Mitomycyna C (MMC) indukuje różne rodzaje uszkodzeń DNA, które powodują znaczną cytotoksyczność komórek. cytotoksyczność dla komórek. W związku z tym naprawa uszkodzeń indukowanych przez MMC obejmuje wiele szlaków naprawczych, takich jak naprawa przez wycięcie nukleotydu, naprawa przez rekombinację homologiczną naprawa rekombinacji homologicznej i naprawa z ominięciem translesionów. Niemniej jednak, naprawa uszkodzeń DNA indukowanych przez MMC u ssaków nie została w pełni określona. W W tym badaniu zbadaliśmy potencjalną rolę białek Xeroderma pigmentosum (XP) w naprawie uszkodzeń DNA indukowanych przez MMC przy użyciu testu wykrywającego łatki ssDNA generowane po leczeniu MMC lub 8'-metoksy-psoralenem (8-MOP) + UVA (światło ultrafioletowe A). Ludzkie komórki typu dzikiego tworzyły charakterystyczne ogniska ssDNA po leczeniu MMC lub 8-MOP + UVA, ale nie z tymi indukującymi uszkodzenia alkilacyjne, uszkodzenia oksydacyjne lub uszkodzenia typu strand-break, co sugeruje, że że ogniska reprezentują łaty ssDNA utworzone podczas naprawy wiązań krzyżowych. W W przeciwieństwie do komórek typu dzikiego, mutanty z defektem XPE lub XPG nie tworzyły ognisk ssDNA po ssDNA po traktowaniu MMC, podczas gdy zmutowane komórki XPF wykazywały znacznie opóźnioną odpowiedź w tworzeniu ognisk. Pozytywna rola XPG w w naprawie uszkodzeń DNA indukowanych przez MMC została dodatkowo poparta obserwacjami, że komórki traktowane MMC indukowały ścisłą asocjację XPG z chromatyną, a ukierunkowana inhibicja ukierunkowane hamowanie XPG znosiło indukowane przez MMC tworzenie ognisk ssDNA, czyniąc komórki komórki nadwrażliwe na MMC. Łącznie nasze wyniki sugerują, że XPG wraz z XPE i XPF odgrywają unikalną rolę w naprawie uszkodzeń DNA indukowanych przez MMC. --- Specyficzny dla piersi i jajników supresor nowotworów, BRCA1, został zaangażowany w w wielu procesach jądrowych, w tym w naprawie uszkodzeń DNA, rekombinacji, transkrypcja, ubikwitynacja, egzekwowanie punktu kontrolnego cyklu komórkowego i regulacja centrosomu regulację centrosomu. Wykorzystując wcześniej opisaną interakcję między BRCA1 i RNA helikazą A (RHA), opracowaliśmy dominująco-ujemne podejście do blokowania funkcji BRCA1 w ludzkich komórkach nabłonka piersi. Nadekspresja skróconego peptydu RHA peptydu, który może wiązać się z karboksy-końcem BRCA1, zapobiega normalnej funkcji BRCA1 takich jak asocjacja BRCA1 z ogniskami jądrowymi po uszkodzeniu DNA. Nadekspresja tego dominująco-ujemnego białka indukuje pleomorficzne jądra, nieprawidłowe mitozy z dodatkowymi centrosomami i tetraploidię. Ten modelowy system pozwala nam obserwować zmiany w komórkach nabłonka sutka, które występują ostro po utracie funkcji BRCA1. Ponadto, zahamowanie BRCA1 poprzez nadekspresję fragmentu RHA zbiega się z redukcją ekspresji białka PARP-1 sugerując możliwy mechanizm dla BRCA1 w utrzymaniu integralności genomu. integralności genomu. --- Naprawa DNA odgrywa istotną rolę w ochronie genomu przed uszkodzeniem przez czynniki endogenne i środowiskowe. Polimorfizmy w genach naprawy DNA oraz i różnice w zdolności naprawczej między osobnikami zostały szeroko udokumentowane. W przypadku raka jelita grubego utrata aktywności genu naprawy niedopasowania jest kluczowym czynnikiem genetycznym. kluczowym czynnikiem genetycznym. Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER), naprawa przez rekombinację (RR) i naprawa po wycięciu zasad (BER) odgrywają kluczową rolę w ochronie przed innymi nowotworami. przed innymi nowotworami, a my chcieliśmy zbadać ich rolę w raku jelita grubego. raka jelita grubego. Porównaliśmy częstotliwość polimorfizmów w genach NER, XPD, XPF, XPG, ERCC1; w genie BER, XRCC1; oraz w genie RR, XRCC3; w pacjentów z rakiem jelita grubego i w grupie kontrolnej. Nie stwierdzono istotnych powiązań dla żadnego z polimorfizmów genu NER lub polimorfizmu XRCC1. Allel C (pozycja 18067) genu XRCC3 był słabo, ale istotnie związany z rakiem jelita grubego (pozycja 18067). związany z rakiem jelita grubego (iloraz szans 1,52, 95% przedział ufności 1.04-2.22, P=0.03). U wszystkich pacjentów, którzy byli heterozygotyczni dla któregokolwiek z badanych genów naprawczych badano tkankę nowotworową pod kątem utraty heterozygotyczności (LOH). Znaleziono tylko jeden przykład LOH dla wszystkich badanych genów. Na podstawie i LOH wnioskujemy, że geny te nie odgrywają istotnej roli w roli w ochronie przed rakiem jelita grubego. --- Pęknięcie dwuniciowe DNA (DSB) jest główną zmianą cytotoksyczną dla promieniowania jonizującego