Lizosom jest organellą cytoplazmatyczną ograniczoną błoną, która zawiera co najmniej 50 enzymów hydrolitycznych. co najmniej 50 enzymów hydrolitycznych i związanych z nimi kofaktorów. Znaczenie biomedyczne tych enzymów tych enzymów jest podkreślane przez wiele lizosomalnych zaburzeń spichrzeniowych, które są związane z mutacjami w genach kodujących białka lizosomalne, a także istnieją dowody na to, że również dowody na to, że aktywność lizosomalna może być zaangażowana w bardziej powszechne choroby choroby. Celem tego badania było scharakteryzowanie lizosomalnego proteomu ludzkiego mózgu. proteomu ludzkiego mózgu w celu ustanowienia mapy referencyjnej do badania ludzkich chorób o nieznanej etiologii i uzyskanie wglądu w komórkową funkcję lizosomu. lizosomu. Białka zawierające mannozo-6-fosforan (Man6-P), modyfikację węglowodanową modyfikację węglowodanową stosowaną do kierowania rezydentnych rozpuszczalnych białek lizosomalnych do lizosomu. lizosomu, oczyszczono metodą powinowactwa przy użyciu unieruchomionego receptora Man6-P. Frakcjonowanie za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy rozwiązało złożoną mieszaninę składającą się z około 800 plamek. Białka składowe w każdej plamce zostały zidentyfikowane przy użyciu kombinacji lasera wspomaganego matrycą laserowej desorpcji/jonizacji w czasie lotu spektrometrii mas (zarówno peptydowy odcisk masy odcisk palca i tandemowa spektrometria mas) [poprawione] na tryptycznych i sekwencjonowaniu N-końcowym. W analizie uzupełniającej przeanalizowaliśmy również tryptyczne trawienie niefrakcjonowanej mieszaniny za pomocą chromatografii cieczowej MS/MS. W sumie zidentyfikowano 61 różnych białek. Siedem było prawdopodobnie zanieczyszczeniami związanych z prawdziwymi glikoproteinami Man6-P. Czterdzieści jeden było znanymi białkami lizosomalnymi białkami lizosomalnymi, z których 11 nie zawierało wcześniej Man6-P. Dodatkowe dodatkowych dziewięć białek było albo niescharakteryzowanych, albo białek, o których wcześniej nie o których wcześniej nie informowano, że pełnią funkcję lizosomalną. Stwierdziliśmy, że ludzki mózg Man6-P jest wysoce złożony i zawiera więcej białek o znacznie większej liczbie funkcji lizosomalnych. białek ze znacznie większą liczbą poszczególnych izoform niż stwierdzono w wcześniejszych badaniach glikoproteomów Man6-P. --- Glikoproteiny zawierające modyfikację mannozo-6-fosforanu (Man-6-P) stanowią klasę białek o dużym znaczeniu biomedycznym. Obejmują one obejmują ponad sześćdziesiąt różnych rozpuszczalnych hydrolaz lizosomalnych i białek pomocniczych. białka, których niedobory skutkują ponad czterdziestoma różnymi znanymi ludzkimi chorobami genetycznymi. chorób genetycznych. Ponadto istnieją pacjenci z lizosomalnymi chorobami spichrzeniowymi o nieznanej etiologii i lizosomalnymi chorobami o nieznanej etiologii, a białka lizosomalne są zaangażowane w procesy patofizjologiczne związane z procesy patofizjologiczne związane z chorobą Alzheimera, zapaleniem stawów i nowotworami. rakiem. Celem tego badania było zbadanie moczu jako źródła do badań proteomicznych w lizosomalnych chorobach spichrzeniowych. badania lizosomalnych zaburzeń spichrzeniowych, a także do badań biomarkerów nad roli białek zawierających Man-6-P w innych chorobach człowieka. W tym celu, białka moczu oczyszczono metodą powinowactwa na unieruchomionych receptorach Man-6-P, trawione trypsyną i analizowane przy użyciu nanospray LC/MS/MS. Doprowadziło to do 67 białek, w tym 48 znanych białek lizosomalnych i 9 białek, które mogą być lizosomalne. białek, które mogą być lizosomalne. Identyfikacja dużej części znanego zestawu rozpuszczalnych białek lizosomalnych ze stosunkowo niewielką liczbą zanieczyszczeń sugeruje, że mocz stanowi obiecujące podłoże do opracowania porównawczych metod proteomicznych do badania zaburzeń lizosomalnych i innych chorób obejmujących innych chorób obejmujących glikoproteiny Man-6-P. --- Niniejszy rozdział opisuje proces produkcji, oczyszczania, separacji i identyfikacji rozpuszczalnych białek lizosomalnych za