Wierność transmisji chromosomowej 4 (Ctf4) jest konserwatywnym białkiem wymaganym do replikacji DNA. W tym raporcie interakcje między ludzkim Ctf4 (hCtf4) a helikazą replikacyjną helikazą replikacyjną zawierającą cykl podziału komórki 45 (Cdc45)/minichromosome maintenance 2-7 (Mcm2-7)/Go, Ichi, Nii, and San (GINS) (CMG) [ludzki kompleks CMG (hCMG)]. Kompleks hCtf4-CMG został wyizolowany po interakcji in vitro oczyszczonych białek (hCtf4 plus kompleks hCMG), koinfekcji komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z wirusami wyrażającymi wirusami wyrażającymi kompleks hCMG i hCtf4 oraz z chromatyny komórek HeLa po etapach benzonazy i immunoprecypitacji. Stabilność kompleksu hCtf4-CMG zależy od interakcji między hCtf4 i wieloma składnikami kompleksu hCMG. hCMG. Kompleks hCtf4-CMG, podobnie jak kompleks hCMG, zawiera aktywność helikazy DNA która jest bardziej odporna na sól niż aktywność helikazy kompleksu hCMG. kompleksu hCMG. Wykazaliśmy, że kompleks hCtf4-CMG zawiera homodimeryczny hCtf4 i monomeryczny kompleks hCMG i sugerujemy, że homodimeryczny hCtf4 działa jako platforma łącząca polimerazę α z kompleksem hCMG. Rola kompleksu hCMG jako rdzenia replikomu jest również omawiana. --- Mutacje w genie ELG1 drożdży prowadzą do niestabilności genomowej, przejawiającej się w wysokim poziomem rekombinacji genetycznej, utratą chromosomów i dużymi rearanżacjami chromosomalnymi. rearanżacje chromosomalne. Elg1 wykazuje podobieństwo do dużej podjednostki klamry ładującej czynnika replikacji i tworzy kompleks podobny do RFC (RLC) w połączeniu z 4 małymi podjednostkami RFC. 4 małymi podjednostkami RFC. Dwa dodatkowe RLC istnieją w drożdżach: w jednym z nich dużą podjednostką jest duża podjednostka to Ctf18, a w drugiej Rad24. Ctf18 został scharakteryzowany jako RLC, który funkcjonuje w kohezji chromatyd siostrzanych. Tutaj przedstawiamy dowody że RLC Elg1 (ale nie Rad24) również odgrywa ważną rolę w tym procesie. Ekran genetyczny zidentyfikował podjednostkę kohezyny Mcd1 / Scc1 i jej ładowarkę Scc2 jako jako supresory syntetycznej letalności między elg1 i ctf4. Opisujemy interakcje genetyczne między ELG1 a genami kodującymi podjednostki kohezyny i ich białka pomocnicze. Pokazujemy również, że defekty w Elg1 prowadzą do wyższej przedwczesnej separacji chromatyd siostrzanych oraz że Ctf18 i Elg1 wpływają na kohezję poprzez wspólną ścieżkę wspólny szlak. Wreszcie, lokalizujemy zarówno Ctf18, jak i Elg1 w chromatynie i pokazujemy, że Elg1 odgrywa rolę w rekrutacji Ctf18. Nasze wyniki sugerują, że Elg1, Ctf4 i Ctf18 mogą koordynować względny ruch widełek replikacyjnych w odniesieniu do pierścienia kohezyny. --- Ctf4/AND-1 jest wysoce konserwatywnym produktem genowym wymaganym zarówno do replikacji DNA i ustanowienia kohezji chromatyd siostrzanych. W tym raporcie zbadaliśmy mechanizm działania ludzkiego Ctf4 (hCtf4) w replikacji DNA zarówno in vitro i in vivo. Nasze odkrycia pokazują, że oczyszczony hCtf4 istnieje jako dimer i że domena SepB hCtf4 prawdopodobnie odgrywa główną rolę w określaniu struktury dimerycznej. hCtf4 wiąże się preferencyjnie ze strukturami matrycowo-primerowymi DNA, oddziałuje bezpośrednio z replikacyjnymi polimerazami DNA (alfa, delta