Reszty N6-metyloadenozyny (m6A), które znajdują się wewnętrznie w wirusowych i komórkowych populacjach mRNA w sekwencjach komórkowych populacjach mRNA w sekwencjach Apm6ApC i Gpm6ApC, zostały odgrywają rolę w przetwarzaniu i transporcie mRNA. Opracowaliśmy wrażliwe podejście do analizy poziomu i lokalizacji m6A w specyficznie oczyszczonych komórkowych mRNA, próbując skorelować lokalizację m6A z funkcją. Poliadenylowany mRNA jest hybrydyzowany z klonami cDNA reprezentującymi pełny rozmiar badanego mRNA lub jego fragmenty. badane mRNA lub jego fragmenty, a zabezpieczone RNA jest trawione i znakowany kinazą polinukleotydową in vitro. Po wzbogaceniu m6A przeciwciałem przeciwciałem anty-m6A, [32P]-pm6A jest rozdzielany na płytkach TLC i porównywany z całkowitą ilością radioznakowanych nukleotydów. Używając tej kombinacji znakowania in vitro RNA i selekcji przeciwciał, byliśmy w stanie wykryć m6A w oczyszczonym stabilnych mRNA, które nie mogą być łatwo znakowane w komórkach z większą czułością niż było to możliwe przy użyciu poprzednich technik. Zastosowaliśmy tę technikę do bydlęcego prolaktyny i wykazaliśmy, że ten mRNA zawiera m6A. Co więcej, wszystkie reszty m6A w tej wiadomości znajdują się w 2/3 cząsteczki i są wysoce skoncentrowane (61%). są wysoce skoncentrowane (61%) w sekwencji 108 nukleotydów w 3 ' niekodującym regionie wiadomości. Nielosowa dystrybucja m6A w specyficznym komórkowym mRNA, jak wykazano w przypadku bydlęcej prolaktyny, będzie musiało zostać wzięte pod uwagę przy projektowaniu modelu funkcji m6A. --- Cykloleucyna, konkurencyjny inhibitor transferazy metioniny, została użyta do generowania in vivo częściowo metylowanego mRNA w komórkach BSC-1 zakażonych SV40. Cykloleucyna w stężeniu 0,5 mg/ml powoduje ponad 30% spadek wewnętrznych m6A późnego mRNA SV40. późnego SV40 mRNA z niewielkim wpływem na dimetyloadenozynę 5' czapeczki m7GpppmAm. Po traktowaniu 2 i 5 mg/ml cykloleucyny, wewnętrzne m6As zostały zredukowane odpowiednio 10- i 100-krotnie. Zahamowanie metylacji mRNA BSC-1 metylacji było podobne do tego obserwowanego dla późnych mRNA SV40. W komórkach wystawionych na działanie 2 mg/ml cykloleucyny produkcja późnego mRNA SV40 została zahamowana o 80%, podczas gdy ilość jądrowego RNA SV40 była tylko nieznacznie zmniejszona. Frakcjonowanie wielkości jądrowego RNA SV40 jądrowego RNA z komórek traktowanych cykloleucyną ujawniło utratę SV40 19 S RNA z odpowiadającym jej wzrostem pofragmentowanego RNA sedymentującego między 11 a 5 S, tak, że całkowita ilość RNA SV40 w jądrze była prawie niezmieniona. Analiza wirusowych kompleksów transkrypcyjnych z komórek poddanych działaniu cykloleucyny wykazała, że cykloleucyna nie miała wpływu na transkrypcję SV40. Komórki transformowane SV40, w przeciwieństwie do komórek BSC-1, były zdolne do przetwarzania i transportować niedemetylowane RNA. Gdy transformowane komórki były traktowane 2 mg/ml cykloleucyną nie wykryto zmian w ilości lub wielkości cytoplazmatycznego i jądrowego RNA. i jądrowego RNA. Dane te przemawiają za rolą wewnętrznych cząsteczek m6A w modulowaniu związany z przetwarzaniem transport mRNA z jądra do cytoplazmy komórek komórek nietransformowanych. Transformowane komórki mogą uniknąć tej kontroli z powodu zmiany strukturalne w ich regionach okołojądrowych. --- Informacje o autorze: (1)Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA. (2)Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA; Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA 02142, USA; Departament ds. Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA 02142, USA; Department of Biologii, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139, USA. (3) Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA; Graduate Program in Immunology, Division of Medical Sciences, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA. (4) Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA 02142, USA. (5) Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA; Harvard Stem Cell Institute and Department of Stem Cell Stem Cell Institute oraz Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University, Cambridge, MA 02138, USA. (6)Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA 02142, USA; Department of Radiation Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, 450 Brookline Avenue, Boston, MA 022. Avenue, Boston, MA 02215, USA. (7) Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA; Center for Immunologii i Chorób Zapalnych, Massachusetts General Hospital, Charlestown, MA 02129, USA. (8)Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA; McGovern Institute for Brain Research, Massachusetts General Hospital, Charlestown, MA 02129, USA. McGovern Institute for Brain Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139, USA; Department of Brain and Cognitive Sciences and Biological Engineering, Massachusetts Institute, USA. Inżynierii Biologicznej, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139, USA. (9)Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA; Wydział Biologii, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139, USA. Biologii, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139, USA; Wydział Biologii Systemów, Harvard Medical School, Boston, MA 02114, USA. Adres elektroniczny: lander@broadinstitute.org. (10)Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA; Department of Biologii, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139, USA; Howard Hughes Medical Institute, 4000 Jones Bridge Road, Chevy Chase, MD 20815, USA. Adres elektroniczny: aregev@broad.mit.edu. --- Wielokrotnie wykazano, że przewlekły stres zmienia dendryty, kolce i moduluje ekspresję cząsteczek synaptycznych. moduluje ekspresję cząsteczek synaptycznych. Wszystkie te efekty mogą upośledzać przekazywanie informacji między neuronami. Niniejsze badanie pokazuje, że przewlekły stres reguluje również ekspresję M6a, glikoproteiny zlokalizowanej w błonach aksonalnych. błonach aksonalnych. Wcześniej wykazaliśmy, że M6a jest składnikiem aksonów glutaminergicznych. aksonów glutaminergicznych. Obecne dane ujawniają, że jest to wariant splicingowy M6a-Ib, a nie M6a-Ia, który ulega silnej ekspresji w mózgu. Przewlekły stres u samce szczurów (3 tygodnie codziennego powściągliwości) mają skutki regionalne: ilościowa hybrydyzacja in situ hybrydyzacja wykazała, że mRNA M6a-Ib w neuronach ziarnistych zakrętu zębatego i w neuronach piramidalnych CA3 jest obniżone, podczas gdy mRNA M6a-Ib w przyśrodkowej korze przedczołowej jest regulowane w górę przez przewlekły stres. Jest to pierwsze badanie pokazujące, że ekspresja cząsteczki błony aksonalnej jest zróżnicowana wpływ stresu w sposób zależny od regionu. Dlatego można spekulować że zmniejszona ekspresja glikoproteiny w hipokampie prowadzi do w odpowiednich obszarach projekcji korowej. Zwiększona ekspresja M6a-Ib w przyśrodkowej korze przedczołowej (w obszarach kory przedlimbicznej i infralimbicznej) kory) może być interpretowana jako mechanizm kompensacyjny w odpowiedzi na zmiany w projekcjach aksonalnych z hipokampa. Nasze odkrycia dostarczają dowodów na to, że oprócz zmian w dendrytach i kolcach przewlekły stres zmienia również integralność aksonów, a tym samym może upośledzać transfer informacji nawet między odległymi regionami mózgu. --- Polimorfizm genu FTO kodującego demetylazę N(6)-metyladenozyny (m(6)A) RNA demetylazy był silnie związany z otyłością u ludzi; jednak mechanizm przez który FTO wpływa na metabolizm, biorąc pod uwagę jego wyłaniającą się rolę w modyfikacji RNA jest wciąż słabo poznany. Nowe badanie opublikowane