Podwójnie precyzyjna natura reakcji napromieniowanego UV DNA katalizowana przez kompleks UvrABC potencjalnie prowadzi do wycięcia uszkodzonego fragmentu. Jednakże, ani uwalnianie fragmentów w warunkach niedenaturujących, ani białka UvrBC są odwracane. Dodanie białka UvrD do kompleksu DNA-UvrBC powoduje wycięcie naciętej uszkodzonej nici i obrót białka UvrC. białka UvrC. W celu lepszego zrozumienia zaangażowania UvrD w etap wycięcia etapie wycięcia, immunoprecypitacja została wykorzystana do wykrycia białek oddziałujących z UvrD w procesie naprawy DNA. W niniejszym komunikacie wykazano, że UvrA i UvrB są wytrącane z UvrD w roztworze, ale kompleks UvrAB nie jest. W kompleksie UvrB może zostać wytrącony, a preinkubacja UvrD z UvrB wykazała inhibicję UvrB ujawniła hamujący wpływ na obrót kompleksu nacięcia. Dane te sugerują, że UvrB w kompleksie nacięcia wydaje się rekrutować UvrD do 3' naciętego miejsca naciętej nici przez interakcję białko-białko i do umożliwić inicjację odwijania przez UvrD z powstałego nicka w kierunku od 3' do 5' w kierunku od 3' do 5'. --- Powszechnie przyjmuje się, że kompleks rozpoznający uszkodzenie naprawy wycięcia nukleotydu w Escherichia coli składa się z dwóch cząsteczek UvrA i jednej UvrB, oraz że w kompleksie przedwycięciowym UvrB wiąże się z uszkodzeniem jako monomer. Używając mikroskopii sił skaningowych, pokazujemy tutaj, że kompleks rozpoznawania uszkodzeń składa się z dwóch podjednostek UvrA i dwóch UvrB, z DNA owiniętym wokół jednego z monomerów monomerów UvrB. Po związaniu uszkodzenia i uwolnieniu podjednostek UvrA, UvrB pozostaje dimerem w kompleksie preincyzyjnym. Po połączeniu z białkiem UvrC jeden z monomerów UvrB zostaje uwolniony. Proponujemy model, w którym obecność dwóch podjednostek UvrB zapewnia rozpoznawanie uszkodzeń w obu niciach DNA. Po związaniu kompleksu UvrA(2)B(2) z domniemanym uszkodzonym miejscem, DNA owija się wokół jednego z monomerów UvrB, który następnie sonduje jedną z nici DNA na obecność DNA pod kątem obecności uszkodzenia. Gdy nie zostanie znalezione żadne uszkodzenie, DNA owinie się wokół drugiej podjednostki UvrB, która sprawdzi drugą nić pod kątem aberracji. --- Aby zbadać aktywność białek naprawczych Escherichia coli UvrA i UvrB podczas tworzenia kompleksu przed wycięciem nukleotydów podczas tworzenia kompleksu wstępnego wycięcia w uszkodzonym miejscu DNA. DNA, użyliśmy substratów z modyfikacjami wokół pojedynczego 2-(acetyloamino)fluorenu (AAF). W oparciu o uwalnianie oligonukleotydów zawierających AAF oligonukleotydów z jednoniciowego kręgu DNA, doszliśmy do wniosku, że podczas interakcji z naszymi substratami UvrAB wprowadza zmiany w DNA, które są zlokalizowane w miejscu uszkodzenia i są ograniczone do 1-3 bp. Ponieważ zmiany te mogą mogą obejmować denaturację DNA w miejscu uszkodzenia, a w konsekwencji struktura pęcherzykowa może być obecna w kompleksie przed nacięciem, zbadaliśmy aktywność nacięcia UvrABC na substratach z 1-4 niesparowanymi zasadami obok adduktu AAF. AAF. Otwarcie więcej niż jednej zasady po jednej lub obu stronach zmiany powodowało znaczący spadek aktywności UvrABC, ale nie zmieniało zmieniało położenia miejsc nacięcia. Wnioskujemy, że działanie UvrAB prowadzące do kompleksu przed nacięciem nie obejmuje tworzenia pęcherzyka generowanego przez rozległą denaturację par zasad. --- Dimery pirymidynowe w DNA indukowane światłem ultrafioletowym są rozpoznawane i naprawiane przez szereg unikalnych systemów nadzoru komórkowego. Na najwyższym poziomie złożoności złożoności Escherichia coli (E. coli) posiada system naprawy DNA uvr