Zachowany ewolucyjnie układ odpornościowy danio pręgowanego (Danio rerio), w połączeniu z jego genetyczną w połączeniu z jego genetyczną plastycznością, pozycjonuje go jako doskonały model system, w którym można wyjaśnić pochodzenie i funkcję komórek odpornościowych kręgowców. Niedawno donieśliśmy o istnieniu prezentujących antygen jednojądrzastych fagocytów u danio pręgowanego, a mianowicie makrofagów i komórek dendrytycznych (DC), ale zostały one w dalszym scharakteryzowaniu biologii tych komórek z powodu braku specyficznej transgenicznej linii reporterowej. Wykorzystując elementy regulacyjne głównego genu wygenerowaliśmy linię reporterową danio pręgowanego wyrażającą zielone białko fluorescencyjne (GFP). białko fluorescencyjne (GFP) we wszystkich APC, makrofagach, DC i limfocytach B. Badanie zwierząt podwójnie transgenicznych mhc2dab:GFP; cd45:DsRed wykazało, że że komórki mhc2dab:GFP(hi); cd45:DsRed(hi) nerek były wyłącznie dojrzałymi monocyty/makrofagi i DC, jak wykazały analizy morfologiczne i molekularne. analizy. Jednojądrzaste fagocyty znaleziono we wszystkich narządach hematolimfoidalnych, ale były najbardziej obfite w jelicie i śledzionie, gdzie regulują w górę ekspresję cytokin zapalnych po prowokacji bakteryjnej. Wreszcie, Transgeny mhc2dab:GFP i cd45:DsRed oznaczają wzajemnie wykluczające się podzbiory komórek we frakcji limfoidalnej, umożliwiając frakcji limfoidalnej, umożliwiając wytyczenie głównych linii krwiotwórczych linii krwiotwórczych u dorosłego danio pręgowanego. Odkrycia te sugerują, że transgen mhc2dab:GFP i cd45:DsRed będą miały zasadnicze znaczenie w wyjaśnianiu odpowiedzi immunologicznej u danio pręgowanego. odpowiedź u danio pręgowanego. --- Rozpoczęto badania przesiewowe w celu zidentyfikowania nowych składników białkowych Caenorhabditis elegans. Subkomórkowa lokalizacja białek fuzyjnych pełnej długości GFP zbadano u zwierząt transgenicznych dla 62 zasadniczo niescharakteryzowanych genów, o których sądzi się, że ulegają ekspresji w komórkach mięśniowych ściany ciała. Trzy geny, T03G6.3, C46G7.2 i K04A8.6, zostały zidentyfikowane do dalszych badań. K04A8.6::GFP tylko sporadycznie wykazywał regularną dystrybucję sarkomeryczną. Jednakże, C46G7.2::GFP lokalizował się w centrum pasm A i ciałek gęstych i T03G6.3::GFP zlokalizowany w paśmie I sarkomerów mięśni ściany ciała, konsekwentnie. Ten sukces z tak małym ekranem sugeruje, że istnieją że istnieją dalsze pomniejsze składniki sarkomerów C. elegans, które nie zostały jeszcze odkryte. Odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) zastosowano do żywych transgenicznych osobników osobników w celu oceny mobilności T03G6.3 i C46G7.2 oraz innych dobrze znanych składników sarkomeru in vivo. Białka związane z cienkimi wykazały dynamiczną wymianę, podczas gdy te związane z grubymi włóknami wydawały się bardziej statyczne. Jest to pierwsza demonstracja, że istnieją białka sarkomerowe białka w komórkach mięśniowych C. elegans w dynamicznej wymianie i że szybkości wymiany in vivo odpowiadają ogólnie obserwacjom w innych systemach eksperymentalnych. eksperymentalnych. --- TŁO: Białko zielonej fluorescencji (GFP) jest szeroko stosowane jako reporter do ekspresji transgenów u Drosophila i innych organizmów. Jednak GFP nie jest generalnie nie był używany jako reporter dla okołodobowych wzorców ekspresji genów i nie było wcześniej możliwe skorelowanie wzorców ekspresji reportera z ruchem 3D i zachowaniem zwierząt transgenicznych. WYNIKI: Przedstawiamy system śledzenia wideo, który umożliwia specyficzną dla tkanki ekspresję