pomocą spektrometrii mas. identyfikacji rozpuszczalnych białek lizosomalnych za pomocą spektrometrii mas. Uzasadnieniem do oczyszczania tych białek wynika z ich charakterystycznego cukru, mannozy-6-fosforanu (M6P), który umożliwia mannozo-6-fosforan (M6P), który umożliwia łatwe oczyszczanie przez chromatografię powinowactwa na immobilizowanym M6P. na unieruchomionym receptorze M6P (MPR). Wydzielanie białek M6P (zasadniczo rozpuszczalnych białek lizosomalnych) z komórek w hodowli jest indukowane przez dodanie słabej zasady do pożywki hodowlanej. Wydzielane białka są strącane siarczanem amonu strącane, dializowane i ładowane na unieruchomioną kolumnę MPR. Po specyficznej elucji i zebraniu białek M6P, są one rozdzielane przez dwuwymiarową lub jednowymiarową elektroforezę żelową (oznaczoną odpowiednio jako 2-DE lub 1-DE). Analiza spektrometrii masowej jest wykonywana na plamkach wyciętych z żelu 2-DE lub na dyskretnych pasmach obejmujących całą długość pasa żelu pasa żelu 1-DE: te plamki lub pasma są trawione w żelu trypsyną i uzyskuje się identyfikację białek, dzięki uzyskuje się identyfikację białka dzięki odciskom palców masy peptydowej [dostarczonym przez analizę trawienia za pomocą laserowej desorpcji matrycy desorpcji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI-MS)] lub sekwencji aminokwasów peptydowych (dostarczane przez analizę strawów przez połączenie chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii masowej) chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas, LC-MS/MS). --- Większość luminalnych białek lizosomalnych jest syntetyzowana jako prekursory zawierające mannozę 6-fosforan (Man6-P), a wiele ostatnich badań przeprowadziło powinowactwo oczyszczanie białek zawierających Man6-P jako krok w kierunku zdefiniowania składu lizosomu. Około 60 znanych białek lizosomalnych zostało w takich badaniach, jak również wiele innych glikoprotein Man-6-P, z których niektóre reprezentują nowe białka lizosomalne. Te ostatnie są bardzo interesujące z punktu widzenia perspektywy komórkowo-biologicznej i biomedycznej, ale rozróżnienie między nimi od innych białek pozostaje znaczącym wyzwaniem. Celem tego badania było przeprowadzenie globalnej analizy glikoproteomu Man6-P ssaków, wdrażając metod technicznych i biostatystycznych, aby pomóc w odkrywaniu i walidacji lizosomalnych kandydatów kandydatów lizosomalnych. Oczyściliśmy glikoproteiny Man6-P z 17 poszczególnych tkanek szczura. tkanek szczura. Aby odróżnić niespecyficzne zanieczyszczenia (tj. obfite lub "lepkie" białka, które nie są w pełni usuwane podczas oczyszczania) od specyficznie oczyszczonych białek, przeprowadziliśmy półilościowe porównanie spektrometryczne mas poziomów białek w niespecyficznych eluatach mock versus specyficznych eluatach chromatografii powinowactwa chromatografii powinowactwa, aby zidentyfikować te białka, które są specyficznie oczyszczone. Zidentyfikowaliśmy 60 znanych białek lizosomalnych, reprezentujących prawie wszystkie które obecnie zawierają Man-6-P. Znaleźliśmy również 136 innych białek które są specyficznie oczyszczone, ale o których nie wiadomo, że mają funkcję lizosomalną. funkcję lizosomalną. Takie podejście zapewnia listę kandydujących białek lizosomalnych, a także zapewnia wgląd we względną dystrybucję glikoprotein Man6-P. --- Przedział lizosomalny ludzkich komórek monocytarnych nigdy nie był badany przez podejście proteomiczne. Dzięki połączeniu jednowymiarowej (1-D) i dwuwymiarowej (2-D) elektroforezy żelowej dwuwymiarowej (2-D) elektroforezy żelowej, identyfikacji białek przez N-końcowe sekwencjonowanie sekwencjonowanie, wspomagana matrycą desorpcja laserowa/jonizacja-spektrometria masowa (MALDI-MS) peptydowe masowe odciski palców i tandemowa spektrometria mas (MS/MS) analiza sekwencji peptydów, zainicjowaliśmy wyczerpujące badanie ludzkiego proteomu proteomu lizosomalnego, które ma na celu ustanowienie 2-D mapy referencyjnej ludzkich rozpuszczalnych białek lizosomalnych. Ludzkie monocytarne komórki U937 indukowano do wydzielania rozpuszczalnych hydrolaz