Podejścia terapeutyczne oparte na transferze genów w znacznym stopniu skorzystały z zdolność niektórych wektorów wirusowych do skutecznej integracji w genomie komórki i zapewnienia trwałej transmisji nowo nabytych transgenów do potomstwa komórek docelowych. komórek docelowych. Integracja prowirusa wiąże się jednak z reperkusjami reperkusjami epigenetycznymi, które mogą wpływać na ekspresję zarówno transgenu i genów komórkowych w pobliżu loci integracji wektora. Wykorzystanie genetycznych elementów izolatora może przezwyciężyć oba problemy poprzez ich zdolność do działania jako barier, które ograniczają wyciszanie transgenu i/lub jako blokery enhancerów zapobiegające aktywacji endogennych genów przez enhancer wektora. Stworzyliśmy ilościowe systemy testowe oparte na plazmidzie do badań przesiewowych wzmacniacza-blokera i bariery elementy genetyczne. Krótkie syntetyczne izolatory, które wiążą się z czynnikami transkrypcyjnymi z rodziny czynnika jądrowego I czynniki transkrypcyjne z rodziny białek zostały zidentyfikowane, aby wywierać zarówno funkcje wzmacniacza-blokera i bariery, i porównano je z miejscami wiązania dla białka izolatora CTCF (czynnik wiążący CCCTC). Wektory gamma-retrowirusowe otaczające te elementy izolatora zostały wyprodukowane w mianach podobnych do ich nieizolowanych odpowiedników i okazały się mniej genotoksyczne w teście immortalizacji in vitro w teście immortalizacji in vitro, dając niższą aktywację ekspresji onkogenu Evi1 i zmniejszoną ekspansję klonalną komórek szpiku kostnego. --- Wyciszanie i wariacja z efektem pozycji (PE) (PEV), która jest spowodowana integracji wektorów wirusowych w regionach heterochromatyny, są uważane za znaczące przeszkody w uzyskaniu spójnego poziomu ekspresji transgenu w terapii genowej. w terapii genowej. Włączenie izolatorów chromatyny do wektorów zostało aby przeciwdziałać tej zależnej od pozycji zmienności ekspresji transgenu. ekspresji transgenu. Tutaj pokazujemy, że izolator chromatyny jeżowca, sns5, chroni rekombinowany wektor gamma-retrowirusowy przed negatywnym wpływem chromatyny w środowisku erytroidalnym. Element ten zwiększa prawdopodobieństwo ekspresji wektora ekspresji wektora w różnych chromosomalnych miejscach integracji, co zmniejsza zarówno wyciszanie i PEV. Za pomocą analizy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) wykazaliśmy specyficzne wiązanie czynników transkrypcyjnych GATA1 i OCT1 oraz wzbogacenie hiperacetylowanych nukleosomów do sekwencji sns5. Wyniki sugerują, że ten nowy izolator jest w stanie utrzymać stan euchromatyny wewnątrz locus prowirusa za pomocą mechanizmów, które są wspólne dla innych scharakteryzowanych izolatorów. izolatorów. Na podstawie jego zdolności do funkcjonowania jako element barierowy w środowisku erytroidalnym i wiązania specyficznego dla erytroidów czynnika GATA1, włączenie izolatora izolatora sns5 w wektorach wirusowych może przynieść praktyczne korzyści w transferze genów a w szczególności w terapii genowej zaburzeń erytroidalnych. --- Wcześniej opisaliśmy rozwój wektorów onkoretrowirusowych dla ludzkiej gamma-globiny gamma-globiny przy użyciu skróconego promotora beta-globiny, zmodyfikowanej kasety gamma-globiny zmodyfikowaną kasetę gamma-globiny i enhancer alfa-globiny. Jednak jeden z tych wektorów jest genetycznie niestabilny, a oba wektory wykazują zmienne wzorce ekspresji w hodowanych komórkach. hodowanych komórkach, wspólne cechy wektorów onkoretrowirusowych