Chociaż ich sekwencje aminokwasowe i struktura bardzo przypominają metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA, białka Dnmt2 zostały niedawno wykazane przez Golla i współpracowników, że funkcjonują jako metylotransferazy RNA przenoszące grupę metylową do pozycji C5 w pozycji C38 w tRNA(Asp). Zaobserwowaliśmy, że ludzka DNMT2 metyluje tRNA izolowane od Dnmt2 knock-out Drosophila melanogaster i Dictyostelium discoideum. RNA wyekstrahowane z dzikiego typu D. melanogaster było metylowane w niższym stopniu, ale w przypadku niższym stopniu, ale w przypadku Dictyostelium nie było różnicy w metylacji RNA izolowanego z Drosophila melanogaster i Dictyostelium discoideum. metylacji RNA wyizolowanego ze szczepów typu dzikiego i Dnmt2 knock-out. Metylacja transkrybowanego in vitro tRNA(Asp) potwierdza, że jest on celem DNMT2. DNMT2. Używając mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, pokazujemy tutaj, że enzym ma mechanizm DNA mechanizm podobny do metylotransferazy DNA, ponieważ podobne reszty z motywów IV, VI, i VIII są zaangażowane w katalizę, jak zidentyfikowano w metylotransferazach DNA. Ponadto Ponadto, wymiana C292, która znajduje się w motywie CFT konserwowanym wśród białek białek Dnmt2, silnie zmniejszyła aktywność katalityczną DNMT2. Dnmt2 reprezentuje pierwszy przykład metylotransferazy RNA wykorzystującej typ metylotransferazy DNA wykorzystując mechanizm typu metylotransferazy DNA. --- Metylotransferaza DNA została częściowo oczyszczona z ciężkich komórek grasicy bydlęcej. Enzym ma Mr 130 000 i wprowadza grupy metylowe z S-adenozylometioniny do pozycji 5 cytozyny w DNA. Sekwencja analiza specyficzności ujawniła, że około 60% całkowitej metylacji wystąpiło w dublecie 5'd(C-G)3'. Jednoniciowe i hemi-metylowane DNA były metylowane w podwyższonym tempie przez enzym. Analiza kinetyczna wykazała, że reakcja przebiega zgodnie z losowym mechanizmem sekwencyjnym. Wyniki te sugerują, że enzym enzym służy głównie jako metylotransferaza DNA. --- Wszystkie (cytozyno-5)-metylotransferazy DNA zawierają pojedynczą konserwowaną cysteinę. To zaproponowano, że ta cysteina inicjuje katalizę poprzez atakowanie pozycji C6 cytozyny i w ten sposób aktywując normalnie obojętną pozycję C5. Pokazujemy tutaj że substytucje tej cysteiny w metylazie E. coli M. EcoRII przez seryną lub tryptofanem powoduje całkowitą utratę zdolności do przenoszenia grup metylowych na DNA. grup metylowych do DNA. Co ciekawe, mutanty z substytucją seryny lub glicyny ściśle wiążą się z substratowym DNA. Mutanty te przypominają dziki typ w tym, że ich wiązanie z substratem nie jest eliminowane przez obecność niespecyficznego DNA w reakcji. niespecyficznego DNA w reakcji, jest wrażliwe na stan metylacji substratu i jest stymulowane przez substratu i jest stymulowane przez analog donora metylu. Stąd cysteina nie jest niezbędna do specyficznego stabilnego wiązania enzymu z substratem. enzymu z jego substratem. Jednakże, zastąpienie cysteiny większym tryptofanem zmniejsza wiązanie DNA. Przedstawiamy również nową procedurę syntezy syntezy DNA zawierającego 5-fluorocytozynę. Ponadto