Białko O 6-alkiloguanina-DNA alkilotransferaza (alkilotransferaza) bierze udział w naprawie w naprawę O 6-alkiloguaniny i O 4-alkilotyminy w DNA i odgrywa ważną rolę w ważną rolę w większości organizmów w łagodzeniu cytotoksycznych i mutagennych niektórych klas środków alkilujących. Klon genomowy obejmujący gen alkilotransferazy Drosophila melanogaster ( DmAGT ) został zidentyfikowany na podstawie na podstawie homologii sekwencji z odpowiednimi genami u Saccharomyces cerevisiae i człowieka. Gen DmAGT znajduje się w pozycji 84A na trzecim chromosomie. chromosomie. Sekwencja nukleotydowa cDNA DmAGT ujawniła otwartą ramkę odczytu kodującą 194 aminokwasy. Nadwrażliwy na MNNG fenotyp bakterii z niedoborem alkilotransferazy został uratowany przez ekspresję cDNA DmAGT. Ponadto, aktywność alkilotransferazy zidentyfikowano w surowych ekstraktach bakterii Escherichia coli zawierających cDNA DmAGT i aktywność ta była hamowana przez preinkubację ekstraktu z oligonukleotydem zawierającym pojedynczą O6-metyloguaninę. Podobny do E.coli Ogt i alkilotransferazy drożdży, ale w przeciwieństwie do ludzkiej alkilotransferazy przeciwieństwie do ludzkiej alkilotransferazy, alkilotransferaza Drosophila jest odporna na inaktywację przez O 6-benzylguaninę. W teście E.coli lac Z reversion ekspresja DmAGT skutecznie tłumiła indukowane przez MNNG G:C-->A:T, jak również jak również mutacje przejściowe A:T-->G:C in vivo. Wyniki te wskazują na obecność alkilotransferazy specyficznej dla naprawy O 6-metyloguaniny i O 4-metylotyminy u Drosophila. --- O6-alkiloguaninowa DNA-alkilotransferaza (ATaza) naprawia toksyczne, mutagenne i rakotwórcze uszkodzenia rakotwórcze zmiany O6-alkiloguaniny (O6-alkG) w DNA poprzez wysoce konserwatywną reakcję polegającą na stechiometrycznym przeniesieniu grupy alkilowej do aktywnej reszty cysteiny centrum aktywnej reszty cysteinowej białka ATazy. W Escherichia coli Ada ATase, która jest skutecznie odporna na inhibicję przez O6-benzylguaninę (O6-BzG), reszta reszta odpowiadająca glicynie-160 (G160) dla białek ssaków tej klasy jest zastąpiona tryptofanem (W). Dlatego, aby zbadać potencjalną rolę G160 ludzkiego białka ATazy (hAT) w określaniu wrażliwości na O6-BzG, mutagenezę ukierunkowaną na miejsce zastosowano do wytworzenia zmutowanego białka (hATG160W) podstawionego w pozycji 160 resztą W. Mutant hATG160W został ulegał stabilnej ekspresji i był 3- i 5-krotnie bardziej wrażliwy niż hAT na inaktywację przez O6-BzG, odpowiednio w nieobecności i obecności dodatkowego DNA grasicy cielęcej. DNA, odpowiednio. Podobną, zależną od DNA zwiększoną wrażliwość mutanta hATG160W w stosunku do typu dzikiego stwierdzono również w przypadku inaktywacji za pośrednictwem O6-metyloguaniny. inaktywacji. Potencjalna rola reszty W160 w stabilizowaniu wiązania O6-alkG do białka omówiono w kategoriach modelu homologicznego struktury hAT. Region zajmowany przez G/W-160 tworzy miejsce domniemanego zawiasu zawias, który może być ważny w zmianie konformacyjnej, która prawdopodobnie zachodzić podczas wiązania DNA. W regionie tym zidentyfikowano trzy motywy sekwencyjne które mogą wpływać na dostęp O6-BzG do miejsca aktywnego; YSGG lub YSGG u ssaków (YAGG w E. coli Ogt, YAGS w Dat z Bacillus subtilis), YRWG w