dla genów globiny. genów globiny. Aby rozwiązać te problemy, zidentyfikowaliśmy i usunęliśmy sekwencje wektora odpowiedzialne za niestabilność genetyczną i otoczyliśmy powstały wektor genem izolatorem chromatynowym HS4 kurzej beta-globiny w celu ochrony ekspresji przed efektów pozycji chromosomalnej. Po ustaleniu, że flankowanie elementem cHS4 umożliwiło wyższe, bardziej jednolite poziomy ekspresji gamma-globiny w liniach komórkowych MEL przetestowaliśmy te wektory przy użyciu mysiego modelu transdukcji i transplantacji szpiku kostnego. model transplantacji. Gdy były obecne, kasety gamma-globiny z wektorów nieizolowanych wektorów ulegały ekspresji w zaledwie 2% do 5% czerwonych krwinek (RBC) wskazując, że są one bardzo wrażliwe na wyciszanie epigenetyczne. Natomiast natomiast, gdy była obecna, kaseta gamma-globiny z izolowanego wektora była ulegała ekspresji w 49% +/- 20% RBC przez długi czas. Analiza ochrony przed RNazą wykazała że izolowana kaseta gamma-globiny ulegała ekspresji w 23% +/- 16% na kopię mysiej alfa-globiny w transdukowanych RBC. Wyniki te pokazują, że flankowanie wektora globiny izolatorem cHS4 zwiększa prawdopodobieństwo ekspresji prawie 10-krotnie, co z kolei pozwala na ekspresję gamma-globiny zbliżając się do zakresu terapeutycznego dla niedokrwistości sierpowatokrwinkowej i talasemii beta. --- Mutageneza insercyjna pojawiła się jako główna przeszkoda dla terapii genowej opartej na wektorach na wektorach, które integrują się losowo w genomie. Zmniejszenie genotoksyczności genomowej integracji wirusowej można, w pierwszym przybliżeniu, utożsamić ze zmniejszeniem ryzyka aktywacji ryzyka aktywacji onkogenów, przynajmniej w przypadku ładunków terapeutycznych które nie mają znanego potencjału onkogennego, takich jak geny globiny. Atrakcyjne atrakcyjnym rozwiązaniem problemu aktywacji onkogenów jest włączenie izolatorów/blokerów wzmacniaczy w wektorach wirusowych. W tym badaniu wykorzystaliśmy Recombinase-Mediated Cassette Exchange, aby scharakteryzować efekt integracji kaset terapeutycznych globiny. kaset terapeutycznych globiny w obecności lub nieobecności kurczaka HS4 i trzech innych domniemanych izolatorów wstawionych w pobliżu Stil, Tal1 i MAP17, trzech dobrze znanych protoonkogenów komórkowych w locus SCL/Tal1. Pokazujemy, że wstawienie terapeutycznego transgenu globiny sterowanego regionem kontroli locus miało dramatyczny wpływ aktywujący na Tal1 i Map17, dwa najbliższe geny, niewielki wpływ na Stil i brak niewielki wpływ na Stil i brak wpływu na Cyp4x1, gen bez ekspresji. Spośród czterech testowanych elementów, cHS4 był jedynym, który był w stanie powstrzymać tę cHS4 miał silny efekt supresyjny na aktywację ekspresji transkrypcji. supresyjny wpływ na aktywację ekspresji Map17, ale ma niewielki lub żaden wpływ na ekspresję Tal1. Aktywność supresyjna cHS4 jest zatem specyficzna dla promotora. Co ważne, obserwowany efekt supresyjny cHS4 na aktywację Map17 nie zależał od jego interkalacji między LCR a promotorem Map17 promotorem. Obecność jednej lub dwóch kopii cHS4 w dowolnym miejscu transgenu była wystarczająca do prawie całkowitego zablokowania aktywacji Map17. W związku z tym, w tym złożonym locus, tłumienie transgenowej insercyjnej aktywacji transkrypcyjnej przez cHS4 było wystarczające. aktywacja transkrypcyjna przez cHS4 nie może być odpowiednio wyjaśniona przez modele które przewidują, że cHS4 może tłumić ekspresję tylko poprzez blokowanie