Polimeraza poli(ADP-rybozy-1) (PARP-1) jest aktywowana przez pęknięcia nici DNA podczas komórkowej odpowiedzi na stres genotoksyczny. komórkowej odpowiedzi na stres genotoksyczny i katalizuje poli(ADP-rybozylo)atację białek akceptorowych. Te białka akceptorowe obejmują te zaangażowane w modulację struktury chromatyny, syntezy DNA, naprawy DNA, transkrypcji i kontroli cyklu komórkowego. kontrolę cyklu komórkowego. W związku z tym uważa się, że PARP-1 odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności genomu poprzez modulację interakcji białko-białko i białko-DNA. My wcześniej opisaliśmy związek PARP-1 z normalnymi centromerami ssaków i ludzkimi neocentromerami poprzez oczyszczanie powinowactwa i immunofluorescencję. Tutaj zbadaliśmy interakcję tego białka z i poli(ADP-rybozylo)atację trzech konstytutywnych białek centromerowych, Cenpa, Cenpb i Cenpc oraz białka punktu kontrolnego wrzeciona białko punktu kontrolnego wrzeciona, Bub3. Immunoprecypitacja i analizy Western blot wykazują, że Cenpa, Cenpb i Bub3, ale nie Cenpc, oddziałują z PARP-1, i są poli(ADP-rybozyl)atowane po indukcji uszkodzenia DNA. Wyniki sugerują rolę PARP-1 w montażu / demontażu centromerów i kontroli punktu kontrolnego kontroli. Wykazanie wiązania PARP-1 i poli(ADP-rybozyl)atacji w trzech z czterech badanych białek z czterech testowanych białek sugeruje, że wiele innych białek centromerowych może zachowywać się podobnie i sugeruje, że PARP-1 jest ważnym regulatorem różnych funkcji centromeru. funkcji centromeru. --- Polimeraza poli(ADP-rybozy) 2 (PARP-2) jest nowo odkrytym członkiem rodziny PARP PARP. Opisujemy związek PARP-2 z centromerami ssaków w sposób w sposób zależny od cyklu komórkowego, gromadząc się w centromerach podczas prometafazy i metafazy, dysocjując podczas anafazy i znikając z centromerów przez telofazę. Analiza pseudodicentrycznego chromosomu i ludzkiego neocentromeru wskazuje, że wiązanie PARP-2 występuje tylko w aktywnych centromerach w sposób sposób niezależny od sekwencji. Wiązanie centromerowe osiąga szczyt w zewnętrznym regionie centromeru region i jest znacznie wzmocniony po leczeniu lekami hamującymi mikrotubule leki. Test koimmunoprecypitacji wykazuje interakcję między PARP-2 i jego funkcjonalnym homologiem PARP-1, konstytutywnymi białkami centromerowymi Cenpa i Cenpb, i białkiem punktu kontrolnego wrzeciona Bub3, ale nie z trzecim konstytutywnym białkiem centromerowym białkiem centromerowym Cenpc. Wyniki te, wraz z naszym poprzednim wykazaniem, że PARP-1 wykazuje identyczny wzór wiązania z Cenpa, Cenpb i Bub3, ale nie Cenpc, i że wszystkie trzy białka ulegają znacznemu poli(ADP-rybozylo)atacji po napromieniowaniu komórek promieniowaniem gamma, wskazują na możliwe PARP-2 i PARP-1 w modulowaniu struktury i funkcji punktu kontrolnego centromeru ssaków. funkcje centromeru ssaków, w szczególności podczas indukowanego promieniowaniem uszkodzenia DNA. --- Dziedziczenie materiału genetycznego wymaga wiernej segregacji chromosomów podczas podziału komórki. Niepowodzenie w tym procesie może prowadzić do aneuploidii zjawisko. Kinetochory to unikalne makromolekularne struktury białkowe centromeru które mocują chromosomy do wrzeciona w celu prawidłowego ruchu i segregacji. A unikalny typ nukleosomów chromatyny centromerowej stanowi podstawę dla tworzenia kinetochoru. Specyficzny wariant histonu H3, CENPA, zastępuje konwencjonalny histon H3 i wraz z centromerowymi czynnikami wiążącymi DNA kieruje montażem aktywnych kinetochorów. Ostatnie badania nad CENPA struktury nukleosomalnej, epigenetycznego dziedziczenia chromatyny centromerowej i transkrypcji pericentrycznej heterochromatyny dostarczają nowych wskazówek do naszego zrozumienia struktury i funkcji centromerów. Niniejszy przegląd podkreśla rolę i dynamikę montażu CENPA w centromerach oraz potencjalny wkład tego białka kinetochoru w choroby autoimmunologiczne i nowotworowe u ludzi. u ludzi. --- Białko centromerowe A (Cenpa dla myszy, CENP-A dla innych gatunków) jest białkiem podobnym do histonu H3, które uważa się za zaangażowane w pakowanie nukleosomalnego centromerowego DNA. Wykorzystując