Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) jest potężnym narzędziem do profilowania transkryptomu, ale jest utrudnione przez zależne od sekwencji odchylenie i niedokładność przy niskich liczbach kopii nieodłącznych z wykładniczą amplifikacją PCR. Opracowaliśmy prostą strategię łagodzenia te komplikacje, umożliwiając prawdziwie cyfrowy RNA-Seq. Po odwrotnej odwrotnej transkrypcji, duży zestaw sekwencji kodów kreskowych jest dodawany w nadmiarze, a prawie a prawie każda cząsteczka cDNA jest unikalnie znakowana przez losowe dołączenie sekwencji kodu kreskowego do obu końców. Po PCR zastosowaliśmy głębokie sekwencjonowanie typu paired-end, aby odczytać dwóch kodów kreskowych i sekwencji cDNA. Zamiast liczyć liczbę odczytów, Obfitość RNA jest mierzona na podstawie liczby unikalnych sekwencji kodów kreskowych zaobserwowanych dla danej sekwencji cDNA. Zoptymalizowaliśmy kody kreskowe, aby były jednoznacznie identyfikowalne, nawet w obecności wielu błędów sekwencjonowania. Metoda ta umożliwia zliczanie z rozdzielczością pojedynczej kopii pomimo stronniczości zależnej od sekwencji i szumu amplifikacji PCR i jest analogiczna do cyfrowego PCR, ale nadaje się do kwantyfikacji całego transkryptomu. Zademonstrowaliśmy profilowanie transkryptomu Escherichia coli z dokładniejszym i bardziej powtarzalnym kwantyfikacji niż konwencjonalne RNA-Seq. --- TŁO: Konie pełnej krwi angielskiej są najdroższymi zwierzętami domowymi. a ich zdolność do biegania i wiedza na temat chorób związanych z mięśniami są ważne w genetyce zwierząt. Podczas gdy genom referencyjny konia jest dostępny, nie przeprowadzono funkcjonalnej adnotacji genomu na dużą skalę przy użyciu wyrażonych genów pochodzących z transkryptomów. WYNIKI: Przedstawiamy analizę całego transkryptomu na dużą skalę. My sekwencjonowaliśmy całe mRNA z krwi i tkanek mięśniowych sześciu koni pełnej krwi koni pełnej krwi przed i po wysiłku. Porównując aktualne adnotacje genomu, zidentyfikowaliśmy zidentyfikowaliśmy 32 361 klastrów unigenów obejmujących 51,83 Mb, które zawierały 11 933 (36,87%) genów z adnotacjami. Ponad 60% (20 428) klastrów unigenów nie pasowało do żadnego pasowało do żadnego z aktualnych modeli genów koni. Zidentyfikowaliśmy również 189 973 pojedynczych nukleotydów (SNV) z sekwencji dopasowanych do genomu referencyjnego konia z genomem referencyjnym konia. Większość SNV (171 558 SNV; 90,31%) była nowa w porównaniu z ponad 1,1 miliona SNP koni z dwóch baz danych SNP. Wykorzystując analizę analizę ekspresji, zidentyfikowaliśmy szereg genów regulowanych wysiłkiem fizycznym: 62 geny regulowane w górę i 80 regulowanych w dół we krwi oraz 878 regulowanych w górę i 285 genów regulowanych w dół w mięśniach. Sześć z 28 wcześniej znanych genów związanych z wysiłkiem fizycznym uległo nadmiernej ekspresji w mięśniach po wysiłku. Wśród różnie wyrażonych genów, było 91 genów kodujących czynniki transkrypcyjne które obejmowały 56 funkcjonalnie nieznanych kandydatów na czynniki transkrypcyjne które są prawdopodobnie związane z wczesnym mechanizmem regulacyjnym ćwiczeń. Ponadto Ponadto znaleźliśmy interesujące wzorce ekspresji RNA, w których różne alternatywne formy splicingu tego samego genu wykazywały odwróconą ekspresję przed i po ćwiczeniach. WNIOSKI: Pierwsze dane transkryptomu koni oparte na sekwencjonowaniu, obszerne analizy wyniki analiz, geny ulegające ekspresji przed i po ćwiczeniach oraz geny kandydujące, które są związane z ćwiczeniami. --- Profile ekspresji RNA wytwarzane za pomocą technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) (RNA-seq) umożliwiają kompleksowe badanie sekwencji transkrybowanych w komórce lub tkance. sekwencji transkrybowanych w komórce lub tkance. RNA-seq szybko staje się coraz bardziej opłacalne dla profilowania transkryptomu. profilowania transkryptomu. Jednak jego zastosowanie znacznie wzrośnie, jeśli ktoś zaczyna się od małej ilości RNA i uzyskuje kierunkowość transkryptu podczas analizy. analizy. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół tworzenia kierunkowej biblioteki RNA-seq z kierunkowej biblioteki RNA-seq ze 100 ng wyjściowego całkowitego RNA. --- Zasadniczym pytaniem w biologii człowieka jest to, w jaki sposób komórki i tkanki różnią się pod względem ekspresji genów i białek i ekspresji białek oraz w jaki sposób różnice te określają specyficzne funkcje biologiczne. funkcję biologiczną. Tutaj przeprowadziliśmy globalną analizę zarówno poziomów mRNA, jak i białek w oparciu o analizę transkryptomu opartą na sekwencji (RNA-seq), analizę spektrometrii mas opartą na SILAC analizę spektrometrii mas i mikroskopię konfokalną opartą na przeciwciałach. Badanie zostało przeprowadzono na trzech funkcjonalnie różnych ludzkich liniach komórkowych i na podstawie globalnej analizie oszacowaliśmy frakcje mRNA i białek, które są specyficzne dla komórek specyficzne dla komórek lub wyrażane na podobnych/różnych poziomach w liniach komórkowych. Wysoce Wszechobecna ekspresja RNA została znaleziona z >60% produktów genowych wykrytych we wszystkich komórkach. wszystkich komórkach. Zmiany poziomów mRNA i białka w liniach komórkowych przy użyciu SILAC i RNA wykazują wysokie korelacje, nawet jeśli zakres dynamiczny w całym genomie jest znacznie wyższy dla białek w porównaniu z transkryptami. Duże ogólne różnice w obfitości białek z różnych klas funkcjonalnych i, ogólnie rzecz biorąc, białka specyficzne dla typu komórki są mało obfite i wysoce wzbogacone o białka powierzchniowe. Tak więc, badanie to pokazuje ścieżkę do scharakteryzować transkryptom i proteom w ludzkich komórkach różnego pochodzenia. pochodzenia. --- Gwałtowny wzrost ilości i jakości danych RNA-Seq wymaga rozwoju zaawansowanych, wysokowydajnych narzędzi bioinformatycznych zdolnych do szybko przekształcić te dane w znaczące informacje, które są łatwo łatwe do interpretacji przez biologów. Obecnie dostępne narzędzia analityczne często nie są łatwe do zainstalowania przez zwykłego biologa, a większość z nich nie posiada nieodłącznej przetwarzania równoległego, powszechnie uznawanego za podstawową cechę bioinformatyki nowej generacji. narzędzi bioinformatycznych nowej generacji. Przedstawiamy tutaj przyjazny dla użytkownika i w pełni w pełni zautomatyzowany potok analizy RNA-Seq (R-SAP) z wbudowaną wielowątkowością do analizy i kwantyfikacji wysokoprzepustowych zestawów danych RNA-Seq. R-SAP stosuje hierarchiczną procedurę podejmowania decyzji w celu dokładnego scharakteryzowania różnych klas transkryptów i osiąga niemal liniowy spadek czasu przetwarzania danych w wyniku zwiększonej wielowątkowości. czas przetwarzania danych w wyniku zwiększonej wielowątkowości. Ponadto, oszacowania poziomu ekspresji RNA oszacowania poziomu ekspresji uzyskane przy użyciu R-SAP wykazują wysoką zgodność z poziomami mierzonymi za pomocą mikromacierzy. --- Aby skonstruować mapę regulacyjną genomu ludzkiego patogenu, Mycobacterium tuberculosis, zastosowaliśmy dwa uzupełniające się podejścia o wysokiej rozdzielczości: RNA-seq specyficzne dla nici, aby zbadać globalny transkryptom, oraz ChIP-seq, aby monitorowania dynamiki polimerazy RNA (RNAP) i antyterminatora NusA w całym genomie. antyterminatora NusA. Chociaż NusA nie wiąże się bezpośrednio z DNA, ale raczej z RNAP i/lub do powstającego transkryptu, wykazujemy, że NusA wchodzi w interakcje z RNAP wszechobecnie w całym chromosomie, a jego profil odzwierciedla rozkład RNAP zarówno w wykładniczej, jak i stacjonarnej fazie wzrostu. Ogólnie, zaobserwowano proksymalne piki promotora dla RNAP i NusA, a następnie spadek w sile sygnału odzwierciedlającej polaryzację transkrypcji. Różnicowe wiązanie RNAP i NusA w dwóch warunkach wzrostu korelowało z aktywnością transkrypcyjną aktywnością transkrypcyjną odzwierciedloną przez obfitość RNA. Rzeczywiście, znaczący związek między poziomami ekspresji a obecnością NusA w całym ciele genu. potwierdzając szczególną rolę NusA w promowaniu transkrypcji. Integracja zestawów danych wskazała jednostki transkrypcyjne, zmapowała promotory