Choroba Gauchera, wynikająca z obniżonej aktywności enzymu lizosomalnego glukocerebrozydazy, jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą spichrzeniową sfingolipidów. Ze względu na znaczną heterogeniczność ekspresji fenotypowej, została ona podzielona na nieneurologiczną chorobę typu 1 oraz typy 2 i 3, typy neurologiczne. Opisujemy homozygotyczność dla mutacji D409H w obrębie genu glukocerebrozydazy związaną z unikalną postacią choroby Gauchera typu 3. Dwunastu pacjentów, pochodzących z trzech arabskich rodzeństw, okazało się być homozygotycznymi dla mutacji D409H mutacji. U wszystkich stwierdzono apraksję okoruchową i postępującą wadę zastawki serca z minimalną organomegalią. serca z minimalną organomegalią. Po ekspresji w ludzkich komórkach w hodowli, przy użyciu hybrydowego systemu ekspresji wirusa T7/EMC/vaccinia, byliśmy w stanie wykazać, że mRNA niosące mutację D409H było mniej stabilne niż normalny odpowiednik. niż normalny odpowiednik. Eksperymenty pulsacyjne wykazały, że zmutowane białko białko wykazywało niższą stabilność niż normalny odpowiednik. Jego aktywność wobec sztucznego substratu 4-metylo umbelliferyloglukopiranozydu była podobna do zmutowanych enzymów niosących mutacje N370S lub L444P . Jednak w eksperymentach obciążeniowych z użyciem sprzężonego z lissaminą i rodaminą glukozylo-ceramidu jako substratu, rekombinowane zmutowane białko niosące mutację D409H wykazywało 28,63 +/- 6,05% aktywności wykazywanej przez normalny enzym enzymu. Mutacje L444P i N370S wykazywały odpowiednio 51,90 +/- 7,16 i 115,75 +/- 12,64% normalnej aktywności enzymu. normalnej aktywności enzymu. Ładowanie komórek homozygotycznych dla mutacji mutacji D409H wykazało 10. 05% aktywności wykazywanej przez normalne komórki. HOMOZYGOTY L444P i N370S wykazywały 25,3 i 98,5% aktywności glukocerebrozydazy fibroblastów napletkowych. odpowiednio aktywność glukocerebrozydazy. Wykazaliśmy, że homozygotyczność dla mutacji mutacji D409H jest unikalnym przypadkiem szczególnego fenotypu związanego ze specyficzną wewnątrzkomórkową glukocerebrozydazą. specyficzną wewnątrzkomórkową aktywnością glukocerebrozydazy. --- Badanie przesiewowe mutacji genu glukocerebrozydazy za pomocą analizy SSCP ujawniło nieprawidłowy wzór eksonu 10 u dwóch niespokrewnionych włoskich pacjentów z chorobą Gauchera. Bezpośrednie sekwencjonowanie zmutowanych próbek zidentyfikowało przejście G6490-->A. Ta sama mutacja została opisana wcześniej u japońskiego pacjenta z chorobą Gauchera typu III. Fenotyp kliniczny naszych pacjentów był typu I u jednego, którego drugi allel nosił mutację allel nosił mutację N370S, a typ II u drugiego z mutacją L444P mutacją. W tym drugim przypadku substytucja G6490-->A anuluje normalne miejsce Msp I, podczas gdy na przeciwległym chromosomie mutacja T6433-->C (L444P) wprowadza nowe miejsce Msp I. Msp I. Zatem trawienie Msp I amplifikowanego eksonu 10 jest użyteczną metodą identyfikacji dwóch mutacji. metoda identyfikacji dwóch mutacji jednocześnie. --- W populacji portugalskiej najczęstszą postacią choroby Gauchera jest typ 1. Mutacja genu glukocerebrozydazy N370S stanowi 63% zmutowanych alleli. zmutowanych alleli. Częstość występowania tej mutacji została dokładnie określona w populacji portugalskiej. populacji portugalskiej, która nie ma aszkenazyjskiego żydowskiego tła genetycznego. aszkenazyjskich. Częstotliwość genu wynosi 0,0043, z 95% granicami ufności między 0,0023 i 0,0063, uzyskano badając genomowe DNA z 2000 kart krwi losowo pobranych z