Prawidłowe wzorcowanie metylacji DNA wymaga uzupełniających się procesów metylacji de metylacji de novo (początkowa metylacja niezmetylowanych sekwencji DNA) oraz utrzymania metylacji (wierna replikacja wcześniej istniejącej metylacji). Arabidopsis posiada dwa rodzaje metylotransferaz z wykazaną aktywnością konserwacyjną aktywność: MET1, która utrzymuje metylację CpG i jest homologiczna do ssaków DNMT1 i CHROMOMETHYLASE 3 (CMT3), która utrzymuje metylację CpNpG (N = A, T, C lub G) i jest unikalna. metylację i jest unikalna dla królestwa roślin. Tutaj opisujemy mutacje utraty funkcji w genach Arabidopsis DOMAINS REARRANGED METHYLASE (DRM) i dostarczamy dowodów na to, że kodują one metylotransferazy de novo. drm1 drm2 zachowały wcześniej istniejącą metylację CpG w endogennym locus FWA ale blokowały metylację de novo CpG, która jest normalnie związana z wyciszaniem transgenów FWA wyciszaniem transgenów. Ponadto, podwójne mutanty drm1 drm2 blokowały metylację de novo CpNpG i asymetryczną metylację oraz wyciszanie genu endogennego SUPERMAN (SUP) które jest normalnie wyzwalane przez odwrócone powtórzenie SUP. Jednak podwójne mutanty drm1 drm2 nie wykazywały reaktywacji wcześniej ustalonych epigenetycznie wyciszonych alleli SUPERMAN epigenetycznie wyciszonych alleli. Zatem mutanty drm zapobiegają ustanowieniu, ale nie utrzymanie wyciszenia genów w FWA i SUP, sugerując, że DRMs kodują główne enzymy metylacji de novo wpływające na te geny. --- U ssaków kadm jest powszechnie uważany za niegenotoksyczny czynnik rakotwórczy działający poprzez mechanizm epigenetyczny zależny od metylacji. Tutaj zbadano wpływ leczenia Cd na wzór metylacji DNA, a także jego wpływ na rekonfigurację chromatyny u Posidonia rekonfigurację chromatyny u Posidonia oceanica. Poziom i wzór metylacji DNA DNA analizowano w aktywnie rosnących organach, w krótkim (6 h) i długim (2 d lub 4 d) okresie. (2 d lub 4 d) oraz niskimi (10 μM) i wysokimi (50 μM) dawkami Cd, za pomocą metody Technika polimorfizmu amplifikacji wrażliwej na metylację i podejście immunocytologiczne. podejście immunocytologiczne. Ekspresja jednego z członków grupy CHROMOMETHYLASE (CMT), metylotransferazy DNA, została również oceniona przez qRT-PCR. Ultrastrukturę chromatyny jądrowej zbadano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. mikroskopii elektronowej. Leczenie Cd indukowało hipermetylację DNA, jak również CMT, co wskazuje, że rzeczywiście doszło do metylacji de novo. Co więcej, wysoka dawka Cd prowadziła do postępującej heterochromatynizacji jąder interfazowych i jąder interfazowych, a po długotrwałym leczeniu zaobserwowano również postacie apoptotyczne. leczeniu. Dane te pokazują, że Cd zaburza stan metylacji DNA poprzez zaangażowanie specyficznej metylotransferazy. Takie zmiany są powiązane z rekonfiguracją chromatyny jądrowej, która może ustanowić nową równowagę chromatyny ekspresji/represji chromatyny. Ogólnie rzecz biorąc, dane wskazują na epigenetyczne podstawy mechanizmu mechanizmu leżącego u podstaw toksyczności Cd u roślin. --- Metylacja de novo DNA w Arabidopsis thaliana jest katalizowana przez metylotransferazę DRM2, homologa metylotransferazy de novo ssaków DNMT3. DRM2 jest ukierunkowana na DNA przez małe interferujące RNA (siRNA) w procesie znanym jako znanym jako metylacja DNA ukierunkowana przez RNA (RdDM). Podczas gdy kilka składników szlaku RdDM, funkcjonalne zrozumienie leżącego u jego podstaw mechanizmu jest dalekie od ukończenia. jest dalekie od ukończenia. Zastosowaliśmy podejścia genetyczne zarówno do przodu, jak i do tyłu, aby zidentyfikować czynniki zaangażowane w metylację de novo. Wykorzystaliśmy transgen FWA, który jest metylowany i wyciszany po transformacji do roślin typu dzikiego, ale niemetylowany i ulega ekspresji po transformacji do mutantów