Granulki P i inne ciała RNA/białkowe są organellami bezbłonowymi, które mogą przez wewnątrzkomórkową separację faz, podobną do kondensacji pary wodnej w kropelki. kondensacji pary wodnej w kropelki. Jednak molekularne siły napędowe i natura skondensowanych faz pozostają słabo poznane. skondensowanych faz pozostają słabo poznane. Tutaj pokazujemy, że białko Caenorhabditis elegans LAF-1, helikaza DDX3 RNA znajdująca się w granulkach P, oddziela fazę w kropelki podobne do granulek P in vitro. Dostosowujemy technikę mikroreologii do precyzyjnego pomiaru lepkosprężystości mikrometrowych kropelek LAF-1, ujawniając czysto lepkie właściwości wysoce przestrajalne przez stężenie soli i RNA stężenie. RNA zmniejsza lepkość i zwiększa dynamikę molekularną w kropli. w kropli. Testy FRET pojedynczych cząsteczek sugerują, że ta fluidyzacja RNA wynika z wysoce dynamicznych interakcji RNA-białko, które pojawiają się blisko granicy faz kropli. granicy faz kropli. Demonstrujemy, że N-końcowy, bogaty w argininę/glicynę bogata, wewnętrznie nieuporządkowana domena białkowa (IDP) LAF-1 jest konieczna i wystarczająca zarówno do separacji faz, jak i interakcji RNA-białko. In vivo, RNAi LAF-1 powoduje rozpuszczanie granulek P we wczesnym zarodku, z pozorną submikromolarną granicą faz porównywalną do tej mierzonej in in vitro. Wszystkie te odkrycia pokazują, że LAF-1 jest ważny dla promowanie montażu granulek P i zapewnia wgląd w mechanizm, za pomocą którego Interakcje molekularne napędzane przez IDP powodują powstanie organelli w fazie ciekłej o o zmiennych właściwościach. --- TŁO: Analiza sekwencji aminokwasowej wewnętrznie nieuporządkowanego białka (IDP) w kontekście ewolucyjnym białka (IDP) w kontekście ewolucyjnym może dostarczyć nowych informacji na temat funkcjonalnej roli nieuporządkowanych regionów i elementów sekwencji. Jednak w przypadku przypadku wielu IDP, brak ewolucyjnej konserwacji pierwotnej sekwencji może utrudniać badanie funkcjonalności, ponieważ zachowanie ich profilu zaburzeń i wynikającej z tego funkcji (funkcji) może nie pojawić się w tradycyjnej tradycyjnej analizie historii ewolucyjnej białka. WYNIKI: Poniżej przedstawiamy DisCons (Disorder Conservation), nowe narzędzie potokowe które łączy kwantyfikację zachowania sekwencji i zaburzeń w celu klasyfikacji nieuporządkowanych pozycji reszt. Zgodnie z tym schematem, najbardziej interesującymi kategoriami (dla celów funkcjonalnych) są ograniczone nieuporządkowane i elastyczne nieuporządkowane reszty. Te pierwsze wykazują zachowanie zarówno sekwencji, jak i właściwości nieuporządkowania i są związane głównie z specyficznymi funkcjami wiążącymi (np. krótkie, liniowe motywy, SLiM), podczas gdy druga klasa odpowiada segmentom, w których zaburzenie jako cecha jest ważne dla funkcji, w przeciwieństwie do tożsamości sekwencji bazowej (np, łańcuchy entropowe i łączniki). DisCons pomaga zatem w wyjaśnieniu funkcji wynikających ze stanu nieuporządkowania poprzez analizę poszczególnych białek jak również dużych zbiorów danych proteomicznych. WNIOSKI: DisCons to ogólnodostępne narzędzie do analizy sekwencji, które identyfikuje i podkreśla strukturalnie nieuporządkowane segmenty białek, w których elastyczność konformacyjna jest zachowana między homologami, a zatem potencjalnie funkcjonalne. Narzędzie jest dostępne bezpłatnie zarówno jako aplikacja internetowa oraz jako samodzielny kod źródłowy hostowany pod adresem http://pedb.vib.be/discons . --- Samoistnie nieuporządkowane białko (IDP) stathmina odgrywa ważną rolę regulacyjną regulacyjną rolę w utrzymaniu cytoszkieletu poprzez jego helikalne wiązanie z tubuliny i mikrotubul. Jednak brakuje jej stabilnego fałdu pod nieobecność jej partnera wiążącego. Chociaż stathmina była przedmiotem badań w ciągu ostatnich dwie dekady, dynamika konformacyjna tego IDP w fazie roztworu jest słabo słabo poznana. Doniesiono, że stathmina jest czysto monomeryczna w roztworze i że ma krótki helikalny region o trwałej fałdowości, który może działać w celu zarodkowania fałdowania helikalnego w kierunku C-końcowym. Tutaj przedstawiamy kompleksowe badanie równowag strukturalnych lokalnych dla tego regionu w stathmin, które zaprzecza tym dwóm twierdzeniom. Wykorzystując technikę elektronowego spektroskopii rezonansu paramagnetycznego (EPR) na znakowanych spinowo mutantach stathminy w fazie w fazie roztworu i po unieruchomieniu na stałym podłożu Sepharose, pokazujemy, że wszystkie miejsca w helikalnym regionie nukleacji stathminy wykazują wiele widmowych które odpowiadają stanom dynamicznym o różnej ruchliwości i stabilności. stabilnościach. Co ważne, stan o stosunkowo niskiej ruchliwości dominuje w każdym widmie. widma ze średnią populacją większą niż 50%, co sugerujemy odpowiada stanowi oligomeryzacji białka. Jest to w przeciwieństwie do mniej zaludnionym, bardziej mobilnym stanem, który prawdopodobnie reprezentuje helikalnie sfałdowany