krajowego programu badań przesiewowych noworodków. Na podstawie Na podstawie tej częstotliwości należy oczekiwać znacznie wysokiej liczby homozygot dla mutacji N370S w populacji portugalskiej. To odkrycie wspiera ideę że większość homozygot dla tej mutacji ma bardzo łagodny fenotyp kliniczny i pozostaje niezdiagnozowana. fenotyp kliniczny i pozostaje niezdiagnozowana. --- U większości pacjentów choroba Gauchera wynika z mutacji w genie kodującym glukocerebrozydazę. glukocerebrozydazę. Mutacja D409H jest trzecią najczęstszą u hiszpańskich pacjentów pacjentów, stanowiąc 5,7% wszystkich zmutowanych alleli. Ten allel jest związany głównie z neurologicznymi postaciami choroby. Ostatnio homozygotyczność dla mutacji mutacji D409H została powiązana ze szczególnym fenotypem, obejmującym specyficznymi objawami sercowo-naczyniowymi. Tutaj opisujemy drugiego hiszpańskiego pacjenta z genotypem D409H/D409H z bardzo wczesną manifestacją choroby. Pacjent rozpoczął enzymatyczną terapię zastępczą w wieku 3 miesięcy. Wspólne pochodzenie pochodzenie hiszpańskich alleli D409H zostało wykluczone przez analizę haplotypów przy użyciu wewnętrznego polimorfizmu genu glukocerebrozydazy i dwóch zewnętrznych markerów mikrosatelitarnych. zewnętrznych markerów mikrosatelitarnych. --- Porównaliśmy wzór substytucji genu glukocerebrozydazy (GBA) i pseudogenu glukocerebrozydazy (psGBA), dwóch wysoce homologicznych regionów pod różnymi presjami selektywnymi i na tym samym tle genomowym. Mutacje w GBA mogą prowadzić do choroby Gauchera, wrodzonego zaburzenia metabolicznego. Mutacje powodujące chorobę i neutralna zmienność w genie zostały porównane z neutralną zmiennością w pseudogenie. do neutralnej zmienności w pseudogenie. To porównanie oferuje wyjątkową możliwość lepszego zrozumienia działania selekcji oczyszczającej, ponieważ różnice między wzorcami mutacji można przypisać różnym presjom selektywnym. presji selektywnej. Podobną częstotliwość dinukleotydów CpG zaobserwowano w GBA i psGBA. psGBA, a pary CpG były mutowane z taką samą wysoką częstotliwością w obu regionach. Jednakże, nukleotydy nie będące w parach CpG częściej przyczyniały się do mutacji mutacji powodujących choroby niż do akceptowanych polimorfizmów. Ten wzorzec, który w genie, może wynikać z unikania CpG w krytycznych regionach. unikaniem CpG w krytycznych regionach w obrębie eksonów. --- Choroba Gauchera jest heterogenną chorobą charakteryzującą się upośledzoną aktywnością enzymu lizosomalnego glukocerebrozydazy. enzymu lizosomalnego glukocerebrozydazy. Ta heterogeniczność jest przypisywana dużej liczbie mutacji w odpowiednim genie. W celu przetestowania właściwości biochemiczne niektórych mutacji występujących w populacjach izraelskich, cDNA normalnej ludzkiej glukocerebrozydazy i cDNA niosących mutacje N370S, L444P, D409H, recTL, recNcil, P415R i 84GG zostały sprzężone z promotorem polimerazy T7 RNA w wektorze ekspresyjnym pochodzącym z wirusa krowianki (pTM-1). Rekombinowane wirusy zostały wyprodukowane i wykorzystane do infekowania ludzkich komórek hodowli tkankowej. Stabilność RNA i białka, rozpoznawanie przez przeciwciała monoklonalne anty-glukocerebrozydaza i wewnątrzkomórkową aktywność enzymatyczną. Wyniki wykazały, że allel D409H kierował syntezą cytoplazmatycznego RNA o zmniejszoną stabilnością w porównaniu z jego normalnym odpowiednikiem lub innymi zmutowanymi formami. Zmutowane białka D409H i L444P miały niższą stabilność niż ich normalne odpowiedniki. normalnego odpowiednika, podczas gdy