NEMO (niezbędny modulator NF-κB) wiąże się z podjednostkami katalitycznymi IKKα i IKKβ, tworząc kompleks kinazy IκB (IKK) i jest kluczowym regulatorem sygnalizacji szlaku NF-κB i jest kluczowym regulatorem sygnalizacji szlaku NF-κB. Biochemiczna i strukturalna charakterystyka NEMO była jednak wyzwaniem, prowadząc do sprzecznych danych na temat podstawowych właściwości biochemicznych, takich jak właściwości, takich jak stan oligomeryczny aktywnego NEMO i jego powinowactwo wiązania dla IKKβ. Pokazujemy, że do siedmiu z 11 reszt cysteinowych NEMO można zmutować aby wygenerować rekombinowaną pełną długość NEMO, która jest wysoce rozpuszczalna i aktywna. Wykorzystując test wiązania anizotropii fluorescencji, pokazujemy, że pełna długość NEMO wiąże 44-merowy peptyd obejmujący reszty 701-745 IKKβ z K(D) 2,2 ± 0,8 nM. ± 0,8 nM. Powinowactwa wiązania IKKβ mutantów z pięcioma i siedmioma podstawieniami Cys do Ala są nie do odróżnienia od NEMO typu dzikiego. Ponadto, gdy wyrażone w fibroblastach NEMO -/-, mutanty NEMO z pięcioma-Ala i siedmioma-Ala mogą oddziaływać z komórkową IKKβ i przywracać sygnalizację NF-κB, aby zapewnić ochronę przed śmiercią komórek indukowaną czynnikiem martwicy nowotworów α. Leczenie Rekonstytuowane komórki NEMO z H₂O₂ doprowadziły do powstania kowalencyjnych dimerów dla NEMO typu dzikiego i mutanta 5-Ala, ale nie dla mutanta 7-Ala, potwierdzając, że Cys54 i/lub Cys347 mogą pośredniczyć w międzyłańcuchowym wiązaniu disiarczkowym. Jednak na powinowactwo wiązania IKKβ przez NEMO nie ma wpływu obecność lub obecność lub brak międzyłańcuchowego wiązania disiarczkowego na Cys54, który leży w domenie wiążącej IKKβ lub na Cys347, co wskazuje, że NEMO istnieje jako niekowalencyjny dimer niezależny od IKKβ. niekowalencyjny dimer niezależny od stanu redoks jego cystein. Ten wniosek został potwierdzony przez obserwację, że struktura drugorzędowa zawartość NEMO i jego stabilność termiczna były niezależne od obecności lub międzyłańcuchowych wiązań disiarczkowych. --- Prozapalna aktywacja NF-kappaB wymaga kompleksu kinazy IkappaB (inhibitora NF-kappaB) (IKK), który zawiera dwie podjednostki katalityczne o nazwach IKKalpha i IKKbeta oraz podjednostkę regulatorową o nazwie NF-kappaB essential modulator (NEMO). NEMO i IKKbeta są niezbędne dla czynnika martwicy nowotworów (TNF) - indukowanej aktywacji NF-kappaB, a ostatnio wykazaliśmy, że NEMO i IKKalfa są wystarczające do sygnalizacji indukowanej interleukiną (IL) -1. IKKalfa i IKKbeta zawierają funkcjonalną domenę wiążącą NEMO (NBD); jednak rola powiązania NEMO z każdą kinazą w sygnalizacji NF-kappaB i tworzeniu kompleksu IKK pozostaje niejasna. Aby odpowiedzieć na to pytanie, stabilnie odtworzyliśmy IKKalpha(-/-) i IKKbeta(-/-) mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) z dzikimi (WT) lub pozbawionymi NBD (DeltaNBD) wersjami IKKalpha i IKKbeta, odpowiednio. Indukowana przez TNF klasyczna aktywacja NF-kappaB w IKKbeta(-/-) MEFs został uratowany przez IKKbeta (WT), ale nie IKKbeta (DeltaNBD), podczas gdy ani IKKbeta (WT) ani IKKbeta (DeltaNBD) nie wpływały na sygnalizację NF-kappaB indukowaną przez IL-1. Jak wcześniej opisano, klasyczna aktywność transkrypcyjna NF-kappaB była nieobecna w IKKalfa(-/-). Rekonstytucja za pomocą IKKalpha(WT) lub IKKalpha (DeltaNBD) ratowała