Wiadomo, że potranslacyjna modyfikacja histonów reguluje strukturę chromatyny i aktywność transkrypcyjną. strukturę chromatyny i aktywność transkrypcyjną, a blaszkę jądrową uważa się za służy jako miejsce utrzymania heterochromatyny i wyciszania transkrypcji. W tym raporcie pokazujemy, że blaszka jądrowa może również odgrywać rolę w regulacji heterochromatyny i aktywacji genów. Wirus opryszczki pospolitej DNA inicjuje replikację w przedziałach replikacyjnych w pobliżu wewnętrznej krawędzi jądra. jądra, a histony są wykluczone z tych struktur. Aby zdefiniować rolę laminy jądrowej w replikacji HSV, zbadaliśmy infekcję HSV w typie dzikim i z niedoborem lamin typu A (Lmna-/-) mysich fibroblastów embrionalnych (MEF). W komórkach Lmna-/- przedziały replikacji wirusa są zmniejszone i nie są ukierunkowane na obrzeża jądra, jak zaobserwowano w komórkach WT. Immunoprecypitacja chromatyny i badania immunofluorescencyjne pokazują, że DNA HSV jest związane z zwiększoną heterochromatyną w komórkach Lmna-/- MEF. Wyniki te przemawiają za funkcjonalną rolą laminy typu A, ponieważ ekspresja genów wirusa, replikacja DNA i wzrost są zmniejszone w Lmna-/- MEF, z największym wpływem na replikację wirusa przy niskiej wielokrotności infekcji. Zatem lamin A/C jest wymagany do ukierunkowania genomu genomu wirusowego i redukcji heterochromatyny na promotorach wirusowych podczas infekcji litycznej. infekcji litycznej. Lamina jądrowa może służyć jako rusztowanie molekularne dla genomów DNA DNA i kompleksów białkowych, które regulują zarówno euchromatynę, jak i modyfikacje histonów heterochromatyny. --- Laminy jądrowe funkcjonują w regulacji replikacji, transkrypcji i epigenetycznych modyfikacji chromatyny. Jednak mechanizmy odpowiedzialne za te funkcje lamin są słabo poznane. Wykazaliśmy, że laminy typu A i B tworzą oddzielne, ale wzajemnie oddziałujące, stabilne siatki w laminie i mają różne ruchliwości w nukleoplazmie, jak określono za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). Wyciszenie ekspresji lamin B1 (LB1) dramatycznie zwiększa rozmiar siateczki laminy i ruchliwość nukleoplazmatycznej lamin A (LA). Zmiany w rozmiarze siatki laminy są powiązane z tworzeniem się bogatych w LA/C otoczki jądrowej z niedoborem LB2. Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) analizy mikrodyssekcji krwawień, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunofluorescencyjna lokalizacja zmodyfikowanych histonów pokazują, że bogata w geny euchromatyna wiąże się z pęcherzykami LA/C. Wzbogacenie hiperfosforylowanej polimerazy RNA II (Pol II) i znaczników histonowych dla aktywnej transkrypcji sugeruje że pęcherzyki są aktywne transkrypcyjnie. Jednakże, znakowanie RNA in vivo wskazuje, że transkrypcja jest zmniejszona, co sugeruje, że mikrośrodowisko bogate w LA/C indukuje zahamowanie proksymalnego promotora Pol II. Proponujemy, aby różne laminy są zorganizowane w oddzielne, ale wzajemnie oddziałujące mikrodomeny i że LB1 jest niezbędna dla ich organizacji. Nasze dowody sugerują, że na organizację i regulację chromatyny wpływają wzajemne połączenia między tymi mikrodomenami lamin. --- Aby zbadać rolę kaspazy-6 podczas demontażu jądra, wygenerowaliśmy linię komórkową linię komórkową DT40, w której oba allele genu kaspazy-6 były zaburzone. Nie zaobserwowano oczywistych różnic morfologicznych w procesie apoptozy w komórkach z niedoborem kaspazy-6. w komórkach z niedoborem kaspazy-6 w porównaniu z komórkami typu dzikiego. Jednakże, badanie apoptozy w systemie bezkomórkowym ujawniło blok w chromatynie kondensacji chromatyny i tworzenia ciałek apoptotycznych, gdy jądra z komórek HeLa wyrażających lamin A lub komórek Jurkat transfekowanych lamin A