Projektowanie i ocena terapii zespołów niedokrwistości sierpowatokrwinkowej i talasemii beta opiera się na naszym zrozumieniu akumulacji hemoglobiny podczas ludzkiej erytropoezy. erytropoezy. Tutaj przedstawiamy bezpośrednie pomiary składu hemoglobiny i RNA (mRNA) w hodowanych komórkach CD34(+) i korelujemy te pomiary z badaniami pomiary z badaniami świeżo uzyskanych próbek szpiku kostnego. Poziomy hemoglobiny w różnicujących się komórkach porównano również z cechami morfologicznymi, immunofenotypowymi i oceną cyklu komórkowego. Populacja dużych preproerytroblastów została po raz pierwszy zidentyfikowana w ciągu 24 godzin i stała się dominującą populacją do dnia 5. populacja do dnia 5. Przejście od proerytroblastów do bazofilnych normoblastów nastąpiło później, od 7 do 9 dnia i korelowało ze szczytem 74,1% +/- 3,9% komórek. +/- 3,9% komórek w fazie S cyklu komórkowego. Ortochromatyczne normoblasty były dominującym i ostatecznym typem komórek do dnia 13. Wysokosprawna chromatografia cieczowa wysokosprawnej chromatografii cieczowej ilościowego oznaczania hemoglobiny płodowej (HbF) i dorosłej (HbA) oraz ilościowe oznaczenie mRNA globiny w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym wykazało skoordynowany wzrost akumulacji zarówno białek, jak i mRNA wśród tych populacji populacjach na różnych etapach rozwoju. Analizy ilościowe na świeżo posortowanych populacjach szpiku kostnego szpiku kostnego wykazały podobny wzorzec wzrostu z beta-globiną i HbA jako dominującymi gatunkami zarówno na wczesnych, jak i późnych etapach różnicowania. My nie znaleźliśmy dowodów na dominujące populacje HbF lub przełączanie podczas różnicowania w dorosłych komórkach. Zamiast tego, gwałtowny wzrost zarówno HbF (heterokomórkowej) i HbA (pancelularnej), co zbiegło się w czasie z wierzchołkiem cyklu komórkowego i proerythroblast-basophilic normoblast przejście. Na podstawie tych pomiarów doszliśmy do wniosku, że zawartość HbF i HbA są regulowane szybkością proliferacji podczas erytropoezy dorosłych. --- Hemoglobina płodowa (HbF), dominująca hemoglobina u płodu, jest mieszaniną dwóch gatunków molekularnych (alfa(2(G)gamma(2) i alfa(2(A)gamma(2)). dwóch gatunków molekularnych (alfa(2)(G)gamma(2) i alfa(2)(A)gamma(2)), które różnią się tylko w pozycji 136, odzwierciedlając produkty tylko w pozycji 136, odzwierciedlając produkty dwóch nieallelicznych genów gamma-globiny gamma-globiny. W momencie narodzin HbF stanowi około 70% całkowitej Hb. Stosunek (G)gamma:(A)gamma globiny w HbF normalnego noworodka wynosi 70:30, podczas gdy w śladowych ilościach HbF, które występują u dorosłych, odwraca się do 40:60 z powodu zamiany genu gamma na beta-globinę. Zmiany tych proporcji są wskazują na defekt molekularny na poziomie syntezy HbF. Jakościowe hemoglobinopatie spowodowane wariantami strukturalnymi łańcuchów (G)gamma i (A)gamma oraz ilościowe hemoglobinopatie wpływające na syntezę HbF, takie jak talasemie gamma, duplikacje, triplikacje, a nawet sekstuplikacje genów gamma-globiny. gamma-globiny, które mogą być wykrywane w lizatach krwi noworodków. opisano. Ponadto opisano kilka stanów patologicznych i niepatologicznych wpływających na klaster genów beta-globiny, takich jak beta-talasemia, choroba sierpowata choroba, deltabeta-talasemia i dziedziczna trwałość zespołów HbF, charakteryzują się ciągłą syntezą gamma-globiny. charakteryzują się ciągłą syntezą łańcuchów gamma-globiny w dorosłym życiu. życiu. Badania tych naturalnych mutantów związanych ze zwiększoną syntezą HbF w dorosłym życiu zapewniły znaczny wgląd w zrozumienie kontroli ekspresji genów globiny i przełączania Hb. --- Pacjenci, u których uzyskano przeszczep szpiku kostnego komórek progenitorowych pochodzących z krwi