W tym badaniu zbadaliśmy mechanizmy molekularne leżące u podstaw analogu ATP analogiem adenozyno-5'-O-(3-thio)trifosforanu indukowanego nukleocytoplazmatycznym transportem czynnika stabilizującego mRNA HuR w ludzkich (h) komórkach mezangialnych (MC). Używając syntetycznych inhibitorów kinazy białkowej C (PKC) i małych interferujących RNA wykazaliśmy, że knockdown PKC alfa skutecznie blokował zależną od ATP zależny od ATP jądrowy eksport HuR do cytoplazmy. Funkcjonalne znaczenie PKC alfa w transporcie HuR jest podkreślone przez wysoką cytozolową zawartość HuR wykryta w hMC stabilnie nadeksprymujących PKC alfa w porównaniu z komórkami transfekowanymi mockami komórkami. Indukowana ATP rekrutacja HuR do cytoplazmy jest poprzedzona bezpośrednią interakcją PKC alfa z HuR. bezpośrednią interakcją PKC alfa z jądrowym HuR i towarzyszy jej zwiększona fosforylacja fosforylacji Ser, jak wykazały eksperymenty koimmunoprecypitacji. Mapowanie domniemanych miejsc docelowych PKC zidentyfikowało seryny 158 i 221 jako niezbędne do fosforylacji HuR przez PKC alfa. Test ściągania RNA i test elektroforetycznego przesunięcia ruchliwości RNA oraz test elektroforetycznego przesunięcia ruchliwości RNA wykazały, że przemieszczeniu HuR przez ATP towarzyszy zwiększone wiązanie HuR z mRNA cyklooksygenazy (COX)-2. Fizjologicznie, zależny od ATP wzrost wiązania RNA jest powiązany z stabilnością mRNA COX-2 i późniejszym wzrostem syntezy prostaglandyny E(2). Regulacja HuR poprzez fosforylację zależną od PKC alfa podkreśla znaczenie modyfikacji potranslacyjnej dla zależne od bodźca przemieszczanie HuR. --- Donosimy o antyapoptotycznym działaniu białka wiążącego RNA HuR, krytycznego regulatora regulatora potranskrypcyjnego losu transkryptów docelowych. Wśród najbardziej mRNA kompleksujących się z HuR jest ten kodujący protymozynę alfa (ProTalpha), inhibitor apoptosomu. W komórkach HeLa, leczenie bodziec apoptotyczny światło ultrafioletowe (UVC) wywołało mobilizację ProTalpha mRNA do cytoplazmy i na cięższe polisomy, gdzie jego związek z HuR dramatycznie wzrósł. Analiza chimerycznego ProTalpha mRNA bezpośrednio zaangażowała HuR w regulację produkcji ProTalpha: ProTalpha i stężenie cytoplazmatyczne wzrosły w komórkach z nadekspresją HuR i spadło w komórkach, w których poziomy HuR zostały obniżone przez interferencję RNA. Co ważne, antyapoptotyczny wpływ wywołany przez HuR był w znacznym stopniu zależny od ekspresji ProTalpha. od ekspresji ProTalpha, ponieważ zastosowanie oligomerów, które blokowały translację ProTalpha zniosło ochronne działanie HuR. Łącznie nasze dane potwierdzają schemat regulacyjny, w którym HuR wiąże mRNA ProTalpha, podnosi jego cytoplazmatyczną cytoplazmatyczną i translację, a tym samym wywołuje program antyapoptotyczny. --- p19(ARF) odgrywa istotną rolę w starzeniu się komórek myszy, a jego ekspresja jest tracona przez metylację lub delecję ekspresja jest tracona przez metylację lub delecję locus ARF; w przeciwnym razie p53 jest inaktywowane w celu ominięcia starzenia. Ekspresja ARF jest ściśle regulowana, ale niewiele wiadomo na temat jego regulacji potranskrypcyjnej. Tutaj pokazujemy, że białko wiążące białko wiążące RNA, HuR (ludzki antygen R), hamuje translację mRNA