Autofagia za pośrednictwem opiekuna (CMA) jest selektywnym rodzajem autofagii, w którym określone białka cytozolowe są wysyłane do lizosomów w celu degradacji. Substraty białka wiążą się z błoną lizosomalną poprzez błonę związaną z lizosomem białko typu 2A (LAMP-2A), jeden z trzech wariantów splicingowych genu lamp2, i to wiązanie ogranicza ich degradację przez CMA. Jednakże mechanizmy wiązania i wychwytu substratu pozostają nieznane. Donosimy tutaj, że LAMP-2A organizuje się w błonie lizosomalnej w kompleksy białkowe o różnych rozmiarach. rozmiarach. Montaż i demontaż tych kompleksów jest bardzo dynamicznym procesem bezpośrednio związanym z aktywnością CMA. procesem bezpośrednio związanym z aktywnością CMA. Białka substratowe wiążą się tylko z monomerycznym LAMP-2A, podczas gdy efektywna translokacja substratów wymaga tworzenie określonego kompleksu LAMP-2A o wysokiej masie cząsteczkowej. Dwa główne chaperony związane z CMA, hsc70 i hsp90, odgrywają krytyczną rolę w funkcjonalnej dynamice LAMP-2A. funkcjonalnej dynamice kompleksów LAMP-2A w błonie lizosomalnej. W ten sposób zidentyfikowaliśmy nową funkcję dla hsc70 w demontażu LAMP-2A z tych kompleksów. tych kompleksów, podczas gdy obecność hsp90 związanego z lizosomem jest niezbędna do do zachowania stabilności LAMP-2A w błonie lizosomalnej. --- Choroba Parkinsona (PD) jest najczęstszym neurodegeneracyjnym zaburzeniem ruchowym. Wzrost ilości białka alfa-synukleiny może stanowić przyczynę PD. Alfa-synukleina jest degradowana przynajmniej częściowo przez autofagię za pośrednictwem chaperonu (CMA). Mutacja I93M w C-końcowej hydrolazie ubikwityny L1 (UCH-L1) jest związana z rodzinną PD. związana z rodzinną PD. Jednak związek między alfa-synukleiną i UCH-L1 w patogenezie PD pozostaje w dużej mierze niejasny. W tym badaniu odkryliśmy, że UCH-L1 fizycznie oddziałuje z LAMP-2A, lizosomalnym receptorem receptorem dla CMA oraz Hsc70 i Hsp90, które mogą funkcjonować jako składniki szlaku szlaku CMA. Interakcje te zostały nieprawidłowo wzmocnione przez mutację I93M i były niezależne od wiązania monoubikwityny przez UCH-L1. W systemie bezkomórkowym system, UCH-L1 bezpośrednio oddziaływał z cytozolowym regionem LAMP-2A. Ekspresja I93M UCH-L1 w komórkach indukowała związany z hamowaniem CMA wzrost ilości alfa-synukleiny. Nasze odkrycia mogą dostarczyć nowych wgląd w molekularne powiązania między alfa-synukleiną a UCH-L1 i sugerują że nieprawidłowa interakcja zmutowanego UCH-L1 z maszynerią CMA, przynajmniej częściowo, leży u podstaw patogenezy PD związanej z I93M UCH-L1. --- Ko-represor receptora jądrowego (N-CoR) odgrywa ważną rolę w kontroli transkrypcji w której pośredniczy kilka białek supresorowych nowotworów. Niedawno zgłosiliśmy rolę utraty zależnej od nieprawidłowej konformacji (MCDL) N-CoR w aktywacji onkogennego szlaku przetrwania w ostrej białaczce promielocytowej (APL). Ponieważ N-CoR odgrywa ważną rolę w homeostazie komórkowej w różnych tkankach, dlatego też postawiliśmy hipotezę, że APL, podobnie jak MCDL N-CoR, może być również zaangażowany w inne nowotwory złośliwe. złośliwości. Rzeczywiście, nasze wstępne badanie statusu N-CoR w różnych białaczkach i komórkach guzów litych ujawniły APL jak MCDL N-CoR w pierwotnych i wtórnych komórkach nowotworowych pochodzących z niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Specyficzna dla komórek NSCLC N-CoR może być blokowana przez Kaletrę, kliniczny inhibitor proteazy inhibitor proteazy i genisteina, inhibitor nieprawidłowego fałdowania N-CoR wcześniej scharakteryzowany przez nas. Nieprawidłowo sfałdowany N-CoR prezentowany w komórkach NSCLC był związany z amplifikacją stresu ER i został poddany degradacji przez komórki NSCLC specyficzną dla komórek NSCLC aktywność proteazy. W komórkach NSCLC stwierdzono, że nieprawidłowo sfałdowany N-CoR być związany z Hsc70, molekularnym chaperonem zaangażowanym w autofagię autofagię (CMA). Genetyczne i chemiczne hamowanie