wzmacniacza aktywność, która wymaga interkalacji między enhancerem a promotorem. Ma to ma ważne implikacje dla naszego teoretycznego zrozumienia możliwych wpływu insercji cHS4 na wektory terapii genowej. Pokazujemy również, że cHS4 obniżył poziom ekspresji transgenu globiny. Dlatego też korzyści z częściowego zapobiegania aktywacji genów insercyjnych są częściowo negowane przez niższy poziom ekspresji transgenu. Analiza kosztów i korzyści użyteczności włączenia izolatorów do wektorów terapii genowej będzie wymagać dalszych badań, w których wpływ izolatorów zarówno na gen terapeutyczny terapeutyczny, jak i geny flankujące są określane w dużej liczbie miejsc integracji. Identyfikacja izolatorów o minimalnej specyficzności promotora również miałaby dużą wartość. dużą wartość. --- Terapeutyczne zastosowanie rekombinowanych retrowirusów i innych integrujących wektorów transferu genów wektorów transferu genów było ograniczone przez problemy związane z ekspresją wektora i jego genotoksycznością. genotoksyczności wektora. Problemy te wynikają w dużej mierze z interakcji między sekwencjami wektora a środowiskiem genomowym otaczającym miejsca integracji. miejsca integracji. Poczyniono postępy w przezwyciężaniu obu tych poprzez modyfikację szkodliwych sekwencji wektora, włączenie lepszych wzmacniaczy i promotorów. lepszych wzmacniaczy i promotorów oraz wykorzystanie alternatywnych systemów wirusowych. Jednakże, modyfikacje te często dodają inne ograniczenia w projektowaniu wektorów, co z kolei może jeszcze bardziej ograniczyć zastosowania terapeutyczne. Jako alternatywa, kilka grup badało klasę elementów regulacyjnych DNA znanych jako izolatory chromatyny. jako izolatory chromatyny. Elementy te zapewniają możliwość blokowania interakcji między wektorem integrującym a genomem komórki docelowej w sposób który jest niezależny od transgenu wektora, elementów regulatorowych lub wirusa wirusa. Niniejszy przegląd przedstawia tło, uzasadnienie i dowody na stosowanie izolatorów chromatyny w celu poprawy ekspresji i bezpieczeństwa wektorów transferu genów. wektorów transferu genów. Dokonano również przeglądu czynników topologicznych, które ograniczają wykorzystanie izolatorów w integrujących wektorach transferu genów, alternatywne źródła izolatorów oraz rola izolatorów chromatynowych jako jednego z kilku składników dla optymalnego projektu wektora. --- Niedawne przypadki rozwoju białaczki u pacjentów z X-SCID po skutecznym leczeniu choroby za pomocą retrowirusowej terapii genowej wzbudziły obawy dotyczące dotyczące bezpieczeństwa stosowania wektorów retrowirusowych w klinicznej terapii genowej. W niniejszym przeglądzie podjęliśmy próbę ponownej oceny kwestii bezpieczeństwa związanych ze stosowaniem wektorów retrowirusowych w klinicznej terapii genowej. wektorów retrowirusowych w badaniach klinicznych na ludziach i zasugerować możliwe odpowiednie rozwiązania tych kwestii. Jak ujawnił incydent X-SCID, onkogeneza spowodowana retrowirusową insercyjną aktywacją genów gospodarza jest jednym z najważniejszych zagrożeń. najbardziej widocznych zagrożeń. Ostatecznym rozwiązaniem tego problemu będzie przeprojektowanie wektorów retrowirusowych tak, aby insercja retrowirusowa miała miejsce tylko w pożądanych, specyficznych miejscach chromosomu komórki gospodarza. Jest to jednak to jednak wymagające technicznie zadanie, a opracowanie wektorów retrowirusowych z ukierunkowanymi insercjami zajmie lata. wektorów