ARF, utrzymując w ten sposób replikacyjną żywotność mysich zarodkowych fibroblastów (MEF). Utrata HuR skutkuje przedwczesnym starzeniem się, z towarzyszącym wzrostem w p19(ARF), ale nie w p16(Ink4a), a starzenie to nie jest obserwowane w MEF null ARF. ARF-null MEF, które zachowują nienaruszony locus Ink4a. Zubożenie HuR nie zmienia transkrypcji transkrypcji lub stabilności ARF, ale zwiększa asocjację rybosomu z mRNA ARF. W tych warunkach ARF mRNA gromadzi się w jąderkach, gdzie wiąże się z nukleoliną. z nukleoliną. Ponadto, specyficzna dla tkanki tłuszczowej delecja genu HuR powoduje w zwiększonej ekspresji p19 (ARF) u starszych zwierząt, której towarzyszy zmniejszona wrażliwość na insulinę. Nasze odkrycia pokazują, że p19(ARF) jest również regulowana na poziomie translacyjnym, a ta regulacja translacyjna ogranicza żywotność komórek i funkcje tkanek in vivo. --- Zdarzenia cytoplazmatyczne, które kontrolują ekspresję genów ssaków, głównie stabilność i translację mRNA i translację, silnie wpływają na odpowiedź komórkową na sygnały wewnętrzne i zewnętrzne. i sygnały zewnętrzne. Wszechobecne białko wiążące RNA (RBP) HuR jest jednym z najlepiej zbadanych regulatorów cytoplazmatycznego losu mRNA. Poprzez swój posttranskrypcyjny wpływ na specyficzne docelowe mRNA, HuR może zmienić odpowiedź komórkową na proliferację, stres, apoptozę, różnicowanie, starzenie, bodźce zapalne i immunologiczne. W świetle jego centralnej roli w ważnych funkcjach komórkowych, rola HuR w chorobach, w których te odpowiedzi jest coraz bardziej doceniana. Tutaj dokonujemy przeglądu mechanizmów, które kontrolować funkcję HuR, jego wpływ na docelowe mRNA oraz sposób, w jaki upośledzenie Programy ekspresji genów regulowane przez HuR wpływają na różne procesy chorobowe. Skupiamy się na dobrze rozpoznanym wpływie HuR na raka i przewlekłe zapalenie i przewlekłym zapaleniu, a także omawiamy pojawiające się badania łączące HuR z chorobami układu krążenia, patologiami neurologicznymi i mięśniowymi. Omawiamy również postęp, potencjał i wyzwania związane z terapeutycznym ukierunkowaniem na HuR. --- W jądrze HuR wiąże się z mRNA zawierającym elementy bogate w adenylan-urydylany w regionie 3'-nietranslowanym. HuR może wpływać na ekspresję swojego ligandu mRNA poprzez regulację poliadenylacji, translokację wiadomości do cytozolu, stabilizację cytozolu, stabilizację mRNA i/lub zmianę jego wydajności translacyjnej. Tłumienie HuR za pomocą siRNA spowodowało osłabienie programu różnicowania 3T3-L1 programu różnicowania, co jest zgodne z kontrolą HuR ekspresji mRNA ligandów krytycznych dla procesu różnicowania. W niniejszym badaniu zaczynamy identyfikować ligandy mRNA HuR, których regulowana ekspresja jest niezbędna do adipogenezy. dla adipogenezy. --- HuR, znane również jako Elavl1, jest białkiem wiążącym RNA, które reguluje rozwój embrionalny komórek progenitorowych. rozwój, przeżycie komórek progenitorowych i reakcje komórek na stres. Rola HuR w angiogenezie nie jest znana. HuR w angiogenezie nie jest znana. Używając mysiego modelu knock-out HuR specyficznego dla mieloidów (Elavl1Mø KO), wykazujemy, że ekspresja HuR w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) jest potrzebna do utrzymania ekspresji genów