pokazujemy, że DNA dla M. EcoRII, w którym docelowa cytozyna jest zastąpiona przez 5-fluorocytozyną jest opartym na mechanizmie inhibitorem enzymu i że tworzy on nieodwracalny kompleks z enzymem. Zgodnie z oczekiwaniami, ten zmodyfikowany substrat nie tworzy nieodwracalnych kompleksów z mutantami. --- Produkt genu dcm jest jedyną metylotransferazą DNA cytozyna-C5 w Escherichia coli K-12. Escherichia coli K-12; katalizuje przeniesienie grupy metylowej z S-adenozylo metioniny (SAM) do pozycji C-5 wewnętrznej reszty cytozyny w sekwencji sekwencji CCA/TGG. Specyficzne dla sekwencji, kowalencyjne sieciowanie enzymu do syntetycznych oligonukleotydów zawierających 5-fluoro-2'-deoksycytydynę. wykazano. Reakcja ta jest zniesiona, jeśli seryna zastępuje cysteinę przy reszcie #177 enzymu. reszcie #177 enzymu. Wyniki te stanowią silne wsparcie dla mechanizmu katalitycznego mechanizm, w którym enzymatyczna grupa sulfhydrylowa ulega addycji Michaela do podwójnego wiązania podwójnego wiązania C5-C6, aktywując w ten sposób pozycję C-5 reszty cytozyny DNA substratu do ataku elektrofilowego przez donor metylu SAM. Enzym jest zdolny do metylacji w reakcji niezależnej od DNA, wymagającej SAM i obecności cysteiny w pozycji #1. cysteiny w pozycji 177. --- Większość prokariotycznych (cytozyno-5)-DNA metylotransferaz zwiększa częstotliwość deaminacji cytozyny przeznaczonej do metylacji in vitro pod nieobecność kofaktora kofaktora S-adenozylometioniny (AdoMet) lub produktu reakcji S-adenozylohomocysteiny (AdoHcy). Pokazujemy tutaj, że w tych samych warunkach in vitro warunkach, prokariotyczna metylotransferaza, M.MspI (z Moraxella sp.), powoduje bardzo niewiele deaminacji cytozyny, co sugeruje mechanizm, w którym M.MspI może unikać deaminacji cytozyny za pośrednictwem enzymu. Dwa analogi AdoMet, sinefungina i 5'-amino-5'-deoksyadenozyna, znacznie zwiększyły częstotliwość deaminacji cytozyny za pośrednictwem M.MspI, prawdopodobnie poprzez wprowadzenie grupy aminowej oddającej proton do centrum katalitycznego, ułatwiając w ten sposób tworzenie niestabilnego enzymu-dihydrocytozyny pośredniego i hydrolitycznego deaminację. Co ciekawe, dwa naturalnie występujące analogi, adenozyna i 5'-metylotio-5'-deoksyadenozyna, które nie zawierają grupy aminowej oddającej proton, również słabo zwiększały deaminację. grupy aminowej, również słabo zwiększały częstotliwość deaminacji przez M.MspI, nawet w obecności obecności AdoMet lub AdoHcy. Analogi te mogą wywoływać zmianę konformacyjną zmianę w enzymie bez całkowitego hamowania dostępu wody rozpuszczalnikowej do centrum katalitycznego, umożliwiając w ten sposób hydrolityczną deaminację enzymu-dihydrocytozyny. W normalnych warunkach fizjologicznych enzymy M.HpaII (z Haemophilus parainfluenzae), M.HhaI (z Haemophilus hemolytica) i M.MspI zwiększyły częstotliwość deaminacji in vivo w docelowych cytozynach z porównywalną wydajnością. docelowych cytozynach z porównywalną wydajnością. --- Uszkodzenia DNA spowodowane wiązaniem 7R,8S-diolu 9S,10R-epoksydu nowotworowego (B[a]PDE), metabolitu bezo[a]pirenu, do guaniny w sekwencjach dinukleotydowych CpG może