TŁO: CTCF jest wysoce konserwatywnym i niezbędnym białkiem palca cynkowego wyrażane praktycznie we wszystkich typach komórek. W połączeniu z kohezyną organizuje chromatynę w pętle, regulując w ten sposób ekspresję genów i zdarzenia epigenetyczne. Funkcja CTCFL lub BORIS, specyficznego dla jąder paralogu CTCF, jest mniej jasna. mniej jasna. WYNIKI: Stosując immunohistochemię na skrawkach jąder i mikroskopię opartą na fluorescencji mikroskopii na nienaruszonych żywych kanalikach nasiennych, pokazujemy, że CTCFL jest tylko przejściowo obecny podczas spermatogenezy, przed rozpoczęciem mejozy, kiedy białko kolokalizuje w jądrach z wszechobecnie wyrażanym CTCF. DYSTRYBUCJA CTCFL pokrywa się całkowicie z dystrybucją Stra8, białka indukowanego kwasem retinowym białkiem niezbędnym do propagacji mejozy. Odkryliśmy, że brak CTCFL u myszy powoduje bezpłodność z powodu częściowo penetrującej atrofii jąder. zanik jąder. Niedobór CTCFL wpływa na ekspresję wielu genów specyficznych dla jąder, w tym genów, w tym Gal3st1 i Prss50. Łącznie dane te wskazują, że CTCFL odgrywa wyjątkową rolę w spermatogenezie. Badania ekspresji RNA w całym genomie w komórkach ES wyrażające znakowaną V5 i GFP formę CTCFL pokazują, że geny, które są w jądrze z niedoborem CTCFL są regulowane w komórkach ES. Dane te wskazują, że CTCFL jest regulatorem genów męskich komórek płciowych. Ponadto, analiza wiązania DNA w całym genomie Analiza wiązania DNA pokazuje, że CTCFL wiąże sekwencję konsensusową, która jest bardzo bardzo podobna do sekwencji CTCF. Jednak tylko ~3,700 z ~5,700 CTCFL- i ~31 000 miejsc wiążących CTCF pokrywa się. CTCFL wiąże promotory z luźno zmontowanymi nukleosomami, podczas gdy nukleosomy, podczas gdy CTCF faworyzuje miejsca konsensusu otoczone fazowymi nukleosomy. Wreszcie, test ratunkowy oparty na komórkach ES pokazuje, że CTCFL jest funkcjonalnie różni się od CTCF. WNIOSKI: Nasze dane sugerują, że skład nukleosomów określa wiązanie CTCFL i CTCF w całym genomie. Proponujemy, aby przejściowa ekspresja CTCFL w spermatogoniach i spermatocytach preleptotenowych służy do zajmowania podzbioru promotorów i utrzymania ekspresji genów męskich komórek płciowych. --- W odpowiedzi immunologicznej na inwazję patogenów pośredniczy głównie rodzina receptorów przezbłonowych receptorów Toll-podobnych i modulowane przez szereg dalszych efektorów. W szczególności, rodzina czterech związanych z receptorem interleukiny 1 (IRAK) reguluje reaktywność na endotoksyny bakteryjne. Farmakologiczne ukierunkowanie poszczególnych składników IRAK może być korzystne w leczeniu infekcji bakteryjnych. infekcji bakteryjnych. Tutaj badaliśmy transkrypcyjną regulację ludzkiego genu IRAK2. genu IRAK2. Analiza regionu promotora IRAK2 ujawnia domniemane miejsca wiązania dla kilku czynników transkrypcyjnych, w tym ZIP (EGR1 i SP1), CTCF i AP-2beta. Usunięcie miejsc ZIP lub AP-2 nie wpłynęło znacząco na aktywność promotora IRAK2 w naiwnych i traktowanych endotoksyną komórkach jednojądrzastych, w uśpionych i aktywowanych komórkach T Jurkat i aktywowanych limfocytach T Jurkat, w komórkach płuc i nerek. W przeciwieństwie do tego, odkryliśmy że CTCF odgrywa główną rolę w transkrypcji IRAK2. Test elektroforetycznego przesunięcia test przesunięcia elektroforetycznego fragmentów DNA zawierających wyspę CpG IRAK2, ujawnił pojedyncze miejsce wiązania o wysokim powinowactwie dla regulatora transkrypcji i białka izolatora chromatyny białka izolatora chromatyny, CTCF. Test ten ujawnił miejsce wiązania CTCF w mysim promotorze Irak2. Obecność białka CTCF w ludzkim promotorze IRAK2 została potwierdzona przez test immunoprecypitacji chromatyny. Specyficzne reszty które oddziaływały z białkiem CTCF, zostały