retrowirusowych z możliwością ukierunkowanej insercji. W międzyczasie zastosowanie izolatorów chromatyny może zmniejszyć szanse na onkogenezę za pośrednictwem retrowirusów poprzez hamowanie niespecyficznej aktywacji pobliskich protoonkogenów komórkowych. Ko-transdukcja samobójczego genu pod kontrolą indukowalnego promotora może być również jedną z ważnych cech bezpieczeństwa, ponieważ zniszczenie ponieważ zniszczenie transdukowanych komórek może zostać uruchomione w przypadku zaobserwowania nieprawidłowego wzrostu. Dodatkowo, warunkowa ekspresja transgenu tylko w odpowiednich komórkach docelowych poprzez kombinację połączenie ukierunkowanej transdukcji, ekspresji specyficznej dla typu komórki i podawania miejscowego zwiększy ogólne bezpieczeństwo systemów retrowirusowych. systemów retrowirusowych. Wreszcie, podział genomu wirusowego, zastosowanie samoaktywujących się wektorów retrowirusowych (SIN) wektorów retrowirusowych lub całkowite usunięcie sekwencji kodujących dla genów gag, pol, i env jest pożądane, aby praktycznie wyeliminować możliwość generowania retrowirusów zdolnych do replikacji (RCR). --- Izolatory chromatyny oddzielają aktywne domeny transkrypcyjne i blokują rozprzestrzenianie się heterochromatyny w genomie. Badania nad nadwrażliwym elementem miejscu-4 (cHS4), prototypowym izolatorze, zidentyfikowały motywy CTCF i USF-1/2 w proksymalnych 250 bp elementu cHS4, określanych jako "rdzeń", które zapewniają aktywność blokującą enhancer aktywność blokującą i zmniejszają efekty pozycji. Jednak sam rdzeń nie skutecznie izoluje wektory wirusowe. Pełnej długości cHS4 ma doskonałe właściwości izolacyjne, ale jego duży rozmiar poważnie obniża miano wektora. My przeprowadziliśmy analizę struktura-funkcja cHS4 flankującego wektory lentiwirusowe i przeanalizowaliśmy ekspresję transgenu w klonalnym potomstwie hematopoetycznych komórek macierzystych oraz zmiany epigenetyczne w cHS4 i promotorze transgenu. Stwierdziliśmy, że zmniejszył tylko klonalną zmienność ekspresji. Unikalna aktywność izolatora w dystalnych sekwencjach 400 bp cHS4, które w połączeniu z rdzeniem rdzeniem, przywracały pełną aktywność izolatora i otwarte znaczniki chromatyny nad promotorem transgenu i izolatorem. Dane te potwierdzają znaną aktywność izolacyjną kanonicznego rdzenia 5' z nowym elementem 3' 400 bp o właściwościach podobnych do rdzenia. Razem mają doskonałe właściwości izolacyjne właściwości izolacyjne i miana wirusów. Nasze dane mają ważne implikacje w zrozumieniu molekularnych podstaw funkcji izolatora i projektowaniu wektorów do terapii genowej. wektorów do terapii genowej. --- Integracja i stabilna ekspresja transgenu w genomie komórkowym pozostają głównymi wyzwaniami dla terapii opartych na genach i celów bioprodukcji. głównymi wyzwaniami dla terapii opartych na genach i dla celów bioprodukcji. Podczas gdy wektory transpozonowe pośredniczą w skutecznej integracji transgenu, ekspresja może być ograniczona przez wyciszanie epigenetyczne, a utrzymująca się ekspresja transpozazy może pośredniczyć w wielu cyklach transpozycji. Tutaj oceniliśmy dostarczanie RNA transpozazy piggyBac w połączeniu z genetycznie izolowanymi transpozonami transpozonami w celu odizolowania transgenu od sąsiednich elementów regulatorowych i ustabilizować ekspresję. Porównanie ekspresji transpozazy piggyBac z wektorów RNA i wektorów DNA pod względem poziomów ekspresji, wydajności transpozycji, ekspresji transgenu i efektów