Regulowana wapniem fosfataza białkowa kalcyneuryna (PP2B) funkcjonuje jako regulator ekspresji genów w różnych tkankach poprzez regulator ekspresji genów w różnych tkankach poprzez defosforylację i aktywację rodziny czynników transkrypcyjnych znanych jako czynnik jądrowy aktywowanych komórek T (NFAT). aktywowanych limfocytów T (NFAT). Tutaj pokazujemy, że NFATc3, oprócz tego, że reaguje na wapń jest regulowany poprzez pośrednią rekrutację deacetylaz histonowych klasy II (HDAC). deacetylaz histonowych (HDAC). W szczególności, drożdżowe badania dwuhybrydowe z domeną homologii rel NFATc3 zidentyfikowano chaperon ssaków spokrewniony z DnaJ (Mrj) jako specyficzny czynnik interakcji. Wykazano, że Mrj i NFATc3 bezpośrednio łączą się ze sobą w komórkach ssaków i in vitro. Mrj służył jako silny inhibitor aktywności transkrypcyjnej NFAT w jądrze poprzez mechanizm mechanizm obejmujący rekrutację deacetylazy histonowej w połączeniu ze stymulacją szokiem cieplnym. szoku cieplnego. Rzeczywiście, ustalono, że Mrj oddziałuje z deacetylazami histonowymi klasy II deacetylazami histonowymi klasy II, z których każda uległa translokacji do jądra po stymulacji szokiem cieplnym. stymulacji szokiem cieplnym. Mrj zmniejszył również zajętość NFATc3 promotora czynnika martwicy nowotworów czynnika alfa w kardiomiocytach w sposób zależny od HDAC, a Mrj blokował indukowany kalcyneuryną hipertroficzny wzrost kardiomiocytów. I odwrotnie, redukcja Mrj za pośrednictwem małego interferującego RNA zwiększała aktywność transkrypcyjną NFAT i spontanicznie indukowała i spontanicznie indukowany wzrost miocytów serca. Podsumowując, nasze wyniki definiują nowy szlak odpowiedzi, w którym NFATc3 jest negatywnie regulowany przez deacetylazy histonowe klasy II poprzez DnaJ (białko szoku cieplnego-40) członka nadrodziny Mrj. --- Serce reaguje na uraz i przewlekłe przeciążenie ciśnieniowe patologicznym wzrostem i przebudową, które często prowadzą do niewydolności serca i nagłej śmierci. Zależne od wapnia szlaki sygnałowe promują wzrost serca i związane z nim zmiany ekspresji genów w odpowiedzi na stres. zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na stres. Szlak zależna od wapnia/kalmoduliny fosfataza kalcyneuryna, która sygnalizuje jądrowemu czynników transkrypcyjnych aktywowanych komórek T (NFAT), służy jako przekaźnik sygnałów wapniowych i jest wystarczająca sygnałów wapniowych i jest wystarczająca i niezbędna do patologicznego przerostu i przebudowy serca przerostu i przebudowy serca. Białka przejściowego potencjału receptorowego (TRP) regulują wejście kationów do komórek w odpowiedzi na różne sygnały, a w mięśniach szkieletowych mięśni szkieletowych, ekspresja kanału kationowego TRP, podrodzina C, członek 3 (TRPC3) jest zwiększona w odpowiedzi na neurostymulację i sygnalizację kalcyneuryny. Tutaj my wykazać, że TRPC6 był regulowany w górę w sercach myszy w odpowiedzi na aktywowaną kalcyneurynę i przeciążenie ciśnieniowe, a także w niewydolnych ludzkich sercach. Dwa konserwowane miejsca konsensusu NFAT w promotorze genu TRPC6 nadawały na stres sercowy. Specyficzna dla serca nadekspresja TRPC6 u transgenicznych myszy u myszy transgenicznych skutkowała zwiększoną wrażliwością na stres, skłonnością do śmiertelnego wzrostu serca i niewydolności serca oraz wzrostem zależnej od NFAT ekspresji łańcucha ciężkiego beta-miozyny, czułego markera patologicznego przerostu. przerostu. Odkrycia te wskazują