Uważa się, że neurony noradrenergiczne pontospinalne stanowią część zstępującego endogennego układu przeciwbólowego, który wywiera hamujący wpływ na rdzeń nocycepcję. Wykorzystując celowanie optogenetyczne, przetestowaliśmy hipotezę, że pobudzenie locus ceruleus (LC) jest antynocyceptywne. Transdukowaliśmy szczurze neurony LC przez bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego wyrażającego channelrhodopsin2 pod kontrolą promotora PRS. Późniejsza optoaktywacja LC wywołała powtarzalne, silne, antynocyceptywne (+4,7°C ± 1,0, p < 0,0001) lub pronociceptive (-4.4 ° C ± 0.7, p < 0.0001) zmiany w wycofaniu termicznym tylnej łapy progi. Post hoc anatomiczna charakterystyka rozmieszczenia transdukowane somaty odniesione do pozycji światłowodu i późniejsza dalsza analiza funkcjonalna wykazała, że działania antynocyceptywne były wywołane z odrębnej, brzusznej subpopulacji neuronów LC. Dlatego LC jest zdolny do wywierania silnego, dyskretnego, dwukierunkowego wpływu na termiczne nocycepcja, która jest wytwarzana przez określone subpopulacje neuronów noradrenergicznych neuronów noradrenergicznych. Odzwierciedla to leżącą u podstaw funkcjonalną heterogeniczność wpływu LC na przetwarzanie informacji nocyceptywnych. --- Optogenetyka to nowa technologia służąca do manipulowania i kontrolowania tkanek pobudliwych, takich jak mózg i serce. Ponieważ technika ta wymaga genetycznej modyfikacji komórek w celu nadania im wrażliwości na światło. zastosowań kardiologicznych, opisujemy tutaj proces, w którym miocyty komorowe noworodków szczura są wirusowo infekowane in vitro za pomocą channelrhodopsin-2 (ChR2). (ChR2). Opisujemy również szczegółowo procedurę ilościowego określania optymalnej dawki wirusa, w tym instrukcje dotyczące wzorcowej ekspresji genów w wielokomórkowych preparatach kardiomiocytów (syncytia serca) w celu symulacji potencjalnych rozkładów transgenów in vivo. Wreszcie, zajmujemy się aktywacją optyczną komórek transdukowanych ChR2 i środków do pomiaru ich funkcjonalnej odpowiedzi na światło. światło. --- Nawrót do nieprzystosowawczych nawyków żywieniowych podczas diety jest często wywoływany przez stres. Niedawno zidentyfikowaliśmy rolę neuronów grzbietowej przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) w wywołanym stresem przywróceniu poszukiwania smacznego jedzenia u samców szczurów. Nie wiadomo, czy nie wiadomo, czy endogenna aktywność neuronalna w grzbietowej mPFC napędza indukowane stresem przywrócenie u samic szczurów. Tutaj zastosowaliśmy podejście optogenetyczne, w którym samice szczurów otrzymały obustronne grzbietowe mikroiniekcje mPFC konstruktów wirusowych kodujące światłoczułe eNpHR3.0-eYFP lub kontrolne białko eYFP i wewnątrzczaszkowe implanty światłowodowe. implanty światłowodowe. Szczury były ograniczone do żywności i przeszkolone do naciskania dźwigni dla smaczne granulki żywności. Następnie granulki zostały usunięte, a naciśnięcie dźwigni został wygaszony; następnie wpływ dwustronnego dostarczania światła grzbietowego mPFC na przywrócenie poszukiwania żywności oceniano po wstrzyknięciu farmakologiczny stresor johimbina (antagonista α-2 andrenoceptora) lub pellet priming, manipulacja znana z prowokowania poszukiwania jedzenia u głodnych szczurów. Grzbietowe dostarczanie światła mPFC osłabiło indukowane johimbiną przywrócenie poszukiwania pożywienia u szczurów, którym wstrzyknięto eNpHR3.0, ale nie eYFP. Ta optyczna manipulacja miała brak wpływu na przywrócenie wywołane granulkami lub trwające wzmocnienie żywności reagowanie. Dostarczanie światła do grzbietowej mPFC osłabiło immunoreaktywność Fos indukowaną johimbiną i zakłócało aktywność neuronalną podczas in vivo rejestracji elektrofizjologicznej u przebudzonych szczurów. Stymulacja optyczna powodowała znaczące prądy zewnętrzne i blokowała elektrycznie wywołane potencjały czynnościowe w półkulach mPFC, którym wstrzyknięto eNpHR3.0, ale nie eYFP. Dostarczanie światła nie spowodowało znaczącej odpowiedzi zapalnej w mPFC. Wyniki te wskazują, że wewnątrzczaszkowe dostarczanie światła u szczurów eNpHR3.0 zakłóca endogenne aktywność neuronalna grzbietowej mPFC, która odgrywa rolę w wywołanym stresem nawrocie do jedzenia poszukiwanie u samic szczurów. --- Optogenetyka to technika kontrolowania subpopulacji neuronów w nienaruszonym mózgu za pomocą światła. mózgu