Modyfikacje histonów są obecnie dobrze ugruntowanymi mediatorami programów transkrypcyjnych które rozróżniają stany komórek. Jednak kinetyka modyfikacji histonów i ich rola w pośredniczeniu w szybkich, reagujących na sygnał zmianach ekspresji genów zmiany ekspresji genów zostały w niewielkim stopniu zbadane w skali całego genomu. Naczyniowy czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGFA), główny regulator angiogenezy, wyzwala zmiany w aktywności transkrypcyjnej ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Tutaj zastosowaliśmy immunoprecypitację chromatyny, a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (ChIP-seq) do pomiaru zmian w całym genomie w acetylacji histonu H3 w lizynie 27 (H3K27ac), markera aktywnych wzmacniaczy, w niestymulowanych HUVEC niestymulowanych HUVEC i HUVEC stymulowanych VEGFA przez 1, 4 i 12 h. Pokazujemy że miejsca z największą zmianą H3K27ac po stymulacji były związane ściśle z EP300, acetylotransferazą histonową. Wykorzystując zmienność H3K27ac jako nową sygnaturę epigenetyczną, zidentyfikowaliśmy transkrypcyjne elementy regulacyjne które są funkcjonalnie związane z angiogenezą, uczestniczą w szybkich zmianach stymulowanych przez stymulowane przez VEGFA zmiany w konformacji chromatyny i pośredniczą w odpowiedziach transkrypcyjnych indukowanych przez VEGFA odpowiedzi transkrypcyjne. Dynamiczne odkładanie H3K27ac i związane z tym zmiany w konformacji chromatyny konformacji chromatyny wymagały aktywności EP300 zamiast zmienionego nukleosomu lub zmian w nadwrażliwości na DNazę I. Aktywność EP300 była również wymagana dla podzbioru dynamicznych miejsc H3K27ac, aby zapętlić się w pobliżu promotorów. Nasze badanie zidentyfikowało tysiące śródbłonkowych, reagujących na VEGFA enhancerów, wykazując, że sygnatura epigenetyczna oparta na zmienności cechy chromatyny cech chromatyny jest produktywnym podejściem do definiowania elementów genomowych elementy. Co więcej, nasze badanie wskazuje na globalne modyfikacje epigenetyczne w szybkiej, reagującej na sygnał regulacji transkrypcji. --- Wcześniej informowaliśmy, że dobrze scharakteryzowane enhancery, ale nie promotory dla typowych genów specyficznych dla tkanek, w tym klasycznego genu Alb1, zawierają niemetylowane dinukleotydy CpG i dowody na interakcje czynników pionierskich w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Te właściwości, które różnią się od dwuwartościowych domen modyfikacji histonów, które charakteryzują promotory genów zaangażowanych w decyzje rozwojowe, podnoszą możliwość, że geny wyrażane tylko w zróżnicowanych komórkach mogą wymagać tylko w zróżnicowanych komórkach mogą wymagać oznaczenia na etapie pluripotencjalnym. Tutaj wykazujemy, że FoxD3, członek rodziny widełkowatych, jest niezbędny dla niemetylowanego znaku obserwowanego w enhancerze Alb1 w komórkach ES, z FoxA1 zastępując FoxD3 po różnicowaniu do endodermy. Zwiększona regulacja FoxD3 i utrata metylacji CpG w enhancerze Alb1 towarzyszyły przeprogramowaniu mysich zarodkowych fibroblastów (MEF) w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS). Badania dwóch genów ulegających ekspresji w określonych liniach krwiotwórczych ujawniły, że ustanowienie znaczników wzmacniających w komórkach ES i komórkach iPS może być regulowane zarówno pozytywnie, jak i negatywnie. Co więcej, brak wcześniej ustalonego znacznika konsekwentnie skutkował opornością na aktywację transkrypcyjną w represyjnym środowisku chromatyny, które charakteryzuje zróżnicowane komórki. Te wyniki