na TRPC6 jako pozytywny regulator kalcyneuryny-NFAT i kluczowy składnik zależnej od wapnia pętli regulacyjnej, która napędza patologiczną pętli regulacyjnej zależnej od wapnia, która napędza patologiczną przebudowę serca. --- Grupa czynników transkrypcyjnych czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T (NFAT) jest jest zatrzymywana w cytoplazmie komórek w stanie spoczynku. W aktywacji NFAT pośredniczy częściowo przez indukowany import jądrowy. Proces ten wymaga zależnej od wapnia zależnej od wapnia defosforylacji NFAT spowodowanej przez fosfatazę kalcyneurynę. Aminokońcowa kinaza c-Jun (JNK) fosforyluje NFAT4 w dwóch miejscach. Mutacyjne usunięcie miejsc fosforylacji JNK spowodowało konstytutywną jądrową lokalizację NFAT4. jądrową lokalizację NFAT4. W przeciwieństwie do tego, aktywacja JNK w komórkach stymulowanych kalcyneuryną komórek spowodowała jądrowe wykluczenie NFAT4. Odkrycia te pokazują, że jądrowa NFAT4 promowana przez kalcyneurynę jest przeciwstawiana przez szlak transdukcji sygnału JNK. szlak transdukcji sygnału JNK. --- Transkrypcja genów aktywowana wapniem poprzez białko NFAT (Nuclear Factor of Activated komórek T (NFAT), staje się wszechobecnym mechanizmem kontroli ważnych procesów fizjologicznych. ważnych procesów fizjologicznych. Spośród pięciu izoform NFAT ssaków, aktywność transkrypcyjna NFAT 1-4 jest stymulowana przez związek wapnia między wszechobecną fosfatazą kalcyneuryną a białkiem kalmoduliny białkiem wyczuwającym wapń - kalmoduliną. Opublikowane dowody in vitro sugerują że inni członkowie nadrodziny kalmoduliny, w szczególności neuronalne białka białka czujnika wapnia (NCS), mogą podobnie modulować aktywność kalcyneuryny. W W tym badaniu oceniliśmy zdolność białek NCS do bezpośredniej interakcji z kalcyneuryną in vitro i zgłosiliśmy specyficzne, choć słabe powiązanie między różnymi białkami NCS i fosfatazą. W rozszerzeniu tych analiz zbadaliśmy również wpływ nadekspresji NCS-1 lub mutantów NCS-1 na sygnalizacji kalcyneuryny w komórkach HeLa w eksperymentach badających fosforylacji konstruktu reporterowego NFAT-GFP jako odczytu aktywności kalcyneuryny aktywność. Wyniki tych eksperymentów wskazują, że NCS-1 nie był w stanie wykrywalnie modulować sygnalizację kalcyneuryny / NFAT w systemie żywych komórek ssaków, odkrycia, które są zgodne z ideą, że kalmodulina, a nie NCS-1 lub inne białka z rodziny NCS są fizjologicznie istotnym modulatorem aktywności kalcyneuryny. aktywność kalcyneuryny. --- Sygnalizacja kalcyneuryny została zaangażowana w szerokie spektrum procesów rozwojowych w różnych układach narządów. procesów rozwojowych w różnych układach narządów. Kalcyneuryna jest zależną od kalmoduliny, aktywowaną wapniem fosfatazą białkową składającą się z podjednostek katalitycznych i regulatorowych. podjednostek katalitycznych i regulatorowych. Fosfataza specyficzna dla seryny/treoniny funkcjonuje w szlaku transdukcji sygnału, który reguluje który reguluje ekspresję genów i odpowiedzi biologiczne w wielu rozwojowo ważnych typach komórek. wielu rozwojowo ważnych typach komórek. Sygnalizacja kalcyneuryny została po raz pierwszy w limfocytach T jako regulator czynnika jądrowego aktywowanych komórek T (NFAT) translokacji jądrowej i aktywacji czynnika transkrypcyjnego. Ostatnie badania wykazały istotną naturę sygnalizacji wapnia/kalcyneuryny/NFAT w rozwoju układu sercowo-naczyniowego i mięśni szkieletowych u kręgowców. Inhibicja, mutacja