Choroby poliglutaminowe, w tym choroba Huntingtona, oznaczają grupę neurodegeneracyjnych charakteryzujących się obecnością toksycznej ekspansji poliglutaminy w określonych białkach docelowych. Wykorzystując modele komórkowe i mysie modeli komórkowych i mysich wykazaliśmy, że rozszerzona poliglutamina prowadzi do aktywacji kinazy stresu JNK i czynnika transkrypcyjnego AP-1, które są zaangażowane w śmierć neuronów. śmierci neuronów. Stres wywołany ekspansją poliglutaminy miał wspólne cechy ze stresem uszkadzającym białka, takim jak szok termiczny, ponieważ aktywacja JNK wiązała się z hamowaniem aktywności fosfatazy JNK. Rzeczywiście, rozszerzona poliglutamina upośledzała rozpuszczalność fosfatazy JNK o podwójnej specyficzności M3/6. Agregacja M3/6 przez ekspansję poliglutaminy wydawała się być pośrednia, ponieważ M3/6 nie była rekrutowana do inkluzji poliglutaminy. Białko szoku cieplnego białko HSP70, o którym wiadomo, że hamuje JNK podczas odpowiedzi na szok cieplny, hamowało agregację M3/6 za pośrednictwem poliglutaminy i aktywację JNK. Co ciekawe, poziomy HSP70 były regulowane w dół przez ekspansję poliglutaminy. Sugerujemy, że redukcja HSP70 przez rozszerzoną poliglutaminę jest zaangażowana w agregacji i hamowaniu M3/6 oraz w aktywacji JNK i AP-1. --- Sygnały stresowe wywołują szeroką gamę odpowiedzi komórkowych, z których wiele zbiegają się na fosforylacji kinaz JNK i p38, których aktywacja została dobrze scharakteryzowana. Sposób, w jaki te kinazy są wyłączane przez nie jest dobrze poznany. Tutaj opisujemy, jak różne stresy komórkowe stresy komórkowe wpływają w różny sposób na stabilność i aktywność aktywującej JNK fosfatazy treoninowo-tyrozynowej M3/6 o podwójnej specyficzności. Zarówno anizomycyna, jak i arsenin aktywują szlak JNK, a ponadto inaktywują fosfatazę M3/6 fosfatazę. Jednakże, podczas gdy leczenie komórek anizomycyną prowadzi do degradacji białka M3/6 degradacji, arsenin wydaje się bezpośrednio inaktywować M3/6. Wyniki te mogą mieć wpływ na mechanizm promowania nowotworów przez arsen. --- Specyficzne wyniki aktywacji szlaku kinazy c-Jun N-końcowej (JNK) krytycznie zależą od intensywności i czasu trwania transmisji sygnału. Fosfatazy o podwójnej specyficzności (DUSP) odgrywają bardzo ważną rolę w tych zdarzeniach modulując zakres fosforylacji i aktywacji JNK, a tym samym regulując odpowiedzi komórkowe na stres. M3/6 (DUSP8) jest jedną z fosfataz białkowych o podwójnej specyficzności z wyraźną specyficznością wobec JNK. Wykazano, że wykazano, że sama M3/6 jest fosforylowana przez JNK po stymulacji arsenianem. arsenitem, ale rola tej fosforylacji nie została zbadana. W W tym badaniu zmapowaliśmy miejsca fosforylacji indukowane przez JNK na M3/6 przy użyciu spektrometrii mas spektrometrii mas. Zidentyfikowano fosforylowane reszty Ser 515, Thr 518 i Ser 520 zidentyfikowano i zastosowano mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, aby zbadać ich rolę. Po stymulacji arsenitem, M3/6 zmutowany w tych miejscach wykazywał zmniejszoną fosforylację w porównaniu do fosforylację w porównaniu do białka typu dzikiego. Nie zaobserwowano różnicy w pod względem aktywności