Proteomika oparta na żelu jest najbardziej użyteczną metodą separacji białek, nawet w porównaniu z proteomiką bezżelową. Analiza proteomiczna za pomocą elektroforezy żelowej 2D elektroforezy (2-DE) z unieruchomionymi gradientami pH jest z kolei najlepszym podejściem do podejście do badań przesiewowych ekspresji białek na dużą skalę. Wizualizacja plamek jest kluczowa dla identyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas. Powszechnie stosowane metody barwienia metody barwienia o doskonałej kompatybilności ze spektrometrią mas to błękit brylantowy Coomassie (CBB) lub barwniki fluorescencyjne. W tym badaniu zaimplementowano "niebieskie koloidalnego CBB, charakteryzującego się wysoką czułością i natychmiastowo niskim tłem. niskim tłem. Czułość klasycznych, koloidalnych i "niebieskich srebra" porównano na żelach jednowymiarowych i 2-DE. Wdrożenie Wdrożenie metody "niebieskiego srebra" działa lepiej, pod warunkiem, że stan fizyczny miceli jest przestrzegany. Przykład 2-DE ludzkiego moczu traktowanego kombinatorycznymi bibliotekami ligandów peptydowych pokazuje, że zaimplementowane "niebieskie srebro" może wykazać złożoność próbki. --- Chociaż proteomicy pracujący metodami bezżelowymi uważają żele za z przeszłości, proteomika oparta na żelach wciąż ma wiele do zaoferowania. do zaoferowania, a pozyskiwanie obrazów, na których można rozdzielić tysiące plamek jest nadal w dużej mierze wykonywana. W dzisiejszych czasach dwuwymiarowa elektroforeza pozostaje narzędziem do badania proteomu roślin i odkrywania zmian w obfitości białek między próbkami. między próbkami. Można jednak wskazać pewne słabe punkty, jak w przypadku każdej innej metody. metody, jak na przykład brak powtarzalności lub wykrywanie białek o niskiej liczebności. białek o niskiej liczebności. Zastosowanie techniki zwanej "elektroforezą różnicową elektroforezy różnicowej" lub "DIGE" może pomóc przezwyciężyć lub przynajmniej zmniejszyć te niedogodności. niedogodności. DIGE wymaga znakowania białek fluorochromami przed przed ich rozdzieleniem na żelach 2DE. Technika ta może być stosowana w szerokim zakresie badań stresu roślin, między innymi drzew. Dokładne wyniki ilościowe można następnie uzyskać, a białka wykazujące zainteresowanie badanym stresem są następnie poddawane trawieniu enzymatycznemu (zwykle trypsyną) i i identyfikowane przy użyciu jonizacji elektrorozpryskowej, laserowej desorpcji/jonizacji w czasie przelotu i/lub tandemowej MS. --- Podejście proteomiczne oparte na żelu jest cenną techniką badania właściwości białek. charakterystyki białek. Technika ta ma różnorodne zastosowania od analizy pojedynczego białka do badania wszystkich białek komórkowych. Co więcej, jakość białek i do pewnego stopnia ich dystrybucję można najpierw ocenić za pomocą jednowymiarowej elektroforezy żelowej, a następnie bardziej informacyjnie, dla analizy porównawczej, przy użyciu techniki dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Tutaj opisujemy, jak wykorzystać dostępność barwników fluorescencyjnych do barwienia selektywnej klasy białek na tym samym żelu w celu wykrycia zarówno fosfo-, jak i całkowitych proteomów. Umożliwia to współwykrywanie fosfoprotein, jak również całkowitych białek z tego samego żelu i jest osiągane poprzez wykorzystanie dwóch różnych barwników fluorescencyjnych, ProQ-Diamond, który barwi tylko fosforylowane białka i Sypro Ruby, który barwi cały podzbiór białek. białek. Ten przepływ pracy można zastosować w celu uzyskania wglądu w mechanizmy regulacyjne mechanizmów regulacyjnych indukowanych przez cząsteczki sygnałowe, takie jak cykliczne nukleotydy, poprzez kwantyfikację i późniejszą identyfikację reagujących fosfo- i całkowitych białek. białek. --- Rodzina barwników fluorescencyjnych CyDye jest obecnie najczęściej wybierana do zastosowań w analizie proteomicznej z wykorzystaniem dwuwymiarowej elektroforezy różnicowej elektroforezy różnicowej 2D (2D-DIGE). Znakowanie