CEL: Dystrofie pręcikowe, stożkowe, stożkowo-pręcikowe i plamkowe ostatecznie powodują śmierć komórek fotoreceptorów stożka. Niniejsze badanie bada środki hamowania apoptozy oprócz indukowania specyficznego szlaku apoptotycznego w obrębie linii komórkowej pochodzącej z fotoreceptorów. METODY: Hodowla komórek siatkówki pochodzących z fotoreceptorów mysich 661W została wykorzystano do oceny wpływu zarówno syntetycznego peptydowego inhibitora kaspaz (benzyloksykarbonylo-Val-Ala-DL-Asp-[Ome] fluorometyloketon [Z-VAD.FMK]) i naturalnego inhibitora naturalny inhibitor, bakulowirus p35. Ponadto, wpływ transfekcji Fas-associated death domain (FADD), białka komórkowego związanego z apoptozą indukowaną przez receptor apoptozę indukowaną przez receptor. Testy przeprowadzono przez przejściową transfekcję hodowli komórkowych, a wyniki rejestrowano poprzez zliczanie komórek, Western blot i spektrofotometrię. WYNIKI: Analiza Western blot i chromogenne rozszczepienie substratu kaspazy potwierdziły aktywację kaspaz w komórkach 661W. Przy stężeniu stężeniu 80 mikro M, Z-VAD.FMK, przeżyło 72,36% +/- 0,93% komórek 661W przeżyło atak cytotoksyczny w porównaniu z 6,99% +/- 1,35% komórek kontrolnych. Transfekcja przejściowa transfekcja 1200 ng bakulowirusa p35 zapewniła ochronę na poziomie 75,30% +/- 4,23%, w porównaniu z 19,61% +/-1,84% komórek kontrolnych, a dodatkowo zaobserwowano, że zaobserwowano, że zaledwie 50 ng transfekcji FADD było w stanie wywołać śmierć śmierć 53,21% +/- 1,33% komórek w hodowlach 661W. WNIOSKI: Apoptotyczna śmierć komórek w komórkach 661W jest zależna od kaspaz i może być hamowana zarówno syntetycznym, jak i naturalnym inhibitorem funkcji kaspaz. Ponadto, komórki 661W są wysoce wrażliwe na białko FADD, co może sugerować szereg nowych podejść terapeutycznych do zatrzymania apoptozy komórek fotoreceptorów. fotoreceptorów. --- Kaspazy (zawierające cysteinę proteazy specyficzne dla asparaginianu) są rdzeniem mechanizmu samobójczego komórki. Enzymy te, po aktywacji, demontują komórkę poprzez selektywne rozszczepianie kluczowych białek po resztach asparaginianowych. Zdarzenia kończące się aktywacją kaspaz są przedmiotem intensywnych badań z powodu ich rolę w chorobach nowotworowych, neurodegeneracyjnych i autoimmunologicznych. Tutaj przedstawiamy mechanistyczny model matematyczny, sformułowany na podstawie nowo nowych informacji, opisujący kluczowe elementy aktywacji kaspaz za pośrednictwem receptorów i i indukowanej stresem aktywacji kaspaz. Wykorzystaliśmy zasady zachowania masy w w połączeniu z kinetycznymi prawami szybkości do sformułowania zwykłych równań różniczkowych które opisują czasową ewolucję aktywacji kaspaz. Jakościowe strategie zapobiegania aktywacji kaspaz są symulowane i porównywane z danymi eksperymentalnymi. Pokazujemy, że przewidywania modelu są zgodne z dostępnymi informacjami. W ten sposób model może pomóc w lepszym zrozumieniu aktywacji kaspazy aktywacji kaspaz i identyfikacji podejść terapeutycznych promujących lub opóźniających apoptotyczną śmierć komórki. --- Członkowie rodziny kaspaz proteaz cysteinowych koordynują morfologiczne i i biochemiczne zdarzenia, które charakteryzują apoptozę. Jednak neutralizacja aktywności kaspaz u ssaków nie blokuje śmierci w odpowiedzi na większość bodźców proapoptotycznych. proapoptotyczne. Dzieje się tak dlatego, że wiele czynników wywołujących śmierć komórki dysfunkcję przed aktywacją kaspaz w wyniku otwarcia kanału BAX/BAK. BAX/BAK. Chociaż genetyczna lub farmakologiczna inaktywacja kaspaz w większości przypadków nie w większości przypadków nie blokuje śmierci komórkowej, ale przekształca fenotyp z apoptozy do nekrozy. Ma to istotne implikacje dla sposobu, w jaki układ odpornościowy reaguje na takie komórki. na takie komórki, ponieważ komórki nekrotyczne wywołują stan zapalny, podczas gdy komórki apoptotyczne zazwyczaj nie. Tutaj proponujemy alternatywne spojrzenie na związaną z apoptozą funkcję kaspaz, sugerując, że proteazy te są aktywowane nie w celu zabicia, ale w celu wygaszenia prozapalnych właściwości umierających komórek. umierających komórek. Perspektywa ta ujednolica rodzinę kaspaz ssaków jako pozytywne lub negatywne regulatory stanu zapalnego. --- Zdefiniowaliśmy niektóre z mechanizmów, dzięki którym inhibitor kinazy lapatynib zabija komórki HCT116. Lapatynib hamował indukowaną promieniowaniem aktywację ERBB1/2, kinaz regulowanych sygnałem pozakomórkowym 1/2 i AKT oraz radiosensybilizował komórki HCT116 komórki. Długotrwała inkubacja komórek HCT116 z lapatynibem powodowała zabijanie komórek a następnie wzrost komórek przystosowanych do lapatynibu. Zaadaptowane komórki były odporne na zabijanie komórek wywołane głodzeniem surowicy i były krzyżowo odporne na wiele leków terapeutycznych. leki terapeutyczne. Lapatynib był kompetentny do hamowania podstawowego i naskórkowego czynnika wzrostu czynnika wzrostu naskórka (EGF) w adaptowanych komórkach. Koekspresja dominująco-ujemnego ERBB1 i dominująco-ujemnego ERBB2 hamowała