fosfatazy enzymu in vitro, jego specyficzności substratowej wobec izoform JNK, jego interakcji z JNK i rodziną rusztowań białkami oddziałującymi z JNK (JIP), jego stabilnością lub lokalizacją subkomórkową. Co ciekawe, ekspresja mutantów fosforylacji M3/6 opóźniała opóźniała przebieg czasowy fosforylacji i aktywacji JNK przez arsenin. Proponujemy, aby fosforylacja fosfatazy M3/6 przez JNK w odpowiedzi na bodźce stresowe powoduje osłabienie aktywności fosfatazy i przyspieszenie aktywacji JNK aktywacji JNK. --- N-końcowa kinaza c-Jun (JNK) ulega całkowitej inaktywacji w następstwie intensywna aktywacja wywołana niedokrwieniem mózgu i reperfuzją u szczurów hipokampach szczurów. Niniejsze badanie bada mechanizm molekularny leżący u podstaw defosforylacji i inaktywacji JNK i inaktywacji wywołanej przez fosforany o podwójnej specyficzności po niedokrwieniu mózgu. Wyniki ujawniły regulację w górę fosfatazy o podwójnej specyficzności M3/6 (DUSP8) po 4 godzinach reperfuzji w hipokampach szczurów. hipokampach szczurów. Towarzyszyła temu defosforylacja JNK. Inhibitor M3/6 anizomycyna zwiększała aktywność JNK po reperfuzji niedokrwiennej, co sugeruje, że reperfuzji, co sugeruje, że M3/6 jest ściśle związany z inaktywacją JNK po niedokrwieniu mózgu. Niedokrwienie mózgu wywołało również wzrost poziomu białka szoku cieplnego (HSP70). białka szoku cieplnego (HSP70), które jest zaangażowane w regulację w górę rozpuszczalnych cytoplazmatycznego M3/6. Zahamowanie HSP70 za pomocą kwercetyny spowodowało zwiększenie aktywności JNK poprzez zmniejszenie rozpuszczalności cytoplazmatycznej M3/6. Wyniki Wyniki obecnego badania sugerują, że M3/6 jest zaangażowany w inaktywacji JNK w odpowiedzi na niedokrwienie mózgu, które wymaga molekularnego opiekuna HSP70, aby ułatwić korektę defektów fałdowania. --- Leczenie komórek białaczkowych 12-myristanem 13-octanu forbolu (PMA) indukuje krótkotrwałą fosforylację i aktywację kinazy białkowej aktywowanej stresem. krótkotrwałą fosforylację i aktywację kinazy białkowej aktywowanej stresem (SAPK) i różnicowanie komórkowe. Aby zbadać, czy szybka dezaktywacja SAPK wynika z defosforylacji przez fosfatazy o podwójnej specyficzności fosfataz (DSP), zbadaliśmy regulację DSP hVH5 i jego mysiego ortologa ortologa M3/6 w komórkach białaczki ludzkiej K562. Leczenie PMA szybko indukowało transkrypty hVH5 w tych komórkach, a indukowana ekspresja M3/6 całkowicie hamowała fosforylację stymulowaną stymulowana przez PMA fosforylacja SAPK, sugerując pętlę sprzężenia zwrotnego do kontroli SAPK. Wykorzystując zarówno stabilne linie komórkowe, jak i przejściową transfekcję wykazaliśmy, że aktywacja SAPK szybko stymulowała fosforylację M3/6. Fosforylacja ta nie regulowała okresu półtrwania całkowitego komórkowego M3/6. hVH5 i M3/6 dzielą ze wszystkimi sekwencjonowanymi DSP ssaków motyw aminokwasowy, XILPXLXL, znajdujący się około 80 aminokwasów od miejsca aktywnego. Sekwencja hVH5-M3/6 sekwencja, RILPHLYL, wykazuje znaczną homologię z miejscem wiązania SAPK białka białka c-Jun, zwanym domeną delta. Motyw ten został uznany za ważny dla funkcji DSP, ponieważ delecja RILPHLYL hamuje pośredniczoną przez