CTF4 i CTF18 są wymagane dla wysokiej wierności segregacji chromosomów. Oba wykazują genetyczne i fizyczne powiązania ze składnikami widełek replikacyjnych. Stwierdziliśmy, że brak CTF4 lub CTF18 powoduje niepowodzenie kohezji chromatyd siostrzanych i prowadzi do akumulacji komórek w preanafazie, która zależy od wrzeciona punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Fizyczne i genetyczne interakcje między CTF4, CTF18, i podstawowymi składnikami kompleksów widełek replikacyjnych obserwowanymi w tym badaniu i innych sugerują, że oba produkty genowe działają w połączeniu z widełkami replikacyjnymi widełek replikacyjnych, aby ułatwić kohezję chromatyd siostrzanych. Odkryliśmy, że Ctf18p, białko podobne do RFC1 bezpośrednio oddziałuje z Rfc2p, Rfc3p, Rfc4p i Rfc5p. Jednakże, Ctf18p nie jest składnikiem biochemicznie oczyszczonego antygenu jądrowego proliferujących komórek RF-C, co sugeruje obecność dyskretnego kompleksu zawierającego Ctf18p, Rfc2p, Rfc3p, Rfc4p i Rfc5p. Niedawna identyfikacja i charakterystyka polimerazy kappa drożdży pączkujących, kodowanej przez TRF4, silnie wspiera hipotezę hipotezę, że mechanizm replikacji DNA jest wymagany do prawidłowej kohezji chromatyd siostrzanych. kohezji chromatyd siostrzanych. Analogicznie do roli przełączania polimerazy w kompleksach bakteryjnych i ludzkich kompleksów RF-C, proponujemy, aby pączkujące drożdże RF-C (CTF18) mogły być zaangażowany w przełączanie polimerazy, które ułatwia spójność chromatyd siostrzanych. Wymóg CTF4 i CTF18 w silnej kohezji identyfikuje nowe role dla białek pomocniczych białek pomocniczych replikacji w tym procesie. --- Replikacja DNA zależy w dużej mierze od struktury chromatyny. Niewiele wiadomo o tym, jak kompleks replikacyjny pokonuje pakiety nukleosomów w chromatynie podczas replikacji DNA. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zbadaliśmy czynniki, które oddziałują in vivo z główną inicjacyjną polimerazą DNA, polimerazą DNA alfa (Polalpha). Wykazano, że podjednostka katalityczna Polalfa pączkujących drożdży (Pol1p) wykazano, że wiąże się in vitro z kompleksem Spt16p-Pob3p, składnikiem system reorganizacji nukleosomów wymagany zarówno do replikacji, jak i transkrypcji. transkrypcji, a także z czynnikiem kohezji chromatyd siostrzanych, Ctf4p. Tutaj pokazujemy że N-końcowy region Polalfa (Pol1p), który jest ewolucyjnie konserwowany między różnymi gatunkami oddziałuje z Spt16p-Pob3p i Ctf4p in vivo. A mutacja w reszcie glicyny w tym N-końcowym regionie POL1 upośledza zdolność Pol1p do asocjacji ze Spt16p i zmienia czasowo uporządkowaną asocjację asocjacji Ctf4p z Pol1p. Upośledzona asocjacja między czynnikiem reorganizującym chromatynę Spt16p i inicjującą polimerazą DNA Pol1p opóźnia montaż i demontaż Pol1p z późnych źródeł replikacji i powoduje spowolnienie procesu replikacji. i powoduje spowolnienie progresji fazy S. Nasze wyniki sugerują zatem że skoordynowana czasowa i przestrzenna interakcja między konserwowanym N-końcowym regionem białka Polalfa i czynnikami, które są zaangażowane w reorganizację nukleosomów i promowanie ustanowienia siostrzanej chromatyny jest wymagana do ułatwienia progresji fazy S. --- Stabilizacja i przetwarzanie zatrzymanych widełek replikacyjnych jest wymagane do utrzymania integralności genomu u wszystkich organizmów. W celu zidentyfikowania nowych białek, które mogą być zaangażowane w stabilizację zatrzymanych widełek replikacyjnych, Saccharomyces cerevisiae