Kompensacja dawki u ssaków wymaga wyciszenia jednego z dwóch chromosomów X u samic i jest kontrolowana przez centrum inaktywacji X (Xic). Xic zawiera wiele elementów regulacyjnych dla wzajemnego oddziaływania transkryptu specyficznego dla inaktywacji X (Xist) i Tsix, antysensownego odpowiednika Xist. Elementy regulacyjne kontrolują inaktywację chromosomu X (XCI) poprzez tworzenie kompleksów DNA-DNA i kompleksów DNA-białko z czynnikami cis- i trans-działającymi. Jednakże zależna od procesu regulacja Xist/Tsix przez te elementy w każdym procesie XCI pozostaje w dużej mierze nieznana. W tym badaniu, odporna na 6-tioguaninę żeńska hybrydowa mysia linia komórkowa F(1) hybrydowa linia komórkowa myszy (oznaczona jako HOBMSKI2) została skonstruowana z krzyżówki między samicą myszy transgenicznej z niedoborem HPRT (oznaczoną jako BM3) a samcem dzikiego typu Mus spretus (oznaczonego MS), co umożliwiło bezpośrednią dyskryminacja zarówno specyficznej dla alleli ekspresji genów sprzężonych z chromosomem X, jak i specyficzne dla alleli wiązanie białek związanych z XCI z powodu polimorfizmów DNA między BM3 i MS. Korzystając z tej linii komórkowej, odkryliśmy, że Tsix na aktywnym chromosomie X (Xa) nie ulegał ekspresji w komórkach somatycznych pomimo faktu, że CTCF, który zapewnia ekspresję Tsix w embrionalnych komórkach macierzystych, był nadal związany z końcem 5' Tsix na Xa, co sugeruje, że CTCF może funkcjonować inaczej podczas każdego procesu XCI a jego aktywność transaktywująca ekspresję Tsix może zostać utracona w procesie konserwacji. proces konserwacji. Ponadto, monoalleliczna ekspresja Tsix na Xa była hamowana przez epigenetyczną modyfikację chromatyny w procesie konserwacji w której pośredniczyły kompleksy białkowe rekrutowane przez MeCP2. Wyniki wskazują na wartość HOBMSKI2 w bezpośrednim wykrywaniu wiązania specyficznego dla alleli CTCF i MeCP2 do końca 5' Tsix. Linia myszy HOBMSKI2 jest wszechstronnym i użytecznym źródłem do badania molekularnego mechanizmu procesu XCI. --- Uważa się, że ekspresja transkryptu specyficznego dla nieaktywnego chromosomu X (Xist) jest niezbędna do inicjacji inaktywacji chromosomu X i kompensacji dawki podczas rozwoju zarodka żeńskiego. W niniejszym badaniu przeanalizowaliśmy wzorce transkrypcji Xist i początek inaktywacji chromosomu X w bydlęcych zarodkach przedpłodowych. Reakcja łańcuchowa odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) ujawniła obecność transkryptów Xist we wszystkich tkankach somatycznych ocenianych tkankach. W przeciwieństwie do tego, wśród badanych tkanek męskich, ekspresję Xist wykryto tylko w jądrach. Nie zaobserwowano żadnych dowodów na transkrypcję Xist po pojedynczej rundzie RT-PCR z puli zarodków uzyskanych in vitro w stadium od 2 do 4 komórek. do 4-komórkowych. Transkrypty Xist zostały wykryte jako słaby amplikon w stadium 8-komórkowym, a następnie konsekwentnie we wszystkich badanych stadiach aż do i włącznie z etapem rozszerzonej blastocysty. Transkrypty Xist były jednak następnie wykrywane od stadium 2-komórkowego po zagnieżdżonej RT-PCR. Preferencyjne znakowanie [3H]tymidyną wskazujące na późną replikację jednego z chromosomów X odnotowano u żeńskich zarodków w różnym wieku rozwojowym w następujący sposób w następujący sposób: 2 z 7 (28,5%) wczesnych blastocyst, 6 z 13 (46,1%) blastocyst, 8 z 11 (72,1%) ekspandujących blastocyst. (72,1%) rozszerzonych blastocyst i 14 z 17 (77,7%) wyklutych blastocyst. Te wyniki sugerują, że ekspresja Xist poprzedza początek późnej replikacji w zarodka bydlęcego, we wzorze zgodnym z możliwą rolą bydlęcego Xist w inicjacji inaktywacji chromosomu X. --- W ostatnich latach nastąpił szybki postęp w kierunku zrozumienia mechanizmów molekularnych zaangażowanych w inaktywację chromosomu X (inaktywacja X). Postęp ten w dużej mierze obracał się wokół odkrycia specyficznego transkryptu nieaktywnego X (Xist), o którym obecnie wiadomo, że reprezentuje główny locus regulujący inaktywację X. inaktywację X. W dorosłych komórkach Xist jest transkrybowany wyłącznie z nieaktywnego chromosomu X. chromosomu X. Transkrypt nie ma widocznego potencjału kodowania białek i jest w jądrze w ścisłym związku z domeną zajmowaną przez nieaktywny chromosom X. nieaktywny chromosom X. Uważa się zatem, że reprezentuje funkcjonalną cząsteczkę RNA która działa jako główny sygnał odpowiedzialny za propagację inaktywacji X inaktywacji. Regulacja rozwojowa Xist koreluje z czasem inaktywacji X. czas inaktywacji X. Ostatnie wyniki wykazały, że Xist jest zarówno niezbędny i wystarczający do inaktywacji X. Cele na przyszłość to zrozumienie mechanizmu regulacji Xist, który leży u podstaw ustanowienia odpowiednich wzorców inaktywacji X i określenie, w jaki sposób RNA Xist uczestniczy w procesie propagacji inaktywacji in cis. --- Inaktywacja X, transkrypcyjne wyciszenie jednego z dwóch chromosomów X u samic ssaków samic ssaków, osiąga kompensację dawki genów sprzężonych z chromosomem X w stosunku do XY samców. U ssaków eutherycznych inaktywacja X jest regulowana przez specyficzny transkrypt X-inactive (Xist), cis-działający niekodujący RNA, który wyzwala wyciszenie chromosomu, z którego pochodzi. chromosomu, z którego jest transkrybowany. Ssaki torbacze również przechodzą inaktywację X ale mechanizm ten jest stosunkowo słabo poznany. Postanowiliśmy przeanalizować chromosom X u Monodelphis domestica i Didelphis virginiana, koncentrując się na scharakteryzowaniu przedziału określonego przez geny Chic1 i Slc16a2 które u euterydów flankują locus Xist. Syntenia tego regionu jest zachowana na chromosomie 4 kurczaka, gdzie inne loci należące do ewolucyjnie starożytnej warstwy ludzkiego chromosomu X, tak zwanego regionu konserwatywnego X (XCR), są również również zlokalizowane. Pokazujemy, że zarówno u M. domestica, jak i u D. virginiana ewolucyjny punkt przerwania oddzielił loci Chic1 i Slc16a2. Szczegółowa analiza sekwencji genomowych oposa ujawniła powiązanie Chic1 z genem Lnx3 niedawno zaproponowanym jako ewolucyjny prekursor Xist, oraz Fip1, ewolucyjnym prekursorem Tsist. ewolucyjnym prekursorem Tsx, genu znajdującego się bezpośrednio za Xist u eutera euteryków. Omawiamy te odkrycia w odniesieniu do ewolucji Xist i inaktywacji X u ssaków. --- Podczas wczesnej embriogenezy ssaków, jeden z dwóch chromosomów X w komórkach somatycznych w komórkach somatycznych samicy ulega inaktywacji w procesie, który uważa się za zależy od unikalnego regionu inicjującego, centrum inaktywacji chromosomu X (Xic). Niedawno scharakteryzowana sekwencja Xist (transkrypt specyficzny dla X-inactive) jest jest uważana za potencjalnego kandydata na Xic. U myszy kolejny element genetyczny, element kontrolujący chromosom X (Xce), o którym również wiadomo, że wpływa na wybór wybór, który z dwóch chromosomów X jest inaktywowany. Donosimy, że region mysiego chromosomu X leżącego 15 kb dystalnie do Xist zawiera kilka miejsc, które wykazują hipermetylację specyficznie związaną z aktywnym chromosomem X. Analiza tego regionu w różnych szczepach Xce ujawniła korelację między siłą przenoszonego allelu Xce a statusem metylacji tego regionu. tego regionu. Proponujemy, aby taki region mógł być zaangażowany w początkowe etapy procesu inaktywacji. początkowych etapach procesu inaktywacji, a w szczególności w wyborze, który z dwóch obecnych chromosomów który z dwóch chromosomów X obecnych w komórce żeńskiej zostanie inaktywowany. --- Kilka badań wykazało wpływ spalin z silników wysokoprężnych (DE) na ośrodkowy układ nerwowy. ale mechanizm jest niejasny. Płodowe myszy były narażone na całe DE (zawiera gazy i cząsteczki) w komorze inhalacyjnej, a zmiany ekspresji genów w mózgu mózgu badano za pomocą testu genowego (mikromacierz i ilościowa PCR w czasie rzeczywistym). PCR w czasie