Proteoglikany siarczanu heparanu (HS) na powierzchni komórek są bogatymi w węglowodany regulatorami aktywności migracyjnej, mitogennej, wydzielniczej i zapalnej komórek, które wiążą i rozpuszczalne czynniki wzrostu wiążące heparynę (np. czynnik wzrostu fibroblastów, Wnt, Hh, transformujący czynnik wzrostu beta, amfiregulina i czynnik wzrostu hepatocytów czynnik) do ich odpowiednich receptorów sygnałowych. Wykazaliśmy, że zdeglikanizowane białko rdzeniowe syndekanu-1 (SDC1), a nie łańcuchy HS ani SDC2 lub -4, wydaje się celować w nabłonkowy selektywny mitogen prosekrecyjny lakrytynę. Ważnym ważnym i nowym krokiem w tym mechanizmie jest to, że wiązanie wymaga wcześniejszego częściowego lub całkowitego usunięcia łańcuchów HS przez endogenną heparanazę. Ogranicza to aktywność lacytyny do miejsc, w których heparanaza wydaje się dominować, takich jak miejsca migracji komórek zewnątrzwydzielniczych, wydzielania, odnowy i zapalenia. Wiązanie jest wzajemnie określone przez C-końcową domenę mitogenną lakrytyny i N-końcówkę SDC1. SDC1. Modyfikacja heparanazy tego ostatniego przekształca szeroko wyrażony proteoglikan HS w wysoce selektywne białko wiążące się z powierzchnią. Ten nowy przykład specyfikacji komórek poprzez zewnątrzkomórkową modyfikację proteoglikanu HS ma szerokie implikacje w rozwoju, homeostazie i chorobach. --- CEL: Lakrytyna jest ludzką glikoproteiną łzową, która promuje podstawowe białko łzowe wydzielanie w hodowanych szczurzych komórkach gruczołu łzowego i proliferację subkonfluentnych ludzkich komórek nabłonka rogówki. Po miejscowym dodaniu do oczu królika oczu królika, lacytyna promuje podstawowe łzawienie. Pomimo tych działań na kilku gatunków, obecność lakrytyny w łzach innych niż naczelne lub innych tkankach nie została tkankach. Tutaj sprawdziliśmy obecność lacytyny w normalnych końskich łzach. METODY: Sekwencje zostały zebrane z genomowego wyrównania Ensembl ludzkiego genu LACRT z wysokiej jakości projektem genomu konia (EquCab2.0) i przeanalizowano. Normalne końskie łzy zostały zebrane i zbadane metodą Western blotting, ELISA i spektrometrii masowej. spektrometrii mas. Nowo wygenerowane przeciwciała królicze, odpowiednio, przeciwko N- i C-końcowym regionom ludzkiej lacytyny. WYNIKI: Identyczność wynosiła odpowiednio 75% i 45% na poziomie nukleotydów i białek. poziomie nukleotydów i białek. Cechy strukturalne były zachowane, w tym C-końcowy amfipatyczny region α-helisa. Przeciwciała anty-C-końcowe silnie wykrywały pasmo ∼13 kDa w końskich łzach. który został potwierdzony za pomocą spektrometrii mas. W ludzkich łzach to samo przeciwciało wykrywało silnie nieprzetworzoną lakrytynę (∼24 kDa) i C-końcowe fragmenty ∼13 i ∼11 kDa słabo. Przeciwciała anty-N-końcowe były lekko reaktywne z antygenem końskim ∼24 kDa i nie wykazywały reakcji z anty-C-końcowym reaktywnym antygenem ∼13 kDa. Podobne odpowiednie poziomy końskiej C-końcowej i N-końcowej immunoreaktywności immunoreaktywności były widoczne w teście ELISA. WNIOSKI: Lakrytyna jest obecna w końskich łzach, głównie jako C-końcowy fragment homologiczny do mitogennego i bakteriobójczego regionu w ludzkiej lakrytynie, sugerując potencjalne korzyści w naprawie ran rogówki. --- Retinopatia cukrzycowa jest główną przyczyną nowych przypadków ślepoty u dorosłych w krajach rozwiniętych. dorosłych w krajach rozwiniętych. Około 40% wszystkich osób z cukrzycą ma retinopatię cukrzycową, a 