i odkryła nowe antysensowne i niekodujące transkrypty. Jednostki transkrypcyjne o wysokiej ekspresji jednostki transkrypcyjne znajdowały się głównie na nici wiodącej, pomimo stosunkowo bezstronnej dystrybucji genów w całym genomie, pomagając w ten sposób kompleksy replikacyjne i transkrypcyjne. --- Targeted RNA-Seq łączy sekwencjonowanie następnej generacji z przechwytywaniem sekwencji z odpowiedniego podzbioru transkryptomu. z odpowiedniego podzbioru transkryptomu. Podczas testowania przez przechwytywanie sekwencji z biblioteki cDNA guza poprzez hybrydyzację z sondami oligonukleotydowymi specyficznymi dla dla 467 genów związanych z rakiem, metoda ta wykazała wysoką selektywność, ulepszone wykrywanie mutacji, umożliwiając odkrycie nowych transkryptów chimerycznych, oraz dostarczyła danych dotyczących ekspresji RNA. Tak więc, ukierunkowane RNA-Seq daje lepszy obraz stanu molekularnego stanu molekularnego zestawu genów "wysokiego zainteresowania". --- Streszczenie Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe nowej generacji (NGS) jest gotowe do zastąpienia jako eksperyment z wyboru do pomiaru poziomów ekspresji RNA poziomów ekspresji. Kilka grup zademonstrowało moc tego nowego podejścia podejście (RNA-seq), wnosząc znaczący i nowatorski wkład oraz jednocześnie proponując metodologie analizy danych RNA-seq. W W typowym eksperymencie miliony krótkich sekwencji (odczytów) są pobierane z ekstraktów RNA i mapowane z powrotem do genomu referencyjnego. Liczba odczytów mapowanych do każdego genu jest wykorzystywana jako wskaźnik odpowiadającego mu stężenia RNA. A Znaczącym wyzwaniem w analizie ekspresji RNA homologicznych genów jest duża część odczytów, które mapują się do wielu lokalizacji w genomie referencyjnym. genomie referencyjnym. Obecnie odczyty te są albo usuwane z analizy, albo do ich oszacowania stosuje się naiwny algorytm. algorytm jest używany do oszacowania ich rozkładu. W tej pracy przedstawiamy rygorystyczną alternatywę dla obsługi odczytów generowanych w eksperymencie RNA-seq w ramach modelu probabilistycznego dla danych RNA-seq; opracowujemy metody oparte na maksymalnej maksymalnego prawdopodobieństwa do szacowania parametrów modelu. W przeciwieństwie do metod, nasz model uwzględnia fakt, że DNA sekwencjonowanego osobnika nie jest idealną kopią. nie jest idealną kopią sekwencji referencyjnej. Pokazujemy zarówno na symulowanych, jak i rzeczywistych danych RNA-seq, że nasza nowa metoda poprawia dokładność i moc eksperymentów RNA-seq. --- Pomiary obfitości RNA są ważne dla wielu obszarów biologii i często uzyskiwane z wysokoprzepustowych metod sekwencjonowania RNA, takich jak sekwencja Illumina Illumina. Miary te muszą być znormalizowane w celu usunięcia błędów technicznych nieodłącznie związanych z metodą sekwencjonowania. w podejściu do sekwencjonowania, w szczególności długość gatunku RNA i głębokość sekwencjonowania próbki. głębokość sekwencjonowania próbki. Odchylenia te są korygowane w powszechnie stosowanym wskaźniku odczytów na kilobazę na milion odczytów (RPKM). Tutaj argumentujemy, że zamierzone znaczenie RPKM jest miarą względnego molowego stężenia RNA (rmc) i pokazujemy, że dla każdego zestawu transkryptów średnia rmc jest stała, a mianowicie odwrotnością liczby zmapowanych transkryptów. Ponadto pokazujemy, że RPKM nie nie przestrzega tej właściwości niezmienności, a zatem nie może być dokładną miarą rmc. Proponujemy niewielką modyfikację RPKM, która eliminuje tę niespójność i nazywamy ją TPM dla transkryptów na milion. TPM respektuje średnią niezmienność i eliminuje błędy statystyczne nieodłącznie związane z miarą RPKM.
Jaka jest popularna struktura ekspresji genów w eksperymentach RNA-seq?
Powszechnie stosowaną miarą ekspresji genów w eksperymentach RNA-seq jest liczba odczytów na kilobazę na milion zmapowanych odczytów (RPKM). W niektórych przypadkach, w celu uwzględnienia częściowo zmapowanych odczytów, alternatywnie stosuje się Fragmenty na Kilobazę na Milion zmapowanych odczytów (FPKM).