wpływać na metylację DNA, a tym samym stanowić potencjalny epigenetyczny mechanizm epigenetyczny mechanizm chemicznej kancerogenezy. W tej pracy zbadaliśmy wpływ stereoizomerycznych (+)- i (-)-trans-anti-B[a]P-N(2)-dG adduktów (B(+) i B(-)) na metylację DNA przez prokariotyczne metylotransferazy DNA M.SssI i M.HhaI. Te dwie metylotransferazy rozpoznają sekwencje CpG i GCGC, i przenoszą grupę metylową na atom C5 cytozyny (C). A Seria 18-merowych niemetylowanych lub hemimetylowanych dupleksów oligodeoksynukleotydowych zawierających addukty trans-anty-B[a]P-N(2)-dG. Reszty B(+) lub B(-) wprowadzono albo 5' lub 3' sąsiadujące lub przeciwne do docelowego 2'-deoksycytydyny. Zmiany B[a]PDE praktycznie nie miały wpływu na wiązanie M.SssI ale zmniejszały wiązanie M.HhaI o 1-2 rzędy wielkości. W większości przypadkach, reszty benzo[a]pirenylowe zmniejszały wydajność metylacji hemimetylowanego i niemetylowanego DNA przez M.SssI i M.HhaI. Brak metylacji hemimetylowanych dupleksów zaobserwowano, gdy (+) - lub (-)-trans-anty-B[a]P-N(2)-dG addukt był umieszczony 5' do docelowego dC. Zaobserwowane efekty obserwowane efekty mogą być związane z konformacją mniejszego rowka nieporęcznego benzo[a]pirenylu i zaburzeniem normalnych kontaktów katalizatora metylotransferazy pętli katalitycznej metylotransferazy z DNA zmodyfikowanym B[a]PDE. Nasze wyniki wskazują, że zmiana trans-anty-B[a]P-N(2)-dG flankująca docelowe dC w sekwencji dinukleotydu CpG w sekwencji dinukleotydu CpG po jego stronie 5'- ma większy niekorzystny wpływ na metylację niż ta sama zmiana, gdy przylega do 3' lub jest przeciwna do docelowego dC. --- Enzymy, które przenoszą grupę metylową na C5 cytozyny w określonych sekwencjach (mtazy sekwencji (C5 Mtazy) deaminują docelową cytozynę do uracylu, jeśli donor metylu S-adenozylometionina (SAM) jest pomijana w reakcji. Niedawno wykazano, że wykazano, że deaminacja cytozyny powodowana przez C5 Mtazy M.HpaII, M.SssI i M.MspI jest nasilona w obecności kilku analogów SAM, a mechanizm zaproponowano mechanizm tej promowanej przez analogi deaminacji. Zgodnie z tym mechanizmem, analogi protonują C5 docelowej cytozyny, tworząc dihydrocytozynę który jest podatny na deaminację. Pokazujemy tutaj, że jeden z tych analogów, 5'-aminoadenozyna (AA), zwiększa deaminację cytozyny przez Mtase M. EcoRII, ale robi to bez zwiększania protonacji C5. Co więcej, pokazujemy że uracyl jest związkiem pośrednim w szlaku mutacji i proponujemy alternatywny mechanizm alternatywny mechanizm deaminacji promowanej przez analogi. Nowy mechanizm obejmuje ułatwiony atak wody na C4, ale nie wymaga ataku na C6 przez enzym. przez enzym. Ta ostatnia cecha mechanizmu została przetestowana przy użyciu mutantów M.EcoRII mutantów defektywnych w ataku nukleofilowym na C6 w teście deaminacji. My stwierdziliśmy, że chociaż białka te są wadliwe w transferze metylu i deaminacji cytozyny deaminacji, powodują deaminację cytozyny w obecności AA w reakcji. reakcji. Nasze wyniki wskazują na możliwy związek między mechanizmem katalitycznym mechanizmem katalitycznym Mtaz C5 i enzymów, które przenoszą grupy metylowe na