podstawową i EGF fosforylację ERBB1 i ERBB2 w komórkach rodzicielskich i adaptowanych. Jednak ani w komórkach rodzicielskich, ani zaadaptowanych ekspresja dominująco-ujemna ERBB1 i dominująco-ujemna ERBB2 odtworzyła komórkę promujące śmierć komórek działanie lapatynibu. Zaadaptowane komórki miały zwiększoną ekspresję MCL-1, zmniejszoną ekspresję BAX i zmniejszoną aktywację BAX i BAK. Nadekspresja BCL-XL chroniła komórki rodzicielskie przed toksycznością lapatynibu. Znokautowanie ekspresji MCL-1 zwiększyło toksyczność lapatynibu w zaadaptowanych komórkach, którą była odwracana przez obniżenie ekspresji BAK. Zahamowanie funkcji kaspazy umiarkowanie zmniejszało toksyczność lapatynibu w komórkach macierzystych, podczas gdy knockdown ekspresji czynnika indukującego apoptozę ekspresji czynnika indukującego apoptozę tłumiło toksyczność lapatynibu. Tak więc, w komórkach HCT116, adaptacja lapatynibu może być pośredniczona przez zmienioną ekspresję białek pro- i antyapoptotycznych. i antyapoptotycznych białek, które utrzymują funkcję mitochondriów. --- Kaspazy, początkowo zidentyfikowane jako rodzina proteaz regulujących śmierć komórki, stwierdzono, że pełnią one również funkcje nieapoptotyczne. Niektórzy członkowie rodziny są mają kluczowe znaczenie dla pośredniczenia w zaprogramowanej śmierci komórki w rozwoju. Po rozwoju, kaspazy są regulowane w dół w układzie nerwowym, ale nadal pełnią ważne funkcje nieapoptotyczne istotne dla neurogenezy i plastyczności synaptycznej. plastyczności synaptycznej. W chorobach neurodegeneracyjnych, w których nieprawidłowa śmierć neuronów jest cechą wyróżniającą neuronów, obserwuje się wzrost aktywności kaspaz. Specyficzne szlaki śmierci kaspaz prowadzące do dysfunkcji i śmierci nadal nie zostały w pełni wyjaśnione, pomimo wielu w pełni wyjaśnione, pomimo mnóstwa literatury naukowej poświęconej tym zagadnieniom. zagadnień. W tym rozdziale przedstawimy aktualną wiedzę na temat szlaków aktywacji i aktywności kaspaz szlaków aktywacji i aktywności kaspaz, aktualne narzędzia do badania kaspaz oraz funkcje kaspaz w układzie nerwowym w zdrowiu i chorobie. Choroba Alzheimera, najczęstsze zaburzenie neurodegeneracyjne i niedokrwienie mózgu, najczęstsza przyczyna chorób układu nerwowego. niedokrwienie mózgu, najczęstsza przyczyna śmierci neurologicznej, są wykorzystywane do zilustrowania naszego obecne zrozumienie sygnalizacji śmierci w chorobach neurodegeneracyjnych. Lepsze zrozumienie funkcjonowania kaspaz w zdrowiu i chorobie zapewniłoby odpowiednie cele dla rozwoju interwencji terapeutycznych w tych chorobach. dla tych chorób. Życie i śmierć są ściśle regulowane na poziomie komórkowym poziomie komórkowym, od rozwoju do dojrzałości. Podczas rozwoju, śmierć neuronów jest głównym czynnikiem kształtującym układ nerwowy. Ta śmierć to głównie apoptoza, w której pośredniczy kaspaza. Gdy fale śmierci rozwojowej miną (śmierć następuje w różnym czasie w różnych częściach układu nerwowego), następuje regulacja w dół mechanizmu śmierci, ponieważ neurony postmitotyczne powinny żyć przez całe życie organizmu. Nieprawidłowa śmierć neuronów jest główną częścią zaburzeń neurodegeneracyjnych, ale nadal nie ma jasnego zrozumienia procesów prowadzących do fenotypów różnych chorób. Nawet rodzaj nawet rodzaj śmierci, który występuje, jest nadal przedmiotem dyskusji, niezależnie od tego, czy jest to śmierć apoptotyczna, czy jest to śmierć apoptotyczna, nekrotyczna lub autofagiczna, czy też jakaś kombinacja tych mechanizmów śmierci. Tutaj omówimy rolę, jaką kaspazy odgrywają w funkcjonowaniu, dysfunkcji i śmierci neuronów, i śmierci. Najpierw omówimy regulację aktywacji i aktywności kaspaz. aktywności. Przeanalizujemy obecne zrozumienie funkcji kaspaz w rozwojowej śmierci neuronów, a następnie zilustrujemy rolę kaspaz w śmierci neuronów w chorobie, wykorzystując dwie choroby związane z utratą neuronów, chorobę Alzheimera Alzheimera (AD), która jest najczęstszym przewlekłym zaburzeniem neurodegeneracyjnym, oraz niedokrwienie mózgu / udar mózgu, trzecia najczęstsza przyczyna śmierci w zachodnim jest ostrym zaburzeniem neuronalnym z przewlekłymi następstwami. --- Zaprogramowana śmierć komórki lub apoptoza jest wymagana do modelowania i rozwoju organizmów wielokomórkowych. rozwoju organizmów wielokomórkowych. Jednakże, apoptoza jest trudnym procesem do zmierzenia, ponieważ martwe komórki są szybko degradowane przez ich sąsiadów w ciągu kilku godzin. Zdarzenia po aktywacji kaspazy, które określają czy komórka ulegnie apoptozie, pozostają nieuchwytne. Tutaj donosimy, że specyficzne dla apoptozy zdarzenia jądrowe, które występują przed fragmentacją DNA, mogą być poprzez monitorowanie statusu histonu H1. Zarówno u ssaków, jak i Drosophila, umierające komórki nie były znakowane immunologicznie przeciwciałem monoklonalnym anty-H1, AE-4. AE-4. Obrazowanie w czasie rzeczywistym aktywacji kaspaz i dynamiki H1 w komórkach nerwowych ssaków w komórkach nerwowych ssaków ujawniło, że H1 zmienił swoją lokalizację w jądrze