Aktywacja transkrypcji genów u metazoanów jest wieloetapowym procesem, który jest wyzwalany przez czynniki, które rozpoznają miejsca wzmocnienia transkrypcji w DNA. Czynniki te czynniki współpracują z koaktywatorami, aby kierować inicjacją transkrypcji przez aparat RNA polimerazę II. Jedną z klas koaktywatorów są podjednostki TAF(II) czynnika transkrypcyjnego TFIID. czynnika transkrypcyjnego TFIID, mogą służyć jako cele aktywatorów i jako białka które rozpoznają sekwencje promotora niezbędne do inicjacji transkrypcji. Aktywacja transkrypcji przez czynniki wiążące enhancer, takie jak Sp1, wymaga TFIID, ale tożsamość innych niezbędnych kofaktorów pozostaje nieznana. Tutaj opisujemy nowy ludzki czynnik, CRSP, który jest wymagany wraz z czynnikami TAF(II) do aktywacji transkrypcji przez Sp1. Oczyszczanie CRSP identyfikuje kompleks o przybliżonej względnej masie cząsteczkowej 700 000 (M(r) ok. 700K), który zawiera dziewięć podjednostek o wartościach M(r) od 33K do 200K. Klonowanie genów kodujących podjednostki CRSP ujawnia, że CRSP33 jest homologiem podjednostki mediatora drożdży Med7, podczas gdy CRSP150 zawiera domenę konserwowaną w drożdżowej podjednostce mediatora Rgr1. CRSP p200 jest identyczny z jądrowym podjednostka koaktywatora receptora hormonalnego TRIP2/PBP. CRSP 34, 77 i 130 są nowymi białkami. białkami, ale aminowy koniec CRSP70 jest homologiczny do czynnika elongacji TFIIS. Badania immunodeplecji potwierdzają, że te podjednostki mają zasadniczą funkcję kofaktora funkcję kofaktora. Obecność wspólnych podjednostek w różnych kompleksach kofaktorów sugeruje kombinatoryczny mechanizm montażu koaktywatora podczas aktywacji transkrypcyjnej. aktywacji transkrypcyjnej. --- Ludzki MED26 został pierwotnie oczyszczony w kofaktorze wymaganym dla kompleksu aktywacji Sp1 (CRSP) jako składnik 70-kDa o nazwie CRSP70. Ten polipeptyd był specyficzny dla metazoanów i "małej" formy kompleksu Mediator. My donosimy tutaj, że homolog MED26 u Drosophila melanogaster podobnie oddziałuje z innymi składnikami podstawowego kompleksu Drosophila Mediator, ale nie z modułem kinazy i jest rekrutowany do genów po aktywacji. Używając allelu null allelu Med26, pokazujemy, że Med26 jest wymagany dla żywotności organizmu, ale nie dla proliferacji lub przeżycia komórek. Klony pozbawione Med26 w tarczy skrzydłowej prowadzą do do utraty dorosłego marginesu skrzydła i zmniejszonej ekspresji genów zaangażowanych w tworzenie tworzenie marginesu skrzydła. Co zaskakujące, gdy chromosomy polietylenowe z gruczołu ślinowego gruczołu ślinowego przy użyciu przeciwciał przeciwko Med26, okazało się, że frakcja białka była związana z chromocentrum, które zawiera pericentryczną heterochromatynę. heterochromatyny. Barwienie to kolokalizuje z białkiem heterochromatyny 1 (HP1). Eksperymenty immunoprecypitacji pokazują, że Med26 oddziałuje z HP1. Interakcja interakcja odbywa się za pośrednictwem domeny chromoshadow HP1 i poprzez konserwowany motyw w karboksykońcu białka Med26. Ta praca jest pierwszą charakterystyką specyficznej dla metazoanów podjednostki Mediator w modelu zwierzęcym. modelu zwierzęcym. --- Transkrypcja genów kodujących białka u metazoanów obejmuje skoordynowane działanie białek wiążących enhancery i aparatu polimerazy RNA II. Wzajemne oddziaływanie między tymi dwiema klasami czynników transkrypcyjnych pośredniczy skomplikowany zestaw kompleksów kofaktorów. Dla aktywacji transkrypcji przez promotor białko specyficzności promotora 1 (Sp1), czynniki związane z białkiem wiążącym TATA w kompleksie TFIID zostały pierwotnie zidentyfikowane jako niezbędne koaktywatory, ale tożsamość dodatkowych kofaktorów Tożsamość dodatkowych kofaktorów wymaganych do aktywowanej transkrypcji była nieznana. Niedawno donieśliśmy o izolacji i właściwościach kofaktora kofaktora, CRSP (kofaktor wymagany dla Sp1), który działa w połączeniu z czynniki związane z białkiem wiążącym TATA w celu promowania skutecznej aktywacji transkrypcji przez Sp1. CRSP zawiera unikalne podjednostki, jak również polipeptydy, które są współdzielone z innymi kompleksami kofaktorów. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół protokół oczyszczania do izolacji CRSP z ludzkich komórek HeLa. Nasza strategia oczyszczania wykorzystuje zdolność CRSP do wiązania Ni2+-kwasu nitrylotrioctowego-żywicy agarozowej, jak również innych konwencjonalnych żywic chromatograficznych. żywic chromatograficznych. Opisujemy również usprawniony protokół oczyszczania który pozwala na szybsze i skuteczniejsze sposoby izolowania aktywnego CRSP. --- C/EBPbeta jest wewnętrznie represyjnym czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje geny zaangażowane w różnicowanie, proliferację, nowotworzenie i apoptozę. C/EBPbeta działa jako represor, który jest przekształcany w aktywator przez onkoproteinę Ras poprzez fosforylację miejsca MAPK. Aktywacji C/EBPbeta towarzyszy towarzyszy zmiana konformacyjna. Aktywny i represyjny C/EBPbeta oddziałuje z wielopodjednostkowymi kompleksami Mediator poprzez podjednostkę CRSP130/Sur2. Podjednostka CRSP130/Sur2 jest wspólna dla dwóch różnych typów kompleksów Mediator, scharakteryzowanych przez białka CRSP70 i CDK8 jako odpowiednio aktywne i nieaktywne nieaktywny Mediator, odpowiednio. Zablokowanie CRSP130/Sur2 zapobiega wiązaniu i transaktywacji Mediator wiązaniu i transaktywacji przez C/EBPbeta. Onkogenna sygnalizacja Ras lub aktywujące mutacje w C/EBPbeta wybierają aktywny transkrypcyjnie kompleks Mediator który również wiąże się z polimerazą RNA II. Wyniki te pokazują, że indukowana przez Ras strukturalna zmiana C/EBPbeta determinuje zróżnicowaną aktywację genu poprzez selektywną interakcję z różnymi kompleksami Mediator. --- Specyficzne dla sekwencji aktywatory wiążące DNA, kluczowe regulatory ekspresji genów, stymulują transkrypcję częściowo poprzez celowanie w kompleks TFIID rozpoznający rdzeń promotora i pomagając w jego rekrutacji do DNA promotora. Chociaż ustalono, że aktywatory ustalono, że aktywatory mogą wchodzić w interakcje z wieloma składnikami TFIID, to nie wiadomo, czy wspólne lub odrębne powierzchnie w obrębie TFIID są ukierunkowane przez aktywatory aktywatory i jakie zmiany, jeśli w ogóle, w strukturze TFIID mogą wystąpić po wiązaniu aktywatorów. Jako pierwszy krok w kierunku strukturalnej analizy interakcji aktywator/TFIID, określiliśmy trójwymiarowe struktury TFIID związanego z trzema różnymi aktywatorami (tj. supresorem nowotworu p53 białkiem supresorowym nowotworu p53, bogatym w glutaminę Sp1 i onkoproteiną c-Jun) i porównaliśmy ich struktury struktury określone przez mikroskopię elektronową i rekonstrukcję pojedynczej cząsteczki rekonstrukcji. Dzięki połączeniu EM i biochemicznej analizy mapowania, nasze wyniki odkrywają odrębne regiony kontaktowe w obrębie TFIID związane przez każdy aktywator. W przeciwieństwie do kompleksu koaktywatora CRSP/Mediator, który ulega drastycznym i globalnym zmianom strukturalnym po związaniu aktywatora zmiany strukturalne po związaniu aktywatora, zamiast tego zaobserwowano raczej ograniczony zestaw lokalnych konserwowanych zmian strukturalnych zaobserwowano, gdy każdy aktywator wiąże holo-TFIID. Wyniki te sugerują, że kontakt aktywatora może indukować unikalne strukturalne TFIID, dostarczając