Badania przeprowadzone na hodowanych komórkach wykazały, że modyfikatory przeprogramowania epigenetycznego przeprogramowanie w regulacji długości telomerów, zgłaszając wydłużenie w komórkach komórkach pozbawionych metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA 1 (Dnmt1), metylotransferazy DNA de novo, Dnmt3a i Dnmt3b lub różnych metylotransferaz histonowych. metylotransferaz histonowych. Aby zbadać to dokładniej, zbadaliśmy długość telomerów w całych zarodkach lub dorosłych tkankach myszy niosących mutacje w czterech różnych modyfikatorach przeprogramowania epigenetycznego: Dnmt1, metylotransferazę DNA 3-podobną, strukturalne utrzymanie domeny zawiasowej chromosomów zawierającej 1 i forkhead box O3a. Analiza terminalnych fragmentów restrykcyjnych została wykorzystana do porównania długości telomerów w mutantach homozygotycznych, mutantach heterozygotycznych i miotach typu dzikiego. W przeciwieństwie do oczekiwań, nie wykryliśmy ogólnego wydłużenia u mutantów, podnosząc pytania o rolę procesów epigenetycznych w długości telomerów in vivo. in vivo. --- Metylacja specyficznych reszt CG w genomie ssaków skutkuje specyficzne dla tkanki wzorce ekspresji genów, które są krytyczne dla różnicowania komórek. Zarodki, które nie ustalą i nie utrzymają prawidłowych wzorców metylacji DNA DNA wykazują poważne nieprawidłowości rozwojowe, jak ma to miejsce w przypadku zarodki z niedoborem metylotransferazy DNA 1 (Dnmt1). Dnmt1 jest główną metylotransferazą konserwującą u myszy, a jej ekspresja jest regulowana przez mechanizm mechanizm splicingowy, który dyktuje ekspresję izoform specyficznych dla danego etapu. Niewiele wiadomo na temat ekspresji Dnmt1 u krowy, a izoformy Dnmt1 są jeszcze nieznane u tego gatunku. nieznane u tego gatunku. Tutaj wykazujemy, że wcześniej opisana bydlęcy transkrypt Dnmt1 ulega wszechobecnej ekspresji w zarodkach i tkankach płodowych. Ponadto donosimy o identyfikacji wariantu splicingowego bydlęcego transkryptu Dnmt1. Dnmt1, który wykazuje wszechobecny wzór ekspresji. Ten nowy transkrypt został wykryty przy użyciu 5'RACE i mapowania genomowego, a jego wzór ekspresji został wykazany zgodny z trybem regulacji specyficznym dla tkanki. Co więcej, nasza analiza pokazuje, że ekspresja specyficznej dla oocytów izoformy Dnmt1 jest jest mało prawdopodobne u bydła. Nowo opisana izoforma Dnmt1 została wykazano, że jest ona, podobnie jak Dnmt1a, poliadenylowana i jeśli zostanie przetłumaczona posiadają funkcjonalne domeny niezbędne do utrzymania i de novo aktywność metylotransferazy. --- Metylotransferaza DNA-1 (Dnmt1) jest zaangażowana w utrzymanie wzorców metylacji DNA i ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju ssaków. i ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju ssaków. Celem niniejszego badania była ocena lokalizacji Dnmt1 u krowy, podczas ostatnich faz różnicowania oocytów i podczas wczesnych etapów segmentacji. segmentacji. Ekspresję i lokalizację Dnmt1 oceniano w oocytach zgodnie z konfiguracją chromatyny, co z kolei stanowi ważny mechanizm epigenetyczny mechanizm kontroli globalnej ekspresji genów i reprezentuje morfologiczny marker różnicowania oocytów. Stwierdziliśmy, że początkowej kondensacji chromatyny towarzyszył niewielki wzrost poziomu globalnej metylacji DNA, ocenianej przez immunobarwienie 5-metylo-cytozyną, a następnie przez analizę laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej (LSCM). RT-PCR potwierdził obecność transkryptów Dnmt1 w tej fazie różnicowania oocytów. Analogicznie, immunodetekcja Dnmt1 i LSCM wykazały, że białko było zawsze obecne i zlokalizowane w cytoplazmie. zawsze obecne i zlokalizowane w cytoplazmie, niezależnie od konfiguracji chromatyny konfiguracji chromatyny i poziomu globalnej metylacji DNA. Co więcej, nasze dane wskazują, że podczas gdy Dnmt1 jest zatrzymywany w cytoplazmie w stadium metafazy II oocytów i zygot, wchodzi do jąder zarodków w stadium 8-16 komórek. Jak u myszy, funkcjonalne znaczenie obecności Dnmt1 w jądrach zarodków bydlęcych w jądrach zarodków bydlęcych może być utrzymanie wzoru metylacji genów imprintowanych. wdrukowanych genów. Podsumowując, niniejsza praca dostarcza przydatnych elementów do badania funkcji Dnmt1 podczas późnego etapu różnicowania oocytów, dojrzewania i wczesnego rozwoju embrionalnego u ssaków. --- Specyficzna metylacja cytozyn jest kluczowym epigenetycznym znakiem DNA kręgowców. DNA KRĘGOWCÓW. Podczas gdy większość metylowanych reszt znajduje się w symetrycznej konfiguracji (meC)pG:Gp(meC), mniejsza, ale znacząca część znajduje się w konfiguracji asymetrycznych (nie-CpG) dinukleotydach CpA, CpT i CpC. Metylacja CpG jest powtarzalnie utrzymywana przez aktywność metylotransferazy DNA 1 (Dnmt1) na nowo replikowanych hemimetylowanych substratach (meC)pG:GpC. Z drugiej strony z drugiej strony, ustanowienie i dziedziczne utrzymanie wzorów metylacji innych niż CpG nie zostały szczegółowo przeanalizowane. Wcześniej donosiliśmy o występowaniu metylacji i specyficznej dla alleli metylacji zarówno w miejscach CpG, jak i nie-CpG. Tutaj scharakteryzować dziedziczny kompleks metylacji innych niż CpG, z transgeneracyjnym utrzymaniem trzech różnych profili w stałym stosunku, związane z rozległą metylacją CpG. Obserwacje te nasunęły pytanie o sygnał prowadzący do utrzymania wzoru asymetrycznej metylacji. metylacji. Kompletny wzór nie-CpG był przywracany w każdym pokoleniu, pomimo faktu, że większość pomimo faktu, że większość genomów plemników nie zawierała żadnego lub tylko jedno zmetylowane miejsce nie-CpG. Ta obserwacja doprowadziła nas do hipotezy że stabilne wzorce CpG mogą działać jako plany utrzymania metylacji DNA metylacji DNA nie-CpG. Zgodnie z przewidywaniami, profile metylacji DNA nie-CpG były w mutantach pozbawionych Dnmt1, enzymów odpowiedzialnych za metylację CpG ale nie w mutantach z defektem Dnmt3a lub Dnmt2. --- Korekta dwuniciowych pęknięć DNA przebiega w bezbłędnej ścieżce rekombinacji homologicznej (HR). rekombinacji homologicznej (HR), co może skutkować wyciszeniem połowy cząsteczek DNA w wyniku działania DNA spowodowane działaniem metylotransferazy DNA 1 (DNMT1) (Cuozzo, C., Porcellini, A., Angrisano, T., Morano, A., Lee, B., Di Pardo, A., Messina, S., Iuliano, R., Fusco, A., Santillo, M. R., Muller, M. T., Chiariotti, L., Gottesman, M. E., and Avvedimento, E. V. (2007) PLoS Genet. 3, e110). Aby zbadać mechanizm, który prowadzi do wyciszania indukowanego przez HR, przeprowadzono ekran genetyczny w oparciu o wyciszanie reportera GFP w celu zidentyfikowania potencjalnych partnerów. DMAP1, białko oddziałujące z DNMT1, zostało zidentyfikowane jako mediator tego procesu. procesu. DMAP1 jest silnym aktywatorem metylacji DNMT1 in vitro, co sugeruje, że że DMAP1 jest korepresorem, który wspiera utrzymanie i działanie de novo DNMT1. Aby zbadać krytyczną rolę DMAP1 in vivo, użyto lentiwirusowego shRNA do warunkowego obniżenia komórkowego poziomu DMAP1. Komórki transdukowane shRNA rosły słabo i ostatecznie przestały rosnąć. Analiza stanu metylacji genu supresorowego nowotworu p16 ujawniła wyraźną redukcję metylowanych CpGs w komórkach shRNA, co sugeruje, że reaktywacja szlaku genu supresorowego nowotworu spowodowała fenotyp powolnego wzrostu. Analiza HR przy użyciu reportera opartego na fluorescencji ujawniła, że znokautowanie DMAP1 spowodowało również hipometylację produktów naprawy produktów naprawy DNA po konwersji genów. DMAP1 został selektywnie wzbogacony w rekombinowanej chromatynie GFP w oparciu o analizę immunoprecypitacji chromatyny. Obraz wyłania się obraz, że DMAP1 aktywuje DNMT1 preferencyjnie w miejscach naprawy HR naprawy. Ponieważ komórki pozbawione DMAP1 wykazują zwiększoną HR, dochodzimy do wniosku, że odgrywa dodatkową rolę w stabilności genomu. --- Metylacja DNA i metylotransferazy DNA są niezbędne dla spermatogenezy. Mutacje w genie metylotransferazy DNA Dnmt1 wywierają ojcowski wpływ na stany epigenetyczne i fenotypy potomstwa. stany epigenetyczne i fenotypy potomstwa, sugerując, że DNMT1 jest ważne dla epigenetycznej przebudowy genomu, która ma miejsce podczas spermatogenezy. spermatogenezy. Jednakże, specyficzna rola DNMT1 w spermatogenezie oraz ustanowienie odcisków genomowych w męskiej linii zarodkowej pozostaje nieuchwytne. Aby dalej scharakteryzować wpływ niedoboru DNMT1 na resetowanie odcisków metylacji podczas spermatogenezy, przeanalizowaliśmy metylację profile regionów wdrukowanych w plemnikach myszy, które były heterozygotyczne dla mutacji utraty funkcji Dnmt1. Mutacja nie miała wpływu na regiony H19 lub IG różnie metylowane regiony (DMR), które są zwykle silnie metylowane, ale prowadziła do częściowej hipermetylacji DMR Snrpn, regionu, który normalnie powinien być niemetylowany w normalnie powinien być niemetylowany w dojrzałych plemnikach. Wada ta nie występuje w modelach myszy z mutacjami w genach Dnmt3a i Mthfr, a zatem jest specyficzny dla genu Dnmt1 i sugeruje rolę DNMT1 w odcisku resetowanie lub utrzymanie w męskiej linii zarodkowej. --- Metylacja DNA odgrywa kluczową rolę w epigenetycznej regulacji ekspresji genów u kręgowców. u kręgowców. Dane genetyczne i biochemiczne wskazują, że metylotransferaza DNA metylotransferaza 1 (Dnmt1) jest niezbędna do utrzymania wzorców metylacji DNA u myszy. wzorców metylacji DNA u myszy, ale celowanie w locus DNMT1 w ludzkich komórkach nowotworowych HCT116 miało jedynie niewielki