Leczenie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) szybko ewoluuje wraz z wprowadzeniem wprowadzenie bezpośrednio działających leków przeciwwirusowych (DAA). Inhibitory replikacji kompleksu HCV NS5A na przykładzie daklataswiru (BMS-790052), stanowią nową klasę DAA. klasę DAA. Wyjątkowa siła działania in vitro (wartości EC50 w zakresie od pM do niskiego nM zakres) i szerokie pokrycie genotypu inhibitorów NS5A przełożyły się na solidne efekty anty-HCV u zakażonych pacjentów, czyniąc inhibitory NS5A niezbędnym składnikiem skutecznych terapii skojarzonych HCV DAA. Na podstawie substytucji oporności indukowanej lekami i modelowania komputerowego, inhibitory NS5A najprawdopodobniej działają na N-końcu NS5A (domena I). Mechanizm hamowania Badania mające na celu wyjaśnienie wyjątkowej siły działania tych inhibitorów wygenerowały kilka działających modeli. --- CELE: Bezpośrednio działające leki przeciwwirusowe (DAA) przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) zostały niedawno opracowane i ostatecznie mają zastąpić terapię opartą na terapię opartą na interferonie. Jednak monoterapia DAA skutkuje szybkim pojawieniem się opornych szczepów, a DAA muszą być stosowane w kombinacjach, które stanowią wysoką barierę genetyczną dla oporności. genetyczną barierę dla oporności, chociaż kinetyka wirusowa szczepów wielolekoopornych pozostaje słabo scharakteryzowana. pozostają słabo scharakteryzowane. Celem tego badania jest śledzenie i kondycji oporności przy użyciu kombinacji telaprewiru i inhibitorów NS5A lub NS5B z klonami genotypu 1b. METODY: Myszy chimeryczne zakażone HCV były leczone DAA, a oporność była monitorowana przy użyciu sekwencjonowania bezpośredniego i ultra głębokiego. WYNIKI: Terapia skojarzona telaprewirem i BMS-788329 (inhibitor NS5A) obniżyła poziom HCV RNA w surowicy do niewykrywalnego poziomu. Obecność mutacji oporności NS3-V36A mutacji oporności na telaprewir skutkowała słabą odpowiedzią na monoterapię telaprewirem monoterapię, ale wykazywała znaczną redukcję HCV, gdy telaprewir był łączony z BMS-788329. Jednak szczep oporny na BMS-788329 pojawiał się z niską częstotliwością. częstotliwości. Zakażenie mutacją NS5A-L31V oporną na BMS-788329 szybko skutkowało uzyskaniem dodatkowej mutacji NS5A-Y93A, która nadawała telaprewirowi oporność podczas terapii skojarzonej. Zakażenie podwójnymi mutacjami NS5AL31V/NS5AY93H skutkowało słabą odpowiedzią na terapię skojarzoną i rozwojem oporności na telaprewir. telaprewiru. Chociaż HCV RNA stało się niewykrywalne wkrótce po terapii skojarzonej z BMS-788329 i BMS-821095 (inhibitor NS5B inhibitor NS5B), nastąpiło odbicie z pojawieniem się oporności na wszystkie trzy leki. wystąpiło. Potrójna oporność wystąpiła również po zakażeniu NS3V36A/NS5AL31V/NS5AY93H. WNIOSKI: Oporne szczepy łatwo rozwijają się ze sklonowanych szczepów wirusa. Należy unikać sekwencyjnego stosowania DAA, aby zapobiec pojawieniu się szczepów wielolekoopornych. szczepów wielolekoopornych. --- Jednym z najtrudniejszych celów badań nad wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) jest opracowanie dobrze tolerowanych schematów z wysokimi wskaźnikami wyleczeń w różnych populacjach pacjentów. populacjach pacjentów. Taki schemat będzie prawdopodobnie wymagał połączenia co najmniej dwóch różnych leków przeciwwirusowych o bezpośrednim działaniu (DAA). Połączenie dwóch lub więcej DAA o różnych profilach oporności różnymi profilami oporności zwiększa liczbę mutacji wymaganych do przełomu wirusowego. Obecnie większość DAA hamuje replikację HCV. Niedawno że połączenie dwóch różnych klas