Produkujący inulinazę szczep Microbulbifer sp., JAM-3301, został wyizolowany z osadu głębinowego osadów głębinowych. Operon inuliny zawierający trzy otwarte ramki odczytu został sklonowany i zsekwencjonowany. Dwa z trzech genów uległy ekspresji. Jednym z produktów była endo-inulinazy, a drugim była β-fruktofuranozydaza. Oba enzymy pracowały razem, aby skutecznie degradować inulinę. --- Inulina wyłania się jako niezwykle rzadkie źródło cukru, ma więcej zdolność słodzenia niż cukier stołowy, ma korzystny wpływ na pacjentów z cukrzycą. Inulinazy produkowane głównie przez mikroorganizmy rozkładają inulinę do fruktozy, która jest formą strawną. fruktozę, która jest formą strawną. Istnieje ponad 58 szczepów mikroorganizmów, które są zaangażowane w produkcję inulinaz. Niniejszy raport bada selektywność inuliny przez inulinazę i jej działanie do produkcji fruktozy poprzez dokowanie molekularne. Zbadaliśmy egzo-inulinazy i endo-inulinazy z Penicillium sp. TN-88(BAC16218) i Penicillium sp. TN-88(BAA19132), odpowiednio z różnym układem aminokwasów w miejscu aktywnym, które wykrywają substrat. Sekwencje białek opisane powyżej zostały przetworzone do modelowania homologii za pomocą modelu szwajcarskiego i dalej zostały zadokowane z 1-ketozą i fruktozo-6-fosforanem jako substratem za pomocą pakietu oprogramowania DOCK6 (dock.compbio.ucsf.edu). Wyniki niniejszych badań reprezentowały, że fruktozo-6-fosforan ((2R,3R,4S) fruktozo-6-fosforan) był miał lepszą interakcję z egzo-inulinazą, wykazując wynik siatki -40.288094 a konserwowany aminokwas Asp-22, Asp 128, Asp 179 i Ser 84 z egzo-inulinazy są zaangażowane w wiązanie. Oprócz tego zaobserwowano również że 1-ketoza ((3S,4R)-ketoza 1-fosforan) nie wykazywała żadnej interakcji z konserwowaną częścią endoinulinazy. konserwowaną częścią endo-inulinazy. --- Inulina jest węglowodanem składającym się z liniowych łańcuchów cząsteczek β-2,1-fruktofuranozy zakończonych resztami glukozy. D-fruktofuranozy zakończonych resztami glukozy poprzez wiązanie typu wiązanie typu sacharozy na końcu redukującym. Topinambur (JA) jest jednym z najbardziej interesujących materiałów wśród najbardziej interesujących materiałów wśród niekonwencjonalnych i odnawialnych surowców, z poziomami inuliny sięgającymi 50-80% suchej masy. Inulina lub materiały bogate w inulinę inulinę mogą być aktywnie hydrolizowane przez inulinazy mikrobiologiczne w celu wytworzenia syropów glukozowo-fruktozowych. i syropów fruktozowych, które mogą być wykorzystywane w bioprocesach. W tym badaniu wyizolowano kilka wyizolowano kilka szczepów drobnoustrojów i oceniono ich zdolność do biosyntezy inulinazy. oceniono. Nowy szczep drożdży Talf1, zidentyfikowany jako Zygosaccharomyces bailii, był najlepszym producentem inulinazy, osiągając 8,67 U/ml aktywności inulinazy, gdy sok sok JA był stosowany jako substrat indukujący. Szczep Z. bailii Talf1 i/lub jego enzymatyczny surowy ekstrakt enzymatyczny surowy ekstrakt były dalej stosowane do produkcji bioetanolu i biodesulfurization (BDS), wykorzystując inulinę i sok JA jako źródło węgla. W skonsolidowanym bioprocesie produkcji etanolu z 200 g/l inuliny, Z. bailii szczep Talf1 był w stanie wyprodukować 67 g/l etanolu. Ta wydajność etanolu została poprawiona w procesie jednoczesnego scukrzania i fermentacji (SSF), z użyciem drożdży etanogennych Saccharomyces cerevisiae CCMI 885 i inulinazy Talf1 inulinazy, osiągając produkcję 78 g/l etanolu. Jednakże, najwyższa etanolu (∼48%) uzyskano w procesie SSF z soku JA (∼130 g/l cukrów fermentowalnych), w którym cukrów fermentowalnych), gdzie S. cerevisiae wyprodukował 63 g/l etanolu. Względnie do testów BDS dibenzotiofenu, szczep Gordonia alkanivorans 1B osiągnął szybkość odsiarczania na poziomie 4,8 μM/h w procesie SSF z wykorzystaniem inulinazy Talf1 i soku JA, podkreślając potencjał JA jako tańszej alternatywy źródło węgla. Wyniki te wykazały wysoki potencjał inulinaz Z. bailii szczepu Talf1 jako wszechstronnego narzędzia do bioprocesów wykorzystujących materiały bogate w inulinę. --- Szczepy należące do gatunku drożdży Kluyveromyces marxianus zostały zostały wyizolowane z bardzo różnych siedlisk, co skutkuje wysoką różnorodnością metaboliczną i znacznym stopniem polimorfizmu różnorodność metaboliczną i znaczny stopień polimorfizmu wewnątrzgatunkowego. W konsekwencji W konsekwencji, kilka różnych zastosowań biotechnologicznych zostało biotechnologicznych: produkcja enzymów (beta-galaktozydazy, beta-glukozydazy, inulinazy i poligalakturonazy, między innymi), białek jednokomórkowych białek jednokomórkowych, związków aromatycznych i etanolu (w tym wysokotemperaturowe i symultaniczne procesy scukrzania-fermentacji); redukcja zawartości laktozy w produktach spożywczych; produkcja bioskładników z sera serów; bioremediacja; jako środek antycholesterolemiczny; oraz jako gospodarz do produkcji białek heterologicznych. heterologicznej produkcji białek. W porównaniu do swojego kongenera i organizmu modelowego, Kluyveromyces lactis, zgromadzona wiedza na temat K. marxianus jest znacznie mniejsza i rozproszona na wiele różnych szczepów. Chociaż nie ma publicznie sekwencji genomu dla tego gatunku, 20% genomu szczepu CBS 712 zostało losowo zsekwencjonowane (Llore (Llorente et al. w FEBS Lett 487:71-75, 2000). Pomimo Pomimo tych faktów, K. marxianus może przewidywać wielką przyszłość biotechnologiczną ze względu na niektóre z jego cech, takie jak szerokie spektrum substratów, termotolerancja, wysokie tempo wzrostu i mniejsza tendencja do fermentacji pod wpływem nadmiaru cukru, w porównaniu do K. lactis. Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii tego gatunku biologii tego gatunku i umożliwić przekształcenie potencjalnych zastosowań w praktykę przemysłową. w praktyce przemysłowej, bardziej systematyczne podejście, w tym staranny wybór (a) szczepów referencyjnych przez społeczność naukową, z pewnością miałoby wielką wartość. wartość. --- Egzoinulinaza (fruktohydrolaza beta-d-fruktanu, EC 3.2.1.80) wydzielana przez Aspergillus terreus CCT4083 uzyskano przy użyciu wytłoków z trzciny cukrowej, pozostałości trzciny cukrowej, pozostałości rolno-przemysłowej, jako źródła węgla. Został on następnie oczyszczony z supernatantu w szybkiej procedurze. Enzym wykazywał 57 kDa na SDS-PAGE i 56 kDa w chromatografii filtracji żelowej. Inulina była hydrolizowana przez oczyszczony enzym, dając d-fruktozę jako główny produkt. Enzym ten wykazywał maksymalną aktywność przy pH 4,0 i 60 stopniach C i utrzymywał ponad 90 i 75% swojej pierwotnej aktywności odpowiednio w 40 i 50 stopniach C, po 3,5 godz. preinkubacji. Wartości K(M) dla inuliny, sacharozy i rafinozy wynosiły odpowiednio 11, 4,20, i 27,89 mM, a d-fruktoza była konkurencyjnym inhibitorem (K(i) = 47,55 mM). Energie aktywacji dla sacharozy, rafinozy i inuliny wynosiły odpowiednio 10,4, odpowiednio 5,61 i 4,44 kcal/mol. Charakterystyka egzoinulinazy A. terreus zostały porównane z inulinazami