Zmniejszona obsługa Ca w kardiomiocytach jest często przypisywana upośledzonej funkcji retikulum sarkoplazmatycznego (SR) w ludzkiej i eksperymentalnej niewydolności serca. Fosfolamban (PLN) jest kluczowym regulatorem SR i funkcji serca, a mutacje PLN u ludzi są związane z kardiomiopatią rozstrzeniową (DCM). My wcześniej donosiliśmy o delecji wysoce konserwatywnej reszty aminokwasowej argininy 14 (kwasy nukleinowe 39, 40 i 41) u pacjentów z DCM. Ten podstawowy aminokwas jest ważny w utrzymaniu sekwencji konsensusu dla fosforylacji PKA fosforylacji Ser 16 w PLN. Aby ocenić funkcję tego zmutowanego PLN, wprowadziliśmy wprowadziliśmy PLN-R14Del do miocytów serca myszy bez PLN. Transgeniczne linie wyrażające zmutowany PLN-R14Del na podobnych poziomach białka jak typy dzikie nie wykazywały zahamowania początkowego tempa wychwytu Ca z SR ułatwionego przez szczawiany w porównaniu do PLN-knockouts (PLN-KO). Parametry kurczliwości i kinetyka Ca również pozostawały silnie stymulowane w kardiomiocytach PLN-R14Del, podobnie jak w PLN-KO, a izoproterenol nie stymulował dalej tych hiper-skurczowych parametrów podstawowych. parametry. Zgodnie z brakiem zahamowania transportu SR Ca i kurczliwości, mikroskopia konfokalna kurczliwości, mikroskopia konfokalna wykazała, że PLN-R14Del nie udało się kolokalizować z SERCA2a. Co więcej, PLN-R14Del nie współimmunoprecypitował z SERCA2a (podobnie jak WT-PLN), ale raczej koimmunoprecypitował z sarkolemmalną Na/K-ATPazą (NKA) i stymulował aktywność NKA. Ponadto badania na komórkach HEK wykazały znaczący transfer energii rezonansu fluorescencji między PLN-R14Del-YFP i NKAα1-CFP, ale nie z regulatorem NKA fosfolemmanem. Pomimo zwiększonej funkcji serca w sercach PLN-R14Del (podobnie jak w sercach PLN-knockouts), wystąpił przerost mięśnia sercowego (w przeciwieństwie do PLN-KO) w połączeniu z aktywacją Akt i szlaków MAPK. Zatem ludzki PLN-R14Del jest nieprawidłowo kierowany do sarkolemma, przy braku endogennego PLN, i zmienia aktywność NKA, prowadząc do przebudowy serca. --- Molekularna etiologia niewydolności serca, wyłaniającej się epidemii sercowo-naczyniowej dotykającą 4,7 miliona Amerykanów i kosztującą 17,8 miliarda dolarów rocznie. rocznie, pozostają słabo poznane. Tutaj donosimy, że dziedziczna ludzka kardiomiopatia rozstrzeniowa z oporną na leczenie zastoinową niewydolnością serca jest spowodowana przez dominującą mutację typu missense Arg --> Cys w pozycji 9 (R9C) w fosfolambanie (PLN), przezbłonowej fosfoproteinie, która hamuje sarkoplazmatyczną sercową sarkoplazmatyczną pompę Ca2+-adenozynotrifosfatazy (SERCA2a). Transgeniczne myszy PLN(R9C) odtworzyły ludzką niewydolność serca z przedwczesną śmiercią. Badania komórkowe i biochemiczne badania wykazały, że w przeciwieństwie do PLN typu dzikiego, PLN(R9C) nie hamuje bezpośrednio SERCA2a. Zamiast tego, PLN(R9C) uwięził kinazę białkową A (PKA), która zablokowała fosforylację PLN typu dzikiego za pośrednictwem PKA, co z kolei opóźniało zanik wapnia w miocytach. Wyniki te wskazują, że dysregulacja może inicjować niewydolność serca u ludzi - odkrycie, które może prowadzić do możliwości terapeutyczne. --- Fosfolamban (PLN) jest kluczowym regulatorem homeostazy Ca(2+) i kurczliwości w sercu. Jego działanie regulacyjne odbywa