Karboksylo-końcowy Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) lub blisko spokrewniona sekwencja jest ważne dla lokalizacji ER zarówno lumenalnej, jak i błonowej typu II białek błonowych typu II. Sekwencja ta funkcjonuje jako sygnał pobierania w przedziałach post-ER przedziale (przedziałach), ale dokładny przedział (przedziały), w którym następuje pobieranie, pozostaje nierozwiązane. Z przeciwciałem oczyszczonym przez powinowactwo przeciwko karboksylowo-końcowej sekwencji sekwencji receptora KDEL ssaków, zbadaliśmy jego subkomórkową lokalizację przy użyciu znakowania immunogold na rozmrożonych kriosekcjach różnych tkanek, takich jak tkanek, takich jak mysie plemniki i trzustka szczura, a także komórki HeLa, Vero, NRK, i mysich komórkach L. Pokazujemy, że rab1 jest doskonałym markerem przedziału pośredniego i używamy tego markera. i wykorzystujemy ten marker, a także profile pączkowania mysiego wirusa zapalenia wątroby (MHV). wirusa zapalenia wątroby myszy (MHV) w komórkach zakażonych tym wirusem, aby zidentyfikować ten przedział. przedziału. Nasze wyniki pokazują, że receptor KDEL jest skoncentrowany w przedziale przedziale pośrednim, jak również w stosie Golgiego. Niższe, ale ale znaczące znakowanie wykryto w szorstkim ER. Ogólnie rzecz biorąc, tylko niewielkie ilości receptora wykryto po stronie trans stosu Golgiego, w tym w sieci trans-Golgiego (TGN) normalnych komórek i tkanek. Jednakże, niektóre warunki stresowe, takie jak zakażenie wirusem krowianki lub wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej, a także leczenie w temperaturze 20 stopni C lub 43 stopni C, spowodowały znaczące przesunięcie dystrybucji w kierunku strony trans-TGN stosu Golgiego. stosu. Przesunięcie to można było określić ilościowo w komórkach HeLa stabilnie wyrażających marker TGN TGN. Nie wykryto znaczącego znakowania w strukturach dystalnych do TGN we wszystkich badanych warunkach. Po traktowaniu GTP gamma S permeabilizowanych komórek, receptor został wykryty w pąkach / pęcherzykach zawierających beta-COP, które gromadzą się po tym leczeniu, co sugeruje, że te pęcherzyki mogą transportować receptor między przedziałami. Proponujemy, aby odzyskiwanie białek zawierających KDEL występuje w wielu przedziałach po ER aż do TGN wzdłuż szlaku egzocytotycznego szlaku egzocytotycznego, i że w ramach tego szlaku, ilości receptora w różnych przedziałach zmienia się w zależności od warunków fizjologicznych. --- Szlak wydzielniczy komórek eukariotycznych składa się z wielu różnych przedziałów związanych z błoną, połączonych ruchem pęcherzykowym. Każdy ma charakterystyczną zawartość białek i lipidów, które muszą być utrzymywana. Osiąga się to w większości przypadków poprzez aktywne sortowanie - białka mogą dotrzeć do mogą trafić do niewłaściwego przedziału, ale są stale odzyskiwane. Dobrym przykładem jest system dla białek lumenalnych ER. Białka te niosą specyficzny sygnał sygnał sortowania, zazwyczaj tetrapeptyd KDEL, który jest wiązany przez receptor w aparacie Golgiego. receptor w aparacie Golgiego. Kompleks receptor-ligand, wraz z uciekającymi białkami błony ER białkami błonowymi, powraca do ER. Wiele składników ruchu pęcherzykowego, w tym białek płaszcza wymaganych do pączkowania pęcherzyków z ER, tych, które tworzą pęcherzyki wsteczne na przedziałach po ER i integralne białka błonowe które kierują pęcherzyki do ich właściwego miejsca przeznaczenia. Zdarzenia zdarzenia sortowania, które występują, można w dużej mierze zrozumieć w kategoriach specyficznych interakcji białko-białko z udziałem tych składników. Jednakże, sortowanie