wyizolowanymi z innych organizmów. Cechy egzoinulinazy charakteryzowały się szczególnie dobrą termostabilnością i zdolność do produkcji czystej d-fruktozy, co sugeruje jej zastosowanie do produkcji syropu wysokofruktozowego. syropu wysokofruktozowego. --- Trzydzieści gatunków grzybów hodowanych na ekstrakcie z korzenia Cichorium intybus L. jako jedynym źródle węgla jako jedynym źródle węgla, zostało przebadanych pod kątem produkcji egzo-inulinazy. The termofil Thielavia terrestris NRRL 8126 i mezofil Aspergillus foetidus NRRL 337 dały najwyższe poziomy produkcji inulinazy I i II w temperaturze odpowiednio 50 i 24 ºC. odpowiednio. Ekstrakt drożdżowy i pepton były najlepszymi źródłami azotu dla najwyższej produkcji inulinazy I i II odpowiednio po pięciu i siedmiu dniach inkubacji. odpowiednio. Obie inulinazy I i II zostały oczyszczone do jednorodności przez filtrację żelową i chromatografię jonowymienną z odpowiednio 66,0 i 42,0-krotnym oczyszczania odpowiednio. Optymalne temperatury oczyszczonych inulinaz I i II wynosiły odpowiednio 75 i 50 ºC. Inulinaza I była bardziej termostabilna niż niż druga. Stwierdzono, że optymalne pH dla aktywności wynosi 4,5 i 5,5 odpowiednio dla inulinazy I i II. Stosunkowo niższa stała Michaelisa-Menten (2,15 mg/ml) i wyższa maksymalna prędkość początkowa (115 µmol/min/mg białka) dla inulinazy I na inulinie wykazały większe powinowactwo egzoinulinazy do substratu do substratu inuliny. Odkrycia te są istotne dla jej potencjalnego zastosowania w przemyśle. Masę cząsteczkową inulinazy I i II oszacowano odpowiednio na 72 i 78 kDa odpowiednio przez dodecylosiarczan sodu-żel poliakryloamidowy elektroforezy. --- Oceniono różne źródła węgla do produkcji inulinazy przez drożdże, Kluyveromyces marxianus MTCC 3995. Najwyższą aktywność inulinazy zaobserwowano w przypadku Ekstrakt z dalii (25,3 nkat mL(-1)) jako źródło węgla. Aktywność enzymu była 1,4 krotnie wyższa niż obserwowana w podłożach zawierających czystą inulinę z cykorii (17,8 nkat mL(-1)). Drożdże wykazywały dobry wzrost na prostej pożywce zawierającej ekstrakt z dalii (20% w / v) i ekstrakt drożdżowy (2% w / v) jako źródło węgla i azotu odpowiednio w ciągu 96 godzin w temperaturze 28°C i 120 obr. Najniższą wydajność inulinazy (4,8 nkat mL(-1)) zaobserwowano w podłożu zawierającym glukozę jako źródło C. Chociaż zróżnicowane poziomy inulinazy zaobserwowano na różnych źródłach C, Inulinase: Sucrase (I/S) były podobne. Spośród różnych testowanych źródeł białka ekstrakt drożdżowy okazał się najlepszym źródłem, a następnie ekstrakt wołowy (17,9 nkat mL(-1)) i pepton (13,8 nkat mL(-1)). Enzym był optymalnie aktywny przy pH (4,0) i temperaturze 50°C. Analiza TLC produktu końcowego wykazała, że inulinazy hydrolizowały inulinę wyłącznie do fruktozy. inulinę wyłącznie do fruktozy. Wyniki sugerują, że ekstrakt z dalii indukował syntezę egzoinulinazy w Kluyveromyces marxianus i może być wykorzystany jako potencjalny substrat do produkcji inulinazy. --- Niniejsza praca koncentruje się na syntezie fruktooligosacharydów (FOS) z sacharozy i inuliny, przy użyciu wolnej, immobilizowanej i poddanej wstępnej obróbce immobilizowanej inulinazy z Kluyveromyces marxianus NRRL Y 7571 i Aspergillus niger w układzie wodno-organicznym. w układzie wodno-organicznym. Początkowo badano wpływ obróbki wstępnej przy użyciu czterech różnych gazów różnych gazów, propanu, n-butanu, CO(2) i skroplonego gazu ropopochodnego (LPG), na produkcję FOS. w