się poprzez interakcję z sarkoplazmatyczną retikulum Ca(2+)-ATPazą (SERCA2a), co skutkuje zmianami jej powinowactwa do Ca(2+). jego powinowactwo do Ca(2+). Aby zidentyfikować dodatkowe białka, które mogą wchodzić w interakcje z PLN, wykorzystaliśmy system drożdżowo-dwuhybrydowy do badania biblioteki cDNA dorosłego ludzkiego serca serca dorosłego człowieka. Białko X-1 związane z HS-1 (HAX-1) zostało zidentyfikowane jako partner wiążący PLN. partnera. Minimalne regiony wiązania zostały zmapowane do reszt aminokwasowych 203-245 dla HAX-1 i reszt 16-22 dla PLN. Interakcja między dwoma białkami została potwierdzona przy użyciu GST-HAX-1, związanego z matrycą glutationową, która specyficznie adsorbował natywny PLN z ludzkich lub mysich homogenatów serca, podczas gdy w badaniach wzajemnego wiązania, rekombinowany His-HAX-1 wiązał GST-PLN. Kinetyczne badania z wykorzystaniem rezonansu plazmonów powierzchniowych dały K(D) około 1 muM jako powinowactwo wiązania dla kompleksu PLN/HAX-1. Fosforylacja PLN przez kinazę białkową zależną od cAMP zmniejszała wiązanie z HAX-1, podczas gdy zwiększanie stężenia Ca (2+) zmniejszały interakcję PLN / HAX-1 w sposób sposób zależny od dawki. HAX-1 koncentrował się w mitochondriach, ale po przejściowej ko-transfekcji komórek HEK 293 z PLN, HAX-1 uległ redystrybucji i kolokalizacji z PLN w retikulum endoplazmatycznym. Analiza funkcji antyapoptotycznej HAX-1 ujawniła, że obecność PLN wzmocniła działanie ochronne HAX-1 przed śmiercią komórek wywołaną niedotlenieniem/reoksygenacją. Odkrycia te sugerują możliwy związek między obsługą Ca(2+) przez retikulum sarkoplazmatyczne a przeżyciem komórek w którym pośredniczy interakcja PLN/HAX-1. --- Wcześniej informowaliśmy, że acylofosfataza, enzym cytozolowy obecny w mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym, aktywnie hydrolizuje fosfoenzym (EP) sercowej sarkoplazmatycznego retikulum (SR) Ca2+-ATPazy (SERCA2a), indukując zwiększoną aktywność tej pompy. aktywność tej pompy. Postawiliśmy hipotezę, że stymulacja indukowana acylofosfatazą SERCA2a, oprócz zwiększonej hydrolizy EP, może być spowodowana przemieszczeniem fosfolambanu (PLN), usuwając jego działanie hamujące. Aby zweryfikować tę hipotezę przeprowadzono eksperymenty koimmunoprecypitacji przez dodanie rekombinowanej acylofosfatazy mięśniowej do rozpuszczonych pęcherzyków SR serca, stosowanych jako źródło źródło SERCA2a i PLN. Z przeciwciałami przeciwko acylofosfatazie tylko SERCA2a był w ilości, która wzrastała równolegle do stężenia naszego enzymu. stężenia naszego enzymu. I odwrotnie, przy użyciu przeciwciała anty-SERCA2a, zarówno PLN i acylofosfataza były koimmunoprecypitowane z SERCA2a, a ilość PLN w osadzie zmniejszała się wraz ze wzrostem stężenia acylofosfatazy. SERCA2a i PLN były koimmunoprecypitowane przez przeciwciała anty-fosfolamban, ale podczas gdy ilość wytrąconego fosfolambanu wzrosła w obecności acylofosfatazy, poziom SERCA2a zmniejszył się. Te wstępne wyniki wzmacniają przypuszczalne wypieranie fosfolambanu przez acylofosfatazę. --- Fosfolamban (PLN) odwracalnie hamuje Ca(2+)-ATPazę retikulum sarkoplazmatycznego serca (SERCA2a) poprzez bezpośrednią interakcję białko-białko. retikulum sarkoplazmatycznego (SERCA2a) poprzez bezpośrednią interakcję