SAPK fosforylację M3/6, a delecja tej sekwencji lub mutacja części LYL blokuje zdolność tej fosfatazy do defosforylacji SAPK. --- Kaskady kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK) są zaangażowane w regulację proliferacji komórkowej, różnicowania, przeżycia, apoptozy, a także w reakcjach zapalnych. odpowiedzi zapalnych. Intensywność i czas trwania sygnału zostały uznane za kluczowe parametry określające wydajność sygnalizacji MAPK. Fosfatazy odgrywają szczególnie ważną rolę w tym zakresie, ściśle kontrolując fosforylację i aktywację MAPK fosforylację i aktywację. M3/6 (DUSP8) jest fosfatazą o podwójnej specyficzności zaangażowaną w defosforylację i inaktywację JNK oraz, w mniejszym stopniu, p38 MAPK. w mniejszym stopniu, p38 MAPK i znajduje się w kompleksie z tymi kinazami, wraz z innymi składnikami szlaku składnikami szlaku, utrzymywanymi razem przez białka rusztowania. Rodzina JNK składa się z z trzech genów, dając początek co najmniej dziesięciu różnym wariantom splicingu. Niektóre Funkcjonalne różnice między tymi produktami genowymi zostały wykazane, ale mechanizmy molekularne i role poszczególnych wariantów splicingowych są wciąż nie do końca poznane. są wciąż nie do końca poznane. Zbadaliśmy interakcję M3/6 z izoformami JNK, a także białkami rusztowania z rodziny białek oddziałujących z JNK (JIP), w celu wyjaśnienia udziału M3/6 w regulacji różnych sygnałów JNK. różnych modułów sygnalizacyjnych JNK. M3/6 wykazywał silniejsze wiązanie z JNK1β i JNK2α, co znalazło odzwierciedlenie w wyższej aktywności enzymatycznej wobec JNK2α2 w porównaniu do JNK1α1 in vitro. Po aktywacji szlaku przez narażenie komórek na arsenit, interakcja M3/6 z JNK1α i JNK3 była zwiększona, podczas gdy ta z JNK1β lub JNK2α zmniejszyła się. Modulacja wiązania stwierdzono, że jest niezależna od fosforylacji M3/6 za pośrednictwem JNK. Ponadto leczenie arsenitem spowodowało indukowaną rekrutację M3/6 do kompleksów rusztowania białka oddziałującego z JNK 3 (JIP3), podczas gdy jego interakcja z JIP1 lub JIP2 była konstytutywna. Przedstawione dane sugerują specyficzną dla izoformy rolę fosfatazy M3/6 i dynamiczne ukierunkowanie M3/6 na różne kompleksy sygnalizacyjne zawierające kompleksów sygnałowych zawierających JNK. --- Białka rusztowania JNK wiążą JNK i wcześniejsze kinazy, aby aktywować podzbiory JNK i lokalizują aktywowaną JNK w określonych miejscach subkomórkowych. Wcześniej wykazaliśmy, że fosfatazy o podwójnej specyficzności (DSP) MKP7 i M3/6 wiążą białko oddziałujące z JNK-1 (JIP-1) i inaktywują związany podzbiór JNK (1). Adaptor beta-arrestin 2 receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) jest jest również rusztowaniem JNK3. Wiąże się on z kinazami ASK1 i MKK4 i sprzęga się z nimi. receptora angiotensyny II AT1aR z aktywacją cytoplazmatycznej puli JNK3. cytoplazmatycznej puli JNK3. Tutaj donosimy, że MKP7 wiąże również beta-arrestynę 2 poprzez aminokwasy 394-443 MKP7. kwasy 394-443 MKP7, ten sam region, który oddziałuje z JIP-1. Ten region MKP7 oddziałuje z beta-arrestiną 2 w centralnym regionie w pobliżu domeny wiążącej JNK domeny wiążącej JNK. MKP7 defosforyluje JNK3 związaną