po aktywacji kaspaz. Ponadto, czas tej ponownej lokalizacji był w dużej mierze zależał od zastosowanego bodźca apoptotycznego. Na podstawie wzorów barwienia AE-4 i przeciwciał przeciwko aktywnej kaspazie-3, komórki przechodzące od aktywacji aktywacji kaspazy do apoptotycznej zmiany H1 można zidentyfikować jako komórki H1-dodatnie aktywowane przez kaspazę, dostarczając nowego kryterium dla wczesnej apoptozy oraz umożliwiając scharakteryzowanie komórek aktywowanych kaspazą w tkankach. Na podstawie na podstawie tych wzorców barwienia stwierdziliśmy, że wiele neuronów węchowych w rozwijającym się nabłonku węchowym myszy wykazywało trwałą aktywność kaspazy bez zmiany H1, co sugeruje unikalną funkcję kaspazy w tych neuronach. --- Wykazano, że retinoidy są klinicznie użyteczne w terapii biologicznej niektórych nowotworów złośliwych szpiku i komórek T, podczas gdy CD20 okazał się być skutecznym celem w immunoterapii chłoniaków B-komórkowych. Zarówno pochodne kwasu retinowego pochodne kwasu retinowego, jak i przeciwciała monoklonalne anty-CD20 również indukują apoptozę złośliwych komórek in vitro. Uważa się, że apoptoza indukowana retinoidami pośredniczy wiązanie jądrowego receptora retinoidowego i aktywacja transkrypcji, podczas gdy ligacja CD20 wydaje się inicjować przezbłonowy napływ Ca(2+) z wynikającą z tego zaprogramowaną śmiercią komórki. W tym raporcie oceniamy in vitro działanie N-(4-hydroksyfenylo) retinamidu (4-HPR) z i bez przeciwciał anty-CD20 w liniach chłoniaków B-komórkowych. Wykazaliśmy, że 4-HPR hamuje wzrost złośliwych komórek B poza kwasem all-trans-retinowym i kwasem 13-cis-retinowym. kwas 13-cis-retinowy. Pokazujemy również, że to hamowanie wzrostu za pośrednictwem 4-HPR jest można przypisać apoptozie, jest spójne w różnych złośliwych liniach komórek B (Ramos, Ramos AW, SU-DHL4 i Raji), osiąga szczyt po 96 do 144 godzinach i jest osiągalny przy stężeniach tak niskich jak 2 mikroM. Podobnie jak w przypadku apoptozy, w której pośredniczy CD20 apoptoza, pokazujemy, że ostatnia wspólna ścieżka obejmuje aktywację kaspaz którą można zablokować za pomocą 2-val-Ala-Asp-fluorometyloketonu (z-VAD), specyficznego inhibitor funkcji kaspaz. Koinkubacja stężenia 2 mikroM 4-HPR i przeciwciał anty-CD20 rytuksymab i tositumomab wykazywały ponadaddytywny wzrost poziomów indukcji apoptozy o 24% (P = 0,009) i 42% (P = 0,0019) w stosunku do oczekiwanych poziomów addytywnych tych samych środków. Te wyniki in vitro sugerują, że potencjalna synergia in vivo tych dobrze tolerowanych leków może zwiększyć wcześniej wykazaną aktywność kliniczną przeciwciał monoklonalnych anty-CD20 w leczeniu nowotworów złośliwych z komórek B. --- Wcześniejsze badania dowodziły, że zwiększona aktywność receptora naskórkowego czynnika wzrostu receptora czynnika wzrostu naskórka (EGFR) i szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) może promować przeżycie komórek nowotworowych w odpowiedzi na obrażenia cytotoksyczne. W tym badaniu, zbadaliśmy wpływ sygnalizacji MAPK na przeżycie pierwotnych hepatocytów narażonych na niskie stężenia kwasu dezoksycholowego (DCA, 50 mikroM). Leczenie hepatocytów z DCA spowodowało aktywację MAPK, która była zależna od ligandu niezależnej aktywacji EGFR i sygnalizacji przez Ras i PI(3) kinazę. Ani hamowanie samej sygnalizacji MAPK przez inhibitory MEK1 / 2, ani ekspozycja na sam DCA, zwiększała podstawową apoptozę hepatocytów, podczas gdy hamowanie aktywacji MAPK indukowanej przez DCA spowodowało około 25% apoptozę w ciągu 6 godzin. Podobne dane uzyskano również, gdy dominująco ujemny EGFR-CD533 lub Ras N17 zostały użyte do zablokowania aktywacji MAPK. Wywołana przez DCA apoptoza korelowała z sekwencyjnym rozszczepieniem prokaspazy 8, BID, prokaspazy 9 i prokaspazy 3. Hamowanie MAPK nasilało apoptozę indukowaną kwasami żółciowymi w hepatocytach ze zmutowanym ligandem FAS, ale nie nasilało się w hepatocytach, które były pozbawione ekspresji receptora FAS. Dane te dowodzą, że DCA powoduje niezależną od ligandu aktywację receptora FAS w celu stymulacji odpowiedzi apoptotycznej. odpowiedź, której przeciwdziała wzmocniona niezależna od ligandu sygnalizacja EGFR/MAPK sygnalizacja. Zgodnie z zabijaniem komórek za pośrednictwem FAS, hamowanie funkcji kaspazy za pomocą dominującego ujemnego białka związanego z Fas z domeną śmierci domeny śmierci, inhibitora kaspazy 8 (Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilid [IETD]) lub dominująca ujemna prokaspaza 8 blokowała nasilenie apoptozy indukowanej kwasem żółciowym apoptozę. Zahamowanie sygnalizacji MAPK indukowanej kwasem żółciowym zwiększyło rozszczepienie BID i uwalnianie cytochromu c z mitochondriów, które zostały zablokowane przez IETD. Pomimo aktywacji kaspazy 8, ekspresja dominującej ujemnej prokaspazy 9 blokowała rozszczepienie prokaspazy 3 i nasilenie apoptozy indukowanej przez DCA. apoptozę. Leczenie hepatocytów DCA przejściowo zwiększało ekspresję białek hamujących kaspazę białek hamujących kaspazę 8 c-FLIP-(S) i c-FLIP-(L), które