Rif1, pierwotnie rozpoznany ze względu na swoją rolę w telomerach u pączkujących drożdży, był jest zaangażowana w wiele różnych procesów komórkowych u ssaków, w tym pluripotencję komórek macierzystych, odpowiedź na podwójne pęknięcia nici i rozwój raka piersi. rozwój raka piersi. Ponieważ funkcja molekularna Rif1 nie jest znana, zbadaliśmy konsekwencje niedoboru Rif1 w komórkach myszy. Niedobór Rif1 prowadzi do niepowodzenia w rozwoju embrionalnym, a warunkowa delecja Rif1 z mysich fibroblastów zarodka wpływa na progresję fazy S, czyniąc komórki nadwrażliwymi na trucizny replikacyjne. trucizny replikacyjne. Niedobór Rif1 nie zmienia aktywacji punktu kontrolnego replikacji DNA ale raczej wpływa na wykonanie naprawy. RNA RNA na ludzki Rif1 zmniejsza wydajność naprawy ukierunkowanej homologicznie (HDR), a Rif1 zmniejsza wydajność naprawy ukierunkowanej homologicznie (HDR). (HDR), a niedobór Rif1 powoduje nieprawidłowe agregacje czynnika HDR Rad51. Zgodnie z rolą w progresji fazy S, Rif1 gromadzi się na zatrzymanych widełkach replikacyjnych, preferencyjnie wokół pericentromerycznej heterochromatyny. heterochromatyny. Podsumowując, odkrycia te ujawniają funkcję Rif1 w naprawie zablokowanych widełek poprzez ułatwianie HDR. --- Pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) są wysoce toksyczne dla komórek, a akumulacja DSBs powoduje szereg szkodliwych skutków w różnych procesach komórkowych które mogą prowadzić do zaburzeń neurologicznych, immunologicznych i rozwojowych. Niepowodzenie naprawy DSBs pobudza mutagenezę i jest siłą napędową nowotworów, podkreślając w ten sposób znaczenie dokładnej naprawy DSB. Dwa główne kanoniczne szlaki naprawy DSB to niehomologiczne łączenie końców (ang. non-homologous end joining (NHEJ) i rekombinacja homologiczna (HR). 53BP1 i BRCA1 są kluczowymi białkami kluczowymi białkami mediatorowymi, które koordynują z innymi składnikami mechanizmu naprawy DNA DNA odpowiednio w szlakach NHEJ i HR, a ich wyłączna rekrutacja do pęknięć/końców rekrutacja do pęknięć/końców DNA potencjalnie decyduje o wyborze naprawy przez NHEJ lub HR. Niedawno czynnik interakcji Rap1 1 został zidentyfikowany jako ważny składnik szlaku naprawy DNA, który działa w dół łańcucha ATM/53BP1 w celu zahamowania resekcji 5'-3' uszkodzonych końców DNA, co z kolei ułatwiając naprawę NHEJ i hamując naprawę ukierunkowaną homologicznie. Rif1 jest zachowana od drożdży do ludzi, ale jej funkcja ewoluowała od regulacji długości telomerów w drożdżach do utrzymania w drożdżach do utrzymania integralności genomu w komórkach ssaków. Ostatnio jego rola w utrzymaniu integralności genomu została rozszerzona na regulację struktury chromatyny, czasu replikacji i punktu kontrolnego fazy intra-S . Przedstawiamy podsumowanie tych ważnych odkryć, podkreślając różne aspekty funkcji Rif1 i omawiamy kluczowe implikacje dla integralności genomu. integralności genomu. --- Zaobserwowano, że początki replikacji DNA w genomach eukariotycznych uruchamiają się podczas fazy S w skoordynowany sposób. Badania przeprowadzone na drożdżach wskazują, że jest zależne od kilku czynników, w tym regulatorów punktu kontrolnego i modyfikatorów chromatyny. modyfikatory chromatyny. Nie jest jednak jasne, jakie są mechanizmy orkiestrujące ten skoordynowany proces. ten skoordynowany proces. Ostatnie badania zidentyfikowały czynniki, które regulują czas aktywacji pochodzenia, w tym Rif1, który odgrywa kluczową rolę w regulacji replikacji. odgrywa kluczową rolę w regulacji programu czasowego replikacji u drożdży, a także u wyższych eukariontów. wyższych eukariontów. W komórkach ssaków Rif1 wydaje się regulować struktury domen domen czasu replikacji poprzez jego zdolność do organizowania pętli chromatyny struktury. Regulacja architektury chromatyny przez Rif1 może być powiązana z innymi transakcjami chromosomowymi, w tym rekombinacją, naprawą lub transkrypcją. Niniejszy przegląd podsumowuje ostatnie postępy w wysiłkach zmierzających do wyjaśnienia regulacyjnych mechanizmów czasu replikacji replikonów eukariotycznych. --- Inicjacja eukariotycznej replikacji DNA wymaga fosforylacji kompleksu MCM przez kinazę zależną