Enzym sprzęgający poliubikwitynę E2 Ubc13 jest mediatorem wrodzonych reakcji immunologicznych. reakcji. Ubc13 pośredniczy w koniugacji łańcuchów poliubikwityny związanych z keratyną (K)63 na czynnik 6 związany z receptorem TNF i IKKγ podczas aktywacji NF-κB. W przeciwieństwie do łańcuchów poliubikwityny związanych z K48, łańcuchy poliubikwityny związane z K63 funkcjonują w nieproteasomalnych procesach biologicznych. Chociaż wykazano, że Ubc13 ma kluczowe znaczenie dla sygnalizacji receptora Toll-podobnego (TLR) i receptora IL-1, to funkcja Ubc13 w naskórku nie została zbadana. Wygenerowaliśmy myszy z niedoborem Ubc13 specyficznym dla keratynocytów (Ubc13(flox/flox)K5-Cre). Przy urodzeniu, skóra myszy Ubc13(flox/flox)K5-Cre była nienormalnie błyszcząca i gładka; ponadto, myszy nie rosły. Ponadto myszy nie rosły i umierały w 2. dniu po urodzeniu. Analiza histologiczna Analiza histologiczna wykazała atrofię naskórka z apoptozą keratynocytów. Analizy immunohistochemiczne ujawniły zmniejszoną proliferację, nieprawidłowe różnicowanie i apoptozę keratynocytów w naskórku myszy Ubc13(flox/flox)K5-Cre naskórka myszy. W hodowli, wzrost keratynocytów Ubc13(flox/flox)K5-Cre był upośledzony i spontaniczny. upośledzony i dochodziło do spontanicznej śmierci komórek. Co więcej, usunięcie Ubc13 z hodowanych keratynocytów Ubc13(flox/flox) za pomocą wektora adenowirusowego niosącego rekombinazę Cre również skutkowało spontaniczną śmiercią komórek. Zatem, Ubc13 jest niezbędny dla wzrostu, różnicowania i przeżycia keratynocytów. Analizy sygnalizacji wewnątrzkomórkowej ujawniły, że indukowana przez IL-1 i TNF aktywacja aktywacja szlaków JNK, p38 i NF-κB była upośledzona w Ubc13(flox/flox)K5-Cre keratynocytów. Podsumowując, Ubc13 wydaje się być niezbędny dla integralności naskórka u myszy. --- Sugeruje się, że modyfikacja białek poprzez dodanie łańcuchów poliubikwityny (poliUb) związanych z lizyną (K)-63 (polyUb) odgrywa ważną rolę w różnych zdarzeniach komórkowych, w tym w naprawie DNA komórkowych, w tym naprawie DNA, transdukcji sygnału i endocytozie receptorów. Jednak identyfikacja takich modyfikacji w żywych komórkach jest złożona i uciążliwa. uciążliwe. Wygenerowaliśmy przeciwciało monoklonalne (mAb), które specyficznie rozpoznaje poliUb związane z K63, ale nie żadne inne związane z izopeptydem (K6, K11, K27, K29, K33 lub K48) poliUb lub monoubikwitynę. Wykazaliśmy czułość i specyficzność tej mAb specyficznej dla K63Ub do wykrywania białek zmodyfikowanych K63Ub w lizatach komórkowych lizatach komórkowych metodą Western blotting i w komórkach metodą immunofluorescencji oraz TRAF6 i MEKK1 zmodyfikowanych K63Ub in vitro i ex vivo. To unikalne mAb będzie ułatwi analizę polubikwitylacji związanej z K63 ex vivo i przedstawia strategię generowania podobnych odczynników przeciwko innym formom poliUb. --- Ligazy E3 RING (naprawdę interesujący nowy gen) i U-box łączą enzymy sprzęgające ubikwitynę E2 sprzęgające ubikwitynę i substraty, aby umożliwić przeniesienie ubikwityny do reszty lizynowej na substracie lub do jednej z siedmiu reszt lizynowych ubikwityny w celu wydłużenia