Synchroniczna mitoza jest powszechna w komórkach wielojądrzastych. Przeanalizowaliśmy unikalny asynchroniczny cykl podziału jądrowego w wielojądrowym grzybie nitkowatym, Ashbya gossypii. Analiza rodowodu jądrowego i obserwacja znakowanych GFP wykazały, że sąsiadujące jądra w komórkach A. gossypii znajdują się na różnych etapach cyklu komórkowego pomimo bliskiej fizycznej odległości. Sąsiadujące jądra nie różniły się znacząco pod względem wzorców lokalizacji białek cykliny cyklin, tak że zarówno cykliny G1, jak i mitotyczne były obecne niezależnie od cyklu komórkowego, co sugeruje, że całkowite zniszczenie cyklin nie zachodzi w tym systemie. zachodzi w tym systemie. Rzeczywiście, ekspresja cykliny mitotycznej pozbawionej NH(2)-końcowych sekwencji niszczących nie blokowała progresji cyklu komórkowego. Komórki pozbawione AgSic1p, przewidywanego inhibitora kinazy zależnej od cyklin (CDK), wykazały jednak nieprawidłowe wrzeciona wielobiegunowe i pofragmentowane jądra, które są wskazujące na wadliwe mitozy. Postawiliśmy hipotezę, że ciągła cytoplazma w tych komórkach w tych komórkach sprzyjała ewolucji cyklu podziału jądrowego, w którym inhibitory CDK kontrolują przede wszystkim aktywność CDK, a nie oscylację białek cyklin mitotycznych białka. --- Przedstawiamy mechanistyczne podstawy kierujące wzorcem migracji wielu jąder w strzępkach Ashbya gossypii. Wykorzystując tomografię elektronową, zrekonstruowaliśmy cytoszkielet cytoplazmatyczne mikrotubule (cMT) w trzech regionach wierzchołkowych z łącznie 13 jąder, a także mikrotubule wrzeciona czterech jąder mitotycznych. Każde wrzeciono wrzeciona (SPB) nukleuje trzy cMT, a większość cMT powyżej pewnej długości rośnie zgodnie z ich strukturą plus-end. Długie cMT ściśle przylegają do siebie przez kilka mikronów wzdłuż kory, przypuszczalnie oznaczając regiony, w których dyneina generuje siły ciągnące jądra. Nie zaobserwowano bliskości między cMT emanującymi z sąsiednich jąder. nie zaobserwowano. Większość jąder posiada zduplikowane obok siebie SPB, które razem emanują średnio sześć cMT, w większości przypadków w przeciwnej orientacji w stosunku do osi wzrostu strzępek. Takie tablice cMT wyjaśniają, dlaczego wiele jąder podlega krótkodystansowym ruchom tam i z powrotem. Tylko od czasu do czasu wszystkie sześć cMT orientuje się w jednym kierunku, co jest warunkiem wstępnym dla dalekozasięgowego omijania. Po mitozie jądra potomne niosą pojedynczy SPB z trzema cMT. cMT. Zwiększone prawdopodobieństwo, że wszystkie trzy cMT orientują się w jednym kierunku wyjaśnia wysoki wskaźnik omijania jądrowego obserwowany w tych jądrach. Wrzeciono mitotyczne A. gossypii jest strukturalnie podobne do wrzeciona mitotycznego Saccharomyces cerevisia. Saccharomyces cerevisiae pod względem liczby mikrotubul jądrowych (nMT), długości dystrybucja i trójwymiarowa organizacja, mimo że oba organizmy różnią się znacznie liczbą chromosomów. Nasze wyniki sugerują, że dwie nMT przyczepiają się do każdego kinetochoru w A. gossypii, a nie tylko jedna nMT, jak w S. cerevisiae. --- Kilka lat temu A. gossypii został uznany za atrakcyjny model do badania wzrostu długich i wielojądrowych komórek grzybowych (strzępek). wzrostu długich i wielojądrzastych komórek grzybowych (strzępek) ze względu na mały genom genom, haploidalne jądra i skuteczne metody celowania w geny. Ogólnie rzecz biorąc zakłada się, że lepsze zrozumienie wzrostu grzybów strzępkowych znacznie stymulować rozwój nowych fungicydów. Wykorzystanie Ashbya gossypii jako modelu jest szczególnie obiecujące ze względu na wysoki poziom zachowania kolejności genów (syntenii) (syntenii) między genomami A. gossypii i drożdży Saccharomyces cerevisiae. Tak więc, podobny zestaw genów wydaje się kontrolować zaskakująco różne tryby wzrostu tych dwóch organizmów, co przewiduje, że ortologiczne geny kontroli wzrostu mogą nie odgrywać identycznych ról komórkowych w obu systemach. systemach. Analizując fenotypy mutantów A. gossypii pozbawionych czynników o znanych funkcji w morfogenezie drożdży i dynamice jądrowej potwierdzają tę hipotezę. hipotezę. Genomika porównawcza obu organizmów ujawnia również rzadkie przykłady różnice w