Ssaki wykazują ekspresję kwasów sialowych N-acetyloneuraminowego (Neu5Ac) i kwas N-glikoliloneuraminowy (Neu5Gc) na powierzchni komórek, gdzie działają jako receptory dla patogenów, w tym wirusa grypy typu A (IAV). Neu5Gc jest syntetyzowany z Neu5Ac przez enzym hydroksylazę kwasu N-acetyloneuraminowego monofosforanu cytydyny (CMAH). U ludzi enzym ten jest nieaktywny i produkowany jest tylko Neu5Ac. Fretki są podatne na adaptowane przez ludzi szczepy IAV i były dominującym zwierzęcym modelem dominującym modelem zwierzęcym w badaniach nad IAV. Tutaj pokazujemy, że fretki, podobnie jak ludzie, nie syntetyzują Neu5Gc. Analiza genomu ujawnia starożytną delecję dziewięciu eksonów w genie CMAH fretki. CMAH, która jest wspólna dla członków Pinnipedia i Musteloidia z Carnivora. Carnivora. Interakcje między dwoma ludzkimi szczepami IAV z receptorem sialilaktozy (kwas sialowy--α2,6Gal) potwierdzają, że rodzaj końcowego kwasu sialowego znacząco przyczynia się do specyficzności receptora IAV. Nasze wyniki wskazują, że wyłączna ekspresja Neu5Ac przyczynia się do podatności fretek na szczepy IAV przystosowane do ludzi. --- Kwas N-glikoliloneuraminowy (Neu5Gc) jest nieludzkim kwasem sialowym, który może odgrywać znaczącą rolę w patologiach u ludzi, takich jak rak i choroby naczyniowe. Dalsze badania nad rolą Neu5Gc w chorobach człowieka są utrudnione przez ograniczone źródła tego węglowodanu. źródła tego węglowodanu. Stosując podejście chemo-enzymatyczne, Neu5Gc został w sześciu etapach z glukozy. Synteza umożliwia szybki i ekonomiczny dostęp do ilości szybko i ekonomicznie oraz produkuje Neu5Gc w lepszej jakości niż źródła komercyjne. Wreszcie, wykazujemy, że zsyntetyzowany Neu5Gc może być do glikokaliksu komórek ludzkich, które naturalnie nie syntetyzują tego cukru. naturalnie nie syntetyzują tego cukru. Synteza wytwarza Neu5Gc odpowiedni do stosowania in vitro lub in in vivo. --- Niektóre zwierzęce wirusy grypy typu A (IAV) wiążą się nie tylko z kwasem N-acetyloneuraminowym (Neu5Ac), ale także z kwasem N-glikoliloneuraminowym (Neu5Gc), który został omówiony jako receptor wirusa. omawiany jako receptor wirusa. Ludzkie komórki nie mogą syntetyzować Neu5Gc z powodu dysfunkcji genu hydroksylazy CMP-Neu5Ac (CMAH), który przekształca CMP-Neu5Ac do CMP-Neu5Gc. Jednak egzogenna Neu5Gc ze źródeł dietetycznych bogatych w Neu5Gc jest w stanie może być metabolicznie włączony do powierzchni komórek tkankowych i może być związane ze zwiększeniem zakaźności i nasilenia IAV. Tutaj zbadaliśmy funkcję receptora Neu5Gc na infekcję IAV w komórkach wykazujących ekspresję Neu5Gc poprzez transfekcję małpiego genu CMAH do ludzkich komórek lub przez inkubację z ludzkimi komórkami w obecności N-glikolilomannozy. Ekspresja Neu5Gc na ludzkich komórkach wyraźnie tłumiła infekcyjność IAV, które posiadają zdolność wiązania Neu5Gc. Ponadto, nie było różnicy w zakaźności wirusa transfekującego, który zawierał gen HA typu dzikiego od A/Memphis/1/1971 (H3N2), który nie wykazuje wiązania Neu5Gc, między macierzystymi komórkami MCF7 a komórkami stabilnie wyrażającymi małpi gen CMAH (komórki CMAH-MCF7). Z drugiej strony z drugiej strony, wejście do komórek wirusa transfekującego, który zawierał gen HA wiążący Neu5Gc z pojedynczą mutacją do Tyr w pozycji Thr155 był zatrzymane na etapie internalizacji z błony plazmatycznej komórek komórek CMAH-MCF7. Wyniki te wskazują, że ekspresja Neu5Gc na powierzchni ludzkich komórek nabłonkowych ludzkich komórek nabłonkowych hamuje infekcję