Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) mogą indukować aberracje chromosomalne i karcynogenezę. kancerogenezę, a ich prawidłowa naprawa ma kluczowe znaczenie dla stabilności genetycznej. Odpowiedź Odpowiedź komórkowa na DSBs zależy od sygnalizacji uszkodzeń, w tym od fosforylacji histonu H2AX (γH2AX). Jednakże, brak tworzenia γH2AX w heterochromatynie (HC) jest zwykle obserwowany po indukcji uszkodzenia DNA. Tutaj, badamy γH2AX i ogniska białek naprawczych wzdłuż liniowych ścieżek jonowych przemierzających heterochromatyczne w komórkach ludzkich lub mysich i stwierdzamy, że DSB i uszkodzenie zaginające się wokół wysoce zagęszczonego DNA. Biorąc pod uwagę liniową ścieżkę ścieżki, takie zginanie wskazuje na przeniesienie uszkodzeń z początkowego miejsca indukcji do peryferii HC. Obrazowanie w czasie rzeczywistym białka naprawczego GFP-XRCC1 potwierdza szybką rekrutację do heterochromatycznych uszkodzeń wewnątrz mysich chromocentrów. Wykorzystując mikro-napromieniowanie pojedynczymi jonami do indukowania zlokalizowanych DSBs bezpośrednio w chromocentrach, wykazujemy, że H2AX jest wcześnie fosforylowany w HC, ale miejsce uszkodzenia jest następnie wydalane z centrum do peryferii chromocentów w ciągu ∼ 20 min. Podczas gdy proces ten może zachodzić przy nieobecności kinazy ATM, naprawa DSB graniczących z HC wymaga tego białka. Wreszcie, opisujemy lokalną dekondensację HC w miejscach trafień jonowych, potencjalnie umożliwiając ruch DSB za pomocą sił fizycznych. --- Rak rozwija się, gdy komórki przestają podążać za normalnym wzorcem kontrolowanego wzrostu. wzrostu. W przypadku braku lub lekceważenia takiej regulacji, wynikającej ze zmian w ich składzie genetycznym, te błędne komórki uzyskują przewagę wzrostu, rozwijając się w przedrakowe klony. W ciągu ostatniej dekady wiele badań ujawniło znaczenie mutacji genomowych w tym procesie, czy to przez błędną replikację, uszkodzenia środowiskowe lub niedobór w naprawie uszkodzeń endogennych i egzogennych. i egzogennych uszkodzeń. Tutaj omawiamy homologiczną rekombinację jako kolejny mechanizm, który może skutkować utratą heterozygotyczności lub rearanżacjami genetycznymi. Niektóre z tych zmian genetycznych mogą odgrywać podstawową rolę w kancerogenezie, ale jednak bardziej prawdopodobne jest, że będą one zaangażowane we wtórne i kolejne etapy w których ujawniają się recesywne mutacje onkogenne. Pacjenci, których komórki wykazują zwiększoną częstotliwość rekombinacji, mają również raka, co dodatkowo potwierdza związek między rekombinacją i kancerogenezą. --- TŁO: Genom jest nieustannie atakowany przez różne czynniki, które które powodują uszkodzenia DNA. Rozpoznanie uszkodzeń DNA aktywuje komórkową odpowiedź na uszkodzenie DNA odpowiedź (DDR), która obejmuje sieć szlaków transdukcji sygnału w celu utrzymania integralności genomu. W odpowiedzi na poważne uszkodzenia DNA, komórki ulegają apoptozie, aby uniknąć transformacji w komórki nowotworowe, lub alternatywnie, komórki wchodzą w trwałe zatrzymanie cyklu komórkowego, zwane starzeniem się. Większość komórek nowotworowych ma w szlakach prowadzących do naprawy DNA lub apoptozy. Ponadto, apoptoza może być przeciwdziałana przez czynnik jądrowy kappa B (NF-κB), główny antyapoptotyczny czynnik transkrypcyjny w DDR. czynnik transkrypcyjny w DDR. Pomimo dużego znaczenia klinicznego wzajemne oddziaływanie szlaków DDR jest słabo poznane. Do celów terapeutycznych procesy sygnalizacji uszkodzeń DNA są indukowane w celu wywołania apoptozy w komórkach nowotworowych. Jednak skuteczność radio- i chemioterapii jest silnie hamowana przez szlaki przeżycia komórek nowotworowych. przeżycia w komórkach nowotworowych. W niniejszym badaniu przeprowadzono modelowanie logiczne aby ułatwić zrozumienie złożoności sieci transdukcji sygnału w DDR i zapewnić sieci transdukcji sygnału w DDR i zapewnienie opcji leczenia raka. WYNIKI: Nasz kompleksowy dyskretny model logiczny dostarczył nowych informacji na temat dynamikę DDR w ludzkich nowotworach nabłonkowych. Zidentyfikowaliśmy nowe mechanizmy w których komórka reguluje dynamikę aktywacji supresora nowotworu p53 i NF-κB. Symulowanie interwencji terapeutycznej środkami powodującymi pęknięcia jednoniciowe DNA jednoniciowe (SSBs) lub dwuniciowe (DSBs) DNA, zidentyfikowaliśmy kandydujące białka docelowe do uwrażliwienia raków na interwencję terapeutyczną interwencję terapeutyczną. Ponadto, wyjaśniliśmy DDR w różnych chorobach genetycznych i przez analizę trybu awaryjnego zdefiniowaliśmy defekty molekularne, które mogą przyczyniać się do kancerogenezy. WNIOSKI: Dzięki modelowaniu logicznemu zidentyfikowaliśmy białka