wzbogaconych w elementy bogate w AU i elementy bogate w U w 3'-UTR. Ponadto, BMDM od Elavl1Mø KO wykazały również zmiany w ekspresji kilku miRNA. Co ciekawe, analiza obliczeniowa sugeruje, że miR-200b, który jest miR-200b, który jest regulowany w górę w BMDM Elavl1Mø KO, oddziałuje z mieloidalnymi mRNA bardzo blisko miejsca wiązania HuR, co sugeruje konkurencyjną regulację ekspresji genów. Jeden taki mRNA koduje czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) -A, główny regulator angiogenezy. angiogenezy. Immunoprecypitacja kompleksów RNA-białko i testy reporterowe lucyferazy wskazują, że HuR antagonizuje supresyjną aktywność miR-200b, obniżając regulację miR-200b, obniża ekspresję miR-200b i promuje ekspresję VEGF-A. Rzeczywiście, Vegf-a i inne angiogenne transkrypty regulatorowe były regulowane w dół w BMDM Elavl1Mø KO. Co ciekawe, wzrost guza, angiogeneza, kiełkowanie naczyniowe kiełkowanie, rozgałęzianie i przepuszczalność były znacznie osłabione u myszy Elavl1Mø KO, co sugeruje, że czynniki pochodzenia szpikowego regulowane przez HuR modulują angiogenezę guza angiogenezę w trans. Zarodki danio pręgowanego, którym wstrzyknięto oligomer morfoliny elavl1 lub miR-200b wykazywały defekty angiogenezy w splocie żył podjelitowych, a elavl1 splotu podjelitowego, a mRNA elavl1 ratowało represyjny efekt miR-200b. Ponadto, miR-200b i oligomer morfolino HuR hamowały aktywność konstruktu reporterowego lucyferazy zVEGF 3'-UTR lucyferazy. Łącznie badania te ujawniają ewolucyjnie konserwowany mechanizm potranskrypcyjny obejmujący konkurencyjne interakcje między HuR i miR-200b, który kontroluje angiogenezę. --- Białko wiążące RNA HuR, choć znane z tego, że stabilizuje cytoplazmatyczne mRNA, jest w dużej mierze jądrowe. W tym wydaniu Molecular Cell, Mukherjee i wsp. (2011) oraz Lebedeva et al. (2011) identyfikują interakcje HuR-RNA w całym transkryptomie za pomocą PAR-CLIP, ujawniając jądrową rolę HuR w przetwarzaniu pre-mRNA. --- MikroRNA są ważnymi regulatorami ekspresji genów w prawidłowym rozwoju i chorobach. miR-9 ulega nadekspresji w kilku postaciach raka, w tym w guzach mózgu, raku wątroby, raku piersi i chłoniaku Hodgkina (HL). mózgu, raku wątrobowokomórkowym, raku piersi i chłoniaku Hodgkina (HL). Tutaj wykazaliśmy znaczenie miR-9 w patogenezie HL i zidentyfikowaliśmy dwa nowe cele nowe cele Dicer1 i HuR. HL charakteryzuje się masywną infiltracją komórek odpornościowych i fibroblastów. komórek odpornościowych i fibroblastów w guzie, podczas gdy komórki złośliwe stanowią tylko 1% masy guza. tylko 1% masy guza. Nacieki te dostarczają ważnych sygnałów przeżycia i sygnały wzrostu i przeżycia komórkom nowotworowym, a kilka linii dowodów wskazuje, że że są one niezbędne dla przetrwania HL. Pokazujemy, że hamowanie miR-9 prowadzi do derepresji DICER i HuR, co z kolei skutkuje spadkiem produkcji cytokin przez komórki HL. cytokin przez komórki HL, a następnie upośledzoną zdolność do przyciągania normalnych komórek zapalnych. normalnych komórek zapalnych. Wreszcie, zahamowanie miR-9 przez systemowo miR-9 w modelu ksenoprzeszczepu HL zwiększa poziomy białek HuR i DICER1 i powoduje zmniejszenie wzrostu guza, potwierdzając, że miR-9 aktywnie uczestniczy w patogenezie HL i