Odpowiedź szybkiego chłodzenia (RC) w mięśniach jest wzrostem cytoplazmatycznego stężenia Ca2+ ([Ca2+]i), który jest prawdopodobnie spowodowany uwalnianiem Ca2+ z retikulum sarkoplazmatycznego (SR). retikulum sarkoplazmatycznego (SR). Jednak molekularne podstawy tej odpowiedzi nie zostały nie zostały całkowicie wyjaśnione. Trzy różne izoformy kanałów SR uwalniających Ca2+ lub receptorów ryanodynowych (RyR), zostały wyizolowane (RyR1, RyR2 i RyR3). W obecnym badaniu odpowiedź RC badano w komórkach mięśniowych RyR-null komórkach mięśniowych (1B5) przed i po transdukcji wirionami HSV-1 zawierającymi cDNA kodującymi RyR1, RyR2 lub RyR3. Komórki zostały obciążone fluo 4-AM w celu monitorować zmiany w [Ca2+]i i perfundowano albo zimną (około 0 stopni C), temperaturą pokojową (RT) lub buforem RT zawierającym 40 mM kofeiny. Komórki kontrolne nie wykazywały znaczącej odpowiedzi na zimno lub kofeinę, podczas gdy silne Ca2+ zarejestrowano w odpowiedzi zarówno na RC, jak i kofeinę w transdukowanych komórkach komórki wyrażające dowolną z trzech izoform RyR. Nasze dane pokazują bezpośrednio, że RyR są odpowiedzialne za odpowiedź RC i że wszystkie trzy izoformy izoformy reagują w podobny sposób. Uwalnianie Ca2+ z RyR jest prawdopodobnie spowodowane przez indukowaną przez RC zmianą konformacyjną kanału ze stanu zamkniętego do otwartego. do stanu otwartego. --- Szkieletowe (RyR1) i sercowe (RyR2) izoformy receptora wapniowego ryanodyny są hamowane przez milimolowe Ca(2+), ale powinowactwo RyR2 do hamującego Ca(2+) jest ~10 razy niższe niż RyR1. hamującego Ca(2+) jest ~10 razy niższe niż RyR1. Poprzednie badania wykazały, że C-końcowa ćwiartka RyR ma krytyczną domenę (domeny) dla inaktywacji Ca(2+). Aby uzyskać dalszy wgląd w molekularne podstawy regulacji RyR przez Ca(2+), skonstruowaliśmy i wyraziliśmy 18 chimer RyR1-RyR2 w komórkach HEK293 i określiliśmy powinowactwo aktywacji i inaktywacji Ca(2+) tych kanałów przy użyciu testu wiązania [(3)H]ryanodyny. Zastąpienie dwóch odrębnych regionów RyR1 odpowiadającymi sekwencjami RyR2 zmniejszyło powinowactwo do inaktywacji Ca(2+). Pierwszy region (RyR2 aminokwasy 4020-4250) zawiera dwa motywy wiążące Ca(2+) EF-hand (EF1, aminokwasy 4036-4047; EF2, aminokwasy 4071-4082), a drugi region obejmuje domniemany drugi segment transbłonowy (S2). segment (S2). Chimera szkieletowa RyR1 zawierająca tylko EF2 z RyR2 miała skromną (nieistotną) zmianę (nieistotną) zmianę w inaktywacji Ca(2+), podczas gdy inny kanał chimery niosący tylko EF1 z RyR2 miał znacznie obniżony poziom inaktywacji Ca(2+) inaktywacji. Wyniki sugerują, że EF1 jest bardziej krytycznym czynnikiem determinującym RyR przez Ca(2+). Ponadto, aktywność chimery niosącej ręce RyR2 EF-hands były tłumione przy 10-100 μM Ca(2+), a tłumienie było łagodzone przez 1 mM Mg(2+). Te same efekty zaobserwowano w przypadku RyR2 typu dzikiego. A mutant RyR1 niosący oba regiony zastąpione sekwencjami RyR2 (aminokwasy 4020-4250 i 4560-4618) wykazywał powinowactwo do inaktywacji Ca(2+) porównywalne do RyR2, wskazując, że regiony te są wystarczające do nadania typu RyR2 inaktywacji zależnej od Ca(2+) na RyR1. --- W komórkach pobudliwych, takich jak miocyty szkieletowe i mięśnia sercowego, sprzężenie pobudzenie-skurcz jest ważnym etapem pośrednim między inicjacją potencjału czynnościowego a indukcją skurczu. a indukcją skurczu. Proces ten jest głównie kontrolowany przez uwalnianie Ca(2+) z retikulum sarkoplazmatycznego przez receptor ryanodynowy. To bardzo duże białko (MW 560 kDa) istnieje jako homotetramer (~2,2 MDa) i jest wyrażane w trzech izoformach wyrażane w trzech izoformach: RyR1, wyrażany w mięśniach szkieletowych; RyR2, wyrażany w mięśniu sercowym; i RyR3, wyrażany w różnych komórkach na niższych poziomach niż pozostałe izoformy. niż inne izoformy. Uwalnianie Ca(2+) przez RyR2 jest indukowane przez napływ Ca(2+) przez kanały Ca(2+) typu kanały Ca(2+) typu L i jest modulowane przez wiele czynników, w tym fosforylację białka RyR2 przez kinazę białkową A, kinazę kalmoduliny II i FKBP12.6 oraz stymulację poprzez szlak sygnałowy receptora beta-adrenergicznego. Hiperfosforylacja RyR2 indukuje wyciek Ca(2+) podczas rozkurczu, co może powodować powodować śmiertelne arytmie i prowadzić do niewydolności serca. To sprawia, że RyR2 jest ważnym cel