genotoksycznych, w celu aby skalibrować i zabezpieczyć system dostarczania oparty na transpozycji. Komunikacyjny RNA zmniejszyło trwałość transpozazy do wąskiego okna, zmniejszając w ten sposób efekty uboczne, takie jak zbędne rozszczepienie genomowego DNA. Zarówno izolatory CTF/NF1, jak i D4Z4 pośredniczyły w bardziej wydajnej ekspresji z kilku zdarzeń transpozycji. zdarzeń transpozycji. Wnioskujemy, że zastosowanie zmodyfikowanego mRNA transpozazy piggyBac mRNA transpozazy i izolowanych transpozonów oferuje obiecujące sposoby poprawy jakości procesu integracji i podtrzymania ekspresji wektorów transpozonowych. wektorów transpozonowych. --- Szeroko zakrojone badania nad terapią genową w modelach przedklinicznych i w badaniach klinicznych podkreślają względne bezpieczeństwo wektorów onkoretrowirusowych. Do niedawna nie zgłaszano żadnych działań niepożądanych u prawie 2000 pacjentów, którzy zostali włączeni do badań klinicznych w badaniach klinicznych terapii genowej z udziałem wektorów onkoretrowirusowych. Jednakże bezpieczeństwa stosowania wektorów onko-retrowirusowych jest związane z ryzykiem złośliwej transformacji po aktywacji onkogenu z powodu przypadkowego przypadkowej integracji genomu onko-retrowirusowego. W oparciu o badania na naczelnych, istnieje pozornie niskie ryzyko wystąpienia nowotworu złośliwego, które jest głównie związane z występowaniem przewlekłej retrowiremii wynikającej z retrowirusów zdolnych do replikacji retrowirusów (RCR), szczególnie u biorców poddanych immunosupresji. Jednakże, w najnowszych pakujących liniach komórkowych i wektorach ryzyko generowania RCR zostało drastycznie zmniejszone, głównie dzięki zostało drastycznie zmniejszone, głównie poprzez zminimalizowanie homologicznego nakładania się sekwencji wektora i sekwencji pomocniczych. Niemniej jednak, wyniki ostatnich badań przedklinicznych badania na myszach i badania klinicznego u pacjentów cierpiących na SCID-X1 silnie sugerują, że wektory onkoretrowirusowe pozbawione RCR mogą przyczyniać się do limfomagenezy poprzez insercyjną aktywację onkogenów komórkowych. Ryzyko ryzyko nieumyślnego przeniesienia wektorów onko-retrowirusowych do linii zarodkowej wydaje się być niskie, szczególnie w stosunku do endogennego wskaźnika insercji do linii zarodkowej, który jak wiadomo występuje naturalnie w populacji ludzkiej poprzez przenoszenie endogennych retrotranspozonów. retro-transpozonów. Ścisła zależność transferu genów onko-retrowirusowych od podziału komórek jest ważną zaletą bezpieczeństwa, która znacznie ogranicza ryzyko transmisji horyzontalnej. Ponieważ ulepszone wektory onko-retrowirusowe lub protokoły protokoły transdukcji mogą skutkować zwiększoną liczbą integracji retrowirusowych na komórkę. na komórkę, może to jednocześnie zwiększać ryzyko złośliwej transformacji. transformacji złośliwej. Zastosowanie genów samobójczych, wektorów samoaktywujących i/lub izolatorów chromosomalnych izolatorów chromosomalnych jest zatem uzasadnione w celu dalszego zwiększenia bezpieczeństwa bezpieczeństwa wektorów onko-retrowirusowych. Szczegółowe analizy miejsc insercji w połączeniu z długoterminową obserwacją kliniczną mogą przyczynić się do dokładniejszej oceny ryzyka. oceny ryzyka. --- Terapia genowa w leczeniu zespołu Wiskotta-Aldricha (WAS) stanowi alternatywę dla alternatywę dla obecnie stosowanego allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego. My opisujemy rozwój samoaktywującego się wektora