i epsilon) i znacząco stymuluje aktywność polimerazową polimeraz DNA alfa i epsilon in vitro. Zubożenie hCtf4 w komórkach HeLa przez małe RNA skutkowało zatrzymaniem fazy G(1)/S. Analiza włókien DNA ujawniła że komórki pozbawione hCtf4 wykazywały tempo replikacji DNA wolniejsze niż komórki traktowane kontrolnym małym interferującym RNA. Odkrycia te sugerują, że w ludzkich komórkach, hCtf4 odgrywa istotną rolę w replikacji DNA i jego zdolności do stymulowania replikacyjnych polimeraz DNA może przyczyniać się do tego efektu. --- Kohezja między chromatydami siostrzanymi, w której pośredniczy wielopodjednostkowy kompleks zwany kohezyna jest ustanawiana podczas replikacji DNA i jest niezbędna dla uporządkowanej segregacji chromatyd podczas anafazy. U pączkujących drożdży, wyspecjalizowany czynnik replikacyjny C o nazwie RF-C(Ctf18/Dcc1/Ctf8) i kompleks związane z polimerazą DNA alfa białko Ctf4 są wymagane do utrzymania spójności chromatyd siostrzanych w komórkach zatrzymanych na długi czas w mitozie. Pokazujemy tutaj, że CTF8, CTF4 i helikaza kodowana przez CHL1 są wymagane do wydajnej kohezji chromatyd siostrzanych w niezaburzonych komórkach mitotycznych i dostarczają dowodów na to, że że Chl1 funkcjonuje podczas fazy S. Pokazujemy również, że w przeciwieństwie do mitozy, RF-C(Ctf18/Dcc1/Cft8), Ctf4 i Chl1 są niezbędne do segregacji chromosomów podczas mejozy i dla żywotności produktów mejozy. Nasze odkrycie, że komórki usunięte dla CTF8, CTF4 lub CHL1 ulegają masowej mejozie II bez dysjunkcji sugeruje, że drugi podział mejotyczny jest szczególnie wrażliwy na defekty kohezji. defekty. Wykorzystując testy funkcjonalne i cytologiczne, wykazaliśmy, że CTF8, CHL1 i CTF4 są niezbędne dla kohezji między siostrzanymi centromerami podczas mejozy, ale są zbędne do wiązania kohezyny z centromerowym DNA. Nasze odkrycie, że mutanty ctf18 i dcc1 drożdży rozszczepkowych mają podobne defekty sugeruje, że zaangażowanie alternatywnego kompleksu RF-C(Ctf18/Dcc1/Ctf8) w kohezji chromatyd siostrzanych może być wysoce konserwatywny. --- Kohezja między chromatydami siostrzanymi, w której pośredniczy kompleks kohezyny chromosomalnej, jest warunkiem wstępnym dla ich wyrównania na aparacie wrzeciona i segregacji w mitozie. Kohezyna drożdży najpierw łączy się z chromosomami w fazie G1. Następnie, podczas replikacji DNA w fazie S, związana z widełkami replikacyjnymi acetylotransferaza Eco1 acetyluje podjednostkę kohezyny Smc3, aby uczynić wiązanie DNA kohezyny wiązanie odporne na destabilizację przez białko Wapl. Czy stabilizacja cząsteczek kohezyny, które łączą chromatydy siostrzane, jest wystarczająca do zbudować kohezję chromatyd siostrzanych, czy też wymagane są dodatkowe reakcje w celu nie są znane. Oprócz Eco1, kilka innych czynników przyczyniają się do ustanowienia kohezji, w tym Ctf4, Ctf18, Tof1, Csm3, Chl1 i Mrc1, ale niewiele wiadomo o ich roli. Tutaj pokazujemy, że każdy z tych czynników z tych czynników ułatwia acetylację kohezyny. Co więcej, brak Ctf4 i Chl1, ale nie innych czynników, powoduje syntetyczny defekt wzrostu w komórkach pozbawionych Eco1. W odróżnieniu od defektów acetylacji, kohezja chromatyd siostrzanych w ctf4Δ i chl1Δ nie jest poprawiana przez