Pomimo wysokiej homologii sekwencji, neurotoksyny peptydowe omega-konotoksyna MVIIA i MVIIC selektywnie blokują kanały wapniowe typu N i P/Q, odpowiednio. Aby zbadać mechanizm rozpoznawania podtypów kanałów wapniowych, dwa chimeryczne analogi omega-konotoksyny MVIIA i MVIIC zostały zsyntetyzowane przez wymianę ich N- i C-końcowych połówek. Test wiązania dla kanałów wapniowych typu N- i P/Q wykazały, że reszty aminokwasowe ograniczone do N-końcowej połowy są ważne dla rozpoznawania kanałów typu N, podczas gdy niezbędne reszty do rozpoznawania kanałów typu P / Q są szeroko rozłożone na cała cząsteczka omega-konotoksyny. --- Wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2+ indukowany przez aktywację receptorów glutaminianu ma kluczowe znaczenie dla ostateczne znaczenie dla pobudliwości neuronów i procesów patofizjologicznych. W niniejszym badaniu staraliśmy się wyjaśnić rodzaje zależnych od napięcia kanałów Ca2+ zaangażowanych w stymulowany przez NMDA napływ Ca2+ do izolowanej siatkówki szczura za pomocą selektywnych blokerów. Dodatkowo, liczba miejsc wiązania dla radioligandów znakujących L- ([3H]nitrendypina), N- ([125I]omega-konotoksyna MVIIA) i kanałów Ca2+ typu P/Q ([125I]omega-konotoksyna MVIIC) oceniano w siatkówce szczura. w siatkówce szczura i, w celu dalszego porównania, w korze szczura. Inkubacja izolowanych siatkówek szczurów za pomocą 100 mikroM NMDA spowodowało trzykrotny wzrost napływ 45Ca2 +, który został całkowicie stłumiony przez MK-801, antagonistę receptora NMDA antagonistę receptora NMDA i częściowo osłabiony (około 20%) przez tetrodotoksynę, bloker kanału Na+ bloker kanału Na+. Nifedypina, bloker kanału Ca2+ typu L, zmniejszała stymulowany przez NMDA napływ Ca2 + w sposób zależny od dawki, z maksymalną redukcją około 50%. Podobne efekty zaobserwowano w przypadku werapamilu i diltiazemem. Blokery kanałów Ca2+ typu N i P/Q nie miały znaczącego wpływu na napływ Ca2+ wywołany przez NMDA. Co2+, niespecyficzny bloker kanałów Ca2+, spowodował zahamowanie napływu Ca2 + stymulowanego przez NMDA podobne do tego z nifedypiny. Dlatego spośród wszystkich zależnych od napięcia kanałów Ca2+, kanały typu L wydają się wnosić największy wkład (do 50%) do stymulowanego przez NMDA napływ Ca2 + do izolowanej siatkówki szczura. To odkrycie kontrastuje z dowody uzyskane w neuronach mózgowych potwierdzające rolę kanałów typu L-, N- i P/Q w sygnałach Ca2+ wywołanych przez NMDA. Porównanie liczby miejsc wiązania radioligandu związanych z kanałami Ca2+ typu L-, N- lub P/Q w korze szczura i siatkówce wykazało, że takiej różnicy nie można przypisać odmiennemu wzorcowi ekspresji tych kanałów w obu tkankach. ekspresji tych kanałów w obu tkankach, chociaż stwierdzono pewne różnice. znaleziono pewne różnice. Co ciekawe, różne powinowactwo [3H]nitrendypiny do kanałów Ca2+ typu L Ca2+ w siatkówce i korze szczura, co może odzwierciedlać ekspresję różnych klas kanałów typu ekspresję różnych klas kanałów typu L w tych tkankach. Zdolność blokerów kanałów Ca2+ typu L do osłabiania napływu Ca2+ stymulowanego przez NMDA może może