N(4) cytozyny. cytozyny. Co więcej, stanowią one niezwykły przykład, w którym koenzym aktywuje aktywuje "martwy" enzym do katalizy poprzez nową ścieżkę reakcji. --- W utrzymaniu wzorców metylacji genomu pośredniczy głównie metylotransferaza DNA metylotransferazę DNA-1 (DNMT1). Rozwiązaliśmy struktury mysiej i ludzkiej DNMT1 składającej się z domen CXXC, tandemowej homologii bromo-sąsiadującej (BAH1/2) i metylotransferazy związanych z zawierającymi DNA niemetylowanymi miejscami CpG. CXXC specyficznie wiąże się z niemetylowanym dinukleotydem CpG i pozycjonuje łącznik CXXC-BAH1 między DNA a aktywnym miejscem DNMT1, zapobiegając metylacji de novo. Ponadto Ponadto pętla wystająca z BAH2 oddziałuje z domeną rozpoznawania celu (TRD) metylotransferazy, stabilizując TRD w pozycji cofniętej pozycji i uniemożliwiając jej wstawienie do głównego rowka DNA. Nasze badania identyfikują mechanizm autoinhibicji, w którym niezmetylowane dinukleotydy CpG są zablokowane w miejscu aktywnym, aby zapewnić, że tylko hemimetylowane dinukleotydy CpG ulegają metylacji. --- Arg165 stanowi część wcześniej zidentyfikowanego motywu przerzucania zasad w bakteryjnej metylotransferazie cytozyny DNA, M.HhaI. Zastąpienie Arg165 przez Ala nie ma wykrywalnego wpływu ani na powinowactwo do DNA, ani na powinowactwo do AdoMet. przerzucanie i przejścia restackingowe są zmniejszone odpowiednio około 16 i 190-krotnie, potwierdzając w ten sposób znaczenie tego motywu. Jednakże, te zmiany kinetyczne nie mogą odpowiadać za zaobserwowaną 10(5)-krotność mutanta zmniejszonej szybkości katalitycznej mutanta. Struktura kokryształu zmutowanego enzymu/kognatu DNA (rozdzielczość 2,79 A) pokazuje, że docelowa cytozyna jest umieszczona około 30 stopni w głównym rowku. stopni do głównego rowka, co jest zgodne ze ścieżką głównego rowka dla przerzucania nukleotydów. Kąt chi pirymidyna-cukier jest obrócony do około +171 stopni, z zakresu od -95 stopni do -120 stopni w B DNA i -77 stopni w kompleksie WT M.HhaI. Zatem Arg165 jest ważny dla utrzymanie cytozyny w pozycji do ataku nukleofilowego przez Cys81. The cytozyny jest w konformacji C2'-endo-C3'-exo (konformacja południowa), w przeciwieństwie do wcześniej opisanej konformacji w przeciwieństwie do wcześniej opisanego C3'-endo (konformacja północna) opisanego dla oryginalnej struktury kokrystalicznej kompleksu WT M.HhaI/DNA o rozdzielczości 2,70 A. Wyznaczyliśmy strukturę o wysokiej rozdzielczości kompleksu WT M.HhaI/DNA (1,96 A) aby lepiej określić strukturę cukrową. Ta nowa struktura jest podobna do oryginalnego kompleksu WT M.HhaI o niższej rozdzielczości, ale pokazuje, że pucker cukrowy jest O4'-endo (konformacja wschodnia), pośrednia między konformacją południową i północną konformerami. Podsumowując, Arg165 odgrywa znaczącą rolę w przerzucaniu zasad, pozycjonowaniu cytozyny i katalizie. Co więcej, wcześniej zaproponowany M.HhaI mogą nie być ważnym czynnikiem przyczyniającym się do mechanizmu przerzucania zasad. mechanizmu przerzucania zasad. Wyniki te zapewniają wgląd w mechanizm i mechanizmy katalityczne bakteryjnych i eukariotycznych metylotransferaz DNA. bakteryjnych