inhibitorów HCV, inhibitorów wejścia i inhibitorów replikacji inhibitorów i inhibitorów replikacji, przedłuża redukcję pozakomórkowego HCV w trwale zakażonych komórkach. Dlatego też staraliśmy się zidentyfikować nowe inhibitory ukierunkowanych na aspekty cyklu replikacji HCV inne niż replikacja RNA. My donosimy o odkryciu pierwszego drobnocząsteczkowego inhibitora zakaźności HCV, GS-563253, zwanego również inhibitorem zakaźności HCV 1 (HCV II-1). HCV II-1 jest podstawioną tetrahydrochinoliną, która selektywnie hamuje genotyp 1 i 2 HCV z niskimi nanomolarnymi 50% skutecznymi stężeniami. Został on zidentyfikowany poprzez i późniejszej optymalizacji chemicznej. HCV II-1 tylko pozwala na produkcję i uwalnianie niezakaźnych cząstek HCV z komórek. Co więcej, zakaźny HCV jest szybko inaktywowany w jego obecności. MUTACJE OPORNOŚCI HCV II-1 mutacje oporności mapują się do HCV E2. Ponadto, HCV-II zapobiega fuzji endosomalnej HCV fuzji, co sugeruje, że albo blokuje otoczkę wirusową w stanie prefuzji lub promuje zmianę konformacji otoczki wirusowej niezdolnej do fuzji. Co ważne, odkrycie HCV II-1 otwiera nową klasę inhibitorów HCV które przedłużają supresję wirusa przez inhibitory replikacji HCV w uporczywie zakażonych kulturach komórkowych. zakażonych hodowlach komórkowych. --- Proteaza NS3/4A wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) jest ważnym i atrakcyjnym celem rozwoju leków anty-HCV. dla rozwoju i odkrywania leków anty-HCV. Vaniprevir (faza III badań klinicznych badania kliniczne) i MK-5172 (badania kliniczne fazy II) to dwa silne związki przeciwwirusowe które celują w proteazę NS3/4A. Jednak pojawienie się oporności na na te dwa inhibitory zmniejszyło skuteczność vanipreviru i MK-5172 przeciwko replikacji wirusa. replikacji wirusa. Wśród mutacji oporności na leki, trzy mutacje jednomiejscowe w resztach Arg155, Ala156 i Asp168 w proteazie NS3/4A są szczególnie ważne ze względu na ich oporność na prawie szczególnie ważne ze względu na ich oporność na prawie wszystkie inhibitory w rozwoju klinicznym. rozwój kliniczny. Szczegółowe zrozumienie mechanizmu oporności na vaniprevir i MK-5172 jest zatem bardzo istotne dla zaprojektowania nowych, silnych środków ukierunkowanych na warianty wirusa. W niniejszej pracy przeprowadzono symulację dynamiki molekularnej (MD) symulacja, obliczenie energii swobodnej wiązania, rozkład energii swobodnej, sieć interakcji pozostałości (residue sieć interakcji (RIN) i analiza obwiedni substratów zostały wykorzystane do zbadania szczegółowego mechanizmu lekooporności trzech mutantów R155K, A156T i D168A na waniprewir i MK-5172. Symulacja MD została wykorzystana do zbadania tryb wiązania tych dwóch inhibitorów z typem dzikim i opornymi mutantami proteazy HCV NS3/4A. Obliczenia energii swobodnej wiązania i rozkład energii swobodnej ujawniają, że mutacje oporności na leki zmniejszyły interakcje między resztami w miejscu aktywnym i podstawnikiem w łączniku P2 do P4 waniprewiru i MK-5172. Ponadto, analiza RIN i obwiedni substratowej wskazują, że badane mutacje reszt znajdują się poza miejscem wiązania substratu (4B5A) i selektywnie zmniejszają powinowactwo inhibitorów, ale nie aktywność enzymu, a w konsekwencji aktywność enzymu, a w konsekwencji pomagają proteazie NS3/4A uciec spod działania inhibitorów bez wpływu na powinowactwo wiązania substratu. Odkrycia te mogą dostarczyć przydatnych informacji do zrozumienia mechanizmu oporności na lek mechanizmu oporności na waniprewir i MK-5172. Wyniki mogą również dostarczyć potencjalnych wskazówek do dalszego projektowania nowych inhibitorów, które