5% z nich ma postać zagrażającą wzrokowi. W zaawansowanym stadium zaawansowane stadium, w którym istnieje wysokie ryzyko utraty wzroku, może rozwijać się bez żadnych poważnych objawów, czasami trudno jest ją wykryć. Nieinwazyjna metoda do wykrywania biomarkerów charakterystycznych dla retinopatii cukrzycowej z płynu łzowego została opracowana. Próbki łez od pacjentów z cukrzycą bez retinopatii, bez retinopatią, nieproliferacyjnym i proliferacyjnym stadium retinopatii cukrzycowej oraz porównano zawartość białek w każdej próbce. zawartość białka w każdej próbce porównano z zawartością białka w puli łez od zdrowych ochotników. Próbki znakowano za pomocą iTRAQ fourplex i analizowano za pomocą spektrometrii mas ESI-MS/MS sprzężonej z nanoHPLC. Analizie poddano lipokalina 1, laktotransferyna, lakrytyna, lizozym C, lipofilina A i łańcuch łańcuch lambda immunoglobuliny zostały zidentyfikowane jako potencjalni kandydaci na biomarkery z istotnie wyższymi względnymi poziomami we łzach pacjentów z retinopatią cukrzycową. retinopatią cukrzycową. --- Zakłada się, że wiele czynników zewnątrzkomórkowych promuje różnicowanie niestymulowanych i / lub stymulowanych szlaków wydzielniczych w egzokrynnych komórkach wydzielniczych zewnątrzwydzielniczych, ale tożsamość czynników różnicujących, szczególnie tych specyficznych dla narządów, pozostaje w dużej mierze nieznana. Tutaj donosimy o identyfikacji nowej wydzielanej glikoproteiny, lakrytyny, która zwiększa wydzielanie zewnątrzwydzielnicze w hodowli komórek gruczołu łzowego, które w przeciwnym razie wykazują utratę funkcji wydzielniczej. funkcję wydzielniczą. MRNA i białko lakrytyny ulegają wysokiej ekspresji w ludzkim gruczole gruczole łzowym, umiarkowanie w głównych i mniejszych gruczołach ślinowych oraz nieznacznie w tarczycy. tarczycy. Wśród ponad 50 przebadanych tkanek ludzkich nie wykryto żadnych informacji ani białka lakrytyny. przebadanych tkanek ludzkich. Lakrytyna wykazuje częściowe podobieństwo do regionu wiążącego glikozaminoglikan specyficznego dla mózgu neuroglikanu C (32% identyczności ponad 102 reszt aminokwasowych) i do prawdopodobnie podobnego do mucyny aminokulistego regionu region fibuliny-2 (30% identyczności ponad 81 reszt aminokwasowych) i lokalizuje się głównie do granulek wydzielniczych i płynu wydzielniczego. Gen lakrytyny składa się z z pięciu eksonów, nie wykazuje alternatywnego splicingu i mapuje się na 12q13. Rekombinowana lacritin zwiększa niestymulowane, ale nie stymulowane wydzielanie komórek acinar, promuje proliferację komórek przewodowych i stymuluje sygnalizację poprzez fosforylację tyrozyny i uwalnianie wapnia. fosforylację tyrozyny i uwalnianie wapnia. Wiąże kolagen IV, lamininę-1, entaktynę/nidogen-1, fibronektynę i witronektynę, ale nie kolagen I, heparynę lub EGF. Jako autokrynny / parakrynny wzmacniacz konstytutywnego szlaku wydzielania łzowego szlak, mitogen komórek przewodowych i stymulator komórek nabłonka rogówki, lacytyna może odgrywać kluczową rolę w funkcjonowaniu osi gruczoł łzowy-rogówka. --- Lakrytyna jest mitogenem ludzkich komórek gruczołów ślinowych, a także stymulatorem ludzkich komórek nabłonka rogówki. Oczekuje się, że będzie to ważny czynnik w utrzymaniu otaczającej powierzchni oka. Małpa byłaby odpowiednim modelem zwierzęcym do badania roli lacytyny w fizjologii i patologii oka. patologii. Jednakże, zgodnie z naszą wiedzą, nie przeprowadzono