z beta-arrestyną 2, albo po aktywacji przez nadekspresję ASK1 lub po stymulacji AT1aR. Początkowa stymulacja AT1aR powoduje szybką (w ciągu 5 minut) dysocjację MKP7 od beta-arrestyny 2. Następnie MKP7 ponownie wiąże się z beta-arrestyną 2 na pęcherzykach endocytarnych 30-60 minut po początkowej aktywacji. pęcherzykach 30-60 min po początkowej stymulacji receptora. Ta dynamiczna interakcja między fosfatazą a rusztowaniem umożliwia transdukcję sygnału poprzez moduł który wiąże zarówno pozytywne, jak i negatywne regulatory. --- Komórki reagują na stresy, takie jak szok osmotyczny i szok termiczny, aktywując kinazy białkowe aktywowane stresem (SAPK), w tym c-Jun N-końcowa kinaza (JNK) [1]. Aktywacja JNK wymaga fosforylacji reszt treoniny i tyrozyny w motywie pętli aktywacyjnej TPY [2, 3] i może być odwrócona przez usunięcie jednej z grup fosforanowych. Liczne fosfatazy JNK, w tym fosfatazy o podwójnej specyficzności [4, 5]. Wiele bodźców aktywuje JNK poprzez zwiększenie szybkości jej fosforylacji; jednak defosforylacja JNK jest hamowana w komórkach po szoku termicznym [6], co sugeruje, że fosfataza(y) fosfataza(y) JNK jest inaktywowana. M3/6 jest fosfatazą o podwójnej specyficzności selektywną dla JNK [7, 8]. Wcześniej wyraziliśmy M3/6 w mysiej linii komórek szpiku kostnego mysiej linii komórkowej szpiku kostnego BAF3 w celu wykazania, że aktywacja JNK przez IL-3 jest niezbędna dla przeżycia i proliferacji komórek [9]. Tutaj donosimy, że M3/6 dysocjuje od JNK i pojawia się w nierozpuszczalnej frakcji po szoku cieplnym. Dane te identyfikują M3/6 jako fosfatazę JNK, która jest inaktywowana przez szok cieplny i zapewnia molekularny mechanizm aktywacji JNK przez szok cieplny. --- N-końcowa kinaza c-Jun (JNK) z grupy kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (MAPK) jest aktywowana przez plejotropowe sygnały, w tym stresy środowiskowe. (MAPK) są aktywowane przez sygnały plejotropowe, w tym stresy środowiskowe, czynniki wzrostu i hormony. Podzbiór JNK może wiązać się z różnymi białkami rusztowania białka, które wiążą również kinazy wyższego szczebla szlaku JNK, umożliwiając sekwencyjną aktywację kinaz w module sygnalizacyjnym. aktywację kinazy w obrębie modułu sygnalizacyjnego. Białko oddziałujące z JNK-1 (JIP-1) specyficznie wiąże JNK, kinazę MAP 7 i członków rodziny MLK. członków rodziny MLK i jest niezbędne do aktywacji JNK za pośrednictwem stresu w neuronach. neuronach. Tutaj donosimy, że JIP-1 wiąże również fosfatazy o podwójnej specyficzności MKP7 i M3/6 poprzez region niezależny od domeny wiążącej JNK. C-końcowy region region MKP7, homologiczny do M3/6, ale nie innych DSP, jest wymagany do interakcji z JIP-1. Kiedy MKP7 wiąże się z JIP-1, zmniejsza aktywację JNK prowadząc do zmniejszonej fosforylacji celu JNK c-Jun. Wyniki te wskazują, że białko rusztowania JIP-1 moduluje sygnalizację JNK poprzez asocjację z kinazami białkowymi i fosfatazami białkowymi, które są ukierunkowane na JNK.
Czy białko M3/6 jest fosfatazą o podwójnej specyficzności?
M3/6 (DUSP8) jest fosfatazą o podwójnej specyficzności zaangażowaną w defosforylację i inaktywację JNK oraz, w mniejszym stopniu, p38 MAPK.