Geny z rodziny kaspaz odgrywają kluczową rolę w inicjowaniu i przeprowadzaniu zaprogramowanej śmierci komórki. Zaprogramowana śmierć komórki jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do utraty neuronów po niedokrwieniu mózgu. Przeprowadziliśmy serię eksperymentów eksperymentów w celu zbadania roli określonej kaspazy, kaspazy-2, w rozwoju opóźnionej śmierci neuronów po przejściowym globalnym niedokrwieniu u szczura. szczura. Przebadano bibliotekę cDNA szczurzego niedokrwiennego mózgu i dwa warianty splicingu zidentyfikowano dwa warianty splicingu mRNA kaspazy-2, kaspaza-2S i kaspaza-2L, które były wysoce homologiczne z sekwencjami odpowiednio ludzkich i mysich genów kaspazy-2S i kaspazy-2L. odpowiednio. RT-PCR wykazał wzrost ekspresji zarówno mRNA kaspazy-2S i kaspazy-2L po 8, 24 i 72 godzinach reperfuzji po globalnym niedokrwieniu. niedokrwieniu. Stosunek dwóch fragmentów PCR nie zmienił się znacząco w czasie reperfuzji. Western blot z przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla proapoptotycznego wariantu splicingu kaspazy-2L ujawnił wzrost białka prokaspazy-2 (51 kDa) od 4 do 72 godzin po niedokrwieniu w porównaniu do kontrolami pozorowanymi. Ponadto, produkt rozszczepienia o masie około 30 kDa pojawił się po 8 godzinach i zwiększał się wraz ze wzrostem czasu trwania reperfuzji. Zatem, kaspaza-2L jest zarówno tłumaczona, jak i aktywowana po przejściowym globalnym niedokrwieniu. Wreszcie, dokomorowe podanie inhibitora podobnego do kaspazy-2 (VDVAD-FMK) 30 minut przed indukcją niedokrwienia zmniejszyło liczbę neuronów CA1 neuronów wybarwiających się pozytywnie na uszkodzenia DNA (test znakowania Klenowa) i zwiększonych liczba zdrowo wyglądających neuronów CA1 (fiolet krezolowy) w porównaniu z kontrole traktowane nośnikiem. Podsumowując, dane sugerują, że indukcja i aktywacja kaspazy-2 indukcja i aktywacja są ważnymi mediatorami opóźnionej śmierci neuronów po przejściowym globalnym niedokrwieniu. --- Czynnik transkrypcyjny E2F1 pełni kluczową funkcję podczas progresji fazy S i apoptozy. apoptozy. Zostało dobrze wykazane, że apoptotyczna funkcja E2F1 obejmuje jego zdolność do transaktywacji proapoptotycznych genów docelowych. Alternatywne splicing pre-mRNA ma również ważną funkcję w regulacji apoptozy. apoptozy. W tym badaniu zidentyfikowaliśmy czynnik splicingowy SC35, należący do grupy białek Ser-Rich Arg (SR). Ser-Rich Arg (SR), jako nowy cel transkrypcyjny E2F1. Wykazujemy, że E2F1 wymaga SC35. wykazujemy, że E2F1 wymaga SC35 do przełączania alternatywnego profilu splicingu różnych genów apoptotycznych, takich jak c-flip, kaspazy-8 i -9 oraz Bcl-x, w kierunku ekspresji proapoptotycznych wariantów splicingu. Wreszcie, dostarczamy dowodów że E2F1 reguluje w górę SC35 w odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA i pokazujemy, że SC35 jest wymagany do apoptozy w odpowiedzi na te leki. Podsumowując, te wyniki pokazują, że E2F1 kontroluje zdarzenia przetwarzania pre-mRNA w celu wywołania apoptozę i identyfikują białko SC35 SR jako kluczowy bezpośredni cel E2F1 w tym kontekście. ustawienie. --- Alternatywny splicing jest ważnym źródłem różnorodności białek i jest ustalonym, ale jeszcze nie w pełni poznanym mechanizmem regulacji genów u wyższych eukariontów. Jego regulacja jest regulowana przez różne mechanizmy, w tym zmienność poziomów ekspresji czynników splicingowych zaangażowanych w tworzenie spliceosomu spliceosomu. SRp55 jest jednym z najbardziej wszechobecnych czynników splicingowych, który może być regulowany w górę przez może być regulowany w górę przez uszkodzenie DNA przy braku p53, a wcześniej odkryliśmy że wyczerpanie jego aktywności zwiększyło odporność na uszkodzenia DNA w sposób sposób zależny od p53. Aby ocenić jego wpływ na wzorce splicingu genów zaangażowanych w apoptozę, przeprowadziliśmy