Mutacje FANCJ są związane z rakiem piersi i genetycznie powiązane z chorobą szpiku kostnego chorobą szpiku kostnego - niedokrwistością Fanconiego (FA). Niestabilność genomowa zmutowanych komórek FA-J sugeruje, że helikaza FANCJ funkcjonuje w odpowiedzi na stres replikacyjny. replikacyjnym. Domniemana helikaza z podobieństwem sekwencji do FANCJ u Caenorhabditis elegans (DOG-1) i myszy (RTEL) jest wymagana do utrzymania szlaku poli(G) co sugeruje jej udział w rozwiązywaniu alternatywnych struktur DNA, które utrudniają replikację. struktur DNA, które utrudniają replikację. W warunkach fizjologicznych sekwencje bogate w guaninę w guaninę spontanicznie łączą się w czteroniciowe struktury (kwadrupleksy G [G4]), które wpływają na stabilność genomu. FANCJ odwija substraty DNA G4 w sposób sposób zależny od ATPazy. Odwijanie G4 przez FANCJ jest specyficzne, ponieważ inna helikaza helikaza z nadrodziny 2, RECQ1, nie odwijała wszystkich substratów G4 testowanych w warunkach, w których w warunkach, w których helikaza odwijała dupleks DNA. Białko replikacyjne A stymulowało odwijanie FANCJ G4, podczas gdy kompleks naprawy niedopasowania MSH2/MSH6 hamował tę aktywność. Komórki pozbawione FANCJ traktowane związkiem G4-interaktywnym telomestatyną wykazywały upośledzoną proliferację i podwyższony poziom apoptozy i uszkodzeń DNA w porównaniu do komórek kontrolnych z małym interferującym RNA, co sugeruje, że DNA G4 jest fizjologicznym substratem FANCJ. Chociaż szlak FA został klasycznie opisany w kategoriach naprawy międzypasmowych wiązań krzyżowych (ICL) naprawy, defekty komórkowe związane z mutacją FANCJ wykraczają poza zmniejszoną zdolność do naprawy ICL i obejmują inne rodzaje blokad strukturalnych DNA strukturalne DNA. --- Duże ekspansje niekodującego powtórzenia GGGGCC w pierwszym intronie genu C9orf72 są częstą przyczyną stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) i otępienia czołowo-skroniowego (FTD). otępienia czołowo-skroniowego (FTD). Sekwencje bogate w G mają skłonność do tworzenia wysoce stabilnych struktur kwadrupleksowych zarówno w RNA, jak i DNA, określanych jako G-kwadrupleksy. Wykazano, że kwadrupleksy G są zaangażowane w szereg procesów, w tym w stabilność telomerów i transkrypcję RNA, splicing, translację i transport. Tutaj pokazujemy przy użyciu spektroskopii NMR i CD, że heksanukleotyd C9orf72 może tworzyć stabilny G-kwadrupleks, co ma głębokie implikacje dla mechanizmu mechanizmu chorobowego w ALS i FTD. --- Antyamyloidogenne przetwarzanie białka prekursorowego amyloidu APP przez α-sekretazę zapobiega powstawaniu peptydu amyloidu-β, który gromadzi się w organizmie. α-sekretazy zapobiega tworzeniu się peptydu amyloidu-β, który gromadzi się w blaszkach starczych u pacjentów z chorobą Alzheimera. α-sekretaza należy do rodziny dezintegryn i metaloproteaz (ADAM), a ADAM10 jest głównym kandydatem do aktywności antyamyloidogennej. Niedawno wykazaliśmy, że translacja ADAM10 jest tłumiona przez jego 5'-UTR i że w szczególności pierwsza połowa połowa 5'-UTR ADAM10 jest odpowiedzialna za represję translacji. Tutaj zapytaliśmy, czy w 5'-UTR ADAM10 istnieją określone motywy sekwencyjne, które są w stanie tworzyć złożone struktury drugorzędowe, a tym samym potencjalnie hamować translację ADAM10 translację. Wykorzystując spektroskopię dichroizmu kołowego, wykazaliśmy, że region bogaty w G region między nukleotydami 66 i 94 ADAM10 5'-UTR tworzy wysoce stabilny, wewnątrzcząsteczkową, równoległą strukturę G-kwadrupleksu w warunkach