Wdrożenie proteomiki ilościowej chemii klinicznej (qCCP) wymaga ukierunkowanych podejść proteomicznych, zwykle obejmujących oddolną wielokrotną reakcję monitorowanie-spektrometrii mas (MRM-MS) z peptydami wzorcowymi znakowanymi stabilnym izotopem (SIS). peptydów, aby przejść do dokładniejszych pomiarów. Dwa aspekty qCCP, które zasługują na szczególną uwagę to (1) właściwa kalibracja i (2) zapewnienie spójnego trawienia. Tutaj opisujemy ocenę skuteczności trawienia tryptycznego poprzez monitorowanie różnych peptydów sygnaturowych, pominiętych rozszczepień i modyfikacje podczas proteolizy apolipoproteiny A-I i B w normo- i i hipertriglicerydemii. Bezwzględną kwantyfikację apolipoproteiny A-I i B przeprowadzono za pomocą LC-MRM-MS z wewnętrznymi wzorcami peptydów SIS w dwóch punktach czasowych (4 i 20 h). w dwóch punktach czasowych (4 i 20 h), przy użyciu trzech natywnych kalibratorów białkowych. Porównanie z testem immunoturbidymetrycznym ujawniło odzysk 99,4 ± 6,5% dla apolipoproteiny A-I i 102,6 ± 7,2% dla apolipoproteiny B po 4 godzinach trawienia trypsyną. Odzysk białka po 20-godzinnej inkubacji z trypsyną wynosił 95,9 ± 6,9% i 106,0 ± 10,0% dla apolipoproteiny A-I. 10,0% odpowiednio dla apolipoprotein A-I i B. Podsumowując, zastosowanie metrologicznie identyfikowalnych, natywnych kalibratorów białkowych wygląda obiecująco dla dokładnej kwantyfikacji apolipoproteiny A-I i B. Wybór szybko uformowanych peptydów, tj. peptydów, to znaczy bez pominiętych rozszczepień lub z pominiętymi rozszczepieniami, oraz zastosowanie krótkich czasów inkubacji z trypsyną dla czasy inkubacji trypsyny dla tych skutecznie rozszczepionych peptydów prawdopodobnie jeszcze bardziej zmniejszyć zmienność wprowadzoną przez trawienie trypsyną i poprawić identyfikowalność wyników testów w celu osiągnięcia pożądanej wydajności analitycznej dla zastosowań chemii klinicznej. --- Większość badań kwantyfikacji białek opartych na spektrometrii mas wykorzystuje peptydocentryczne metody analityczne, a zatem silnie opiera się na wydajnych i bezstronnych protokołów trawienia białek do przygotowania próbek. Przedstawiamy nowatorskie obiektywne podejście do oceny wydajności trawienia białek przy użyciu kombinacji jakościowych i ilościowych metod chromatografii cieczowej-tandemowej MS i statystycznej analizy danych. statystycznej analizy danych. W przeciwieństwie do poprzednich badań zastosowaliśmy zarówno standardowe jakościowe, jak również niezależne od danych ilościowe przepływy pracy do systematycznie oceniać wydajność trawienia trypsyną i stronniczość przy użyciu mitochondriów frakcji białek mitochondrialnych. Oceniliśmy dziewięć protokołów trawienia trypsyną, opartych na w roztworze lub na trawieniu wspomaganym filtrem spinowym, w tym nowe zoptymalizowane protokoły. zoptymalizowane protokoły. Zbadaliśmy różne odczynniki do solubilizacji i denaturacji białek i denaturacji białek (siarczan dodecylu, dezoksycholan, mocznik), kilka warunków trawienia trypsyną trypsyny (bufor, RapiGest, deoksycholan, mocznik) oraz dwie metody usuwania detergentów przed analizą detergentów przed analizą peptydów (wytrącanie kwasem lub rozdzielanie faz separacja fazowa z octanem etylu). Nasza niezależna od danych ilościowa chromatografia cieczowa chromatografia cieczowa-tandem MS określiła ilościowo ponad 3700 różnych peptydów z 96% kompletności między