Lamp2A, czynnika ograniczającego szybkość czynnik ograniczający szybkość CMA, znacząco zablokowało utratę N-CoR w komórkach NSCLC, sugerując kluczową rolę CMA w degradacji N-CoR. Odkrycia te identyfikują ważną rolę indukowanej przez CMA degradacji nieprawidłowo sfałdowanego N-CoR w neutralizacji stresu ER i sugerują możliwą rolę nieprawidłowo sfałdowanego białka N-CoR w aktywacji onkogennego szlaku przeżycia w komórkach NSCLC. --- W chorobach neurodegeneracyjnych pozostaje niejasne, dlaczego niektóre regiony mózgu są selektywnie podatne na agregację białek. U transgenicznych myszy wyrażających ludzką α-synukleinę A53T, w pniu mózgu i rdzeniu kręgowym rozwijają się najbardziej widoczne inkluzje α-synukleiny, które korelują z zależną od wieku dysfunkcją motoryczną. W niniejszym dokumencie przedstawiamy nowe odkrycie, że ta selektywna agregacja jest częściowo zależna od niezdolności autofagii za pośrednictwem opiekuna (CMA) do skutecznej degradacji α-synukleiny w tych regionach mózgu. Testy lizosomalne wykazały, że aktywność CMA była znacznie zmniejszona w regionach podatnych na agregację w porównaniu do pozostała część mózgu. Wcześniej wykazano, że aktywność CMA jest proporcjonalna do poziomu receptora CMA Lamp-2a. Stosując przeciwciała, tkanka mózgowa tkanki mózgowej myszy Lamp-2a null, enzymatycznej deglikozylacji i spektrometrii mas, zidentyfikowaliśmy Lamp2a jako nową glikoproteinę 72 kDa w mózgu myszy. Badanie poziomów Lamp-2a ujawniło różnice w ekspresji w różnych regionach mózgu. regionach mózgu. Pień mózgu i rdzeń kręgowy miały ponad trzykrotnie wyższe poziomy Lamp-2a w porównaniu do poziomy Lamp-2a w porównaniu z regionami mniej podatnymi na agregację i wykazały selektywną regulację Lamp-2a podczas rozwoju inkluzji α-synukleiny. inkluzji. Pomimo tej dynamicznej odpowiedzi Lamp-2a, poziomy substratów związanych z lizosomami mózgu, jak również szybkości wychwytu i degradacji substratów nie były proporcjonalne do degradacji nie były proporcjonalne do poziomów Lamp-2a. Te regionalne różnice w aktywności CMA i ekspresji Lamp-2a stwierdzono zarówno u myszy myszy nietransgenicznych, jak i myszy A53T α-syn. Dlatego są to nieodłączne zmiany, a nie efekt specyficzny dla transgenu. Jednak różnice w aktywności CMA mogą sprawić, że wybrane regiony mózgu będą podatne na zaburzenia homeostazy w obecności czynników stresogennych, takich jak nadekspresja ludzkiego A53T α-syn. Łącznie dane te dostarczają potencjalnego mechanizmu wyjaśniającego dychotomię podatność lub odporność, która leży u podstaw regionów mózgu podczas agregacji powstawania agregatów w chorobach neurodegeneracyjnych. --- C-końcowa hydrolaza ubikwityny L1 (UCH-L1) ulega obfitej ekspresji w neuronach i została zgłoszona jako główny cel uszkodzeń oksydacyjnych / karbonylowych związanych ze sporadyczną chorobą Parkinsona (PD). Mutacja I93M w UCH-L1 jest również związana z rodzinną PD. Niedawno donieśliśmy, że UCH-L1 fizycznie oddziałuje z LAMP-2A, receptorem lizosomalnym dla autofagii za pośrednictwem chaperonu (CMA) oraz Hsc70 i Hsp90, z których oba mogą funkcjonować jako składniki szlaku CMA szlaku. Stwierdziliśmy, że poziomy tych interakcji były nieprawidłowo zwiększone przez mutację I93M i że ekspresja I93M UCH-L1 w komórkach indukowała związany z hamowaniem CMA wzrost ilości alfa-synukleiny, czynnika ryzyka PD. Interakcje UCH-L1 z LAMP-2A, Hsc70 i Hsp90 zostały również nieprawidłowo wzmocnione przez karbonylową modyfikację UCH-L1. Proponujemy że nieprawidłowe interakcje wariantów UCH-L1 z maszynerią CMA, co najmniej częściowo leżą u podstaw patogenezy PD związanej z I93M UCH-L1 i prawdopodobnie sporadycznej PD. Nasze odkrycia mogą zapewnić nowy wgląd w powiązania między rodzinną i sporadyczną PD. --- Autofagia za pośrednictwem opiekuna (CMA) jest selektywną ścieżką degradacji białek cytozolowych w lizosomach. białek cytozolowych w lizosomach. CMA zmniejsza się wraz z wiekiem z powodu spadku