Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest jedną z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych chorób genetycznych na świecie. zaburzeń genetycznych, z 20 000 dzieci rocznie rodzących się z DMD na całym świecie. DMD jest spowodowana przez mutacje w genie dystrofiny (DMD). Terapia pomijania eksonów za pośrednictwem antysensu jest obiecującym podejściem terapeutycznym, które wykorzystuje krótkie cząsteczki podobne do DNA zwane oligonukleotydami antysensownymi (AO) do pomijania/wycinania zmutowanej części genu w celu wytworzenia skróconego, ale funkcjonalnego białka dystrofiny. Jednym z głównych wyzwaniem jest ich ograniczone zastosowanie. Pomijanie wielu eksonów jako potencjalne rozwiązanie. Rzeczywiście, wielu pacjentów z DMD potrzebuje pominięcia wielu eksonów w celu przywrócenia ramki odczytu, w zależności od tego ile par zasad ma zmutowany ekson (eksony) i sąsiednie eksony. Teoretycznie, pomijanie wielu eksonów może być stosowane w leczeniu około 90%, 80% i 98% pacjentów z DMD z delecją, duplikacją pacjentów z DMD z mutacjami delecyjnymi, duplikacyjnymi i nonsensownymi. Ponadto, wielokrotne pomijanie eksonów może być wykorzystane do wyboru delecji, które zoptymalizować funkcjonalność skróconego białka dystrofiny. Dowód koncepcji systemowego pomijania wielu eksonów przy użyciu koktajlu AO został w dystroficznych modelach psich i mysich. Pozostałe wyzwania obejmują niewystarczającą skuteczność leczenia ogólnoustrojowego, zwłaszcza w przypadku terapii ukierunkowanych na serce oraz ograniczone długoterminowe dane dotyczące bezpieczeństwa. Tutaj dokonujemy przeglądu ostatnich przedkliniczne w pomijaniu wielu eksonów za pośrednictwem AO i omówić pozostałe wyzwania. pozostałe wyzwania. --- TŁO: Pomijanie eksonów za pośrednictwem antysensu jest przypuszczalnym sposobem leczenia dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Przy użyciu oligonukleotydów antysensownych (AON), ramka odczytu zaburzona ramka odczytu DMD jest przywracana, umożliwiając generowanie częściowo funkcjonalną dystrofinę i przekształcenie ciężkiej dystrofii mięśniowej Duchenne'a w łagodniejszy fenotyp dystrofii mięśniowej Beckera. w łagodniejszy fenotyp dystrofii mięśniowej Beckera. Badania in vivo prowadzone są głównie przy użyciu 2'-O-fosforotioanu metylu (2OMePS) lub morfolino (PMO) AON. Związki te nigdy nie były bezpośrednio porównywane. METODY: Myszom mdx i humanizowanym myszom (h)DMD wstrzyknięto domięśniowo i dożylnie dożylnie z krótkimi i długimi 2OMePS i PMO dla mysiego eksonu 23 i ludzkich eksonów 44, 45, 46 i 51. WYNIKI: Wstrzyknięcie domięśniowe wykazało, że zwiększenie długości 2OMePS AON zwiększyło skuteczność pomijania ludzkiego eksonu 45, ale zmniejszyło wydajność dla mysiego eksonu 23. Chociaż PMO indukował więcej pomijania mysiego eksonu 23, PMO i 2OMePS były bardziej porównywalne dla ludzkich eksonów. Po podaniu dożylnym, pomijanie eksonów i nowe białko wykazano w sercu z obiema substancjami chemicznymi. Ponadto, PMO wykazywał niższe stężenia domięśniowe z wyższymi poziomami pomijania eksonu 23 w porównaniu do 2OMePS, co może być spowodowane sekwestracją w macierzy zewnątrzkomórkowej. macierzy zewnątrzkomórkowej. Wreszcie, dwa niedopasowania sprawiły, że 2OMePS, ale nie PMO AONs prawie nieskuteczne. WNIOSKI: Wyniki uzyskane w niniejszym badaniu wskazują, że zwiększenie długości AON poprawia wydajność pomijania w niektórych, ale nie we wszystkich przypadkach. Jest to możliwe jest indukowanie pomijania eksonów i odbudowy dystrofiny w sercu po wstrzyknięciu wstrzyknięciu 2OMePS i nieskoniugowanego PMO. Ponadto, różnice w skuteczności między PMO i 2OMePS wydają się być zależne od sekwencji, a nie od chemii. Wreszcie, wyniki wskazują, że PMO mogą być mniej specyficzne dla sekwencji niż 2OMePS. --- TŁO: Pomijanie eksonów za pośrednictwem antysensu jest obecnie jednym z najbardziej obiecujących podejść terapeutycznych. obiecujących podejść terapeutycznych do dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Używanie oligonukleotydów antysensownych (AON) ukierunkowanych na określone eksony, ramka odczytu DMD jest przywracana i wytwarzane są częściowo funkcjonalne dystrofiny. Po udowodnieniu w hodowanych komórkach mięśniowych od pacjentów z różnymi delecjami i mutacjami punktowymi. mutacjami punktowymi, skupiamy się teraz na pojedynczych i wielokrotnych duplikacjach eksonów. Te mutacje są w zasadzie idealnymi celami dla tego podejścia, ponieważ specyficzne pomijanie zduplikowanych eksonów generowałoby oryginalne transkrypty o pełnej długości. METODY: Hodowane komórki mięśniowe od pacjentów z DMD niosących duplikacje były AON celującymi w zduplikowane eksony, a RNA i białko dystrofiny zostały przeanalizowane. i białko dystrofiny. WYNIKI: W