inkubowano w komórkach ekstraktami apoptotycznymi pozbawionymi kaspazy-6. Transfekcja egzogennej kaspazy-6 do klonu odwróciła ten fenotyp. Laminy A i C, które są substratami tylko dla kaspazy-6 substratami kaspazy-6, zostały rozszczepione przez ekstrakty apoptotyczne typu dzikiego i heterozygotyczne ale nie przez ekstrakty pozbawione kaspazy-6. Ponadto, inhibitor kaspazy-6 z-VEID-fmk naśladował skutki niedoboru kaspazy-6 i zapobiegał rozszczepieniu lamin A. Razem wzięte, obserwacje te wskazują, że aktywność kaspazy-6 jest niezbędna do rozszczepienia lamin A. jest niezbędna do rozszczepienia laminu A i że gdy lamin A jest obecny musi zostać rozszczepiony, aby chromosomalne DNA uległo całkowitej kondensacji podczas apoptozy. kondensacji podczas apoptozy. --- Ponad 300 mutacji w genie LMNA, kodującym laminy typu A, jest powiązanych z 15 ludzkimi zaburzeniami zwyrodnieniowymi i zespołami przedwczesnego starzenia. Chociaż niestabilność genomowa wydaje się przyczyniać do patofizjologii niektórych laminopatii, istnieją ograniczone informacje na temat tego, jakie mutacje powodują niestabilność genomową i przez jakie mechanizmy molekularne. przez jakie mechanizmy molekularne. Zarodkowe fibroblasty myszy pozbawione lamin typu A laminy typu A lub wyrażające mutanty pozbawione eksonów 8-11 (Lmna(Δ8-11/Δ8-11)) wykazują zmiany w biologii telomerów i naprawie DNA spowodowane przez katepsynę L za pośrednictwem degradację 53BP1 i zmniejszoną ekspresję BRCA1 i RAD51. Zatem region obejmujący eksony 8-11 wydaje się niezbędny dla integralności genomu. Biorąc pod uwagę, że delecja eksonu 9 lamin A u myszy (Lmna(Δ9/Δ9)) skutkuje fenotypem progerii. przetestowaliśmy, czy domena ta jest ważna dla integralności genomu. MEFy Lmna(Δ9/Δ9) wykazują skrócenie telomerów i zmiany heterochromatyny, ale nie aktywują degradacji 53BP1 za pośrednictwem katepsyny L i utrzymują ekspresję BRCA1 i RAD51. W związku z tym MEF Lmna(Δ9/Δ9) nie wykazują niestabilności genomowej i ekspresji niestabilność genomowa, a ekspresja zmutowanego laminu A Δexon9 w komórkach pozbawionych laminu przywraca poziomy czynników naprawy DNA i częściowo ratuje jądro nieprawidłowości. Dane te ujawniają, że domena kodowana przez ekson 9 jest ważna dla utrzymania homeostazy telomerów i struktury heterochromatyny, ale nie odgrywa rolę w naprawie DNA, wskazując w ten sposób na inne eksony w ogonie lamin A jako odpowiedzialne za fenotyp niestabilności genomowej u myszy Lmna(Δ8-11/Δ8-11). Nasze badanie sugeruje również, że poziomy czynników naprawy DNA 53BP1, BRCA1 i RAD51 mogą potencjalnie służyć jako biomarkery do identyfikacji laminopatii, które charakteryzują się niestabilnością genomową. z niestabilnością genomową. --- Po dojrzewaniu in vitro (IVM), izolacja najzdrowszych oocytów jest jest niezbędna do udanego zapłodnienia in vitro. Jako pęcherzyki zarodkowe (GV) oocyty wznawiają mejozę poprzez zdrowe lub apoptotyczne szlaki bez dostrzegalnych kryteriów morfologicznych, sprawdziliśmy element apoptotyczny działający na poziomie jądra. poziomie jądra. Postawiliśmy hipotezę, że kaspaza-6 z odpowiadającym jej substratem, lamin A/C, może być potencjalnym kandydatem na cel, ponieważ kaspaza-6 jest jedyną funkcjonalną kaspazą dla lamin A/C. Zastosowaliśmy metody immunohistochemiczne, Western i specyficzny inhibitor kaspazy-6 w celu określenia obecności lamin A/C i kaspazy-6 podczas oogenezy i w izolowanych oocytach. Nasze wyniki wykazały że białka te były zawsze obecne, a ich dystrybucja była związane z dojrzałością oocytu, określoną przez konfigurację chromatyny i średnicę oocytu. średnica oocytu. Zahamowanie kaspazy-6 spowolniło wznowienie mejozy, co sugeruje zaangażowanie kaspazy-6 w szlak apoptozy