Narzędzia i techniki stosowane w jednokomórkowej analizie uszkodzeń DNA u drożdży Saccharomyces cerevisiae są ograniczone. W tym badaniu zmodyfikowaliśmy test elektroforezy elektroforezy żelowej, a mianowicie test komety pojedynczego chromosomu oparty na analizie pęknięć DNA na poziomie chromosomalnym. analizie pęknięć DNA, na poziomie chromosomalnym. Badaliśmy największy drożdżowy XII, który zawiera locus rDNA, i zbadaliśmy jego niestabilność przy użyciu niestabilność przy użyciu punktów kontrolnych cyklu komórkowego, uszkodzeń DNA i antyoksydacyjnych i antyoksydacyjnych, a także szczepów mutantów drożdży o regulowanej długości życia. Ponadto porównaliśmy niestabilność chromosomu XII ze zmiennością sygnałów fluorescencji jąderkowego rDNA sygnałów fluorescencji. Trzy szczepy z delecją pojedynczego genu, komórki pozbawione jednoniciowej endonukleazy DNA, Rad1p; zależnej od NAD(+) deacetylazy histonów, Sir2p; i syntetazy gamma glutamylocysteiny, Gsh1p, były bardziej podatne na niestabilność chromosomu XII w porównaniu do odpowiednich szczepów typu dzikiego, wskazując, że mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA, wyciszanie chromatyny i homeostaza redoks mogą przyczyniać się do stabilności genomu. Wzrost liczby pęknięć DNA było skorelowane z dużą zmiennością poziomów nukleolarnego rDNA w Δrad1, podczas gdy chromosom XII pozostał nienaruszony, a zmienność fluktuacji nukleolarnego rDNA była niska. nukleolarnych sygnałów fluorescencji rDNA zaobserwowano w mutancie długowieczności Δtor1. Podsumowując, test kometowy pojedynczego chromosomu może być z powodzeniem stosowany do badania uszkodzeń DNA na poziomie chromosomalnym, które mogą zostać przeoczone przy użyciu całej analizy całej populacji na pęknięciach DNA z separacją PFGE. --- Opracowaliśmy metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania struktury zarówno naturalnych chromosomów, jak i małych sztucznych chromosomów podczas cyklu mitotycznego pączkujących drożdży. Nasze wyniki sugerują, że parowanie chromatyd siostrzanych: (a) zachodzi w pobliżu centromeru i w wielu miejscach wzdłuż ramienia chromosomu, jak zaobserwowano w innych komórkach eukariotycznych; (b) jest utrzymywane przy braku katenacji między siostrzanymi cząsteczkami DNA; oraz (c) jest niezależny od dużych bloków powtarzalnego DNA powszechnie związanego z heterochromatyną. heterochromatyną. Kondensacja unikalnego regionu chromosomu XVI i wysoce powtarzalnego wysoce repetytywnego klastra rybosomalnego DNA (rDNA) z chromosomu XII. badane w pączkujących drożdżach. Chromosomy interfazowe uległy 80-krotnej kondensacji w stosunku do DNA formy B, podobnie do tego, co zaobserwowano u innych eukariontów, sugerując, że struktura chromosomów interfazowych może być zachowana wśród eukariontów. Podczas gdy dodatkowa kondensacja chromosomów pączkujących drożdży była zaobserwowano podczas mitozy, poziom kondensacji był mniejszy niż obserwowany dla ludzkich chromosomów mitotycznych. Na większości etapów cyklu komórkowego, zarówno unikalne jak i zarówno unikalne, jak i powtarzalne sekwencje ulegały kondensacji lub dekondensacji. Jednak w komórkach zatrzymanych w późnej mitozie (M) przez mutację cdc15, unikalny DNA wydawał się zdekondensowany, podczas gdy powtarzalny region rDNA wydawał się skondensowany, co sugeruje, że stan kondensacji oddzielnych regionów genomu może być regulowany inaczej. w różny sposób. Zdolność do monitorowania parowania i kondensacji siostrzanych chromatyd chromatyd w pączkujących drożdżach powinna ułatwić analizę molekularną tych procesów, a także zapewnić dwa nowe punkty orientacyjne do oceny funkcji ważnych regulatorów cyklu komórkowego, takich jak kinazy p34 i cykliny. Wreszcie nasza metoda FISH zapewnia nowe narzędzie do analizy centromerów, telomerów i ekspresji genów w pączkujących drożdżach. ekspresji genów u pączkujących drożdży.
W którym chromosomie drożdży znajduje się klaster rDNA?
Kontekst chromosomu XII jest ważny dla funkcji rDNA u drożdży