Genomy zwierząt posiadają wysoce konserwatywne sekwencje cis-regulacyjne, które są często często znajdują się w pobliżu genów regulujących transkrypcję i rozwój. Naukowcy zaproponowali, że silna konserwacja tych sekwencji może wpływać na ewolucję ewolucję otaczającego genomu, zarówno poprzez represję rearanżacji, jak i prawdopodobnie poprzez promowanie retencji zduplikowanych genów. Sprzeczne dane sprawiły jednak, że sprawiły, że ważność tych propozycji jest niejasna. Tutaj używamy nowej metodę obliczeniową do identyfikacji filogenetycznie konserwowanych elementów niekodujących (PCNE) w sposób, który nie jest zależny od rearanżacji i duplikacji. Ta metoda jest wystarczająco skuteczna, aby zidentyfikować ponad tysiąc PCNE, które zostały zachowanych między kręgowcami i podstawowymi płazami strunowymi. Przetestowaliśmy 42 z PCNE w testach transgenicznych danio pręgowanego - w tym przykłady z kręgowców i płazów - i stwierdzamy, że większość z nich jest funkcjonalnymi wzmacniaczami. Odkryliśmy, że PCNE są wzbogacone wokół genów ze starożytną konserwacją syntenii i że ten jest najsilniejsze w przypadku PCNE pozagenowych, co sugeruje, że cis-regulacyjna odgrywa kluczową rolę w hamowaniu rearanżacji genomu. Następnie sklasyfikowaliśmy geny myszy i danio pręgowanego według powiązania z PCNE, zachowania syntenii konserwacja, historia duplikacji i obecność w dwukierunkowych parach promotorów, i wykorzystujemy te dane do grupowania funkcji genów w szereg różnych wzorców ewolucyjnych. wzorców ewolucyjnych. Wyniki te pokazują, że subfunkcjonalizacja konserwowanej cis-regulacji nie była głównym wyznacznikiem duplikacji genów u kręgowców. Zamiast tego dane wspierają hipotezę równowagi genowej, która proponuje, że retencja duplikatów była napędzana przez selekcję przeciwko nierównowagi dawek w genach z wieloma połączeniami białkowymi. --- TŁO: Współczesny koelakant (Latimeria) jest zachowanym taksonem podstawowej linii sarkopterygicznej. sarkopterygii i grupą siostrzaną tetrapodów. Oprócz pewnych cech apomorficznych, jego morfologia charakteryzuje się wysokim stopniem zachowania struktur przodków kręgowców i niewielkimi zmianami morfologicznymi. Wgląd w ewolucję molekularną, która może wyjaśnić niezmieniony charakter morfologii morfologii Latimeria wymaga analizy wzorców ekspresji genów regulatorowych genów regulatorów rozwoju i ich modułów cis-regulacyjnych (CRM). WYNIKI: Opisujemy analizę porównawczą i funkcjonalną genów sonic hedgehog (shh) u Latimeria menadoensis. Kilka domniemanych wzmacniaczy w locus Latimeria shh zostało zidentyfikowanych przez porównania z sarcopterygian i actinopterygian. Specyficzna sekwencja z wszystkimi znanymi elementami wzmacniającymi u actinopterygian. Jednak elementów tych selektywnie brakuje w bardziej rozbieżnych gatunkach actinopterygian i sarcopterygian. Funkcjonalność domniemanych Latimeria została potwierdzona przez analizę ekspresji genów reporterowych w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego i pisklęcia. WNIOSKI: Latimeria shh CRMs reprezentują ancestralny zestaw enhancerów, które które pojawiły się przed podziałem ryb na płetwopłetwe i promieniopłetwe. W przeciwieństwie do do specyficznych dla linii strat i różnicowania w bardziej pochodnych liniach, Latimeria shh wykazują niski poziom dywersyfikacji sekwencji. Wysoki ogólna konserwacja sekwencji konserwowanych elementów niekodujących shh (CNE) jest zgodna z ogólnym trendem wysokiego poziomu zachowania niekodującego DNA w powoli ewoluującym genomie Latimeria. --- Gen Lmo2 koduje kofaktor transkrypcyjny krytyczny dla rozwoju hematopoetycznych komórek macierzystych. hematopoetycznych komórek macierzystych. Ektopowa ekspresja LMO2 powoduje białaczkę