wpływ na metylację genomu i żywotność komórek. W W tym badaniu zidentyfikowaliśmy alternatywny splicing w tych komórkach, który omija zakłócający selektywny marker i skutkuje katalitycznie aktywnym białkiem DNMT1 białko pozbawione domeny wiążącej antygen jądrowy proliferujących komórek, wymaganej do powiązania z maszynerią replikacyjną. Korzystając z opartego na mechanizmie pułapkowania pokazujemy, że to skrócone białko DNMT1 wykazuje tylko dwukrotne zmniejszenie postreplikacyjną aktywność utrzymania metylacji DNA in vivo. RNA za pośrednictwem interferencji RNA nokaut tego skróconego DNMT1 skutkuje globalną hipometylację genomową i śmierć komórki. Wyniki te wskazują, że DNMT1 jest niezbędny w komórkach myszy i ludzi, ale bezpośrednie sprzężenie replikacji informacji genetycznej i epigenetycznej nie jest ściśle wymagane. --- Opracowano test w czasie rzeczywistym dla aktywności metylotransferazy cytozyny-C5 specyficznej dla CpG. został opracowany. W teście zastosowano oligonukleotyd typu "break light", w którym metylacja niemetylowanego miejsca 5'-CG-3' jest enzymatycznie sprzężona z rozwojem sygnału fluorescencyjnego. rozwój sygnału fluorescencyjnego. Ten czuły test może mierzyć szybkość metylacji DNA do 0,34 +/- 0,06 fmol/s. Test jest powtarzalny, ze współczynnikiem zmienności współczynnik zmienności w sześciu niezależnych pomiarach wynosi 4,5%. Stężenie produktu zostało dokładnie zmierzone na podstawie sygnałów fluorescencji przy użyciu liniowej krzywej kalibracyjnej. krzywej kalibracyjnej, która osiągnęła dobroć dopasowania (R(2)) powyżej 0,98. Podłoże substrat oligonukleotydowy zawiera trzy C5-metylowane reszty cytozyny i jedną niemetylowane miejsce 5'-CG-3'. Metylacja daje oligonukleotyd zawierający optymalny substrat dla enzymu restrykcyjnego GlaI. Rozszczepienie w pełni metylowanego oligonukleotydu prowadzi do oddzielenia fluoroforu od wygaszacza, dając proporcjonalny wzrost fluorescencji. Metoda ta została wykorzystana do testowania aktywności DNMT1, głównej metylotransferazy konserwującej w ludzkich komórkach komórkach ludzkich oraz do kinetycznej charakterystyki bakteryjnej metylotransferazy cytozyny-C5 bakteryjnej metylotransferazy cytozyny-C5 M.SssI. Wykazano, że test jest odpowiedni do monitorowania aktywności DNMT1 w czasie rzeczywistym w formacie o wysokiej przepustowości, z niskim sygnał tła i zdolność do uzyskania liniowych szybkości metylacji w długich okresach, co czyni go obiecującą metodą wysokoprzepustowego badania przesiewowego dla inhibitorów. --- Dnmt1, główna metylotransferaza DNA w komórkach ssaków, jest dużym i wysoce dynamicznym enzymem. wysoce dynamicznym enzymem o wielu cechach regulacyjnych, który może kontrolować metylację DNA metylację DNA w komórkach. W tym rozdziale podkreślono, w jaki sposób wgląd w strukturę i funkcję Dnmt1 i funkcji może przyczynić się do lepszego zrozumienia metylacji DNA w komórkach. The allosteryczne na Dnmt1 mogą regulować procesy metylacji DNA de novo i konserwacji w komórkach. metylacji DNA w komórkach. Pozostałe otwarte pytania obejmują, które cząsteczki, poprzez jakie mechanizmy wiążą się z miejscem(ami) allosterycznym(i) w komórkach? Różne miejsca fosforylacji na Dnmt1 mogą zmieniać jego aktywność lub zdolność do wiązania DNA DNA. Obecnie wiadomo, że trzydzieści jeden różnych cząsteczek ma fizyczne i/lub funkcjonalne interakcje z Dnmt1 w komórkach. Struktura Dnmt1 i mechanizm enzymatyczny oferują unikalny wgląd w te interakcje. Cząsteczki są zaangażowane w organizację chromatyny, naprawę DNA, regulację cyklu komórkowego i apoptozę. regulację cyklu komórkowego i apoptozę, a także obejmują polimerazę RNA II, niektóre białka wiążące białka wiążące RNA i niektóre specyficzne cząsteczki RNA hamujące Dnmt1. Połączone z badań nad różnymi cechami enzymatycznymi Dnmt1 oferują nowe pomysły na rozwój kandydatów na leki i mogą być wykorzystane w selekcji obiecujących kandydatów na leki spośród ponad 15 różnych związków, które zostały zidentyfikowane jako potencjalne inhibitory metylacji DNA w komórkach. --- Metylotransferaza DNA 1 (DNMT1) ma kluczowe znaczenie dla utrzymania metylacji, regulacji genów i stabilności chromatyny. i stabilności chromatyny. Naprawa niedopasowania DNA, regulacja cyklu komórkowego w neuronach postmitotycznych i neurogenezie zależy od metylacji DNA. Tutaj pokazujemy, że mutacje w DNMT1 powodują zarówno centralną, jak i obwodową neurodegenerację neurodegenerację w jednej z form dziedzicznej neuropatii czuciowej i autonomicznej z demencją i utratą słuchu. Sekwencjonowanie egzomu doprowadziło do identyfikacji DNMT1 mutacji c.1484A>G (p.Tyr495Cys) w dwóch amerykańskich i jednym japońskim genotypie. oraz potrójną zmianę nukleotydową, c.1470-1472TCC>ATA (p.Asp490Glu-Pro491Tyr) w jednej europejskiej rodzinie. Wszystkie mutacje znajdują się w domeny sekwencji docelowej DNMT1. Mutacje te powodują przedwczesną degradację zmutowanych białek, zmniejszoną aktywność metylotransferazy i upośledzone wiązania heterochromatyny podczas fazy cyklu komórkowego G2, co prowadzi do globalnej hipometylacji i hipermetylacji specyficznej dla danego miejsca. Nasze badanie pokazuje, że mutacje DNMT1 powodują nieprawidłową metylację związaną ze złożoną patogenezą. Odkryte mutacje odkryte mutacje DNMT1 zapewniają nowe ramy dla badania chorób neurodegeneracyjnych. chorób neurodegeneracyjnych. --- Wyciszanie genów przez hipermetylację przyczynia się do progresji raka i jest wykazano, że występuje ze zwiększoną częstotliwością w określonych loci genomowych. Jednakże, precyzyjne mechanizmy leżące u podstaw ustanowienia i utrzymania nieprawidłowych metylacji są wciąż nieuchwytne. Metylotransferaza DNA de novo 3B (DNMT3B) odgrywa ważną rolę w generowaniu wzorców metylacji specyficznych dla nowotworów. specyficznych dla raka wzorców metylacji. Poprzednie badania wykazały, że redukcja poziomu białka DNMT3B indukuje działanie antyproliferacyjne w komórkach nowotworowych które przypisywano demetylacji i reaktywacji genów supresorowych nowotworów. genów supresorowych. Jednak zmiany metylacji nie zostały jeszcze szczegółowo przeanalizowane jeszcze szczegółowo analizowane. Stosując interferencję RNA zmniejszyliśmy poziom białka DNMT3B w liniach komórkowych raka okrężnicy. linii komórkowych raka jelita grubego. Nasze wyniki potwierdzają, że pozbawienie DNMT3B specyficznie zmniejszyło tempo proliferacji linii komórkowych raka okrężnicy z nadekspresją DNMT3B. Jednak profilowanie metylacji DNA w skali genomu nie ujawniło zmian metylacji w genach docelowych DNMT3B, nawet przy całkowitym braku DNMT3B. Wyniki te pokazują, że DNMT3B jest zbędny do utrzymania nieprawidłowych wzorów metylacji wzorców metylacji DNA w ludzkich komórkach raka okrężnicy i mają ważne implikacje dla rozwoju ukierunkowanych inhibitorów metylotransferazy DNA jako epigenetycznych leków przeciwnowotworowych. --- Metylotransferaza DNA 1 metyluje hemi-metylowane miejsca CG generowane podczas replikacji DNA replikacji DNA. Wykazano, że seryna 515 tego enzymu jest fosforylowana. Aby zbadać znaczenie fosforylacji S515, wygenerowaliśmy mutanty Dnmt1 które usunęły potencjał fosforylacji (S515A) lub naśladowały fosfoserynę (S515E), oczyściliśmy białka z komórek owadzich i przeanalizowaliśmy ich aktywność metylacji DNA aktywność metylacji DNA in vitro. Mutant S515E okazał się być aktywny, podczas gdy mutant mutant S515A wykazywał znaczną utratę aktywności w porównaniu do białka typu dzikiego. Utrata aktywności wariantu S515A nie była spowodowana utratą zdolności wiązania DNA. DNA. Ponadto wykazaliśmy, że fosforylowany peptyd, którego sekwencja naśladuje otoczenie Ser515 (EKIYIS(P)KIVVE) hamował aktywność dzikiego typu dzikiego Dnmt1 dziesięciokrotnie bardziej niż niefosforylowany peptyd. Hamowanie było specyficzne dla Dnmt1 i dla określonej sekwencji peptydu. Nasze dane sugerują że fosforylacja Ser515 jest ważna dla interakcji między N-końcową domeną Dnmt1 i jej domeną katalityczną, która jest niezbędna do aktywności i że ta interakcja jest specyficznie zakłócana przez fosforylowany peptyd. Wnioskujemy, że fosforylacja Dnmt1 na Ser515 może być ważnym regulatorem aktywności Dnmt1 podczas cyklu komórkowego i po bodźce proliferacyjne. --- Dnmt1 (metylotransferaza DNA 1) jest głównym enzymem odpowiedzialnym za utrzymanie metylacji cytozyny w dinukleotydach CpG w genomie ssaków. genomie ssaków. N-końcowa sekwencja celująca ogniska replikacji (RFTS) domeny Dnmt1 została zaangażowana w lokalizację subkomórkową, asocjację białek i funkcję katalityczną. funkcję katalityczną. Jednak postęp w zrozumieniu jej funkcji został ograniczony przez brak testów i struktury tej domeny. Tutaj pokazujemy że aktywność Dnmt1 wiążąca nagie DNA i polinukleosomy jest hamowana przez domenę przez domenę RFTS, która funkcjonuje na mocy wiązania domeny katalitycznej do z wyłączeniem DNA. Analiza kinetyczna z fluorogenicznym substratem DNA wykazała, że domena RFTS jest 600-krotnym inhibitorem aktywności enzymatycznej Dnmt1. Struktura krystaliczna domeny RFTS ujawnia nowy fałd i wspiera mechanizm mechanizm, w którym białko wiążące Dnmt1 ukierunkowane na RFTS, takie jak Uhrf1, może aktywować Dnmt1 do wiązania DNA. --- Genom tkanek pozazarodkowych, takich jak łożysko, jest hipometylowany w stosunku do genomu tkanek somatycznych. w stosunku do tkanek somatycznych. Jednak pochodzenie i rola tej hipometylacji pozostaje