klonowania cDNA ani analizy funkcjonalnej lakrytyny małp. małpiej lacytyny. W związku z tym, celem tego badania było: (1) sklonowanie małpiego ortologa lakrytyny; (2) scharakteryzowanie lakrytyny we łzach od kilku gatunków; oraz (3) określenie tkanek, w których lakrytyna jest produkowana i wydzielana. cDNA dla lacytyny z makaka rezus zawierało 547 bp, z 411 bp w otwartej ramce odczytu (ORF) kodującej białko 137 aminokwasów. kwasów. Małpia lakrytyna wykazywała 89% homologii aminokwasowej z ludzką lakrytyną; we wszystkich trzech aminokwas został usunięty we wszystkich trzech szczepach małp. Przewidywany MW dojrzałej dojrzałej lacytyny wynosił 12,2 kDa, a punkt izoelektryczny 4,99. Lakrytyna wykazywała anomalną migrację przy około 21,0 kDa na SDS-PAGE, co zostało potwierdzone przez immunoblotting i sekwencjonowanie aminokwasów. Podobnie do natywnej lakrytyny w małpich łzach małp, pasmo 21 kDa wykryto również w ludzkich łzach. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano lacrytyny w podobnej pozycji na SDS-PAGE we łzach szczurów, królików i psów. U małpy, mRNA lacytyny ulegało wysokiej ekspresji w gruczole łzowym, umiarkowanej w spojówce i gruczole Meiboma oraz słabo w nabłonku rogówki. U naczelnych lakrytyna była produkowana w gruczole łzowym i wydzielana do płynu łzowego. płynu łzowego. Wyniki te sugerują, że lakrytyna może być ważna dla utrzymania powierzchni oka u wyższych zwierząt, takich jak małpy i ludzie. --- WPROWADZENIE: Białka znajdujące się we łzach odgrywają ważną rolę w utrzymaniu powierzchni oka. powierzchni oka, a zmiany w składnikach białkowych łez mogą odzwierciedlać zmiany w zdrowiu powierzchni oka. zdrowia powierzchni oka. Proteomika zapewnia kompleksowe podejście do katalogowania wszystkich białek proteomu łez, co pomoże w wyjaśnić patogenezę chorób, postawić diagnozę kliniczną i ocenić wpływ leków na strukturę, skład i wydzielanie białek łez. białka łez. W niniejszym badaniu zbadano alternatywną strategię proteomiczną w celu zbadać proteom ludzkich łez. MATERIAŁY I METODY: Próbki łez uzyskano od pacjentów, którzy mieli skrzydlika i zostały pobrane pierwszego i trzeciego dnia po operacji skrzydlika. operacji skrzydlika. Do analizy wykorzystano łzy zebrane od 6 pacjentów. Wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy (RPHPLC) został użyty jako pierwszy krok do rozdzielenia nienaruszonych białek na 21 pików. Każda frakcja została następnie poddana trawieniu tryptycznemu i analizowana przez nanoLC-nano-ESI-MS/MS w celu scharakteryzowania składników białkowych w każdej frakcji. każdej frakcji. WYNIKI: W sumie zidentyfikowano 60 białek łez z wysokim poziomem ufności, w tym dobrze znane obfite białka łez i białka specyficzne dla łez, takie jak lakrytyna i białka bogate w prolinę. Wśród nich po raz pierwszy w płynie łzowym znaleziono białko 5 bogate w prolinę. po raz pierwszy w płynie łzowym. W płynie łzowym zaobserwowano również dużą liczbę białek osocza. w płynie łzowym. WNIOSKI: Wyniki wykazały, że strategia proteomiczna zastosowana w tym badaniu została z powodzeniem zastosowana do analizy proteomu łez. --- CEL: Białko lakrytyny jest silnie wyrażane w gruczole łzowym, wydzielane do płynu łzowego. do płynu łzowego i wykrywane tylko u naczelnych. Mechanizm wydzielania lakrytyny nie został w pełni zbadany, ponieważ system hodowli komórek do hodowli komórek gruczołu łzowego naczelnych. Celem niniejszego