lub wymuszona ekspresja genów szlaku kalcyneuryny skutkuje defektami lub w dojrzewaniu kardiomiocytów, tworzeniu zastawek serca, rozwoju naczyń krwionośnych rozwój, różnicowanie mięśni szkieletowych i przełączanie typu włókien oraz przerost mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych. Zachowane geny kalcyneuryny znajdują się u bezkręgowców, takich jak Drosophila i Caenorhabditis elegans, a badania genetyczne wykazały specyficzne funkcje miogenne. wykazały specyficzne funkcje miogenne dla fosfatazy w ich rozwoju. ich rozwoju. Zdolność do badania szlaków sygnałowych kalcyneuryny u kręgowców i modelowych organizmów genetycznych zapewnia ogromny potencjał do pełniejszego zrozumieć funkcje kalcyneuryny i jej genów w rozwoju serca, naczyń krwionośnych i mięśni, naczyń krwionośnych i rozwoju mięśni. --- Białka NFAT (czynnik jądrowy aktywowanych komórek T) ulegają ekspresji w większości komórek układu odpornościowego i regulują transkrypcję genów cytokin krytycznych dla odpowiedzi immunologicznej. odpowiedzi immunologicznej. Aktywność białek NFAT jest ściśle regulowana przez zależną od Ca(2+)/kalmoduliny fosfatazę białkową 2B/kalcyneurynę (CaN). Dephosforylacja NFAT przez CaN jest wymagana do lokalizacji jądrowej NFAT. Obecne leki immunosupresyjne, takie jak cyklosporyna A i FK506, blokują aktywność CaN hamując w ten sposób jądrową translokację NFAT i w konsekwencji transkrypcję genów cytokin. transkrypcję genów cytokin. Hamowanie CaN w komórkach poza układem odpornościowym może przyczyniać się do toksyczności związanej z terapią cyklosporyną A. W poszukiwaniu bezpieczniejszych leków immunosupresyjnych, zidentyfikowaliśmy serię 3,5-bistrifluorometylopirazolu (BTP), które blokują transkrypcję genów cytokin Th1 i Th2 transkrypcję genów cytokin. Związki BTP blokują zależną od aktywacji lokalizację jądrową NFAT, jak określono w testach elektroforetycznego przesunięcia ruchliwości testy. Mikroskopia konfokalna komórek wyrażających znakowany fluorescencyjnie NFAT potwierdziła, że związki BTP blokują indukowany wapniem ruch NFAT z cytozolu do jądra. cytozolu do jądra. Hamowanie NFAT było selektywne, ponieważ związki BTP nie wpływały na aktywację czynników transkrypcyjnych NF-kappaB i AP-1. czynników transkrypcyjnych. Leczenie nienaruszonych komórek T związkami BTP przed aktywacją jonoforem wapnia spowodowało, że NFAT pozostał w wysokim stanie fosforylacji. stanie fosforylacji. Jednak związki BTP nie hamowały bezpośrednio fosforylacji NFAT przez CaN in vitro, ani też nie blokowały fosforylacji innych substratów CaN, w tym podjednostki regulatorowej typu II podjednostki kinazy białkowej A i czynnika transkrypcyjnego Elk-1. Dane sugerują że związki BTP powodują, że NFAT jest utrzymywany w cytozolu w stanie stan fosforylowany i blokują import jądrowy NFAT, a tym samym, transkrypcję genów cytokin zależną od NFAT poprzez mechanizm inny niż bezpośrednie hamowanie aktywności fosfatazy CaN. Nowe inhibitory opisane w niniejszym dokumencie będą przydatne w lepszym zdefiniowaniu komórkowej regulacji aktywacji NFAT i może prowadzić do identyfikacji nowych celów terapeutycznych w leczeniu chorób autoimmunologicznych i chorób autoimmunologicznych i odrzucania przeszczepów. --- W komórkach układu odpornościowego, które są stymulowane przez antygen lub kompleksy antygen-przeciwciało kompleksy, wejście Ca(2+) ze środowiska zewnątrzkomórkowego jest napędzane przez