i eukariotycznych metylotransferaz DNA. --- Poprzednie badania krystalografii rentgenowskiej ujawniły, że domena katalityczna metylotransferazy DNA (Mtase) generującej C5-metylocytozynę wykazuje uderzające podobieństwo strukturalne do strukturalne podobieństwo do Mtazy generującej N6-metyloadeninę. Kierując się tą wspólną strukturą, przeprowadziliśmy wielokrotne dopasowanie sekwencji 42 amino-Mtaz (N6-adeniny i N4-cytozyny). Porównanie to ujawniło dziewięć konserwowanych motywów, odpowiadających motywom od I do VIII i X wcześniej zdefiniowanym w C5-cytozynowych Mtazach. Mtazy aminowe i C5-cytozynowe wydają się być zatem bardziej bliżej spokrewnione niż dotychczas sądzono. Mtazy aminowe można podzielić na trzy grupy, w oparciu o sekwencyjną kolejność motywów, a ta zmienność w kolejności może wyjaśniać, dlaczego tylko dwa motywy zostały wcześniej rozpoznane w amino Mtazy. Mtazy pogrupowane w ten sposób wykazują kilka innych specyficznych dla grupy właściwości, w tym różnice w sekwencji aminokwasów, masie cząsteczkowej i specyficzności sekwencji DNA. DNA. Co zaskakujące, Mtazy N4-cytozynowe i N6-adeninowe nie tworzą oddzielnych grup. tworzą oddzielnych grup. Wyniki te mają wpływ na mechanizmy katalityczne, ewolucję i dywersyfikację mechanizmy katalityczne, ewolucję i dywersyfikację tej rodziny enzymów. Ponadto, analiza porównawcza S-adenozylo-L-metioniny i adenina/cytozyna sugeruje, że strukturalnie i funkcjonalnie, są one niezwykle podobne do siebie. --- Ko-transfekcja plazmidów reporterowych i plazmidów kodujących domenę katalityczną mysiej metylotransferazy DNA Dnmt3a prowadzi do zahamowania ekspresji genu reporterowego ekspresji. Ponieważ mutanty Dnmt3a z wymianami C-->A i E-->A w konserwowanych motywach PCQ i ENV PCQ i ENV w centrum katalitycznym enzymu również powodują represję, sprawdziliśmy ich aktywność katalityczną in vitro. Co zaskakujące, aktywność wariantu cysteinowego i odpowiadającego mu wariantu Dnmt3a o pełnej długości jest tylko od dwóch do sześciu razy zmniejszona w odniesieniu do Dnmt3a typu dzikiego. W przeciwieństwie do tego, warianty enzymu warianty enzymu niosące E-->A, E-->D lub E-->Q wymiany glutaminianu ENV są katalitycznie prawie nieaktywne, wykazując, że ta reszta ma centralną funkcję funkcję w katalizie. Ponieważ reszta kwasu glutaminowego styka się z odwróconą zasadą jego główną funkcją może być utrzymywanie docelowej zasady w pozycji, która wspiera przeniesienie grupy metylowej. Podczas gdy Dnmt3a typu dzikiego i warianty ENV tworzą kowalencyjne kompleksy z DNA zmodyfikowanym 5-fluorocytydyną, wariant PCN nie nie. Dlatego tworzenie kompleksów kowalencyjnych nie jest niezbędne w mechanizmie reakcji mechanizmie reakcji Dnmt3a. Proponujemy, aby prawidłowe pozycjonowanie odwróconej zasady i kofaktora i kofaktora oraz wiązanie do stanu przejściowego przeniesienia grupy metylowej są najważniejszymi rolami Dnmt3a. najważniejsze role enzymu Dnmt3a w cyklu katalitycznym przeniesienia grupy metylowej. przeniesienia grupy metylowej. --- Opisano właściwości kinetyczne i katalityczne metylotransferazy DNA (cytozyny-5) HhaI są