wszystkimi protokołami i powtórzeniami, ze średnim pokryciem sekwencji 40% pokryciu sekwencji białka i średnio 11 zidentyfikowanych peptydów na białko. Systematyczna analiza ilościowa i statystyczna parametrów fizykochemicznych wykazała, że wspomagane deoksycholanem trawienie w roztworze w połączeniu z pozwala na wydajne, bezstronne generowanie i odzyskiwanie peptydów ze wszystkich klas białek. peptydów ze wszystkich klas białek, w tym białek błonowych. Ten protokół wspomagany dezoksycholanem był również optymalny dla trawienia wspomaganego filtrem spinowym w porównaniu z istniejącymi metodami. --- Suszone plamki krwi mają wiele zalet jako format próbki, w tym łatwość i bezpieczeństwo transportu. bezpieczeństwo transportu i obsługi. Do tej pory większość analiz spektrometrii masowej suszonych plamek krwi koncentrowała się na małych cząsteczkach lub hemoglobinie. Suszone plamki krwi są jednak potencjalnie bogatym źródłem biomarkerów białkowych, obszar, który został przeoczony. Aby rozwiązać ten problem, zastosowaliśmy nieukierunkowane oddolne podejście proteomiczne do analizy zaschniętych plamek krwi. Przedstawiamy zautomatyzowaną i zintegrowaną metodę ekstrakcji endogennych białek z powierzchni wysuszonej krwi. białek z powierzchni wysuszonych plamek krwi i przygotowania próbki poprzez trawienie trypsyną przy użyciu zrobotyzowanej platformy Advion Biosciences Triversa Nanomate platformy. Chromatografia cieczowa tandemowa spektrometria masowa uzyskanych umożliwiła identyfikację 120 białek z pojedynczej wysuszonej plamki krwi. Zidentyfikowane białka przekraczają zakres stężeń o cztery rzędy wielkości. Metoda została oceniona, a wyniki omówione pod kątem zidentyfikowanych białek i ich potencjalnego zastosowania jako biomarkerów. zidentyfikowanych białek i ich potencjalnego zastosowania jako biomarkerów w programach przesiewowych. --- Przepływy pracy w proteomice oddolnej tradycyjnie wdrażały zastosowanie proteolizy podczas przygotowywania próbek; trawienie enzymatyczne jest najczęściej enzymatyczna jest najczęściej wykonywana przy użyciu trypsyny. Powoduje to hydrolizę wiązań peptydowych, tworząc peptydy tryptyczne, które można następnie poddać analizie LC-MS/MS. Podczas gdy struktura, specyficzność i kinetyka trypsyny są dobrze scharakteryzowane, brak konsensusu i zrozumienia pozostał w odniesieniu do podstawowych parametrów krytycznych dla uzyskania optymalnych danych z eksperymentu proteomicznego. Obejmują one rodzaj użytej trypsyny, pH podczas trawienia, temperatura inkubacji, jak również stosunek enzymu do substratu. Dzięki zastosowaniu metody projektowania eksperymentów (DOE) zoptymalizowaliśmy te parametry, uzyskując głębsze pokrycie proteomu i większy zakres dynamiki pomiarów. zakres dynamiczny pomiaru. Wiedza zdobyta dzięki optymalizacji eksperymentu eksperymentu proteomicznego opartego na odkryciach została zastosowana do ukierunkowanych eksperymentów LC-MS/MS wykorzystujących spektrometrię mas z rozcieńczeniem izotopowym białka do bezwzględnej kwantyfikacji. Wykazaliśmy znaczenie tych parametrów trawienia parametrów w odniesieniu do naszej granicy wykrywalności, jak również naszej zdolności do uzyskania dokładniejszych pomiarów ilościowych. Dodatkowo, byliśmy w stanie ilościowo uwzględnić rozpad peptydów obserwowany w poprzednich badaniach, spowodowany niespecyficzną aktywnością