Geny związane z miotubularyną definiują nową, wysoce konserwatywną rodzinę białek eukariotycznych białek składającą się z co najmniej 11 ludzkich członków. Gen hMTM1, który koduje jest zmutowany w miopatii miotubularnej sprzężonej z chromosomem X, ciężkiej wrodzonej chorobie. wrodzonej. Niedawno my i inni scharakteryzowaliśmy miotubularynę jako silną i silną i specyficzną 3-fosfatazę fosfatydyloinozytolu. W niniejszym badaniu zbadaliśmy aktywność fosfatazy lipidowej i lokalizację subkomórkową dwóch innych członków rodziny, białka hMTMR2, które jest zmutowane w neuropatii demielinizacyjnej demielinizacyjnej neuropatii Charcot-Marie-Tooth typu 4B oraz białko hMTMR3 zawierające palec FYVE. zawierające białko hMTMR3. Nasze wyniki pokazują, że oba białka są silnymi inhibitorami 3-fosfatazami fosfatydyloinozytolu zarówno in vitro, jak i w drożdżach. gdzie zakłócały transport pęcherzykowy. Ich lokalizacja jest głównie cytoplazmatyczna, jednak z silnym znakowaniem indukowalnych przez Rac błon plazmatycznych błonę plazmatyczną. Fakt, że wszechobecnie wyrażane geny hMTM1 i hMTMR2 są zaangażowane w różne patologie wskazuje, że zaangażowane w różne patologie wskazuje, że pomimo ich wspólnej aktywności enzymatycznej aktywności enzymatycznej, nie są one funkcjonalnie redundantne, przynajmniej w niektórych typach komórek. Można to wyjaśnić subtelnymi różnicami w ekspresji i/lub w rekrutacji i regulacji w ich specyficznym miejscu działania. --- Rodzina miotubularin jest dużą eukariotyczną grupą w ramach nadrodziny tyrozyny/nadrodziny fosfataz o podwójnej specyficzności (PTP/DSP). Wśród 14 ludzkich członków członków, trzech jest zmutowanych w chorobach genetycznych: miopatii miotubularnej i dwóch formach formy neuropatii Charcota-Marie-Tootha. Przedstawiamy analizę rodziny miotubularin w zsekwencjonowanych genomach. Rodzina miotubularin obejmuje katalitycznie aktywne i nieaktywne fosfatazy, a obie klasy są dobrze zachowane od nicieni do człowieka. Katalitycznie aktywne miotubulariny dephosphorylate phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) and PtdIns3,5P2, prowadząc do produkcji PtdIns i PtdIns5P. Aktywność ta może być modulowana przez bezpośrednią interakcję z katalitycznie nieaktywnymi miotubularinami. Te fosfoinozytydy są cząsteczkami sygnalizacyjnymi, które są szczególnie zaangażowane w wakuolarny transporcie wakuolarnym i transporcie błonowym. Proponuje się zatem, aby miotubularyny były zaangażowane w te mechanizmy komórkowe, a ostatnie obserwacje dotyczące homologi miotubularin u nicienia Caenorhabditis elegans wskazują na rolę w endocytozie. --- TŁO: Wykazano, że mutacje w co najmniej czterech genach z rodziny miotubularin (MTM1, MTMR1, 2 i 13) są przyczyną zaburzeń nerwowo-mięśniowych u ludzi. zaburzenia nerwowo-mięśniowe. Jednak szlak i mechanizm regulacyjny pozostają nieznane. METODOLOGIA / GŁÓWNE USTALENIA: Tutaj zgłosiliśmy nową rolę Mtmr8 w rozwoju nerwowo-mięśniowym zebry. rozwoju nerwowo-mięśniowym danio pręgowanego. Po pierwsze, sklonowaliśmy i scharakteryzowaliśmy zebrafish Mtmr8 i ujawniliśmy wzór ekspresji głównie w polu oka i somitach podczas wczesnej somitogenezy. Następnie, stosując nokaut morfolino, zaobserwowaliśmy, że utrata funkcji Mtmr8 prowadzi do defektów w somitogenezie. Następnie zbadano możliwy mechanizm i szlak sygnałowy. zbadane. Najpierw sprawdziliśmy fosforylację Akt i zaobserwowaliśmy wzrost fosforylacji Akt w morfogenezie. fosforylacji Akt w zarodkach morfantów. Ponadto zbadaliśmy funkcję domeny PH/G w obrębie Mtmr8. Chociaż delecja domeny PH/G sama w sobie nie nie powodowała defektu embrionalnego, dodanie inhibitora PI3K LY294002 powodowało wadliwy fenotyp u morfantów z delecją PH/G, wskazując, że domena PH/G była niezbędna dla funkcji Mtmr8. Ponadto zbadaliśmy współpracę Mtmr8 z PI3K w modelowaniu włókien aktyny i rozwoju mięśni. i odkryliśmy, że zarówno Mtmr8-MO1, jak i Mtmr8-MO2+LY294002 prowadziły do dezorganizacji cytoszkieletu aktynowego. Ponadto ujawniliśmy możliwy udział Mtmr8 w szlaku Hedgehog, a eksperymenty transplantacji komórek wykazały, że eksperymenty wykazały, że Mtmr8 działał w sposób niekomórkowy w modelowaniu aktyny. modelowanie. WNIOSEK/ZNACZENIE: Powyższe dane wskazują, że zachowana funkcjonalna współpraca współpraca Mtmr8 z PI3K reguluje modelowanie włókien aktyny i mięśnie rozwój u danio pręgowanego i ujawniają możliwy udział Mtmr8 w szlaku szlaku Hedgehog. Dlatego też praca ta dostarcza nowych wskazówek do badania fizjologicznej funkcji członków rodziny MTM. --- Rodzina białek MTM (myotubularin)/MTMR (myotubularin-related) składa się z 15 fosfataz