lentiwirusowego zawierającego izolatory chromatyny izolatory chromatyny do leczenia WAS i porównujemy gammakrowirusa (MND), ludzki komórkowy (EF1α) i ludzki promotor genu WASp dla wzorców ekspresji in vivo podczas hematopoezy myszy przy użyciu zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) marker. W porównaniu z promotorami EF1α i WASp, ekspresja z promotora MND u biorców przeszczepów myszy była znacznie wyższa we wszystkich badanych liniach. we wszystkich badanych liniach. Co ważne, utrzymywała się ekspresja w płytkach krwi wtórnych biorców, niezbędna do skorygowania defektu trombocytopenii u pacjentów z WAS. pacjentów z WAS. Analiza ekspresji białka WAS w transdukowanych ludzkich EBV-immortalizowanych komórkach B i transdukowanych jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej pacjenta. wykazała również silniejszą ekspresję na kopię z promotora MND w porównaniu z innymi promotorami. Ponadto, podczas analizy w teście aktywacji LM02 dodanie izolatora do konstruktów zawierających promotor MND zmniejszało transaktywację. zmniejszyło transaktywację genu LM02. Proponujemy projekt badania klinicznego w którym zmobilizowane cytokinami, autologiczne, transdukowane komórki CD34(+) są podawane po mielosupresji. --- Niska wydajność transferu genów jest główną przeszkodą dla klinicznie skutecznej terapii genowej na poziomie pluripotencjalnych hematopoetycznych komórek macierzystych. terapii genowej na poziomie pluripotencjalnych hematopoetycznych komórek macierzystych. Innym ważny aspekt terapii genowej komórek macierzystych, rzeczywista ekspresja transdukowanych genów. transdukowanych genów, została odpowiednio zbadana tylko w nielicznych badaniach, głównie dla genów globiny. Wyciszanie transkrypcji i efekty pozycji spowodowane negatywny wpływ otaczającej chromatyny na ekspresję losowo może poważnie zagrozić powodzeniu obecnych strategii terapii genowej, nawet jeśli transdukcja strategii terapii genowej, nawet jeśli wydajność transdukcji może być znacznie znacznie poprawić. Proponujemy włączenie izolatorów chromatyny w projekt wektorów do terapii genowej, aby przezwyciężyć wektorów do terapii genowej, aby przezwyciężyć problem efektów pozycyjnych. Izolatory chromatynowe izolatory chromatyny to wiążące białka elementy DNA, które nie posiadają wewnętrznej aktywności promotora/wzmacniacza, ale chronią geny przed wpływem transkrypcyjnym otaczającej chromatyny. otaczającej chromatyny. Najlepiej scharakteryzowane izolatory pochodzą od Drosophila. My stawiamy hipotezę, że ważna funkcja komórkowa organizacji chromatyny jest ewolucyjnie zachowana ewolucyjnie konserwowana i że ludzkie homologi białek wiążących izolatory Drosophila białka, takie jak supresor Hairy-wing, istnieją i mogą być klonowane. Używając tych domniemanych białek, powinno być możliwe zidentyfikowanie odpowiadających im minimalnych miejsc wiązania z aktywnością izolatora. Zaprojektowanie i włączenie skutecznych sekwencji sekwencji izolatorów chromatyny w następnej generacji wektorów do terapii genowej powinno prowadzić do lepszej i bardziej przewidywalnej ekspresji terapeutycznych transgenów transgenów i stanowić ważny krok w kierunku klinicznie skutecznej terapii genowej. terapii genowej.
Dlaczego izolatory są niezbędne w wektorach do terapii genowej?
a) Hamują aktywację onkogenów po integracji wektora i b) Maksymalizują prawdopodobieństwo ekspresji wektora po integracji w regionach heterochromatynowych.