leżeć u podstaw ich neuroprotekcyjnego działania w siatkówce. --- W tym badaniu zbadano behawioralne i przeciwdrgawkowe działanie wrażliwych na napięcie blokerów kanału wapniowego u myszy DBA/2. Omega-konotoksyna MVIIC (0,1, 0,3 mikrograma ICV / mysz) i omega-agatoksyna IVA (0,1, 0,3, 1 mikrograma ICV), które działają głównie na kanały wapniowe typu P i / lub Q, zapobiegały drgawkom klonicznym i tonicznym wywołanym dźwiękiem w tym zwierzęcym modelu padaczki odruchowej (wartości ED50 z 95% granicami ufności dla ochrony przed napadami klonicznymi napady wywołane dźwiękiem wynosiły odpowiednio 0,09 (0,04-0,36) mikrogramów ICV i 0,09 (0,05-0,15) mikrogramów ICV i przed napadami tonicznymi odpowiednio 0,07 (0,03-0,16) odpowiednio 0,07 (0,03-0,16) mikrograma ICV i 0,08 (0,04-0,13) mikrograma ICV). Antagoniści kanału wapniowego typu N antagoniści kanału wapniowego omega-konotoksyna GVIA i omega-konotoksyna MVIIA były również testowane w tym modelu. również testowane w tym modelu. Omega-konotoksyna GVIA działała przeciwdrgawkowo u myszy DBA/2 myszy, ale tylko w wysokich dawkach (3 mikrogramy ICV zapobiegały napadom tonicznym u 60% zwierząt; 10 mikrogramów zwierząt; 10 mikrogramów ICV zapobiegało napadom klonicznym u 60% i tonicznym napadom klonicznym u 60% i tonicznym u 90% zwierząt), podczas gdy omega-konotoksyna MVIIA nie hamowała drgawki wywołane dźwiękiem w dawkach do 10 mikrogramów ICV. Zarówno omega-konotoksyna GVIA i omega-konotoksyna MVIIA wywoływały zespół intensywnego drżenia w dawkach tak niskich jak tak niskich jak 0,1 mikrograma ICV, podczas gdy omega-konotoksyna MVIIC i omega-agatoksyna IVA nie wywoływały drżenia w żadnej z badanych dawek. Wreszcie, omega-konotoksyna GI (0,01-1 mikrogram ICV) i alfa-konotoksyna SI (0,3-30 mikrogramów ICV), które działają na nikotynowe receptory acetylocholiny, nie były przeciwdrgawkowe i nie nie wywoływały drgawek u myszy DBA/2. Wyniki te potwierdzają, że blokery kanałów wapniowych typu N- i P-/Q wywołują różne reakcje behawioralne u zwierząt. Działanie przeciwdrgawkowe omega-konotoksyny MVIIC i omega-agatoksyny IVA u myszy DBA/2 są zgodne z doniesieniami, że blokery kanałów wapniowych typu P i / lub Q hamują uwalnianie aminokwasów pobudzających i są warte dalszych badań. dalszych badań. --- Indukowane elektrycznie odpowiedzi skurczowe odcinka prostaty nasieniowodów (0,1 Hz, 65 V, 1 ms) są głównie spowodowane przejściowym presynaptycznym uwalnianiem ATP, który działa postsynaptycznie na receptory nieadrenergiczne w celu skurczu komórek mięśni gładkich. mięśni gładkich. Odpowiedzi te były w pełni blokowane przez nanomolarne stężenia omega-konotoksyny GVIA, MVIIA i MVIIC, najprawdopodobniej poprzez hamowanie Ca2+ poprzez presynaptyczne kanały Ca2+ typu N kontrolujące uwalnianie ATP. Wielokrotne wypłukiwanie toksyn pozwoliło na przywrócenie skurczów, z wyjątkiem omega-konotoksyny GVIA, której działanie hamujące pozostało niezmienione przez co najmniej 60 min. Ponadto, mikromolarne stężenia omega-konotoksyny MVIIC były nie były w stanie chronić przed nieodwracalnym hamowaniem skurczów