opisane. Z poli(dG-dC) jako substratem, reakcja przebiega według uporządkowanego mechanizmu Bi-Bi, w którym DNA najpierw wiąże się z enzymem, a następnie DNA, a następnie S-adenozylometionina (AdoMet). Po przeniesieniu metylu, S-adenozylohomocysteina (AdoHcy) dysocjuje, a następnie metylowane DNA. AdoHcy jest silnym inhibitorem kompetycyjnym w odniesieniu do AdoMet (Ki = 2,0 mikroM) i a jego wytwarzanie podczas reakcji skutkuje nieliniową kinetyką. AdoMet i AdoHcy znacząco oddziałują tylko z kompleksem substrat enzym-DNA; one nie wiążą się z wolnym enzymem i słabo wiążą się z metylowanym kompleksem enzym-DNA. Pod nieobecność AdoMet, metylaza HhaI katalizuje wymianę 5-H cytozyny substratu na protony. cytozyny substratu na protony wody z około 7-krotną szybkością metylacji. metylacji. Reakcja wymiany 5-H jest hamowana przez AdoMet lub AdoHcy. W układzie W kompleksie enzym-DNA-AdoHcy, AdoHcy również hamuje dysocjację DNA i reasocjację enzymu z innymi sekwencjami substratowymi. Nasze badania ujawniają że mechanizm katalityczny (cytozyno-5)-metylotransferaz DNA obejmuje atak na C6 cytozyny substratu przez nukleofil enzymu i tworzenie kowalencyjnego adduktu. W oparciu o precedensy innych enzymów, które katalizują podobne reakcje i podatność HhaI na inaktywację przez N-etylomaleimid, proponujemy, że grupa sulfhydrylowa reszty cysteinowej jest nukleofilowym katalizatorem. nukleofilowym katalizatorem. Ponadto proponujemy, że Cys-81 jest katalizatorem katalizatorem aktywnego miejsca w HhaI. Ta reszta znajduje się w dublecie Pro-Cys, który jest konserwowana we wszystkich (cytozyno-5)-metylotransferazach DNA, których sekwencje zostały sekwencje i występuje w pokrewnych enzymach. Na koniec omawiamy możliwość możliwość, że kowalencyjne addukty między C6 pirymidyn a nukleofilami białek mogą być ważnymi ogólnymi składnikami interakcji białko-kwas nukleinowy kwasów nukleinowych. --- Metylotransferazy cytozyny DNA regulują ekspresję genomu poprzez precyzyjne epigenetyczne znakowanie niektórych cytozyn grupą metylową, a nieprawidłowa metylacja jest cechą charakterystyczną chorób człowieka, w tym raka. Ukierunkowanie tych enzymów w celu projektowania leków jest obecnie priorytetem. Wykorzystaliśmy ab initio mechanikę kwantową/molekularną (QM/MM) dynamikę molekularną (MD) do zbadania mechanizmu reakcji reprezentatywnej metylotransferazy DNA. reprezentatywnej metylotransferazy DNA HhaI (M.HhaI) z prokariotów, której ogólny mechanizm ogólny mechanizm jest wspólny z enzymami ssaków. Po raz pierwszy otrzymaliśmy po raz pierwszy pełne profile energii swobodnej dla całej reakcji, wraz z atomistyczną dynamiką reakcji. dynamiką reakcji w szczegółach atomistycznych. Nasze wyniki pokazują preferowany energetycznie mechanizm, w którym nukleofilowy atak cytozyny C5 na cząsteczkę grupę metylową S-adenozylo-L-metioniny (AdoMet) jest skoordynowany z tworzeniem adduktu Michaela pomiędzy konserwatywnym Michaela między konserwowaną Cys w miejscu aktywnym z cytozyną C6. Spontaniczne i odwracalne przeniesienie protonu między konserwowanym Glu w miejscu aktywnym i cytozyną N3 w stanie przejściowym