IAV, które posiadają zdolność wiązania Neu5Gc zdolność wiązania. Sugeruje się, że Neu5Gc działa jako receptor wabika dla IAV wiążących Neu5Gc, ale nie funkcjonalny receptor dla infekcji IAV. WAŻNOŚĆ: Wirusy grypy typu A (IAV) wiążą się z powierzchnią komórek gospodarza poprzez kwasy sialowe na końcach glikokoniugatów. W przypadku wiązania IAV z kwasami sialowymi kwasami sialowymi, niektóre IAV wiążą się nie tylko z kwasem N-acetyloneuraminowym (Neu5Ac) jako receptorem ale także z kwasem N-glikoliloneuraminowym (Neu5Gc). Neu5Gc został omówiony jako receptor jako receptor ludzkich i zwierzęcych IAV. Nasze wyniki wykazały, że ekspresja Neu5Gc na ludzkich komórkach nabłonkowych hamuje infekcję IAV, które posiadają zdolność wiązania Neu5Gc zdolność. Sugeruje się, że Neu5Gc jest "receptorem wabika" IAV wiążącym Neu5Gc, ale ale nie funkcjonalnym receptorem dla infekcji IAV. Komórki ludzkie nie mogą syntetyzować Neu5Gc z powodu dysfunkcji hydroksylazy kwasu CMP-N-acetyloneuraminowego ale mogą egzogennie i metabolicznie włączać Neu5Gc ze źródeł dietetycznych. źródeł. Ekspresja Neu5Gc na ludzkich komórkach nabłonkowych poprzez przyjmowanie egzogennej Neu5Gc ze źródeł diety bogatych w Neu5Gc może być związana z ograniczeniem infekcji IAV, które nabyły zdolność wiązania Neu5Gc. --- TŁO: Ludzie są genetycznie wadliwi w syntezie powszechnego kwasu sialowego ssaków kwas sialowy ssaków kwas N-glikoliloneuraminowy (Neu5Gc), ale może metabolicznie włączyć go ze źródeł dietetycznych (zwłaszcza czerwonego mięsa i mleka) do glikoprotein i glikolipidów ludzkich guzów, płodów i niektórych normalnych tkanek. Metaboliczna inkorporacja Neu5Gc z komórek pochodzenia zwierzęcego i składników pożywki powoduje również zmienne zanieczyszczenie cząsteczek i komórek przeznaczonych do terapii ludzi. Te zjawiska inkorporacji Neu5Gc są praktycznie istotne, ponieważ normalni ludzie mogą mieć wysoki poziom krążących przeciwciał anty-Neu5Gc. W związku z tym istnieje potrzeba czułego i specyficznego wykrywania Neu5Gc w tkankach ludzkich i produktach bioterapeutycznych. W przeciwieństwie do przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają Neu5Gc tylko w kontekście struktury, przeciwciała poliklonalne immunoglobuliny Y (IgY) kurczaka mogą rozpoznawać Neu5Gc w szerszym kontekście. Jednak wcześniejsze preparaty takich przeciwciała (w tym nasze własne) cierpiały z powodu pewnej niespecyficzności, a także pewna reaktywność krzyżowa z ludzkim kwasem sialowym N-acetyloneuraminowym (Neu5Ac). METODOLOGIA/GŁÓWNE WNIOSKI: Opracowaliśmy nową metodę powinowactwa wykorzystującą sekwencyjne kolumny unieruchomionej surowicy ludzkiej i szympansiej sialoglikoproteiny, a następnie specyficzną elucję z tej ostatniej kolumny przez wolne Neu5Gc. Powstałe monospecyficzne przeciwciało nie wykazuje barwienia w tkankach lub komórkach myszy komórkach myszy z ludzkim defektem produkcji Neu5Gc. Pozwala to na czułe i specyficzne wykrywanie Neu5Gc we wszystkich badanych kontekstach strukturalnych glikanu. kontekstach strukturalnych glikanu i ma zastosowanie do immunohistochemicznego, enzymatycznego immunosorbentu (ELISA), Western blot i analiz cytometrii przepływowej. Nieimmunologiczna kurza IgY jest stosowana jako wiarygodna kontrola negatywna. Pokazujemy, że te podejścia pozwalają na czułe wykrywanie Neu5Gc w próbkach tkanek ludzkich i w niektórych produktach bioterapeutycznych, a na koniec pokazujemy przykład tego, jak Neu5Gc może być z takich produktów, przy użyciu ludzkiej linii