zmutowane białko recNcil było bardziej stabilne. Tylko formy glukocerebrozydazy zawierające leucynę w pozycji 444 były rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne przeciwko glukocerebrozydazie (8E4 i 2C7). Pomiary aktywności enzymatycznej rekombinowanych białek w komórkach obciążonych fluorescencyjnym glukozyloceramidem wykazały, że zmutowany enzym N370S miał aktywność podobną do normalnego enzymu. Pozostałe zmutowane enzymy wykazywały różne stopnie aktywności, ogólnie odpowiadające fenotypom, z którymi są związane. fenotypom, z którymi są związane. Przedstawione wyniki pokazują wykorzystanie systemu ekspresji pochodzącego z wirusa Vaccinia i ładowanie żywych komórek fluorescencyjnym substratem jako skutecznych narzędzi do badania mutantów w chorobie Gauchera i innych lizosomach. i w innych chorobach lizosomalnych. --- Częstotliwość występowania dziewięciu różnych zmutowanych alleli w genie glukocerebrozydazy genie glukocerebrozydazy określono u 247 pacjentów z chorobą Gauchera, z których 176 było pochodzenia pochodzenia żydowskiego, 2 było Żydami z jednym nawróconym rodzicem, a 69 było pochodzenia pochodzenia nieżydowskiego. DNA przygotowano z krwi obwodowej, aktywnej sekwencje glukocerebrozydazy amplifikowano przy użyciu techniki PCR, a mutacje mutacje zidentyfikowano metodą hybrydyzacji oligonukleotydów specyficznych dla alleli. metodą hybrydyzacji oligonukleotydów. Mutacja N37OS pojawiła się w 69,77% zmutowanych alleli u pacjentów pochodzenia zmutowanych alleli u pacjentów pochodzenia żydowskiego i w 22,86% zmutowanych alleli u pacjentów pochodzenia nieżydowskiego. Mutacja 84GG, która do tej pory nie została znaleziona wśród pacjentów nieżydowskiego pochodzenia, występowała w 10,17% alleli choroby wśród pacjentów żydowskich. Mutacja IVS + 1 stanowiła 2,26% alleli choroby wśród pacjentów żydowskich i 1,43% wśród pacjentów nieżydowskich. 1,43% wśród pacjentów nieżydowskiego pochodzenia. RecTL, złożony allel zawierający cztery zmiany zmiany pojedynczej pary zasad, występował w 2,26% alleli u pacjentów żydowskiego pochodzenia i został znaleziony u dwóch (1,43%) pacjentów pochodzenia nieżydowskiego. Inny złożony allel, oznaczony jako "RecNciI" i zawierający trzy jednopunktowe mutacje mutacje, pojawił się w 7,8% alleli pacjentów nieżydowskiego pochodzenia i tylko w dwóch (0,56%) rodzin żydowskich. Częstość występowania mutacji L444P wśród nieżydowskich pacjentów z chorobą Gauchera wynosiła 31,43%, podczas gdy częstość jej występowania wśród żydowskich pacjentów pacjentów żydowskich wynosiła tylko 4,24%. Częstość występowania dwóch innych mutacji punktowych - D409H i R463C - wynosiło odpowiednio 5,00% i 3,57% wśród pacjentów nieżydowskich i nie było wśród żydowskiej populacji pacjentów z chorobą Gauchera. Częstość występowania mutacji R496H stwierdzonej do tej pory tylko wśród pacjentów żydowskiego pochodzenia, wynosiła 1,13%. Przedstawione wyniki Przedstawione wyniki pokazują, że siedem mutacji identyfikuje 90,40% mutacji wśród pacjentów żydowskich i że te siedem mutacji pozwala na zdiagnozowanie tylko 73,52% pacjentów nieżydowskiego pochodzenia. Identyfikacja dodatkowych zmutowanych alleli zwiększy dokładność wykrywania nosicielstwa. --- TŁO: Choroba Gauchera (GD) jest heterogenną chorobą charakteryzującą się upośledzoną aktywnością lizosomalnej glukocerebrozydazy. upośledzoną aktywnością lizosomalnej glukocerebrozydazy. Ta heterogeniczność jest przypisuje się częściowo istnieniu dużej liczby mutacji w odpowiednim genie. odpowiednim