CELE: Celem tego badania była ocena wpływu PDX-1 (homeobox-1 dla trzustki i dwunastnicy), NeuroD1 (różnicowanie neurogenne-1) i MafA (Vafafa). dwunastnicy homeobox-1), NeuroD1 (neurogenne różnicowanie-1) i MafA (V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A) w różnicowaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do komórek produkujących insulinę i do zbadać to nowe podejście do terapii transplantacji komórek w cukrzycy typu 1 u myszy. myszy. METODY: iPSC zostały zainfekowane adenowirusem (Ad-Mouse PDX-1-IRES-GFP, Ad-Mouse NeuroD1-IRES-GFP i Ad-Mouse Mafa-IRES-GFP), a następnie różnicowane w komórki produkujące insulinę in vitro. komórki produkujące insulinę in vitro. RT-PCR zastosowano do wykrycia ekspresji genu insuliny ekspresji insuliny, immunofluorescencję w celu identyfikacji białka insuliny i mysią insulinę test immunoenzymatyczny (ELISA) do oceny ilości insuliny w różnych stężeniach glukozy. insuliny w różnych stężeniach glukozy. Komórki produkujące insulinę zostały przeszczepiono do miąższu wątroby myszy z cukrzycą. Immunohistochemia, dootrzewnowy test tolerancji glukozy (IPGTT) i stężenie glukozy we krwi na czczo (FBG) w celu oceny funkcji komórek produkujących insulinę. WYNIKI: Biosynteza i wydzielanie insuliny były indukowane w iPSC i komórki produkujące insulinę reagowały na glukozę w sposób zależny od dawki. Ekspresja genów zmodyfikowanych trzech genów ciałek embrioidalnych (EB) była podobna do do mysiej linii komórek β trzustki MIN6. Transplantacja komórek produkujących insulinę do myszy z cukrzycą typu I spowodowało odwrócenie hiperglikemii. WNIOSKI: Komórki produkujące insulinę uzyskane z EBs zmodyfikowanych trzema genami EB mogą być wykorzystywane jako komórki macierzyste w inżynierii tkankowej i mogą stanowić strategię zastępowania komórek do produkcji komórek β w leczeniu cukrzycy typu 1 cukrzycy typu 1. --- Przełomowe odkrycie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przez Shinya Yamanakę zmieniło biologię regeneracyjną. Wcześniej wgląd w patogenezę patogenezę przewlekłych chorób człowieka były utrudnione przez niedostępność próbek pobranych od pacjentów. Jednak naukowcy są teraz w stanie przekształcić fibroblasty pacjentów w iPSC i różnicować je w typy komórek związane z chorobą. Zdolność ta otwiera nowe możliwości badania patogenezy chorób i projektowania nowych metod leczenia. W niniejszym przeglądzie podkreślamy zastosowania ludzkich iPSCs do odkrywania przyczyn i patologicznych konsekwencji cukrzycy i zespołów metabolicznych. i zespołów metabolicznych, chorób wieloczynnikowych, których etiologie były trudna do rozwikłania przy użyciu tradycyjnych metodologii. --- Trzustka powstaje z progenitorów wykazujących ekspresję Pdx1 w rozwijającej się endodermie przedniego jelita we wczesnym zarodku. Ekspresja Ngn3 i NeuroD1 zobowiązuje komórki do do tworzenia trzustki endokrynnej i różnicowania się w podgrupy komórek, które tworzą wysepki Langerhansa. Komórki β w wysepkach transkrybują gen kodujący a następnie przetwarzają i wydzielają insulinę w odpowiedzi na krążącą glukozę. krążącą glukozę. Dysfunkcja komórek β ma poważne konsekwencje metaboliczne prowadząc do hiperglikemii i cukrzycy. Komórki β są niszczone przez reakcję autoimmunologiczną w cukrzycy typu 1 (T1D). Cukrzyca typu 2 (T2D), charakteryzuje się upośledzoną funkcją komórek β i zmniejszoną wrażliwością na insulinę, stanowi 90% wszystkich pacjentów z cukrzycą. Przeszczep wysepek jest obiecującym obiecującym sposobem leczenia T1D. Pluripotencjalne komórki macierzyste stanowią nieograniczone źródło komórek do generowania nowych komórek β dla pacjentów z T1D. Ponadto, wyprowadzenie indukowanych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) od pacjentów umożliwia "chorobę w naczyniu" dla autologicznej terapii zastępczej komórkami, modelowania chorób i badań przesiewowych leków dla obu typów cukrzycy. Niniejszy przegląd przedstawia najważniejsze etapy