Białko A Staphylococcus aureus (SpA) jest najpopularniejszym ligandem powinowactwa dla immunoglobuliny G1 (IgG1). immunoglobuliny G1 (IgG1). Jednak molekularne podstawy dynamiki dysocjacji kompleksu SpA-IgG1 są niejasne. kompleksu SpA-IgG1 jest niejasna. W tym celu przeprowadzono symulacje gruboziarnistej (CG) dynamiki molekularnej (MD). symulacje dynamiki molekularnej (MD) z polem siłowym Martini zostały wykorzystane do zbadania dynamiki dysocjacji kompleksu. dynamiki dysocjacji kompleksu. Symulacje CG-MD zostały najpierw zweryfikowane przez zgodność właściwości strukturalnych i interakcyjnych SpA i ludzkiej IgG1 (hIgG1) w procesie asocjacji między CG-MD i all-atomowym MD przy różnych stężeniach NaCl. Następnie badania symulacyjne CG-MD skupiły się na molekularnym wglądzie w dynamikę dysocjacji kompleksu SpA-hIgG1 przy pH 3.0. Stwierdzono, że w procesie dysocjacji kompleksu występują cztery etapy. kompleksu. Po pierwsze, następuje niewielkie dostosowanie konformacyjne helisy II w SpA. Po tym następuje zjawisko, że oddziaływania elektrostatyczne dostarczane przez trzy gorące punkty (Glu143, Arg146 i Lys154) helisy II SpA, prowadząc do dysocjacji helisy II z miejsca wiązania hIgG1. Następnie rozpad oddziaływań hydrofobowych między helisą I (Phe132, Tyr133 i His137) w SpA i hIgG1, co powoduje odłączenie helisy helisy I z miejsca wiązania hIgG1. Wreszcie, niespecyficzne interakcje między SpA i hIgG1 zmniejszają się powoli aż do zaniku, prowadząc do całkowitej dysocjacji kompleksu SpA-hIgG1. Ta praca ujawniła, że CG-MD w połączeniu z polem siłowym Martiniego jest skuteczną metodą badania dynamiki dysocjacji dynamiki dysocjacji kompleksu białko-białko. --- Gronkowcowe białko A (SpA) odgrywa ważną rolę w patogenezie Staphylococcus aureus patogenezie. Rekombinowane SpA jest również szeroko stosowane w biotechnologii do oczyszczania poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał immunoglobulin G. oczyszczania poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał immunoglobulin G. W tym badaniu ekspresja i wydzielanie skróconej formy SpA zawierającej pięć domen wiążących immunoglobulinę immunoglobuliny przy użyciu własnej natywnej sekwencji sygnałowej zostały zoptymalizowane w Escherichia coli. Optymalizację przeprowadzono przy użyciu metody powierzchni odpowiedzi (RSM), wykorzystując interakcji między pięcioma zmiennymi. Wstępne wyniki wykazały, że peptyd sygnałowy z S. aureus został rozpoznany w E. coli, a powstały SpA ulegał ekspresji i był wydzielany do pożywki. Związki, takie jak glicyna, wpływały na wydzielanie SpA do pożywki hodowlanej. Centralny złożony projekt wykazał, że optymalne warunki dla maksymalnej ekspresji rekombinowanego skróconego SpA w E. coli obejmowały 10% (w/v) laktozę, 1,77% (w/v) glicyna, czas indukcji 11 H, gęstość optyczna (600) 1,1 i temperatura 33 °C. temperatura 33 °C. Optymalizacja przy użyciu RSM spowodowała pięciokrotny wzrost wydzielanie SpA. Do tej pory jest to pierwsze tego rodzaju badanie dotyczące wpływu stężenia glicyny i czasu trwania hodowli na wydzielanie SpA. na wydzielanie SpA. --- Chromatografia powinowactwa z białkiem A ze Staphylococcus aureus (SpA) jest najbardziej rozpowszechnioną i akceptowaną metodologią wychwytywania przeciwciał podczas procesu wytwarzania przeciwciał. Ligand na bazie triazyny (ligand 22/8) został wcześniej opracowany jako niedroga i solidna alternatywa dla chromatografii SpA (Li i in. oraz Teng i in.). Pomimo sukcesu eksperymentalnego, nie ma informacji strukturalnych na temat sposobów wiązania ligandu 22/8 do przeciwciał, a mianowicie do cząsteczek i fragmentów immunoglobuliny G (IgG). W tej pracy zajęliśmy się tą kwestią poprzez dokowanie molekularne połączone z symulacjami dynamiki molekularnej. symulacjami dynamiki molekularnej. Wyniki teoretyczne potwierdziły preferencję syntetycznego liganda do wiązania IgG poprzez