składający się z białek UvrA, UvrB i UvrC odpowiedzialne za nacinanie. Istnieje kilka etapów regulowanych przez ten szlak, który obejmuje zależną od ATP reakcję dimeryzacji UvrA wymaganą do utworzenia nukleoproteiny UvrAB. To tworzenie kompleksu napędzany przez wiązanie ATP, jest związany ze zlokalizowanym topologicznym odwijaniem DNA. Ten kompleks białkowy może katalizować zależne od ATP 5'----3' przemieszczenie nici D-pętli DNA lub krótkich pojedynczych nici zneutralizowanych do pojedynczej nici kolistego lub liniowego DNA. Ten domniemany proces translokacji jest zatrzymany po napotkaniu uszkodzonych miejsc. Kompleks jest teraz przygotowany do podwójnego katalizowanego przez UvrC. Pozostała część procesu naprawy obejmuje UvrD (helikaza II) i polimerazę DNA I w celu skoordynowanej kontroli "wycięcia resyntezy", której towarzyszy obrót UvrABC. Ponadto proponuje się że poziomy białek naprawczych mogą być regulowane przez proteolizę. UvrB jest do skróconego UvrB* przez proteazę indukowaną stresem, która działa również w podobnych miejscach na podobne miejsca na białku E. coli Ada. Chociaż UvrB* może wiązać się z UvrA do DNA, nie może uczestniczyć w reakcjach helikazy lub nacinania. Jest to również ATPazą zależną od DNA. --- Geny uvrA, uvrB i uvrC Escherichia coli kontrolują początkowe etapy naprawy wycięcia nukleotydów. naprawy wycinania nukleotydów. Produkt genu uvrC jest zaangażowany w co najmniej jedno z podwójnych nacięć wytwarzanych przez kompleks UvrABC. Wykorzystując chromatografię powinowactwa jednoniciowego (ss) DNA (ss), oddzieliliśmy dwie formy UvrC od obu komórek E. coli typu dzikiego i komórek nadprodukujących. UvrCI eluuje przy 0,4 M KCl, a UvrCII eluuje przy 0,6 M KCl. Ogólnie rzecz biorąc, obie formy, w obecności UvrA i UvrB, aktywnie nacinają DNA napromieniowane UV i zmodyfikowane CC-1065 w ten sam sposób, tj. sposób; tj. nacinają od sześciu do ośmiu nukleotydów 5' do i od trzech do pięciu nukleotydów 3' do fotoproduktu lub adduktu CC-1065-N3-adeniny. Produkują one jednak różne nacięcia w addukcie CC-1065-N3-adeniny w sekwencji 5'-GATTACG- obecnej we fragmencie MspI-BstNI 117 bp M13mp1. UvrABCI nacina zarówno po stronie 5', jak i 3' adduktu (cięcie UvrABCI), podczas gdy UvrABCII nacina tylko po stronie 5' (cięcie UvrABCII). Mieszanie UvrCI i UvrCII skutkuje zarówno UvrABCI i UvrABCII, a poziomy tych dwóch rodzajów cięcia są proporcjonalne do ilości UvrCI i UvrCII. Ślady DNazy I MspI-BstNI 117 bp fragmentu DNA zawierającego addukt adeninowy CC-1065 w miejscu w miejscu 5'-GATTACG- pokazują, że UvrCII, ale nie UvrCI, wiąże się z miejscem adduktu miejsce. Ponadto wzór śladów DNazy I indukowanych przez wiązanie UvrCII różni się od wzoru śladów indukowanych przez wiązanie UvrA, UvrAB i UvrABCI wiązanie. Co ciekawe, podczas gdy obecność nienapromieniowanego DNA zwiększa wydajność UvrABCII w cięciu DNA napromieniowanego UV, nie zwiększa to UvrABCII adduktu adeninowego CC-1065-N3 utworzonego przy 5'-GATTACG-. Te wyniki pokazują, że dwie różne formy UvrC różnią się właściwościami wiązania DNA a także trybami cięcia przy niektórych rodzajach uszkodzeń DNA. --- Rozpoznawanie przez białka naprawy wycięcia nukleotydów Escherichia coli Uvr o zróżnicowanej strukturze chemicznej oraz obecność aktywności helikazy w kompleksie w kompleksie UvrAB, która może wypierać krótkie oligonukleotydy wyżarzone do jednoniciowego DNA doprowadziło do modelu, w którym aktywność ta przemieszcza UvrAB wzdłuż nieuszkodzonego DNA do uszkodzonych miejsc, gdzie uszkodzenie blokuje dalszą translokację i i powstaje kompleks białko-DNA. Aby