skurczowych indukowanego przez nanomolarne stężenia omega-konotoksyny GVIA. Przy niskich zewnątrzkomórkowych stężeniach Ca2+ (1,5 mM), 20 nM omega-konotoksyny GVIA lub MVIIA całkowicie hamowały skurcze skurczowe w ciągu około 10 minut. W 5 mM Ca2+ blokada skurczów po 10 minutach wynosiła 70% dla obu toksyn. W 1,5 mM Ca2+ omega-konotoksyna MVIIC (1 mikroM) całkowicie hamowała skurcz po 10 min. skurcz po 10 min. W 5 mM Ca2+ blokada rozwijała się bardzo powoli i była bardzo słaba po 30 minutach, omega-konotoksyna MVIIC obniżyła odpowiedź tylko o 20%. Wyniki te są zgodne z koncepcją, że trzy omega-konotoksyny blokują neurotransmisję purynergiczną nasieniowodów, działając na presynaptyczne kanały Ca2+ typu N zależne od napięcia. Jednak omega-konotoksyna MVIIC wydaje się wiązać z miejscami innymi niż te rozpoznawane przez omega-konotoksyny GVIA i MVIIA, które znacznie różnią się wymaganiami Ca2+ dla wiązania z ich receptorami. wiązania z ich receptorami. --- Zastąpienie N-końcowej połowy omega-konotoksyny MVIIC, blokera peptydowego kanałów wapniowych typu P/Q z omega-konotoksyną MVIIA znacząco zwiększała powinowactwo do kanałów wapniowych typu N. Aby zidentyfikować reszty istotne dla selektywności podtypu, zbadaliśmy pojedyncze mutacje odwrotne od MVIIA do typu MVIIC w tym chimerycznym analogu. Odwrotna mutacja z Lys(7) do Pro(7) zmniejszyła powinowactwo zarówno do kanałów typu P/Q, jak i N, podczas gdy ta z Leu (11) do Thr (11) zwiększyło powinowactwo do kanałów typu P / Q i zmniejszało powinowactwo do kanałów typu N. Role tych dwóch reszt zostały potwierdzone przez syntezę dwóch analogów MVIIC, w których Pro(7) i Thr(11) zostały zastąpione odpowiednio Lys(7) i Leu(11). --- Omega-konotoksyna MVIIC (MVIIC) blokuje kanały wapniowe typu P/Q z wysokim powinowactwem i kanały wapniowe typu N z niskim powinowactwem. i kanały wapniowe typu N o niskim powinowactwie, podczas gdy wysoce homologiczna omega-konotoksyna MVIIA blokuje tylko kanały wapniowe typu N. Chcieliśmy uzyskać analogi MVIIC bardziej selektywne dla kanałów wapniowych typu P/Q niż MVIIC, aby wyjaśnić różnice strukturalne między kanałami, które rozróżniają omega-konotoksyny. Aby wydajnie przygotować szereg analogów MVIIC, opracowaliśmy opracowaliśmy metodę kombinatoryczną, która obejmuje losowy etap utleniania powietrzem. Czterdzieści siedem analogów zostało przygotowanych w sześciu seriach, a niektóre z nich wykazywały wyższą selektywność dla kanałów wapniowych typu P/Q niż MVIIC w testach wiązania. --- Wysokoprogowe, wrażliwe na napięcie kanały wapniowe typu N, typu L i typu P zostały rozróżnione w OUN ssaków głównie na podstawie ich wrażliwości na selektywnych antagonistów. ich wrażliwości na selektywnych antagonistów. Dopasowanie ich do genów zidentyfikowanymi przez klonowanie molekularne jest ciągłym przedsięwzięciem. Podczas gdy kanały typu L charakteryzują się wrażliwością na dihydropirydyny, a kanały typu P przez wrażliwość na toksynę pająka AgaIVA, wykazano, że kanał typu N są rozpoznawane przez omega-konopeptydy GVIA i MVIIA. Ostatnio dwóch nowych członków