niejasne. Metylotransferazy DNA DNMT1, -3A i -3B są głównymi mediatorami ustanawiania i utrzymywania metylacji DNA metylacji DNA u ssaków. W tym badaniu zbadaliśmy promotor za pośrednictwem metylacji epigenetyczną regulację w dół genów DNMT jako potencjalnego jako potencjalnego regulatora globalnych poziomów metylacji w tkance łożyskowej. Chociaż promotory DNMT3A i -3B brak metylacji we wszystkich badanych tkankach somatycznych i pozazarodkowych, znaleźliśmy specyficzną hipermetylację utrzymującej metylotransferazy DNA (DNMT1) i hipometylację genu DNMT3L w tkankach łożyskowych urodzonych o czasie i w pierwszym trymestrze ciąży. trymestrze ciąży. Sekwencjonowanie bisulfitowe DNA ujawniło monoalleliczną metylację DNMT1, bez dowodów na imprinting (efekt rodzica pochodzenia). Eksperymenty reporterowe in vitro potwierdziły, że metylacja promotora DNMT1 osłabia aktywność transkrypcyjną w komórkach trofoblastów. Jednakże, globalna hipometylacja przy braku regulacji DNMT1 w dół jest widoczna w łożyskach łożyskach innych niż naczelne i ludzkich komórkach macierzystych cytotrofoblastów in vitro, sugerując, że regulacja w dół DNMT1 nie jest absolutnym wymogiem dla genomu hipometylacji we wszystkich przypadkach. Dane te stanowią pierwszą demonstrację regulacji genu DNMT1 za pośrednictwem metylacji w dowolnym systemie i pokazują, że unikalny epigenom ludzkiego łożyska obejmuje w dół DNMT1 z jednoczesną hipometylacją genu DNMT3L. To silnie implikuje epigenetyczną regulację rodziny genów DNMT w ustanowienie unikalnego profilu epigenetycznego tkanki pozazarodkowej u ludzi. --- Metylacja DNA jest główną modyfikacją epigenetyczną i odgrywa kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. regulacji ekspresji genów. W obrębie rodziny metylotransferaz DNA (Dnmts), Dnmt3a i 3b ustanawiają ślady metylacji podczas wczesnego rozwoju, podczas gdy Dnmt1 utrzymuje wzorce metylacji po replikacji DNA. Funkcja funkcja konserwacyjna Dnmt1 jest regulowana przez jego dużą regulatorową N-końcową domenę która oddziałuje z innymi czynnikami chromatynowymi i jest niezbędna do rozpoznawania hemi-metylowanego DNA. Analiza gelfiltracji wykazała, że oczyszczony Dnmt1 eluuje przy pozornej masie cząsteczkowej odpowiadającej wielkości dimeru. Dzięki testom interakcji białek mogliśmy wykazać, że Dnmt1 oddziałuje z samym sobą poprzez poprzez swoją N-końcową domenę regulatorową. Poprzez analizę delecji i i koimmunoprecypitacji zmapowaliśmy domenę dimeryzacji do docelowej sekwencji sekwencji TS, która znajduje się w centrum domeny N-końcowej (aminokwasy 310-629) i wcześniej wykazano, że pośredniczy w niezależnej od replikacji asocjacji z heterochromatyną w chromocentrach. Dalsze analizy mutacyjne sugerowały że kompleks dimeryczny ma dwudzielny interfejs interakcji i jest utworzony w orientacji orientacji head-to-head. Tworzenie dimeru Dnmt1 może ułatwić dyskryminację hemi-metylowanych miejsc docelowych, jak stwierdzono w przypadku innych enzymów rozpoznających palindromiczną sekwencję DNA. Wyniki te przypisują dodatkową funkcję funkcję domenie TS i podnoszą interesujące pytanie, w jaki sposób te funkcje są przestrzennie i czasowo skoordynowane. --- Metylotransferazy DNA (DNMT) są niezbędne do utrzymania nieprawidłowej metylacji w komórkach nowotworowych i odgrywają ważną rolę w rozwoju nowotworów. metylacji w komórkach nowotworowych i odgrywają ważną rolę w rozwoju nowotworów. Nieuregulowana aktywacja szlaku PI3K/Akt jest główną cechą wielu ludzkich nowotworów, w tym ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (HCC). W niniejszym badaniu stwierdziliśmy, że poziomy DNMT3B mRNA i białka były obniżone w sposób zależny od dawki i w sposób zależny od dawki i czasu w liniach komórkowych HCC leczonych LY294002. Jednakże wykryliśmy, że leczenie LY294002 nie indukowało wzrostu degradacji białka DNMT3B przy użyciu testu rozpadu białka. Ponadto stwierdziliśmy, że Akt indukował zmianę ekspresji DNMT3B w komórkach transfekowanych mirystylowanymi wariantami wariantami Akt2 lub komórkami transfekowanymi odpowiednio małym interferującym RNA. Na podstawie testu reporterowego podwójnej lucyferazy promotora DNMT3B stwierdziliśmy, że szlak PI3K reguluje ekspresję DNMT3B na poziomie transkrypcji. A analiza rozpadu mRNA DNMT3B analiza sugeruje, że regulacja w dół DNMT3B przez LY294002 jest również kontrola potranskrypcyjna. Ponadto wykazaliśmy, że LY294002 obniżał ekspresję HuR w sposób zależny od czasu w BEL-7404. Podsumowując Podsumowując, po raz pierwszy wykazaliśmy, że szlak PI3K/Akt reguluje ekspresję DNMT3B na poziomie transkrypcyjnym i posttranskrypcyjnym. co jest szczególnie ważne dla zrozumienia wpływu PI3K/Akt i DNMT3B na hepatokarcynogenezę. --- Wpływ metylacji DNA na ekspresję CXCR4 został wykazany w komórkach raka trzustki i czerniaka. raka trzustki i komórek czerniaka, ale niewiele wiadomo o wpływie metylotransferaz DNA 1 i 3 (DNMT1 i DNMT3B) na ekspresję CXCR4. metylotransferaz DNA 1 i 3 (DNMT1 i DNMT3B) na ekspresję CXCR4. Stosując wektory lentiwirusowe, stworzyliśmy stabilny knockdown DNMT1 i DNMT3B za pomocą interferencji RNA. DNMT1 i DNMT3B w komórkach raka trzustki AsPC1. Stosując odwrotną transkrypcję ilościową PCR w czasie rzeczywistym i analizę cytometryczną przepływu, oceniliśmy wzrost ekspresji transkryptu CXCR4 i poziomu białka w tych komórkach. komórkach. Analiza sekwencjonowania bisulfitowego wykazała, że poziom demetylacji promotora demetylacji okazał się bardziej skuteczny w komórkach z knockdownem DNMT1 niż w komórkach z knockdownem w komórkach z knockdownem DNMT3B. Ponadto, połączona interferencja RNA nokaut zarówno DNMT1, jak i DNMT3B zwiększył demetylację promotora, prowadząc do niewielki wzrost ekspresji CXCR4. Jednakże, czynnik demetylujący 5-Aza-2'-deoksycytydyna wykazywała najsilniejszy wpływ na demetylację promotora, co korelowało z najwyższą produkcją transkryptu i białka CXCR4 w komórkach AsPC1. komórkach AsPC1. Nasze wyniki wskazują, że DNMT1 odgrywa główną rolę w utrzymaniu metylacji promotora CXCR4, podczas gdy DNMT3B może funkcjonować jako dodatkowa metylotransferaza DNA w modulowaniu ekspresji CXCR4 w komórkach AsPC1. --- Reaktywacja wyciszonych genów supresorowych nowotworów przez 5-azacytydynę (Vidaza) i jej kongener 5-aza-2'-deoksycytydynę (decytabina) jego kongener 5-aza-2'-deoksycytydyna (decytabina) zapewniła alternatywne podejście do terapii raka. Wcześniej wykazaliśmy, że leki te selektywnie i szybko indukują degradację metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA (DNMT) 1 przez szlak proteasomalny. Ponieważ toksyczność tych związków jest w dużej mierze spowodowana ich włączeniem do DNA, krytyczne jest zbadanie nowych związków nienukleozydowych, które mogą skutecznie reaktywować wyciszone geny. wyciszone geny. Tutaj donosimy, że związek na bazie chinoliny, oznaczony jako SGI-1027, hamuje aktywność DNMT1, DNMT3A i DNMT3B, a także M. SssI z porównywalnym IC(50) (6-13 mikromoli / L) poprzez konkurowanie z S-adenozylometioniną w reakcji metylacji. Leczenie różnych linii komórek nowotworowych za pomocą SGI-1027 spowodowało selektywną degradację DNMT1 przy minimalnym lub zerowym wpływie na DNMT3A i DNMT3B. W stężeniu od 2,5 do 5 mikromoli / l (podobnym do tego dekitabiny), całkowita degradacja białka DNMT1 została osiągnięta w ciągu 24 godzin bez znaczącego wpływu na jego poziom mRNA. MG132 blokował indukowane przez SGI-1027 zubożenie DNMT1, wskazując na zaangażowanie szlaku proteasomalnego. Przedłużone leczenie komórek RKO za pomocą SGI-1027 prowadziło do demetylacji i reekspresji wyciszonych genów supresorowych nowotworów P16, MLH1 i TIMP3. Ponadto, związek ten nie wykazywał znaczącej toksyczności w linii komórkowej szczurzego wątrobiaka (H4IIE). To badanie badanie zapewnia nową klasę środków hipometylujących DNA, które mają potencjał do wykorzystania w epigenetycznej terapii nowotworów. --- Wstęp: Wczesna utrata ciąży (EPL) jest frustrującym problemem klinicznym, którego mechanizmy mechanizmy nie są do końca poznane. Metylacja DNA, która obejmuje metylację podtrzymującą i metylację de novo kierowaną przez metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA (DNMT), jest ważna dla rozwoju zarodka. Nieprawidłowe funkcji tych DNMT może mieć poważne konsekwencje dla rozwoju zarodka. METODY: Aby ocenić możliwy udział metylacji DNA w ludzkim EPL, ekspresja białek DNMT i globalna metylacja DNA zostały ocenione w kosmków lub decidua od pacjentów z EPL. Związek utrzymania metylacji z implantacją i rozwojem zarodka. WYNIKI: Stwierdziliśmy, że DNMT1 i DNMT3A ulegały ekspresji w prawidłowych ludzkich kosmkach i decidua. kosmków i decidua. Ekspresja DNMT1 i globalne poziomy metylacji DNA były znacząco obniżone w kosmkach EPL. Ekspresja DNMT3A nie była znacząco zmieniona w grupie EPL w porównaniu z grupą kontrolną w kosmkach lub decidua. Stwierdziliśmy również, że zaburzenie metylacji podtrzymującej za pomocą inhibitora DNMT1 może skutkować obniżonym globalnym poziomem metylacji DNA i upośledzonym rozwojem zarodka w mysim modelu. rozwój embrionalny w modelu mysim i hamować przyczepianie się zarodka in vitro do komórek endometrium. WNIOSKI: Nasze wyniki pokazują, że defekty w metylacji konserwującej DNA w zarodku, a nie w matce, są związane z nieprawidłową implantacją i rozwojem zarodka. implantacją i rozwojem zarodka. Wyniki obecnego badania dostarczają nowych wgląd w etiologię