ocenić ten mechanizm rozpoznawania uszkodzeń, skonstruowaliśmy substraty z oligonukleotydami o różnych długościach długości wyżarzonych do jednoniciowych kręgów DNA i umieściliśmy pojedynczy 2-(acetyloamino)fluoren (AAF) albo na oligonukleotydzie, albo na okręgu. okręgu. W przypadku substratów bez zmian, kompleks UvrAB skutecznie skutecznie wypierał 22-merowe, ale nie 27-merowe lub dłuższe fragmenty. Obecność AAF na oligonukleotydzie znacząco zwiększała uwalnianie 27-meru, ale oligomery 30 lub dłuższe nie były rozdzielane. Umieszczenie zmiany na kolistej nici nie blokowało uwalniania fragmentów. Zamiast tego, aktywność uwalniania aktywność UvrAB była stymulowana i zależała również od długości wyżarzonego oligonukleotydu. oligonukleotydu. Obserwacje te nie zgadzają się z przewidywaniami mechanizmu rozpoznawania uszkodzeń mechanizmu rozpoznawania uszkodzeń, który zależy od translokacji napędzanej helikazą. Najprawdopodobniej Prawdopodobnie, aktywność UvrAB polegająca na rozdzielaniu nici jest konsekwencją lokalnych zmian zmian zachodzących podczas formowania kompleksu DNA-białko przed nacięciem w uszkodzonym miejscu miejscu uszkodzenia i nie jest spowodowana translokacją białka wzdłuż nieuszkodzonego DNA w celu zlokalizowania uszkodzenia. DNA w celu zlokalizowania uszkodzenia. --- Naprawa wycięcia nukleotydów (NER) u Escherichia coli jest odpowiedzialna za usuwanie nieporęcznych adduktów DNA przez podwójne nacięcia endonukleazy UvrABC. Chociaż aktywność kompleksu UvrAB, który może indukować zmianę konformacji DNA, jest w NER, zaangażowanie topologii DNA i topoizomeraz DNA pozostaje niejasne. pozostaje niejasny. Zbadaliśmy wpływ inhibicji topoizomerazy na system NER in vivo in vivo. Analiza naprawy wewnątrzkomórkowego plazmidu wykazała, że uszkodzenia DNA na dodatnich superzwójkach generowanych przez inhibicję gyrazy pozostało nienaprawione, podczas gdy uszkodzenia DNA zostały naprawione w mutantach topoizomerazy I. Wyniki te sugerują, że topologia DNA wpływa na proces NER i usuwanie dodatnich superzwojów przez gyrazę jest kluczowe dla wydajności systemu NER E. coli. E. coli. --- Sposób, w jaki białka naprawcze DNA sortują genom w poszukiwaniu uszkodzeń, jest jednym z podstawowych pytań fundamentalnych pytań bez odpowiedzi w tej dziedzinie. Aby rozwiązać ten problem unikalnie oznakowaliśmy bakteryjne UvrA i UvrB różnokolorowymi kropkami kwantowymi i zwizualizowaliśmy, w jaki sposób oddziałują one z DNA indywidualnie lub razem przy użyciu skośnej mikroskopii fluorescencyjnej. Zaobserwowano, że UvrA wykorzystuje mechanizm trójwymiarowy mechanizm wyszukiwania, wiążąc się przejściowo z DNA przez krótki czas (7 s). okresy (7 s). Zaobserwowano również, że UvrA przeskakuje z jednej cząsteczki DNA na drugą na odległość około 1 mikrometra. Dwa UvrB mogą wiązać się z dimerem UvrA i zwinąć wymiarowość wyszukiwania UvrA z trzech do jednego wymiaru poprzez indukując znaczną liczbę kompleksów UvrAB do przesuwania się wzdłuż DNA. Scharakteryzowano trzy scharakteryzowano trzy rodzaje ruchu ślizgowego: losową dyfuzję, ruch wstrzymany i ruch ukierunkowany. ruch ukierunkowany. Ta wywołana przez UvrB zmiana w trybie wyszukiwania pozwala na szybsze i bardziej szybkie i wydajne skanowanie genomu w poszukiwaniu uszkodzeń. --- Transkrypcja, gdy jest połączona z naprawą wycięcia nukleotydów, określa lokalizację w aktywnych genach, gdzie ma mieć miejsce preferencyjna naprawa DNA. Podczas indukowanej uszkodzeniem DNA polimerazy RNA (RNAP), istnieje fizyczny związek podjednostki beta RNAP Escherichia coli. podjednostki beta RNAP Escherichia coli