rodziny omega-konopeptydów - MVIIC z ślimaka morskiego Conus magus i SVIB z Conus striatus. Wiązanie i dane elektrofizjologiczne sugerują, że te dwa peptydy, oprócz oprócz interakcji z kanałami wapniowymi typu N, oddziałują z szeroko rozproszony receptor w błonach neuronalnych, który różni się od kanałów typu N kanały. W niniejszym raporcie wykazujemy poprzez biochemiczne i farmakologiczne różnicowanie w indywidualnej rozdzielczości polipeptydu receptora, przez powinowactwo sieciowanie, SDS-PAGE i autoradiografię, że SNX-230 (syntetyczny MVIIC) wiąże się z wysokim powinowactwem do podjednostki alfa 1 kanału wapniowego różnej od o wysokim powinowactwie alfa 1 SNX-111 (syntetyczny MVIIA). SNX-183 (syntetyczny SVIB) oddziałuje z obiema podjednostkami alfa 1 z niższym powinowactwem. Podczas gdy podjednostka podjednostka alfa 1 rozpoznawana z wysokim powinowactwem przez MVIIA odpowiada kanałowi typu N kanał, drugi reprezentuje nowy kanał wapniowy różniący się od kanałów typu N, L i być może kanałów typu P. --- Chociaż etiologia neurorozwojowych zaburzeń psychicznych pozostaje niejasna, zbieżne linie dowodów wykorzystujące modelowanie na zwierzętach sugerują krytyczną rolę procesów neurorozwojowych zależnych od aktywności w okresie noworodkowym. Tutaj zgłaszamy behawioralne skutki nowej techniki zaprojektowanej w celu wywołania ukierunkowanego, przejściowe zakłócenie procesów zależnych od aktywności we wczesnym rozwoju poprzez zmniejszenie uwalniania neuroprzekaźników za pośrednictwem wapnia. Zbadaliśmy efekty behawioralne po okresie dojrzewania noworodków (dzień po urodzeniu 7) przyśrodkowej kory przedczołowej infuzja kory mózgowej nośnika lub presynaptycznego typu N i typu P / Q blokery kanału wapniowego zależne od napięcia (omega-konotoksyny MVIIA i MVIIC odpowiednio 6,8 i 45 pmol) u szczurzych szczeniąt. W teście uczulenie behawioralne wywołane amfetaminą, noworodkowa omega-konotoksyna MVIIA znacząco zwiększyło lokomocję po wielokrotnych wstrzyknięciach amfetaminy zastrzyki (1,5 mg / kg i.p.) i znacznie zmniejszyły lokomocję po powtarzane zastrzyki soli fizjologicznej w stosunku do zwierząt leczonych noworodkowo nośnikiem. Jednak nie było wpływu leczenia konotoksyną na długoterminową ekspresję uczulenia na amfetaminę. uczulenia na amfetaminę. Noworodkowe leczenie omega-konotoksynami nie miało wpływ na inne badane zachowania, a mianowicie akustyczną reakcję zaskoczenia, hamowanie przedimpulsowe startu, nowości i lokomocji indukowanej amfetaminą (1,5 mg / kg i.p.) lokomocja i zachowanie podobne do lęku w podwyższonym plus-maze. Te dane potwierdzają, że przejściowe, specyficzne dla regionu zaburzenie transmisji synaptycznej podczas wczesnego rozwoju może mieć długoterminowy wpływ na zachowania istotne dla neurorozwojowe zaburzenia psychiczne.
Czy MVIIA i MVIIC wiążą się z tym samym kanałem wapniowym?
Nie, omega-konotoksyna MVIIC blokuje kanały wapniowe typu P/Q z wysokim powinowactwem i kanały wapniowe typu N z niskim powinowactwem, podczas gdy wysoce homologiczna omega-konotoksyna MVIIA blokuje tylko kanały wapniowe typu N.