Oprócz znaczenia w wytwarzaniu różnorodności genetycznej w gatunkach bakterii, rekombinacja homologiczna (HR) rekombinacji homologicznej (HR) odgrywa kluczową rolę w naprawie DNA i tolerancji na uszkodzenia. i tolerancji na uszkodzenia. Częstotliwość HR zależy od kilku czynników, w tym od wydajności systemów naprawy DNA, ponieważ HR jest zaangażowana w odzyskiwanie widełek replikacyjnych widełek replikacyjnych zaburzonych przez uszkodzenia DNA. Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) jest jednym z głównych głównych szlaków naprawy DNA zaangażowanych w naprawę szerokiego zakresu uszkodzeń DNA zazwyczaj indukowanych przez egzogenne substancje chemiczne lub promieniowanie UV, a jego funkcje w komórkach komórki nie narażone na czynniki uszkadzające DNA przyciągnęły mniej uwagi. W W tym badaniu opracowaliśmy test, który umożliwia badanie HR między loci chromosomalnych bakterii glebowej Pseudomonas putida zarówno w komórkach rosnących, jak i komórkach w fazie stacjonarnej. Niniejszy test wykrywa zdarzenia HR między dwoma niefunkcjonalnymi allelami genów degradujących fenol, które wytwarzają funkcjonalny allel allel i umożliwiają wzrost bakterii na fenolu jako jedynym źródle węgla. Nasze wyniki wskazują, że HR pomiędzy loci chromosomalnymi zachodzi głównie w rosnących komórkach rosnących komórkach, a częstotliwość HR jest zmniejszona podczas następującego głodzenia u P. putida z niedoborem NER, ale nie w przypadku, gdy bakterie nie posiadają enzymów UvrA lub UvrB enzymów. Brak UvrA lub UvrB skutkował fenotypem hiper-rekombinacji w P. putida, komórki były nitkowate, a ich wzrost był upośledzony nawet przy braku egzogennych uszkodzeń DNA. brak egzogennych uszkodzeń DNA. Jednak pochodne z niedoborem NER, które które przezwyciężyły defekty wzrostu, pojawiły się szybko. Taka adaptacja spowodowała spadek częstotliwości HR. Chociaż HR w aktywnie replikującym P. putida był nadal podwyższony w zaadaptowanych wariantach szczepów z niedoborem UvrA i UvrB, dynamika pojawiania się dynamika pojawiania się rekombinantów w tych szczepach okazała się podobna do NER. Dodatkowo, zaobserwowaliśmy, że HR było wzmocnione przy braku czynnika sprzęgającego naprawę transkrypcji Mfd w rosnących komórkach, ale nie podczas głodzenia. Na częstotliwość HR nie miał wpływu homolog UvrA UvrA2 ani w bakteriach z niedoborem NER, ani pod nieobecność UvrA, co sugeruje niewielką rolę UvrA2 w NER. W związku z tym dochodzimy do wniosku, że funkcje NER są ważne również bez egzogennie indukowanych uszkodzeń DNA w P. putida i zarówno sprzężony z transkrypcją i globalny genomowy NER działają w celu tłumienia HR w rosnących komórkach, podczas gdy UvrA i UvrB są zaangażowane w utrzymanie integralności genomu również w komórkach w fazie stacjonarnej. --- Naprawa DNA sprzężona z transkrypcją (TCR) jest podszlakiem naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER). (NER), która jest uruchamiana, gdy polimeraza RNA zostaje zatrzymana przez uszkodzenie DNA. Uszkodzenia ukierunkowane przez TCR są naprawiane szybciej niż uszkodzenia naprawiane przez niezależny od transkrypcji "globalny" szlak NER, ale mechanizm leżący u podstaw ten mechanizm nie jest zrozumiały. Rozpoznawanie uszkodzeń podczas bakteryjnego NER zależy od UvrA, który wiąże się z uszkodzeniem i ładuje UvrB na DNA. Bakteryjny TCR dodatkowo wymaga białka Mfd, translokazę DNA, która usuwa zatrzymane kompleksy transkrypcyjne. Określiliśmy właściwości Mfd, UvrA i UvrB, które są wymagane do podwyższonej szybkości naprawy obserwowanego podczas TCR. Pokazujemy, że TCR i globalny NER różnią się pod względem wymagania dotyczące rozpoznawania uszkodzeń przez UvrA, wskazując, że Mfd działa na najwcześniejszym etapie