fizjologicznych. warunkach fizjologicznych. Mutacja guanin w tej sekwencji znosi tworzenie struktury G-kwadrupleksu. G-kwadrupleksu. Chociaż struktura G-kwadrupleksu skutecznie hamuje translację reportera lucyferazy w testach translacji in vitro i w żywych komórkach. żywych komórkach, hamowanie tworzenia się G-kwadrupleksu tego nie czyni. Ponadto, ekspresja ADAM10 była podobnie hamowana przez G-kwadrupleks. Mutacja motywu G-kwadrupleksu powoduje znaczny wzrost poziomów ADAM10 i w konsekwencji wydzielanie APPsα. W ten sposób zidentyfikowaliśmy krytyczną drugorzędową strukturę RNA strukturę w obrębie 5'-UTR, która przyczynia się do represji translacji ADAM10. --- Enzym rozszczepiający białko prekursorowe amyloidu β (APP) 1 (BACE1) jest przezbłonową proteazą aspartylową, która katalizuje pierwszy etap rozszczepienia w proteolizie proteolizy APP do białka amyloidu β (Aβ), procesu zaangażowanego w patogenezę choroby Alzheimera. patogenezie choroby Alzheimera. Pre-mRNA BACE1 ulega złożonemu alternatywnemu splicingowi, którego regulacja nie jest dobrze poznana. Zidentyfikowaliśmy sekwencję bogatą w G w eksonie 3 BACE1 zaangażowaną w kontrolowanie wyboru miejsca splicingu. Mutacja sekwencji bogatej w G zmniejszyła użycie normalnego miejsca splicingu 5' w eksonie 3, co prowadzi do pełnego splicingu. eksonu 3, co prowadzi do pełnej długości i proteolitycznie aktywnej BACE1, oraz zwiększone wykorzystanie alternatywnego miejsca splicingu, co prowadzi do krótszej, zasadniczo nieaktywnej izoformy. Testy ochrony przed nukleazą, magnetyczny rezonans jądrowy i spektroskopia dichroizmu kołowego ujawniły, że ta sekwencja składa się w strukturę G-kwadrupleksu. Zidentyfikowano kilka białek zdolnych do wiązania się z sekwencją bogatą w G, a jedno z nich, heterogeniczna jądrowa heterogenna jądrowa rybonukleoproteina H, która reguluje alternatywne splicing egzonu 3 BACE1 i w sposób zależny od sekwencji bogatej w G. Zablokowanie heterogennej jądrowej rybonukleoproteiny H doprowadziło do spadku izoformy mRNA BACE1 pełnej długości, jak również jak również zmniejszenie produkcji Aβ z APP, co sugeruje nowe możliwości dla terapeutycznego podejścia do choroby Alzheimera. --- Kompleks telomerazy jest odpowiedzialny za utrzymanie telomerów i stanowi obiecujący cel terapii obiecujący cel terapeutyczny w nowotworach. Niedawno wykazaliśmy, że leczenie środkiem interferującym z G-kwadrupleksem, telomestatyną, w sposób powtarzalny hamowało aktywność telomerazy w białaczkowych liniach komórkowych BCR-ABL-dodatnich. W W niniejszym badaniu zbadaliśmy mechanizmy apoptozy indukowanej przez hamowanie telomerazy w ostrej białaczce. Stwierdziliśmy aktywację kaspazy-3 i polimerazy poli(ADP-rybozy) w komórkach U937 traktowanych telomestatyną (PD20) i dominująco-ujemnych komórkach U937 z ekspresją DN-hTERT (PD25). Aktywacja kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p38 (MAP) i MKK3/6 stwierdzono również w komórkach U937 traktowanych telomestatyną (PD20) i dominująco-ujemnych komórkach U937 z ekspresją DN-hTERT (PD25). U937 (PD25); jednakże aktywacja JNK i ASK1 nie została wykryta w tych komórkach. komórkach. Aby zbadać wpływ hamowania kinazy p38 MAP na właściwości wzrostu i apoptozę w komórkach zahamowanych telomerazą, hodowaliśmy komórki U937 z ekspresją DN-hTERT U937 z lub bez SB203580. Komórki U937 z dominującą ujemną ekspresją hTERT zatrzymały proliferację na PD25; jednak znaczący wzrost tempa wzrostu zaobserwowano w obecności SB203580. zaobserwowano w obecności SB203580. Leczenie