zarówno transkrypcję indukowaną IL-1, jak i TNF, wykazując, że asocjacja NEMO nie jest wymagana do zależnej od IKKalfa regulacja transkrypcji zależnej od NF-kappaB. Stabilnie wyrażone IKKalfa(WT) lub IKKbeta(WT) związane z endogennymi IKK i NEMO w IKKalpha(-/-) lub IKKbeta(-/-) MEFs, odpowiednio, powodując tworzenie heterotrimerycznego IKKalpha-IKKbeta-NEMO. W przeciwieństwie do tego, chociaż IKKalpha(DeltaNBD) i IKKbeta(DeltaNBD) związane z endogennymi IKK zawierającymi NBD, te dimeryczne endogenne kompleksy IKK-IKK (DeltaNBD) nie wiązały się z NEMO. Odkrycia te pokazują zatem, że tworzenie heterotrimerycznych kompleksów IKKalfa-IKKbeta-NEMO absolutnie wymaga dwóch nienaruszonych domen wiążących NEMO domen wiążących NEMO. --- Ogólna (makro)autofagia i aktywacja NFκB stanowią znaczące odpowiedzi na odpowiedzi na szeroki wachlarz wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych warunków stresowych. Zubożenie którejkolwiek z trzech podjednostek inhibitora kinazy NFκB (IκB) (IKKα, IKKβ, IKKγ/NEMO), z których każda jest niezbędna dla kanonicznego szlaku aktywacji NFκB, ogranicza autofagię. aktywacji NFκB, ogranicza indukcję autofagii przez czynniki fizjologiczne lub farmakologiczne. farmakologiczne, podczas gdy konstytutywnie aktywne podjednostki IKK wystarczają do stymulować autofagię. Aktywacja IKK zwykle opiera się na aktywowanej przez TGFβ kinazę 1 (TAK1), która jest również niezbędna do optymalnej indukcji autofagii w wielu ustawieniach. TAK1 oddziałuje z dwoma strukturalnie podobnymi koaktywatorami koaktywatorami, białkami wiążącymi TAK1 2 i 3 (TAB2 i TAB3). Co ważne, w warunkach warunkach spoczynku zarówno TAB2, jak i TAB3 wiążą istotny czynnik autofagii Beclin 1, ale nie TAK1. W odpowiedzi na bodźce pro-autofagiczne, TAB2 i TAB3 dysocjują od Beclin 1 i angażują się w stymulujące interakcje z TAK1. Hamująca hamująca interakcja między TAB i Beclin 1 jest pośredniczona przez ich domeny coiled-coil (CCD). W związku z tym nadekspresja TAB2 lub TAB3 stymuluje autofagię zależną od Beclin 1 i TAK1. Wyniki te wskazują na istnienie bezpośredniego sprzężenia molekularnego między kanonicznym szlakiem aktywacji NFκB a maszynerią rdzenia autofagii, która gwarantuje skoordynowaną indukcję tych procesów. skoordynowaną indukcję tych procesów w odpowiedzi na stres. --- Kompleks kinazy IκB (IKK) odgrywa kluczową rolę w aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB poprzez fosforylację cząsteczki hamującej IκBα. czynnika transkrypcyjnego NF-κB poprzez fosforylację cząsteczki hamującej IκBα. Niedawno wykazaliśmy, że IKK2 (zwany także IKKβ), podjednostka katalityczna kompleksu IKK kompleks, indukuje degranulację komórek tucznych za pośrednictwem immunoglobuliny E poprzez fosforylację SNAP-23, rozpuszczalnego w błonie docelowej receptora N-etylomaleimidu wrażliwego na receptor białka przyłączającego czynnik fuzyjny (SNARE). Oprócz IKK2, ostatnie badanie wykazało, że ELKS, podjednostka regulatorowa kompleksu IKK, również indukuje degranulację szczurzych komórek białaczki bazofilowej. Odkrycia te wskazują, że że dwie podjednostki kompleksu IKK, IKK2 i ELKS, funkcjonują nie tylko w komórkach białaczki bazofilów. NF-κB-zależnej aktywacji transkrypcyjnej, ale także w NF-κB-niezależnym szlakach. Niniejszy przegląd koncentruje