Wyniki pokazują, że NS5 stymulował aktywność NTPazy i RTPazy NS3. Stymulacja NS5 NTPazy NS3 była zależna od dawki, aż do osiągnięcia stosunku równowagowego. Ponadto, konserwowany motyw motyw, 184RKRK, NS3 odgrywał kluczową rolę w wiązaniu się z substratem RNA i modulowaniu aktywności NTPazy/RNA helikazy i RTPazy NS3. --- NS3 pestiwirusów zawiera domenę proteazy i domenę helikazy/NTPazy RNA. Zgłoszono sprzeczne wyniki dotyczące NS3 w syntezie RNA. Aby zbadać wpływ NS3 na klasyczny wirus pomoru świń (CSFV) NS5B Aktywność polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp) i interakcja NS3-NS5B, Reakcje RdRp, testy ściągania GST i analizy koimmunoprecypitacji zawierające NS5B i jedno z białek NS3 oraz różne skrócone mutanty NS3 przeprowadzono odpowiednio. Stwierdziliśmy, że NS3 stymulował aktywność NS5B RdRp w sposób zależny od dawki, wiążąc się z NS5 poprzez domenę proteazy NS3 domenę proteazy NS3. Ponadto, mapowanie ważnych regionów domeny proteazy NS3 zostało przeprowadzono przez mutagenezę delecyjną, związaną z reakcjami RdRp, GST i analizami koimmunoprecypitacji. Wyniki wykazały, że stymulację aktywności CSFV NS5B RdRp uzyskano poprzez wiązanie NS3 do NS5B poprzez 31-aminokwasowy fragment na N-końcu domeny proteazy NS3, który pośredniczył w specyficznej interakcji NS3-NS5B. --- Replikacja RNA wirusa dengi (DENV) wymaga co najmniej dwóch wirusowych białek białek niestrukturalnych (NS), NS3 i NS5. Aby ułatwić badanie kompleksu replikacyjnego DENV replikacji DENV, ludzkie monoklonalne IgG, które są specyficzne dla białek NS zostały wygenerowane i scharakteryzowane. IgG anty-NS3, 3F8, wiąże konserwowany epitop epitop (aa526-531) w domenie helikazy NS3 i reaguje krzyżowo z NS3 ze wszystkich czterech serotypów DENV. wszystkich czterech serotypów DENV i pokrewnym wirusem żółtej gorączki. IgG anty-NS2B, 3F10, wiąże aa49-66 NS2B (CF18), który stanowi część 47 aa hydrofilowego regionu kofaktora wymaganego dla NS3. wymaganego dla aktywności proteazy NS3. Specyficzność IgG dla ich odpowiednich białek niestrukturalnych została wykazana przez immunofluorescencję komórek zakażonych DENV i Western blotting. 3F8 jest w stanie do koimmunoprecypitacji NS3 i NS5 z komórek BHK-21 zakażonych DENV2, a 3F10 jest w stanie wykryć interakcję między rekombinowanym białkiem NS2B(CF18)NS3 i domeną NS5 polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp) w teście wiązania opartym na Test wiązania oparty na ELISA. Test jest specyficzny i wysoce powtarzalny, z wyraźną krzywą wiązania wyraźną krzywą wiązania, gdy RdRp jest inkubowany ze zwiększającymi się ilościami pełnej długości NS3, ale nie z domeną proteazy NS3. Domena helikazy NS3 konkuruje z pełną długością NS3 o wiązanie NS5 RdRp, z K(d.) wynoszącym 2,5 μM. Ponieważ NS3 i NS5 są wymagane do replikacji DENV, ten test fascile może być użyty do badania nienukleozydowych, allosterycznych inhibitorów, które zakłócają interakcję między tymi dwoma białkami. --- Flawiwirusy to wirusy otoczkowe z jednoniciowym, pozytywnym genomem RNA o długości 10,7 kb. RNA. Genomowy RNA, który ma czapeczkę 5', ale nie ma ogona poli(A), jest tłumaczony jako pojedyncze polibiałko, które jest następnie rozszczepiane na trzy białka strukturalne i siedem białek niestrukturalnych. strukturalne i siedem białek niestrukturalnych (NS) przez proteazy wirusa i gospodarza. proteazy. Białka NS obejmują polimerazę RNA zależną od RNA (NS5), helikazę/proteazę helikazę/proteazę (NS3) i inne białka, które stanowią część kompleksu replikacyjnego wirusa. kompleksu replikacyjnego wirusa. Sekwencje i struktury w 5' i 3' regionach nieulegających translacji (UTR) regionach (UTR) i genie kapsydu, w tym sekwencjach cyklizacji, regionie upstream AUG i końcowej pętli macierzystej 3', regulują translację, syntezę RNA i replikację wirusa. Odkryliśmy również, że struktura spinki do włosów RNA w regionie kodującym w regionie kodującym kapsydu (cHP) wpływa na wybór kodonu startowego i replikację wirusa replikację flawiwirusa dengi (DENV). Sprzężone z peptydem oligomery morfolino-fosforodiamidowe (P-PMO) zostały wykorzystane do dalszej analizy rolę konserwatywnych regionów 5' i 3' UTR; wykazano, że kilka P-PMO specyficznie hamują translację DENV i/lub syntezę RNA, a zatem są potencjalnie użyteczne jako środki przeciwwirusowe. Jeśli chodzi o mechanizm translacji DENV wykazaliśmy, że DENV przechodzi kanoniczną inicjację translacji zależną od czapeczki inicjacji translacji, jak również mechanizm niekanoniczny, gdy translacja zależna od czapeczki jest tłumiona. translacja jest tłumiona. Chociaż wiele pozostaje do wyjaśnienia na temat biologii molekularnej biologii molekularnej infekcji flawiwirusami, poczyniono postępy w kierunku cis i trans, które regulują translację i replikację flawiwirusów. replikację. --- Wpływ biogennych poliamin: sperminy, spermidyny i putrescyny oraz ich pochodnych na enzymy replikacyjne wirusa zapalenia wątroby (HCV) a także ich pochodnych na enzymy replikacyjne wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) . Stwierdzono, że spermina i spermidyna aktywują polimerazę RNA zależną od HCV polimerazę RNA zależną od RNA HCV (białko NS5B). Efekt ten nie był spowodowany przez stabilizacją enzymu lub konkurencją z kompleksem szablon-primer, ale raczej był raczej spowodowany osiągnięciem rzeczywistej maksymalnej prędkości V(max). Naturalne poliaminy i ich pochodne skutecznie hamowały reakcję helikazy katalizowaną przez inny enzym replikacji HCV - helikazę/NTPazę (białko NS3). Związki te nie wpływały jednak ani na reakcję NTPazy, ani na jej aktywację przez polinukleotydy. Aktywacja polimerazy RNA HCV i hamowanie helikazy wirusowej helikazy wirusowej wykazano przy fizjologicznych stężeniach poliamin. Dane te sugerują, że biogenne poliaminy mogą powodować różnie ukierunkowane wpływ na replikację genomu HCV w zakażonej komórce. --- Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) zakaża ponad 170 milionów osób na całym świecie. Jest to główną przyczyną chorób wątroby w USA i jest odpowiedzialny za większość przeszczepów wątroby. przeszczepów wątroby. Obecne metody leczenia tej choroby zakaźnej są niewystarczające; dlatego konieczne jest opracowanie nowych terapii. Kilka laboratoriów uzyskało dowody dla kompleksu białkowego, który obejmuje wiele białek niestrukturalnych (NS) kodowanych przez wirusa. NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B wydają się oddziaływać ze sobą strukturalnie i funkcjonalnie. strukturalnie i funkcjonalnie. W tym badaniu zbadaliśmy interakcję między helikazą NS3 a polimerazą RNA NS5B. Eksperymenty pull-down i dane rezonansu plazmonów powierzchniowych wskazują na bezpośrednią interakcję między NS3 i NS5B, w której pośredniczy przede wszystkim domena proteazy NS3. Ta interakcja zmniejsza podstawową aktywność ATPazy NS3. Jednak NS5B stymuluje w eksperymentach odwijania RNA w warunkach nadmiaru substratu kwasu nukleinowego. substratu kwasu nukleinowego. Gdy stężenia NS3 i NS5B są większe niż substratu kwasu nukleinowego, NS5B zmniejsza szybkość odwijania katalizowanego przez NS3. W warunkach warunkach stanu ustalonego, w których stężenia NS3 i substratu są podobne, tworzenie produktu wzrastało w obecności NS5B. Wzrost ten był zgodny z kompleksem 1:1 utworzonym między dwoma białkami. Znakowana fluorescencyjnie znakowana fluorescencyjnie forma NS3 została wykorzystana do zbadania tej interakcji poprzez testy wiązania polaryzacji fluorescencyjnej. Wyniki tego testu potwierdzają interakcje, które obejmują kompleks 1:1 utworzony między NS3 i NS5B. The modulacja NS3 przez NS5B sugeruje, że białka te mogą funkcjonować razem podczas replikacji genomu HCV. --- Ostatecznym celem leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV) jest eradykacja wirusa. wirusa. Trwające badania nadal poszerzają wiedzę na temat cyklu życia HCV, ujawniając nowe potencjalne cele wirusowe i gospodarza dla rozwoju terapii. Zrozumienie HCV było początkowo utrudnione przez niemożność osiągnięcia replikacji wirusa w hodowli komórkowej. replikacji wirusa w hodowli komórkowej. Postępy takie jak replikon HCV i kompletne systemy hodowli komórkowej i kompletne