TŁO: Epigenom odnosi się do śladów na genomie, w tym metylacji DNA i modyfikacji histonów. metylację DNA i modyfikacje histonów, które regulują ekspresję genów genów. Spójny profil zmian ekspresji genów w schyłkowej kardiomiopatii kardiomiopatii doprowadził nas do postawienia hipotezy, że mogą również istnieć odrębne globalne wzorce epigenomu. METODY I WYNIKI: Skonstruowaliśmy mapy metylacji DNA w całym genomie oraz trimetylacji lizyny-36 histonu-3 (H3K36me3) dla kardiomiopatycznych i normalnych ludzkich serc. normalnych ludzkich sercach. Ponad 506 Mb sekwencji na bibliotekę zostało wygenerowanych przez sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, co pozwoliło nam przypisać wyniki metylacji do ≈28 milionów dinukleotydów CG w ludzkim genomie. Metylacja DNA była znacząco różniła się w promotorowych wyspach CpG, wewnątrzgenowych wyspach CpG, ciałach genów i regionach genomu wzbogaconych w H3K36me3. Różnice w metylacji DNA były obecne w promotorach genów regulowanych w górę, ale nie w dół. Wzbogacenie H3K36me3 było również znacząco różne w regionach kodujących genomu. genomu. W szczególności, obfitość transkryptów RNA kodowanych przez locus DUX4 korelowała z różnicową metylacją DNA i wzbogaceniem H3K36me3. In vitro, ekspresja genu Dux reagowała na specyficzny inhibitor metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA, a knockdown siRNA Dux prowadził do zmniejszenia żywotności komórek. WNIOSKI: Istnieją odrębne wzorce epigenomiczne w ważnych elementach DNA genomu DNA w ludzkiej kardiomiopatii schyłkowej. Epigenom może kontrolować ekspresję lokalnych lub dystalnych genów o krytycznych funkcjach w odpowiedzi mięśnia sercowego na stres. mięśnia sercowego. Jeśli wzorce epigenomiczne są zgodne z postępem choroby, testy dla epigenomu mogą być przydatne do oceny rokowania w niewydolności serca. Potrzebne są dalsze aby określić, czy i w jaki sposób epigenom przyczynia się do rozwoju kardiomiopatii. rozwój kardiomiopatii. --- Autosomalna dominująca dystrofia mięśniowa twarzowo-łopatkowo-ramieniowa (FSHD) ma niezwykły mechanizm patogenetyczny. nietypowy mechanizm patogenetyczny. FSHD jest spowodowana delecją podzbioru jednostek powtórzeń makrosatelitarnych D4Z4 w subtelomerze chromosomu 4q. Ostatnie badania dostarczają przekonujących dowodów na to, że retrotranspozycja genu w powtórzeniu D4Z4, DUX4, ulega ekspresji w ludzkiej linii zarodkowej, a następnie jest epigenetycznie wyciszany w tkankach somatycznych. tkankach somatycznych. W FSHD połączenie nieefektywnego wyciszania chromatyny powtórzenia D4Z4 i polimorfizmów na allelach tolerancyjnych FSHD, które stabilizują mRNA DUX4. mRNA DUX4 pochodzące z powtórzenia skutkują niewłaściwą ekspresją białka DUX4 w komórkach mięśniowych. w komórkach mięśniowych. FSHD jest zatem pierwszym przykładem ludzkiej choroby spowodowanej nieskuteczną represją retrogenu w makrosatelitarnym układzie powtórzeń. tablica. --- Każda jednostka makrosatelitarnego powtórzenia D4Z4 zawiera retrotranspozycyjny gen kodujący czynnik transkrypcyjny DUX4 double-homeobox. Dystrofia twarzowo-łopatkowo-ramienna (FSHD) jest spowodowana delecją podzbioru jednostek D4Z4 w subtelomerowym regionie