TŁO: Interakcje chromatyny dalekiego zasięgu odgrywają ważną rolę w regulacji regulacji transkrypcji. Analiza interakcji chromatyny z sekwencjonowaniem Paired-End-Tag (ChIA-PET) jest nową technologią, która ma unikalne zalety w analizie interakcji chromatyny analizę interakcji chromatyny, a tym samym zapewnia wgląd w badanie regulacji transkrypcji. WYNIKI: W niniejszym artykule przedstawiono protokół eksperymentalny i proces analizy danych ChIA-PET. ChIA-PET, a także omawia niektóre aplikacje wykorzystujące tę technologię. technologii. Ujawnia również kierunek przyszłych badań opartych na tej technologii. technologii. WNIOSKI: Ogólnie rzecz biorąc, pokazujemy, że ChIA-PET jest kamieniem węgielnym do badania do badania trójwymiarowej (3D) struktury chromatyny i z pewnością doprowadzi do nadchodzącej fali badań genomiki 3D. --- Identyfikacja trójwymiarowych (3D) interakcji między elementami regulatorowymi w genomie w całym genomie ma kluczowe znaczenie dla odkrycia złożonego mechanizmu regulacyjnego, który która koordynuje proliferację i różnicowanie komórek. ChIA-PET jest nowatorską metodą identyfikacji takich interakcji, w której fizyczne kontakty między regionami związanymi przez określone białko są określane ilościowo przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. sekwencjonowania nowej generacji. Jednak określenie znaczenia obserwowanych częstotliwości interakcji w takich zbiorach danych jest trudne i zaproponowano niewiele metod. Pomimo faktu, że regiony znajdujące się blisko siebie w liniowej odległości genomowej mają znacznie większą tendencję do interakcji przez przypadek, żadna z dotychczasowych metod nie jest w stanie uwzględniać takiej zależności. Tutaj proponujemy model statystyczny uwzględniający uwzględniający zależność odległości genomowej, a także ogólną skłonność skłonność kotwic do angażowania się w kontakty. Wykorzystując zarówno rzeczywiste, jak i i symulowanych danych, pokazujemy, że wcześniej zaproponowany test statystyczny, oparty na teście Fishera, prowadzi do nieprawidłowych wyników, gdy dane zależą od odległości genomowej. odległości genomowej. Oceniamy również naszą metodę na wcześniej zwalidowanych, specyficznych dla linii komórkowej i konstytutywnych interakcjach 3D i pokazujemy, że istotne interakcje są istotne, jednocześnie unikając przeszacowania znaczenia krótkich, pobliskich interakcji. interakcji. --- Genomy są zorganizowane w trójwymiarowe struktury, przyjmując konformacje wyższego rzędu konformacje wewnątrz mikronowych przestrzeni jądrowych (7, 2, 12). Takie architektury nie są przypadkowe i obejmują interakcje między promotorami genów i elementami regulacyjnymi (13). elementami regulacyjnymi (13). Wiązanie czynników transkrypcyjnych z określonymi sekwencjami regulacyjnymi tworzy sieć regulacji i koordynacji transkrypcji (1, 14). i koordynację (1, 14). Analiza interakcji chromatyny przez sekwencjonowanie parami końcówek (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag (ChIA-PET) została opracowana w celu identyfikacji tych struktur chromatyny wyższego rzędu (5,6). struktur chromatyny (5,6). Komórki są utrwalane, a oddziałujące loci są wychwytywane przez kowalencyjne wiązania krzyżowe DNA-białko. wiązania krzyżowe DNA-białko. Aby zminimalizować niespecyficzny szum i zmniejszyć złożoność, a także zwiększyć specyficzność analizy interakcji chromatyny, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest stosowana przeciwko specyficznym czynnikom białkowym w celu wzbogacenia interesujących fragmentów chromatyny przed ligacją zbliżeniową. Ligacja z udziałem pół-łączników tworzy następnie kowalencyjne połączenia między parami fragmentów DNA DNA połączonymi ze sobą w ramach poszczególnych kompleksów chromatynowych. Flankujące miejsca enzymu restrykcyjnego MmeI w pół-łącznikach umożliwiają ekstrakcję sparowanego końca konstruktów tag-linker-tag (PET) po trawieniu MmeI. Ponieważ pół-łączniki są biotynylowane, te konstrukty PET są oczyszczane przy użyciu kulek magnetycznych ze streptawidyną perełek. Oczyszczone PET są ligowane z adapterami do sekwencjonowania następnej generacji a katalog oddziałujących fragmentów jest generowany za pomocą sekwenatorów nowej generacji, takich jak sekwenatorów następnej generacji, takich jak Illumina Genome Analyzer. Mapowanie i analiza bioinformatyczna analiza bioinformatyczna jest następnie przeprowadzana w celu identyfikacji miejsc wiązania wzbogaconych o ChIP i interakcji chromatynowych wzbogaconych o ChIP (8). Wyprodukowaliśmy wideo, aby zademonstrować krytyczne aspekty protokołu ChIA-PET, w szczególności przygotowanie ChIP, ponieważ jakość ChIP odgrywa główną rolę w wynikach biblioteki ChIA-PET. biblioteki ChIA-PET. Ponieważ protokoły są bardzo długie, tylko krytyczne kroki są pokazane w filmie. --- Od czasu scharakteryzowania przez Jacoba i Monoda roli elementów DNA w kontroli genów kontroli genów, uznano, że liniowa organizacja struktury genomu jest ważna dla regulacji transkrypcji genów, a tym samym dla manifestacji fenotypów. Podobnie, od dawna stawiano hipotezę, że organizacja organizacja przestrzenna (w trzech wymiarach ewoluujących w czasie), jako część epigenomu, wnosi znaczący wkład w przejście genotyp-fenotyp. przejście genotyp-fenotyp. Testy ligacji zbliżeniowej powszechnie znane jako konformacja chromosomów (3C) i metodologie oparte na 3C (np. GCC, HiC i ChIA-Pet) są coraz częściej włączane do badań empirycznych. są coraz częściej włączane do badań empirycznych w celu zbadania roli że trójwymiarowa struktura genomu odgrywa rolę w regulacji fenotypu. Pozorna prostota tych metod - sieciowanie chromatyny, trawienie, rozcieńczać, ligować, wykrywać interakcje - zaprzecza złożoności danych i rozważań, które należy wziąć pod uwagę. rozważania, które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić generowanie i dokładną interpretację wiarygodnych danych. Tutaj omawiamy probabilistyczny probabilistyczny charakter tych metodologii i sposób, w jaki przyczynia się to do ich endogennych ograniczeń. ograniczeń.
Jaka jest zasada metodologiczna ChIA-PET?
Analiza interakcji chromatyny z sekwencjonowaniem tagów o sparowanych końcach (ChIA-PET) jest nową technologią do badania interakcji chromatyny dalekiego zasięgu w całym genomie, związanych przez czynniki białkowe. Aby zminimalizować niespecyficzny szum i zmniejszyć złożoność, a także zwiększyć specyficzność analizy interakcji chromatyny, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest stosowana przeciwko specyficznym czynnikom białkowym w celu wzbogacenia interesujących fragmentów chromatyny przed ligacją zbliżeniową. Łącząc immunoprecypitację chromatyny (ChIP), ligację zbliżeniową i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, ChIA-PET zapewnia globalne i bezstronne badanie struktur chromatyny wyższego rzędu związanych z określonymi czynnikami białkowymi. Proponujemy tutaj model statystyczny uwzględniający relację odległości genomowej, a także ogólną skłonność kotwic do angażowania się w kontakty.