rozwoju trzustki trzustki oraz potencjalne zastosowania komórek macierzystych w terapii regeneracji komórek w leczeniu cukrzycy. --- Insulinooporność ma kluczowe znaczenie dla cukrzycy i zespołu metabolicznego. Aby zdefiniować konsekwencje konsekwencje genetycznej insulinooporności różnią się od tych wtórnych do różnicowania komórkowego lub regulacji in vivo, wygenerowaliśmy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) od osób z mutacjami receptora insuliny i osób z mutacjami receptora insuliny i osób kontrolnych w odpowiednim wieku oraz zbadaliśmy sygnalizację insulinową i ekspresję genów ekspresję genów w porównaniu z fibroblastami, z których zostały uzyskane. iPSCs od pacjentów z genetyczną insulinoopornością wykazywały zmienioną sygnalizację sygnalizację insulinową, podobną do tej obserwowanej w oryginalnych fibroblastach. Stymulowana insuliną ekspresja natychmiastowych wczesnych genów i proliferacja były również silnie zmniejszone w insulinoopornych iPSC. Globalna analiza ekspresji genów ujawniła znaczne różnice zarówno w insulinoopornych iPSC, jak i odpowiadających im fibroblastach w porównaniu z kontrolnymi iPSC i fibroblastami. Wzorce ekspresji genów u pacjentów z genetyczną opornością na insulinę były szczególnie różne w dwóch typach komórek, wskazując na zależność nie tylko od aktywności receptora, ale także od kontekstu komórkowego zmutowanego receptora insuliny. W ten sposób iPSC zapewniają nowe podejście podejście do określenia skutków genetycznie uwarunkowanej insulinooporności. Niniejsze badanie pokazuje, że wpływ insulinooporności na ekspresję genów jest modyfikowane przez kontekst komórkowy i stan różnicowania. Co więcej, zmieniona i insulinooporność mogą modyfikować proliferację i funkcję pluripotencjalnych komórek macierzystych. funkcję populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych. --- Ludzkie antygeny zgodności tkankowej są dość heterogeniczne i sprzyjają odrzucenie przeszczepionej tkanki. Ostatnie postępy w badaniach nad komórkami macierzystymi umożliwiają wykorzystanie własnych komórek macierzystych pacjenta do przeszczepu, są bardzo ważne, ponieważ można uniknąć odrzucenia. W szczególności, japońska grupa Yamanaka w Japonii dała nową nadzieję pacjentom cierpiącym na nieuleczalne choroby, gdy opracowała indukowane mysie pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) w 2006 roku i ludzkie iPSC w 2007 roku. Podczas gdy embrionalne komórki macierzyste (ESC) pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej i są w hodowli przez LIF, iPSC pochodzą z płodowych lub dorosłych komórek somatycznych. płodu lub dorosłych komórek somatycznych. Dzięki zastosowaniu technologii iPSC, dorosłe komórki somatyczne mogą rozwinąć stan pluripotencjalny. Jedną z zalet stosowania iPSC zamiast ESC w medycynie regeneracyjnej jest to, że (teoretycznie) w medycynie regeneracyjnej jest to, że (teoretycznie) można uniknąć odrzucenia immunologicznego, chociaż istnieje pewna debata na temat odrzucenia immunologicznego własnych iPSC pacjenta. Wiele chorób występuje u pacjentów w podeszłym wieku. Aby wykorzystać medycynę regeneracyjną regeneracyjnej u osób starszych, ważne jest wykazanie, że iPSC mogą być rzeczywiście generowane od starszych pacjentów. Ostatnie odkrycia wykazały, że iPSC mogą być można uzyskać od starszych myszy i starszych ludzi. Te iPSC mogą różnicować się do komórki ze wszystkich trzech warstw zarodkowych. Nie wiadomo jednak, czy iPSC pochodzące od starzejących się myszy lub ludzi wykazują wczesne starzenie. Przed klinicznym zastosowaniem iPSCs, kwestie związane ze zmiennością liczby kopii, nowotworowością i immunogennością muszą być immunogennością. Szczególnie ważne jest, aby naukowcom udało się iPSC, które zróżnicowały się do komórek somatycznych związanych z konkretnymi chorobami osób starszych, w tym miażdżycą, cukrzycą, chorobą Alzheimera i chorobą Parkinsona. i chorobą Parkinsona. Wysiłki te ułatwią stosowanie