GFP i skorelowanie jej z ruchem zwierząt 3D w czasie rzeczywistym. Ekspresja reportera eyeless/Pax6 miała 12-godzinny okres, który korelował z poziomem aktywności muchy. Reporterzy genów hsp70 i hsp22 byli indukowani podczas starzenia się muchy w wzorcach okołodobowych (odpowiednio 24-godzinnym i 18-godzinnym), a ich ekspresja wzrastała w godzinach godzinach poprzedzających i pokrywających się ze śmiercią zwierzęcia. Faza ekspresji reportera genu hsp w stosunku do poziomu aktywności muchy była różna dla każdej muchy, i pozostawała taka sama przez cały okres życia. WNIOSEK: Eksperymenty te pokazują, że GFP można łatwo wykorzystać do oceny ruchu muchy i specyficznych dla tkanki wzorców ekspresji genów. The Stwierdzono, że wzorce ekspresji hsp22-GFP i hsp70-GFP dokładnie odzwierciedlają endogenne wzorce ekspresji genów, w tym indukcję podczas starzenia i okresowość okołodobową. okresowość okołodobową. Połączenie tych nowych metod śledzenia z reporterami hsp-GFP ujawniło dodatkowe informacje, w tym skok ekspresji reporterów hsp22 i hsp70 poprzedzający śmierć, a także intrygującą zmienność fazy hsp22 i hsp70 zmienność w fazie wzorców ekspresji reporterów hsp70 i hsp22. Te metody pozwalają na skorelowanie określonych czasowych wzorców ekspresji genów z czasowymi wzorcami aktywności, zachowania i śmiertelności zwierząt. --- Gromadzące się dowody sugerują, że do trzech różnych gatunków molekularnych peptydów Peptydy GnRH kodowane przez różne paralogi genów gnrh są wyrażane przez anatomicznie różne grupy neuronów GnRH w mózgu jednego gatunku kręgowców gatunków kręgowców. Są one nazywane gnrh1, gnrh2 i gnrh3. Ostatnie dowody z molekularnych, anatomicznych i fizjologicznych eksperymentów silnie sugerują, że każdy system System GnRH działa inaczej. Tutaj dokonujemy przeglądu ostatnich postępów w badania funkcjonalne trzech różnych układów neuronów GnRH, koncentrując się głównie na na analizie elektrofizjologicznej GnRH-zielone białko fluorescencyjne (GFP) zwierząt transgenicznych. Wprowadzenie zwierząt transgenicznych GFP w celu analizy elektrofizjologicznej neuronów GnRH znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat ich anatomii i elektrofizjologii, zwłaszcza neuronów gnrh1, które od dawna nie poddawały się szczegółowej analizie elektrofizjologicznej pojedynczych neuronów ze względu na ich mały rozmiar i rozproszony rozkład. W oparciu o wyniki ostatnich badań, proponujemy, aby różne właściwości elektrofizjologiczne, w szczególności spontaniczne wzorce aktywności elektrycznej i ich zmiany zależne od czasu, i projekcje aksonalne charakteryzują różne funkcje neuronów GnRH1-3 neurony GnRH1 działają jako hipofizjotropowe regulatory neuroendokrynne i Neurony GnRH2 i GnRH3 działają jako neuromodulatory w szerokich obszarach mózgu. --- Wektory lentiwirusowe zawierające gen białka zielonej fluorescen z powodzeniem wykorzystywane do selekcji transgenicznych zarodków przed przeniesieniem do matce zastępczej. Jednak najwyraźniej nie ma doniesień dotyczących wczesnego wykrywania transgenicznych zarodków przy użyciu wektora lentiwirusowego zawierającego dodatkową jednostkę jednostkę transkrypcyjną do specyficznej tkankowo ekspresji cennego białka. W tym skonstruowano dwa wektory lentiwirusowe oparte na HIV. Pierwszy z nich zawierał sekwencję kodującą białko zielonej fluorescencji (GFP) napędzaną przez promotor wczesny promotor SV40 (Lv-G), podczas gdy drugi zawierał dodatkową jednostkę transkrypcyjną do ekspresji jednostkę transkrypcyjną do ekspresji glikoproteiny E2 z klasycznego wirusa pomoru świń wirusa