Stwierdziliśmy, że hydroksylacja zachodzi w pozycji C-2 adeniny przez rodnik tlenowy (Fe2+-EDTA) dA, dATP oraz jedno- i dwuniciowego DNA. Ta oksydacyjnie uszkodzona zasada, 2-hydroksyadenina, była produkowana 3-6-krotnie i 40-krotnie mniej niż 8-hydroksyguanina, gdy monomery i polinukleotydy, i polinukleotydów. Aby ustalić, czy uszkodzony nukleotyd, 2-hydroksydeoksyadenozynotrifosforan (2-OH-dATP), jest włączany do rosnącego DNA i ujawnić rodzaje nukleotydów, naprzeciwko których 2-OH-dATP jest włączona, polimeraza DNA grasicy cielęcej alfa i fragment Klenowa Escherichia coli polimerazę DNA I zastosowano w syntezie DAN in vitro w obecności obecności 2-OH-dATP. Polimeraza DNA alfa włączała przeciwne nukleotydy T i C w matrycy DNA. Z drugiej strony, w eksperymencie z użyciem fragmentu Klenowa, przyłączenie 2-OH-dATP obserwowano tylko naprzeciwko T. Badania kinetyczne w stanie ustalonym wykazały, że przyłączenie 2-OH-dATP przez polimerazę DNA polimerazę alfa naprzeciwko T było faworyzowane w stosunku do tego naprzeciwko C tylko o współczynnik 4.5. Wyniki te wskazują, że 2-OH-dATP, oksydacyjnie uszkodzony nukleotyd, jest substratem dla polimeraz DNA i jest nieprawidłowo włączany przez replikacyjną polimerazę DNA. replikacyjną polimerazę DNA. --- TŁO: Niedawno odkryliśmy, że białko Escherichia coli Orf135, enzym typu MutT, hydrolizuje 2-hydroksy-dATP (2-OH-dATP) i mniej wydajnie, 8-hydroksy-dGTP. WYNIKI: W tym badaniu zbadaliśmy skutki braku genu orf135 genu. Częstotliwość spontanicznych i indukowanych H2O2 mutacji była od dwóch do trzykrotnie wyższe w szczepie orf135 niż w szczepie typu dzikiego. Te mutacje obejmują różne mutacje obejmujące konwersję G:C-->T:A, ten sam typ mutacji wywołany przez typ mutacji wywołany przez 2-OH-dATP. Nadekspresja białka Orf135 tłumiła mutacje nawet w szczepie typu dzikiego, jak również w szczepie orf135- . WNIOSKI: Fenotyp mutatora bakterii pozbawionych białka Orf135 sugeruje, że białko to jest zaangażowane w tłumienie mutacji indukowanych przez utlenione deoksynukleotydy in vivo i że różne enzymy typu MutT przyczyniają się do sanityzacji puli nukleotydów. --- Efekty współistnienia wielu rodzajów utlenionych dezoksyrybonukleotydów zostały zbadano przy użyciu zależnego od pochodzenia SV40 systemu replikacji in vitro z ekstraktem HeLa HeLa. Utlenione dGTP i dATP, 5'-trifosforan 8-hydroksy-2'-deoksyguanozyny (8-OH-dGTP) i 2-hydroksy-2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforan (2-OH-dATP), zostały użyte w tym badaniu. użyte w tym badaniu. Częstotliwość mutacji synergistycznie wzrosła, gdy dwa utlenione deoksyrybonukleotydy były razem w reakcji. 2-OH-dATP zwiększał mutagenność 8-OH-dGTP, ponieważ indukowane mutacje były transwersjami A.T --> C.G. Udział wysoce podatnej na błędy polimerazy DNA eta był mało prawdopodobny, ponieważ podobne wyniki zaobserwowano w przypadku ekstraktu komórkowego XP-V. The możliwy udział 2-hydroksyadeniny w nici komplementarnej (matrycowej) został wykluczony na podstawie eksperymentów z użyciem plazmidów zawierających 2-hydroksyadeninę jako szablony w reakcjach z 8-OH-dGTP. 2-OH-dATP hamował hydrolizę 8-OH-dGTP, co sugeruje, że hamowanie białka MTH1 odgrywało główną rolę we wzmocnieniu. Wyniki te podkreślają znaczenie specyficznej hydrolizy 8-OH-dGTP dla tłumienia jego indukowanej mutacji. --- Nieprawidłowe utlenianie jest właściwością wielu komórek nowotworowych. Utlenianie prekursorów DNA prekursorów DNA, tj. trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP), a