niektórych białek błonowych, w tym cząsteczek celujących w pęcherzyki, wpływają ich domeny przez ich domeny transmembranowe i jest prawdopodobne, że ich segregacja jest zależy od składu i właściwości biofizycznych dwuwarstwy lipidowej, które bardzo różnią się między przedziałami. Szlak wydzielniczy jest zatem dynamiczną jednostką, podzielona na dyskretne organelle poprzez ciągłą segregację i recykling lipidów i białek, procesy, które są ostatecznie napędzane przez mechanikę tworzenia i fuzji pęcherzyków. tworzenia i fuzji pęcherzyków. --- Aby zbadać rolę receptora KDEL w odzyskiwaniu toksyn białkowych do retikulum endoplazmatycznego komórek ssaków (ER), warianty lizozymu zawierające C-końcowe znaczniki AARL lub C-końcowe znaczniki KDEL, lub ludzki receptor KDEL, zostały wyrażone w poddanych działaniu toksyny komórkach COS 7 i HeLa. Ekspresja wariantów lizozymu i receptora KDEL została potwierdzona przez immunofluorescencję. Kiedy takie komórki były toksyną błoniczą (DT) lub toksyną podobną do Shiga 1 Escherichia coli (SLT-1). (SLT-1), nie było zauważalnej różnicy w ich wrażliwości w porównaniu z komórkami, które nie wykazywały ekspresji tych eks do komórek, które nie wyrażały tych egzogennych białek. Dla kontrastu, cytotoksyczność cytotoksyczność egzotoksyny Pseudomonas A (PE) jest zmniejszona przez ekspresję lizozymu-KDEL, co powoduje redystrybucję receptora KDEL z kompleksu Golgi do ER, a komórki są uwrażliwione na tę toksynę, gdy wyrażają dodatkowe receptory KDEL. Dane te sugerują, że w przeciwieństwie do SLT-1, PE może wykorzystywać receptor KDEL w celu dotarcia do światła ER, gdzie uważa się, że uważa się, że następuje transfer błonowy do cytozolu. Twierdzenie to zostało potwierdzone przez mikroiniekcji do komórek Vero przeciwciał podniesionych przeciwko cytoplazmatycznie odsłoniętemu cytoplazmatycznie ogonowi receptora KDEL. Immunofluorescencja potwierdziła, że te przeciwciała przeciwciała zapobiegały wstecznemu transportowi receptora KDEL z kompleksu Golgiego do ER, a to z kolei zmniejszyło cytotoksyczność PE, ale nie ale nie SLT-1, na te komórki. --- Zatrzymanie rozpuszczalnych białek w retikulum endoplazmatycznym jest zależne od ich interakcji z receptorem KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) w aparacie Golgiego oraz ich późniejsze odzyskanie z powrotem do retikulum endoplazmatycznego. Zbadaliśmy trójwymiarową organizację ludzkiego receptora KDEL przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej na miejsce i znakowania specyficznego dla sulfhydrylu. Zidentyfikowaliśmy zidentyfikowaliśmy cztery reszty aminokwasowe, Arg-5, Asp-50, Tyr-162 i Asn-165, które sugerujemy uczestniczą w tworzeniu kieszeni wiążącej ligand. Arg-5 i Asp-50 są wykazano, że znajdują się po stronie światła błony i są niedostępne z cytoplazmy. Ponadto, nasze wyniki silnie wspierają topologię receptora KDEL podobnej do rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G z siedmioma domenami transbłonowymi. domenami transmembranowymi. Co więcej, Asp-50 odgrywa kluczową rolę w wiązaniu ligandów His/Lys-Asp-Glu-Leu, ale nie jest wymagany do wiązania Asp-Asp-Glu-Leu, co sugeruje, że ta reszta tworzy parę jonową z dodatnio naładowaną aminokwasem dodatnio naładowaną resztą aminokwasową umieszczoną 4 reszty od końca karboksylowego liganda. --- W komórkach eukariotycznych wydzielanie białek stanowi złożony problem organizacyjny. problem organizacyjny. Białka wydzielnicze są najpierw transportowane w stanie rozłożonym przez błonę retikulum endoplazmatycznego (ER), a następnie przenoszone w małych cząsteczkach. błonę retikulum