lipidowych, z których dziewięciu członków jest aktywnych katalitycznie. MTM odgrywają fundamentalną rolę w fizjologii człowieka, ponieważ mutacje genów mogą mutacje genów mogą powodować miopatię miotubularną sprzężoną z chromosomem X lub chorobę Charcota-Marie-Tootha. które objawiają się odpowiednio w mięśniach szkieletowych lub neuronach obwodowych. Co ciekawe, badania wykazały, że MTMR2 i MTMR5, dwaj członkowie rodziny MTM, są wykazują wysoką ekspresję w jądrach, szczególnie w komórkach Sertoliego i komórkach zarodkowych, a nokaut nokaut któregokolwiek z genów skutkował defektami spermatogenetycznymi. Inne badania wykazały wykazały, że MTMR2 funkcjonuje w endocytozie i transporcie błonowym. W MTMR2 oddziałuje i kolokalizuje z c-Src/phospho-Src-(Tyr⁴¹⁶), niereceptorowym białkiem tyrozynowym. niereceptorową białkową kinazą tyrozynową, która reguluje stan fosforylacji białek w apikalnym ES (specjalizacja ektoplazmatyczna), unikalnym typie połączenia komórkowego między komórkami Sertoliego a wydłużającymi się/wydłużonymi spermatydami. W W niniejszym przeglądzie podkreślamy najnowsze odkrycia, które wywarły znaczący wpływ na nasze zrozumienie tej rodziny białek w prawidłowym funkcjonowaniu komórek i w chorobach, z naciskiem na rolę MTM i MTMR w spermatogenezie. My opisujemy również działający model wyjaśniający, w jaki sposób MTMR2 oddziałuje z innymi białkami, takimi jak takimi jak c-Src, dynamina 2, EPS8 (substrat szlaku receptora czynnika wzrostu 8) i ARP2/3 (białko związane z aktyną 2/3) w apikalnym ES i apikalnym TBC (kompleks tubulobulbar; rurkowate inaginacje, które funkcjonują w demontażu apikalnego ES i recyklingu jego składników) w celu regulacji plemnikowanie na późnym etapie VIII cyklu nabłonka nasiennego. --- TŁO: Autofagia jest wszechobecnym procesem komórkowym odpowiedzialnym za masową degradację składników cytoplazmy poprzez degradację składników cytoplazmatycznych poprzez szlak autofagosomalno-lizosomalny szlak autofagosomalno-lizosomalny. W mięśniach szkieletowych autofagia jest uważana za kluczowy regulator utrzymania masy mięśniowej. utrzymania masy mięśniowej, a jej brak równowagi prowadzi do sarkopenii. Jednak mechanizm mechanizm jest jednak słabo poznany. WYNIKI: W tym badaniu wykazaliśmy, że ceMTM3, domena FYVE zawierająca fosfataza z rodziny miotubalaryn, jest wymagana do utrzymania włókien mięśniowych poprzez zapobieganie nadmiernej autofagii. włókien mięśniowych poprzez zapobieganie nadmiernej autofagii u Caenorhabditis elegans. Zablokowanie ceMTM3 za pomocą interferencji RNA opartej na karmieniu spowodowało utratę włókien mięśniowych wraz ze skróceniem komórek mięśniowych i wielkości ciała u starzejących się robaków C. elegans. Było to poprzedzone wystąpieniem nadmiernej autofagii w mięśniach i innych tkankach. innych tkankach, co następnie skutkowało zwiększoną aktywnością lizosomalną i nekrotyczną śmiercią komórek. nekrotycznej śmierci komórek. Jednakże, knockdown ceMTM3 nie pogorszył nieprawidłowości wyniszczenia mięśni u zmutowanych robaków atg-18 z niedoborem autofagii. WNIOSKI: Nasze dane sugerują ważną rolę ceMTM3 w regulacji autofagii i utrzymaniu włókien mięśniowych. Badanie to może mieć kliniczne implikacje kliniczne dla zapobiegania i leczenia sarkopenii. --- Białko związane z miotubulariną 2 (MTMR2) jest członkiem rodziny miotubularin fosfataz lipidowych fosfoinozytydów. Chociaż MTMR2 defosforyluje fosfoinozytydy fosfoinozytydy PI(3)P i PI(3,5)P2, białka wiążące fosfoinozytydy które są regulowane przez MTMR2 są słabo scharakteryzowane. W tym badaniu, chromatografia powinowactwa fosfoinozytydów sprzężona ze spektrometrią mas zidentyfikowała receptor pośredniczący w endocytozie 8 (RME-8) jako nowe białko wiążące PI(3)P. RME-8 kolokalizował z markerem PI(3)P DsRed-FYVE, podczas gdy N-końcowy region RME-8 jest wymagany do wiązania PI(3)P i PI(3,5)P(2) in vitro. Pozbawienie PI (3) P przez MTMR2 S58A lub leczenie wortmaniną osłabiło endosomalną lokalizację RME-8 lokalizację i kolokalizację z EGFR na wczesnych endosomach. Nasze wyniki sugerują model, w którym lokalizacja RME-8 do przedziałów endosomalnych jest jest przestrzennie regulowana przez wiązanie PI(3)P i czasowo regulowana przez aktywność MTMR2. --- Rodzina fosfataz fosfoinozytydowych miotubularyny obejmuje kilku członków zmutowanych w chorobach nerwowo-mięśniowych lub związanych z zespołem metabolicznym, otyłością i rakiem. Katalitycznie martwe fosfatazy regulują swoje aktywne przez heterodimeryzację i potencjalnie reprezentują kluczowych graczy w równowadze fosfataza-kinaza. równowadze fosfataza-kinaza. Chociaż