analizę mikromacierzy specyficznych dla splicingu komórek traktowanych siRNA specyficznym dla tego genu. Analiza ta, poparta weryfikacją RT-PCR weryfikacją RT-PCR, zidentyfikowaliśmy trzy geny, KSR1, ZAK i mda7/IL24, które są wrażliwe na deplecję SRp55. Przeanalizowaliśmy również wzorce splicingu genów związanych z apoptozą w komórkach U2OS z niedoborem p53 po leczeniu genotoksycznym lekiem mitomycyną C. Analiza ta wykazała, że uszkodzenie DNA powodowało zmiany w aktywności splicingu, które modyfikowały aktywność splicingu. zmiany w aktywności splicingu, które zmodyfikowały wzór splicingu Fas, kluczowego proapoptotycznego receptora śmierci indukowanego przez p53. Co ciekawe, ta modyfikacja doprowadziła do wzbogacenia antyapoptotycznej rozpuszczalnej izoformy Fas, a tę izoforma została wykryta w mediach otaczających komórki poddane uszkodzeniu DNA. DNA. Odkrycia te pokazują, że modulacja aktywności splicingu w komórkach z niedoborem komórek z niedoborem p53 podczas wczesnej odpowiedzi na subletalne uszkodzenie DNA powoduje w splicingu genów docelowych, modyfikując w ten sposób odpowiedź komórkową na czynniki genotoksyczne. odpowiedź komórkową na czynniki genotoksyczne. --- Chemioterapeutyki przeciwnowotworowe, takie jak cisplatyna, wywierają działanie cytotoksyczne poprzez indukując uszkodzenia DNA i aktywując zaprogramowaną śmierć komórki (apoptozę). Białko białko supresorowe p53 jest ważnym aktywatorem apoptozy. Chociaż komórki nowotworowe z niedoborem p53 są mniej wrażliwe na chemioterapię, ich oporność nie jest całkowita, co sugeruje, że mogą istnieć inne szlaki apoptozy. A p53, p73, który koduje kilka białek w wyniku alternatywnej splicingu, może również indukować apoptozę. Tutaj pokazujemy, że ilość białka p73 w komórce jest zwiększona przez cisplatynę. Ta indukcja p73 nie jest obserwowana w komórkach komórkach niezdolnych do przeprowadzenia naprawy niedopasowania i w których enzym jądrowy c-Abl nie jest aktywowany przez cisplatynę. Okres półtrwania p73 jest przedłużony przez cisplatynę i przez koekspresję z kinazą tyrozynową c-Abl; funkcja indukująca apoptozę funkcja p73 jest również wzmacniana przez kinazę c-Abl. Myszy fibroblasty zarodkowe myszy z niedoborem naprawy niedopasowania lub c-Abl nie regulują w górę p73 i są bardziej odporne na zabijanie przez cisplatynę. Nasze wyniki wskazują, że c-Abl i p73 są składnikami szlaku apoptozy zależnego od naprawy niedopasowania który przyczynia się do cytotoksyczności indukowanej cisplatyną. --- Uszkodzenia DNA indukują apoptozę, a wiele genów apoptotycznych jest regulowanych poprzez alternatywny splicing (AS), ale niewiele wiadomo na temat mechanizmów kontroli. Tutaj pokazujemy, że promieniowanie ultrafioletowe (UV) wpływa na kotranskrypcyjną AS w sposób sposób niezależny od p53, poprzez hiperfosforylację domeny karboksykońcowej polimerazy RNA II domeny karboksy-końcowej (CTD) i późniejsze zahamowanie transkrypcji elongacji transkrypcji, oceniane in vivo i w czasie rzeczywistym. Fosfomimetyczne mutanty CTD nie tylko nie tylko wykazują niższą elongację, ale także powielają wpływ UV na AS. Konsekwentnie, mutanty niefosforylujące zapobiegają efektowi UV. Apoptoza promowana przez UV w komórkach pozbawionych p53 jest uniemożliwiona, gdy zmiana w AS apoptotycznego genu bcl-x, potwierdzając znaczenie tego mechanizmu. Mikromacierze wrażliwe na splicing ujawniły znaczące nakładanie się podzbiorów genów, które zmieniły AS z UV i tych, które zmniejszyły ekspresję, sugerując, że sprzężenie transkrypcyjne z AS jest kluczową cechą odpowiedzi odpowiedź na uszkodzenie DNA. --- Pudełko CCAAT jest elementem DNA obecnym w większości ludzkich promotorów, związanym przez trimeryczny NF-Y, składający się z podjednostek NF-YA, NF-YB i NF-YC. przez trimeryczny NF-Y, składający się z podjednostek