Zapalenie w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) jest powszechną cechą chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem. Cytokiny prozapalne, takie jak IL-1β i TNFα, są wytwarzane głównie przez komórki wrodzonego układu odpornościowego, a mianowicie mikrogleju w OUN i uważa się, że przyczyniają się one do uszkodzenia neuronów obserwowanego w chorobie. Kinaza białkowa aktywowana mitogenem p38 (MAPK) jest jednym ze szlaków kinazy kinaz, które regulują produkcję IL-1β i TNFα. Co ważne, Inhibitory drobnocząsteczkowe z rodziny p38 MAPK zostały opracowane i wykazują skuteczność w blokowaniu produkcji IL-1β i TNFα. Rodzina p38 składa się z z co najmniej czterech izoform (p38α, β, γ, δ) kodowanych przez oddzielne geny. Ostatnie badania zaczęły wykazywać unikalne funkcje różnych izoform, z p38α jako kluczową izoformą zaangażowaną w zapalenie OUN. Co ciekawe, pojawiają się również dowody na to, że dwa substraty p38 mogą pełnić przeciwstawne funkcje. p38 mogą mieć przeciwstawne role, przy czym MK2 jest prozapalny, a MSK1/2 jest przeciwzapalne. W niniejszym przeglądzie omówiono właściwości, funkcję i regulację rodziny p38 MAPK w odniesieniu do produkcji cytokin w OUN. --- Kinaza białkowa aktywowana mitogenami (MAPK) p38 jest kinazą Ser/Thr, pierwotnie wyizolowana z monocytów stymulowanych lipopolisacharydem. Istnieją cztery izoformy enzymu (p38alfa, p38beta, p38gamma i p38delta), które różnią się dystrybucją w tkankach, regulacją aktywacji kinazy i aktywacją MAPK. dystrybucją w tkankach, regulacją aktywacji kinazy i późniejszą fosforylacją substratów substratów. Enzymy te różnią się również wrażliwością na inhibitory p38 MAPK inhibitory. Najdokładniej zbadaną izoformą jest p38alfa, dla której aktywację zaobserwowano w wielu komórkach krwiotwórczych i niehematopoetycznych Kinaza p38alfa jest zaangażowana w biosyntezę cytokin martwicy nowotworów. cytokin czynnika martwicy nowotworów alfa i interleukiny-1beta na poziomie translacyjnym i transkrypcyjnym. poziomie translacyjnym i transkrypcyjnym. MAPK p38alfa reprezentuje punkt konwergencji dla wielu procesów sygnalizacyjnych, które są aktywowane podczas zapalenie, co czyni go kluczowym potencjalnym celem modulacji produkcji cytokin produkcji cytokin. Odkrycie i opublikowanie p38alfa i a p38alfa i inhibitora p38alfa opartego na pirydynyloimidazolu zapoczątkowało ogromny wysiłek wielu firm w celu opracowania inhibitora p38alfa. w celu opracowania inhibitorów p38alfa jako potencjalnych metod leczenia chorób zapalnych. chorób zapalnych. Poniżej przedstawiono krótki przegląd odkrycia i rozwoju AMG-548 (AmG-548). i rozwoju AMG-548 (Amgen Inc), selektywnego i skutecznego inhibitora p38alfa oraz jego działanie farmakodynamiczne w pierwszym badaniu na ludziach. Dane z badania klinicznego fazy I z zastosowaniem wielu dawek. Ponadto, inne inhibitory p38alfa, które przeszły do badań klinicznych w ciągu ostatnich trzech lat. lat, takie jak BIRB-796 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc), SCIO-469 i SCIO-323 (Scios Inc) oraz VX-702 (Vertex Pharmaceuticals Inc/Kissei Pharmaceutical Co). --- Rodzina kinaz białkowych aktywowanych mitogenami p38 (MAPK) ssaków składa się z czterech członków (p38α, p38γ i p38δ). z czterech członków (p38α, p38β, p38γ i p38δ), które są bardzo podobne pod