mutant wss1Delta został wyizolowany z wysokoprzepustowego badań przesiewowych około 5000 szczepów delecyjnych dla genów zaangażowanych w odpowiedź na ciągłe promieniowanie UV o niskiej intensywności. Zakłócenie WSS1 skutkowało synergistycznym wzrostem wrażliwości na promieniowanie UV z mutantami zerowymi genów zaangażowanych w rekombinację (RAD52) i kontrolę cyklu komórkowego (RAD9 i RAD24). WSS1 WSS1 wchodzi również w interakcje genetyczne z SGS1, TOP3, SRS2 i CTF4, które są zaangażowane w rekombinację, naprawę widełek replikacyjnych i ustanowienie spójności chromatyd siostrzanych. W badaniu dwuhybrydowym drożdży zidentyfikowano potencjalną fizyczną interakcję między Wss1 a Psy2 i Tof1. Interakcje genetyczne wykryto również między PSY2 i CTF4. wykryto również między PSY2 i TOF1, a także między każdym genem a RAD52 i SRS2, a także między WSS1 i TOF1. Wiadomo, że Tof1 jest zaangażowany w stabilizację zatrzymane widełki replikacji, a nasze dane sugerują, że Wss1 i Psy2 podobnie działają w celu stabilizacji lub przetwarzania zatrzymanych lub zapadniętych widełek replikacyjnych. --- Ctf4/AND-1 jest wysoce konserwatywnym produktem genowym wymaganym zarówno do replikacji DNA i ustanowienia kohezji chromatyd siostrzanych. W tym raporcie zbadaliśmy mechanizm działania ludzkiego Ctf4 (hCtf4) w replikacji DNA zarówno in vitro i in vivo. Nasze odkrycia pokazują, że oczyszczony hCtf4 istnieje jako dimer i że domena SepB hCtf4 prawdopodobnie odgrywa główną rolę w określaniu struktury dimerycznej. hCtf4 wiąże się preferencyjnie ze strukturami matrycowo-primerowymi DNA, oddziałuje bezpośrednio z replikacyjnymi polimerazami DNA (alfa, delta i epsilon) i znacząco stymuluje aktywność polimerazową polimeraz DNA alfa i epsilon in vitro. Zubożenie hCtf4 w komórkach HeLa przez małe RNA skutkowało zatrzymaniem fazy G(1)/S. Analiza włókien DNA ujawniła że komórki pozbawione hCtf4 wykazywały tempo replikacji DNA wolniejsze niż komórki traktowane kontrolnym małym interferującym RNA. Odkrycia te sugerują, że w ludzkich komórkach, hCtf4 odgrywa istotną rolę w replikacji DNA i jego zdolności do stymulowania replikacyjnych polimeraz DNA może przyczyniać się do tego efektu. --- Kohezja między chromatydami siostrzanymi, w której pośredniczy wielopodjednostkowy kompleks zwany kohezyna jest ustanawiana podczas replikacji DNA i jest niezbędna dla uporządkowanej segregacji chromatyd podczas anafazy. U pączkujących drożdży, wyspecjalizowany czynnik replikacyjny C o nazwie RF-C(Ctf18/Dcc1/Ctf8) i kompleks związane z polimerazą DNA alfa białko Ctf4 są wymagane do utrzymania spójności chromatyd siostrzanych w komórkach zatrzymanych na długi czas w mitozie. Pokazujemy tutaj, że CTF8, CTF4 i helikaza kodowana przez CHL1 są wymagane do wydajnej kohezji chromatyd siostrzanych w niezaburzonych komórkach mitotycznych i dostarczają dowodów na to, że że Chl1 funkcjonuje podczas fazy S. Pokazujemy również, że w przeciwieństwie do mitozy, RF-C(Ctf18/Dcc1/Cft8), Ctf4 i Chl1 są niezbędne do segregacji chromosomów podczas mejozy i dla żywotności produktów mejozy. Nasze odkrycie, że komórki usunięte dla CTF8, CTF4 lub CHL1 ulegają masowej mejozie II bez dysjunkcji sugeruje, że drugi podział mejotyczny jest szczególnie wrażliwy na defekty kohezji. defekty. Wykorzystując testy funkcjonalne i cytologiczne, wykazaliśmy, że CTF8, CHL1 i CTF4 są niezbędne dla kohezji między siostrzanymi centromerami podczas mejozy, ale są zbędne do wiązania