usunięcie Wapl. W przeciwieństwie do wcześniej myśleliśmy, nie znajdujemy dowodów na rolę Ctf4 i Chl1 w przetwarzaniu fragmentów Okazaki lub przetwarzania fragmentów Okazaki w kohezji chromatyd siostrzanych. Tak więc, Ctf4 i Chl1 wyznaczają dodatkową ścieżkę niezależną od acetylacji, która może zawierać ważne wskazówki dotyczące mechanizmu spójności chromatyd siostrzanych ustanowienie. --- Stwierdzono, że Ctf4p (wierność transmisji chromosomów) funkcjonuje w metabolizmie DNA i spójności chromatyd siostrzanych w Saccharomyces cerevisiae. W tym mutant ctf4(S143F) został wyizolowany z badania genetycznego drożdży w celu identyfikacji białek inicjujących replikację. białek inicjujących replikację. Mutant ctf4(S143F) wykazuje defekty utrzymania plazmidu, które mogą zostać zahamowane. defekty utrzymania plazmidu, które mogą być tłumione przez dodanie wielu genów do plazmidu, podobnie jak inne znane mutanty inicjacji replikacji. Pokazujemy, że zarówno szczepy ctf4(S143F), jak i ctf4Delta mają defekty w wejściu do fazy S i progresji fazy S w restrykcyjnej temperaturze. w restrykcyjnej temperaturze 38 stopni C. Ctf4p lokalizuje się w jądrze komórkowym przez cały okres życia komórki. w jądrze przez cały cykl komórkowy, ale zaczyna wiązać chromatynę tylko w przejściu G1/S, a następnie dysocjuje z chromatyny po replikacji DNA. Co więcej, Ctf4p oddziałuje z Mcm10p fizycznie i genetycznie, a asocjacja Ctf4p z chromatyną asocjacja Ctf4p z chromatyną zależy od Mcm10p. Wreszcie, delecja CTF4 destabilizuje Mcm10p i Pol alfa zarówno w komórkach mcm10-1, jak i MCM10. Dane te wskazują, że Ctf4p ułatwia Mcm10p promowanie replikacji DNA. --- Mutant utraty minichromosomu mcl1-1 drożdży rozszczepkowych został zidentyfikowany w badaniu przesiewowym dla mutantów wadliwych w segregacji chromosomów. Nieprawidłowa segregacja chromosomów chromosomów w komórkach mutanta mcl1-1 wynika ze zmniejszonej kohezji centromerowej między chromatydami siostrzanymi. między chromatydami siostrzanymi. mcl1+ koduje białko podobne do beta-transducyny z podobieństwem do rodziny podobieństwem do rodziny białek eukariotycznych, która obejmuje Ctf4p z Saccharomyces cerevisiae, sepB z Aspergillus nidulans i AND-1 od ludzi. Wcześniej zidentyfikowani grzybiczi członkowie tej rodziny białek również mają wady segregacji chromosomów, ale wpływają one głównie na metabolizm DNA. Chromosomy z komórek mcl1-1 były niejednorodne pod względem wielkości lub struktury na elektroforezy pulsacyjnej i miały wydłużone heterogeniczne telomery. mcl1-1 był letalny w połączeniu z mutacjami punktu kontrolnego DNA rad3delta i rad26delta, wykazując, że utrata funkcji Mcl1p prowadzi do uszkodzenia DNA. mcl1-1 wykazywał ostrą wrażliwość na uszkodzenia DNA, które wpływają na progresję fazy S progresję. Wchodzi w interakcje genetyczne ze składnikami replikacji i powoduje opóźnienie fazy opóźnienie fazy S w przypadku nadekspresji. Proponujemy, aby Mcl1p, podobnie jak Ctf4p, pełnił rolę w regulacji kompleksów replikacji DNA. --- Kompleks helikazy MCM2-7 jest ładowany na źródła replikacji DNA podczas fazy G1 cyklu komórkowego, aby licencjonować źródła replikacji w fazie S. Jak w jaki sposób inicjatorowy kompleks primaza-polimeraza, polimeraza