Transkrypcja stymuluje niestabilność genetyczną sekwencji powtórzeń trinukleotydowych sekwencji. Jednak mechanizmy prowadzące do zależnej od transkrypcji zmienności długości powtórzeń są niejasne. Wykazaliśmy, stosując biochemiczne i genetyczne że tworzenie stabilnych hybryd RNA.DNA zwiększa niestabilność sekwencji CTG.CAG. niestabilność powtórzeń CTG.CAG. Transkrybowane in vitro sekwencje powtarzające się bogate w CG sekwencje, w przeciwieństwie do powtórzeń bogatych w AT i sekwencji niepowtarzających się, tworzą stabilne struktury odporne na rybonukleazę A, struktury odporne na rybonukleazę A. Te hybrydy RNA.DNA są eliminowane przez rybonukleazy H. Mutacja w genie rnhA1, która zmniejsza aktywność rybonukleazy HI stymuluje niestabilność powtórzeń CTG.CAG w E. coli. Co ważne, wpływ zubożenia rybonukleazy HI na niestabilność powtórzeń wymaga aktywnej transkrypcji. Wykazaliśmy również, że zależna od transkrypcji Niestabilność powtórzeń CTG.CAG w ludzkich komórkach jest stymulowana przez knockdown siRNA RNazy H1 i H2. Ponadto zastosowaliśmy modyfikację bisiarczynową, która wykrywa jednoniciowe DNA, aby wykazać, że nieszablonowa nić DNA przy transkrybowane powtórzenia CTG.CAG pozostają częściowo jednoniciowe w ludzkim genomowym DNA DNA, wskazując tym samym, że jest on wypierany przez hybrydę RNA.DNA. Badania te pokazują, że trwałe hybrydy między powstającym transkryptem RNA a matrycową nicią DNA w traktach CTG.CAG promują niestabilność trinukleotydów DNA powtórzeń. --- Pętle R to struktury, w których nić RNA jest sparowana z jedną nicią DNA dupleksu DNA. dupleksu DNA, pozostawiając przesuniętą nić DNA jednoniciową. Stabilne pętle R istnieją in vivo w prokariotycznych źródłach replikacji, mitochondrialnych źródłach replikacji replikacji i regionach przełączających klasy immunoglobulin (Ig) ssaków w aktywowanych limfocytach limfocytach B. Wszystkie te pętle R powstają po wygenerowaniu nici RNA bogatej w G przez polimerazę RNA po transkrypcji bogatej w C nici matrycowej DNA. Te R mają znaczną długość. Na przykład, pętla R w źródle replikacji Col E1 replikacji wydaje się wynosić około 140 bp. Nasze własne laboratorium skupiło się na regionach gdzie pętle R mogą mieć długość znacznie przekraczającą kilobazę. Tutaj opisano metody wykrywania i analizy pętli R in vitro i in vivo. in vivo. --- Ataksja Friedreicha (FRDA) i zespół łamliwego chromosomu X (FXS) to jedne z 40 chorób związanych z ekspansją powtarzających się sekwencji (TRED). Chociaż ich ich patologia molekularna nie jest dobrze poznana, zaproponowano, że tworzenie chromatyny represyjnej i nietypowych struktur DNA nad powtarzającymi się regionami. Nasze badanie pokazuje teraz, że hybrydy RNA/DNA (pętle R) tworzą się w komórkach pacjenta na rozszerzonych powtórzeniach endogennych genów FXN i FMR1, związanych z FRDA i FXS. Te zależne od transkrypcji pętle R są stabilne, kolokalizują z represyjnym znakiem chromatyny H3K9me2 i utrudniają transkrypcję polimerazy RNA II w komórkach pacjentów. My zbadaliśmy wzajemne oddziaływanie między represyjnymi znacznikami chromatyny i pętlami R na genie FXN. Wykazaliśmy, że zmniejszenie represyjnego znaku chromatyny H3K9me2 nie ma wpływu na poziomy pętli R. Co ważne, zwiększenie poziomu pętli R poprzez leczenie inhibitorem topoizomerazy DNA inhibitorem topoizomerazy DNA kamptotecyną prowadzi do regulacji w górę represyjnych represyjnych znaczników chromatynowych, co skutkuje wyciszeniem transkrypcji FXN. Zapewnia to bezpośredni związek molekularny między pętlami R a patologią TRED, sugerując, że pętle R że pętle R działają jako początkowy wyzwalacz promujący wyciszanie FXN i FMR1. Zatem Pętle R stanowią wspólną cechę zaburzeń ekspansji nukleotydów i zapewniają nowy cel dla interwencji terapeutycznych. --- Helikazy z rodziny Pif1 są konserwowane od bakterii do ludzi. Tutaj przedstawiamy aktywność patrolowania DNA, która może leżeć u podstaw różnorodnych funkcji Pif1: monomer Pif1 monomer Pif1 preferencyjnie zakotwicza się do 3'-ogonowego połączenia DNA i okresowo zwija ogon 