Deadenylacja to egzorybonukleolityczne skracanie eukariotycznych ogonów poli(A). Jest to często pierwszy i ograniczający szybkość etap rozpadu mRNA i wyciszenia translacji. wyciszania translacji. Proces ten jest katalizowany przez różnorodne deadenylazy, które zapewniają solidne i elastyczne środki do kontrolowania poziomów mRNA i ekspresji genów. Rybonukleaza specyficzna dla poli(A) (PARN) jest główną deadenylazą ssaków i jedyną znaną jedyną znaną z jednoczesnego wiązania 5' struktury czapeczki i 3' poli(A), w ten sposób zwiększając szybkość degradacji i wzmacniając jej procesywność. PARN jest ważny podczas dojrzewania oocytów, embriogenezy, wczesnego rozwoju, uszkodzenia DNA i w progresji cyklu komórkowego, ale także w procesach wykraczających poza metabolizm mRNA, takich jak dojrzewanie ale także w procesach wykraczających poza metabolizm mRNA, takich jak dojrzewanie snoRNA. Enzym ten uczestniczy również w nonsensownym rozpadzie mRNA oraz w regulacji cytoplazmatycznej poliadenylacji. cytoplazmatycznej poliadenylacji. Co ważne, PARN jest zaangażowany w degradację kilku genów związanych z rakiem. genów związanych z rakiem, podczas gdy jego ekspresja jest zmieniona w raku. Oprócz bezpośredniej interakcji ze strukturą czapeczki, kilka strategii reguluje aktywność PARN takich jak fosforylacja, interakcja z białkami wiążącymi RNA (RBP), i naturalnymi nukleotydami. Ostatnie badania koncentrowały się na regulacji aktywności przez syntetyczne analogi nukleozydów o potencjale terapeutycznym. W tym kontekście kontekście, szeroki repertuar RBP i cząsteczek, które regulują aktywność PARN, wraz z ustaloną rolą deadenylaz w regulacji ekspresji mRNA za pośrednictwem miRNA ekspresji mRNA, sugerują, że obrót mRNA jest bardziej złożony niż wcześniej sądzono niż wcześniej sądzono, a PARN odgrywa kluczową rolę w tym procesie. W niniejszym przeglądzie podkreślamy znaczenie PARN podczas cyklu życia RNA i omawiamy perspektywy kliniczne kliniczne perspektywy modulowania jej aktywności. --- Deadenylacja jest głównym etapem wyzwalania rozpadu mRNA i skutkuje zahamowaniem translacji mRNA w komórkach w komórkach eukariotycznych. Dlatego jest prawdopodobne, że deadenylacja indukuje również przebudowę mRNP wymaganą do tworzenia ciał GW lub ciał przetwarzających RNA (P-bodies), w których znajdują się wyciszone translacyjnie mRNP. wyciszone mRNP. W tym rozdziale omówimy kilka przykładów ilustrujących rolę deadenylacji w regulacji ekspresji genów. Podkreślamy kilka linii dowodów wskazujących, że nawet jeśli nieprzetłumaczalne mRNP mogą być przygotowane i / lub montowane w ciała P na różne sposoby, deadenylacja jest zawsze niezbędnym i być może najwcześniejszym etapem w szlakach rozpadu mRNA, które umożliwiają remodeling mRNP wymagany do tworzenia ciał P. Zatem deadenylacja i uczestniczące w niej deadenylazy nie są po prostu wymagane do przygotowania substratów mRNA substratów; odgrywają niezbędną rolę zarówno strukturalnie, jak i funkcjonalnie w tworzeniu i regulacji ciał P. --- Białka PUF to konserwatywna rodzina eukariotycznych białek wiążących RNA, które regulują określone mRNA: kontrolują wiele procesów, w tym proliferację komórek macierzystych proliferację komórek macierzystych, płodność i tworzenie pamięci. PUF hamują ekspresję białek z ich docelowych mRNA, ale mechanizm, dzięki