pępowinowej stanowiły okazję do zbadania ekspresji płodowej Hb przez noworodkowe progenitory hematopoetyczne progenitorów hematopoetycznych w organizmie postneonatalnym. Komórki krwi pępowinowej od histokompatybilnego rodzeństwa zostały z powodzeniem przeszczepione dwojgu dzieciom z zespołem niedokrwistości zespołem niedokrwistości Fanconiego. Jeden z dawców przeszczepu miał heterokomórkowy dziedziczne utrzymywanie się płodowej Hb, najwyraźniej z powodu triplikacji genu gamma-globiny. drugi dawca był hematologicznie normalny. Stosunek G gamma/A gamma u pacjenta, który otrzymał przeszczep od dawcy z dziedziczną Hb był znacznie podwyższony, podobnie jak w przypadku krwi pępowinowej dawcy przeszczepu. krwi pępowinowej dawcy, a stosunek ten pozostawał podwyższony w kolejnych miesiącach. U u drugiego dziecka stosunek G gamma/A gamma bezpośrednio po przeszczepie był typowy dla normalnego noworodka. typowy dla normalnego noworodka, a w ciągu następnych kilku miesięcy powrócił do wzorca dorosłego. do wzorca osoby dorosłej. Badania syntezy globiny przeprowadzone wkrótce po wszczepieniu wykazały stosunek syntezy Hb płodu do Hb dorosłego u obu pacjentów, który był typowe dla normalnych noworodków. W ciągu następnych kilku miesięcy obaj pacjenci przeszli na wzór dorosłych. Przełączanie płodowej Hb na dorosłą Hb u tych pacjentów wydawało się następować w sekwencji czasowej nieodłącznie związanej z przeszczepionymi noworodkowymi komórkami progenitorowymi komórek progenitorowych, bez zauważalnego wpływu postneonatalnych czynników środowiskowych. czynników środowiskowych. Program zmiany Hb wydaje się być nieodłączną cechą noworodkowych komórek hematopoetycznych. hematopoetycznych komórek progenitorowych noworodka. --- Utrzymywanie się hemoglobiny płodowej u wielu pacjentów z delecją typu beta i wzorce ekspresji ludzkich genów globiny u transgenicznych myszy sugerują, że przełączanie genów gamma myszy sugerują, że przełączanie genów gamma- na beta-globinę wynika przede wszystkim z rywalizacji genów gamma- i beta-globiny o interakcję z regionem kontrolnym beta-globiny (LCR). regionem kontrolnym locus (LCR). Aby zdefiniować sekwencje regulatorowe, które są niezbędne dla przewagi konkurencyjnej genu gamma na wczesnych etapach rozwoju, stabilne transgeniczne linie myszy zostały wyprodukowane z konstruktami LCR gamma-beta zawierającymi delecje 5'-brzegowego DNA gamma. Wszystkie konstrukty zawierały pełny 22 kb LCR, 4,1 kb genu beta-globiny i gen gamma-globiny z 1348, 383, 202, 130, 72 lub 52 bp sekwencji 5'-flanking. Analiza rozszerzenia primerów woreczka żółtkowego, wątroby płodu i RNA krwi z tych linii wykazała, że region między -202 i -130 ludzkiego promotora genu gamma-globiny był wymagany do tłumienia ekspresji genu beta-globiny na wczesnych etapach rozwoju. Cztery miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych w tym regionie [GATA(p), Oct1, GATA(d) i CACCC] zostały zmutowane niezależnie w konstruktach LCR gamma-beta i wyprodukowano transgeniczne linie myszy. Tylko mutacja pola gamma CACCC spowodowała w wysokim poziomie ekspresji genu beta-globiny we wczesnych zarodkach. Wyniki te pokazują, że pole CACCC ludzkiego genu gamma-globiny odgrywa krytyczną rolę rolę w specyficzności rozwojowej ludzkiego genu beta-globiny. Dane sugerują również że czynniki wiążące gamma CACCC box pośredniczą w interakcjach LCR-gamma, które normalnie zwiększają gamma-globinę i hamują ekspresję genu beta-globiny w płodowych komórkach erytroidalnych. komórkach erytroidalnych. --- Leczenie dorosłych komórek macierzystych pochodzących z krwi transformującym czynnikiem wzrostu (TGF-beta) podczas pierwszych 3-4 dni w hodowli zwiększa proporcje i bezwzględną liczbę komórek