pomoru świń, napędzanego przez promotor αS1casein 1,5 kb z bawołu wodnego (Lv-αS1cE2hisG). Mikroiniekcja jednokomórkowych zarodków myszy wektorem lentiwirusowym Lv-G wektor lentiwirusowy spowodował, że zarodki były GFP-dodatnie, począwszy od stadium etapie czterech komórek. Spośród 33 urodzonych myszy, 28 (81%) było nosicielami transgenicznego DNA, a 15 (55,5%) było GFP-dodatnich. Mikroiniekcja wektora lentiwirusowego Lv-αS1cE2hisG urodziło się 28 myszy; chociaż 24 (85%) niosły DNA transgenu, żadna nie była GFP-pozytywny, co sugeruje, że specyficzna dla tkanki kaseta ekspresyjna zakłóciła z ekspresją wszechobecnej jednostki transkrypcyjnej. U myszy transgenicznych Lv-αS1cE2hisG E2his ulegał ekspresji w mleku jako homodimer (w stężeniach ≤ 0,422 mg/ml). Było to najwyraźniej pierwsze doniesienie o ekspresji rekombinowanego białka w mleku. rekombinowanego białka w mleku transgenicznych zwierząt generowanych przez transgenezę lentiwirusową. transgenezę. --- Zwierzęta transgeniczne są od lat wykorzystywane do badania funkcji genów, produkcji ważnych białek i generowania modeli do badania ludzkich chorób. Jednak dziedziczenie i niestabilność ekspresji transgenu u zwierząt transgenicznych jest głównym ograniczeniem. zwierząt transgenicznych jest głównym ograniczeniem. Wiadomo, że liczba kopii i metylacja promotora regulują ekspresję genów, ale żaden raport nie badał systematycznie ich wpływu na ekspresję transgenów. na ekspresję transgenu. W badaniu wygenerowaliśmy dwie transgeniczne świnie poprzez transfer jądrowy komórek somatycznych (SCNT), które wyrażają białko zielonej fluorescencji (GFP) napędzane wirusem cytomegalii (CMV). Przeprowadzono bezwzględną ilościową PCR w czasie rzeczywistym i sekwencjonowanie dwusiarczynowe w celu określenia liczby kopii transgenu i poziomu metylacji promotora. poziom metylacji promotora. Korelacja ekspresji transgenu z liczbą kopii i metylacją promotora analizowano w rozwoju indywidualnym, komórkach fibroblastów, różnych tkankach i potomstwie transgenicznych świń. Nasze wyniki pokazują, że ekspresja transgenu jest związana z liczbą kopii i metylacją promotora metylacją promotora CMV u transgenicznych świń. --- TŁO: Głównym ograniczeniem technicznym w przedklinicznych badaniach nad zastępowaniem komórek komórek jest zdolność do odróżnienia tkanki dawcy od tkanki gospodarza po przeszczepie. przeszczepie. Problem ten został zmniejszony dzięki dostępności transgenicznych, które wyrażają geny "reporterowe", takie jak białko zielonej fluorescencji (GFP). białko (GFP). CEL: Określiliśmy przydatność jednego z takich transgenicznych szczurów reporterowych do oceny przeżywalności pochodzących ze szpiku kostnego szczurzych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) po bezpośredniej transplantacji do nienaruszonego mózgu dorosłego osobnika. Staraliśmy się również określić, czy ekspresja GFP w mózgu wpłynęła na przeżywalność MSC lub odpowiedź neuroimmunologiczną gospodarza na komórki. METODY: Szczurom wstrzyknięto śródstriatalnie sterylną pożywkę do przeszczepów pożywki, 100 000 normalnych MSC lub 100 000 GFP-MSC i zostały humanitarnie zabite 1, 4, 7, 28 i 42 dni po transplantacji do barwienia immunohistochemicznego astrocytów i mikrogleju. barwienia immunohistochemicznego. WYNIKI: GFP-MSC były widoczne podczas każdego badania, chociaż ich przeżywalność malała z czasem. spadała z czasem. Szacunki objętości przeszczepu porównujące normalne i GFP-MSCs wykazały, że ekspresja GFP nie wpływa negatywnie na przeżywalność komórek macierzystych w mózgu. komórek macierzystych w