procesu naprawy i rozszerzając funkcjonalne podobieństwa między TCR u bakterii i podobieństwa między TCR u bakterii i eukariontów. --- TŁO: Rozległa różnorodność genetyczna i szybka dywersyfikacja alleliczna są cechy ludzkiego patogenu żołądkowego Helicobacter pylori i są uważa się, że przyczyniają się do jego zdolności do wywoływania przewlekłych infekcji. Zarówno wysoki mutacji i częsty import krótkich fragmentów egzogennego DNA podczas mieszanych infekcji odgrywają ważną rolę. mieszanych infekcji odgrywają ważną rolę w generowaniu tej różnorodności allelicznej. W W tym badaniu zastosowaliśmy podejście genetyczne do zbadania roli nukleotydów (NER) w mutacji i rekombinacji H. pylori. rekombinacji. WYNIKI: Inaktywacja któregokolwiek z czterech genów uvr silnie zwiększyła podatność H. pylori na mutacje i rekombinację. podatność H. pylori na uszkodzenia DNA przez światło ultrafioletowe. Inaktywacja genów uvrA i uvrB znacząco zmniejszyła częstotliwość mutacji, podczas gdy tylko mutant z niedoborem uvrA wykazywał znaczący spadek częstotliwości rekombinacji po naturalnej transformacji. po naturalnej transformacji. Mutant uvrC nie wykazywał znaczących zmian w częstości mutacji i rekombinacji. mutacji lub częstości rekombinacji; jednak inaktywacja uvrC promowała włączenie znacznie dłuższych fragmentów DNA dawcy (2,2-krotny wzrost) do chromosomu biorcy. Delecja uvrD indukowała fenotyp hiperrekombinacyjny. fenotyp hiper-rekombinacyjny. WNIOSKI: Nasze dane sugerują, że system NER pełni wiele funkcji w genetycznej dywersyfikacji H. pylori, przyczyniając się do wysokiego wskaźnika mutacji, i kontrolując włączanie importowanych fragmentów DNA po naturalnej transformacji. transformacji. --- Mechanizm naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER) Escherichia coli jest odpowiedzialny za rozpoznawanie i eliminację ponad dwudziestu różnych uszkodzeń DNA. W niniejszym badaniu oceniliśmy in vivo rolę NER w naprawie adduktów DNA adduktów DNA generowanych przez psoraleny (mono- lub dwufunkcyjne) i światło UV-A (PUVA) w E. coli. E. coli. Hodowle E. coli K12 typu dzikiego i mutantów dla genów uvrA, uvrB, uvrC lub uvrAC poddano działaniu PUVA i określono przeżywalność komórek. Równolegle równolegle, kinetykę naprawy DNA oceniano również przez porównanie profili sedymentacji DNA we wszystkich szczepach po leczeniu PUVA. Mutant uvrB był bardziej wrażliwy na leczenie PUVA niż wszystkie inne szczepy mutantów uvr. Szczep typu dzikiego oraz mutanty uvrA i uvrC były zdolne do naprawy uszkodzeń indukowanych przez PUVA. uszkodzeń, co widać na podstawie profili sedymentacji DNA, podczas gdy mutant uvrB nie był w stanie do naprawy uszkodzeń. Ponadto, poczwórny mutant fpg nth xth nfo był niezdolny do niklowania DNA poddanego działaniu PUVA, gdy surowy ekstrakt bezkomórkowy został użyty do do niklowania plazmidu. Dane te sugerują, że naprawa DNA uszkodzeń indukowanych PUVA może wymagać funkcji naprawy przez wycięcie zasady, pomimo biegłej aktywności UvrABC aktywność. Wyniki te wskazują na specyficzną rolę białka UvrB w naprawie adduktów psoralenu adduktów psoralenu, które wydają się być niezależne od białek UvrA lub UvrC, tak jak opisane dla klasycznego mechanizmu endonukleazy UvrABC. --- Wiązania krzyżowe DNA-białko (DPC) są unikalne wśród zmian DNA w ich niezwykle nieporęczny charakter. Niedawno wykazaliśmy, że naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) i rekombinacja homologiczna (HR) rekombinacja homologiczna (HR) zależna od RecBCD wspólnie łagodzą śmiertelny efekt DPC w Escherichia coli. W tym badaniu, aby uzyskać dalszy wgląd w mechanizm przetwarzania uszkodzeń dla DPC, oceniliśmy wrażliwość panelu mutantów E. coli z niedoborem naprawy