docelowe, które które mogą być odpowiednie dla radio- i chemioterapii, i przyczynia się do projektowania bardziej skutecznych terapii. --- W celu zbadania roli przetwarzania uszkodzeń DNA w rozwoju skórnego raka płaskonabłonkowego (SCC), oceniliśmy zdolność sześciu linii komórkowych linii komórkowych keratynocytów z wieloetapowego modelu progresji nowotworu do naprawy trzech rodzajów uszkodzeń DNA: dimerów pirymidynowych, oksydacyjnych uszkodzeń DNA i dwuniciowych pęknięć DNA pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB). Model obejmował spontanicznie unieśmiertelnione, nienowotworową linię komórek ludzkich keratynocytów HaCaT, cztery różne transfekanty c-Ha-ras HaCaT (nienowotworowe, łagodne i dwa złośliwe) oraz linię komórkową pochodzącą z linia komórkowa pochodząca z SCC. Testy reaktywacji komórek gospodarza z wektorami plazmidowymi UVB pRSVcat nie wykazały znacząco zmienionej naprawy indukowanych UVB dimerów pirymidyny w nowotworowych liniach komórkowych w porównaniu z liniami nienowotworowymi. Przy użyciu plazmidów pRSVcat poddanych działaniu tlenu singletowego, klony Ha-ras-HaCaT i komórki SCC komórki SCC wykazywały wydajność naprawy DNA, która nie różniła się znacząco od różniła się znacząco od komórek HaCaT. W celu oceny zdolności komórek do ligacji wolnych końców DNA (naprawa DSB), zastosowaliśmy test wektora wahadłowego plazmidu z linearyzowanym plazmidem pZ189. Stwierdziliśmy znaczny wzrost zdolności DNA w nienowotworowych, łagodnych i w jednym z nowotworów złośliwych. HaCaT II-4. Jednakże złośliwy klon HaCaT II-3 wykazywał znacznie niższy wskaźnik ponownego przyłączania zlinearyzowanego plazmidu. Ta linia komórkowa wykazała również wysoce i znacząco podwyższony wskaźnik mikrojąder, który odzwierciedla wyraźną niestabilność chromosomalną. Komórki SCC wykazywały bardziej skuteczniejszą naprawę DSB DNA niż komórki HaCaT. Wnioskujemy, że w badanym modelu badanym modelu, progresja ludzkich keratynocytów od fenotypu nienowotworowego do do fenotypu wysoce nowotworowego, nie towarzyszy spadek zdolności komórek do naprawy DSB DNA zdolności komórek do naprawy uszkodzeń DNA wywołanych promieniowaniem UVB i tlenem singletowym. Jednakże nabyty niedobór naprawy podwójnych pęknięć nici DNA może być jednym z mechanizmów promującym progresję w kierunku złośliwości, prawdopodobnie poprzez upośledzenie stabilności chromosomalnej. stabilność chromosomów. --- Stwierdzono, że przewlekły stan zapalny wywołany przez czynniki biologiczne, chemiczne i fizyczne Stwierdzono, że jest on związany ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka w różnych narządach. Wykazaliśmy, że czynniki zakaźne, w tym motylica wątrobowa, Helicobacter pylori, i wirus brodawczaka ludzkiego oraz czynniki niezakaźne, takie jak włókno azbestowe indukowały zależne od iNOS tworzenie 8-nitroguaniny i 8-okso-7, 8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oksodG) w tkankach nowotworowych i obszarach przedrakowych. regionach. Nasze wyniki dotyczące kolokalizacji fosforylowanego ATM i γ-H2AX z 8-oksodG i 8-nitroguaniną w tkankach nowotworowych związanych ze stanem zapalnym sugerują, że że uszkodzenia zasad DNA prowadzą do pęknięć dwuniciowych. Jest to interesujące z punktu widzenia aspekt niestabilności genetycznej. Wykazaliśmy również, że IL-6 moduluje ekspresję iNOS poprzez STAT3 i EGFR w raku jamy nosowo-gardłowej związanym z wirusem Epsteina-Barr i stwierdziliśmy hipermetylację promotorów w kilku genach supresorowych nowotworów. Taka zmiana epigenetyczna może wystąpić poprzez kontrolowanie metylacji DNA poprzez IL-6 za pośrednictwem szlaków JAK/STAT3. Podsumowując, 8-nitroguanina byłaby użytecznym biomarkerem do przewidywania ryzyka nowotworów związanych ze stanem zapalnym. --- Nowotworowa rola szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA (DSBs) naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) została zasugerowana przez nasze odkrycie znaczącego związku między zwiększonym ryzykiem raka piersi a kooperatywnym polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genach NHEJ. Aby potwierdzić to aby potwierdzić to odkrycie, w tym badaniu kliniczno-kontrolnym wykryto zarówno in vivo, jak i in vitro DNA (EJ) w immortalizowanych wirusem Epsteina-Barr komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). komórek jednojądrzastych (PBMC) 112 pacjentek z rakiem piersi i 108 zdrowych osób z grupy kontrolnej w celu zidentyfikowania indywidualnych różnic w zdolności EJ do naprawy DSB jako czynnika ryzyka predysponującym kobiety do raka piersi. PBMC od pacjentek z rakiem piersi konsekwentnie wykazywały niższe wartości zdolności EJ in vivo i