zostało zaobserwowane w naszych symulacjach, ujawniając chemiczny udział tej reszty Glu w mechanizmie katalitycznym. w mechanizmie katalitycznym. Następnie, β-eliminacja protonu C5 wykorzystuje jako zasadę OH(-) pochodzącą z konserwowanej wody krystalicznej, która jest częścią protonowego kanału wodnego i ta reakcja β-eliminacji jest etapem ograniczającym szybkość. Projekt nowych inhibitorów metylacji cytozyny byłoby zaawansowane dzięki naszej strukturalnej i strukturalna i termodynamiczna charakterystyka mechanizmu reakcji. --- Określiliśmy strukturę metylotransferazy Pvu II (M. Pvu II) skompleksowanej z S -adenozylo-L-metioniną (AdoMet) za pomocą anomalnej dyfrakcji o wielu długościach fali przy użyciu kryształu białka podstawionego selenometioniną. M. Pvu II katalizuje przeniesienie grupy metylowej z AdoMet na egzocykliczny azot amino (N4) centralnej cytozyny w sekwencji rozpoznawczej 5'-CAGCTG-3'. Białko jest zdominowane przez otwartą strukturę alfa/beta-arkusza z wyraźną szczeliną w kształcie litery V. w kształcie litery V: AdoMet i aminokwasy katalityczne znajdują się na dole tej szczeliny. tej szczeliny. Rozmiar i podstawowa natura szczeliny są zgodne z wiązaniem dupleksowym DNA. wiązanie dupleksu DNA. Docelowa (metylowana) cytozyna, jeśli zostanie odwrócona od podwójnej spirali DNA, jak w przypadku metylotransferaz DNA, które generują 5-metylocytozynę, pasowałaby do wklęsłego miejsca aktywnego obok AdoMet. Ta struktura arkusza alfa/beta M. Pvu II jest bardzo podobna do struktury arkusza M. Hha I (a cytozyny C5) i M. Taq I (metylotransferazy adeniny N6), zgodne z modelem przewidującym, że metylotransferazy DNA mają wspólny fałd strukturalny, podczas gdy główne regiony funkcjonalne są permutowane do trzech trzy różne porządki liniowe. Główną cechą wspólnego fałdu jest siedmioniciowy arkusz beta (6 7 5 4 1 2 3) utworzony przez pięć równoległych nici beta i antyrównoległą antyrównoległej beta-spinki do włosów. Arkusz beta jest otoczony sześcioma równoległymi alfa-heliksów, po trzy z każdej strony. Miejsce wiązania AdoMet znajduje się na C-końcowych końcach nici beta1 i beta2, a miejsce aktywne znajduje się na C-końcowe końce nici beta4 i beta5 oraz N-końcowy koniec nici beta7. Interakcje AdoMet-białko są prawie identyczne wśród M. Pvu II, M. Hha I i M. Taq I, a także w metylotransferazie RNA i co najmniej jednej metylotransferazie małych cząsteczek. metylotransferazy małych cząsteczek. Podobieństwo strukturalne między miejscami aktywnymi miejsc aktywnych M. Pvu II, M. Taq I i M. Hha I ujawnia, że katalityczne aminokwasy niezbędne do metylacji cytozyny N4 i adeniny N6 pokrywają się przestrzennie z aminokwasami z metylacją cytozyny C5, co sugeruje mechanizm metylacji aminowej. --- Na podstawie dopasowań sekwencji aminokwasów i danych strukturalnych pokrewnych enzymów enzymów, przeprowadziliśmy analizę mutacyjną 14 reszt aminokwasowych w domenie katalitycznej domenie katalitycznej mysiej Dnmt3a DNA-(cytozyna C5)-metylotransferazy. Docelowe reszty znajdują się w obrębie dziesięciu konserwowanych sekwencji aminokwasowych charakterystycznych dla metylotransferaz