erytroidalnych wykazujących następnie ekspresję hemoglobiny płodowej (komórki F+ komórki). Zmiana proporcji komórek F+ może być spowodowana przełączaniem globin lub selektywnego wpływu na ekspansję subpopulacji komórek macierzystych z różnymi programami ekspresji globiny. programami ekspresji globiny. Aby rozróżnić te dwa mechanizmy, porównaliśmy porównaliśmy wpływ TGF-beta na proliferację i ekspresję globiny z efektami dobrze zbadanych czynników, o których wiadomo, że zwiększają stężenie hemoglobiny płodowej (HbF) u pacjentów z sierpowatymi komórkami krwi. pacjentów z anemią sierpowatą. Hydroksymocznik w równym stopniu hamował komórki erytroidalne F+ i F- a zatem nie wpływała na proporcje F+. Aza-cytydyna i maślan sodu, znane reaktywatory ekspresji gamma-globiny, tłumiły komórki F+ i F- różnie i zwiększały proporcje komórek F+ z zależnością od leczenia czas podobny do TGF-beta. W przeciwieństwie do TGF-beta, środki te nie miały nałożony efekt stymulujący. Dane sugerują, że TGF-beta reaktywuje ekspresję gamma-globiny, w połączeniu z sekwencyjną stymulacją i supresją erytropoezy. Podobieństwa między działaniami TGF-beta i terapeutycznymi reaktywatorami hemoglobiny płodowej sprawiają, że można sobie wyobrazić, że TGF-beta może mieć potencjał do zwiększenia HbF u pacjentów z zaburzeniami hemoglobiny beta zaburzenia. --- Zbadaliśmy wpływ rapamycyny na hodowle progenitorów erytroidalnych pochodzących z krwi obwodowej z krwi obwodowej 10 pacjentów z talasemią beta, różniących się znacznie pod względem w odniesieniu do ich potencjału do produkcji hemoglobiny płodowej (HbF). W tym celu zastosowaliśmy dwufazową procedurę hodowli płynnej do hodowli progenitorów erytroidalnych progenitorów erytroidalnych, wysokosprawną chromatografię cieczową do analizy produkcji HbF i reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją do ilościowej akumulacji mRNA globiny. Wyniki wykazały że rapamycyna indukowała wzrost HbF w hodowlach pochodzących od wszystkich badanych pacjentów z beta-talasemią. badanych pacjentów z talasemią beta i wzrost ich ogólnej zawartości Hb na komórkę. Indukujący efekt rapamycyny był ograniczony do akumulacji mRNA gamma-globiny mRNA, będąc jedynie niewielkim dla beta-globiny i żadnym dla mRNA alfa-globiny. mRNA alfa-globiny. Zdolność rapamycyny do preferencyjnego zwiększania mRNA gamma-globiny i produkcji HbF w komórkach prekursorowych erytroidalnych od pacjentów z pacjentów z talasemią beta ma ogromne znaczenie, ponieważ środek ten (znany również jako sirolimus lub rapamune) jest już stosowany klinicznie jako środek zapobiegający odrzuceniu po przeszczepie nerki. Dane te sugerują, że rapamycyna gwarantuje jako potencjalny lek terapeutyczny w talasemii beta i niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. --- Przerwanie normalnego przejścia ekspresji hemoglobiny między płodem a dorosłym powinno w znacznym stopniu złagodzić zespoły anemii sierpowatej i beta-talasemii. Osiągnięcie tego celu klinicznego wymaga solidnego zrozumienia genu gamma-globiny i wyciszania białka podczas rozwoju człowieka. W tym celu W tym celu, związane z wiekiem zmiany w fenotypach globiny krążących ludzkich komórek erytroidalnych od 5 pępowin, 99 niemowląt i 5 dorosłych dawców. Nieoczekiwanie, średnio 95% erytrocytów i retikulocytów krwi pępowinowej wyrażało HbA i gen beta-globiny dorosłych, a także HbF i geny gamma-globiny. gamma-globiny. Rozkład ekspresji genów hemoglobiny i globiny następnie zmienił się gwałtownie z powodu ekspansji komórek pozbawionych HbF lub gamma-globiny mRNA (komórki wyciszone). W dorosłych retikulocytach mniej niż 5% wyrażało mRNA mRNA gamma-globiny. Dane te są zgodne z modelem "przełączania" u ludzi który początkowo wynika w dużej