Zastosowaliśmy macierz Illumina Human Methylation450K do przeprowadzenia analizy metylacji DNA w skali genomowej analizę metylacji DNA w rozdzielczości pojedynczego miejsca w neuronalnych i nieneuronalnych (głównie glejowych) jądrach oddzielonych od kory oczodołowo-czołowej pośmiertnie ludzkiego mózgu. Wyniki zostały zweryfikowane przy użyciu sekwencjonowania bisulfitowego sekwencjonowanie dwusiarczynowe. Zidentyfikowaliśmy tysiące miejsc różnie metylowanych (DM) między komórkami neuronalnymi i nieneuronalnymi. Miejsca DM były zubożone w obrębie promotorów zawierających wyspy CpG, ale wzbogacone w przewidywanych wzmacniaczach. Klasyfikacja miejsc DM na te niedemetylowane w neuronach (typ neuronalny) i te niedemetylowane w komórkach nieneuronalnych (typ neuronalny). neuronalnych) i tych niedemetylowanych w komórkach nieneuronalnych (typ glejowy), w połączeniu z że metylacja w obrębie elementów kontrolnych zazwyczaj ujemnie koreluje z ekspresją genów, dało duże zestawy przewidywanych genów specyficznych dla neuronów i niespecyficznych dla neuronów. Te zestawy przewidywanych genów były w doskonałej z dostępnymi bezpośrednimi pomiarami ekspresji genów u ludzi i myszy. myszy. Znaleźliśmy również odrębny zestaw wzorców metylacji DNA, które były unikalne dla komórek neuronalnych. dla komórek neuronalnych. W szczególności, metylacja różnicowa typu neuronalnego była nadreprezentowana na brzegach wysp CpG, wzbogacona w obrębie ciał genów, ale nie w regionach regionach międzygenowych i preferencyjnie zawierała motywy wiążące dla odrębnego zestawu czynników transkrypcyjnych, w tym czynników zależnych od aktywności neuronów. zależnych od aktywności neuronów. Wreszcie, metylacja nie-CpG była znacznie bardziej rozpowszechniona w neuronach niż w komórkach nieneuronalnych. --- Niedawne opisy wzorców metylacji CpG w komórkach ssaków w całym genomie zidentyfikowały wiele różnicowo metylowanych regionów (DMR) zlokalizowanych na wyspach CpG "brzegach". Feinberg, Daley i współpracownicy donoszą teraz w Nature Genetics, że rekonfiguracja tych DMR występuje podczas indukowanego przeprogramowania (Doi et al., 2009). --- Od 25 lat wiadomo, że zmiany w metylacji DNA (DNAm) występują w nowotworach. (DNAm), w tym hipometylacja onkogenów i hipermetylacja genów supresorowych nowotworów. hipermetylacja genów supresorowych nowotworów. Jednak większość badań nad metylacją nowotworów zakładała, że funkcjonalnie ważne DNAm będzie występować w promotorach promotorach i że większość zmian DNAm w raku występuje w wyspach CpG. Tutaj pokazujemy, że większość zmian metylacji w raku okrężnicy występuje nie w promotorach, a także nie w wyspach CpG, ale w sekwencjach odległych do 2 kb, które nazywamy "brzegi wysp CpG". Metylacja brzegów wysp CpG była silnie związana z ekspresją genów ekspresją genów i była wysoce konserwatywna u myszy, różnicując typy tkanek niezależnie od gatunku pochodzenia. Występowało znaczne nakładanie się (45-65%) lokalizacji metylacji lokalizacji zmian metylacji związanych z rakiem okrężnicy z tymi, które tkanek, z hipermetylacją wzbogaconą bliżej powiązanych wysp CpG, i powiązanych wysp CpG, a hipometylacją wzbogaconą dalej od powiązanej wyspy CpG i przypominające normalne tkanki inne niż okrężnica. Zatem zmiany metylacji w nowotworach znajdują się w miejscach, które różnią się normalnie w różnicowaniu tkanek, zgodnie z epigenetycznym modelem progenitorowym raka, który proponuje, że zmiany epigenetyczne wpływające na różnicowanie specyficzne dla tkanki są dominującym mechanizmem, za pomocą którego zmiany epigenetyczne powodują raka. --- Immunoprecypitacja metylowanego DNA, a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (MeDIP-seq) może potencjalnie identyfikować zmiany w metylacji DNA ważne dla rozwoju raka. w rozwoju nowotworów. Aby zrozumieć rolę modulacji epigenetycznej w rozwoju ostrej białaczki szpikowej (AML) zastosowaliśmy MeDIP-seq do DNA 12 pacjentów z AML i 4 prawidłowych szpików kostnych. Analiza ta ujawniła związane z białaczką różnie metylowane regiony, które obejmowały geny promotory genów, ciała genów, wyspy CpG i brzegi wysp CpG. Dwa geny (SPHKAP i DPP6) ze znacząco zmetylowanymi promotorami były interesujące i dalsza analiza ich ekspresji wykazała, że są one represjonowane