białko-białko, odgrywając kluczową rolę w regulacji wewnątrzkomórkowego Ca(2+) w komórkach mięśnia sercowego komórkach mięśnia sercowego. Interakcja między PLN i SERCA2a zachodzi w wielu miejscach w obrębie domen cytoplazmatycznych i błonowych. Tutaj odtworzyliśmy cytoplazmatyczną interakcję białko-białko przy użyciu bakteryjnie wyrażonych białek fuzyjnych białka domeny cytoplazmatycznej PLN i długiej pętli cytoplazmatycznej SERCA2a. Opracowaliśmy dwie metody oceny wiązania białek fuzyjnych białek fuzyjnych, jedną z kulkami glutationowo-sefarozowymi, a drugą z 96-dołkową płytką płytce. Zasadniczo te dwie metody dały takie same wyniki. Powinowactwo powinowactwo wiązania (K(D)) wynosiło 0,70 mikroM. Asocjacja była hamowana przez fosforylację zależną od cAMP. zależna od cAMP fosforylacja białka fuzyjnego PLN i użycie przeciwciało monoklonalne anty-PLN. Było również zmniejszone przez podstawienie w miejscu fosforylacji fosforylacji PLN z Ser (16) na Asp. Wyniki te sugerują, że PLN może wiązać SERCA2a przy braku domen błonowych i że modyfikacje cytoplazmy modyfikacje cytoplazmatycznej domeny PLN, które aktywują SERCA2a równolegle równolegle z zaburzeniem asocjacji między dwoma białkami fuzyjnymi. Zostało wykazano, że usunięcie hamowania SERCA2a przez PLN ratuje funkcję serca i morfologię w mysim modelu kardiomiopatii rozstrzeniowej. Nasz system testowy może być zastosowany do badań przesiewowych nowych środków inotropowych, które usuwają hamowanie SERCA2a przez PLN, poprawiając relaksację, jak również kurczliwość niewydolnego serca. --- Celem niniejszego badania było wykorzystanie sztucznie wywołanego procesu starzenia modelu kardiomiocytów w celu dalszego zbadania potencjalnego związanego ze starzeniem się komórkowe efekty dysfunkcji rozkurczowej EGB761 i zbadać leżące u podstaw mechanizmy molekularne. Hodowane pierwotne kardiomiocyty szczura traktowano D-galaktozą lub D-galaktozą w połączeniu z EGB761 przez 48 godzin. leczenia, odsetek komórek dodatnich dla SA-β-gal, produkcja AGE, aktywność sarkoplazmatycznej pompy wapniowej (SERCA), sarkoplazmatyczna pompa wapniowa mięśnia sercowego wychwyt wapnia przez siateczkę sarkoplazmatyczną i względne poziomy białka białka. Nasze wyniki wykazały, że stymulacja in vitro D-galaktozą indukowała produkcję AGEs. Dodanie EGB761 znacząco zmniejszyło liczbę komórek Ponadto, zmniejszenie rozkurczowego wychwytu [Ca(2+)](Ca(2+)](EGB761) znacząco zmniejszyło liczbę komórek dodatnich dla SA-β-gal. [Ca(2+)](i), skrócenie czasu od maksymalnego stężenia Ca(2+) do poziomu wyjściowego i zwiększony wychwyt zwrotny zaobserwowano również zwiększony wychwyt zwrotny Ca(2+) w SR. w SR. Ponadto poziom białka p-Ser16-PLN, jak również SERCA był znacznie zwiększony. znacznie zwiększony. Badanie wykazało, że EGb761 łagodzi powstawanie produktów AGEs produktów na SERCA2a w celu złagodzenia sztywności mięśnia sercowego z jednej strony; na z drugiej strony, poprawia funkcję SERCA2a poprzez zwiększenie ilości miejsc Ser16 Fosforylacja PLN, która ostatecznie doprowadziła do złagodzenia rozkurczu dysfunkcji starzejących się kardiomiocytów. --- Sercowa sarko(endo)plazmowa retikulum Ca(2)-ATPaza (SERCA2a) odgrywa główną rolę w kurczliwości mięśnia sercowego. rolę w kurczliwości mięśnia sercowego. Fosfolamban (PLN) reguluje funkcję SERCA2a poprzez jego fosforylację Ser(16). Ponieważ zaproponowano, że reszty Ser/Thr na białkach cytoplazmatycznych i jądrowych są modyfikowane przez O-linked N-acetyloglukozaminę (O-GlcNAc), zbadaliśmy wpływ O-GlcNAcylacji na funkcję PLN w kardiomiocytach dorosłych szczurów. Badania z wykorzystaniem znakowania enzymatycznego i koimmunoprecypitacji typu dzikiego i serii mutantów PLN wykazały, że PLN była O-GlcNAcylowana, a Ser(16) PLN może być miejscem O-GlcNAcylacji. W kardiomiocytach traktowanych O-(2-acetamido-2-deoksy-D-glukopiranozylideno)amino-N-fenylokarbaminianem (PUGNAc), O-GlcNAcylacja była znacznie zwiększona w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Jednocześnie fosforylacja Ser(16) PLN była zmniejszona. W komórkach jajnika chomika chińskiego komórki jajnika chomika chińskiego, w których cDNA PLN i siRNA transferazy O-GlcNAc były współtransfekowane, Ser(16)-fosforylacja PLN była znacznie zwiększona w porównaniu do kontroli. Te same wyniki zaobserwowano w homogenatach serca szczurów z cukrzycą. szczurów z cukrzycą. W koimmunoprecypitacji PLN z SERCA2a, fizyczna interakcja między tymi dwoma białkami była zwiększona w kardiomiocytach traktowanych PUGNAc. W przeciwieństwie do w przeciwieństwie do komórek nieleczonych, aktywność SERCA2a i profile transjentów wapnia wapnia w kardiomiocytach traktowanych PUGNAc nie uległy istotnym zmianom nawet po leczeniu katecholaminą. Dane te sugerują, że PLN jest O-GlcNAcylowany w celu zahamowania jego fosforylacji, co koreluje z pogorszeniem czynności serca. z pogorszeniem funkcji serca. Może to definiować nowy mechanizm w którym regulacja SERCA2a przez PLN jest zmieniona w warunkach, w których O-GlcNAcylacja jest zwiększona, na przykład w cukrzycy. --- Istnieją wyraźne dowody na bezpośrednie regulacyjne interakcje białko-białko między fosfolambanem (PLN) a Ca2+-ATPazą retikulum sarkoplazmatycznego serca (SERCA2a) w domenach cytoplazmatycznych, ale mniej wyraźnych dowodów retikulum (SERCA2a) w domenach cytoplazmatycznych, ale istnieją mniej wyraźne dowody na interakcji regulacyjnych w domenach transmembranowych obu białek. My izoformy SERCA z sekwencją przezbłonową PLN i znakowaną epitopem transmembraną z sekwencjami transbłonowymi PLN znakowanymi epitopem w celu zbadania interakcji wewnątrzbłonowych interakcje przy braku interakcji cytoplazmatycznych. Koekspresja sekwencji sekwencji transbłonowej fosfolambanu (Met-PLN28-52) z SERCA1a, SERCA2a, i SERCA3 hamowała transport Ca2+ poprzez obniżenie pozornego powinowactwa Ca2+. Dodanie epitopu hemaglutyniny (HA) do sekwencji transbłonowej PLN (HA-PLN28-52) lub usunięcie reszt PLN 21-29 (PLN1-20-PLN30-52) "supershifted" pozorne powinowactwo Ca2+ do wartości niższych niż obserwowane z natywnego PLN bez odłączania transportu Ca2+ od hydrolizy ATP. Hamowanie przez PLN1-20-PLN30-52 lub Flag-PLN28-52 zostało odwrócone przez przeciwciało PLN lub Flag przeciwciałem Flag, wykazując, że hamowanie przez te konstrukty jest odwracalne i że konstrukty hamujące są prawidłowo zorientowane w błonie. Te wyniki sugerują, że PLN moduluje pozorne powinowactwo Ca2+ SERCA2a poprzez interakcje wewnątrzbłonowe, które są zakłócane na duże odległości i zgodnie z zakłóceniem dobrze scharakteryzowanych