EPL. --- Metylacja cytozyny w DNA odgrywa kluczową rolę w rozwoju poprzez dziedziczne wyciszanie genów. Metylotransferaza DNA Dnmt1 jest odpowiedzialna za propagację wzorców metylacji do następnego pokolenia poprzez jej preferencyjną metylację hemimetylowanych miejsc CpG w genomie; jednak w jaki sposób Dnmt1 utrzymuje wzorce metylacji nie jest w pełni zrozumiałe. Tutaj przedstawiamy strukturę krystaliczną dużego fragmentu (291-1620) mysiego Dnmt1 i jego kompleksy z kofaktorem S-adenozylo-L-metioniną i jej produktem S-adenozylo-L-homocysteiną. Warto zauważyć, że pod nieobecność DNA, N-końcowa domena odpowiedzialna za kierowanie Dnmt1 do ognisk replikacji jest wstawiana do kieszeni wiążącej DNA DNA, wskazując, że domena ta musi zostać usunięta, aby mogła nastąpić metylacja. metylacji. Po związaniu S-adenozylo-L-metioniny, katalityczna reszta cysteiny ulega przejściu konformacji do katalitycznie kompetentnej pozycji. pozycji katalitycznie kompetentnej. Oczekuje się, że w celu rozpoznania hemimetylowanego DNA, Dnmt1 wykorzystywać domenę rozpoznawania celu, która wystaje poza domniemaną kieszeń wiążącą DNA DNA. Biorąc pod uwagę niedawne doniesienia o krótszym fragmencie struktury Dnmt1, że motyw CXXC pozycjonuje się w kieszeni katalitycznej i zapobiega nieprawidłowej metylacji de novo, proponujemy, aby utrzymanie metylacji jest wieloetapowym procesem, któremu towarzyszą zmiany strukturalne. --- Metylacja reszt cytozyny w DNA odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów podczas rozwoju zarodkowego kręgowców. ekspresji genów podczas rozwoju embrionalnego kręgowców. I odwrotnie, zakłócenie normalnych wzorców metylacji jest powszechne w nowotworach i występuje na wczesnym etapie progresji niektórych ludzkich nowotworów. U kręgowców wydaje się, że ta sama metylotransferaza DNA metylotransferaza DNA utrzymuje wcześniej istniejące wzorce metylacji podczas replikacji DNA replikacji DNA i przeprowadza metylację de novo w celu utworzenia nowych wzorów metylacji. wzory metylacji. Istnieje kilka przesłanek wskazujących na to, że nieodłączne sygnały w strukturze DNA mogą działać in vivo w celu zainicjowania lub zablokowania metylacji de novo w sąsiednich regionach DNA. regionach DNA. Aby zidentyfikować sekwencje zdolne do wzmocnienia metylacji de novo DNA in vitro, zaprojektowaliśmy serię substratów oligodeoksyrybonukleotydowych z resztami cytozyny w różnych kontekstach sekwencji. Uzyskaliśmy dowody że niektóre reszty 5-metylocytozyny w tych jednoniciowych DNA mogą stymulować metylację de novo sąsiednich miejsc przez metylotransferazę 5-cytozynową mysiego DNA równie skutecznie, jak reszty 5-metylocytozyny w dwuniciowym DNA stymulują metylację podtrzymującą. Sugeruje to, że dwuniciowy DNA może nie być naturalnym substratem dla metylacji de novo i że zapętlone jednoniciowe struktury jednoniciowe struktury utworzone podczas normalnego przebiegu replikacji lub naprawy DNA służą jako miejsca "nukleacji" dla metylacji de novo sąsiednich regionów DNA. regionów DNA. --- Dziedziczenie informacji epigenetycznych kodowanych przez wzory metylacji cytozyny DNA ma kluczowe znaczenie dla przetrwania komórek ssaków, w dużej mierze poprzez aktywność metylotransferazy DNA (DNMT1). Tutaj pokazujemy, że SET7, znana metylotransferaza histonów, jest zaangażowana w regulację stabilności białka DNMT1. stabilności białka DNMT1. SET7 kolokalizuje i bezpośrednio oddziałuje z DNMT1 i specyficznie monometyluje Lys-142 DNMT1. Metylowane szczyty DNMT1 podczas fazy S i G (2) cyklu komórkowego i jest podatny na degradację za pośrednictwem proteasomu degradację. Nadekspresja SET7 prowadzi do obniżenia poziomu DNMT1 i nokaut SET7 za pomocą siRNA stabilizuje DNMT1. Wyniki te pokazują że sygnalizacja poprzez SET7 stanowi środek obrotu enzymu DNMT1. --- 1. --- W przeciwieństwie do normalnych komórek, komórki nowotworowe wykazują zarówno genetyczną, jak i epigenetyczną niestabilność. niestabilność genetyczną i epigenetyczną. Te unikalne właściwości prowadzą do genetycznej i epigenetycznej heterogeniczności w danej populacji komórek nowotworowych i zapewniają środki do do progresji fenotypowej poprzez selekcję klonalną. DNA metylacja dinukleotydów CpG jest jednym ze znaczników epigenetycznych, które są często zaburzane w komórkach nowotworowych. Aby zrozumieć, w jaki sposób metylacja CpG jest zmienna w komórkach nowotworowych, konieczne jest poznanie, w jaki sposób jest ona wiernie utrzymywany w normalnej proliferacji komórek. Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy opracowaliśmy nowy system in vitro, który opiera się na dobrze ugruntowanym systemie replikacji SV40 in in vitro i działa w celu odtworzenia jednoczesnej replikacji DNA reakcje replikacji i metylacji DNA. Odkryliśmy, że metylacja DNA była utrzymywana tylko wtedy, gdy egzogenna metylotransferaza DNA 1 (DNMT1) i S-adenozylometionina (SAM) zostały dodane do reakcji. Wykazaliśmy, że DNMT1 wiąże się z replikującą i/lub replikowaną chromatyną niezależnie od status metylacji matrycowego DNA. Co więcej, domena wiążąca PCNA (PBD) DNMT1 nie jest wymagana do asocjacji. Podsumowując, sugerujemy, że że DNMT1 jest rekrutowany do replikującej i/lub replikowanej chromatyny w sposób konstytutywny sposób niezależny od reakcji metylacji DNA. System in vitro opisany w tym raporcie jest bardzo przydatny do analizy molekularnego mechanizmu mechanizmu leżącego u podstaw reakcji metylacji DNA. --- Utrzymanie metylacji cytozyny w roślinach jest kontrolowane przez trzy metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA. MET1 utrzymuje metylację CG, a DRM1/2 i CMT3 działają redundantnie, aby wymusić metylację inną niż CG. RPS, powtarzalny hipermetylowany fragment DNA fragment z Petunia hybrida, przyciąga metylację DNA po przeniesieniu do petunii lub innych gatunków. W Arabidopsis thaliana, który nie zawiera żadnych homologów RPS, transgeny RPS są skutecznie metylowane we wszystkich kontekstach sekwencji. kontekstach. Aby sprawdzić, które szlaki metylacji DNA regulują metylację RPS, zbadaliśmy zbadaliśmy utrzymanie metylacji RPS w różnych zmutowanych środowiskach. Co zaskakujące, metylacja CG została utracona w mutancie drm1/2/cmt3, a metylacja non-CG została prawie całkowicie wyeliminowana w mutancie met1. Niezwykła kooperatywna aktywność wszystkich trzech metylotransferaz DNA jest zatem wymagana do utrzymania metylacji CG i non-CG w RPS. Inne niezwykłe cechy metylacji RPS to niezależność metylacji non-CG od metylacji DNA kierowanej przez metylacji DNA kierowanej przez RNA (RdDM) oraz wyjątkowe utrzymanie metylacji w miejscu CC(m)TGG w niektórych mutantach epigenetycznych. Wskazuje to na aktywność systemu metylacji u roślin, który mógł wyewoluować z systemu metylacji DCM który kontroluje metylację CC(m)WGG u bakterii. Nasze dane sugerują, że ścisłe oddzielenie szlaków metylacji CG i innych niż CG nie nie ma zastosowania do wszystkich regionów docelowych i że należy zachować ostrożność przy uogólnianiu danych metylacyjnych uzyskanych dla poszczególnych regionów genomowych. --- W utrzymaniu wzorców metylacji genomu pośredniczy głównie metylotransferaza DNA metylotransferazę DNA-1 (DNMT1). Rozwiązaliśmy struktury mysiej i ludzkiej DNMT1 składającej się z domen CXXC, tandemowej homologii bromo-sąsiadującej (BAH1/2) i metylotransferazy związanych z zawierającymi DNA niemetylowanymi miejscami CpG. CXXC specyficznie wiąże się z niemetylowanym dinukleotydem CpG i pozycjonuje łącznik CXXC-BAH1 między DNA a aktywnym miejscem DNMT1, zapobiegając metylacji de novo. Ponadto Ponadto pętla wystająca z BAH2 oddziałuje z domeną rozpoznawania celu (TRD) metylotransferazy, stabilizując TRD w pozycji cofniętej pozycji i uniemożliwiając jej wstawienie do głównego rowka DNA. Nasze badania identyfikują mechanizm autoinhibicji, w którym niezmetylowane dinukleotydy CpG są zablokowane w miejscu aktywnym, aby zapewnić, że tylko hemimetylowane dinukleotydy CpG ulegają metylacji. --- Ostatnie badania wykazały, że UHRF1 jest wymagany do metylacji DNA poprzez kierowanie DNMT1 do ognisk replikacji DNA, prawdopodobnie poprzez jego unikalną aktywność wiązania hemi-metylowanego DNA i interakcję z DNMT1. UHRF2, inny członek rodziny białek UHRF, jest bardzo podobny do UHRF1 zarówno w sekwencji, jak i strukturze sekwencji i strukturze, co rodzi pytania o jego rolę w metylacji DNA. W W tym badaniu wykazaliśmy, że podobnie jak UHRF1, UHRF2 również wiąże się preferencyjnie do metylowany histon H3 lizynę 9 (H3K9) poprzez swoją konserwatywną domenę tudor i hemi-metylowanego DNA poprzez SET i domenę związaną z pierścieniem. Podobnie jak UHRF1, UHRF2 jest wzbogacony w pericentryczną heterochromatynę. Lokalizacja heterochromatyny lokalizacja zależy w dużym stopniu od jego aktywności wiązania metylowanego H3K9 i w mniejszym stopniu od aktywności wiązania metylowanego DNA. Eksperymenty koimmunoprecypitacji wykazują, że zarówno UHRF1, jak i UHRF2 oddziałują z DNMT1, DNMT3a, DNMT3b i G9a. Pomimo tych wszystkich konserwatywnych funkcji, stwierdzamy, że UHRF2 nie jest w stanie w stanie uratować defektu metylacji DNA w mysich embrionalnych komórkach macierzystych Uhrf1 null komórki. Można to przypisać niezdolności UHRF2 do rekrutacji DNMT1 do ognisk replikacji w fazie ognisk replikacji podczas fazy S cyklu komórkowego. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że podczas gdy UHRF1 oddziałuje z DNMT1 w sposób zależny od fazy S w komórkach, UHRF2 nie nie. Tak więc nasze badanie pokazuje, że UHRF2 i UHRF1 nie są funkcjonalnie redundantne w utrzymaniu metylacji DNA i ujawnia zależną od cyklu komórkowego interakcję między UHRF1 i DNMT1 jako kluczowy mechanizm regulacyjny ukierunkowany na DNMT1 dla metylacji DNA. --- Utrzymanie metylacji hemimetylowanych miejsc CpG przez metylotransferazę DNA metylotransferazę Dnmt1 jest molekularną podstawą dziedziczenia wzorów metylacji DNA wzorców metylacji DNA. W oparciu o dane strukturalne i kinetykę uzyskaną za pomocą skróconą formą Dnmt1, zaproponowano model autoinhibicji dla specyficzności Dnmt1 w którym niezmetylowany DNA wiąże się z domeną CXXC Dnmt1, co zapobiega jego metylacji. zapobiega jego metylacji. Przygotowaliśmy warianty domeny CXXC, które utraciły wiązanie DNA DNA. Odpowiednie warianty Dnmt1 o pełnej długości nie wykazywały zmniejszenia specyficzności, wskazując, że model autoinhibicji nie ma zastosowania w pełnej długości Dnmt1. Ponadto pokazujemy, że wariant Dnmt1 M1235S, który niesie wymianę w domenie katalitycznej enzymu, ma wyraźną redukcję specyficzności, wskazując, że rozpoznawanie hemimetylowanych miejsc docelowych stan miejsc docelowych znajduje się w domenie katalitycznej. --- Ustanowienie trwałej infekcji wirusem Epsteina-Barr (EBV) wymaga przejście z programu pełnej ekspresji genów latencji wirusowej (latencja III) do który jest wysoce ograniczony (latencja I i 0) w limfocytach B pamięci. Jest to że metylacja DNA odgrywa kluczową rolę w wyciszaniu genów EBV. wyciszaniu genów EBV, a ostatnio białko graniczne chromatyny CTCF zostało zaangażowane jako kluczowy regulator latencji poprzez wiązanie się z kilkoma loci w genomie EBV. genomu EBV. Jedno godne uwagi miejsce znajduje się przed wspólnym promotorem genu EBNA Cp, w którym CTCF może działać jako regulator latencji. w którym CTCF może działać jako czynnik blokujący wzmacniacz, aby zainicjować i utrzymać wyciszanie transkrypcji genu EBNA. Wcześniej sugerowano, że zwiększona ekspresja ekspresji CTCF może leżeć u podstaw jego potencjału do promowania ograniczonej latencji i tutaj zauważyliśmy również podwyższone poziomy metylotransferazy DNA 1 (DNMT1) i DNMT3B związane z latencją I. Jednak w liniach komórek B, które utrzymują latencję I, stabilne znokautowanie CTCF, DNMT1 lub DNMT3B lub DNMT1 i DNMT3B w połączeniu nie skutkowało aktywacją ekspresji białka latencji III lub transkrypcji genu EBNA transkrypcji, ani też nokaut DNMT nie zmienił znacząco metylacji CpG w obrębie Cp. Tak więc, zróżnicowana ekspresja CTCF i DNMT1 i -3B nie jest krytyczna dla utrzymania ograniczonej latencji. Wreszcie, zmutowany EBV pozbawiony miejsca wiązania Cp CTCF wykazywał trwałą aktywność Cp w stosunku do EBV typu dzikiego w niedawno opracowanym modelu superinfekcji komórek B, ale ostatecznie był w stanie przejście do latencji I, co sugeruje, że CTCF przyczynia się, ale niekoniecznie jest ale niekoniecznie jest niezbędny do ustanowienia ograniczonej latencji. --- Metylacja DNA jest postreplikacyjną modyfikacją występującą w większości prokariotycznych genomów. i eukariotycznych genomach, która ma wiele ważnych funkcji biologicznych w tym regulację ekspresji genów, odciskanie genów, zachowanie integralności chromosomów i inaktywację chromosomu X. Zgodnie z ich struktury i funkcji, metylotransferazy DNA (Dnmts) są podzielone na dwie główne rodziny w komórkach ssaków: metylotransferazy konserwujące (Dnmt1) i metylotransferazy de novo (Dnmt3a, Dnmt3b i Dnmt3L). Ponadto, Dnmt2 również wykazuje słabą aktywność katalityczną metylotransferazy DNA, ale nowo założona funkcja funkcją jest metylowanie cytozyny 38 w antykodonowej pętli tRNAAsp. Te Dnmts są kluczowe dla wzrostu i rozwoju ssaków. Niedobór Dnmts będzie prowadzi do wad rozwoju embrionalnego, raka i innych chorób. Dlatego, Dnmts mogą być ważnymi celami terapeutycznymi. Niniejszy artykuł podsumowuje klasyfikację, funkcję i ostatnie postępy w badaniach nad metylotransferazami DNA metylotransferaz. --- Fosfataza Cdc25C pośredniczy w wejściu komórki w mitozę w komórkach ssaków. Cdc25C aktywuje Cdc2 do wejścia w mitozę poprzez defosforylację Thr i Tyr w miejscu hamującej fosforylacji. w miejscu hamującej fosforylacji. Gen Cdc25C zawiera miejsca wiązania supresora nowotworu supresorowe miejsca wiązania p53 i wykazano, że przyczynia się do p53-zależnego zatrzymania cyklu komórkowego po uszkodzeniu DNA. Tutaj pokazujemy, że zarówno Cdc25C i Cdc2 były regulowane w dół w komórkach HCT116 typu dzikiego, ale nie w komórkach p53-null, DNMT1-null lub DNMT1 i DNMT3b-null, po stabilizacji p53 w następstwie uszkodzenie DNA za pośrednictwem doksorubicyny. Ponadto, zebularina, lek, który selektywnie wychwytuje i zubaża jądrowe DNMT1 i DNMT3b, łagodzi za pośrednictwem p53 represję endogennych Cdc25C i Cdc2. Analiza metylacji promotorów Cdc25C i Cdc2 wykazała wewnętrzną metylację CG proksymalnie do miejsca wiązania p53 po uszkodzeniu DNA w sposób zależny od p53. Immunoprecypitacja chromatyny traktowanych doksorubicyną komórek HCT116 typu dzikiego wykazała obecność DNMT1, p53, H3K9me2 i represora transkrypcji HDAC1 na promotorach Cdc25C i Cdc2 promotorów, co sugeruje ich udział jako kompleksów represyjnych w wyciszaniu genów Cdc25C i Cdc2. Tak więc, ogólny mechanizm represji genów za pośrednictwem p53 może obejmować rekrutację innych czynników represyjnych. --- Metylacja DNA jest znacznikiem epigenetycznym niezbędnym dla rozwoju ssaków, stabilności genomu i imprintingu. Wzorce metylacji DNA są ustalane i utrzymywane przez trzy metylotransferazy DNA: DNMT1, DNMT3A i DNMT3B. Co ciekawe, wszystkie trzy DNMT wykorzystują alternatywny splicing. DNMT3B ma prawie 40 znanych wariantów splicingu wyrażanych w sposób specyficzny dla tkanki i choroby. sposób, ale bardzo niewiele wiadomo na temat roli tych wariantów splicingu w modulowaniu funkcji DNMT3B. Opisujemy tutaj identyfikację i charakterystykę nowej alternatywnie splicowanej formy DNMT3B pozbawionej eksonu 5 w obrębie NH(2)-końcowej domeny regulatorowej. Ten wariant, który określamy jako DNMT3B3Delta5, ponieważ jest blisko spokrewniony w strukturze z wszechobecną ekspresji izoformy DNMT3B3, ulega wysokiej ekspresji w komórkach pluripotencjalnych i mózgu mózgu, jest regulowana w dół podczas różnicowania i jest konserwowana u myszy. Tworzenie pluripotencjalnych komórek iPS z fibroblastów powoduje znaczną indukcję DNMT3B3Delta5. Ekspresja DNMT3B3Delta5 jest również zmieniona w chorobach człowieka, z liniami komórek nowotworowych wykazującymi podwyższoną lub obniżoną ekspresję w zależności od ich tkanki pochodzenia. Następnie porównaliśmy wiązanie DNA i subkomórkową lokalizację lokalizację DNMT3B3Delta5 w porównaniu z DNMT3B3, ujawniając, że DNMT3B3Delta5 posiadał znacznie zwiększone powinowactwo wiązania DNA i wykazywał zmienioną dystrybucję jądrową. Wreszcie, ektopowa nadekspresja DNMT3B3Delta5 spowodowała w hipometylacji elementów powtarzalnych i zwiększonym wzroście komórek w teście tworzenia kolonii kolonii. Podsumowując, wyniki te pokazują, że DNMT3B3Delta5 może odgrywać ważną rolę w utrzymaniu lub różnicowaniu komórek macierzystych i sugerują, że sekwencje kodowane przez ekson sekwencje kodowane przez ekson 5 wpływają na właściwości funkcjonalne DNMT3B. --- Metylotransferaza DNA-1 (DNMT1) ma wyższą specyficzną aktywność na hemimetylowanym DNA niż na niemetylowanym DNA. DNA niż na niemetylowanym DNA, ale ta preferencja jest zbyt mała, aby wyjaśnić wierne mitotyczne dziedziczenie wzorców metylacji genomowej. Nowe badania genetyczne genetyczne u roślin i ssaków zidentyfikowały nowy czynnik, który zwiększa wierność metylacji konserwacyjnej. --- Metylacja DNA w neuronach postmitotycznych służy różnym funkcjom funkcji, od przetrwania podczas rozwoju do konsolidacji pamięci. Szczególnie szczególnego zainteresowania w odniesieniu do funkcjonowania neuronów jest zmiana w metylacji różnych promotorów genów w kontekście depolaryzacji neuronów i konsolidacji pamięci. depolaryzacji neuronów i kodowania nowych informacji. Zbadaliśmy ekspresję DNMT1 i DNMT3a, reprezentujących odpowiednio metylotransferazę konserwującą i de novo metylotransferazy, odpowiednio, w odpowiedzi na depolaryzację in vitro neuronów korowych neuronów korowych, przy użyciu standardowych technik, takich jak wysokie stężenie potasu (KCl) lub agonista kanału sodowego weratrydyna. Depolaryzacja, w której pośredniczyły KCl i weratrydyna spowodowały skromne, ale znaczące i powtarzalne zmniejszenie ekspresji mRNA i białka ekspresji obu DNMT, która była zależna od czasu i dawki. Efekty te były wspierane przez równoległy wzrost ekspresji mRNA egzonu-1 i egzonu-4 BDNF jako typowa odpowiedź neuronów na depolaryzację i wykluczenie możliwości możliwość upośledzenia aktywności transkrypcyjnej jako trywialnego wyjaśnienia. W oprócz wpływu na ekspresję mRNA i białka, funkcjonalna aktywność metylotransferazy DNA aktywność metylotransferazy DNA została zmniejszona w ekstraktach białek jądrowych z komórek narażonych na warunki depolaryzacji. Zmiany te nie mogły być również wyjaśnione przez zróżnicowaną utratę neuronów mierzoną żywotnością komórek cytochemii. Nasze wyniki potwierdzają koncepcję, że zmniejszenie aktywności metylotransferazy DNA aktywności metylotransferazy DNA w aktywowanym i zdepolaryzowanym neuronie może przyczynić się do zwiększonej intensywności i mnogości