specyficzność enzymatyczna dla wskazuje na rolę miotubularin w endocytozie i transporcie błonowym. w endocytozie i transporcie błonowym, ostatnie odkrycia w modelach komórkowych i zwierzęcych sugerują, że że miotubularyny regulują dodatkowe procesy, w tym proliferację i różnicowanie komórek. różnicowanie, autofagię, cytokinezę oraz dynamikę cytoszkieletu i połączeń komórkowych. dynamikę cytoszkieletu i połączeń komórkowych. W niniejszym przeglądzie omawiamy, w jaki sposób miotubularyny regulują tak różnorodne procesy procesy, podkreślając nowo zidentyfikowane funkcje w kontekście fizjologicznym i patologicznym. kontekście fizjologicznym i patologicznym. Lepsze zrozumienie patofizjologii miotubularin utoruje drogę do strategii terapeutycznych. --- Białka związane z miotubulariną są dużą podrodziną białkowych fosfataz tyrozynowych (PTP). fosfataz tyrozynowych (PTP), które defosforylują D3-fosforylowane lipidy inozytolu. Mutacje u członków rodziny miotubularin powodują zaburzenia nerwowo-mięśniowe u ludzi, miopatię miotubularną. miopatię miotubularną i zespół Charcota-Marie-Tootha typu 4B. Struktura krystaliczna Struktura krystaliczna reprezentatywnego członka tej rodziny, MTMR2, ujawnia domenę domenę fosfatazy, która jest strukturalnie unikalna wśród PTP. Opisano serię mutantów mutantów, które wykazują zmienioną aktywność enzymatyczną i zapewniają wgląd w specyficzność fosfataz miotubularyny wobec substratów fosfoinozytydowych. Struktura ujawnia również, że domena GRAM, występująca w fosfatazach z rodziny miotubularin fosfatazach z rodziny miotubularin i przewidywana do występowania w około 180 białkach, jest częścią większego motywu z domeną pleckstrin homology (PH). Wreszcie, struktura MTMR2 będzie służyć jako model dla innych członków rodziny miotubularin i zapewnić ramy dla zrozumienia mechanizmu, w którym mutacje w tych białka prowadzą do choroby. --- Myotubularin jest archetypem rodziny wysoce konserwatywnych enzymów białkowo-tyrozynowych enzymów podobnych do fosfatazy białkowo-tyrozynowej. Gen miotubularyny, MTM1, jest zmutowany w zaburzeniu genetycznym, miopatii miotubularnej sprzężonej z chromosomem X. genetycznym, miopatii miotubularnej sprzężonej z chromosomem X. My i inni wykazaliśmy wcześniej, że miotubularyna wykorzystuje lipidowy drugi przekaźnik, fosfatydyloinozytol 3-fosforan (PI(3)P), jako substrat fizjologiczny. Wykazaliśmy tutaj, że białko związane z miotubularyną MTMR2, które jest zmutowane w neurodegeneracyjnej chorobie zaburzenie, choroba Charcot-Marie-Tooth typu 4B, jest również wysoce specyficzne dla PI(3)P jako substratu. Ponadto fosfatazy związane z MTM MTMR1, MTMR3, i MTMR6 również defosforylują PI(3)P, co sugeruje, że aktywność wobec tego substratu jest wspólna dla wszystkich miocytów. substratu jest wspólna dla wszystkich enzymów z rodziny miotubularin. Bezpośrednie porównanie aktywności fosfatazy lipidowej rekombinowanej miotubulariny i MTMR2 pokazuje, że ich właściwości enzymatyczne są nie do odróżnienia, wskazując że brak redundancji funkcjonalnej między tymi białkami jest prawdopodobnie z powodu czynników innych niż wykorzystanie różnych substratów fizjologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy transkrypty miotubularyny i MTMR2 podczas indukowanego różnicowania hodowanych mysich mioblastów C2C12 i stwierdziliśmy, że ich ekspresja jest rozbieżnie regulowana. Ponadto, miotubularyna i MTMR2 wykazują nakładające się, ale odmienne wzorce lokalizacji subkomórkowej. różne wzorce lokalizacji subkomórkowej. Wreszcie, dostarczamy dowodów na to, że miotubularyna, ale nie MTMR2, może modulować poziomy endosomalnego PI (3) P. Z tych danych wnioskujemy, że rozwój miotubularyny i MTMR2 nie jest możliwy. tych danych wnioskujemy, że ekspresja rozwojowa i subkomórkowa lokalizacja miotubulariny i MTMR2 jest różnie regulowana, co skutkuje w ich wykorzystaniu specyficznych komórkowych pul PI(3)P. --- Fosfatydyloinozytol (PtdIns) jest fosfolipidem błonowym składającym się z diacyloglicerolu i grupy D-myo-inozytolu. U ssaków grupy hydroksylowe w pozycjach D3, D4 i D5 pierścienia inozytolu mogą być fosforylowane do siedem pochodnych fosfoinozytolu. PtdIns-3,5-bisfosforan [PtdIns(3,5)P2] jest ostatnio odkrytym gatunkiem fosfoinozytydu, który jest generowany przez fosforylację PtdIns(3)P w pozycji D5 przez kinazę fosforanową PtdIns kinazę fosforanową i katabolizowany poprzez defosforylację przez rodzinę fosfataz miotubularyny rodzinę fosfataz. Analizy genetyczne i biochemiczne enzymów metabolizujących PtdIns(3,5)P2 ujawniły, że ten fosfolipid jest zaangażowany w kontrolę systemów