Western blot jest bardzo użyteczną i powszechnie stosowaną techniką laboratoryjną, ale jej wykonanie jest wyzwaniem. Przepływ pracy jest często określany jako "czarna skrzynka" ponieważ eksperymentator nie wie, czy został on wykonany pomyślnie aż do ostatniego z kilku kroków. Co więcej, jakość danych western blot jest czasami jest czasami kwestionowana z powodu braku skutecznych narzędzi kontroli jakości na miejscu w całym procesie western blottingu. Tutaj opisujemy przepływ pracy V3 western który wykorzystuje technologię bezbarwnikową, aby rozwiązać główne obawy związane z tradycyjnym protokołem western blot. Ten przepływ pracy pozwala badaczom: 1) uruchomienie żelu w około 20-30 minut; 2) wizualizację jakości separacji próbki jakość separacji próbki w ciągu 5 minut po uruchomieniu żelu; 3) transfer białek w ciągu 3-10 min; 4) ilościową weryfikację wydajności transferu; i co najważniejsze 5) sprawdzenie zmian w poziomie białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu kontroli kontroli ładowania białka. To nowatorskie podejście eliminuje potrzebę usuwania i reprobowania blotu dla białek gospodarza, takich jak β-aktyna, β-tubulina, GAPDH itp. Przepływ pracy bez barwienia V3 sprawia, że proces western blot jest szybszy, przejrzysty, bardziej ilościowy i niezawodny. --- Western blots są używane do specyficznego pomiaru względnych ilości białek w złożonych próbkach biologicznych. Pomiary ilościowe mogą być obarczone błędem wynikającym z niespójności procesu, takich jak nierównomierny transfer białek na błonę. transfer białek na membranę. Te zmiany niezwiązane z próbką muszą być kompensowane przez podejście znane jako normalizacja. Powszechnie stosowane są dwa podejścia do są powszechnie stosowane: normalizacja białka housekeeping (HKP) i normalizacja białka całkowitego (TPN). W tym badaniu oceniliśmy wydajność technologii Stain-Free jako nowego narzędzia TPN dla eksperymentów Western blotting w porównaniu z dehydrogenazą gliceraldehydo-3-fosforanową (GAPDH) jako przedstawicielem strategii normalizacji HKP. Białkiem docelowym (TP) zastosowanym w tym badaniu było MCM7, czynnik replikacji licencjonowania DNA, który został wykazano wcześniej, że jest on regulowany w dół o 20% w napromieniowanych liniach komórek limfoblastoidalnych (LCL). liniach limfoblastoidalnych (LCL). Zbadaliśmy regulację MCM7 za pomocą multipleksowej metody Western blottingu opartego na fluorescencyjnie znakowanych przeciwciałach drugorzędowych i stwierdziliśmy, że technologia że technologia Stain-Free wydaje się być bardziej niezawodna, solidniejsza i bardziej wrażliwa na niewielkie efekty regulacji białek w porównaniu z normalizacją HKP z GAPDH. Technologia Stain-Free oferuje dodatkowe zalety zapewniając punkty kontrolne w całym procesie Western blotting, umożliwiając szybką wizualizację separacji w żelu i transferu białek.
Jakie są zalety stosowania żelu białkowego bez barwnika w eksperymencie Western Blot?
Technologia Stain-Free może być stosowana jako narzędzie normalizacji w analizie Western blot.