Kalsekwestryna (CSQ) jest białkiem magazynującym Ca(2+), które oddziałuje z triadyną (TRN), receptorem ryanodyny (RyR) i junktyną (JUN), tworząc makromolekularny tetrameryczny kompleks sygnalizacyjny Ca(2+) w sarkoplazmatycznym retikulum retikulum (SR). Specyficzna dla serca nadekspresja CSQ u myszy transgenicznych (TG(CSQ)) była związana z niewydolnością serca, osłabieniem uwalniania SR Ca(2+), i obniżeniem poziomu powiązanych białek SR, np. TRN. W związku z tym przetestowaliśmy, czy koekspresja CSQ i TRN w sercach myszy (TG(CxT)) może być korzystne dla upośledzonej wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca(2+) i kurczliwości funkcji skurczowej. Rzeczywiście, obniżone wewnątrzkomórkowe stężenie Ca(2+) ([Ca](i)) w miocytach TG(CSQ) zostało znormalizowane przez koekspresję w miocytach TG(CxT) miocytów. Efekt ten był związany ze zmianami w ekspresji sercowych białek regulatorowych białek regulatorowych Ca(2+). Na przykład, poziom białka kanału Ca(2+) typu L Ca(v)1.2 był wyższy w TG(CxT) w porównaniu z TG(CSQ). Sarco(endo)plasmic retikulum Ca(2+)-ATPazy 2a (SERCA2a) była zmniejszona w TG(CxT) w porównaniu z z TG(CSQ), podczas gdy ekspresja JUN i wiązanie [(3)H]ryanodyny były niższe w zarówno w TG(CxT), jak i TG(CSQ) w porównaniu z sercami typu dzikiego. W wyniku tych zmiany ekspresji, ładunek SR Ca(2+) był wyższy zarówno w miocytach TG (CxT), jak i TG (CSQ) miocytach. W przeciwieństwie do poprawy komórkowego Ca(2+), przejściowa koekspresja koekspresja CSQ i TRN skutkowała zmniejszoną przeżywalnością, zwiększonym włóknieniem mięśnia sercowego i zwiększone zwłóknienie serca i zmniejszoną podstawową kurczliwość w cewnikowanych myszy, preparatach serca roboczego i izolowanych miocytach. Pomiary echokardiograficzne i pomiary hemodynamiczne ujawniły obniżoną wydajność serca po izoproterenolu w TG(CxT) w porównaniu z TG(CSQ). Nasze wyniki sugerują że koekspresja CSQ i TRN doprowadziła do normalizacji uwalniania SR Ca(2+) w porównaniu z myszami TG(CSQ), ale obniżonej funkcji skurczowej i przeżywalności przeżywalność prawdopodobnie z powodu zwłóknienia serca, niższej ekspresji SERCA2a i osłabioną odpowiedź na stymulację β-adrenergiczną. Zatem stosunek TRN do CSQ jest krytycznym modulatorem krytycznym modulatorem sygnalizacji SR Ca(2+). --- CEL: Junktyna jest głównym białkiem transmembranowym w retikulum sarkoplazmatycznym mięśnia sercowego. retikulum sarkoplazmatycznym serca, które tworzy czwartorzędowy kompleks z receptorem ryanodyny (kanałem uwalniającym Ca(2+)), triadyną i kalsekwestryną. METODY: Aby lepiej zrozumieć rolę junktyny w sprzężeniu pobudzenie-skurcz w sercu, wygenerowaliśmy transgeniczne myszy z ukierunkowaną nadekspresją junktyny do serca myszy, wykorzystując promotor alfa-MHC do napędzania białka ekspresji białka. WYNIKI: Białko uległo 10-krotnej nadekspresji w komorach myszy i nadekspresji towarzyszył przerost serca (19%). Poziomy dwóch innych łączących białek SR, receptora ryanodyny i triadyny, zostały zmniejszone odpowiednio o 32% i 23%. Jednakże, wiązanie [3H]ryanodyny i poziomy ekspresji kalsekwestryny, fosfolambanu i SERCA2a pozostały niezmienione. Kardiomiocyty myszy z nadekspresją junktyny