promieniowania i chemikaliów radio-mimetycznych, ale może być również spowodowane mechanicznym stres na chromosomach lub gdy replikacyjna polimeraza DNA napotyka DNA DNA lub inny rodzaj uszkodzenia DNA. DSB występują również jako w różnych zdarzeniach biologicznych, takich jak rekombinacja V(D)J w rozwijających się komórkach limfoidalnych. w rozwijających się komórkach limfoidalnych. Niedokładna naprawa lub brak naprawy DSB może prowadzić do mutacji lub do mutacji lub niestabilności genomowej na większą skalę poprzez generowanie dicentrycznych lub acentrycznych fragmentów chromosomów. Takie zmiany w genomie mogą mieć potencjał nowotworowy. W innych przypadkach DSB mogą być wystarczające do wywołania apoptozy. Ze względu na zagrożenia stwarzane przez DSB, komórki eukariotyczne wykształciły złożone i wysoce konserwatywne systemy do szybkiego i skutecznego wykrywania tych uszkodzeń, sygnalizowania ich obecności i doprowadzania do ich naprawy. Tutaj przedstawiam przegląd tych systemów, ze szczególnym uwzględnieniem dwóch głównych ścieżek naprawy DSB naprawy DSB: niehomologicznym łączeniu końców i homologicznej rekombinacji. Wrodzone lub nabyte defekty w tych szlakach mogą prowadzić do raka lub innych chorób choroby i mogą wpływać na wrażliwość pacjentów lub komórek nowotworowych na radioterapię i niektóre chemioterapie. Zwiększona wiedza na temat naprawy DSB i innych reakcji DSB DNA może zatem zapewnić możliwości opracowania skuteczniejszych metod leczenia raka. --- Rak rozwija się, gdy komórki przestają podążać za normalnym wzorcem kontrolowanego wzrostu. wzrostu. W przypadku braku lub lekceważenia takiej regulacji, wynikającej ze zmian w ich składzie genetycznym, te błędne komórki uzyskują przewagę wzrostu, rozwijając się w przedrakowe klony. W ciągu ostatniej dekady wiele badań ujawniło znaczenie mutacji genomowych w tym procesie, czy to przez błędną replikację, uszkodzenia środowiskowe lub niedobór w naprawie uszkodzeń endogennych i egzogennych. i egzogennych uszkodzeń. Tutaj omawiamy homologiczną rekombinację jako kolejny mechanizm, który może skutkować utratą heterozygotyczności lub rearanżacjami genetycznymi. Niektóre z tych zmian genetycznych mogą odgrywać podstawową rolę w kancerogenezie, ale jednak bardziej prawdopodobne jest, że będą one zaangażowane we wtórne i kolejne etapy w których ujawniają się recesywne mutacje onkogenne. Pacjenci, których komórki wykazują zwiększoną częstotliwość rekombinacji, mają również raka, co dodatkowo potwierdza związek między rekombinacją i kancerogenezą. --- Dokładna naprawa pęknięć podwójnej nici DNA jest niezbędna do życia. Rzeczywiście, Wadliwa naprawa pęknięć dwuniciowych DNA może prowadzić do toksyczności i dużej skali rearanżacji sekwencji, które powodują raka i sprzyjają przedwczesnemu starzeniu się. Tutaj podkreślamy dwa główne systemy naprawy dwuniciowych pęknięć DNA: homologiczną rekombinację i niehomologiczne łączenie końców. Aby wyjaśnić mechanizmy rekombinacji, przedstawiamy animacje ilustrujące ruchy nici DNA. DNA. Oprócz opisania sposobu działania tych ścieżek, opisujemy również opisujemy również, dlaczego odpowiedni wybór ścieżki ma kluczowe znaczenie dla stabilności genomu, a także podsumowujemy kluczowe cechy kontroli szlaku związane z punktem kontrolnym cyklu komórkowego i sygnalizacją sygnalizacji apoptozy. Co ważne, ostatnie postępy w określaniu skutków określonych defektów w naprawie i kontroli punktów kontrolnych pomógł wyjaśnić kilka fenotypów chorobowych, w tym fenotypów chorobowych, w tym raka i przedwczesnego starzenia się. Lepsze zrozumienie tych szlaków zapoczątkowało również rozwój nowych strategii chemioterapeutycznych, które chemioterapeutycznych, które zabijają guzy ze zwiększoną specyficznością i skutecznością. Niniejszy przegląd ma na celu zapewnienie fundamentalnego zrozumienia, w jaki sposób homologiczna rekombinacja i niehomologicznego łączenia końców oraz wykazanie, w jaki sposób lepsze zrozumienie tych procesów zrozumienie tych procesów przyczyniło się zarówno do lepszego zrozumienia przyczyn raka i naszą zdolność do wprowadzania innowacji w nowych strategiach leczenia raka. strategie. --- Ludzkie komórki mogą przetwarzać dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) za pomocą homologii ukierunkowane lub niehomologiczne ścieżki naprawy. Wady w składnikach szlaków naprawy DSB są związane z predyspozycją do raka. Produkty genów BRCA1 i BRCA2, które normalnie zapewniają ochronę przed rakiem piersi, są zaangażowane w ukierunkowaną