celowanie genowe, zakłóciliśmy mysi gen Cenpa i wykazaliśmy, że gen ten jest niezbędny. Heterozygotyczne myszy są zdrowe i płodne. płodne, podczas gdy mutanty null nie przeżywają dłużej niż 6,5 dnia po zapłodnieniu. Dotknięte zarodki wykazują poważne problemy mitotyczne, w tym tworzenie mikro- i makrojąder i makrojądra, mostkowanie jądrowe i pękanie oraz fragmentację i hiperkondensację chromatyny. fragmentacja i hiperkondensacja chromatyny. Analiza immunofluorescencyjna komórek interfazowych w dniu 5.5 ujawnia całkowite zubożenie Cenpa, rozproszone ogniska Cenpb, nieobecność dyskretnego sygnału Cenpc na centromerach i rozproszenie Cenpb i Cenpc w całym jądrze. Wyniki te sugerują, że Cenpa jest niezbędna dla kinetochoru Cenpc i odgrywa wczesną rolę w organizowaniu centromerycznej chromatyny w interfazie. chromatyny w interfazie. Dowody są zgodne z propozycją krytycznej funkcji epigenetycznej dla CENP-A w oznaczaniu regionu chromosomalnego dla centromeru. --- Kluczowym elementem definiującym tożsamość centromeru jest przyłączenie specyficznego histonu specyficznego histonu H3, CENPA, znanego jako Cnp1p w Schizosaccharomyces pombe. Poprzednie badania sugerowały, że funkcjonalne centromery S. pombe nie posiadają regularnie ułożonych nukleosomów i mogą obejmować remodeling chromatyny jako kluczowy etap montażu kinetochorów. etap montażu kinetochoru. Użyliśmy mikromacierzy kafelkowych, aby pokazać, że nukleosomy są w rzeczywistości rozmieszczone w regularnych odstępach w rdzeniu centromeru 2, zapewniając pierwszą mapę wysokiej rozdzielczości regionalnej chromatyny centromeru chromatyny. Lokalizacje nukleosomów nie są zakłócane przez mutacje w genach kinetochorów białek kinetochorowych cnp1, mis18, mis12, nuf2, mal2; nadekspresja cnp1; lub delecja ams2, który koduje czynnik podobny do GATA uczestniczący w inkorporacji CENPA inkorporacji. Analiza bioinformatyczna sekwencji centromerowej wskazuje na pewne wzbogacone motywy w regionach łącznikowych między nukleosomami i ujawnia sekwencji w pozycjonowaniu nukleosomów. Ponadto, analiza sekwencji regionów wolnych od nukleosomów identyfikuje nowe miejsca wiązania Ams2p. Wnioskujemy że centromeryczne pozycje nukleosomów są stabilne i mogą pochodzić z sekwencji DNA sekwencji DNA. --- Gen Forkhead box m1 (Foxm1) jest krytyczny dla przejścia G(1)/S i niezbędny dla progresji mitotycznej. dla progresji mitotycznej. Jednak mechanizmy transkrypcyjne poniżej FoxM1, które kontrolują te zdarzenia cyklu komórkowego, pozostają do ustalenia. Tutaj pokazujemy, że zarówno mysie embrionalne fibroblasty (MEF) Foxm1(-)(/)(-) we wczesnym stadium rozwojowym i ludzkie komórki kostniakomięsaka U2OS pozbawione białka FoxM1 przez małe interferujące RNA nie rosną w hodowli z powodu bloku mitotycznego i gromadzą poziomy jądrowe białek inhibitora kinazy zależnej od cyklin (CDKI) p21(Cip1) i p27(Kip1). Stosując ilościową immunoprecypitację chromatyny i testy ekspresji, pokazujemy że FoxM1 jest niezbędny do transkrypcji mitotycznych genów regulatorowych Cdc25B, kinazy Aurora B, surwiwiny, białka centromerowego A (CENPA) i CENPB. My również zidentyfikować mechanizm, za pomocą którego niedobór FoxM1 powoduje podwyższony poziom jądrowy poziomy białek CDKI p21 (Cip1) i p27 (Kip1). Dostarczamy dowodów na to, że FoxM1 jest niezbędny do transkrypcji Skp2 i Cks1, które są specyficznymi podjednostkami podjednostki kompleksu ligazy ubikwityny Skp1-Cullin 1-F-box (SCF), który jest docelowy białka CDKI do degradacji podczas przejścia G(1)/S. Ponadto, wczesne przejście Foxm1 (-) (/) (-) MEF wykazują przedwczesne starzenie się, o czym świadczy wysoka ekspresja beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem, p19 (ARF) i p16(INK4A). Podsumowując, wyniki te pokazują, że FoxM1 reguluje transkrypcję genów cyklu komórkowego krytycznych dla progresji do fazy S i mitozy. --- CENP-A jest niezbędnym białkiem podobnym do histonu H3, które lokalizuje się w centromerowym regionie chromosomów eukariotycznych. regionu chromosomów eukariotycznych. Heterozygotyczne i homozygotyczne mutanty Cenpa-GFP wygenerowane poprzez ukierunkowaną