także DNA jest główną przyczyną niestabilności genomu. DNA jest główną przyczyną niestabilności genomu. Tutaj donosimy, że ludzka polimeraza DNA eta (h Poleta) włącza utlenione dNTP, tj. 2-hydroksy-2'-deoksyadenozynę 5'-trifosforan 2-hydroksy-2'-deoksyadenozyny (2-OH-dATP) i 5'-trifosforan 8-hydroksy-2'-deoksyguanozyny (8-OH-dGTP), do DNA w błędny i wydajny sposób, indukując w ten sposób różne rodzaje mutacji podczas syntezy DNA in vitro. Kiedy 2-OH-dATP był obecny w stężeniu równym stężeniu czterech normalnych dNTPs w mieszaninie reakcyjnej, synteza DNA przez h Poleta zwiększała częstotliwość  gdzie obecne były tylko normalne dNTP. Gdy 8-OH-dGTP był obecny w stężeniu równomolowym stężeniu do normalnych dNTP, zwiększyło to częstotliwość A do C 17-krotnie wyższą niż w przypadku kontroli. Zwiększył również częstotliwość konwersji C do A około dwukrotnie. Wyniki te sugerują, że h Poleta włącza 2-OH-dATP naprzeciwko szablonu G i włącza 8-OH-dGTP naprzeciwko szablonu szablonu A i nieznacznie naprzeciwko szablonu C podczas syntezy DNA. Oprócz podstawień zasad podstawień, h Poleta zwiększała częstotliwość jednopodstawowych przesunięć ramki i delecji o wielkości ponad 100 par zasad, gdy 8-OH-dGTP był obecny w mieszaninie reakcyjnej w mieszaninie reakcyjnej. Ponieważ h Poleta jest obecna w ogniskach replikacji nawet bez egzogennego uszkodzenia DNA, sugerujemy, że h Poleta może być zaangażowana w indukcję różnych typów mutacji poprzez błędne i wydajne włączanie utlenionych dNTP do DNA w ludzkich komórkach. --- Zmieniony metabolizm oksydacyjny jest właściwością wielu komórek nowotworowych. Utlenianie prekursorów DNA prekursorów DNA, tj. puli dNTP, a także DNA jest głównym źródłem mutagenezy i kancerogenezy. kancerogenezy. Tutaj opisujemy niezwykłą naturę ludzkiej polimerazy DNA eta, która włącza utlenione dNTP do powstającej nici DNA w wydajny i błędny sposób. i błędny sposób. Polimeraza prawie wyłącznie włączała 8-hydroksy-dGTP (8-OH-dGTP) naprzeciwko matrycowej adeniny (A) z 60% wydajnością normalnej inkorporacji dTTP i włączała 2-hydroksy-dATP (2-OH-dATP) naprzeciwko szablonu tyminy (T), guaniny (G) lub cytozyny (C) ze znaczną szybkością. The syntetyczne startery mające 8-hydroksy-G sparowane z matrycą A lub 2-hydroksy-A sparowane z matrycą T, G lub C na końcach były skutecznie przedłużane. Natomiast W przeciwieństwie do tego, ludzka polimeraza DNA iota włączała 8-OH-dGTP naprzeciwko matrycy A ze znacznie niższą wydajnością i nie włączała 2-OH-dATP naprzeciwko żadnej z zasad matrycy. zasad matrycy. Nie przedłużyła również starterów z utlenionymi zasadami na końcach. terminini. Proponujemy, aby ludzka polimeraza DNA eta mogła uczestniczyć w mutagenezie mutagenezie oksydacyjnej poprzez wydajne i błędne przyłączanie utlenionych dNTP podczas syntezy DNA. --- Białko MutT Escherichia coli hydrolizuje 8-hydroksy-DGTP (8-OH-dGTP) in in vitro, a niedobory genu mutT powodują zwiększone spontaniczne mutacje A:T-->C:G mutacji. Nie istnieją jednak bezpośrednie dowody na zwiększoną mutagenność 8-OH-dGTP w komórkach mutT. W tym badaniu 8-OH-dGTP wprowadzono do komórek typu dzikiego i mutT E. coli i monitorowano mutacje genu chromosomalnego. 