były redukowane przez hamowanie MAPK lub kinazy PI(3). Konstytutywna nadekspresja c-FLIP-(s) znosiła nasilenie apoptozy indukowanej kwasami żółciowymi. Podsumowując, nasze dane dowodzą, że utrata funkcji szlaku EGFR / Ras / MAPK indukowanej przez DCA nasila stymulowaną przez DCA śmierć komórek hepatocytów indukowaną przez FAS poprzez zmniejszenie ekspresji izoform c-FLIP. --- Autofagiczna zaprogramowana śmierć komórki występuje podczas rozwoju różnych grup zwierząt. ale mechanizmy kontrolujące tę genetycznie regulowaną formę zabijania komórek są słabo poznane. zabijania komórek są słabo poznane. Badania genetyczne nad degradacją białek u drożdży drożdży dostarczyły ważnych postępów w naszym zrozumieniu autofagii i Ostatnie badania autofagicznej śmierci komórek Drosophila sugerują, że niektóre z tych mechanizmów mogą być zachowane. te mechanizmy mogą być zachowane. U Drosophila kilka genów regulowanych przez steroidy geny kodujące regulatory transkrypcji są wymagane do autofagicznej śmierci komórki. śmierci. Wydaje się, że te regulatory transkrypcji aktywują dużą liczbę genów które odgrywają bardziej bezpośrednią rolę w zabijaniu komórek, w tym geny funkcjonujące w apoptozie, takie jak kaspazy. Podczas gdy funkcja kaspaz jest wymagana do autofagicznej śmierci komórek autofagicznej podczas rozwoju Drosophila, geny kodujące białka, które są podobne do regulatorów autofagii drożdży są również indukowane w umierających gruczołach ślinowych. gruczołach ślinowych. Ponadto, liczne proteazy niekaspazowe, cytoplazmatyczne czynniki organizujące czynniki, cząsteczki sygnalizacyjne i nieznane czynniki ulegają ekspresji w interesujących podczas autofagicznej śmierci komórek. W tym artykule dokonano przeglądu aktualnej wiedzy na temat regulacji autofagicznej zaprogramowanej śmierci komórki podczas rozwoju Drosophila. rozwoju Drosophila. --- Uważa się, że przyspieszona utrata nabłonka płuc poprzez aktywację zewnątrzpochodnej apoptozy Uważa się, że apoptoza odgrywa przyczynową rolę w patogenezie płuc. Poprzednie badania wykazały, że cynk jest niezbędny do utrzymania żywotności komórek nabłonka płuc żywotności komórek nabłonka płuc w warunkach stresu i że niedobór wewnątrzkomórkowego cynku predysponuje komórki do apoptozy. W tym badaniu ustaliliśmy, czy wewnątrzkomórkowy niedobór cynku zwiększa podatność pierwotnych, zróżnicowanych kultur ludzkiego nabłonka płuc na apoptozę, w której pośredniczy receptor śmierci apoptozę, prowadzącą do dysfunkcji bariery. Kultury uzyskane od wielu dawców były narażone na bodźce wywołujące apoptozę, w której pośredniczy receptor śmierci i pozbawiono wewnątrzkomórkowego cynku za pomocą specyficznego dla cynku czynnika chelatującego. Zmierzono opór przezbłonowy, transport parakomórkowy, aktywność kaspazy-8 i kaspazy-3 oraz apoptozę. oraz apoptozę. Aktywacja apoptozy zewnątrzpochodnej lub sama chelatacja cynku spowodowała nominalny wzrost funkcji kaspaz i apoptozy bez większych dowodów na zaburzenie bariery. bez większych dowodów na zakłócenie bariery. Aktywacja apoptozy zewnątrzpochodnej w połączeniu z niedoborem cynku spowodowała gwałtowny spadek oporności przezbłonkowej odporność, znaczny wzrost apoptozy i zwiększony wyciek parakomórkowy. parakomórkowego. Hodowle zostały uratowane przez suplementację siarczanem cynku. Dalsza analiza wykazała, że egzogenny cynk ułatwia przeżycie komórek poprzez aktywację szlaku sygnałowego kinazy fosfatydyloinozytolu 3/Akt. My że wewnątrzkomórkowy cynk jest istotnym czynnikiem w nabłonku płuc, który chroni komórki przed apoptozą za pośrednictwem receptorów śmierci i dysfunkcją bariery. --- Czynnik jądrowy kappaB (NFkappaB) reguluje ekspresję różnych genów niezbędnych do przeżycia komórek. Tutaj pokazujemy, że tłumienie importu jądrowego NFkappaB importu jądrowego za pomocą peptydu SN50 niosącego sekwencję lokalizacji jądrowej (NLS) podjednostki NFkappaB p50 indukuje apoptozę w ludzkich limfocytach T (T-PBL), którą można zablokować za pomocą inhibitora pan-kazpazy Z-VAD.fmk. Jednakże, nawet gdy funkcja kaspazy jest zablokowana, dodanie SN50 indukuje nieodwracalną utratę komórek z powodu zmniejszenia mitochondrialnego potencjału transmembranowego potencjału transmembranowego mitochondriów (DeltaPsim), po którym następuje przerwanie błony komórkowej, cechy charakterystyczne martwicy. Obserwacje te pokazują, że chociaż hamowanie translokacji jądrowej NFkappaB przez peptyd SN50 może indukować zależną od kaspazy apoptozę w T-PBL, śmierć komórki może nadal postępować przy braku funkcjonalnej aktywności kaspazy. aktywności kaspaz. Dostępność dalszych kaspaz wydaje się determinować tryb śmierci komórkowej w komórkach z defektem NFkappaB. --- Pierwsza proapoptotyczna kaspaza, CED-3, została sklonowana z Caenorhabditis elegans w 1993 roku i wykazano, że jest ona niezbędna do śmierci rozwojowej wszystkich komórek somatycznych. 