Znana jest maszyneria ESCRT (endosomalny kompleks sortujący wymagany do transportu) do sortowania ubikwitynowanych białek transmembranowych do pęcherzyków, które tworzą do światła ciał wielopęcherzykowych (MVB). Chociaż same ESCRT są ubikwitynowane, są one wykluczane z pęcherzyków wewnątrzśluzówkowych i powracają z powrotem do cytoplazmy w celu dalszego sortowania. Aby uzyskać wgląd w zasady, które odróżniają maszynerię ESCRT od ładunku, przeanalizowaliśmy przemieszczanie się sztucznych fuzji białek podobnych do ESCRT. Badania te wykazały, że obniżenie powinowactwa wiązania ESCRT przekształca białko z zachowującego się jak maszyneria ESCRT w ładunek szlaku MVB, podkreślając bliski związek między a ładunkami, które sortują. Co więcej, nasze odkrycia dają wgląd w ukierunkowanie rozpuszczalnych białek na szlak MVB i pokazują, że wiązanie do któregokolwiek z ESCRT może pośredniczyć w niezależnym od ubikwityny sortowaniu MVB. --- Podczas telofazy otoczka jądrowa (NE) reformuje się wokół jąder potomnych, aby zapewnić właściwą segregację zawartości jądrowej i cytoplazmatycznej. Reformacja NE wymaga pokrycia chromatyny błoną pochodzącą z retikulum endoplazmatycznego retikulum endoplazmatycznego, a następnie etap fuzji pierścieniowej, aby zapewnić, że utworzona otoczka otoczka jest szczelnie zamknięta. Sposób, w jaki dochodzi do fuzji pierścieniowej jest nieznany, ale uważa się, że uważa się, że obejmuje kompleks p97 AAA-ATPazy i ma topologiczną równoważność z fuzją błon, która zachodzi podczas fazy rozszczepienia cytokinezy. Tutaj pokazujemy, że kompleks sortowania endosomalnego wymagany dla transportu-III (ESCRT-III) lokalizuje się w miejscach fuzji pierścieniowej w NE w ludzkich komórkach i jest niezbędny do prawidłowego postmitotycznego kompartmentalizacji nukleo-cytoplazmatycznej. Naładowany składnik ESCRT-III białko ciała wielopęcherzykowego 2A (CHMP2A) jest kierowane do tworzącego się NE poprzez wiązanie z CHMP4B i zapewnia aktywność niezbędną do reformacji NE. Lokalizacja wymaga również fuzji i degradacji ubikwityny 1 (UFD1) członka kompleksu p97. degradacji 1 (UFD1). Nasze wyniki opisują nową rolę maszynerii ESCRT w podziale komórkowym i wykazują zachowanie maszyn zaangażowanych w topologicznie równoważne zdarzenia przebudowy błony mitotycznej. --- Kompleksy sortowania endosomalnego wymagane do transportu (ESCRT) są zaangażowane w tworzenie ciał wielopęcherzykowych i sortowanie docelowych białek do wakuoli drożdży wakuoli drożdży. Delecja siedmiu genów kodujących składniki maszynerii ESCRT czyni komórki Saccharomyces cerevisiae wrażliwymi na wysokie pozakomórkowe stężenia CaCl2 jak również na niskie pH w mediach. W tej pracy skupiliśmy się na wewnątrzkomórkowej homeostazie pH (pHin) tych mutantów. Żaden z badanych mutantów ESCRT nie wykazywał zmienionego poziomu pHin w porównaniu do typu dzikiego w standardowych warunkach wzrostu. warunkach wzrostu. Niemniej jednak, 60-minutowe leczenie CaCl2 spowodowało bardziej znaczący spadek poziomu pHin u tych mutantów niż u typu dzikiego, sugerując, że homeostaza pHin jest zaburzona u mutantów ESCRT po dodaniu wapnia. Podobnie, leczenie CaCl2 spowodowało większy spadek pHin w komórkach pozbawionych wakuolarnego antyportera Ca(2+)/H(+) Vcx1, co wskazuje na rolę tego białka w utrzymaniu prawidłowego pHin. białka w utrzymaniu prawidłowej homeostazy pHin, gdy komórki muszą radzić sobie z z wysokim stężeniem CaCl2 w mediach. Co ważne, delecje genów ESCRT w szczepie vcx1Δ nie spowodowały wzrostu wywołanego przez CaCl2 spadku poziomu pHin w komórkach, co pokazuje pHin w komórkach, co wskazuje na genetyczną interakcję między VCX1 a badanymi genami ESCRT. badanymi genami ESCRT. --- Obrót białkami można osiągnąć poprzez lizosom/wakuolę i autofagiczną ścieżkę degradacji. szlaki degradacji. Zgromadzono dowody ujawniające, że skuteczna autofagiczna degradacja wymaga funkcjonalnego kompleksu sortowania endosomalnego wymaganego do transportu (ESCRT). Jednak wzajemne oddziaływanie między maszynerią ESCRT a regulatorem autofagii pozostaje