Dynamina, GTPaza wymagana do endocytozy za pośrednictwem klatryny, jest rekrutowana do w dwóch następujących po sobie fazach. Pierwsza jest związana z dojrzewaniem dojrzewaniem pokrytego dołu; drugi, z rozszczepieniem szyjki błony pokrytej dołu. Używając komórek edytowanych genowo, które wyrażają dynaminę2-EGFP zamiast dynaminy2 i obrazowanie TIRF na żywo z czułością pojedynczej cząsteczki EGFP i wysoką rozdzielczością czasową rozdzielczość, wykryliśmy przybycie dynaminy do powlekanych dołów i zdefiniowaliśmy dimery dynaminy jako preferowaną jednostkę montażową. Wykorzystaliśmy również mikroskopię konfokalną mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem skalibrowaną przez wykrywanie pojedynczych cząsteczek EGFP w celu określenia liczby dynamin rekrutowanych do powlekanych dołków. Duża powlekanych dołów rekrutuje od 26 do 40 dynamin (między 1 i 1,5 spiralnych zwojów kołnierza dynaminowego) podczas fazy rekrutacji związanej z rozszczepieniem szyjki; 26 wystarcza do uwolnienia powlekanego pęcherzyka w komórkach częściowo pozbawionych dynaminy przez interferencję RNA. Omawiamy, w jaki sposób te wyniki ograniczają modele mechanizmu rozszczepiania błony za pośrednictwem dynaminy. --- Informacje o autorze: (1)Zakład Chemii Biomolekularnej, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, Wydział Botaniki, Wydział Genetyki, Wydział Chemii, Graduate Program in Biophysics, Wydział Matematyki, Wydział Biochemii, Instytut Wirusologii Molekularnej, Instytut Medyczny Howarda Hughesa i Morgridge Institute for Research, Uniwersytet Wisconsin. Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706 Wydział Chemii Biomolekularnej, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, Department of Botany, Department of Genetics, Department of Chemistry, Graduate Program in Biophysics, Department of Biophysics. Program in Biophysics, Wydział Matematyki, Wydział Biochemii, Instytut Wirusologii Molekularnej, Instytut Medyczny Howarda Hughesa i Morgridge Institute for Research, Uniwersytet Wisconsin. Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706 Wydział Chemii Biomolekularnej, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, Department of Botany, Department of Genetics, Department of Chemistry, Graduate Program in Biophysics, Department of Biophysics. Program in Biophysics, Wydział Matematyki, Wydział Biochemii, Instytut Wirusologii Molekularnej, Instytut Medyczny Howarda Hughesa i Morgridge Institute for Research, Uniwersytet Wisconsin. Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706. (2) Wydział Chemii Biomolekularnej, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, Department of Botany, Department of Genetics, Department of Chemistry, Graduate Program in Biophysics, Wydział Matematyki, Wydział Biochemii, Instytut Wirusologii Molekularnej, Instytut Medyczny Howarda Hughesa i Morgridge Institute for Research, Uniwersytet Wisconsin. Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706. (3)Wydział Chemii Biomolekularnej, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, Department of Botany, Department of Genetics, Department of Chemistry, Graduate Program in Biophysics, Wydział Matematyki, Wydział Biochemii, Instytut Wirusologii Molekularnej, Instytut Medyczny Howarda Hughesa i Morgridge Institute for Research, Uniwersytet Wisconsin. Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706 Wydział Chemii Biomolekularnej, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, Department of Botany, Department of Genetics, Department of Chemistry, Graduate Program in Biophysics, Department of Biophysics. Program in Biophysics, Wydział Matematyki, Wydział Biochemii, Instytut Wirusologii Molekularnej, Instytut Medyczny Howarda Hughesa i Morgridge Institute for Research, Uniwersytet Wisconsin. Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706. (4) Wydział Chemii Biomolekularnej, Szkoła Medycyny i Zdrowia Publicznego, Department of Botany, Department of Genetics, Department of Chemistry, Graduate Program in Biophysics, Wydział Matematyki, Wydział Biochemii, Instytut Wirusologii Molekularnej, Instytut Medyczny Howarda Hughesa i Morgridge Institute for Research, Uniwersytet Wisconsin. Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706 audhya@wisc.edu. --- Syncytialny wirus oddechowy jest jednoniciowym wirusem RNA z rodziny Paramyxoviridae, który preferencyjnie gromadzi się i pączkuje z wierzchołkowej powierzchni spolaryzowanych komórek nabłonka. powierzchni spolaryzowanych komórek nabłonkowych, tworząc nitkowate struktury, które zawierają zarówno białka wirusowe, jak i genomowy RNA. Ostatnie badania opisały zarówno czynniki wirusowe, jak i gospodarza, które biorą udział w montażu rybonukleoprotein i przemieszczanie białek wirusowych na powierzchnię komórki. Na powierzchni komórki białka wirusowe białka wirusowe łączą się w filamenty, które prawdopodobnie wymagają interakcji między między białkami wirusowymi, białkami gospodarza i błoną komórkową. Na koniec musi nastąpić rozszczepienie błony aby uwolnić wolny wirion. W tym artykule zostanie dokonany przegląd opisujący mechanizmy napędzające składanie i pączkowanie syncytialnego wirusa oddechowego. i pączkowanie. --- Szlak sortowania ciał wielopęcherzykowych (MVB) jest mechanizmem dostarczania białek transmembranowych do światła lizosomu w celu ich degradacji. białek transmembranowych do światła lizosomu w celu ich degradacji. ESCRT-III jest ostatnim kompleksem w szlaku, który gromadzi się na endosomach i wykonuje rozszczepienie błony pęcherzyków wewnątrzświatłowych. Ponadto, białka tego kompleksu są zaangażowane w inne topologicznie podobne procesy, takie jak cytokineza, wydostawanie się wirusów i autofagia. Tutaj pokazujemy, że kinaza białkowa CK2α jest zaangażowana w fosforylację podjednostek ESCRT-III CHMP3 i CHMP2B, jak również VPS4B/SKD1, ATPazy, która pośredniczy w demontażu ESCRT-III. Ta fosforylacja jest obserwowana zarówno in vitro, jak i w komórkach. Chociaż nie obserwujemy rekrutacji CK2α do endosomów, wykazujemy lokalizację CK2α do midbodies podczas cytokinezy. Fosfomimetyczne i niefosforylujące mutanty białek ESCRT-III mogą nadal wiązać endosomy i lokalizować się do midbodies, wskazując, że CK2α nie reguluje lokalizacji ESCRT-III. Na koniec przeanalizowaliśmy dwie funkcje komórkowe, w których CHMP3, CHMP2B i VPS4 są znane jako zaangażowane, degradację naskórkowego czynnika wzrostu i rozszczepienie cytokinetyczne. My wykazać, że pierwsza z nich jest upośledzona przez downregulację CK2α, podczas gdy nie ma to wpływu. Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że CK2α reguluje funkcję białek ESCRT-III w sortowaniu MVB. --- Cytokineza u ssaków przebiega poprzez zwężenie pierścienia aktomiozyny i bruzdkowanie. w wyniku czego powstaje mostek środkowy łączący dwie komórki potomne. komórki potomne. W centrum ciała środkowego znajduje się ciało Flemminga, gęsty pierścień białkowy białkowy pierścień otaczający zazębiające się końce antyrównoległych macierzy mikrotubul. Rozszczepienie, końcowy etap cytokinezy, zachodzi w pobliżu ciała Flemminga. ciała Flemminga. Rozszczepieniem rządzi szereg szeroko