mierze z koekspresji genów gamma- i beta-globiny oraz konkurencji podczas rozwoju płodowego. konkurencji podczas rozwoju płodowego. W przeciwieństwie do tego, wczesne życie postnatalne jest naznaczone szybką akumulacją komórek, które posiadają niewykrywalne mRNA gamma-globiny i HbF. mRNA i HbF. W zjawisku wyciszania pośredniczy mechanizm wymiany komórkowej. wymiany komórkowej. Ten nowy wzór wyciszania może być ważny dla rozwoju terapii wzmacniających HbF. --- Mechanizmy leżące u podstaw zamiany ludzkiego genu beta-globiny z płodu na dorosłego pozostają do ustalenia. Chociaż istnieją istotne dowody eksperymentalne sugerują, że metylacja DNA promotora jest zaangażowana w ten proces, większość danych pochodzi z badań w systemach innych niż ludzkie. Oceniliśmy ludzką gamma- i beta-globiny w pierwotnej ludzkiej wątrobie płodowej (FL) i dorosłym szpiku kostnym (ABM). komórkach erytroidalnych szpiku kostnego (ABM). Nasze wyniki pokazują, że ogólnie rzecz biorąc, metylacja promotora metylacja i ekspresja genów są odwrotnie powiązane. Jednakże, CpGs przy -162 promotora promotora gamma i -126 promotora beta są hipometylowane odpowiednio w ABM i FL, odpowiednio. Badaliśmy również metylację promotora gamma-globiny podczas różnicowania in in vitro komórek erytroidalnych. Promotory gamma są początkowo hipermetylowane w komórkach CD34(+). CpGs górnego promotora gamma stają się hipometylowane podczas fazy różnicowania preerytroidów, a następnie są remetylowane później, podczas erytropoezy. Okres hipometylacji promotora hipometylacji koreluje z przejściową ekspresją genu gamma-globiny i może wyjaśniać wcześniej zaobserwowaną produkcję hemoglobiny płodowej, która występuje podczas wczesnej erytropoezy dorosłych. Wyniki te stanowią pierwsze kompleksowe badanie zmian rozwojowych w metylacji promotorów ludzkiej gamma- i beta-globiny i potwierdzają hipotezę, że metylacja promotora odgrywa rolę w ludzkim przełączaniu genów w locus beta-globiny. --- CEL: Erytropoeza jest regulowana przez niektóre czynniki zewnętrzne i wewnętrzne, takie jak mikroRNA (miRNA). mikroRNA (miRNA). miRNA są endogennie małymi niekodującymi regulatorowymi RNA, które odgrywają istotną rolę w różnych losach komórkowych. regulacyjne RNA, które odgrywają istotną rolę w różnych losach komórkowych, krytycznych procesy; wzrost, apoptoza, metabolizm, przeżycie komórek, a zwłaszcza ich różnicowanie. różnicowaniu. Wykazano, że kilka miRNA, takich jak miR-16 i miR-451, jest skorelowanych z różnicowaniem erytroidalnym. Biorąc pod uwagę znaczenie miRNA w różnicowaniu komórkowym, celem niniejszego badania było zbadanie roli miRNA w różnicowaniu hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) do komórek komórek erytroidalnych przy braku czynników wzrostu i cytokin stymulujących. MATERIAŁY I METODY: Komórki macierzyste CD133+ zostały zainfekowane lentiwirusami zawierającymi sekwencję prekursorową miR-451/miR-16, różnicowanie erytroidalne było oceniano za pomocą RT-PCR dla łańcuchów hemoglobiny i antygenów powierzchniowych, również przez barwienie banzydyną. WYNIKI: Regulacja w górę miR-451, ale nie miR-16, może indukować ekspresję α, β i γ-globiny w komórkach CD133+ i γ-globinie w komórkach CD133+. w komórkach CD133+ i mają silną korelację z pojawieniem się markerów CD71 i CD235a w tych komórkach. Co więcej, regulacja miR-451 w górę zwiększa liczbę komórek dodatnich komórek banzydyny do ~ %40. WNIOSEK: Nasze wyniki dostarczają mocnych dowodów na to, że regulacja miR-451 w górę silnie indukuje różnicowanie erytroidalne i dojrzewanie komórek macierzystych CD133+. W związku z tym, metoda ta może stanowić użyteczną technikę produkcji sztucznej krwi RBC i być stosowana jako nowa strategia terapii genowej