i składnika UvrA aparatu naprawczego (G. C. Lin i L. Grossman, złożone do publikacji). To powinowactwo molekularne znajduje odzwierciedlenie w zdolności RNAP do zwiększania, w sposób w sposób zależny od promotora, zwijania DNA przez kompleks UvrAB. W obecności obecności RNAP, kompleks UvrAB jest w stanie wiązać się z regionami promotorowymi i do translokacji w kierunku od 5' do 3' wzdłuż nici nietranskrybowanej. W konsekwencji konsekwencją tej katalizowanej przez helikazę translokacji, preferencyjne nacinanie uszkodzonych miejsc uszkodzonych miejsc DNA następuje w dół transkrybowanej nici. Ze względu na kierunkowość kierunkowość helikazy, początkowe wiązanie kompleksu UvrAB do nici transkrybowanej nieuchronnie prowadziłoby do jego kolizji z RNAP. Te wyniki sugerują, że indukowana przez RNAP struktura DNA w pobliżu miejsca transkrypcji sygnalizuje miejsce lądowania lub wejścia dla kompleksu UvrAB na DNA. --- Nielegalna rekombinacja jest główną przyczyną niestabilności genetycznej u zarówno u prokariotów, jak i u eukariotów. Rekombinacja ta występuje zwykle z niską częstotliwości, ale jest znacznie zwiększona przez promieniowanie UV lub inne stresy środowiskowe. stresy środowiskowe. Uważa się, że uszkodzenia DNA wytwarzane przez te stresy środowiskowe indukują pęknięcia podwójnej nici DNA, prowadząc do nielegalnej rekombinacji. W tym artykule artykule pokazujemy, że nielegalna rekombinacja wywołana promieniowaniem UV jest wzmacniana przez mutacje genów naprawy wycięcia nukleotydów, uvrA lub uvrB, i częściowo przez mutację uvrC, ale nie przez mutację uvrD. Niespodziewanie, rekombinacja była wzmocniona przez podwójną mutację uvrA uvrB nawet bez napromieniowania UV, ale mutacja podwójna mutacja uvrB uvrC nie wykazała tego efektu, co sugeruje, że nielegalna rekombinacja jest głównie tłumiona przez UvrA i UvrB. Ponadto, nielegalna rekombinacja była synergistycznie wzmacniana przez podwójną mutację recQ uvrA mutację. Ponadto, nadprodukcja białka UvrA tłumiła fenotyp hiperrekombinacji fenotyp hiperrekombinacji mutanta recQ lub uvrB, ale nie miała wpływu na fenotyp wrażliwy na promieniowanie UV fenotyp mutanta uvrB. Doszliśmy do wniosku, że kompleks UvrAB hamuje nielegalną rekombinację w szlaku współdzielonym z helikazą RecQ helikazą. Ponadto, samo białko UvrA może hamować nielegalną rekombinację w szlaku rekombinację w szlaku, w którym działają helikaza RecQ i kompleks UvrAB. Omówiono również możliwe funkcje białek zaangażowanych w te szlaki. omówione. --- Naprawa sprzężona z transkrypcją (TCR) jest podszlakiem naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER). (NER), który działa specyficznie na zmiany w transkrybowanej nici wyrażonych genów. Po raz pierwszy opisany w komórkach ssaków, TCR został następnie udokumentowany w Escherichia coli. W tym organizmie polimeraza RNA zatrzymana w miejscu uszkodzenia jest przemieszczana przez czynnik sprzęgający naprawę transkrypcji, Mfd. Białko to rekrutuje czynnik NER UvrA, a następnie oddysocjowuje od DNA. UvrA wiąże UvrB, a złożony kompleks UvrAB* inicjuje naprawę. U mutantów pozbawionych aktywnego Mfd, TCR jest nieobecny. Gen transkrybowany przez polimerazę RNA bakteriofaga T7 polimerazę RNA bakteriofaga T7 w E. coli również wymaga Mfd dla TCR. Białko CSB (brakujące lub wadliwe w komórkach pacjentów z zespołem Cockayne'a, grupa dopełniacza B) jest niezbędne dla TCR u ludzi. CSB i jego homologi u wyższych eukariontów są prawdopodobnie funkcjonalnymi odpowiednikami prawdopodobnie funkcjonalnymi odpowiednikami Mfd. --- UvrB odgrywa kluczową rolę w bakteryjnej naprawie wycięcia