komórkowej hodowanej w określonych warunkach. warunkach. WNIOSKI: Przedstawiamy niezawodną metodę opartą na przeciwciałach do wysoce czułego i specyficznego wykrywania nieludzkiego kwasu sialowego Neu5Gc w ludzkich tkankach i produktach bioterapeutycznych. produktach bioterapeutycznych, która nie została wcześniej opisana. --- Ostatnio pojawiły się obawy, że linie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych (HESC) hodowane przy użyciu obecnie dostępnych metod mogą mieć ograniczoną przydatność kliniczną ze względu na immunogenność nieludzkiego kwasu sialowego Neu5Gc włączonego do do ich błon podczas hodowli. Uważamy, że ta obawa ma niewielkie znaczenie dla protokołów różnicowania neuronalnego z B27/N2/noggin z powodu stopniowego spadek Neu5Gc do mniej niż 1% w różnicujących się komórkach po przejściu na pożywkę B27/N2. --- Znane są ludzkie przeciwciała heterofilne, które aglutynują erytrocyty zwierzęce. wykrywają nieludzki kwas sialowy N-glikoliloneuraminowy (Neu5Gc). Ten monosacharyd nie może sam wypełnić miejsca wiązania (paratopu) przeciwciała i może być również modyfikowany i prezentowany w różnych wiązaniach, na różnych glikanach. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że ludzkie przeciwciało anty-Neu5Gc jest zróżnicowana i poliklonalna. Tutaj używamy nowego zestawu naturalnych i chemoenzymatycznie syntetyzowanych glikanów. chemoenzymatycznie syntetyzowanych glikanów, aby pokazać, że normalni ludzie mają obfite i zróżnicowane spektrum takich przeciwciał anty-Neu5Gc, skierowanych przeciwko różnych epitopów zawierających Neu5Gc. Wysoką czułość i specyficzność testów zostały osiągnięte przy użyciu sond zawierających kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac) (różniących się od Neu5Gc o jeden atom tlenu mniej) jako optymalnych kontroli tła. Najczęstsze przeciwciała anty-Neu5Gc należą do klasy IgG. Ponadto zakres reaktywności i klasy Ig przeciwciał różnią się znacznie u normalnych ludzi, przy czym niektóre osoby mają niezwykle duże ilości, nawet przewyższające poziomy niektórych dobrze znanych naturalnych grup krwi i przeciwciał ksenoreaktywnych. Oczyściliśmy Te przeciwciała anty-Neu5Gc z poszczególnych ludzkich surowic przy użyciu nowo opracowanej metody powinowactwa powinowactwa i wykazaliśmy, że wiążą się one z tkankami myszy typu dzikiego, ale nie z niedoborem Neu5Gc. tkanek myszy. Co więcej, wiążą się one z powrotem z ludzkimi rakami, które nagromadziły Neu5Gc in vivo. Ponieważ Neu5Gc w diecie znajduje się głównie w czerwonym mięsie i produktach produktach mlecznych, sugerujemy, że ta trwająca reakcja antygen-przeciwciało może generować przewlekły stan zapalny, prawdopodobnie przyczyniając się do wysokiej częstotliwości raka związanego z dietą i innych chorób u ludzi. --- Biologia ludzkich kwasów sialowych jest niezwykła i uważa się, że jest unikalna wśród ssaków. Ludziom brakuje funkcjonalnego monofosforanu cytydyny - kwasu N-acetyloneuraminowego hydroksylazy (CMAH) i nie mogą syntetyzować cukru Neu5Gc, wrodzonego sygnału "ja" ssaków. wrodzony sygnał ssaków o sobie. Utrata tego cukru zmieniła sposób interakcji ludzi z niektóre z naszych najbardziej śmiercionośnych patogenów: między innymi malaria, grypa i paciorkowce. innymi. Pokazujemy, że małpy z Nowego Świata, obejmujące jedną trzecią wszystkich gatunków naczelnych gatunków naczelnych, mają biologię kwasu sialowego podobną do ludzkiej. Straciły one Neu5Gc z powodu niezależnej inaktywacji CMAH ~30 milionów lat temu (mya) (w