w Cell Research donosi o nowych funkcjach implikujących FTO w regulacji alternatywnego splicingu mRNA splicingu w kontroli adipogenezy. --- Dwie ludzkie demetylazy, enzym związany z masą tłuszczową i otyłością (FTO) oraz enzym ALKBH5, oksydacyjnie demetylują obfite reszty N(6)-metyladenozyny (m(6)A) w mRNA. w mRNA. Osiągnięcie metody selektywnego hamowania FTO w stosunku do ALKBH5 pozostaje jednak wyzwaniem. wyzwaniem. Tutaj zidentyfikowaliśmy kwas meklofenamowy (MA) jako wysoce selektywny inhibitor FTO. MA jest niesteroidowym lekiem przeciwzapalnym że badania mechanistyczne wskazują, że konkuruje z wiązaniem FTO dla kwasu nukleinowego zawierającego m(6)A. Struktura FTO/MA ujawniła wiele na temat hamującej funkcji FTO. Nasze nowo odkryte zrozumienie, ujawnione tutaj, części części pokrywy rozpoznawania nukleotydów (NRL) w FTO, na przykład, pomogło wyjaśnić zasady stojące za selektywnością FTO w stosunku do ALKBH5. Leczenie komórek komórek HeLa formą estru etylowego MA (MA2) doprowadziło do podwyższonego poziomu modyfikacji m(6)A w m(6)A. m(6)A w mRNA. Nasze wspólne wyniki podkreślają rozwój funkcjonalnych sond enzymu FTO, które (i) umożliwią przyszłe badania biologiczne badania biologiczne i (ii) utorują drogę do racjonalnego projektowania silnych i specyficznych inhibitorów FTO do zastosowania w medycynie. --- Wiadomo, że rozległy repertuar modyfikacji leży u podstaw wszechstronnych kodujące, strukturalne i katalityczne funkcje RNA, ale pozostaje on w dużej mierze niezbadane terytorium. Chociaż badania biochemiczne wskazują, że N(6)-metyladenozyna (m(6)A) jest najbardziej rozpowszechnioną wewnętrzną modyfikacją w informacyjnym RNA. RNA, dogłębne badanie jej dystrybucji i funkcji zostało utrudnione przez brak solidnych metod analitycznych. Tutaj przedstawiamy ludzki i mysi krajobraz modyfikacji m(6)A w sposób obejmujący cały transkryptom, przy użyciu nowego podejście, m(6)A-seq, oparte na wychwytywaniu za pośrednictwem przeciwciał i masowo równoległym sekwencjonowaniu. sekwencjonowaniu. Zidentyfikowaliśmy ponad 12 000 miejsc m(6)A charakteryzujących się typowym konsensusem w transkryptach. w transkryptach ponad 7 000 ludzkich genów. Miejsca preferencyjnie pojawiają się w dwóch różnych punktach orientacyjnych - wokół kodonów stop i wewnątrz i są wysoce konserwatywne między człowiekiem a myszą. Chociaż większość miejsc jest dobrze zachowana w tkankach prawidłowych i nowotworowych oraz w odpowiedzi na różne bodźce. odpowiedzi na różne bodźce, zidentyfikowano podzbiór zależnych od bodźca, dynamicznie modulowanych miejsc. zidentyfikowano dynamicznie modulowane miejsca. Wyciszenie metylotransferazy m(6)A znacząco wpływa na ekspresję genów i alternatywne wzorce splicingu, co skutkuje modulacją szlaku sygnałowego p53 (znanego również jako TP53) i apoptozą. apoptozę. Nasze odkrycia sugerują zatem, że dekoracja RNA przez m(6)A ma fundamentalną rolę w regulacji ekspresji genów. --- Niedawne odkrycia dotyczące odwracalnej metylacji N(6)-metyladenozyny (m(6)A) na informacyjnego RNA (mRNA) i mapowanie metylomów m(6)A u ssaków i drożdży mają ujawniły potencjalne funkcje regulacyjne tej modyfikacji RNA. U roślin, defekty w metylotransferazie m(6)A powodują fenotyp letalny zarodka, sugerując krytyczną rolę m(6)A w rozwoju roślin. Tutaj profilujemy m(6)A w dwóch odmianach Arabidopsis thaliana i ujawniamy, że m(6)A jest wysoce konserwatywną modyfikacją mRNA w roślinach. W odróżnieniu od ssaków, m(6)A w A. thaliana jest wzbogacony nie tylko wokół kodonu stop i w obrębie regionów 3'-nietranslowanych, ale także wokół kodonu start. Analiza ontologii genów wskazuje, że unikalny wzór dystrybucji m(6)A w A. thaliana jest związany ze specyficznymi dla roślin szlakami obejmującymi chloroplast. Odkryliśmy również odkryliśmy pozytywną