spersonalizowanej terapii przeszczepiania komórek macierzystych w przypadku obecnie nieuleczalnych chorób. --- Udane przeprogramowanie komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) (iPSC) zapoczątkowało nową erę medycyny regeneracyjnej. Kilka badań dotyczących iPSCs potwierdziły ich ogromne możliwości i potencjał do wykorzystania w terapii komórkowej i modelowaniu chorób. terapii komórkowej i modelowaniu chorób. Należy jednak przezwyciężyć kilka niedociągnięć zanim będą mogły zostać wykorzystane w terapii klinicznej. Badanie losów iPSC i ich iPSC in vivo, a ostatecznie wykonalność ich zastosowania w terapii transplantacji komórek wymaga bardziej dogłębnych badań na żywych osobnikach. Jedno alternatywnym podejściem do przeprogramowania jest bezpośrednia konwersja terminalnie konwersję terminalnie zróżnicowanej komórki somatycznej jednego typu w inną, bez różnicowania do stanu pluripotencjalnego. Ta bezpośrednia strategia jest znacznie szybsza, ma potencjał do generowania wzbogaconej populacji określonego podtypu komórek. wzbogaconej populacji określonego podtypu komórek, a tym samym ma szerokie implikacje w regeneracyjnej terapii komórkowej. Tutaj dokonujemy przeglądu ostatnich postępów w technologii iPSC i podsumowujemy badania nad generowaniem specyficznych dla pacjenta specyficznych dla pacjenta typów komórek przy użyciu bezpośredniej konwersji linii. W szczególności skupiamy się na zakresie zastosowania tego podejścia w autologicznej terapii komórkowej w leczeniu ran cukrzycowych. --- WPROWADZENIE: Wstępne kondycjonowanie anestetyczne chroni kardiomiocyty przed uszkodzeniem wywołanym stresem oksydacyjnym. stresem oksydacyjnym, ale jest nieskuteczne u pacjentów z cukrzycą. Aby zająć się rolą hiperglikemii w niezdolności osób z cukrzycą do do kondycjonowania wstępnego, wykorzystaliśmy ludzkie kardiomiocyty zróżnicowane z indukowanych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wygenerowanych od pacjentów z cukrzycą typu 2 lub bez niej (DM-iPS). typu 2 (odpowiednio DM-iPSC- i N-iPSC-CMs) w celu zbadania skuteczności w różnych warunkach glukozy (5, 11 i 25 mM). METODY: Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste indukowano w celu wytworzenia kardiomiocytów poprzez ukierunkowane różnicowanie. W późniejszych badaniach kardiomiocyty były zidentyfikowane przez genetyczne znakowanie wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym napędzanym przez promotor specyficzny dla serca. Żywotność komórek analizowano za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej test dehydrogenazy mleczanowej. Mikroskopia konfokalna została wykorzystana do pomiaru otwarcia mitochondrialnych porów przejścia przepuszczalności i mitochondrialnej adenozyny 5'-trifosforan-wrażliwe kanały potasowe. WYNIKI: Wstępne kondycjonowanie izofluranem (0,5 mM) chroniło N-iPSC- i DM-iPSC-CMs przed indukowanym stresem oksydacyjnym uwalnianiem dehydrogenazy mleczanowej i mitochondriów otwarcie porów przejścia przepuszczalności w 5 mM i 11 mM glukozie. Izofluran wyzwalał mitochondrialny kanał potasowy wrażliwy na adenozyno-5'-trifosforan w N-iPSC-CMs w 5 mM i 11 mM glukozie oraz w DM-iPSC-CMs w 5 mM glukozie; 25 mM glukozy. glukozy; 25 mM glukozy zakłóciło ochronę, w której pośredniczyło znieczulenie wstępne w DM-iPSC- i N-iPSC-CMs. WNIOSKI: Otwarcie mitochondrialnych kanałów potasowych wrażliwych na adenozyno-5'-trifosforan kanałów potasowych jest zakłócone w DM-iPSC-CM w 11 mM i 25 mM glukozie i w N-iPSC-CM w 25 mM glukozie. Kardiomiocyty pochodzące od zdrowych dawców i pacjentów pacjentów z konkretną chorobą, taką jak cukrzyca w tym badaniu, otwierają możliwości w badaniu patologii związanych z genotypem i fenotypem w modelu modelu związanym z człowiekiem. --- Przeszczep wysepek jest uważany za ostateczną opcję leczenia cukrzycy typu cukrzycy typu I. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs) stworzyły możliwość że specyficzne dla pacjenta komórki wydzielające insulinę mogą pochodzić z komórek komórek somatycznych poprzez przeprogramowanie losów komórek. Jednak obecne protokoły w większości opierają się na wykorzystaniu kilku cytokin i inhibitorów do kierowania różnicowania w kierunku trzustki. Biorąc pod uwagę wysoki koszt produkcji tych rekombinowanych białek, podejście to jest zaporowe dla zastosowań klinicznych. klinicznych. Wiedząc, że mikroRNA (miRNA) są kluczowymi graczami na różnych etapach rozwoju trzustki. rozwoju trzustki, przedstawiamy nowatorską i opłacalną strategię, w której nadekspresja w której nadekspresja miR-375 promuje różnicowanie trzustki w hiPSCs przy braku jakiegokolwiek innego stymulatora. Użyliśmy polikistronicznego wektora wirusowego wyrażający Sox2, Klf4, c-Myc i Oct4 do napędzania hiPSCs z ludzkich fibroblastów napletka. fibroblastów ludzkiego napletka. Utworzone hiPSC są podobne do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w wielu aspektach, w tym wielu aspektach, w tym morfologii, pasażowaniu, markerach powierzchni i pluripotencji, i ekspresję genów. W celu indukcji różnicowania, miR-375 był lentiwirusowo nadeksprymowany w tych hiPSCs. Ocena morfologiczna, immunocytochemia, i analiza ekspresji genów markerów wysepek potwierdziły, że komórki podobne do wysepek zostały uzyskane w komórkach transdukowanych miR-375 w porównaniu do komórek kontrolnych. Nasze zróżnicowane klastry wydzielały insulinę w sposób zależny od glukozy, wykazując funkcjonalność in vitro. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że miRNA mogą być idealnymi substytutami do indukowania różnicowania trzustki w hiPSCs. Ta praca zapewnia nowe podejście do badania roli miRNA w specyfikacji trzustki trzustki i zwiększyć wykonalność wykorzystania specyficznych dla pacjenta iPSCs w terapii zastępczej komórek beta komórek beta w leczeniu cukrzycy typu I. --- Ludzkie antygeny zgodności tkankowej są dość heterogeniczne i sprzyjają odrzucenie przeszczepionej tkanki. Ostatnie postępy w badaniach nad komórkami macierzystymi umożliwiają wykorzystanie własnych komórek macierzystych pacjenta do przeszczepu, są bardzo ważne, ponieważ można uniknąć odrzucenia. W szczególności, japońska grupa Yamanaka w Japonii dała nową nadzieję pacjentom cierpiącym na nieuleczalne choroby, gdy opracowała indukowane mysie pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) w 2006 roku i ludzkie iPSC w 2007 roku. Podczas gdy embrionalne komórki macierzyste (ESC) pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej i są w hodowli przez LIF, iPSC pochodzą z płodowych lub dorosłych komórek somatycznych. płodu lub dorosłych komórek somatycznych. Dzięki zastosowaniu technologii iPSC, dorosłe komórki somatyczne mogą rozwinąć stan pluripotencjalny. Jedną z zalet stosowania iPSC zamiast ESC w medycynie regeneracyjnej jest to, że (teoretycznie) w medycynie regeneracyjnej jest to, że (teoretycznie) można uniknąć odrzucenia immunologicznego, chociaż istnieje pewna debata na temat odrzucenia immunologicznego własnych iPSC pacjenta. Wiele chorób występuje u pacjentów w podeszłym wieku. Aby wykorzystać medycynę regeneracyjną regeneracyjnej u osób starszych, ważne jest wykazanie, że iPSC mogą być rzeczywiście generowane od starszych pacjentów. Ostatnie odkrycia wykazały, że iPSC mogą być można uzyskać od starszych myszy i starszych ludzi. Te iPSC mogą różnicować się do komórki ze wszystkich trzech warstw zarodkowych. Nie wiadomo jednak, czy iPSC pochodzące od starzejących się myszy lub ludzi wykazują wczesne starzenie. Przed klinicznym zastosowaniem iPSCs, kwestie związane ze zmiennością liczby kopii, nowotworowością i immunogennością muszą być immunogennością. Szczególnie ważne jest, aby naukowcom udało się iPSC, które zróżnicowały się do komórek somatycznych związanych z konkretnymi chorobami osób starszych, w tym miażdżycą, cukrzycą, chorobą Alzheimera i chorobą Parkinsona. i chorobą Parkinsona. Wysiłki te ułatwią stosowanie spersonalizowanej