któremu to robią, pozostaje niejasny, zwłaszcza u ludzi. Ludzie posiadają dwa białka PUF, PUM1 i PUM2, które wykazują podobną specyficzność wiązania RNA. Tutaj przedstawiamy nowy wgląd w ich aktywność regulacyjną i mechanizmy działania. Opracowaliśmy funkcjonalne testy do pomiaru represji specyficznej dla sekwencji przez PUM1 i PUM2. Oba silnie hamują translację i promują degradację mRNA. Oczyszczone kompleksy PUM zawierają podjednostki kompleksu CCR4-NOT (CNOT), który zawiera który zawiera wiele enzymów katalizujących deadenylację mRNA. PUM oddziałują z podjednostkami deadenylazy CNOT in vitro. Zastosowaliśmy trzy podejścia, aby określić znaczenie deadenylaz dla represji PUM. Po pierwsze, dominująco-ujemne mutanty CNOT7 i CNOT8 zmniejszały represję PUM. Po drugie, pozbawienie interferencji RNA deadenylaz złagodziło represję PUM. Po trzecie, ogon poli(A) był niezbędny do maksymalnej represji PUM. Odkrycia te pokazują zachowany mechanizm represji za pośrednictwem PUF poprzez bezpośrednią rekrutację deadenylazy CCR4-POP2-NOT prowadzącą do zahamowania translacji i degradacji mRNA. Drugi, mechanizm niezależny od deadenylazy został ujawniony przez odkrycie, że PUMs represjonują mRNA, któremu brakuje ogona poli(A). Zatem ludzkie PUM są represorami zdolnymi do represji zależnej i niezależnej od deadenylacji. --- Degradacja większości eukariotycznych mRNA jest inicjowana przez usunięcie ogona poli(A) a główna aktywność deadenylazy jest związana z kompleksem CCR4/CAF1/NOT (kompleks NOT). Badamy tutaj rolę CNOT10, białka występującego u ludzi i trypanosomów. w ludzkich i trypanosomowych, ale nie w drożdżowych kompleksach NOT. Trypanosom (Tb) CNOT10 jest niezbędne do wzrostu. TbCNOT10 oddziałuje z deadenylazą TbCAF1 i białkiem rusztowania TbNOT1; TbCAF1 oddziaływał również z TbNOT1 w teście dwuhybrydowym drożdży w teście dwuhybrydowym na drożdżach. Zarówno w trypanosomach, jak i ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych, około połowa CAF1 była związana z kompleksem NOT. Usunięcie CNOT10 z ludzkich komórek nie wpłynęło na to powiązanie. W przeciwieństwie do tego, zubożenie TbCNOT10 w trypanosomach spowodowało obniżenie poziomu TbNOT1, odłączenie TbCAF1 od kompleksu i wyraźną stabilizację większości mRNA trypanosomów. mRNA trypanosomów. Sztuczne uwiązanie TbCAF1 do reporterowego mRNA in vivo spowodowało degradację mRNA, co skutkowało degradację mRNA i nie miało na to wpływu zubożenie TbCNOT10. Wnioskujemy że u trypanosomów TbCNOT10 może stabilizować interakcję między TbCAF1 a kompleksem NOT. kompleksem NOT. Wyniki sugerują ponadto, że TbCAF1 jest w stanie jedynie deadenylować mRNA in vivo, jeśli jest rekrutowany do mRNA przez inne składniki kompleksu NOT przez inne składniki kompleksu NOT. --- Stabilność mRNA jest ważnym punktem w regulacji ekspresji genów u eukotów. ekspresji genów u eukariontów. Ścieżki obrotu mRNA zostały zidentyfikowane u drożdży i ssaków. Jednak szlaki obrotu mRNA u trypanosomów nie zostały szeroko badane. Deadenylacja jest pierwszym krokiem w głównych szlakach obrotu mRNA u drożdży i ssaków. Aby lepiej zrozumieć procesy degradacji mRNA w tych organizmach, opracowaliśmy system obrotu mRNA in vitro, który jest funkcjonalny dla deadenylacji. W tym systemie dodanie homopolimeru poli(A) aktywuje deadenylację ogonów