endolizosomalnych i odgrywa kluczową rolę w różnych tkankach ssaków. tkankach ssaków. W tym artykule dokonujemy przeglądu aktualnego stanu wiedzy na temat metabolicznych / fizjologicznych funkcji PtdIns(3,5)P2 i opisujemy, w jaki sposób zaburzenia tych funkcji mogą przyczyniać się do rozwoju chorób u ludzi. --- Choroba Charcota-Marie-Tootha typu 4B (CMT4B) jest ciężką, demielinizacyjną neuropatią obwodową. demielinizacyjną, charakteryzującą się charakterystycznymi, ogniskowo pofałdowanymi osłonkami mielinowymi. osłonek mielinowych. CMT4B jest spowodowana recesywnie dziedziczonymi mutacjami w genach miotubularin-related 2 (MTMR2) lub MTMR13 (zwanym również czynnikiem wiążącym SET 2). MTMR2 koduje członka rodziny miotubularin z grupy fosforyloinozyto-3-fosfataz, które defosforylują fosfatydyloinozytol 3-fosforan (PI(3)P) i bisfosforan PI(3,5)P2. MTMR13 koduje duży, niescharakteryzowanego członka rodziny miotubularin. Domena fosfatazy MTMR13 jest katalitycznie nieaktywna, ponieważ brakuje w niej niezbędnych reszt Cys i Arg. Biorąc pod uwagę genetyczne powiązanie zarówno MTMR2, jak i MTMR13 z CMT4B, my zbadaliśmy biochemiczny związek między tymi dwoma białkami. Stwierdziliśmy że endogenne białka MTMR2 i MTMR13 są związane w ludzkich embrionalnych komórkach nerki 293. komórkach nerki 293. Asocjacja MTMR2-MTMR13 jest pośredniczona przez sekwencje coiled-coil obecne w każdym białku. Zbadaliśmy również lokalizację komórkową MTMR2 i MTMR13 przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i frakcjonowania subkomórkowego. Stwierdziliśmy że (i) MTMR13 jest białkiem głównie związanym z błoną; (ii) MTMR2 i MTMR13 współfrakcjonują zarówno we frakcji lekkiej błony, jak i we frakcji cytozolowej; oraz (iii) w asocjacji błonowej MTMR13 pośredniczy segment białka który zawiera domenę pseudofosfatazy. Ta praca, która opisuje pierwsze komórkowe lub biochemiczne badanie pseudofosfatazy MTMR13 sugeruje, że MTMR13 funkcjonuje w połączeniu z MTMR2. Utrata MTMR13 u pacjentów z CMT4B2 może prowadzić do zmian w funkcji MTMR2 i a następnie zmiany w sygnalizacji 3-fosfoinozytydowej. Taki mechanizm wyjaśniałby uderzająco podobne fenotypy pacjentów z recesywnymi mutacjami w MTMR2 lub MTMR13. --- Wykazano, że miotubularyna, fosfataza zmutowana w miopatii miotubularnej sprzężonej z chromosomem X fosforyluje 3-monofosforan fosfatydyloinozytolu (PtdIns3P) i jest również interakcji z jądrowymi regulatorami transkrypcji z rodziny trithorax trithorax. Scharakteryzowaliśmy panel specyficznych przeciwciał i zbadaliśmy subkomórkową lokalizację miotubulariny. Miotubularina nie jest wykrywana w jądrze jądrze i lokalizuje się głównie jako gęsta sieć cytoplazmatyczna. Nadekspresja miotubulariny nie wpływa w wykrywalny sposób na przemieszczanie się pęcherzyków w komórkach ssaków. badanych komórkach ssaków, w przeciwieństwie do wcześniejszych obserwacji w modelach drożdżowych. Zarówno mutacja kluczowej reszty asparaginianowej miotubulariny i dominująca aktywacja GTPazy GTPazy Rac1 prowadzą do rekrutacji miotubulariny do określonych domen błony plazmatycznej. domen. Lokalizacja w indukowanych przez Rac1 marszczeniach jest zależna od obecności domeny domeny wysoce konserwatywnej w rodzinie miotubularin (którą nazwaliśmy RID). W ten sposób proponujemy, że miotubularyna może defosforylować subpula PtdIns3P (lub innego pokrewnego substratu) w błonie plazmatycznej. --- 3-fosforan fosfatydyloinozytolu [PtdIns(3)P] reguluje ruch endocytarny i sortowanie receptorów przez wczesne endosomy, w tym szybki recykling transferyny (Tfn). Jednak fosfataza fosfoinozytydowa, która selektywnie przeciwstawia się tej funkcji jest nieznana. Miotubularyny są rodziną osiem katalitycznie aktywnych i sześć nieaktywnych enzymów, które hydrolizują PtdIns(3)P do tworząc PtdIns. Jednak rola, jaką każdy członek rodziny miotubularin odgrywa w regulując endosomalne PtdIns (3) P, a tym samym handel endocytarny nie jest dobrze ustalona. Tutaj zidentyfikowaliśmy członka rodziny miotubularin MTMR4, który lokalizuje się do wczesnych endosomów, a także do recyklingu Rab11- i Sec15-pozytywny endosomów. W komórkach z knockdownem MTMR4 lub po ekspresji MTMR4, MTMR4(C407A), liczba endosomów dekorowanych PtdIns(3)P znacznie wzrosła. znacznie wzrosła. Nadekspresja MTMR4 opóźniała wyjście Tfn z wczesnych endosomów i jego recykling do błony plazmatycznej. Natomiast, ekspresja MTMR4(C407A), która działa jako konstrukt dominująco-ujemny, znacznie przyspieszyła recykling Tfn. Jednak w komórkach MTMR4 knockdown recykling Tfn recykling był niezmieniony, co sugeruje, że inne MTM mogą również przyczyniać się