homologicznie naprawę DSB. Wady w innym homologii, annealingu jednoniciowego, są związane z niestabilnością genomu i predyspozycją do nowotworów w genomie niestabilnością genomu i predyspozycją do raka w zespole złamania Nijmegen i wrażliwy na promieniowanie zespół podobny do ataksji i teleangiektazji. Wiele białek naprawy DSB uczestniczy również w szlakach sygnałowych, które leżą u podstaw odpowiedzi komórki na DSB. odpowiedź komórki na DSB. --- Sześciowartościowy chrom [Cr(VI)] jest dobrze znanym mutagenem i czynnikiem rakotwórczym. Ponieważ niestabilność genomu spowodowana generowaniem podwójnych pęknięć nici (DSB) jest przyczynowo powiązana z kancerogenezą, przetestowaliśmy hipotezę, że Cr(VI) powoduje in vivo generowanie DSB i wywołuje odpowiedź na uszkodzenie DNA. Karmiliśmy zdolne do naprawy Drosophila melanogaster (Oregon R(+)) larwami Cr(VI) (20.0μg/ml) mieszanym pokarmem przez 24 i 48 godzin i zaobserwowano znaczącą (p<0,05) indukcję DSB w ich komórkach midgut po 48 godzinach przy użyciu neutralnego testu Cometa. Globalne profilowanie ekspresji genów w Narażone na Cr(VI) larwy Oregon R(+) ujawniły nieprawidłową regulację genów naprawy reagujących na DSBs zarówno po 24, jak i 48 godzinach. Generowanie DSB in vivo u narażonych Drosophila zostało potwierdzone przez zwiększone barwienie immunologiczne pH2Av wraz z aktywacją genów regulujących cykl komórkowy. Analiza nieprawidłowo regulowanych genów zgrupowanych w odpowiedzi na DSB przez GOEAST wskazała na udział niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w szlaku naprawy DSB. Wybraliśmy dwa szczepy, jeden mutant (ligIV) i drugi ku80-RNAi (knockdown ku80), których funkcje są zasadniczo związane ze szlakiem naprawy NHEJ-DSB. Jako dowód zasady, porównaliśmy porównaliśmy generowanie DSB w larwach tych dwóch szczepów z naprawą Oregon R(+). Wraz z tym, generowanie DSBs w spn-A i okr [niezbędne geny w szlaku naprawy rekombinacji homologicznej (HR)] mutantów było przetestowano również pod kątem możliwego zaangażowania naprawy HR-DSB. Znacząco zwiększone generowanie DSB w narażonych larwach ku80-RNAi i ligIV (mutant) z powodu upośledzonej naprawy, przy jednoczesnym nieznacznym generowaniu DSB w mutantach okr i larwach mutantów spn-A wskazuje na aktywny udział szlaku naprawy NHEJ NHEJ. Badanie, pierwsze tego rodzaju według naszej wiedzy, dostarczając jednocześnie dowodów na generowanie DSBs in vivo u larw Drosophila narażonych na Cr(VI), nabiera znaczenia ze względu na jego znaczenie dla organizmów wyższych ze względu na związek przyczynowy między generowaniem DSB a kancerogenezą indukowaną przez Cr(VI). --- Radioterapia odgrywa ważną rolę w leczeniu szerokiego zakresu nowotworów. nowotworów. Oprócz innowacji w fizycznym stosowaniu dawki promieniowania, radioterapia prawdopodobnie skorzysta z nowych podejść wykorzystujących różnice w odpowiedzi na promieniowanie między komórkami prawidłowymi i nowotworowymi. Podczas gdy promieniowanie jonizujące promieniowanie jonizujące wywołuje różne uszkodzenia DNA, w tym uszkodzenia zasad i i pęknięcia pojedynczej nici, pęknięcie podwójnej nici DNA (DSB) jest powszechnie uważane za odpowiedzialne nie tylko za celowe zabijanie komórek nowotworowych, ale także za ogólną niestabilność genomu. również za ogólną niestabilność genomową, która prowadzi do rozwoju wtórnych nowotworów wśród normalnych komórek. Naprawa rekombinacji homologicznej (HRR), niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i alternatywne NHEJ, działające jako kopia zapasowa, są głównymi szlakami wykorzystywanymi przez komórki do przetwarzania DSB. Dlatego, ich funkcja stanowi główny mechanizm oporności na promieniowanie w komórkach nowotworowych. komórek nowotworowych. HRR jest również wymagany do przezwyciężenia stresu replikacyjnego - silnego przyczynia się do niestabilności genomu, która napędza rozwój raka. HRR i alternatywny NHEJ wykazują silną zależność od cyklu komórkowego i prawdopodobnie skorzystają z redystrybucji komórek nowotworowych w cyklu komórkowym, w której pośredniczy radioterapia. cyklu komórkowego. Co więcej, udokumentowany fenotyp syntetycznej letalności między niedoborem HRR i inhibicją PARP otworzył nowe możliwości dla terapii celowanych. Obserwacje te sprawiają, że HRR jest szczególnie intrygującym celem dla terapii mających na celu poprawę skuteczności radioterapii. Tutaj krótko opisujemy główne szlaki naprawy DSB i dokonujemy przeglądu ich możliwego wkładu w radiooporność komórek nowotworowych. Na koniec omawiamy obiecujące