poli(A). Aktywność deadenylazy trypanosomalnej jest egzonukleazą 3'-->5' specyficzną dla reszt adenylanowych, generuje 5'-AMP jako produkt, jest zależna od magnezu i jest hamowana przez siarczan neomycyny B siarczan neomycyny. Te cechy sugerują podobieństwo do innych eukariotycznych deadenylazami eukariotycznymi. Ponadto, aktywność ta jest niezależna od czapeczki, co wskazuje na potencjalną różnicę między aktywnością trypanosomalną a PARN, ale sugerującą podobieństwo do aktywności Ccr4p/Pop2p. Ekstrakty pozbawione immunodepletu Pab1p wymagały aby aktywować deadenylację. Trypanosomalny Pab1p działa jako inhibitor aktywności w warunkach in vitro. Pab1p wydaje się być jednym z kilku białek stabilizujących mRNA w ekstraktach trypanosomalnych. --- W organizmach eukariotycznych inicjacja obrotu mRNA jest kontrolowana przez stopniowe skracanie ogona poli-A, proces obejmujący kompleks mega-Dalton Kompleks Ccr4-Not i jego dwie związane egzonukleazy 3'-5', Ccr4p i Pop2p (Caf1p). Degradacja RNA przez egzonukleazę 3'-5' DEDDh, Pop2p, jest regulowana przez klasyczny mechanizm dwóch jonów metali, tradycyjnie zakładany jako zależny od jonów Mg(2+) związanych w miejscu aktywnym. Tutaj pokazujemy biochemicznie i strukturalnie, że Pop2p drożdży rozszczepialnych (Schizosaccharomyces pombe) preferuje Mn(2+) i Zn(2+) nad Mg(2+) w stężeniach jonów występujących wewnątrz komórek oraz że tożsamość jonów w miejscu aktywnym wpływa na aktywność enzymu. enzymu. Eksperymenty z zastępowaniem jonów sugerują ponadto, że deadenylacja mRNA może być subtelnie regulowana przez lokalne poziomy Zn(2+) w komórce. Wreszcie, używamy mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, aby zaproponować mechanistyczny model podstawy preferencji dla sekwencji poli-A wykazywanych przez deadenylazy typu Pop2p, jak również jak również ich dystrybucyjne zachowanie enzymatyczne. --- Większość rozpadu informacyjnego RNA (mRNA) w komórkach ssaków wydaje się być dziełem pracą serii egzorybonukleaz RNA. Zidentyfikowano zestaw wielu specyficznych dla poli(A) deadenylaz, z których niektóre, jeśli nie większość, prawdopodobnie odgrywają rolę w kluczowym pierwszym etapie rozpadu mRNA. odgrywają rolę w kluczowym pierwszym etapie obrotu mRNA - regulowanym skracaniu ogona ogona poli(A). Po deadenylacji transkrypt jest prawdopodobnie degradowany przez 5'-do-3' lub 3'-do-5' szlakiem egzonukleolitycznym. Co ciekawe, zidentyfikowano wiele egzonukleazy zostały zidentyfikowane dla obu tych szlaków, które wydają się tworzyć wieloskładnikowe kompleksy o różnych rolach w biologii komórkowej. Dlatego te enzymy wydają się być nie tylko ważnymi składnikami mechanizmu obrotu mRNA ale także mogą funkcjonować w sposób sieciowy w potranskrypcyjnej kontroli ekspresji genów. --- Deadenylacja jest głównym etapem wyzwalającym rozpad mRNA ssaków. Jedną z konsekwencji deadenylacji jest tworzenie nieulegających translacji kompleksów białkowych (mRNA) kompleksów białkowych (rybonukleoproteiny przekaźnikowe [mRNP]). Nieulegające translacji mRNP mogą gromadzić się w ciałach P, które zawierają czynniki zaangażowane w translację represję, odkapslowanie i degradację 5'-do-3'. Wykazaliśmy, że deadenylacja jest wymagana do tworzenia ciał P ssaków i rozpadu mRNA. My zidentyfikowaliśmy deadenylazy Pan2, Pan3 i Caf1 jako nowe składniki ciała P i