wykazywały upośledzoną relaksację: Przemiany Ca(2+) zanikały wolniej, a wydłużenie komórek było wydłużone. Izolowane elektrycznie stymulowane mięśnie brodawkowate z serc z nadekspresją junktyny serca wykazywały przedłużoną relaksację mechaniczną, a parametry echokardiograficzne echokardiograficzne parametry relaksacji były wydłużone u żywych myszy transgenicznych. Amplituda amplituda indukowanych kofeiną stanów przejściowych Ca(2+) była niższa w kardiomiocytach z myszy z nadekspresją junktyny. Kinetyka inaktywacji kanału Ca(2+) typu L była wydłużona w kardiomiocytach z nadekspresją junktyny przy użyciu Ca(2+) lub Ba(2+) jako nośników ładunku. WNIOSEK: Nasze dane dostarczają dowodów na to, że specyficznej dla serca nadekspresji junktyny towarzyszy upośledzona relaksacja mięśnia sercowego z przedłużoną kinetyką transientu Ca(2+) na poziomie kardiomiocytów. --- Triadyna i junktyna są integralnymi białkami błony retikulum sarkoplazmatycznego, które tworzą makromolekularny kompleks z receptorem ryanodyny mięśni szkieletowych (RyR1) ale ich rola w homeostazie wapnia w mięśniach szkieletowych pozostaje niekompletnie nie do końca poznana. Tutaj donosimy, że dostarczanie siRNA specyficznych dla triadyny lub junktyny do mioblastów szkieletowych C2C12 zmniejszyło ekspresję triadyny i junktyny w 8-dniowych miotubach odpowiednio o 80 i 100%. Zablokowanie triadyny lub junktyny w tych komórkach zmniejszyło uwalnianie Ca2+ indukowane depolaryzacją (10 mM KCl) o 20-25%. W przeciwieństwie do miotub z knockdownem triadyny, knockdown junktyny i junctin/triadin double knockdown miotubes miały również zmniejszone uwalnianie Ca2+ indukowane przez 400 mikroM 4-chloro-m-krezolu, 10mM kofeiny, 400 mikroM UTP lub 1 mikroM thapsigargin. Tak więc znokautowanie junktyny naruszyło zapasy Ca2+ w retikulum sarkoplazmatycznym retikulum sarkoplazmatycznym tych komórek. Nasze późniejsze badania wykazały, że w junctin knockdown miotubach co najmniej dwa białka retikulum sarkoplazmatycznego (RyR1 i kalsekwestryna mięśni szkieletowych) były regulowane w dół, podczas gdy ekspresja mRNA tych białek nie uległa zmianie. ekspresja mRNA tych białek nie uległa zmianie. Wyniki sugerują, że triadyna odgrywa rolę w ułatwianiu uwalniania Ca2+ indukowanego depolaryzacją KCl, w przeciwieństwie do junktyny która odgrywa rolę w utrzymywaniu wielkości zapasów Ca2+ w retikulum sarkoplazmatycznym w miotubach C2C12 miotubes. --- Triadyna 1 jest głównym białkiem transmembranowym w sarkoplazmatycznym retikulum retikulum (SR), które tworzy czwartorzędowy kompleks z receptorem ryanodyny (kanałem uwalniania Ca(2+)), junktyną i kalsekwestryną. Aby lepiej zrozumieć rolę triadyny 1 w sprzężeniu pobudzenie-skurcz w sercu, wygenerowaliśmy myszy transgeniczne z ukierunkowaną nadekspresją triadyny 1 do przedsionków i komór myszy, wykorzystując komory, wykorzystując promotor łańcucha ciężkiego alfa-miozyny do napędzania ekspresji białka ekspresji białka. Białko uległo 5-krotnej nadekspresji w komorach myszy, a nadekspresji towarzyszył przerost mięśnia sercowego. Poziomy dwóch innych białek białek SR, receptora ryanodyny i junktyny, zostały obniżone odpowiednio o 55% i 73%. i 73%, odpowiednio, w