DNA alfa (pol alfa), jest jest wciąż niejasny. Pokazujemy, że And-1/Ctf4 (Chromosome transmisja 4) oddziałuje z Mcm10, który wiąże się z MCM2-7 i z podjednostką p180 DNA pol alfa. And-1 jest niezbędny do syntezy DNA i stabilności p180 w komórkach ssaków. W ekstraktach z jaj Xenopus And-1 jest ładowany na chromatynę po Mcm10, jednocześnie z DNA pol alfa i jest wymagany do wydajnej syntezy DNA. Mcm10 jest wymagany do załadowania chromatyny And-1, a przeciwciało, które zakłóca interakcję Mcm10-And-1, zakłóca And-1 i pol alfa, hamując syntezę DNA. And-1/Ctf4 jest zatem nowym czynnikiem inicjacji replikacji, który łączy helikazę MCM2-7 helikazę i kompleks DNA pol alfa-prymaza, analogicznie do łącznika między helikazą i primazą lub helikazą i polimerazą, który jest widoczny w bakteryjnej replikacji bakteryjnej. Odkrycie to zwiększa również związek między inicjacją replikacji a kohezją chromatyd siostrzanych. --- U eukariontów aktywacja kompleksu przedreplikacyjnego i montaż aktywnego kompleksu odwijania aktywnego kompleksu odwijania DNA są krytycznymi, ale słabo poznanymi etapami wymaganymi do inicjacji replikacji DNA. W niniejszym raporcie wykorzystaliśmy dwucząsteczkowe testy komplementacji fluorescencji w komórkach HeLa w celu zbadania interakcji między Cdc45, Mcm2-7 i kompleksem GINS (zwanym łącznie kompleksem CMG ), które wydają się odgrywać kluczową rolę w tworzeniu i progresji widełek replikacyjnych. widełek replikacyjnych. Interakcje między komponentami CMG zaobserwowano tylko po przejściu G(1)/S cyklu komórkowego i zostały zniesione przez traktowanie komórek komórek inhibitorem CDK lub siRNA przeciwko kinazie Cdc7. Stabilne asocjacja CMG wymagała wszystkich trzech składników kompleksu CMG, jak również RecQL4, Ctf4/And-1 i Mcm10. Co zaskakujące, pozbawienie TopBP1, homologa Dpb11, który odgrywa istotną rolę w ładowaniu chromatyny Cdc45 i GINS w komórkach drożdży w komórkach drożdży, nie wpłynęło znacząco na tworzenie kompleksu CMG. Wyniki te sugerują, że białka zaangażowane w tworzenie kompleksów inicjacyjnych w komórkach ludzkie komórki mogą się nieco różnić od tych w systemach drożdżowych. --- Potencjalne czynniki pomocnicze replikacji DNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae zostały wcześniej zidentyfikowane na podstawie ich zdolności do wiązania się z matrycami powinowactwa białek polimerazy DNA polimerazy alfa (J. Miles i T. Formosa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1276-1280, 1992). Obecnie wykorzystaliśmy metody genetyczne do scharakteryzować gen kodujący jedną z tych polimeraz DNA wiążących alfa (POB1), aby określić, czy odgrywa on rolę w replikacji DNA in vivo. Odkryliśmy, że komórki drożdży pozbawione POB1 są żywotne, ale wykazują konstelację fenotypów wskazujących na wadliwy metabolizm DNA. fenotypów wskazujących na wadliwy metabolizm DNA. Populacje komórek pozbawionych POB1 gromadzą nienormalnie wysoką liczbę powiększonych komórek o dużych pęczkach z pojedynczym jądrem na szyjce pąka. Średnia zawartość DNA w populacji komórek pozbawionych POB1 jest przesunięta w kierunku wartości G2. Te dwa fenotypy wskazują, że podczas gdy większość replikacji DNA jest zakończona bez POB1, mitoza jest