do recyklingu. MTMR4 regulował subkomórkową dystrybucję Rab11 i, w komórkach z nokautem MTMR4 za pośrednictwem RNAi, Rab11 został skierowany z dala od pericentriolarnego przedziału recyklingu. Subkomórkowa dystrybucja VAMP3, białka v-SNARE, które znajduje się w endosomach recyklingu i pęcherzykach transportowych pochodzących z endosomów. pęcherzyków transportowych, była również regulowana przez MTMR4. Dlatego MTMR4 lokalizuje się na interfejsie wczesnych i recyklingowych endosomów, aby regulować przemieszczanie się przez ten szlak. --- Ludzkie choroby nerwowo-mięśniowe miopatia miotubularna sprzężona z chromosomem X i choroba Charcota-Marie-Tootha typu 4B są spowodowane mutacjami miotubuliny. Charcota-Marie-Tootha typu 4B są spowodowane mutacjami w białkach rodziny miotubuliny rodziny białek miotubularnych. Miotubularyny są unikalną podrodziną białkowych fosfataz tyrozynowych. fosfataz, które wykorzystują fosfolipidy inozytolu, a nie fosfoproteiny, jako substraty. Ostatnie badania strukturalne, w tym pierwsza struktura krystaliczna białka z rodziny miotubularin, określiły cechy strukturalne, które są charakterystyczne dla tej rodziny i ujawniły molekularne podstawy ich unikalnej specyficzności substratowej. Co ciekawe, rodzina miotubularin zawiera podgrupę białek, które są podgrupę białek, które są katalitycznie nieaktywne. Ostatnie badania biochemiczne biochemiczne wykazały, że nieaktywne miotubularyny funkcjonują jako adaptory dla aktywnych członków i odgrywają ważną rolę regulacyjną w rodzinie. --- Inicjacja autofagii jest ściśle zależna od syntezy 3-fosforanu fosfatydyloinozytolu (PI3P). Produkcja PI3P jest pod ścisłą kontrolą PI3Kinazy, hVps34, w kompleksie z Beclin-1. Komórki ssaków wyrażają kilka fosfataz PI3P, które należą do rodziny miotubularin. Mimo że niektóre z nich zostały powiązane z poważnymi chorobami człowieka, ich funkcja komórkowa jest w dużej mierze nieznana. Dwa ostatnie badania wskazują, że metabolizm PI3P zaangażowany w inicjację autofagii jest dalej regulowany przez fosfatazy PI3P Jumpy i MTMR3. Dodatkowe pule PI3P, przed mTOR i na szlaku endocytarnym, mogą modulować autofagię pośrednio, sugerując, że inne fosfatazy PI3P mogą być zaangażowane w ten proces. procesie. Niniejszy przegląd podsumowuje naszą wiedzę na temat fosfataz PI3P i omawia ostatnie postępy w zakresie ich roli w autofagii. --- Miotubularyny (MTM) stanowią dużą rodzinę lipidowych fosfoinozytydów 3-fosfataz o specyficzności dla PtdIns3P i PtdIns (3,5)P2. Mutacje w białkach MTM są związane z dziedzicznymi schorzeniami, takimi jak miopatia miotubularna miopatia miotubularna i zespół Charcota-Marie-Tootha. Wiadomo, że lipidy substratowe są regulatorami szlaku endosomalnego poprzez rekrutację specyficznych białek efektorowych. białek efektorowych. Hydroliza PtdIns (3,5)P2 zapewnia szlak biosyntezy do produkcji PtdIns5P. produkcji PtdIns5P, który sam w sobie może allosterycznie aktywować MTM. Dokonaliśmy przeglądu właściwości tej intrygującej rodziny białek i omawiamy potencjalne funkcje fizjologiczne, które obejmują regulację szlaku endocytarnego. --- Geny związane z miotubuliną definiują dużą rodzinę białek eukariotycznych, większość z nich początkowo charakteryzowała się obecnością sekwencji konsensusowej dziesięciu aminokwasów sekwencji konsensusowej związanej z miejscami aktywnymi fosfataz tyrozynowych, fosfataz białkowych o podwójnej specyficzności i fosfatazy lipidowej PTEN. Myotubularin (hMTM1), członek założyciel, jest zmutowany w miopatii miotubularnej, a jego bliski homolog (hMTM1) jest zmutowany w miopatii miotubularnej. bliski homolog (hMTMR2) został niedawno znaleziony zmutowany w recesywnej formie Charcot-Marie-Tooth. Chociaż uważano, że miotubularyna jest fosfatazą białkową o podwójnej specyficzności, ostatnie wyniki wskazują, że jest to przede wszystkim fosfatazą lipidową, działającą na 3-monofosforan fosfatydyloinozytolu, i może być zaangażowana w regulację szlaku 3-kinazy fosfatydyloinozytolu (PI 3-kinazy) i transportu błonowego. --- Poziom i obrót fosfoinozydów (PI) są ściśle kontrolowane przez duży zestaw enzymów duży zestaw enzymów specyficznych dla PI (kinazy i fosfatazy PI). Fosfatazy PI są konserwowane na drodze ewolucji, a wśród tej dużej rodziny znajduje się fosfataz o podwójnej specyficzności (PTP/DSP) są enzymami niezależnymi od metali, wykazującymi sygnaturę aminokwasową Cys-X5-Arg-Thr/Ser (CX5RT/S) w ich miejscu aktywnym. Takie miejsce katalityczne charakteryzuje 3-fosfatazy miotubularyny, które fosforylują PtdIns3P i PtdIns(3,5)P₂ i wytwarzają PtdIns5P. Substraty miotubularyny są zaangażowane