potwierdzają hipotezę, że pluripotencja i skuteczne przeprogramowanie mogą być krytycznie zależne od znakowania enhancerów dla wielu lub wszystkich genów genów specyficznych dla tkanki. --- Programy rozwojowe są kontrolowane przez czynniki transkrypcyjne i regulatory chromatyny. które utrzymują określone programy ekspresji genów poprzez epigenetyczną modyfikację genomu. modyfikację genomu. Te zdarzenia regulacyjne we wzmacniaczach przyczyniają się do specyficznych programów ekspresji genów, które określają stan komórki i potencjał potencjał do różnicowania się w nowe typy komórek. Chociaż elementy wzmacniające są związane z pewnymi modyfikacjami histonów i czynnikami transkrypcyjnymi czynnikami transkrypcyjnymi, związek tych modyfikacji z ekspresją genów i a stanem rozwojowym nie został jasno określony. Tutaj badamy epigenetyczny krajobraz elementów wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych i kilku dorosłych tkankach myszy. dorosłych tkankach myszy. Odkryliśmy, że histon H3K27ac odróżnia aktywne enhancery od nieaktywnych/wyciszonych elementów enhancerów zawierających tylko H3K4me1. To wskazuje, że ilość aktywnie wykorzystywanych enhancerów jest niższa niż wcześniej przewidywano. niż wcześniej przewidywano. Co więcej, sieci enhancerów dostarczają wskazówek na temat niezrealizowanych programów rozwojowych. programów rozwojowych. Wreszcie, pokazujemy, że enhancery są resetowane podczas jądrowego przeprogramowania. --- Elementy regulacyjne, które kierują ekspresją genów specyficznych dla tkanek w rozwijającym się zarodku ssaków rozwijającym się zarodku ssaka pozostają w dużej mierze nieznane. Chociaż profilowanie chromatyny okazało się skuteczną metodą mapowania sekwencji regulatorowych w hodowanych komórkach. w hodowanych komórkach, stany chromatyny charakterystyczne dla aktywnych wzmacniaczy rozwojowych nie zostały bezpośrednio zidentyfikowane w tkankach embrionalnych. Tutaj używamy analizę całego transkryptomu w połączeniu z profilowaniem H3K27ac i H3K27me3 do mapowania stanów chromatyny i wzmacniaczy w embrionalnej kończynie przedniej i tylnej myszy. kończyny tylnej. Pokazujemy, że różnice w ekspresji genów między kończyną przednią i tylną kończyną tylną, a także między kończynami i innymi typami komórek embrionalnych, są skorelowane z specyficznymi dla tkanki sygnaturami H3K27ac w promotorach i miejscach dystalnych. Używając profili H3K27ac zidentyfikowaliśmy 28 377 domniemanych wzmacniaczy, z których wiele jest prawdopodobnie być specyficzne dla kończyny w oparciu o silne wzbogacenie w pobliżu genów o wysokiej ekspresji w kończynie kończynach i porównania z miejscami EP300 specyficznymi dla tkanek i znanymi enhancerami. My opisujemy sygnaturę stanu chromatyny związaną z aktywnymi rozwojowymi rozwojowymi, zdefiniowanymi przez wysoki poziom znakowania H3K27ac, przemieszczenie nukleosomów, nadwrażliwość na sonikację i silne zubożenie H3K27me3. Stwierdziliśmy również że niektóre wzmacniacze rozwojowe wykazują elementy tej sygnatury, w tym nadwrażliwość, wzbogacenie H3K27ac i zubożenie H3K27me3, na niższych poziomach w tkankach, w których nie są aktywne. Nasze wyniki ustanawiają profilowanie modyfikacji histonów profilowanie modyfikacji histonów jako narzędzie do odkrywania wzmacniaczy rozwojowych i sugerują, że enhancery utrzymują otwarty stan chromatyny w wielu tkankach embrionalnych tkankach embrionalnych niezależnie od ich poziomu aktywności. --- Identyfikacja transkrypcyjnych modułów regulatorowych w genomach ssaków