wskazuje na miR-9 jako potencjalny cel terapeutyczny. cel terapeutyczny. --- Wcześniej zaobserwowaliśmy, że ekspozycja na tlenek azotu (NO) zwiększa stabilność mRNA kodującego oksygenazę hemową 1 (HO-1) i TIEG-1 w ludzkich i mysich fibroblastach. fibroblastach ludzkich i mysich. Tutaj wykorzystaliśmy mikromacierze, aby szeroko spojrzeć na zmiany w stabilności mRNA w odpowiedzi na leczenie NO. Wykorzystując ludzkie IMR-90 i mysie NIH 3T3 traktowanych aktynomycyną D w celu zablokowania transkrypcji de novo, analiza mikromacierzy sugerowała, że stabilność większości mRNA była nie uległa zmianie. Wśród mRNA, które zostały ustabilizowane przez leczenie NO, siedem transkryptów transkryptów znaleziono zarówno w komórkach IMR-90, jak i NIH 3T3 (CHIC2, GADD45B, HO-1, PTGS2, RGS2, TIEG i ID3) i zostały wybrane do dalszej analizy. Wszystkie siedem mRNA wykazały co najmniej jedno trafienie motywu sygnaturowego dla stabilizującego białko wiążące RNA (RBP) HuR; odpowiednio, rybonukleoproteina analiza immunoprecypitacji ujawniła, że wszystkie siedem mRNA wiąże się z HuR. Zgodnie z funkcjonalną rolą HuR w odpowiedzi na NO, mierzalna frakcja HuR wzrosła w odpowiedzi na NO. mierzalna frakcja HuR wzrosła w cytoplazmie po leczeniu NO. Jednakże, wśród siedmiu transkryptów, tylko HO-1 mRNA wykazał silny wzrost poziomu poziom jego asocjacji z HuR po leczeniu NO. Z kolei poziomy HO-1 mRNA i białka były znacznie zmniejszone, gdy poziomy HuR zostały wyciszone w komórkach IMR-90 i były podwyższone, gdy HuR ulegał nadekspresji. Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że NO stabilizuje podzbiory mRNA w fibroblastach, identyfikuje HuR jako RBP zaangażowany w odpowiedź na NO, ujawniają, że sam HuR jest niewystarczający do stabilizacji kilku mRNA przez NO i pokazują, że indukcja HO-1 przez NO jest regulowana przez HuR. przez HuR. --- Aktywność białek wiążących RNA jest zaburzona w kilku stanach patologicznych, w tym w nowotworach. stanach patologicznych, w tym w nowotworach. Białka te obejmują tristetraprolinę (TTP, ZFP36) i HuR (ELAVL1), które odpowiednio promują rozpad lub stabilność mRNA bogatych w adenylan-uridylan (bogatych w AU). Tutaj wykazaliśmy, że zwiększona stabilizacja i późniejsza nadekspresja mRNA HuR były sprzężone z niedoborem TTP niedobór. Odkrycia te zaobserwowano w liniach komórkowych raka piersi o fenotypie inwazyjnym fenotypem i zostały dodatkowo potwierdzone w mysich fibroblastach z nokautem ZFP36 fibroblastach myszy. Wykazaliśmy, że brak równowagi TTP-HuR korelował ze zwiększoną ekspresją mRNA elementów bogatych w AU (ARE), które kodują geny inwazji raka. MikroRNA miR-29a był obfity w inwazyjnych komórkach raka piersi w porównaniu do nienowotworowych typów komórek. Gdy normalne komórki piersi były traktowane miR-29a, HuR mRNA i ekspresja białka były regulowane w górę. MiR-29a rozpoznał w 3' UTR TTP, a przepuszczalny dla komórek inhibitor miR-29a zwiększał aktywność TTP w kierunku HuR 3' UTR. Doprowadziło to do destabilizacji mRNA HuR i przywrócenie nieprawidłowej osi TTP-HuR. Następnie, czynniki inwazji raka uPA, MMP-1 i MMP-13 oraz inwazyjności komórek. The mRNA TTP:HuR były również zaburzone w próbkach pochodzących od inwazyjnego raka piersi w porównaniu z