zidentyfikowane przez metylację metylacji. We wszystkich analizowanych liniach komórkowych, w tym komórkach płuc, nerek, monocytarnych i komórek T, konstrukt reporterowy lucyferazy IRAK2, zawierający nienaruszone miejsce wiązania CTCF, wykazywał silną aktywność promotora. Jednak aktywność promotora IRAK2 była dramatycznie zmniejszona dla konstruktów ze zmutowanym miejscem wiązania zmutowanym miejscem wiązania CTCF. --- CTCF jest wszechobecnie wyrażanym regulatorem podstawowych procesów genomowych w tym transkrypcji, interakcji wewnątrz- i międzychromosomalnych oraz struktury chromatyny. strukturę. Ze względu na jego kluczową rolę w funkcjonowaniu genomu, wzorce wiązania CTCF od dawna zakładano, że są one w dużej mierze niezmienne w różnych środowiskach komórkowych. środowiskach komórkowych. Tutaj analizujemy wzorce zajętości CTCF w całym genomie przez ChIP-seq w 19 różnych typach komórek ludzkich, w tym w normalnych komórkach pierwotnych i liniach nieśmiertelnych. nieśmiertelne linie. Zaobserwowaliśmy wysoce powtarzalne, ale zaskakująco plastyczne genomowe wiążące krajobrazy, wskazujące na silną selektywną komórkową regulację zajęcia CTCF . Porównanie z masowo równoległymi danymi sekwencjonowania bisulfitowego wskazuje, że 41% zmiennego wiązania CTCF jest związane z różnicową metylacją DNA metylacją DNA, skoncentrowaną w dwóch krytycznych pozycjach w sekwencji rozpoznawania CTCF sekwencji. Nieoczekiwanie, wzorce wiązania CTCF były znacząco różne w normalnych i nieśmiertelnych komórkach. w porównaniu z komórkami nieśmiertelnymi, przy czym te ostatnie wykazywały rozległe zaburzenia wiązania CTCF związane ze zwiększoną metylacją. Uderzające jest to, że temu zaburzeniu towarzyszy wzrost ekspresji CTCF, w wyniku czego zarówno normalne, jak i nieśmiertelne komórki normalne i nieśmiertelne komórki utrzymują tę samą średnią liczbę miejsc zajmowanych przez CTCF w całym genomie. Wyniki te ujawniają ścisły związek między metylacją DNA a globalnymi wzorcami zajętości głównego czynnika regulacyjnego specyficznego dla sekwencji czynnika regulacyjnego. --- Molekularne podstawy zaangażowania progenitorów w linię eozynofilów i mechanizmy mechanizmy, za pomocą których geny specyficzne dla eozynofilów są wyrażane i regulowane podczas różnicowania są nieznane. Ekspresja peroksydazy eozynofilowej (EPO) jest ograniczona do linii eozynofilów. Aby zrozumieć mechanizmy zaangażowane w transkrypcyjną regulację ekspresji genu EPO, sklonowaliśmy region genu EPO przed miejscem startu transkrypcji i przeanalizowaliśmy elementy cis-acting elementy wymagane do aktywności promotora EPO w indukowalnej przez eozynofile linii komórek białaczkowych HL-60-C15. linii komórkowej HL-60-C15. Region 5'-flanking genu EPO zawierający 1,5 kilobaz sekwencji przed miejscem startu transkrypcji został subklonowany do pozbawionego promotora wektora pXP2-lucyferazy. Konstrukt EPO-pXP2 i mutanty delecyjne 5' elektroporowano do komórek HL-60-C15 i oceniano aktywność reporterową lucyferazy. i oceniano aktywność reporterową lucyferazy. Konstrukt promotora EPO-pXP2 z -1,5-kilobazą powtarzalnie wyrażał > 120-krotnie większą aktywność lucyferazy niż bez promotora pXP2, a 12-krotny (90%) spadek aktywności promotora uzyskano, gdy sekwencje między -122 i -45 par zasad (bp) zostały usunięte. Specyficzność promotora EPO dla linii eozynofilów analizowano przez transfekcję konstruktów Konstrukty EPO-pXP2 i mutanty delecyjne do komórek HL-60-C15 i macierzystej linii HL-60; aktywność promotora EPO była 8-10 razy mniejsza w linii rodzicielskiej HL-60, sugerując elementy specyficzne dla linii w regionie od -122 do -45 bp. Aby dalej scharakteryzować sekwencje regulatorowe ważne dla aktywności