hemoglobinopatii, takich jak β-talasemie i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa. --- Terapia genowa może okazać się niewystarczająca do osiągnięcia całkowitego odwrócenia fenotypu fenotypu β-talasemii ze względu na obecne ograniczenia w projektowaniu wektorów i schemat mieloablacyjny. Po transferze genów, wszystkie lub duża część komórek erytroidalnych komórek erytroidalnych może wyrażać suboptymalne poziomy β-globiny, osłabiając potencjał terapeutyczny leczenia. potencjał terapeutyczny leczenia. Naszym celem była ocena, czy w przypadku braku całkowitego odwrócenia fenotypu β-globiny po transferze genu, możliwe jest zastosowanie możliwe jest zastosowanie indukcji hemoglobiny płodowej w celu wyeliminowania resztkowych agregatów α-globiny i osiągnięcia normalnego poziomu hemoglobiny. Transgeniczne linie komórkowe K562 i komórki prekursorowe erytroidalne od pacjentów z β(0)39-talasemią. Terapię genową przeprowadzono za pomocą wektora lentiwirusowego T9W. Indukcję hemoglobiny płodowej hemoglobiny płodowej uzyskano stosując mitramycynę. Poziomy mRNA i hemoglobiny zostały określono za pomocą qRT-PCR i HPLC. Najpierw przeanalizowaliśmy wpływ mitramycyny na transgeniczne linie komórkowe transgeniczne linie komórkowe K562 zawierające różne kopie wektora lentiwirusowego niosącego ludzki gen β-globiny, wykazując, że ekspresja mRNA γ-globiny i produkcja HbF może być indukowana w obecności wysokiego poziomu ekspresji genu β-globiny i akumulacji HbA. i akumulacji HbA. Następnie poddaliśmy działaniu erytroidalnych komórek progenitorowych pochodzących od pacjentów z talasemią β za pomocą T9W, który wyraża ludzki gen β-globiny i mitramycynę oddzielnie lub w połączeniu. Gdy transdukcja naszym wektorem lentiwirusowym jest niewystarczająca do całkowitego wyeliminowania niesparowanych łańcuchów α-globiny, połączenie terapii transferu genu β-globiny z indukcją hemoglobiny płodowej może być bardzo skuteczne. indukcja może być bardzo skuteczna w usuwaniu nadmiaru białek α-globiny w talasemicznych komórkach progenitorowych erytroidalnych. --- Talasemia beta jest genetycznym zaburzeniem krwinek czerwonych wpływającym na łańcuch beta-globiny genu hemoglobiny dorosłych. Powoduje to nadmierną akumulację niesparowanych produktów genu łańcucha alfa, co prowadzi do skrócenia żywotności krwinek czerwonych i rozwoju ciężkiej niedokrwistości. Obecne leczenie tej choroby obejmuje regularną transfuzję krwi i uzupełniającą terapię chelatującą w celu obniżenia przeciążenie żelazem wywołane transfuzją. Czynniki przełączające hemoglobinę płodową zostały do leczenia genetycznych zaburzeń krwi, takich jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa i beta-talasemia. beta-talasemia, w celu zrekompensowania dysfunkcyjnej postaci łańcucha łańcucha beta-globiny w hemoglobinie dorosłych. Uzasadnieniem tego podejścia jest sparowanie nadmiaru normalnego łańcucha alfa-globiny z alternatywnym płodowym łańcuchem gamma w celu promowania przeżycia czerwonych krwinek i złagodzenia niedokrwistości. Przeprogramowanie różnicowania w nienaruszonych, dojrzałych, dorosłych białych krwinkach w odpowiedzi na opisano włączenie przeciwciała monoklonalnego CR3/43. Ta forma wstecznego rozwoju została określona jako "retrodifferentacja", z możliwością do ponownej ekspresji różnych markerów komórek macierzystych w heterogennej populacji białych krwinek. białych krwinek. Ta forma przeprogramowania lub reontogenezy do bardziej pluripotencjalnych komórek macierzystych powinna odzwierciedlać wczesną hematopoezę i ułatwić ekspresję płodowego i/lub dorosłego programu syntezy hemoglobiny lub regeneracji podczas infuzji i późniejszego ponownego różnicowania. W tym przypadku wynik infuzji autologicznych