Rak piersi jest zdecydowanie najczęściej diagnozowaną formą raka i główną przyczyną zgonów kobiet. przyczyną zgonów z powodu raka u kobiet. Przydatne klinicznie biomarkery do wczesnego wykrywania raka piersi mogłyby doprowadzić do znacznego zmniejszenia śmiertelności. Tutaj opisujemy szczegółową analizę z wykorzystaniem proteomiki opartej na żelu w połączeniu ze spektrometrią mas i immunohistochemią (IHC) śródmiąższowych płynów nowotworowych (TIF) i prawidłowych płynów płynów śródmiąższowych guza (TIF) i prawidłowych płynów śródmiąższowych (NIF) pobranych od 69 prospektywnych pacjentek z rakiem piersi. pacjentek z rakiem piersi. Celem tego badania była identyfikacja białek regulowanych w górę przez raka. białek, które są eksternalizowane przez komórki w mikrośrodowisku guza większości, jeśli nie mikrośrodowisku większości, jeśli nie wszystkich tych zmian. W tym celu zastosowaliśmy etapową strategię badawczą odkrywania biomarkerów do analizy tych próbek zamiast porównywać wszystkie próbki między sobą, co wiąże się z nieodłącznymi problemami problemy ze zmiennością między i wewnątrz próbek. W tym celu zdecydowaliśmy się użyć próbek pochodzących z z pojedynczej pary guz/tkanka łagodna (pacjent 46, potrójnie ujemny guz), dla których mieliśmy dobrze dopasowane próbki pod względem liczby komórek nabłonkowych, aby wygenerować początkowy zestaw danych. W tej pierwszej fazie znaleźliśmy 110 białek, które były regulowane w górę o współczynnik 2 lub więcej w TIF, z których niektóre zostały potwierdzone przez IHC. W drugiej fazie przeprowadziliśmy systematyczną komputerową analizę komputerową analizę żeli 2D pozostałych 68 próbek TIF w celu zidentyfikować białka o podwyższonej regulacji w TIF 46, które były zderegulowane w 90% lub więcej wszystkich dostępnych TIF, reprezentując w ten sposób powszechne markery raka piersi. Ten druga faza wyróżniła zestaw 26 markerów raka piersi, z których większość została również zidentyfikowana przez uzupełniającą analizę przy użyciu LC-MS/MS. Ekspresja kalretikuliny, komórkowego białka wiążącego kwas retinowy II, wewnątrzkomórkowego białka kanału chlorkowego kanału chlorkowego 1, EF-1-beta, galektyny 1, peroksydoksyny-2, płytkowego czynnika wzrostu komórek śródbłonka czynnik wzrostu komórek śródbłonka, izomeraza disiarczku białka i ubikwityna karboksylowo-końcową hydrolazę 5 poddano dalszej walidacji przy użyciu mikromacierzy tkankowej zawierającej 70 złośliwych raków piersi o różnym stopniu atypii. A znaczna liczba tych białek została już wykryta w krwi/osoczu/sekrecie. Kolejne kroki, które obejmują priorytetyzację biomarkerów priorytetyzację w oparciu o hierarchiczną ocenę tych markerów, opracowanie przeciwciał i przeciwciał i antygenów, opracowanie testów, walidację analityczną i wstępne wstępne testy we krwi osób zdrowych i pacjentek z rakiem piersi. --- CEL: Aby zidentyfikować molekularne markery odpowiedzi patologicznej na leczenie neoadiuwantowe leczenie paklitakselem / radioterapią, profilowanie ekspresji białek i genów zostało wykonane na biopsjach przed leczeniem. PROJEKT EKSPERYMENTALNY: Pacjentki z operacyjnym rakiem piersi wysokiego ryzyka były leczono trzema cyklami paklitakselu, a następnie równoczesnym paklitaksel/napromienianie. Tkankę guza z biopsji przed leczeniem uzyskano od 19 z 38 pacjentów włączonych do badania. Profilowanie ekspresji białek i genów i ekspresji genów przeprowadzono na seryjnych odcinkach biopsji od pacjentów, którzy osiągnęły całkowitą odpowiedź patologiczną (pCR) i porównano je z tymi, u których chorobą resztkową, non-pCR (NR). WYNIKI: Proteomiczne i walidacyjne analizy immunohistochemiczne