miejsce wiązania znalezione w strukturze krystalograficznej w strukturze krystalograficznej naturalnego kompleksu pomiędzy SpA i fragmentem Fc IgG. Nasze badania zasugerowały również inne nieznane "gorące punkty" dla specyficznego wiązania ligandu powinowactwa w zawiasie między domenami V (H) i C (H) 1 fragmentu Fab. Najlepsze pozy dokowania były dalej analizowane przez badania dynamiki molekularnej w trzech różnych stanach protonowania (pH 3, 7 i 11). Główne oddziaływania pomiędzy ligandem 22/8 a fragmentami IgG występujące przy pH 7 były słabsze przy pH 3 i pH 11 i w tych warunkach ligand zaczyna tracić ścisły kontakt z miejscem wiązania, potwierdzając eksperymentalne dowody na elucję białka z adsorbentów chromatograficznych w tych warunkach pH. --- Białko A ze Staphylococcus aureus odgrywa kluczową rolę jako unieruchomiony ligand powinowactwa do oczyszczania przeciwciał. ligand powinowactwa do oczyszczania przeciwciał. Prosta metoda dla jego zewnątrzkomórkowej ekspresji w Escherichia coli i późniejszego oczyszczania jest w niniejszym dokumencie. N-koniec genu kodującego pięć domen wiążących IgG IgG połączono z peptydem sygnałowym pelB, który jest odpowiedzialny za lokalizację peryplazmatyczną i który jest usuwany po translacji. lokalizację i który jest usuwany po translokacji do przestrzeni peryplazmatycznej E. coli. Różne dodatki, które zostały dodane w tym samym czasie z indukcją ekspresji białka przez indukcją ekspresji białka przez IPTG, zostały przetestowane w celu ułatwienia uwalnianie białka docelowego. Z pomocą tego zoptymalizowanego protokołu uwalniania, uzyskano ponad 380 mgL(-1) białka A, gdy dodano Tris-HCl pH 8,5 do końcowego stężenia 180 mM w eksperymentach z kolbą wytrząsającą. Na podstawie tych obserwacji opracowano protokół pozakomórkowej produkcji SpA w bioreaktorze z mieszanym zbiornikiem, uzyskując 5,5 gL (-1) wydzielanego białka docelowego białka. Po usunięciu komórek przez odwirowanie, supernatant zawierający białko A supernatant zatężono i dializowano przez filtrację z przepływem stycznym. Białko docelowe białko docelowe zostało następnie oczyszczone za pomocą chromatografii anionowymiennej z uzyskano całkowitą wydajność procesu na poziomie 90% i końcową czystość ⩾95% (RP HPLC). --- Chromatografia powinowactwa wykorzystująca białko A ze Staphylococcus aureus jako ligand jest szeroko stosowana do izolacji immunoglobuliny G (IgG) od różnych gatunków. gatunków. Ponieważ może wystąpić wyciek ligandu z nośnika powinowactwa, wymagane są czasochłonne kontrole analityczne. czasochłonne kontrole analityczne są wymagane do wykrycia obecności zanieczyszczeń związanych z wyizolowaną IgG przed jej użyciem do celów terapeutycznych u ludzi. terapeutycznego u ludzi. Poza tym, białko A jest drogim produktem bakteryjnym, którego izolacja wymaga złożonych i pracochłonnych procedur. Chemia kombinatoryczna umożliwia syntezę szerokiej gamy ligandów w krótkim czasie. krótkim czasie. Dlatego chemicznie zdefiniowane, stabilne i niedrogie ligandy, które mogą naśladować działanie białka A, zostały opracowane w celu izolacji immunoglobulin. immunoglobulin. Dwa różne typy ligandów, zsyntetyzowane zgodnie z technikami techniki chemii kombinatorycznej, zostały użyte do izolacji immunoglobulin. immunoglobulin. Jednym z nich jest syntetyczny peptyd (TG 19318) składający się z czterech identycznych łańcuchów tripeptydowych połączonych z centralnym rdzeniem polilizynowym. Unieruchomiony TG 19318 został użyty do izolacji przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych różnych klas klas (IgG, IgM, IgA, IgE) z różnych źródeł (surowica, popioły i supernatanty komórkowe) i gatunków. supernatanty komórek) i gatunków. Ligand ma zdolność wiązania, która może osiągnąć do 25 mg IgG/ml podłoża. Jest stabilny, gdy jest traktowany środkami sanitarnymi takimi jak etanol i 0,1 M wodorotlenek sodu. Wspomagane