korelację między odkładaniem m(6)A a obfitością mRNA, sugerując regulacyjną rolę m(6)A w ekspresji genów roślinnych. --- Informacje o autorze: (1)Departament Genetyki Molekularnej, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Izrael. (2)Centrum Badań nad Rakiem, Centrum Medyczne Chaim Sheba, Tel Hashomer, Izrael, oraz Sackler School of Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv, Izrael. (3)Department of Chemistry and Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago, Chicago, IL 60637, USA. (4)Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, Ramat Gan, Izrael. (5) Departament Immunologii, Instytut Nauki Weizmanna, Rehovot, Izrael. (6)The Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Izrael. Wydział Pediatrii i Oddział Immunologii Dziecięcej, Centrum Medyczne Rambam Centrum Medyczne Rambam i Wydział Medycyny B. Rappaporta, Technion, Hajfa, Izrael. (7) Cancer Research Center, Chaim Sheba Medical Center, Tel Hashomer, Izrael, oraz Sackler School of Medicine, Uniwersytet w Tel Awiwie, Tel Awiw, Izrael. Mina i Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, Ramat Gan, Izrael. (8)Departament Genetyki Molekularnej, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Izrael. jacob.hanna@weizmann.ac.il noa.novershtern@weizmann.ac.il gidi.rechavi@sheba.health.gov.il. (9) Centrum Badań nad Rakiem, Centrum Medyczne Chaim Sheba, Tel Hashomer, Izrael, oraz Sackler School of Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv, Izrael. jacob.hanna@weizmann.ac.il noa.novershtern@weizmann.ac.il gidi.rechavi@sheba.health.gov.il. --- Wcześniej zmapowaliśmy miejsca N6-metyloadenozyny (m6A) w genomowym RNA wirusa mięsaka Rous (RSV). Wyniki tego badania i eksperymentów z wykorzystaniem inhibitorów metylacji sugerują, że m6A może być zaangażowany w przetwarzanie mRNA zdarzeń. Opisujemy podejście do bezpośredniej analizy funkcji m6A w RNA i do badania specyficzności sekwencji metylazy m6A. Dwa miejsca metylacji w RSV (nukleotydy 7414 i 7424) zostały zmienione przez mutagenezę ukierunkowaną oligonukleotydami. Wysoce konserwatywna sekwencja konsensusu GAC w tych miejscach została zmieniona na GAU. Nowe sekwencje nie były już metylowane w genomowym RNA RSV; sekwencja GAC była wymagana do skutecznej modyfikacji zasad w tych dwóch adenozynach. Zmieniony wzór m6A nie wpływ na przetwarzanie wirusowego RNA ani na cykl życiowy wirusa w zainfekowanych komórkach. --- N(6)-metyladenozyna (m6A) jest najliczniej występującą zmodyfikowaną zasadą w eukariotycznym mRNA i została powiązana z różnymi efektami na los mRNA. Obecne podejścia do mapowania lokalizują reszty m6A w regionach transkryptu o długości 100-200 nt, ale nie mogą zidentyfikować dokładnych pozycji m6A na poziomie całego transkryptomu. Tutaj opracowaliśmy m6A o rozdzielczości pojedynczych nukleotydów i immunoprecypitacji (miCLIP) i wykorzystaliśmy go do wykazania, że przeciwciała przeciwko m6A mogą indukować specyficzne mutacje sygnatury na resztach m6A po indukowanym światłem ultrafioletowym przeciwciałem-RNA i odwrotnej transkrypcji. Odkryliśmy, że te przeciwciała w podobny sposób indukowały sygnatury mutacji w N(6),2'-O-dimetyloadenozynie (m6Am), modyfikacji modyfikacji występującej w pierwszym nukleotydzie niektórych mRNA. Używając tych sygnatur, zmapowaliśmy m6A i m6Am z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu w ludzkim i mysim mRNA i zidentyfikowaliśmy małe nukleolarne RNA (snoRNA) jako nową klasę niekodujących cząsteczek zawierających m6A niekodujących RNA (ncRNA).
Na jakie właściwości mRNA wpływa N6-metyloadenozyna (m6A)?
N(6)-metyladenozyna (m6A) jest najliczniej występującą zmodyfikowaną zasadą w eukariotycznym mRNA i została powiązana z różnymi efektami na los mRNA. m6A głównie i bezpośrednio zmniejsza stabilność mRNA.