3' z krokiem wielkości jednego nukleotydu, wytłaczając pętlę. pętlę. Ta okresowa aktywność patrolowania jest wykorzystywana do rozwijania wewnątrzcząsteczkowego G-kwadrupleksu (G4) przy każdym napotkaniu i jest wystarczająca do rozwinięcia heterodupleksu RNA-DNA, ale nie dupleksu DNA. Zamiast wychodzić po rozwinięciu G4, pozwalając mu na ponowne zwinięcie, lub idąc dalej, aby rozwinąć dupleks DNA, Pif1 wielokrotnie odwija DNA G4, utrzymując go w stanie rozwiniętym. Indukowane przez Pif1 rozwijanie G4 zachodzi w trzech dyskretnych krokach, po jednej nici na raz, i jest wystarczająco silne, aby pokonać leki stabilizujące G4. Okresowa aktywność patrolowa może utrzymywać Pif1 w miejscu jego działania działania in vivo w wypieraniu telomerazy, rozwiązywaniu pętli R i utrzymywaniu G4 podczas replikacji, rekombinacji i naprawy. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.02190.001. --- Rekombinacja przełącznika klasy immunoglobuliny H (CSR) zachodzi między regionami przełącznika i wymaga transkrypcji i indukowanej aktywacją deaminazy cytydyny (AID). Transkrypcja przez regiony przełącznikowe ssaków, ze względu na ich skład bogaty w GC skład, generuje stabilne pętle R, które zapewniają jednoniciowe DNA substraty dla AID. Jednak pokazujemy tutaj, że region przełączający Xenopus laevis S(mu), który jest bogaty w AT i nie jest podatny na tworzenie pętli R, może funkcjonalnie zastąpić mysi region przełączający, aby pośredniczyć w CSR in vivo. Za pośrednictwem X. laevis S (mu) CSR występował głównie w regionie powtórzeń AGCT ukierunkowanych przez kompleks replikacji AID A podczas transkrypcji in vitro. Proponujemy, że AGCT jest pierwotnym motywem CSR, który celuje w AID poprzez mechanizm inny niż pętla R obejmujący kompleks AID-białko replikacyjne A. --- W tym wydaniu Molecular Cell, Ginno i wsp. (2012) opisują niezwykłe cechy sekwencji w wyspach CpG promotora, które mogą prowadzić do powstawania trwałych hybryd RNA-DNA (pętli R). hybryd RNA-DNA (pętle R), które mają zapobiegać metylacji genomowego DNA metylacji genomowego DNA. --- Niespodziewane powszechne występowanie stabilnych hybrydowych struktur DNA/RNA (pętli R) w ludzkich komórkach i coraz więcej dowodów na ich zaangażowanie w kilka ludzkich nowotworów złośliwych ożywiło badania nad biologią pętli R w ostatnich latach. Tutaj proponujemy, że fizjologiczne tworzenie pętli R na wyspach CpG może przyczyniać się do specyfikacji pochodzenia replikacji DNA w tych regionach. regionach, najbardziej wydajnych miejscach inicjacji replikacji w komórkach ssaków. Całkiem prawdopodobne, że dzieje się to poprzez reakcję wypierania nici aktywującą tworzenie struktur G-kwadrupleksowych, które są ukierunkowane na kompleks rozpoznawania pochodzenia (ORC) w konformacji jednoniciowej. Zgodnie z tym stwierdziliśmy, że R-pętle kolokalizują się z ORC w tym samym regionie wyspy CpG w znacznej części tych wydajnych źródeł replikacji, dokładnie w miejscu pozycji wykazującej największą gęstość motywów G4. Ten scenariusz opiera się na związek między transkrypcją a replikacją w ludzkich komórkach i sugeruje że rozregulowanie pętli R w miejscach pochodzenia promotorów wysp CpG może przyczyniać się do fenotypu fenotypu nieprawidłowości replikacji DNA i utraty integralności genomu wykrytej w komórkach nowotworowych.
Które sekwencje DNA są bardziej podatne na tworzenie pętli R?
Pętle R, indukowane transkrypcyjnie hybrydy RNA:DNA, występujące na powtarzających się odcinkach (CTG)n, (CAG)n, (CGG)n, (CCG)n i (GAA)n, są związane z chorobami, w tym dystrofią miotoniczną, chorobą Huntingtona, łamliwym chromosomem X i ataksją Friedreicha.  Fizjologiczne tworzenie pętli R w promotorach wysp CpG może przyczyniać się do specyfikacji pochodzenia replikacji DNA w tych regionach, najbardziej wydajnych miejscach inicjacji replikacji w komórkach ssaków. Pętle R mogą mieć również korzystny wpływ, ponieważ ich powszechne tworzenie zostało wykryte w promotorach wysp CpG w ludzkich genach. Pętle R są szczególnie wzbogacone o bogate w G elementy terminatora.