poziomu białka błonowego związanego z lizosomami (LAMP) typu 2A, receptora lizosomalnego dla tego szlaku. receptora lizosomalnego dla tego szlaku. Selektywnie zablokowaliśmy ekspresję LAMP-2A w mysich fibroblastach w hodowli i przeanalizowaliśmy komórkowe konsekwencje zmniejszonej aktywności CMA. Komórki z defektem CMA utrzymują normalne tempo degradacji białek o długim czasie życia degradacji białek poprzez regulację w górę makroautofagii, głównej formy autofagii. Konstytutywna regulacja makroautofagii nie jest jednak w stanie zrekompensować wszystkich funkcji CMA. zrekompensować wszystkich funkcji CMA. Zatem komórki z defektem CMA są bardziej wrażliwe na czynniki stresogenne, co sugeruje, że chociaż obrót białkami jest utrzymywany, to selektywność CMA jest niezbędna jako część komórkowej odpowiedzi na stres. Nasze wyniki wskazują również na istnienie wzajemnego oddziaływania między różnymi formami autofagii. autofagii. --- Lamp2a działa jako receptor w błonie lizosomalnej dla białek substratowych autofagii za pośrednictwem chaperonów. Stosując przeciwciała specyficzne dla cytozolowego ogona ogona cytozolowego lampy2a i innych rozpoznających wszystkie izoformy lampy2, stwierdziliśmy, że w wątrobie szczura lamp2a stanowi 25% lamp2s w lizosomie. Pokazujemy, że poziomy lamp2a w błonie lizosomalnej w wątrobie szczura i fibroblastach w hodowli bezpośrednio koreluje z szybkością autofagii za pośrednictwem chaperonów w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. warunkach fizjologicznych i patologicznych. Stężenie innych lamp2s w w błonie lizosomalnej nie wykazuje korelacji w tych samych warunkach. Co więcej, białka substratowe wiążą się z lampą2a, ale nie z innymi lampami2. Cztery dodatnio naładowane aminokwasy unikalnie obecne w cytozolowym ogonie lampy2a są wymagane do wiązania białek substratowych. Lamp2a dystrybuuje również do unikalnej subpopulacji okołojądrowych lizosomów w hodowanych fibroblastach w odpowiedzi na odpowiedź na odstawienie surowicy, a lamp2a, bardziej niż inne lampy2, ma tendencję do multimeryzacji. Te cechy mogą być ważne, aby lampa2a działała jako receptor receptora dla autofagii, w której pośredniczy chaperon. --- Wewnątrzkomórkowa degradacja białek zmniejsza się wraz z wiekiem w wielu tkankach i narządach. narządach. W hodowanych komórkach, autofagia za pośrednictwem chaperonów, która jest odpowiedzialna za selektywną degradację białek cytozolowych w lizosomach za selektywną degradację białek cytozolowych w lizosomach, zmniejsza się wraz z wiekiem. wiekiem. W tej pracy wykorzystujemy lizosomy wyizolowane z wątroby szczura do analizy związane z wiekiem zmiany w poziomach i aktywności głównych składników autofagii za pośrednictwem chaperonów. Lizosomy od "starych" (22-miesięcznych) szczurów wykazują niższe wskaźniki autofagii za pośrednictwem chaperonu, a zarówno wiązanie substratu z błoną lizosomalną, jak i do błony lizosomalnej i transport do lizosomów zmniejszają się wraz z wiekiem. Postępujący związany z wiekiem spadek poziomu białka błonowego związanego z lizosomami typu 2a, które działa jako receptor dla autofagii za pośrednictwem chaperonu, był odpowiedzialny za zmniejszone wiązanie substratu w lizosomach pochodzących od starych szczurów, jak również z ludzkich fibroblastów późnego ludzkich fibroblastów. Poziomy cytozolowe i aktywność 73-kDa wymaganego do kierowania substratu do lizosomów były niezmienione z wiekiem. niezmienione z wiekiem. Poziomy hsc73 związanego z lizosomami były zwiększone tylko u najstarszych szczurów. Wzrost ten może być próbą zrekompensowania zmniejszonej z wiekiem aktywności szlaku aktywności szlaku wraz z wiekiem. --- Pojedyncza komórka może zabić całego człowieka. Wysiłki zmierzające do wyleczenia raka są ograniczone przez przetrwanie pojedynczych komórek nowotworowych pomimo i toksycznych terapii. Zrozumienie skomplikowanej sieci szlaków, które utrzymują homeostazę komórkową i pośredniczą w