u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek T ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) i u pacjentów z ciężkim złożonym niedoborem pacjentów z ciężkim złożonym niedoborem odporności poddawanych retrowirusowej terapii genowej. Ściśle kontrolowana ekspresja Ekspresja Lmo2 jest zatem niezbędna, ale jak dotąd nie opublikowano kompleksowej analizy regulacji Lmo2 nie została do tej pory opublikowana. Dzięki genomice porównawczej zidentyfikowaliśmy 17 wysoce konserwatywne elementy niekodujące, z których 9 ujawniło specyficzną acetylację w testach immunoprecypitacji chromatyny i mikromacierzy (ChIP-chip) przeprowadzonych na 250 kb locus Lmo2 w 11 typach komórek obejmujących różne etapy różnicowania hematopoetycznego. Wszystkie kandydujące regiony regulatorowe zostały przetestowane na transgenicznych myszach. Rozszerzony proksymalny fragment promotora LMO2 wykazywał silną aktywność śródbłonkową, podczas gdy dystalny promotor wykazywał słabą aktywność przodomózgowia. aktywność. Osiem z 15 dystalnych elementów kandydujących funkcjonowało jako wzmacniacze, które razem odtworzyły pełny wzór ekspresji Lmo2, kierując ekspresję do śródbłonka, mózgu i mózgu. ekspresję do śródbłonka, komórek krwiotwórczych, ogona i przodomózgowia. Co ciekawe, różne kombinacje specyficznych dystalnych elementów regulatorowych były wymagane do rozszerzenia aktywności śródbłonkowej promotora LMO2 na woreczek żółtkowy lub komórek krwiotwórczych wątroby płodu. Wreszcie, wykazano, że Sfpi1/Pu.1, Fli1, Gata2, Tal1/Scl i Wykazano, że Lmo2 wiąże się i transaktywuje hematopoetyczne wzmacniacze Lmo2, w ten sposób identyfikując kluczowe regulatory upstream i pozycjonując Lmo2 w hematopoetycznej sieci regulacyjnych. --- Genomy owadów zawierają większe bloki zachowanej kolejności genów (mikrosynteza) niż niż można by oczekiwać na podstawie losowego modelu ewolucji chromosomów. My przedstawiamy dowody na to, że mikrosynteza została zachowana, aby utrzymać duże tablice wysoce konserwatywnych elementów niekodujących (HCNE). Tablice te obejmują kluczowe rozwojowe geny regulatorowe, tworząc genomowe bloki regulatorowe (GRB). My niedawno opisaliśmy GRB u kręgowców, gdzie większość HCNE funkcjonuje jako wzmacniacze a tablice HCNE określają złożone programy ekspresji genów docelowych. Tutaj przedstawiamy porównanie pięciu genomów Drosophila, pokazując, że gęstość HCNE osiąga szczyt centralnie w dużych blokach syntenicznych zawierających wiele genów. Oprócz regulatorów rozwoju, które są prawdopodobnymi celami enhancerów HCNE, tablice HCNE często obejmują niepowiązane sąsiednie geny. Opisujemy różnice w rdzeniu między genami docelowymi a niespokrewnionymi genami, które oferują wyjaśnienie różnic w ich reaktywności na enhancery. Pokazujemy przykłady uderzającej zgodności między granicami bloków syntenii, tablicami HCNE i regionami wiązania Polycomb, potwierdzając, że bloki syntenii odpowiadają domenom regulatorowym. Chociaż kilka niekodujących elementów jest wysoce zachowanych między Drosophila i komarem malarii Anopheles gambiae, stwierdzamy, że regiony że regiony A. gambiae ortologiczne do GRB Drosophila zawierają równoważny rozkład niekodujących elementów wysoce konserwatywnych u komara żółtej febry Aëdes aegypti i pokrywają się z regionami starożytnej mikrosyntezy między Drosophila i komarami. Strukturalna i funkcjonalna równoważność między GRB owadów i kręgowców oznacza je jako starożytną cechę genomów metazoicznych oraz jako klucz do przyszłych badań nad rozwojem i regulacją genów. --- Pan-kręgowców rozwojowe elementy cis-regulacyjne są rozróżnialne jako wysoce konserwowane elementy niekodujące (HCNE) i często są rozproszone na obszarach elementy niekodujące (HCNE) i często są rozproszone na