E. coli Ada i Salmonella typhimurium (ale YKWS w Saccharomyces cerevisiae) lub YRGGF w AdaB z B. Subtilis. Wreszcie, konformacyjna i stereoelektroniczna analiza domniemanych stanów przejściowych dla przeniesienia alkilu z serii inaktywatorów hAT, w tym O6-BzG, została podjęta w celu racjonalizacji nieoczekiwaną słabą inhibicję wykazaną przez alfa-pi-nienasycone elektrofilowe związki. --- Zbadaliśmy rolę alkilotransferazy O6-alkiloguaniny-DNA kodowanej przez gen ogt w wrażliwości Escherichia coli na mutagenne działanie dibromoalkanów, dibromoetanu i dibromometanu. dibromoalkanów, dibromoetanu i dibromometanu, poprzez porównanie odpowiedzi u bakterii ogt- z ich izogenicznymi odpowiednikami rodzicielskimi ogt+. Efekty uvrABC, odpowiedzi adaptacyjnej, przetwarzania mutagennego mucAB i umuDC oraz glutenu. przetwarzanie mutagenne i bioaktywacja glutationu na zróżnicowane odpowiedzi bakterii ogt- i ogt+. Indukcja mutacji była monitorowano poprzez pomiar częstotliwości mutacji w kierunku L-arabinozy. . Indukowane mutacje występowały tylko w szczepach z defektem naprawy wycięcia i były całkowicie (z dibromometanem) lub znacząco (z dibromoetanem) zależne od alkilotransferazy (ATazy) kodowanej przez gen ogt. Zwiększona mutagenną na oba dibromoalkany zaobserwowano również u bakterii ogt, które nadeksprymowały białko ogt z wielokopijnego plazmidu, co wskazuje, że różnice w mutowalności między bakteriami ogt+ i ogt- nie były zależne od null allelu ogt- przenoszonego przez wadliwy szczep. ATaza kodowana przez konstytutywny gen ogt był bardziej skuteczny w promowaniu mutagenności dibromoalkanu niż ATaza ada indukowana przez ekspozycję na niskie dawki czynnika metylującego. Mutagenność mutagenność promowana przez ATazę ogt była zależna zarówno od bioaktywacji glutationu, jak i mutagenności SOS. i przetwarzania mutagennego SOS. Zgodnie z naszą wiedzą, niniejszy artykuł przedstawia po raz pierwszy dowody na to, że ATazy DNA, w szczególności ATaza kodowana przez gen ogt, może zwiększać mutagenne działanie czynnika uszkadzającego DNA. czynnika uszkadzającego DNA. Mechanizm tego działania nie został jeszcze ustalony. --- Metylotransferazy DNA (MTazy) Escherichia coli Ada i Ogt są znane z tego, że przenoszą proste grupy alkilowe z O6-alkiloguaniny i O4-alkilotyminy, bezpośrednio przywracając te alkilowane zmiany DNA do guaniny i tyminy. Oprócz będąc wyjątkowo wrażliwymi na mutagenne działanie czynników metylujących, E. coli ada ogt null wykazują wyższy wskaźnik mutacji spontanicznych niż typ dziki. dziki typ. Tutaj określiliśmy, które mutacje substytucji zasad są podwyższone w komórkach z niedoborem w komórkach z niedoborem MTazy poprzez monitorowanie rewersji sześciu zmutowanych alleli lacZ które ulegają rewersji poprzez każdą z sześciu możliwych mutacji podstawienia zasady. Podczas wzrostu wykładniczego, spontaniczna szybkość przejść G:C do A:T i G:C do C:G była podwyższona około czterokrotnie w podwójnym mutancie ada ogt w porównaniu z dzikim typem E. coli. Ponadto, w porównaniu z typem dzikim, stacjonarne populacje populacje E. coli z niedoborem MTazy (pod selekcją laktozy) wykazywały zwiększone przejścia G:C do A:T i A:T do G:C (odpowiednio 10- i 3-krotnie) oraz zwiększone przejścia G:C do C:G, A:T do