badania było (1) opracowanie procedury hodowli komórek gruczołu łzowego z małpy i (2) określenie mechanizmu wydzielania lakrytyny w systemie hodowlanym. systemie hodowli. METODY: Komórki rakowe z małpiego gruczołu łzowego zostały wyhodowane i scharakteryzowane. scharakteryzowano. Lakrytynę i inne białka wykryto metodą immunohistochemii, immunocytochemii i analizy immunoblot. Wydzielane białka wykryto również w pożywce ze stymulowanych komórek acinar. mRNA oznaczono za pomocą mikromacierzy i qRNA. określono za pomocą mikromacierzy i qPCR. Wewnątrzkomórkowe poziomy wapnia były mierzono za pomocą testu wapnia-4. WYNIKI: Komórki rakowe hodowane przez 1 dzień zawierały odpowiednie ilości lakrytyny, laktoferyny i lipokaliny do wykorzystania w badaniach wydzielania lakrytyny. Agonista cholinergiczny cholinergiczny agonista karbachol (Cch) stymulował wydzielanie lakrytyny i zwiększał wewnątrzkomórkowy poziom Ca2+. Wydzielanie lakrytyny indukowane przez Cch było hamowane przez inhibitor kanału wapniowego (SOC) YM58483 i inhibitory PKC GF109203 i Ro-32-0432. Wydzielanie lakrytyny indukowane przez Cch nie było hamowane przez inhibitor MAPKK U0126, chociaż p42/p44 MAPK był fosforylowany. Cch zwiększał również transkrypcję genów, która była hamowana przez U0126, GF109203, i chelatory wapnia. WNIOSKI: Udana hodowla komórek gruczołu łzowego małpy wykazała, że, wśród dominujących białek łez, wydzielanie lakrytyny wiązało się ze szlakiem PKC/Ca2+, a nie szlak p42/p44 MAPK. Indukcja transkrypcji przez Cch obejmowała niezależne szlaki p42/p44 MAPK i PKC. --- Odnawianie się nabłonka niezarodkowego jest słabo poznane. Nowy mitogen "lakrytyna" jest wydzielana apikalnie przez kilka nabłonków nie zarodkowych. Przetestowaliśmy 17 różnych typów komórek i odkryliśmy, że lakrytyna jest preferencyjnie mitogenna lub prosekrecyjne dla tych typów, które normalnie kontaktują się z lakrytyną podczas jej gruczołowego gruczołowej. Mitogeneza jest zależna od C-końcowej domeny lakrytyny, która może tworzyć alfa-helisę z hydrofobową powierzchnią, jak w przypadku VEGF i PTHLP odpowiednie domeny dimeryzacji lub wiązania receptora. Cele lacrytyny w dalszej kolejności NFATC1 i mTOR. Zastosowanie inhibitorów lub siRNA sugeruje, że sygnalizacja mitogenna lakrytyny sygnalizacja obejmuje Galpha(i) lub Galpha(o)-PKCalpha-PLC-Ca2+-kalcyneuryna-NFATC1 i Galpha(i) lub Galpha(o)-PKCalpha-PLC-fosfolipaza D (PLD) -mTOR w kształcie dzwonu w zależności od dawki. w kształcie dzwonu, w sposób zależny od dawki, wymagający czujnika Ca2+ STIM1, ale nie TRPC1. Ta ścieżka sugeruje umieszczenie przejściowo defosforylowanych i perinuclear Golgi-translocated PKCalpha upstream zarówno mobilizacji Ca2+, jak i aktywacji PLD w kompleksie z PLCgamma2. Zewnętrzny przepływ lakrytyny z komórek wydzielniczych przez kanały może generować pole proliferacyjne / wydzielnicze jako inną jednostkę odnowy komórkowej w nabłonku niehermetycznym, w którym dominują struktury luminalne. dominują struktury luminalne. --- Glikoproteiny są potencjalnie ważnymi biomarkerami chorób i celami terapeutycznymi. cele terapeutyczne. W szczególności, glikoproteiny N-związane są przedmiotem zainteresowania, ponieważ można je znaleźć w środowisku pozakomórkowym i płynach ustrojowych. W tym badanie, pobraliśmy próbki łez, płynu pozakomórkowego nabłonka komórek pokrywających powierzchnię oka u pacjentów z klimatyczną keratopatią