od Dbf4 (DDK), składającą się z kinazy Cdc7 i jej aktywatora, Dbf4. aktywatora, Dbf4. Donosimy tutaj, że drożdże pączkujące Rif1 (Rap1-interacting factor 1) kontroluje replikację DNA w całym genomie i opisuje, w jaki sposób Rif1 przeciwstawia się funkcji DDK poprzez kierowanie fosfatazą białkową 1 (PP1) za pośrednictwem defosforylacji kompleksu kompleksu MCM. Usunięcie RIF1 częściowo kompensuje ograniczoną aktywność DDK w mutancie cdc7-1, umożliwiając zwiększoną, przedwczesną fosforylację Mcm4. przedwczesną fosforylację Mcm4. Motywy interakcji PP1 w obrębie N-końcowej domeny Rif1 są krytyczne dla jego represyjnego wpływu na replikację. Potwierdzamy, że Rif1 oddziałuje z PP1 i że PP1 zapobiega przedwczesnej fosforylacji Mcm4. Co ciekawe, nasze wyniki sugerują, że represja replikacji przez Rif1 jest sama w sobie również regulowana przez DDK poprzez fosforylację w pobliżu motywów oddziałujących z PP1. Na podstawie naszych ustaleń proponujemy, że Rif1 jest nową podjednostką PP1, która przeciwdziała DDK. która przeciwdziała fosforylacji za pośrednictwem DDK podczas replikacji. Białka Rif1 drożdży rozszczepialnych i ssaków są również zaangażowane w regulujące replikację DNA. Ponieważ miejsca interakcji PP1 są ewolucyjnie ewolucyjnie konserwowane w sekwencji Rif1, prawdopodobne jest, że kontrola replikacji przez Rif1 przez PP1 jest zachowanym mechanizmem. --- Genom eukariotyczny jest replikowany zgodnie z określonym programem przestrzenno-czasowym. programem. Jednak niewiele wiadomo na temat zarówno jego kontroli molekularnej, jak i znaczenia biologicznego. znaczenie biologiczne. Tutaj identyfikujemy mysi Rif1 jako kluczowego gracza w regulacji czasu replikacji DNA. Pokazujemy, że niedobór Rif1 w komórkach pierwotnych powoduje bezprecedensową globalną zmianę czasowej kolejności replikacji. replikacji. Efekt ten ma miejsce już w pierwszej fazie S po delecji Rif1 i nie towarzyszą mu ani zmiany w krajobrazie transkrypcyjnym, ani poważne zmiany w biologii replikacji. ani poważnym zmianom w biochemicznej tożsamości konstytutywnej heterochromatyny. heterochromatyny. Ponadto, niedobór Rif1 prowadzi zarówno do wadliwego przejścia G1/S i reorganizacji chromatyny po replikacji DNA. Razem, te dane oferują nowy wgląd w globalną regulację i biologiczne znaczenie programu czasowego replikacji w komórkach ssaków. --- Replikacja DNA jest regulowana przestrzennie i czasowo podczas fazy S. CZAS REPLIKACJI DNA czas replikacji jest ustalany we wczesnej fazie G1 w punkcie określanym jako czasowy punkt decyzyjny. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób ustalane są domeny czasowe replikacji w całym genomie. są nieznane. Tutaj pokazujemy, że Rif1 (Rap1-interacting-factor-1), pierwotnie zidentyfikowany jako czynnik wiążący telomery u drożdży, jest krytycznym determinantą programu czasowego replikacji w ludzkich komórkach. Pozbawienie Rif1 powoduje specyficzną utratę profili ognisk replikacji w połowie fazy S, stymulację inicjacji we wczesnej fazie S i zmiany w dalekosiężnym czasie replikacji struktury domeny. Analizy czasu replikacji pokazują, że replikacja sekwencji normalnie replikujących się wcześnie jest opóźniona, podczas gdy ta normalnie replikująca się późno jest zaawansowane, co sugeruje, że regulacja czasu replikacji jest zniesiona w brak Rif1. Rif1 ściśle wiąże się z jądrowymi strukturami nierozpuszczalnymi w od późnego M do wczesnego G1 i reguluje rozmiary pętli chromatyny. Ponadto, Rif1 kolokalizuje się specyficznie z ogniskami replikacji mid-S. W ten sposób Rif1 ustanawia domeny replikacyjne w połowie fazy S, które nie są aktywowane we wczesnej fazie S. Nasze wyniki wskazują, że Rif1 odgrywa kluczową rolę w określaniu struktury domen czasu replikacji w ludzkich komórkach poprzez regulację architekturę chromatyny wyższego rzędu. --- Białko Rif1, pierwotnie zidentyfikowane jako czynnik wiążący telomery u drożdży, zostało niedawno zaangażowane w kontrolę replikacji DNA od drożdży po metazoany. Tutaj pokazujemy, że białko Rif1 pączkujących drożdży hamuje aktywację kompleksów przedreplikacyjnych (pre-RC). kompleksów przedreplikacyjnych (pre-RC). Ta funkcja hamująca