Procesy komórkowe, takie jak proliferacja, różnicowanie i adaptacja do zmian środowiskowych są regulowane przez fosforylację białek. środowiska są regulowane przez fosforylację białek. Rozwój czułych i kompleksowych metod analitycznych do oznaczania fosforylacji białek fosforylacji białek jest zatem koniecznością w dążeniu do szczegółowego molekularnego szczegółowego obrazu molekularnego złożonych procesów biologicznych. Przedstawiamy ilościowe specyficzne dla modyfikacji podejście proteomiczne, które łączy stabilne znakowanie izotopowe przez aminokwasy w hodowli komórkowej (SILAC) do kwantyfikacji z IMAC dla wzbogacanie fosfopeptydów i trzy etapy spektrometrii mas (MS/MS/MS) dla identyfikacji. Ta zintegrowana technologia fosfoproteomiczna zidentyfikowała i ilościowo fosforylację w kluczowych białkach regulatorowych i efektorowych prototypowego szlaku sygnałowego receptora sprzężonego z białkiem G, feromonu drożdżowego drożdży. Kodowanie SILAC proteomów drożdży zostało osiągnięte poprzez włączenie [(13)C(6)]argininy i [(13)C(6)]lizyny do podwójnego auksotroficznego szczepu drożdży. Komórki drożdży poddane działaniu feromonów zmieszano z komórkami zakodowanymi SILAC jako kontrolą i lizowano, a wyekstrahowane białka trawiono trypsyną. Fosfopeptydy zostały wzbogacone przez połączenie silnej chromatografii kationowymiennej i IMAC. Frakcje fosfopeptydów analizowano za pomocą LC-MS przy użyciu liniowej pułapki jonowej przy użyciu liniowego spektrometru mas z pułapką jonową i transformacją Fouriera. MS/MS i analiza MS/MS/MS ukierunkowana na straty neutralne umożliwiła wykrywanie i sekwencjonowanie fosfopeptydów z wyjątkową dokładnością i specyficznością. Z ponad 700 zidentyfikowanych fosfopeptydów, 139 było regulowanych różnicowo co najmniej 2-krotnie w odpowiedzi na feromon godowy. Wśród tych regulowanych białek były składniki należące do szlaku sygnałowego kinazy białkowej aktywowanej mitogenem i do procesy niższego szczebla, w tym regulacja transkrypcji, ustanowienie spolaryzowanego wzrostu i regulacji cyklu komórkowego. --- Normalny ludzki mocz zawiera dużą liczbę egzosomów, które są pęcherzykami o wielkości od 40 do 100 nm. pęcherzyki, które powstają jako wewnętrzne pęcherzyki w ciałach wielopęcherzykowych z każdego typu komórek nabłonka nerkowego skierowanych do przestrzeni moczowej. Tutaj użyliśmy LC-MS/MS do profilowania proteomu ludzkich egzosomów moczowych. Ogólnie rzecz biorąc analiza jednoznacznie zidentyfikowała 1132 białka, w tym 177, które są reprezentowane w bazie danych Online Mendelian Inheritance in Man of genów związanych z chorobą, co sugeruje, że analiza egzosomów jest potencjalnym podejściem do odkrywania biomarkerów moczu. Rozszerzyliśmy analizę proteomiczną o profilowanie fosfoproteomiczne przy użyciu skanowania neutralnej utraty, co dało wiele nowych miejsc fosforylacji, w tym serynę-811 w białku wrażliwym na tiazyd ko-transporterze Na-Cl, NCC. Aby zademonstrować potencjalne zastosowanie analizy egzosomów do identyfikacji genetycznej choroby nerek, przeprowadziliśmy immunoblotting egzosomów z próbek moczu pacjentów z rozpoznaniem klinicznym diagnozą zespołu Barttera typu I, wykazując brak zespołu ko-transportera sodowo-potasowo-chlorkowego 2, NKCC2. Dane proteomiczne są publicznie dostępne na stronie http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/exosome/. --- Odwracalna