zestawach genów dla niektórych procesów komórkowych, które jak wykazano dla homeostazy fosforanowej mogą być związane z różnicami w poziomach kontroli. --- Podczas rozwoju grzybów nitkowatych, wielojądrowe strzępki wykorzystują system do migracji jądrowej na duże odległości w celu utrzymania równej gęstości jądrowej. Dziesięć lat temu wykazano, że silnik mikrotubulowy dyneina odgrywa kluczową rolę w tym procesie. Poprzednie badania z Ashbya gossypii ujawniły rozległe ruchy dwukierunkowe i omijanie jąder, autonomiczny cytoplazmatyczny mikrotubule (cMT) cytoszkielet emanujący z każdego jądra i ciągnięcie jąder przez poślizg cMT wzdłuż kory. Tutaj pokazujemy, że dyneina jest jedynym motorem dla ruchów dwukierunkowych i omijania, ponieważ ruchy te są jednocześnie zmniejszone u mutantów niosących skrócenia dyneiny DYN1 promotora. Składnik dynaktyny Jnm1, białka pomocnicze Dyn2 i Ndl1, oraz potencjalna kotwica korowa dyneiny Num1 są również zaangażowane w dynamiczną dystrybucję jąder. dystrybucji jąder. W przypadku ich braku jądra agregują się w różnym stopniu, przy czym mutanty z gęstymi skupiskami jądrowymi rosną niezwykle długie cMT. Podobnie jak w odkryliśmy, że dyneina jest dostarczana do końców cMT, a jej aktywność lub procesywność jest prawdopodobnie kontrolowana przez aktywność lub procesywność jest prawdopodobnie kontrolowana przez dynaktynę i Num1. Razem z jej rolą w napędzaniu ruchów jądrowych, proponujemy, aby dyneina odgrywała również (bezpośrednio lub pośrednio) rolę w kontroli długości cMT. Te połączone działania dyneiny zapobiegają klastrowaniu jądrowemu u A. gossypii, a tym samym ujawniają nową komórkową rolę dla dyneiny. --- Ashbya gossypii ma genom podobny do pączkujących drożdży, ale rośnie wyłącznie jako wielojądrowe strzępki. wielojądrowych strzępek. W przeciwieństwie do pączkujących drożdży, gdzie pozycjonowanie jąder w szyjce pąka jest główną funkcją cytoplazmatycznych mikrotubul (cMT), jądra A. gossypii jądra są w ciągłym ruchu i ich pozycjonowanie nie jest problemem. Aby zbadać rolę cMT w oscylacji i omijaniu jądra, skonstruowaliśmy mutanty potencjalnie wpływające na skonstruowaliśmy mutanty potencjalnie wpływające na długość cMT. Strzępki pozbawione markera plus (+)markera Bik1 lub kinezyny Kip2 nie mogą polimeryzować długich cMT i tracą ruchy jądrowe typu dzikiego. ruchy jądrowe typu dzikiego. Co ciekawe, strzępki pozbawione kinezyny Kip3 wykazują dłuższe cMT wraz ze zwiększoną oscylacją jądrową i omijaniem. Szybkość polimeryzacji i depolimeryzacji cMT jest 3 razy wyższa u A. gossypii niż u drożdży pączkujących, a katastrofy cMT są rzadkie. Rosnące cMT przesuwają się wzdłuż kory strzępek i wywierają siły ciągnące na jądra komórkowe. Zaskakujące, mechanizm wychwytywania/skurczu wydaje się być nieobecny w A. gossypii. cMT docierające do końcówki strzępki nie kurczą się, a końce cMT + gromadzą się na końcach strzępek. Zatem, różnice w dynamice cMT i kontroli długości między drożdżami pączkującymi a A. gossypii są kluczowymi elementami w adaptacji cytoszkieletu cMT do znacznie dłuższych komórek i znacznie wyższego stopnia jądrowości. dłuższych komórek i znacznie wyższego stopnia ruchliwości jądrowej. --- Zachowanie białka cykliny nie było systematycznie badane w komórkach komórkach wielojądrowych z asynchronicznymi mitozami. Cykliny są kanonicznymi oscylującymi białkami cyklu komórkowego, ale nie jest jasne, w jaki sposób fluktuujące gradienty białek w komórkach wielojądrzastych, w których jądra na różnych etapach cyklu podziału etapach cyklu podziałowego dzielą cytoplazmę. Wcześniejsze prace nad A. gossypii, nitkowatym grzybie, w którym jądra dzielą się asynchronicznie we wspólnej cytoplazmie cytoplazmie, wykazały, że jedna cyklina G1 i jedna cyklina typu B nie wahają się pod względem w cyklu podziału. Przeprowadziliśmy kompleksową analizę wszystkich cyklin typu G1 i B w A. gossypii, aby określić, czy którakolwiek z nich cyklin wykazuje okresową obfitość w całym cyklu komórkowym i zbadać, czy cykliny wykazują funkcjonalną redundancję w takim środowisku komórkowym. My zlokalizowaliśmy wszystkie cykliny typu G1 i B i w szczególności stwierdziliśmy, że tylko