opóźniona. Usunięcie POB1 powoduje również podwyższony poziom utraty chromosomów i rekombinacji genetycznej. i rekombinacji genetycznej, zwiększa wrażliwość komórek na temperaturę ze zmutowanymi genami polimerazy DNA alfa, powoduje zwiększoną wrażliwość na promieniowanie UV promieniowanie UV w komórkach pozbawionych funkcjonalnego genu punktu kontrolnego RAD9 i powoduje zwiększone prawdopodobieństwo śmierci w komórkach niosących mutację w genie punktu kontrolnego MEC1 genie punktu kontrolnego. Sekwencja genu POB1 wskazuje, że jest on identyczny z genem gen CTF4 (CHL15) zidentyfikowany wcześniej w badaniach przesiewowych mutacji, które zmniejszają wierność transmisji chromosomów. Te fenotypy są zgodne z wadliwym metabolizmem DNA w komórkach pozbawionych POB1 i silnie sugerują, że to białko wiążące polimerazę DNA alfa odgrywa rolę w dokładnym powielaniu genomu in vivo. --- Ustanowienie i utrzymanie kohezji jest realizowane przez białka, które modyfikują aktywność kohezyny, niezbędnego kompleksu, który utrzymuje chromatydy siostrzane razem. Składniki widełek replikacyjnych, takie jak polimeraza DNA Ctf4, przyczyniają się do kohezji w sposób, który jest słabo poznany. słabo poznane. Aby zidentyfikować dodatkowe składniki kohezji, przeanalizowaliśmy syntetyczny ekran letalny ctf4Delta przeprowadzoną na mikromacierzach. Skupiliśmy się na podzbiorze ctf4Delta z własną niestabilnością genetyczną. Nasze analizy ujawniły, że 17 wcześniej badanych genów jest również niezbędnych do utrzymania silnej asocjacji sióstr w metafazie. Wśród nich były podjednostki kompleksu MRX, które tworzą strukturę molekularną podobną do kohezyny. Dalsze badania wykazały, że kompleks MRX nie przyczynia się do metafazy niezależnie od kohezyny, chociaż dodatkową rolę może odgrywać przez XRS2. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki badań przesiewowych wskazują na rolę kohezji chromatyd siostrzanych dla określonego podzbioru genów, które funkcjonują w replikacji i naprawie DNA. i naprawy DNA. Ten podzbiór jest szczególnie wzbogacony o geny, które wspierają punkt kontrolny fazy S. punkt kontrolny fazy S. Sugerujemy, że geny te promują i chronią chromatynę środowisko sprzyjające silnej kohezji. --- CTF4 i CTF18 są wymagane dla wysokiej wierności segregacji chromosomów. Oba wykazują genetyczne i fizyczne powiązania ze składnikami widełek replikacyjnych. Stwierdziliśmy, że brak CTF4 lub CTF18 powoduje niepowodzenie kohezji chromatyd siostrzanych i prowadzi do akumulacji komórek w preanafazie, która zależy od wrzeciona punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Fizyczne i genetyczne interakcje między CTF4, CTF18, i podstawowymi składnikami kompleksów widełek replikacyjnych obserwowanymi w tym badaniu i innych sugerują, że oba produkty genowe działają w połączeniu z widełkami replikacyjnymi widełek replikacyjnych, aby ułatwić kohezję chromatyd siostrzanych. Odkryliśmy, że Ctf18p, białko podobne do RFC1 bezpośrednio oddziałuje z Rfc2p, Rfc3p, Rfc4p i Rfc5p. Jednakże, Ctf18p nie jest składnikiem biochemicznie oczyszczonego antygenu jądrowego proliferujących komórek RF-C, co sugeruje obecność dyskretnego kompleksu zawierającego Ctf18p, Rfc2p, Rfc3p, Rfc4p i