monomeryczny stan stathminy i wysoce mobilny stan, który proponujemy jest przypadkowy konformer cewki białka. Nasza interpretacja danych EPR jest potwierdzona przez dalszą charakterystykę białka przy użyciu technik natywnego i SDS PAGE, chromatografii żelowej oraz wielokątowego i dynamicznego rozpraszania światła. rozpraszanie światła, z których wszystkie wykazują obecność oligomerycznej stathminy w roztworze roztworze. Łącznie dane te sugerują, że stathmina istnieje w zróżnicowanej równowaga stanów w całym rzekomym helikalnym regionie zarodkowania i że ten IDP wykazuje skłonność do oligomeryzacji. --- Pokazujemy tutaj, że kaldesmon żołądka kurczaka (CaD) i jego domena C-końcowa (reszty 636-771, CaD136) są wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami. Analiza analizy obliczeniowe i eksperymentalne dzikiego typu CaD136 i serii mutantów jego pojedynczych mutantów tryptofanowych (W674A, W707A i W737A) oraz podwójnego mutanta tryptofanowego (W674A/W707A). (W674A/W707A) sugerowały, że chociaż interakcja CaD136 z kalmoduliną (CaM) może być napędzana przez niespecyficzne przyciąganie elektrostatyczne między tymi przeciwnie naładowanymi cząsteczkami, specyficzność wiązania CaD136-CaM jest prawdopodobnie określona przez specyficzne upakowanie ważnych reszt tryptofanowych CaD136 tryptofanu na interfejsie CaD136-CaM. Sugeruje się, że tę można opisać jako model "guzików na naładowanym sznurku", w którym przyciąganie elektrostatyczne między wewnętrznie nieuporządkowanymi CaD136 i CaM jest zestalone w sposób "zatrzaskiwania guzików" przez specyficzne upakowanie "giętkich guzików" CaD136 (które są krótkimi segmentami fluktuującej lokalnej struktury skondensowanej wokół tryptofanu). struktury skondensowanej wokół reszt tryptofanu) na interfejsie CaD136-CaM. Nasze dane pokazują również, że wszystkie trzy "przyciski" są ważne dla wiązania, ponieważ mutacja któregokolwiek z tryptofanów wpływa na wiązanie CaD136-CaM i ponieważ CaD136 pozostaje związany z CaM nawet wtedy, gdy dwa z trzech tryptofanów są zmutowane do alaniny. --- Wewnętrznie nieuporządkowane białka (IDP) są wszechobecnie zaangażowane w procesy komórkowe. procesach komórkowych i często biorą udział w stanach patologicznych u ludzi. Krytyczne rola biologiczna tych białek, pomimo braku dobrze zdefiniowanego fałdu, zachęciły biologów strukturalnych do zrewidowania swoich poglądów na temat paradygmatu struktura paradygmatu struktura-funkcja. Niestety, badanie cech i opisanie zachowania strukturalnego IDP jest dalekie od trywialnego, a a wnioskowanie o funkcji (funkcjach) nieuporządkowanego regionu białka pozostaje dużym wyzwaniem. wyzwaniem. Metody obliczeniowe okazały się szczególnie przydatne do badania IDP: na poziomie sekwencji ich zależność od różnych cech determinowanych przez lokalny kontekst aminokwasowy sprawia, że algorytmy przewidywania oparte na sekwencji i niezawodne narzędzia do analiz na dużą skalę, podczas gdy na poziomie struktury na poziomie struktury integracja in silico fundamentalnie różnych danych eksperymentalnych jest niezbędna do opisania zachowania elastycznego łańcucha białkowego. łańcucha białkowego. Tutaj oferujemy przegląd najnowszych osiągnięć i technik obliczeniowych, których celem jest odkrycie technik obliczeniowych, które mają na celu odkrycie, w jaki sposób funkcja białka jest powiązana z wewnętrznymi zaburzeniami. --- Wewnętrznie nieuporządkowanym białkom brakuje stabilnych struktur trzeciorzędowych i/lub drugorzędowych w warunkach fizjologicznych w warunkach fizjologicznych in vitro. Wewnętrznie nieuporządkowane białka przechodzą znaczące przejścia konformacyjne do dobrze sfałdowanych form tylko po związaniu z partnerem. Symulacje dynamiki molekularnej są wykorzystywane do badania mechanizmu fałdowania białek wewnętrznie nieuporządkowanych po związaniu partnera partnera. Symulacje MD w temperaturze pokojowej sugerują, że wewnętrznie nieuporządkowane białka nieuporządkowane białka mają niespecyficzne i specyficzne interakcje z partnerem. Analiza kinetyczna wysokotemperaturowych symulacji MD pokazuje, że stany związane i apo rozwijają się odpowiednio w procesie dwustanowym. Analiza wartości Φ może może zidentyfikować kluczowe reszty wewnętrznie nieuporządkowanych białek. Analiza testu P Kołmogorowa-Smirnowa (KS) ilustruje, że specyficzne rozpoznawanie między wewnętrznie nieuporządkowanym białkiem a partnerem może następować po mechanizm indukowanego dopasowania. Ponadto metody te mogą być szeroko stosowane do badania wiązania indukowanego fałdowania dla wewnętrznie nieuporządkowanych białek.
Co to jest nieuporządkowane białko?
Białka nieuporządkowane wewnętrznie nie posiadają stabilnych struktur trzeciorzędowych i/lub drugorzędowych w warunkach fizjologicznych in vitro. Wewnętrznie nieuporządkowane białka przechodzą znaczące przejścia konformacyjne do dobrze sfałdowanych form tylko po związaniu z partnerem.