kierunku produkcji FOS i najlepsze wyniki uzyskano, gdy oba enzymy enzymy zostały wcześniej poddane działaniu LPG. Najlepszą wydajność reakcji uzyskano gdy immobilizowane enzymy były traktowane LPG. Biorąc pod uwagę syntezę FOS przy użyciu enzymu z A. niger, uzyskano 26,62% GF2 (kestoza), 30,62% GF3 (nystoza) i 8,47% GF4 (fruktozylo-nystoza) uzyskano stosując sacharozę jako substrat. jako substratu. Stosując inulinazy z K. marxianus NRRL Y 7571, 11,89% GF2 i 20,83% GF3, stosując inulinę jako substrat. Jednakże, obiecujące inulinazy z A. niger (77,19% GF2; 14,03% GF3). GF2; 14,03% GF3 i 0,07% GF4) przy użyciu inuliny jako substratu. --- Komercyjna inulinazy z Aspergillus niger została unieruchomiona w montmorylonicie a następnie poddano działaniu propanu i skroplonego gazu ropopochodnego (LPG) pod ciśnieniem. Po pierwsze, wpływ ciśnienia w układzie, czasu ekspozycji i szybkości obniżania ciśnienia przy użyciu propanu i LPG na aktywność enzymatyczną oceniano za pomocą centralny złożony projekt 2³. Aktywności resztkowe wynoszące 145,1 i 148,5% zostały zaobserwowano dla LPG (30 barów, 6 godzin i szybkość obniżania ciśnienia 20 barów min-¹) i propan (270 barów, 1 h i szybkość obniżania ciśnienia 100 barów min-¹), odpowiednio. Katalizatory poddane obróbce w tych warunkach w obu cieczach zostały następnie do produkcji fruktooligosacharydów (FOS) przy użyciu sacharozy i inuliny jako substratów w układach wodnych i organicznych. Głównym celem tego etapu była ocena wydajności i produktywności FOS, przy użyciu alternatyw dla aktywności enzymów za pomocą płynów pod ciśnieniem, a także przy użyciu tanich nośników do immobilizacji enzymów, mając na celu uzyskanie stabilnego biokatalizatora do wykorzystania w reakcjach syntezy. do wykorzystania w reakcjach syntezy. Uzyskano wydajność 18% przy użyciu sacharozy jako substratu jako substratu w środowisku wodnym, pokazując potencjał tej procedury, a tym samym sugerując dalszy etap optymalizacji w celu zwiększenia wydajności procesu. --- Fruktany zostały wyekstrahowane z soku Agave salmiana, scharakteryzowane i poddane procesowi hydrolizy przy użyciu komercyjnego preparatu inulinazy działającego swobodnie. Aby porównać wydajność preparatu enzymatycznego, partię eksperymentów przeprowadzono również z inuliną z cykorii (odniesienie). Hydrolizę prowadzono przez 6 h w dwóch temperaturach (50, 60 °C) i dwóch stężeniach substratu (40, 60 mg/ml). Proces hydrolizy monitorowano poprzez pomiar uwolnionych cukrów i i pozostałości substratu metodą HPLC. Opracowano model matematyczny opisujący kinetykę kinetykę degradacji substratu, jak również produkcję fruktozy. ocenę hydrolizy. Stwierdzono, że na kinetykę istotnie wpływały temperatura, stężenie substratu i rodzaj substratu (P < 0,01). Zakres stopień hydrolizy substratu wahał się od 82 do 99%. Produkt hydrolizy był składał się głównie z fruktozy, uzyskując od 77 do 96,4% całkowitej ilości cukrów redukujących. cukrów redukujących. --- Nowa zewnątrzkomórkowa egzoinulinaza została oczyszczona i scharakteryzowana z nowego szczepu drożdży KRF1(T). KRF1(T), a gen kodujący enzym został pomyślnie sklonowany. Enzym był stabilny przy niskim pH między 3,0 a 6,5. Wartości K (m) i V (max) oczyszczonego enzymu dla inuliny wynosiły odpowiednio 2,3 mg/ml i 4,8 mg/min, odpowiednio. Optymalna temperatura inulinazy wynosiła 50 ° C, a enzym enzym zachowywał 78% aktywności w 60 °C przez 2 h. Inulinazy wykazywały identyczność sekwencji aminokwasów na