związku z nadekspresją triadyny 1, podczas gdy poziomy poziomy kalsekwestryny, białka wiążącego Ca(2+) łączącego SR, oraz fosfolamban i SERCA2a, białka obsługujące Ca (2+) wolnego SR, były niezmienione. Miocyty serca myszy z nadekspresją triadyny 1 wykazywały obniżoną kurczliwość; transjenty Ca(2+) zanikały w wolniejszym tempie, a komórki skracanie i wydłużanie komórek były zmniejszone. Zakres depresji skracania komórek kardiomiocytów z nadekspresją triadyny 1 był zależny od szybkości, będąc bardziej obniżony przy niskich częstotliwościach stymulacji (0,5 Hz), ale osiągając porównywalny poziom przy wyższych częstotliwościach stymulacji (5 Hz). Spontanicznie bicie, izolowane preparaty serca wykonujące pracę z nadekspresją triadyny 1 również rozluźniały się wolniej niż serca kontrolne i nie dostosowywały się odpowiednio do odpowiednio do zwiększonego obciążenia następczego. Stała szybkiej inaktywacji czasowej, tau(1), kanału Ca(2+) typu l była wydłużona w transgenicznych kardiomiocytach. Nasze wyniki dostarczają dowodów na skoordynowaną regulację ekspresji białka SR w sercu niezależnie od ekspresji wolnego białka SR, a ponadto sugerują ważną rolę triadyny 1 w regulacji właściwości skurczowych serca podczas sprzężenia pobudzenie-skurcz. --- Junktyna jest białkiem transmembranowym retikulum sarkoplazmatycznego (SR) złącza sercowego. retikulum (SR), które wiąże się z receptorem ryanodyny, kalsekwestryną i triadyną. 1. Uważa się, że ten czwartorzędowy kompleks białkowy ułatwia uwalnianie SR Ca2+. Aby poprawić nasze zrozumienie udziału junktyny w regulacji funkcji SR funkcji SR, zbadaliśmy zależne od wieku skutki nadekspresji junktyny w przedsionków 3-, 6- i 18-tygodniowych myszy transgenicznych. Stosunek masy przedsionków i masy ciała masy ciała był niezmieniony między myszami z nadekspresją junktyny (JCN) i myszami typu dzikiego (WT) we wszystkich badanych grupach wiekowych (n=6-8). Ekspresja białka triadyny 1 była zmniejszona począwszy od 3-letnich przedsionków JCN (o 69%), podczas gdy ekspresja receptora receptora ryanodyny była zmniejszona w 6- (o 48%) i 18-tygodniowych (o 57%) przedsionkach JCN w porównaniu z dopasowanymi wiekowo przedsionkami WT. Siła skurczu była zmniejszona o 35% w 18-tygodniowych JCN w porównaniu z dopasowanymi wiekowo paskami mięśnia lewego przedsionka WT, czemu towarzyszył wydłużony czas relaksacji (odpowiednio 48,1 +/- 0,9 vs. 44,2 +/- 0,8 ms, odpowiednio, n=6-8, P <0,05). Spontaniczna częstość skurczów izolowanych prawych przedsionków była wyższa u 18-tygodniowych myszy JCN w porównaniu z dopasowanymi wiekowo myszami WT (389 +/- 10 vs. 357 +/- 6 uderzeń/min, odpowiednio, n=6-8, P <0,05). Tętno było niższe o 9% w telemetrycznych zapisach EKG u 18-kilkuletnich myszy JCN podczas testów wysiłkowych. Trzytygodniowe przedsionki myszy JCN wykazywały większą siłę siły skurczu przy przerwach spoczynkowych 30 s (o 13%) i 300 s (o 35%), co sugeruje zwiększoną zawartość SR Ca2+. Było to zgodne z wyższą siłą skurczu w 3-letnich przedsionkach JCN (o 29%) w porównaniu z dopasowanymi wiekowo przedsionkami WT (o 10%) po podaniu kofeiny. Wnioskujemy, że w 3-letnich przedsionkach nadekspresja junktyny była związana