pokazujemy, że że Pan3 pomaga rekrutować Pan2, Ccr4 i Caf1 do ciał P. Nokaut Pan3 powoduje redukcję ciał P i ma zróżnicowany wpływ na rozpad mRNA. Znokautowanie w dół Caf1 lub nadekspresja katalitycznie nieaktywnego mutanta Caf1 upośledza deadenylację i rozpad mRNA. Ciała P nie są wykrywane, gdy deadenylacja jest zablokowana i są przywracane po zwolnieniu blokady. Gdy deadenylacja jest upośledzona, tworzenie ciał P nie jest przywracalne, nawet gdy mRNA opuszcza pulę z puli translacyjnej. Wyniki te potwierdzają dynamiczną interakcję między deadenylacją, mRNP i tworzeniem ciał P w selektywnym rozpadzie mRNA ssaków. --- Deadenylacja eukariotycznego mRNA jest mechanizmem krytycznym dla funkcji mRNA poprzez wpływając na obrót mRNA i wydajność syntezy białek. Tutaj dokonujemy przeglądu rybonukleazy specyficznej dla poli(A) (PARN), która jest jedną z najlepiej scharakteryzowanych biochemicznie deadenylaz. najlepiej scharakteryzowanych deadenylaz. PARN jest wyjątkowa wśród obecnie znanych eukariotycznych nukleaz degradujących nukleaz degradujących poli(A), będąc jedyną deadenylazą, która ma zdolność do bezpośrednio oddziaływać podczas hydrolizy poli(A) zarówno ze strukturą m(7)G-cap i ogonem poli(A) mRNA. Krótko mówiąc, PARN jest dwuwartościowym jonem metalu jonami metali dwuwartościowych, specyficzną dla poli(A), procesywną i oddziałującą z czapeczką 3'-5' egzorybonukleazą która skutecznie degraduje ogony poli(A) eukariotycznych mRNA. Omawiamy szczegółowo szczegółowo mechanizmy rozpoznawania substratu, katalizy, allosteryzacji i procesywnego sposobu działania. Na podstawie dowodów biochemicznych i strukturalnych, przedstawiamy i omawiamy roboczy model działania PARN. Modele regulacji aktywności PARN przez czynniki trans-działające, jak również znaczenie fizjologiczne PARN. znaczenie PARN. --- Białka z rodziny CCR4 są 3'-5'-deadenylazami, które funkcjonują w pierwszym etapie degradacji poli(A) mRNA. Tutaj opisujemy oczyszczanie do jednorodności białka CCR4 drożdży i analizę jego substratu specyficzności. CCR4 deadenyluje substrat 7N+23A (siedem nukleotydów, a następnie przez 23 reszty A) w sposób dystrybucyjny. Tylko niewielkie różnice w aktywności CCR4 dla substratów o różnej długości A obserwowano do momentu, gdy pozostała tylko 1 reszta A. pozostała. Odpowiednio, K(m) dla substratu 25N+2A było co najmniej 20-krotnie niższe niż dla substratu 25N+2A. co najmniej 20-krotnie niższa niż dla substratu 26N + 1A, chociaż ich wartości V (max) różniły się tylko 2-krotnie. Ponadto stwierdzono, że całkowita długość RNA przyczynia się do aktywności CCR4: do 17 nukleotydów (niekoniecznie (niekoniecznie poli(A)) może być rozpoznawanych przez CCR4. Poli(U), poli(C) i poli(G) były również okazały się być 12-30 razy lepszymi inhibitorami CCR4 w porównaniu z poli(A), potwierdzając obserwację, że CCR4 zawiera niespecyficzne wiązanie poli(A) miejsce wiązania. Co zaskakujące, nawet dłuższe substraty (>/=45 nukleotydów) stymulowały CCR4 do stania się enzymem procesywnym, co sugeruje, że CCR4 przechodzi dodatkową transformację w obecności takich substratów. w obecności takich substratów. CCR4 nie wykazywał również różnicy w swojej aktywności z zamkniętymi lub nie zamkniętymi substratami RNA. Wyniki te wskazują że rozpoznawanie przez CCR4 substratów RNA wiąże się z kilkoma cechami