Rfc5p. Niedawna identyfikacja i charakterystyka polimerazy kappa drożdży pączkujących, kodowanej przez TRF4, silnie wspiera hipotezę hipotezę, że mechanizm replikacji DNA jest wymagany do prawidłowej kohezji chromatyd siostrzanych. kohezji chromatyd siostrzanych. Analogicznie do roli przełączania polimerazy w kompleksach bakteryjnych i ludzkich kompleksów RF-C, proponujemy, aby pączkujące drożdże RF-C (CTF18) mogły być zaangażowany w przełączanie polimerazy, które ułatwia spójność chromatyd siostrzanych. Wymóg CTF4 i CTF18 w silnej kohezji identyfikuje nowe role dla białek pomocniczych białek pomocniczych replikacji w tym procesie. --- Replikacja DNA w komórkach eukariotycznych jest ściśle regulowana, aby zapewnić wierne dziedziczenie materiału genetycznego. dziedziczenie materiału genetycznego. Podczas gdy replikatory, źródła replikacji i wiele białek inicjujących replikację w Saccharomyces cerevisiae zostały i wiele białek inicjujących replikację u Saccharomyces cerevisiae, szczegółowy mechanizm kontrolujący inicjację replikacji DNA wciąż nie jest dobrze poznany. Jest prawdopodobne, że że niektóre czynniki zaangażowane lub regulujące inicjację replikacji DNA nie zostały odkryte. nie zostały odkryte. Aby zidentyfikować nowe białka inicjujące replikację DNA i ich regulatory ich regulatorów, opracowaliśmy czuły i kompleksowy ekran fenotypowy łącząc kilka ustalonych strategii genetycznych, w tym testy utraty plazmidu testy z plazmidami zawierającymi pojedyncze lub wielokrotne źródła replikacji i testy sektorowania koloru kolonii. Wyizolowaliśmy dziesiątki mutantów w znanych wcześniej białkach inicjacyjnych białek inicjacyjnych i zidentyfikowaliśmy kilka nowych czynników, w tym Ctf1p, Ctf3p, Ctf4p, Ctf18p, Adk1p i Cdc60p, których mutanty tracą plazmid zawierający pojedyncze źródło replikacji replikacji w wysokim tempie, ale tracą plazmid zawierający wiele źródeł replikacji w niższym tempie. w niższym tempie. Pokazujemy również, że nadekspresja białek inicjacji replikacji białek inicjacji replikacji powoduje syntetyczną letalność dawki lub defekty wzrostu u mutantów ctf1 i ctf18 oraz że Ctf1p i Ctf18p fizycznie oddziałują z białkami ORC, Cdt1p i białkami MCM. Co więcej, zubożenie zarówno Ctf1p, jak i Ctf18p zapobiega wejściu w fazę S wejście w fazę S, opóźnia progresję fazy S i zmniejsza tworzenie pre-RC podczas przejścia M do G₁. Dane te sugerują, że Ctf1p i Ctf18p razem odgrywają ważną rolę w regulacji inicjacji replikacji DNA. --- Eukariotyczny replikosom jest kluczowym czynnikiem determinującym stabilność genomu, ale jego struktura jest wciąż słabo poznana. struktura jest wciąż słabo poznana. Wcześniej odkryliśmy, że wiele białek regulatorowych białek regulacyjnych gromadzi się wokół helikazy MCM2-7 w widełkach replikacyjnych drożdży, tworząc kompleks progresji replikomu (RPC), który może łączyć MCM2-7 z innymi składnikami replikomu. składnikami replikomu. Tutaj pokazujemy, że RPC wiąże się z polimerazą DNA alfa, która przygotowuje każdy fragment Okazaki podczas syntezy opóźnionej nici. Nasze dane wskazują, że kompleks składników GINS i Ctf4 RPC jest kluczowy dla połączenia MCM2-7 z polimerazą DNA alfa. Inni odkryli niedawno że podjednostka Mrc1 RPC