Zbadaliśmy wzbogacenie i dystrybucję wariantu histonu mH2A1 w skondensowanym nieaktywnym chromosomie X (Xi). skondensowanym nieaktywnym chromosomie X (Xi). Stosując wysoce specyficzne przeciwciała przeciwko mH2A1 i stabilnych linii komórkowych HEK 293 wyrażających zieloną fluorescencję białko (GFP) -mH2A1 lub GFP-H2A, stwierdziliśmy, że chromosom Xi zawiera około 1,5-krotnie więcej mH2A1 niż autosomy. Aby określić in vivo dystrybucję mH2A1 wzdłuż chromosomu X, użyliśmy natywnej chromatyny technikę immunoprecypitacji na chipie. DNA wyizolowane z mH2A1-immunoprecypitowane nukleosomy z męskiej lub żeńskiej wątroby myszy były hybrydyzowane do mikromacierzy kafelkowych obejmujących 5 kb wokół większości promotorów lub całego chromosomu X. Dane pokazują, że mH2A1 jest równomiernie rozmieszczony na całym chromosomie Xi. Co ciekawe, silniejsze wzbogacenie mH2A1 wzdłuż pseudoautosomalnego regionu chromosomu X zaobserwowano u obu płci. Nasze wyniki wskazują na potencjalną rolę makroH2A w wielkoskalowej strukturze chromosomu i stabilności genomu. stabilności genomu. --- Jedną z kilku cech nabytych przez chromatynę nieaktywnego chromosomu X (Xi) jest wzbogacenie o podstawowy wariant histonu H2A macroH2A w obrębie odrębnej struktury jądrowej zwanej struktury jądrowej określanej jako ciało makrochromatynowe (MCB). Oprócz do MCB, makroH2A gromadzi się w strukturze okołojądrowej wyśrodkowanej w centrosomie. Aby lepiej zrozumieć związek makroH2A1 z centrosomem i tworzeniem MCB, zbadaliśmy dystrybucję makroH2A1 w całym somatycznym cyklu komórkowym. W przeciwieństwie do RNA specyficznego dla Xi, które wiąże się z Xi przez całą interfazę, pojawienie się MCB jest jest głównie cechą fazy S. Chociaż MCB rozprasza się podczas późnej fazy S i G2 przed reformacją w późnym G1, makroH2A1 pozostaje związany podczas mitozy z określonymi regionami Xi, w tym w centrum inaktywacji X. Ta asocjacja daje wyraźny wzór pasmowania makroH2A, który pokrywa się z miejscem metylacji lizyny-4 histonu H3 w locus DXZ4 w Xq24. Centrosomalna pula makroH2A1 gromadzi się w obecności inhibitora proteasomu 20S. proteasomu 20S. Dlatego celowanie makroH2A1 do centrosomu jest prawdopodobnie częścią szlaku degradacji, mechanizmu wspólnego dla wielu innych białek chromatyny. białek chromatyny. --- Komórki samic ssaków inaktywują transkrypcję z jednego z ich chromosomów X w celu wyrównania ekspresji genów sprzężonych z chromosomem X między samcami i samicami. Dezaktywacja jest wieloetapowym procesem, który obejmuje duży niekodujący RNA o nazwie XIST, różnorodne modyfikacje epigenetyczne chromatyny i zmiany w składzie białek, takie jak wzbogacenie w składzie białek, takie jak wzbogacenie wariantu histonu macroH2A. Pokazujemy tutaj, że nieaktywne chromosomy X są również wzbogacone w dobrze scharakteryzowany białkowy składnik rusztowania jądrowego, SAF-A. Białko to zostało zaangażowane w organizację chromatyny, ze względu na jego wysoką specyficzność dla regionu związanego z rusztowaniem (SAR) - DNA, w regulacji transkrypcji, np. genów regulowanych hormonalnie, dzięki funkcjonalnej interakcji z receptorami steroidowymi receptorami steroidowymi, a także w przetwarzaniu RNA, dzięki interakcji z RNA i heterogennymi cząsteczkami rybonukleoprotein jądrowych (hnRNP). Po prawie całkowitym usunięciu DNA i powiązanych białek chromatyny, takich jak makroH2A, SAF-A pozostaje z "matrycą jądrową", nadal podkreślając poprzednią pozycję nieaktywnych chromosomów X chromosomów X. Co ciekawe, wzbogacenie SAF-A w nieaktywnym chromosomie X zależy od domeny wiążącej RNA białka, pola RGG, podnosząc możliwość możliwość, że interakcja SAF-A z RNA XIST może przyczyniać się do wyciszania genów sprzężonych z chromosomem X poprzez lokalne zmiany w architekturze jądrowej. --- Warianty histonów zastępują histony rdzeniowe w znacznej części nukleosomów. nukleosomach, wpływając na strukturę chromatyny i wpływając na procesy wzorowane na chromatynie procesy. W wielu przypadkach włączenie wariantów histonów skutkuje tworzenie wyspecjalizowanych regionów chromatyny. Właściwa lokalizacja wariantów histonów do różnych regionów genomu ma kluczowe znaczenie dla ich funkcji, ale jak ta specyficzna lokalizacja jest osiągana, pozostaje niejasne. macroH2A1 jest wzbogacony na nieaktywnym chromosomie X w komórkach żeńskich ssaków, gdzie makroH2A1 składa się z domeny histonowej podobnej do histonu H2A i dużej, globalnej domeny histonowej. domeny histonowej i dużej, kulistej C-końcowej makro domeny, która nie jest obecna w innych białkach histonowych. Sama domena histonowa makroH2A1 jest wystarczająca do bezpośredniego wzbogacenia na nieaktywnym chromosomie X, gdy ulega ekspresji w komórkach żeńskich wskazując, że sekwencje ważne dla prawidłowej lokalizacji leżą w tej domenie. domenie. Tutaj badamy, czy rozbieżne sekwencje wariantu H2A macroH2A1 przyczyniają się do jego prawidłowej lokalizacji. Zmapowaliśmy regiony domeny histonowej makroH2A1, które są wystarczające do lokalizacji w nieaktywnym chromosomie X przy użyciu chimer pomiędzy H2A i domeną histonową makroH2A1. Wiele krótkich sekwencji rozproszonych wzdłuż domeny histonowej makroH2A1 indywidualnie wspierały wzbogacenie na nieaktywnym chromosomie X po wprowadzeniu do H2A. Sekwencje te mapują powierzchnię dimeru makroH2A1/H2B, ale są ukryte w strukturze krystalicznej makroH2A1. zakopane w strukturze krystalicznej nukleosomu zawierającego makroH2A1, sugerując, że mogą one przyczyniać się do rozpoznawania przez czynniki osadzania makroH2A1/H2B czynników.
W których pozycjach genomu wzbogacony jest wariant histonu macroH2A?
makroH2A1 jest wzbogacony na nieaktywnym chromosomie X w komórkach żeńskich ssaków, gdzie działa w celu utrzymania wyciszania genów. Regiony transkrypcyjne większości aktywnych genów są pozbawione makroH2A, często w ostro zlokalizowanych domenach, które wykazują 4-krotne lub większe zubożenie w stosunku do chromatyny wątroby myszy. Ta represorowa aktywność marcroH2A jest dodatkowo wspierana przez znaczne i stosunkowo jednolite wzbogacenie makroH2A1 wzdłuż nieaktywnego chromosomu X, które wynosi średnio 4-krotność. Oprócz lokalizacji w MCB, makroH2A gromadzi się w strukturze okołojądrowej skupionej w centrosomie