rzeczywistym). Za pomocą mikromacierzy wykryto regulację w górę Xist, B-raf i Drwms2. i Drwms2. W szczególności ekspresja mRNA Xist była zwiększona w sposób w sposób zależny od stężenia u samców i samic myszy. Xist (X-inactive specyficzny transkrypt) jest głównym efektorem procesu inaktywacji X i Geny sprzężone z chromosomem X są silnie wyrażane w tkance mózgowej i zgodne z rolą w rozwoju mózgu. Za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, Tsix (kluczowy niekodujący antysensowny partner Xist) i inne geny sprzężone z chromosomem X (Mecp2, Hprt1 i Sts). zbadane; Tsix był regulowany w górę, a inne geny sprzężone z chromosomem X nie uległy zmianie w samce i samice myszy. Nasze odkrycia sugerują, że ekspozycja na DE zwiększa ekspresję genów Xist i Tsix in utero bez wpływu na ekspresję genów sprzężonych z chromosomem X. Badanie zmian ekspresji genów Xist może stanowić ważny biomarker biomarker dla efektów wywołanych przez DE. Możliwość uniknięcia inaktywacji chromosomu X (XCI) poprzez zminimalizowanie ekspozycji na DE. --- Dostosowanie proporcji płci potomstwa do warunków panujących w momencie poczęcia jest obserwowane u wielu ssaków, w tym koni. Zależy to od preferencyjnego przeżycia męskich zarodków w warunkach wysokiego spożycia energii. U kilku gatunków, wykazano, że czynniki wzrostu, w tym insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF)-1 rozwój embrionalny poprzez zmniejszenie apoptozy i zwiększenie proliferacji komórek. proliferację komórek. Postawiliśmy hipotezę, że związane z płcią różnice w ekspresji IGF-1 w zarodkach koni podczas fazy matczynego rozpoznawania ciąży mogą istnieć, a tym samym przyczyniać się do preferencyjnego przeżycia zarodków jednej z obu płci w określonych warunkach środowiskowych. Insulinopodobny czynnik wzrostu-1 Ekspresja mRNA zarodków koni wyprodukowanych in vivo w różnych dniach (Dzień 8, N = 6; Dzień 10, N = 8; Dzień 12, N = 14). Ekspresja mRNA insuliny jak ekspresja mRNA czynnika wzrostu-1 została oceniona za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościową reakcję łańcuchową polimerazy. Płeć zarodka została określona przez wykrywanie transkryptu specyficznego dla inaktywacji X (Xist) RNA i końskiej płci determinującego płeć regionu DNA chromosomu Y. Zarodki pozytywne dla ekspresji Xist zostały sklasyfikowane jako samice, a Xist ujemny i region determinujący płeć koni chromosomu Y zostały sklasyfikowane jako męskie. Z 28 zarodków 15 (54%) wykazało pozytywną ekspresję Xist i tym samym zostało sklasyfikowanych jako żeńskie. Ekspresja mRNA insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 była zależna od płci (P = 0,01), ale nie przez dzień ciąży (względna ekspresja IGF-1 w stosunku do β-aktyny, Dzień 8: mężczyzna 5,1 ± 2,1, kobieta 11,4; Dzień 10: mężczyzna 5,2 ± 1,6, kobieta 17,4 ± 6,7; Dzień 12: mężczyzna 2,6 ± 0,3, kobieta 11,6 ± 2,4). Wyniki wykazują zwiększoną ekspresję IGF-1 u żeńskich zarodków koni. Wpływy związane z płcią na ekspresję systemu IGF są prawdopodobnie związane ze stopniową inaktywacją chromosomu X. inaktywacją chromosomu X. --- Różnice w ekspresji alleli przyczyniają się do zmienności fenotypowej. W przypadku inaktywacji chromosomu X (XCI), niekorzystne proporcje XCI promują penetrację choroby sprzężonej z chromosomem X u kobiet. u kobiet. Podczas XCI jeden X jest losowo wyciszany przez Xist. X jest określany przez asymetryczną ekspresję Tsix, którego działanie antysensowne działanie tłumi Xist. Tutaj odkrywamy element cis w mysim centrum inaktywacji X, który reguluje Tsix. Xist zawiera międzygenowe miejsca transkrypcji miejsca startu transkrypcji i miejsca nadwrażliwe na DNaseI z różnicami allelicznymi. Na początku na początku XCI, usunięcie Xite obniża Tsix in cis i wypacza proporcje XCI, sugerując, że Xite promuje utrzymywanie się Tsix na aktywnym X. Obcięcie Xite RNA jest nieistotne, co wskazuje, że