mózgu. Ponadto, immunobarwienie astrocytów i mikrogleju że ekspresja białka reporterowego nie wpływa na immunogenność komórek macierzystych. immunogenność komórek macierzystych. WNIOSKI: Dane te wskazują na przydatność GFP do badania przeżywalności przeżywalności MSC po przeszczepieniu do mózgu. Jednak mechanizmy odpowiedzialne za słabą przeżywalność komórek macierzystych muszą zostać wyjaśnione, jeśli te mają służyć terapiom komórkowym zaburzeń neurodegeneracyjnych. --- Danio pręgowany stanowi przydatny system eksperymentalny do badania rozwoju słuchu. rozwoju słuchu. Aby umożliwić kontrolowaną ekspresję transgenów w rozwijających się komórkach komórek słuchowych, wyizolowaliśmy genomowe regiony kontrolne parwalbuminy 3a (pvalb3a) i parvalbuminy 3b (pvalb3b). Analiza delecji i transgeneza komórek somatycznych transgeneza ograniczyła cis-działające regiony kontrolne dla komórek rzęsatych do zaledwie zaledwie 484 par bazowych dla pvalb3a i 650 par bazowych dla pvalb3b. Używając zarówno zarówno za pomocą meganukleazy, jak i standardowych metod, wyprodukowaliśmy zwierzęta transgeniczne, które przekazują transgen przez swoje linie zarodkowe. Ryby te wyrażają GFP w komórkach w komórkach włosowatych ucha wewnętrznego i linii bocznej. Dwie stabilne linie transgeniczne wyrażają GFP przed utworzeniem wiązki włosów, więc powiązane konstrukty promotorowe są odpowiednie do manipulowania ekspresją genów podczas rozwoju wiązki. My dodatkowo zidentyfikowaliśmy linię transgeniczną, która oferuje zmienne znakowanie komórek komórek podporowych. --- Tworzenie zwierząt transgenicznych jest szeroko wykorzystywane w badaniach nad C. elegans w tym wykorzystanie białek fuzyjnych GFP do badania regulacji i ekspresji interesujących genów lub generowanie tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) znakowanych wersji określonych genów w celu ułatwienia ich oczyszczania. Zazwyczaj transgeny są generowane przez umieszczenie promotora przed genem reporterowym GFP lub cDNA, co często daje reprezentatywny wzór ekspresji. wzór ekspresji. Jednak krytyczne elementy regulacji genów, takie jak elementy kontrolne w regionie niepodlegającym translacji 3' lub alternatywne promotory, mogą zostać pominięte przez to podejście. podejście. Ponadto w ten sposób można zwykle badać tylko pojedynczy wariant splicingu. sposób. W przeciwieństwie do tego, użycie genomowego DNA robaka przenoszonego przez klony fosmidowego DNA prawdopodobnie obejmuje większość, jeśli nie wszystkie elementy zaangażowane w regulację genów in vivo co pozwala na większą zdolność do uchwycenia prawdziwego wzorca ekspresji i czasu. Aby ułatwić generowanie transgenów przy użyciu fosmidowego DNA, opisujemy procedurę rekombinacji opartą na E. coli w celu wstawienia GFP, znacznika TAP lub innych sekwencji do dowolnego miejsca w genie. Procedura wykorzystuje gen galK jako marker selekcyjny zarówno dla etapu selekcji pozytywnej, jak i negatywnej w rekombinacji, co skutkuje uzyskaniem pożądanej modyfikacji z wysoką wydajnością. wydajnością. Ponadto, plazmidy zawierające gen galK otoczony ramionami homologicznymi do powszechnie stosowanych genów fuzyjnych GFP i TAP, które zmniejszają koszt oligos o 50% podczas generowania oligos o 50% podczas generowania białka fuzyjnego GFP lub TAP. Plazmidy te wykorzystują replikacji R6K, co wyklucza potrzebę rozległego oczyszczania produktu PCR. oczyszczania. Wreszcie, demonstrujemy również technikę integracji markera unc-119 do szkieletu fosfidu, co pozwala na bezpośrednie wstrzyknięcie fosfidu lub bombardowanie robaków w celu