Przeprogramowanie komórkowe polega na przekształceniu zróżnicowanych komórek w komórki pluripotencjalne. komórki pluripotencjalne; tak zwane indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. iPSC są iPSC są podatne na manipulacje in vitro i, teoretycznie, bezpośrednią produkcję dowolnego zróżnicowanego typu komórek. Co więcej, iPSC można uzyskać od osób chorych a następnie wykorzystywane do modelowania chorób, odkrywania leków i terapii regeneracyjnych. Produkcja iPSC została po raz pierwszy osiągnięta poprzez transdukcję za pomocą wektorów retrowirusowych. za pomocą wektorów retrowirusowych, czterech specyficznych czynników transkrypcyjnych: Oct4, Klf4, Sox2 i c-Myc (OKSM), do pierwotnych komórek w hodowli Takahashi i Yamanaka, (Cell 126(4):663-676, 2006). Od tego czasu zaproponowano wiele alternatywnych protokołów alternatywnych protokołów: wielokrotne transfekcje plazmidów ekspresyjnych zawierających cztery Okita et al. (Science 322(5903):949-953, 2008), lentiwirusowe dostarczanie czterech czynników Sommer i wsp. (Stem Cells 27(3):543-549, 2009), dostarczanie wirusa Sendai Fusaki et al. (Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences 85(8):348-362, 2009), usuwanie wektorów przeprogramowujących przez "świnię" (Proceedings of Japan Academy. wektorów reprogramujących przez transpozycję "piggyBac" Woltjen et al. (Nature 458(7239):766-770, 2009); Kaji et al. (Nature 458(7239):771-775, 2009), Cre-rekombinaza wirusów ekspresyjnych Soldner i wsp. (Cell 136(5):964-977, 2009), wektory episomalne Yu et al. (Science 324(5928):797-801, 2009), białka przeprogramowujące komórki przeprogramowujące białka Zhou i wsp. (Stem Cells 4(5):381-384, 2009), sztuczne chromosomy ssaków sztuczne chromosomy ssaków Hiratsuka i wsp. (PLoS One 6(10):e25961, 2011) syntetycznie zmodyfikowane mRNA Warren et al. (Scientific Reports 2:657, 2012), miRNA Anokye-Danso et al. (Cell Stem Cell 8(4):376-388, 2009); jednakże, chociaż niektóre z tych metod są komercyjne chociaż niektóre z tych metod są dostępne komercyjnie, generalnie nadal muszą one osiągnąć powtarzalność i wydajność przeprogramowywania wymaganą do rutynowych zastosowań Mochiduki i Okita (Biotechnol Journal 7(6):789-797, 2012). Poniżej wyjaśniamy, w czterech szczegółowych protokołach, izolację mysich i ludzkich komórek somatycznych i ich przeprogramowanie w iPSC. Wszechstronne instrukcje, nie wcześniej opublikowane w jednym dokumencie, dotyczące izolacji i wyprowadzania kolonii mysich i ludzkich iPSC. iPSC. Chociaż mysie i ludzkie iPSC mają podobieństwa w procesie przeprogramowania komórkowego i hodowli, oba typy komórek muszą być traktowane inaczej. --- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są tworzone przez przeprogramowanie komórek somatycznych poprzez nadekspresję pewnych czynników transkrypcyjnych, takich jak komórek somatycznych poprzez nadekspresję pewnych czynników transkrypcyjnych, takich jak pierwotnie opisane czynniki Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc (OSKM). Tutaj omawiamy ostatnie postępy w przeprogramowywaniu iPSC i wprowadzamy matematyczne matematyczne, aby pomóc w mapowaniu krajobrazu między stanami komórek podczas przeprogramowywania. Nasze modelowanie wskazuje, że ekspresja OSKM zmniejsza i/lub zmienia potencjalne bariery między stanami komórkowymi i że przebudowa epigenetyczna ułatwia te przejścia. Z praktycznego punktu widzenia, przedstawione tutaj podejścia do modelowania modelowania pozwalają nam przewidzieć czas niezbędny do utworzenia danej liczby kolonii iPSC lub liczby kolonii iPSC. iPSC lub liczby przeprogramowanych komórek wygenerowanych w danym czasie. Dodatkowe badania pomogą jeszcze bardziej udoskonalić strategie modelowania, dzięki czemu będą one miały zastosowanie do badania rozwoju i stabilności komórek nowotworowych, a nawet innych przeprogramowanych komórek. komórek nowotworowych, a nawet innych procesów przeprogramowania, takich jak konwersja linii. Ostatecznie, ilościowe zrozumienie zmian stanu komórek może ułatwić opracowanie strategii medycyny regeneracyjnej i usprawnić przełożenie