względem sekwencji aminokwasów, ale różnią się wzorcami ekspresji. ale różnią się wzorcami ekspresji. Sugeruje to, że mogą pełnić określone funkcje w różnych narządach. W ostatnich latach większość wysiłków koncentrowała się na badaniu funkcji izoformy p38α, która jest powszechnie określana jako p38. jest powszechnie określana jako p38 w literaturze. Jednak rola, jaką inne izoformy p38 odgrywają w funkcjach komórkowych i ich implikacji w niektórych stanach patologicznych, nie została dokładnie określona. patologicznych nie zostały do tej pory precyzyjnie zdefiniowane. W niniejszym artykule podkreślamy ostatnie postępy poczynione w definiowaniu funkcji dwóch mniej zbadanych alternatywnych p38MAPK, p38γ i p38δ. Opisujemy, że te p38MAPK wykazują podobieństwa do klasycznej izoformy p38α, chociaż mogą odgrywać centralną i odrębną rolę w pewnych procesach fizjologicznych i patologicznych. --- CEL: Zwiększona ekspresja stromelizyny-1 (metaloproteinazy macierzy [MMP]-3) przez beleczkowanie siatkówki (TM) inicjuje obrót macierzy zewnątrzkomórkowej i zwiększa odpływ cieczy wodnistej. Czynnik martwicy nowotworów (TNF)alfa i interleukina (IL)-1alfa są skutecznymi induktorami MMP-3 w TM. Aby ułatwić zrozumienie regulacji MMP-3, autorzy zbadali udział białek szlaku kinazy p38 MAP w tym procesie. METODY: Zachodnie immunobloty zostały wykorzystane do określenia wpływu tych cytokin i kinazy p38 MAP na MMP-3. cytokin i inhibitorów szlaku kinazy p38 MAP na poziom białka MMP-3, izoformy kinazy p38 MAP i poziomy fosforylacji w ludzkich i świńskich komórkach TM. Wpływ oceniano wpływ dominująco-ujemnego konstruktu kinazy p38 MAP na ekspresję MMP-3. na ekspresję MMP-3. Zbadano również zmiany morfologiczne w komórkach. WYNIKI: Obie cytokiny zwiększyły poziom MMP-3. Inhibitor kinazy p38 MAP SB202190 zmniejszał indukcję MMP-3 przez TNFalfa przez cały czas i po 24 godzinach przez IL-1alfa, ale nasilał indukowany IL-1alfa wzrost MMP-3 w późniejszym czasie później. Indukcja MMP-3 przez obie cytokiny była blokowana przez dominująco-ujemne konstrukty kinazy p38 MAP. Każda cytokina zwiększała fosforylację składników szlaku kinazy p38 MAP i zmieniały morfologię komórek TM. Inhibitor p38 blokował tylko zmiany morfologiczne wywołane przez TNFalfa. Ludzkie i świńskie komórki TM wyrażały izoformy p38 alfa, beta, delta i gamma, które migrowały zbiegają się z pasmami specyficznej fosforylacji. WNIOSKI: Wpływ inhibitorów p38 i konstruktu dominująco-ujemnego na indukcję MMP-3 przez TNFalfa i IL-1alfa wykazują istotną rolę p38 w tym procesie sygnalizacyjnym. p38 w tym procesie sygnalizacyjnym. Różnice między wpływem inhibitorów p38 na TNFalfa i IL-1alfa indukcji MMP-3 sugerują rozbieżne wykorzystanie izoformy p38, podobnie jak odpowiedzi morfologiczne. Anomalny wpływ inhibitora p38 na indukcję IL-1alfa indukcję MMP-3 i fosforylację p38 delta/gamma sugeruje złożone interakcje między izoformami kinazy p38 MAP i ich zróżnicowane wykorzystanie przez TNFalfa i IL-1alfa w TM. --- Szlak transdukcji sygnału kinazy p38 MAP jest ważnym regulatorem produkcji cytokin prozapalnych i stanu zapalnego. produkcji cytokin prozapalnych i stanu zapalnego. Określenie roli różnych członków rodziny różnych członków rodziny p38, w szczególności p38alfa i p38beta, w tych procesach procesach było trudne. W tym