wytworzenia zwierząt transgenicznych. Ten film demonstruje procedury związane z generowaniem transgenu poprzez rekombinację przy użyciu tej metody. metody. --- Zdolność do określenia poziomów ekspresji egzogennych genów wprowadzonych do genomów transgenicznych zwierząt genomów zwierząt transgenicznych ma kluczowe znaczenie dla powodzenia wielu różnych eksperymentalnych manipulacji. manipulacji eksperymentalnych. Produkcja białek może być regulowana na poziomie transkrypcji, transportu mRNA, okresu półtrwania mRNA lub wydajności translacji. W tym raporcie pokazujemy, że kilka dobrze scharakteryzowanych elementów sekwencji pochodzących z wirusów roślinnych i owadzich z wirusów roślinnych i owadzich jest w stanie funkcjonować u Drosophila w celu zwiększenia pozorną wydajność translacji mRNA nawet 20-krotnie. Te sprawiają, że poziomy ekspresji są wystarczające dla konstruktów genetycznych wcześniej wymagających wielu kopii, aby były skuteczne w pojedynczej kopii, w tym konstruktów wyrażających wrażliwy na temperaturę inaktywator funkcji neuronów Shibire(ts1), a także do wykorzystania cytoplazmatycznego GFP do obrazowania drobnych procesów neuronów. neuronów. --- Stabilna transgeneza genów kodujących białka funkcjonalne lub zlokalizowane przestrzennie białka, połączone z białkami fluorescencyjnymi, takimi jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) lub czerwone białko fluorescencyjne (RFP), jest niezwykle ważnym narzędziem badawczym w biologii komórek i rozwoju. biologii komórki i rozwoju. Organizmy transgeniczne skonstruowane z fluorescencyjnymi dla błon komórkowych, organelli subkomórkowych i funkcjonalnych białek. białek zostały wykorzystane do badania cykli komórkowych, linii, kształtów i u żywych zwierząt oraz w komórkach lub tkankach pochodzących od tych zwierząt. Interesujące geny zostały zintegrowane i utrzymane w pokoleniach transgenicznych zwierząt, które stały się zwierząt transgenicznych, które stały się cennym zasobem dla społeczności biologii komórkowej i biologii rozwoju. Chociaż wykorzystanie Xenopus laevis jako transgenicznego organizmu modelowego transgenicznego organizmu modelowego było utrudnione przez jego stosunkowo długi czas reprodukcji (w porównaniu do rozmnażania (w porównaniu do Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans), jego duże komórek embrionalnych i łatwość manipulacji na wczesnych embrionach sprawiły, że jest to historycznie cenny preparat, który nadal ma ogromny potencjał badawczy. potencjał badawczy. Poniżej przedstawiamy linie transgeniczne Xenopus laevis wygenerowane przez nasze laboratorium i omawiamy ich potencjalne zastosowanie w badaniach biologicznych. i omawiamy ich potencjalne zastosowanie w obrazowaniu biologicznym. --- Technologie transgeniczne konwencjonalnie opierają się na oocycie jako podłożu do modyfikacji modyfikacji genetycznej. Jednak ze względu na ich dostępność, męskie komórki rozrodcze, w tym dojrzałe plemniki, w tym dojrzałe plemniki, mają istotne zalety do wykorzystania w transgenezie. Tutaj wykorzystaliśmy lentiwirusy do generowania transgenicznych zwierząt poprzez męską linię zarodkową. męską linię zarodkową. Kiedy pseudotypowane wektory lentiwirusowe kodujące białko zielonej fluorescencji (GFP) inkubowano z plemnikami myszy, plemniki te były bardzo skuteczne w produkcji transgenów. Transdukowane lentiwirusowo plemniki myszy zostały wykorzystane w w badaniach zapłodnienia in vitro (IVF), a po transferze zarodków stwierdzono ≥ 42% założycieli było transgenicznych dla GFP. Odwrotna strategia PCR dla analiza miejsca