Ubikwitynacja jest potranslacyjną modyfikacją białek, która obejmuje kowalencyjne przyłączenie ubikwityny, zarówno w postaci pojedynczej cząsteczki, jak i polimerów. Proces ten proces kontroluje prawie każdy komórkowy szlak metaboliczny poprzez różne kombinacje wiązań. Spektrometria masowa pozwala obecnie na podejścia do identyfikacji tysięcy ubikwitynowanych białek i miejsc ich ubikwitynacji. ich miejsc ubikwitynacji. Pomimo znacznych ulepszeń technologicznych w spektrometrii spektrometrii mas pod względem czułości, rozdzielczości i szybkości akwizycji, zastosowanie skutecznych metod oczyszczania ubikwitynowanych białek przed analizą spektrometrii mas spektrometrii mas ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wydajnej charakterystyki ubikwitynomu. ubikwitynomu. Ten krytyczny etap jest osiągany przy użyciu różnych podejść, które posiadają zalety i pułapki. Tutaj omawiamy ograniczenia, które można napotkane podczas rozszyfrowywania ubikwitomu. Ten artykuł jest częścią zatytułowanego: Molekularne podstawy zaniku mięśni. --- Ubikwitynacja białek odgrywa ważną rolę w regulacji wielu procesów komórkowych, w tym procesów komórkowych, w tym degradacji białek, regulacji cyklu komórkowego apoptozę i naprawę DNA. Aby zbadać proteom ubikwityny, opracowaliśmy metodę oczyszczania immunopowinowactwa do analizy proteomicznej endogennie ubikwitynowanych kompleksów białkowych. ubikwitynowanych kompleksów białkowych. Silne, specyficzne wzbogacenie ubikwitynowanych czynników ubikwitynowanych czynników uzyskano stosując przeciwciało FK2 związane z agarozą zawierającą białko G, która rozpoznaje koniugaty monoubikwitynowane i polubikwitynowane. Masa Analiza spektrometryczna dwóch immunoprecypitacji FK2 (IP) doprowadziła do identyfikację 296 białek specyficznych dla FK2 w obu eksperymentach. Izolacja ubikwitynowanych i związanych z ubikwitynacją białek została potwierdzona przez analizy ścieżek analizy (przy użyciu Ingenuity Pathway Analysis i Gene Ontology-annotation enrichment). Dodatkowo, porównanie białek, które specyficznie spadły w FK2 IP z bazami danych ubikwitynowanych białek wykazało, że wysoki procent białek w naszej wzbogaconej frakcji był rzeczywiście ubikwitynowany. Wreszcie, ocena interakcji białko-białko wykazała, że znacznie więcej białek więcej białek specyficznych dla FK2 znajdowało się w kompleksach białkowych niż w losowych zestawach białek. niż w losowych zestawach białek. Ta metoda, która jest zdolna do izolowania zarówno endogennie ubikwitynowanych białek i oddziałujących z nimi białek, może być szeroko stosowana do do odkrywania regulacji białek za pośrednictwem ubikwityny w różnych systemach komórkowych i tkankach tkankach przy porównywaniu różnych stanów komórkowych. --- Udane zastosowanie inhibitorów proteasomu w badaniach klinicznych ujawniło potencjał potencjał systemu proteasomu ubikwityny do opracowywania leków. Białko poprzez ubikwitylację reguluje stabilność i aktywność istotnych czynników komórkowych poprzez i aktywność istotnych czynników komórkowych poprzez w dużej mierze niescharakteryzowane mechanizmy. mechanizmy. Tutaj wykorzystaliśmy tandemowo powtarzające się jednostki wiążące ubikwitynę (TUBE) w warunkach niedenaturujących, a następnie analizę spektrometrii masowej w celu zbadania globalne zdarzenia ubikwitylacji, które mogą prowadzić do identyfikacji potencjalnych celów dla leków. Korzystając z tego podejścia zidentyfikowaliśmy 643 białka, w tym znane i nieznane cele ubikwityny z ludzkich komórek gruczolakoraka piersi MCF7 traktowanych adriamycyną. Zgodnie z globalną odpowiedzią komórkową na tę genotoksyczną zidentyfikowane czynniki komórkowe są zaangażowane w syntezę białek, transport komórkowy transport komórkowy, potranskrypcyjną modyfikację RNA i szlaki sygnałowe regulujące wczesne reakcje na stres. Obejmuje to składniki dużych kompleksów makromolekularnych, takich jak podjednostki i regulatory proteasomu, wspierając wykorzystanie tej metody do scharakteryzowania sieci interakcji molekularnych interakcji molekularnych koordynowanych przez ubikwitylację. Dalsza analiza in vitro i in silico potwierdziły, że 84% wszystkich zidentyfikowanych tutaj białek jest ubikwitylowane. Co ważniejsze, wzbogacenie znanych biomarkerów i celów dla rozwoju leków, podkreśliło potencjał tego podejścia dla identyfikacji tych klinicznie istotnych informacji. Ten artykuł jest częścią wydania specjalnego zatytułowanego: Proteomika: Powiązanie kliniczne.
Czym jest proteom ubikwityny?
Proteom ubikwityny to cały zestaw ubikwitynowanych białek i ich odpowiednich miejsc ubikwitynacji.