terapeutyczny. Chociaż istnieje kilka komercyjnie dostępnych leków, które hamują wyciek Ca(2+) z RyR2, K201 (JTV-519), pochodna benzotiazepiny, pojawiła się jako nowy ryanod pojawiła się jako nowy środek selektywny wobec receptora ryanodyny, który zapobiega migotaniu przedsionków migotaniu przedsionków, komorowym zaburzeniom rytmu, niewydolności serca i nagłej śmierci sercowej wywołanej wysiłkiem fizycznym. nagłej śmierci sercowej. W niniejszym przeglądzie omawiamy najnowsze postępy w naszym rozumieniu podstawowej struktury i funkcji receptorów ryanodynowych, ich udziału w chorobach serca i rozwoju leków w chorobach serca, a także rozwój leków zapobiegających nieprawidłowemu działaniu receptorów ryanodynowych i najnowsze patenty. --- CEL: Dowody funkcjonalne sugerują obecność dwóch typów wewnątrzkomórkowych kanałów Ca(2+ odpowiedzialnych za uwalnianie Ca(2+ z magazynów Ca(2+), tj. kanałów Ca(2+) odpowiedzialnych za uwalnianie Ca(2+) z magazynów Ca(2+), tj. inozytolo-1,4,5-trifosforanu (IP(3)R) i receptorów ryanodynowych (RyR) w nabłonku okrężnicy szczura. nabłonka okrężnicy szczura. Ogólnie rzecz biorąc, znane są trzy izoformy receptora ryanodyny (RyR1-RyR3). znane; jednak typ RyR w tym nabłonku jest nieznany i był przedmiotem zainteresowania niniejszego badania. METODY: RyR zostały scharakteryzowane metodami biologii molekularnej i immunohistochemicznymi w okrężnicy szczura. metody w okrężnicy szczura. WYNIKI: Transkrypt RyR1 znaleziono w mRNA z krypt okrężnicy. Natomiast RyR2 i RyR3 znaleziono w odpowiadających im tkankach referencyjnych, ale nie w cDNA z okrężnicy. ale nie w cDNA z krypt okrężnicy, co sugeruje dominującą ekspresję izoformy RyR1 w tym nabłonku. W celu scharakteryzowania subkomórkowej lokalizację RyR1, przeprowadzono eksperymenty immunohistochemiczne. Wykazały one wykazały, że RyR1 jest obecny w nabłonku blaszkowatym błony śluzowej i komórkach mięśni gładkich mięśni gładkich i jest równomiernie rozmieszczony wzdłuż całej osi krypty, bez różnicy między komórkami powierzchniowymi i kryptowymi. Podwójne barwienie IP(3)R3, dominującą izoformą cytoplazmatyczną dominującą cytoplazmatyczną izoformą IP3R w tym nabłonku, ujawniło, że jest tylko niewielka kolokalizacja dwóch podtypów receptorów w komórkach nabłonka. Co więcej, nabłonek jest wyposażony w enzym CD38 odpowiedzialny za produkcję cyklicznego adenozynodifosforanu rybozy, fizjologicznego agonisty RyR. RyR. Wiadomo, że RyR są aktywowane przez zmiany stanu redoks. Utleniacz, monochloramina wywołała wrażliwe na czerwień rutenową uwalnianie Ca(2+) w całej osi krypt. osi krypty. Na uwalnianie to nie miała wpływu wcześniejsza stymulacja receptorów IP(3) za pomocą ATP (i odwrotnie). WNIOSEK: Obecne dane sugerują funkcjonalną separację IP(3)- i receptorów ryanodynowych przenoszących Ca(2+) w nabłonku okrężnicy. --- Receptor ryanodynowy (RyR) jest kanałem Ca(2+), który pośredniczy w uwalnianiu Ca(2+) z wewnątrzkomórkowych magazynów z magazynów wewnątrzkomórkowych. Zmieniona homeostaza Ca(2+) w mięśniach szkieletowych, która zwykle występuje w wyniku mutacji punktowych w RyR1 (RyR1) typu 1, jest kluczowym kluczowym zdarzeniem molekularnym wywołującym hipertermię złośliwą (MH). Istnieją trzy izoformy RyR i po raz pierwszy pokazujemy, że ludzkie komórki dendrytyczne (DC) preferencyjnie wyrażają wśród nich mRNA RyR1. Aktywator RyR, 4-chloro-m-krezol (4CmC), indukował uwalnianie Ca(2+) w DCs, a ta odpowiedź była wyeliminowana przez dantrolen, inhibitor RyR1, i nie miała na nią wpływu xestospongin C, selektywny inhibitor receptora IP(3). Aktywacja RyR1 zmniejszała indukowaną przez LPS produkcję IL-10, promowała ekspresję HLA-DR i CD86, a tym samym wykazywała zwiększoną zdolność do stymulacji allogenicznych limfocytów T komórek T. Odkrycia te pokazują, że sygnalizacja wapniowa, w której pośredniczy RyR1, modyfikuje modyfikuje różne odpowiedzi DC i sugeruje możliwość wykorzystania preparatów DC do diagnostyki MH. w diagnostyce MH.
Ile i jakie są różne izoformy receptora ryanodyny?
Ogólnie znane są trzy izoformy receptora ryanodyny (RyR1-RyR3). RyR1 ulega ekspresji w mięśniach szkieletowych; RyR2 ulega ekspresji w mięśniu sercowym; a RyR3 ulega ekspresji w różnych komórkach. RyR3 ulega preferencyjnej ekspresji w mózgu, zwłaszcza w hipokampie i prążkowiu.