przypadku wykorzystaliśmy podejście genetyki chemicznej myszy knock-in, u których kinaza p38alfa lub p38beta została uodporniona na działanie specyficznych inhibitorów odporna na działanie specyficznych inhibitorów wraz z nokautem p38beta w celu zbadania biologicznej funkcji tych specyficznych izoform kinazy. Myszy noszące mutację T106M w p38alfa są odporne na farmakologiczne farmakologiczne hamowanie produkcji TNF indukowanej przez LPS i zapalenie stawów wywołane przez przeciwciało kolagenowe zapalenie stawów, co wskazuje, że aktywność p38beta nie jest wymagana do ostrych lub przewlekłych odpowiedzi zapalnych. odpowiedzi zapalnych. Produkcja TNF indukowana przez LPS jest jednak nadal całkowicie wrażliwa na inhibitory p38 u myszy z mutacją punktową T106M w p38beta. Podobnie, myszy z nokautem p38beta normalnie reagują na bodźce zapalne. Wyniki te wskazują jednoznacznie, że specyficzne hamowanie izoformy p38alfa jest konieczne i wystarczające dla skuteczności przeciwzapalnej in vivo. --- Kinazy białkowe aktywowane mitogenem p38 są aktywowane w odpowiedzi na różne sygnały zewnątrzkomórkowe w komórkach sygnały zewnątrzkomórkowe w komórkach eukariotycznych i odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach komórkowych na te sygnały. komórkowych odpowiedziach na te sygnały. Cztery izoformy występujące u ssaków (p38alfa, p38beta, p38gamma i p38delta) są koeksprymowane i koaktywowane w tych samych komórkach. komórkach. Dokładna rola każdej izoformy p38 nie została w pełni zidentyfikowana, częściowo z powodu częściowo ze względu na niezdolność do aktywacji każdego członka indywidualnie. Może to być rozwiązać poprzez zastosowanie wewnętrznie aktywnych mutantów. Na podstawie wcześniejszych badań na drożdżach p38/Hog1 [Bell M, Capone R, Pashtan I, Levitzki A & Engelberg D (2001) J Biol Chem276, 25351-2538] i ludzkim p38alfa [Diskin R, Askari N, Capone R, Engelberg D & Livnah O (2004) J Biol Chem279, 47040-47049] wygenerowaliśmy wewnętrznie aktywne mutanty p38beta, p38gamma i p38delta. Ponadto zidentyfikowaliśmy nowe aktywujące miejsce mutacji w p38alfa. Większość mutacji aktywujących znajduje się w pętli L16, w której zmiany konformacyjne wykazano, że zmiany konformacyjne indukują aktywację. Pokazujemy, że zmiany te nakładają znaczną aktywność autofosforylacji, zapewniając mechanistyczne wyjaśnienie dla wewnętrznej aktywności mutantów. Nowe aktywne warianty zachowują specyficzność wobec substratów i inhibitorów podobną do rodzicielskich białek typu dzikiego. typu dzikiego i są fosforylowane przez kinazę białkową aktywowaną mitogenami kinazę białkową 6, ich aktywator. W ten sposób zakończyliśmy rozwój serii serii wewnętrznie aktywnych mutantów wszystkich izoform p38. Te aktywne warianty mogą teraz stać się potężnymi narzędziami do wyjaśnienia aktywacji mechanizmu aktywacji i specyficznych biologicznych ról każdej izoformy p38. --- Dorosły mięsień szkieletowy jest bardzo stabilną tkanką zawierającą niewielką populację komórek satelitarnych związanych z miofibrylami w porównaniu z późnymi embrionalnym/neonatalnym mięśniem szkieletowym, który zawiera silnie proliferujące mioblasty mioblasty i małe aktywnie rosnące miofibryle, co sugeruje, że specyficzne szlaki regulacyjne mogą kontrolować miogenezę na różnych etapach rozwoju. Szlak sygnałowy Szlak