zubożenie magazynów Ca(2+) retikulum endoplazmatycznego i odbywa się poprzez wyspecjalizowane kanały Ca(2+) aktywowane uwalnianiem Ca(2+) (CRAC). (CRAC). Proces napływu Ca(2+) z magazynu jest niezbędny dla zarówno krótkoterminowych, jak i długoterminowych odpowiedzi komórek układu odpornościowego. Krótkoterminowe obejmują degranulację komórek tucznych i zabijanie komórek docelowych przez efektorowe cytolityczne limfocyty T, podczas gdy reakcje długoterminowe zazwyczaj obejmują zmiany w transkrypcji genów i obejmują proliferację i różnicowanie komórek T i B. różnicowanie. Transkrypcja następująca po napływie Ca(2+) jest w dużej mierze przez czynnik transkrypcyjny czynnika jądrowego aktywowanych komórek T (NFAT), silnie fosforylowane białko, które jest cytoplazmatyczne w komórkach spoczynkowych, ale które wchodzi do jądra, gdy jest defosforylowane przez zależną od kalmoduliny zależną od kalmoduliny fosfatazę serynowo-treoninową kalcyneurynę. Znaczenie relacji Ca(2+)/kalcyneuryna / szlak sygnałowy NFAT dla aktywacji limfocytów jest jest podkreślone przez odkrycie, że defekt leżący u podstaw w rodzinie z dziedzicznym zespołem ciężkiego złożonego niedoboru odporności (SCID) jest defekt w funkcji kanału CRAC funkcji kanału CRAC, wejścia Ca(2+) obsługiwanego przez magazyn, aktywacji NFAT i transkrypcji cytokin, chemokin i wielu innych genów docelowych NFAT, których transkrypcja jest niezbędna dla produktywnej obrony immunologicznej. niezbędna dla produktywnej obrony immunologicznej. Niedawno zastosowaliśmy dwutorowe podejście genetyczne podejście do identyfikacji Orai1 jako podjednostki porów kanału CRAC. Z jednej strony z jednej strony zainicjowaliśmy podejście do klonowania pozycyjnego, w którym wykorzystaliśmy w całym genomie mapowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) w celu identyfikacji genomu region związany ze zmutowanym genem w rodzinie SCID opisanej powyżej. Równolegle równolegle, wykorzystaliśmy ogólnogenomowy ekran RNAi u Drosophila w celu zidentyfikowania krytycznych regulatorów translokacji jądrowej NFAT i wejścia Ca(2+) do magazynu. Te podejścia, wraz z późniejszymi mutacjami i analizami elektrofizjologicznymi analizy, zbiegły się w celu zidentyfikowania ludzkiego Orai1 jako podjednostki porów kanału CRAC i jako produkt genu zmutowanego u pacjentów z SCID. --- Czynniki transkrypcyjne z rodziny NFAT (czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T) ulegają ekspresji w większości komórek układu odpornościowego oraz w wielu innych typach komórek. Sygnalizacja poprzez NFAT jest zaangażowana w regulację transkrypcji w odpowiedzi immunologicznej i innych procesach, w tym różnicowaniu i apoptozie. odpowiedzi immunologicznej i innych procesów, w tym różnicowania i apoptozy. NFAT normalnie znajduje się w cytoplazmie, a kluczowym aspektem szlaku aktywacji NFAT jest regulacja jego importu jądrowego przez układ przez zależną od Ca(2+)/kalmoduliny fosfatazę kalcyneurynę. W linii komórkowej stabilnie wyrażającej zielone białko fluorescencyjne (GFP) -NFAT, import ten może być wyzwalany przez podniesienie wewnątrzkomórkowego wapnia i wizualizowane w żywych komórkach. Tutaj pokazujemy że indukowany import jądrowy GFP-NFAT jest skutecznie blokowany na wczesnych etapach etapach infekcji wirusem opryszczki pospolitej (HSV). Jest to specyficzny efekt, ponieważ zaobserwowaliśmy obfitą akumulację jądrową testowego białka wirusowego i brak przeszkody