C:G i A:T do T:A (odpowiednio 10-, 2,5-, i 1,7-krotnie). Pojedyncze mutanty ada i ogt nie wykazywały podwyższonego wskaźnika mutacji spontanicznych dla żadnej zasady. spontanicznych mutacji dla żadnego zdarzenia podstawienia zasady, a sklonowane geny ada i ogt przywracały wskaźniki spontanicznych mutacji typu dzikiego do szczepów ada ogt MTase. Wnioskujemy, że zarówno MTaza Ada, jak i MTaza Ogt mogą naprawiać endogennie wytwarzane zmiany DNA odpowiedzialne za każde z pięciu podstawień zasad, które są podwyższone w komórkach z niedoborem MTazy. Proste czynniki metylujące i etylujące indukowały przejścia G:C do A:T i A:T do G:C w tych szczepach, ale nie indukowały znacząco przejść G:C do C:G, A:T do C:G i A:T do T:A. Wnioskujemy, że S-adenozylometionina (znana jako słaby czynnik środek metylujący) nie jest jedynym metabolitem odpowiedzialnym za endogenną alkilację DNA alkilację DNA i że przynajmniej niektóre z endogennych metabolitów, które powodują O-alkilowe uszkodzenia DNA w E. coli nie są prostymi czynnikami metylującymi lub etylującymi. --- O6-metyloguanina jest usuwana z DNA poprzez przeniesienie grupy metylowej do miejsca akceptorowego cysteiny obecnej w białku naprawczym DNA O6-alkiloguanina-DNA alkilotransferaza. Ludzka alkilotransferaza jest inaktywowana przez wolną zasadę O6-benzylguanina, co stwarza możliwość, że znacznie większe grupy alkilowe mogą być również akceptowane jako substraty. Jednakże, alkilotransferaza Escherichia coli Ada-C, nie jest inaktywowana przez O6-benzylguaninę. Białko Ada-C stało się zdolne do reakcji poprzez włączenie dwóch mutacji mutacji przekształcających Ala316 w prolinę (A316P) i Trp336 w alaninę (W336A). alaninę (W336A) lub glicynę (W336G). Zmiany te zwiększają przestrzeń w miejscu aktywnym białka, w którym Cys321 jest zakopany, a tym samym umożliwia dostęp do inhibitora O6-benzylguaniny. Reakcja mutanta A316P/W336A-Ada-C z O6-benzylguaniną była znacznie stymulowana przez obecność DNA, zapewniając silne wsparcie dla koncepcji, że wiązanie DNA z białkiem Ada-C aktywuje białko białko. Białko Ada-C było zdolne do naprawy O6-benzylguaniny w 16-merowym oligodeoksyrybonukleotydzie. Jednak tempo naprawy było bardzo wolne, podczas gdy białko E. coli Ogt, ludzka alkilotransferaza i mutant A316P/W336A-Ada-C alkilotransferazy reagowały bardzo szybko z tym 16-merowym substratem i preferencyjnie naprawiał go po inkubacji z mieszaniną metylowanych i benzylowanych 16-merów. Wyniki te pokazują, że grupy benzylowe są lepszymi substratami niż grupy metylowe dla alkilotransferaz, pod warunkiem, że czynniki steryczne nie zapobiegają wiązaniu substratu w prawidłowej orientacji dla grupy alkilowej przeniesienia grupy alkilowej. --- Wcześniej informowaliśmy o wyizolowaniu mutanta Escherichia coli K12, który jest niezwykle wrażliwy na mutagenezę przez niskie dawki czynników etylujących. Teraz że mutacja obejmuje delecję obejmującą co najmniej geny ogt i fnr. co najmniej geny ogt i fnr oraz że nie występuje aktywność O6-alkiloguaniny-DNA-alkilotransferazy jest obecna w bezkomórkowych ekstraktach pochodnej ada::Tn10 tych bakterii. bakterii. Potwierdzenie, że uczulenie na mutagenezę indukowaną etylacją było można przypisać ogt, a nie innym loci objętym delecją, uzyskano