ekspresji genów często zgłaszane. --- TŁO: Metylacja DNA, modyfikacje histonów i obłożenie nukleosomów działają w regulacji wzorców ekspresji genów w komórkach ssaków. Ostatnio wykazano, że G9a, metylotransferaza H3K9, odgrywa rolę w metylacji DNA w miejscach docelowych genów embrionalnych w komórkach ES poprzez rekrutację enzymów de novo DNMT3A/3B. Jednakże, czy G9a odgrywa podobną rolę w utrzymaniu metylacji DNA w komórkach somatycznych jest nadal niejasne. WYNIKI: Tutaj pokazujemy, że G9a nie jest niezbędny do utrzymania metylacji DNA w komórkach somatycznych. metylacji DNA w komórkach somatycznych. Zablokowanie G9a nie ma mierzalnego wpływu na poziomy metylacji DNA poziomy metylacji DNA w loci docelowych G9a. DNMT3A/3B pozostają stabilnie zakotwiczone do nukleosomów zawierających metylowane DNA nawet przy braku G9a, zapewniając wierną propagację stanów metylowanych we współpracy z DNMT1 poprzez podziały somatyczne. Co więcej, G9a wiąże się również z nukleosomami w sposób DNMT3A/3B i w sposób niezależny od metylacji DNA. Jednakże, nokaut G9a działa synergistycznie z farmakologicznym hamowaniem DNMT, co skutkuje zwiększoną hipometylacją i hamowanie proliferacji komórek. WNIOSKI: Podsumowując, dane te sugerują, że G9a nie jest zaangażowany w utrzymanie metylacji DNA w komórkach somatycznych, ale może odgrywać rolę w ponownej inicjacji metylacji de novo po leczeniu lekami hipometylującymi, tym samym służąc jako potencjalny cel dla kombinatorycznych strategii leczenia obejmujących inhibitory DNMT. --- Metylacja reszt cytozyny w kontekście dinukleotydów CpG w DNA ssaków DNA ssaków jest modyfikacją epigenetyczną o głębokim wpływie na regulację transkrypcji. Grupa enzymów, metylotransferaz DNA (DNMT) ściśle reguluje zarówno inicjację, jak i utrzymanie tych znaczników metylowych. znaczników. Utrata krytycznych składników tej maszynerii enzymatycznej skutkuje wady wzrostu, żywotności i różnicowania zarówno u myszy, jak i u ludzi, wspierając pogląd, że ta epigenetyczna modyfikacja jest niezbędna dla prawidłowego rozwoju. rozwoju. Poza tym, metylacja DNA zapewnia również silny mechanizm epigenetyczny mechanizm pamięci komórkowej potrzebny do wyciszenia powtarzających się elementów i zachowania specyficzności linii przez powtarzające się podziały komórek w okresie dorosłości. Ostatnie prace podkreślające wyspecjalizowaną rolę metylacji DNA i metylotransferaz w utrzymaniu funkcji dorosłych somatycznych komórek macierzystych sugeruje, że że dalsza analiza tych mechanizmów rzuci nowe światło na złożoną naturę samoodnowy. --- W genomie ssaków występuje podzbiór genów, znanych jako geny imprintowane. Imprinting genomowy reguluje monoalleliczną ekspresję tych genów, w zależności od tego, czy od tego, czy gen został odziedziczony od plemnika czy komórki jajowej. Ten specyficzna dla rodzica pochodzenia ekspresja genu jest generalnie zależna od epigenetycznej modyfikacji, metylacji DNA i statusu metylacji DNA dinukleotydów CpG dinukleotydów rezydujących w loci znanych jako regiony różnie metylowane (DMR). (DMR). Mechanizm enzymatyczny odpowiedzialny za dodawanie grup metylowych (-CH(3)) do reszt cytozyny w dinukleotydach CpG są znane jako metylotransferazy DNA metylotransferazy DNA (DNMT). Prawidłowe ustanowienie i utrzymanie wzorów metylacji w genach wdrukowanych jest związane z funkcją łożyska i regulacją regulacją rozwoju zarodka/płodu. Wiele prac zostało przeprowadzonych na geny wdrukowane u myszy i ludzi; jednak niewiele wiadomo na temat dynamiki metylacji u bydła. dynamiki metylacji w oocycie bydlęcym. Głównym celem niniejszego badania było scharakteryzowanie ustanowienia metylacji w matczynym odciśniętych genów w rosnących oocytach bydlęcych i określenie, czy ekspresja bydlęcych DNMT - DNMT3A, DNMT3B i DNMT3L - była skoordynowana z metylacją DNA podczas rozwoju oocytów. W tym celu wybrano panel genów wdrukowanych matczynie (SNRPN, MEST, IGF2R, PEG10 i PLAGL1) oraz domniemane DMR dla MEST, IGF2R, PEG10 i PLAGL1 zostały zidentyfikowane w regionach 5' dla każdego genu; DMR SNRPN został zgłoszony wcześniej. Konwencjonalne sekwencjonowanie dwusiarczynowe ujawniło, że znaczniki metylacji zostały nabyte we wszystkich pięciu DMR badanych w sposób zależny od wielkości oocytu. Zostało to potwierdzone dla wybranych genów przy użyciu analizy pirosekwencjonowania. Ponadto, ekspresja mRNA i analiza białek ujawniła, że DNMT3A, DNMT3B i DNMT3L są również obecne w oocycie bydlęcym podczas fazy wzrostu. Badanie to pokazuje po raz pierwszy, że wzrost wzrost metylacji DMR bydlęcego genu wdrukowanego występuje podczas wzrostu oocytu, co obserwuje się u myszy. --- Metylacja DNA na promotorowych wyspach CpG (CGI) jest modyfikacją epigenetyczną związaną z niewłaściwym wyciszaniem genów w wielu typach nowotworów. W przypadku braku linii komórkowej ludzkiego guza przysadki, małe interferujące RNA za pośrednictwem knockdown metylotransferazy konserwującej DNA (cytozyna 5)-1 (Dnmt1) zastosowano w mysiej linii komórkowej gruczolaka przysadki AtT-20. Trwały knockdown indukował reekspresję w pełni zmetylowanego i normalnie wdrukowanego genu neuronatyny. neuronatyny (Nnat) w sposób zależny od czasu. Połączona analiza restrykcji analiza restrykcyjna (COBRA) ujawniła, że reekspresja Nnat była związana z częściową demetylacją CGI z częściową demetylacją CGI, którą zaobserwowano również w regionie H19 różnie metylowanym regionie. Późniejsza analiza mikromacierzy obejmująca cały genom zidentyfikowała 91 genów, które ulegały znaczącej ekspresji w komórkach Dnmt1 (10% współczynnik fałszywych odkryć). Analiza wykazała, że geny związane z indukcją apoptozy, transdukcją sygnału i procesami rozwojowymi procesy rozwojowe były znacząco nadreprezentowane na tej liście (P < 0.05). Po walidacji za pomocą odwrotnej transkrypcji-PCR i wykryciu niewłaściwej metylacji CGI przez COBRA, cztery geny (ICAM1, NNAT, RUNX1 i S100A10) analizowano w pierwotnych ludzkich guzach przysadki, z których każdy wykazywał znacznie obniżone poziomy mRNA w stosunku do prawidłowej przysadki mózgowej (P < 0,05). Dla dwóch z tych genów, NNAT i S100A10, zmniejszona ekspresja była związana z zwiększoną metylacją promotora CGI. Indukowana ekspresja Nnat w stabilnych transfekowanych komórkach AtT-20 hamowała proliferację komórek. Według naszej wiedzy, jest to pierwsze doniesienie o "demaskowaniu epigenetycznym" opartym na tablicy w połączeniu z Dnmt1 i ujawnia potencjał tej strategii w kierunku identyfikacji genów wyciszonych przez mechanizmy epigenetyczne ponad granicami gatunków. --- CEL: Patogeneza nowotworów gruczołów ślinowych nie została dobrze poznana. Metylacja DNA występuje, gdy grupy metylowe są dodawane do nukleotydów cytozyny w określonych obszarach genu przez enzym określonych obszarach genu przez enzym metylotransferazę DNA (DNMT). Ta chemiczna modyfikacja chemiczna może zmienić ekspresję genu bez zmiany sekwencji DNA. Podczas gdy DNMT3a jest głównie zaangażowana w metylację de novo, DNMT1 działa jako metylotransferaza metylotransferaza konserwująca. Naszym celem było zbadanie immunoekspresji DNMT3a i DNMT1 w nowotworach drobnych gruczołów ślinowych, porównując je z prawidłową tkanką. tkanką. MATERIAŁ: Czterdzieści cztery utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie próbki gruczolaka gruczolaka, gruczolakoraka torbielowatego, raka śluzowo-naskórkowego i polimorficznego gruczolakoraka o niskim stopniu złośliwości. Białka DNMT1 i DNMT3a zidentyfikowano przy użyciu wysoce czułego systemu opartego na polimerach. WYNIKI: Pozytywne jądrowe i cytoplazmatyczne znakowanie DNMT1 zaobserwowano we wszystkich próbkach, w tym w próbkach kontrolnych. próbkach, w tym w próbkach kontrolnych. Pozytywne znakowanie jądrowe dla DNMT3a stwierdzono tylko w kilku nowotworach: 1 gruczolaku wielopostaciowym (9,0%), 2 raku gruczołowo-torbielowatym (16,6%) i 1 śluzowo-naskórkowym (9,0%). WNIOSEK: Nasze wyniki nie były w stanie wykazać wyraźnej korelacji między DNMT1 i DNMT3a a rozwojem nowotworów gruczołów ślinowych. --- TŁO: Chociaż Dnmt1 jest uważana za podstawową metylotransferazę konserwującą a Dnmt3a i Dnmt3b są uważane za metylotransferazy de novo u ssaków, te trzy enzymy mogą współpracować zarówno w utrzymywaniu, jak i ustalaniu wzorców metylacji DNA wzorców metylacji DNA. Zaproponowano, że Dnmt1 może przeprowadzać metylację de novo metylację w miejscach w genomie z przejściowymi regionami jednoniciowymi, takimi jak jako początki replikacji, a następnie rozprzestrzeniać metylację z tych miejsc nukleacji in vivo, chociaż taka aktywność nie została zgłoszona. WYNIKI: W tym badaniu wykazaliśmy, że Dnmt3a nie działa na jednoniciowe substraty in vitro, co wskazuje, że Dnmt3a nie działa na jednoniciowe substraty in vitro. substratach jednoniciowych in vitro, co wskazuje, że Dnmt3a prawdopodobnie nie inicjuje metylacji DNA metylacji DNA w takich proponowanych miejscach nukleacji. Dnmt3a wykazuje podobną aktywność metylacji metylacji na niemetylowanym i hemimetylowanym dupleksie DNA, choć z pewną preferencją substratową. preferencją substratową. W przeciwieństwie do Dnmt1, wcześniej istniejąca metylacja cytozyny w miejscach CpG lub nie-CpG nie stymuluje aktywności Dnmt3a in vitro i in vivo. WNIOSEK: Fakt, że Dnmt3a nie działa na jednoniciowe DNA i nie jest stymulowany przez wcześniej istniejącą metylację cytozyny wskazuje, że aktywność metylacji de novo aktywność