metylujących de novo. Ekspresja FWA charakteryzuje się fenotypem późnego kwitnienia, który można łatwo łatwo ocenić u roślin zmutowanych w porównaniu z roślinami typu dzikiego. Dzięki odwrotnej genetyce odkryliśmy AGO6 i NRPE5a dla wydajnej metylacji de novo. metylacji. Podejście genetyczne do przodu ujawniło allele kilku składników szlaku RdDM, w tym allele clsy1, ktf1 i nrpd/e2, które nie były wcześniej nie zostały wcześniej wykazane jako wymagane do początkowego ustanowienia metylacji DNA metylacji DNA. Mutacje zostały zmapowane, a geny sklonowane zarówno metodą tradycyjną, jak i sekwencjonowania podejścia do sekwencjonowania całego genomu. Odkryte metodologie i zmutowane allele będą miały kluczowe znaczenie w dalszych badaniach nad metylacją DNA de novo. --- Metylacja DNA i modyfikacja histonów wywierają epigenetyczną kontrolę nad ekspresją genów. ekspresją genów. Metylacja CHG przez CHROMOMETYLAZĘ3 (CMT3) zależy od dimetylacji histonu H3K9 dimetylacji histonu H3K9 (H3K9me2), ale mechanizm leżący u podstaw tego związku jest słabo poznany. Tutaj przedstawiamy wiele dowodów na to, że CMT3 oddziałuje z nukleosomami zawierającymi H3K9me2. Lokalizacje genomu CMT3 prawie doskonale skorelowane z H3K9me2, a CMT3 stabilnie związane z nukleosomami zawierającymi nukleosomami zawierającymi H3K9me2. Struktury krystaliczne homologa CMT3 kukurydzy ZMET2, w kompleksie z peptydami H3K9me2 wykazały, że ZMET2 wiąże H3K9me2 zarówno poprzez bromo sąsiadujące domeny homologiczne (BAH) i chromo. Struktury ujawniają aromatyczną klatkę w domenach BAH i chromo jako interfejsy interakcji, które wychwytują H3K9me2. Mutacje, które znoszą obie interakcje, zakłócają wiązanie CMT3 do nukleosomów nukleosomów i wykazują całkowitą utratę aktywności CMT3 in vivo. Nasze badanie ustanawia podwójne rozpoznawanie znaczników H3K9me2 przez domeny BAH i chromo oraz ujawnia odrębny mechanizm wzajemnego oddziaływania metylacji DNA i modyfikacji histonów modyfikacją histonów. --- Uważa się, że chromodomeny pośredniczą w interakcjach białko-białko między składnikami chromatyny. Wykryliśmy chromodomenę osadzoną w regionie katalitycznym regionu katalitycznego przewidywanej metylotransferazy DNA Arabidopsis, która jest różni się od innych enzymów eukariotycznych. Licząca 791 reszt "chromometylaza" (CMT1) jest kodowana przez transkrypt kwiatowy, który jest splicingowany z 20 eksonów i jest obecny tylko w przybliżeniu 1/10(-7) całkowitego mRNA. Sekwencjonowanie genomu ujawnia starożytny podział haplotypów w CMT1 między Col-0 + Metz i innymi badanymi ekotypami. badanymi ekotypami. W haplotypie Col-0 + Metz alternatywne przetwarzanie mRNA w intronie 13 powoduje skrócenie regionu kodującego. W Ler, RLD i No-0 podobne skrócenie jest spowodowane przez insercję nienaruszonego retrotranspozonu, Evelknievel, który jest obecny jako pojedyncza kopia w Ler i RLD i jest obecnie metylowany i nieaktywny. Evelknievel znajduje się w tym miejscu na pojedynczej gałęzi, która łączy ekotypy Ler, RLD, i No-0, ale jest nieobecny w genomach wszystkich innych badanych ekotypów. Kodon stop w eksonie 6 ekotypu Metz potwierdza, że CMT1 jest nieistotny. Niemniej jednak, porównanie z CMT1 Cardaminopsis arenosa, krewnego wskazuje na zachowanie funkcji metylotransferazy DNA. Omawiamy, w jaki sposób różnorodność alleliczna CMT1 może odzwierciedlać rozluźnione ograniczenia selektywne w samozapłodnieniu. ograniczenia w gatunkach samopłodnych, takich jak Arabidopsis thaliana. --- Metylacja cytozyny w eukariotycznym DNA może być wykorzystywana do transkrypcyjnego wyciszania sekwencji powtarzalnych, w tym transpozonów i retrowirusów. To wyciszenie jest stabilne między pokoleniami komórek, ponieważ metylacja cytozyny jest utrzymywana epigenetycznie poprzez replikację DNA. Arabidopsis thaliana Dnmt3, ortolog