1993 roku i wykazano, że jest niezbędna do śmierci rozwojowej wszystkich komórek somatycznych. Po odkryciu CED-3, kaspazy zostały sklonowane z kilku gatunków gatunków kręgowców i bezkręgowców. Jak opisano w innych artykułach w tym wydaniu Cell Death and Differentiation, wiele kaspaz funkcjonuje w szlakach nieapoptotycznych. szlakach. Jednakże, jak wynika z badań przeprowadzonych na robakach, ewolucyjnie ewolucyjnie zachowaną rolą kaspaz jest wykonywanie zaprogramowanej śmierci komórki. W tym artykule, skupię się w szczególności na kaspazach, które funkcjonują głównie w procesie śmierci komórki. W szczególności, fizjologiczna funkcja kaspaz w apoptozie jest na przykładzie robaków, much i ssaków. --- Apoptoza zależy od aktywacji kaspaz prowadzącej do rozszczepienia substratu i ostatecznie do śmierci komórki. Chociaż jest to wymagane dla fenotypu apoptotycznego, to stało się oczywiste, że komórki często umierają nawet wtedy, gdy funkcja kaspazy jest zablokowana. Proces ten, określany jako niezależna od kaspaz śmierć komórki (CICD), występuje w odpowiedzi na odpowiedzi na większość wewnętrznych sygnałów apoptotycznych, pod warunkiem, że nastąpiła permeabilizacja zewnętrznej błony mitochondrialnej. nastąpiła permeabilizacja błony zewnętrznej mitochondriów. Ligacja receptora śmierci może również wywołać formę CICD określaną jako nekroptoza. W niniejszym przeglądzie zbadamy molekularne mechanizmy molekularne rządzące CICD, podkreślimy ostatnie odkrycia wykazujące powrót do zdrowia po CICD i omówimy potencjalne patofizjologiczne funkcje tych procesów. procesów. --- Kaspazy są wewnątrzkomórkowymi proteazami, które propagują zaprogramowaną śmierć komórki, proliferację i stany zapalne. Aktywacja kaspaz zachodzi poprzez konserwatywny mechanizm mechanizm podlegający ścisłej regulacji komórkowej. Po aktywacji przez określony bodziec bodziec, kaspazy wykonują ograniczoną proteolizę dalszych substratów, aby wyzwalają kaskadę zdarzeń, która kończy się pożądaną odpowiedzią biologiczną. Wiele dowiedzieliśmy się o mechanizmach rządzących aktywacją i regulacją kaspaz. i regulację kaspaz, a niniejszy mini-przegląd zawiera aktualizację tych obszarów. Wyznaczamy również istotne luki w wiedzy na temat funkcji kaspaz, które można można podejść za pomocą technik i paradygmatów eksperymentalnych, które są obecnie obecnie rozwijane. --- Proteazy specyficzne dla asparaginianu cysteinylu (kaspazy) zostały zidentyfikowane jako kluczowych graczy w procesie komórkowym określanym jako zaprogramowana śmierć komórki lub apoptoza. Podczas apoptozy, aktywowane kaspazy apoptotyczne rozszczepiają wybrane białka docelowe w celu wykonania śmierci komórki. Oprócz ich ustalonej funkcji w śmierci komórki, wiele ostatnich publikacji dostarczyło coraz więcej dowodów na to, że że kaspazy apoptotyczne uczestniczą również w kilku nieapoptotycznych procesach komórkowych. Aktywowane kaspazy wykazują funkcje podczas proliferacji komórek T i regulacji cyklu komórkowego. komórkowego, ale są również zaangażowane w różnicowanie różnorodnych typów komórek. typów komórek. W niektórych typach komórek, ich różnicowanie może być morfologicznie postrzegane jako rodzaj niekompletnej apoptozy. Analiza dobrze znanych apoptotycznych apoptotycznych kaspaz sugeruje, że rozszczepienie ograniczonej liczby wybranych substratów substratów odgrywa główną rolę w nieapoptotycznych funkcjach kaspaz. Selektywne rozszczepianie substratów może być regulowane przez aktywację czynników antyapoptotycznych czynników antyapoptotycznych, poprzez przedziałową aktywację kaspaz lub poprzez ograniczoną aktywność kaspaz podczas apoptozy. aktywność kaspaz podczas funkcji niezależnych od apoptozy. Coraz więcej dowodów dowodów na funkcję kaspaz w nieapoptotycznych zdarzeniach komórkowych sugeruje, że że kaspazy odgrywają znacznie bardziej zróżnicowaną rolę niż wcześniej zakładano. --- Apoptoza ma kluczowe znaczenie dla homeostazy organizmu i wielu różnych chorób. Kaspazy są ostatecznymi wykonawcami szlaku apoptotycznej zaprogramowanej śmierci komórki. apoptotycznej. Ponieważ kaspazy odgrywają tak kluczową rolę w apoptozie, istnieje znaczne zapotrzebowanie na technologie zapotrzebowanie na technologie monitorowania funkcji kaspaz. Niedawno opracowaliśmy aktywowany przez kaspazę reporter GFP (CA-GFP). CA-GFP jest wyjątkowy ze względu na swój "ciemny" stan w którym dojrzewanie chromoforu GFP jest hamowane przez obecność peptydu C-końcowego peptydu. Tutaj pokazujemy, że dojrzewanie chromoforu jest uniemożliwione ponieważ CA-GFP nie fałduje się w solidną β-beczkę GFP, dopóki peptyd został rozszczepiony przez aktywną kaspazę. Zarówno CA-GFP, jak i GFP₁₋₁₀ , rozszczepiona forma GFP pozbawiona 11. nici, mają podobną strukturę drugorzędową, różną od dojrzałego GFP. Podobna podatność na trawienie proteolityczne wskazuje, że że ta wspólna struktura nie jest solidną, w pełni uformowaną β-beczką GFP. Opracowaliśmy model, który sugeruje, że gdy CA-GFP jest tłumaczony in vivo, podąża za tę samą ścieżkę składania, co GFP typu dzikiego; jednak obecność dołączonego peptydu peptydu nie pozwala CA-GFP na utworzenie beczki w pełni