zakrojonych procesów: inicjacja i stabilizacja strefy rozszczepienia, a następnie odcięcie mikrotubuli i rozszczepienie błony - w tym ostatnim pośredniczy kompleks sortowania endosomalnego wymagany do transportu (ESCRT) do transportu (ESCRT). Kluczowym celem biologów komórkowych i rozwojowych jest zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw rozszczepienia, i jak przebiega koordynacja czasowo-przestrzenna tych zdarzeń z poprzednimi etapami podziału komórki. podziałów komórkowych. Ten artykuł skupi się na funkcji i dynamice białek i dynamice białek ESCRT w rozszczepieniu i dokona przeglądu ostatnich prac, które które zaczęły badać, w jaki sposób te złożone zespoły białek są regulowane przez maszynerię cyklu komórkowego. przez maszynerię cyklu komórkowego. --- TŁO: Dynamin 2 (Dyn2) jest GTPazą o masie ~100 kDa, która gromadzi się wokół szyjek powstających pęcherzyków endocytarnych i pęcherzyków Golgiego i katalizuje rozszczepienie błony. Wykazano, że mutacje w Dyn2, które powodują miopatię centrojądrową (CNM) stabilizują polimery Dyn2 przed demontażem zależnym od GTP in vitro. Precyzyjnie Regulacja czasowa montażu i demontażu jest uważana za krytyczną dla funkcji Dyn2 w pęcherzykowaniu błony, a mutacje CNM zakłócają tę regulację regulację, przesuwając równowagę w kierunku stanu złożonego. METODY: W tym badaniu wykorzystujemy dwie metody spektroskopii fluorescencji fluorescencji (FFS) aby pokazać, że zmutowana forma CNM Dyn2 ma również większą skłonność do samoorganizacji w cytozolu. do samoorganizacji w cytozolu i na błonie plazmatycznej żywych komórek. WYNIKI: Wyniki uzyskane przy użyciu analizy jasności wskazują, że niezmontowany Dyn2 typu dzikiego jest głównie tetrameryczny w cytozolu, chociaż obserwuje się różne obserwuje się różne gatunki oligomeryczne, w zależności od stężenia wyrażonego białka białka. W przeciwieństwie do tego, mutant R369W zidentyfikowany u pacjentów z CNM tworzy oligomery wyższego rzędu w stężeniach powyżej 1μM. Badanie Dyn2-R369W przez całkowitą wewnętrzną fluorescencję odbiciową (TIRF) FFS ujawnia, że ten mutant tworzy większe i bardziej stabilne struktury zawierające klatrynę na błonie plazmatycznej niż Dyn2 typu dzikiego. WNIOSKI I OGÓLNE ZNACZENIE: Obserwacje te mogą wyjaśniać defekty w w transporcie błonowym zgłaszane w komórkach pacjentów z CNM i w układach heterologicznych wyrażających mutanty Dyn2 związane z CNM. --- Właściwości fizyczne szyjek błon są istotne w procesie pęcherzykowania, który odgrywa istotną rolę w fizjologii komórek. który odgrywa istotną rolę w fizjologii komórkowej. Ponieważ promień szyjki szyjki jest, ogólnie rzecz biorąc, skończony, rozszczepienie błony i wynikające z tego uszczypnięcie pęcherzyka może wystąpić tylko wtedy, gdy jest on zwężony, aby umożliwić niezbędną reformację topologiczną błony. topologiczną reformację błony. Tutaj badamy, w prostej jednofazowej lipidowej pęcherzyku, w jaki sposób siły zewnętrzne mogą promować zwężenie szyjki nie tylko poprzez bezpośrednie ściskanie szyjki, ale także, wbrew intuicji, przez rozszerzanie w odległych miejscach. lokalizacjach. Wyniki te zapewniają nowe spojrzenie na rolę odgrywaną przez polimeryzację aktyny w procesie endocytozy.
Co to jest rozszczepienie błony?
Rozszczepienie błony jest ostatnim krokiem w celu zakończenia procesu pączkowania, ściskając pęcherzyk. Aby promować rozszczepienie błony, białka dynaminowe polimeryzują, owijają się i zwężają błonę. Rozszczepienie błon biologicznych jest ułatwione przez różne kompleksy białkowe, które wiążą i manipulują dwuwarstwami lipidowymi.