działanie Xite nie wymaga nienaruszonych transkryptów. transkryptów. Proponujemy, aby specyficzne dla alleli działanie Xite promowało asymetrię Tsix i generuje nierówność chromosomu X. Dlatego też Xite jest kandydatem na Xce, klasycznego modyfikatora proporcji XCI. --- Inaktywacja chromosomu X rozpoczyna się, gdy nowy chromosomalny RNA (cRNA) z odciśniętego mysiego locus Xist lub ludzkiego locus XIST pokrywa lub "maluje" jeden chromosom X in cis i inicjuje kaskadę zdarzeń przebudowy chromosomu. Badania molekularne badania cytologiczne okazały się nieocenione dla zrozumienia charakterystycznego komórkowego zachowania tego pojedynczego RNA zaangażowanego w strukturę i regulację chromosomów. i regulację chromosomów. Podczas gdy szczegółowy mechanizm działania RNA XIST/Xist (X-inactivation Specific transkryptu) RNA pozostaje w dużej mierze nieznany, ostatnie postępy dostarczają nowych wgląd w złożone czynniki komórkowe, które wpływają na lokalizację RNA w chromosomie, a także do chromosomu, a także wczesne zdarzenia przebudowy chromosomu, które następują po malowaniu przez Xist RNA. Ponieważ zmiany chromatyny mogą być bezpośrednio wizualizowane na wyciszonym chromosomie, inaktywacja chromosomu X zapewnia korzystny model do badania tworzenia i utrzymania heterochromatyny w całym genomie. utrzymanie, co ma szerokie implikacje dla normalnych komórek i chorób. --- Liczne pary genów sens-antysens zostały odkryte w różnych organizmach. Geny antysensowne odgrywają ważną rolę w ustalaniu wzorców ekspresji genów wdrukowanych rodzicielsko wzorców ekspresji genów u ssaków. Zazwyczaj geny sensowne kodujące białka są wzajemnie regulowane przez ich niekodujących partnerów antysensownych. Jednym z przykładów antysensownych jest para genów Xist (X-inactive specific transcript) i Tsix, która odgrywa kluczową rolę która odgrywa kluczową rolę w inaktywacji X. Xist działa jako funkcjonalna cząsteczka RNA który rekrutuje represyjne czynniki chromatynowe w kierunku jednego z żeńskich Xs w celu inaktywacji. Antysensowna transkrypcja Tsix negatywnie reguluje Xist i chroni jeden chromosom X in cis przed inaktywacją przez Xist. Chociaż dokładny mechanizm molekularny mechanizm molekularny jest nadal niejasny, wykazano, że transkrypcja Tsix reguluje strukturę chromatyny poprzez zmianę modyfikacji ogona histonowego i metylację DNA metylację DNA w promotorze Xist. Ponadto, RNA Xist i Tsix tworzą dupleksy RNA RNA in vivo i są przetwarzane na małe RNA, które mają potencjalną funkcję regulacyjną. funkcję regulacyjną. Tutaj dokonujemy przeglądu najnowszych odkryć i na podstawie obszernych danych eksperymentalnych dane eksperymentalne rozważają modele regulacji genów za pośrednictwem antysensu w Inaktywacja X. --- Przypadkowa inaktywacja chromosomu X (XCI), eutheriański mechanizm kompensacji dawki genów sprzężonych z chromosomem X jest kontrolowany przez cis-działający locus zwany centrum inaktywacji X (Xic). centrum inaktywacji X (Xic). Jedną z uderzających cech, które charakteryzują krajobraz Xic jest obfitość loci transkrybujących niekodujące RNA (ncRNA), w tym Xist, głównego regulatora procesu inaktywacji. Ostatnie porównawcze analizy genomiczne przedstawiły scenariusz ewolucyjny stojący za pochodzenia centrum inaktywacji X, ujawniając, że locus to wyewoluowało z regionu regionu zawierającego geny kodujące białka. Podczas radiacji ssaków, ten region kodujący białko został przerwany w grupie torbaczy, podczas gdy dostarczył w linii eutherycznej materiał wyjściowy dla nieulegającego translacji RNA centrum inaktywacji X. Pojawienie się niekodujących genów nastąpiło przez podwójnego mechanizmu obejmującego utratę funkcji kodowania białek przez wcześniej istniejące geny genów i integrację różnych klas elementów mobilnych, z których niektóre modelowały strukturę i sekwencję niekodujących genów w sposób specyficzny dla gatunku. sposób. Powstające