fosforylacja białek jest centralnym komórkowym mechanizmem regulacyjnym w modulowaniu aktywności białek i propagowaniu sygnałów w obrębie szlaków i sieci komórkowych. sieci. Opracowanie bardziej skutecznych metod jednoczesnej identyfikacji miejsc fosforylacji i kwantyfikacji czasowych zmian w fosforylacji białek może zapewnić ważny wgląd w molekularne mechanizmów sygnalizacyjnych w różnych procesach komórkowych. Tutaj przedstawiamy zintegrowane ilościowe podejście fosfoproteomiczne i jego zastosowanie do analizy porównawczej komórek Cos-7 w odpowiedzi na stymulację gradientem kwasu lizofosfatydowego (LPA) gradient stymulacji. Podejście to łączy katalizowane trypsyną znakowanie (16)O/(18)O oraz estryfikację (16)O/(18)O-metanolem w celu oznaczenia ilościowego, a także pułapkę chromatograficzną powinowactwa jonów metali do fosfopeptydu wzbogacanie i analiza LC-MS/MS. Po separacji LC i MS/MS następuje zależny od strat neutralnych MS/MS/MS do identyfikacji fosfopeptydów przy użyciu liniowej pułapki jonowej liniowej pułapki jonowej (LTQ)-FT. Różnorodne fosforylowane białka zostały zidentyfikowano i oznaczono ilościowo, w tym receptory, kinazy, białka związane z małymi GTPazami i białkami cytoszkieletu. Szereg hipotetycznych białek zostało również zidentyfikowano również jako ulegające różnej ekspresji po stymulacji LPA, a my wykazaliśmy dowody na subkomórkową lokalizację pseudopodiów jednego z tych białek kandydujących. kandydujących białek. Wyniki te pokazują skuteczność tej ilościowej fosfoproteomiki i jej zastosowania do szybkiego odkrywania zdarzeń fosforylacji związanych z wyczuwaniem gradientu LPA i chemotaksją komórek. chemotaksją. --- Tutaj opisujemy zestaw ulepszonych metod przetwarzania i filtrowania danych w celu poprawić znaczenie i zasięg identyfikacji fosfopeptydów za pomocą spektrometrii mas spektrometrii mas. Pokazujemy, że dla próbek o ograniczonej złożoności, oszacowanie współczynnika fałszywych odkryć na podstawie widma doprowadzi do przeszacowania fosforylowanych peptydów ze względu na błąd spowodowany wielokrotną fragmentację wysoce obfitych gatunków peptydów. Ponadto przedstawiamy dowody że fragmentacja obfitych peptydów na ogonach ich chromatograficznych pików chromatograficznych jest głównym źródłem fałszywie dodatnich dopasowań peptydów i ogólnego zaufanie do identyfikacji fosfopeptydów można poprawić za pomocą schemat agregacji oparty na piku chromatograficznym, neutralna utrata oparta na intensywności i zoptymalizowane filtry błędów masy. Gdy powtórzone przebiegi standardowej próbki zostały przy użyciu różnych technik fragmentacji na spektrometrze mas Orbitrap zaobserwowaliśmy poprawę o 7-31% w pokryciu fosfopeptydów w zależności od metody fragmentacji i pożądanego wskaźnika fałszywych odkryć. --- Fosfoproteomika jest potężną platformą analityczną do identyfikacji i kwantyfikacji fosforylowanych peptydów i przypisywania miejsc fosforylacji miejsc fosforylacji. Narzędzia bioinformatyczne do identyfikacji fosforylowanych peptydów z ich tandemowych widm masowych i baz danych sekwencji białek są ważną częścią fosfoproteomiki. fosfoproteomiki. W tej pracy omawiamy ogólne aspekty informatyczne fosfoproteomiki opartej na spektrometrii mas. Niektóre z aspektów identyfikacji fosfopeptydów wynika z labilnego charakteru grup fosforowych i rozszerzonej przestrzeni wyszukiwania