metylotransferazy cytozyny ortolog metylotransferazy DOMAINS rearanżowanej metylotransferazy2 (DRM2) jest wymagana do ustanowienia małych interferujących RNA (siRNA) ukierunkowanych na metylację DNA metylacji. U ssaków białka PIWI i piRNA działają w konwergentnie wyewoluowany sposób ukierunkowany przez RNA system metylacji DNA, który jest wymagany do tłumienia ekspresji transpozonu w linii zarodkowej. Metylacja de novo może być również niezależna od interferencji RNA interferencji RNA i małych RNA, jak u Neurospora crassa. Tutaj identyfikujemy klad katalitycznie zmutowanych paralogów DRM2 w genomach roślin kwitnących, które w A.thaliana określamy mianem domeny rearanżowanej metylotransferazy3 (DRM3). Pomimo tego, że katalitycznie zmutowana, DRM3 jest wymagana do normalnego utrzymania metylacji DNA non-CG metylacji, ustanowienia metylacji DNA kierowanej przez RNA wyzwalanej przez sekwencje powtórzone sekwencje i akumulacji małych RNA związanych z powtórzeniami. Chociaż ssaków katalitycznie nieaktywne paralogi Dnmt3L działają w analogiczny sposób, analiza filogenetyczna wskazuje, że rodziny białek DRM i Dnmt3 rozeszły się niezależnie u roślin i zwierząt. niezależnie u roślin i zwierząt. Pokazujemy również przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce że zarówno N-końcowe domeny UBA DRM2, jak i C-końcowa domena metylotransferazy są wymagane do normalnej metylacji DNA kierowanej przez RNA, wspierając istotną funkcję ukierunkowującą dla domen UBA. Wyniki te sugerują, że systemy metylacji DNA kierowane przez RNA u roślin i ssaków składają się z kombinacji cech przodków i cech zbieżnych. --- Rośliny utrzymują metylację cytozyny w resztach CG i non-CG, aby kontrolować ekspresję genów i stabilność genomu. i stabilność genomu. W badaniu przesiewowym mutantów Arabidopsis, które zmieniają metylację i wyciszanie gęsto metylowanego endogennego genu reporterowego, odkryliśmy odkryliśmy 11 alleli utraty funkcji w genie chromometylazy CMT3. Mutanty cmt3 wykazywały zwiększoną ekspresję i zmniejszoną metylację reportera, szczególnie w cytozynach innych niż CG. Metylacja CNG była również zmniejszona w powtarzalnych sekwencjach centromerowych. sekwencjach centromerowych. Tak więc CMT3 jest kluczową determinantą metylacji nie-CG. Brak homologów CMT w genomach zwierząt może wyjaśniać obserwację że w przeciwieństwie do roślin, zwierzęta utrzymują głównie metylację CG. --- TŁO: Przejście od sekwencji genu do jego funkcji w kontekście całego organizmu wymaga strategii ukierunkowanej na mutacje. organizmu wymaga strategii ukierunkowanej na mutacje, określanej jako genetyka odwrotna. genetyką odwrotną. Genetyka odwrotna jest wysoce pożądana w erze nowoczesnej genomiki; jednak najpotężniejsze metody są zazwyczaj ograniczone do kilku organizmów modelowych. organizmów modelowych. Wcześniej wprowadziliśmy strategię odwrotnej genetyki z potencjałem z możliwością ogólnego zastosowania do organizmów, którym brakuje dobrze rozwiniętych narzędzi genetycznych. narzędzi genetycznych. Nasza metoda TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) wykorzystuje mutagenezę chemiczną, a następnie badanie przesiewowe pod kątem zmian pojedynczych zasad w celu odkryć indukowane mutacje, które zmieniają funkcję białka. TILLING okazał się być skuteczną strategią odwrotnej genetyki poprzez ustanowienie wysokowydajnego ośrodka TILLING i dostarczenie tysięcy mutacji punktowych w setkach genów geny Arabidopsis członkom społeczności zajmującej się biologią roślin. WYNIKI: Pokazujemy, że wysokoprzepustowy TILLING ma zastosowanie do kukurydzy, ważnej rośliny uprawnej o dużym genomie. kukurydzy, ważnej rośliny uprawnej o dużym genomie, ale z ograniczonymi zasobami odwrotnej genetyki. odwrotną genetyką. Przebadaliśmy pule próbek DNA pod kątem mutacji w 1-kb