Opisaliśmy zastosowanie prostego podejścia do znakowania biotynylacją w celu bezpośredniego oczyszczania znakowanych kompleksów czynników transkrypcyjnych, w oparciu o użyciu sztucznych krótkich znaczników peptydowych, które są specyficznie i wydajnie biotynylowane przez bakteryjną ligazę biotynową BirA, która jest współeksprymowana w komórkach z oznaczonym czynnikiem. Wykorzystaliśmy to podejście do wstępnego scharakteryzowania kompleksy utworzone przez hematopoetyczny czynnik transkrypcyjny GATA-1 w komórkach erytroidalnych. komórkach erytroidalnych. GATA-1 jest niezbędny do różnicowania erytroidalnego, a jego funkcje obejmujące regulację w górę genów erytroidalnych, represję alternatywnych programów programów transkrypcyjnych i hamowanie proliferacji komórek. Jednakże, nie było nie było jasne, w jaki sposób wszystkie te funkcje GATA-1 są mediowane. Nasza praca opisuje, po raz pierwszy, różne interakcje GATA-1 z istotnym czynnikiem hematopoetycznym czynnikiem hematopoetycznym Gfi-1b, represyjnym kompleksem MeCP1 i chromatyną remodelującym kompleksem ACF/WCRF, oprócz znanych kompleksów GATA-1/FOG-1 i GATA-1/TAL-1. Dostarczamy również dowodów na to, że różne kompleksy GATA-1 są związane z określonymi funkcjami GATA-1 w różnicowaniu erytroidalnym, na przykład na przykład GATA-1/Gfi-1b z tłumieniem proliferacji komórek i GATA-1/FOG-1/MeCP1 z tłumieniem innych hematopoetycznych programów transkrypcyjnych programów transkrypcyjnych. Następnie zastosowaliśmy znacznik biotynylacji do Ldb-1, znanego partnera GATA-1 i scharakteryzowaliśmy szereg nowych partnerów interakcji, którzy są istotne w rozwoju erytroidalnym, w szczególności Eto-2, Lmo4 i CdK9. Na koniec, jesteśmy w trakcie stosowania tej samej technologii do scharakteryzowania czynników czynników, które są związane z tłumionym promotorem gamma-globiny in vivo. --- TŁO: Testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) połączone z macierzami genomowymi (Chip-on-chip) lub masowym sekwencjonowaniem równoległym (ChIP-seq) prowadzą do identyfikacji genomowych identyfikacji miejsc wiązania białek związanych z chromatyną. Jednakże wysoce zmienna jakość przeciwciał i dostępność epitopów w chromatynie usieciowanej usieciowanej chromatynie może negatywnie wpływać na wyniki genomowego ChIP. Znaczniki epitopowe są były często używane jako bardziej niezawodne alternatywy. Ponadto zastosowaliśmy znakowanie biotynylacją białek in vivo jako alternatywę o bardzo wysokim powinowactwie do przeciwciał. przeciwciał. W tym artykule opisujemy optymalizację znakowania biotynylacją dla ChIP i jego sprzężenie ze znanym znacznikiem epitopowym w celu zapewnienia niezawodnej i niezawodną i wydajną alternatywę dla przeciwciał. WYNIKI: Na przykładzie znakowanego biotyną czynnika transkrypcyjnego erytroidalnego GATA-1 opisujemy kilka etapów optymalizacji dla zastosowania streptawiny biotynowej o wysokim powinowactwie. powinowactwa biotyny do streptawidyny w ChIP. Stwierdzamy, że pominięcie SDS podczas sonikacji, zastosowanie żelatyny ze skóry ryb jako środka blokującego i wybór kulek perełek streptawidyny może prowadzić do znacznie lepszego wzbogacenia ChIP i niższego tła w porównaniu do przeciwciał. Pokazujemy również, że znacznik epitopowy V5 działa równie dobrze w warunkach równie dobrze w warunkach opracowanych dla ChIP ze