alternatywy dla ukierunkowane na naprawę DSB w celu poprawy radioterapii i leczenia raka. --- Wariacje liczby kopii (CNV) obejmują różnorodne zmiany genetyczne, w tym delecje i amplifikacje. w tym delecje i amplifikacje oraz klastry w regionach ludzkiego genomu o genomu z wewnętrzną niestabilnością. Małe CNV mogą działać jako początkowe zmiany genetyczne genetyczne, dając początek większym CNV, takim jak nabyta somatyczna liczba kopii aberracje liczby kopii (CNA) sprzyjające powstawaniu nowotworów. Poprzednie badania dostarczyły dowody na CNV jako podstawową przyczynę podwyższonego ryzyka raka piersi, gdy ukierunkowanych na geny podatności na raka piersi i przyspieszonej progresji raka piersi progresji raka piersi, gdy są ukierunkowane na onkogeny. Wraz z rozwojem nowych technik wykrywania CNV w całym genomie z coraz wyższą rozdzielczością, stało się możliwe jakościowe i ilościowe możliwe jakościowe i ilościowe analizowanie manifestacji uszkodzeń DNA wynikających z defektów w jednym z wielu mechanizmów naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSB). (DSB). Rak piersi, szczególnie w przypadkach rodzinnych, została powiązana z defektem szlaku rekombinacji homologicznej (HR), który z kolei przełącza usuwanie uszkodzeń na alternatywne, bardziej podatne na błędy szlaki naprawy DSB takich jak mikrohomologiczne łączenie niehomologicznych końców (mmNHEJ). (mmNHEJ). Rzeczywiście, zwiększona aktywność naprawy DSB podatnych na błędy została wykryta w limfocytach krwi obwodowej od osób z rodzinnym ryzykiem raka piersi niezależnie od określonych mutacji genowych. Co ciekawe, analiza sekwencji regionów ujawniła, że większość aberracji genomowych wykrytych w próbkach raka piersi raka piersi jest tworzona przez mmNHEJ. Wykrywanie specyficznych dla szlaku naprawy DSB podatnych na błędy za pomocą testów funkcjonalnych zaproponowano jako biomarker dziedzicznego ryzyka raka piersi i reaktywności na terapie ukierunkowane na dysfunkcję HR. Identyfikacja specyficznych, podatnych na błędy mechanizmów naprawy DSB leżących u podstaw CNA i ostatecznie powstawania guzów sutka, podkreśla potencjalne cele dla przyszłych schematów profilaktyki raka piersi. --- Skuteczna naprawa pęknięć dwuniciowych (DSB) ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności genomu. integralności genomu. Spójność chromatyd siostrzanych jest ważna nie tylko dla wiernej segregacji chromosomów, ale także dla prawidłowej naprawy DSB. Podczas naprawy DSB, kohezja kompleks kohezyny Smc1-Smc3 jest ładowany na chromatynę wokół DSB, aby wspierać naprawy DSB za pośrednictwem rekombinacji. W tym badaniu zbadaliśmy, czy Ctf18, czynnik związany z ustanowieniem kohezji chromatyd siostrzanych, jest zaangażowany w naprawę DSB u pączkujących drożdży. Ctf18 był rekrutowany do miejsc DSB indukowanych przez endonukleazę HO w sposób zależny od Mre11 i do uszkodzonej chromatyny w komórkach zatrzymanych w fazie G2/M komórkach zatrzymanych w fazie G2/M. Zmutowane komórki ctf18 wykazywały wysoką wrażliwość na czynniki genotoksyczne indukujące DSB i defekty w naprawie DSB, a także defekty w rekombinacji między chromatydami siostrzanymi i między homologicznymi chromosomami. chromosomami. Wyniki te sugerują, że Ctf18 jest zaangażowany w indukowaną uszkodzeniem rekombinacji homologicznej. --- Podczas gdy retrowirusy onkogenne są powszechne u zwierząt, ludzki wirus limfotropowy T 1 (HTLV-1) jest jedynym przenoszonym retrowirusem związanym z rakiem u ludzi i jest etiologicznie związany z białaczką dorosłych komórek T. Proces leukemogenezy jest nadal w dużej mierze nieznany, ale opiera się na przedłużonym przeżyciu i ekspansji klonalnej zakażonych komórek, które z kolei gromadzą defekty genetyczne. Wspólną cechą ludzkich wirusów nowotworowych jest ich zdolność do stymulowania proliferacji i przeżywalności zainfekowanych komórek przednowotworowych. i przeżycia zainfekowanych komórek przednowotworowych, a następnie ukrywanie się poprzez ustanowienie latencji w komórkach, które które nabyły przekształcony fenotyp. Podczas gdy zakłócenie naprawy DNA jest jest jednym z głównych procesów odpowiedzialnych za akumulację nieprawidłowości genomowych i kancerogenezę. nieprawidłowości genomowych i kancerogenezę, brak naprawy DNA stwarza również zagrożenie zatrzymania cyklu komórkowego lub apoptozy. zagrożenie zatrzymania cyklu komórkowego lub apoptozy komórek zainfekowanych wirusem. Niniejsze badanie opisuje, w jaki sposób białko wirusowe HTLV-1 p30 hamuje konserwatywną homologiczną