Kompleks rozpoznawania miejsca pochodzenia (ORC) określa lokalizację miejsca pochodzenia replikacji. Kompleks Saccharomyces cerevisiae ORC rozpoznaje sekwencję konsensusu ARS (autonomically replicating sekwencję konsensusową (ACS), ale tylko podzbiór potencjalnych miejsc genomowych są wiązane, co sugeruje, że inne cechy chromosomalne wpływają na wiązanie ORC. Wykorzystując sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości do mapowania wiązania ORC i pozycjonowania nukleosomów, my pokazujemy, że genomy drożdży charakteryzują się asymetrycznym wzorem pozycjonowanych nukleosomów nukleosomów flankujących ACS. Sekwencje pochodzenia są wystarczające do utrzymania wolne od nukleosomów; jednak ORC jest wymagane do precyzyjnego pozycjonowania nukleosomów flankujących pochodzenie. Odkrycia te identyfikują lokalne nukleosomy jako ważną determinantę selekcji i funkcji pochodzenia. --- Okrągły dupleks DNA zawierający początek replikacji SV40 został złożony w chromosomy chromosomy in vitro z histonami rdzenia i czynnikiem składania nukleosomów z komórek HeLa z komórek HeLa. Ich zdolność do służenia jako matryca do replikacji została zbadana przez inkubując je z antygenem SV40 T i ekstraktem z komórek HeLa. Montaż nukleosomu szablonu zapobiegało replikacji DNA. Replikacja chromosomów była poważnie zahamowana przy ponad dwóch trzecich fizjologicznej gęstości nukleosomów. Kiedy DNA było preinkubowane z antygenem T, a następnie łączone w chromosomy w chromosomy, hamowanie replikacji DNA było znacznie zmniejszone. Te wyniki sugerują, że montaż nukleosomu matrycy hamuje inicjację replikacji DNA inicjację replikacji DNA SV40 i że hamowanie to można przezwyciężyć poprzez utworzenie kompleksu kompleksu inicjacyjnego przed złożeniem nukleosomu. --- Mapowanie w skali genomu białek kompleksu przedreplikacyjnego nie zostało zgłoszone w komórkach ssaków. Słabe wzbogacenie tych białek w określonych miejscach może być z powodu rozproszonego wiązania, słabej dostępności epitopu lub wiązania specyficznego dla etapu cyklu komórkowego. wiązania. Tutaj zmapowaliśmy miejsca wiązania znakowanych biotyną białek ORC i MCM w zsynchronizowanych populacjach G1 komórek chomika chińskiego zawierających amplifikowane kopie kopie locus reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), przy użyciu powinowactwa awidyny oczyszczanie biotynylowanej chromatyny, a następnie mikromacierz o wysokiej gęstości w locus DHFR. Zidentyfikowaliśmy kilka miejsc znaczącego wzbogacenia dla obu kompleksów rozmieszczonych w całej wcześniej zidentyfikowanej strefie inicjacji. Analiza częstotliwości inicjacji w rozciągniętych włóknach DNA z locus DHFR potwierdziła istnienie szerokiej strefy zdelokalizowanej aktywności inicjacyjnej otaczającej miejsca wzbogacenia ORC i MCM. Mapowanie pozycji mononukleosomalnego DNA empirycznie i obliczając informacje o położeniu nukleosomów in silico ujawniły, że ORC i MCM mapują regiony o niskiej zmierzonej i przewidywanej nukleosomów. Nasze wyniki pokazują, że specyficzne miejsca wzbogacenia ORC i MCM i MCM można wykryć w strefie inicjacji ssaków i sugerują, że strefy inicjacji mogą być regionami o ogólnie niskim obłożeniu nukleosomów, gdzie elastyczne pozycjonowanie nukleosomów pozwala na elastyczne miejsca montażu pre-RC. --- Rozmieszczenie początków replikacji DNA (ORI) na chromosomach eukariotycznych jest nielosowe, ale przyczyny tego nie są dobrze poznane. Poprzednie badania sugerowały znaczącą rolę aktywności transkrypcyjnej w określaniu organizacji ORI. ORI. Tutaj identyfikujemy obłożenie nukleosomów jako prawdopodobnego kandydata do ustalenia dystrybucji ORI. Łącząc dane z całego genomu dotyczące pozycjonowania nukleosomów i organizacji ORI u drożdży i ludzi, wykazujemy, że otwarte domeny chromatyny domeny, charakteryzujące się zubożeniem nukleosomów, są preferencyjnie permisywne dla replikacji. dla replikacji. Jednakże, w przeciwieństwie do wcześniejszych twierdzeń, wpływ aktywności transkrypcyjnej jest znacznie słabszy niż wcześniej proponowano i może być częściowo wyjaśniony przez nasz model wykluczenia nukleosomów. Proponujemy, aby ORI narzucona przez pozycjonowanie nukleosomów jest filogenetycznie filogenetycznie powszechna u eukariontów.
Czy nukleosomy są umiejscowione w początkach replikacji DNA?
Nie, początki replikacji występują w regionach wolnych od nukleosomów zarówno u pączkujących drożdży, jak i u Drosophila. Otwarte domeny chromatyny, charakteryzujące się zubożeniem nukleosomów, są preferencyjnie permisywne dla replikacji.