RNA które mogą być miejscami in vivo do kontrolowania szybkości specyficznej deadenylacji mRNA. deadenylacji. --- PARN, Nocturnin i Angel to trzy z wielu deadenylaz, które zostały opisane w komórkach opisane w komórkach eukariotycznych. Podczas gdy każdy z tych enzymów wydaje się ogony poli(A) w celu skrócenia i wpływają na poziomy ekspresji genów RNA i kontrolę jakości i kontrolę jakości, enzymy te różnią się pod względem mechanizmów enzymatycznych, regulacji i wpływu biologicznego. Celem niniejszego przeglądu jest przedstawienie dogłębnej biochemicznej i biologicznej perspektywy PARN, Nocturnin i Angel deadenylaz. Zrozumienie wspólnych i unikalnych ról tych enzymów w biologii komórek w biologii komórki zapewni ważny wgląd w liczne aspekty posttranskrypcyjnej kontroli ekspresji genów. Ten artykuł jest częścią wydania specjalnego zatytułowanego: Mechanizmy rozpadu RNA. --- Deadenylacja mRNA jest często pierwszym i ograniczającym szybkość etapem rozpadu mRNA. PARN, specyficzna dla poli(A)-3' --> 5' rybonukleaza, która jest konserwowana w wielu eukariontów, została zaproponowana jako głównie odpowiedzialna za taką reakcję, jednak znaczenie funkcji PARN na poziomie całego organizmu nie zostało nie zostało wykazane u żadnego gatunku. Tutaj pokazujemy, że deadenylacja mRNA przez PARN jest niezbędna dla żywotności roślin wyższych (Arabidopsis thaliana). Jednak ten niezbędny wymóg dla funkcji PARN nie jest uniwersalny w całym spektrum filogenetycznym, ponieważ spektrum filogenetycznym, ponieważ PARN jest zbędny u grzybów (Schizosaccharomyces pombe) i może być co najmniej poważnie regulowany w dół bez żadnych oczywistych konsekwencji u Metazoa (Caenorhabditis elegans). Rozwój zarodków Arabidopsis zarodków Arabidopsis pozbawionych PARN (AtPARN), jak również tych wyrażających enzymatycznie enzymatycznie nieaktywne białko, był znacznie opóźniony i ostatecznie zakończył się zatrzymaniem na etapie zgiętego liścienia. Co ważne, tylko niektóre, a nie wszystkie, transkrypty specyficzne dla zarodka były hiperadenylowane w zmutowanych zarodkach, co sugeruje, że preferencyjna deadenylacja określonego, wybranego podzbioru mRNA, zamiast ogólnej deadenylacji całej populacji mRNA przez AtPARN jest jest niezbędna do embriogenezy u Arabidopsis. Odkrycia te wskazują na unikalną, nieredundantną rolę AtPARN wśród wielu roślinnych deadenylaz. --- TŁO / CELE: Degradacja mRNA jest kluczowym procesem w kontroli ekspresji genów skorelowanej z anomalną proliferacją komórek. ekspresji genów skorelowanym z anomalną proliferacją komórek. Etapem ograniczającym szybkość degradacji mRNA jest usunięcie ogona poli(A) przez deadenylazy. Jednakże, badania nad ekspresją deadenylaz w nowotworach są ograniczone. W niniejszym badaniu przeanalizowaliśmy ekspresję kilku deadenylaz z ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) i ostrej białaczki szpikowej. ostrej białaczki szpikowej (AML). METODY: Źródłem komórek białaczkowych były próbki kliniczne od pacjentów ze zdiagnozowaną ALL i AML. źródłem komórek białaczkowych. Ekstrakty z komórek białaczkowych i kontrolnych zostały przeanalizowane pod kątem poziomów mRNA deadenylazy przy użyciu qRT-PCR oraz poziomów białek PARN i CNOT7 przy użyciu immunoblottingu. WYNIKI: Analiza RT-PCR ujawniła zmienioną ekspresję deadenylaz CNOT6, CNOT6L, CNOT7 