segmentach 11 różnych genów, uzyskując 17 niezależnych indukowanych mutacji mutacji z populacji 750 zmutagenizowanych pyłkiem roślin kukurydzy. Jednym z był gen chromometylazy DMT102, dla którego uzyskaliśmy serię alleliczną trzech mutacji missensowych. alleliczną serię trzech mutacji missense, które zgodnie z przewidywaniami są silnie szkodliwe. WNIOSKI: Nasze odkrycia wskazują, że TILLING jest szeroko stosowaną i skuteczną strategią odwrotnej genetyki. Ustanawiamy publiczną usługę TILLING dla kukurydzy wzorowaną na istniejącym projekcie Arabidopsis TILLING. --- Komórki owoców pomidora charakteryzują się silnym wzrostem ploidii jądrowej podczas rozwoju owoców. Średnie poziomy ploidalności wzrosły do podobnych poziomów (powyżej 50C) w dwóch różnych tkankach owocowych, owocni i tkance miejscowej. Jednakże, profile ploidalności różniły się znacząco między tymi dwiema tkankami, co sugeruje specyficzną dla tkanki kontrolę endoreduplikacji w owocach pomidora. Aby określić możliwe zależności między endoreduplikacją a mechanizmami epigenetycznymi, zbadano metylacji genomowego DNA z owocni i tkanki lokularnej owoców pomidora. owoców pomidora. Genomowy DNA owocni charakteryzował się zwiększoną metylacją CG i/lub CNG w loci 5S i 18S rDNA oraz w sekwencjach retrotranspozonów gyspsy-podobnych retrotranspozonów podczas wzrostu owoców. Gwałtowny spadek globalnego poziomu metylacji poziomu metylacji DNA wraz z redukcją metylacji w loci rDNA zaobserwowano również w owocni podczas dojrzewania owoców. Odwrotnie, nie zaobserwowano metylacji DNA, zarówno globalnej, jak i specyficznej dla locus, zaobserwowano w tkance locus. Tak więc, specyficzne dla tkanki zmiany metylacji DNA są mało prawdopodobne. być wywołane przez indukcję endoreduplikacji w tkankach owoców, ale mogą odzwierciedlać specyficzne dla tkanki profile ploidalne. Analiza ekspresji ośmiu domniemanych pomidorowych genów kodujących metylotransferazy DNA wykazała, że jedna chromometylaza (CMT) i dwie rearanżowane metylotransferazy (DRM) ulegają preferencyjnej ekspresji w owocni podczas wzrostu owoców i mogą być zaangażowane w specyficzny dla locus wzrost metylacji obserwowany w tej fazie rozwojowej w owocni. --- Metylacja DNA odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu stanów aktywności genów w większości organizmów większości organizmów eukariotycznych i jest niezbędna dla prawidłowego wzrostu i rozwoju. rozwoju. Wzorce metylacji są ustalane przez metylotransferazy de novo metylotransferazy i utrzymywane przez aktywność metylotransferazy konserwującej. Rodzina metylotransferaz DNA de novo Dnmt3 została niedawno scharakteryzowana u zwierząt. scharakteryzowana u zwierząt. Tutaj opisujemy geny metylotransferaz DNA zarówno z Arabidopsis i kukurydzy, które wykazują wysoki poziom podobieństwa sekwencji do Dnmt3, co sugeruje, że kodują one roślinne metylotransferazy de novo. W stosunku do wszystkich znanych eukariotycznych metylotransferaz, te białka roślinne zawierają nowy układ motywów wymaganych do aktywności katalitycznej metylotransferazy DNA. N-końce tych metylotransferaz zawierają serię motywów domen związanych z ubikwityną (UBA). Domeny UBA znajdują się w kilku białkach szlaku ubikwityny szlaku ubikwityny oraz w enzymach naprawy DNA, takich jak Rad23, i mogą one być zaangażowane w wiązanie ubikwityny. Obecność domen UBA zapewnia możliwy związek między metylacją DNA a szlakami ubikwityna/proteasom. --- Metylotransferaza DNA cytozyny zawierająca chromodomenę, Zea metylotransferaza2 (Zmet2), została sklonowana z kukurydzy. Sekwencja ZMET2 jest podobna do sekwencji chromometylaz CMT1 i CMT3 Arabidopsis, przy czym C-końcowymi motywami charakterystycznymi dla eukariotycznych i prokariotycznych metylotransferaz DNA i prokariotycznych metylotransferaz DNA. Do określenia funkcji