w endocytozę i transport błonowy, podczas gdy PtdIns5P może odgrywać rolę w transdukcji sygnału. Paradoksalnie, 6 z 14 członków rodziny miotubularin nie wykazuje aktywności enzymatycznej i jest uważanych za martwe fosfatazy. Kilka miotubularin zostało genetycznie powiązanych z ludzkimi chorobami chorobami: MTM1 jest zmutowana we wrodzonej miopatii X-linked centronuclear or miopatii miotubularnej (XLCNM), a MTMR14 (JUMPY) został powiązany z autosomalną postacią tej choroby. formą takiej choroby, podczas gdy MTMR2 i MTMR13 są zmutowane w neuropatii Charcot-Marie-Tooth (CMT). Ponadto, ostatnie dowody z genetycznych badań asocjacyjnych ujawniły, że kilka innych miotubularin może być związanych z przewlekłymi chorobami, takimi jak rak i otyłość. zaburzeniami, takimi jak rak i otyłość, podkreślając ich znaczenie dla ludzkiego zdrowia. zdrowia. Tutaj omawiamy komórkowe i fizjologiczne role miotubularin oraz ich ich znaczenie w chorobach człowieka, a także przedstawiamy potencjalne mechanizmy patologiczne patologiczne wpływające na określone tkanki w chorobach związanych z miotubularinami. --- Myotubulariny (MTM) stanowią dużą rodzinę fosfataz lipidowych, które specyficznie defosforylują fosfatydyloinozytol (3)P. MTM1 i MTM2 są zmutowane odpowiednio w miopatii miotubularnej sprzężonej z chromosomem X i chorobie Charcota-Marie-Tootha (typ 4B), chociaż mechanizmy, w których dysfunkcja MTM prowadzi do tych chorób, są nieznane. tych chorób jest nieznany. Aby uzyskać wgląd w funkcję MTM, podjęliśmy się badanie MTM u nicienia Caenorhabditis elegans, który posiada reprezentatywne homologi czterech głównych podgrup MTM zidentyfikowanych u ssaków. ssaków. Podobnie jak u ssaków, odkryliśmy, że MTM C. elegans pośredniczą w różnych funkcjach. funkcje. let-512 (vps34) koduje homolog C. elegans drożdży i ssaków. ssaków homologa 3-kinazy fosfatydyloinozytolu Vps34. Stwierdziliśmy, że zmniejszenie funkcji mtm-6 (F53A2.8) przez hamowanie RNA uratowało larwalną letalność mutantów let-512 (vps34) i że redukcja aktywności mtm-1 (Y110A7A.5) przez inhibicję RNA ratowało defekt endocytozy zwierząt let-512. Łącznie obserwacje te dostarczają dowodów genetycznych, że MTM negatywnie regulują poziom fosfatydyloinozytolu (3)P. Analiza wzorców ekspresji MTM przy użyciu transkrypcyjnych reporterów białka zielonej fluorescencji wykazała, że te dwa MTM wykazują w większości nienakładające się wzorce ekspresji i że białka fuzyjne MTM-zielona fluorescencja są zlokalizowane w różnych miejscach subkomórkowych. lokalizacjach subkomórkowych. Obserwacje te sugerują, że niektóre z różnych funkcje MTM mogą być częściowo konsekwencją unikalnych wzorców ekspresji i lokalizacji. wzorców ekspresji i lokalizacji. Jednak nasze odkrycie, że co najmniej trzy MTM C. elegans odgrywają istotną rolę w endocytozie koelomocytów, procesie, który również wymaga VPS34, wskazuje, że MTM nie tylko wyłączają VPS34, ale nieoczekiwanie również działają jako pozytywne regulatory procesów biologicznych. --- Miotubularyny są dużą rodziną fosfataz lipidowych o specyficzności wobec PtdIns3P i PtdIns(3,5)P(2). Każdy z 14 członków rodziny posiada domenę fosfatazy, która w sześciu przypadkach jest nieaktywna z powodu zmian aminokwasowych w miejscu katalitycznym. zmiany aminokwasów w miejscu katalitycznym. Fragmentaryczne dane wskazują na heteromeryczne między miotubularinami, które dotychczas łączyły aktywnego członka rodziny z nieaktywnym. aktywnego członka rodziny z nieaktywnym. W tym badaniu przeprowadziliśmy analizę na dużą skalę analizę potencjalnych powiązań w obrębie ludzkiej rodziny miotubularin, poprzez ukierunkowane badania dwuhybrydowe i immunoprecypitację białek znakowanych epitopem białek. Potwierdziliśmy wszystkie wcześniej zgłoszone połączenia i zidentyfikowaliśmy nowe interakcje heteromeryczne: MTMR8 z MTMR9 i MTMR3 z MTMR4, pierwszą taką kombinację enzymatycznie aktywnych białek. pierwsza taka kombinacja enzymatycznie aktywnych MTM. Zgłosiliśmy również zdolność kilku członków rodziny do samoasocjacji, w tym MTMR3 i MTMR4. Badania lokalizacji subkomórkowej ujawniają unikalną dystrybucję MTMR4 do struktur endosomalnych, głównego miejsca akumulacji lipidów substratowych. Wszystkie aktywne MTM (MTM1, MTMR2-MTMR4) zmniejszają endosomalne poziomy PtdIns3P po nadekspresji. nadekspresji. Mimo to tylko MTMR4 wywiera jakikolwiek wpływ na przemieszczanie się i degradację receptora EGF przemieszczanie się i degradację, co jest bardziej wyraźne w przypadku fosfatazy MTMR4 i wymaga nienaruszonej domeny FYVE. --- 3-fosforan fosfatydyloinozytolu [PtdIns(3)P] działa jako drugi przekaźnik