prawidłowymi tkankami i były związane z ekspresją genów inwazji. ekspresją genów inwazji. Badanie to pokazuje, że nieprawidłowy szlak, w którym pośredniczy ARE w raku inwazyjnym można znormalizować poprzez celowanie w nieprawidłową i funkcjonalnie funkcjonalnie sprzężoną oś TTP-HuR, wskazując na potencjalne podejście terapeutyczne. --- CEL: Nadtlenek wodoru (H(2)O(2)) jest ważnym mediatorem w naczyniach krwionośnych. naczyń krwionośnych, ale jego rola w regulacji aktywności i ekspresji rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGC) nie jest do końca poznana. Celem tego badania było przetestowanie wpływu H(2)O(2) na ekspresję i funkcję sGC oraz zbadanie mechanizmu molekularnego. METODY I WYNIKI: H(2)O(2) zwiększył poziom białka sGCβ1 w stanie stacjonarnym w aorcie szczura i aorcie gładkiej. aorcie i komórkach mięśni gładkich aorty (RASMC) w sposób zależny od czasu i dawki. sposób, a efekt ten został zablokowany przez katalazę. ekspresja sGCα2 wzrosła wraz z podjednostką β1, podczas gdy podjednostka α1 pozostała niezmieniona. Naczyniowa relaksacja do donora NO (nitroprusydek sodu) została wzmocniona przez H (2) O (2) i zapobiegało temu ODQ (inhibitor sGC). produkcja cGMP zarówno w świeżo izolowane naczynia i RASMC narażone na H (2) O (2) były znacznie zwiększone po leczenie nitroprusydkiem sodu. Zależna od H(2)O(2) regulacja w górę sGCβ1 była można przypisać stabilizacji mRNA sGCβ1, uwarunkowanej translokacją białka wiążącego mRNA białka wiążącego mRNA HuR z jądra do cytozolu i zwiększonym wiązaniem mRNA HuR do cytozolu. wiązanie mRNA HuR do 3' regionu nieulegającego translacji sGCβ1. Wyciszenie HuR odwróciło wpływ H(2)O(2) na poziomy sGCβ1 i syntezę cGMP. WNIOSKI: Nasze wyniki identyfikują H(2)O(2) jako endogenny mediator przyczyniającym się do regulacji napięcia naczyniowego i wskazują na kluczową rolę HuR w stabilizacji mRNA sGCβ1. --- Białka ELAV są zaangażowane w regulację stabilności i translacji mRNA cytokin i regulatorów wzrostu, takich jak cytokin i mRNA regulujących wzrost, takich jak GM-CSF, IL-2, c-myc, c-fos i GLUT1 poprzez wiązanie się z ich bogatymi w AU 3'UTR. Specyficzne dla tkanek białko ELAV HuB (aka. Hel-N1) jest głównie cytoplazmatyczne i wykazano, że stabilizuje GLUT1 i c-myc mRNA oraz zwiększa ich translację po ekspresji ektopowej w komórkach 3T3-L1. Donosimy, że najczęściej wyrażane mysie białko ELAV, mHuA, jest głównie jądrowe w hodowanych komórkach NIH-3T3, ale jest zlokalizowane w cytoplazmie we wczesnej fazie G1 cyklu komórkowego. Dlatego też, podobnie jak głównie cytoplazmatyczny HuB, HuA staje się czasowo zlokalizowany w cytoplazmie gdzie może potencjalnie regulować stabilność lub translację związanego mRNA. Co więcej, donosimy, że stymulacja komórek śledziony myszy przy użyciu mitogennych lub submitogennych poziomów anty-CD3/CD28 spowodowała dramatyczny wzrost poziomu HuA. wzrost poziomu HuA. Wzrost poziomu HuA odpowiada wcześniej udokumentowanemu wzrostowi ekspresji cytokin. udokumentowany wzrost ekspresji cytokin, który jest spowodowany zwiększoną stabilnością mRNA stabilność po aktywacji komórek T. Zgodnie z tymi odkryciami, HuA był regulowany w dół w spokojnych komórkach i regulowany w górę w komórkach 3T3 po stymulacji