NF-YA, NF-YB i NF-YC. Opisujemy i scharakteryzowaliśmy nowe izoformy jednej z dwóch podjednostek histonopodobnych, NF-YC. Locus generuje co najmniej cztery produkty splicingu, zlokalizowane głównie w domenie aktywacyjnej domeny aktywacyjnej bogatej w Q. Obfitość każdej izoformy jest zależna od komórki; tylko jedna główna izoforma NF-YC jest obecna w danym typie komórek. Izoformy 37- i 50-kDa wzajemnie się wykluczają, a preferencyjne pary z izoformami NF-YA posiadają różne aktywności transkrypcyjne, przy czym określone kombinacje są bardziej aktywne na wybranych promotorach. Regulacja transkrypcji locus NF-YC jest również złożona, a mRNA powstaje z dwóch promotorów P1 i P2. Transfekcje przejściowe, immunoprecypitacje chromatyny i odwrotna transkrypcja-PCR wskazują, że P1 ma silną aktywność podtrzymującą; P2 ma niższą aktywność podstawową, ale jest indukowany w odpowiedzi na uszkodzenie DNA w sposób sposób zależny od p53. Alternatywne użycie promotora bezpośrednio wpływa na splicing NF-YC, przy czym transkrypt 50-kDa jest wykluczony z P2. Specyficzna funkcjonalna inaktywacja izoformy 37-kDa wpływa na podstawowe poziomy blokowania G(1)/S i genów proapoptotycznych, ale nie promotorów G(2)/M. Podsumowując, nasze dane podkreślają nieoczekiwany stopień złożoności i regulacji genu NF-YC, wykazując istnienie dyskretnej kohorty podtypów trimerów NF-Y wynikających z funkcjonalnej dywersyfikacji bogatych w Q podjednostek transaktywujących i specyficznej roli izoformy 37-kDa w tłumieniu odpowiedzi na uszkodzenie DNA odpowiedzi na uszkodzenia DNA w warunkach wzrostu. --- BRCA1 to gen supresorowy nowotworu, który jest zmutowany w rodzinach z rakiem piersi i jajnika. raka jajnika. W różnych tkankach występuje kilka wariantów splicingu BRCA1, ale ich lokalizacja subkomórkowa i funkcje są obecnie słabo poznane. obecnie słabo poznane. Wcześniej opisaliśmy wariant splicingu BRCA1 BRCA1a, który indukuje apoptozę i działa jako supresor nowotworów potrójnie ujemnych raków piersi, jajnika i prostaty. raka prostaty. W tym badaniu przeanalizowaliśmy funkcję izoform BRCA1 (BRCA1a i BRCA1b) i porównaliśmy je z białkiem BRCA1 typu dzikiego, stosując kilka kryteriów, takich jak badanie ekspresji w komórkach prawidłowych i nowotworowych za pomocą testów ochrony przed RNazą testy ochrony, lokalizacja / frakcjonowanie subkomórkowe za pomocą immunofluorescencji mikroskopię i analizę Western blot, regulację transkrypcji biologicznych istotnych biologicznie białek i hamowanie wzrostu komórek raka piersi. Jesteśmy wykazując po raz pierwszy, że ektopowo wyrażone BRCA1 znakowane GFP, BRCA1a i BRCA1b są zlokalizowane w mitochondriach, hamują aktywność transkrypcyjną ELK-1 i posiadają aktywność antyproliferacyjną na komórkach raka piersi. komórki. Wyniki te sugerują, że sekwencje eksonów 9, 10 i 11 (aa 263-1365) które zawierają dwa sygnały lokalizacji jądrowej, p53, Rb, c-Myc, gamma-tubulinę, Stat, Rad51, domeny wiążące Rad50, domena represji angiopoetyny-1 nie są absolutnie absolutnie wymagane do lokalizacji mitochondrialnej i supresora wzrostu wzrostu tych białek. Ponieważ dysfunkcja mitochondriów jest cechą charakterystyczną raka, możemy spekulować, że mitochondrialna lokalizacja białek BRCA1 może być funkcjonalnie istotna w regulacji zarówno uszkodzeń mitochondrialnego DNA jak i aktywności apoptotycznej białek BRCA1, a błędna lokalizacja powoduje raka. J. Cell. Physiol. 219: 634-641, 2009. (c) 2009 Wiley-Liss, Inc.
Czy alternatywny splicing genów apoptotycznych odgrywa rolę w odpowiedzi na uszkodzenia DNA lub mitochondriów?
Tak, alternatywny splicing wydaje się odgrywać kluczową rolę w odpowiedzi na uszkodzenie DNA lub mitochondriów, co sugeruje liczba genów apoptotycznych, które są alternatywnie splicowane, z często antagonistycznymi rolami generowanych izoform.