jest warunkiem wstępnym do zrozumienia mechanizmów kontrolujących regulowaną ekspresję genów. ekspresję genów. Podczas gdy wysokoprzepustowe metody oparte na mikromacierzach i sekwencjonowaniu sekwencjonowania zostały wykorzystane do mapowania genomowych lokalizacji miejsc nadwrażliwości nukleazy nukleazy lub docelowych sekwencji DNA związanych przez określone czynniki białkowe, identyfikacja elementów regulatorowych za pomocą testów funkcjonalnych identyfikacja elementów regulatorowych za pomocą testów funkcjonalnych, które dostarczyć ważnych danych uzupełniających, była stosunkowo rzadka. Tutaj przedstawiamy metodę, która pozwala na funkcjonalną identyfikację aktywnych modułów transkrypcyjnych modułów regulacyjnych przy użyciu prostej procedury izolacji i analizy DNA pochodzącego z regionów wolnych od nukleosomów (NFR), 2% genomu komórkowego który zawiera te elementy. Ponad 100 nowych aktywnych regulacyjnych DNA zidentyfikowanych w ten sposób z komórek F9 odpowiada zarówno promotorowi proksymalnemu, jak i elementy dystalne i wykazują kilka cech przewidywanych dla endogennych regulatorów transkrypcji, w tym lokalizację w chromatynie dostępnej dla DNazy chromatyny i wysp CpG oraz bliskość ekspresjonowanych genów. Ponadto, porównanie z opublikowanymi danymi ChIP-seq chromatyny komórek ES pokazuje, że elementy funkcjonalne, które zidentyfikowaliśmy, odpowiadają regionom genomowym wzbogaconym o H3K4me3, modyfikacji histonowej związanej z aktywnymi transkrypcyjnymi i że zgodność H3K4me3 z naszymi elementami regulatorowymi elementami dystalnymi promotora jest w dużej mierze specyficzna dla komórek ES. Większość elementów dystalnych elementów wykazuje aktywność wzmacniającą. Co ważne, te funkcjonalne fragmenty DNA mają średnią długość 149 bp, co znacznie ułatwia przyszłe zastosowania do identyfikacji miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych pośredniczących w ich aktywności. W ten sposób podejście zapewnia narzędzie do identyfikacji wysokiej rozdzielczości funkcjonalnych składników aktywnych promotorów i wzmacniaczy. --- Enhancery odgrywają kluczową rolę w regulacji transkrypcji genów dystalnych. Chociaż niektóre cechy chromatyny, takie jak acetylotransferaza histonowa P300 i modyfikacja histonu H3K4me1, wskazują na obecność enhancerów, to tylko są funkcjonalnie aktywne. Poszczególne znaczniki chromatynowe, takie jak jak H3K27ac i H3K27me3, zostały zidentyfikowane w celu odróżnienia aktywnych od nieaktywnych enhancerów. nieaktywnych enhancerów. Jednak systematyczna identyfikacja najbardziej najbardziej informatywnej pojedynczej modyfikacji lub jej kombinacji. Co więcej, odkrycie enhancerowych RNA (eRNA) zapewnia alternatywne podejście do bezpośredniego przewidywania podejście do bezpośredniego przewidywania aktywności wzmacniacza. Pozostaje jednak wyzwaniem pozostaje powiązanie modyfikacji chromatyny z transkrypcją eRNA. W tym miejscu model regresji logistycznej, aby odkryć związek między modyfikacjami chromatyny a transkrypcją eRNA. modyfikacjami chromatyny a syntezą eRNA. Przeprowadzamy systematyczną ocenę 24 modyfikacji chromatyny w płodowych fibroblastach płuc i wykazujemy, że kombinacja kombinacja czterech modyfikacji jest wystarczająca do dokładnego przewidywania transkrypcji eRNA transkrypcji eRNA. Ponadto porównujemy zdolność eRNA i H3K27ac do dyskryminacji aktywności wzmacniacza. Wykazujemy, że eRNA jest bardziej wskazujące na aktywność aktywność wzmacniacza. Wreszcie, stosujemy nasz wytrenowany model fibroblastów