konstruując pochodne. uzyskano przez skonstruowanie pochodnych. W ten sposób mutacja zaburzająca ogt::kanr została wprowadzono do rodzicielskich bakterii ogt+, a mutacja ogt::kanr została następnie wyeliminowana przez kotransdukcję ogt+ z blisko spokrewnionym markerem Tetr (zcj::Tn10). Mutanty delecyjne delta(ogt-fnr) lub mutanty dysrupcyjne ogt::kanr były wysoce wrażliwe na mutagenezę indukowaną metanosulfonianem etylu, mierzoną przez indukcję mutacji w kierunku oporności na L-arabinozę (Arar). Co więcej, liczba mutantów Arar wzrastała liniowo wraz z dawką, w przeciwieństwie do bakterii ogt+. w przypadku bakterii ogt+, które miały dawkę progową, poniżej której nie gromadziły się żadne mutanty. mutantów. Różnice w mutacji były jeszcze większe w przypadku metanosulfonianu propylu. metanosulfonianem propylu. Nadprodukcja alkilotransferazy ogt z wielokopijnego plazmidu zmniejszyła mutagenezę indukowaną etylometanosulfonianem w szczepach ogt- mutant a także mutagenezę metylometanosulfonianu u bakterii ada. Próbka AB1157 uzyskana z centrum genetycznego E. coli K12 również zawierała delecję obejmującą geny ogt i fnr. Ponieważ takie delecje znacznie wpływają na mutagenne na czynniki alkilujące, badanie obecności genu ogt w używanym szczepie E. coli K12. --- Alkilotransferaza E. coli ogt O6-alkiloguanina-DNA ma dwie reszty cysteinowe umieszczone identycznie w odniesieniu do cystein w alkilotransferazie E. coli ada O6-alkiloguanina-DNA alkilotransferaza. W celu oceny ich funkcji, te zostały zastąpione glicyną w celu wygenerowania zmienionych form białka ogt białka. Mutageneza cysteiny-139, zlokalizowanej w regionie "PCHRV" homologii homologii, wyeliminowała aktywność funkcjonalną, potwierdzając, że ta reszta jest cysteiną akceptującą metyl w miejscu aktywnym białka. Podstawienie cysteiny 102 w sekwencji "LRTIPCG" miało niewielki wpływ na aktywność białka ogt wykazując, że ta cysteina nie jest bezpośrednio zaangażowana w przenoszeniem adduktów O6-metyloguaniny. --- Indukowalna odporność na mutagenezę alkilacyjną i zabijanie u Escherichia coli (odpowiedź adaptacyjna) jest kontrolowana przez gen ada. Białko Ada działa zarówno jako pozytywny regulator odpowiedzi, jak i enzym naprawczy DNA, naprawiając premutagenną O6-alkiloguaninę w DNA poprzez samobójcze przeniesienie grupy alkilowej do jednej z własnych cyst. do jednej z własnych reszt cysteinowych. Określiliśmy sekwencję DNA sklonowanego genu ada+ i jego regionu regulatorowego. Dane ujawniają potencjalne miejsca autoregulacji ada. Określenia sekwencji aminokwasów pokazują, że centrum aktywne dla metylotransferazy O6-metyloguaniny-DNA znajduje się blisko końca COOH polipeptydu i ma nietypową sekwencję -Pro-Cys-His-, poprzedzoną bardzo hydrofobowym regionem. Te same cechy strukturalne są obecne w miejscu aktywnym syntazy tymidylanowej, co sugeruje wspólny chemiczny mechanizm aktywacji cysteiny. mechanizm aktywacji cysteiny. --- Wielofunkcyjne białko 39 kDa Escherichia coli Ada (O6-metyloguanina-DNA metylotransferaza) (EC 2.1.1.63), produkt genu ada, jest monomerem globularnym polipeptydem o dwóch różnych aktywnościach alkilo-akceptorowych zlokalizowanych w dwóch domenach. domenach. Dwie domeny są prawie równej wielkości i są połączone