surowicą. stymulacji surowicą. Wzrost mysiego HuA podczas cyklu komórkowego ściśle przypomina cykliny B1, która osiąga szczyt w fazie G2/M. Wraz z naszymi wcześniejszymi badaniami, te dane wskazują, że białka ELAV ssaków funkcjonują podczas wzrostu i różnicowania komórek różnicowania, częściowo ze względu na ich wpływ na stabilność potranskrypcyjną i translację wielu mRNA regulujących wzrost. Potwierdza to hipotezę hipotezę, że białka ELAV mogą funkcjonować jako czynniki transaktywujące, które wpływają na domyślny szlak degradacji mRNA zaangażowany w ekspresję białek regulujących wzrost białek regulujących wzrost. --- Białka wiążące RNA, białko wiążące CUG 1 (CUGBP1) i HuR, wykazują wysoką ekspresję w tkankach nabłonkowych. w tkankach nabłonkowych i modulują stabilność i translację docelowego mRNA. Tutaj przedstawiamy dowody na to, że CUGBP1 i HuR wspólnie regulują translację okludyny i odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu szczelności integralności połączeń ścisłych (TJ) w monowarstwie komórek nabłonka jelitowego. CUGBP1 i HuR konkurowały o asocjację z tym samym 3'-nietranslowanym regionem okludyny i regulowały translację okludyny konkurencyjnie i w przeciwnych kierunkach. kierunkach. Nadekspresja CUGBP1 zmniejszyła wiązanie HuR do mRNA okludyny, hamowała translację okludyny i upośledzała funkcję bariery TJ, podczas gdy nadekspresja Nadekspresja HuR hamowała wiązanie CUGBP1 z mRNA okludyny i promowała translację okludyny, zwiększając w ten sposób integralność bariery. Represja translacji translacji okludyny przez CUGBP1 była spowodowana kolokalizacją CUGBP1 i znakowanego RNA okludyny w ciałach przetwarzających (ciałach P), a kolokalizacja ta była zapobiegała nadekspresja HuR. Odkrycia te wskazują, że CUGBP1 hamuje translację okludyny poprzez zwiększenie rekrutacji mRNA okludyny do ciałek P, podczas gdy HuR promuje translację okludyny poprzez blokowanie mRNA okludyny do ciałek P poprzez przemieszczenie CUGBP1. --- RhoB jest małym białkiem wiążącym GTP, które bierze udział w transdukcji sygnału apoptotycznego. transdukcji sygnału apoptotycznego. Sklonowaliśmy mysie mRNA RhoB, w tym 1377 nukleotydów 3'-nietranslowany region (UTR), który zawiera sześć elementów bogatych w AU (ARE), jak również jak również kilka odcinków bogatych w urydynę. Istnieje 94% homologii między genami genami RhoB myszy i szczura oraz 92% homologii między myszą a domniemanym ludzkim klonem. klonem. Światło ultrafioletowe (UVL) indukuje produkcję RhoB poprzez regulowane zmiany w transkrypcji genów i stabilizacji mRNA, chociaż ten drugi mechanizm jest nieznany. Zaobserwowaliśmy, że UVL zwiększyło okres półtrwania mRNA RhoB z 63 min do 3,3 h w komórkach NIH/3T3 i z 87 min do 2,7 h w normalnych ludzkich keratynocytach komórkach. Testy mobilności in vitro wykazały, że HuR wiązał 3'-UTR RhoB w trzech różnych miejscach RhoB w trzech różnych miejscach (nukleotydy 1342-1696, 1765-1920 i 1897-1977), co sugeruje regulacyjną rolę tego białka wiążącego RNA. Immunoprecypitacje HuR były pozytywne dla mRNA RhoB, co wskazuje na związek in vivo, a analiza Western blot i analiza a analiza Western blot i immunofluorescencja wykazały, że HuR szybko przechodzi z jądra do cytoplazmy po