za pomocą światła. Technika ta może potencjalnie usprawnić podstawowe badań nad neuronauką systemową i informować o mechanizmach i leczeniu mechanizmów i leczenia urazów i chorób mózgu. Przed rozpoczęciem badań na naczelnych na dużą skalę, metoda metoda musi być dalej scharakteryzowana i dostosowana do użytku w mózgu naczelnych. mózgu naczelnych. Oceniliśmy bezpieczeństwo i skuteczność dwóch systemów wektorów wirusowych (lentiwirus i wirus adenowirusowy), dwóch ludzkich promotorów (ludzkiej synapsyny (hSyn) i ludzki tymocyt-1 (hThy-1)) oraz trzy pobudzające i hamujące zoptymalizowane pod względem kodonów opsyny ssaków (channelrhodopsin-2, ulepszona halorhodopsyna Natronomonas pharaonis halorhodopsin i opsyna o funkcji stopniowej), które scharakteryzowaliśmy elektrofizjologicznie, histologicznie i behawioralnie u małp rhesus (Macaca mulatta). Wprowadziliśmy również nowe urządzenie do pomiaru fluorescencji in vivo fluorescencji w czasie, umożliwiając minimalnie inwazyjną ocenę ekspresji konstruktu w nienaruszonym mózgu. w nienaruszonym mózgu. Przedstawiamy zestaw narzędzi optogenetycznych zaprojektowanych do eksperymentów optogenetycznych w mózgu naczelnych. --- Informacje o autorze: (1)Allen Institute for Brain Science, 551 N 34(th) Street, Seattle, WA 98103, USA. (2)UCL Institute of Ophthalmology, University College London, 11-43 Bath Street, London, EC1V 9EL, UK. (3) MIT Media Lab i McGovern Institute, Massachusetts Institute of Technology, 20 Ames Street, Cambridge, MA 02139, USA. (4)Brain Research Institute, University of Zurich, Winterthurerstrasse 190, CH-8057 Zurych, Szwajcaria. (5)Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako-city, Saitama 351-0198, Japonia. (6) Instytut Badawczy Lunenfeld-Tanenbaum, Szpital Mount Sinai, 600 University Avenue, Toronto, ON M5000, USA. Avenue, Toronto, ON M5G 1X5, Kanada. (7)UCL Institute of Ophthalmology, University College London, 11-43 Bath Street, London, EC1V 9EL, Wielka Brytania; Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako-city, Saitama 351-0198, Japonia. (8)Department of Physiology, Brain Health Research Centre, University of Otago, PO Box 913, Dunedin 9054, Nowa Zelandia. (9)The Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 160 DuCane Road, Londyn, W12 0NN, Wielka Brytania. (10)Allen Institute for Brain Science, 551 N 34(th) Street, Seattle, WA 98103, USA. Adres elektroniczny: hongkuiz@alleninstitute.org. --- Dokonujemy krótkiego przeglądu aktualnej literatury, w której optogenetyka została wykorzystana do badania różnych aspektów fizjologii astrocytów in vitro i in vivo. Obejmuje to obejmuje zarówno genetycznie zmodyfikowane czujniki Ca(2+), jak i białka efektorowe, takie jak takie jak channelrhodopsin. Pokazujemy, w jaki sposób zdolność do celowania w astrocyty za pomocą wektorów wirusowych specyficznych dla komórki wektorów wirusowych do ekspresji konstruktów optogenetycznych pomogła odkryć niektóre wcześniej nieoczekiwane role tych niepozornych komórek. --- Optogenetyka, czyli wykorzystanie światła do stymulowania lub hamowania obwodów neuronowych poprzez wirusową transdukcję kanałów białkowych kanałów białkowych, pojawiła się jako możliwa metoda leczenia padaczki. padaczki. Poprzez wprowadzenie wektorów wirusowych niosących pochodzące z alg kanały kationowe lub anionowe, znane jako opsyny znane jako opsyny, neurony, które inicjują lub rozprzestrzeniają napady mogą zostać wyciszone. Do tej pory badania z wykorzystaniem tej techniki przeprowadzono na modelach zwierzęcych. modelach zwierzęcych, a obecne wysiłki zmierzają w kierunku bardziej wyrafinowanych modeli naczelnych. modele naczelnych. W niniejszym artykule autorzy przedstawiają krótki przegląd optogenetyki i przegląd ostatnich badań nad optogenetyczną modyfikacją obwodów modyfikacji obwodów zaangażowanych w napady drgawkowe. Dalszy rozwój w tej dziedzinie z naciskiem na to, jak optogenetyka może wpłynąć na przyszłe interwencje neurochirurgiczne. interwencje neurochirurgiczne. --- Terapia genowa w chorobach człowieka szybko się rozwinęła w ostatnich latach dzięki bezpieczniejszych i skuteczniejszych wektorów wirusowych i stanowi nowatorskie podejście do leczenia padaczki. podejście do leczenia padaczki. Badania na modelach zwierzęcych wykazały, że nadekspresja peptydów hamujących może modyfikować próg