metylacyjna Dnmt3a jest zupełnie inna niż Dnmt1. Te są zgodne z modelem, w którym Dnmt3a inicjuje metylację na jednej z nici DNA dupleksu DNA, a te hemimetylowane miejsca następnie stymulują aktywność Dnmt1 do dalszej metylacji. --- U ssaków Dnmt1 jest metylotransferazą DNA odpowiedzialną głównie za utrzymywanie wzorców metylacji genomu poprzez cykle replikacji DNA, ale w jaki sposób jego aktywność konserwacyjna jest kontrolowana, wciąż nie jest dobrze poznany. Co ciekawe, Uhrf1, kluczowy kofaktor dla utrzymania metylacji DNA przez Dnmt1, jest obdarzony aktywnością ligazy ubikwityny E3. Tutaj pokazujemy, że zarówno Dnmt1 i Uhrf1 koprecypitują z peptydazą specyficzną dla ubikwityny 7 (Usp7), enzymem enzymem deubikwitynującym. Nadekspresja Uhrf1 i Usp7 spowodowała przeciwne zmiany w ubikwitynacji. zmiany w statusie ubikwitynacji i stabilności Dnmt1. Nasze odkrycia sugerują, że równoważąc ubikwitynację Dnmt1, Usp7 i Uhrf1 dostrajają stabilność Dnmt1 stabilność. --- Estrogeny odgrywają kluczową rolę w rozwoju mózgu, działając na obszary, które wyrażają receptory estrogenowe. W korze mózgowej gryzoni ekspresja receptora estrogenowego alfa (ER alfa) jest wysoka na wczesnym etapie rozwoju postnatalnego, ale spada począwszy od 10. dnia po urodzeniu (PND) i jest praktycznie nieobecna w dorosłej korze mózgowej. Mechanizmy kontrolujące tę regulację są w dużej mierze nieznane. Metylacja jest ważna dla wyciszania genów podczas rozwoju w wielu tkankach, w tym w mózgu. mózgu. W niniejszym badaniu zbadaliśmy stan metylacji 5' nieulegających translacji eksonów ER alfa podczas wczesnego rozwoju postnatalnego u samców i samic myszy przy użyciu specyficznego dla metylacji PCR i pirosekwencjonowania. Kilka regionów promotora ER alfa wykazało znaczny wzrost metylacji w PND 18 i 25 w porównaniu z PND 4. Metylotransferazy DNA (DNMT) są ważne dla inicjacji i utrzymania metylacji. PCR w czasie rzeczywistym wykazał, że DNMT3A, DNMT DNMT de novo osiągnął szczyt w PND 10 i został zmniejszony do PND 25. DNMT1, który jest ważny dla utrzymania metylacji, wzrastał w trakcie rozwoju i utrzymywał się na wysokim poziomie w dorosłej korze mózgowej. Białko wiążące metylo-CpG 2 (MeCP2) jest również ważne dla stabilizacji metylacji. Test immunoprecypitacji chromatyny wykazało korelację między związkiem MeCP2 z promotorem ER alfa a wzrostem metylacji i spadkiem ekspresji ER alfa po PND 10. U myszy zawierających zmutowane białko MeCP2, ekspresja mRNA ER alfa i wzorce metylacji promotora wzorce metylacji promotora w trakcie rozwoju różniły się w porównaniu z myszami myszy typu dzikiego. Dane te sugerują, że metylacja promotorów ER alfa reguluje ekspresję ER alfa mRNA w korze mózgowej podczas rozwoju postnatalnego w sposób sposób zależny od MeCP2. --- 5-Aza-2'-deoksycytydyna (5-aza-dC) jest analogiem nukleozydu o działaniu cytotoksycznym i demetylującym DNA. działanie demetylujące DNA. Tutaj pokazujemy, że 5-aza-dC indukuje proteasomalną degradację wolnego (niezwiązanego z chromatyną) DNMT1 poprzez mechanizm, który jest zależny od syntezy DNA i ukierunkowania włączonych reszt 5-aza-dC przez samą DNMT1. Tak więc 5-aza-dC indukuje degradację Dnmt1 w mysich komórkach ES typu dzikiego, ale nie w komórkach Dnmt1. komórki, ale nie w Dnmt [3a (-/-), 3b (-/-)] mysie komórki ES, które wyrażają Dnmt1, ale brak metylacji DNA (<0,7% metylowanych CpG) i zawierają niewiele hemi-metylowanych miejsc CpG, które są preferowanymi substratami dla Dnmt1. Sugerujemy, że addukty utworzone między cząsteczkami DNMT1 i 5-aza-dC w DNA indukują aktywność ligazy ubikwityny-E3 aktywność ligazy, która preferencyjnie kieruje wolne cząsteczki DNMT1 do degradacji przez proteasom. Inhibitor proteasomu MG132 zapobiega degradacji DNMT1 i zmniejsza hipometylację indukowaną przez 5-aza-dC. --- Poprzednie badania wykazały, że metylotransferaza DNA (Dnmt) 1 jest wymagana do utrzymania metylacji DNA i jest niezbędna dla rozwoju myszy. Jednak somatyczne zaburzenie DNMT1 w ludzkiej linii komórek nowotworowych HCT116 było nie było śmiertelne i spowodowało jedynie niewielki spadek metylacji. Tutaj donosimy o identyfikację skróconego białka DNMT1, które zostało wygenerowane przez zaburzenie DNMT1 w komórkach HCT116. Skrócone białko, które miało części usunięto regulacyjną domenę N-końcową, ale zachowano katalityczną domenę C-końcową domena, była obecna na różnych poziomach we wszystkich DNMT1 single-knockout i DNMT1/DNMT3b testowanych liniach komórkowych i zachował aktywność hemimetylazy aktywność. DNMT1 RNAi spowodował zmniejszenie żywotności komórek WT i knockout oraz dalszą utratę metylacji DNA w komórkach z nokautem DNMT1. Ponadto, zaobserwowaliśmy opóźnienie metylacji po replikacji i wzrost hemimetylacji określonych miejsc CpG w komórkach wyrażających skrócone białko. Badania remetylacji po hipometylacji indukowanej lekami sugerują przypuszczalną rolę DNMT1 w metylacji de novo subtelomerowego powtórzenia, D4Z4, które jest utracone w komórkach pozbawionych pełnej długości DNMT1. Nasze dane sugerują, że DNMT1 może być niezbędna do utrzymania metylacji DNA, proliferacji i przeżycia komórek nowotworowych. komórek nowotworowych. --- Przeprogramowanie wzorców metylacji DNA podczas rozwoju preimplantacyjnego ssaków rozwój obejmuje jednoczesne utrzymanie metylacji w różnicowo metylowanych domenach (DMD) genów wdrukowanych i znaczną redukcję globalnej metylacji genomowej (non-DMD) metylacji genomowej. W rozwijającym się zarodku ssaków, jeden allel DMD jest niemetylowany, a przeciwny allel rodzicielski jest metylowany, ponieważ odziedziczył tę metylację od rodzicielskiej gamety. Utrzymanie DMD jest ważne dla ekspresji genów wdrukowanych monoallelicznych i prawidłowego rozwoju zarodka. zarodka. Ponieważ metylotransferaza cytozyny DNMT1 reguluje utrzymanie metylacji u ssaków, rearanżacje metylacji nie-DMD, ale nie DMD w przedimplantacyjnych zarodkach zarodkach przedimplantacyjnych sugerują, że zależny od DNMT1 przedimplantacyjny mechanizm utrzymania jest ukierunkowany na sekwencje DMD. Zbadaliśmy tę możliwość przy użyciu zmodyfikowanej mysiej linii komórek ES do badań przesiewowych pod kątem zmutowanych białek DNMT1 białek, które chronią przed utratą DMD i/lub globalną (nie-DMD) metylacji przy braku endogennej metylotransferazy DNMT1 typu dzikiego. Zidentyfikowaliśmy mutanty DNMT1, które były wadliwe w utrzymaniu metylacji DMD i/lub metylacji innej niż DMD. Wśród nich jeden mutant utrzymywał metylację non-DMD metylację, ale nie odciśniętą metylację DMD, a inny mutant utrzymywał tylko metylację metylację DMD. Zmutowane aminokwasy tych mutantów znajdują się w specyficznym dla ssaków, nieuporządkowanym regionie w pobliżu końca aminowego DNMT1. Te odkrycia sugerują, że DNMT1 uczestniczy w przeprogramowaniu epigenetycznym poprzez jego zdolność do rozróżniania różnych kategorii metylowanych sekwencji. --- DNMT1, główna utrzymująca metylotransferaza DNA u zwierząt, pomaga regulować ekspresji genów, imprintingu genomu i inaktywacji chromosomu X. Przedstawiamy strukturę krystaliczną wydajnego kowalencyjnego mysiego kompleksu DNMT1(731-1602)-DNA zawierający centralne hemimetylowane miejsce CpG. Grupa metylowa metylocytozyny jest umieszczona w płytkiej hydrofobowej wklęsłej powierzchni, podczas gdy cytozyna na nici docelowej jest zapętlona i kowalencyjnie zakotwiczona w kieszeni katalitycznej. kieszeni katalitycznej. DNA jest zniekształcony na hemimetylowanym etapie CpG, z łańcuchami bocznymi z pętli katalitycznych i rozpoznających wprowadzanych przez oba rowki w celu wypełnienia wnęki typu wnękę typu interkalacyjnego związaną z podwójną zasadą na nici partnera. nici. Dane strukturalne i biochemiczne pokazują, w jaki sposób połączenie aktywnych i autoinhibicyjnych mechanizmów i mechanizmów autohamujących zapewnia wysoką wierność metylacji DNA, w której pośredniczy DNMT1. utrzymanie metylacji DNA. --- Enzymatyczna kontrola ustawiania i utrzymywania symetrycznych i niesymetrycznych wzorów metylacji i niesymetrycznych wzorców metylacji DNA w określonym kontekście genomu nie jest dobrze poznana. Tutaj opisujemy kompleksową analizę wzorów metylacji DNA wzorców metylacji DNA wygenerowanych przez sekwencjonowanie w wysokiej rozdzielczości amplikonów hairpin-bisulfite wybranych pojedynczych kopii genów i elementów repetytywnych (LINE1, B1, IAP-LTR-retrotranspozony i główne satelity). Analiza jednoznacznie identyfikuje znaczną ilość regionalnego niekompletnego utrzymania metylacji, tj. hemimetylowanych pozycji CpG, z różnymi stopniami w różnych typach komórek. Co więcej, metylacja cytozyny nie-CpG jest ograniczona do ESC i wyłącznie katalizowana wyłącznie przez Dnmt3a i Dnmt3b. Ta zależna od pozycji sekwencji, typu komórki i regionu zależna od regionu metylacja nie-CpG jest silnie związana z sąsiednią metylacją CpG i wymaga obecności Dnmt3L. Wygenerowanie kompleksowego zestawu danych 146 000 diad CpG wykorzystano do zastosowania i opracowania oszacowanych parametrów ukrytych modeli Markowa (HMM) w celu obliczenia względnego udziału metylotransferaz DNA (Dnmts) w metylacji de novo i konserwacji DNA metylacji. Modelowanie porównawcze obejmowało ESC typu dzikiego i zmutowane ESC z niedoborem odpowiednio Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b lub Dnmt3a/3b. Analiza HMM identyfikuje znaczną aktywność metylacji de novo dla Dnmt1 w pewnych powtarzalnych elementach i sekwencjach