peptydów. Umożliwienie modyfikacji reszt Ser, Thr i Tyr wykładniczo zwiększa efektywny rozmiar bazy danych. Wysoka rozdzielczość rozdzielczość i dokładność pomiarów stosunku masy prekursora do ładunku pomagają ograniczyć przestrzeń wyszukiwania kandydujących sekwencji peptydowych. Fragmentacje wyższego rzędu neutralnych jonów stratnych zwiększają widma masowe jonów fragmentacyjnych fosforylowanych peptydów. fosforylowanych peptydów. Pokazujemy przykład identyfikacji fosfopeptydu w którym uwzględnienie fragmentacji jonów strat neutralnych poprawia wyniki wyniki identyfikacji w algorytmie przeszukiwania bazy danych o 50%. --- Dokładne określenie fosforylacji białek jest wyzwaniem, szczególnie dla badaczy, którzy nie mają dostępu do spektrometru masowego o wysokiej dokładności. W tym badaniu badaniu do wzbogacenia fosfopeptydów wykorzystano wiele protokołów, a do analizy uzyskanych próbek zastosowano rygorystyczny rygorystyczny proces filtrowania został wykorzystany do analizy uzyskanych próbek. Fosfopeptydy zostały wzbogacone z hodowanych szczurzych komórek kanalików proksymalnych nerek przy użyciu trzech powszechnie powszechnie stosowanych protokołów i podwójnej metody, która łączy oddzielną immobilizowaną chromatografię powinowactwa do metalu chromatografię powinowactwa unieruchomionych metali (IMAC) i chromatografię dwutlenku tytanu (TiO(2)), określaną jako podwójna IMAC (DIMAC). Fosfopeptydy ze wszystkich czterech strategii wzbogacania analizowano za pomocą chromatografii cieczowej - wielopoziomowej spektrometrii masowej (LC-MS(n)) przy użyciu liniowego spektrometru mas z pułapką jonową. Początkowo uzyskane widma MS(2) i MS(3) zostały przeanalizowane przy użyciu aplikacji PeptideProphet i progi wyszukiwarki baz danych, które dały fałszywy odkryć (FDR) <1,5% podczas wyszukiwania w odwrotnej bazie danych. Jednakże, tylko 40% potencjalnych fosfopeptydów zostało potwierdzonych przez ręczną walidację. Połączone analizy dały 110 pewnie zidentyfikowanych fosfopeptydów. Używając mniej rygorystyczne początkowe progi filtrowania (FDR 7-9%), a następnie rygorystyczną ręczna walidacja, 262 unikalne fosfopeptydy, w tym 111 nowych w tym 111 nowych miejsc fosforylacji. Tak więc tradycyjne metody filtrowania danych w ramach powszechnie akceptowanych FDR były nieodpowiednie do analizy widm fosfopeptydów o niskiej rozdzielczości. Jednak połączenie usprawnionej strategii strategii wzbogacania front-end i rygorystycznej ręcznej walidacji spektralnej pozwoliło na pewną identyfikację fosfopeptydów ze złożonej próbki przy użyciu spektrometru mas z pułapką jonową o niskiej rozdzielczości. --- Fosfoproteomika zajmuje się identyfikacją i kwantyfikacją tysięcy fosfopeptydów. fosfopeptydów. Lokalizacja miejsca fosforylacji jest jednak znacznie trudniejsza trudniejsze niż ustalenie tożsamości fosforylowanego peptydu. Ponadto, ostatnie odkrycia wzbudziły wątpliwości co do ważności przypisań miejsc w w dużych zbiorach danych fosfoproteomicznych. Aby ulepszyć metody lokalizacji lokalizacji, wykorzystaliśmy syntetyczną bibliotekę fosfopeptydów i peptydów znakowanych SILAC z lizatów całych komórek i przeanalizowaliśmy je za pomocą tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości na LTQ Orbitrap Velos. Zweryfikowaliśmy reakcje przegrupowania fosforanów w fazie gazowej podczas dysocjacji dysocjacji (CID) i wykorzystaliśmy