retrodifferentowanych komórek macierzystych (RSC) do 21 pacjentów z talasemią beta. W ciągu 6 miesięcy infuzja 3-godzinnych autologicznych komórek macierzystych RSC poddanych warunkom sprzyjającym hematopoezie pacjentom z beta-talasemią zmniejszyła średnie zapotrzebowanie na transfuzję krwi, zwiększyła średnią syntezę hemoglobiny płodowej i znacząco obniżyła średnie stężenie ferrytyny w surowicy. Towarzyszył temu zawsze wzrost zawsze towarzyszył wzrost średniej objętości krwinek (MCV), średniej hemoglobiny stężenia hemoglobiny w ciałku (MCH) i średniego stężenia hemoglobiny w ciałku (MCHC) u takich pacjentów. Nie odnotowano żadnych niepożądanych skutków ubocznych w odpowiedzi na infuzję autologicznego RSC. Ta nowatorska procedura kliniczna może głęboko zmodyfikować wyniszczający przebieg wielu zaburzeń genetycznych w warunkach autologicznych, tym samym torując drogę do wykorzystania pluripotencji ze zróżnicowanych komórek do przejściowej regeneracji genetycznie zdegenerowanej tkanki, takiej jak krew talasemiczna. --- W przełączaniu genów globiny mogą pośredniczyć białka wyrażane na różnych etapach rozwoju. etapach rozwoju. Ich identyfikacja może wyjaśnić mechanizmy konwersji z płodowej do dorosłej produkcji globiny i prowadzić do nowych podejść do odwracania lub opóźniania przełączania genów gamma- do beta-globiny. Aby zbadać tę komórki erytroleukemii K562 indukowano do różnicowania za pomocą 1,25, 2,5 i 5 mM maślanu sodu, a ekspresję genów badano po 24, 48 i 72 godzinach. 72 h. Różnicowanie erytroidalne zostało zweryfikowane przez barwienie benzydyną i przez pomiar aktywności transdukowanego promotora genu gamma-globiny A połączonego z genem reporterowym lucyferazy genem reporterowym lucyferazy. Wykorzystując łańcuchową reakcję polimerazy z różnicowaniem (PCR), całkowite mRNA wyekstrahowane z indukowanych komórek w każdym punkcie czasowym indukcji poddano odwrotnej transkrypcji w obecności starterów zakotwiczonych w A, G i C oraz 16 arbitralnych starterów, obliczonych w celu amplifikacji około 50% wyrażonych genów. Amplifikowane mRNA z indukowanych i nieindukowanych komórek rozdzielono w żelach w żelach poliakrylamidowych i porównano. Ponad 110 fragmentów cDNA, które wydawały się reprezentowały gatunki mRNA o podwyższonej lub obniżonej ekspresji w indukowanych komórkach K562. zidentyfikowano. Sześćdziesiąt cztery z tych fragmentów miały ponad 95% homologii do znanych sekwencji GenBank. GenBank. Sklonowano siedemnaście fragmentów o cechach czynników transkrypcyjnych. czynników transkrypcyjnych. Obejmują one gen związany z różnicowaniem-1 (drg-1), PAX 3 / czynnik transkrypcyjny głowicy widelca, HZF2, który jest palcem cynkowym związanym z Kruppel białko, trzy białka helisa-pętla-helisa (heir-1, Id3 i GOS8), alfa-NAC koaktywator transkrypcyjny, białko domeny LIM i czynnik regulujący niedotlenienie trofoblastów czynnik regulujący niedotlenienie trofoblastu. Różnicowa ekspresja wszystkich 17 fragmentów w ciągu 72 godzin została potwierdzona przez odwrotną analizę Northern dot blot, półilościową PCR przy użyciu zagnieżdżonych starterów i analizę Northern. Dojrzewanie erytroidalne w indukowanych komórkach K562 jest związane z różnicową ekspresją wielu genów. Niektóre kodują czynniki transkrypcyjne, które mogą wpływać na inicjację syntezy HbF. Prawie połowa klonów o zróżnicowanej ekspresji zawierała cDNA o niezidentyfikowanych otwartych ramek odczytu i są one przedmiotem dalszych badań. --- Choroba sierpowatokrwinkowa (SCD) i ß-talasemia stanowią najczęstsze hemoglobinopatie spowodowane odpowiednio hemoglobinopatie spowodowane odpowiednio zmianą cech strukturalnych lub niedoborem produkcji łańcucha ß cząsteczki Hb. Inne hemoglobinopatie charakteryzują