chromosomu. regionie subtelomerowym chromosomu 4. Chociaż doniesiono, że że delecja jednostek D4Z4 indukuje patologiczną ekspresję mRNA DUX4, związek mRNA związek ekspresji mRNA DUX4 z FSHD nie został rygorystycznie ani nie zidentyfikowano żadnej ludzkiej tkanki, która normalnie wyrażałaby mRNA lub białko DUX4 mRNA lub białko. Pokazujemy, że mięśnie FSHD wyrażają inną formę splicingu mRNA DUX4 w porównaniu do mięśni kontrolnych. Mięsień kontrolny wytwarza niewielkie ilości formy splicingowej DUX4 kodującej tylko amino-końcową część DUX4. MIĘSIEŃ FSHD wytwarza niewielkie ilości mRNA DUX4, które koduje białko DUX4 o pełnej długości. białko. Niska obfitość pełnej długości mRNA DUX4 w komórkach mięśniowych FSHD reprezentuje niewielki podzbiór jąder produkujących stosunkowo dużą ilość DUX4 mRNA i białka. W przeciwieństwie do kontrolnych mięśni szkieletowych i większości innych tkanek somatycznych, transkrypt i białko DUX4 o pełnej długości ulegają ekspresji na w ludzkich jądrach, najprawdopodobniej w komórkach linii zarodkowej. Indukowane komórki pluripotencjalne (iPS) również wykazują ekspresję pełnej długości transkryptu i białka DUX4. a różnicowanie kontrolnych komórek iPS do ciałek embrionalnych tłumi ekspresję pełnej długości DUX4. DUX4 o pełnej długości, podczas gdy ekspresja DUX4 o pełnej długości utrzymuje się w zróżnicowanych komórkach iPS FSHD. Wszystkie te odkrycia wskazują, że pełnej długości DUX4 ulega normalnej ekspresji na określonych etapach rozwoju i jest w większości tkanek somatycznych. Skurcz powtórzenia D4Z4 w FSHD powoduje mniej skuteczną supresję pełnej długości mRNA DUX4 w komórkach mięśni szkieletowych. komórkach mięśni szkieletowych. Dlatego FSHD reprezentuje pierwszą ludzką chorobę, która jest związaną z niekompletnym wyciszeniem rozwojowym tablicy retrogenów normalnie wyrażanego na wczesnym etapie rozwoju. --- Ludzki retrogen z podwójną domeną DUX4 ulega ekspresji w jądrze i jest epigenetycznie represjonowany w tkankach somatycznych. Dystrofia mięśniowa twarzowo-łopatkowo-ramienna (FSHD) (FSHD) jest spowodowana mutacjami, które zmniejszają epigenetyczną represję DUX4 w tkankach somatycznych. DUX4 w tkankach somatycznych i powodują nieprawidłową ekspresję tego czynnika transkrypcyjnego w mięśniach szkieletowych. czynnika transkrypcyjnego w mięśniach szkieletowych. DUX4 wiąże miejsca w ludzkim genomie, które zawierają motyw sekwencji podwójny motyw sekwencji homeobox, w tym miejsca w unikalnych regionach genomu jak również wiele miejsc w powtarzalnych elementach. Wykorzystując ChIP-seq i RNA-seq na mioblastach transdukowanych DUX4 pokazujemy, że DUX4 wiąże i aktywuje transkrypcję pozornych retrotranspozonów LTR ssaków (MaLR), endogennych retrowirusów (ERVL i elementy retrowirusowe (ERVL i ERVK) oraz pericentromeryczne satelitarne sekwencje HSATII sekwencje. Niektóre aktywowane przez DUX4 elementy MaLR i ERV tworzą nowe promotory dla genów, długich niekodujących RNA i transkryptów antysensownych. Wiele z tych nowych transkryptów ulega ekspresji w komórkach mięśniowych FSHD, ale nie w komórkach kontrolnych, a zatem może przyczyniać się do patologii FSHD. Na przykład HEY1, represor miogenezy, jest aktywowany