kohezyny z centromerowym DNA. Nasze odkrycie, że mutanty ctf18 i dcc1 drożdży rozszczepkowych mają podobne defekty sugeruje, że zaangażowanie alternatywnego kompleksu RF-C(Ctf18/Dcc1/Ctf8) w kohezji chromatyd siostrzanych może być wysoce konserwatywny. --- Kohezja między chromatydami siostrzanymi, w której pośredniczy kompleks kohezyny chromosomalnej, jest warunkiem wstępnym dla ich wyrównania na aparacie wrzeciona i segregacji w mitozie. Kohezyna drożdży najpierw łączy się z chromosomami w fazie G1. Następnie, podczas replikacji DNA w fazie S, związana z widełkami replikacyjnymi acetylotransferaza Eco1 acetyluje podjednostkę kohezyny Smc3, aby uczynić wiązanie DNA kohezyny wiązanie odporne na destabilizację przez białko Wapl. Czy stabilizacja cząsteczek kohezyny, które łączą chromatydy siostrzane, jest wystarczająca do zbudować kohezję chromatyd siostrzanych, czy też wymagane są dodatkowe reakcje w celu nie są znane. Oprócz Eco1, kilka innych czynników przyczyniają się do ustanowienia kohezji, w tym Ctf4, Ctf18, Tof1, Csm3, Chl1 i Mrc1, ale niewiele wiadomo o ich roli. Tutaj pokazujemy, że każdy z tych czynników z tych czynników ułatwia acetylację kohezyny. Co więcej, brak Ctf4 i Chl1, ale nie innych czynników, powoduje syntetyczny defekt wzrostu w komórkach pozbawionych Eco1. W odróżnieniu od defektów acetylacji, kohezja chromatyd siostrzanych w ctf4Δ i chl1Δ nie jest poprawiana przez usunięcie Wapl. W przeciwieństwie do wcześniej myśleliśmy, nie znajdujemy dowodów na rolę Ctf4 i Chl1 w przetwarzaniu fragmentów Okazaki lub przetwarzania fragmentów Okazaki w kohezji chromatyd siostrzanych. Tak więc, Ctf4 i Chl1 wyznaczają dodatkową ścieżkę niezależną od acetylacji, która może zawierać ważne wskazówki dotyczące mechanizmu spójności chromatyd siostrzanych ustanowienie. --- Mutanty delecyjne CHL1 lub CTF4, które są wymagane dla siostrzanej chromatydy wykazały wyższą wrażliwość na czynniki uszkadzające DNA - metanosulfonian metylu metanosulfonian metylu (MMS), hydroksymocznik (HU), fleomycynę i kamptotecynę, podobnie jak do fenotypu mutantów RAD52, który jest niezbędny do naprawy rekombinacji. naprawy. Poziomy Chl1 i Ctf4 związane z chromatyną wzrosły znacznie po ekspozycji komórek na MMS i fleomycynę. Chociaż aktywacja punktu kontrolnego uszkodzeń DNA nie miała wpływu na mutanty chl1 i ctf4, naprawa uszkodzonego chromosomu była nieefektywna, co sugeruje, że Chl1 i Ctf4 działają w naprawie DNA. Ponadto, indukowana przez MMS rekombinacja chromatyd siostrzanych w komórkach haploidalnych haploidalnych komórkach i, co ważniejsze, indukowana przez MMS rekombinacja między homologicznymi chromosomami w komórkach diploidalnych były upośledzone w tych mutantach. Nasze wyniki sugerują, że Chl1 i Ctf4 są bezpośrednio zaangażowane w rekombinację homologiczną naprawę rekombinacji, zamiast działać pośrednio poprzez ustanowienie spójności chromatyd siostrzanych. --- Kohezja chromatyd siostrzanych, proces parowania replikowanych chromosomów podczas mitozy i mejozy mitozy i mejozy, odbywa się za pośrednictwem niezbędnego kompleksu kohezyny i szeregu nieistotnych genów kohezji. szereg nieistotnych genów kohezji, ale specyficzne role tych nieistotnych genów w kohezji chromatyd siostrzanych pozostaje do wyjaśnienia. My przeanalizowaliśmy kohezję chromatyd siostrzanych w podwójnych mutantach mrc1Delta, tof1Delta, i csm3Delta i zidentyfikowaliśmy addytywne defekty kohezji, które wskazywały na istnienie co