się na funkcjach IKK2 i ELKS w degranulacji komórek tucznych. degranulacji. --- Czynnik transkrypcyjny NF-kappaB jest niezbędny do osteoklastogenezy i jest uważany za immunomodulator reumatoidalnego zapalenia stawów i zapalnej osteolizy. osteolizy. Aktywacja podjednostek NF-kappaB jest regulowana przez kinazę IkappaB (ang. kompleks kinazy IkappaB (IKK), który zawiera IKKalfa, IKKbeta i IKKgamma; ten ostatni znany jest również jako NF-kappaB. ten ostatni znany jest również jako niezbędny modulator NF-kappaB (NEMO). Rola IKKalfa i IKKbeta w rozwoju szkieletu i osteolizie zapalnej została opisana. natomiast niewiele wiadomo na temat roli NEMO w tym procesie. Zazwyczaj sygnały indukowane przez ligand RANK (RANKL) lub TNF powodują oligomeryzację monomerów oligomeryzacji monomerów NEMO poprzez motywy coiled-coil-2 (CC2) i leucynowego suwaka (LZ). Ten etap ułatwia wiązanie z IKK i dalsze przekazywanie sygnału. Biorąc pod uwagę centralną rolę NF-kappaB w osteoklastogenezie, zapytaliśmy, czy NEMO jest niezbędna do osteoklastogenezy i czy przerwanie oligomeryzacji NEMO hamuje różnicowanie osteoklastów in vitro i in vivo. Używając przepuszczalnych dla komórek krótkich peptydów nakładających się na motywy CC2 i LZ pokazujemy, że peptydy te specyficznie wiążą się z monomerami NEMO, zapobiegają tworzeniu się trimerów i sprawiają, że monomery NEMO są podatne na degradację za pośrednictwem ubikwityny. Ponadto, Peptydy CC2 i LZ osłabiają sygnalizację NF-kappaB indukowaną przez RANKL i TNF w kości pochodzących ze szpiku kostnego prekursorów osteoklastów (OCP). Co ważniejsze, peptydy te silnie hamują osteoklastogenezę in vitro i zatrzymują indukowaną przez RANKL osteolizę u myszy. Aby dokładniej określić jego rolę w osteoklastogenezie, my byliśmy w stanie zablokować osteoklastogenezę za pomocą metody knockdown NEMO siRNA. Podsumowując, nasze dane wskazują, że zablokowanie oligomeryzacji NEMO destabilizuje monomery NEMO, hamuje aktywację NF-kappaB, hamuje osteoklastogenezę i zatrzymuje osteoklastogenezę i zatrzymuje osteolizę zapalną. W ten sposób NEMO prezentuje się się jako obiecujący cel dla interwencji antyosteolitycznej. --- Antyapoptotyczny czynnik transkrypcyjny czynnik jądrowy-kappaB (NF-kappaB) jest konstytutywnie aktywowany w konstytutywnie aktywowany w mieloblastach CD34(+) od pacjentów wysokiego ryzyka z zespołem mielodysplastycznym (MDS) i pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML). Zahamowanie NF-kappaB poprzez tłumienie kanonicznego szlaku aktywacji NF-kappaB, na przykład na przykład poprzez knockdown trzech podjednostek inhibitora kinazy NF-kappaB (I kappaB (IKK) (IKK1, IKK2 i NEMO) wywołuje apoptozę w takich komórkach. komórkach. Tutaj pokazujemy, że modelowa linia komórkowa MDS/AML wykazuje konstytutywną interakcję, w obrębie jądra, aktywowanej, S1981-fosforylowanej ataksji (ATM) z NEMO. Zahamowanie ATM za pomocą dwóch różnych inhibitorami farmakologicznymi tłumiło aktywującą autofosforylację ATM, blokowała interakcję ATM i NEMO, delokalizowała NEMO, jak również inny przypuszczalny aktywator NF-kappaB, PIDD, z jądra, zniósł aktywującą fosforylację katalityczną fosforylację białek katalitycznych kompleksu IKK (IKK1/2 na serynach 176/180), zwiększał ekspresję I kappaB alfa i powodował NF-kappaB z jądra do