w AML. Wykazaliśmy również wykazaliśmy również znaczną specyficzność podtypu cytogenetycznego w metylomie wpływając na różne cechy genomu. Znacznie różniące się wzorce hipometylacji niektórych powtarzających się elementów były związane z podtypami cytogenetycznymi. podtypami cytogenetycznymi. Wzory metylacji członków rodziny SINE ściśle grupowały wszystkich pacjentów z białaczką ze wzbogaceniem powtórzeń Alu o wysoką gęstością CpG (P<0,0001). Udało nam się wykazać znaczącą odwrotną korelację między wewnątrzgenową metylacją sekwencji powtórzeń międzysekwencyjnych a ekspresją genów. z SINE wykazującymi najsilniejszą odwrotną korelację (R(2) = 0,7). My wnioskujemy, że zmiany w metylacji DNA, które towarzyszą rozwojowi AML wpływają nie tylko na promotory, ale także na cechy genomowe niebędące promotorami. cechy, ze znaczną demetylacją niektórych międzysplotowych powtórzeń DNA jest związana z podtypami cytogenetycznymi AML. Dane MeDIP-seq zostały przy użyciu pirosekwencjonowania bisulfitowego i macierzy Infinium. --- TŁO: Dominujący model regulacji ekspresji genów poprzez metylację DNA jest odwrotnym związkiem, w którym zwiększona metylacja powoduje obniżony poziom ekspresji genów. Jednak ostatnie badania sugerują, że związek między zmiennością genetyczną, metylacją DNA i ekspresją jest bardziej bardziej złożony. WYNIKI: Systemowe podejścia genetyczne do badania związków między ekspresją genów i metylacją zostały wykorzystane do znalezienia zarówno negatywnych, jak i pozytywnych powiązań między tymi poziomami. Ważona sieć korelacji korelacji ujawniła, że i) zarówno transkryptom, jak i metylom są zorganizowane w modułach, ii) moduły koekspresji generalnie nie są zachowane w danych metylacji i odwrotnie. metylacji i odwrotnie, oraz iii) istnieją wysoce znaczące korelacje między modułami koekspresji i metylacji, co sugeruje istnienie czynników wpływających na ekspresję i metylację. czynników, które wpływają na ekspresję i metylację różnych modułów (tj. efekty trans na poziomie modułów). efekty na poziomie modułów). Zaobserwowaliśmy, że sondy metylacyjne związane z ekspresją w cis były częściej zlokalizowane poza wyspami CpG, podczas gdy specyficzność dla brzegów wysp CpG była obecna, gdy metylacja, związana z ekspresją, znajdowała się pod lokalną kontrolą genetyczną. Analiza strukturalna analiza oparta na modelu równań strukturalnych wykazała silne wsparcie w szczególności dla tradycyjnego modelu przyczynowego, w którym ekspresja genów jest regulowana przez zmienność genetyczną genetyczną poprzez metylację DNA zamiast ekspresji genów wpływającej na poziomy metylacji DNA. poziomy metylacji DNA. WNIOSKI: Nasze wyniki zapewniają nowy wgląd w złożone mechanizmy między markerami genetycznymi, mechanizmami epigenetycznymi i ekspresją genów. Znajdujemy silne wsparcie dla klasycznego modelu wariantów genetycznych regulujących metylację, która z kolei reguluje ekspresję genów. Ponadto pokazujemy, że, chociaż moduły metylacji i ekspresji różnią się, są one wysoce skorelowane. --- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) pochodzą z przeprogramowania epigenetycznego, ale ich wzorce metylacji DNA nie zostały jeszcze przeanalizowane w skali całego genomu. skali. Tutaj stwierdzamy znaczną hipermetylację i hipometylację wysp cytozyna-fosforan-guanina (CpG) w dziewięciu ludzkich liniach komórkowych iPS w porównaniu do w porównaniu do ich rodzicielskich fibroblastów. Różnicowo metylowane regiony (DMRs) w przeprogramowanych komórkach (oznaczone jako R-DMRs) były znacząco wzbogacone w specyficznych dla tkanek (T-DMRs; 2,6-krotnie, P < 10(-4)) i specyficznych dla nowotworów (C-DMRs; 3,6-krotnie, P < 10(-4)). Warto zauważyć, że chociaż komórki iPS pochodzą z fibroblastów, ich R-DMR mogą rozróżniać między normalnymi komórkami mózgu, wątroby i śledziony oraz między komórkami raka okrężnicy i normalnymi komórkami okrężnicy. Tak więc, wiele DMR jest jest szeroko zaangażowanych w różnicowanie tkanek, przeprogramowanie epigenetyczne i raka. Zaobserwowaliśmy kolokalizację hipometylowanych R-DMR z hipermetylowanymi C-DMR i dwuwartościowymi znacznikami chromatyny oraz kolokalizację hipermetylowanych R-DMR z hipometylowanymi C-DMR i brakiem dwuwartościowych znaczników, co sugeruje dwa mechanizmy