TŁO: Interakcje białek kontrolują sieci regulacyjne leżące u podstaw procesów rozwojowych. procesy rozwojowe. Zrozumienie złożoności rozwojowej będzie zatem będzie wymagało scharakteryzowania interakcji białkowych w ich odpowiednim środowisku. Technologia dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) oferuje taką możliwość, ponieważ umożliwia bezpośrednią wizualizację interakcji białkowych w żywych komórkach. interakcji białkowych w żywych komórkach. Jednak jej potencjał rzadko był w zarodkach zwierzęcych organizmów modelowych i była wykonywana tylko przy przejściowych poziomach ekspresji białek. przejściowych poziomach ekspresji białek. WYNIKI: Wykorzystując partnerstwo białek Hox jako przypadek testowy, zbadaliśmy przydatność BiFC do badania interakcji białek w żywym zarodku Drosophila. zarodku Drosophila. Co ważne, wszystkie parametry BiFC zostały ustalone przy użyciu konstruktów które uległy stabilnej ekspresji pod kontrolą endogennych promotorów. W tych warunkach fizjologicznych wykazaliśmy, że BiFC jest wystarczająco wystarczająco czułe, aby analizować dynamiczne interakcje białek. Następnie wykorzystaliśmy BiFC w interakcji, co doprowadziło do identyfikacji kilku partnerów białek Hox partnerów białkowych. WNIOSEK: Nasze wyniki potwierdzają ogólną przydatność BiFC do ujawniania i badania interakcji białkowych w ich kontekście fizjologicznym podczas szybkiego rozwoju embrionalnego Drosophila. --- Do analizy interakcji białkowych opracowano wiele metod eksperymentalnych. interakcji białkowych. Większość z tych metod wymaga albo przerwania komórek w celu wykrycia interakcji molekularnych lub polega na pośrednim wykrywaniu interakcji białek. interakcji białek. Test dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) zapewnia bezpośrednie podejście do wizualizacji interakcji molekularnych w żywych komórkach i organizmach. żywych komórkach i organizmach. Podejście BiFC opiera się na ułatwionym między dwoma fragmentami białka fluorescencyjnego, gdy fragmenty te są łączone przez interakcję między białkami połączonymi z fragmentami. Podejście BiFC zostało wykorzystane do wizualizacji interakcji między różnymi strukturalnie różnorodnych strukturalnie partnerów interakcji w wielu różnych typach komórek. typach komórek. Umożliwia wykrywanie przejściowych kompleksów, jak również kompleksów utworzonych przez subpopulację partnerów interakcji. Niezbędne jest uwzględnienie kontroli negatywnych w każdym eksperymencie, w którym interfejs między partnerami partnerów interakcji został zmutowany lub usunięty. Test BiFC został do jednoczesnej wizualizacji wielu kompleksów białkowych w tej samej komórce kompleksów białkowych w tej samej komórce i rywalizacji o wspólnych partnerów interakcji. Test komplementacji został również opracowany do wizualizacji kowalencyjnej modyfikacji białek. kowalencyjnej modyfikacji białek przez peptydy z rodziny ubikwityny. Te fluorescencyjne testy komplementarności mają ogromny potencjał, aby w przyszłości różnorodnych interakcji biologicznych w przyszłości. --- Interakcje białko-białko odgrywają kluczową rolę w koordynowaniu wielu procesów komórkowych. procesów komórkowych. Określenie subkomórkowej lokalizacji oddziałujących białek i wizualizacja dynamicznych interakcji wizualizacja dynamicznych interakcji w żywych komórkach są kluczowe dla wyjaśnienia komórkowych funkcji białek. Wykorzystując białka fluorescencyjne, wcześniej bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) oraz wielokolorowy test BiFC do do wizualizacji interakcji białko-białko w żywych komórkach. Jednak czułość dojrzewania chromoforu wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego fluorescencyjnego (YFP) do wyższych temperatur wymaga wstępnej inkubacji w niższych temperaturach przed wizualizacją temperaturach przed wizualizacją sygnału BiFC. Może to potencjalnie ograniczyć ich zastosowania do badania wielu cząsteczek sygnałowych. Tutaj przedstawiamy identyfikację nowych fragmentów białek fluorescencyjnych pochodzących z Venus i Cerulean do testów BiFC i wielokolorowych BiFC w warunkach hodowli fizjologicznej. warunkach fizjologicznych. Co ważniejsze, nowo zidentyfikowane kombinacje wykazują 13-krotnie wyższą wydajność BiFC niż pierwotnie zidentyfikowane fragmenty pochodzące z YFP. Ponadto, zastosowanie nowych kombinacji zmniejsza ilość plazmidu wymaganego do transfekcji i skraca czas inkubacji, prowadząc do 2-krotnego wzrostu specyficznych sygnałów BiFC. Te nowo zidentyfikowane fragmenty białek fluorescencyjnych fluorescencyjne ułatwią badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach komórkach i całych zwierzętach w warunkach fizjologicznych.
Jakie jest zastosowanie testu dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w zarodkach Drosophila?
Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC) jest skuteczną metodą badania interakcji białko-białko w różnych typach komórek i organizmów. Metoda ta została niedawno opracowana u muszki owocowej Drosophila melanogaster, umożliwiając analizę właściwości interakcji białek w fizjologicznie istotnym kontekście rozwoju.