interakcji cytoplazmatycznych. --- Alaninowa mutageneza skaningowa aminokwasów 21-30, tworzących cytoplazmatyczną domenę Ib w fosfolambanie (PLN) ujawniła, że mutacja do Ala z Asn27, Gln29 i Asn30 skutkuje wzmocnieniem funkcji hamującej. We wcześniejszym badaniu (Kimura, Y, Kurzydlowski, K., Tada, M. i MacLennan, D. H. (1997) J. Biol. Chem. 272, 15061-15064), wzmocnienie funkcji w mutantach II domeny transmembranowej PLN było skorelowane z destabilizacją pentameru, co prowadzi do propozycji, że monomer PLN jest aktywnym gatunkiem hamującym, że dysocjacja pentameru PLN jest jednym z wyznaczników funkcji hamującej PLN i że dysocjacja pentameru PLN PLN.cardiac sarco(endo)plasmic Ca2+-ATPase isoform (SERCA2a) jest drugim determinantem. determinantą. Ponieważ każdy z nowych mutantów domeny Ib zawierał normalny stosunek pentameru do monomeru w elektroforezie w żelu SDS-poliakryloamidowym, wzrost funkcji musiał wynikać z mechanizmów innych niż destabilizacja struktury pentamerycznej. struktury pentamerycznej. Dowody na to, że mutanty domeny Ib i domeny II działają poprzez różne miejsca i różne mechanizmy różne miejsca i różne mechanizmy zostały dostarczone przez monomeryczny podwójny mutant N30A/I40A, w którym wzmocniona funkcja hamująca każdego pojedynczego mutanta była addytywna. mutanta była addytywna. Dowody na zmianę stabilności heterodimeru PLN/SERCA2a uzyskano w badaniu podwójnego mutanta N27A/N34A, w którym funkcja hamująca została odzyskana przez połączenie mutacji wzmocnienia funkcji domeny Ib z mutacją utraty funkcji domeny II. Wyniki te potwierdzają propozycję, że hamowanie SERCA2a przez PLN obejmuje, po pierwsze, depolimeryzację PLN a po drugie, tworzenie hamujących interakcji między monomerycznym PLN i SERCA2a. --- W zwierzęcych modelach wad serca typu conotruncal stwierdzono nieprawidłową wrażliwość na wapń aparatu kurczliwego i obniżony prąd wapniowy typu L zostały opisano. ATPaza Ca(2+) retikulum sarkoplazmatycznego (SR) (SERCA) jest białkiem błonowym, które katalizuje zależny od ATP transport Ca(2+). białkiem błonowym, które katalizuje zależny od ATP transport Ca(2+) z cytozolu do cytozolu do SR. Aktywność SERCA jest hamowana przez fosfolamban (PLN) i sarkolipinę (SLN), a wszystkie te białka uczestniczą w utrzymaniu prawidłowej wewnątrzkomórkowej gospodarki wapniowej. Receptory ryanodynowe (RyR) są głównymi kanałami uwalniania wapnia SR kanały uwalniania wapnia wymagane do sprzężenia pobudzenie-skurcz w mięśniach szkieletowych i sercowych. mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego. Naszym celem była ocena SERCA2a (tj. izoformy SERCA serca). SERCA), PLN, SLN i RyR2 (tj. izoformy RyR wzbogaconej w sercu) ekspresji genów w mięśniu sercowym. w sercu) w tkance mięśnia sercowego pacjentów z tetralogią Fallota. tetralogią Fallota (TOF), wadą serca typu conotruncal. Ekspresję genów genów docelowych oceniano półilościowo metodą RT-PCR przy użyciu kalsekwestryny (CASQ, gen gospodarza) RNA jako wewnętrznego standardu w przedsionkowym mięśniu sercowym 23 pacjentów pediatrycznych poddawanych chirurgicznej korekcji TOF, u 10 dopasowanych wiekowo pacjentów z ubytkiem przegrody międzykomorowej (VSD) i u 13 dzieci z ubytkiem przegrody międzyprzedsionkowej. z ubytkiem przegrody