łańcucha poliubikwityny. Różne łańcuchy poliubikwityny mają różne funkcje. Łańcuchy związane z lizyną (48) kierują białka do degradacji proteasomalnej. degradacji, a łańcuchy z wiązaniem Lys(63) funkcjonują w transdukcji sygnału, endocytozie i naprawie DNA. Z tego powodu topologia łańcucha musi być ściśle ściśle kontrolowana. Wykorzystując ligazę U-box E3 CHIP [C-terminus łańcucha Hsc (heat-shock cognate) 70-interacting protein] i ligazy RING E3 TRAF6 (czynnik związany z receptorem nowotworowym 6) z ligazą E2s Ubc13 (enzym sprzęgający ubikwitynę 13)-Uev1a (ubikwityna E2 wariant 1a) i UbcH5a, w w niniejszym badaniu wykazaliśmy, że Ubc13-Uev1a wspiera tworzenie wolnych Lys(63)-powiązane łańcuchy poliubikwityny nie są przyłączone do CHIP lub TRAF6, podczas gdy UbcH5a katalizuje tworzenie łańcuchów poliubikwityny związanych z CHIP i TRAF6 które nie są specyficzne dla żadnej reszty lizynowej ubikwityny. Dlatego też do ubikwitynacji substratu i wydłużania łańcuchów poliubikwityny o określonej topologii wydają się być o określonej topologii wydają się wzajemnie wykluczać. Tak więc dwie różne klasy E2 mogą być wymagane do przyłączenia łańcucha poliubikwityny o określonej topologii do substratu: właściwości jednego E2 są zaprojektowane do mono-ubikwityny substratu bez lub z niewielką specyficznością dla akceptorowej reszty lizyny akceptorowej reszty lizyny, podczas gdy właściwości drugiego E2 są dostosowane do wydłużania łańcucha poliubikwityny przy użyciu określonej reszty lizyny ubikwityny. ubikwityny.
Czy ubikwitynacja białek związana z K-63 jest powiązana z degradacją proteasomalną?
Ubikwitynacja jest najlepiej znana ze swojej roli w kierowaniu białek do degradacji przez proteasom, ale dowody na nieproteolityczne funkcje ubikwityny również szybko się gromadzą. Jednym z przykładów regulacyjnej, a nie proteolitycznej funkcji ubikwityny jest badanie białek związanych z receptorem czynnika martwicy nowotworów (TNF) (TRAF), które działają jako ligazy ubikwityny w celu syntezy łańcuchów poliubikwityny związanych z lizyną 63 (K(63)) w celu pośredniczenia w aktywacji kinazy białkowej poprzez mechanizm niezależny od proteasomu. Niedawno wykazano, że niektóre białka TRAF, takie jak TRAF2 i TRAF3, odgrywają pozytywną rolę w kanonicznym szlaku, który aktywuje czynnik jądrowy kappaB (NF-kappaB) poprzez kinazę IkappaB beta (IKKbeta), ale negatywną rolę w niekanonicznym szlaku, który aktywuje NF-kappaB poprzez IKKalfa. Te przeciwstawne role białek TRAF mogą być związane z ich zdolnością do syntezy różnych form łańcuchów poliubikwitynowych. Rzeczywiście, białko RIP oddziałujące z TRAF2 może pośredniczyć w aktywacji IKK, gdy jest modyfikowane przez łańcuchy poliubikwitynowe K(63), ale jest kierowane do degradacji przez proteasom, gdy jest polikwitynowane K(48) przez inhibitor NF-kappaB A20. Tak więc łańcuchy ubikwityny są dynamicznymi przełącznikami, które mogą wpływać na wyniki sygnalizacji na bardzo różne sposoby. W przeciwieństwie do łańcuchów poliubikwityny związanych z K48, łańcuchy poliubikwityny związane z K63 funkcjonują w nieproteasomalnych procesach biologicznych.