przypadku dwóch braci z duplikacją eksonu 44, pomijanie było, nawet przy suboptymalnych warunkach transfekcji, tak wydajne, że oba eksony 44 zostały pominięte, generując po raz kolejny transkrypt poza ramką. W takich przypadkach, można uciec się do pomijania wielu eksonów w celu przywrócenia ramki odczytu, jak pokazano tutaj poprzez indukowanie pomijania eksonu 43 i obu eksonów 44. Dla kontrastu, w komórkach od pacjenta z duplikacją eksonu 45 byliśmy w stanie indukować pomijanie pojedynczego eksonu 45 co pozwoliło na przywrócenie dystrofiny typu dzikiego. Korekta większej duplikacji (obejmującej eksony od 52 do 62) za pomocą kombinacji AON ukierunkowanych na zewnętrznych eksonów, okazała się problematyczna z powodu nieefektywnego pomijania i niewłaściwego ukierunkowania oryginalnych zamiast zduplikowanych eksonów. WNIOSEK: Korekta duplikacji DMD poprzez pomijanie eksonów zależy od konkretnych egzonów. Jego opcje różnią się od idealnej, przywracając po raz pierwszy po raz pierwszy prawdziwej dystrofiny typu dzikiego, do wymagających bardziej "klasycznych" strategii pomijania, podczas gdy korekta strategii pomijania, podczas gdy korekta delecji wielu eksonów może wymagać dostosowanego podejścia. --- Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest poważną chorobą wyniszczającą mięśnie spowodowaną mutacjami genu DMD. mutacje w genie DMD, dotykające 1 na 3500 nowonarodzonych mężczyzn. Całkowita utrata dystrofiny mięśniowej powoduje postępujące osłabienie mięśni oraz niewydolność serca i układu niewydolność serca i układu oddechowego, prowadząc do przedwczesnej śmierci. Antysensowne oligonukleotydy (AON), które wiążą się z komplementarnymi sekwencjami pre-mRNA dystrofiny, indukując pominięcie docelowego eksonu poprzez modulację splicingu pre-mRNA są obiecującymi środki terapeutyczne dla DMD. Takie AON mogą przywrócić otwartą ramkę odczytu genu DMD i wytwarzać wewnętrznie usunięte, ale częściowo funkcjonalne izoformy białka dystrofiny w mięśniach szkieletowych. W ciągu ostatnich kilku lat badania kliniczne z użyciem AON poczyniły znaczne postępy, wykazując przywrócenie funkcjonalnego białka dystrofiny i akceptowalne profile bezpieczeństwa zarówno po miejscowym i ogólnoustrojowym u pacjentów z DMD. Jednakże, poprawa dostarczania i skuteczności AON i skuteczności, wraz z opracowaniem wielu AON do leczenia jak największej liczby pacjentów z DMD, wymaga pacjentów z DMD, aby to podejście spełniło swój potencjał. jego potencjał. Tutaj dokonujemy przeglądu ostatnich postępów poczynionych w badaniach klinicznych z wykorzystaniem AON w leczeniu DMD i omawiamy obecne wyzwania związane z rozwojem terapii opartej na terapii DMD opartej na AON. --- Wcześniej przeprowadziliśmy dowód zasady; badanie eskalacji dawki u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a dystrofii mięśniowej (DMD) przy użyciu oligonukleotydu morfolino splice-switching oligonukleotyd AVI-4658 (eteplirsen), który indukuje pomijanie eksonu dystrofiny 51 u pacjentów z odpowiednimi delecjami, przywraca otwartą ramkę odczytu i indukuje ekspresję białka dystrofiny po wstrzyknięciu domięśniowym (i.m.). My Teraz pokazujemy, że tej ekspresji dystrofiny towarzyszyła podwyższona ekspresja ekspresji α-sarkoglikanu, β-dystroglikanu (BDG) i - w odpowiednich przypadkach - neuronalnego tlenku azotu. przypadkach - neuronalnej syntazy tlenku azotu (nNOS) w sarkolemie, z których każdy jest składnikiem innego podkompleksu kompleksu glikoprotein związanego z dystrofiną (DAPC). (DAPC). Zgodnie z oczekiwaniami, ekspresja nNOS była relokowana do sarkolemmy u pacjentów z zespołem Duchenne'a, u których delecja dystrofiny pozostawiła domenę wiążącą nNOS (eksony 42-45) nienaruszoną. domenę wiążącą nNOS (eksony 42-45), podczas gdy nie miało to miejsca u pacjentów z delecje, które obejmowały tę domenę. Nasze wyniki wskazują, że nowa wewnętrznie usunięta i krótsza dystrofina indukowana przez pominięcie eksonu 51 w pacjentów z podatnymi delecjami, może również przywrócić kompleks związany z dystrofiną kompleks, co dodatkowo sugeruje zachowaną funkcjonalność nowo przetłumaczonej dystrofiny. dystrofiny.
Jaki jest podstawowy mechanizm pomijania eksonów stosowany w leczeniu dystrofii mięśniowej Duchenne'a?
Terapia pomijania eksonów za pośrednictwem antysensu jest obiecującym podejściem terapeutycznym, które wykorzystuje krótkie cząsteczki podobne do DNA zwane oligonukleotydami antysensownymi (AO) do pomijania/splicingu zmutowanej części genu w celu wytworzenia skróconego, ale funkcjonalnego białka dystrofiny. Wielu pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a wymaga pominięcia wielu eksonów w celu przywrócenia ramki odczytu, w zależności od tego, ile par zasad ma zmutowany ekson (eksony) i sąsiednie eksony.