streptawidyną i że może mniej cierpieć z powodu skutków sieciowania formaldehydem. WNIOSEK: Połączone zastosowanie znacznika biotynowego o bardzo wysokim powinowactwie z mniej wrażliwym na sieciowanie znacznikiem V5 zapewnia elastyczną platformę ChIP z potencjalne implikacje w wynikach sekwencjonowania ChIP. --- GATA-1 jest niezbędny do tworzenia linii erytroidalnej, megakariocytarnej, eozynofilowych i komórek tucznych. Działa jako aktywator i represor różnych genów docelowych, np. różnych genów docelowych, na przykład w komórkach erytroidalnych hamuje proliferację komórek proliferację komórek i wczesne geny hematopoetyczne, jednocześnie aktywując geny erytroidalne, jednak nie jest jasne, w jaki sposób pośredniczą obie te funkcje. Używając znakowanie biotynylacji / podejście proteomiczne w komórkach erytroidalnych, opisujemy różne interakcje GATA-1 z niezbędnym czynnikiem hematopoetycznym Gfi-1b, kompleksem represyjnym kompleksem MeCP1 i remodelującym chromatynę kompleksem ACF/WCRF, oprócz oprócz znanych kompleksów GATA-1/FOG-1 i GATA-1/TAL-1. Co ważne, my pokazujemy, że FOG-1 pośredniczy w interakcjach GATA-1 z kompleksem MeCP1, tym samym zapewniając wyjaśnienie nakładających się funkcji tych dwóch czynników w erytropoezie. erytropoezie. Pokazujemy również, że podzbiory docelowych genów GATA-1 są wiązane in vivo przez różne kompleksy, łącząc w ten sposób specyficznych partnerów GATA-1 z różnymi aspektami jego funkcji. Opierając się na tych odkryciach, sugerujemy model dla różnych ról GATA-1 w różnicowaniu erytroidalnym.
Opisać izolację kompleksów czynników transkrypcyjnych poprzez znakowanie biotynylacją in vivo i bezpośrednie wiązanie z kulkami streptawidyny, jak zastosowano w przypadku istotnego hematopoetycznego czynnika transkrypcyjnego GATA-1.
Ze względu na bardzo wysokie powinowactwo biotyny do awidyny i streptawidyny, znakowanie biotyną oferuje atrakcyjne podejście do wydajnego oczyszczania kompleksów białkowych. Bardzo wysokie powinowactwo układu biotyna/(strept)awidyna oferuje również potencjał do jednoetapowego wychwytywania kompleksów białkowych o niższej liczebności, takich jak kompleksy czynników transkrypcyjnych. Identyfikacja krótkich znaczników peptydowych, które są skutecznie biotynylowane przez bakteryjną ligazę biotynową BirA, doprowadziła do podejścia do jednoetapowego oczyszczania kompleksów czynników transkrypcyjnych poprzez specyficzne znakowanie biotynylacją in vivo. Krótki znacznik sekwencyjny połączony N-końcowo z interesującym czynnikiem transkrypcyjnym jest bardzo wydajnie biotynylowany przez BirA współeksprymowany w tych samych komórkach, co wykazano przez znakowanie istotnego hematopoetycznego czynnika transkrypcyjnego GATA-1. Bezpośrednie wiązanie ze streptawidyną biotynylowanego GATA-1 w ekstraktach jądrowych skutkowało jednoetapowym wychwytywaniem znakowanego czynnika i związanych z nim białek, które były eluowane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Doprowadziło to do scharakteryzowania kilku różnych kompleksów GATA-1 z innymi czynnikami transkrypcyjnymi i kofaktorami remodelującymi chromatynę, które są zaangażowane w aktywację i represję docelowych genów. Zatem znakowanie za pośrednictwem BirA jest skutecznym podejściem do bezpośredniego wychwytywania i charakteryzowania kompleksów czynników transkrypcyjnych.