8-OH-dGTP indukował mutacje genu rpoB, stopień indukcji mutacji w szczepie mutT. w szczepie mutT był około 6-krotnie wyższy niż w szczepie typu dzikiego. szczepu typu dzikiego. Z drugiej strony, 2-hydroksy-DATP, który nie jest substratem białka białka MutT, zwiększał mutację w podobnym stopniu w obu szczepach. Wyniki te stanowią pierwszy dowód na to, że białko MutT hamuje mutację przez 8-OH-dGP. mutację przez 8-OH-dGTP in vivo. --- 2-podstawiony analog nukleotydu purynowego, 2-hydroksy-2'-deoksyadenozyna 5'-trifosforan (2-OH-dATP) został dodany do mieszaniny PCR w celu zbadania jego potencjału mutagennego. potencjał mutagenny. 2-OH-dATP zwiększył całkowitą częstotliwość mutacji.  w tym mutacje A:T-->G:C, A:T-->C:G i G:C-->T:A. W przeciwieństwie do tego, inne 2-podstawione analogi nukleotydów purynowych, 2-aminopuryno-2'-deoksyrybozyd 5'-trifosforan i 2-amino-2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforan nie miały wpływu na całkowitą częstość mutacji. całkowitą częstotliwość mutacji. Wyniki te sugerują, że 2-OH-dATP jest użyteczny w losowej mutagenezy PCR do ewolucji in vitro kwasów nukleinowych i białek, oraz do analizy reszt w tych biomolekułach. --- Mutagenność utlenionej formy dATP, 2-hydroksydeoksyadenozyno 5'-trifosforanu (2-OH-dATP) zbadano przy użyciu systemu replikacji in vitro zależnego od pochodzenia SV40 z ekstraktem HeLa. w systemie replikacji in vitro z ekstraktem HeLa. 2-OH-dATP indukował mutacje w sposób mutacje w sposób zależny od dawki i wywoływał mutacje substytucyjne i delecyjne. Spośród substytucji obserwowano głównie przejście G.C-->A.T, w tym mutację tandemową (CC-->TT). głównie obserwowane. Wynik ten zgadza się z naszymi wcześniejszymi obserwacjami, że ssaki polimeraza DNA alfa nieprawidłowo inkorporuje utleniony nukleotyd przeciwny do C, ale jest  Escherichia coli. Ten typ mutacji był również wywoływany, ale w mniejszym stopniu. stopniu. Co ciekawe, mutagenność 2-OH-dATP była zwiększona w obecności obecności 5'-difosforanu 2-hydroksydeoksyadenozyny, inhibitora białka MTH1 sugerując, że białko to funkcjonuje w hydrolizie 2-OH-dATP w mieszaninie reakcyjnej replikacji i prawdopodobnie w żywych komórkach. Wyniki te wskazują, że 2-OH-dATP jest mutagenny i że jego mutagenność jest tłumiona przez białko białko MTH1 w komórkach ssaków. --- Specyficzność insercji utlenionego analogu dATP, 2-hydroksydeoksyadenozyno-5'-trifosforanu (2-OH-dATP), określono przy użyciu podjednostki alfa (katalitycznej) polimerazy DNA III Escherichia coli i egzonukleazy Kl polimerazy DNA III Escherichia coli i fragmentu Klenowa polimerazy DNA I z niedoborem egzonukleazy. poprzedniej obserwacji, że polimeraza DNA alfa ssaków włączała utleniony nukleotyd utleniony nukleotyd naprzeciwko T i C, te dwie polimerazy DNA E. coli włączały 2-OH-dATP naprzeciwko T i G na matrycy DNA. Badania kinetyczne badania kinetyczne wykazały, że podjednostka alfa włączała 2-OH-dATP 10 razy częściej częściej naprzeciwko T niż naprzeciwko G. Z drugiej strony, inkorporacja 2-OH-dATP naprzeciwko T przez fragment Klenowa z niedoborem egzonukleazy było 2 rzędy wielkości bardziej wydajne niż rzędy wielkości bardziej wydajne niż naprzeciwko G. Wyniki te wskazują że specyficzność błędnej insercji 2-OH-dATP różni się między polimerazami DNA typu replikacyjnego i naprawczego. polimerazami DNA typu naprawczego i dostarczają biochemicznych podstaw dla mutacji indukowanych przez 2-OH-dATP w E. coli.
Jakie rodzaje mutacji DNA są indukowane przez 2-hydroksy-dATP (2-OH-dATP)?
2-hydroksy-dATP wywołuje głównie przejścia G:C --> A:T oraz, w mniejszym stopniu, przejścia G:C --> T:A Indukcja przejść G:C --> T:A przez 2-OH-dATP wskazuje na tworzenie par G*2-OH-dATP. 2-OH-dATP indukuje również mutacje tandemowe (CC --> TT). 