i deadenylaz PARN. Najbardziej znaczące zmiany zaobserwowano dla poziomów mRNA PARN i CNOT7, które odzwierciedlają również poziom białka kognitywnego. Dalsza analiza wykazała, że znaczna ilość PARN jest fosforylowana w ALL. WNIOSKI: Wykazaliśmy, że ekspresja kilku deadenylaz w ostrych białaczkach jest zmieniona. białaczkach jest zmieniona. Wzrost ekspresji PARN i zmiana jego stanu fosforylacji wskazują na ważne zdarzenia regulacyjne. fosforylacji wskazują na ważne zdarzenia regulacyjne. Dane te sugerują że rola deadenylaz jako pomocniczych biomarkerów i celów terapeutycznych powinny być skrupulatnie badane. --- Eukariotyczny czynnik uwalniający GSPT/eRF3 pośredniczy w rozpadzie mRNA sprzężonym z terminacją translacji poprzez interakcję z cytozolowym białkiem wiążącym poli(A) (PABPC1). mRNA poprzez interakcję z cytozolowym białkiem wiążącym poli(A) (PABPC1). A region eRF3 zawierający dwa nakładające się motywy PAM2 (PABPC1-interacting motif 2) zakłada się, że wiąże się z domeną PABC białka PABPC1, na ogonie poli(A) mRNA. Motywy PAM2 występują również w głównych deadenylazach Caf1-Ccr4 i Pan2-Pan3, których aktywność zwiększa się po związaniu PABPC1 z tymi motywami. Ich aktywność deadenylazy jest regulowana przez eRF3, w którym dwa nakładające się motywy PAM2 konkurencyjnie zapobiegają interakcji z PABPC1. Jednakże, nie jest nie jest jednak jasne, w jaki sposób te nakładające się motywy rozpoznają PABC i regulują aktywność deadenylazy w sposób sprzężony z terminacją translacji. Zastosowaliśmy podejście dominująco-ujemne podejście, aby wykazać, że N-końcowy motyw PAM2 jest krytyczny dla wiązania eRF3 z PABPC1 i że oba motywy są wymagane dla funkcji. Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) i analizy NMR ujawniły, że interakcja jest w równowadze między dwoma kompleksami PAM2-PABC, gdzie tylko jeden z dwóch nakładających się motywów PAM2 jest związany z PABC, a drugi jest PABC-niezwiązany i częściowo dostępny dla drugiego PABC. Na podstawie tych wyników, zaproponowaliśmy biologiczną rolę nakładających się motywów PAM2 w regulacji dostępności deadenylazy do PABPC1 na 3' końcu poli(A). --- Deadenylacja jest pierwszym i ograniczającym szybkość etapem podczas obrotu mRNA w eukariontów. U drożdży Saccharomyces cerevisiae zidentyfikowano dwie różne egzonukleazy 3'-5' egzonukleazy, Pop2p i Ccr4p, zostały zidentyfikowane w obrębie kompleksu Ccr4-NOT deadenylazy, należące do kompleksów DEDD i Exonuclease-Endonuclease-Phosphatase (EEP). Ngl3p został został zidentyfikowany jako nowy członek rodziny egzonukleaz EEP na podstawie homologii sekwencji homologii sekwencji, ale jego aktywność i rola biologiczna są obecnie nieznane. Tutaj pokazujemy przy użyciu testów deadenylacji in vitro na określonych gatunkach RNA naśladujących poli-A zawierające mRNA, że drożdżowa Ngl3p jest funkcjonalną egzonukleazą 3'-5' egzonukleazą najbardziej aktywną w warunkach lekko kwaśnych. Ponadto wykazaliśmy, że enzym zależy od dwuwartościowych jonów metali i posiada specyficzność wobec poli-A RNA podobną do tej, którą zaobserwowano dla komórkowych deadenylaz. Wyniki sugerują, że Ngl3p jest naturalnie zaangażowany w przetwarzanie poli-adenylowanego RNA i zapewniają wgląd w mechanistyczne różnice obserwowane wśród nadmiarowego zestawu enzymów EEP występujących u drożdży i