białek za pomocą CyDyes jest utrudnione przez wytrącanie białek i rozmazywanie żelu, gdy są stosowane powyżej minimalnego poziomu znakowania. Rozpuszczalność znakowanego białka można poprawić, wprowadzając grupy rozpuszczalne w wodzie na rozpuszczalnych w wodzie, takich jak kwasy cysteinowe. Jednak dodanie ujemnie naładowanej będzie miało niepożądany efekt przesunięcia pI w stosunku do nieznakowanego białka. nieznakowanego białka. Ograniczenia te zostały rozwiązane poprzez syntezę wysoce rozpuszczalnych w wodzie i równoważących pI zwitterionowych fluoroforów CyDye (Z-CyDyes). Nowe barwniki zawierają motyw kwasu cysteinowego, miareczkowalną aminową i aktywowaną przez NHS grupę estrową. W porównaniu 2D-DIGE Z-CyDyes i CyDyes, nowe barwniki znacznie zwiększyły objętość plamki białka i liczbę plamek. objętość plamki białka i liczbę wykrytych plamek. Barwniki Z-CyDyes mają potencjał do zwiększenia głębokości pokrycia proteomu i zapewnienia ogólnej strategię poprawy wydajności odczynników do znakowania białek. --- Barwienie srebrem jest szeroko stosowane do wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych, gdy wymagana jest wysoka czułość. W niniejszym badaniu opracowano prosty i szybki protokół barwienia srebrem białek po PAGE został opracowany w niniejszym badaniu. Liczba kroków została zmniejszona w porównaniu do konwencjonalnego protokołu poprzez połączenie utrwalania, płukania i moczenie w jednym etapie impregnacji, uzyskując w ten sposób wykrywanie białek w ciągu 20 min. Obecna metoda jest tak samo czuła jak obecne protokoły z zaletą oszczędności czasu i kosztów. zaletą oszczędności czasu i kosztów. --- Ilościowe analizy proteomu sugerują, że dobrze znany barwnik koloidalny Coomassie Blue, stosowany jako barwnik w podczerwieni, może zapewnić czułe, poelektroforetyczne wykrywanie białek w żelu, które może konkurować nawet z Sypro Ruby. Biorąc pod uwagę kluczową rolę dwuwymiarowej elektroforezy żelowej w analizach proteomicznych top-down analizach proteomicznych, bardziej opłacalna alternatywa, taka jak Coomassie Blue może okazać się ważnym narzędziem w ciągłym udoskonalaniu tej ważnej techniki analitycznej. techniki analitycznej. Do tej pory nie przeprowadzono systematycznej charakterystyki wykrywania fluorescencji w podczerwieni Coomassie Blue wykrywania fluorescencji w podczerwieni w stosunku do wykrywania za pomocą SR. Tutaj, siedem komercyjnych odczynników barwiących Coomassie i siedem preparatów barwiących opisanych w literaturze były systematycznie porównywane. Selektywność, czułość progowa, zmienność międzybiałkowa i zakres liniowo-dynamiczny Coomassie Blue w podczerwieni zostały ocenione równolegle z Sypro Ruby. Sypro Ruby. Warto zauważyć, że kilka preparatów barwnika Coomassie zapewniało czułość wykrywania fluorescencji w podczerwieni do <1 ng białka w żelu, nieznacznie nieznacznie przekraczając wydajność Sypro Ruby. Liniowy zakres dynamiczny fluorescencji Coomassie Blue wykrywania fluorescencji w podczerwieni był znacznie wyższy niż Sypro Ruby. Sypro Ruby. Jednakże, w dwuwymiarowych analizach żelowych, z powodu stępionej reakcji fluorescencji z powodu stępionej odpowiedzi fluorescencyjnej, Sypro Ruby był w stanie wykryć kilka dodatkowych białek, stanowiących 0,6% wykrytego proteomu. Tak więc, chociaż obie metody wykrywania mają swoje zalety i wady, różnice między nimi wydają się niewielkie. wydają się być niewielkie. Wykrywanie fluorescencji w podczerwieni Coomassie Blue jest zatem realną alternatywą dla proteomiki opartej na żelu, oferując wykrywanie porównywalne do Sypro Ruby i bardziej wiarygodne oceny ilościowe, ale za ułamek kosztów. kosztów.
Wymień metody barwienia żelu białkowego wizualizujące cały zestaw białek.
W literaturze opisano kilka protokołów barwienia do wizualizacji białek rozdzielonych przez SDS-PAGE:
fluorescencja
Sypro Ruby
Koloidalny błękit Coomassie
Błękit Coomassie
Barwienie srebrem
Błękit brylantowy Coomassie