odpowiedzi na stres lub na śmierć komórki ma kluczowe znaczenie dla rozwoju strategii zwalczania raka. Autofagia, degradacja proteasomalna i reakcja na niesfałdowane białko (UPR) to szlaki komórkowe, które degradują i poddają recyklingowi nadmiar lub uszkodzone białek w celu utrzymania homeostazy komórkowej i przetrwania. W niniejszym przeglądzie omówione zostaną autofagię i sposób, w jaki jest ona zintegrowana z degradacją proteasomalną i UPR, aby zarządzać losem komórek poprzez przywrócenie homeostazy komórkowej lub przejście na szlak apoptotyczną ścieżkę śmierci komórki. Pierwszą reakcją autofagii jest makroautofagia, która sekwestruje cytoplazmę, w tym organelle, wewnątrz podwójnie otoczonych pęcherzyków autofagosomów, które łączą się z lizosomami w celu degradacji i recyklingu zawartości. zawartość. Wzorce ubikwitynacji białek przeznaczonych do degradacji określają czy białka adapterowe doprowadzą je do rozwijających się autofagosomów czy do proteasomów. Po makroautofagii następuje autofagia za pośrednictwem chaperonów (CMA), w której Hsc70 (Heat shock cognate 70) selektywnie wiąże białka z odsłoniętymi motywami motywami KFERQ i wpycha je do wnętrza lizosomów poprzez LAMP-2A (Lysosome-associated membrane protein type 2A). Te dwa procesy i mniej poznana mikroautofagia, która obejmuje bezpośrednie wchłanianie białek do lizosomów. białek do lizosomów, zachodzą na poziomie podstawowym i indukowanym. Niewystarczająca funkcja proteasomu lub indukcja stresu ER UPR może indukować autofagię, która może złagodzić uszkodzenia i stres. Jeśli ta sieć nie jest w stanie naprawić uszkodzenia lub przezwyciężenia ciągłego stresu, domyślna ścieżka apoptozy jest w celu zniszczenia komórki. Indukcja makroautofagii przez leki przeciwnowotworowe doprowadziła do badań klinicznych nad kombinacjami HCQ (hydroksychlorochiny) z czynnikami indukującymi apoptozę. Dalsze badania nad złożoną integracją autofagii, degradacji proteasomalnej, UPR i apoptozy prawdopodobnie zapewnią dodatkowe cele w naszej walce z rakiem. rakiem. Ten artykuł jest częścią specjalnego wydania zatytułowanego "Apoptoza: Cztery dekady później". Decades Later". --- TŁO: Autofagia za pośrednictwem opiekuna (CMA) jest selektywnym szlakiem degradacji białek autofagii i lizosomów. szlak degradacji białek. Rola CMA w prawidłowym funkcjonowaniu neuronów i w patogenezie chorób neuronalnych pozostaje niejasna. patogenezie chorób neuronalnych pozostaje niejasna, częściowo dlatego, że nie ma dostępnej metody monitorowania aktywności CMA na poziomie pojedynczej komórki. METODOLOGIA/GŁÓWNE ODKRYCIA: Staraliśmy się ustanowić metodę monitorowania pojedynczej komórki poprzez wizualizację translokacji substratów CMA z cytozolu do lizosomów przy użyciu systemu HaloTag (HT). GAPDH, substrat CMA, został połączony z HT (GAPDH-HT); białko to gromadziło się w lizosomach komórek HeLa i hodowanych komórek Purkinjego móżdżku (PC) po znakowaniu fluorescencyjnym barwnikiem sprzężonym z ligandem HT. Akumulacja lizosomalna była zwiększona przez leczenie aktywujące CMA i zapobiegane przez knockdown LAMP2A, receptora lizosomalnego dla CMA, za pośrednictwem siRNA, a także przez zabiegi, które w CMA, oraz przez leczenie, które inaktywuje CMA. Wyniki te sugerują, że lizosomalna akumulacja GAPDH-HT odzwierciedla aktywność CMA. Korzystając z tej metody, ujawniliśmy że mutant γPKC, który powoduje ataksję rdzeniowo-móżdżkową typu 14, zmniejsza aktywność CMA w hodowanych PC. WNIOSEK/ZNACZENIE: W niniejszym badaniu opracowaliśmy nowatorską metodę opartą na fluorescencji fluorescencyjną metodę oceny aktywności CMA w pojedynczym neuronie. Ta nowatorska metoda powinna być przydatna i cenna do oceny roli CMA w różnych funkcjach neuronalnych i chorobach neuronalnych. funkcji neuronów i patogenezie chorób neuronalnych. --- CELE: Autofagia za pośrednictwem opiekuna (CMA) jest selektywnym mechanizmem degradacji rozpuszczalnych białek cytozolowych posiadających