lizosomalnych poprzez dodanie NH4Cl do pożywki hodowlanej. Ponieważ rozpuszczalne białka lizosomalne charakteryzują się obecnością mannozo-6-fosforanu, oczyszczono je na nośniku powinowactwa zawierającym receptor mannozy-6-fosforanu. Analiza oczyszczonej frakcji doprowadziła do wstępnej identyfikacji piętnastu białek, wśród których dwanaście to dobrze znanymi hydrolazami lizosomalnymi, a jedno z nich uznano za lizosomalne na podstawie homologii sekwencji do proteinaz cysteinowych z rodziny papain i dwóch (leukocystatyna i ludzki komórkowy represor genów stymulowanych przez E1A) są opisane tutaj po raz pierwszy jako białka zawierające mannozę-6-fosforan. --- Szacuje się, że macierz lizosomalna zawiera około 50 różnych białek. Większość białek macierzy to hydrolazy kwasowe, które zależą od receptorów mannozo-6-fosforanowych (MPR). receptory (MPR) do kierowania do lizosomów. Tutaj opisujemy kompleksową analizę analizę proteomu białek wiążących MPR od myszy. Myszy zarodkowe fibroblasty fibroblasty wadliwe w obu MPR (MPR 46-/- i MPR 300-/-) są znane z tego, że wydzielają białka macierzy lizosomalnej. Wydzieliny tych komórek zostały oczyszczono przy użyciu matrycy powinowactwa derywatyzowanej MPR46 i MPR300. We frakcji frakcji białkowej związanej z matrycą powinowactwa i eluowanej mannozą 6-fosforanem mannozy, 34 znane białka macierzy lizosomalnej, 4 kandydujące białka macierzy lizosomalnej i 4 białka macierzy lizosomalnej. lizosomalnej i 4 zanieczyszczenia nielizosomalne zostały zidentyfikowane za pomocą spektrometrii masowej spektrometrii masowej po rozdzieleniu przez dwuwymiarową elektroforezę żelową lub przez wielowymiarowej technologii identyfikacji białek. Dla 3 kandydujących białek białek, białka związanego z ependyminą ssaków-2 (MERP-2), indukowanej retinoidami karboksypeptydazę serynową (RISC) i hipotetyczne białko 66,3-kDa, mogliśmy zweryfikować, że formy znakowane C-końcem wiązały się w sposób zależny od M6P do matrycy powinowactwa MPR i były internalizowane poprzez endocytozę, w której pośredniczy MPR. Stąd te 3 białka prawdopodobnie reprezentują dotychczas nierozpoznane białka macierzy lizosomalnej białka macierzy lizosomalnej. --- Większość nowo syntetyzowanych rozpuszczalnych białek lizosomalnych zawiera 6-fosforan mannozy (Man-6-P), specyficzną modyfikację węglowodanową, która jest rozpoznawana przez receptory Man-6-P (MPR), które kierują je do lizosomu. Wiele badań proteomicznych proteomicznych skupiło się na białkach lizosomalnych, wykorzystując fakt, że formy zawierające Man-6-P mogą być oczyszczane przez chromatografię powinowactwa na unieruchomionych MPR. Badania te pozwoliły zidentyfikować wiele znanych białek lizosomalnych, jak również a także wiele białek, które wcześniej nie były klasyfikowane jako lizosomalne. Te ostatnie mają potencjalne implikacje dla funkcji lizosomalnych i jako kandydaci na białka lizosomalne. oraz jako kandydaci do lizosomalnych chorób spichrzeniowych o nieznanej etiologii. Jednak istotnym problemem w interpretacji biologicznego znaczenia takich białek było rozróżnienie prawdziwych białek było odróżnienie prawdziwych glikoprotein Man-6-P od prostych zanieczyszczeń i od białek związanych z prawdziwymi glikoproteinami Man-6-P (np. inhibitory proteazy i lektyny). W tym raporcie opisujemy podejście spektrometryczne podejście do weryfikacji fosforylacji Man-6 na podstawie LC-MS oczyszczonych proteolitycznych glikopeptydów MPR. Zapewniło to użyteczne narzędzie w walidacji nowych białek oczyszczonych z MPR jako prawdziwych glikoprotein Man-6-P, a także pozwoliło na identyfikację składników o niskiej liczebności, których nie zaobserwowano w analizie całkowitej mieszaniny glikoprotein Man-6-P. Ponadto, podejście to pozwoliło na globalne mapowanie 99 miejsc fosforylacji Man-6 z 44 znanych białek lizosomalnych białek lizosomalnych oczyszczonych z mózgu myszy i człowieka. Informacje te prawdopodobnie zapewnić użyteczny wgląd w determinanty białkowe dla tej modyfikacji i może mieć znaczącą wartość w podejściach inżynierii białek