in vitro niż od zdrowych kobiet (P < 0,05). Regresja logistyczna, jednocześnie biorąc pod uwagę wpływ znanych czynników ryzyka raka piersi, wykazała, że zdolność EJ in in vitro powyżej mediany osób kontrolnych była związana z prawie 3-krotnie zwiększonym ryzykiem raka piersi. prawie 3-krotnie zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka piersi (skorygowany iloraz szans, 2,98; 95% przedział ufności, 1,64-5,43). Ponadto, zależność dawka-odpowiedź była między ryzykiem zachorowania na raka piersi a zdolnością EJ, która była analizowana jako zmienna zmienna ciągła (każda jednostka spadku pojemności EJ była związana z 1,09-krotnym wzrostem ryzyka raka piersi) i została podzielona na tercyle na podstawie wartości pojemności EJ w grupie kontrolnej (P dla trendu < 0,01). Wyniki że NHEJ może odgrywać rolę w podatności na raka piersi. raka piersi. --- Kinaza białkowa Aurora-A jest głównym regulatorem cyklu komórkowego, który orkiestruje wejście mitotyczne i jest wymagana do montażu funkcjonalnego wrzeciona mitotycznego. wrzeciona mitotycznego. Nadekspresja Aurory-A została silnie powiązana z onkogenezą onkogenezą, co doprowadziło do znacznych wysiłków na rzecz terapeutycznego ukierunkowania aktywność kinazową tego białka. Jednak dokładny mechanizm, za pomocą którego Aurora-A promuje onkogenezę pozostaje niejasny. Tutaj pokazujemy, że Aurora-A moduluje naprawę dwuniciowych pęknięć DNA (DSB). Ekspresja Aurory-A hamuje rekrutację RAD51 do DSB DNA, zmniejsza naprawę DSB przez homologiczną rekombinację rekombinację i uwrażliwia komórki nowotworowe na inhibicję PARP. To upośledzenie funkcji RAD51 wymaga zahamowania CHK1 przez kinazę polipodobną 1 (PLK1). Te wyniki identyfikują nową funkcję Aurory-A w modulowaniu odpowiedzi na DSB DNA DSB, która prawdopodobnie przyczynia się do kancerogenezy i sugeruje nowe podejście terapeutyczne do leczenia nowotworów z nadmiernym podejście terapeutyczne do leczenia nowotworów z nadekspresją tego białka. --- Białko supresorowe raka piersi 1 (BRCA1) chroni nasze komórki przed niestabilnością genomową komórki przed niestabilnością genomową, częściowo poprzez ułatwianie skutecznej naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB). BRCA1 promuje bezbłędną naprawę DSBs poprzez homologiczną rekombinację i jest również zaangażowana w regulację niehomologicznego łączenia końców (NHEJ). Tutaj badamy rolę BRCA1 w mutagenezie naprawy NHEJ po DSB. Zbadaliśmy częstotliwość łączenia końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i wierność naprawy DSB w stosunku do poziomów białka BRCA1 zarówno w kontrolnych, jak i nowotworowych komórkach nabłonka komórek nabłonkowych piersi. Oprócz zmienionych poziomów białka BRCA1, przetestowaliśmy wpływ ekspozycji komórek na mirynę, inhibitor rekombinacji mejotycznej enzymu 11 (Mre11) 3'-5'-ekonukleazy. Zablokowanie lub utrata białka BRCA1 skutkowało zwiększoną częstotliwością ogólnej mutagenezy plazmidowego DNA i MMEJ po DSB. Zahamowanie aktywności egzonukleazy Mre11 za pomocą mirin znacznie zmniejszyło występowanie MMEJ, ale nie wpłynęło znacząco na ogólną mutagenną częstotliwość naprawy DSB plazmidu. Wyniki sugerują, że BRCA1 chroni DNA przed mutagenezą podczas niehomologicznej naprawy DSB w testach w testach plazmidowych. Zwiększona częstotliwość mutagenezy DSB i naprawy MMEJ przy braku BRCA1 sugeruje potencjalny mechanizm kancerogenezy. --- W ludzkich komórkach pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) są naprawiane głównie przez proces łączenia końca DNA (EJ). proces łączenia końców DNA (EJ), a zatem nieprawidłowa aktywność EJ DNA prowadzi do mutacji i/lub aneuploidii, co skutkuje niestabilnością genetyczną komórek. komórek. Ponieważ niestabilność genetyczna jest cechą charakterystyczną komórek nowotworowych, zbadaliśmy DNA EJ normalnych, niezłośliwych immortalizowanych i złośliwych ludzkich komórek nabłonkowych, aby zbadać komórek nabłonkowych, aby zbadać związek między DNA EJ a kancerogenezą. kancerogenezą. Stwierdziliśmy znaczne zmniejszenie precyzyjnej (wolnej od błędów) aktywności DNA EJ w niezłośliwych unieśmiertelnionych ludzkich keratynocytach jamy ustnej (HOK-16B) i ludzkich komórkach raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) w porównaniu z komórkami normalnych ludzkich keratynocytów jamy ustnej (NHOK). Co więcej, nieprawidłowe aktywności DNA EJ zostały wykryte wyłącznie w komórkach HOK-16B i HNSCC z powodu za pośrednictwem mikrohomologii i nie za pośrednictwem mikrohomologii w tych komórkach. w tych komórkach. Dane te wskazują, że nieprawidłowa aktywność DNA EJ może być częściowo odpowiedzialna za niestabilność genetyczną i