te widma do opracowania filtra ilościowego, który poprzez porównanie intensywności sygnału jonów fragmentów fosforylowanych z ich niefosforylowanymi odpowiednikami ich niefosforylowanymi odpowiednikami pozwoliło nam dokładnie określić, które jony jony fragmentów zawierają resztę fosforylowaną, a które nie. Oceniliśmy również oceniliśmy również dysocjację kolizyjną o wyższej energii (HCD) i stwierdziliśmy, że jest to dokładna metoda prawidłowej lokalizacji miejsca fosforylacji bez przegrupowań w fazie gazowej w fazie gazowej. Analizując duży zestaw widm HCD fosfopeptydów znakowanych SILAC, zidentyfikowaliśmy nowy mechanizm fragmentacji który generuje specyficzny dla miejsca fosforylacji neutralny jon x, który bezpośrednio wskazuje resztę fosforylowaną. Wszystkie te odkrycia znacznie poprawiają pewność lokalizacji miejsca fosforylacji. --- Lokalizacja miejsc fosforylacji w sekwencjach peptydowych jest trudnym problemem w analizie fosfoproteomów. problemem w analizie fosfoproteomiki na dużą skalę. Intensywne piki neutralnej utraty oraz współwystępowanie wielu reszt seryny/treoniny i/lub tyrozyny są czynnikami ograniczającymi obiektywną ocenę wzorców miejsc w tysiącach peptydów. peptydów. Zaproponowano różne podejścia obliczeniowe do lokalizacji miejsc fosforylacji fosforylacji, w tym Ascore, Mascot Delta score i ProteinProspector, jednak niewiele z nich zajmuje się bezpośrednim szacowaniem wskaźnika fałszywej lokalizacji (FLR) w każdym eksperymencie. eksperymencie. Tutaj proponujemy LuciPHOr, zmodyfikowane podejście oparte na przynęcie na cel które wykorzystuje dokładność masy i intensywność pików do punktacji lokalizacji i szacowania FLR. szacowania FLR. Dokładne oszacowanie FLR jest trudnym zadaniem na poziomie poziomie pojedynczego miejsca, ponieważ stopień niepewności w lokalizacji jest różny w różnych peptydach. LuciPHOr przeprowadza jednoczesną lokalizację na wszystkich kandydujących miejscach w każdym peptydzie i szacuje FLR na podstawie w oparciu o strukturę cel-wabik, w której fosfopeptydy wabika generowane są przez umieszczenie sztuczne fosforylacje na niekandydackich resztach konkurują z fosfopeptydami fosfopeptydami niebędącymi wabikiem. LuciPHOr zgłasza również przybliżone wyniki zaufania na poziomie miejsca dla wszystkich kandydujących miejsc jako sposób na zlokalizowanie dodatkowych miejsc z wielofosforylowanych peptydów, w których lokalizacja może być częściowo częściowo. W przeciwieństwie do istniejących narzędzi, LuciPHOr jest kompatybilny z dowolną wyszukiwarką wyszukiwarką przetwarzaną przez Trans-Proteomic Pipeline. Oceniliśmy wydajność LuciPHOr pod względem czułości i dokładności szacunków FLR przy użyciu dwóch syntetycznych bibliotek fosfopeptydów i zestawu danych fosfoproteomicznych fosfoproteomicznych wygenerowanych ze złożonych próbek mózgu myszy.
Jaka jest zaleta wykrywania strat neutralnych w fosfoproteomice?
Lokalizacja miejsc fosforylacji w sekwencjach peptydowych jest trudnym problemem w analizie fosfoproteomiki na dużą skalę. Intensywne piki neutralnej utraty i współwystępowanie wielu reszt seryny/treoniny i/lub tyrozyny są czynnikami ograniczającymi obiektywne punktowanie wzorców miejsc w tysiącach peptydów.
CID fosfopeptydów zazwyczaj skutkuje widmami zdominowanymi przez neutralną utratę grupy fosforanowej, umożliwiając wykrywanie i sekwencjonowanie fosfopeptydów.