Opisaliśmy zastosowanie prostego podejścia do znakowania biotynylacją w celu bezpośredniego oczyszczania znakowanych kompleksów czynników transkrypcyjnych, w oparciu o użyciu sztucznych krótkich znaczników peptydowych, które są specyficznie i wydajnie biotynylowane przez bakteryjną ligazę biotynową BirA, która jest współeksprymowana w komórkach z oznaczonym czynnikiem. Wykorzystaliśmy to podejście do wstępnego scharakteryzowania kompleksy utworzone przez hematopoetyczny czynnik transkrypcyjny GATA-1 w komórkach erytroidalnych. komórkach erytroidalnych. GATA-1 jest niezbędny do różnicowania erytroidalnego, a jego funkcje obejmujące regulację w górę genów erytroidalnych, represję alternatywnych programów programów transkrypcyjnych i hamowanie proliferacji komórek. Jednakże, nie było nie było jasne, w jaki sposób wszystkie te funkcje GATA-1 są mediowane. Nasza praca opisuje, po raz pierwszy, różne interakcje GATA-1 z istotnym czynnikiem hematopoetycznym czynnikiem hematopoetycznym Gfi-1b, represyjnym kompleksem MeCP1 i chromatyną remodelującym kompleksem ACF/WCRF, oprócz znanych kompleksów GATA-1/FOG-1 i GATA-1/TAL-1. Dostarczamy również dowodów na to, że różne kompleksy GATA-1 są związane z określonymi funkcjami GATA-1 w różnicowaniu erytroidalnym, na przykład na przykład GATA-1/Gfi-1b z tłumieniem proliferacji komórek i GATA-1/FOG-1/MeCP1 z tłumieniem innych hematopoetycznych programów transkrypcyjnych programów transkrypcyjnych. Następnie zastosowaliśmy znacznik biotynylacji do Ldb-1, znanego partnera GATA-1 i scharakteryzowaliśmy szereg nowych partnerów interakcji, którzy są istotne w rozwoju erytroidalnym, w szczególności Eto-2, Lmo4 i CdK9. Na koniec, jesteśmy w trakcie stosowania tej samej technologii do scharakteryzowania czynników czynników, które są związane z tłumionym promotorem gamma-globiny in vivo. --- Ldb1, wszechobecnie wyrażane białko wiążące domenę LIM, jest niezbędne w wielu tkankach podczas rozwoju. wielu tkankach podczas rozwoju. Wchodzi w interakcje z Gata1, Tal1, E2A i Lmo2, tworząc kompleks czynników transkrypcyjnych regulujących późne geny erytroidalne. My zidentyfikowaliśmy szereg nowych białek oddziałujących z Ldb1 w komórkach erytroleukemicznych, w szczególności białko represorowe Eto-2 (i jego członek rodziny Mtgr1), kinazę cyklinozależną kinazę zależną od cyklin Cdk9 i czynnik pomostowy Lmo4. Za pośrednictwem MO u danio pręgowanego wykazują, że czynniki te są niezbędne dla ostatecznej hematopoezy. hematopoezy. Zgodnie z wynikami zebrafish czynniki te są ulegają koekspresji w komórkach prehematopoetycznych wczesnego zarodka myszy, chociaż my pierwotnie zidentyfikowaliśmy kompleks w późnych komórkach erytroidalnych. Na podstawie zmiany w subkomórkowej lokalizacji Eto-2 postulujemy, że odgrywa on centralną rolę w przejściu z fazy migracji i ekspansji komórek komórek prehematopoetycznych do ustanowienia ostatecznych hematopoetycznych komórek macierzystych. komórek macierzystych. --- Onkoproteina Ski znacząco wpływa na wzrost, różnicowanie i/lub przeżywalność komórek. przeżycie. Niedawno wykazano, że Ski działa w różnych szlakach sygnałowych w tym te obejmujące receptory jądrowe, transformujący czynnik wzrostu beta, i supresory nowotworów. Te rozbieżne role Ski są prawdopodobnie zależne od Zdolność Ski do wiązania wielu partnerów o różnych funkcjach. W szczególności W szczególności, Ski zmienia program wzrostu i różnicowania