sekwencję KFERQ. Te białka są namierzane przez chaperony i dostarczane do lizosomów, gdzie są przenoszone do światła lizosomów i degradowane przez białko błonowe typu 2A (Lysosome-associated białko błonowe typu 2A (LAMP-2A). Mutacje w LAMP2, które hamują autofagię powodują chorobę Danona charakteryzującą się kardiomiopatią przerostową. Receptor receptor ryanodynowy typu 2 (RyR2) odgrywa kluczową rolę w kardiomiocytach a jego dysfunkcja może prowadzić do niewydolności serca. Czy RyR2 jest degradowany przez CMA nie jest znana. METODY I WYNIKI: W celu wywołania CMA, hodowane kardiomiocyty noworodków szczurów były traktowane geldanamycyną (GA) w celu promowania degradacji białek przez ten szlak. szlaku. GA zwiększył poziom LAMP-2A wraz z jego redystrybucją i kolokalizacją z Hsc70 w kolokalizacja z Hsc70 w regionie okołojądrowym, zmiany wskazujące na aktywację CMA aktywacji. Zahamowanie lizosomów, ale nie proteasomów, zapobiegło utracie RyR2. RyR2. Odzyskanie zawartości RyR2 po inkubacji z GA przez siRNA ukierunkowane na LAMP-2A sugeruje, że RyR2 jest degradowany przez CMA. Analiza in silico ujawniła również, że sekwencja RyR2 zawiera sześć motywów KFERQ, które są wymagane do rozpoznania Hsc70 i jego degradacji przez CMA. Nasze dane sugerują że preseniliny są zaangażowane w degradację RyR2 przez CMA. WNIOSEK: Odkrycia te są zgodne z modelem, w którym uszkodzenie oksydacyjne RyR2 ukierunkowuje go na obrót przez preseniliny i CMA, co może prowadzić do usunięcie uszkodzonych lub nieszczelnych kanałów RyR2. --- Choroba Parkinsona (PD) jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną przez interakcji czynników genetycznych i środowiskowych. Do tej pory geny genetyczne i i warianty genetyczne powodujące PD pozostają w dużej mierze nieznane. Autofagia jest konserwatywnym procesem komórkowym procesem komórkowym obejmującym trzy podtypy, makroautofagię (zwaną dalej autofagia), mikroautofagia i autofagia za pośrednictwem opiekuna (CMA). Chociaż CMA i indukowana autofagia są obserwowane w ludzkich próbkach mózgu PD, komórkach i zwierzęcych modelach PD, CMA i autofagia nie były badane systemowo u sporadycznych pacjentów z PD. sporadycznych pacjentów z PD. W leukocytach obwodowych sporadycznych pacjentów z PD, my zbadaliśmy poziomy ekspresji genów błony związanej z lizosomami 2 (LAMP-2), receptora receptor CMA i etap ograniczający oraz białko związane z mikrotubulami 1 lekki łańcuch łańcuch lekki 3 (LC3), którego produkt jest sekwencyjnie rozszczepiany i lipidowany do postaci LC3-II jako marker autofagosomu. W porównaniu do zdrowych osób dopasowanych do wieku i płci kontroli, ekspresja genu LAMP-2 i poziomy białka u sporadycznych pacjentów z PD były znacznie zmniejszone, co może prowadzić do zmniejszonej aktywności CMA i upośledzonej fuzji autofagosomu i lizosomu. Ekspresja genu LC3 i poziom białka LC3-II były znacznie zwiększone u sporadycznych pacjentów z PD, co sugeruje, że autofagosomy są akumulowane. Nasze odkrycia, zmniejszona ekspresja genu LAMP-2 i zwiększona ekspresja genu LC3, są zgodne z wcześniejszymi badaniami z udziałem komórek neuronów dopaminergicznych in vitro i in vivo, co może przyczyniać się do patogenezy sporadycznej PD poprzez zmianę aktywności CMA i autofagii. Przyczyny genetyczne prowadzące do obniżonej ekspresji genu LAMP-2 wymagają dalszych a genetyczne lub farmakologiczne przywrócenie LAMP-2 może być nową strategią leczenia pacjentów z PD. nową strategią leczenia pacjentów z PD. --- Selektywna degradacja białek cytozolowych w lizosomach przez autofagię zależy, przynajmniej częściowo, od poziomu receptora substratu w błonie lizosomalnej. receptora substratu w błonie lizosomalnej. Wcześniej zidentyfikowaliśmy ten receptor receptor jako białko błonowe związane z lizosomami typu 2a (lamp2a) i pokazaliśmy że poziomy lamp2a w błonie lizosomalnej bezpośrednio korelują z aktywnością szlaku proteolitycznego. aktywnością szlaku proteolitycznego. Tutaj