sygnałowy p38 MAPK ma kluczowe znaczenie dla miogenezy, w oparciu o badania z wykorzystaniem immortalizowanych i noworodkowych pierwotnych mioblastów in vitro. Jednak udział tego szlaku tego szlaku do miogenezy dorosłych nigdy nie był badany. Cztery izoformy p38 (p38alfa, p38beta, p38gamma i p38delta) występują w komórkach ssaków, p38alfa i p38gamma są izoformami o największej ekspresji w dorosłych mięśniach szkieletowych. mięśniach szkieletowych. Biorąc pod uwagę śmiertelność embrionalną / noworodkową myszy z niedoborem p38alfa myszy, badamy tutaj względny udział p38beta, p38gamma i p38delta do miogenezy dorosłych. Regeneracja i wzrost miofibryli dorosłych mięśni przebiega z podobną wydajnością u myszy pozbawionych p38beta, p38gamma i p38delta jak u myszy kontrolnych typu dzikiego. Zgodnie z tym, nie ma różnicy w zachowaniu zachowaniu dorosłych pierwotnych mioblastów in vitro między różnymi genotypami. Co ważne, wzór aktywacji p38 (przypisywany p38alfa) pozostaje niezakłócony podczas miogenezy in vitro, w której pośredniczą komórki satelitarne, i regeneracji dorosłych mięśni w typie dzikim i p38alpha. regeneracji mięśni u myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem p38beta-, p38gamma- i p38delta, czyniąc p38alfa niezbędną izoformą p38 podtrzymującą miogenezę dorosłych. Badanie to stanowi pierwszą analizę dotyczącą funkcjonalności p38beta, p38gamma i p38delta w zależnej od komórek satelitarnych regeneracji i wzroście dorosłych mięśni. regeneracji i wzroście dorosłych mięśni. --- Rodzina kinaz p38 jest podgrupą rodziny kinaz białkowych aktywowanych mitogenami. rodzina. Składa się z czterech izoform i jest zaangażowana w krytyczne procesy biologiczne procesach biologicznych, a także w chorobach zapalnych. Dokładna unikalna rola każdej izoformy p38 w tych procesach nie jest dobrze poznana. Aby odpowiedzieć na to pytanie opracowujemy wewnętrznie aktywne warianty p38. Niedawno opisaliśmy serię mutantów ludzkiej p38alfa, które były spontanicznie aktywne jako rekombinowane białka oczyszczone z komórek Escherichia coli. Pokazujemy że niektóre z tych mutantów są spontanicznie aktywne w kilku komórkach ssaków komórkach ssaków w hodowli. Spontaniczna aktywność niektórych mutantów jest wyższa niż aktywność aktywność w pełni aktywowanego odpowiednika typu dzikiego. Następnie wyprodukowaliśmy mutanty innych izoform p38 i stwierdziliśmy, że p38beta(D176A), p38gamma(D179A), p38delta(D176A) i p38delta(F324S) są spontanicznie aktywne in vivo. in vivo. Aktywne mutanty są również spontanicznie fosforylowane. Aby przetestować czy mutanty faktycznie wypełniają obowiązki downstream białek p38, my przetestowaliśmy ich wpływ na aktywację transkrypcji za pośrednictwem białka 1 (AP-1). Aktywne mutanty p38alfa indukowały geny reporterowe napędzane przez AP-1, a także promotory c-jun i c-fos. c-fos. Aktywny wariant p38gamma tłumił transkrypcję za pośrednictwem AP-1. transkrypcję. Gdy aktywne warianty p38alfa i p38gamma były współeksprymowane, aktywność AP-1 nie była indukowana, co pokazuje, że p38gamma dominuje nad p38alfa w odniesieniu do aktywacji AP-1. Tak więc, wewnętrznie aktywne warianty, które są spontanicznie aktywne in vivo zostały uzyskane dla wszystkich izoform p38. Te warianty ujawniły różny wpływ każdej izoformy na aktywność AP-1. --- Senescencja