wymaga dwóch N-końcowych motywów, RVxF i SILK, związanych z rekrutacją fosfatazy PP1 (Glc7). W fazie G1 pokazujemy zarówno, że Glc7 oddziałuje z Rif1 w sposób RVxF/SILK oraz że dwa białka zaangażowane w aktywację pre-RC aktywacja, Mcm4 i Sld3, wykazują zwiększoną kinazę zależną od Dbf4 (DDK) fosforylację w mutantach rif1. Rif1 oddziałuje również z Dbf4 w testach dwuhybrydowych drożdży testy dwuhybrydowe, co dodatkowo sugeruje, że białko to bezpośrednio moduluje aktywację aktywacji pre-RC poprzez DDK. Wreszcie, wykazaliśmy, że Rif1 RVxF/SILK zależną od motywu Rif1 rekrutację Glc7 do telomerów i wcześniejszą replikację tych regionów w komórkach, w których tych regionów w komórkach, w których motywy te są zmutowane. Nasze dane łączą zatem Rif1 z negatywną regulacją odpalania źródła replikacji poprzez rekrutację fosfatazy Glc7 fosfatazy. --- Uruchamianie eukariotycznych początków replikacji DNA wymaga aktywności kinaz CDK i DDK aktywności. DDK, w szczególności, jest zaangażowana w ustalanie czasowego programu aktywacji pochodzenia aktywacji pochodzenia, co jest cechą charakterystyczną eukariontów. Rif1, pierwotnie zidentyfikowane jako białko telomerowe, zostało niedawno zaangażowane w określanie czas replikacji u drożdży i ssaków. Pokazujemy, że ta funkcja Rif1 zależy od jego interakcji z fosfatazami PP1. Mutacje dwóch motywów dokowania PP1 w Rif1 prowadzą do wczesnej replikacji telomerów u pączkujących drożdży i niewłaściwej regulacji odpalania pochodzenia w drożdżach rozszczepialnych. Kilka linii dowodów wskazują, że Rif1/PP1 przeciwdziałają aktywności DDK na replikacyjnej helikazie MCM. Nasze dane sugerują, że interakcja PP1/Rif1 jest regulowana w dół przez fosforylację Rif1. fosforylację Rif1, najprawdopodobniej przez CDK/DDK. Odkrycia te wyjaśniają mechanizm mechanizm działania Rif1 w kontroli replikacji DNA i wykazują rolę fosfataz PP1 w replikacji DNA. rolę fosfataz PP1 w regulacji odpalania origin. --- Donosimy o funkcji ludzkiego ortologa Saccharomyces cerevisiae Rif1 (Rap1-interacting factor 1). Drożdżowy Rif1 wiąże się z telomerami i reguluje ich długość. ich długość. W przeciwieństwie do tego, ludzki Rif1 nie gromadził się w funkcjonalnych telomerach telomerach, ale lokalizował się w dysfunkcyjnych telomerach i skupiskach telomerowego DNA w komórkach ALT. w komórkach ALT, wzór asocjacji telomerów typowy dla czynników reagujących na uszkodzenia DNA. Po indukcji pęknięć dwuniciowych (DSB), Rif1 tworzył ogniska, które kolokalizowały się z innymi czynnikami odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Ta odpowiedź była ściśle zależna od ATM (ataxia telangiectasia mutated) i 53BP1, ale nie miała na nią wpływu zmniejszona funkcja ATR (kinazy związanej z ATM i Rad3 kinaza), BRCA1, Chk2, Nbs1 i Mre11. Zahamowanie Rif1 spowodowało promieniowrażliwością i defektem punktu kontrolnego wewnątrz fazy S. Fenotyp punktu kontrolnego fazy S był niezależny od statusu Nbs1, co dowodzi, że Rif1 i Nbs1 działają na różnych szlakach w celu zahamowania replikacji DNA po uszkodzeniu DNA. Te dane ujawniają, że ludzki Rif1 przyczynia się do ochrony za pośrednictwem ATM przed uszkodzeniom DNA i wskazują na znaczną różnicę w podstawowej funkcji tego białka u drożdży i ssaków. białka u drożdży i ssaków.
W jaki sposób Rif1 reguluje replikację DNA?
Rif1 (Rap1-interacting-factor-1), pierwotnie zidentyfikowany jako czynnik wiążący telomery u drożdży, jest krytycznym determinantem programu czasowego replikacji w komórkach ludzkich. Rif1 ściśle wiąże się z nierozpuszczalnymi strukturami jądrowymi w późnym M do wczesnego G1 i reguluje rozmiary pętli chromatyny. Co więcej, Rif1 kolokalizuje się specyficznie z ogniskami replikacji w połowie S. W ten sposób Rif1 ustanawia domeny replikacyjne w połowie fazy S, które nie są aktywowane we wczesnej fazie S. Ogólnie rzecz biorąc, Rif1 odgrywa kluczową rolę w określaniu struktur domen czasu replikacji w ludzkich komórkach poprzez regulację architektury chromatyny wyższego rzędu. Ta funkcja Rif1 zależy od jego interakcji z fosfatazami PP1, a interakcja PP1/Rif1 jest regulowana w dół przez fosforylację Rif1, najprawdopodobniej przez CDK/DDK.