są mniej podatnych na lekooporność. --- Leczenie pacjentów z wirusowym zapaleniem wątroby typu C bezpośrednio działającymi lekami przeciwwirusowymi obejmuje połączenie wielu drobnocząsteczkowych inhibitorów o różnych mechanizmach działania. działania. ACH-806 (lub GS-9132) jest nowym, małocząsteczkowym inhibitorem specyficznym dla wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). dla wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Hamuje on replikację wirusowego RNA w komórkach replikonu HCV i był aktywny u pacjentów zakażonych genotypem 1 HCV w badaniu klinicznym potwierdzającym słuszność koncepcji badania klinicznego (1). Tutaj opisujemy potencjalny mechanizm działania (MoA) w którym ACH-806 zmienia skład i funkcję kompleksu replikacji wirusa (RC). Stwierdziliśmy, że ACH-806 nie wpływa na translację i przetwarzanie poliprotein HCV, wczesne zdarzenia tworzenia HCV RC. Zamiast tego, ACH-806 wywołał powstawanie homodimerycznej formy NS4A o wielkości 14 kDa (p14) zarówno w komórkach replikonowych, jak i Huh-7. zarówno w komórkach replikonowych, jak i w komórkach Huh-7, w których NS4A ulegał ekspresji samodzielnie. była negatywnie regulowana przez NS3, a jej pojawienie się było z kolei związane z redukcją NS3, a zwłaszcza zawartości NS4A w RC z powodu ich przyspieszonej degradacji. degradacji. Wcześniej opisana substytucja oporności w pobliżu końca N NS3, gdzie NS3 oddziałuje z NS4A, osłabiła redukcję NS3 i NS4A przez leczenie ACH-806. Podsumowując, pokazujemy, że zmiany składu zmiany w wirusowych RC są związane z aktywnością przeciwwirusową ACH-806. Małe cząsteczki, w tym ACH-806, z tym nowym MoA są obiecujące dla dalszego rozwoju i zapewniają unikalne narzędzia do wyjaśnienia rozwoju i zapewniają unikalne narzędzia do wyjaśniania funkcji NS4A w replikacji HCV w replikacji HCV. --- TŁO: Inhibitory kompleksu replikacyjnego NS5A wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) (RCI) wykazały pikomolarną aktywność przeciwwirusową przeciwko genotypowi 1 (GT1) in vitro. Przełożyło się to na szybki i silny spadek HCV RNA u pacjentów GT1 pacjentów. Mniej wiadomo na temat podatności innych genotypów, takich jak GT3 na hamowanie przez NS5A RCI. CELE: Wykrycie i fenotypowanie naturalnie występujących polimorfizmów HCVGT3 NS5A NS5A przeciwko dwóm NS5A RCI (daklataswir [DCV] i GS-5885) obecnie w rozwoju klinicznym. rozwoju klinicznym. PROJEKT BADANIA: Określono region NS5A u 96 pacjentów nieleczonych HCV GT3 w Ameryce Północnej, Europie i Australii. Ameryki Północnej, Europy i Australii. WYNIKI: Analiza filogenetyczna ujawniła szeroką dystrybucję bez znaczących skupisk geograficznych. geograficznym. Warianty związane z opornością na GT1 DCV (RAV) były zaobserwowano u osób z GT3; warianty (i ich częstotliwości) obejmowały 28M/V (1%), 30A/K/S/T/V (10%), 31L/M (1%), E92A (1%) i Y93H (8,3%). Sekwencja konsensusu została wykorzystana do wygenerowania hybrydowego replikonu JFH1/3a-NS5A i wykorzystana do oceny podatności na NS5A RCI. Przeciwko JFH1/3a-NS5A, DCV był silniejszy (EC(50) = 0,52 nM) niż GS-5885 (EC(50) = 141 nM). Wrażliwość DCV była zwiększona przeciwko JFH1/3a-NS5A-M28V (EC50 = 0,006 nM), A30V (EC(50) = 0,012 nM) i E92A (EC(50) = 0,004 nM), podczas gdy warianty NS5A-A30K i -Y93H wykazywały zmniejszoną wrażliwość na DCV (wartości EC50 odpowiednio 23 nM i 1120 nM) oraz na GS-5885 (wartości EC50 odpowiednio 1770 nM i 4300 nM). WNIOSKI: Substytucje nadające oporność na NS5A RCI istniały wcześniej w nieleczonych pacjentów zakażonych HCV GT3. Skuteczność tych NS5A RCI może zależeć od tego, który inhibitor