zaprojektowanych w celu optymalizacji dostarczania białek do lizosomu w zastosowaniach terapeutycznych, takich jak terapie zastępcze genów i enzymów. enzymatyczne terapie zastępcze. --- Reszty 6-fosforanu mannozy (Man6P) stanowią sygnał rozpoznawczy wymagany dla skutecznego, zależnego od receptora transportu rozpuszczalnych białek lizosomalnych do lizosomów. Po dotarciu na miejsce białka są szybko defosforylowane. Użyliśmy myszy z niedoborem lizosomalnej kwaśnej fosfatazy Acp2 lub Acp5 lub z brakiem obu fosfatazy (Acp2/Acp5(-/-)), aby zbadać ich rolę w defosforylacji białek zawierających białek zawierających Man6P. Dwuwymiarowe (2D) analizy immunoblot Man6P z oczyszczonych z tyloxapolu frakcji lizosomalnych ujawniły ważną rolę Acp5 działającego w połączeniu z Acp2 dla całkowitej defosforylacji białek lizosomalnych. Najbardziej najbardziej obfite lizosomalne substraty Acp2 i Acp5 zostały zidentyfikowane za pomocą chromatografii powinowactwa Man6P i spektrometrii mas. W zależności od obecności Acp2 lub Acp5, punkt izoelektryczny lizosomalnego białka wiążącego cholesterol Npc2 wahał się między 7,0 a 5,4 i może w ten sposób regulować jego interakcję z ujemnie naładowanymi błonami lizosomalnymi. naładowanymi błonami lizosomalnymi w kwaśnym pH. Odpowiednio, niezestryfikowany niezestryfikowany cholesterol gromadził się w lizosomach hodowanych hepatocytów Acp2/Acp5(-/-). Dane pokazują, że defosforylacja lizosomów zawierających białek lizosomalnych zawierających Man6P wymaga skoordynowanego działania Acp2 i Acp5 i jest potrzebna do hydrolizy i usuwania produktów degradacji. --- Aktywność hydrolazy kwasowej jest zwykle ograniczona w komórce do lizosomu, organelle cytoplazmatyczne ograniczone błoną, odpowiedzialne głównie za degradację makrocząsteczek. Jednakże, białka lizosomalne są również obecne w ludzkim osoczu ludzkim osoczu, a część z nich zachowuje mannozo-6-fosforan (Man-6-P), modyfikację modyfikację na N-łączonych glikanach, która jest rozpoznawana przez receptory Man-6-P (MPR) które normalnie kierują kierowanie tych białek do lizosomu. W tym W tym badaniu oczyściliśmy glikoformy Man-6-P białek z ludzkiego osocza przez chromatografii powinowactwa na unieruchomionych MPR i scharakteryzowaliśmy ten subproteom za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej i tandemowej spektrometrii mas. Zgodnie z oczekiwaniami zidentyfikowaliśmy wiele znanych i potencjalnych białek lizosomalnych. Ponadto zidentyfikowaliśmy również szereg obfitych klasycznych białek osocza które zostały zatrzymane nawet po dwóch kolejnych rundach oczyszczania powinowactwa. Biorąc pod uwagę ich obfitość w osoczu, początkowo uważaliśmy te białka za prawdopodobne zanieczyszczenia, ale badanie spektrometrii masowej miejsc fosforylacji Man-6 przy użyciu glikopeptydów oczyszczonych z MPR ujawniło, że pewna część tych klasycznych białek osocza zawierała modyfikację Man-6-P. Proponujemy, aby te glikoproteiny są fosforylowane na niskim poziomie przez enzym lizosomalny fosfotransferazę, ale ich wysoka obfitość powoduje wykrywanie glikoform Man-6-P w osoczu. Wyniki te mogą zapewnić użyteczny wgląd w procesy molekularne leżące u podstaw fosforylacji Man-6 i podkreślają okoliczności w których obecność Man-6-P może nie wskazywać na funkcję lizosomalną. Ponadto, charakterystyka glikoproteomu Man-6-P w osoczu powinna ułatwić rozwój narzędzi opartych na spektrometrii mas do diagnozowania lizosomalnych chorób spichrzeniowych i lizosomalnych chorób spichrzeniowych i do badania zaangażowania glikoprotein zawierających Man-6-P w bardziej rozpowszechnionych chorobach człowieka i ich potencjalnej użyteczności jako biomarkerów. potencjalną użyteczność jako biomarkerów.
Jakiego rodzaju oczyszczania powinowactwa można użyć w celu wyizolowania rozpuszczalnych białek lizosomalnych?
Uzasadnieniem dla oczyszczania rozpuszczalnych białek lizosomalnych jest ich charakterystyczny cukier, mannoza-6-fosforan (M6P), który umożliwia łatwe oczyszczanie poprzez chromatografię powinowactwa na unieruchomionych receptorach M6P.