wiąże polimerazę DNA epsilon, która syntetyzuje nić wiodącą w widełkach replikacyjnych DNA. Pokazujemy, że komórki pozbawione zarówno Ctf4 i Mrc1 doświadczają przewlekłej aktywacji punktu kontrolnego uszkodzeń DNA podczas replikacji chromosomu replikacji chromosomów i nie kończą cyklu komórkowego. Wyniki te wskazują, że sprzężenie MCM2-7 z polimerazami replikacyjnymi jest ważną cechą regulacji replikacji chromosomów u eukariontów i podkreśla kluczową rolę rolę Ctf4 w tym procesie. --- Dwie identyczne siostrzane kopie chromosomów eukariotycznych są syntetyzowane podczas fazy S . Aby ułatwić ich rozpoznanie jako pary do segregacji w mitozie, chromatydy siostrzane są utrzymywane razem od momentu ich syntezy przez kompleks kompleks kohezyny chromosomalnej. Uważa się, że progresja widełek replikacyjnych jest sprzężony z ustanowieniem kohezji chromatyd siostrzanych, ułatwiając identyfikację produktów replikacji, ale dowody na to pozostają poszlakowe. Tutaj pokazujemy, że trzy białka wymagane dla spójności chromatyd siostrzanych Eco1, Ctf4 i Ctf18, znajdują się na, a Ctf4 podróżuje wzdłuż chromosomów z widełkami replikacyjnymi. Kompleks kohezyny w kształcie pierścienia jest ładowany na chromosomy przed fazą S w reakcji zależnej od hydrolizy ATP. Ustanowienie kohezji podczas replikacji DNA następuje bez dalszej rekrutacji kohezyny i bez potrzeby ponownego angażowania przez kohezynę motywu hydrolizy ATP który jest krytyczny dla początkowego wiązania DNA. Dostarcza to dowodów na ustanowienia kohezji w kontekście widełek replikacyjnych i nakłada ograniczenia na zaangażowany mechanizm. --- Wykorzystaliśmy chromatografię powinowactwa polimerazy DNA alfa do identyfikacji czynników zaangażowanych w replikację eukariotycznego DNA u drożdży Saccharomyces cerevisiae. Dwa białka wiążące się z podjednostką katalityczną polimerazy DNA alfa (białko Pol1 ) są kodowane przez niezbędne geny CDC68/SPT16 i POB3. Wiązanie obu białek było zwiększone, gdy ekstrakty nie zawierały wcześniej scharakteryzowanego białka wiążącego polimerazę, Ctf4. Odkrycie to sugeruje, że Cdc68 i Pob3 mogą konkurować z Ctf4 o wiązanie z Pol1. Pol1 i Pob3 były koimmunoprecypitowane z ekstraktów z całych komórek z surowicą skierowaną przeciwko Cdc68, a Pol1 był immunoprecypitowany z ekstraktów całokomórkowych z surowicą odpornościową skierowaną przeciwko aminowemu końcowi Pob3, co sugeruje, że białka te mogą tworzyć kompleks in vivo. CDC68 oddziaływało również genetycznie z mutacjami POL1 i CTF4 maksymalna temperatura permisywna podwójnych mutantów była niższa niż w przypadku pojedynczego mutanta. dla pojedynczego mutanta. Nadekspresja Cdc68 w szczepie mutanta pol1 dramatycznie zmniejszyła żywotność komórek, co jest zgodne z tworzeniem lub lub modulacją niezbędnego kompleksu przez te białka in vivo. Mutacja w CDC68/SPT16 wcześniej wykazano, że powoduje plejotropowy wpływ na regulację transkrypcji (J. A. Prendergrast et al., Genetics 124:81-90, 1990; E. A. Malone et al., Mol. Cell. Biol. 11:5710-5717, 1991; A. Rowley et al., Mol. Cell. Biol. 11:5718-5726, 1991), ze spektrum fenotypów podobnych do tych powodowanych przez mutacje w genach do tych powodowanych przez mutacje w genach kodujących białka histonowe