promotora, przeprowadziliśmy analizę skanowania łączników w regionie od -122 do -45 bp i zidentyfikowaliśmy szereg pozytywnie i negatywnie działających elementów w promotorze. DNase I footprinting przeprowadzono z ekstraktami jądrowymi HL-60-C15, HL-60 i HeLa, aby zidentyfikować białek jądrowych, które mogą wiązać się z elementami funkcjonalnymi; te eksperymenty zidentyfikowano trzy chronione regiony promotora EPO, które odpowiadają funkcjonalne segmenty zdefiniowane przez analizę skanowania łączników i które zawierają konsensus, potencjalne miejsca wiązania dla czynników transkrypcyjnych Egr-1, H4TF-1, PuF, CTCF, UBP-1 i GaEII. Dalsze badania nad regulacją promotora EPO powinny wyjaśnić unikalne cechy transkrypcyjne regulacji genów eozynofili w rozwoju granulocytów. rozwoju granulocytów. --- Ewolucja imprintingu genomowego u ssaków nastąpiła ponad 100 milionów lat temu i doprowadziła do powstania genów haploidalnych. lat temu i doprowadziła do powstania genów, które są funkcjonalnie haploidalne z powodu ekspresji zależnej od rodzica pochodzenia. Pomimo licznych dowodów z badań badań na wielu gatunkach sugerujących obecność genów wdrukowanych na ludzkim chromosomie 14. ludzkim chromosomie 14, ich tożsamość pozostawała nieuchwytna. Tutaj przedstawiamy identyfikację dwóch wzajemnie wdrukowanych genów, GTL2 i DLK1, które razem definiują nowy klaster imprintingu na ludzkim chromosomie 14q32. Geny GTL2 (gene trap locus 2) koduje nieulegający translacji RNA. RNA. DLK1 (delta, Drosophila, homolog-like 1) jest genem ulegającym ojcowskiej ekspresji który koduje białko transmembranowe zawierające sześć motywów powtórzeń naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) blisko spokrewnionych z tymi obecnymi w rodzinie cząsteczek sygnałowych delta/notch/serrate rodziny cząsteczek sygnałowych. Ekspresja ojcowska, lokalizacja chromosomalna i biologiczna funkcja DLK1 sprawiają, że jest to prawdopodobny kandydat na gen genem kandydującym dla fenotypu callipyge u owiec. Wiele z przewidywanych cech strukturalnych i i regulacyjnych cech domeny DLK1/GTL2 jest wysoce analogicznych do tych zaangażowanych w regulację odcisku IGF2/H19, w tym dwa hemimetylowane dla białka blokującego enhancer kręgowców, CTCF. Wyniki te dostarczają dowodów na to, że wspólny mechanizm i organizacja domen może być stosowany dla zestawionych, wzajemnie odciśniętych genów. --- Izolatory chromatyny to elementy DNA, które regulują poziom ekspresji genów poprzez zapobieganie wyciszaniu genów poprzez utrzymywanie granic heterochromatyny granic heterochromatyny lub zapobiegając aktywacji genów poprzez blokowanie interakcji między wzmacniaczami i promotorami. Czynnik wiążący CCCTC (CTCF), wszechobecnie wyrażany 11-palcowego białka wiążącego DNA, jest jedynym białkiem zaangażowanym w tworzenie izolatorów u kręgowców. Podczas gdy CTCF jest zaangażowane w różne funkcje regulacyjne, CTCF było badane tylko w ograniczonej liczbie typów komórek w ludzkim genomie. W związku z tym nie jest jasne, czy zidentyfikowane specyficzne dla typu komórki różnice w miejscach wiązania CTCF są funkcjonalnie istotne. Tutaj identyfikujemy i charakteryzujemy specyficzne dla typu komórki i i wszechobecne miejsca wiązania CTCF w ludzkim genomie w 38 typach komórek wyznaczonych przez konsorcjum Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE). Te komórki specyficzne dla typu komórki i wszechobecne miejsca wiązania CTCF wykazują wyjątkowo wszechstronne funkcje transkrypcyjne i charakterystyczne cechy chromatyny. Ponadto potwierdzamy funkcję bariery izolacyjnej wiązania CTCF i badamy nową funkcję CTCF w replikacji DNA. funkcję CTCF w replikacji DNA. Wyniki te stanowią krytyczny krok w kierunku