genu Zmet2 wykorzystaliśmy podejście genetyki odwrotnej. funkcji genu Zmet2. Rośliny homozygotyczne dla elementu transpozycyjnego Mutator do motywu IX miały 13% redukcję metylowanych cytozyn. Analiza DNA w żelu DNA z enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi na metylację i sekwencjonowanie bisulfitowe sekwencjonowanie bisiarczynowe sekwencji gałki 180-bp wykazało zmniejszoną metylację tylko w miejscach CpNpG. Nie zaobserwowano zmniejszenia metylacji w miejscach CpG lub asymetrycznych w heterozygotycznych lub homozygotycznych zmutowanych roślinach. Nasze badania pokazują, że chromometylaza Zmet2 jest wymagana do metylacji in vivo sekwencji CpNpG. --- Podczas embriogenezy następuje poważne przejście od zależności od od produktów zdeponowanych przez matkę do polegania na produktach genomu zygotycznego. U zwierząt, to tak zwane przejście od matczynego do zygotycznego następuje po okresie okresu spoczynku transkrypcyjnego. Niedawno wykazaliśmy, że wczesny zarodek Arabidopsis Arabidopsis jest również w stanie spoczynku, stanie odziedziczonym po żeńskiej gamecie i związany ze specyficznymi wzorcami dimetylacji H3K9 i lokalizacją TERMINAL FLOWER2 (TFL2) lokalizacją. Wykazaliśmy również, że CHROMOMETYLAZA 3 (CMT3) jest wymagana do dimetylacji H3K9 w komórce jajowej i do prawidłowej embriogenezy podczas pierwszych podziałów zygoty. kilku podziałów zygoty. Późniejsza analiza mutantów CMT3 wskazuje na kluczową rolę w przeprogramowaniu komórki jajowej poprzez kontrolowanie wyciszania zarówno w transpozonach, jak i regionach regionach euchromatycznych. Spekulatywny model indukowanego przez CMT3 wyciszania komórek jajowych komórek jajowych, oparty na tych wynikach i aktualnych danych z literatury sugerujący potencjalny udział małych RNA ukierunkowanych na komórkę jajową, proces koncepcyjnie podobny do podziału proces koncepcyjnie podobny do podziału pracy opisanego w męskim gametoficie, dla którego gametoficie, dla którego pokazujemy, że modyfikacje H3K9 i lokalizacja TFL2 są przypominają gametofit żeński. --- Metylacja reszt cytozyny w DNA, katalizowana przez metylotransferazy DNA, jest odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów i rozwoju roślin. rozwoju roślin. W tym badaniu wyizolowaliśmy cztery fragmenty cDNA pszenicy i jeden cDNA z otwartą ramką odczytu kodującą domniemaną metylotransferazę DNA i oznaczone jako TaMET1, TaMET2a, TaMET2b, TaCMT, TaMET3, odpowiednio. Wyszukiwanie BLASTX i analiza filogenetyczna i analiza filogenetyczna sugerowały, że pięć cDNA należało do czterech klas (Dnmt1, Dnmt2, CMT i Dnmt3) genów metylotransferaz DNA. TaMET2a kodował białko 376 aa i zawierał osiem z dziesięciu konserwowanych motywów charakterystycznych dla metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA. Uzyskano sekwencję genomową TaMET2a i stwierdzono, że zawiera ona dziesięć intronów i jedenaście eksonów. Analiza ekspresji pięciu genów ujawniła że ulegały one ekspresji w rozwijających się nasionach, podczas kiełkowania i w różnych tkankach wegetatywnych, ale w różnych ilościach. Warto zauważyć, że że mRNA TaMET1 i TaMET3 były wyraźnie wykrywane w suchych nasionach. Ponadto Ponadto zaobserwowano zróżnicowane wzorce ekspresji pięciu genów między pszenicą a jej rodzicami w liściu, łodydze i korzeniu w fazie łączenia, niektóre były były regulowane w górę, podczas gdy inne były regulowane w dół w hybrydzie. Doszliśmy do wniosku że wiele genów metylotransferazy DNA pszenicy było obecnych i mogło odgrywać ważną rolę we wzroście i rozwoju pszenicy.
Czy w roślinach występują białka DNMT3?
Tak, roślinna DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE2 (DRM2) jest homologiem ssaczej metylotransferazy de novo DNMT3. DRM2 zawiera nowy układ motywów wymaganych do aktywności katalitycznej metylotransferazy DNA.