do sześciu innych typów komórek i z powodzeniem przewidujemy syntezę eRNA. W ten sposób wykazujemy, że że wyuczone zależności są ogólne i niezależne od typu komórek. Dostarczyliśmy potężne narzędzie do identyfikacji aktywnych wzmacniaczy i ujawnienia związku między modyfikacjami chromatyny, produkcją eRNA i aktywnością enhancerów. --- Potranslacyjne modyfikacje histonów, działające samodzielnie lub w sposób zależny od kontekstu sposób, wpływają na liczne procesy komórkowe poprzez regulację ekspresji genów. ekspresji genów. Monometylacja lizyny 27 histonu H3 (K27me1) jest słabo poznaną modyfikacją histonu. słabo poznaną modyfikacją histonów. Niektóre doniesienia opisują zubożenie K27Me1 w promotorach i miejscach rozpoczęcia transkrypcji (TSS), co sugeruje, że jego zubożenie w TSS jest niezbędne do aktywnej transkrypcji, podczas gdy inne wiążą wzbogacenie H3K27me1 w TSS ze zwiększonym poziomem ekspresji mRNA. Wzorce tkankowe i specyficzne dla genu wzorce wzbogacenia H3K27me1 i ich korelacja z genem zostały określone za pomocą immunoprecypitacji chromatyny na mikromacierzy chipowej (ChIP-chip) i analizy macierzy ekspresji ludzkiego mRNA. Wyniki z komórek erytroidalnych zostały porównane z wynikami uzyskanymi w komórkach nerwowych i mięśniowych. Wzbogacenie H3K27me1 różniło się w zależności od poziomu ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, z najwyższym wzbogacenie w geny aktywne transkrypcyjnie. W przypadku poszczególnych genów najwyższe poziomy wzbogacenia H3K27me1 stwierdzono nad ciałami genów o wysokiej ekspresji. ekspresji genów. W przeciwieństwie do H3K4me3, który był wysoce wzbogacony w TSS genów aktywnie transkrybowanych genów, H3K27me1 został selektywnie zubożony w TSS aktywnie transkrybowanych genów. aktywnie transkrybowanych genów. Wzbogacenie H3K27me1 w genach o niskiej transkrypcji było znacznie zmniejszone lub nie występowało wcale. w genach o niskiej ekspresji. W niektórych miejscach stwierdzono również monometylację H3K27 monometylacja była również związana z sygnaturami chromatynowymi wzmacniaczy genów. --- Ludzkie ciało składa się z różnych typów komórek o odmiennych funkcjach. Chociaż wiadomo, że specyfikacja linii zależy od specyficznej dla komórki ekspresji genów ekspresji genów, która z kolei jest napędzana przez promotory, wzmacniacze, izolatory i inne cis-regulacyjne sekwencje DNA dla każdego genu. cis-regulujące sekwencje DNA dla każdego genu, względne role tych elementy regulacyjne w tym procesie nie są jasne. Wcześniej opracowaliśmy metodę mikromacierzy opartą na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-chip) w celu zlokalizowania promotorów, wzmacniaczy i izolatorów w ludzkim genomie. Tutaj używamy tego samego podejście do identyfikacji tych elementów w wielu typach komórek i zbadania ich rolę w ekspresji genów specyficznych dla danego typu komórek. Zaobserwowaliśmy, że stan chromatyny w promotorach i wiązanie CTCF w izolatorach jest w dużej mierze niezmienne w różnych typach komórek. różnych typów komórek. W przeciwieństwie do tego, enhancery są oznaczone wysoce specyficznymi dla typu komórki wzorami modyfikacji histonów, silnie korelują z specyficznymi dla typu komórki programami ekspresji genów w skali globalnej i są funkcjonalnie aktywne w sposób specyficzny dla typu komórki. Nasze wyniki definiują ponad 55 000 potencjalnych wzmacniaczy transkrypcji w ludzkim genomie, znacząco rozszerzając obecny katalog ludzkich enhancerów i podkreślając rolę tych elementów w programach tych