dużych obszarach wokół plejotropowych genów, których ekspresję kontrolują. Na loci dwóch rozwojowych genów czynników transkrypcyjnych, SOX3 i PAX6, wykazujemy, że HCNE konserwowane między człowiekiem a danio pręgowanym mogą być systematycznie i niezawodnie testowane pod kątem ich funkcji regulacyjnej w wielu stabilnych transgenach u danio pręgowanego, a ich zasięg genomowy oszacowano z pewnością, wykorzystując zachowanie syntenii i gęstość HCNE wzdłuż tych loci. HCNE zarówno człowieka, jak i danio pręgowanego funkcjonują jako specyficzne wzmacniacze rozwojowe u danio pręgowanego. Pokazujemy, że ludzkie HCNE powodują we wzorcach ekspresji u danio pręgowanego równoważnych z tymi u myszy, ustanawiając zebrafish jako odpowiedni model do testowania na dużą skalę ludzkich wzmacniaczy rozwojowych. wzmacniaczy. Ortologiczne ludzkie i zebrafish enhancery przeszły funkcjonalną ewolucję ewolucję funkcjonalną w obrębie ich sekwencji i często kierowały pokrewnymi, ale nieidentycznymi wzorcami ekspresji. wzorcami ekspresji. Pomimo odległości ewolucyjnej wynoszącej 450 milionów lat, jeden pax6 HCNE kierował ekspresją w identycznych obszarach, porównując zebrafish i ludzkie HCNE. HCNE z tego samego obszaru często napędzają nakładające się wzorce, co sugeruje, że że do osiągnięcia solidnych i precyzyjnych złożonych wzorców ekspresji złożonych wzorców ekspresji wykazywanych przez geny rozwojowe. --- Określenie, w jaki sposób transkrypcyjne sygnały regulatorowe są kodowane w genomach kręgowców jest niezbędne do zrozumienia pochodzenia złożoności wielokomórkowej; Jednak kod genetyczny regulacji genów kręgowców pozostaje słabo poznany. W próbując wyjaśnić ten kod, synergistycznie połączyliśmy profilowanie ekspresji genów w całym genomie profilowanie ekspresji genów, porównania genomów kręgowców i analizę miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych analizę miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego w celu zdefiniowania sygnatur sekwencji charakterystycznych dla charakterystycznych dla tkanek w ludzkim genomie. Zastosowaliśmy tę strategię do profili ekspresji genów opartych na mikromacierzach z 79 ludzkich tkanek i zidentyfikowaliśmy 7187 kandydatów na enhancery, które definiowały ekspresję genów flankujących, z których większość znajdowała się poza znanymi promotorami. My zwalidowaliśmy krzyżowo tę metodę pod kątem jej zdolności do przewidywania de novo specyficznej dla tkanki ekspresji genów i potwierdziliśmy jej niezawodność w 57 z 79 dostępnych ludzkich tkanek. tkanek, ze średnią precyzją w rozpoznawaniu enhancerów w zakresie od 32% do 63% i czułością na poziomie 47%. Wykorzystaliśmy sygnatury sekwencji zidentyfikowane przez to podejście, aby z powodzeniem przypisać prognozy specyficzne dla tkanki do około 328 000 konserwatywnych niekodujących elementów w ludzkim genomie. Poprzez nakładając te ogólnogenomowe przewidywania na zestaw danych wzmacniaczy zweryfikowanych in vivo u myszy transgenicznych, byliśmy w stanie potwierdzić nasze wyniki z 28% czułością i 50% precyzją. czułością i 50% precyzją. Wyniki te wskazują na moc łączenia komplementarnych zestawów danych genomowych jako wstępnej próby obliczeniowej do globalnego globalny obraz regulacji genów specyficznych dla tkanek u kręgowców. --- Ekran wykrywania enhancerów na dużą skalę przeprowadzono u danio pręgowanego przy użyciu wektora retrowirusowego retrowirusowego wektora niosącego podstawowy promotor i kasetę reporterową białka fluorescencyjnego białko fluorescencyjne. Analiza insercyjnych hotspotów ujawniła obszary wokół rozwojowych genów regulatorowych rozwojowych, w których insercja powoduje ten sam globalny wzorzec ekspresji, niezależnie od dokładnego położenia. niezależnie od