trypsyny. Opisana tutaj optymalizacja trawienia tryptycznego wyeliminowała ten wcześniej zaobserwowany rozpad peptydów, a także zapewniła większe zrozumienie i standaryzację dla wspólnej, ale krytycznej próbki stosowanej w proteomice. --- Dogłębna analiza złożonych próbek proteomu wymaga frakcjonowania próbki na podpróbki przed LC-MS/MS w eksperymentach proteomiki shotgun. My ustaliliśmy przepływ pracy 3D dla proteomiki shotgun, który opiera się na białku PAGE 1D, frakcjonowaniu w żelu, trawieniu trypsyną i separacji peptydów przez IEF w żelu, przed RP-HPLC-MS/MS. Nasze wyniki pokazują, że zastosowanie peptydowej IEF może znacznie zwiększyć liczbę białek zidentyfikowanych z subfrakcjonowania PAGE. PAGE. Metoda ta zapewnia głębsze pokrycie proteomu i zapewnia duży stopień elastyczności w eksperymentalnym podejściu do wysoce złożonych mieszanin, nadal opierając się na separacji białek według masy cząsteczkowej w pierwszym wymiarze. masy cząsteczkowej w pierwszym wymiarze. --- W tym badaniu, białko jaja żółwia błękitnopłetwego (Pelodiscus sinensis) (SSTEW) białka zostały strawione przez termolizynę, a powstałe małe peptydy zostały dalej frakcjonowane przez chromatografię w odwróconej fazie. Peptydy z angiotensyną Aktywność hamująca enzym konwertujący angiotensynę (ACEI) z tych frakcji była przesiewowe. Peptyd pochodzący z lizozymu, IW-11, z frakcji o najbardziej skuteczny ACEI został zidentyfikowany za pomocą chromatografii cieczowej-tandemowej spektrometrii masowej (LC-MS/MS), a jego oczyszczona forma wykazała skuteczną aktywność ACEI in vitro (IC50=4,39±0,31μM). Wykresy Lineweavera-Burka wskazały, że inhibicja w kierunku ACE spowodowana przez ten peptyd jest inhibicją kompetycyjną. Badanie molekularne badanie dokowania ujawniło ponadto, że aktywność ACEI IW-11 jest głównie przypisuje się głównie tworzeniu wiązań wodorowych między N-końcową resztą IW-11 i kieszenią S1 (Ala354 i Tyr523) oraz regionem S2 (His513 i His353) ACE. Co więcej, parametry trawienia były dalej optymalizowane i docelowy peptyd (czystość 82%) został łatwo uzyskany (wydajność 15%) bez żadnych uciążliwej procedury oczyszczania. Warto zauważyć, że lizozym C jest najobficiej występującym białkiem w SSTEW. białko w SSTEW, co sugeruje, że wydajna produkcja tego peptydu ACEI z SSTEW jest obiecująca. ZNACZENIE BIOLOGICZNE: Hamowanie ACE okazało się skuteczną strategią w zapobieganiu i leczeniu nadciśnienia tętniczego. strategią w zapobieganiu i leczeniu nadciśnienia tętniczego i chorób pokrewnych. W przeciwieństwie do typowych syntetycznych inhibitorów ACE, które wywierają dobrze opisane skutki uboczne, peptydy pochodzące z żywności o aktywności hamującej ACE mogą być bezpieczniejszą alternatywą dla leczenia nadciśnienia tętniczego. W tym badaniu kompleksowo zidentyfikowaliśmy peptydy pochodzące z trawienia SSTEW przy użyciu podejścia proteomicznego. IW-11, który pochodzi z lizozymu, najobficiej występującego białka w SSTEW, wykazał niezwykłe hamowanie wobec ACE. Wykazano, że peptyd ten ma konkurencyjne właściwości hamujące właściwość, która jest w stanie wiązać się z aktywnym miejscem ACE i okazała się prawdziwym inhibitorem ACE zgodnie z wykresami Lineweavera-Burka. Używając zoptymalizowanego warunki termolizyny, IW-11 można łatwo uzyskać bez żadnego złożonego etap oczyszczania, co będzie korzystne dla jego dalszego zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu nadciśnienia tętniczego. --- Gan i wsp. (Proteomics 2013, 13, 3117-3123) opisali nowy protokół "makroporowy" do skutecznego trawienia białek trypsyną, odpowiedni dla szerokiego zakresu pH w tym kwaśnego pH. Był on skuteczny nie tylko w eksperymentach z roztworami modelowego białka (mioglobiny), ale także z podfrakcją cytozolu wątroby szczura. To znacznie upraszcza i przyspiesza procedury trawienia białek dla późniejszego MS. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby znaleźć granice eksperymentalnej stosowalności opisanego protokołu w proteomice. --- Zalety analityczne stosowania wielu enzymów do trawienia próbek (MED), przede wszystkim zwiększenie pokrycia sekwencji, zostały zgłoszone w kilku badaniach. Podejście to jest jednak rzadko stosowane, głównie dlatego, że wymaga dodatkowej próbki i czasu pomiaru spektrometrycznego. Wcześniej opisaliśmy wcześniej Filter Aided Sample Preparation (FASP), rodzaj reaktora proteomicznego, w którym próbki rozpuszczone w dodecylosiarczanie sodu (SDS) są trawione w jednostce ultrafiltracyjnej. ultrafiltracji. W FASP, podobnie jak w każdym innym protokole przygotowawczym, część próbki część próbki pozostaje po trawieniu i elucji peptydów. Wykorzystując ten fakt, opracowaliśmy protokół umożliwiający kolejne trawienie próbki dwoma lub trzema enzymami. próbki dwoma lub trzema enzymami. Dzięki zastosowaniu metody FASP, peptydy są uwalniane po każdym etapie trawienia, a pozostały materiał jest następnie rozszczepiany kolejną proteinazą. Zaobserwowaliśmy doskonałą wydajność urządzeń ultrafiltracyjnych w tym trybie, umożliwiając skuteczne oddzielanie ortogonalnych populacji peptydów. ortogonalnych populacji peptydów, co skutkuje wzrostem liczby zidentyfikowanych peptydów i białek. zidentyfikowanych peptydów i białek. Na poziomie niskich mikrogramów stwierdziliśmy, że endoproteinaz LysC i trypsyny umożliwiło identyfikację do 40% więcej białek i fosforylacji. do 40% więcej białek i miejsc fosforylacji w porównaniu do powszechnie stosowanego w porównaniu z powszechnie stosowanym jednoetapowym trawieniem tryptycznym. MED-FASP oferuje wydajną eksplorację wcześniej nieużywanego materiału próbki, zwiększając głębokość analiz proteomicznych i pokrycie sekwencji. sekwencji. --- Ciała olejowe, organelle magazynujące lipidy, są stabilizowane przez szereg specyficznych białek. białek. Białka te są bardzo hydrofobowe, co komplikuje ich ich identyfikację za pomocą "klasycznych" protokołów proteomicznych wykorzystujących trawienie trypsyną. Ze względu na z powodu braku miejsc rozszczepienia trypsyny, osiągalne pokrycie białek jest ograniczone lub nawet niewystarczające do wiarygodnej identyfikacji białek. Aby zidentyfikować aby zidentyfikować takie białka i zwiększyć ich pokrycie, wprowadziliśmy zmodyfikowaną metodę składającą się ze standardowej trzyetapowej procedury (SDS-PAGE, trawienie w żelu i analiza LC-MS/MS). analiza LC-MS/MS). W tej metodzie zastosowano chymotrypsynę, pojedynczą lub w połączeniu z trypsyną. trypsyną, co pozwoliło na uzyskanie peptydów proteolitycznych z regionów regionów hydrofobowych i identyfikację nowych białek ciał oleistych. Nasza metoda może być łatwo zastosować do identyfikacji innych białek hydrofobowych. --- Obecnie proteomika oparta na spektrometrii mas jest przeprowadzana głównie w sposób