rekombinację (HR) naprawy DNA poprzez celowanie w kompleks MRE11/RAD50/NBS1 i faworyzuje podatny na błędy szlak naprawy DNA nonhomologous-end-joining (NHEJ) zamiast tego. W rezultacie HTLV-1 p30 może ułatwiać akumulację mutacji w genomie gospodarza w genomie gospodarza i skumulowane ryzyko transformacji. Nasze wyniki dostarczają nowe spojrzenie na to, jak ludzkie wirusy nowotworowe mogą manipulować komórkowymi uszkodzeniami DNA w celu promowania raka. --- Mechanizmy naprawy DNA są niezbędne dla przetrwania komórek ssaków. Szybka naprawa pęknięć DNA zapewnia szybszy wzrost normalnych komórek, jak również komórek nowotworowych. komórek nowotworowych, co czyni mechanizmy naprawy DNA potencjalnym celem terapeutycznym. Chociaż skuteczność tych procesów naprawczych znacznie zmniejsza skuteczność chemioterapii przeciwnowotworowych chemioterapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na DNA, upośledzona naprawa DNA przyczynia się do mutagenezy i niestabilności genomowej prowadzącej do kancerogenezy. Zatem idealnym w mechanizmach naprawy DNA byłby taki, który specyficznie zabija szybko dzielące się komórki rakowe dzielące się komórki nowotworowe bez dalszej mutagenezy i nie wpływa na normalne komórki. komórki. Endo-egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w nukleolitycznym przetwarzaniu końców DNA DNA w różnych mechanizmach naprawy DNA, zwłaszcza w naprawie rekombinacji homologicznej (HRR), który głównie naprawia uszkodzone DNA w fazach S i G2 cyklu komórkowego w szybko dzielących się komórkach. w szybko dzielących się komórkach. Mechanizmy HRR są również zaangażowane w sygnalizację komórkową i funkcje regulacyjne w odpowiedzi na sygnalizację i funkcje regulacyjne w odpowiedzi na uszkodzenia DNA, które są niezbędne dla żywotności komórek ssaków, gdzie dominujący szlak łączenia niehomologicznych szlak łączenia niehomologicznego jest konstytutywny. Chociaż uważa się, że HRR jest zaangażowany w innych etapach cyklu komórkowego, jest on dominujący w fazach wzrostu (S i G2) cyklu komórkowego. Uważa się, że szybciej rosnące komórki przeprowadzają więcej HRR w replikacyjnych etapach cyklu komórkowego, gdzie homologiczne DNA jest dostępne dla HRR. Celowanie w endo-egzonukleazy specyficznie zaangażowane w HRR sprawi, że normalne komórki będą mniej podatne na mutagenezę. komórki mniej podatne na mutagenezę, czyniąc szybko rosnące komórki nowotworowe bardziej podatne na czynniki uszkadzające DNA, stosowane w chemioterapii nowotworów. --- Chociaż spożycie alkoholu jest związane ze zwiększonym ryzykiem raka, jego molekularny mechanizm pozostaje niejasny. mechanizm pozostaje niejasny. Tutaj wykazaliśmy, że spożycie 10% alkoholu przez 4 tygodnie u szczurów jest genotoksyczne z powodu indukcji mikrojąder. Aldehyd octowy (AA), pierwszy produkt metabolizmu etanolu, jest uważany za odpowiedzialny za uszkodzenia DNA indukowane przez alkohol. uszkodzenia DNA indukowane przez alkohol. Zaobserwowaliśmy, że AA skutecznie blokuje elongację replikacji DNA w komórkach ssaków, powodując dwuniciowe pęknięcia DNA związane z replikacją. związane z replikacją. Miejsca uszkodzeń DNA indukowane przez AA kolokalizują z rekombinacją homologiczną (HR). białkiem naprawczym rekombinacji homologicznej (HR) RAD51. HR mierzone w hipoksantyneguaninefosforybozylotransferazy (HPRT) jest skutecznie indukowana przez AA, a komórki ssaków z defektem rekombinacji są nadwrażliwe na AA, wyraźnie wykazując, że HR jest niezbędny w naprawie uszkodzeń DNA indukowanych przez AA. Podsumowując, nasze dane wskazują, że genotoksyczność alkoholu związana z AA wytwarza uszkodzenia replikacyjne DNA, które uruchamiają naprawę HR. --- Naprawa dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) jest niezbędna dla żywotności komórek i stabilności genomu. stabilności genomu. Naprawa rekombinacji homologicznej odgrywa ważną rolę w naprawie DSB a upośledzenie tego mechanizmu naprawczego może prowadzić do utraty integralności genomu. integralności genomu, co jest jedną z cech charakterystycznych raka. Ostatnie badania wykazały że geny supresorowe nowotworów p53 oraz BRCA1 i -2 są zaangażowane w prawidłową kontrolę rekombinacji homologicznej. kontrolę rekombinacji homologicznej, co sugeruje rolę tego typu naprawy w raku ludzkiego raka. Opracowaliśmy nowy test oparty na rekombinacji między dwoma genami sekwencjami białka zielonej fluorescencji (GFP) w transfekowanym plazmidzie DNA. DNA. Konstrukt plazmidowy zawiera nienaruszony, przesunięty w emisji, "niebieski" wariant