się różnymi mutacjami w genach α- lub ß-globiny i są związane z niedokrwistością oraz mogą wymagać okresowych lub przewlekłych transfuzji krwi. okresowych lub przewlekłych transfuzji krwi. Dlatego też ß-talasemia, SCD i inne hemoglobinopatie hemoglobinopatie są doskonałymi kandydatami do badań genetycznych, ponieważ są zaburzeniami monogenowymi i potencjalnie można je wyleczyć poprzez wprowadzenie lub pojedynczego genu do przedziału hematopoetycznego lub pojedynczej komórki macierzystej. komórki macierzystej. Początkowe próby transferu genów w tych hemoglobinopatiach okazały się nie powiodły się ze względu na ograniczenia dostępnych wektorów transferu genów. Wraz z wektorów lentiwirusowych wiele początkowych ograniczeń zostało przezwyciężonych. Nowe podejścia skupiły się również na ukierunkowaniu na konkretną mutację w genach ß-globiny. genach ß-globiny, korygowaniu sekwencji DNA lub manipulowaniu losem translacji RNA i splicingu w celu przywrócenia ß-globiny. translacji i splicingu w celu przywrócenia syntezy łańcucha ß-globiny. Techniki te mogą potencjalnie skorygować defekt w hematopoetycznych komórkach macierzystych lub być do modyfikacji komórek macierzystych generowanych od pacjentów dotkniętych tymi zaburzeniami. zaburzeniami. W niniejszym przeglądzie omówiono strategie terapii genowej dla hemoglobinopatii, w tym wykorzystanie wektorów lentiwirusowych, generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), celowanie w geny, splice-switching oraz kodon stop. --- Ekspresja mRNA i białka epsilon- i gamma-globiny została określona u trzech gatunków małp Starego Świata (Macaca mulatta, Macaca nemestrina i Cercopithecus aethiops). Stosując RT-PCR ze starterami dla epsilon- i i gamma-globiny, oba mRNA wykryto we wczesnych stadiach płodowych, podczas gdy w 128 dni (85% pełnego terminu), tylko gamma uległa ekspresji. Wysokosprawna chromatografia cieczowa chromatografia cieczowa została użyta do rozdzielenia i oznaczenia ilościowego, a wspomagana matrycą laserową desorpcję / jonizację spektrometrię mas zastosowano do identyfikacji polipeptydów globiny. polipeptydów globiny. Polimorfizm alfa-globiny zaobserwowano u wszystkich badanych gatunków. badanych gatunków. Podczas życia płodowego dominującą ekspresją była gamma-globina. globina typu beta. Czerwone krwinki niemowląt nadal zawierały znaczne ilości gamma-globiny. znaczną ilość gamma-globiny, która zmniejszyła się do nieistotnych poziomów w 14 tygodniu, gdy ekspresja ekspresja beta-globiny osiągnęła wartości dla dorosłych. Stosunek gamma1- do gamma2-globiny (odpowiednik Ggamma/Agamma u ludzi) wynosił około 2,5, podobny do stosunku Ggamma/Agamma obserwowanego u ludzi. Zatem ekspresja genu gamma-globiny w tych gatunkach małp Starego Świata ma trzy cechy wspólne z ludzką ekspresją ludzka ekspresja: ekspresja obu zduplikowanych genów gamma, względna przewaga ekspresji gamma1 nad gamma2 oraz opóźnienie przejścia z gamma- do beta-globiny. gamma- do beta-globiny aż do okresu okołoporodowego. Tak więc, katarrhiny wydają się mają wspólny wzorzec przełączania rozwojowego w klastrze genów beta-globiny który różni się od czasu ekspresji u prosimian lub małp Nowego Świata. małp Nowego Świata. Nasze wyniki wskazują, że małpy Starego Świata, takie jak Rhesus, może służyć jako organizm modelowy (przypominający ludzi) do eksperymentalnego badania wzorców ekspresji genów globiny w okresie embrionalnym, płodowym i postnatalnym. postnatalnych. --- Badanie przełączania hemoglobiny stanowiło główny punkt zainteresowania w hematologii ze względu na w dużej mierze ze względu na kliniczne znaczenie zamiany hemoglobiny płodowej na hemoglobinę dorosłych dla opracowania ukierunkowanych podejść w celu złagodzenia