TALEN jest jednym z najczęściej używanych narzędzi w dziedzinie edycji genomu. TALEN umożliwia integrację i inaktywację genów w wysoce wydajny i sposób. Choć bardzo atrakcyjny, pozorna prostota i wysoki wskaźnik sukcesu TALEN TALEN mogą być mylące dla nowicjuszy w dziedzinie edycji genów. edycji genów. W zależności od zastosowania, konkretne projekty TALEN, oceny aktywności i strategie badań przesiewowych. Tutaj przedstawiamy różne metody skutecznego przeprowadzania integracji i inaktywacji genów za pośrednictwem TALEN inaktywacji w różnych systemach komórkowych ssaków, w tym w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych i opisujemy przykłady eksperymentalne związane z tymi podejściami. --- Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) to nowa klasa nukleaz nukleazy, które są łatwiejsze do zaprojektowania w celu rozszczepienia w pożądanych miejscach w genomie niż genomie niż poprzednie typy nukleaz. Przedstawiamy tutaj wykorzystanie TALENów do szybkiego i wydajnego generowania zmutowanych alleli 15 genów w hodowanych komórkach somatycznych somatycznych lub ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych, dla których zróżnicowaliśmy zarówno linie docelowe, jak i izogeniczne linie kontrolne w różne typy komórek metabolicznych typy komórek metabolicznych. Wykazaliśmy fenotypy autonomiczne dla komórek bezpośrednio związane z dyslipidemią, insulinoopornością, hipoglikemią, lipodystrofią, śmierć neuronów ruchowych i zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C. Znaleźliśmy niewiele dowodów na efekty TALEN off-target, ale każda linia klonalna zawiera jednak znaczną liczbę unikalnych mutacji. znaczną liczbę unikalnych mutacji. Biorąc pod uwagę szybkość i łatwość, z jaką byliśmy w stanie wyprowadzić i scharakteryzować te linie komórkowe, przewidujemy, że edycja genomu za pośrednictwem TALEN ludzkich komórek stanie się podstawą badań nad biologią i chorobami człowieka. biologii i chorób człowieka. --- Niedokrwistość sierpowatokrwinkowa (SCD) jest najczęstszą chorobą genetyczną człowieka. spowodowana pojedynczą mutacją ludzkiego genu β-globiny (HBB). Brak długoterminowego leczenia sprawia, że rozwój niezawodnych terapii komórkowych i genowych jest wysoce pożądany. pożądane. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs) pochodzące od pacjentów z chorobą (hiPSC) mają ogromny potencjał w opracowywaniu nowych terapii komórkowych i genowych. Z mutacje powodujące chorobę skorygowane in situ, hiPSC pochodzące od pacjentów mogą przywrócić normalne funkcje komórek i służyć jako odnawialne źródło komórek autologicznych do leczenia zaburzeń genetycznych. Tutaj z powodzeniem wykorzystaliśmy nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN), niedawno wyłonione narzędzie do edycji genomu, aby skorygować mutację SCD w hiPSC pochodzących od pacjenta. hiPSCs. Zaprojektowane przez nas TALENy są wysoce specyficzne i generują minimalne efekty efekty poza celem. W połączeniu z transpozonem piggyBac, geny za pośrednictwem TALEN nie pozostawia resztkowych sekwencji ektopowych w miejscu korekcji, a skorygowane hiPSC zachowują hiPSC zachowują pełną pluripotencję i prawidłowy kariotyp. Nasze badanie pokazuje ważny pierwszy krok w stosowaniu TALEN do leczenia chorób genetycznych, takich jak chorób genetycznych, takich jak SCD, co stanowi znaczący postęp w kierunku w kierunku terapii komórkowych i genowych opartych na hiPSC. --- Ustanowienie embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i technologii celowania genów u myszy zrewolucjonizowało dziedzinę genetyki. Względna łatwość, z jaką geny mogą zostać znokautowane, a egzogenne sekwencje wprowadzone, pozwoliły myszy myszy stały się głównym modelem do rozszyfrowania kodu genetycznego. Nie Nic dziwnego, że brak autentycznych ESC utrudnił genetykę zwierząt gospodarskich i