genie. PRZEDMIOT I METODY: Aby ustalić relacje genotyp-fenotyp, przeanalizowaliśmy resztkowe aktywności enzymatyczne sześciu naturalnie występujących mutacji występujących w hiszpańskiej populacji w genie glukocerebrozydazy [c.160G>A (V15M), c.485T>C (M123T), c.914C>T (P266L), c.1124T>C (L336P), c.1207A>C (S364R) i c.1510-1512delTCT (S465del)]. Zmutowane geny zostały subklonowane do wektora ekspresyjnego ssaków wektora ekspresyjnego pCR 3.1 i wyrażone przez przejściową transfekcję w komórkach komórkach COS. Aktywność enzymatyczna wyrażonego białka została zmierzona i porównano z cDNA ludzkiej glukocerebrozydazy typu dzikiego. Ponadto, dwa wcześniejsze allele, c.1226A>G (N370S) i c.1448T>C (L444P), zostały użyte do celów porównawczych. celów porównawczych. WYNIKI: Pozostała aktywność wyrażonych białek przy użyciu syntetycznego substratu substratu (4-metylobelliferylo-beta-D-glukopiranozyd, 4MU-Glu) wynosiła od 5,5% (dla delecji 3-bp) do 42,7% (dla mutacji S364R) aktywności enzymu typu dzikiego enzymu typu dzikiego. WNIOSEK: Niniejsze analizy mogą pomóc w lepszym zrozumieniu molekularnych i patogenezę choroby Gauchera. Jednak wyniki ekspresji zmutowanych enzymów są konieczne, ale niewystarczające do wyjaśnienia ostatecznego wyniku klinicznego choroby Gauchera. klinicznego wyniku choroby Gauchera. --- Choroba Gauchera (GD) jest najczęstszą z lizosomalnych chorób spichrzeniowych i jest jest spowodowana defektami genu GBA kodującego glukocerebrozydazę (GlcCerase). Nagromadzenie jej substratu, glukoacyloceramidu (GlcCer), jest uważane za główną przyczynę GD. główną przyczynę GD. Odkryliśmy tutaj, że ekspresja ludzkiego zmutowanego genu GlcCerase (hGBA), która jest związana z neuronopatią u pacjentów z GD, powoduje wady neurorozwojowe w oczach Drosophila. Dane wskazują, że stres retikulum endoplazmatycznego (ER) był podwyższony w oku Drosophila niosącym zmutowanych hGBA przy użyciu markerów stresu ER dXBP1 i dBiP. Stwierdziliśmy również że ambroksol, potencjalny farmakologiczny chaperon dla zmutowanych hGBA, może złagodzić fenotyp neuronopatii poprzez zmniejszenie stresu ER. Wykazaliśmy nowy mechanizm wad neurorozwojowych, w których pośredniczy stres ER poprzez ekspresję mutantów ludzkiego genu GBA w oku Drosophila. --- Choroba Gauchera jest dziedziczona w sposób autosomalny recesywny i jest najbardziej rozpowszechnioną lizosomalną chorobą spichrzeniową. najczęściej występującą lizosomalną chorobą spichrzeniową. Choroba Gauchera charakteryzuje się znaczną zmiennością fenotypową fenotypową i heterogenność molekularną, a kilka prostych i złożonych alleli i złożonych alleli genu kwaśnej beta-glukozydazy. Wykazano, że niektóre kombinacje alleli dobrze korelują z ciężkością choroby. nasileniem choroby, ale istnieje wielu pacjentów z chorobą Gauchera, których choroba nie jest wyjaśniona przez żadną z opublikowanych mutacji. Niniejsze badanie zostało podjęte w celu zidentyfikować zmutowane allele w takiej niekompletnie scharakteryzowanej chorobie Gauchera, w próbie znalezienia dalszych korelacji między fenotypem klinicznym a obecnością obecnością alleli kwaśnej beta-glukozydazy. RNA wyizolowano z linii komórkowych Gauchera Gauchera i przekształcono w cDNA, cDNA amplifikowano metodą PCR i klonowano, a kilka klonów dla każdego allelu kilka klonów dla każdego allelu poddano sekwencjonowaniu. Zidentyfikowano kilka nowych pojedynczo zmutowanych i i zmutowanych alleli, a hybrydyzację oligonukleotydów specyficznych dla sekwencji wykorzystano do