GFP (BFP), z odcinkiem 300 nukleotydów homologii do niefunkcjonalnej kopii GFP. W przypadku braku homologicznej rekombinacji obecny jest tylko BFP, ale rekombinacja homologiczna może stworzyć funkcjonalny GFP. Regiony homologiczne w plazmidzie w plazmidzie zostały skonstruowane zarówno w bezpośredniej, jak i odwróconej orientacji transkrypcji transkrypcji w celu wykrycia możliwych różnic w mechanizmach rekombinacji rekombinacji. Panel ludzkich linii komórek nowotworowych został wybrany na podstawie tła genetycznego i integralności chromosomów. i integralności chromosomów i przetestowano pod kątem homologicznej rekombinacji przy użyciu tego testu. Panel obejmował linie komórkowe o różnych poziomach kariotypowych, izogeniczne linie komórkowe z prawidłowym i zmutowanym p53, izogeniczne linie komórkowe z lub bez naprawy niedopasowania DNA, zmutowane linie komórkowe BRCA1 i -2 oraz linie komórkowe chłoniaka oraz linia komórkowa chłoniaka DT40. W tym teście zaobserwowano różnice między liniami komórkowymi o najniższych i najwyższych poziomach rekombinacji rekombinacji były około 100-krotne. Zwiększone poziomy rekombinacji były związane ze zmutowanym p53, podczas gdy niski poziom rekombinacji stwierdzono w linii komórkowej zmutowanej linii komórkowej BRCA1. W linii komórkowej HT1080TG, zmutowanej pochodnej HT1080 z dwoma zmutowanymi allelami p53, stwierdzono wysoki poziom rekombinacji z bezpośrednią orientacją, ale nie z plazmidem o orientacji bezpośredniej, ale nie z plazmidem o orientacji odwróconej. Nie wykryto różnicy w rekombinacji między dwiema izogenicznymi liniami komórkowymi, które różniły się jedynie zdolnością naprawy niedopasowania DNA. Wnioskujemy, że ten test może wykryć różnice w zdolności do rekombinacji homologicznej w hodowanych liniach komórkowych i że różnice te są zgodne z wzorcami, których można by oczekiwać od różnych genotypów tych linii komórkowych. Przyszłe zastosowanie w normalnych komórkach może być przydatne do identyfikacji determinantów genetycznych kontrolujących integralność genomu lub do wykrywania różnic w zdolności naprawy DNA u poszczególnych osób. --- W komórkach wyższych eukariontów naprawa podwójnych pęknięć nici DNA (DSB) wykorzystuje różne formy potencjalnie podatnego na błędy łączenia końców niehomologicznych (NHEJ): kanoniczne zależne od DNA-PK (C-NHEJ) i alternatywne ścieżki zapasowe (A-NHEJ). W przeciwieństwie do C-NHEJ, A-NHEJ wykazuje wyraźne wahania wydajności w całym cyklu komórkowym i jest poważnie upośledzony, gdy komórki przestają proliferacji i wchodzą w fazę plateau (Windhofer et al., 2007 [23]). Mechanizmy molekularne mechanizmy molekularne leżące u podstaw tej odpowiedzi pozostają nieznane, ale zmiany w strukturze chromatyny są głównymi kandydatami na modulatory A-NHEJ. Ponieważ parametry poza acetylacją chromatyny wydają się determinować wydajność A-NHEJ (Manova et al., 2012 [42,76]), badamy tutaj rolę dekondensacji chromatyny, w której pośredniczy przez traktowanie 5'-aza-2'-deoksycytydyną (AzadC) lub wzrost w warunkach hipotonicznych, na A-NHEJ. warunkach hipotonicznych, na A-NHEJ. Donosimy, że oba zabiegi nie mają wykrywalnego wpływu na C-NHEJ, ale wywołują, szczególnie w przypadku A-NHEJ, efekty zależne od wzrostu komórek. Wyniki te po raz pierwszy odkrywają związek między A-NHEJ i organizacją chromatyny organizacją chromatyny i zapewniają środki do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw zależności A-NHEJ od stanu wzrostu. A-NHEJ jest zaangażowany w powstawaniu translokacji chromosomowych i fuzji chromosomowych, które leżą u podstaw niestabilności genomowej i raka. niestabilności genomowej i kancerogenezie. Przedstawione tutaj obserwacje mogą zatem przyczynić się do rozwoju opartych na lekach strategii supresji A-NHEJ mających na celu optymalizację wyników leczenia raka, a także prawdopodobnie prawdopodobnie również w hamowaniu kancerogenezy. --- Komórkowe DNA jest stale narażone na egzogenny i endogenny stres genotoksyczny. stres, który skutkuje zarówno przejściowymi, jak i skumulowanymi uszkodzeniami DNA i niestabilnością genomową. niestabilność genomu. Wszystkie komórki są wyposażone w szlaki odpowiedzi na uszkodzenia DNA, które naprawy DNA, zatrzymania cyklu komórkowego i, w razie potrzeby, apoptozy, aby wyeliminować uszkodzenia DNA lub uszkodzone komórki. uszkodzeń DNA lub uszkodzonych komórek. Konsekwencje tych procesów dla komórek macierzystych mogą być głębokie: zmniejszenie puli komórek macierzystych lub, ze względu na zmienioną ekspresję