kropelkową (CDK). keratopatią kropelkową (CDK), używając do porównania łez zdrowych pacjentów. Do wstępnego frakcjonowania próbki łez wykorzystano metodę wychwytywania żywicy hydrazydowej i uprzednio N-glikozylowane peptydy poddano następnie dwuwymiarowej analizie nano-LC-nano-ESI-MS/MS w celu uzyskania wzorców fragmentacji peptydów dla identyfikacji poprzez przeszukiwanie baz danych białek. Zidentyfikowaliśmy łącznie 43 unikalne N-glikoproteiny, z których 19 nie zostało wcześniej zgłoszonych w płynie łzowym płynie łzowym. Ponadto porównaliśmy ilościowo profile N-glikoprotein w płynie łzowym pacjentów z płynie łzowym pacjentów z CDK do łez osób kontrolnych bez choroby przy użyciu wychwytu glikopeptydów, znakowania iTRAQ i analizy 2D nano-LC-nano-ESI-MS/MS. W we łzach pacjentów z CDK, zwiększone poziomy czterech N-glikozylowanych białek w tym haptoglobiny (w miejscach N207, N211 i N241), polimerycznej immunoglobuliny receptora (w miejscach N83, N90, N135, N186, N421 i N469), łańcucha J immunoglobuliny (w miejscu N49) i niescharakteryzowane białko DKFZp686M08189 (w miejscu N470), jak również a także spadek poziomu N-glikozylacji jednego N-glikozylowanego białka, lakrytyny (w miejscu N119). Jednak ogólne poziomy tych pięciu białek nie wykazały znaczących zmian między próbkami kontrolnymi i próbkami CDK. Wyniki mogą mieć znaczenie kliniczne pod względem etiologii choroby i biomarkerów. biomarkerów. --- CEL: Zakłada się, że dodatkowe gruczoły łzowe przyczyniają się do produkcji płynu łzowego. produkcji płynu łzowego, ale niewiele wiadomo na temat ich funkcji. Celem tego badania było przeprowadzenie analizy ekspresji genów przez gruczoły Wolfringa. która zapewniłaby pełniejszy obraz funkcji tych gruczołów. METODY: Gruczoły Wolfringa zostały wyizolowane z zamrożonych skrawków ludzkich powiek za pomocą mikrodysekcji laserowej. RNA ekstrahowano z komórek i hybrydyzowano z macierzami ekspresji genów. tablice ekspresji genów. Ekspresja kilku głównych genów została potwierdzona immunohistochemicznie. WYNIKI: Spośród 24 genów o najwyższej ekspresji, 9 miało bezpośrednie znaczenie dla funkcji łzowych. funkcji gruczołu łzowego. Obejmowały one lizozym, laktoferynę, lipokalinę łzową i lakrytynę. lakrytyna. Gruczoły Wolfringa są wzbogacone w geny związane z syntezą białek, celowaniem i wydzielaniem. syntezą białek, celowaniem i wydzielaniem, a duża liczba genów dla białek o aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Kanały jonowe i transportery, anhydraza węglanowa i akwaporyny ulegały obfitej ekspresji. Geny kontrolujące funkcji łzowych, w tym cholinergiczne, adrenergiczne, wazoaktywne polipeptydy jelitowe, purynergiczne, polipeptydy purynergiczne. receptory cholinergiczne, adrenergiczne, wazoaktywne jelitowe, purynergiczne, androgenowe i prolaktynowe. w gruczole Wolfringa. WNIOSKI: Dane sugerują, że funkcja gruczołów Wolfringa jest podobna do głównych gruczołów łzowych i są zgodne z wydzielaniem elektrolitów, płynów i białek pod kontrolą nerwową i hormonalną. Ponieważ gruczoły te wydzielają bezpośrednio na powierzchnię oka, ich lokalizacja może umożliwiać szybką reakcję na bodźce egzogenne i na egzogenne bodźce i czyni je łatwo dostępnymi dla miejscowych leków. leków. --- CEL: Podczas zapalenia powierzchni oka, zwiększone prozapalne cytokiny cytokiny obniżają wydzielanie białka łez, sugerując, że spadek funkcji komórek łzowych przyczynia się