oocytów. Lamin A/C i kaspaza-6 mogą być cennymi narzędziami w wiedzy o przeznaczeniu oocytów in vitro. --- Uważa się, że niektóre białka wiążące DNA organizują genom ssaków w odrębne trójwymiarowe struktury, z których każda jest charakterystyczna dla danego zróżnicowanego stanu stanu. Autoprzeciwciała przeciwko 2 typom kompleksów białek wiążących DNA, jądrowym lamina i p70/p80 (Ku), zostały zidentyfikowane w surowicy pacjentów z kolagenowymi chorobami naczyniowymi. choroby naczyniowe. Dystrybucja wewnątrzjądrowa, wiązanie DNA i zachowanie podczas mitozy tych antygenów zbadano przy użyciu surowic autoimmunologicznych i mysich przeciwciał przeciwciał monoklonalnych. In vivo antygeny mają różne rozkłady wewnątrzjądrowe i charakterystykę rozpuszczalności. dystrybucję i charakterystykę rozpuszczalności. Wydaje się jednak, że oba antygeny odwracalnie wiążą się z DNA podczas interfazy i szybko dysocjują z DNA podczas mitozy. Chociaż powinowactwo wiązania p70/p80 do DNA jest heterogeniczne, interakcja między p70/p80 i DNA in vitro jest stabilna przez 2 h lub dłużej. Szybka dysocjacja p70/p80 z DNA podczas mitozy może być zatem być pośredniczona przez modyfikację struktury chromatyny lub samego antygenu p70/p80. antygenu p70/p80. Inne białka, które odwracalnie oddziałują z DNA, takie jak takie jak laminy i pory jądrowe, mogą odgrywać rolę w organizacji DNA w transkrybowalną euchromatynę i niepodlegającą transkrypcji heterochromatynę. Autoprzeciwciała do tych białek i ewentualnie tych reagujących z p70/p80 lub innymi białkami wiążącymi DNA mogą być użytecznymi sondami do badania zarówno organizacji chromatyny i przyczyn chorób autoimmunologicznych, takich jak toczeń rumieniowaty układowy. --- Embrionalne komórki macierzyste charakteryzują się unikalnymi cechami epigenetycznymi, w tym zdekondensowana chromatyna i hiperdynamiczna asocjacja białek chromatyny z chromatyną. Tutaj badamy potencjalne mechanizmy regulujące plastyczność chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych. w embrionalnych komórkach macierzystych. Stosując leki epigenetyczne i zmutowane embrionalne komórki macierzyste embrionalnych komórek macierzystych pozbawionych różnych białek chromatyny, stwierdzamy, że acetylacja histonów, G9a, metylacja lizyny 9 histonu H3 (H3K9) i ekspresja lamin A wpływają na dynamikę białek chromatyny. wpływają na dynamikę białek chromatyny. Acetylacja histonów kontroluje, prawie wyłącznie dynamikę białek euchromatyny; ekspresja lamin A reguluje dynamikę białek heterochromatyny dynamikę białek heterochromatyny, a G9a reguluje zarówno dynamikę białek euchromatyny, jak i heterochromatyny. i heterochromatynę. W przeciwieństwie do tego stwierdzamy, że metylacja DNA i nukleosomów mają niewielki lub żaden wpływ na dynamikę białek wiążących chromatynę w embrionalnych komórkach macierzystych. w embrionalnych komórkach macierzystych. Zmieniona dynamika chromatyny wiąże się z zaburzonym różnicowaniem embrionalnych komórek macierzystych. Łącznie, dane te dostarczają mechanistyczny wgląd w szlaki epigenetyczne, które są odpowiedzialne za plastyczność chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych i wskazują, że stan epigenetyczny genomu genomu moduluje plastyczność chromatyny i potencjał różnicowania embrionalnych komórek macierzystych. embrionalnych komórek macierzystych.
Czy laminy typu A wiążą euchromatynę czy heterochromatynę?
Dane te ujawniają, że domena kodowana przez ekson 9 jest ważna dla utrzymania homeostazy telomerów i struktury heterochromatyny, ale nie odgrywa roli w naprawie DNA, wskazując tym samym na inne eksony w ogonie lamin A jako odpowiedzialne za fenotyp niestabilności genomowej u myszy Lmna(Δ8-11/Δ8-11)