napadu próg drgawkowy, zapobiegać rozwojowi padaczki i modyfikować padaczkę już istniejącą. Niedawno przeprowadzono szereg badań z wykorzystaniem optogenetyki, w których kanały aktywowane światłem wyrażone w neuronach mogą przejściowo zmieniać pobudliwość neuronów po pobudliwość neuronów po ekspozycji na światło, umożliwiając w ten sposób rozwój zamkniętych systemów pętli do wykrywania i zatrzymywania aktywności napadowej. Leczenie stanu epilepticus stanowi własne wyzwanie. Zarówno ze względu na opóźnienie ekspresji genów ekspresji genów po transfekcji, a także konieczność stosowania ogniskowej transfekcji, istnieje ograniczona liczba sytuacji, w których terapia genowa może być może być stosowana w stanie padaczkowym. Jednym z takich stanów jest epilepsia partialis continua (EPC). Zastosowaliśmy terapię genową w modelu EPC i wykazaliśmy, że możemy możemy "wyleczyć" ten stan. Najnowsze dowody sugerują, że terapia genowa ukierunkowana na regiony podkorowe może modyfikować uogólnione lub bardziej rozproszone padaczki, wskazuje, że zakres sytuacji w stanie padaczkowym, w których można zastosować terapię genową, będzie się rozszerzał. terapia genowa może być stosowana. --- Neurony C1, zlokalizowane w brzuszno-bocznym rdzeniu rostralnym (VLM), są aktywowane przez ból, niedociśnienie, hipoglikemię, niedotlenienie i infekcję, a także przez stres psychiczny. przez stres psychologiczny. Wcześniejsze prace podkreślały zdolność tych neuronów do do zwiększania napięcia współczulnego, a tym samym obwodowego uwalniania katecholamin, prawdopodobnie poprzez ich bezpośrednie pobudzające projekcje do współczulnych neuronów przedzwojowych. W W tym badaniu używamy optogenetyki channelrhodopsin-2 (ChR2), aby sprawdzić, czy komórki C1 są również zdolne do szerokiej aktywacji układu noradrenergicznego mózgu. Selektywnie wyraziliśmy ChR2 (H134R) w neuronach katecholaminergicznych VLM przez wstrzykując zależne od Cre adeno-wirusowe wektory do mózgu dorosłego osobnika dopaminy-β-hydroksylazy (DβH)(Cre/0) myszy. Większość neuronów VLM wykazujących ekspresję ChR2 (75%) była immunoreaktywna dla N-metylotransferazy fenyloetanoloaminy, a więc były to komórki C1 komórki, a większość aksonalnych żylaków ChR2-pozytywnych była immunoreaktywna dla pęcherzykowego transportera glutaminianu-2 (78%). Przedstawiliśmy dowody mikroskopowe że aksony neuronów katecholaminergicznych rostralnego VLM (RVLM) kontaktują się z locus neurony noradrenergiczne A1 i A2 oraz ultrastrukturalne dowody na to, że kontakty te reprezentują asymetryczne synapsy. Używając optogenetyki w tkance plasterki, pokazujemy, że neurony katecholaminergiczne RVLM aktywują locus coeruleus a także neurony noradrenergiczne A1 i A2 monosynaptycznie poprzez uwalnianie glutaminian. Podsumowując, aktywacja neuronów katecholaminergicznych RVLM, głównie komórki C1, przez stres somatyczny lub psychologiczny ma potencjał do zwiększenia wypalania zarówno obwodowych, jak i centralnych neuronów noradrenergicznych. --- Fizjologia i obwody związane z neuronami grzbietowego jądra ślimaka (DCN) zostały dobrze opisane. Zdolność do zdalnego manipulowania aktywnością neuronów w tych neuronach stanowiłaby krok naprzód w zdolności do zrozumieć specyficzną funkcję neuronów DCN w słuchu. Chociaż, optogenetyka była wykorzystywana do badania funkcji ścieżek w innych systemach od kilku lat, w układzie słuchowym badano za pomocą tej techniki tylko neurony w korze słuchowej. zostały zbadane przy użyciu tej techniki. Wektory wirusowe związane z adenozyną z albo channelrhodopsin-2 połączony z GFP (ChR2-GFP) lub halorhodopsin połączony z mCherry (HaloR-mCherry), zdolne do ekspresji wrażliwych na światło kanałów kationowych lub pompy chlorkowe, odpowiednio, zostały dostarczone do grzbietowego jądra ślimaka (DCN). Jeden do 18 miesięcy później zaobserwowano ekspresję ChR2 i HaloR w całym DCN. Dystrybucja rodopsyny w DCN została określona jako w kilku typach komórek zidentyfikowanych na podstawie morfologii i lokalizacji w DCN. DCN. Ekspresję ChR2-GFP i HaloR-mCherry stwierdzono zarówno w miejscu wstrzyknięcia jak i w regionach otrzymujących projekcje z tego miejsca. Długość fali odpowiednia stymulacja optyczna in vivo skutkowała aktywnością neuronów, która była znacznie wzrosła w stosunku do poziomów sprzed stymulacji, bez powrotu do poziomu wyjściowego