SB203580 również zmniejszyło indukcję apoptozy w komórkach U937 z ekspresją DN-hTERT (PD25). Wyniki te sugerują, że kinaza p38 MAP odgrywa kluczową rolę w indukcji apoptozy w komórkach białaczkowych zahamowanych telomerazą. Ponadto oceniliśmy wpływ telomestatyny na wzrost komórek U937 w mysim modelu ksenoprzeszczepu. Ogólnoustrojowe dootrzewnowe podawanie telomestatyny w ksenograftach U937 obniżyło poziom telomerazy w guzie i zmniejszyło objętość guza. Tkanka guza od zwierząt leczonych telomestatyną wykazywała wyraźną apoptozę. Żadna z myszy leczonych telomestatyną nie wykazywała żadnych objawów toksyczności. Podsumowując, te wyniki kładą podwaliny pod program rozwoju leków w celu osiągnięcia podwójnego celu skuteczności i selektywności in vivo. --- Telomeraza, enzym rybonukleoproteinowy utrzymujący telomery eukariotycznych chromosomów jest regulowana w górę w zdecydowanej większości ludzkich nowotworów, ale nie w normalnych tkankach somatycznych. normalnych tkankach somatycznych. Dlatego też kompleks telomerazy stanowi obiecujący obiecujący cel terapeutyczny w nowotworach. Telomeryczny jednoniciowy DNA bogaty w G może in vitro wewnątrzcząsteczkową strukturę kwadrupleksu, która, jak wykazano, hamuje aktywność telomerazy. hamuje aktywność telomerazy. Zbadaliśmy czynnik interaktywny G-kwadrupleksu, telomestatynę (SOT-095), pod kątem jej zdolności do hamowania proliferacji ludzkich komórek białaczkowych, w tym świeżo komórek białaczkowych, w tym świeżo uzyskanych komórek białaczkowych. Długość telomerów została określono za pomocą metody końcowego fragmentu restrykcyjnego lub flow-FISH, a apoptozę oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto zbadano chemowrażliwość w komórkach U937 traktowanych telomestatyną przed ostatecznym skróceniem telomerów. Leczenie telomestatyną w sposób powtarzalny hamowało aktywność telomerazy w komórkach U937 i NB4, po czym następowało skrócenie telomerów. Zwiększona chemowrażliwość na daunorubicynę i cytozyno-arabinozyd zaobserwowano w komórkach U937 traktowanych telomestatyną przed ostatecznym skróceniem telomerów. Skrócenie telomerów związane z apoptozą przez telomestatynę było widoczne w niektórych świeżo uzyskanych komórkach białaczkowych od pacjentów z ostrą białaczką szpikową, niezależnie od podtypów AML i AML po mielodysplazji. Wyniki te sugerują, że zakłócenie telomerów przez telomestatynę ogranicza również długość życia komórek AML. Jednakże, u mniejszości pacjentów z AML apoptoza nie była widoczna, co wskazując, że oporny mechanizm może istnieć w niektórych świeżo uzyskanych komórkach AML komórkach AML. Dlatego dalsze badania telomestatyny jako środka terapeutycznego jest uzasadnione.
Jakie są najczęściej zgłaszane stany patologiczne związane z tworzeniem się kwadrupleksów DNA G?
Istnieje coraz większe uznanie dla głębokiej roli G-kwadrupleksów w szerokim spektrum chorób, takich jak rak, cukrzyca i choroby układu krążenia. Niedawno wykazano, że stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i otępienie czołowo-skroniowe (FTD) są spowodowane ekspansją powtórzenia (GGGGCC)n/(GGCCCC)n w genie C9ORF72.  Wykazano, że leczenie interaktywnym ligandem G-kwadrupleksu ma działanie przeciwzwłóknieniowe. Sekwencje tworzące G-kwadrupleks zostały również powiązane z ADAM10, głównym kandydatem do aktywności antyamyloidogennej w chorobie Alzheimera. Interaktywny czynnik G-kwadrupleksu, telomestatyna (SOT-095), indukuje skracanie telomerów z apoptozą i zwiększa chemiowrażliwość w ostrej białaczce szpikowej.