poprzez rekrutację różnych białek sygnalizacyjnych do różnych przedziałów komórkowych. Ostatnie postępy podkreśliły związek chorób człowieka z mutacjami mutacjami w fosfatazach, które regulują poziom PtdIns(3)P. Myotubularin, gen zmutowany w miopatii miotubularnej, funkcjonuje jako fosfataza lipidowa o Specyficzność dla PtdIns(3)P. Jest teraz oczywiste, że istnieje coraz większa rodzina białek, które są zdefiniowane przez poziom PtdIns(3)P. białek, które są zdefiniowane przez ich znaczącą homologię z miotubularyną. miotubularyną. Rodzina genów związanych z miotubulariną obejmuje białka, które wykazują motyw katalityczny fosfatazy lipidowej, te, które zawierają mutacje krytycznych reszt katalitycznych. mutacje krytycznych reszt katalitycznych i co najmniej jedno białko, które funkcjonuje jako podjednostka podjednostka adaptera dla aktywności fosfatazy PtdIns(3)P-3. Obecnym wyzwaniem jest zrozumieć, w jaki sposób deregulacja metabolizmu fosfoinozytydów powoduje choroby. --- MTMR2 jest członkiem rodziny miotubularin fosfataz lipidowych inozytolu, podgrupy dużej podgrupy fosfataz białkowo-tyrozynowych, która jest konserwowana od drożdży do ludzi. Ponadto, obwodowa choroba nerwowo-mięśniowa Charcot-Marie Tooth typu 4B została przypisana mutacjom w genie mtmr2. Ponieważ mechanizmy molekularne regulujące MTMR2 zostały słabo zdefiniowane, zbadaliśmy czy odwracalna fosforylacja może regulować funkcję MTMR2. Wykorzystaliśmy metody metody oparte na spektrometrii mas, aby zidentyfikować miejsce fosforylacji o wysokiej stechiometrii na serynie 58 MTMR2. Fosforylacja w Ser(58) lub fosfomimetyczna mutacja S58E znacznie zmniejszyła lokalizację MTMR2 do endocytarnych struktur pęcherzykowych. struktury. W przeciwieństwie do tego, mutant MTMR2 z niedoborem fosforylacji (S58A) wykazywał konstytutywną lokalizację do wczesnych struktur endocytarnych. Ten wzorzec lokalizacji towarzyszyło przemieszczenie czujnika specyficznego dla PI(3)P i wzrost szlaków transdukcji sygnału. Zatem fosforylacja MTMR2 jest prawdopodobnie krytycznym mechanizmem, za pomocą którego MTMR2 uzyskuje dostęp do jego substrat(y) lipidowy(e) jest regulowany czasowo i przestrzennie, tym samym przyczyniając się do kontroli dalszych zdarzeń dojrzewania endosomów. --- Rodzina fosfataz białkowo-tyrozynowych (PTP) obejmuje dużą i zróżnicowaną grupę enzymów regulujących szereg procesów biologicznych poprzez grupę enzymów, regulujących szereg procesów biologicznych poprzez de-fosforylację wielu białek i lipidów. Enzymy te mają wspólny mechanizm katalityczny mechanizm katalityczny, który wymaga zredukowanego i reaktywnego nukleofila cysteinowego, co czyni je potencjalnie wrażliwe na inaktywację i regulację przez utlenianie. Analiza PTP zidentyfikowała znaczne różnice we wrażliwości tych enzymów na utlenianie in vitro. Bardziej szczegółowe eksperymenty potwierdziły następującą kolejność kolejność wrażliwości: PTEN i Sac1>PTPL1/FAP-1>>myotubulariny. Kiedy wrażliwość na utlenianie tych PTP w komórkach poddanych działaniu nadtlenku wodoru nadtlenkiem wodoru, korelowało to dobrze z obserwowaną wrażliwością na utlenianie in vitro. Dane te sugerują, że różne PTP mogą należeć do co najmniej trzech różnych klas pod względem mechanizmów co najmniej trzech różnych klas w odniesieniu do mechanizmów komórkowej regulacji redoks komórkowej. 1. PTEN i Sac1 były łatwo i odwracalnie utleniane in vitro i w komórkach poddanych działaniu nadtlenku wodoru. 2. PTPL1 okazał się odporny na utlenianie w komórkach, korelując z jego wrażliwością na redukcję przez glutation in vitro 3. Rodzina fosfataz lipidowych myotubularin była prawie całkowicie odporna na utlenianie in vitro i w komórkach. Nasze wyniki pokazują, że wrażliwość na odwracalne utlenianie nie jest konieczną cechą PTP i sugerują, że taka wrażliwość że taka wrażliwość wyewoluowała jako mechanizm regulacyjny dla niektórych z tej dużej rodziny, ale nie innych. --- Miotubularyny, duża rodzina katalitycznie aktywnych i nieaktywnych białek, należą do unikalnej podgrupy białkowych fosfataz tyrozynowych, które wykorzystują fosfolipidy inozytolu fosfolipidy, a nie fosfoproteiny, jako substraty fizjologiczne. Tutaj, integrując badania krystalograficzne i spektrometrii mas z wymianą deuteru ludzkiego białka związanego z miotubularyną-2 (MTMR2) w kompleksie z fosfoinozytydami, definiujemy molekularne podstawy tej unikalnej specyficzności substratowej. specyficzności. Substraty fosfoinozytydowe wiążą się w kieszeni zlokalizowanej na dodatnio naładowanej powierzchni białka, co sugeruje elektrostatyczny mechanizm dla ukierunkowania na