nasilenia beta-hemoglobinopatii. Ponadto proces, w którym zachodzi ta zmiana stanowi ważny paradygmat dla regulacji genów rozwojowych. W niniejszym przeglądzie przedstawiamy przegląd zarówno embrionalnego prymitywnego, jak i ostatecznego w ekspresji hemoglobiny, jak również przejście od płodu do dorosłego, które jest unikalny dla ludzi i małp Starego Świata. Omawiamy naturę tych przełączników i modele ich regulacji. Czynniki, które zostały zasugerowane do regulacji ten proces. Wraz ze wzrostem zrozumienia i odkryciem molekularnych regulatorów przełączania hemoglobiny, takich jak BCL11A, nowe ścieżki badania mogą ostatecznie doprowadzić do nowych terapeutycznych, opartych na mechanizmach podejść do reaktywacji hemoglobiny płodowej u pacjentów. --- Talasemia beta (tal) jest najczęstszą recesywną chorobą dziedziczną w populacjach śródziemnomorskich. populacjach śródziemnomorskich. Szacuje się, że częstość występowania tej choroby w populacji w populacji marokańskiej wynosi od 1,5 do 3,0%. Ciężkie formy homozygotycznej przypadki talasemii wymagają kosztownego i wymagającego technicznie leczenia (przeszczep szpiku kostnego) lub paliatywnego. terapie lecznicze (przeszczep szpiku kostnego) lub paliatywne (przewlekła transfuzja/chelatacja). Polimorfizm -158 (C-->T) genu (G)gamma-globiny (polimorfizm XmnI) jest znany z tego, że znany jest z łagodzenia ciężkości choroby ze względu na jego silny związek ze zwiększoną produkcją hemoglobiny płodowej (Hb F). Wśród wielu znanych mutacji w Maroku, sześć jest powszechnych [kodon 39 (C-->T), kodon zmiany ramki (FSC) 8 (-AA), IVS-II-745 (CG), FSC 6 (-A), -29 (A-->G) i IVS-I-1 (G-->A)]. W tym W tym badaniu zbadaliśmy, w 82 marokańskich chromosomach beta-talasemii, korelację między korelację między sześcioma powszechnymi mutacjami a polimorfizmem XmnI przy użyciu testu dokładnego dokładnego testu Fishera. Polimorfizm XmnI został podzielony na dwie kategorie (XmnI [+] i XmnI [-]), a sześć powszechnych mutacji marokańskich na dwie grupy (grupa I z FSC 8 i grupa II bez FSC 8). Przeprowadzono korelację między kategorią XmnI [+] i sześcioma powszechnymi mutacjami indywidualnie, które wykazały, że 68% chromosomów w kategorii XmnI [+] miało mutację FSC 8 (-AA). Wyniki Wyniki przedstawione tutaj pokazują, że istnieje dodatnia korelacja między polimorfizmem XmnI a mutacją FSC 8 w powiązaniu z haplotypem IV [- + - + + + - +] (p <10(-5)). Podsumowując, molekularne oznaczanie markerów genetycznych we wczesnym dzieciństwie dzieciństwie pomoże zidentyfikować kandydatów do farmakologicznego przełączania Hb F przez hydroksymocznika (HU). W populacji marokańskiej dobrą odpowiedź na leczenie HU należy podejrzewać w przypadkach z polimorfizmem -158 (C-->T) w powiązaniu z haplotypem IV i wewnętrzną strukturą genu beta-globiny 3.
Czy dorosłych ludzi można skłonić do produkcji hemoglobiny płodowej?
Hemoglobina płodowa lub hemoglobina płodowa jest głównym białkiem transportującym tlen u ludzkiego płodu w ciągu ostatnich siedmiu miesięcy rozwoju w macicy i u noworodka do około 6 miesiąca życia. Pod względem funkcjonalnym hemoglobina płodowa różni się najbardziej od hemoglobiny dorosłych tym, że jest w stanie wiązać tlen z większym powinowactwem niż forma dorosła, zapewniając rozwijającemu się płodowi lepszy dostęp do tlenu z krwiobiegu matki.
Niezwykle wysoki poziom produkcji hemoglobiny płodowej może złagodzić chorobę sierpowatą i β-talasemię. Chociaż wysiłki ukierunkowane na farmakologiczną stymulację hemoglobiny płodowej jako podejścia do leczenia tych schorzeń spotkały się z ograniczonym sukcesem, istnieje duża zmienność w indywidualnych reakcjach.
W oparciu o wyniki, dorośli ludzie mogliby być indukowani do produkcji hemoglobiny płodowej.