integracji wykazała integrację co najmniej 1 lub 2 kopii GFP w transgenach, mapowanych na różne chromosomy. Ekspresja GFP została wykryto w szerokim zakresie tkanek mysich, w tym w jądrach, a transgen był stabilnie przekazywany do trzeciego pokolenia transgenicznych zwierząt. Ta stosunkowo prosta, ale wysoce wydajna technika generowania transgenicznych zwierząt poprzez transdukcję plemników wektorami lentiwirusowymi in vitro jest potężnym narzędziem do badania zapłodnienia/rozwoju przedimplantacyjnego, pionowej transmisji genów wirusowych, funkcji i regulacji genów oraz dziedziczenia epigenetycznego. dziedziczenia epigenetycznego. --- TŁO: Endogenne retrowirusy świń (PERV) stanowią zagrożenie dla ksenotransplantacji przy użyciu świńskich komórek, tkanek lub narządów, ponieważ są one zintegrowane z genomem świń i wykazano, że mogą infekować ludzkie komórki in vitro. komórki in vitro. Aby zwiększyć bezpieczeństwo wirusa poprzez interferencję RNA, transgeniczne świnie wyrażające specyficzną dla PERV małą spinkę do włosów (sh) RNA ukierunkowaną na wysoce konserwatywną sekwencję w genie pol (pol2), w którym ekspresja PERV była zmniejszona (Ksenotransplantacja (Xenotransplantation, 15, 2008, 38). Należy jednak wykazać, jak długo jak długo ekspresja shRNA i interferencja RNA jest skuteczna w zmniejszaniu ekspresji PERV. PERV. METODY: Aby przeanalizować długoterminowy czas trwania interferencji RNA, ekspresja specyficznego dla PERV pol2 shRNA i zahamowanie ekspresji PERV badano wielokrotnie w fibroblastach i komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) transgenicznych świń przez okres 3 lat, kiedy zwierzęta uśmiercano i badano ekspresję w różnych narządach. ekspresję badano w różnych narządach. Ekspresję specyficznego dla PERV shRNA mierzono przy użyciu nowo opracowanej metody PCR w czasie rzeczywistym, a ekspresję PERV mierzono za pomocą specyficznego dla PERV PCR w czasie rzeczywistym. WYNIKI: W okresie 3 lat, specyficzne dla PERV shRNA i zielone białko fluorescencyjne białko (GFP) jako reporter systemu wektorowego były konsekwentnie wyrażane u zwierząt transgenicznych. zwierzęta transgeniczne. Ekspresja PERV była znacznie zmniejszona przez cały przez cały okres. Poziomy ekspresji PERV i shRNA były różne w różnych narządach. narządach. Ekspresja PERV była najwyższa w śledzionie i płucach, a najniższa w wątrobie i sercu. wątrobie i sercu. Jednak we wszystkich narządach transgenicznych świń ekspresja PERV została zahamowana w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi wektora. WNIOSKI: Transgeniczne świnie wyrażające specyficzne dla PERV shRNA utrzymywały swoją specyficzną interferencję RNA, co sugeruje, że ekspresja PERV w ksenotransplantach ksenotransplantach będzie tłumiona przez dłuższy czas. --- Istnieje duże zainteresowanie wykorzystaniem zwierząt hodowlanych jako "bioreaktorów" do produkcji dużych ilości biofarmaceutyków. ilości biofarmaceutyków. Jednak niekontrolowana konstytutywna ekspresja obcych genów obcych genów powoduje poważne zaburzenia fizjologiczne u transgenicznych zwierząt. zwierząt transgenicznych. Celem tego badania było sprawdzenie wykonalności kontrolowanej ekspresji egzogennego genu u kurczaka. Zaprojektowano wektor retrowirusowy retrowirusowy został zaprojektowany do ekspresji GFP (zielonego białka fluorescencyjnego) i rtTA (reverse transaktywator kontrolowany tetracykliną) pod kontrolą wektora promotora indukowanego tetracykliną i promotora PGK (kinazy fosfoglicerynianowej), odpowiednio. Kurczęta założycielskie G0 zostały wyprodukowane przez zainfekowanie