jednokopijnych. Dnmt3a i Dnmt3b przyczyniają się do funkcji de novo. Jednak oba enzymy są również niezbędne do utrzymania symetrycznej metylacji CpG w różnych sekwencjach powtarzalnych i jednokopijnych w ESC. sekwencjach w ESC. --- Metylacja w pozycji 5 cytozyny DNA w genomach kręgowców jest przez połączone katalityczne działanie trzech metylotransferaz DNA (DNMT), enzymów de novo DNMT3A i DNMT3B oraz enzymu konserwującego DNMT1. Chociaż zasugerowano kilka szlaków metabolicznych dla demetylacji DNA kręgowców, to czy istnieją aktywne demetylazy DNA pozostawało nieuchwytne. Co zaskakujące, odkryliśmy, że DNMT ssaków i prawdopodobnie ogólnie kręgowców DNMT mogą również działać jako aktywne demetylazy DNA zależne od jonów Ca(2+) i stanu redoks. demetylazy DNA. Odkrycie to sugeruje nowe kierunki ponownego badania struktur i funkcji tych DNMT, w szczególności ich roli w procesach biologicznych zależnych od jonów Ca(2+) w procesach biologicznych zależnych od jonów Ca(2+), w tym w ogólnogenomowej/lokalnej demetylacji DNA demetylacji podczas wczesnej embriogenezy, różnicowania komórek, ekspresji genów regulowanej aktywnością neuronów ekspresji genów regulowanej aktywnością neuronów i kancerogenezie. --- Hipermetylacja promotora DNA genów supresorowych nowotworów jest cechą charakterystyczną raka. Zmiana ta jest w dużej mierze zależna od działania metylotransferaz DNA de novo metylotransferaz DNA (DNMT) na wczesnym etapie progresji nowotworu, co potwierdza onkogenną rolę tych enzymów. onkogenną rolę tych enzymów. Jednak ostatnie badania zidentyfikowały kilka inaktywujących mutacji DNMT de novo w różnych typach nowotworów. Ponadto Ponadto wykazano, że utrata aktywności metylacji DNA de novo w zaawansowanych stadiach nowotworu prowadzi do zaawansowanych stadiach nowotworu prowadzi do zależnej od demetylacji DNA promotora ekspresji specyficznych onkogenów. Te nowe dane potwierdzają pogląd, że DNMT de novo DNMT odgrywają również ważną rolę w utrzymaniu metylacji DNA i sugerują, że oprócz działania jako onkogeny, zachowują się one również jako supresory nowotworów. supresory nowotworów. Ta potencjalna podwójna rola może mieć implikacje kliniczne, ponieważ DNMT są obecnie uważane za bona fide cele w terapii nowotworów. --- Zaproponowano, że postreplikacyjne utrzymanie wzorców metylacji genomu zależy w dużej mierze od wiązania metylotransferazy DNA 1 (Dnmt1) do PCNA, podstawowego składnika składnikiem maszynerii replikacyjnej. Zbadaliśmy, w jaki sposób powolna i nieciągła metylacja DNA może być mechanicznie powiązana z szybką i procesywną replikacją DNA. procesywną replikacją DNA. Wykorzystując fotowybielanie i ilościowe obrazowanie żywych komórek wykazaliśmy, że wiązanie Dnmt1 do PCNA jest wysoce dynamiczne. Aktywność pomiary mutanta z niedoborem wiązania PCNA z testem pułapkowania enzymu w żywych komórkach żywych komórkach wykazały, że ta interakcja odpowiada za 2-krotny wzrost wydajności metylacji. Ekspresja tego mutanta w mysich zarodkowych komórkach macierzystych dnmt1-/- (ES) przywracała metylację wysp CpG. Tak więc powiązanie Dnmt1 z replikacją zwiększa wydajność metylacji, ale nie jest ściśle wymagane do utrzymania globalnej metylacji. Przejściowy charakter tej interakcji dostosowuje się do różnych kinetyk replikacji DNA i metylacji, jednocześnie przyczyniając się do wiernej propagacji informacji epigenetycznej. informacji. --- Metylacja DNA odgrywa znaczącą rolę w ekspresji kodu genetycznego i wpływa na wczesny wzrost i rozwój poprzez wpływ na ekspresję genów. ekspresję genów. Metylotransferaza DNA 1 (Dnmt1) jest enzymem odpowiedzialnym za utrzymanie śladów metylacji poprzez podział komórki. Jednakże, metylotransferazy de novo metylotransferazy, Dnmt3a i Dnmt3b, mogą również przyczyniać się do utrzymania wzoru metylacji. Manipulacja tymi enzymami, zwłaszcza Dnmt1, umożliwia zmianę poziomu metylacji DNA. Manipulacja wzorem metylacji DNA DNA pozwoli na lepsze zrozumienie różnych procesów molekularnych związanych z chromosomem. różnych procesów molekularnych związanych ze strukturą chromatyny i ekspresją genów. ekspresją genów. Różne podejścia do sztucznej manipulacji ekspresją Dnmt1 w komórkach somatycznych Dnmt1 w komórkach somatycznych obejmują dodanie 5-azacytydyny, hodowlę komórek przez dłuższy okres czasu oraz wykorzystanie technologii małych interferujących RNA technologie. --- Metylacja DNA reguluje ekspresję genów poprzez złożoną sieć interakcji białko-białko i białko-DNA w chromatynie. Utrzymanie metylazy, DNMT1 (metylotransferaza DNA 1), jest ważnym enzymem w tym procesie. który jest powiązany z replikacją DNA i napędza dziedziczną naturę modyfikacji epigenetycznych. modyfikacji epigenetycznych. Mechanistyczne szczegóły, które wyjaśniają, w jaki sposób katalityczne działanie DNMT1 jest kierowane i regulowane w chromatynie są ważne w naszym ogólnym zrozumieniu kontroli genów. W tej pracy pokazujemy, że DNMT1 jest modyfikowany przez SUMOylację i zmapowaliśmy te miejsca SUMOylacji przez zdefiniowane mutacje. SUMOylowana DNMT1 jest katalitycznie aktywna na genomowym DNA in vivo i stwierdzamy, że SUMOylacja znacząco zwiększa aktywność metylazy DNMT1 zarówno in vitro jak i w chromatynie. Dane te sugerują, że SUMOylacja moduluje endogenną aktywność aktywność ważnego szlaku utrzymania epigenetycznego w komórkach somatycznych. --- Metylacja DNA występuje głównie w kontekście dinukleotydów CpG i jest jest niezbędna dla rozwoju embrionalnego i represji genów. Ogólnie przyjmuje się, że że metylotransferazy DNA pełnią specyficzne i nienakładające się funkcje, Dnmt3a i Dnmt3b. funkcje, przy czym Dnmt3a i Dnmt3b są odpowiedzialne za ustanowienie metylacji w czasie implantacji, a Dnmt1 zapewnia, że metylacja jest wiernie kopiowana do komórek potomnych. jest wiernie kopiowana do komórek potomnych poprzez tak zwaną "metylacja podtrzymująca". Ten wieloletni pogląd został zakwestionowany przez lat z obserwacją, że sam Dnmt1 jest niezdolny do doskonałego utrzymania metylacji. Pojawia się nowy model, który uwzględnia wkład enzymów enzymów de novo Dnmt3a i Dnmt3b w utrzymaniu metylacji DNA. Niedawno wykazaliśmy, że niektóre geny linii zarodkowej są specyficznymi celami Dnmt3b, i że Dnmt3b pozostaje związany z ich regionami promotorowymi w komórkach somatycznych poprzez interakcję z represorem transkrypcji E2F6. Kuszące jest rozważenie Dnmt3b w metylacji genów linii zarodkowej w komórkach somatycznych. komórkach somatycznych. Proponujemy tutaj obserwacje na poparcie hipotezy, że utrzymanie metylacji i późniejsze wyciszenie utrzymanie metylacji i późniejsze wyciszenie garstki genów linii zarodkowej wymaga Dnmt3b, ale nie Dnmt1. Oprócz sugerowania nowej roli dla Dnmt3b w ochronie komórek somatycznych przed ryzykowną ekspresją programu linii zarodkowej programu linii zarodkowej, obserwacje te są szczególnie interesujące w dziedzinie kancerogenezy. dziedzinie kancerogenezy, biorąc pod uwagę, że ekspresja katalitycznie nieaktywnych izo Dnmt3b i nieprawidłowa ekspresja genów linii zarodkowej są powszechnie obserwowane w komórkach nowotworowych. w komórkach nowotworowych. --- Metylacja DNA jest szeroko rozpowszechniona u większości gatunków, od bakterii po ssaki, i jest i ma kluczowe znaczenie dla imprintingu genomowego, ekspresji genów i embriogenezy. METYLACJA DNA zachodzi poprzez dwie główne klasy reakcji enzymatycznych: metylację typu konserwującego katalizowaną przez (cytozyno-5-)-metylotransferazę DNA (DNMT) 1, oraz metylację de novo katalizowaną przez DNMT 3 alfa (DNMT3A) i -beta (DNMT3B). Wzór ekspresji i regulacja genów DNMT w pierwotnych komórkach zarodkowych (PGC) i komórkach linii zarodkowej nie został wystarczająco ustalony u ptaków. Dlatego zastosowaliśmy bioinformatykę, RT-PCR, PCR w czasie rzeczywistym i analizy hybrydyzacji in situ analizy hybrydyzacji w celu zbadania strukturalnej konserwacji i zachowanych wzorce ekspresji genów z rodziny DNMT kurczaka. Następnie zbadaliśmy regulację genu kandydującego metylotransferazy DNA de novo, cDNMT3B przez kotransfekcję cDNMT3B 3'UTR- i cDNMT3B 3'UTR-specyficznych miRNA poprzez podwójny reporter fluorescencyjny podwójny test reporterowy fluorescencji. Wszyscy członkowie rodziny cDNMT byli różnicowo wykrywani podczas wczesnego rozwoju embrionalnego. Co ciekawe, ekspresja cDNMT3B była wysoce wykryta we wczesnych zarodkach i PGC. Podczas rozwoju linii zarodkowej i dojrzewanie płciowe, ekspresja cDNMT3B została przywrócona w żeńskich zarodkach sposób specyficzny dla żeńskich komórek zarodkowych. W teście podwójnej fluorescencji reporterowej ekspresja cDNMT3B była znacząco obniżana przez cztery miRNA: gga-miR-15c (25,82%), gga-miR-29b (30,01%), gga-miR-383 (30,0%) i gga-miR-222 (31,28%). Nasze dane podkreślają strukturalną konserwację i zachowane wzorce ekspresji DNMT kurcząt. MiRNA badane w tym badaniu mogą indukować regulację w dół ekspresji genów w PGC i komórkach zarodkowych kurczaka.
Który enzym bierze udział w utrzymaniu (cytozyno-5-)-metylacji DNA?
Ssacza metylotransferaza DNA (cytozyna-5) 1, DNMT1 jest głównym enzymem odpowiedzialnym za utrzymanie wzorów metylacji DNA na nowo zsyntetyzowanej nici po replikacji DNA. DNMT1 preferuje hemimetylowane DNA i podczas replikacji DNA metyluje hemimetylowane miejsca CpG poprzez kopiowanie wzorów metylacji z rodzicielskiej nici DNA do nowo zsyntetyzowanej nici potomnej. Odpowiednikiem DNMT1 w roślinach jest MET1.