transformację onkogenną. --- Odpowiedź komórek na indukowane promieniowaniem jonizującym dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) jest określana przez aktywację wielu ścieżek mających na celu naprawę uszkodzeń i utrzymanie integralności genomu. Gęste promieniowanie jonizujące indukuje złożone uszkodzenia składające się z różnych typów zmian DNA w bliskim sąsiedztwie które są trudne do naprawy i mogą sprzyjać karcynogenezie. Niewiele wiadomo o dynamicznym zachowaniu białek naprawczych na złożonych uszkodzeniach. W tym badaniu wykorzystujemy obrazowanie na żywo w komórkach do przestrzenno-czasowej charakterystyki wczesnych interakcji białkowych w miejscach uszkodzeń o rosnącej złożoności. Mikroskopia Beamline mikroskopia została wykorzystana do obrazowania żywych komórek wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka podczas i bezpośrednio po napromieniowaniu naładowanymi cząstkami, aby ujawnić akumulacji białek w uszkodzonych miejscach w czasie rzeczywistym. Informacje na temat mobilności i szybkości wiązania zrekrutowanych białek uzyskano z fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Rekrutacja czujnika uszkodzeń DNA białka NBS1 przyspiesza wraz ze wzrostem gęstości uszkodzeń i nasyca się przy bardzo wysokich poziomach uszkodzeń. Pomiary FRAP ujawniły dwa różne sposoby wiązania NBS1 do miejsc uszkodzenia i bezpośredni wpływ złożoności uszkodzenia na wiązanie. Szybszą rekrutację wraz ze wzrostem złożoności uszkodzenia zaobserwowano również dla mediatora mediatora MDC1, ale mobilność była ograniczona przy bardzo wysokiej gęstości uszkodzeń z powodu wiązania w całym jądrze. Skonstruowaliśmy minimalny model komputerowy początkowej odpowiedzi na DSB oparty wyłącznie na znanych interakcjach białkowych. Dopasowując wszystkie zmierzone dane przy użyciu tego samego zestawu parametrów, możemy odtworzyć eksperymentalnie scharakteryzowane etapy odpowiedzi na uszkodzenie DNA w szerokim zakresie gęstości uszkodzeń. Model sugeruje, że wpływ rosnącej gęstości uszkodzeń przyspieszających rekrutację NBS1 zależy tylko od różnych sposobów wiązania NBS1, bezpośrednio do DSB i do otaczającej chromatyny poprzez MDC1. To wyjaśnia wpływ grupowania uszkodzeń na naprawę bez potrzeby wywoływania dodatkowych etapów przetwarzania. dodatkowych etapów przetwarzania. --- Sześciowartościowy chrom Cr(VI) jest substancją toksyczną dla układu oddechowego i rakotwórczą. rozpuszczalność odgrywa ważną rolę w jego potencjale rakotwórczym. Cynk chromian cynku, nierozpuszczalny w wodzie lub "cząsteczkowy" związek Cr(VI), okazał się rakotwórczy w badaniach epidemiologicznych. rakotwórczy w badaniach epidemiologicznych i wywoływał nowotwory u zwierząt doświadczalnych, ale jego genotoksyczność zwierząt, ale jego genotoksyczność jest słabo poznana. Nasze badanie pokazuje, że chromian cynku chromian cynku indukował zależny od stężenia wzrost cytotoksyczności, uszkodzenia chromosomów uszkodzeń chromosomów i pęknięć podwójnej nici DNA w ludzkich komórkach płuc. W odpowiedzi na pęknięcia indukowane chromianem cynku, ekspresja MRE11 była zwiększona, a ATM i ATR były fosforylowane, co wskazuje, że system naprawy podwójnej nici DNA został w komórkach. Ponadto, nasze dane pokazują, że indukowane chromianem cynku pęknięcia podwójnej nici były obserwowane tylko w populacji fazy G2/M, bez nie zaobserwowano znaczącej ilości pęknięć podwójnych nici w komórkach fazy G1 i S. Dane te pomogą w zrozumieniu mechanizmów toksyczności chromianu cynku i kancerogenezy. --- Połączony wpływ wanadu i beta-karotenu na przerwanie łańcucha DNA w wątrobie szczura i Analizę emisji rentgenowskiej indukowanej protonami (PIXE) badano podczas nekrogennej dawki (200 mg/kg masy ciała) nitrozoaminy dietylu (DENA) indukowanej wątrobą szczura kancerogeneza. Zaobserwowano zmiany morfologiczne i histopatologiczne jako biomarker punktu końcowego. biomarker punktu końcowego. Suplementacja wanadu (0,5 ppm ad libitum) w wodzie pitnej i beta-karotenie wody pitnej i beta-karotenu w diecie podstawowej (120 mg / kg masy ciała) przeprowadzono cztery tygodnie przed leczeniem DENA i kontynuowano do końca eksperymentu (16 tygodni). Analiza PIXE wykazała przywrócenie prawie normalnych wartości cynku, miedzi i żelaza. cynku, miedzi i żelaza, które uległy znacznym zmianom w porównaniu z grupami leczonymi do grup leczonych kancerogenami. Suplementacja zarówno wanadu, jak i beta-karotenu cztery tygodnie przed wstrzyknięciem DENA zapewniała znaczącą (64,73%, P < 0,001) ochronę przed generowaniem jednoniciowych pęknięć w porównaniu z kontrolnymi częściami rakotwórczymi. Zaobserwowano znaczną stabilizację