na czynniki indukujące DPC czynniki, w tym formaldehyd (FA) i 5-azacytydynę (azaC). Pokazujemy tutaj, że mechanizm tolerancji uszkodzeń obejmujący HR i późniejszy restart replikacji (RR) zapewnia najskuteczniejsze środki przetrwania komórek przeciwko DPC. Synteza translesionów nie służy jako alternatywny mechanizm tolerancji uszkodzeń mechanizm tolerancji uszkodzeń dla DPC w przetrwaniu komórek. Eliminacja DPC z genomu zależy przede wszystkim od przede wszystkim na NER, który zapewnia drugi i umiarkowanie skuteczny sposób przetrwania komórek przeżycia komórek przeciwko DPC. Co ciekawe, Cho zamiast UvrC wydaje się być skuteczną nukleazą dla NER DPC. Wraz z genami odpowiedzialnymi za HR, RR i NER, mutacja genów zaangażowanych w kilka aspektów naprawy DNA i transakcji, takich jak i transakcje, takie jak recQ, xth nfo, dksA i topA, czyniły komórki nieznacznie ale znacząco wrażliwe na FA, ale nie na azaC, prawdopodobnie odzwierciedlając złożoność DPC lub kryptycznych zmian indukowanych przez FA. UvrD może mieć dodatkową rolę poza NER, ponieważ mutacja uvrD nadawała komórkom niewielką wrażliwość na azaC. komórek. Wreszcie, glikozylazy DNA łagodzą toksyczność azaC, niezależnie od naprawy naprawy DPC, prawdopodobnie poprzez usunięcie 5-azacytozyny lub jej produktu degradacji z chromosomu. --- Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) jest powszechnie stosowana do rozpoznawania i usuwania wielu rodzajów uszkodzeń DNA. U eubakterii system NER zazwyczaj składa się z UvrA, UvrB, UvrC, helikazy UvrD, polimerazy DNA I i ligazy. Ponadto, gdy uszkodzenie DNA blokuje transkrypcję, czynnik sprzęgający transkrypcję i naprawę (TRCF), produkt genu mfd, rekrutuje kompleks Uvr do naprawy uszkodzenia. uszkodzenia. Wcześniejsze prace z wykorzystaniem wybranych mutantów i testów wykazały, że patogenne Neisseria spp. posiadają funkcjonalny system NER. W celu kompleksowo zbadać rolę NER w procesach rekombinacji i naprawy DNA Neisseria gonorrhoeae rekombinacji i procesach naprawy, przewidywane geny NER (uvrA, uvrB, uvrC, uvrD i mfd) zostały zakłócone przez insercję transpozonu, a mutanty uvrB i uvrD zostały uzupełnione kopią każdego genu w locus ektopowym. Każdy zmutowany szczep uvr był wysoce wrażliwy na promieniowanie UV, a także wykazywał wrażliwość na zabijanie nadtlenkiem wodoru, potwierdzając, że wszystkie geny NER u N. gonorrhoeae są funkcjonalne. Wpływ ekspresji RecA na przeżywalność UV był niewielki w mutantach uvr, ale znacznie większy w mutancie mfd. Wszystkie mutanty NER wykazywały dzikie poziomy zmienności antygenowej pilin i transformacji DNA. DNA. Jednakże mutant uvrD wykazywał wyższe częstotliwości PilC i spontanicznej mutacji, co jest zgodne z rolą zgodne z rolą UvrD w naprawie niedopasowania. Wnioskujemy, że funkcje NER są konserwowane w N. gonorrhoeae i są ważne dla zdolności naprawy DNA tego ścisłego ludzkiego patogenu. DNA tego ścisłego ludzkiego patogenu. --- Włączanie rybonukleotydów do DNA przyciągnęło znaczną uwagę w ostatnich latach. ostatnich latach, ponieważ pula rybonukleotydów może przekraczać pulę dezoksyrybonukleotydów o co najmniej 10-20 razy, a inkorporacja pojedynczego rybonukleotydu przez polimerazy DNA przez polimerazy DNA wydaje się być częstym zdarzeniem. Ponadto rybonukleotydy są potencjalnie mutagenne i prowadzą do niestabilności genomu. W konsekwencji błędnie przyłączone rybonukleotydy są szybko naprawiane w procesie zależnym od enzymów procesie zależnym od enzymów RNazy H. Z drugiej strony, globalna genomowa nukleotydów (NER) u prokariotów i eukariotów usuwa uszkodzenia spowodowane przez kowalencyjne modyfikacje, które zazwyczaj zniekształcają i destabilizują DNA poprzez wytwarzanie zmian pochodzących