geny zaczęły produkować transkrypty, które uzyskały funkcję w regulowaniu epigenetycznego statusu chromosomu X, jak pokazano w przypadku Xist, jego antysensu Tsix, Jpx, a ostatnio zasugerowano dla Ftx. Tak więc pojawienie się Xic, które nastąpiło po rozbieżności między euterykami i torbaczami, było podstawą ewolucji losowej inaktywacji X jako strategii osiągnięcia kompensacji dawki. kompensacji dawki. --- XIST, długi niekodujący RNA, odgrywa ważną rolę w wyzwalaniu inaktywacji chromosomu X u euteryków. inaktywacji chromosomu X u eutherian i jest szeroko stosowany do kwalifikowania komórek macierzystych i klonowanych zarodków. Jednak świński XIST nie został jeszcze dokładnie pomimo jego biologicznego znaczenia w wielu różnych dziedzinach badań. dziedzinach. Tutaj przedstawiamy sekwencję XIST świni o pełnej długości, zmontowaną przy użyciu znanych sekwencji (GenBank), danych RNA-Seq (NCBI SRA) i PCR/sekwencjonowania. The zaproponowany świński model genu XIST koduje transkrypt o długości 25 215 pz składający się z 7 eksonów, w tym dwóch konserwatywnych i dwóch specyficznych dla świń regionów powtarzalnych. Transkrypcję obejmującą cały region XIST zaobserwowano specyficznie w komórkach komórkach żeńskich, ale nie w komórkach męskich. Zidentyfikowaliśmy również osiem miejsc transkrypcji (TSS) i oceniliśmy wzorce metylacji CpG w górę rzeki (+2,0 kb) i regionach downstream (-2,0 kb). Sześćdziesiąt siedem dwunukleotydów CG zidentyfikowanych w regionie docelowym uznano za kandydujące miejsca CpG i zostały wzbogacone w następujących dwóch regionach: -284 do +53 bp (13 miejsc) i +285 do +1,727 bp (54 miejsca) od wybranego TSS. Męski region 5` XIST (64,5 miejsca, 96,26%) miał wyższy poziom metylacji CpG niż żeńskie DNA (33,4 miejsca, 49,85%). Podsumowując, nasze wyniki ujawniły, że świński gen XIST ulega ekspresji wyłącznie w komórkach żeńskich, na co wpływa niższy poziom metylacji CpG metylacji CpG w przypuszczalnym regionie promotora w porównaniu z komórkami męskimi. XIST świński XIST przedstawiony w tym badaniu stanowi przydatne narzędzie dla powiązanych obszarów badawczych, takich jak obszarów badawczych, takich jak embriologia świń i biologia komórek macierzystych. --- Transkrypcyjne wyciszenie jednego z żeńskich chromosomów X jest precyzyjnie regulowanym procesem. regulowanym procesem, który wymaga akumulacji w cis długiego niekodującego RNA X-inactive-specific transcript (Xist), po którym następuje seria epigenetycznych modyfikacji modyfikacji epigenetycznych. Niewiele wiadomo na temat molekularnej maszynerii regulującej inicjację i utrzymanie wyciszenia chromosomalnego. Tutaj przedstawiamy nową wersję wersję naszego algorytmu catRAPID do badania powiązań Xist z szeregiem białek białkami zaangażowanymi w regulację epigenetyczną, rusztowanie jądrowe, procesy transkrypcji i splicingu. Nasza metoda poprawnie identyfikuje regiony wiązania regiony wiązania i powinowactwa interakcji białkowych, zapewniając potężne teoretyczne ramy do badania inaktywacji chromosomu X i innych zdarzeń, w których pośredniczą przez związki rybonukleoproteinowe. --- Inaktywacja chromosomu X (XCI), wyciszenie jednego z dwóch chromosomów X w żeńskich komórkach XX, wyrównuje dawkę genów sprzężonych z chromosomem X w stosunku do samców XY. W procesie tym pośredniczy niekodujący RNA X nieaktywny specyficzny transkrypt (Xist), który wiąże się in cis i propaguje wzdłuż nieaktywnego chromosomu X elect, wyzwalając wyciszenie całego chromosomu. Mechanizmy, dzięki którym RNA Xist wiąże się i rozprzestrzenia się wzdłuż chromosomu i inicjuje wyciszanie chromosomu za pośrednictwem Xist. pozostają słabo poznane. Gromadzące się dowody sugerują, że chromosom i organizacja jądrowa organizacja jądrowa są ważne w obu procesach. W szczególności, ostatnie badania zidentyfikowały specyficzne czynniki, wcześniej wykazane jako składniki macierzy