wyższych eukariontów. --- Deadenylazy specyficznie katalizują degradację ogona poli(A) eukariotycznego mRNA w kierunku od 3 do 5 końca z uwolnieniem 5'-AMP jako produktu. w kierunku od 3'- do 5'-końca z uwolnieniem 5'-AMP jako produktu. Wśród rodziny deadenylaz, rybonukleaza specyficzna dla poli(A) (PARN) jest wyjątkowa pod względem skład domenowy, który zawiera trzy potencjalne domeny wiążące RNA: katalityczną domenę nukleazy domenę katalityczną nukleazy, domenę R3H i domenę RRM. W tym badaniu, zbadaliśmy rolę tych domen wiążących RNA, porównując cechy strukturalne cechy strukturalne i właściwości enzymatyczne mutantów pozbawionych jednej lub dwóch z trzech domen wiążących RNA. Wyniki wykazały, że domena R3H miała zdolność do wiązania różnych oligonukleotydów na poziomie mikromolarnym bez oligo(A). Usunięcie domeny R3H spowodowało dysocjację PARN na monomery, które nadal posiadały zdolność wiązania RNA i funkcje katalityczne. W przeciwieństwie do krytycznej roli domeny RRM w procesywności PARN, usunięcie domeny domeny R3H nie wpłynęło na wzór katalityczny PARN. Nasze wyniki sugerowały, że zarówno domeny R3H, jak i RRM były niezbędne dla wysokiego powinowactwa długiego substratu poli(A), ale domena R3H nie przyczyniała się do rozpoznawania substratu przez PARN. rozpoznawania substratu przez PARN. W porównaniu z domeną RRM, domena R3H odgrywała bardziej ważniejszą rolę w integralności strukturalnej dimerycznej PARN. Wielokrotna architektura Architektura domeny wiążącej RNA nadaje PARN właściwości wysoce wydajnej katalizy w trybie wysoce procesywnym. --- Białka PUF kontrolują ekspresję genów poprzez wiązanie się z regionami 3'-nietranslacyjnymi określonych mRNA i wyzwalanie rozpadu mRNA lub represji translacji. Tutaj skupić się na mechanizmie regulacji za pośrednictwem PUF. Białko PUF drożdży, Mpt5p, reguluje HO mRNA i stymuluje usuwanie jego ogona poli(A) (tj. deadenylację). Represja Mpt5p in vivo jest zależna od POP2, składnika cytoplazmatycznego kompleksu Ccr4p-Pop2p-Not, który deadenyluje mRNA. W tym badaniu, wyjaśniliśmy indywidualną rolę deadenylaz Ccr4p i Pop2p w deadenylazach regulowanych przez deadenylacji regulowanej przez Mpt5p. Zarówno in vivo, jak i in vitro, białka Pop2p i Ccr4p są wymagane do deadenylacji HO regulowanej przez Mpt5p. Jednakże wymagania dla tych dwóch białek różnią się dramatycznie: aktywność enzymatyczna Ccr4p jest niezbędna, podczas gdy aktywność Pop2p jest zbędna. Wnioskujemy, że Pop2p jest pomostem, przez który białko PUF rekrutuje enzym Ccr4p do docelowego mRNA, stymulując w ten sposób deadenylację. Nasze dane sugerują, że białka PUF mogą zwiększać degradację mRNA i hamować ekspresję zarówno poprzez mechanizmy zależne i niezależne od deadenylacji, wykorzystując ten sam mostek Pop2p do rekrutacji wielofunkcyjnego kompleksu Pop2p do mRNA.
Jaka jest rola deadenylaz w komórce?
Ogon 3'-poli(A), znajdujący się na mRNA, jest enzymatycznie skracany w procesie określanym jako "deadenylacja", który jest przeprowadzany przez deadenylazy. Deadenylazy są zależnymi od magnezu egzorybonukleazami, które specyficznie katalizują degradację ogona poli(A) eukariotycznego mRNA w kierunku 3'-->5' z uwolnieniem 5'-AMP jako produktu. Składają się z trzech potencjalnych domen wiążących RNA: domeny katalitycznej nukleazy, domeny R3H i domeny RRM.