architektury architektura komórek została zaobserwowana w porównaniu do kontroli rakotwórczej w grupie leczonej wanadem i beta-karotenem. Badanie to sugeruje zatem, że wanad, prooksydant, ale potencjalny środek terapeutyczny, daje bezpieczną i skuteczną preparat farmakologiczny z beta-karotenem, przeciwutleniaczem, w hamowanie eksperymentalnej hepatokarcynogenezy szczurów. --- Wstęp: Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest nowotworem, dla którego częstość występowania i śmiertelność są bardzo wysokie na Tajwanie. Niehomologiczny gen naprawy XRCC6/Ku70 odgrywa ważną rolę w naprawie pęknięć dwuniciowych (DSB) DNA. (DSB) indukowanych zarówno przez egzogenne, jak i endogenne czynniki uszkadzające DNA. czynniki uszkadzające DNA. Defekty w ogólnej zdolności naprawy DSB mogą prowadzić do niestabilności genomu i karcynogenezy. niestabilności genomowej i kancerogenezy. W tym badaniu zbadaliśmy udział wariantu XRCC6 w odniesieniu do ryzyka HCC, z poziomów DNA, RNA i białka. białka. MATERIAŁY I METODY: W tym szpitalnym badaniu kliniczno-kontrolnym wzięło udział 298 pacjentów z HCC i 298 kontroli wolnych od raka, z częstotliwością dopasowaną do wieku i płci. Po pierwsze, powiązania promotora XRCC6 T-991C (rs5751129), promotora G-57C (rs2267437), promotora A-31G (rs132770) i intronu-3 (rs132774) z ryzykiem HCC w tej tajwańskiej populacji. Po drugie, przetestowano 30 próbek tkanek HCC z wariantowymi genotypami w celu oszacowania ekspresji mRNA XRCC6 metodą ilościowej odwrotnej transkrypcji w czasie rzeczywistym. Wreszcie, próbki tkanek HCC o różnych genotypach zostały zbadane za pomocą immunohistochemię i western blotting w celu oszacowania poziomu ekspresji białka XRCC6 poziomy ekspresji. WYNIKI: W porównaniu z genotypem TT, genotypy TC i CC przypisywały znacząco zwiększone ryzyko HCC [skorygowany iloraz szans (aOR)=2,43 i 3,52, 95% przedział ufności (CI)=1,52-4,03 i 1,18-13,36, p=0,0003 i 0,0385, odpowiednio]. Poziomy ekspresji mRNA i białka w tkankach HCC ujawniły statystycznie istotnie niższą ekspresję mRNA i białka XRCC6 w próbkach HCC z genotypami TC/CC w porównaniu z próbkami z genotypem TT (p=0,0037 i 0,0003, odpowiednio). WNIOSEK: Nasze wieloaspektowe wyniki na poziomie DNA, RNA i białka sugerują, że XRCC6 może odgrywać ważną rolę w kancerogenezie HCC w populacji tajwańskiej. populacji Tajwanu. --- Wadliwa odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) może skutkować niestabilnością genomową (GIN) i prowadzić do transformacji w raka. Białko wiążące P53 1 (53BP1) należy do rodziny ewolucyjnie konserwowanych białek DDR. Ponieważ cząsteczki 53BP1 lokalizują się w miejscach pęknięć podwójnej nici DNA (DSB) i szybko tworzą ogniska ogniska jądrowe, obecność ognisk 53BP1 można uznać za marker cytologiczny dla endogennych DSB odzwierciedlających GIN. Chociaż zaproponowano, że GIN odgrywa kluczową rolę w progresji kluczową rolę w progresji nowotworów tarczycy, znaczenie GIN podczas nowotworzenia tarczycy pozostaje niejasne, szczególnie u pacjentów. My przeanalizowaliśmy zatem poziom GIN, wykryty za pomocą immunofluorescencji 53BP1, w 40 przypadkach wyciętych tkanek tarczycy. Badanie to wykazało liczbę jądrowych ognisk 53BP1 w rakach tarczycy, co sugeruje konstytutywną aktywację DDR w komórkach raka tarczycy. Ponieważ gruczolak pęcherzykowy również wykazywał kilka ognisk jądrowych 53BP1, GIN może być indukowany na przedrakowym etapie nowotworzenia tarczycy. tarczycy. Ponadto, raki tarczycy o wysokim stopniu złośliwości wykazywały wyraźnie intensywne i heterogeniczne barwienie jądrowe immunoreaktywności 53BP1, które było zaobserwowano również w nowotworach związanych z promieniowaniem oraz w mysich kryptach okrężnicy jako opóźniona odpowiedź na wysoką dawkę promieniowania jonizującego, co sugeruje zwiększoną GIN wraz z progresją raka. W związku z tym niniejsze badanie wykazało różnicę w wzorze barwienia 53BP1 podczas raka tarczycy. Proponujemy, aby analiza immunofluorescencyjna ekspresji 53BP1 może być użytecznym narzędziem do oceny poziomu GIN i jednocześnie złośliwości ludzkich guzów tarczycy. nowotworów tarczycy. --- CELE: Wadliwa odpowiedź na uszkodzenia DNA może skutkować niestabilnością genomową (GIN) i prowadzić do transformacji w raka. Ponieważ białko 1 wiążące p53 (53BP1) lokalizuje się w miejscach podwójnych pęknięć nici DNA (DSB) i szybko tworzy ogniska jądrowe (NF), obecność 53BP1 NF może być uważana za wskaźnik endogennych DSBs odzwierciedlających GIN. Naszym celem było przeanalizowanie obecności DSBs poprzez immunofluorescencji dla ekspresji 53BP1 w serii zmian szyjki macicy, aby ocenić znaczenie GIN podczas