jądrowej lub rusztowania macierzy jądrowej lub rusztowania, które odgrywają rolę zarówno w wiązaniu RNA przez Xist, jak i w wyciszaniu za pośrednictwem Xist. W niniejszym przeglądzie przedstawiamy perspektywę tych badania w kontekście wcześniejszych prac nad architekturą chromosomu/jądra w XCI. --- Równa ekspresja genów sprzężonych z chromosomem X, takich jak G6PD i PGK u kobiet i mężczyzn oraz Inicjacja inaktywacji chromosomu X jest krytycznie zależna od ekspresji specyficznego transkryptu X-inactive (Xist). Celem Celem niniejszego badania było określenie wpływu produkcji in vitro (IVP) i transferu jądrowego (NT) na względną obfitość (RA) transkryptów X-linked G6PD, PGK i Xist w przedimplantacyjnych zarodkach bydlęcych. W eksperymencie 1, zarodki IVP lub in vivo analizowano pod kątem ekspresji mRNA 3 genów. 3 genów. Stosunek płci wynosił 36% vs. 64% w blastocystach IVP, a zatem znacznie odbiegał od oczekiwanego stosunku 50% w grupie kontrolnej vivo. RA transkryptów G6PD był znacząco wyższy w żeńskich zarodkach IVP niż w zarodkach męskich. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano znaczących różnic między żeńskimi zarodkami in a ich męskimi odpowiednikami. Na etapie moruli, żeńskie zarodki IVP transkrybowały znacznie więcej mRNA PGK niż zarodki męskie. zarodki męskie. Jednak blastocysty nie wykazywały znaczących różnic w transkryptach PGK transkryptów. Nie zaobserwowano różnic dla zarodków in vivo w odniesieniu do w odniesieniu do RA transkryptów PGK. RA mRNA Xist był znacząco wyższy wyższy we wszystkich zarodkach żeńskich niż w ich męskich odpowiednikach. W eksperymencie 2, IVP, rozwinięte in vivo, pochodzące z NT i partenogenetyczne zarodki niosące dwa chromosomy X pochodzenia matczynego i ojcowskiego lub tylko pochodzenia matczynego (partenogenoty). (partenogenoty) analizowano pod kątem RA 3 genów. W morulach pochodzących z NT morulae, RA transkryptów G6PD był znacząco zwiększony w porównaniu z ich odpowiednikami IVP i in vivo. Poziomy transkryptów G6PD były znacząco zwiększone w blastocystach IVP w porównaniu z zarodkami in vivo i partenogenetycznymi. zarodkami partenogenetycznymi. Na etapie moruli transkrypty PGK były podobne we wszystkich grupach. we wszystkich grupach, ale RA transkryptów PGK był znacząco wyższy w blastocystach IVP niż w ich odpowiednikach in vivo, partenogenetycznych i pochodzących z NT. NT. RA Xist był znacząco podwyższony w morulach pochodzących z NT w porównaniu z zarodkami IVP, in vivo i partenogenetycznymi. Pochodzące z NT blastocysty wykazywały zwiększoną ekspresję Xist w porównaniu z IVP, in in vivo i zarodków partenogenetycznych. Wyniki niniejszego badania pokazują po raz pierwszy, że różnice w poziomie transkryptu genów związanych z chromosomem X są związane z zaburzoną kompensacją dawki u żeńskich i męskich zarodków IVP i żeńskich zarodkach pochodzących z NT. Odkrycie to uzasadnia dalsze badania w celu ulepszenia systemów IVP i protokołów NT, aby zapewnić produkcję zarodków o normalnych wzorcach ekspresji genów. wzorcami ekspresji genów. --- Klonowanie ssaków metodą transferu jądra komórki somatycznej (SCNT) jest wysoce nieefektywne. Większość zarodków wytworzonych metodą SCNT umiera po implantacji z powodu niezidentyfikowanych, złożonych błędów epigenetycznych w procesie rozwoju zarodka po implantacji. rozwoju zarodka. Tutaj identyfikujemy najbardziej upstreamowy poziom dysfunkcji prowadzący do rozwoju klonów przy użyciu RNAi przeciwko Xist, genowi odpowiedzialnemu za inaktywację chromosomu X. za inaktywację chromosomu X (XCI). Wcześniejsze wstrzyknięcie siRNA specyficznego dla Xist do zrekonstruowanych oocytów skutecznie skorygowało specyficzną dla SCNT nieprawidłową ekspresję Xist na etapie moruli, ale nie udało się tego zrobić na etapie blastocysty. etapie blastocysty. Stwierdziliśmy jednak, że wkrótce po implantacji, ten nieprawidłowy