ze zmniejszoną ekspresją triadyny 1, co skutkuje wyższym obciążeniem SR Ca2+ bez zmian w kurczliwości lub częstości akcji serca. częstości akcji serca. W 6-tygodniowych przedsionkach JCN kompensacyjna regulacja w dół receptora receptora ryanodyny może zrównoważyć skutki nadekspresji junktyny. Wreszcie, postępujący spadek gęstości receptora ryanodyny może przyczyniać się do zmniejszonej kurczliwości przedsionków i niższej częstości akcji serca podczas stresu u 18-kilkuletnich myszy myszy JCN. --- W mięśniu sercowym junktyna tworzy czwartorzędowy kompleks białkowy z receptorem ryanodyny receptorem ryanodyny (RyR), kalsekwestryną i triadyną 1 na powierzchni luminalnej junctional sarcoplasmic reticulum (jSR). Wiążąc bezpośrednio RyR i kalsekwestrynę, junktyna może pośredniczyć w zależnych od Ca(2+) interakcjach regulacyjnych między oboma białkami. Aby uzyskać lepszy wgląd w mechanizmy leżące u podstaw upośledzonej relaksacji skurczowej u transgenicznych myszy ze specyficzną dla serca nadekspresją junktyny (TG), badaliśmy komórkową obsługę Ca(2+) u tych myszy. myszy. Stwierdziliśmy, że ładunek SR Ca(2+) był zmniejszony o 22% w kardiomiocytach myszy z TG. myszy TG. Zgodnie z tym, częstotliwość iskier Ca(2+) została zmniejszona o 32%. Zanik spontanicznych iskier Ca(2+) był wydłużony o 117% w TG. To było związane z niższą ekspresją białka wymiennika Na(+)-Ca(2+) (NCX) (o 67%) i wyższą podstawową fosforylacją RyR w Ser (2809) (o 64%) w TG. Zależności częstotliwości skracania i Delta[Ca](i) (0,5-4 Hz) były płaskie w TG w porównaniu do typu dzikiego (WT), który wykazywał dodatnie schody dla obu parametrów. Co więcej, zwiększenie częstotliwości stymulacji przyspieszyło czas relaksacji i zanik [Ca](i) o wyższy procent w TG. My że upośledzona relaksacja w TG może wynikać ze zmniejszonej ekspresji NCX i/lub wyższego wycieku SR Ca(2+). Zmieniona zależność skrócenie-częstotliwość w TG wydaje się być konsekwencją upośledzonego sprzężenie pobudzenie-skurcz z obniżonym uwalnianiem SR Ca(2+) przy wyższych prędkościach stymulacji. Nasze dane sugerują, że bardziej znaczące zależne od częstotliwości przyspieszenie relaksacji w TG wynika ze stymulacji transportu SR Ca(2+) odzwierciedlone przez odpowiednie zmiany [Ca](i). --- W mięśniach prążkowanych ssaków receptor ryanodynowy (RyR), triadyna, junktyna i kalsekwestryna tworzą czwartorzędowy kompleks w świetle retikulum sarkoplazmatycznego. tworzą czwartorzędowy kompleks w świetle retikulum sarkoplazmatycznego. Takie interakcje międzycząsteczkowe przyczyniają się nie tylko do biernego buforowania Ca2+ w świetle retikulum sarkoplazmatycznego, ale także do aktywnego procesu uwalniania Ca2+ podczas sprzężenia pobudzenie-skurcz. Tutaj przetestowaliśmy hipotezę, że specyficzne naładowane aminokwasy w części luminalnej RyR pośredniczą w jego bezpośrednią interakcję z triadyną. Stosując test wiązania in vitro i mutagenezę ukierunkowaną na miejsce mutagenezy, odkryliśmy, że druga pętla wewnątrz światła mięśnia szkieletowego RyR1 (aminokwasy 4860-4917), ale nie pierwsza pętla intraluminalna RyR1 (aminokwasy 4581-4640) może wiązać triadynę. W szczególności, trzy ujemnie naładowane ujemnie naładowane reszty