systemy hodowli komórkowej pozwoliły jednak na szybki wzrost wiedzy i przyspieszone testowanie potencjalnych leków przeciwwirusowych. Wśród potencjalnych celów znajdują się czynniki wejścia wirusa, w tym receptor zmiatacza typu B1 (SR-B1) i CD81, a także przeciwciała neutralizujące a także przeciwciała neutralizujące przeciwko glikoproteinom wirusowym. Popularne cele związane z translacją i replikacją to proteaza NS3/4A (hamowana przez przez telaprewir i boceprewir) i polimeraza NS5B, jak również autoproteaza NS2/3 NS2/3, helikaza NS3 i cele nieenzymatyczne, takie jak białka NS4B i NS5A białka. Dostępne są również cele gospodarza, w tym mikroRNA i cyklofiliny. Niniejszy artykuł podsumowuje prezentację dr Charlesa M. Rice'a podczas IAS-USA kursie ustawicznego kształcenia medycznego na żywo, Zarządzanie wirusem zapalenia wątroby typu C w New Era: Small Molecules Bring Big Changes, który odbył się w Nowym Jorku w kwietniu 2011 roku. --- Produkcja wysokiej jakości, dobrze scharakteryzowanych białek rekombinowanych ułatwia badania przesiewowe bibliotek związków. Protokoły opisane w tym rozdziale są wykorzystywane do oczyszczania trzech rekombinowanych enzymów, które są szeroko stosowane w badaniach nad HCV: domeny proteazy HCV HCV: domeny proteazy NS3, domeny helikazy jako kompleksu NS3+NS4A oraz domeny NS5B polimerazę RNA zależną od RNA. Aktywne enzymy są oczyszczane do jednorodności przez chromatografii dwukolumnowej w celu wsparcia programu badań przesiewowych inhibitorów HCV. --- W ciągu ostatnich lat poczyniono ogromne postępy w wyjaśnianiu struktury i funkcji białek wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), z których większość jest obecnie aktywnie poszukiwane jako cele przeciwwirusowe. Białka strukturalne, które tworzą cząsteczkę wirusa, obejmują białko rdzeniowe i glikoproteiny otoczkowe E1 i E2. i E2. Białka niestrukturalne obejmują wiroporinę p7, proteazę NS2, kompleks NS3-4A posiadający aktywność proteazy i NTPazy/helikazy RNA, białka NS4B i NS5A oraz polimerazę RNA zależną od RNA NS5B. NS4B jest głównym organizatorem tworzenia kompleksu replikacyjnego, podczas gdy NS5A jest zawierającą cynk fosfoproteiną zaangażowaną w regulację replikacji HCV RNA a produkcją cząstek. Rdzeń do NS2 tworzą moduł montażowy, podczas gdy NS3 do NS5B reprezentują moduł replikacyjny (replikazy). Jednak białka HCV pełnią wiele funkcji podczas cyklu życiowego wirusa, a te mogą być regulowane przez różne konformacje strukturalne i / lub interakcje z wirusem i / lub partnerami komórkowymi. Co ciekawe, każde białko wirusowe jest zakotwiczone w błonie wewnątrzkomórkowej błon wewnątrzkomórkowych poprzez specyficzne determinanty, które są niezbędne do funkcjonowania białka w komórce. komórce. Niniejszy przegląd podsumowuje aktualną wiedzę na temat struktury i funkcji białek białek HCV i podkreśla ostatnie postępy w tej dziedzinie.
Czy istnieje jakikolwiek funkcjonalny związek podczas replikacji wirusa między wirusową polimerazą RNA zależną od RNA a wirusową helikazą?
Kilka laboratoriów uzyskało dowody na istnienie kompleksu białkowego, który obejmuje wiele białek niestrukturalnych (NS) kodowanych przez wirusa. NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B wydają się oddziaływać strukturalnie i funkcjonalnie. Interakcja między helikazą NS3 i polimerazą RNA NS5B odgrywa kluczową rolę w replikacji wirusa. Eksperymenty pull-down i dane rezonansu plazmonów powierzchniowych wskazują na bezpośrednią interakcję między NS3 i NS5B, w której pośredniczy przede wszystkim domena proteazy NS3. Interakcja ta zmniejsza podstawową aktywność ATPazy NS3. Jednak NS5B stymuluje tworzenie produktu w eksperymentach odwijania RNA w warunkach nadmiaru substratu kwasu nukleinowego. Gdy stężenia NS3 i NS5B przekraczają stężenie substratu kwasu nukleinowego, NS5B zmniejsza szybkość odwijania katalizowanego przez NS3. W warunkach stanu ustalonego, w których stężenia NS3 i substratu są podobne, tworzenie produktu wzrastało w obecności NS5B. Wzrost ten był zgodny z kompleksem 1:1 utworzonym między dwoma białkami.