przez miogenezy, jest aktywowany przez DUX4 poprzez promotor MaLR. Motywy związane z DUX4, w tym te w powtarzalnych elementach, wykazują ewolucyjną konserwację, a niektóre transkrypty inicjowane powtórzeniami są wyrażane w zdrowym jądrze, normalnym miejscu ekspresji DUX4, ale rzadziej w innych tkankach somatycznych. Jądra są znane z szybkiej ewolucji u ssaków, ale mechanizmy stojące za tą szybką zmianą nie zostały jeszcze poznane. mechanizmy stojące za tą szybką zmianą nie zostały jeszcze zidentyfikowane: nasze wyniki sugerują, że mobilizacja elementów MaLR i ERV podczas ewolucji ssaków zmieniła wzorce ekspresji genów linii zarodkowej poprzez aktywację transkrypcji przez DUX4. Nasze odkrycia wskazują na rolę DUX4 i powtarzalnych elementów w ewolucji linii zarodkowej ssaków i ewolucji linii zarodkowej ssaków i dystrofii mięśniowej FSHD. --- Dystrofia twarzowo-łopatkowo-ramienna (FSHD) charakteryzuje się rozluźnieniem chromatyny makrosatelitarnego układu makrosatelitarnej D4Z4 na chromosomie 4 i ekspresją genu DUX4 kodowanego przez D4Z4. DUX4 w mięśniach szkieletowych. Bardziej powszechna forma, autosomalna dominująca FSHD1, jest spowodowana spowodowana skurczem matrycy D4Z4, podczas gdy uwarunkowania genetyczne i dziedziczenie i dziedziczenie FSHD2 niezależnej od skurczu matrycy D4Z4 są niejasne. Tutaj wykazać, że mutacje w SMCHD1 (kodujące strukturalne utrzymanie chromosomów elastyczna domena zawiasowa zawierająca 1) na chromosomie 18 zmniejszają poziomy białka SMCHD1 SMCHD1 i segregują z hipometylacją CpG D4Z4 w całym genomie w ludzkich rasach. krewnych. FSHD2 występuje u osób, które odziedziczyły zarówno mutację SMCHD1, jak i normalnej wielkości tablicę D4Z4 na haplotypie chromosomu 4 permisywnym dla ekspresji DUX4 ekspresji. Obniżenie poziomu SMCHD1 w mięśniach szkieletowych skutkuje D4Z4 niezależną od skurczu ekspresję DUX4. Nasze badanie identyfikuje SMCHD1 jako epigenetyczny modyfikator metastabilnej epilepsji D4Z4 i jako przyczynową genetyczną FSHD2 i prawdopodobnie innych ludzkich chorób podlegających regulacji epigenetycznej. regulacji epigenetycznej. --- Dystrofia mięśniowa twarzowo-łopatkowo-ramieniowa (FSHD) jest postępującym zaburzeniem mięśniowym związane ze skurczem układu powtórzeń D4Z4 w regionie subtelomerowym 4q35. regionie. Delecja ta indukuje modyfikacje epigenetyczne, które wpływają na ekspresję kilku genów zlokalizowanych w pobliżu. W każdym elemencie D4Z4 zidentyfikowaliśmy zidentyfikowaliśmy gen podwójnego homeoboksu 4 (DUX4). DUX4 wyraża czynnik transkrypcyjny czynnik transkrypcyjny, który odgrywa główną rolę w rozwoju FSHD poprzez inicjację dużej kaskady dysregulacji genów, która powoduje defekty różnicowania miogenicznego wady, atrofię i zmniejszoną odpowiedź na stres oksydacyjny. Ponieważ miRNA zmiennie wpływają na ekspresję mRNA, wymagane są podejścia proteomiczne, aby zdefiniować w FSHD. W tym badaniu zoptymalizowaliśmy zróżnicowane metodę znakowania izotopowego białek (ICPL) w połączeniu z analizą proteomiczną shotgun przy użyciu systemu bezżelowego (2DLC-MS/MS) do badania miotub FSHD. Pierwotne CD56(+) stwierdzono, że mioblasty FSHD łączą się w miotuby prezentujące różne proporcje