dokładnej pozycji. Obszary te pokrywają się z segmentami chromosomów kręgowców kręgowców segmentami chromosomalnymi zawierającymi identyczną kolejność genów; zjawisko znane jako zjawisko znane jako zachowana syntenia i uważane za pozostałość ewolucji. Genomiczne badania porównawcze badania wykazały dużą liczbę wysoce konserwatywnych elementów niekodujących (HCNE) obejmujących te i inne loci. Uważa się, że HCNE działają jako transkrypcyjne transkrypcji w oparciu o odkrycie, że wiele z tych, które zostały przetestowane bezpośrednio ekspresję specyficzną dla tkanki w testach przejściowych lub transgenicznych. Chociaż kolejność genów w hox i innych klastrach genów od dawna wiadomo, że jest zachowana z powodu wspólnych sekwencji regulatorowych lub nakładających się jednostek transkrypcyjnych, obszary chromosomalne obszary chromosomalne znalezione przez hotspoty insercyjne zawierają tylko jeden lub kilka geny regulujące rozwój, a także geny niepowiązane filogenetycznie. My nazwaliśmy te regiony genomowymi blokami regulacyjnymi (GRB) i wykazaliśmy, że leżą u podstaw zjawiska konserwatywnej syntenii we wszystkich sekwencjonowanych genomach kręgowców. kręgowców. Po duplikacji całego genomu teleostów, podzbiór GRBs został zachowany w dwóch kopiach, przeszedł zmiany degeneracyjne w porównaniu z loci tetrapodów, które istnieją jako pojedyncza kopia, a zatem mogą być postrzegane jako reprezentujące formę przodków. Omawiamy te odkrycia w świetle ewolucji architektury chromosomalnej kręgowców kręgowców i identyfikacji ludzkich mutacji chorobowych. --- Sekwencjonowaliśmy i analizowaliśmy klastry genów Hox rekina słoniowego, holocefalicznej ryby chrzęstnoszkieletowej. holocefalicznej ryby chrzęstnoszkieletowej. Rekin słoniowy posiada 4 klastry Hox z 45 genami Hox, które zawierają ortologi dla większej liczby starożytnych genów Hox gnathostome Hox niż 4 klastry u czworonogów i nadliczbowe klastry u ryb teleostatycznych. ryb teleost. Analiza filogenetyczna genów Hox rekina słoniowego z 7 paralogicznych grup, które zawierają wszystkich 4 członków, wskazała na topologię ((AB)(CD)) dla kolejności duplikacji klastrów Hox, zapewniając wsparcie dla hipotezy 2R (tj. 2 rundy duplikacji całego genomu podczas wczesnej ewolucji kręgowców). ewolucji kręgowców). Porównanie niekodujących sekwencji klastrów Hox słonia rekina i ludzkich klastrów Hox zidentyfikowały dużą liczbę zachowanych niekodujących elementów (CNE), które reprezentują domniemane elementy cis-regulacyjne, które mogą być zaangażowane w regulację genów Hox. Co ciekawe, u fugu ponad 50% tych starożytnych CNE rozeszło się poza rozpoznawanie w zduplikowanych (HoxA, HoxB i HoxD), jak również w pojedynczych (HoxC) klastrach Hox. Co więcej, b-paralogi zduplikowanych klastrów fugu Hox są praktycznie praktycznie pozbawione unikalnych starożytnych CNE. W przeciwieństwie do klastrów Hox fugu, klastry Hox rekina słoniowego i ludzkie klastry Hox straciły mniej starożytnych CNE. Jeśli te starożytne CNE są rzeczywiście enhancerami kierującymi specyficzną tkankowo ekspresją genów Hox, dywergencja ich sekwencji w liniach kręgowców mogła doprowadzić do zmiany wzorców ekspresji i prawdopodobnie funkcji związanych z nimi genów Hox. --- Porównania genomów ryb i ssaków okazały się skuteczne w identyfikowaniu zachowanych niekodujących elementów, które mogą mieć charakter cis-regulacyjny, a większość z nich tych testowanych in vivo wykazano, że działają jako specyficzne dla tkanki wzmacniacze związanych z genami zaangażowanymi w transkrypcyjną regulację rozwoju. Chociaż większość z tych elementów ma niewielką identyczność sekwencji, niewielka liczba niewielka liczba jest niezwykle podobna i wydaje się być produktem duplikacji zdarzeń. Tutaj