technologii przeprogramowywania na klinikę. --- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stały się intrygującym podejściem do modelowania chorób neurologicznych, ponieważ typy komórek specyficzne dla linii neuronalnej które zachowują złożoną genetykę dawcy, mogą być tworzone in vitro. Moc statystyczna moc statystyczna tych modeli opartych na iPSC zależy jednak od dokładnych diagnozy dawców komórek somatycznych; niestety, wiele chorób neurodegeneracyjnych jest często błędnie diagnozowanych. chorób neurodegeneracyjnych jest często błędnie diagnozowanych u żywych ludzi. Pośmiertne pośmiertne badanie histopatologiczne mózgu dawcy, w połączeniu z przedśmiertnymi przedśmiertnymi kryteriami klinicznymi, jest często najbardziej niezawodnym podejściem do prawidłowej klasyfikacji osoby jako przypadek specyficzny dla choroby lub niezmieniony przypadek kontrolny. W niniejszym badaniu opisujemy iPSC wygenerowane z biopsji skóry pobranej pośmiertnie podczas podczas szybkiej autopsji 75-letniego mężczyzny, dawcy całego ciała, zdefiniowanego jako niezmieniony kontrola neurologiczna zarówno według kryteriów klinicznych, jak i histopatologicznych. Te iPSC zostały utworzone w systemie bez podajnika przez transdukcję lentiwirusową czynników Yamanaka, Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-Myc. Wybrane klony iPSC wyrażały zarówno antygeny jądrowe, jak i powierzchniowe rozpoznawane jako markery pluripotencji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) i były w stanie różnicować się in vitro w neurony i glej. Analiza statystyczna wykazała również, że proliferacja fibroblastów na proliferację fibroblastów istotny wpływ miało miejsce biopsji, ale nie wiek dawcy (w kohorcie osób starszych). Wyniki te dostarczają dowodów na to, że fibroblasty fibroblasty pochodzące od dawcy mogą być z powodzeniem przeprogramowane w iPSC i mogą stanowić korzystne podejście do generowania modeli chorób neurologicznych opartych na iPSC. modele chorób neurologicznych. --- Fibroblasty można przeprogramować w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) poprzez Yamanaka (OSKM), ale mechanizmy leżące u podstaw tego przeprogramowania pozostają słabo poznane. przeprogramowanie pozostają słabo poznane. Tutaj donosimy, że Sox2 bezpośrednio reguluje ekspresję endogennego mikroRNA-29b (miR-29b) podczas generowania iPSC i że ekspresja miR-29b jest wymagana do przeprogramowania za pośrednictwem OSKM i OSK. przeprogramowania. Badania mechanistyczne pokazują, że Dnmt3a i Dnmt3b są celami in vivo celami miR-29b in vivo i że ekspresja Dnmt3a i Dnmt3b jest odwrotnie skorelowana z ekspresją miR-29b podczas przeprogramowania. Co więcej, wpływ miR-29b na może być blokowany przez nadekspresję Dnmt3a lub Dnmt3b. Dalsze eksperymenty wskazują, że sygnalizacja miR-29b-DNMT jest znacząco zaangażowana w regulację zdarzeń przeprogramowania związanych z metylacją DNA, takich jak przejście mezenchymalne do nabłonkowego (MET) i transkrypcja regionu Dlk1-Dio3. Tak więc, nasze badania nie tylko ujawniają, że miR-29b jest nowym mediatorem czynnika przeprogramowującego Sox2, ale także dostarczają dowodów na wieloetapowy mechanizm, w którym w którym Sox2 napędza oś sygnałową miR-29b-DNMT, która reguluje zdarzenia związane z metylacją DNA zdarzenia związane z metylacją podczas przeprogramowywania. --- CytoTune™-iPS Reprogramming System wykorzystuje wektory oparte na replikacji w kompetentnym wirusie wirusie Sendai (SeV) do bezpiecznego i skutecznego dostarczania i ekspresji kluczowych czynników czynników genetycznych niezbędnych do przeprogramowania komórek somatycznych w iPSC. W przeciwieństwie do przeciwieństwie do wielu dostępnych protokołów, które opierają się na wektorach wirusowych integrujących się z genomem komórki gospodarza. z genomem komórki gospodarza, CytoTune™ Reprogramming System wykorzystuje wektory nieintegrujące się z genomem komórki gospodarza. wektory, które nie integrują się i pozostają w cytoplazmie (tj. nie pozostawiają śladu). nie pozostawiają śladu). Ponadto, komórka gospodarza może zostać oczyszczona z wektorów i genów czynników geny czynników przeprogramowujących, wykorzystując cytoplazmatyczną naturę SeV i mutacje funkcjonalne mutacje wrażliwości na temperaturę wprowadzone do kluczowych białek wirusowych. białek wirusowych. Zestaw do reprogramowania CytoTune™-iPS zawiera cztery wektory reprogramujące oparte na SeV SeV, każdy zdolny do ekspresji jednego z czterech czynników Yamanaka Yamanaka (tj. Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc) i są zoptymalizowane do generowania iPSC z ludzkich komórek somatycznych. iPSC z ludzkich komórek somatycznych. Wektory przeprogramowujące w tym zestawie zostały zaprojektowane w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego i środowiskowego. --- Dostarczanie czynników transkrypcyjnych Oct4, Klf4, Sox2 i c-Myc za pośrednictwem wektorów wirusowych integrujących wektory wirusowe jest szeroko stosowane do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z tkanek somatycznych zarówno prawidłowych, jak i specyficznych dla choroby, zapewniając nieocenione źródło do badań medycznych i opracowywania leków. Pozostała przeprogramowanie ekspresji transgenu ze zintegrowanych wirusów zmienia jednak właściwości biologiczne iPSCs i jest związana ze zmniejszoną kompetencją rozwojową zarówno kompetencjami rozwojowymi zarówno in vivo, jak i in vitro. Przeprowadziliśmy profilowanie transkrypcyjne profilowanie mysich linii iPSC przed i po wycięciu polikistronicznego lentiwirusowego wektora przeprogramowującego, aby systematycznie definiować ogólny wpływ utrzymującej się ekspresji transgenu na cechy molekularne iPSC. My wykazać, że szczątkowa ekspresja czynników Yamanaka uniemożliwia iPSCs z nabycie programu transkrypcyjnego wykazywanego przez embrionalne komórki macierzyste (ESC) i że profile ekspresji iPSC generowanych z i bez c-Myc są nierozróżnialne. nierozróżnialne. Po wycięciu wektora stwierdziliśmy, że 36% klonów iPSC wykazuje normalną metylację Gtl. metylację regionu Gtl2, odciśniętego locus, który oznacza linie iPSC równoważne ESC. iPSC. Ponadto wykazaliśmy, że czynnik przeprogramowujący Klf4 wiąże się z regionem promotora Gtl2. region promotora Gtl2. Niezależnie od statusu metylacji Gtl2, znajdujemy podobne potencjał różnicowania endodermy i hepatocytów, porównując syngeniczne Gtl2(ON) vs klony iPSC Gtl2(OFF). Nasze odkrycia zapewniają nowy wgląd w proces proces przeprogramowania i podkreślają znaczenie generowania iPSC wolnych od jakiejkolwiek resztkowej ekspresji transgenu. --- Niedawno opracowane przez Takahashi i Yamanaka przeprogramowanie komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przez Takahashi i Yamanaka stanowi cenne narzędzie do przyszłych zastosowań terapeutycznych. Do tej pory mechanizmy leżące u podstaw tego procesu są nadal w dużej mierze nieznane. W szczególności mechanizmy, w jaki sposób czynniki Yamanaka Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc) bezpośrednio napędzają przeprogramowanie i które dodatkowe składniki są zaangażowane. dodatkowe komponenty są zaangażowane, nie zostały jeszcze poznane. W tym badaniu, mieliśmy na celu przeanalizowanie roli ADP-rybozylotransferazy podobnej do toksyny błoniczej jeden (Artd1; wcześniej nazywana polimerazą poli(ADP-rybozy) 1 [Parp1]) podczas przeprogramowania. Odkryliśmy, że poli(ADP-rybozylacja) (PARylacja) czynnika przeprogramowującego czynnika reprogramowania Sox2 przez Artd1 odgrywa ważną rolę w pierwszych dniach po transdukcji czynnikami reprogramującymi. Proces, który zachodzi przed Artd1 w połączeniu z 10-11 translokacją-2 (Tet2) pośredniczy w modyfikacjach histonów modyfikacje niezbędne do ustanowienia aktywowanego stanu chromatyny w loci loci pluripotencji (np. Nanog i Essrb) [Nature 2012; 488: 652-655]. Fibroblasty typu dzikiego (WT) traktowane inhibitorem Artd1, jak również fibroblasty z niedoborem Artd1 (Artd1-/-) wykazują znacznie zmniejszoną zdolność do przeprogramowywania. Nasze dane wskazują, że PARylacja Sox2, w której pośredniczy Artd1, sprzyja jej wiązaniu do enhancera czynnika wzrostu fibroblastów 4 (Fgf4), aktywując w ten sposób ekspresję Fgf4 