regionem zawiasowym. region. Białko Ada akceptuje stechiometrycznie grupę alkilową z O6-alkiloguaniny w DNA przy reszcie Cys-321 i od fosfotriestru alkilowego przy reszcie Cys-69. Białko to funkcjonuje w naprawie DNA poprzez bezpośrednią dealkilację mutagennej O6-alkiloguaniny. Białko metylowane przy Cys-69 staje się aktywatorem transkrypcyjnym genów w regulonie ada, w tym własnego. Każda z dwóch domen funkcjonuje niezależnie jako akceptor alkilu. Oczyszczone oczyszczone homogenne białko jest niestabilne w 37 stopniach C i spontanicznie traci około 30% swojej struktury drugorzędowej w czasie krótszym niż 30 minut wraz z całkowitą utratą aktywności. całkowitą utratą aktywności. Jednak badania równowagi sedymentacyjnej wykazały że nieaktywne białko pozostaje w formie monomerycznej bez agregacji. Ponadto analiza spektroskopii masowej metodą elektrorozpylania wykazała brak utleniania nieaktywnego białka. Ta zależna od temperatury inaktywacja białka Ada jest hamowana przez DNA. W obecności wzrastających stężeń mocznika lub guanidyny, białko stopniowo traci ponad 80% swojej struktury. swojej struktury. Dwie aktywności akceptora alkilu wydają się być różnie wrażliwe na rozwijanie, a aktywność metylotransferazy fosfotriestrowej jest odporna na 7 M mocznik. Częściowe lub całkowite rozwinięcie indukowane przez mocznik lub guanidyną jest całkowicie odwracane w ciągu kilku sekund przez usunięcie denaturanta. Białko poddane koagulacji termicznej może również zostać przywrócone do pełnej aktywności poprzez poddanie go działaniu poprzez traktowanie 8 M mocznikiem lub 6 M guanidyną. Wyniki te sugerują, że powstający lub rozłożony polipeptyd Ada fałduje się do metastabilnej formy, która jest aktywna i że termodynamicznie stabilna struktura jest częściowo rozwinięta i nieaktywna. nieaktywna. --- Spontaniczną mutagenezę w alkilotransferazie O6-alkiloguaniny-DNA (mutanty ada ogt) badano na dwa sposoby. -(mutanty ada ogt) Escherichia coli badano na dwa sposoby: u bakterii w bakteriach rosnących w nieselektywnej pożywce płynnej i w bakteriach spoczywających na na selektywnych płytkach agarowych. Mutanty ATazy wykazywały podobne wskaźniki spontanicznej mutacji mutacji spontanicznych, jak bakterie z ATazą w fazie wzrostu; nadmiar mutantów powstawał w nie dzielących się komórkach. Mutageneza związana ze spoczynkiem u bakterii ada + ogt + uvr- była dwufazowa; wysoki zakres czułości był wyzwalany po pierwszych 6 dni po posianiu. W przeciwieństwie do tego, spontaniczne mutanty Lacc z komórek ada- ogt- uvr- stale rosły w ciągu 8-dniowego okresu inkubacji płytek. Te Wyniki te sugerują, że przy braku naprawy wycięcia nukleotydów, naprawa przez ATazy Ada i Ogt nie jest nasycona, dopóki komórki nie będą odpoczywały przez 6 dni. Spektrum spontanicznych mutacji LacI-d u bakterii ada + ogt + uvr- rosnących w nieselektywnej pożywce płynnej posłużyło jako punkt odniesienia do określenia zdarzeń mutacji zwiększonych w pochodnej z niedoborem ATazy po przedłużonej inkubacji na płytkach selektywnych. Odsetek przejść G:C-->A:T prawdopodobnie napędzanych przez nienaprawione zmiany O6-alkiloguaniny, był zwiększony kosztem innych typów mutacji. Przejścia G:C-->A:T gromadziły się z wyraźnym odchyleniem 5'PuG, co sugeruje, że endogenny metabolit(y) odpowiedzialny(e) za tę klasę mutacji to związek(i) alkilujący(e) typu SN1. związek(i) alkilujący(e) typu SN1. W związku z tym rozkład miejsc przejść G:C-->A:T w u nie dzielących się bakterii z defektem ATazy wykazywał podobieństwa do widm indukowanymi przez alkilonitrozomoczniki, szczególnie z tymi, które generują nieporęczne alkilowane addukty DNA. addukty DNA. --- Chociaż ludzka alkilotransferaza O6-alkiloguanina-DNA (AGT) jest bardzo wrażliwa na inaktywację przez O6-benzylguaninę (BG) lub na inaktywację przez O6-benzylguaninę (BG) lub 2,4-diamino-6-benzyloksy-5-nitrozopirymidynę (5-nitrozo-BP), równoważną białko utworzone przez karboksylową domenę końcową produktu genu Escherichia coli (Ada-C) nie ulega wpływowi tych inhibitorów. Ta różnica jest niezwykła w świetle znacznego podobieństwa między tymi białkami (33% reszt we wspólnej sekwencji jest identycznych) i jest potencjalnie bardzo i jest potencjalnie bardzo ważna, ponieważ inhibitory te są opracowywane jako leki zwiększające aktywność przeciwnowotworową środków alkilujących. Aby zrozumieć przyczynę oporności białka Ada-C, stworzyliśmy chimery między sekwencjami Ada-C i AGT i mutacjami w białku Ada-C, wyraziliśmy zmienione białka w szczepie E. coli pozbawionym szczepie E. coli pozbawionym endogennej aktywności alkilotransferazy i przetestowaliśmy inaktywację powstałych białek przez BG lub 5-nitrozo-BP. Chimeryczne alkilotransferazy, w których reszty po stronie aminowej miejsca akceptorowego cysteiny cysteiny pochodziły z Ada-C, a reszty po stronie karboksylowej pochodziły z AGT i odwrotnie. pochodziły z AGT i odwrotnie, ale nie wykazywały one wrażliwości na BG, co sugeruje, że że odporność jest wytwarzana przez reszty w obu segmentach białka. Analiza zmutowanych białek Ada-C ujawniła dwa miejsca mutacji, które które nadają wrażliwość na te inhibitory. Jednym z nich był tryptofan-336, a drugim drugim były reszty lizyny-314 i alaniny-316. Tak więc, gdy połączone mutacje A316P/W336A w sekwencji Ada-C, białko było wrażliwe na inaktywację przez BG. Zmutowane białko A316P/W336A było jeszcze bardziej wrażliwe na 5-nitrozo-BP, a zmutowane białka W336A, K314P/A316P i A316P mogły być również hamowane przez ten lek (w kolejności malejącej wrażliwości), chociaż kontrola Ada-C i mutant R335S nie były hamowane. Wyniki te stanowią silne poparcie dla hipotezy, że oporność alkilotransferazy Ada-C jest z powodu efektu sterycznego ograniczającego dostęp do miejsca aktywnego. Wstawienie reszt proliny w pozycjach 314 i 316 oraz usunięcie nieporęcznej reszty tryptofanu w pozycji 336 pozycji 336 zwiększa przestrzeń dostępną w miejscu aktywnym i pozwala tym inhibitory są skuteczne. --- Mutant Bacillus subtilis defektywny w konstytutywnej aktywności alkilotransferazy O6-alkiloguaniny-DNA został wyizolowany ze szczepu (ada-1). alkilotransferazy O6-alkiloguaniny-DNA został wyizolowany ze szczepu (ada-1) z niedoborem odpowiedzi adaptacyjnej na alkilację DNA. Komórki niosące mutację mutację dat-1, która była odpowiedzialna za defekt aktywności konstytutywnej wykazywały nadwrażliwość na śmiertelność i mutagenezę po zakażeniu związkami metylo-nitrozowymi. związkami metylo-nitrozowymi. Aktywność konstytutywna jest niezależna od odpowiedź