jest stosowany w połączeniu z innymi lekami przeciwwirusowymi. w połączeniu z innymi lekami przeciwwirusowymi. --- Wstęp: Oporność na mericytabinę (prolek inhibitora polimerazy HCV NS5B PSI-6130) jest rzadka i spowodowana mutacją NS5B S282T. METODY: RNA HCV w surowicy od pacjentów, u których wystąpił przełom wirusowy, częściowa odpowiedź lub brak odpowiedzi w 2 badaniach klinicznych, w których pacjenci otrzymywali mericitabine plus peginterferon alfa-2a (40KD)/rybawiryna były analizowane przez analizę populacji i sekwencji klonalnej, a także test fenotypowy w celu oceny oporności in vivo na mericytabinę. WYNIKI: Wśród 405 pacjentów leczonych merytracykliną i peginterferonem peginterferonem alfa-2a/rybawiryną w badaniach PROPEL i JUMP-C nie zaobserwowano przełomu wirusologicznego ani braku odpowiedzi. nie zaobserwowano; 12 pacjentów doświadczyło częściowej odpowiedzi. Mutacji oporności NS5B S282T nie zaobserwowano u żadnego pacjenta. U wielu pacjentów zaobserwowano i scharakteryzowano szereg zmian NS5B związanych z leczeniem. Nowość podwójny mutant (L159F/L320F) z upośledzoną zdolnością replikacji został wykryty u u jednego pacjenta zakażonego genotypem 1b HCV. Wprowadzenie podwójnego mutanta L159F/L320F odpowiednio do replikonów genotypu 1a (H77) i 1b (Con-1), zwiększyło wartość EC50 dla mericytabiny o 3,1- i 5,5-krotnie, a EC90 o 3,1- i 8,9-krotnie. Podwójny mutant zmniejszał również wrażliwość na sofosbuwir (GS-7977) i GS-938, ale nie setrobuvir, w stosunku do typu dzikiego. WNIOSKI: Nowa i pozbawiona replikacji podwójna mutacja (L159F/L320F) nadaje niski poziom oporności na mericytabinę i oporność krzyżową zarówno na sofosbuvir i GS-938. REJESTRACJA BADAŃ KLINICZNYCH: NCT00869661, NCT01057667. --- TŁO I CELE: Tratwy lipidowe komórek gospodarza tworzą rusztowanie wymagane do replikacji replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Palmitoilotransferazy serynowe (SPT) wytwarzają sfingolipidy, które są niezbędnymi składnikami tratw lipidowych, które które wiążą się z białkami niestrukturalnymi HCV. Zapobieganie syntezie de novo sfingolipidów przez inhibitor SPT zakłóca kompleks replikacyjny HCV i tym samym hamuje replikację HCV. tym samym hamuje replikację HCV. Zbadaliśmy zdolność inhibitora SPT NA808 do zapobiegania replikacji HCV w komórkach i u myszy. METODY: Przetestowaliśmy zdolność NA808 do hamowania aktywności enzymatycznej SPT w komórkach replikonu FLR3-1. FLR3-1. Użyliśmy systemu replikonowego do selekcji wariantów HCV, które stały się oporne na NA808 w stężeniach od 4- do 6-krotności 50% stężenia hamującego. stężeniu, po 14 rundach pasażowania komórek. Oceniliśmy zdolność NA808 lub telaprewiru do hamowania replikacji genotypów 1a, 1b, 2a, 3a i 4a wirusa HCV u myszy z humanizowanymi wątrobami (ang. myszy z humanizowanymi wątrobami (przeszczepionymi ludzkimi hepatocytami). NA808 był dożylnie, z lub bez pegylowanego interferonu alfa-2a i inhibitorów polimerazy i/lub proteazy HCV oraz inhibitorami polimerazy i/lub proteazy HCV. WYNIKI: NA808 zapobiegał replikacji HCV poprzez niekonkurencyjne hamowanie SPT; nie rozwinęły się mutacje oporności. NA808 zapobiegał replikacji wszystkich genotypów HCV u myszy z humanizowanymi wątrobami. Dożylne podawanie NA808 znacząco miano wirusa u myszy i wykazywał działanie synergistyczne z pegylowanym interferonem pegylowanym interferonem alfa-2a oraz inhibitorami polimerazy i proteazy HCV. WNIOSKI: Inhibitor SPT NA808 zapobiega replikacji genotypów HCV 1a, 1b, 2a, 3a i 4a w hodowanych hepatocytach i u myszy z humanizowanymi wątrobami. To może zostać opracowany do