zmusił naukowców zajmujących się zwierzętami do dostosowania alternatywnych technologii do inżynierii genetycznej. Niedawne odkrycie stworzenia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez regulację w górę garstki przeprogramowanych genów genów wzbudziło nowy entuzjazm wśród genetyków zwierzęcych. Jednakże, podobnie jak w przypadku ESC, tworzenie autentycznych iPSC od zwierząt domowych jest wciąż najeżone problemami. problemami, w tym (ale nie tylko) utrzymującą się ekspresją genów i brak udowodnionego potencjału do różnicowania się w docelowe typy komórek zarówno w docelowe typy komórek zarówno in vitro, jak i in vivo. Nukleazy specyficzne dla miejsca składające się z z nukleaz z palcem cynkowym (ZFN), nukleaz efektorowych podobnych do aktywatorów transkrypcji (TALEN) i klastrowych regulowanych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) pojawiły się jako potężne narzędzia genetyczne do precyzyjnej edycji genomu, zastępując potrzebę modyfikacji genetycznych opartych na ESC nawet u myszy. W tym artykule, w w następstwie tych potężnych technologii edycji genomu, rola pluripotencjalnych komórek macierzystych w genetyce zwierząt gospodarskich. --- Rozwój ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) komórek macierzystych (iPSC) ułatwia badania in vitro mechanizmów ludzkich chorób, przyspiesza proces badania przesiewowego leków i zwiększa wykonalność stosowania terapii zastępczej w klinikach. Jednakże, badanie zależności genotyp-fenotyp w ESC lub iPSC jest utrudnione przez niską wydajność edycji genów edycji genów specyficznych dla danego miejsca. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) wzbudziły zainteresowanie ze względu na łatwość montażu, wysoką wydajność i wierne celowanie w geny. W tym badaniu zoptymalizowaliśmy projekt TALEN, aby zmaksymalizować jego wydajność cięcia genomu. Wykazaliśmy, że użycie zoptymalizowanych TALENów w połączeniu z jednoniciowym oligodeoksynukleotydem (ssODN) umożliwiło wydajną edycję genów w ludzkich komórkach. edycję genów w ludzkich komórkach. Mutacje genów i delecje genów do 7,8 kb można osiągnąć z wysoką wydajnością. Stworzyliśmy ludzkie linie komórek nowotworowych i linie H9 ESC z homozygotyczną delecją genu mikroRNA-21 (miR-21) i genu miR-9-2. miR-9-2. Te linie komórkowe stanowią solidną platformę do badania roli tych genów podczas różnicowania komórek i nowotworzenia. Zaobserwowaliśmy również że endogenny chromosom homologiczny może służyć jako szablon dawcy dla edycji genów. edycji genów. Ogólnie rzecz biorąc, nasze badania pokazują wszechstronność wykorzystania ssODN i TALEN do tworzenia genetycznie zmodyfikowanych komórek do celów badawczych i terapeutycznych. i terapeutycznych. --- Generowanie i precyzyjna korekta genetyczna hiPSC pochodzących od pacjenta mają ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej. potencjał w medycynie regeneracyjnej. Takie ukierunkowane manipulacje genetyczne można teraz być osiągnięte przy użyciu nukleaz edytujących geny. Tutaj opisujemy generowanie komórek mukowiscydozę (CF) i chorobę Gauchera (GD) hiPSCs odpowiednio z CF (homozygotycznego dla mutacji CFTRΔF508) i GD typu II [homozygotyczne dla β-glukocerebrozydazy (GBA) 1448T>C] fibroblastów pacjentów, przy użyciu TALEN specyficznych dla CCR5. Specyficzne dla miejsca dodanie kasety genowej Oct4/Sox2/Klf4/Lin28/Nanog/eGFP w endogennym CCR5. w endogennym miejscu CCR5 pierwotnych fibroblastów pochodzących od pacjentów z chorobą fibroblasty indukowały przeprogramowanie, dając początek zarówno monoallelicznym (heterozygotycznym) i dwuallelowych hiPSC zmodyfikowanych CCR5. Późniejsze wycięcie kasety dawcy zostało poprzez traktowanie zmodyfikowanych CCR5 hiPSCs CF i GD za pomocą Cre. Wykazaliśmy również korekcję mutacji specyficznych dla choroby sierpowatokrwinkowej (SCD) w locus