status XCI w sklonowanych zarodkach został autonomicznie skorygowany zarówno w tkankach zarodkowych, jak i pozazarodkowych. tkankach pozazarodkowych, prawdopodobnie poprzez nowo ustanowioną kontrolę XCI dla zarodków poimplantacyjnych. zarodków po implantacji. Eksperymenty transferu zarodków wykazały, że zarodki poddane działaniu siRNA wykazywały 10-krotnie wyższą przeżywalność niż zarodki kontrolne już w 5,5 dnia embrionalnego i ta wysoka przeżywalność utrzymywała się aż do terminu, co skutkowało znaczną poprawę wydajności klonowania (12% w porównaniu do 1% w grupie kontrolnej). Co ważne, w przeciwieństwie do klonów kontrolnych, te klony Xist-siRNA po urodzeniu wykazywały jedynie ograniczoną dysregulację ekspresji genów, co wskazuje, że korekta ekspresji Xist Xist w zarodkach przedimplantacyjnych miała długoterminowy wpływ na ich postnatalną normalność. normalność postnatalną. Tak więc, w przeciwieństwie do ogólnego założenia, nasze wyniki sugerują, że los klonowanych zarodków jest zdeterminowany niemal wyłącznie przed implantacją przez ich status XCI. Co więcej, nasza strategia stanowi obiecujący obiecujący przełom w klonowaniu SCNT ssaków, ponieważ leczenie RNAi oocytów jest łatwe do zastosowania u większości gatunków ssaków. --- Gen Xist (X inactive specific transcript) odgrywa istotną rolę w inaktywacji chromosomu X inaktywacji chromosomu X. Aby wyjaśnić mechanizmy kontrolujące ekspresję Xist i inaktywację X, zbadaliśmy in vivo interakcje DNA-białko w regionie promotora Xist w mysiej linii komórkowej (BMSL2), która ma rozróżnialne allele Xist. allele Xist. Ślad in vivo został osiągnięty poprzez traktowanie komórek siarczanem dimetylu lub światłem ultrafioletowym, a następnie przez reakcję łańcuchową polimerazy reakcję łańcuchową oczyszczonego DNA. Ekspresyjny allel na nieaktywnym chromosomie X i cichy allel na aktywnym chromosomie X zostały oddzielone przez zastosowanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych przed reakcją łańcuchową polimerazy za pośrednictwem ligacji reakcją łańcuchową polimerazy. Struktura chromatyny promotora Xist została okazała się zgodna ze stanem aktywności genu Xist. Cichy allel (na aktywnym chromosomie X) nie wykazywał żadnych śladów, podczas gdy allel z ekspresją allel (na nieaktywnym chromosomie X) wykazywał ślady w sekwencji konsensusowej dla pola CCAAT, dwóch słabych miejsc Sp1 i słabego pola TATA. --- Inaktywacja X u samic ssaków obejmuje transkrypcyjne wyciszenie całego chromosomu chromosomu w odpowiedzi na działający cis niekodujący RNA, specyficzny dla X nieaktywny transkrypt (Xist). Xist może również inaktywować sekwencje autosomalne, na przykład w przypadku X; translokacje autosomalne; ale tutaj wyciszanie wydaje się być stosunkowo nieefektywne. Ta zmienność została przypisana albo osłabionemu rozprzestrzenianiu się RNA Xist na początku inaktywacji X lub nieefektywnemu utrzymaniu autosomalnego wyciszenia. autosomalnego wyciszania. Dotychczasowe dowody sprzyjały temu drugiemu. Tutaj wykazać osłabione rozprzestrzenianie się Xist RNA na początku inaktywacji X w translokacji T(X;4)37H X;autosom. Nasze odkrycia dostarczają bezpośrednich dowodów że podstawowe cechy chromosomu / chromatyny mogą zakłócać rozprzestrzenianie się pierwotnego sygnału inaktywującego. --- Inicjacja inaktywacji chromosomu X wymaga obecności, in cis, centrum inaktywacji X (XIC). Gen Xist, który znajduje się w regionie XIC zarówno u człowieka, jak i myszy zarówno u ludzi, jak i myszy, i ma unikalną właściwość ekspresji tylko z nieaktywnego chromosomu X w żeńskich komórkach somatycznych, jest znany jako niezbędny dla inaktywacji X w oparciu o ukierunkowane delecje u myszy. Chociaż nasze zrozumienie regulacji rozwojowej i funkcji mysiego genu Xist postępowało szybko, mniej wiadomo o jego ludzkim homologu. Aby rozwiązać i ocenić międzygatunkową konserwację inaktywacji X, sztuczny