nukleotydów. Jest to ostatecznym białkiem wiążącym uszkodzenia, które oddziałuje zarówno z UvrA, jak i UvrC. Stan oligomeryczny stan oligomeryczny UvrB i kompleksu UvrAB były przedmiotem debaty przez długi czas. przez długi czas. Wykorzystując transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) pomiędzy GFP i YFP połączonymi z C-końcowym końcem UvrB Escherichia coli, jednoznacznie pokazujemy że w roztworze dwie podjednostki UvrB wiążą się z UvrA, najprawdopodobniej jako część kompleksu UvrA2B2. Kompleks ten jest najbardziej stabilny, gdy zarówno UvrA, jak i UvrB są w formie w formie związanej z ATP. Analiza skróconej formy UvrB pokazuje, że wiązanie z UvrA promuje dimeryzację dwóch C-końcowych regionów domeny 4 UvrB. Obecność obecność nieuszkodzonego DNA prowadzi do dysocjacji kompleksu UvrA2B2, ale gdy miejsce ATPazy UvrB jest inaktywowane, kompleks zostaje uwięziony na DNA. Gdy kompleks jest związany z uszkodzonym miejscem, FRET między dwiema podjednostkami UvrB może ale tylko tak długo, jak długo UvrA pozostaje związany. Dysocjacja UvrA od związanego z uszkodzeniem dimeru UvrB prowadzi do zmniejszenia wielkości sygnału FRET, co wskazuje na sygnału FRET, wskazując, że regiony domeny 4 nie wchodzą już w interakcje. My proponujemy, że indukowana przez UvrA dimeryzacja regionów domeny 4 służy do chroni te domeny przed przedwczesnym wiązaniem UvrC. Dopiero po specyficznym związaniu dimeru UvrB do uszkodzonego miejsca i późniejszym uwolnieniu UvrA jest kontakt między regionami domeny 4, umożliwiając rekrutację UvrC i kolejne nacięcia. nacięcia. --- Endonukleaza Escherichia coli Uvr(A)BC (Uvr(A)BC) inicjuje naprawę wycięcia nukleotydu naprawy wielu różnych uszkodzeń DNA. Rozpoznawanie uszkodzeń i przez endonukleazę Uvr(A)BC jest złożonym procesem wykorzystującym zależną od ATP aktywność śledzenia helisy DNA związaną z kompleksem UvrA2B1. Ta ostatnia aktywność prowadzi do generowania wysoce dodatnio superzwiniętego DNA w obecności topoizomerazy I E. coli in vitro. Takie wysoce dodatnio superskręcone DNA, zawierające fotoprodukty indukowane promieniowaniem ultrafioletowym (uvDNA), jest odporny na nacięcie przez Uvr(A)BC, podczas gdy ujemnie superzwinięty i zrelaksowane formy uvDNA są skutecznie nacinane. Gyraza E. coli może przyczynić się do powyższej reakcji poprzez zniesienie akumulacji wysoce dodatnio superzwiniętego uvDNA, przywracając w ten sposób nacięcie katalizowane przez Uvr(A)BC. Eukariotyczna (grasica cielęca) topoizomeraza I jest w stanie zastąpić gyrazę w przywracając reakcję nacięcia, w której pośredniczy Uvr(A)BC. Niezdolność Uvr(A)BC do nacinania wysoce dodatnio superskręconego uvDNA wynika z niepowodzenia tworzenia zależnych od UvrAB obowiązkowych intermediatów związanych ze zmianą konformacji DNA zmianą konformacyjną DNA. W przeciwieństwie do Uvr(A)BC, endonukleaza Micrococcus luteus UV skutecznie przecina uvDNA niezależnie od jego stanu topologicznego. System system topodynamiczny in vitro zaproponowany w tym badaniu może stanowić prosty model do badania topologicznego aspektu naprawy przez wycinanie nukleotydów i jego interakcji z innymi procesami związanymi z topologią DNA w E. coli.
W jakie rodzaje naprawy DNA zaangażowany jest kompleks UvrAB?
UvrB i czynnik rozpoznający uszkodzenia UvrA tworzą kompleks UvrAB, który odgrywa kluczową rolę w bakteryjnej naprawie wycięcia nukleotydów (NER). W naprawie sprzężonej z transkrypcją (TCR), czynnik sprzężenia naprawy transkrypcji Mfd rekrutuje uvrA, a złożony kompleks UvrAB inicjuje naprawę. Kompleks UvrAB hamuje również nielegalną rekombinację.