AgClb5/6p różni się w lokalizacji subkomórkowej podczas cyklu podziału. AgClb5/6p jest tracona z jądra przy przejściu metafazy w sposób zależny od D-box. Dane te pokazują, że może wystąpić wydajna autonomiczna degradacja białek jądrowych w komórkach wielojądrowych rezydujących we wspólnej cytoplazmie. Wykazaliśmy, że trzy z pięciu cyklin u A. gossypii są genami niezbędnymi, co wskazuje, że istnieje minimalna redundancja funkcjonalna w tym wielojądrowym systemie. Ponadto Ponadto zidentyfikowaliśmy cyklinę AgClb3/4p, która jest niezbędna tylko do sporulacji. Proponujemy, aby wspólne zamieszkiwanie różnych cyklin w jądrach doprowadziło do zwiększonej specyficzności substratowej i ograniczonej redundancji funkcjonalnej w obrębie klas cyklin w komórkach wielojądrowych. --- Śledziliśmy migrację jąder znakowanych GFP w wielojądrowych strzępkach Ashbya gossypii. Po raz pierwszy udało nam się wykazać, że tryb migracji jąder na duże odległości składa się z oscylacyjnych ruchów jąder z, średnio średnio wyższą amplitudą w kierunku rosnącego wierzchołka. Mogliśmy również wykazać, że podział mitotyczny przebiega ze stałą szybkością 0,64 mikrometra/minutę co różni się od dwufazowej kinetyki opisanej dla drożdży Saccharomyces cerevisiae. Ponadto udało nam się zidentyfikować silnik oparty na mikrotubulach dyneinę jako kluczowy element kontroli migracji jądrowej na duże odległości. Dla innych grzybów strzępkowych wykazano już, że inaktywacja mutacji mutacje w dyneinie prowadziły do poważnych problemów w migracji jądrowej, tj. generowania długich, pozbawionych jąder strzępek i skupisk jąder w całych strzępkach. Ten fenotyp potwierdza pogląd, że dyneina jest ważna dla ruchu jąder w kierunku wierzchołka. jąder w kierunku wierzchołka. U A. gossypii wydaje się być odwrotnie. A całkowita delecja genu łańcucha ciężkiego dyneiny prowadzi do skupisk jądrowych wyłącznie na końcach strzępek i do zasadniczo wolnej od jąder sieci rurek i rozgałęzień strzępek. bezjądrowych strzępek i rozgałęzień. Bezjądrowe strzępki i rozgałęzienia w pobliżu skupisk jądrowych klastry jądrowe pokazują kable aktyny i spolaryzowane plamy aktyny, a także mikrotubule. Powolny wzrost tego mutanta dynein null może być całkowicie przywrócić do wzrostu podobnego do dzikiego w obecności benomylu, co można można wytłumaczyć obserwowaną redystrybucją jąder w sieci strzępek. --- Ashbya gossypii rośnie w postaci wielojądrowych i stale wydłużających się strzępek. Jądra są w ciągłym ruchu do przodu i do tyłu, poruszają się również podczas mitozy i często omijają się nawzajem. Podczas gdy te ruchy jądrowe są dobrze stosunkowo niewiele wiadomo na temat gęstości i morfologii organelli, które prawdopodobnie wpływają na te ruchy. organelli, które prawdopodobnie wpływają na te ruchy. Aby zrozumieć trójwymiarową organizację subkomórkową strzępek w wysokiej rozdzielczości, wykonaliśmy przeprowadziliśmy wielkoskalową tomografię elektronową regionów wierzchołkowych u A. gossypii. Tutaj przedstawiamy kompleksowy model wypełniania przestrzeni, w którym większość organelli ograniczonych błoną, w tym jądra, mitochondria, endosomy, ciał wielopęcherzykowych, wakuoli, autofagosomów, peroksysomów i pęcherzyków. modelowane. Jądra ujawniły różne morfologie i wypukłości wypełnione przez jąderko. jąderka. Mitochondria są bardzo obfite i tworzą rurową sieć ze spolaryzowaną frakcją kulistą. spolaryzowaną frakcją sferyczną. Organelle szlaków degradacyjnych wykazują skupioną organizację. Analizując ciała podobne do pęcherzyków, zidentyfikowaliśmy trzy klasy wielkości pęcherzyków gęstych elektronowo (∼200, ∼150 i ∼100 nm) jednorodnie rozmieszczonych w cytoplazmie. rozmieszczone w cytoplazmie, które najprawdopodobniej reprezentują peroksysomy. Wreszcie, powlekane i niepowlekane pęcherzyki o średnicy około 40 nm wykazują spolaryzowaną dystrybucję w kierunku wierzchołka strzępek, przy czym powlekane pęcherzyki preferencyjnie preferencyjnie lokalizują się na obrzeżach strzępek.
Czy grzyb Ashbya gossypii ma wiele jąder, które współdzielą cytoplazmę?
Tak, Ashbya gossypii ma genom podobny do pączkujących drożdży, ale rośnie wyłącznie w postaci wielojądrowych strzępek.