przeprogramowania epigenetycznego w komórkach iPS i nowotworach. --- Modyfikacje epigenetyczne muszą leżeć u podstaw różnicowania specyficznego dla danej linii, ponieważ terminalnie zróżnicowane komórki wyrażają geny specyficzne dla tkanki, ale ich sekwencja DNA sekwencja DNA pozostaje niezmieniona. Hematopoeza zapewnia dobrze zdefiniowany model do badania modyfikacje epigenetyczne podczas podejmowania decyzji o losie komórki, ponieważ multipotencjalne progenitory (MPP) różnicują się w stopniowo ograniczone progenitory szpikowe lub limfoidalne. lub limfoidalne. Chociaż metylacja DNA ma kluczowe znaczenie dla różnicowania szpikowego i limfoidalnego różnicowania, jak wykazano przez stronniczość mieloerytroidalną u hipomorfów Dnmt1, kompleksowa mapa metylacji DNA progenitorów hematopoetycznych lub dowolnego linii multipotencjalnej/oligopotencjalnej, nie istnieje. Tutaj zbadaliśmy 4,6 miliona miejsc CpG w całym genomie dla MPP, wspólnych progenitorów limfoidalnych (CLP), wspólnych progenitorów szpikowych (CMP), progenitorów granulocytów/makrofagów (GMP), i progenitorów tymocytów (DN1, DN2, DN3). Wyraźna plastyczność epigenetyczna towarzyszyła zarówno limfoidalnej, jak i mieloidalnej restrykcji. Zaangażowanie szpikowe obejmowało mniej globalnej metylacji DNA niż zaangażowanie limfoidalne, wspierane funkcjonalnie przez przekrzywienie szpikowe progenitorów po leczeniu inhibitorem metylotransferazy DNA inhibitorem metylotransferazy DNA. Zróżnicowana metylacja DNA silniej korelowała z ekspresją genów silniej na brzegach wysp CpG niż na wyspach CpG. Wiele przykładów genów i szlaków, o których wcześniej nie wiedziano, że są zaangażowane w wybór między różnicowaniem limfoidalnym/mieloidalnym zostało zidentyfikowanych, takich jak Arl4c i Jdp2. Kilka czynników transkrypcyjnych, w tym Meis1, uległo metylacji i wyciszeniu podczas różnicowania, co wskazuje na ich rolę w utrzymaniu stanu niezróżnicowanego. Dodatkowo, epigenetyczna modyfikacja modyfikatorów epigenomu wydaje się być ważna w różnicowaniu hematopoetycznym. Nasze wyniki bezpośrednio pokazują że modulacja metylacji DNA zachodzi podczas różnicowania specyficznego dla linii i definiuje kompleksową mapę metylacji i zmian transkrypcyjnych, które towarzyszą różnicowaniu szpiku. zmian transkrypcyjnych, które towarzyszą decyzjom o losie szpikowym i limfoidalnym. --- Znana jest nieprawidłowa metylacja DNA wysp CpG, brzegów wysp CpG i pierwszych eksonów. odgrywa kluczową rolę w zmienionych wzorcach ekspresji genów we wszystkich ludzkich nowotworach. nowotworach. Do tej pory systematyczne badania nad wpływem metylacji DNA na ekspresję genów ekspresję genów przy użyciu danych o wysokiej rozdzielczości. W tym badaniu przeprowadziliśmy zintegrowaną analizę danych sekwencjonowania MethylCap i danych mikromacierzy ekspresji genów Affymetrix dla 30 linii komórkowych raka piersi reprezentujących różne fenotypy nowotworów piersi. reprezentujących różne fenotypy nowotworów piersi. Ponieważ dobrze rozwinięte metody zintegrowanej analizy analizy obecnie nie istnieją, stworzyliśmy serię czterech różnych metod analizy metod analizy. Od strony obliczeniowej, naszym celem jest opracowanie protokołów analizy danych metylomu dla zintegrowanej analizy danych metylacji DNA i ekspresji genów w skali genomu. i ekspresji genów w skali genomu. Po stronie biologii nowotworów przedstawiamy wyniki kompleksowej analizy metylomu w skali całego genomu dla różnicowo metylowanych regionów i ich potencjalnego wpływu na ekspresję genów w 30 liniach komórkowych raka piersi linii komórkowych raka piersi reprezentujących trzy fenotypy molekularne: luminalny, podstawny A i podstawny B. Nasza zintegrowana analiza wykazała, że rak piersi może mieć wpływ na ekspresję genów. Nasza zintegrowana analiza pokazuje, że status metylacji różnych regionów genomowych może odgrywać rolę w ekspresji genów. różnych regionów genomowych może odgrywać kluczową rolę w ustalaniu wzorców transkrypcyjnych wzorców transkrypcji w podtypach molekularnych ludzkiego raka piersi.
Jak definiowane są brzegi wysp CpG?
"Brzegi" wysp CpG są zdefiniowane jako regiony genomu odległe do 2 kb od znanych wysp CpG. Zróżnicowana metylacja DNA silniej koreluje z ekspresją genów na brzegach wysp CpG niż na wyspach CpG.