weryfikacji obecności tych mutacji w genomie tych pacjentów. tych pacjentów. Wszystkie nowo zidentyfikowane mutacje występowały rzadko w populacji Gauchera, co utrudnia ustalenie, czy dziedziczenie określonej kombinacji alleli danej kombinacji alleli zawsze koreluje z objawami klinicznymi obserwowanymi u badanych pacjentów. klinicznymi obserwowanymi u badanych pacjentów. Trzy z nowo opisanych alleli były pojedynczymi mutacjami typu missense w eksonie 8, jedna była pojedynczą mutacją typu missense w eksonie 5, a piąta była pojedynczą mutacją typu missense w eksonie 5. w eksonie 5, a piąty był allelem złożonym, obejmującym serię różnych mutacji mutacji punktowych rozproszonych w eksonach 5 i 6.(ABSTRAKT SKRÓCONY DO 250 SŁÓW) SŁÓW) --- Choroba Gauchera (GD) jest zaburzeniem metabolizmu glikosfinglipidów spowodowanym przez niedoborem lizosomalnej kwaśnej beta-glukozydazy (GC), co skutkuje postępującym odkładanie się glukozyloceramidu w makrofagach. Analog glukozy, N-butylo-deoksynojirimycyna (NB-DNJ, Miglustat) jest inhibitorem glukozyloceramidu specyficznego dla ceramidu. specyficznej dla ceramidów glukozylotransferazy (CSG), która katalizuje pierwszy etap biosyntezy glikosfingolipidów i jest obecnie zatwierdzony do doustnego leczenia GD typu 1. GD typu 1. Stosując mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, skonstruowaliśmy plazmidy zawierające typ dziki i kilka mutacji w genie glukocerebrozydazy (GBA). Plazmidy Plazmidy transfekowano do komórek COS-7, a stabilne transfekowane linie komórkowe uzyskano przez selekcję genetyną (G418). Komórki hodowano przez 6 dni z pożywką z lub bez 10 mikroM NB-DNJ. Dodanie NB-DNJ do pożywki komórek COS-7 do pożywki komórkowej COS-7 prowadzi do 1,3-, 2,1-, 2,3-, 3,6- i 9,9-krotnego wzrostu aktywności S364R, wild aktywności GC S364R, typu dzikiego, N370S, V15M i M123T. Jednakże, nie zaobserwowano znaczących zmian w aktywności zmutowanych białek L444P, L336P i S465del, ale zaobserwowano niewielki spadek w rzadkim wariancie P266L. zaobserwowano niewielki spadek rzadkiego wariantu P266L. Wyniki te sugerują, że NB-DNJ, oprócz działania hamującego na CSG, działa również jako "chemiczny przyzwoitek", zwiększając aktywność kwaśnej beta-glukozydazy typu dzikiego i kilku zmutowanych białek GC, w tym najczęstszej mutacji N370S. Specyficzna lokalizacja miejsca wiązania Miglustat w GC jest nieznane. Potencjalne miejsca wiązania w enzymie zostały przeszukane za pomocą obliczeniowego dokowania molekularnego. Strategia wyszukiwania zidentyfikowała trzy potencjalne miejsca wiązania GC dla Miglustatu, z których jedno jest miejscem wiązania substratu enzymu, które było najlepiej ocenianym miejscem przez program AutoDock. Dlatego możliwe jest, że Miglustat wywiera swoje działanie przyzwoitości na kwaśną beta-glukozydazy, działając jako inhibitor związany w miejscu aktywnym. To wzrost aktywności kwaśnej beta-glukozydazy sugerowałby, że Miglustat jest nie tylko reduktorem substratu, ale także inhibitorem degradacji GC, z bardzo obiecującymi implikacjami klinicznymi dla leczenia pacjentów z GD. --- KRÓTKIE WPROWADZENIE: Choroba Gauchera (GD) jest chorobą autosomalną recesywną. spowodowaną mutacjami genu glukocerebrozydazy. Nosiciele są uważani za za osoby zdrowe, ponieważ nie występują u nich objawy choroby, ale wykazują oznaki dysfunkcji makrofagów. Celem badania było ustalenie, czy pacjenci z GD i osoby niebędące nosicielami mogą cierpieć na inne choroby w porównaniu w porównaniu do zdrowych krewnych niebędących