poziomie 58% z najbliższym enzymem. identyczność sekwencji aminokwasowej 58% z jej najbliższym homologiem w Meyerozyma (Pichia) guilliermondii. W strukturze drugorzędowej, domena G (VMEVH) enzymu zawierała trzy unikalne reszty (V, M i H). W porównaniu z wcześniej opisanymi inulinazy, enzym ze szczepu KRF1(T) wykazywał silną odporność na kwasy, znaczną termostabilność i wysokie powinowactwo do substratu inuliny. Na podstawie analizę sekwencji domeny 26S rDNA D1/D2 i charakterystykę fenotypową, stwierdzono, że szczep drożdży KRF1(T) reprezentuje nowy anamorficzny, ascomycetyczny gatunek drożdży. gatunek drożdży. Podano pełny opis gatunku i nazwę Candida kutaonensis sp. nov (typ szczepu = KRF1(T) = AS 2.4027(T) = CBS 11388(T)). --- Wyizolowano nowy termofilny szczep produkujący inulinę, który optymalnie rośnie w temperaturze 60 C, został wyizolowany z próbek gleby z pożywką zawierającą inulinę jako jako jedyne źródło węgla. Został on zidentyfikowany jako Bacillus smithii poprzez analizę 16s rDNA. Maksymalna wydajność inulinazy wynosząca 135,2 IU/ml została osiągnięta przy pH 7,0, zawierającej inulinę 2,0%, (NH(4))H(2)PO(4) 0,5%, ekstrakt drożdżowy 0,5%, w temperaturze 50 st. C 200 rpm wytrząsarce przez 72-godzinną inkubację. Oczyszczona inulinazy z ekstraktu zewnątrzkomórkowego B. smithii T7 wykazuje aktywność endoinulinolityczną. Optymalne pH optymalne pH dla tej endoinulinazy wynosi 4,5 i jest stabilne w zakresie pH 4,0-8,0. Optymalna optymalna temperatura dla aktywności enzymu wynosiła 70 stopni C, okres półtrwania endoinulinazy wynosi 9 godzin i 2,5 godziny odpowiednio w 70 stopniach C i 80 stopniach C. Porównywalnie niższa stała Michaelisa-Menten (4,17 mM) i wyższa maksymalna prędkość reakcji (833 I (833 IU/mg białka) świadczą o większym powinowactwie endoinulinazy do substratu inuliny. powinowactwo do substratu inuliny. Odkrycia te są istotne dla jej potencjalnego zastosowania przemysłowego. --- Około 1 miliona ton roślin Agave tequilana jest przetwarzanych rocznie przez meksykański przemysł Meksykański przemysł tequili generuje ogromne ilości odpadów rolniczych. Celem Celem tego badania było zbadanie potencjalnego wykorzystania odpadów Agave tequilana jako substratu do produkcji enzymów o znaczeniu komercyjnym. Dwa szczepy Aspergillus niger (CH-A-2010 i CH-A-2016), wyizolowane z pól agawy, zostały rosły i rozmnażały się w kulturach zanurzonych przy użyciu odpadów Agave tequilana jako substratu. jako podłoża. Izolaty wykazywały jednoczesną zewnątrzkomórkową inulinazę, ksylanazę, aktywność pektynazy i celulazy. Aspergillus CH-A-2010 wykazał najwyższą aktywność aktywność inulinazy (1,48 U/ml), podczas gdy Aspergillus niger CH-A-2016 wytwarzał najwyższą aktywność ksylanazy (1,52 U/ml) i endo-pektynazy (2,7 U/ml). aktywności. W obu przypadkach produkcja aktywności enzymów była znacząco wyższa na odpadach Agave tequilana niż obserwowana na skórce cytryny i specyficznych polimerowych węglowodanów. Hydroliza enzymatyczna surowych łodyg i liści A. tequilana przez enzymy wydzielane przez liści przez enzymy wydzielane przez izolaty dała maksymalne stężenia cukrów redukujących odpowiednio 28,2 g/l i 9,9 g/l. Podsumowując, odpady Agave tequilana mogą być wykorzystywane jako substrat do produkcji ważnych enzymów biotechnologicznych. enzymów biotechnologicznych.
Co jest substratem enzymu mikrobiologicznego inulinazy?
Inulinaza działa na połączenia beta-(2,1)-D-fruktozydu w inulinie uwalniając D-fruktozę.