błonę. Elastyczna, hydrofobowa helisa powoduje rozległe interakcje z cząsteczkami diacyloglicerolu substratów, wyjaśniając specyficzność dla fosfoinozydów związanych z błoną. Rozległa sieć wiązań H i interakcje ładunek-ładunek w kieszeni miejsca aktywnego określają specyficzność grupy funkcyjnej fosfoinozytydu. Zachowanie tej specyficzności determinantów w obrębie aktywnych, ale nie nieaktywnych miotubularin zapewnia wgląd w funkcjonalne różnice między aktywnymi i nieaktywnymi członkami. --- Myotubulariny (MTM) są dużą podrodziną fosfataz lipidowych, które specyficznie defosforylują w pozycji D3 fosfatydyloinozytolu 3-fosforanu (PI(3)P) w PI(3)P i PI(3,5)P2. Niedawno odkryliśmy, że MTMR6 specyficznie hamuje aktywowany przez Ca2+ kanał K+, KCa3.1, poprzez Teraz pokazujemy, że hamowanie jest specyficzne dla MTMR6, a inne MTM nie hamują tego kanału. inne MTM nie hamują KCa3.1. Zastępując jedną lub obie cewki zwijane (CC) i domeny pleckstrin homology / GRAM (PH / GR) MTM, które nie hamowały KCa3.1 domenami CC i PH/G MTMR6, odkryliśmy, że chimeryczne MTMs zawierające zarówno domeny CC MTMR6, jak i PH / G funkcjonowały jak MTMR6 w celu hamowania aktywność kanału KCa3.1, podczas gdy chimeryczne MTM zawierające tylko jedną domenę nie. Mikroskopia immunofluorescencyjna wykazała, że zarówno domeny MTMR6 CC, jak i PH / G są wymagane do kolokalizacji MTMR6 z błoną plazmatyczną z KCa3.1. Odkrycia te potwierdzają model, w którym dwie specyficzne interakcje o niskim powinowactwie interakcje są wymagane do kolokalizacji MTMR6 z KCa3.1: 1) między domenami CC na MTMR6 i KCa3.1 oraz (2) między domeną PH/G i składnikiem błony plazmatycznej. błoną plazmatyczną. Nasza niezdolność do wykrycia znaczącej interakcji domeny MTMR6 G/PH z fosfoinozytydami sugeruje, że domena ta może wiązać białko. białko. Identyfikacja specyficznych partnerów wiążących domeny CC i PH/G na innych MTM innych MTM dostarczy ważnych wskazówek na temat specyficznych funkcji regulowanych przez inne MTM, a także mechanizmy, w których utrata niektórych MTM prowadzi do choroby. --- Fosfoinozytydy kontrolują wiele różnych procesów wymaganych do prawidłowego funkcjonowania komórek. funkcji. Myotubulariny to rodzina fosfataz 3-fosforanu fosfatydyloinozytolu (PtdIns3P) zidentyfikowana przez pozycyjne klonowanie genu MTM1 u pacjentów cierpiących na miopatię miotubularną sprzężoną z chromosomem X i genu MTMR2 u pacjentów cierpiących na neuropatię demielinizacyjną Charcot-Marie-Tooth typu 4B. typu 4B. MTM1 jest fosfatazą fosfatydyloinozytolu o specyficzności względem PtdIns3P, podczas gdy pokrewne białka MTMR2 i MTMR3 hydrolizują zarówno PtdIns3P i PtdIns(3,5)P2. Zbadaliśmy MTM1 i MTMR6 i stwierdziliśmy, że wykorzystują PtdIns(3,5)P2 oprócz PtdIns3P jako substratu in vitro. The produkt hydrolizy PtdIns(3,5)P2, PtdIns5P, powoduje, że MTM1 tworzy heptameryczny pierścień o średnicy pierścień o średnicy 12,5 nm i jest specyficznym aktywatorem allosterycznym MTM1, MTMR3 i MTMR6. Mutacja powodująca chorobę w argininie 69 MTM1 mieszcząca się w domniemanej domenie homologii pleckstryny zmniejsza zdolność enzymu do reagowania na PtdIns5P. Proponujemy, aby rodzina enzymów miotubularyny wykorzystuje zarówno PtdIns3P, jak i PtdIns(3,5)P2 jako substraty, a PtdIns5P funkcjonuje w pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego kontrolującej ich aktywność. Odkrycia te podkreślają znaczenie regulowanej aktywności fosfatazy dla kontroli metabolizmu fosfoinozytydów. metabolizmu fosfoinozytydów. --- W komórkach eukariotycznych fosfatydyloinozytol podlega zróżnicowanej fosforylacji, co skutkuje produkcją siedmiu różnych fosforanów fosfatydyloinozytolu, często określanych jako fosfoinozytydy (PI). PI mają wiele różnych ról w regulacji komórkowej i transporcie błonowym. błonowych. Ostatnio fosfatazy PI 3 z rodziny miotubularin pojawiły się jako kluczowe regulatory fosfatydyloinozytolu. regulatory fosfatydyloinozytolu 3-fosforanu i fosfatydyloinozytolu 3,5-bisfosforan, dwa PI, które regulują ruch w szlaku endosomalno-lizosomalnym szlaku endosomalno-lizosomalnego. Mutacje w kilku genach miotubuliny prowadzą do miopatii miotubularnej i neuropatii obwodowej Charcota-Marie-Tootha. Uderzające jest to, że prawie połowa członków ludzkiej rodziny miotubularin wydaje się być katalitycznie nieaktywna. Kilka nieaktywnych miotubularin pełni istotne funkcje u ssaków. Ostatnie prace w komórkach ssaków i organizmach modelowych rzucają światło na role miotubularin w ruchu błonowym.
Jaka jest aktywność enzymatyczna białek z rodziny miotubularin?
Rodzina białek myotubularin to lipidowe fosfatazy inozytolu