najmniej dwóch ścieżek, które przyczyniają się do spójności chromatyd siostrzanych. Aby zrozumieć związek innych nieistotnych genów kohezji w odniesieniu do do tych dwóch szlaków, kombinacje par delecji i alleli wrażliwych na temperaturę alleli wrażliwych na temperaturę pod kątem defektów kohezji. Dane te zdefiniowały dwa szlaki kohezji, jeden zawierający CSM3, TOF1, CTF4 i CHL1, oraz drugi zawierający MRC1, CTF18, CTF8 i DCC1. Ponadto stwierdziliśmy, że nieistotne geny nie są ważne dla utrzymania spójności w G(2)/M. G(2)/M. Zatem nasze dane sugerują, że nieistotne geny kohezji mają krytyczny redundantny wkład w ustanowienie spójności chromatyd siostrzanych i definiują dwa szlaki spójności, ustanawiając w ten sposób ramy dla zrozumienia rolę nieistotnych genów w spójności chromatyd siostrzanych. --- Ustanowienie i utrzymanie kohezji jest realizowane przez białka, które modyfikują aktywność kohezyny, niezbędnego kompleksu, który utrzymuje chromatydy siostrzane razem. Składniki widełek replikacyjnych, takie jak polimeraza DNA Ctf4, przyczyniają się do kohezji w sposób, który jest słabo poznany. słabo poznane. Aby zidentyfikować dodatkowe składniki kohezji, przeanalizowaliśmy syntetyczny ekran letalny ctf4Delta przeprowadzoną na mikromacierzach. Skupiliśmy się na podzbiorze ctf4Delta z własną niestabilnością genetyczną. Nasze analizy ujawniły, że 17 wcześniej badanych genów jest również niezbędnych do utrzymania silnej asocjacji sióstr w metafazie. Wśród nich były podjednostki kompleksu MRX, które tworzą strukturę molekularną podobną do kohezyny. Dalsze badania wykazały, że kompleks MRX nie przyczynia się do metafazy niezależnie od kohezyny, chociaż dodatkową rolę może odgrywać przez XRS2. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki badań przesiewowych wskazują na rolę kohezji chromatyd siostrzanych dla określonego podzbioru genów, które funkcjonują w replikacji i naprawie DNA. i naprawy DNA. Ten podzbiór jest szczególnie wzbogacony o geny, które wspierają punkt kontrolny fazy S. punkt kontrolny fazy S. Sugerujemy, że geny te promują i chronią chromatynę środowisko sprzyjające silnej kohezji. --- Dwie identyczne siostrzane kopie chromosomów eukariotycznych są syntetyzowane podczas fazy S . Aby ułatwić ich rozpoznanie jako pary do segregacji w mitozie, chromatydy siostrzane są utrzymywane razem od momentu ich syntezy przez kompleks kompleks kohezyny chromosomalnej. Uważa się, że progresja widełek replikacyjnych jest sprzężony z ustanowieniem kohezji chromatyd siostrzanych, ułatwiając identyfikację produktów replikacji, ale dowody na to pozostają poszlakowe. Tutaj pokazujemy, że trzy białka wymagane dla spójności chromatyd siostrzanych Eco1, Ctf4 i Ctf18, znajdują się na, a Ctf4 podróżuje wzdłuż chromosomów z widełkami replikacyjnymi. Kompleks kohezyny w kształcie pierścienia jest ładowany na chromosomy przed fazą S w reakcji zależnej od hydrolizy ATP. Ustanowienie kohezji podczas replikacji DNA następuje bez dalszej rekrutacji kohezyny i bez potrzeby ponownego angażowania przez kohezynę motywu hydrolizy ATP który jest krytyczny dla początkowego wiązania DNA. Dostarcza to dowodów na ustanowienia kohezji w kontekście widełek replikacyjnych i nakłada ograniczenia na zaangażowany mechanizm.
Czy Ctf4 bierze udział w tworzeniu kohezji chromatyd siostrzanych?
Tak. Ctf4 jest związany z replikosomem i jest wymagany do prawidłowego ustanowienia kohezji poprzez ułatwianie acetylacji kohezyny.