endogennym locus HBB hiPSCs specyficznych dla pacjenta [linia TNC1, która jest homozygotyczna dla zmutowanych alleli β-globiny (βS/βS)], przy użyciu TALEN specyficznych dla HBB. Linie hiPSC z korekcją SCD wykazały konwersję genu zmutowanego βS do dzikiego typu βA w jednym z alleli HBB, podczas gdy z alleli HBB, podczas gdy drugi allel pozostał zmutowanym fenotypem. Po wycięciu kasety DNA otoczonej loxP z linii hiPSC skorygowanych SCD przy użyciu Cre, uzyskaliśmy wtórne heterozygotyczne hiPSC βS/βA, które wykazują ekspresję typu dzikiego (βA) do poziomu 30-40% w porównaniu do nieskorygowanych (βS/βS) hiPSC SCD hiPSCs po zróżnicowaniu w komórki erytroidalne. Co więcej, wykazaliśmy również, że TALEN i korekta genetyczna hiPSCs specyficznych dla choroby nie indukowała nie indukuje żadnych mutacji poza celem w blisko spokrewnionych miejscach. --- MikroRNA są ważnymi regulatorami genów zaangażowanymi w wiele procesów biologicznych, w tym utrzymanie macierzy i przeprogramowanie komórek. Obecnie stosowane metody w badaniach utraty funkcji mikroRNA obejmują głównie zablokowany kwas nukleinowy (LNA) oligonukleotydy i inhibitory miRZip, które mają kilka ograniczeń. Ze względu na ich unikalne struktury genowe i małe rozmiary, nie ma skutecznej lub prostej strategii, aby znokautować lub znokautować mikroRNA lub całe klastry mikroRNA. Tutaj demonstrujemy knockdown klastra miR-302/367 przy użyciu białka Kruppel-associated box repressor domain fused with specific transcription aktywatorami podobnymi do efektorów (TALE) zaprojektowanymi do wiązania klastra miR-302/367 promotora. Zaprojektowaliśmy również dwie pary nukleaz TALE (TALEN), aby skutecznie usunięcia klastra miR-302/367 w pierwotnych ludzkich fibroblastach i ustaliliśmy, że nokaut klastra miR-302/367 całkowicie zablokował indukowaną generację pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). (iPSC). Łącznie nasze wyniki pokazują, że oparte na TALE represor transkrypcji i TALEN są dwoma obiecującymi podejściami do badania utraty funkcji klastrów mikroRNA w komórkach somatycznych i pluripotencjalnych komórkach macierzystych komórkach macierzystych. --- Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest ciężką chorobą zwyrodnieniową mięśni spowodowaną mutacją genu dystrofiny. przez mutację w genie dystrofiny. Korekcja genetyczna pochodzących od pacjenta indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą TALEN lub CRISPR-Cas9 jest obiecująca dla terapii genowej DMD; jednak bezpieczeństwo takiego leczenia nukleazą musi zostać bezpieczeństwo takiego leczenia nukleazą. Korzystając z unikalnej bazy danych k-merów, systematycznie identyfikowaliśmy unikalny region docelowy region docelowy, który redukuje miejsca poza celem. Aby przywrócić białko dystrofiny, przeprowadziliśmy trzy metody korekcji (pomijanie eksonów, frameshifting i exon knockin) w iPSC pochodzących od pacjentów z DMD i stwierdziliśmy, że knockin eksonu był najbardziej skutecznym podejściem. skutecznym podejściem. Następnie zbadaliśmy integralność genomu poprzez kariotypowanie, tablicę zmienności liczby kopii i sekwencjonowanie egzomu w celu zidentyfikowania klonów z minimalnym obciążeniem mutacjami. Na koniec zróżnicowaliśmy skorygowane iPSC w kierunku komórek mięśni szkieletowych i z powodzeniem wykryliśmy ekspresję pełnej długości białka dystrofiny. Wyniki te stanowią ważne ramy dla rozwoju opartej na iPSC terapii genowej zaburzeń genetycznych przy użyciu programowalnych nukleaz. nukleazy. --- Szczur jest preferowanym modelem zwierzęcym w wielu obszarach badań biomedycznych i rozwoju leków. rozwoju leków. Manipulacje genetyczne na szczurach pozostają w tyle za manipulacjami na myszach ze względu na brak skutecznych narzędzi do celowania w geny. Wcześniej wygenerowaliśmy knockout szczura poprzez konwencjonalną homologiczną rekombinację