w czasie ekspozycji na światło. Zbadaliśmy również wpływ optycznie napędzanej aktywności neuronalnej na kolejne odpowiedzi tonowe w DCN. DCN. W DCN 75% z 16 miejsc elektrod wykazało zmniejszoną aktywność neuronalną w odpowiedzi na ton bezpośrednio po stymulacji światłem, podczas gdy sześć procent zmniejszyło się po stymulacji tonowej, a 19% miejsc elektrod wykazało bez zmian. Kontrastuje to z aktywnością neuronalną stymulowaną tonem przed ekspozycją na światło. ekspozycją na światło, w której większość miejsc elektrod wykazywała zwiększoną aktywność neuronalną. aktywność neuronalną. Nasze wyniki wskazują, że ekspresja i aktywacja rodopsyny w neuronach zaangażowanych w przetwarzanie słuchowe nie wydaje się mieć szkodliwy wpływ na słuch nawet 18 miesięcy po ekspresji. Ponadto, wirusowo ukierunkowane rodopsyny mogą być użyteczne jako znaczniki szlaków do wyznaczania, jak również a także modulować aktywność szlaków i określonych neuronów. W przyszłości rodopsyny mogą być ukierunkowane na określone subpopulacje neuronów słuchowych. Ostatecznie fotostymulacja może zapewnić fizjologicznie istotną metodę modulowania funkcji neuronów słuchowych i wpływania na wyniki słyszenia. Ten artykuł jest częścią numeru specjalnego zatytułowanego Optogenetics (7th BRES). --- Wiele podejść wykorzystujących wektory wirusowe do dostarczania transgenów ma ograniczoną skuteczność transdukcji, ale wymagają wysokiego poziomu ekspresji transgenu. W szczególności w szczególności infekcja przez zakończenia aksonów jest stosunkowo nieefektywna, ale jest potężnym sposobem na osiągnięcie infekcji określonych typów neuronów. Połączenie tego z podejściami optogenetycznymi wymaga wysokich poziomów ekspresji genów, które nie są typowo osiągane z nietoksycznymi wektorami infekującymi retrogradacyjnie. Wygenerowaliśmy wektory lentiwirusowe z pseudotypem glikoproteiny wścieklizny, które wykorzystują dodatnie sprzężenie zwrotne. pętlę złożoną z promotora Tet napędzającego zarówno własny, zależny od tetracykliny aktywator transkrypcji aktywator transkrypcji zależny od tetracykliny (tTA) ("TLoop") i channelrhodopsin-2-YFP (ChR2YFP). My pokazujemy, że wektory TLoop silnie wyrażają białka w sposób kontrolowany przez lek w neuronach, które wystają do miejsc wstrzyknięcia w mózgu myszy. Po początkowej infekcji wirus przemieszcza się retrogradacyjnie, stabilnie integruje się z genomem gospodarza gospodarza i wyraża produkty genowe. Ekspresja jest silna i umożliwia badania optogenetyczne neuronów wystających do miejsca wstrzyknięcia wirusa, jak wykazane przez ukierunkowane fluorescencyjnie zapisy wewnątrzkomórkowe. Ekspresja ChR2YFP nie powodowała zauważalnych oznak toksyczności i utrzymywała się do 6 miesięcy po zakażeniu. miesięcy po infekcji. Ekspresja może być odwracalnie zablokowana przez podanie doksycykliny, jeśli to konieczne, dla ekspresji produktów genowych, które mogą być bardziej toksyczne. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiamy system, który pozwoli badaczom osiągnąć wysokie poziom ekspresji genów nawet w obliczu nieefektywnej transdukcji wirusowej. Konkretne wektory, które demonstrujemy, mogą zwiększyć wysiłki w celu uzyskania dokładnego zrozumienia wkładu określonych typów neuronów projekcyjnych w funkcjonowanie mózgu. funkcji mózgu. --- Klasycznie, czasowo precyzyjne wzbudzenie potencjału błonowego w neuronach w nienaruszonej tkance można osiągnąć poprzez bezpośrednią stymulację elektryczną lub pośrednią stymulację elektryczną indukowaną przez zmieniające się pola magnetyczne. Oba podejścia mają z góry określoną selektywność opartą na biofizycznych właściwości tkanki nerwowej i błony w obszarze stymulacji. Niedawnym postępem w selektywnym wzbudzaniu neuronów jest podejście "optogenetyczne" podejście wykorzystujące channelrhodopsyny (ChRs). Poprzez ekspresję reagującego na światło ChR w neuronach przy użyciu selektywnych promotorów typu komórkowego lub innych metod, określone neurony mogą być depolaryzowane przez światło w czasowo precyzyjny sposób z rozdzielczością z rozdzielczością milisekundową, nawet jeśli ich właściwości biofizyczne błony są mniej mniej korzystne dla stymulacji elektrycznej. Ponadto, ChR mogą być wykorzystywane do depolaryzacji komórek nieneuronalnych w tkance nerwowej, a także do utrzymania depolaryzacji przez dłuższy okres