chromosom drożdży 480-kb zawierający ludzki gen XIST został wprowadzony do mysich zarodkowych komórek macierzystych (ES). mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES). Ludzki transkrypt XIST ulegał ekspresji i mógł pokrywać mysi autosom, z którego został przepisany, co wskazuje, że czynniki czynniki wymagane do asocjacji cis są zachowane w mysich komórkach ES. Cis w wyniku ekspresji ludzkiego transkryptu XIST stwierdzono tylko w części zróżnicowanych komórek, co sugeruje, że zdarzenia zachodzące za RNA XIST które kończą się stabilną inaktywacją mogą wymagać czynników specyficznych dla gatunku. czynniki. Ludzkie RNA XIST wydaje się pokrywać mysie autosomy w komórkach ES przed różnicowaniem in różnicowaniem in vitro, w przeciwieństwie do zachowania mysiego genu Xist w niezróżnicowanych komórkach ES, gdzie występuje niestabilny transkrypt i brak powłoki chromosomowej. powłoki chromosomowej. Może to nie tylko odzwierciedlać istotne różnice gatunkowe w regulacji Xist, ale także dostarcza dowodów na to, że czynniki związane z Xist RNA mogą być już obecne w niezróżnicowanych komórkach ES. --- U myszy aktywność Sry (genu determinującego płeć na chromosomie Y) inicjuje transformację obojętnej gonady w jądro. U ludzi, częściowa duplikacja Xp21 prowadzi do rozwoju jajników zamiast jąder u osobników XY. u osobników XY. Ta obserwacja wskazuje, że determinacja płci może również być również pod wpływem mechanizmu kompensacji dawki genu, oprócz dominującego działania genu Sry. U samic ssaków regulacja dawkowania genów sprzężonych z chromosomem X we wczesnej embriogenezie osiąga się poprzez inaktywację jednego z dwóch chromosomów X. dwóch chromosomów X. Tutaj zbadaliśmy możliwość, że inaktywacja chromosomu X może odgrywać rolę w determinacji płci męskiej. Wykazaliśmy, przy użyciu transgenicznej linii myszy lacZ sprzężonej z chromosomem X, że utrata beta-galaktozydazy występuje w niektórych komórkach somatycznych rozwijającego się męskiego grzbietu moczowo-płciowego. grzbietu. Gdy zmiany związane z apoptozą kanalików mezonefrycznych w w rozwijających się grzbietach moczowo-płciowych, ekspresja genu Xist (X nieaktywnego specyficznego transkryptu) koreluje z inaktywacją X ujawnioną przez utratę aktywności beta-galaktozydazy w bardzo wczesnych komórkach nabłonkowych kanalików mezonefrynowych mezenchymalnych komórkach śródmiąższowych gonad i komórkach nabłonka cewy moczowej. --- Inaktywacja chromosomu X (XCI) u samic ssaków zależy od niekodującego RNA X specyficznego dla inaktywacji (Xist). Mechanizm wyciszania całego chromosomu przez Xist jest słabo poznany. Chociaż ustalono, że region 5' regionu RNA Xist, obejmującego powtórzenia A i zawierającego 7,5-8,5 kopii konserwatywnej 26-merowej sekwencji konserwowanej 26-merowej sekwencji, jest niezbędny do wyciszania za pośrednictwem Xist, informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dla powtórzeń A nie są dostępne. Tutaj, zgłaszamy trójwymiarową strukturę roztworu 14-merowej spinki do włosów w regionie 5 ' regionu ludzkiego powtórzenia A. Ta spinka do włosów jest niezwykle stabilna i przyjmuje nową AUCG, której integralność jest wymagana do wyciszania. Pokazujemy że w przeciwieństwie do wcześniejszych przewidywań, region 3 'pojedynczych lub tandemowych powtórzeń A pośredniczy w tworzeniu dupleksów in vitro. Co istotne, mutacje w tym regionie zakłócają tworzenie dupleksu między powtórzeniami in vitro i znoszą funkcję wyciszającą funkcję wyciszającą powtórzeń A Xist in vivo. Nasze dane sugerują, że cały region A może być stabilizowany przez tworzenie dupleksu między powtórzeniami i jako taki, może stanowić platformę dla multimeryzacji i specyficznego rozpoznawania tetralopów AUCG przez czynniki trans-działające.
Który transkrypt jest odpowiedzialny za inaktywację chromosomu X?
Długi niekodujący RNA Xist (transkrypt specyficzny dla nieaktywnego X)