pokazujemy, że poziomy lamp2a w błonie lizosomalnej lizosomalnej są kontrolowane głównie przez zmiany w jej okresie półtrwania i jej dystrybucji między błoną lizosomalną a macierzą. Lizosomalna degradacja degradacja lampy2a wymaga połączonego działania co najmniej dwóch różnych aktywności proteolitycznych w błonie lizosomalnej. Lamp2a jest uwalniana z błony błony przez działanie tych proteaz, a następnie skrócona lampa2a jest szybko degradowana w obrębie macierzy lizosomalnej. Degradacja błonowa lampy2a jest regulowanym procesem, który jest hamowany w obecności substratów dla autofagii i w warunkach, które aktywują ten typ autofagii. autofagię. Wchłanianie białek substratowych powoduje również transport niektórych nienaruszonych białek lampy2a z błony lizosomalnej do macierzy. Ta frakcja lampy2a może być ponownie wprowadzona do błony lizosomalnej. Ruch lampy2a przez przez macierz lizosomalną nie odbywa się za pośrednictwem pęcherzyków, a reinsercja lampy2a wymaga potencjału błony lizosomalnej i składników białkowych błony lizosomalnej. błony lizosomalnej. Dystrybucja lampy2a między błoną lizosomalną i macierzą jest dynamicznym procesem, który przyczynia się do regulacji poziomu błony lizosomalnej poziomu lampy2a w błonie lizosomalnej, a w konsekwencji do aktywności autofagocytów szlaku autofagii, w którym pośredniczy chaperon. --- Autofagia dostarcza składniki cytoplazmatyczne do degradacji lizosomalnej, a tym samym w ten sposób ułatwia degradację patogenów i ładowanie fragmentów patogenów na cząsteczki MHC w celu prezentacji antygenu komórkom T. Herpeswirusy zostały wykorzystane do zademonstrować te nowe funkcje autofagii, która wcześniej była doceniano przede wszystkim za jej rolę pro-przetrwania podczas głodu. W niniejszym podsumowujemy najnowsze odkrycia, w jaki sposób makroautofagia ogranicza infekcje herpeswirusami bezpośrednio infekcje herpeswirusami, jak makroautofagia i autofagia za pośrednictwem chaperonów przyczyniają się do prezentacji antygenu herpeswirusowego na cząsteczkach MHC oraz jakie mechanizmy mechanizmy opracowane przez herpeswirusy w celu zakłócania tych szlaków. Te badania sugerują, że herpeswirusy znacząco modulują autofagię, aby uniknąć od jej funkcji w odporności wrodzonej i adaptacyjnej. --- Białka cytozolowe mogą być selektywnie dostarczane do lizosomów w celu degradacji poprzez rodzaj autofagii znany jako autofagia za pośrednictwem chaperonów (CMA). CMA przyczynia się do wewnątrzkomórkowej kontroli jakości i odpowiedzi komórkowej na stres. stres. Upośledzona CMA została opisana w starzeniu się i w różnych zaburzeniach związanych z wiekiem. zaburzeniach związanych z wiekiem. Substraty CMA przechodzą przez błonę lizosomalną poprzez kompleks translokacyjny. kompleksu translokacyjnego; w konsekwencji zmiany właściwości błony lizosomalnej powinny mieć znaczący wpływ na aktywność CMA. W tej pracy przeanalizowaliśmy wpływ wpływ spożycia lipidów w diecie na aktywność CMA. Stwierdziliśmy, że przewlekła ekspozycja na dietę wysokotłuszczową lub ostra ekspozycja na dietę wzbogaconą w cholesterol mają hamujący wpływ na CMA. Lizosomy z wątroby myszy myszy, którym podawano lipidy, wykazywały znaczny spadek poziomu receptora CMA, białka błonowego związanego z lizosomami typu 2A, z powodu utraty jego stabilności w lizosomach. stabilności w błonie lizosomalnej. Ta przyspieszona degradacja związanego z lizosomami białka błonowego typu 2A, opisana również jako mechanizm który determinuje spadek aktywności CMA wraz z wiekiem, wynika z jego zwiększonej mobilizacji do specyficznych regionów lipidowych w błonie lizosomalnej. Porównawcze analizy lipidomiczne ujawniły jakościowe i ilościowe zmiany w składzie lipidowym błony lizosomalnej. lipidów w błonie lizosomalnej zwierząt poddanych działaniu lipidów, które przypominają te obserwowane wraz z wiekiem. Nasze odkrycia identyfikują nieznany wcześniej negatywny wpływ wysokiego spożycia lipidów w diecie