kancerogenezy. METODY I WYNIKI: Łącznie 80 archiwalnych próbek tkanki szyjki macicy, w tym 11 prawidłowych, 16 próbek śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy (CIN)1, 15 CIN2, 24 CIN3 i 14 raka płaskonabłonkowego, analizowano pod kątem 53BP1 NF, wirusa brodawczaka ludzkiego zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) i nadekspresji p16(INK4a). Liczba 53BP1 NF w komórkach szyjki macicy wydawała się wzrastać wraz z progresją podczas karcynogenezy. Rozkład 53BP1 NF był podobny do rozkładu sygnałów punktowych sygnałów HPV określonych przez hybrydyzację in situ, a także do p16 (INK4a) w CIN, co sugeruje związek z infekcją wirusową i stresem replikacyjnym. stresem replikacyjnym. WNIOSKI: Analiza immunofluorescencyjna ekspresji 53BP1 może być użytecznym narzędziem do oceny poziomu GIN. Podczas kancerogenezy szyjki macicy, GIN może umożliwić dalszą akumulację zmian genomowych, powodując progresję do raka inwazyjnego. do raka inwazyjnego. --- Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) są indukowane przez promieniowanie jonizujące (IR) i różne czynniki bezpośrednio lub pośrednio w wyniku naprawy DNA, rekombinacji i replikacji uszkodzonego DNA. naprawy, rekombinacji i replikacji uszkodzonego DNA. Są one ostatecznie zaangażowane w generowanie aberracji chromosomalnych i zostały zgłoszone jako powodujące niestabilność genomową, amplifikację genów i śmierć komórek rozrodczych. Aby odpowiedzieć na pytanie pytanie, czy DSB działają jako wyzwalacz apoptozy, indukowaliśmy DSB przez za pomocą elektroporacji enzymów restrykcyjnych i porównaliśmy efekt z IR w fibroblastach myszy, które różnią się statusem p53 [typ dziki (+/+) versus komórki z niedoborem p53 (-/-)]. Pokazujemy, że (i) elektroporacja PVU:II jest wysoce skuteczna w indukcji DSB, (ii) elektroporacja PVU:II zwiększa szybkość apoptozy, ale nie szybkość apoptozy, ale nie nekrozy w komórkach p53-/-, (iii) leczenie promieniami gamma indukuje zarówno promieniami gamma indukuje zarówno apoptozę, jak i nekrozę w komórkach p53-/-, (iv) częstotliwość DSBs częstotliwość DSB koreluje z wydajnością apoptozy i (v) zarówno PVU:II, jak i leczenie promieniami gamma promieniowanie gamma zmniejszają poziom antyapoptotycznego białka Bcl-2 w komórkach p53-/- podczas gdy poziom Bax pozostaje niezmieniony. Komórki wyrażające dziki typ p53 były bardziej odporne na indukcję apoptozy niż komórki z niedoborem p53 i nie wykazywały spadku Bcl-2 po leczeniu PVU:II i promieniami gamma. Dane dane dostarczają dowodów na to, że stępione DSB indukowane przez enzym restrykcyjny PVU:II działają jako wysoce skuteczny czynnik wyzwalający apoptozę, ale nie nekrozę. Proces ten proces jest związany ze spadkiem Bcl-2 i nie wymaga p53. --- Test kometowy w warunkach neutralnych umożliwia wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA (DSB), co ma wpływ na niestabilność genomu i kancerogenezę. Niniejsze badanie ma na celu walidację neutralnego testu Comet dla genotoksyczności oceny genotoksyczności u Drosophila melanogaster (Oregon R(+)) z trzema dobrze znanymi induktorami DSBs induktorami DSB, tj. cyklofosfamidem (CP), bleomycyną (BLM), cisplatyną (CPT) oraz a następnie jego skuteczność w wykrywaniu DSBs w organizmie narażonym na dobrze chrom [Cr(VI)]. Larwy D. melanogaster podawano różne stężenia BLM, CPT i CP (50.0-200.0μg/ml) lub Cr(VI) (5.0-20.0μg/ml) zmieszane ze standardowym pokarmem dla Drosophila przez 48h. 48h. Test Neutral Comet przeprowadzono w komórkach jelita środkowego i mózgu larw kontrolnych i leczonych. kontrolnych i leczonych larw. Nasze wyniki wskazują na zależny od dawki wzrost migracji DNA w komórkach narażonych organizmów. Porównanie uszkodzeń DNA na liczbę moli badanej substancji chemicznej w narażonych grupach wykazało, że zarówno BLM, jak i CPT indukują więcej DSB niż CP. Co ciekawe, Cr(VI) w stężeniu 20,0 μg/ml stwierdzono, że indukuje znacznie zwiększone (p<0,001) DSBs w narażonym organizmie w porównaniu do kontroli. Badanie podczas walidacji neutralnego testu Comet w D. melanogaster sugeruje jego zastosowanie do oceny in vivo DSBs indukowanych przez chemikalia środowiskowe. --- Kiedy komórki napotykają stres genotoksyczny, czujniki uszkodzeń DNA stabilizują i aktywują p53; zaangażowane sygnały są jednak w dużej mierze niejasne. Nieorganiczny arsenin jest wszechobecnym zanieczyszczeniem środowiska związanym ze zwiększonym ryzykiem uszkodzenia płuc i skóry oraz raka. ryzykiem uszkodzenia płuc i skóry oraz raka. Chociaż pęknięcia podwójnej nici DNA i apoptoza mogą odnosić się do uszkodzeń wywołanych arsenitem i kancerogenezy, mechanizm działania pozostaje niejasny. mechanizm