niejasna. Tutaj pokazujemy, że białko domeny FYVE wymagane do sortowania endosomalnego 1 (FREE1), niedawno zidentyfikowanego specyficzny dla roślin składnik ESCRT niezbędny do biogenezy ciała wielopęcherzykowego (MVB) i wzrostu roślin biogenezy i wzrostu roślin, odgrywa rolę zarówno w wakuolarnym transporcie białek, jak i degradacji autofagicznej. autofagicznej degradacji. FREE1 reguluje również biogenezę wakuoli zarówno w nasionach i komórkach wegetatywnych Arabidopsis. Dodatkowo, FREE1 oddziałuje bezpośrednio z unikalnym roślinnym regulatorem autofagii, białkiem zawierającym domenę SH32 i wiąże się z kompleksem PI3K, regulując degradację autofagiczną u roślin. Zatem, FREE1 odgrywa wiele funkcjonalnych ról w przemieszczaniu białek wakuolarnych i biogenezie organelli, a także w degradacji autofagicznej poprzez wcześniej niezidentyfikowany mechanizm regulacyjny wzajemnego oddziaływania między maszynerią ESCRT a procesem procesem autofagii. --- Wiriony HIV-1 gromadzą się w błonie plazmatycznej komórek ssaków i rekrutują kompleks endosomalny kompleks sortujący wymagany do transportu (ESCRT), aby umożliwić uwalnianie cząstek. Niewiele jednak wiadomo na temat czasowej i przestrzennej organizacji rekrutacji białek ESCRT. Wykorzystując wielokolorową mikroskopię fluorescencyjną mikroskopii fluorescencyjnej zaobserwowaliśmy, że białko ESCRT-I Tsg101 jest rekrutowane razem z Gag do miejsc montażu HIV-1, podczas gdy później działające białka ESCRT (Chmp4b i Vps4A) są rekrutowane sekwencyjnie, po zakończeniu montażu Gag. Chmp4b, białko, które jest wymagane do do pośredniczenia w rozszczepianiu cząstek, jest rekrutowane do miejsc montażu HIV-1 ∼10 s przed ATPazą Vps4A. Korzystając z dwukolorowego obrazowania w super rozdzielczości, zaobserwowaliśmy, że mechanizm maszyneria ESCRT (białka Tsg101, Alix i Chmp4b/c) jest umieszczona na peryferiach powstających wirionów, z zespołami Tsg101 umieszczonymi bliżej do zespołów Gag niż Alix, Chmp4b lub Chmp4c. Wyniki te są zgodne z poglądem, że maszyneria ESCRT jest rekrutowana przejściowo do szyjki składającej się cząsteczki, a zatem jest obecna w odpowiednim czasie i miejscu, aby pośredniczyć w rozszczepieniu między powstającym wirusem a błoną plazmatyczną. --- Demontaż endosomalnego kompleksu sortującego wymaganego do transportu (ESCRT) z błon biologicznych jest krytycznym ostatnim krokiem w procesach komórkowych wymagających funkcji ESCRT. procesów komórkowych, które wymagają funkcji ESCRT. Reakcja ta jest katalizowana przez VPS4, AAA-ATPazę, której aktywność jest ściśle regulowana przez szereg białek, w tym LIP5 i białka ESCRT-III. Tutaj przedstawiamy strukturalne i funkcjonalne analizy interakcji molekularnych między ludzkimi białkami VPS4, LIP5 i białkami ESCRT-III. N-końcowa domena LIP5 (LIP5NTD) jest wymagana dla stymulacji VPS4 za pośrednictwem LIP5, a białko ESCRT-III CHMP5 silnie hamuje stymulację. Obie te obserwacje różnią się od tego, co zostało wcześniej opisane dla homologicznych białek drożdży. Struktura krystaliczna LIP5NTD w kompleksie z motywami oddziałującymi z mikrotubulami MIT (microtubule-interacting and transport) CHMP5 i drugim białkiem ESCRT-III, CHMP1B, zostało określone w rozdzielczości 1 Å. Ujawnia to indukowaną wiązaniem ESCRT-III umiarkowaną zmianę konformacyjną w LIP5NTD, która wynika z insercji konserwowanej tyrozyny konserwowanej reszty tyrozynowej CHMP5 (Tyr(182)) w rdzeniu struktury LIP5NTD. Mutacja Tyr(182) częściowo łagodzi inhibicję wykazywaną przez CHMP5. Łącznie wyniki te sugerują nowy mechanizm regulacji VPS4 u metazoans, w którym CHMP5 działa jako negatywny przełącznik allosteryczny do kontroli stymulację VPS4 za pośrednictwem LIP5.
Jakie są funkcje maszyn ESCRT?
Kompleksy sortowania endosomalnego wymagane do transportu (ESCRT) są potrzebne do trzech różnych funkcji komórkowych u wyższych eukariontów: (i) tworzenia ciał wielopęcherzykowych w celu degradacji białek transmembranowych w lizosomach, (ii) wydzielania ciałka środkowego podczas cytokinezy oraz (iii) pączkowania retrowirusów.