cytozyny-C5 oraz w domniemanej domenie rozpoznawania DNA (TR domenie rozpoznawania DNA enzymu (TRD). Zmutowane białka zostały oczyszczone i przetestowane pod kątem ich właściwości katalitycznych i zdolności do wiązania DNA i AdoMet. My przygotowaliśmy model strukturalny Dnmt3a, aby zinterpretować nasze wyniki. Wykazaliśmy, że że Phe50 (motyw I) i Glu74 (motyw II) są ważne dla wiązania i katalizy AdoMet. katalizy. D96A (motyw III) wykazał zmniejszone wiązanie AdoMet, ale zwiększoną aktywność w warunkach nasycenia S-adenozylo-L-metioniną (AdoMet), wskazując na że kontakt Asp96 z AdoMet nie jest wymagany do katalizy. R130A (następujący po motywie IV), R241A i R246A (w TRD), R292A i R297A (oba zlokalizowane przed motywem X) wykazywały zmniejszone wiązanie DNA. R130A wykazywał silną redukcję aktywności katalitycznej i całkowitą zmianę preferencji sekwencji flankujących preferencji sekwencji, wskazując, że Arg130 odgrywa ważną rolę w interakcji DNA DNA Dnmt3a. R292A również wykazywał zmniejszoną aktywność i zmiany w preferencjach sekwencji preferencji sekwencji flankującej, wskazując na potencjalną rolę w kontaktach DNA dalej od miejsca docelowego CG. N167A (motyw VI) i R202A (motyw VIII) mają normalne wiązanie AdoMet i DNA, ale zmniejszoną aktywność katalityczną. Podczas gdy Asn167 może przyczyniać się do pozycjonowania reszt z motywu VI, zgodnie z danymi strukturalnymi danych strukturalnych Arg202 odgrywa rolę w katalizie metylotransferaz cytozyna-C5 metylotransferaz. Wariant R295A był katalitycznie nieaktywny najprawdopodobniej najprawdopodobniej z powodu destabilizacji subdomeny zawiasowej białka. --- 2'-Deoksyoligonukleotydy z resztami 5-fluorocytozyny wbudowanymi w określone pozycje sekwencji nukleotydowej pozycjach sekwencji nukleotydowej są narzędziami o dużym potencjale w badaniu mechanizmu katalitycznego, za pomocą którego metylotransferazy cytozyny DNA metylują metylują reszty cytozyny DNA w pozycji 5 w określonych kontekstach sekwencji. Chemiczna opisano chemiczną syntezę takich oligonukleotydów. Opracowano dwa alternatywne podejścia opracowano dwa alternatywne podejścia, z których jedno przebiega poprzez w pełni chroniony fosforoamidyt 5-fluoro-4-metylomerkapto-2'-deoksyurydyny 2, a druga przez w pełni chroniony fosforoamidyt 5-fluoro-2'-deoksycytydyny 3. Każdy z tych bloków może być w zautomatyzowanej syntezie oligonukleotydów z zastosowaniem standardowych cykli wydłużania i procedury deprotekcji. Funkcja metylomerkapto w 2 jest zastąpiona grupą aminową w końcowej obróbce amoniakiem stosowanej do odszczepienia od i deprotekcji zasad.
Jaki jest mechanizm katalityczny metylotransferaz DNA (cytozyny-5)?
Mechanizm katalityczny DNA (cytozyno-5-)-metylotransferazy obejmuje nukleofilowy atak C6 substratu cytozyny przez pojedynczą konserwowaną cysteinę enzymu, a następnie nukleofilowe podstawienie C5 grupy metylowej kofaktora S-adenozylo-L-metioniny (AdoMet) w celu wytworzenia 5-metylo-6-Cys-81-S-5,6-dihydrocytozyny. Wykazano również, że Phe i Glu, które znajdują się w motywach katalitycznych I i II enzymu, są ważne dla wiązania i katalizy AdoMet.