oddolnie, z peptydami uzyskanymi po proteolitycznym trawieniu całego lizatu proteomu proteomu jako głównych analitów zamiast samych białek. Ta eksperymentalna w zasadniczy sposób opiera się na proteazie trawiącej obfitą i złożoną mieszaninę białek w znacznie bardziej złożoną mieszaninę peptydów. Pełna wiedza mechanizmu działania i specyficzności stosowanych proteaz jest zatem kluczowa, zarówno dla samego etapu trawienia, jak i dla dalszej identyfikacji i kwantyfikacji widm masowych (fragmentacji) uzyskanych dla peptydów w mieszaninie. Ukierunkowana analiza białek poprzez wybrane monitorowanie reakcji, względny nowicjusz w konkretnej dziedzinie proteomiki opartej na spektrometrii mas proteomiki opartej na spektrometrii mas, wymaga nawet wcześniejszego zrozumienia zachowania proteazy dla interesujących nas białek. Ze względu na szybko rosnącą popularność proteomiki jako narzędzia analitycznego w naukach przyrodniczych, istnieje obecnie obecnie ponowne zapotrzebowanie na szczegółową wiedzę na temat trypsyny, proteazy będącej koniem pociągowym w proteomice. Niniejszy przegląd odpowiada na tę potrzebę i zawiera przegląd struktury i mechanizmu działania trypsyny, po którym następuje krytyczna analiza jej zachowania podczas rozszczepiania, które zwykle przyjmuje się jako występujące wyłącznie, ale konsekwentnie po Arg i Lys, chyba że po nich następuje Pro. W tym kontekście kontekście, niedociągnięcia w naszej zdolności do zrozumienia i przewidywania zachowania trypsyny, a także implikacje wynikające z tego faktu. Ponadto przeprowadzona zostanie analiza nieodłącznych wad trypsyny w odniesieniu do analizy całego proteomu, a alternatywne podejścia zostaną które mogą złagodzić te kwestie. Wreszcie, kilka refleksji na temat przyszłości trypsyny jako proteazy w proteomice opartej na spektrometrii mas. proteomice opartej na spektrometrii mas. --- Profilowanie proteomiczne tkanki serca może pomóc w odkryciu zdarzeń molekularnych związanych z chorobami układu sercowo-naczyniowego u ludzi, a nawet je powodujących. Jednak ten materiał materiał jest rzadki i dostępny tylko z biopsji pobranych do diagnostyki, np, ocena zdarzeń zapalnych lub trwałości wirusa. W tym rozdziale opisujemy przepływ pracy do ilościowej analizy proteomu biopsji serca. Zaczynając od 1-2 mg materiału tkankowego, przygotowano surowe ekstrakty białkowe, trawione LysC i trypsyną, a następnie analizowane za pomocą LC-ESI-tandemowej spektrometrii mas. spektrometrii mas. Ze względu na niską wariancję techniczną, metoda ta może być stosowana do ilościowego oznaczania specyficznych dla choroby zmian w ludzkim sercu. Omówione metody obejmują homogenizację tkanki biopsyjnej, przygotowanie próbki, trawienie proteolityczne, a także analizę danych dla kwantyfikacji bez znakowania. --- Proteomika ilościowa z wykorzystaniem znakowania izobarycznego zazwyczaj obejmuje trawienie próbki, znakowanie na poziomie peptydów i 2D LC-MS/MS. Analiza proteomiczna złożonych próbek można potencjalnie przeprowadzić bardziej kompleksowo za pomocą GeLC-MS/MS. Jednak połączenie tego podejścia ze znakowaniem na poziomie peptydów wielu trawień w żelu z całkowicie pociętych pasów żelu może wprowadzić wiele punktów zmienności i negatywnie wpłynąć na końcową dokładność ilościową. Alternatywnie, próbki znakowane znacznikami izobarycznymi na poziomie białka mogą być łączone i