Asp4878, Asp4907 i Glu4908 wydają się być krytyczne dla wiązania z triadyną. z triadyną. Stosując podejścia delecyjne, wykazaliśmy, że motyw KEKE triadyny (aminokwasy 200-232) jest niezbędny do wiązania z RyR1. Ponieważ ponieważ wcześniej wykazano, że druga pętla intraluminalna RyR zawiera przewodzący jony, jak również filtr selektywności kanału uwalniania Ca2+ a reszty Asp4878, Asp4907 i Glu4908 są przewidywane do zlokalizowania na peryferiach zespołu porów kanału, nasze dane sugerują, że fizyczna interakcja między RyR1 i fizyczna interakcja między RyR1 i triadyną może odgrywać aktywną rolę w procesie uwalniania Ca2+ w komórkach mięśniowych. --- UZASADNIENIE: Katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy jest dziedziczną chorobą która predysponuje do zatrzymania akcji serca i nagłej śmierci. Choroba jest jest związana z mutacjami w genach kodujących sercowy receptor ryanodyny (RyR2) i kalsekwestryny sercowej (CASQ2). Mutacje CASQ2 prowadzą do utraty monomerów CASQ2, prawdopodobnie z powodu zwiększonej degradacji zmutowanego białka. zmutowanego białka. Zmniejszenie CASQ2 jest związane ze zmniejszeniem poziomu triadyny (TrD). poziomów triadyny (TrD) i junktyny (JnC), dwóch białek, które tworzą z CASQ2 i RyR2, kompleks makrocząsteczkowy poświęcony kontroli uwalniania wapnia z retikulum sarkoplazmatycznego. retikulum sarkoplazmatycznego. CEL: Zamierzaliśmy ocenić, czy wirusowy transfer genów typu dzikiego CASQ2 może uratować szerokie spektrum nieprawidłowości spowodowanych przez zmutowany CASQ2. METODY I WYNIKI: Użyliśmy wektora wirusowego serotypu 9 związanego z adenozyną do wyrażać konstrukt CASQ2 znakowany zielonym białkiem fluorescencyjnym. Dwadzieścia tygodni po dootrzewnowe wstrzyknięcie wektora noworodkom myszy CASQ2 KO, zaobserwowaliśmy normalizację poziomów kalsekwestryny, triadyny i junktyny, uratowanie elektrofizjologicznych i ultrastrukturalnych nieprawidłowości spowodowanych ablacją CASQ2, oraz brak zagrażających życiu arytmii. WNIOSKI: Udowodniliśmy koncepcję, że indukcja ekspresji CASQ2 u myszy nokautu odwraca nieprawidłowości molekularne, strukturalne i elektryczne oraz zapobiega zagrażającym życiu arytmiom u myszy z defektem katecholaminergicznym CASQ2 myszy z polimorficznym częstoskurczem komorowym. Dane te potwierdzają pogląd, że że wirusowy transfer genu CASQ2 może mieć zastosowanie kliniczne. --- Kalsekwestryna, główne białko sekwestrujące wapń w retikulum sarkoplazmatycznym mięśni, tworzy czwartorzędowy kompleks z receptorem retikulum mięśniowym, tworzy czwartorzędowy kompleks z receptorem ryanodynowym kanałem uwalniania wapnia oraz wewnętrznymi białkami błonowymi triadyną i junktyną. Zbadaliśmy możliwość, że kalsekwestryna jest luminalnym czujnikiem stężenia wapnia dla receptora ryanodyny. Zmierzyliśmy stężenie wapnia w świetle stężenie, przy którym kalsekwestryna dysocjuje z receptora ryanodyny i wpływ kalsekwestryny na odpowiedź receptora ryanodynowego na zmiany w wapniu luminalnym. Przedstawiamy elektrofizjologiczne i biochemiczne dowody na to, że że: 1), stężenie wapnia w świetle >/=4 mM dysocjuje kalsekwestrynę od błony łączącej, podczas gdy w zakresie 1-3 mM kalsekwestryna pozostaje