zanikowy lub zdezorganizowany fenotyp. Aby lepiej zrozumieć defekt miogeniczny FSHD defekt miogenny, nasza ulepszona procedura proteomiczna została wykorzystana do porównania głównie zanikowe lub zdezorganizowane miotuby do tej samej pasującej zdrowej kontroli. kontrolą. Zanikowe miotuby FSHD wykazywały zmniejszone strukturalne i kurczliwe składniki mięśniowe. składników mięśniowych. Fenotyp ten sugeruje występowanie proteolizy związanej z atrofią. proteolizy, która prawdopodobnie wynika z kaskady dysregulacji genów, w której pośredniczy DUX4. kaskady. Izoformy miozyny mięśni szkieletowych były zmniejszone, podczas gdy kompleksy miozyny niemięśniowej kompleksy miozyny były bardziej obfite. W zdezorganizowanych miotubach FSHD izoformy miozyny izoformy miozyny nie były zmniejszone, a zwiększona ilość białek była głównie zaangażowana w organizację sieci mikrotubul i miozyny. w organizację sieci mikrotubul i przebudowę miofibryli. Wspólną cechą obu fenotypów miotuby FSHD było zaburzenie kilku białek jaskiniowych, takich jak białek jaskiniowych, takich jak PTRF i MURC. Podsumowując, nasze dane sugerują zmiany w i w mikrodomenach błonowych miotub FSHD. Wreszcie, dostosowanie dostosowanie frakcjonowania jądrowego zgodnego ze spektrometrią mas pozwoliło nam nam podkreślić zmiany białek zaangażowanych w przetwarzanie i stabilność mRNA. stabilność. --- W większości przypadków dystrofia mięśniowa twarzowo-łopatkowo-ramieniowa (FSHD) jest spowodowana przez skurczem powtórzenia D4Z4 w subtelomerze 4q. Skurcz ten jest związane z miejscową dekondensacją chromatyny i derepresją retrogenu DUX4 retrogenu. Złożona przyczyna genetyczna i epigenetyczna oraz wysoka zmienność kliniczna kliniczna w nasileniu choroby komplikują badania nad patogennym mechanizmem mechanizm leżący u podstaw FSHD. Zwalidowany model komórkowy omijający znaczną heterogenność heterogeniczność ułatwiłaby badania mechanistyczne i terapeutyczne FSHD. Wykorzystując wysoką częstość występowania mozaicyzmu somatycznego dla powtórzenia D4Z4 w FSHD de novo, stworzyliśmy klonalny model komórek miogennych od pacjenta z mozaiką. Poszczególne klony są genetycznie identyczne, z wyjątkiem z wyjątkiem wielkości macierzy powtórzeń D4Z4, która jest albo normalna, albo wielkości FSHD. Te klony zachowują swoje właściwości miogenne, a klony zakontraktowane D4Z4 różnią się od niekontraktowanych klonów przez wybuchy ekspresji DUX4 w jądrach sporadycznych jądrach, pokazując, że to zjawisko podobne do wybuchu jest cechą wewnętrzną locus. W konsekwencji, efekty ekspresji DUX4 można zaobserwować w klonach D4Z4 jak zróżnicowana ekspresja genów docelowych DUX4. Wykazaliśmy również pokazujemy ich udział w regeneracji in vivo u myszy z niedoborem odporności, rozszerzając potencjał tych klonów w badaniach mechanistycznych i terapeutycznych. terapeutycznych. Te linie komórkowe ułatwią porównania parami w celu zidentyfikowania różnic specyficznych dla FSHD i oczekuje się, że stworzą nowe możliwości dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. --- Dystrofia twarzowo-łopatkowo-ramieniowa (FSHD) jest postępującą dystrofią mięśniową spowodowaną przez zmniejszoną represję epigenetyczną