szukaliśmy zduplikowanych konserwatywnych elementów niekodujących w genomie ludzkim genomie, używając porównań z Fugu, aby wybrać przypuszczalne sekwencje cis-regulacyjne. sekwencje. Zidentyfikowaliśmy 124 rodziny zduplikowanych elementów, z których każda zawierała od dwóch do pięciu członków, które są wysoce konserwatywne w genomach kręgowców i pomiędzy nimi. genomów kręgowców. W 74% przypadków byliśmy w stanie przypisać określony zestaw paralogicznych genów z adnotacjami odnoszącymi się do regulacji transkrypcji i/lub rozwoju do każdej rodziny, usuwając w ten sposób wiele niejasności w identyfikacji powiązanych genów. Stwierdziliśmy, że zduplikowane elementy mogą potencjalnie zwiększać ekspresję genów reporterowych w sposób specyficzny dla tkanki i że domeny ekspresji często nakładają się, ale niekoniecznie są identyczne, między członkami rodziny. Ponad dwie trzecie rodzin jest konserwowanych w duplikatach u ryb rybach i wydają się poprzedzać wydarzenia duplikacji na dużą skalę, o których uważa się, że wystąpiły u początków kręgowców. Proponujemy model, w którym duplikacja genów duplikacja genów i ewolucja elementów cis-regulacyjnych mogą być rozpatrywane w kontekście zwiększonej różnorodności morfologicznej i pojawienia się współczesnego planu ciała kręgowców. kręgowców. --- Cefalochordaty, urochordaty i kręgowce wyewoluowały od wspólnego przodka ponad 520 milionów lat temu. Aby poprawić nasze zrozumienie ewolucji strunowców i pochodzenia kręgowców, intensywnie poszukiwaliśmy określonych genów, rodzin genów i konserwowanych elementów niekodujących w zsekwencjonowanym genomie cephalochordate Branchiostoma floridae, powszechnie nazywanych amphioxus lub lancelets. Szczególną uwagę poświęcono genom homeobox, genom opsyn, genom zaangażowanym w rozwój grzebienia nerwowego, receptorom jądrowym rozwój grzebienia nerwowego, geny receptorów jądrowych, geny kodujące składniki układu hormonalnego i odpornościowego oraz konserwatywnym wzmacniaczom cis-regulacyjnym. Genom amphioxus zawiera podstawowy zestaw genów strunowców zaangażowanych w rozwój i sygnalizację komórkową, w tym piętnasty gen Hox. Zestaw ten obejmuje wiele genów które zostały dokooptowane u kręgowców do nowych ról w rozwoju grzebienia nerwowego i odporności adaptacyjnej. odporności adaptacyjnej. Jednak tam, gdzie amphioxus ma pojedynczy gen, kręgowce często często mają dwa, trzy lub cztery paralogi pochodzące z dwóch duplikacji całego genomu. duplikacji całego genomu. Ponadto, kilka wzmacniaczy transkrypcji jest zachowanych między między płazami i kręgowcami - bardzo duża odległość filogenetyczna. W przeciwieństwie do tego, genomy urochordatów utraciły wiele genów, w tym różnorodność rodzin homeobox i genów zaangażowanych w funkcje hormonów steroidowych. Genom amphioxus wykazuje również cechy pochodne, w tym duplikacje opsyn i genów proponowane jako funkcjonujące we wrodzonej odporności i układach hormonalnych. Nasze wyniki wskazują, że genom amphioxus jest kluczowy dla zrozumienia biologii i ewolucji biologii i ewolucji deuterostomów, bezkręgowców i kręgowców. kręgowców. --- Konserwowane elementy niekodujące (CNE) w genomach kręgowców często działają jako rozwojowe, ale krytyczną kwestią jest to, jak dobrze ortologiczne sekwencje CNE zachowują tę samą aktywność u swoich gatunków, co jest cechą ważna dla uogólnienia badań nad organizmami modelowymi. Aby określić ilościowo, jak dobrze aktywność wzmacniacza CNE aktywność wzmacniacza została zachowana, porównaliśmy specyficzne dla anatomii aktywność 41 CNE ryb zebry w zarodkach ryb zebry z aktywnością ortologicznych ludzkich CNE w zarodkach myszy. Stwierdziliśmy, że 13/41 (∼30%) ortologicznych par CNE ortologicznych par CNE wykazuje zachowaną pozytywną