wykazały, że alfa-defensyny (DEFA) ulegały nadekspresji w guzach od pacjentów z pCR. Analiza ekspresji genów ujawniła, że MAP2, białko związane z mikrotubulami, miało znacznie wyższy poziom ekspresji u pacjentów osiągających pCR. Podwyższenie poziomu MAP2 w liniach komórkowych raka piersi prowadziło do zwiększonej wrażliwości na paklitaksel. wrażliwości na paklitaksel. Ponadto, ekspresja genów, które są związane z rakiem z fenotypem potrójnie ujemnym była zwiększona w guzach pochodzących od pacjentek z pCR. pCR. Analiza większego panelu guzów od pacjentów otrzymujących przedoperacyjne leczenie taksanów wykazała, że ekspresja DEFA i MAP2, jak również histologiczne cechy stanu zapalnego były statystycznie związane z odpowiedzią na leczenie w czasie operacji. WNIOSEK: Pokazujemy użyteczność profilowania molekularnego biopsji przed leczeniem do odkrywania markerów odpowiedzi. Nasze wyniki sugerują potencjalne zastosowanie cząsteczek cząsteczek sygnalizacyjnych, takich jak DEFA, a także MAP2, białko związane z mikrotubulami białko związane z mikrotubulami, jako markerów nowotworowych, które wiążą się z odpowiedzią na neoadiuwantową terapię opartą na taksanach. terapię opartą na taksanach. --- Porównaliśmy wzór ekspresji białek potrójnie ujemnych raków piersi (HER2-, ER-, PR-) w porównaniu z tymi, które są dodatnie dla HER2 i ujemne dla receptorów hormonalnych (HER2+, ER-, PR-) receptorów hormonalnych (HER2+, ER-, PR-) za pomocą 2-D DIGE i spektrometrii mas. Uzyskaliśmy uzyskaliśmy zróżnicowane wzorce ekspresji dla kilku enzymów glikolitycznych (jak na przykład MDH2, PGK1, TKT, Aldolase1), cytokeratyn (CK7, 8, 9, 14, 17, 19), inne białka strukturalne (wimentyna, fibronektyna, L-plastyna), dla NME1-NME2, laktoferyny i członków rodziny aneksyn. Przeprowadzono analizę Western blot i immunohistochemia zostały przeprowadzone w celu weryfikacji wyników. Zidentyfikowane białka markerowe białka mogą przyczynić się do bardziej szczegółowej charakterystyki potrójnie ujemnych raków piersi i raka piersi i może przyczynić się do opracowania lepszych strategii leczenia. --- Potrójnie ujemny rak piersi jest trudny do leczenia z powodu braku racjonalnych terapii. Nie ma ustalonych markerów i celów, które można by mogą być wykorzystywane do stratyfikacji pacjentów i terapii celowanej. Tutaj przedstawiamy identyfikację nowych cech molekularnych, które wydają się zwiększać przerzuty potrójnie ujemnych guzów piersi. Stwierdziliśmy, że potrójnie ujemne guzy piersi można podzielić na 2 fenotypy na podstawie ich profili obfitości białek w całym genomie. profili. Pierwszy z nich charakteryzuje się wysoką ekspresją Stat1, Mx1 i CD74. Siedem z 9 guzów z tej grupy zaatakowało co najmniej 2 węzły chłonne, podczas gdy tylko 1 z 10 guzów w grupie 2 miał dodatnie węzły chłonne. Eksperymenty in vitro wykazały, że indukowany interferonem wzrost obfitości Stat1 koreluje ze zwiększoną migracją i inwazją w hodowanych komórkach. Kiedy nadekspresja CD74, zwiększała adhezję komórek do matrigelu. Efektowi temu towarzyszył znaczny wzrost ekspresji błonowej beta-kateniny, MUC18, pleksyn, integryn i innych białek zaangażowanych w adhezję komórek i przerzuty raka. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że guzy potrójnie ujemne Stat1/CD74 dodatnie są bardziej agresywne i sugerują podejście do rozwoju lepszej diagnostyki i bardziej ukierunkowanych terapii potrójnie negatywnego raka piersi. Ten artykuł jest częścią wydania specjalnego zatytułowanego: Proteomika: Powiązania kliniczne. --- Przedział CD44(hi) w ludzkim raku piersi jest wzbogacony w komórki inicjujące nowotwór. jednak funkcjonalna heterogeniczność w obrębie tej subpopulacji pozostaje słabo zdefiniowana. Wykorzystaliśmy potrójnie ujemną linię komórkową raka piersi o znanym fenotypie fenotypem bilinearnym, aby wyizolować i sklonować pojedyncze komórki CD44(hi), które wykazywały mezenchymalne/podstawne B i luminalne/podstawne A. W tym miejscu wykazać w tej i innych potrójnie ujemnych liniach komórkowych raka piersi, że, zamiast CD44(hi)/CD24(-) mezenchymalnych komórek podstawy B, komórki CD44(hi)/CD24(lo) epitelioidne komórki podstawne A zachowały klasyczne cechy nowotworowych komórek macierzystych takie jak zdolność do inicjowania nowotworu in vivo, tworzenie mammosfery i oporność na standardową chemioterapię. oporność na standardową chemioterapię. Wyniki te uzupełniają wcześniejsze odkrycia przy użyciu normalnych komórek sutka transformowanych onkogenami, wykazując, że tylko klony komórek z fenotypem mezenchymalnym wykazują cechy nowotworowych komórek macierzystych. Ponadto przeprowadziliśmy porównawcze ilościowe analizy proteomiczne i analizy macierzy genów tych komórek komórek i zidentyfikowaliśmy potencjalne nowe markery komórek raka piersi z cechami inicjującymi nowotwór, takimi jak receptor lipoprotein stymulowany lipolizą (LSR), RAB25, S100A14 i mucyna 1 (MUC1), a także nowy podpis 31 genów zdolny do przewidywania odległych przerzutów. zdolną do przewidywania odległych przerzutów w kohortach receptorów estrogenowych receptorów estrogenowych ujemnych ludzkich raków piersi. Odkrycia te zdecydowanie faworyzują funkcjonalną heterogeniczności w przedziale komórek raka piersi i obiecują dalsze udoskonalenia profilowania markerów prognostycznych. Nasza praca potwierdza, że oprócz do nowotworowych komórek macierzystych o morfologii mezenchymalnej, te komórki inicjujące nowotwór o morfologii podobnej do nabłonka powinny być również przedmiotem zainteresowania rozwoju leków. --- Rak piersi jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka u kobiet w Stanach Zjednoczonych. Stanach Zjednoczonych. Spośród różnych podtypów, guzy z ujemnym receptorem estrogenowym (ER(-)), które są ErbB2+ lub potrójnie ujemne, mają stosunkowo złe rokowanie. (ER(-)), które są ErbB2+ lub potrójnie ujemne, mają stosunkowo złe rokowanie. W tym badaniu wykorzystaliśmy ogólnosystemową analizę proteomów raka piersi do zidentyfikować białka, które są związane z progresją guzów ER(-). Nasze dwuetapowe podejście obejmowało wstępną dogłębną analizę hodowanych komórek, które zostały uzyskanych z guzów o określonym stadium zaawansowania raka piersi, a następnie walidację przy użyciu ludzkich guzów piersi. Wykorzystując spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości i kwantyfikację za pomocą stabilnego znakowania izotopowego aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC), zidentyfikowaliśmy 8750 białek i określiliśmy ilościowo 7800 z nich. A wyodrębniono i zweryfikowano za pomocą spektrometrii masowej i immunohistochemii na mikromacierzach tkankowych. Ogólnie rzecz biorąc, sygnatura proteomiczna odzwierciedlała zarówno globalną utratę architektury tkanki, jak i szereg zmian metabolicznych w transformowanych komórkach. zmian metabolicznych w transformowanych komórkach. Analiza proteomiczna zidentyfikowała również wysokie poziomy IDH2 i CRABP2 oraz niski poziom SEC14L2 jako markery prognostyczne dla całkowitego przeżycia raka piersi. całkowitego przeżycia raka piersi. Łącznie nasze odkrycia sugerują, że globalna analiza proteomiczna dostarcza informacji o zmianach białkowych specyficznych dla ER(-), a także ważnych informacji prognostycznych. --- Podstawnokomórkowe