cytoplazmy, a następnie apoptozę. apoptozę. Knockdown ATM z małymi zakłócającymi RNA miał podobny efekt który nie mógł być wzmocniony przez znokautowanie NEMO, PIDD i podjednostki p65 NF-kappaB co sugeruje, że inhibicja/deplecja ATM rzeczywiście indukowała apoptozę poprzez hamowanie systemu NF-kappaB. Farmakologiczne hamowanie ATM indukowało również nukleocytoplazmatyczną relokalizację p65 w złośliwych mieloblastów oczyszczonych od pacjentów z MDS lub AML wysokiego ryzyka, korelując z indukcją apoptozy. indukcją apoptozy. W sumie, wyniki te potwierdzają tezę że konstytutywnie aktywny ATM odpowiada za aktywację NF-kappaB w MDS i AML wysokiego ryzyka. --- Czynniki transkrypcyjne NF-κB są kluczowymi graczami w kontrolowaniu reakcji zapalnych i odpowiedzi immunologicznej, a także proliferacji i apoptozy komórek. Nieprawidłowa regulacja NF-κB i szlaków sygnałowych, które regulują jego aktywność, były były zaangażowane w różne patologie, w szczególności nowotwory, a także choroby zapalne i autoimmunologiczne. choroby zapalne i autoimmunologiczne. Aktywacja NF-κB jest ściśle regulowana przez kompleks kinazy IκB (IKK), który składa się z dwóch podjednostek katalitycznych IKKα i IKKβ oraz podjednostki regulatorowej IKKγ/NEMO. Chociaż IKKα i IKKβ mają podobieństwa strukturalne, wykazano, że IKKα ma różne funkcje biologiczne. funkcje biologiczne. Jednak mechanizmy molekularne modulujące aktywność IKKα nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Aby lepiej zrozumieć regulację aktywności IKKα oczyściliśmy białka związane z IKKα i zidentyfikowaliśmy ABIN-2. Tutaj wykazać, że IKKα i IKKβ oddziałują z ABIN-2 i osłabiają jego konstytutywną degradację przez proteinazy. konstytutywną degradację przez proteasom. Niemniej jednak ABIN-2 wzmacnia IKKα- ale nie aktywację NF-κB za pośrednictwem IKKβ poprzez specyficzne indukowanie autofosforylacji i kinazy IKKα autofosforylację i aktywność kinazy. Ponadto odkryliśmy, że ABIN-2 seryna 146 ma kluczowe znaczenie dla zależnej od ABIN-2 transkrypcji IKKα regulacji w górę specyficznych genów docelowych NF-κB. Wyniki te sugerują, że ABIN-2 działa jako pozytywny regulator transkrypcji zależnej od NF-κB poprzez aktywację IKKα. --- Helicobacter pylori, czynnik etiologiczny kilku ludzkich chorób żołądka, indukuje czynnik transkrypcyjny czynnik jądrowy-κB (NF-κB) w skolonizowanych komórkach nabłonkowych komórkach nabłonkowych, co prowadzi do uwalniania mediatorów prozapalnych. Aktywacja NF-κB obejmuje kompleks kinazy IκB (IKK) składający się z dwóch podjednostek katalitycznych, IKKα i IKKα. podjednostek katalitycznych, IKKα i IKKβ, oraz regulacyjnego białka rusztowania, IKKγ. Wykazano, że IKKβ niezbędne do aktywacji NF-κB w odpowiedzi na różne bodźce, w tym H. pylori. w tym H. pylori. Oprócz fosforylacji reszt serynowych, fosforylacja tyrozyny może mieć kluczowe znaczenie dla aktywacji IKKβ. Tutaj przedstawiamy dowody na to, że fosforylacja IKKβ jest indukowana w tratwach lipidowych (frakcjach DRM) H. pylori, ale nie w komórkach stymulowanych TNFα. Ponadto, H. pylori przejściowo indukuje wiązanie IKKβ z kinazą c-Src. Hamowanie c-Src przez specyficzne inhibitory, jak również knockdown c-Src przez małe interferujące RNA zmniejszyło fosforylację IκBα, jak również p65. Tak więc, fosforylowany tyrozyną IKKβ przyczynia się przynajmniej częściowo do aktywacji NF-κB w odpowiedzi na zakażenie H. pylori pylori. --- WPROWADZENIE: NF-kB jest kluczowym regulatorem stanu zapalnego i odporności w rozwoju raka. rozwoju nowotworów. Kinaza IkB (IKK) jest wielopodjednostkowym kompleksem zawierającym podjednostki katalityczne określane jako podjednostki katalityczne określane jako IKK-α, -β i -γ. Powszechnie wiadomo, że wiele bodźców prozapalnych wymaga podjednostki IKK-β do aktywacji NF-kB. OBSZARY OBJĘTE: NF-kB wpływa na progresję chorób związanych z zapaleniem chorób, takich jak niedokrwienie mięśnia sercowego, astma oskrzelowa, zapalenie stawów, rak i inne choroby. inne choroby. Dokonujemy przeglądu właściwości i wpływu tych inhibitorów na zapalne i inne choroby. OPINIA EKSPERTA: Opracowano różne zsyntetyzowane inhibitory IKK i będą one będą stosowane klinicznie w najbliższej przyszłości. --- Kompleks IkappaB-Kinaza (IKK) jest wielopodjednostkowym kompleksem białkowym kluczowym dla fosforylacji białek IkappaB, a tym samym kontroluje aktywność czynnika transkrypcyjnego NF-kappaB. aktywność czynnika transkrypcyjnego NF-kappaB. Oprócz dwóch kinaz IKKalfa i IKKbeta, kompleks IKK zawiera NEMO/IKKgamma, dodatkową podjednostkę o funkcjach regulacyjnych i adaptacyjnych. funkcje regulacyjne i adaptacyjne. NEMO nie tylko nadaje stabilność strukturalną kompleksowi kompleksowi IKK, ale także uczestniczy w procesie aktywacji kompleksu IKK poprzez łączenie podjednostek IKK z aktywatorami wyższego rzędu. W tym badaniu analizujemy fosforylację domeny NEMO wiążącej IKK, w której pośredniczy IKKbeta. In vitro, IKKbeta fosforyluje trzy reszty serynowe w domenie NEMO w pozycjach 43, 68 i 85. pozycjach 43, 68 i 85. Jednak analiza mutacji wykazała, że tylko fosforylacja fosforylacji seryny 68 w centrum domeny wiążącej IKK odgrywa odgrywa istotną rolę w tworzeniu i funkcjonowaniu kompleksu IKK. Tak więc, Fosforylacja Ser(68) osłabia amino-końcową dimeryzację NEMO, jak również jak również interakcję IKKbeta-NEMO. W przeciwieństwie do tego, interakcja NEMO-IKKalfa była tylko nieznacznie zaburzona przez fosforylację Ser(68). Jednak analiza funkcjonalna analiza ujawniła, że fosforylacja Ser(68) wpływa przede wszystkim na aktywność IKKalfa. Ponadto, w eksperymentach komplementacji mysich fibroblastów embrionalnych z niedoborem NEMO embrionalnych fibroblastów, mutant S68A-NEMO wzmocniony, podczas gdy mutant S68E zmniejszona, aktywność NF-kappaB indukowana przez TNF-alfa, podkreślając w ten sposób hamującą rolę fosforylacji Ser (68) w aktywności NF-kappaB indukowanej sygnałem. Wreszcie, dostarczamy dowodów na to, że fosfataza białkowa PP2A jest zaangażowana w regulację mechanizmu opartego na Ser(68). Podsumowując, dostarczamy dowodów na indukowaną sygnałem fosforylację zależną od zmiany kompleksu IKK podkreślając dynamiczny charakter tego wielopodjednostkowego kompleksu kinazy.
Jakie są podjednostki kinazy białkowej IkB (IKK)?
Prozapalna aktywacja NF-kappaB wymaga kompleksu kinazy IkappaB (inhibitora NF-kappaB) (IKK), który zawiera dwie podjednostki katalityczne o nazwach IKKalfa i IKKbeta oraz podjednostkę regulatorową o nazwie niezbędny modulator NF-kappaB (NEMO). Dodatkowe składniki mogą istnieć przejściowo lub trwale, ale ich charakterystyka jest nadal niepewna.