komputerowo projektowanie molekularne i chemia kombinatoryczna zostały wykorzystane do opracowania ligandu powinowactwa wiązania IgG (22/8), który składa się z dwóch organicznych amin aromatycznych (3-aminofenol i 4-amino-1-napthol) połączonych z rusztowaniem chlorku cyjanurowego (triazyny). Ligand 22/8 wykazywał szerszą specyficzność niż białko A, ponieważ izolował IgG z wielu gatunków wielu gatunków, kolejność adsorpcji to człowiek> kurczak > krowa > królik > świnia > koń > szczur > koza > owca > mysz. Wykazał pozorną zdolność wiązania 51,9 mg IgG/g wilgotnego żelu i może izolować ludzkie IgG z osocza z wydajnością 60% z czystością 92%. Ligand jest stabilny, ponieważ wytrzymał inkubację w 1M NaOH przez tydzień bez utraty zdolności wiązania IgG. Odkrycia te sugerują że syntetyczne ligandy powinowactwa, które są niedrogie, stabilne i specyficzne, mogą mogą ułatwić oczyszczanie immunoglobulin w opłacalny sposób. --- Gronkowcowe białko A (SpA) wiąże domeny Fcγ i VH3 klanu Fab ludzkich i zwierzęcych immunoglobulin (Ig) z każdą z pięciu domen wiążących Ig (IgBD). zwierzęcej immunoglobuliny (Ig) z każdą z pięciu domen wiążących Ig (IgBD), wspierając w ten sposób ucieczkę Staphylococcus aureus przed zabijaniem opsonofagocytarnym i tłumienie adaptacyjnych odpowiedzi komórek B. Wariant SpAKKAA nie może wiązać Ig ale zachowuje właściwości antygenowe, które wywołują przeciwciała neutralizujące SpA i ochronę przed chorobą u myszy, podczas gdy zakażenie S. aureus lub immunizacja SpA nie może wywołać przeciwciał neutralizujących. Jako test dla tego modelu przeanalizowaliśmy tutaj mAb 358A76, który został wyizolowany od myszy z immunizacją SpA. W przeciwieństwie do SpAKKAA, mAb 358A76 wiąże tylko pierwszą IgBD (E), ale nie żadną z pozostałych czterech IgBD (E). pozostałych czterech IgBD (D-A-B-C), a jego wiązanie może neutralizować tylko domenę E SpA, co nie zapewnia ochrony przed chorobą u myszy. Wyniki te są zgodne zgodne z modelem, w którym immunizacja SpA typu dzikiego generuje ograniczone odpowiedź przeciwciał bez właściwości neutralizujących i/lub chroniących przed chorobą. --- Staphylococcal Protein A (SPA), białko ściany komórkowej Staphylococcus aureus, jest ze względu na jego zdolność do wiązania immunoglobulin. Większość SPA jest rekombinowane SPA (rSPA), które jest produkowane w Escherichia coli. Ponieważ rSPA uzyskuje się poprzez ekspresję SPA jako białka wewnątrzkomórkowego, jego oczyszczanie jest żmudne i czasochłonne. W celu uzyskania dużej ilości wysoce oczyszczonego rSPA ze względną łatwością, wyraziliśmy SPA jako formę wydzielniczą w drożdży Pichia pastoris. Aby zwiększyć poziom ekspresji SPA i stłumić jego proteolizę podczas fermentacji, gęstość komórek (OD600), temperatura i pH, w którym indukowano ekspresję SPA, jak również czas indukcji. zoptymalizowane. Ostateczna wydajność SPA wyniosła około 8,8 g na litr hodowli, co w zoptymalizowanych warunkach fermentacji stanowiło 80% całkowitego białka w supernatancie hodowli. białka w supernatancie hodowli. Wyrażone SPA zostało oczyszczone z supernatantu supernatantu hodowlanego za pomocą chromatografii jonowymiennej DEAE (IEC) po tym, jak supernatant poddano etapowi odsalania. Oczyszczone SPA zostało rozdzielone jako pojedyncze pasmo przez SDS-PAGE i jako pojedynczy pik przez HPLC. Jego tożsamość została potwierdzona przez MALDI-TOF MS i western-blot. Ponadto białko wykazywało również doskonałe powinowactwo do IgG podczas testowania z ludzką IgG. Produkcja i oczyszczanie oczyszczanie SPA opisane w tym badaniu oferuje nową metodę uzyskiwania SPA w stosunkowo czystej postaci, która jest odpowiednia do praktycznego zastosowania. zastosowania.
Do czego w biochemii wykorzystywane jest białko A ze Staphylococcus aureus?
Białko A z bakterii Staphylococcus aureus (SpA) jest stosowane jako ligand powinowactwa do oczyszczania immunoglobuliny G (IgG).