przyłączona; 2), asocjacja z kalsekwestryną hamuje aktywność receptora ryanodyny ryanodyny, ale wzmacnia jego odpowiedź na zmiany stężenia wapnia w świetle i 3), w warunkach fizjologicznego stężenia wapnia (1 mM), fosforylacja kalsekwestryny nie zmienia jej zdolności do hamowania natywnej aktywności receptora receptora ryanodyny, gdy obecne są białka kotwiczące triadyna i junktyna. obecne. Dane te sugerują, że czwartorzędowy kompleks jest nienaruszony in vivo, i dostarcza dalszych dowodów na to, że kalsekwestryna jest zaangażowana w sarkoplazmatyczny i odgrywa rolę jako czujnik wapnia w świetle receptora ryanodynowego. dla receptora ryanodyny. --- Junktyna, wewnątrzsarkoplazmatyczne białko retikulum (SR) o masie 26 kDa, tworzy czwartorzędowy kompleks z triadyną, kalsekwestryną i receptorem ryanodyny (RyR) na kompleks z triadyną, kalsekwestryną i receptorem ryanodyny (RyR) w błonie błonie łączącej SR. Fizjologiczna rola junktyny w luminalnej regulacji regulacji uwalniania RyR Ca(2+) pozostaje nierozwiązana, ale wydaje się być niezbędna dla prawidłowej funkcji serca, ponieważ ablacja junktyny skutkuje zwiększa automatyzm komór. Biorąc pod uwagę, że poziomy junktyny są poważnie zmniejszone w ludzkich niewydolnych sercach, przeprowadziliśmy dogłębne badanie mechanizmów wpływających na wewnątrzkomórkową homeostazę Ca(2+) w kardiomiocytach z niedoborem junktyny. kardiomiocytach. W połączeniu z iskrami, kardiomiocyty JCN-KO wykazują zwiększoną amplitudę transjentów Ca(2+), wynikającą ze zwiększonego SR [Ca(2+)] ([Ca(2+)](SR)). Wydaje się, że ablacja Junctin wpływa na sposób, w jaki RyRs "wyczuwają" obciążenie SR Ca(2+) co skutkuje zmniejszonym rozkurczowym wyciekiem SR Ca(2+) pomimo podwyższonego poziomu [Ca(2+)](SR). [Ca(2+)](SR). Co zaskakujące, β-adrenergiczne wzmocnienie [Ca(2+)](SR) odwraca spadek aktywności RyR i prowadzi do spontanicznego uwalniania Ca(2+), o czym świadczy rozwój spontanicznych skurczów następczych. Pojedynczy kanał RyR z SR serca WT i JCN-KO wskazują, że brak junktyny wywołuje podwójny efekt na normalnie liniową odpowiedź RyRs na Ca(2+)]: przy niskim poziomie [Ca(2+)] (<1 mmol l(-1)), pozbawione junktyny kanały RyR są mniej wrażliwe na luminal [Ca(2+)]; odwrotnie, wysoki luminal [Ca(2+)] czyni je nadwrażliwymi na tę formę modulacji kanału. Zatem, junktyna wywołuje złożony wpływ na iskry Ca(2+), stany przejściowe i wyciek, ale luminal [Ca(2+)]-zależna podwójna odpowiedź RyRs pozbawionych junktyny pokazuje że junktyna normalnie działa jako aktywator kanałów RyR przy niskim świetle [Ca(2+)] i jako inhibitor przy wysokim poziomie [Ca(2+)]. Ponieważ crossover występuje przy [Ca(2+)](SR), który jest zbliżony do tego obecnego w komórkach spoczynkowych, jest to możliwe, że rola aktywatora-inhibitora junktyny może być wywierana pod okresach dominującej aktywności przywspółczulnej i współczulnej.
Które białka uczestniczą w tworzeniu czwartorzędowego kompleksu makromolekularnego receptora ryanodyny?
Junktyna jest głównym białkiem transmembranowym w retikulum sarkoplazmatycznym złącza sercowego, które tworzy czwartorzędowy kompleks z receptorem ryanodynowym (kanałem uwalniania Ca(2+)), triadyną i kalsekwestryną.   