H2A i H2B (Malone et al., Mol. Cell. Biol. 11:5710-5717, 1991). Pokazujemy, że w niedozwolonej temperaturze mutanty cdc68-1 zatrzymują się jako niezbudowane komórki z zawartością DNA 1C DNA, co jest zgodne z możliwą rolą Cdc68 w przedproliferacyjnym etapie cyklu komórkowego. etapie cyklu komórkowego. Mutacja cdc68-1 powodowała podwyższone wskaźniki utraty fragmentów chromosomów, fenotyp charakterystyczny dla genów, których natywne produkty produkty są wymagane do prawidłowego metabolizmu DNA. Jednakże, mutacja ta nie wpływała na szybkość utraty lub rekombinacji dla dwóch nienaruszonych chromosomów, ani nie wpływ na zachowanie plazmidu o niskiej liczbie kopii. Wcześniej niescharakteryzowana sekwencja Pob3 ma znaczące podobieństwo sekwencji aminokwasów z białkiem podobnym do HMG1 pochodzącym od kręgowców. W oparciu o te wyniki i ponieważ Cdc68 został zaangażowany jako regulator struktury chromatyny, postulujemy że polimeraza alfa może wchodzić w interakcje z tymi białkami, aby uzyskać dostęp do swojej szablonu lub początków replikacji in vivo. --- Wydajna duplikacja genomu wymaga skoordynowanego działania helikazy i polimeraz DNA w widełkach replikacyjnych, aby uniknąć zatrzymania replikacji i wynikającej z tego niestabilności genomu. U eukariontów, fizyczne sprzężenie między helikazą a polimerazami DNA pozostaje słabo poznane. Tutaj definiujemy mechanizm molekularny, za pomocą którego białko Ctf4 drożdży łączy helikazę Cdc45-MCM-GINS (CMG) z polimerazą DNA α (Pol α) w obrębie replikonu. repliksomu. Wykorzystujemy krystalografię rentgenowską i mikroskopię elektronową, aby pokazać, że Ctf4 samoasocjuje w konstytutywnym trimerze w kształcie dysku. Trimeryzacja zależy od domeny β-propellerowej w karboksy-terminalnej połowie białka, która jest połączona z helikalnym przedłużeniem, które wystaje z jednej strony trimerycznego dysku. Co ważne, Pol α i helikaza CMG mają wspólny mechanizm interakcji z Ctf4. z Ctf4. Pokazujemy, że amino-końcowe ogony podjednostki katalitycznej Pol α i podjednostki Sld5 GINS zawierają konserwowany motyw wiążący Ctf4, który dokuje na odsłoniętym helikalnym przedłużeniu protomeru Ctf4 w obrębie trimeru. W związku z tym wykazujemy, że jeden trimer Ctf4 może wspierać wiązanie do trzech białek partnerskich, w tym jednoczesną asocjację zarówno z Pol α i GINS. Nasze odkrycia wskazują, że Ctf4 może wiązać dwie cząsteczki Pol α do jednej helikazie CMG w obrębie replikomu, zapewniając nowy model syntezy opóźnionej nici u eukariontów, który przypomina wyłaniający się model dla prostszego replikomu Escherichia coli. Zdolność Ctf4 do działania jako platforma dla wielowartościowych interakcji ilustruje mechanizm jednoczesnej rekrutacji czynników, które działają razem na rozwidleniu.
Jaka jest główna rola Ctf4 w replikacji DNA?
Sprzężenie MCM2-7 z polimerazami replikacyjnymi jest ważną cechą regulacji replikacji chromosomów u eukariontów i podkreśla kluczową rolę Ctf4 w tym procesieAnd-1/Ctf4 jest zatem nowym czynnikiem inicjacji replikacji, który łączy helikazę MCM2-7 i kompleks DNA pol alfa-primaza, analogicznie do łącznika między helikazą i primazą lub helikazą i polimerazą, który jest widoczny w bakteryjnej maszynerii replikacyjnej.