czasu, czego nie można osiągnąć przy za pomocą stymulacji elektrycznej lub magnetycznej. Aby przeprowadzić eksperyment z ChR, eksperymentatorzy muszą dokonać właściwego wyboru trzech głównych elementów takiego eksperymentu eksperymentu: systemu ekspresji, źródła oświetlenia i zastosowanego wariantu ChR i zastosowanego wariantu ChR. Niniejszy rozdział ma na celu przedstawienie kilku dyskusji na temat aktualnych rozwoju tych aspektów eksperymentów. Do ekspresji ChR w neuronach stosuje się systemy ekspresji obejmują wektory wirusowe, elektroporację in utero i zwierzęta transgeniczne. zwierzęta transgeniczne, z których każdy ma swoje zalety i ograniczenia dotyczące kosztów, wzorca ekspresji i wymaganego wysiłku. Jeśli chodzi o oprzyrządowania, źródło oświetlenia, które jest w stanie zapewnić pożądaną długość fali o wysokiej intensywności. długości fali o wysokiej intensywności ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Ważne czynniki Ważne czynniki dotyczące zastosowanego źródła światła obejmują koszt, gęstość światła gęstość światła, wydajność sprzężenia światłowodowego dla eksperymentów na gryzoniach in vivo, oraz dostępne metody kontroli natężenia światła i początku/końca. Trzecim Trzecim elementem eksperymentu jest wybór odpowiednich wariantów ChR. ChR. Opracowano wiele nowych wariantów ChR o unikalnych właściwościach, a eksperymentatorom może być trudno eksperymentatorzy mogą mieć trudności z wyborem odpowiedniego wariantu o pożądanych właściwościach do swoich eksperymentów. z pożądanymi właściwościami dla swoich eksperymentów, ponieważ niektóre informacje niezbędne dla eksperymentatora do dokonania właściwego wyboru eksperymentatora do dokonania właściwego wyboru są często niekompletne lub niedostępne. Obecnie dostępne warianty do badań neuronaukowych to typ dziki ChR2, ChR2+H134R, ChETA, VChR1, SFO, ChD, ChEF, ChIEF, ChRGR, CatCh i TC. Cechy cechy i ograniczenia tych różnych wariantów. Na koniec, Rozdział ten zawiera pewne sugestie dotyczące przyszłego rozwoju źródła światła, systemu ekspresji i źródła światła, systemu ekspresji i rozwoju "następnej" generacji ChRs. ChRs. --- Krytyczną techniką pozwalającą zrozumieć, w jaki sposób aktywność neuronalna przyczynia się do zachowanie jest określenie, czy jego zaburzenie zmienia zachowanie. Pojawienie się technik optogenetycznych pozwala na natychmiastową odwracalną zmianę aktywności neuronalnej w przeciwieństwie do metod chemicznych trwających od minut do godzin. Modyfikacja zachowania za pomocą optogenetyki odniosła znaczący sukces u gryzoni gryzoniach, ale nie była tak skuteczna u małp. Tutaj pokazujemy, jak optogenetyczna dezaktywacja neuronów kola górnego u przebudzonych małp prowadzi do wyraźnych i powtarzalnych powtarzalnych deficytów behawioralnych w metrykach sakkadowych ruchów gałek ocznych. Wykorzystaliśmy nasze obserwacje do oceny zasad rządzących stosowaniem technik optogenetycznych w badaniu neuronalnych podstaw zachowania u małp, w szczególności, w jaki sposób projekt eksperymentalny musi uwzględniać odpowiednie parametry, takie jak zastosowanie światła do struktur podkorowych, rozprzestrzenianie się wirusa i zakres inaktywacji neuronów za pomocą światła. --- Dynamiczna natura ekspresji genów umożliwia programowanie komórkowe, homeostazę i adaptację środowiskową w żywych systemach. Rozcięcie przyczynowego genu w procesach komórkowych i organizmalnych wymaga zatem podejścia które umożliwiają przestrzennie i czasowo precyzyjną modulację ekspresji genów. Niedawno opracowano wiele białek wrażliwych na światło pochodzących z drobnoustrojów i roślin. jako siłowniki optogenetyczne, umożliwiając precyzyjną kontrolę przestrzenno-czasową wielu funkcji komórkowych. kontrolę wielu funkcji komórkowych. Jednak wszechstronne i niezawodne technologie które umożliwiają optyczną modulację transkrypcji w endogennym genomie ssaków pozostają nieuchwytne. genomie ssaków pozostają nieuchwytne. Tutaj opisujemy rozwój indukowanych światłem efektorów transkrypcyjnych (LITE), optogenetycznego systemu dwuhybrydowego integrującego konfigurowalną domenę wiążącą DNA TALE z wrażliwym na światło białkiem kryptochromu 2 i jego partnerem CIB1 z Arabidopsis thaliana. LITE nie wymagają dodatkowych egzogennych kofaktorów chemicznych, można je łatwo dostosować do celu wiele endogennych loci genomowych i