międzyprzedsionkowej (ASD). Zaobserwowaliśmy znacząco niższą ekspresję PLN i SLN u pacjentów z TOF, podczas gdy nie było różnicy między ekspresją ekspresją SERCA2a i RyR2 w TOF i VSD. Dane te sugerują złożony mechanizm mechanizm mający na celu zwiększenie wewnątrzkomórkowej rezerwy Ca(2+) u dzieci dotkniętych tetralogią tetralogią Fallota. --- Fosfolamban (PLN), homopentameryczne, integralne białko błonowe, odwracalnie hamuje aktywność sercowej sarkoplazmatycznej retikulum Ca2+-ATPazy (SERCA2a) poprzez interakcje wewnątrzbłonowe. W tym przypadku zastosowano mutagenezę skanującą alaninę sekwencji transbłonowej PLN wykorzystano do zidentyfikowania dwóch funkcjonalnych domen na przeciwległych powierzchni helisy transmembranowej. Mutacje na jednej powierzchni zmniejszają hamujące interakcje z sekwencjami transbłonowymi SERCA2a, ale mają stosunkowo niewielki wpływ na stan pentameryczny, podczas gdy mutacje w drugiej powierzchni aktywują oddziaływania hamujące i wzmacniają tworzenie monomerów. Podwójne mutanty są monomeryczne, ale utrata funkcji hamującej dominuje nad aktywacją funkcji hamującej. funkcji hamującej. Obserwacje te potwierdzają wniosek, że miejsce interakcji SERCA2a leży na helikalnej powierzchni, która nie jest zaangażowana w tworzenie pentameru. tworzenie pentameru. Cztery wysoce hamujące mutanty są skutecznie pozbawione pentameru, sugerując, że pentameryczny PLN reprezentuje mniej aktywny lub nieaktywny rezerwuar który dysocjuje w celu dostarczenia hamujących monomerycznych podjednostek PLN. Model jest przedstawiono model, w którym stopień hamowania przez PLN aktywności SERCA2a jest ostatecznie określony przez stężenie hamowanego monomeru PLN.SERCA2a kompleks heterodimeryczny. Stężenie tego zahamowanego kompleksu jest określane przez stałą dysocjacji dla pentameru PLN (który jest wrażliwy na mutacje) i stałą dysocjacji dla heterodimeru PLN/SERCA2a (który jest prawdopodobnie wrażliwy na mutacje). --- Zarówno sarkolipina (SLN), jak i fosfolamban (PLN) obniżają pozorne powinowactwo SERCA1a lub SERCA2a dla Ca(2+). Ponieważ SLN i PLN są współeksprymowane w sercu sercu, zbadano interakcje między tymi trzema białkami. Kiedy SERCA1a lub SERCA2a były koeksprymowane w komórkach HEK-293 zarówno z SLN, jak i PLN, nastąpiła superinhibicja. Zdolność SLN do zwiększania zawartości monomerów PLN monomerów odpowiada, przynajmniej częściowo, za superhamujące działanie SLN w obecności PLN. Aby ocenić rolę SLN w mięśniach szkieletowych, SLN cDNA wstrzyknięto bezpośrednio do mięśnia podeszwowego szczura i przeanalizowano charakterystykę siły. analizowano charakterystykę siły. Nadekspresja SLN spowodowała znaczące zmniejszenie zarówno szczytowej amplitudy siły szczytowej skurczu i tężca oraz maksymalnych szybkości skurczu i rozkurczu, a także oraz zwiększoną męczliwość przy powtarzanej stymulacji elektrycznej. Wychwyt Ca(2+) w homogenatach mięśni był upośledzony, co sugeruje, że nadekspresja SLN może zmniejszać magazyn Ca(2+) w retikulum sarkoplazmatycznym. SLN i PLN wydają się wiążą się z tym samym miejscem regulacyjnym w SERCA. Jednak w kompleksie trójskładnikowym PLN zajmuje miejsce regulacyjne, a SLN wiąże się z odsłoniętą stroną PLN i do SERCA.
Czy Serca2a wiąże PLN w sercu?
Tak, Serca2a wiąże PLN w sercu.