w ogólnym imporcie jądrowym zależnym od sygnału lokalizacji jądrowej i retencji w zainfekowanych komórkach. Pokazujemy, że wiązanie wirusa na powierzchni komórki jest samo w sobie nie wystarcza do zahamowania sygnalizacji, która indukuje jądrową translokację NFAT. translokację. Ponieważ blok występuje po zakażeniu w obecności kwasu fosfonooctowego, ale nie cykloheksymidu, wnioskujemy, że wejście wirionu i wczesna transkrypcja genów wirionu i wczesna transkrypcja genów są wymagane, ale efekt jest niezależny replikacji DNA lub ekspresji późnych genów wirusa. Konsekwencją blokady importu GFP-NFAT jest zmniejszenie zależnej od NFAT aktywacji transkrypcji z promotora promotora interleukiny-2 w zakażonych komórkach. Ta zależna od HSV represja szlaku NFAT może stanowić strategię unikania immunologicznego lub obalenia innych procesów komórkowych zależnych od NFAT w celu promowania replikacji wirusa. --- Czynniki transkrypcyjne należące do rodziny czynników jądrowych aktywowanych limfocytów T (NFAT) regulują ekspresję genów cytokin i innych indukowalnych genów podczas odpowiedzi immunologicznej. genów podczas odpowiedzi immunologicznej. Funkcje białek NFAT są bezpośrednio bezpośrednio kontrolowane przez zależną od wapnia i kalmoduliny fosfatazę kalcyneurynę. Tutaj pokazujemy, że wiązanie kalcyneuryny z NFAT jest znacznie zwiększone gdy kalcyneuryna jest aktywowana kalmoduliną i wapniem. FK506.FKBP12 kompleksy lek-immunofilina hamowały interakcję NFAT z aktywowaną kalcyneuryną kalcyneuryną znacznie skuteczniej niż hamowały interakcję z nieaktywną kalcyneuryną. nieaktywną kalcyneuryną, co sugeruje, że część interakcji z aktywowaną kalcyneuryną kalcyneuryną obejmowała miejsce aktywne enzymu. Wcześniej wykazaliśmy, że NFAT jest ukierunkowany na nieaktywną kalcyneurynę w regionie różniącym się od miejsca aktywnego kalcyneuryny (Aramburu, J., Garcia-Cozar, F. J., Raghavan, A., Okamura, H., Rao, A. i Hogan, P. G. (1998) Mol. Cell 1, 627-637); region ten jest również zaangażowany w w wiązanie NFAT z aktywowaną kalcyneuryną, ponieważ wiązanie jest hamowane przez peptyd NFAT peptyd obejmujący miejsce dokowania kalcyneuryny na NFAT. Powierzchnie oddziałujące znajdują się na domenie katalitycznej łańcucha kalcyneuryny A i na 86-aminokwasowym fragmencie domeny regulatorowej NFAT. Wiązanie NFAT do kalcyneuryny było hamowane przez domenę autoinhibitorową kalcyneuryny i domenę substratową RII. i peptyd substratowy RII, które wiążą się w miejscu aktywnym kalcyneuryny, jak również przez peptyd miejsca dokowania NFAT, który wiąże się z regionem kalcyneuryny różniącym się od miejsca aktywnego. Proponujemy, aby w komórkach spoczynkowych, NFAT jest ukierunkowany na region domeny katalitycznej kalcyneuryny, który nie pokrywa się z miejscem aktywnym kalcyneuryny. Po aktywacji komórki, przemieszczenie domeny przez wiązanie kalmoduliny pozwala NFAT dodatkowo wiązać się z miejscem aktywnym kalcyneuryny. aktywnego miejsca kalcyneuryny, pozycjonując w ten sposób NFAT do natychmiastowej fosforylacji na funkcjonalnych resztach fosfoseryny.
Która fosfataza białkowa zależna od wapnia/kalmoduliny bierze udział w aktywacji rodziny czynników transkrypcyjnych NFAT (Nuclear Factors of Activated T cells)?
Aktywność białek NFAT jest ściśle regulowana przez zależną od Ca(2+)/kalmoduliny fosfatazę białkową 2B/kalcyneurynę (CaN), a defosforylacja NFAT przez CaN jest wymagana do lokalizacji jądrowej NFAT.