adaptacyjna i wydaje się funkcjonować jako podstawowa obrona przed środowiskowymi czynnikami alkilującymi. --- Porównano inaktywację ludzkiej i Escherichia coli O6-alkiloguaniny-DNA przez O6-metyloguaninę i O6-benzyloguaninę. Kiedy ekstrakty komórek HT29 lub białko E. coli Ada inkubowano w obecności 200 mikroM O6-metyloguaniny przez 1 godzinę, aktywność alkilotransferazy została zredukowana odpowiednio do 44 i 39% poziomów kontrolnych. Jednak w tych samych warunkach O6-benzylguanina całkowicie wyczerpała aktywność alkilotransferazy w ekstrakcie z ludzkich komórek, ale praktycznie nie miała wpływu na białko Ada. Inkubacja alkilotransferazy komórek HT29 z O6-benzylo[3H]guaniną skutkowała zależną od czasu produkcję [3H]guaniny. Nie zaobserwowano podobnej produkcji [3H]guaniny zaobserwowano w obecności białka Ada. W komórkach CHO transfekowanych bakteryjnym genem ada (CHO-ada) lub ludzkim cDNA alkilotransferazy (CHO-MGMT), leczenie 500 mikroM O6-metyloguaniną hamowało obie alkilotransferazy o więcej niż 85%. W przeciwieństwie do tego, 2 mikroM O6-benzylguaniny hamowało ludzką alkilotransferazę wyrażoną w komórkach CHO-MGMT o ponad 99%, chociaż stężenia tak wysokie jak 25 mikroM przez 24 godziny nie miały hamującego wpływu na bakteryjną alkilotransferazę wyrażaną w komórkach CHO-ada. To selektywne hamowanie zaobserwowano również in vivo u transgenicznych myszy wyrażających ada w wątrobie, gdzie O6-benzylguanina powodowała spadek całkowitej aktywności alkilotransferazy wątrobowej tylko o 40% w porównaniu do 95% u myszy nietransgenicznych. w porównaniu do 95% u myszy nietransgenicznych, co jest zgodne z hamowaniem tylko alkilotransferazy ssaków i utrzymaniem aktywności alkilotransferazy bakteryjnej alkilotransferazy bakteryjnej u tych zwierząt. Tak więc, podczas gdy O6-metyloguanina w wysokich stężeniach stężeniach inaktywuje zarówno alkilotransferazy bakteryjne, jak i ssaków, O6-benzylguanina jest substratem tylko dla białka ssaków i nie jest w stanie, być może z powodu przeszkody sterycznej, hamować białka Ada.
Jaka jest rola alkilotransferazy Ada O6-alkiloguaniny w bakteriach?
Metylotransferaza O6-metyloguaniny-DNA Ada jest wielofunkcyjnym białkiem, produktem genu ada. Ada funkcjonuje w naprawie DNA poprzez bezpośrednią dealkilację alkilowanych zmian DNA, takich jak toksyczna, mutagenna i rakotwórcza O6-alkiloguanina (O6-AlkG) i O4-alkilotymina (O4-AlkT), które są przywracane do guaniny i tyminy. Ada akceptuje stechiometrycznie grupę alkilową z O6-alkiloguaniny w DNA przy reszcie Cys-321 i z alkilofosfotriestru przy reszcie Cys-69. Po metylacji przy Cys-69, Ada staje się aktywatorem transkrypcji genów w regulonie ada, w tym własnego. Gen ada kontroluje indukowalną odporność na mutagenezę alkilacyjną i zabijanie (odpowiedź adaptacyjna). Alkilotransferaza Ada (ATaza) jest indukowana przez ekspozycję na niskie dawki czynników metylujących. Podczas wzrostu wykładniczego Ada usuwa zmiany odpowiedzialne za przejścia G:C do A:T i G:C do C:G, podczas gdy w populacjach stacjonarnych usuwa zmiany powodujące przejścia G:C do A:T i A:T do G:C oraz G:C do C:G, A:T do C:G i A:T do T:A. W ten sposób białko Ada działa zarówno jako pozytywny regulator odpowiedzi ada, jak i jako enzym naprawczy DNA.