w szczurzych embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Tutaj pokazujemy, że skuteczne namierzanie genów w szczurzych komórkach ES może być osiągnąć szybko poprzez nukleazę podobną do aktywatora transkrypcji (TALEN) za pośrednictwem dwuniciowych pęknięć DNA. Wykorzystując technikę klonowania Golden Gate skonstruowaliśmy parę wektorów celujących TALEN dla interesującego nas genu w ciągu 5 dni. w ciągu 5 dni. Po transfekcji genu, docelowe kolonie szczurzych komórek ES zostały wyizolowane, przebadane i potwierdzone metodą PCR bez potrzeby selekcji leków. selekcji. Nasze wyniki sugerują, że celowanie w geny za pośrednictwem TALEN jest doskonałym sposób tworzenia genetycznie zmodyfikowanych linii komórek ES szczura z wysoką wydajnością i krótkim czasem realizacji. --- Bezpieczeństwo i niezawodność integracji transgenu z ludzkim genomem nadal stanowią wyzwanie dla wyzwania dla terapii genowej opartej na komórkach macierzystych. Poniżej przedstawiamy system nukleazy efektorowej podobnej do aktywatora transkrypcji bakulowirusa dla AAVS1 w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC). (iPSC). Ten system wirusowy, po zoptymalizowaniu w ludzkich komórkach U87, zapewnił ukierunkowaną wydajność integracji na poziomie 95,21% we włączaniu kasety Neo-eGFP i był w stanie pośredniczyć w integracji wstawki DNA do 13,5 kb. W iPSCs, ukierunkowana integracja z trwałą ekspresją transgenu została osiągnięta bez naruszając stabilność genomu. Zmodyfikowane iPSC nadal wyrażały markery pluripotencji komórek macierzystych iPSC nadal wyrażały markery pluripotencji komórek macierzystych i zachowały zdolność do różnicowania się w trzy linie linii zarodkowych w uzyskanych ciałkach embrioidalnych. Używając systemu bakulowirus-Cre/LoxP w iPSCs iPSCs, kaseta Neo-eGFP w locus AAVS1 mogła zostać zastąpiona przez kasetę Hygro-mCherry, demonstrując wykonalność wymiany kasety. Ponadto, jak oceniono na podstawie pomiaru poziomów ekspresji γ-H2AX, toksyczność genomu związana z chromosomalnymi pęknięciami dwuniciowymi nie była wykrywalna po transdukcji umiarkowanymi dawkami wektorów bakulowirusowych wyrażających nukleotydy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji. Biorąc pod uwagę wysoką docelową wydajność integracji, elastyczność w wymianie transgenu i niską toksyczność dla genomu, nasze podejście oparte na transdukcji bakulowirusowej podejście oparte na transdukcji bakulowirusowej oferuje ogromny potencjał i atrakcyjną opcję dla precyzyjnych manipulacji genetycznych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych. --- Funkcjonalne badanie genów chromosomu Y było utrudnione przez brak mysich modeli z określonymi mutacjami chromosomu modeli z określonymi mutacjami chromosomu Y. Użyliśmy nukleazy aktywatora transkrypcji edycję genów za pośrednictwem nukleazy aktywatoropodobnej (TALEN) w mysich embrionalnych komórkach macierzystych myszy (mESC) w celu wytworzenia myszy z ukierunkowanymi zaburzeniami genów i w dwóch genach Y - Sry i Uty. Edycja genów za pośrednictwem TALEN jest przydatnym narzędziem do badania biologii chromosomu Y. --- β-talasemia (β-Thal) to grupa zagrażających życiu zaburzeń krwi spowodowanych przez mutacje punktowe lub delecje nukleotydów w genie β-globiny (HBB). Szacuje się, że szacuje się, że 4,5% populacji na świecie jest nosicielami mutacji β-Thal (1), stanowiąc trwałe zagrożenie dla zdrowia publicznego. Generowanie specyficznych dla pacjenta indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i późniejsza korekta mutacji mutacji chorobotwórczych stanowi idealne rozwiązanie terapeutyczne tego problemu. Jednakże, korekcja genów oparta na rekombinacji homologicznej w ludzkich iPSC pozostaje w dużej mierze nieefektywna. Tutaj opisujemy solidny proces łączący wydajne generowanie wolnych od integracji β-Thal iPSCs z komórek