w ten sposób informacji w nanoskali na temat zależnego od aktywatora montażu TFIID i inicjacji transkrypcji. --- Ludzkie kompleksy kofaktorów ARC (kofaktor rekrutowany przez aktywator) i CRSP (kofaktor wymagany do aktywacji Sp1) pośredniczą w transkrypcji zależnej od aktywatora in vitro. Chociaż kompleksy te mają kilka wspólnych podjednostek, ich strukturalne i funkcjonalne pozostają nieznane. Tutaj donosimy, że powinowactwa ARC składa się z dwóch odrębnych kompleksów wielopodjednostkowych: większego kompleksu, oznaczonego jako ARC-L, oraz mniejszego koaktywatora, CRSP. Transkrypcja odtworzona in vitro z biochemicznie oddzielonymi ARC-L i CRSP ujawnia zróżnicowane funkcje kofaktorów. funkcje kofaktorów. Kompleks ARC-L jest transkrypcyjnie nieaktywny, podczas gdy kompleks CRSP jest wysoce aktywny. Określenie strukturalne za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) i trójwymiarową rekonstrukcję wskazują na znaczne różnice w rozmiarze i kształcie pomiędzy ARC-L i CRSP. Co więcej, analiza EM niezależnie kompleksów CRSP ujawnia różne konformacje indukowane przez różne aktywatory. aktywatory. Wyniki te sugerują, że CRSP może wzmacniać transkrypcję poprzez specyficzne zmiany konformacyjne indukowane przez aktywator. --- Indukowany przez interferon (IFN) kompleks aktywujący transdukcję sygnału i transkrypcję, ISGF3 Kompleks ISGF3 składa się z trzech białek: STAT1, STAT2 i IRF9. Spośród tych składników, STAT2 zapewnia podstawową i niezbędną funkcję aktywacji transkrypcji dla ISGF3. funkcję aktywacji transkrypcji dla ISGF3. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że transkrypcja, w której pośredniczy ISGF3 transkrypcja jest zależna od interakcji STAT2 z DRIP150, podjednostką multimerycznego kompleksu koaktywatora Mediator. Inne podjednostki Mediatora, DRIP77 i DRIP130, albo wiążą STAT2 bez zwiększania aktywności transkrypcyjnej ISGF3 aktywność transkrypcyjną lub zwiększać transkrypcję ISGF3 bez wiązania STAT2, ale tylko DRIP150 zarówno zwiększał transkrypcję zależną od IFN, jak i koimmunoprecypitował z STAT2. Endogenne DRIP150 i STAT2 były w stanie oddziaływać w roztworze, a chromatografia powinowactwa DNA i chromatyna testy immunoprecypitacji wykazały, że DRIP150 wiąże się z dojrzałym, aktywowany kompleks ISGF3-DNA i jest rekrutowany do promotorów genów docelowych w sposób sposób zależny od IFN. Zależna od IFN rekrutacja DRIP130 do docelowego promotora ISGF3 promotora ISGF3 i koprecypitacja SRB10-STAT2 sugerują pośrednie powiązanie z wielopodjednostkowym kompleksem Mediator. Miejsce interakcji STAT2 zostało zmapowane na DRIP150 od 188 do 566, które są niezbędne i wystarczające do interakcji z STAT2. Ekspresja tego fragmentu DRIP150, ale nie fragmentów DRIP150 poza regionem interakcji STAT2, tłumiła aktywność transkrypcyjną za pośrednictwem ISGF3 w sposób dominująco-ujemny, co sugeruje bezpośrednią funkcjonalną rolę tej domeny tej domeny w pośredniczeniu w interakcjach STAT2-DRIP150. Odkrycia te wskazują że aktywowany przez IFN czynnik transkrypcyjny ISGF3 reguluje transkrypcję poprzez kontakt z DRIP150 i implikują kompleks koaktywatora Mediator w genach regulacji genów aktywowanych przez IFN.
Wymień składniki kompleksu CRSP/Med.
Mediator podjednostki 7 transkrypcji polimerazy II RNA
Mediator podjednostki 14 transkrypcji polimerazy II RNA
Mediator podjednostki transkrypcyjnej polimerazy II RNA 17
Mediator podjednostki transkrypcyjnej polimerazy II RNA 23
Mediator podjednostki transkrypcyjnej polimerazy II RNA 24
Mediator podjednostki transkrypcyjnej polimerazy RNA II 26
Mediator podjednostki transkrypcyjnej polimerazy II RNA 27