porównaniu do ~3 mya u hominidów). Ta równoległa utrata Neu5Gc otwiera biologię kwasów sialowych na porównawczą analizę filogenetyczną i ujawnia nieoczekiwany priorytet ochrony priorytet. Małpy z Nowego Świata są narażone na infekcje ludzkimi patogenami, które mogą rozpoznać komórki pod nieobecność Neu5Gc. Ta uderzająca konwergencja molekularna zapewnia mechanizm mechanizm, który może wyjaśnić długotrwałą obserwację, że małpy z Nowego Świata są podatne na niektóre ludzkie choroby, które nie mogą być przenoszone na inne naczelne. inne naczelne. --- Kwas N-glikoliloneuraminowy (Neu5Gc) jest immunogennym cukrem pochodzenia pokarmowego. który metabolicznie łączy się w różne natywne glikokoniugaty u ludzi. Przeciwciała anty-Neu5Gc są wykrywane we wszystkich ludzkich surowicach, choć ze zmiennymi poziomy i profile rozpoznawania epitopów. Przeciwciała te prawdopodobnie odgrywają rolę w patologiach, w tym chorobach układu krążenia i nowotworach. raka. W raku pełnią one dualistyczne i przeciwstawne role, stymulując lub hamujące chorobę, w zależności od ich dawki, a niektóre z tych przeciwciał służą jako biomarkery raka. Zatem przeciwciała anty-Neu5Gc mogą oznaczać ryzyko chorób chorób, w których pośredniczy stan zapalny, a zmiany ich poziomów mogą być potencjalnie wykorzystane do monitorowania progresji choroby i/lub odpowiedzi na terapię. Obecnie trudno jest trudno jest określić poziom przeciwciał anty-Neu5Gc w poszczególnych ludzkich ponieważ przeciwciała te rozpoznają wiele epitopów Neu5Gc. Poniżej opisujemy prostą i specyficzną metodę wykrywania i ogólnej oceny ludzkich przeciwciał anty-Neu5Gc. Wykorzystujemy różnicę między dwoma modelami myszy które różnią się tylko obecnością Neu5Gc (typ dziki) lub brakiem Neu5Gc (Cmah(-/-) knockout). Scharakteryzowaliśmy surowicę myszy z obu szczepów za pomocą HPLC, lektyny i analizę spektrometrii masowej i pokazujemy docelowe epitopy Neu5Gc. Następnie używamy surowic z nokautem Cmah(-/-) w celu zahamowania wszystkich reaktywności innych niż Neu5Gc, a następnie wiązania z surowicami typu dzikiego w celu wykrycia ogólnej odpowiedzi anty-Neu5Gc w pojedynczym teście. My zastosowaliśmy tę metodologię do scharakteryzowania i ilościowego określenia IgG i IgA anty-Neu5Gc w surowicy pacjentów z chorobą Kawasaki (KD) na różnych etapach w porównaniu do grupą kontrolną. KD jest ostrą chorobą gorączkową wieku dziecięcego charakteryzującą się zapaleniem tętnic wieńcowych, które nieleczone może prowadzić do tętniaków tętnic wieńcowych z ryzyko zakrzepicy i zawału mięśnia sercowego. Ta szacowana odpowiedź jest porównywalna ze średnią szczegółowego profilu IgG anty-Neu5Gc analizowanego przez mikromacierz sialoglikanów mikromacierzy sialoglikanowej. Oba testy wykazały podwyższoną odpowiedź u pacjentów z ostrą KD z prawidłowymi naczyniami wieńcowymi w porównaniu z pacjentami z tętniakiem lub poszerzonymi naczyniami wieńcowymi. wieńcowych. Omówiono implikacje tych ustaleń.
Dlaczego ludzie nie mogą syntetyzować Neu5Gc (kwasu N-glikoliloneuraminowego)?
Kwas N-glikoliloneuraminowy (Neu5Gc) jest kwasem sialowym syntetyzowanym przez zwierzęta, ale nie przez ludzi i ptaki. Ludziom brakuje funkcjonalnego białka hydroksylazy kwasu N-acetyloneuraminowego (CMAH) monofosforanu cytydyny i nie mogą syntetyzować cukru Neu5Gc, wrodzonego sygnału ssaków. Utrata tego cukru zmieniła sposób, w jaki ludzie wchodzą w interakcje z niektórymi z naszych najbardziej śmiercionośnych patogenów: między innymi malarią, grypą i paciorkowcami.