Wykorzystanie syntetycznych niekodujących RNA do potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów ekspresji genów stało się nie tylko standardowym narzędziem laboratoryjnym do badań funkcjonalnych genów ale także otworzyło nowe perspektywy w projektowaniu nowych i potencjalnie obiecujących strategii terapeutycznych. potencjalnie obiecujących strategii terapeutycznych. Bioinformatyka dostarczyła naukowcom różnorodne narzędzia do projektowania, analizy i oceny środków RNAi, takich jak oceny środków RNAi, takich jak RNA o małej interferencji (siRNA), RNA o krótkich spinach RNA (shRNA), sztuczne mikroRNA (a-miR) i gąbki mikroRNA. Niedawno opracowano nowy system inżynierii genomu oparty na bakteryjnym systemie CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), wykazano, że ma on potencjał potencjał do regulacji ekspresji genów zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i posttranskrypcyjnym. poziomie transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym w bardziej specyficzny sposób. W tym mini przeglądzie przedstawiamy zasady projektowania RNAi i CRISPRi oraz omawiamy ich zalety i ograniczenia. i ograniczenia obecnych podejść projektowych. --- Proliferacja komórek T ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi immunologicznej; jednak molekularne mechanizmy pośredniczące w odpowiedzi proliferacyjnej są słabo poznane. mechanizmy, które pośredniczą w odpowiedzi proliferacyjnej są słabo poznane. MikroRNA (miR) regulują różne procesy molekularne, w tym rozwój i funkcjonowanie układu odpornościowego. funkcjonowanie układu odpornościowego. Tutaj, wykorzystując wiele uzupełniających się podejść genetycznych i podejścia molekularne, zbadaliśmy udział specyficznego dla układu krwiotwórczego specyficznego dla układu krwiotwórczego miR, miR-142, w regulacji odpowiedzi komórek T. Rozwój komórek T nie miał wpływu na zwierzęta z ukierunkowaną delecją Mir142; jednak proliferacja komórek T była znacznie zmniejszona po stymulacji zarówno in in vitro, jak i w wielu mysich modelach choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD). Komórki T z niedoborem miR-142 wykazywały znaczne wady cyklu komórkowego, a a analizy mikromacierzy i bioinformatyczne ujawniły regulację w górę genów zaangażowanych w w cyklu komórkowym. Co więcej, 2 przewidywane geny docelowe miR-142, nietypowe czynniki transkrypcyjne E2F czynniki transkrypcyjne E2f7 i E2f8, były najsilniej regulowane w komórkach pozbawionych komórkach z niedoborem miR-142. Klastry regularnie przeplatanych krótkich palindromowych powtórzeń (CRISPRi) wyciszanie E2F7 i E2F8 w komórkach T z niedoborem miR-142 komórek T z niedoborem miR-142 złagodziło defekty cyklu komórkowego i zmniejszyło GVHD, a nadekspresja tych czynników w komórkach T WT hamowała odpowiedź proliferacyjną. odpowiedź proliferacyjną. Łącznie wyniki te identyfikują związek między specyficznym dla układu krwiotwórczego miR-142 i nietypowymi czynnikami transkrypcyjnymi E2F w regulacji cyklu dojrzałych komórek T i sugerują, że ukierunkowanie tej interakcji może być istotne dla łagodzenia GVHD. --- Specyficzna dla sekwencji kontrola ekspresji genów w skali całego genomu jest ważne podejście do zrozumienia funkcji genów i inżynierii genetycznej systemów regulacyjnych. Niedawno opisaliśmy metodę opartą na RNA, interferencję CRISPR (CRISPRi) do ukierunkowanego wyciszania transkrypcji w bakteriach i ludzkich komórkach. ludzkich komórkach. System CRISPRi wywodzi się z bakterii Streptococcus pyogenes CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats), wymagając jedynie koekspresji katalizatora. wymaga jedynie koekspresji katalitycznie nieaktywnego białka Cas9 i pojedynczego RNA (sgRNA). Kompleks Cas9-sgRNA wiąże się z elementami DNA elementy komplementarne do sgRNA i powoduje blokadę steryczną, która zatrzymuje elongację transkryptu przez polimerazę RNA, co skutkuje represją docelowego genu. Tutaj przedstawiamy protokół projektowania, budowy i ekspresji sgRNA. ekspresji niestandardowych sgRNA do represji transkrypcji dowolnego genu interesującego. Przedstawiamy również szczegóły dotyczące testowania aktywności represyjnej CRISPRi przy użyciu ilościowych testów fluorescencyjnych i natywnego sekwencjonowania wydłużających się transkryptów. sekwencjonowania. CRISPRi zapewnia uproszczone podejście do szybkiej represji genów w ciągu 1-2 tygodni. Metoda ta może być również dostosowana do wysokoprzepustowego badania funkcji genów w całym genomie i interakcji genetycznych, zapewniając w ten sposób komplementarne podejście do zapewniając komplementarne podejście do interferencji RNA, która może być stosowana w szerszej gamie organizmów.
Czym jest CRISPRi?
Interferencja regularnie przeplatanych powtórzeń palindromicznych (CRISPRi). To narzędzie jest wykorzystywane do badań genetycznych opartych na fenotypach utraty funkcji.