genów ekspresji genów, zwiększona szansa na różnicowanie komórek macierzystych lub złośliwą transformację. transformacji nowotworowej. Ponadto, szereg nieprawidłowości w naprawie DNA jest powiązanych z zespołami przedwczesnego starzenia się. przedwczesnym starzeniem, a te są związane z defektami w populacji komórek macierzystych. populacji komórek macierzystych. Konkretne systemy naprawy DNA, dla których istnieją dane dotyczące wpływu defektów naprawy na funkcjonowanie komórek macierzystych obejmują O(6)-alkiloguaninowa alkilotransferaza DNA, naprawa przez wycięcie nukleotydów, naprawa przez wycięcie zasad naprawa wycięcia zasady, naprawa niedopasowania, niehomologiczne łączenie końca DNA, kompleks białkowy niedokrwistości Fanconiego kompleks białkowy niedokrwistości Fanconiego i rekombinacja homologiczna. Niedawno stało się Niedawno stało się jasne, że niedobory tych procesów są związane nie tylko z rakiem i/lub starzeniem, ale także z defektami komórek macierzystych. To odkrycie podnosi możliwość związku między starzeniem się a dysfunkcją komórek macierzystych. W tym przeglądzie, przedstawiamy dowody na związek między systemami naprawy DNA a utrzymaniem i długowiecznością komórek macierzystych. --- Odpowiedź na uszkodzenia DNA i szlaki naprawy są ważnymi barierami dla kancerogenezy. Tutaj pokazujemy, że białaczka promielocytowa (PML, znana również jako TRIM19), zaangażowany w wykrywanie uszkodzeń DNA i wykonywanie naprawy rekombinacji homologicznej naprawy, jest regulowana w dół w nienowotworowych komórkach wątroby otaczających hepatitis B (HBV) związanego z rakiem wątrobowokomórkowym (HCC). Nie stwierdzono mutacji ani delecji PML w wątrobie zakażonej HBV lub komórkach HCC. Analiza immunohistochemiczna biopsji wątroby od pacjentów z rakiem piersi lub wątroby i reaktywacją HBV po chemioterapii ujawniła regulację w górę PML i zaostrzenie HBV w normalnej wątroby w odpowiedzi na uszkodzenie DNA (funkcjonalny PML), obniżenie regulacji PML w komórkach okołotorbielowatych komórkach okołoguzowych HCC związanych z wysoką akumulacją HBsAg i niską aktywnością replikacji HBV replikacji HBV (supresyjna PML) oraz heterogeniczna jądrowa ekspresja PML w komórkach HCC, które utraciły DNA HBV i HBsAg i nie reagowały na uszkodzenia DNA (rozregulowany PML). Utrata PML u myszy transgenicznych HBsAg sprzyjała chromosomowym w komórkach wątroby i przyspieszała gromadzenie się tkanki tłuszczowej w organizmie i wątrobie oraz rozwój sekwencji stłuszczenie wątroby-dysplazja-gruczolakorak w sekwencji niezależny od stanu zapalnego i dominujący u mężczyzn, w porównaniu do PML knock-out lub myszy transgenicznych HBsAg w tym samym okresie. Wyniki te wskazują że niedobór PML ułatwia niestabilność genomową i promuje związaną z HBsAg hepatokarcynogenezę, która obejmuje również metabolizm androgenów i lipidów. Te odkrywają nowy związek PML między nowotworami związanymi z HBV, naprawą DNA i metabolizmem. DNA i metabolizmem. --- TŁO: Zespół Wernera (WS) wynika z defektów w helikazie RecQ (WRN) i charakteryzuje się przedwczesnym starzeniem i przyspieszoną nowotworzeniem. W przeciwieństwie do tego, ludzkie fibroblasty z niedoborem WRN pochodzące od pacjentów z WS wykazują charakterystycznie wolniejszy wskaźnik proliferacji komórek, podobnie jak pierwotne fibroblasty i ludzkie linie komórek nowotworowych z niedoborem WRN. Poprzednie badania wykazały, że wyciszenie WRN w połączeniu z niedoborem innych genów prowadziło do znacznie przyspieszonej proliferacji komórkowej. przyspieszonej proliferacji komórkowej i nowotworzenia. Celem niniejszego badania było zbadanie skutków wyciszenia WRN w HL60 z niedoborem p53 i p53 TK6 typu dzikiego, aby pogłębić zrozumienie nowotworów związanych z WRN. nowotworzenia związanego z WRN. METODOLOGIA/GŁÓWNE ODKRYCIA: Stwierdziliśmy, że wyciszenie WRN przyspieszyło proliferację komórek HL60 i zmniejszało tempo wzrostu komórek TK6. Utrata WRN zwiększyła uszkodzenia DNA w obu typach komórek, mierzone testem COMET, ale wywołała różne reakcje w każdej linii komórkowej. W komórkach HL60, ale nie w komórkach TK6, utrata WRN doprowadziła do znacznego wzrostu poziomów fosforylowanego RB i liczby komórek przechodzących z fazy G1 do fazy S, jak jak wykazała analiza cyklu komórkowego. Co więcej, zubożenie WRN w komórkach HL60 doprowadziło do hiperaktywacji naprawy rekombinacji homologicznej poprzez regulację w górę poziomów białek RAD51 i poziomu białka BLM. Spowodowało to uszkodzenie DNA, widoczne przez zwiększone częstotliwości zarówno