nosicielami. PROJEKT: Badanie epidemiologiczne kohort historycznych. Fakt, że mają oni jeden lub zmutowanych alleli został uznany za czynnik ryzyka prowadzący do innych schorzeń (demencja, choroba Parkinsona). (demencja, choroba Parkinsona, udar niedokrwienny, choroba niedokrwienna serca, niereumatyczna choroba zastawek serca). choroba, niereumatyczna choroba zastawkowa, nowotwory hematologiczne i niehematologiczne, zwłóknienie płuc. niehematologiczne, zwłóknienie płuc, gruźlica, kamica żółciowa i schizofrenia). Schizofrenia). Wszystkie osoby, pacjenci, nosiciele i zdrowe grupy kontrolne miały wspólne to samo tło genetyczne i wpływ środowiska. - Pacjenci i krewni zarejestrowani w hiszpańskim rejestrze choroby Gauchera. STATYSTYKA: Do obliczenia ryzyka względnego zastosowano test Mantela-Haenszela. zastosowano test Mantela-Haenszela. Korekta Yatesa została zastosowana, gdy wielkość próby była zbyt mała. Wartość p <0,05 została przyjęta dla istotności statystycznej. WYNIKI: W badaniu wzięło udział 370 osób z 79 różnych rodzin. Otrzymaliśmy możliwe do oceny informacje od 45 rodzin (56%), w sumie od 258 osób (69%): 59 zdrowych osób (średnia wieku 32,20 lat, ZAKRES: 10-85 lat; M 57,63%/F 42,37%), 132 nosicieli (średnia wieku 35,91 lat, zakres: 1-79 lat; M 56,82%/F 43,18%) i 67 pacjentów (średnia wieku 32,16 lat, zakres wiek 32,16 lat, ZAKRES: 1-76; M 44,78%/F 55,22%. - Względne ryzyko wystąpienia jakiejkolwiek choroby w odniesieniu do statusu Gauchera: Pacjent vs Zdrowy 9,69 (95% przedział ufności [CI] przedział ufności [CI] 2,00-63,99; p 0,0006). Pacjent vs Nosiciel 3,74 (CI 1,53-9,27; p 0,001); Nosiciel vs Zdrowy 2,59 (CI 0,52-12,50; p 0,21). Względne ryzyko wystąpienia jakiejkolwiek choroby w odniesieniu do płci wynosiło 3,96 dla pacjentek (CI 1,01-16,75; p 0,02) i 1,34 dla nosicielek (CI 0,27-6,75; p = 0,68). WNIOSEK: Jako grupa, pacjenci z chorobą Gauchera wydają się mieć większe ryzyko ryzyko zachorowania na inne powszechne, niespokrewnione choroby niż nosiciele lub zdrowi krewni. To nadmierne ryzyko jest szczególnie wyższe wśród pacjentek i nie może być wyjaśnić różnicami w wieku. Status nosiciela nie wydaje się zwiększać ryzyka wystąpienia innych chorób. --- Pseudogeny, powstałe w wyniku duplikacji funkcjonalnych genów, przyczyniają się do funkcjonalną złożoność swoich genów rodzicielskich. Gen glukocerebrozydazy (GBA), zlokalizowany w regionie bogatym w geny na chromosomie 1q 21, jest zmutowany w chorobie Gauchera. Gauchera. Obecność sąsiadujących, wysoce homologicznych pseudogenów zarówno dla GBA i metaksyny 1 w tym locus zwiększa prawdopodobieństwo rearanżacji DNA. My opisujemy łatwą metodę identyfikacji i analizy rekombinowanych alleli u pacjentów z chorobą Gauchera. z chorobą Gauchera. Genomowe DNA od 20 pacjentów z rekombinowanymi allelami GBA i pięciu kontroli oceniano w celu identyfikacji rearanżacji DNA lub liczby kopii przy użyciu sześciu sond specyficznych dla genu GBA lub pseudogenu. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono na genomowym DNA i Southern blot przy użyciu HincII wraz z sekwencjonowaniem potwierdziły wyniki w czasie rzeczywistym. Można było wykryć zarówno fuzje, jak i duplikacje GBA. Zidentyfikowano różne miejsca zidentyfikowano, a allele powstałe w wyniku konwersji genów można było od wzajemnie rekombinowanych alleli. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym jest czułą i szybką metodą wykrywania fuzji i duplikacji u pacjentów z rekombinowanymi allelami GBA. rekombinowanymi allelami GBA. Technika ta jest bardziej czuła, szybsza i tańsza niż analiza Southern blot i może być stosowana w laboratoriach diagnostycznych oraz do wykrywania innych rekombinowanych alleli w genomie. --- Choroba Gauchera jest najczęstszą lizosomalną chorobą spichrzeniową o wysokiej częstości występowania w populacji Żydów aszkenazyjskich. w populacji Żydów aszkenazyjskich, ale występuje również w innych populacjach. populacjach. Obecność ośmiu mutacji (1226G, 1448C, IVS2+1. 84GG, 1504T, 1604T, 1342C i 1297T) oraz całkowitej delecji genu beta-glukocerebrozydazy badano u 25 niespokrewnionych pacjentów nieżydowskiego pochodzenia z chorobą Gauchera w Niemczech. W populacji żydowskiej trzy z tych mutacji stanowią ponad 90% wszystkich zmutowanych alleli. ponad 90% wszystkich zmutowanych alleli. Ponadto krewni dwóch pacjentów zostali włączeni do naszego badania. Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych i sekwencjonowanie sekwencjonowania produktów PCR uzyskanych z DNA leukocytów krwi obwodowej. przeprowadzono w celu analizy mutacji. Delecję genu wykryto przez porównanie radioaktywnie znakowanych fragmentów PCR zarówno funkcjonalnych genu beta-glukocerebrozydazy i pseudogenu. Wśród niespokrewnionych pacjentów, Zbadano 50 alleli, a mutacje zidentyfikowano w 35 allelach (70%), podczas gdy 15 alleli (30%) pozostało niezidentyfikowanych. Najbardziej rozpowszechnioną mutacją w w naszej grupie pacjentów była mutacja 1226G (370Asn-->Ser), stanowiąca 18 alleli (36%). alleli (36%), a następnie mutacja 1448C (444Lcu-->Pro), którą stwierdzono w 12 allelach (24%). 12 allelach (24%). Całkowita delecja genu była obecna w dwóch allelach (4%). Mutacja IVS1+2 (mutacja splicingowa), 1504T (463Arg-->Cys), jak również 1342C (409Asp-->His) były obecne w jednym allelu (2%). Żaden z alleli alleli 84GG (przesunięcie ramki), 1604A (496Arg-->His) lub 1297T (394Val-->Leu). Rozkład ten różni się od aszkenazyjskiej populacji aszkenazyjskich, ale jest podobny do innych grup kaukaskich, takich jak populacja hiszpańska i portugalska. populacje hiszpańskie i portugalskie. Nasze wyniki potwierdzają zmienność wzorców mutacji u pacjentów z chorobą Gauchera o różnym pochodzeniu etnicznym. Wszyscy pacjenci zostali podzieleni na dziewięć grup według ich genotypu, a ich stan kliniczny był powiązany z indywidualnym genotypem. z indywidualnym genotypem. Charakterystyka genotypu/fenotypu mutacji 1226G, 1448C, i 1342C z poprzednich badań zostały potwierdzone przez nasze wyniki. --- Siedmiu członków rodziny Żydów aszkenazyjskich z chorobą Gauchera w 3 kolejnych pokoleniach pokoleń przebadano na obecność 2 powszechnych mutacji występujących w genie glukocerebrozydazy. występujących w genie glukocerebrozydazy. Genomowe DNA z fibroblastów krwi lub skóry krewnych krewnych amplifikowano przy użyciu techniki PCR, a poszczególne mutacje zidentyfikowane za pomocą oligonukleotydów specyficznych dla zmutowanych sekwencji. Cztery osoby były homozygotyczne dla mutacji w aminokwasie 370 (mutacja 370) o której wiadomo, że występuje tylko w chorobie typu 1. Pozostałe 3 dotknięte chorobą krewne były heterozygotami złożonymi dla tej mutacji i mutacji w aminokwasie 444 (mutacja NciI), która w stanie homozygotycznym jest związana z chorobą neurologiczną. chorobą neurologiczną. Nasilenie kliniczne było bardziej wyraźne u złożonych heterozygot niż u homozygot. homozygotach. Ponieważ mutacja jest obecna u Aszkenazyjczyków, diagnostyka molekularna w rodzinach nosicieli molekularna w rodzinach, które