z nieporęcznych chemicznych czynników rakotwórczych, takich jak takich jak metabolity wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych lub poprzez sieciowanie. Jednakże ostatnie badanie podważa ten paradygmat rozpoznawania zmian. Praca Vaismana i wsp. al. (2013) [34] pokazuje, że nawet pojedynczy rybonukleotyd osadzony w dezoksyrybonukleotydzie dupleksie dezoksyrybonukleotydowym jest rozpoznawany przez bakteryjną maszynerię NER in in vitro. W swoim raporcie autorzy pokazują, że spontaniczna mutageneza promowana przez mutanta steric-gate pol V wzrasta w szczepach uvrA, uvrB lub uvrC pozbawionych rnhB (kodującego RNazę HII) i w większym stopniu w szczepie z niedoborem NER pozbawionym zarówno RNazy HI, jak i RNazy HII. Używając oczyszczonych białek UvrA, UvrB i UvrC w testach in vitro pokazują, że pomimo powodowania niewielkich zniekształceń, pojedynczy rybonukleotyd pojedynczy rybonukleotyd osadzony w dupleksie DNA jest rozpoznawany i podwójnie inkorporowany przez kompleks NER. Przedstawiamy hipotezę wyjaśniającą rozpoznawanie i/lub weryfikację tej małej zmiany, że krytyczny 2'-OH rybonukleotydu - z jego unikalnymi właściwościami elektrostatycznymi i wiązaniami wodorowymi - może działać jako sygnał sygnał poprzez interakcje z resztami aminokwasowymi prokariotycznego kompleksu NER które nie są możliwe w przypadku DNA. Taki mechanizm mógłby być również istotny gdyby wykazano, że eukariotyczna maszyneria NER również nacina osadzony rybonukleotyd w DNA. --- Cisplatyna jest obecnie stosowana w chemioterapii nowotworów w celu wywołania śmierci złośliwych komórek poprzez blokowanie replikacji DNA. Jest to powszechnie stosowany powszechnie stosowanym środkiem chemioterapeutycznym wiążącym się mono- lub dwufunkcyjnie z guaninami w DNA. Zmutowane szczepy Escherichia coli K12 z niedoborem naprawy wycięcia nukleotydów (NER) zostały poddane rosnącym stężeniom cisplatyny, a wyniki ujawniły, że mutanty uvrA i uvrB są wrażliwe na ten czynnik, podczas gdy mutanty uvrC i cho pozostają jak szczep typu dzikiego. Czas wymagany do wyłączenia ekspresji genów ekspresji i powrotu do normalnej masy DNA w dzikim typie E. coli nie został osiągnięty nawet po 4 godzinach po leczeniu cisplatyną, podczas gdy ten sam proces zachodzi w ciągu 1,5 godziny. proces zachodzi w ciągu 1,5 godziny po naświetlaniu promieniowaniem ultrafioletowym (UV). Poza tym silnie uszkadzające działanie cisplatyny można zaobserwować nie tylko poprzez trwałe nacięcia na genomowym DNA, ale także przez ekspresję genów NER przekraczającą wielokrotnie tę obserwowaną po równoważnych śmiertelnych dawkach UV. Co więcej, cisplatyna spowodowała wzrost ekspresji genu uvrB z jego przypuszczalnego promotora P3 w sposób niezależny od SOS. sposób.
Które enzymy są zaangażowane w globalną naprawę wycinania nukleotydów genomowych (GG-NER) u bakterii?
Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) jest powszechnie stosowana do rozpoznawania i usuwania wielu rodzajów uszkodzeń DNA. U eubakterii system NER składa się zazwyczaj z UvrA, UvrB, UvrC, helikazy UvrD, polimerazy DNA I i ligazy.  Rozpoznawanie uszkodzeń podczas bakteryjnego NER zależy od UvrA, który wiąże się z uszkodzeniem i ładuje UvrB na DNA. Następnie UvrA, UvrB i UvrC tworzą endonukleazę białkową UvrABC, kompleks wieloenzymatyczny, który przeprowadza naprawę uszkodzonego DNA w sposób sekwencyjny. W niektórych przypadkach Cho może być skuteczną nukleazą dla NER, a nie UvrC. Nukleaza UvrC i krótki oligonukleotyd zawierający uszkodzenie DNA są usuwane z kompleksu po nacięciu przez UvrD, helikazę nadrodziny 1A. U organizmów Gram-dodatnich helikaza PcrA może również wypierać UvrC i wycięty oligonukleotyd z kompleksu NER po nacięciu.