dojrzałego GFP. CA-GFP jest zatem utrzymywany w stanie pośrednim "pro-fałdowania" do momentu uwolnienia peptydu peptydu, pozwalając mu na kontynuowanie fałdowania do dojrzałej geometrii beczki. To nowe zrozumienie strukturalnych podstaw ciemnego stanu reportera CA-GFP umożliwi manipulowanie tym mechanizmem w rozwoju systemów reporterowych dla dowolnej liczby komórek. systemów reporterowych dla dowolnej liczby procesów komórkowych z udziałem proteaz i potencjalnie innych enzymów. i potencjalnie innych enzymów. --- Aktywacja kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) przez receptory czynnika martwicy nowotworów receptory czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF) (TNFR) jest integralną częścią plejotropowych odpowiedzi komórkowych cytokiny plejotropowych odpowiedzi komórkowych cytokin. Tutaj opisujemy różnice w wrażliwości kaspaz i aktywacji podtypu TNFR członków rodziny ERK. Zahamowanie funkcji kaspaz w komórkach HeLa przez inhibitory farmakologiczne lub ekspresję CrmA (cytokine response modifier A), wirusowego białka modyfikującego, blokuje apoptozę indukowaną przez TNF lub zależną od kaspazy kinazę białkową Cdelta i degradację białka polimerazy poli(ADP-rybozy). Stymulowane przez TNFR1 lub TNFR2 c-Jun N-końcowa kinaza (JNK) była osłabiona w komórkach, w których aktywność kaspazy była hamowana przez blokery farmakologiczne lub ekspresję CrmA. Zarówno aktywność JNK stymulowana przez TNFR1, jak i TNFR2 była wrażliwa na kaspazę; jednak, tylko TNFR1 był zdolny do stymulowania kinazy białkowej aktywowanej mitogenami p42/44 (MAPK) i p38 MAPK. Stymulowane przez TNFR1 aktywności p42/44 MAPK i p38 MAPK były niewrażliwe na farmakologiczne hamowanie kaspaz lub CrmA. Te odkrycia zostały poparte podczas pomiaru indukowanej TNF cytozolowej fosfolipazy A (2) która jest celem dla MAPK i p38 MAPK. Profilowanie enzymów kaspaz aktywowanych przez TNF w komórkach HeLa wykazało sekwencyjną kaspazę 8, -3, -7, -6 i -9, z ich charakterystyką hamowania sugerującą rolę rolę kaspazy-3 i/lub kaspazy-6 w modulowaniu aktywności JNK. Podsumowując wyniki te wskazują na określone szlaki aktywacji ERK stosowane przez podtypy TNFR. --- Badania nad apoptozą pokazują, że chociaż wiele obwodów regulacyjnych obwodów kontrolujących zaprogramowaną śmierć komórki może się różnić, podstawowe elementy "silnika apoptotycznego" są szeroko konserwowane. Dlatego też badania w mniej złożonych systemach modelowych, takich jak nicienie i muchy, powinny nadal mieć głęboki wpływ na nasze zrozumienie tego procesu. Niniejszy przegląd bada geny i cząsteczki, które kontrolują apoptozę u Drosophila. Induktory śmierci Reaper, Grim i Hid przekazują sygnały, prawdopodobnie poprzez IAP (inhibitor apoptozy białka apoptozy) i Dark (homolog Apaf-1/Ced-4), aby uruchomić funkcję kaspazy. Ten model zwierzęcy obiecuje dalszy wgląd w determinanty śmierci komórek w "naturalnie występujących" i śmierci komórek w "naturalnie występujących" i patologicznych kontekstach. --- Kaspazy to proteazy cysteinowe, które są niezbędne do dojrzewania cytokin i apoptozy. apoptozy. Aby ułatwić analizę funkcji kaspaz in vitro i in vivo, zsyntetyzowaliśmy nieodwracalne inhibitory kaspaz z dołączoną biotyną poprzez ramiona łączące o różnej długości (12a-d) oraz inhibitor znakowany 2,4-dinitrofenylem (13). (13). Znakowanie powinowactwem ekstraktów apoptotycznych, a następnie blotting ujawnia, że te sondy powinowactwa wykrywają aktywne kaspazy. Wykorzystując silne powinowactwo awidyny do biotyny, wyizolowaliśmy znakowaną powinowactwem kaspazę 6 z apoptotycznych ekstraktów cytozolowych apoptotycznych ekstraktów cytozolowych komórek z nadekspresją prokaspazy 6 przez traktowanie z 12c, który zawiera biotynę przyłączoną do N(epsilon)-lizyny inhibitora inhibitora przez ramię łączące 22,5 A, a następnie oczyszczanie powinowactwa na monomerycznej na monomerycznych kulkach awidynowo-sefarozowych. Związek 13 okazał się wystarczająco przepuszczalny dla komórek, aby ratować komórki przed apoptozą. Te nowe inhibitory kaspaz powinny zapewnić potężne sondy do badania aktywnego proteomu kaspaz podczas apoptozy zarówno in vitro, jak i in vivo. --- Kaspazy to rodzina ewolucyjnie konserwowanych proteaz cysteinowych, które stanowią ramię efektorowe maszynerii apoptotycznej. Badania w Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster i myszy wskazują na ewolucyjnie zachowaną funkcję kaspaz w rozwojowo zaprogramowanej śmierci komórki u metazoanów. śmierci komórek u metazoanów. Podczas gdy u nicieni cała rozwojowa śmierć komórki jest pośredniczy pojedyncza kaspaza, u Drosophila i myszy niektóre kaspazy wydają się regulują śmierć komórki w sposób ograniczony czasowo-przestrzennie. Niniejszy artykuł przegląd tego, co obecnie wiemy na temat roli różnych kaspaz w wykonaniu rozwojowo zaprogramowanej śmierci komórki i czego można oczekiwać od przyszłych badań w tej dziedzinie. przyszłych badań w tej dziedzinie. --- Neuroblastoma jest najczęstszym pozaczaszkowym guzem litym wieku