analizowane przez GeLC-MS/MS jako pojedynczy pas żelu. Zastrzeżeniem do tej strategii jest to, że znakowane są tylko reszty lizyny są znakowane, co może ograniczać trawienie białek i kwantyfikację peptydów. peptydów. Tutaj porównaliśmy strategię GeLC-MS/MS znakowania na poziomie białka z podejściem 2D LC-MS/MS znakowania na poziomie peptydów, przy użyciu hipokampa myszy synaptosomy myszy i izobaryczne tandemowe znaczniki masy. Etykietowanie na poziomie białek umożliwiło identyfikację 3 razy więcej białek (697 w porównaniu do 241) niż na poziomie peptydów znakowanie, a co ważne dla ilościowego oznaczania, dwa razy więcej białek ze znakowanymi peptydami peptydami (480 w porównaniu do 232). Wstępna analiza in silico również zasugerowała również alternatywne zastosowanie Asp-N do trypsyny w celu obejścia zakłóceń znakowania lizyny podczas trawienia białek. Zastosowanie Asp-N spowodowało skuteczną analizę mniejszej liczby peptydów niż w przypadku trypsyny dla podejścia na poziomie białka (1677 w porównaniu do 3131), ale dało podobne ilościowe pokrycie proteomiczne pod względem pod względem zarówno peptydów (1150 w porównaniu do 1181), jak i białek (448 w porównaniu do 480). Podsumowując razem, eksperymenty te pokazują, że etykietowanie na poziomie białka w połączeniu z z GeLC-MS / MS jest skuteczną strategią dla multipleksowanej kwantyfikacji preparatów synaptosomalnych i może mieć również zastosowanie do próbek o podobnej złożoności proteomicznej i dynamicznego zakresu obfitości białek. --- Analiza kompleksomu immunologicznego jest metodą identyfikacji i profilowania antygenów w krążących kompleksach immunologicznych (CIC); obejmuje oddzielenie kompleksów immunologicznych z surowicy, bezpośrednie kompleksów immunologicznych z surowicy, bezpośrednie trawienie tryptyczne tych kompleksów i analizę białek analiza białek za pomocą chromatografii nano-cieczowej z tandemową spektrometrią mas (nano-LC-MS/MS). Aby ulepszyć tę metodę, początkowo zbadaliśmy wpływ dwóch czynników dwóch czynników - programu elucji gradientowej i typu kolumny nano-LC (z wypełnieniem C18, C8 lub upakowana kapilarna kolumna natryskowa) - na liczbę zidentyfikowanych peptydów i białek. zidentyfikowanych białek. Dłuższe czasy elucji gradientowej skutkowały większą zdolność identyfikacji w zakresie 25-400 min. Ponadto upakowana kolumna kapilarna natryskowa wspierała identyfikację większej liczby peptydów i białek niż jakakolwiek inna kolumna. Dodatkowo, trawienie wspomagane mikrofalami zostało porównane z trawieniem konwencjonalnym, które obejmowało inkubację przez noc w temperaturze 37 °C. Trawienie wspomagane mikrofalami wytworzyło więcej częściowo strawionych peptydów niż w przypadku trawienia konwencjonalnego. Jednak odsetek błędnie strawionych peptydów we wszystkich zidentyfikowanych peptydach w trawieniu wspomaganym mikrofalami kompleksów immunologicznych (mieszaniny białek) kompleksów immunologicznych (mieszaniny białek) były niższe niż w trawieniu wspomaganego fizyczną stymulacją trawienia modelowego białka. Trawienie wspomagane mikrofalami jest nieco gorsze lub tak samo skuteczne jak trawienie konwencjonalne, ale drastycznie skraca czas trawienia.
Wymień główne proteazy używane do trawienia próbek w proteomice.
Trypsyna jest główną proteazą stosowaną w proteomice, a następnie Asp-N, chymotrypsyna, LysC, GluC i termolizyna.