elementów w ekspresji genów specyficznych dla typu komórki. --- Regulacja ekspresji genów podczas rozwoju tymocytów stanowi idealny system eksperymentalny do badania procesów idealny system eksperymentalny do badania procesów łączenia linii. W szczególności, ekspresja genów CD4, CD8A i CD8B wydaje się dobrze korelować z decyzjami z decyzjami dotyczącymi losu komórkowego podejmowanymi przez tymocyty, a wyjaśnienie molekularnych molekularnych, które leżą u podstaw zróżnicowanej ekspresji tych genów, może ujawnić kluczowe zdarzenia w procesach różnicowania. Poniżej przedstawiamy przykłady tego, w jaki sposób elementy cis genów cis (takie jak promotory, enhancery i regiony kontrolne locus) oraz elementy trans (takie jak czynniki transkrypcyjne, regiony kontrolne locus). (takie jak czynniki transkrypcyjne, kompleksy remodelujące chromatynę i enzymy modyfikujące histony). enzymy modyfikujące histony) łączą się, aby zaaranżować precyzyjnie dostrojoną sekwencję sekwencję zdarzeń, która skutkuje złożonym wzorem ekspresji genów CD4, CD8A i CD8B obserwowany podczas rozwoju tymocytów. --- TŁO: Niedawne badania genomicznych stanów epigenetycznych w genomach ssaków genomach ssaków wykazały, że promotory i enhancery są skorelowane z różnymi sygnaturami sygnaturami chromatyny, zapewniając pragmatyczny sposób systematycznego mapowania tych elementów regulacyjnych w genomie. Wraz z szybką akumulacją profili modyfikacji chromatyny profili modyfikacji chromatyny w genomie różnych organizmów i typów komórek, to podejście oparte na chromatynie obiecuje odkryć wiele nowych elementów regulatorowych, ale metody obliczeniowe do skutecznego wydobywania informacji z tych zbiorów danych są nadal ograniczone. wciąż ograniczone. WYNIKI: Przedstawiamy tutaj nadzorowaną metodę uczenia się do przewidywania promotorów i na podstawie ich unikalnych sygnatur modyfikacji chromatyny. Wyszkoliliśmy Ukryte modele Markowa (HMM) na danych modyfikacji histonów dla znanych promotorów i enhancerów, a następnie wykorzystaliśmy wytrenowane modele HMM do identyfikacji sekwencji promotora lub enhancera w ludzkim genomie. Korzystając z procedury symulowanego wyżarzania (SA), szukaliśmy najbardziej informatywnej kombinacji i optymalnego rozmiaru okna histonów. WNIOSKI: W porównaniu z poprzednimi metodami, metoda HMM może uchwycić uchwycić złożone wzorce modyfikacji histonów, szczególnie na podstawie słabych sygnałów. Walidacja krzyżowa i skanowanie regionów ENCODE wykazały, że nasza metoda przewyższa poprzednią metodę opartą na profilach w mapowaniu promotorów i enhancerów. Wykazaliśmy również, że uwzględnienie większej liczby znaczników histonowych może dodatkowo zwiększyć wydajność naszej metody. Ta obserwacja sugeruje, że HMM jest solidna i jest w stanie integrować informacje z wielu znaczników histonowych. Aby zademonstrować przydatność naszej metody, zastosowaliśmy ją do analizy danych genomowych danych ChIP-Seq w trzech mysich liniach komórkowych i poprawnie przewidzieliśmy aktywnych i nieaktywnych promotorów z dodatnimi wartościami predykcyjnymi przekraczającymi 80%. Oprogramowanie jest dostępne pod adresem http://http:/nash.ucsd.edu/chromatin.tar.gz.
Które modyfikacje histonów odróżniają promotory od enhancerów?
H3K27ac jest markerem aktywnych enhancerów. Sygnatura stanu chromatyny enhancera związana z aktywnymi enhancerami rozwojowymi może być zdefiniowana przez wysoki poziom znakowania H3K27ac, przemieszczenie nukleosomów, nadwrażliwość na sonikację i silne zubożenie H3K27me3.