indukowana onkogenami to stabilne zatrzymanie proliferacji, które służy jako mechanizm obronny przed nowotworem. Mechanizm obronny hamujący rozwój nowotworu. Kinaza białkowa aktywowana mitogenem p38 (MAPK) jest zaangażowana w indukowaną przez onkogeny senescencję i supresję nowotworów. Jednak specyficzna rola każdej z czterech izoform p38 w starzeniu indukowanym przez onkogeny nie jest w pełni poznana. nie jest w pełni poznana. Tutaj wykazaliśmy, że p38δ pośredniczy w starzenie indukowane onkogenami poprzez mechanizm niezależny od p53 i p16(INK4A). Zamiast tego dowody sugerują związek między p38δ a szlakami uszkodzeń DNA. Co więcej, odkryliśmy nowy mechanizm, który zwiększa ekspresję p38δ podczas starzenia. W tym mechanizmie onkogenny ras indukuje szlak Raf-1-MEK-kinazę regulowaną sygnałem pozakomórkowym (ERK), która z kolei aktywuje AP-1 i Ets, aktywuje czynniki transkrypcyjne AP-1 i Ets, które są związane z promotorem p38δ prowadząc do zwiększonej transkrypcji p38δ. Odkrycia te wskazują że indukcja funkcji prosenescencyjnej p38δ przez onkogenny ras jest osiągana poprzez 2 mechanizmy, aktywację transkrypcji przez szlak Raf-1-MEK-ERK-AP-1/Ets która zwiększa komórkowe stężenie białka p38δ, oraz posttranslacyjnej modyfikacji przez modyfikację potranslacyjną przez MKK3/6, która stymuluje aktywność enzymatyczną p38δ. aktywność enzymatyczną p38δ. Ponadto badania te identyfikują czynniki transkrypcyjne AP-1 i Ets jako nowe składniki sygnalizacyjne w szlaku indukującym senescencję. szlaku indukującym senescencję. --- My i inni wcześniej wykazaliśmy, że kinaza białkowa aktywowana mitogenem p38 jest jest niezbędna do różnicowania miogenicznego. Jednak jest mniej jasne, która z czterech izoform czterech izoform p38 w genomie myszy uczestniczy w tym procesie. Wykorzystując C2C12 jako modelu, wykazaliśmy tutaj, że p38alfa, beta i gamma ulegają ekspresji z różnymi wzorcami ekspresji podczas różnicowania. Zablokowanie któregokolwiek z nich przez małe interferujące RNA hamuje różnicowanie miogenne różnicowanie, co sugeruje, że funkcje trzech izoform p38 są nie są całkowicie redundantne. W celu dalszego wyjaśnienia unikalnej roli każdej izoformy p38 w różnicowaniu miogenicznym, indywidualnie znokautowaliśmy jedną izoformę p38 w komórkach C2C12 i porównaliśmy profile ekspresji genów całego genomu za pomocą mikromacierzy. profile ekspresji całego genomu za pomocą mikromacierzy. Odkryliśmy, że niektóre geny są współregulowane przez wszystkie trzy izoformy p38, podczas gdy inne są unikalnie regulowane przez jedną konkretną izoformę p38. izoformę p38. Co więcej, kilka nowych genów docelowych p38 (tj. E2F2, cyklina D3, i WISP1) są wymagane do ekspresji miogeniny, co zapewnia molekularne podstawy do wyjaśnienia, dlaczego różne izoformy p38 są wymagane do różnicowania miogenicznego różnicowania.
Które białka są różnymi izoformami kinazy p38 MAP?
Kinaza p38 Mitogen-Activated Protein (MAP), kinaza serynowo-treoninowa, jest jedną z najlepiej scharakteryzowanych kinaz w procesie zapalnym. Istnieją cztery izoformy enzymu (p38alfa, p38beta, p38gamma i p38delta), które różnią się dystrybucją tkankową, regulacją aktywacji kinazy i późniejszą fosforylacją substratów. Spośród czterech zidentyfikowanych izoform p38 (p38α, p38β, p38γ i p38δ), forma α jest najlepiej zbadana.