działania pozostaje niejasny. Tutaj stwierdzamy, że w ludzkich zarodkowych fibroblastach płuc (HELF), arsenin indukuje aktywację zależnej podjednostki katalitycznej kinazy białkowej podjednostki katalitycznej kinazy białkowej (DNA-PKcs), która następnie fosforyluje i aktywuje c-Jun N-końcową kinazę 2 (JNK2), ale nie JNK1. Jako pozytywny regulator p53, JNK2 wiąże się z p53 i zapobiega pośredniczeniu p53 przez mysią podwójną minutę 2 (mdm2), degradacji zależnej od proteasomu ubikwityny. Zablokowanie szlaku sygnałowego DNA-PKcs/JNK2 lub p53 zmniejsza apoptozę, ale zwiększa uszkodzenia DNA indukowane przez wysoki poziom arsenianu. poziom arsenitu. Wyniki te sugerują, że stabilizacja p53 za pośrednictwem DNA-PKcs p53 przez JNK2 jest zaangażowana w indukowane arsenitem uszkodzenia DNA i apoptozę. --- Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) są najbardziej szkodliwymi uszkodzeniami powodowanymi przez promieniowanie jonizujące. promieniowanie jonizujące. Chociaż DSBs są potencjalnie rakotwórcze, nie jest jasne nie jest jasne, czy złożone DSB, które są oporne na naprawę, są silniej rakotwórcze w porównaniu z prostymi przerwami, które mogą być szybko naprawione, poprawnie lub nieprawidłowo przez komórki ssaków. Wcześniej wykazaliśmy, że złożone DSBs indukowane przez jony Fe o wysokim liniowym transferze energii (LET) są naprawiane powoli i niekompletnie. niekompletnie, podczas gdy te indukowane przez promienie gamma o niskim LET są naprawiane skutecznie przez komórki ssaków. Aby ustalić, czy DSB indukowane przez Fe są bardziej silniej rakotwórcze niż pęknięcia indukowane promieniami gamma, napromieniowaliśmy "uwrażliwione mysie astrocyty, które miały niedobór supresorów nowotworów Ink4a i Arf oraz i wstrzyknęliśmy ocalałe komórki podskórnie nagim myszom. Korzystając z tego modelu system, stwierdziliśmy, że jony Fe są silnie nowotworowe, generując guzy ze znacznie wyższą częstotliwością i krótszym czasem utajenia w porównaniu z guzami generowanymi przez promienie gamma. Powstawaniu guzów przez napromieniowane Fe komórki towarzyszy przez szalejącą niestabilność genomową i liczne zmiany genomowe, z których najbardziej najciekawszą z nich jest utrata supresora nowotworu p15/Ink4b spowodowana delecją regionu chromosomalnego zawierającego loci CDKN2A i CDKN2B. Dodatkowa utrata p15/Ink4b w guzach pochodzących z komórek, które mają już niedobór p16/Ink4a wzmacnia hipotezę, że p15 odgrywa ważną rolę w supresji guza supresji nowotworów, szczególnie w przypadku braku p16. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że reekspresja p15 w komórkach nowotworowych znacząco osłabia potencjał nowotworowy tych komórek, wskazując, że p15 tych komórek, wskazując, że utrata p15 może być krytycznym wydarzeniem w nowotworzeniu wywołanym przez złożone DSB. --- Naprawa dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) jest niezbędna dla żywotności komórek i stabilności genomu. stabilności genomu. Naprawa rekombinacji homologicznej odgrywa ważną rolę w naprawie DSB a upośledzenie tego mechanizmu naprawczego może prowadzić do utraty integralności genomu. integralności genomu, co jest jedną z cech charakterystycznych raka. Ostatnie badania wykazały że geny supresorowe nowotworów p53 oraz BRCA1 i -2 są zaangażowane w prawidłową kontrolę rekombinacji homologicznej. kontrolę rekombinacji homologicznej, co sugeruje rolę tego typu naprawy w raku ludzkiego raka. Opracowaliśmy nowy test oparty na rekombinacji między dwoma genami sekwencjami białka zielonej fluorescencji (GFP) w transfekowanym plazmidzie DNA. DNA. Konstrukt plazmidowy zawiera nienaruszony, przesunięty w emisji, "niebieski" wariant GFP (BFP), z odcinkiem 300 nukleotydów homologii do niefunkcjonalnej kopii GFP. W przypadku braku homologicznej rekombinacji obecny jest tylko BFP, ale rekombinacja homologiczna może stworzyć funkcjonalny GFP. Regiony homologiczne w plazmidzie w plazmidzie zostały skonstruowane zarówno w bezpośredniej, jak i odwróconej orientacji transkrypcji transkrypcji w celu wykrycia możliwych różnic w mechanizmach rekombinacji rekombinacji. Panel ludzkich linii komórek nowotworowych został wybrany na podstawie tła genetycznego i integralności chromosomów. i integralności chromosomów i przetestowano pod kątem homologicznej rekombinacji przy użyciu tego testu. Panel obejmował linie komórkowe o różnych poziomach kariotypowych, izogeniczne linie komórkowe z prawidłowym i zmutowanym p53, izogeniczne linie komórkowe z lub bez naprawy niedopasowania DNA, zmutowane linie komórkowe BRCA1 i -2 oraz linie komórkowe chłoniaka oraz linia komórkowa chłoniaka DT40. W tym teście zaobserwowano