endoplazmatycznego (ER), a następnie są przenoszone w małych pęcherzykach do aparatu Golgiego i ostatecznie do błony komórkowej. pęcherzykach do aparatu Golgiego i ostatecznie do błony komórkowej. ER zawiera rozpuszczalne białka, które katalizują fałdowanie nowo zsyntetyzowanych polipeptydów. polipeptydów. Białka te są sortowane od białek wydzielniczych w kompleksie Golgiego kompleksie Golgiego: niosą one sygnał sortowania (tetrapeptyd KDEL lub pokrewną sekwencję), który umożliwia ich selekcję. sekwencja), który umożliwia ich selektywne pobieranie i powrót do ER. Wydaje się, że ten proces odzyskiwania jest również wykorzystywany przez niektóre toksyny bakteryjne, aby pomóc ich inwazji do komórki: toksyny te zawierają sekwencje podobne do KDEL i mogą w efekcie toksyny te zawierają sekwencje podobne do KDEL i mogą w efekcie podążać odwrotną ścieżką wydzielniczą. Receptor związany z błoną odpowiedzialny za sortowanie białek luminalnych ER został zidentyfikowany u drożdży za pomocą środków genetycznie, a pokrewne receptory znajdują się w komórkach ssaków. Nieoczekiwanie, receptor ten ma drugą rolę: w drożdżach jest on wymagany do utrzymania normalnego rozmiaru i funkcji aparatu Golgiego. Pomagając utrzymać skład zarówno ER, jak i Golgiego, receptor KDEL odgrywa ważną rolę w organizacji szlaku wydzielniczego. organizacji szlaku wydzielniczego. --- Hydroksylacja reszt lizylowych ma kluczowe znaczenie dla unikalnego wzoru glikozylacji występującego w kolagenach i dla wytrzymałości mechanicznej w pełni zmontowanych pozakomórkowych włókien kolagenowych. Hydroksylacja jest katalizowana w świetle retikulum endoplazmatycznego retikulum endoplazmatycznego (ER) przez specyficzny enzym, hydroksylazę lizylową (LH). Brak brak znanych motywów pobierania specyficznych dla ER w jego pierwotnej strukturze i jego związek z błonami ER in vivo sugerują, że enzym jest zlokalizowany w ER poprzez nowy mechanizm retencji / odzyskiwania. Zidentyfikowaliśmy zidentyfikowaliśmy tutaj 40-aminokwasowy C-końcowy segment peptydowy LH, który jest w stanie przekształcić katepsynę D, normalnie rozpuszczalną proteazę lizosomalną, w białko białko związane z błoną. Ten sam segment również znacznie spowalnia transport białka reporterowego z ER do przedziałów post-ER, jak oceniono w naszych eksperymentach pulsacyjno-pościgowych. Skuteczność opóźniania, w której pośredniczy ten C-końcowy segment peptydu jest porównywalny z nienaruszonym LH, ale niższa niż w przypadku mechanizmu pobierania opartego na receptorze KDEL. W ramach tego 40-aminokwasowy segment, pierwsze 25 aminokwasów wydaje się być najbardziej kluczowe te pod względem asocjacji błonowej i lokalizacji ER, ponieważ ostatnie 15 C-końcowe aminokwasy nie posiadały znaczącej aktywności opóźniającej. Nasze odkrycia definiują zatem krótki segment peptydowy bardzo blisko skrajnego C LH jako jedyną niezbędną determinantę zarówno dla jego membrany i lokalizacji w ER.
Jaka jest najbardziej typowa sekwencja peptydowa odpowiedzialna za pobieranie białek światła retikulum endoplazmatycznego (ER) z aparatu Golgiego?
Białka lumenalnego retikulum endoplazmatycznego (ER) niosą specyficzny sygnał sortujący, który umożliwia ich odzyskanie z wielu przedziałów post-ER (aż do TGN wzdłuż szlaku egzocytotycznego), z powrotem do ER. Najbardziej typowym takim sygnałem jest karboksylo-końcowy Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL), który jest wiązany przez receptor KDEL w aparacie Golgiego, a także w przedziale pośrednim. W ten sposób KDEL funkcjonuje jako sygnał pobierania białek lumenalnych ER z Golgiego do ER.