blastodermy świeżo złożonych jaj skoncentrowanym wektorem retrowirusowym. Karmienie kurcząt doksycykliną, pochodną tetracykliny, spowodowało emisję zielonego koloru ciała w świetle fluorescencyjnym. zielonego koloru ciała w świetle fluorescencyjnym i brak widocznych znaczących dysfunkcji fizjologicznych. Potwierdzono również udaną transmisję egzogennego genu w linii zarodkowej. została również potwierdzona. Ekspresja genu GFP powróciła do poziomów po usunięciu doksycykliny z diety. Wyniki wykazały, że system ekspresji indukowany tetracykliną u zwierząt transgenicznych może być obiecującym rozwiązaniem w celu zminimalizowania zaburzeń fizjologicznych spowodowanych przez transgen. przez transgen. --- TŁO: Białka fluorescencyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) są szeroko stosowane u zwierząt transgenicznych jako geny reporterowe. Ich zastosowanie w transgenicznych kijankach Xenopus jest szczególnie interesujące, ponieważ dużą liczbę żywych zwierząt można łatwo żywych zwierząt może być łatwo badana. Aby śledzić więcej niż jedno zdarzenie zwierzęciu, potrzebne są markery fluorescencyjne, które wyraźnie różnią się widmem emisji. spektrum emisji. WYNIKI: Stworzyliśmy transgeniczny szczep Xenopus laevis tom3, który wykazuje ekspresję wszechobecną czerwoną fluorescencję z genu tdTomato przez wszystkie stadia larwalne i u dorosłego osobnika. To nowe narzędzie zostało zastosowane do śledzenia przeszczepionych blastemy uzyskanej po amputacji ogona. Blastema może regenerować ektopowe ogony oznaczone czerwoną fluorescencją u zwierzęcia-gospodarza. Co zaskakujące, znaleźliśmy również udział zwierzęcia gospodarza w tworzeniu regeneratu. WNIOSEK: Stworzyliśmy nowe, przydatne narzędzie do znakowania przeszczepów w eksperymentach transplantacyjnych Xenopus eksperymentach transplantacyjnych. --- Odkąd po raz pierwszy z powodzeniem podjęto próbę transgenezy dużych zwierząt około 25 lat temu, technologia ta została zastosowana w różnych liniach transgenicznych świń. transgenicznych świń. Niemniej jednak jedna z obaw związanych z tą technologią - dobrostan zwierząt dobrostan zwierząt - nie został poddany systematycznej ocenie, a oświadczenia dotyczące dobrostanu transgenicznych świń opierały się na niepotwierdzonych obserwacjach na wczesnych etapach programów transgenicznych. Głównym celem było zatem przeprowadzenie szeroko zakrojonej oceny dobrostanu, porównując heterozygotycznych zwierząt transgenicznych wyrażających GFP ze zwierzętami typu dzikiego na różnych etapach rozwoju na różnych etapach rozwoju pourodzeniowego. Zastosowany protokół obejmował wydajność reprodukcyjną i zachowanie u loch GFP i dzikich oraz ogólny stan zdrowia i rozwój, zachowania społeczne, zachowania eksploracyjne i emocjonalność u miotów GFP i od urodzenia do wieku około 4 miesięcy. Brak znaczących różnic między zwierzętami GFP i dzikimi w obserwowanych parametrach sugeruje, że jest mało prawdopodobne, aby zwierzęta transgeniczne, o których mowa, cierpiały z powodu od szkodliwych skutków ekspresji transgenu na ich dobrostan, a tym samym wspierają istniejące niepotwierdzone obserwacje świń wyrażających GFP jako zdrowe. Chociaż wyniki nie są zaskakujące w świetle wcześniejszych doświadczeń, dają bardziej solidne podstawy do oceny ekspresji GFP jako względnie nieinwazyjnej stosunkowo nieinwazyjna u świń. Niniejsze badanie może ponadto służyć jako punkt wyjścia dla badaczy mających na celu systematyczną charakterystykę efektów istotnych dla dobrostanu w linii transgenicznych świń, z którymi pracują. --- W szczególności, zakodowane