komórek progenitorowych erytroidalnych komórek progenitorowych erytroidalnych, prowadząc do złośliwej białaczki. Jednak mechanizm leżący u podstaw tego ważnego efektu pozostawał nieuchwytny. Tutaj pokazujemy, że Ski oddziałuje z GATA1, czynnikiem transkrypcyjnym niezbędnym w erytropoezie. Używając mutanta Ski z niedoborem wiązania GATA1, pokazujemy, że ta interakcja Ski-GATA1 jest krytyczna dla zdolności Ski do tłumienia transkrypcji za pośrednictwem GATA1 i blokowania różnicowanie erytroidalne. Co więcej, represja transkrypcji, w której pośredniczy GATA1 transkrypcja obejmuje zdolność Ski do blokowania wiązania DNA GATA1. To odkrycie jest w wyraźnym kontraście do tych z poprzednich doniesień na temat mechanizmu represji przez Ski, które opisywały model obejmujący rekrutację korepresorów do kompleksów transkrypcyjnych związanych z DNA. Proponujemy, aby Ski współpracuje w procesie transformacji w komórkach erytroidalnych poprzez zakłócanie funkcji z funkcją GATA1, przyczyniając się w ten sposób do erytroleukemii. --- Inhibitor białkowy aktywowanego przekaźnika sygnału i aktywatorów transkrypcji 3 (PIAS3) jest cząsteczką, która reguluje STAT3 i ma właściwości antyproliferacyjne. właściwości antyproliferacyjne. Glejak i płaskonabłonkowy rak płuc nie wykazują ekspresji PIAS3. Aby przetestować hipotezę, że efekty transkrypcyjne PIAS3 są niezależne od STAT3, my opracowaliśmy modele dla STAT3 knockdown i nadekspresji PIAS3. Ekspresja PIAS3 skutkuje odmiennym profilem transkrypcyjnym, który nie występuje w przypadku STAT3 knockdown. Zidentyfikowaliśmy nowych partnerów wiążących czynniki transkrypcyjne dla PIAS3 w tym ETS, EGR1, NR1I2 i GATA1. PIAS3 wiąże się z tymi czynnikami i reguluje ich efekty transkrypcyjne, powodując zmiany w kanonicznych w kanonicznych szlakach, w tym sygnalizacji Wnt/β-kateniny i funkcjach takich jak śmierć komórki i proliferacja. proliferacja. Zaproponowano model, w którym PIAS3 wpływa na szlaki regulowane przez EGR1. ścieżki. --- GATA-1 jest niezbędny do tworzenia linii erytroidalnej, megakariocytarnej, eozynofilowych i komórek tucznych. Działa jako aktywator i represor różnych genów docelowych, np. różnych genów docelowych, na przykład w komórkach erytroidalnych hamuje proliferację komórek proliferację komórek i wczesne geny hematopoetyczne, jednocześnie aktywując geny erytroidalne, jednak nie jest jasne, w jaki sposób pośredniczą obie te funkcje. Używając znakowanie biotynylacji / podejście proteomiczne w komórkach erytroidalnych, opisujemy różne interakcje GATA-1 z niezbędnym czynnikiem hematopoetycznym Gfi-1b, kompleksem represyjnym kompleksem MeCP1 i remodelującym chromatynę kompleksem ACF/WCRF, oprócz oprócz znanych kompleksów GATA-1/FOG-1 i GATA-1/TAL-1. Co ważne, my pokazujemy, że FOG-1 pośredniczy w interakcjach GATA-1 z kompleksem MeCP1, tym samym zapewniając wyjaśnienie nakładających się funkcji tych dwóch czynników w erytropoezie. erytropoezie. Pokazujemy również, że podzbiory docelowych genów GATA-1 są wiązane in vivo przez różne kompleksy, łącząc w ten sposób specyficznych partnerów GATA-1 z różnymi aspektami jego funkcji. Opierając się na tych odkryciach, sugerujemy model dla różnych ról GATA-1 w różnicowaniu erytroidalnym.
Lista partnerów interakcji dla białka GATA1.
GATA-1 oddziałuje z czynnikiem Gfi-1b, represyjnym kompleksem MeCP1, kompleksem remodelującym chromatynę ACF/WCRF, FOG-1, TAL-1, Ldb-1 i LMO2-C.