raki piersi są zwykle ujemne pod względem ekspresji receptorów estrogenowych i receptorów progesteronowych i HER-2 (potrójnie ujemny rak piersi), co sprawia, że ten podtyp raka piersi jest bardziej agresywny i mniej wrażliwy na standardowe leczenie. leczenie. Zastosowaliśmy metodę proteomiki chemicznej na małą skalę przy użyciu bisindolilomaleimidu (Bis) inhibitorów kinazy białkowej C do badania proteomu wiążącego Bis w komórce. proteomu wiążącego Bis w modelu hodowli komórkowej raka podstawnokomórkowego piersi (MDA-MB-231). Za pomocą MS zidentyfikowaliśmy 174 białka wychwycone przez sondę Bis w w komórkach stymulowanych estrem forbolu (PMA). Analiza ontologii genów szeroko skategoryzowała białka jako wiążące ATP (42%), wiążące GTP (6%) i posiadające aktywność nukleozydo-trifosfatazy (21%). Spośród 64 enzymów wychwyconych przez Bis-sondę, większość miała funkcje wiązania ATP i/lub nukleotydów. Dwa wcześniej nieopisane kinazy białkowe wiążące Bis, bogate w serynę/argininę kinaza białkowa 1 (SRPK1) i kinaza białkowa zależna od RNA indukowanego interferonem (PKR). (PKR). Następnie włączyliśmy SILAC do kwantyfikacji, aby zbadać białka, które były różnie wychwytywane przez Bis-sondę po 30 i 60 minutach stymulacji PMA. Dostarczyło to nowych dowodów na regulację regulację enzymów dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej, jąderkowej helikazy RNA i heterogenicznej jądrowej rybonukleoproteiny M. --- Potrójnie ujemne raki piersi (TNBC) są definiowane przez brak ekspresji receptorów receptorów estrogenowych, progesteronowych i HER2. Ze względu na brak zidentyfikowanych celów i terapii celowanych, a także ze względu na heterogenną prezentację molekularną molekularną, wytyczne dotyczące leczenia pacjentek z TNBC obejmują jedynie konwencjonalną chemioterapię. Takie leczenie, choć skuteczne dla niektórych, pozostawia innych z wysokim odsetkiem wczesnych nawrotów i nie jest lecznicze dla żadnego pacjenta z z przerzutami. Tutaj wykazujemy, że guzy te są wrażliwe na białko szoku cieplnego 90 (Hsp90) inhibitor PU-H71. Silne i trwałe działanie przeciwnowotworowe w ksenograftach TNBC, w tym całkowitą odpowiedź i regresję guza, bez toksyczności dla gospodarza. Warto zauważyć, że guzy TNBC reagują na ponowne leczenie PU-H71 przez kilka cykli trwających ponad 5 miesięcy bez oznak oporności lub toksyczności. Poprzez podejście proteomiczne podejście, pokazujemy, że wiele onkoprotein zaangażowanych w proliferację guza, przeżycie i potencjał inwazyjny są w kompleksie z Hsp90 związanym z PU-H71 w TNBC. PU-H71 indukuje skuteczną i trwałą regulację w dół i inaktywację, zarówno in in vitro i in vivo, tych białek. Wśród nich zidentyfikowaliśmy regulację w dół składników szlaku Ras/Raf/MAPK i fazy G (2) -M, aby przyczynić się do jego działanie antyproliferacyjne, degradację aktywowanego Akt i Bcl-xL w celu wywołania apoptozę oraz hamowanie aktywowanego NF-kappaB, Akt, ERK2, Tyk2 i PKC w celu zmniejszenie potencjału inwazyjnego TNBC. Wyniki identyfikują Hsp90 jako krytyczny i multimodalny cel multimodalny cel w tym najtrudniejszym do leczenia podtypie raka piersi i wspierają stosowanie inhibitora Hsp90 PU-H71 w badaniach klinicznych z udziałem pacjentek z TNBC. pacjentów z TNBC.
Analizy proteomiczne ujawniły białka związane z potrójnie ujemnym rakiem piersi. Wymień kilka proponowanych białek.
Wybrane białka będące przedmiotem zainteresowania zaproponowane w badaniach proteomicznych raka potrójnie ujemnego to CD44, PARP1, Mage-A4, LSR, RAB25, S100A14, MUC1, Hsp90, aktyna, 14-3-3, wimentyna, HSP70, CK18, moesin, IDH2, CRABP2, SEC14L2, beta-katenina, MUC18, Stat1 i CD74.