na CMA i podkreślają znaczenie składu diety na nieprawidłowe funkcjonowanie CMA w procesie starzenia. --- Promowanie degradacji białek klienckich Hsp90 poprzez hamowanie Hsp90, ważnego chaperonu białkowego ważnego chaperonu białkowego, jest obiecującą nową strategią przeciwnowotworową. strategia. W tym badaniu wykazaliśmy, że oksazolinowy analog apratoksyny A (oz-apraA), cyklodepsipeptyd wyizolowany z morskiej cyjanobakterii, promuje degradację klientów Hsp90 poprzez autofagię za pośrednictwem chaperonu (CMA). My identyfikujemy motyw podobny do KFERQ jako konserwowaną sekwencję pentapeptydową w domenie kinazy domenie receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) niezbędnej do rozpoznania jako substratu CMA. Mutacja tego motywu zapobiega degradacji EGFR przez CMA i promuje degradację EGFR poprzez szlak proteasomalny w komórkach traktowanych oz-apraA. Oz-apraA wiąże się z Hsc70/Hsp70. Proponujemy, aby apratoksyna A hamuje funkcję Hsp90 poprzez stabilizację interakcji białek klienckich Hsp90 z Hsc70/Hsp70, a tym samym zapobiega ich interakcjom z Hsp90. Nasze badanie dostarcza pierwszych przykładów na zdolność CMA do pośredniczenia w degradacji receptorów błonowych i krzyżowych rozmów CMA i proteasomalnych mechanizmów degradacji mechanizmów degradacji proteasomalnej. --- TŁO: Rodzina białek błonowych związanych z lizosomami (LAMP) obejmuje wielofunkcyjne, wszechobecne LAMP-1 i LAMP-2 oraz specyficzne dla typu komórki białka DC-LAMP (LAMP-3), BAD-LAMP (UNC-46, C20orf103) i makrosialinę (CD68). LAMP są zaangażowane w wiele procesów komórkowych, w tym fagocytozę, autofagię, transport lipidów i starzenie. Izoforma A LAMP-2 działa jako receptor receptor w autofagii, w której pośredniczy chaperon. Niedobór LAMP-2 powoduje śmiertelną chorobę chorobę Danona. Obficie występujące białka LAMP-1 i LAMP-2 są głównymi składnikami glikokoniugatu obecnego na wewnętrznej stronie błony lizosomalnej, tzw. "glikokaliks lizosomalny". Rodzina LAMP charakteryzuje się konserwatywną domeną od 150 do 200 aminokwasów z dwoma wiązaniami dwusiarczkowymi. WYNIKI: Struktura krystaliczna konserwowanej domeny ludzkiego DC-LAMP została rozwiązana. Jest to pierwsza struktura o wysokiej rozdzielczości silnie glikozylowanej glikozylowanego białka błony lizosomalnej. Struktura reprezentuje nowy fałd β-pryzmatyczny utworzony przez dwa β-sheets wygięte przez β-bulges i połączone wiązaniem dwusiarczkowym. Elastyczne pętle i hydrofobowa kieszeń reprezentują możliwe miejsca molekularne interakcji molekularnych. Modele obliczeniowe glikozylowanych regionów luminalnych LAMP-1 i LAMP-2 wskazują, że białka przyjmują zwartą konformację w bliskiej odległości od lizosomu. w pobliżu błony lizosomalnej. Modele odpowiadają grubości lizosomalnej powłoki glikoproteinowej wynoszącej tylko 5 do 12 nm, zgodnie z mikroskopią elektronową. mikroskopii elektronowej. WNIOSEK: Konserwowana domena luminalna białek błonowych związanych z lizosomem białek błonowych lizosomów tworzy nieznany wcześniej fałd β-pryzmatyczny. Wgląd w strukturę lizosomalnego płaszcza glikoproteinowego uzyskano dzięki modelom obliczeniowym białek luminalnych LAMP-1 i LAMP-2. --- Związana z RPE65 wrodzona amauroza Lebera (LCA) jest dystrofią pręcikowo-stożkową, której wynik kliniczny przypisuje się głównie wynik kliniczny przypisuje się głównie utracie fotoreceptorów pręcikowych, a następnie a następnie degeneracji stożka. Patogeneza u myszy Rpe65(-/-) charakteryzuje się powolną i postępującą i postępującą degeneracją pręcików zależną od konstytutywnej aktywacji nieligandowanej opsyny. Wcześniej donosiliśmy, że apoptoza pręcików, w której pośredniczy opsyna pręcików była zależna od szlaku apoptotycznego Bcl-2 i indukowanej przez Bax aktywności pro-death aktywność. W tym badaniu donosimy o wczesnej początkowej apoptozie w nowo zróżnicowanej siatkówce myszy Rpe65(-/-). Apoptotyczne fotoreceptory zostały zidentyfikowane jako pręciki i