ekspresję. Znaczenie Fgf4 w ciągu pierwszych 4 dni po rozpoczęciu przeprogramowania przeprogramowania zostało również podkreślone przez obserwację, że egzogenny dodatek Fgf4 było wystarczające do przywrócenia zdolności przeprogramowania fibroblastów Artd1-/- do poziomów do poziomu WT. Podsumowując, nasze dane wyraźnie pokazują, że interakcja między Artd1 i Sox2 jest kluczowa dla pierwszych etapów procesu przeprogramowania i że wczesna ekspresja Fgf4 (od dnia 2 do dnia 4) jest niezbędnym składnikiem do udanej generacji iPSC. --- Poprzez ektopową ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych, Oct4, Klf4, Sox2 i cMyc, ludzkie komórki somatyczne mogą zostać przekształcone w stan pluripotencjalny, generując tak zwane indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC)(1-4). Specyficzne dla pacjenta komórki iPSC nie budzą obaw etycznych, które otaczają embrionalne komórki macierzyste (ESC). embrionalne komórki macierzyste (ESC) i ominęłyby ewentualne odrzucenie immunologiczne. W związku z tym, iPSC przyciągnęły znaczną uwagę do badań modelowania chorób, badań przesiewowych związków związków farmakologicznych i terapii regeneracyjnych(5). Wykazaliśmy, że generowanie wolnych od transgenów ludzkich iPSCs od pacjentów z różnymi chorobami płuc płuc przy użyciu pojedynczej policistronicznej lentiwirusowej kasety komórek macierzystych (STEMCCA) kodującej czynniki Yamanaka(6). Te linie iPSC zostały wygenerowane z fibroblastów skóry, najczęstszego typu komórek wykorzystywanych do przeprogramowania. Normalnie, uzyskanie fibroblastów wymaga biopsji punkcyjnej skóry, a następnie ekspansji komórek komórek w hodowli przez kilka pasaży. Co ważne, wiele grup zgłosiło przeprogramowanie ludzkich komórek krwi obwodowej w iPSC(7-9). W W jednym z badań zastosowano indukowalną przez Tet wersję wektora STEMCCA(9), która wymagało jednoczesnego zakażenia komórek krwi konstytutywnie aktywnym lentiwirusem aktywnym lentiwirusem kodującym odwrotny transaktywator tetracykliny. W przeciwieństwie do do fibroblastów, komórki krwi obwodowej można pobierać za pomocą minimalnie inwazyjnych procedur, znacznie zmniejszając dyskomfort procedury, znacznie zmniejszając dyskomfort i cierpienie pacjenta. A prosty i skuteczny protokół przeprogramowywania komórek krwi przy użyciu konstytutywnego wektora wektora może przyspieszyć zastosowanie technologii iPSC, udostępniając ją szerszemu gronu badaczy. czyniąc ją dostępną dla szerszej społeczności badawczej. Ponadto, przeprogramowanie komórek krwi obwodowej pozwala na generowanie iPSC od osób, u których należy unikać biopsji skóry. u których należy unikać biopsji skóry (np. nieprawidłowe bliznowacenie) lub z powodu istniejące wcześniej stany chorobowe uniemożliwiające dostęp do biopsji punkcyjnej. Tutaj protokół generowania ludzkich iPSC z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu pojedynczego wektora lentiwirusowego floxed-excisable konstytutywnie wyrażającego 4 czynniki. Świeżo pobrane lub rozmrożone PBMC są ekspandowane przez 9 dni zgodnie z opisem(10,11) w pożywce zawierającej kwas askorbinowy, SCF, IGF-1, IL-3 i EPO przed transdukcją lentiwirusem STEMCCA. Komórki są następnie umieszczane na MEF, a kolonie podobne do ESC można wizualizować dwa tygodnie po infekcji. Na koniec wybrane klony są ekspandowane i testowane pod kątem ekspresji markerów pluripotencji SSEA-4, Tra-1-60 i Tra-1-81. Ten protokół jest prosty, solidny i wysoce spójny, zapewniając niezawodną niezawodną metodologię generowania ludzkich iPSC z łatwo dostępnych 4 ml krwi. krwi.
Które czynniki transkrypcyjne są znane jako cztery (4) "czynniki Yamanaka", które zostały wykorzystane do stworzenia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)?
Fibroblasty można przeprogramować w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) poprzez zastosowanie czynników Yamanaka (OSKM). W szczególności mechanizmy, w jaki sposób czynniki Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc) bezpośrednio napędzają przeprogramowanie i które dodatkowe składniki są zaangażowane, nie zostały jeszcze poznane.