różnice między liniami komórkowymi o najniższych i najwyższych poziomach rekombinacji rekombinacji były około 100-krotne. Zwiększone poziomy rekombinacji były związane ze zmutowanym p53, podczas gdy niski poziom rekombinacji stwierdzono w linii komórkowej zmutowanej linii komórkowej BRCA1. W linii komórkowej HT1080TG, zmutowanej pochodnej HT1080 z dwoma zmutowanymi allelami p53, stwierdzono wysoki poziom rekombinacji z bezpośrednią orientacją, ale nie z plazmidem o orientacji bezpośredniej, ale nie z plazmidem o orientacji odwróconej. Nie wykryto różnicy w rekombinacji między dwiema izogenicznymi liniami komórkowymi, które różniły się jedynie zdolnością naprawy niedopasowania DNA. Wnioskujemy, że ten test może wykryć różnice w zdolności do rekombinacji homologicznej w hodowanych liniach komórkowych i że różnice te są zgodne z wzorcami, których można by oczekiwać od różnych genotypów tych linii komórkowych. Przyszłe zastosowanie w normalnych komórkach może być przydatne do identyfikacji determinantów genetycznych kontrolujących integralność genomu lub do wykrywania różnic w zdolności naprawy DNA u poszczególnych osób. --- TŁO: Indukcja podwójnych pęknięć nici DNA i zmiany w naprawie tych pęknięć tych pęknięć jest związana z karcynogenezą piersi. Wcześniejsze badania wykazały, że komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od pacjentek z rakiem piersi wykazują zwiększoną liczbę pęknięć nici DNA po ekspozycji na promieniowanie jonizujące. promieniowanie jonizujące, ale badania te nie mierzyły konkretnie podwójnych pęknięć nici DNA i nie wiadomo, czy chemiczne czynniki rakotwórcze wywołują podobne efekty. efekty. MATERIAŁY I METODY: PBMC od 32 kobiet poddawanych operacji piersi były genotypowane w dziewięciu loci siedmiu genów naprawy DNA. Naprawę podwójnej nici DNA mierzono za pomocą neutralnego testu kometowego po ekspozycji na promieniowanie jonizujące (0,5 Gy) lub bioaktywowany benzo[a]piren (B[a]P, 5 mikroM). WYNIKI: PBMC od pacjentek z rakiem piersi wykazywały wyższe poziomy pozostałości DNA pęknięć podwójnej nici 30 minut po ekspozycji na promieniowanie niż PBMC od pacjentów z łagodną chorobą piersi (1,40-krotność wartości wyjściowej [95% przedział ufności [CI] 1,29-1,51] w porównaniu z 1,24-krotnością wartości wyjściowej [95% CI 1,15-1,33], odpowiednio, P = 0.04). Odpowiedź na B[a]P wykazywała tendencję w tym samym kierunku, ale nie osiągnęła istotności statystycznej. Genotyp wariantu MGMT K178R był związany z lepszą naprawą podwójnych pęknięć nici DNA w PBMC narażonych na B[a]P. WNIOSKI: Zmniejszona naprawa indukowanych promieniowaniem podwójnych pęknięć nici DNA w PBMC jest silnym biomarkerem ryzyka raka piersi. Zmniejszona zdolność naprawy DNA może mieć podłoże genetyczne nawet w sporadycznym raku piersi. --- Uszkodzenia DNA i wynikające z nich mutacje inicjują wieloetapowy proces rakotwórczy. Zróżnicowane komórki mają zmniejszoną zdolność do naprawy uszkodzeń DNA, ale biologiczny wpływ nienaprawionych uszkodzeń DNA w zróżnicowanych komórkach nabłonka płuc jest niejasny. płuc jest niejasny. Tutaj wykorzystaliśmy nowy organotypowy trójwymiarowy model ludzkiego płuca (3D) do zbadania biologicznego znaczenia nienaprawionych uszkodzeń DNA w zróżnicowanych komórkach nabłonka płuc. Wykazaliśmy, zgodnie z istniejącymi że kinetyka utraty prostych pęknięć dwuniciowych (DSBs) była znacznie zmniejszona w organotypowej hodowli 3D w porównaniu do kinetyki naprawy w hodowli dwuwymiarowej (2D). Co uderzające, odkryliśmy, że w przeciwieństwie do prostych DSB, większość złożonych uszkodzeń DNA była nieodwracalna w organotypowej hodowli 3D. Poziomy ekspresji wielu genów szlaku naprawy uszkodzeń DNA były znacznie zmniejszone w organotypowej hodowli 3D w porównaniu z tymi w hodowli 2D dostarczając molekularnych dowodów na wadliwą naprawę uszkodzeń DNA w kulturze organotypowej. w hodowli organotypowej. Ponadto, gdy zróżnicowane komórki z nienaprawionymi uszkodzeniami DNA ponownie weszły w cykl komórkowy, przejawiały spektrum spektrum aberracji chromosomalnych w mitozie. Nasze dane sugerują, że regulacja w dół wielu genów szlaku naprawy DNA w zróżnicowanych komórkach czyni je podatne na DSB, promując niestabilność genomu, która może prowadzić do kancerogenezy.
Czy pęknięcia podwójnej nici DNA odgrywają przyczynową rolę w kancerogenezie?
Tak. Wykazano, że indukcja dwuniciowych pęknięć DNA (DSBs) i defekty w ogólnej zdolności naprawy DSBs mogą prowadzić do akumulacji mutacji, powodując niestabilność genomową komórek. Biorąc pod uwagę, że niestabilność genomu jest cechą charakterystyczną raka, DSB odgrywają rolę przyczynową w kancerogenezie.