mogą być aktywowane w ciągu kilku minut z odwracalnością. odwracalności. LITE mogą być pakowane do wektorów wirusowych i genetycznie ukierunkowane do badania określonych populacji komórek. Zastosowaliśmy ten system w pierwotnych mysich neuronach neuronach myszy, a także w mózgu swobodnie zachowujących się myszy in vivo, aby pośredniczyć w odwracalnej modulacji ekspresji endogennych genów ssaków, jak również ukierunkowanych epigenetycznych modyfikacji chromatyny. System LITE ustanawia nowy tryb optogenetycznej kontroli endogennych procesów komórkowych i umożliwia bezpośrednie testowanie przyczynowej roli regulacji genetycznej i epigenetycznej w normalnych procesach biologicznych i stanach chorobowych. procesach biologicznych i stanach chorobowych. --- Zrozumienie struktury i funkcji obwodów korowych wymaga identyfikacji i kontroli określonych typów komórek w korze mózgowej. Aby rozwiązać te przeszkody, opracowano najnowsze podejścia optogenetyczne. Zdolność do aktywacji, wyciszania lub monitorowania określonych typów komórek poprzez połączenie genetyki, wirusologii i optyki pozwoli rozszyfrować rolę określonych grup neuronów w obwodach o z rozdzielczością przestrzenno-czasową, która pokonuje standardowe podejścia. W W tym przeglądzie omówiono różne strategie selektywnego ukierunkowania genetycznego określonej populacji neuronów, a także neuronów, a także wady i zalety wykorzystania zwierząt transgenicznych i rekombinowanych neuronów. transgenicznych zwierząt i rekombinowanych wektorów wirusowych do ekspresji transgenów w określonym zestawie neuronów. --- Kontrolowanie aktywności określonych populacji neuronów bez wpływu na inne neurony w mózgu neuronów w mózgu jest teraz możliwe dzięki nowej technologii inżynierii genów i neuroinżynierii, zwanej optogenetyką. i neuroinżynierii zwanej optogenetyką. Pochodzące z organizmów mikrobiologicznych geny opsyn kodujące aktywowane światłem kanały jonowe i pompy (channelrhodopsin-2 [ChR2]; halorhodopsin [NpHR], odpowiednio), zaprojektowane do ekspresji w mózgu ssaków mózgu ssaków, mogą być genetycznie ukierunkowane na określone populacje neuronalne za pomocą wektorów wirusowych. wektorów wirusowych. Po wystawieniu na działanie światła o odpowiedniej długości fali, potencjały czynnościowe mogą być wyzwalane w neuronach z ekspresją ChR2, podczas gdy hamowanie potencjałów czynnościowych potencjały można uzyskać w neuronach z ekspresją NpHR, co pozwala na potężną kontrolę aktywności neuronalnej. Optogenetyka jest obecnie intensywnie stosowana na zwierzętach laboratoryjnych, zarówno in vitro, jak i in vivo, do badania funkcji złożonych obwodów neuronalnych i przetwarzania informacji w normalnym mózgu i w różnych stanach neurologicznych. Perspektywy kliniczne zastosowania optogenetyki jako nowej strategii leczenia zaburzeń neurologicznych u ludzi wygenerowały znaczne zainteresowanie, głównie ze względu na ogromny potencjał wykazany w ostatnich badaniach na gryzoniach i naczelnych. Przywrócenie dysfunkcji ruchowej związanej z dopaminą u zwierząt z chorobą Parkinsona, poprawa ślepoty i odzyskiwanie oddechu po urazie rdzenia kręgowego to tylko kilka przykładów. takich perspektyw. --- Narzędzia umożliwiające manipulowanie dobrze zdefiniowanymi subpopulacjami neuronów są mają kluczowe znaczenie dla badania złożonych sieci neuronalnych. Linie mysich sterowników rekombinazy Cre (Cre) w połączeniu z zależną od Cre ekspresją białek przy użyciu wektorów wirusowych - w szczególności rekombinowanej adenozyny wektorów wirusowych - w szczególności rekombinowanych wektorów adenowirusowych (rAAV) - pojawiły się jako szeroko stosowana platforma do osiągania ekspresji transgenów w określonych populacjach neuronalnych. w określonych populacjach neuronalnych. Jednak zdolność rAAV do dalszego określania podgrup neuronalnych na podstawie ich anatomicznej łączności została zgłoszona jako ograniczona lub niespójna. Tutaj systematycznie testowaliśmy różnorodność szeroko stosowanych neurotropowych rAAV pod kątem ich zdolności do pośredniczenia w wstecznej transdukcji genów w mózgu myszy. Przetestowaliśmy pseudotypowe rAAV kilku popularnych serotypów (rAAV 2/1, 2/5 i 2/9), a także konstrukty zarówno z, jak i bez bez przełączników ekspresji zależnych od Cre. Wiele z testowanych rAAV - w szczególności w szczególności, choć nie wyłącznie, wektory