dziecięcego. Komórki typu N (reprezentowane przez linie komórkowe SH-SY5Y i IMR32) charakteryzują się fenotypem neuronalnym. charakteryzują się fenotypem neuronalnym. Linie komórkowe typu N są zazwyczaj amplifikowane przez N-myc amplifikowane, wyrażają antyapoptotyczne białko Bcl-2 i nie wyrażają kaspazy-8. kaspazy-8. Niniejsze badanie miało na celu określenie mechanizmu, dzięki któremu komórki typu komórki typu N umierają w odpowiedzi na określone środki cytotoksyczne (takie jak cisplatyna i doksorubicyna) powszechnie stosowane w leczeniu tej choroby. Stwierdziliśmy, że komórki typu N były równie wrażliwe na cisplatynę i doksorubicynę. Jednak śmierć indukowana przez cisplatyną była hamowana przez nieselektywny inhibitor kaspaz z-Val-Ala-Asp-fluorometylketon lub specyficzny inhibitor kaspazy-9 N-acetylo-Leu-Glu-His-Asp-aldehyd, podczas gdy w przeciwieństwie do tego, hamowanie kaspazy nie nie zapobiegało śmierci indukowanej doksorubicyną. Ani reaktywne formy tlenu, ani mitochondrialne przejście przepuszczalności wydaje się odgrywać ważną rolę w tym procesie. w tym procesie. Doksorubicyna indukowała aktywację transkrypcji NF-kappa B w powiązaniu z w połączeniu z degradacją I-kappa B alfa przed utratą żywotności komórek. Co zaskakujące, przeciwutleniacz i inhibitor NF-kappa B pirolidyna blokował indukowaną doksorubicyną aktywację transkrypcji NF-kappa B i zapewniał głęboką ochronę przed doksorubicyną. i zapewniał głęboką ochronę przed zabijaniem doksorubicyną. Co więcej, komórki SH-SY5Y wyrażające super-represyjną formę I-kappa B były całkowicie odporne na działanie doksorubicyny. Wszystkie te odkrycia pokazują, że aktywacja NF-kappa B pośredniczy w śmierci komórek indukowanej doksorubicyną bez dowodów funkcji kaspaz i sugerują, że cisplatyna i doksorubicyna angażują różne szlaki śmierci w celu zabicia komórek neuroblastoma. --- Wpływ ekspresji fragmentów ludzkiej huntingtyny zawierających poliglutaminę (polyQ) o różnej długości oceniano w neuronach czuciowych Caenorhabditis elegans ASH u młodych i starych zwierząt. Ekspresja fragmentu huntingtyny zawierającego odcinek polyQ o długości 150 reszt (Htn-Q150) prowadziła do postępującej neurodegeneracji ASH neurodegeneracji, ale nie powodowała śmierci komórek. Obserwowano postępującą śmierć komórek i zwiększoną neurodegenerację zaobserwowano w neuronach ASH, które koeksprymowały Htn-Q150 i podprogową dawkę toksycznego OSM-10::zielone białko fluorescencyjne (OSM-10::GFP). Fragmenty białka huntingtyny Htn-Q150 tworzyły w neuronach ASH, a liczba neuronów ASH zawierających agregaty wzrastała wraz z wiekiem zwierząt. agregaty wzrastała wraz z wiekiem zwierząt. Śmierć komórek neuronalnych ASH wymagała funkcji kaspazy ced-3 wskazując, że obserwowana śmierć komórek jest apoptotyczna. Co ciekawe ced-3 odgrywał kluczową rolę w neurodegeneracji za pośrednictwem Htn-Q150 ale nie w neurodegeneracji ASH za pośrednictwem OSM10::GFP. Funkcja ced-3 była ważna, ale nie niezbędna do tworzenia ważna, ale nie niezbędna do tworzenia agregatów białkowych. Wreszcie, testy behawioralne wykazały, że neurony ASH, koeksprymujące Htn-Q150 i OSM10::GFP, były funkcjonalnie upośledzone na 3 dni przed wykryciem neurodegeneracji, śmierci komórek i agregatów białkowych. --- Kaspazy są kluczowymi efektorami apoptozy, procesu zaprogramowanej śmierci komórek. śmierci komórki. Jednakże, wiele ostatnich prac wykazało, że aktywność kaspaz jest niezbędna dla kilku nieapoptotycznych funkcji komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie, przeżycie i regulacja ekspresji cytokin. W niniejszym W niniejszym przeglądzie koncentrujemy się na nieapoptotycznych funkcjach kaspaz, a w szczególności na w szczególności na nieapoptotycznej roli kaspaz w układzie odpornościowym. Ze względu na zaangażowanie kaspaz w promowanie śmierci komórek, a także proliferację komórek i inne nieapoptotyczne funkcje. proliferacji komórek i innych funkcji nieapoptotycznych, badania obejmujące hamowanie kaspaz in vivo muszą być interpretowane z ostrożnością. --- Kaspaza-3 jest proteazą cysteinową zlokalizowaną zarówno w cytoplazmie, jak i mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej. przestrzeni międzybłonowej, która jest centralnym efektorem wielu szlaków apoptotycznych. W w komórkach spoczynkowych, podzbiór zymogenów kaspazy-3 jest S-nitrozylowany w aktywnym miejscu cysteiny cysteiny, hamując aktywność enzymu. Podczas apoptozy indukowanej przez Fas, kaspazy są denitrozylowane, umożliwiając funkcjonowanie miejsca katalitycznego. W W obecnych badaniach staraliśmy się zidentyfikować subpopulację kaspaz, która jest regulowana przez S-nitrozylację. Donosimy, że większość mitochondrialnych, ale nie cytoplazmatycznych kaspaz ale nie cytoplazmatycznych, zymogenów kaspazy-3 zawiera tę hamującą modyfikację. Ponadto Ponadto większość mitochondrialnej kaspazy-9 jest S-nitrozylowana. Te badania sugerują, że S-nitrozylacja odgrywa ważną rolę w regulacji funkcji mitochondrialnej kaspazy i że stan S-nitrozylacji