aktywność u ryb zebry i myszy. myszy. Zachowana pozytywna aktywność jest tylko słabo związana z konserwacją sekwencji lub brakiem konserwacją sekwencji lub brakiem zasad podlegających przyspieszonej ewolucji. Silniejszym efektem jest to, że różna aktywność jest związana z dywergencją miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego. rozbieżnością miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego. Aby rozróżnić wkład cis- i trans-regulacyjnych zmian zmian trans-regulacyjnych, przeanalizowaliśmy 13 CNE w trójstronnym porównaniu eksperymentalnym porównanie: ludzkie CNE testowane u ryb zebry, ludzkie CNE testowane u myszy i ortologiczne CNE ryb zebry testowane u ryb zebry. Zarówno zmiany cis-, jak i trans wpływają na znaczną część CNE, chociaż sekwencje ludzkie i sekwencje ryb zebra wykazują różną aktywność u ryb zebra (wskazując na zmiany regulacyjne cis) dwukrotnie częściej niż sekwencje ludzkie wykazują rozbieżną aktywność, gdy są testowane u myszy i rybach zebra (wskazując na zmiany regulacyjne trans). We wszystkich czterech przypadkach, w których CNE zebry i człowieka wykazują podobny wzór ekspresji u zebry, ludzka CNE wykazuje również podobny wzór ekspresji u myszy. Sugeruje to że endogenna aktywność wzmacniacza ∼30% ludzkich CNE może być określona z eksperymentów na samych rybach zebra, a aby zidentyfikować te CNE, zarówno zebra i ludzkie sekwencje powinny zostać przetestowane. --- Kręgowiec Lhx2 jest członkiem rodziny czynników transkrypcyjnych LIM homeobox. czynników transkrypcyjnych. Jest niezbędny do prawidłowego rozwoju przodomózgowia, oka, układu węchowego i wątroby, a także do różnicowania komórek limfoidalnych. Jednakże, pomimo wysoce ograniczonego przestrzenno-czasowego wzorca ekspresji Lhx2, nic nie wiadomo o jego regulacji transkrypcyjnej. U ssaków i kurczaka, Crb2, Dennd1a i Lhx2 stanowią konserwatywny blok sprzężenia, podczas gdy Dennd1a jest utracony w locus Lhx2 fugu. Aby zidentyfikować funkcjonalne wzmacniacze Lhx2, przewidzieliśmy konserwatywne elementy niekodujące (CNE) w ludzkim, mysim i fugu Crb2-Lhx2 i zbadaliśmy ich funkcję u transgenicznych myszy w E11.5. Cztery z ośmiu testowanych konstruktów CNE funkcjonowały jako tkankowo-specyficzne wzmacniacze w określonych regionach ośrodkowego układu nerwowego i zwojach korzenia grzbietowego (DRG), odtwarzając częściowe i nakładające się wzorce ekspresji wzorce ekspresji genów Lhx2 i Crb2. Występowało znaczne nakładanie się domen domenach ekspresji CNE, co sugeruje, że CNE są albo nadmiarowymi wzmacniaczami lub regulują różne geny w locus. Używając dużego zestawu CNE (810 CNE) związanych z genami kodującymi czynniki transkrypcyjne, które ulegają ekspresji głównie w ośrodkowym układzie nerwowym, przewidzieliśmy cztery nadreprezentowane 8-merowe motywy, które mogą być związane z ekspresją w ośrodkowym układzie nerwowym. w ośrodkowym układzie nerwowym. Mutacja jednego z nich w CNE, który napędzał ekspresję reportera w cewie nerwowej. ekspresję reportera w cewie nerwowej i DRG zniosła ekspresję w obu domenach domenach, wskazując, że motyw ten jest niezbędny do ekspresji w tych domenach. Niepowodzenie czterech funkcjonalnych enhancerów w odtworzeniu pełnego wzoru ekspresji wzoru ekspresji Lhx2 w E11.5 wskazuje, że muszą istnieć inne enhancery Lhx2 które znajdują się poza badanym regionem lub są rozbieżne u ssaków i ryb. u ssaków i ryb. Inne podejścia, takie jak porównanie sekwencji między ssakami są wymagane do identyfikacji i scharakteryzowania takich enhancerów.
Czy zachowane elementy niekodujące działają jako wzmacniacze?
Znaczny odsetek niekodujących elementów zachowanych u odległych gatunków wykazuje aktywność wzmacniającą i inne formy funkcjonalności regulacyjnej.