spontanicznych, jak i indukowanych chemicznie strukturalnych aberracji chromosomalnych i wymian chromatyd siostrzanych. WNIOSKI/ZNACZENIE: Łącznie nasze dane sugerują, że wpływ wyciszenia WRN na proliferację komórek i niestabilność genomu są prawdopodobnie modulowane przez inne czynniki genetyczne, w tym p53, które mogą odgrywać rolę w karcynogenezie indukowanej przez WRN. kancerogenezie indukowanej niedoborem WRN. --- PALB2 współdziała z BRCA1 i BRCA2 w superkompleksach zaangażowanych w naprawę DNA poprzez homologiczną rekombinację. Heterozygotyczne mutacje germinalne w PALB2 wiążą się z umiarkowanym ryzykiem raka piersi. umiarkowane ryzyko raka piersi, podczas gdy bialleliczne mutacje PALB2 są związane z ciężką postacią niedokrwistości Fanconiego, charakteryzującą się guzami litymi we wczesnym dzieciństwie i poważną niestabilnością chromosomalną. W przeciwieństwie do nowotworów związanych z BRCA1- lub BRCA2 nowotworów, guzy piersi u heterozygotycznych nosicieli mutacji PALB2 nie wykazują utraty allelu typu dzikiego, co sugeruje, że PALB2 może być haploinowystarczalny dla supresji guza. supresji guza. Aby zbadać rolę PALB2 w rozwoju i nowotworzeniu, my wygenerowaliśmy mutanty myszy Palb2(GT) przy użyciu pułapki genowej. Natomiast homozygotyczne zmutowane zarodki Palb2(GT/GT) umierały w połowie ciąży z powodu masywnej apoptozy. apoptozy, myszy heterozygotyczne Palb2(GT/+) były żywotne i nie wykazywały żadnych oczywistych nieprawidłowości. Delecja p53 złagodziła fenotyp zarodków Palb2(GT/GT) ale nie ratowała śmiertelności embrionalnej. Ponadto, utrata p53 nie nie współpracowała znacząco z heterozygotycznością Palb2 w nowotworzeniu w heterozygotycznych lub homozygotycznych myszy z nokautem p53. Guzy powstające u Palb2(GT/+) Palb2(GT/+) ;p53(+/-) lub Palb2(GT/+) ;p53(-/-) myszy z mutacją złożoną zachowały allel Palb2 typu dzikiego, a nie Palb2 i nie wykazywały zwiększonej niestabilności genomowej. --- XRCC3 jest paralogiem RAD51, który funkcjonuje w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) poprzez rekombinację homologiczną (HR). (DSB) poprzez homologiczną rekombinację (HR). Mutacja XRCC3 powoduje poważną niestabilność chromosomów. Odkryliśmy, że zmutowane komórki XRCC3 wykazują radykalnie zmienione widma produktów HR, ze zwiększonymi długościami ścieżek konwersji genów, zwiększoną częstotliwością nieciągłych szlaków i częstymi lokalnymi rearanżacjami związane z HR. Wyniki te wskazują, że funkcja XRCC3 nie ogranicza się do inicjacji inicjacji HR, ale rozciąga się na późniejsze etapy tworzenia i rozwiązywania pośrednich HR prawdopodobnie poprzez stabilizację heterodupleksów DNA. Wyniki dalej że defekty HR mogą promować niestabilność genomową nie tylko poprzez nie tylko poprzez niepowodzenie inicjacji HR (prowadzące do naprawy niehomologicznej), ale także poprzez nieprawidłowe przetwarzanie produktów pośrednich HR. Oba mechanizmy mogą przyczyniać się do karcynogenezy w komórkach z niedoborem HR. --- Utrzymanie stabilności materiału genetycznego jest istotną cechą każdego żywego organizmu. każdego żywego organizmu. Organizmy we wszystkich królestwach rozwinęły zróżnicowane i wysoce wydajne mechanizmy naprawcze w celu ochrony genomu przed szkodliwymi przed szkodliwymi konsekwencjami różnych czynników genotoksycznych, które mogą destabilizować integralność genomu w każdym pokoleniu. Jedną z takich grup białek aktywnie zaangażowana w nadzór genomu jest rodzina helikaz RecQ. Te białka są wysoce konserwatywnymi helikazami DNA, które pełnią różnorodne role w wielu procesach metabolicznych DNA, takich jak replikacja DNA, rekombinacja i naprawa DNA. naprawa DNA. U ludzi zidentyfikowano pięć helikaz RecQ, a trzy z nich a mianowicie WRN, BLM i RecQL4 zostały powiązane z chorobami genetycznymi charakteryzującymi się niestabilnością genomu, przedwczesnym starzeniem się i predyspozycją do raka. Ta rodzina helikaz odgrywa ważną rolę w różnych szlakach naprawy DNA, w tym w ochronie genomu przed nielegalną rekombinacją podczas segregacji chromosomów w mitozie mitozy i zapewniając stabilność genomu. Niniejszy przegląd koncentruje się głównie na różnych rolach ludzkich helikaz RecQ w procesie naprawy DNA opartej na rekombinacji w celu utrzymania stabilności genomu i fizjologicznych konsekwencjach ich defektów w w rozwoju nowotworów i przedwczesnego starzenia się.
Czy defekty w naprawie rekombinacji są zaangażowane w karcynogenezę?
Tak. Białka BRCA1 i BRCA2 związane z rakiem piersi są silnie zaangażowane w naprawę rekombinacji.