są nosicielami mutacji NciI, powinna okazać się przydatna w w ocenie ryzyka wystąpienia neurologicznych postaci choroby Gauchera. --- Mutacja N370S stanowi 63% zmutowanych alleli glukocerebrozydazy u portugalskich pacjentów z Gauchera typu 1. portugalskich pacjentów z chorobą Gauchera typu 1. Wcześniej wykazano, że ta mutacja mutacja jest powiązana z formą Pv1.1- polimorfizmu PvuII i sugerowała, że że mutacja N370S w allelach glukocerebrozydazy ma aszkenazyjskie pochodzenie żydowskie. pochodzenie. Stwierdziliśmy, że u portugalskich pacjentów z chorobą Gauchera typu 1 mutacja ta jest również niezmiennie związana z haplotypem Pv1.1-, pomimo faktu, że nie ma dowodów na aszkenazyjskie pochodzenie żydowskie w tej populacji. --- Choroba Gauchera (GD) wynika z niedoboru enzymu lizosomalnego glukocerebrozydazy oraz, w bardzo rzadkich przypadkach, niedoboru jej aktywatora, sapozyny C. Złożoność identyfikacji i scharakteryzowania mutacji w genie glukocerebrozydazy jest bardzo trudna. mutacji w genie glukocerebrozydazy (GBA1) jest spowodowana dużą liczbą zmutowanych alleli, istnieniem zmutowanych alleli, istnieniem wysoce homologicznego pseudogenu i jego lokalizacją w bardzo bogatej strefie genów. w bardzo bogatej strefie genów, co sprzyja występowaniu złożonych alleli. alleli. Chociaż korelacje genotyp-fenotyp w EG nie są całkowicie ustalone, istnieje szereg ogólnych cech, ponieważ mutacja c.1226A>G (N370S) jest często związana z pewnym stopniem neuroprotekcji, a homozygotyczność dla c.1226A>G homozygotyczność mutacji c.1448T>C (L444P) wiąże się z objawami neurologicznymi. objawy neurologiczne. --- W chorobie Gauchera (GD) dziedziczny niedobór glukocerebrozydazy powoduje w gromadzeniu się glukocerebrozydu w lizosomach. Chociaż prawie 300 mutacji w genie glukocerebrozydazy (GBA), zdolność do przewidywania fenotypu na podstawie genotypu jest niewielka. przewidywania fenotypu na podstawie genotypu jest dość ograniczona. W tym badaniu staraliśmy się zbadać potencjalne transkrypcyjne elementy regulacyjne GBA dla wariantów, które przyczyniają się do różnorodności fenotypowej. W szczególności, wygenerowaliśmy sekwencję genomową sekwencję dla ortologicznego regionu genomowego (około 39,4 kb) obejmującego GBA u ośmiu ssaków innych niż człowiek. Porównania obliczeniowe uzyskanych sekwencji sekwencji, przy użyciu ludzkiej sekwencji jako odniesienia, pozwoliło na identyfikację wielogatunkowych sekwencji konserwatywnych (MCS). Dalsze analizy przewidywały obecność dwóch domniemanych klastrów transkrypcyjnych elementów regulatorowych przed i za GBA, zawierających pięć i trzy miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego (TFBS). miejsca wiążące czynnik transkrypcyjny (TFBS). Konstrukcja reporterowa lucyferazy firefly (Fluc) konstrukt zawierający sekwencję flankującą gen GBA został użyty do przetestowania funkcjonalne konsekwencje zmiany tych konserwatywnych sekwencji. Przewidywane TFBS były indywidualnie zmieniane przez ukierunkowaną mutagenezę, co skutkowało zwiększoną ekspresją Fluc dla jednego miejsca i zmniejszoną ekspresję dla siedmiu innych miejsc. Testy przesunięcia żelowego potwierdziły utratę wiązania białka jądrowego dla kilku zmutowanych konstruktów. Te zidentyfikowane sekwencje niekodujące flankujące GBA mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji genu, przyczyniając się do do złożoności leżącej u podstaw różnorodności fenotypowej obserwowanej w GD.
Jaki gen jest zmutowany w chorobie Gauchera?
Gen glukocerebrozydazy (GBA)