terapii przeszczepiania komórek macierzystych w przypadku obecnie nieuleczalnych chorób. --- Pluripotencjalne komórki macierzyste mają potencjalne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej dla cukrzycy. Różnicowanie komórek macierzystych w komórki produkujące insulinę zostało przy użyciu różnych protokołów. Jednak zarówno skuteczność metody, jak i siła zróżnicowanych komórek są niewystarczające. Wykazano, że ciśnienie parcjalne tlenu wykazano, że reguluje rozwój embrionalny kilku narządów, w tym trzustki. kilku narządów, w tym komórek β trzustki. W tym badaniu próbowaliśmy ustalić skuteczną metodę różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych komórek macierzystych (iPSC) w komórki produkujące insulinę poprzez hodowlę w warunkach wysokiej zawartości tlenu (O2). Leczenie wysokim poziomem O2 we wczesnym etapie różnicowania różnicowania zwiększyło liczbę komórek insulinododatnich w końcowej fazie różnicowania. różnicowania. Stwierdziliśmy, że wysoki poziom O2 tłumił ekspresję genu Hes1 zależnego od Notch Hes1 i zwiększał ekspresję Ngn3 na etapie progenitorów trzustki. progenitorów trzustki. Efekt ten był spowodowany hamowaniem poziomu białka czynnika indukowanego hipoksją-1α . Co więcej, wysoki poziom O2 aktywował sygnalizację Wnt. Optymalne specyficzne dla etapu leczenie w warunkach wysokiego O2 spowodowało znaczny wzrost produkcji insuliny zarówno w mysich embrionalnych komórkach macierzystych, jak i ludzkich iPSC iPSCs i dało populacje zawierające do 10% komórek C-peptydododatnich w ludzkich iPSCs. w ludzkich iPSC. Wyniki te sugerują, że hodowla w warunkach wysokiego O2 na określonym etapie jest przydatne do wydajnego generowania komórek produkujących insulinę. produkujących insulinę. --- Cukrzyca jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą o postępującej częstości występowania na całym świecie. na całym świecie. Do tej pory patogeneza cukrzycy jest daleka od zrozumienia, a nie ma dostępnego stałego leczenia cukrzycy. Jednym z obiecujących podejść do zrozumienia i leczenia cukrzycy jest wykorzystanie pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), w tym embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i indukowanych PCS (iPSC). ESC i iPSC mają duży potencjał do różnicowania się we wszystkie typy komórek i mają wysoką zdolność do różnicowania się w komórki β wydzielające insulinę. Uzyskanie PSCs genetycznie identycznych z pacjentem cierpiącym na cukrzycę od dawna było marzeniem od dawna marzeniem dla modelowania choroby in vitro i ostatecznie terapii komórkowej. terapii komórkowej. Przez kilka lat transfer jądrowy komórek somatycznych (SCNT) był metodą metodą z wyboru do generowania linii ESC specyficznych dla pacjenta. Jednak technologia ta napotyka wątpliwości natury etycznej i praktycznej. Co ciekawe, niedawno opracowana technologia iPSC przezwycięża główne problemy innych typów komórek macierzystych, w tym brak obaw etycznych i brak ryzyka odrzucenia immunologicznego. Kilka linii iPSC zostało zostało ostatnio wygenerowanych od pacjentów z różnymi typami cukrzycy, a większość z tych linii komórkowych jest w stanie z tych linii komórkowych jest w stanie różnicować się w komórki β wydzielające insulinę. W W tym przeglądzie podsumowujemy ostatnie postępy w różnicowaniu trzustkowych komórek β z PSC i opisujemy wyzwania związane z ich klinicznym zastosowaniem w terapii komórkowej cukrzycy. cukrzycy. Ponadto omawiamy potencjalne zastosowanie PSCs specyficznych dla pacjenta jako modelu in vitro, zapewniając nowy wgląd w patofizjologię cukrzycy. cukrzycy.
Jak można wykorzystać iPSC w leczeniu cukrzycy?
Jednym z obiecujących podejść do leczenia cukrzycy jest wykorzystanie indukowanych PCS (iPSC) i różnicowanie ich w komórki β wydzielające insulinę. Indukcję różnicowania iPSC do komórek wydzielających insulinę można osiągnąć na kilka sposobów, np. za pomocą mikroRNA lub transfekcji adenowirusowej wybranymi genami.