pacjentów oraz nukleazę podobną do aktywatora transkrypcji (TALEN) - opartą na uniwersalnej korekcji mutacji HBB in situ. Wygenerowaliśmy wolne od integracji i iPSC od dwóch pacjentów niosących różne typy mutacji homozygotycznych i wykazaliśmy, że homozygotyczne mutacje i wykazaliśmy, że te iPSC są pluripotencjalne i mają normalny kariotyp. kariotyp. Wykazaliśmy, że proces korekcji nie wygenerował mutacji wywołanych przez TALEN przez sekwencjonowanie. Co ważniejsze, skorygowane geny β-Thal iPS od każdego pacjenta mogą być indukowane do różnicowania w hematopoetyczne komórki progenitorowe, a następnie do erytroblastów wyrażających normalną β-globinę. Nasze badania zapewniają skuteczną i uniwersalną strategię korekcji różnych typów mutacji β-globiny w β-Thal iPSCs dla modelowania i zastosowań choroby modelowania i zastosowań. --- TŁO: Nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) pojawiły się jako narzędzie umożliwiające ukierunkowaną edycję i zakłócanie genów w trudnych systemach, takich jak ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC). Modułowa architektura efektorów TAL teoretycznie umożliwia ukierunkowanie dowolnego locus genomowego i kilka systemów klonowania do niestandardowego montażu TALEN zostało niedawno TALEN. Brakuje jednak wszechstronnych systemów ekspresji TALEN mających zastosowanie do hPSC. WYNIKI: Tutaj rozszerzamy istniejący system montażu TALE o podwójny zestaw wektorów ekspresji wektorów ekspresyjnych dla efektywnego zastosowania technologii TALEN w hPSC. Charakteryzuje się to charakteryzuje się ulepszoną architekturą TALEN, a także odpornością na antybiotyki i fluorescencyjnymi kasetami reporterowymi, umożliwiając w ten sposób wzbogacenie transfekowanych komórek komórek. Ulepszona funkcjonalność połączonego systemu została zademonstrowana przez ukierunkowane zakłócenie genu HPRT1 w celu stworzenia izogenicznych modeli choroby zespołu Lescha-Nyhana. Używając żeńskich hPSC, homozygotyczne zaburzenie HPRT1 wystąpiło z wydajnością do 15%. Różnicowanie izogenicznych komórek knock-out zarówno do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), jak i do neuronów czuciowych odtworzyło wcześniej opisane fenotypy oparte na indukowanych PSC specyficznych dla pacjenta PSC i rozszerzyło te odkrycia odpowiednio na neurony spoza OUN. WNIOSEK: Połączony system wektorowy pozwala na elastyczne i niedrogie generowanie znokautowanych linii hPSCs, umożliwiając w ten sposób badanie procesów rozwojowych, a także generowanie izogenicznych modeli chorób bez konieczności stosowania materiału pochodzącego od pacjenta. --- Nasza zdolność do precyzyjnego i wydajnego edytowania genomów ssaków i roślin została znacznie poprawiona w ostatnich latach, częściowo ze względu na rosnące wykorzystanie nukleaz, które rozpoznają wcześniej ustaloną sekwencję DNA, dokonują specyficznej dwuniciowe DNA i stymulują celowanie w geny. Para nukleaz z palcem cynkowym nukleaz z palcem cynkowym (ZFN) lub nukleaz efektorowych podobnych do aktywatorów transkrypcji (TALEN) które rozpoznają dwie sąsiadujące unikalne sekwencje DNA, dimeryzują przez połączoną domenę nukleazy FokI i przecinają w środku docelowe sekwencje DNA. Opisujemy tutaj że zwiększenie długości rozpoznawanych sekwencji DNA przez TALEN lub ZFN niekoniecznie niekoniecznie przekłada się na wyższą wydajność lub specyficzność. Odkryliśmy również że jedna podjednostka ZFN i jedna podjednostka TALEN mogą tworzyć parę hybrydowych nukleaz o rozszerzonej specyficzności. nukleazy hybrydowe o rozszerzonej specyficzności dla dwóch różnych celów i stymulować celowanie w geny w wielu typach komórek, w tym w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPS) z lepszą wydajnością.
Czy TALEN jest używany na komórkach macierzystych?
Tak, TALEN jest używany na komórkach macierzystych do edycji genomu.