kompleksowego i systematycznego zrozumienia izolatorów zależnych od CTCF i ich wszechstronnej roli w ludzkim genomie. --- Gen transportera serotoniny (5-HTT) zawiera domenę zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (ang. (VNTR) w obrębie intronu 2, który jest często związany z wieloma schorzeniami neurologicznymi, w tym zaburzeniami afektywnymi. Implikacje tego polimorfizmu polimorfizmu nie są jeszcze poznane, jednak wcześniej wykazaliśmy, że że 5-HTT VNTR jest transkrypcyjną domeną regulacyjną, a alleliczna zmienność wspiera zróżnicowaną ekspresję genów reporterowych in vivo i in vitro. Celem tego badania była identyfikacja czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za regulację tego VNTR. regulację tego VNTR. Wykorzystując drożdżowy ekran jednohybrydowy, znaleźliśmy czynnik transkrypcyjny Y box wiążący białko 1 (YB-1) oddziałuje z 5-HTT VNTR. Zgodnie z tym, wykazaliśmy w teście genu reporterowego, że polimorficzne domeny VNTR różnie reagują na egzogenne YB-1 i że YB-1 wiąże się z VNTR in vitro w sposób specyficzny dla sekwencji. Co ciekawe, czynnik czynnik transkrypcyjny czynnik wiążący CCTC (CTCF), wcześniej wykazany do interakcji z YB-1, zakłóca zdolność VNTR do wspierania ekspresji genu reporterowego kierowanego przez YB-1. ekspresji genu reporterowego. Ponadto, CTCF blokuje wiązanie YB-1 do jego sekwencji rozpoznawania DNA sekwencjami rozpoznającymi DNA in vitro, zapewniając w ten sposób możliwy mechanizm regulacji aktywacji VNTR przez YB-1 przez CTCF. Dlatego zidentyfikowaliśmy YB-1 i CTCF jako czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne, przynajmniej częściowo, za modulację funkcji VNTR jako transkrypcyjnej domeny regulatorowej. Nasze dane sugerują nowy mechanizm, który częściowo wyjaśnia zdolność różnych liczb kopii VNTR do wspierania zróżnicowanej ekspresji genów reporterowych w oparciu o miejsca wiązania YB-1 miejsca wiązania. --- Imprinting genomowy, czyli zróżnicowana ekspresja genów autosomalnych w zależności od ich rodzica pochodzenia, obserwuje się u wszystkich ssaków euterycznych, które zostały zbadanych. W większości przypadków geny, które są wdrukowane u jednego gatunku, są również wdrukowane w innych gatunkach, co sugeruje, że imprinting poprzedzał promieniowanie euteryków. promieniowanie. Na przykład, kodujący RNA gen H19 jest represjonowany podczas ojcowskiego dziedziczenia dziedziczeniu ojcowskim u wszystkich badanych do tej pory gatunków. Zaskakujące jest więc to, że jest niezwykle mała konserwacja sekwencji wśród cis-działających elementów regulatorowych DNA które są wymagane do imprintingu H19 i ściśle powiązanego genu Igf2 i ściśle powiązanego genu Igf2. Najbardziej konserwatywną cechą w regionie kontrolnym imprintingu (ICR) jest obecność wielu miejsc wiązania dla białka palca cynkowego CTCF, podnosząc możliwość, że wiązanie CTCF może być wystarczające do wzajemnego imprintingu H19 i Igf2. Aby zbadać, czy ludzki transgen H19, zawierający siedem miejsc CTCF, jest prawidłowo rozpoznawany i imprintowany u myszy, transgen 100 kb zawierający ludzki gen H19 został wprowadzony do mysiej linii zarodkowej linii zarodkowej myszy. Ludzki transgen był specyficznie metylowany po przejściu przez męską linię zarodkową w sposób zależny od liczby kopii, ale metylacja była niestabilna, ulegając stopniowej utracie podczas rozwoju. W konsekwencji transgen transgen ulegał silnej ekspresji zarówno w przypadku dziedziczenia matczynego, jak i ojcowskiego. Wyniki te dowodzą, że sygnały zarówno dla nabycia, jak i utrzymania metylacji szybko się rozchodzą.
Jaka jest przybliżona liczba miejsc wiązania CTCF w ludzkim genomie?
Liczba miejsc wiązania CTCF w ludzkim genomie wynosi od 31 000 do 50 000.