leczenia zakażenia HCV lub stosowany w połączeniu z pegylowanym interferonem alfa-2a lub inhibitorami polimerazy lub proteazy HCV. --- Przetrwałe zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) jest główną przyczyną przewlekłego zapalenia wątroby i marskości wątroby oraz raka wątrobowokomórkowego. przewlekłego zapalenia wątroby, marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego oraz głównym wskazaniem do przeszczepu wątroby u dorosłych. przeszczepu wątroby u dorosłych. Obecny standard leczenia (SOC) z zastosowaniem pegylowanym interferonem-α2 i rybawiryną (RBV) ma ograniczoną skuteczność i jest wiąże się ze znaczącymi skutkami ubocznymi, często związanymi ze słabą lub przerwaniem leczenia, co wymaga specjalistycznego i częstego monitorowania. monitorowania. Aby przezwyciężyć ograniczoną skuteczność SOC, ponad 50 leków przeciwwirusowych o bezpośrednim działaniu przeciwwirusowych (DAA) zaprojektowanych tak, aby celować w białka kodowane przez wirusy, istotne w cyklu życia HCV są obecnie w fazie rozwoju. Szybka selekcja mutantów związanych z quasi-gatunkową naturą HCV z wysokimi wskaźnikami mutacji i replikacji mutacji i replikacji jest jednym z głównych wyzwań dla nowych terapii HCV. HCV. Czynniki predykcyjne gospodarza i wirusa wraz z kombinacją DAAs z lub bez IFN i/lub RBV muszą być dokładnie ocenione, aby zaprojektować najskuteczniejszą zindywidualizowaną strategię leczenia. najskuteczniejszą zindywidualizowaną strategię leczenia w najkrótszym i przy minimalnych skutkach ubocznych. --- W tym badaniu opracowaliśmy test oparty na cytometrii przepływowej na żywych komórkach, który pozwala na badanie przesiewowe inhibitorów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). W szczególności stworzyliśmy stabilną linię komórkową, która zawiera subgenomowy replikon kodujący białko fuzyjne kodujący białko fuzyjne NS5A-YFP. System ten umożliwia bezpośredni pomiar fluorescencji YFP w żywych komórkach wątrobiaka, w których replikuje się replikon HCV. Wykazaliśmy wykazaliśmy, że ten stabilny system fluorescencyjny pozwala na szybką i czułą ilościowe hamowanie replikacji HCV przez bezpośrednio działające środki przeciwwirusowe (DAA), w tym inhibitorów proteazy i NS5A oraz środków przeciwwirusowych ukierunkowanych na gospodarza (HTA), w tym inhibitorów cyklofiliny. Ten oparty na cytometrii przepływowej test dobrze nadaje się do wielu zastosowań, takich jak ocena replikacji HCV jak również badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. --- W oparciu o symetryczną bidentną strukturę inhibitora NS5A BMS-790052, zaprojektowano serię nowych monodentnych cząsteczek zaprojektowano serię nowych cząsteczek monodentnych. Przedstawiono syntezę 36 nowych niedimerycznych inhibitorów NS5A wraz z ich zdolnością do blokowania replikacji HCV w systemie replikonu HCV 1b. Wśród nich związek 5a wykazał aktywność w zakresie pikomolarnym wraz z doskonałym wskaźnikiem selektywności (SI > 90,000).
Czy dostępne są inhibitory replikacji wirusa HCV?
Przewlekłe zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) jest ogólnoświatowym problemem zdrowotnym powodującym poważne powikłania, takie jak marskość wątroby i rak wątroby. Stwierdzono, że małe interferujące RNA (siRNA) i krótkie RNA ze spinką do włosów (shRNA) znacząco hamują ekspresję genów. HCV wydaje się odpowiednim kandydatem na cel siRNA, ponieważ HCV jest pozytywnym jednoniciowym wirusem RNA i replikuje się w cytoplazmie.  W oparciu o wyniki, obecnie istnieje kilka inhibitorów replikacji HCV, takich jak GS-563253, PSI-6130, NA-808, BMS-790052, GS-9132 i BMS-788329.