insercję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). białka fluorescencyjnego (GFP) do mysiego locus genu Cenpa, wykazują specyficzną zlokalizowaną fluorescencję we wszystkich centromerach. Heterozygotyczne myszy są zdrowe i płodne. płodne. Homozygoty Cenpa-GFP (Cenpag/g) przechodzą wiele podziałów komórkowych, dając do miliona komórek, które wykazują stosunkowo dokładne różnicowanie w różne tkanki embrionalne myszy aż do dnia 10.5, kiedy to znaczące poziomy nieprawidłowej segregacji chromosomów, aneuploidii i apoptozy prowadzi do śmierci. Zarodki Cenpag/g gromadzą funkcjonalne kinetochory, które wiążą się z szeregiem białkami strukturalnymi specyficznymi dla centromerów i białkami punktu kontrolnego wrzeciona mitotycznego (Cenpc, BubR1, Mad2 i Zw10). Badanie fazowania nukleosomalnego centromerycznego i pericentromerycznych głównych sekwencji satelitarnych wskazuje, że tworzenie nukleosomów homotypowych Cenpag/g nie towarzyszą żadne jawne zmiany w ogólny rozmiar monomerycznej struktury nukleosomalnej lub odstępy między nimi struktur. Badanie to stanowi pierwszy przykład niezbędnego wariantu genu białka centromerowego wariantu genu białka centromerowego, w którym subtelne perturbacje w centromerach nukleosomalnym/chromatynowym objawia się znacznie opóźnioną śmiertelnością, gdy w porównaniu z myszami Cenpa null. --- Określiliśmy strukturę genomową i organizację mysich genów Cenpa i Cenpc. CENPA jest członkiem białek podobnych do histonu H3 i uważa się, że zastępuje histon H3 w nukleosomach centromerowych. CENPC jest białkiem wiążącym DNA które znajduje się na wewnętrznej płytce kinetochoru aktywnych centromerów ssaków. CDNA Cenpa koduje 134-aminokwasowy produkt, który jest w 70% identyczny i w 84% podobny do swojego ludzkiego homologa. Mysi gen Cenpa ma około 8 kb długości i zawiera pięć eksonów. długości i zawiera pięć eksonów. Analiza sekwencji 5' sekwencji DNA genu Cenpa ujawniła dwa konsensusowe pola CAAT, domniemane miejsce wiązania TFIID, domenę wiążącą domenę wiążącą Sp1 i dwa motywy regulujące cykl komórkowy, ale brak konsensusowego elementu TATA elementu TATA. Mysi gen Cenpc rozciąga się na 60 kb i zawiera 19 eksonów o wielkości od 44 do 602 bp. wielkości od 44 do 602 bp. Analiza sekwencji regionu promotora bogatego w C+G wykazała obecność znanych elementów promotora, w tym wyspy CpG, pola CAAT i kilku pól GC, ale nieobecność kilka pól GC, ale brak konsensusowego elementu TATA. --- Wykorzystując wcześniej wyizolowaną sondę mysiego białka centromerowego A (Cenpa), zlokalizowaliśmy gen zlokalizowaliśmy gen w proksymalnym regionie mysiego chromosomu 5, pomiędzy znanymi loci znanymi loci Il6 i Yes1 w pobliżu [Adra2C-D5H4S43-Hdh]. Porównanie tej lokalizacji z ludzkim CENPA, który mapuje się na chromosom 2, jest zgodny z obecnością nowego regionu konserwatywnej syntenii między tymi dwoma gatunkami. --- Wierność podczas segregacji chromosomów jest niezbędna, aby zapobiec aneuploidii. Białka białka i chromatyna w centromerze tworzą unikalne miejsce dla kinetochoru i pozwalają komórce wykrywać i korygować błędy podczas segregacji chromosomów. segregacji chromosomów. Chromatyna centromerowa charakteryzuje się odmienną organizacją chromatyny organizacją chromatyny, epigenetyką, białkami związanymi z centromerem i wariantami histonów. Obejmują one wariant białka centromerowego A histonu H3 (CENPA), którego skład i osadzanie którego skład i odkładanie były szeroko badane. W badaniach strukturalne i biofizyczne właściwości centromeru i zasugerowały, że centromer nie jest zasugerowały, że centromer nie jest po prostu "lądowiskiem" dla kinetochoru ale odgrywa istotną rolę w mitozie poprzez składanie i kierowanie organizacją kinetochoru. organizację kinetochoru.
Gdzie preferencyjnie zlokalizowany jest wariant histonowy CENPA?
Białko centromerowe A (Cenpa dla myszy, CENP-A dla innych gatunków) jest niezbędnym białkiem podobnym do histonu H3, które lokalizuje się w regionie centromerowym chromosomów eukariotycznych, gdzie zastępuje konwencjonalny histon H3 i wraz z czynnikami wiążącymi DNA specyficznymi dla centromeru kieruje montażem aktywnych kinetochorów.