w genach sondy biologiczne służą jako stabilne i wysokowydajne narzędzia do wizualizacji losów komórek u żywych zwierząt. Szczur, podobnie jak szczur, podobnie jak mysz, stanowi ważny model zwierzęcy w badaniach biologicznych i medycznych. w badaniach biologicznych i medycznych, a także dostarczył wielu danych fizjologicznych i farmakologicznych. Zwierzęta o większych rozmiarach ciała, w porównaniu do myszy, pozwoliły na zastosowanie różnych manipulacji fizjologicznych i chirurgicznych, które mogą mieć znaczenie biologiczne. znaczenie biologiczne. Rozszerzyliśmy techniki inżynierii genetycznej inżynierii genetycznej na szczury, króliki i świnie, i stworzyliśmy odpowiednie zwierzęta transgeniczne zwierzęta transgeniczne GFP. Narządy GFP-dodatnie tych zwierząt zapewniają cenne czujniki w warunkach przedklinicznych dla terapii komórkowej i transplantacji i transplantacji. W tym rozdziale podkreślamy profile ekspresji u tych zwierząt i opisujemy przykłady zastosowań przedklinicznych. --- CEL: Zbadanie możliwości wykorzystania transgenicznego białka fluorescencyjnego pOBCol3.6GFPtpz [3.6-green (GFP)] jako modelu in vivo do badania biologicznej sekwencji zdarzeń podczas gojenia miazgi i reparacyjnej dentynogenezy. biologiczną sekwencję zdarzeń podczas gojenia miazgi i reparacyjnej dentynogenezy. METODOLOGIA: Obnażenia miazgi zostały utworzone w pierwszym trzonowcu szczęki u 12-16-tygodniowych myszy transgenicznych 3.6-GFP o podłożu genetycznym CD1 i C57/Bl6. Bezpośrednie pokrycie miazgi na odsłoniętych zębach wykonano przy użyciu trójtlenku minerału trójtlenku mineralnego, a następnie odbudowę światłoutwardzalnym systemem adhezyjnym (AS) i żywicą kompozytową. żywicą kompozytową. W zębach kontrolnych AS umieszczono w bezpośrednim kontakcie z miazgą. miazgą. Zwierzęta poddawano eutanazji w różnych punktach czasowych po obnażeniu i pokryciu miazgi. miazgi. Łuk szczęki został wyizolowany, utrwalony i poddany analizie histologicznej i analizy epifluorescencyjnej w celu zbadania reparacyjnej dentynogenezy. WYNIKI: Analiza zębów bezpośrednio po odsłonięciu miazgi wykazała brak odontoblastów wykazujących ekspresję 3.6-GFP w miejscu urazu. Dowody na reparacyjną dentynogenezy były widoczne po 4 tygodniach u myszy 3.6-GFP na tle CD1 i po 8 tygodniach u myszy 3.6-GFP na tle CD1. 8 tygodniach u myszy 3.6-GFP na tle C57/Bl6. Zębina reparacyjna w obu grupach w obu grupach zawierała nowo utworzoną zmineralizowaną tkankę atubularną przypominającą most zębinowy i/lub osteodentynę, która była wyścielona komórkami wykazującymi ekspresję 3.6-GFP, jak również jak również komórki wyrażające 3.6-GFP osadzone w macierzy atubularnej. WNIOSEK: Badanie to zostało przeprowadzone na kilku zwierzętach i nie pozwoliło na analizę statystyczną. analizę statystyczną. Wyniki wykazały, że zwierzęta transgeniczne 3.6-GFP stanowią unikalny model do bezpośredniej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych komórkowych i molekularnych mechanizmów naprawy miazgi i trzeciorzędowej dentynogenezy in vivo. Badanie pokazuje również wpływ materiału zamykającego i tła genetycznego myszy na sekwencję sekwencji i czasie reparacyjnej dentynogenezy.
Czy białko GFP było używane w transgenezie do obrazowania białek na żywo?
Tak, stabilna transgeneza genów kodujących funkcjonalne lub zlokalizowane przestrzennie białka, połączone z białkami fluorescencyjnymi, takimi jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) lub czerwone białko fluorescencyjne (RFP), jest niezwykle ważnym narzędziem badawczym w biologii komórki i rozwoju.