makrosatelitarnych powtórzeń D4Z4 i ektopową ekspresję ektopową ekspresją DUX4, retrogenu kodującego germinalny czynnik transkrypcyjny kodowanego w każdym powtórzeniu. Osoby niezmienione chorobowo mają zazwyczaj więcej niż 10 powtórzeń rozmieszczonych w subtelomerowym regionie chromosomu 4, podczas gdy najbardziej Najczęstsza postać FSHD (FSHD1) jest spowodowana skurczeniem się tablicy do mniej niż 10 powtórzeń. niż 10 powtórzeń, co wiąże się ze zmniejszoną represją epigenetyczną i zróżnicowaną ekspresją ekspresją DUX4 w mięśniach szkieletowych. Wygenerowaliśmy transgeniczne myszy niosące tablice D4Z4 z allelu FSHD1 i allelu kontrolnego. Myszy te odzwierciedlają ważne atrybuty epigenetyczne i ekspresji DUX4 obserwowane odpowiednio u pacjentów i kontrolnych, w tym wysokie poziomy ekspresji DUX4 w linii w linii zarodkowej, (niekompletną) represję epigenetyczną w tkance somatycznej oraz specyficzna dla FSHD zróżnicowana ekspresja DUX4 w sporadycznych jądrach mięśni związanych z z relaksacją chromatyny D4Z4. Ponadto pokazujemy, że DUX4 jest w stanie aktywować podobne funkcjonalne grupy genów w mysich komórkach mięśniowych, jak w ludzkich komórkach mięśniowych. ludzkich komórkach mięśniowych. Te transgeniczne myszy stanowią zatem cenny zwierzęcy model model dla FSHD i będą użytecznym źródłem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw FSHD i testowania nowych strategii interwencji terapeutycznych. --- Chociaż patofizjologia dystrofii twarzowo-łopatkowo-ramiennej (FSHD) była przez ostatnie dziesięciolecia kontrowersyjna przez ostatnie dziesięciolecia, postęp w ostatnich latach doprowadził do powstania modelu, który który uwzględnia te dziesięciolecia ustaleń i zyskuje ogólną akceptację w społeczności badaczy FSHD. społeczności badawczej FSHD. Poniżej przedstawiamy, w jaki sposób wkład wielu laboratoriów przez wiele lat doprowadził do zrozumienia całkowicie nowego mechanizmu ludzkiej choroby. ludzkiej choroby. FSHD jest spowodowana nieefektywną epigenetyczną represją D4Z4. represji makrosatelitarnej tablicy powtórzeń D4Z4 na chromosomie 4, co skutkuje zróżnicowaną ekspresję retrogenu DUX4, kodującego czynnik transkrypcyjny double-homeobox w mięśniach szkieletowych. Normalnie wyrażany w jądrze i epigenetycznie tłumiona w tkankach somatycznych, ekspresja DUX4 w mięśniach szkieletowych indukuje ekspresję wielu genów linii zarodkowej, komórek macierzystych i innych genów, które mogą odpowiadać za patofizjologię FSHD. Chociaż niektóre nieporozumienia dotyczące co do szczegółów mechanizmów, panuje zgoda co do centralnego modelu patofizjologii. centralnego modelu patofizjologii stanowi punkt zwrotny w badaniach nad FSHD, przejście od badań zorientowanych na odkrycia do badań translacyjnych mające na celu opracowanie terapii opartych na solidnym modelu patofizjologii choroby.
Czy gen DUX4 jest regulowany epigenetycznie w komórkach somatycznych?
Ludzki retrogen z podwójną domeną DUX4 ulega ekspresji w jądrze i jest epigenetycznie wyciszany w tkankach somatycznych. Ostatnie badania dostarczają dowodów na to, że DUX4 ulega ekspresji w ludzkiej linii zarodkowej, a następnie jest epigenetycznie wyciszany w komórkach somatycznych.