wynikały z patologicznej sygnalizacji fototransdukcji. Ta fala wczesnej apoptozy wyzwoliła szlak związany z Bcl-2 i aktywność apoptotyczną Bax podczas gdy aktywacja kaspaz nie była indukowana. Po stresie komórkowym stres, inicjowane są liczne szlaki sygnałowe, które albo zobowiązują komórki do śmierci lub wyzwalają odpowiedzi pro-przeżycia, w tym autofagię. Donosimy, że Wczesna apoptoza pręcików związana z Bcl-2 była związana z regulacją w górę markerów autofagii, w tym substratu autofagii za pośrednictwem chaperonu (CMA) receptor LAMP-2 i hydrolazy lizosomalne katepsynę S i lizozym. Sugeruje to że autofagia za pośrednictwem lizosomów może być wyzwalana w odpowiedzi na wczesną apoptozę pręcika apoptozę w chorobie Rpe65-LCA. Wyniki te podkreślają, że związany z Rpe65 indukuje wczesne zdarzenia sygnalizacyjne, które wyzwalają szlak apoptotyczny indukowany przez Bax i odpowiedź komórkową, w której pośredniczy autofagia. Te zdarzenia mogą determinować los komórek siatkówki, progresję i nasilenie choroby. --- Podzbiór białek cytozolowych może być selektywnie degradowany w lizosomach poprzez autofagię, w której pośredniczy chaperon. Białko błony lizosomalnej typu 2A (LAMP-2A) działa jako receptor dla substratów autofagii za pośrednictwem chaperonów (CMA), które powinny ulec rozwinięciu przed przekroczeniem błony lizosomalnej i docierając do światła w celu degradacji. Translokacja substratów jest wspomagana przez chaperony po obu stronach błony, ale rzeczywiste etapy zaangażowane w ten proces i charakterystyka kompleksu translokacyjnego były w większości nieznane. w większości nieznane. Obecnie odkryliśmy, że zamiast stabilnego translokonu w błonie lizosomalnej błonie lizosomalnej, substraty CMA wiążą się z monomerami LAMP-2A, co prowadzi do organizację tego białka w multimeryczny kompleks o wysokiej masie cząsteczkowej który pośredniczy w translokacji. Montaż i demontaż LAMP-2A do i z tego kompleksu jest dynamiczny i regulowany. tego kompleksu jest dynamiczne i jest regulowane przez hsc70 i hsp90, dwa lizosomalne chaperony związane z CMA. Ta praca ujawnia zatem unikalny mechanizm translokacji białek przez błonę lizosomalną, który obejmuje jedynie tylko przejściowe przerwanie ciągłości błony. Możliwe zalety tego translokacji lizosomalnej są omawiane w świetle unikalnych właściwości właściwości przedziału lizosomalnego. --- Białko ochronne/katepsyna A (PPCA) ma aktywność karboksypeptydazy serynowej o nieznanej funkcji fizjologicznej. nieznanej funkcji fizjologicznej. Obecnie wykazujemy, że ta aktywność proteazy wyzwala degradację białka błonowego związanego z lizosomem typu 2a (lamp2a), receptora dla autofagii za pośrednictwem chaperonów (CMA). Degradacja lampy2a jest ważna, ponieważ jej poziom w błonie lizosomalnej jest etapem ograniczającym szybkość CMA. Komórki z defektem PPCA wykazują zmniejszone tempo degradacji lamp2a wyższe poziomy lampy2a i wyższe tempo CMA. Przywrócenie aktywności proteazy aktywności proteazy PPCA zwiększa szybkość degradacji lampy2a, zmniejsza poziomy lizosomalnych lamp2a i zmniejsza szybkość CMA. PPCA wiąże się z lamp2a na lizosomalnej i rozszczepia lamp2a w pobliżu granicy między domenami luminalnymi i transmembranowymi. domenami transmembranowymi. Oprócz dobrze zbadanej roli PPCA w ukierunkowywaniu i ochronie dwóch lizosomalnych glikozydaz, zdefiniowaliśmy rolę dla aktywności proteolitycznej tego wielofunkcyjnego białka.
Jaki jest receptor dla substratów autofagii zależnej od opiekuna?
Autofagia za pośrednictwem opiekuna (CMA) jest lizosomalnym szlakiem selektywnego usuwania uszkodzonych białek cytozolowych. LAMP2A (Lysosome-associated membrane protein 2 isoform A) funkcjonuje jako receptor dla białek cytozolowych, a także jako niezbędny składnik kompleksu translokacji CMA [28]. Cytozolowe białka substratowe wiążą się z monomerami LAMP-2A, który następnie ulega multimeryzacji, tworząc kompleks wymagany do importu przezbłonowego substratu.