do suchości oka. funkcji komórek łzowych przyczynia się do suchości oka. Lakrytyna, glikoproteina wydzielana przez komórki może funkcjonować jako czynnik autokrynny stymulujący wydzielanie białek łzowych. wydzielanie białek łez. Celem niniejszego eksperymentu było zbadanie indukowanego lakrytyną wydzielania białka w normalnych i traktowanych cytokinami (model zapalenia) małpich komórek gruczołowych. METODY: Komórki rakowe z małpich gruczołów łzowych hodowano z lub bez czynnikiem martwicy nowotworów alfa (TNF-α) i interferonem gamma (IFN-γ). Białko było indukowane przez lakrytynę lub karbachol (Cch, kontrola pozytywna). Białka wykryto i zidentyfikowano za pomocą immunoblottingu i immunocytochemii. Wewnątrzkomórkowy Ca(2+) mierzono za pomocą fluoroforu Calcium-4, a uszkodzenie komórek uszkodzenie komórek określono na podstawie wycieku LDH do pożywki hodowlanej. WYNIKI: W hodowanych małpich komórkach acinarnych lakrytyna stymulowała wydzielanie białka łez wydzielanie białka łez w normalnych komórkach bez podnoszenia wewnątrzkomórkowego Ca(2+). W przeciwieństwie do tego, Cch podnosił wewnątrzkomórkowy poziom Ca(2+) i uwalniał białka łez. Ten kontrast sugeruje alternatywny, niezależny od wapnia mechanizm indukowanego przez lakrytynę wydzielanie białek. TNF-α i IFN-γ powodowały wyciek LDH z wrażliwego ludzkiego nabłonka rogówki. komórek nabłonka rogówki, ale nawet wyższe dawki TNF-α plus IFN-γ nie powodowały wycieku LDH z komórek nabłonka rogówki małp. powodowały wycieku LDH z małpich komórek acinarnych, co sugeruje wyższą tolerancję przeciwko tym cytokinom. W komórkach acinarnych traktowanych cytokinami, lakrytyna stymulowała wydzielanie białka w takim samym stopniu jak w normalnych komórkach. W przeciwieństwie do tego, indukowane przez Cch podwyższenie poziomu Ca(2+) i uwalnianie białek były hamowane przez cytokiny. WNIOSKI: Lakrytyna może być użytecznym środkiem leczniczym opartym na biotechnologii przeciwko chorobom powierzchni oka, w których endogenna lakrytyna jest niewystarczająca. --- CEL: Celem tego badania było zbadanie guzów piersi i prawidłowej tkanek piersi pod kątem ekspresji glikoproteiny lacytyny. Ekspresja mRNA i i białka lakrytyny są ograniczone do gruczołu łzowego. gruczołu łzowego. METODY: Zbadaliśmy 37 ludzkich pierwotnych inwazyjnych guzów piersi, siedem linii komórkowych raka piersi i 16 prawidłowych tkanek piersi. linii komórkowych raka piersi i 16 normalnych tkanek piersi za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym dla ekspresji lakrytyny. WYNIKI: Wykryliśmy transkrypty lakrytyny w 51% (19/37) pierwotnych inwazyjnych guzów piersi, w 71% (19/37) inwazyjnych guzów piersi, w 71% (5/7) linii komórkowych raka piersi, a także w 56% (9/16) prawidłowych tkanek piersi. (9/16) prawidłowych tkanek piersi. Brak mRNA lakrytyny był wykrywalny w krwi obwodowej zdrowych osób. WNIOSKI: Tutaj pokazujemy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, że lakrytyna jest ulega ekspresji w ludzkich guzach piersi, liniach komórkowych raka piersi i prawidłowej piersi. Wcześniej zgłaszany ograniczony wzór ekspresji lakrytyny jest zatem nieprawidłowy. Transkrypty lakrytyny nie zostały wykryte we krwi obwodowej, co czyni lakrytynę potencjalnym kandydatem na gen markerowy raka piersi.
Gdzie można znaleźć białko lakrytynę?
Białko lakrytynę można znaleźć w gruczołach łzowych i ślinowych, a także w płynie łzowym i tarczycy.