zależne od Cre - wykazały solidną zdolność do infekcji wstecznej i ekspresji transgenu. Ekspresja wsteczna była skuteczna na odległościach tak dużych jak 6 mm i w wielu typach neuronów, w tym neuronach, w tym neuronach projekcyjnych węchowych, neokortykalnych komórkach piramidowych rzutujące na różne cele oraz neurony projekcyjne kortykofugalne i modulujące neurony. Infekcja wsteczna przy użyciu transgenów, takich jak ChR2, pozwoliła na optyczną kontrolę optyczną lub wspomaganą optycznie identyfikację elektrofizjologiczną neuronów zdefiniowanych genetycznie, jak również przez ich cel projekcji. Wyniki te ustanawiają szeroko dostępne narzędzie do osiągania specyficzności kombinatorycznej i stabilnej, długoterminowej ekspresji transgenu w celu izolacji precyzyjnie zdefiniowanych populacji neuronów w nienaruszonym zwierzęciu. --- Długotrwałe, indukowane lekami adaptacje w jądrze półleżącym (NAc) zostały zaproponowano, aby przyczynić się do uzależniających zachowań za pośrednictwem narkotyków. Tutaj mamy wykorzystaliśmy podejście optogenetyczne do zbadania roli średnich neuronów kolczastych NAc (MSN) wyrażających receptory dopaminy D2 (D2R) w indukowanym kokainą zachowaniu uczulenie. Adeno-związane wektory wirusowe kodujące channelrhodopsin-2 (ChR2) zostały dostarczone do NAc myszy transgenicznych D2R-Cre. To pozwoliło nam selektywnie fotostymulować D2R-MSNs w NAc. D2R-MSN tworzą lokalne obwody hamujące obwody, ponieważ fotostymulacja D2R-MSN wywołała hamujące postsynaptyczne prądy (IPSC) w sąsiednich MSN. Fotostymulacja NAc D2R-MSN in vivo nie wpłynęła ani na inicjację, ani na ekspresję zachowania wywołanego kokainą uczulenie. Jednak fotostymulacja podczas okresu odstawienia leku osłabiła ekspresję uczulenia behawioralnego wywołanego kokainą. Wyniki te pokazują, że D2R-MSNs NAc odgrywają kluczową rolę w plastyczności wywołanej odstawieniem i może przyczynić się do nawrotu po zaprzestaniu nadużywania narkotyków. --- W obecnej palecie narzędzi optogenetycznych opartych na opsynach brakuje bramkowanego światłem kanału potasowego (K(+)) pożądanego do wyciszania komórek pobudliwych. Tutaj opisać budowę indukowanego niebieskim światłem kanału K(+) 1 (BLINK1) zmodyfikowanego przez połączenie modułu fotosensorycznego LOV2-Jα rośliny z małym wirusowym kanałem K(+) wirusowym kanałem K(+) Kcv. BLINK1 wykazuje biofizyczne cechy Kcv, w tym selektywność K(+) i wysoką przewodność jednokanałową, ale odwracalnie fotoaktywuje się w świetle niebieskim. niebieskim świetle. Otwarcie kanałów BLINK1 hiperpolaryzuje komórkę do potencjału równowagi K(+) potencjału równowagi. Ektopowa ekspresja BLINK1 odwracalnie hamuje reakcję ucieczki reakcję ucieczki u larw danio pręgowanego narażonych na działanie światła. BLINK1 zapewnia zatem jednoskładnikowe narzędzie optogenetyczne, które może ustanowić długotrwałą, fizjologiczną hiperpolaryzację komórek przy niskim natężeniu światła. --- CEL PRZEGLĄDU: W niniejszym przeglądzie omówimy najnowsze osiągnięcia w dziedzinie optogenetyki i ich potencjalne zastosowania w okulistyce. optogenetyki i ich potencjalne zastosowania w okulistyce w celu przywrócenia wzroku w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. NAJNOWSZE OSIĄGNIĘCIA: W ostatnich latach byliśmy świadkami znacznych postępów w dziedzinie optogenetyki. optogenetyki, dostarczając nam nowe opsyny do potencjalnych zastosowań w siatkówce. siatkówce. Mikrobiologiczne opsyny o zwiększonej wrażliwości na światło i przesuniętym ku czerwieni widmie działania umożliwiają stymulację optogenetyczną przy poziomach światła znacznie poniżej progu bezpieczeństwa w ludzkim oku. bezpieczeństwa w ludzkim oku. Równolegle, niezwykły sukces w rozwoju wysoce wydajnych wektorów wirusowych do ocznej terapii genowej doprowadził do nowych strategii wykorzystania tych nowych narzędzi optogenetycznych do przywracania wzroku. PODSUMOWANIE: Ostatnie odkrycia pokazują, że nowe narzędzia optogenetyczne i wektory wirusowe wektory do dostarczania genów do oczu są teraz dostępne, zapewniając wiele możliwości do opracowania potencjalnych strategii optogenetycznych do przywracania wzroku. --- Transfer genów za pośrednictwem wektorów wirusowych staje się coraz bardziej wartościowy dla badań nad mózgiem naczelnych. mózgu naczelnych, w szczególności do stosowania metod genetycznych (np. optogenetyka) do badania funkcji obwodów neuronalnych. Tropizmy komórek neuronalnych i i wzorce infekcji są realnymi opcjami uzyskania wektora wirusowego, w którym pośredniczy wektora wirusowego, który jest selektywny dla określonych ścieżek neuronalnych. Na przykład Na przykład, kilka typów wektorów wirusowych może infekować zakończenia aksonów (infekcje wsteczne), co umożliwia ukierunkowaną infekcje), co umożliwia ukierunkowane dostarczanie transgenu do neuronów, które bezpośrednio do określonego regionu iniekcji wirusowej. Chociaż ostatnie badania gryzoniach wykazały, że wirus adenowirusowy serotypu 8 (AAV8) i 9 (AAV9) skutecznie transdukują neurony, tropizmy i wzorce infekcji pozostają słabo poznane w mózgach naczelnych. słabo poznane w mózgach naczelnych. Tutaj skonstruowaliśmy rekombinowane AAV8 lub AAV9, które wyrażały gen wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP) napędzany przez wszechobecny promotor (odpowiednio AAV8-EGFP i AAV9-EGFP), oraz stereotaktycznie wstrzyknięto go do kilku obszarów mózgu u marmozet i makaków. małp. Analizy immunohistochemiczne ujawniły prawie wyłączną kolokalizację fluorescencji fluorescencji EGFP poprzez transfer genów za pośrednictwem AAV9 z markerem specyficznym dla neuronu markerem, wskazując na endogenny tropizm neuronów AAV9, co było zgodne z naszymi wcześniejszymi wynikami wykorzystującymi z naszymi poprzednimi wynikami wykorzystującymi AAV8. Wstrzyknięcia AAV8-EGFP lub AAV9-EGFP do prążkowia marmozety spowodowało ekspresję EGFP w lokalnych neuronach prążkowia. neuronach prążkowia w wyniku miejscowej infekcji, a także ekspresję w neuronach dopaminergicznych neuronach dopaminergicznych istoty czarnej poprzez transport wsteczny wzdłuż aksonalnych projekcji nigrostriatalnych. Infekcje wsteczne obserwowano również w korze czołowej i wzgórzu, o których wiadomo, że mają bezpośrednie projekcje do prążkowia. prążkowia. Te lokalne i wsteczne transfery genów były dalej wykazano w szlaku genikulokortykalnym układu wzrokowego marmozety. Odkrycia te wskazują na obiecujące możliwości AAV8 i AAV9 w zakresie dostarczania narzędzi molekularnych do szeregu układów nerwowych naczelnych w sposób specyficzny dla szlaku poprzez ich tropizmy neuronalne i wzorce infekcji. --- Ostatnie postępy w metodach optogenetycznych pokazują wykonalność selektywnej fotoaktywacji w soma neuronów, które wyrażają channelrhodopsin-2 (ChR2), ale kompleksowa ocena różnych metod selektywnego wywoływania uwalniania przekaźnika z odległych synaps przy użyciu metod optogenetycznych. potrzebne. Tutaj porównaliśmy różne wektory lentiwirusowe, z specyficznymi dla subpopulacji i silnymi promotorami oraz transgenicznymi metodami ekspresji i fotostymulacji ChR2 w projekcjach dalekiego zasięgu jądra przykomorowego neuronów podwzgórza (PVN) do neuronów nerwu błędnego pnia mózgu (CVN). Używając promotorów specyficznych dla subpopulacji PVN dla wazopresyny i oksytocyny, byliśmy w stanie w stanie depolaryzować soma tych neuronów po fotostymulacji, ale te promotory nie były wystarczająco silne, aby napędzać wystarczającą ekspresję dla optogenetycznej stymulacji i uwalniania synaptycznego z dystalnych aksonów. Jednakże, wykorzystując fotostymulacja dystalnych aksonów PVN z powodzeniem wywołała pobudzenie glutaminergiczne glutaminergiczne pobudzające prądy postsynaptyczne w CVN. Stosując system Cre/loxP przy użyciu linii myszy Sim-1 Cre-driver, odkryliśmy, że Rosa-CAG-LSL-ChR2-EYFP Cre-responder myszy wyrażały wyższe poziomy ChR2 niż linia Rosa-CAG-LSL-ChR2-tdTomato w PVN, oceniana przez prądy wywołane światłem w soma. Jednak żadna z nich nie była w stanie wywołać wystarczającej ekspresji, aby obserwować i fotostymulować projekcje dalekiego zasięgu do autonomicznych regionów pnia mózgu. My że podejście wektora wirusowego z silnym promotorem jest wymagane do skutecznej stymulacji optogenetycznej dystalnych aksonów w celu wywołania uwalniania przekaźnika w przedautonomicznych neuronach PVN. Takie podejście może być bardzo przydatne do badania ważnych połączeń między podwzgórzem a pniem mózgu i może być łatwo modyfikowane w celu selektywnie aktywować inne projekcje dalekiego zasięgu w mózgu.
Do czego wykorzystywane są wektory wirusowe w optogenetyce?
Wektory wirusowe są wykorzystywane do ekspresji konstruktów optogenetycznych w wybranych komórkach.