danego białka białka zależy od jego lokalizacji subkomórkowej. --- Zakłócenie cytoszkieletu aktynowego wywołuje głębokie zmiany w przeżywalności komórek. i funkcji komórek. Cytoszkielet aktyny jest regulowany w sposób hierarchiczny przez GTPazy Rho. Kinaza Rho, efektor niższego rzędu RhoA, reguluje powstawanie włókien naprężeniowych i zrostów ogniskowych. Zakłócenie cytoszkieletu aktynowego powoduje apoptozę w komórkach nabłonka dróg oddechowych. Aby dokładniej zbadać związek integralności cytoszkieletu i apoptozy, przetestowaliśmy, czy zahamowanie kinazy Rho wywoła apoptozę w komórkach nabłonka dróg oddechowych. Zahamowanie za pomocą Y-27632 lub HA1077 indukowało falowanie błony i utratę włókien naprężeniowych aktyny oraz apoptozę w komórkach nabłonka dróg oddechowych, która była blokowana przez hamowanie funkcji kaspazy lub hamując syntezę białek. Komórki z nadekspresją konstytutywnie aktywną kinazę Rho, ale nie natywną kinazę Rho, były odporne na indukowane inhibitorem kinazy Rho i apoptozę. Zahamowanie kinazy Rho zaburzało włókna naprężeniowe aktyny, ale nie indukowało apoptozy w komórkach 3T3. Wykazaliśmy, że hamowanie kinazy Rho indukuje apoptozę komórek nabłonka dróg oddechowych apoptozę związaną ze zmianami w integralności włókien aktyny. Nasze dane sugerują, że że kinaza Rho może być regulatorem wczesnej inicjacji apoptozy. --- Zaprogramowana śmierć komórki odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy podczas rozwoju zwierząt. rozwoju zwierząt i została zachowana u zwierząt tak różnych jak nicienie i ludzie. Ostatnie badania nad Drosophila dostarczyły cennych informacji w kierunku naszego zrozumienia genetycznej regulacji śmierci. Różne sygnały wyzwalają nowe regulatory śmierci rpr, hid i grim, które wykorzystują ewolucyjnie konserwowane ewolucyjnie konserwowane geny iap i ark do modulowania funkcji kaspaz. Późniejsze usuwanie umierających komórek również wydaje się być realizowane przez zachowane mechanizmów. Podobieństwo między Drosophila i człowiekiem w sygnalizacji śmierci komórki ilustrują obietnicę muszek owocowych jako systemu modelowego do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw regulacji programowanej śmierci komórki. --- Apoptoza i autofagiczna śmierć komórki występują podczas rozwoju Drosophila, a Ostatnio poczyniono postępy w zakresie ich mechanizmów. Podobnie jak w innych organizmach, apoptoza jest przeprowadzana przez kaspazy. W żywych komórkach kaspazy są utrzymywane w ryzach poprzez połączenie wiązania IAP i inhibicji proteolitycznej. Gdy komórka do apoptozy, fagocyty rozpoznają je poprzez immunoreceptory podobne do białek Drapera i Simu. białek Draper i Simu i inicjują pochłanianie zwłok. Badania nad Drosophila w znacznym stopniu przyczyniły się do odkrycia, że autofagia jest wymagana dla pewnych form śmierci komórkowej i że form śmierci komórki, a funkcja kaspaz w autofagicznej śmierci komórki zależy od kontekstu komórki. od kontekstu komórkowego. Co zaskakujące, receptor pochłaniania zwłok komórkowych Draper również funkcjonuje również w autofagicznej śmierci komórki. Te postępy ułatwiają nam zrozumienie mechanizmów śmierci komórkowej w rozwoju i chorobach. --- Postępy w biologii molekularnej zapewniają możliwość opracowania szczegółowych modeli procesów biologicznych, które można wykorzystać do uzyskania zintegrowanego zrozumienia systemu. systemu. Jednak opracowanie użytecznych modeli na podstawie dostępnej wiedzy o systemie i obserwacji eksperymentalnych nadal pozostaje trudnym zadaniem. zadanie. W niniejszej pracy zaproponowano strategię identyfikacji modeli dla złożonych sieci biologicznych. sieci biologicznych. Podejście to obejmuje problem regulatora stanu (SRP), który zapewnia oszacowanie wszystkich stężeń składników i szybkości reakcji sieci przy użyciu dostępnych pomiarów. sieci przy użyciu dostępnych pomiarów. Pełny zestaw oszacowań jest do identyfikacji parametrów modelu dla sieci o znanej topologii. Opracowano test złożoności modelu a priori, który wskazuje na wykonalność proponowanego algorytmu. proponowanego algorytmu. Teoria macierzy informacyjnej Fishera (FIM) jest wykorzystywana do rozwiązywania kwestii identyfikowalności modelu. Dwa przypadki ścieżek sygnalizacyjnych w apoptozie i system kaskadowy kinazy MAP, są brane pod uwagę. Kaskada kinazy MAP, z pomiarami ograniczonymi do stężeń kompleksów białkowych kompleksów białkowych, nie przechodzi testu a priori, a szacunki SRP są słabe. zgodnie z oczekiwaniami. Struktura sieci apoptozy wykorzystana w tej pracy jest umiarkowanie złożoność i nadaje się do zastosowania proponowanych narzędzi. Przy użyciu siedmiu stężeń białek, uzyskano dokładne oszacowania dla wszystkich niewiadomych. niewiadomych. Ponadto, efekty próbkowania pomiarów i jakości informacji w zestawie pomiarowym na wydajność zidentyfikowanego modelu. zidentyfikowanego modelu.
Jaka jest funkcja kaspaz?
Kaspazy to wewnątrzkomórkowe proteazy, które propagują zaprogramowaną śmierć komórek, proliferację i stany zapalne.