UVL. Dlatego, proponujemy model, w którym UVL indukuje transdukcję sygnału aktywowaną stresem prowadzące do jądrowego / cytoplazmatycznego przemieszczania się HuR i późniejszej stabilizacji RhoB mRNA. --- Starzeniu się komórek towarzyszą zmiany we wzorcach ekspresji genów. Tutaj, wykorzystując dwa modele starzenia replikacyjnego, opisujemy wpływ białka wiążącego RNA białka wiążącego RNA HuR w regulacji ekspresji kilku genów, których ekspresja których ekspresja zmniejsza się podczas starzenia. Wykazujemy, że poziomy HuR, wiązanie HuR wiążącego się z docelowymi mRNA kodującymi geny proliferacyjne i okresy półtrwania takich mRNA są niższe w komórkach starzejących się. Co ważne, nadekspresja HuR w komórkach przywracała "młodszy" fenotyp, podczas gdy redukcja ekspresji HuR zaakcentowało fenotyp starzenia. Nasze badania podkreślają krytyczną rolę HuR w procesie starzenia replikacyjnego. --- HuR jest ligandem dla jądrowych mRNA zawierających elementy bogate w adenylan-uridylan w regionie 3'-nietranslowanym. Po związaniu z mRNA, HuR jest rozpoznawany przez białka adapterowe, które następnie ułatwiają eksport jądrowy kompleksu. W cytozolu cytozolu, uważa się, że HuR funkcjonuje w celu kontrolowania stabilności i translacji swojego ligandu. W komórkach 3T3-L1 HuR jest konstytutywnie wyrażany i zlokalizowany głównie w jądrze w preadipocytach. Jednak w ciągu 30 min od ekspozycji na bodziec różnicujący zawartość HuR w cytozolu wzrasta, co jest zgodne z HuR regulującym dostępność odpowiednich mRNA do translacji. translacji. Stosując przesunięcia żelu RNA in vitro, wykazaliśmy, że białko wiążące wzmacniacz CCAAT (C/EBPbeta) jest ligandem dla HuR. W ciągu 2 h od rozpoczęcia procesu różnicowania, kompleksy HuR zawierające C/EBPbeta mogą być izolowane z przedziału cytozolowego. Co ważne, proces wydaje się być wysoce selektywny, ponieważ cyklina D1, która zawiera przypuszczalne miejsce wiązania HuR i ulega ekspresji w tym samym czasie co C/EBPbeta, nie została znaleziona w immunoprecypitowanych kompleksach rybonukleoprotein przekaźnikowych. Bliskość tego zdarzenia do bodźców adipogennych i znaczenie C / EBPbeta w procesie różnicowania doprowadziły nas do postawienia hipotezy o roli HuR w regulacji początku adipogenezy. Na poparcie tej hipoteza, tłumienie zawartości białka HuR przez małe interferujące RNA spowodowało zahamowanie ekspresji białka C / EBPbeta i osłabienie procesu różnicowania procesu różnicowania. --- Wykazano, że 3'-nietranslacyjne regiony różnych mRNA zawierają motywy sekwencji które kontrolują stabilność mRNA, zdolność do translacji i wydajność translacji, a także lokalizację wewnątrzkomórkową. Naszym celem było zidentyfikowanie regionów regionów wiążących białka długiego i wysoce konserwatywnego 3'UTR mRNA kodującego neurofibrominy, dobrze znanego białka supresorowego nowotworu, którego niedobór genetyczny powoduje autosomalną dominującą chorobę neurofibromatozę typu 1 (NF1). My odkryliśmy pięć fragmentów RNA, które były w stanie ulegać specyficznemu wiązaniu do białkami z lizatów komórkowych (NF1-PBR, regiony wiążące białko NF1). Dodatkowo zidentyfikowaliśmy podobne do Elav białko HuR wiążące się z NF1-PBR1. HuR oddziałuje z Elementy bogate w AU w 3'UTR wielu protoonkogenów, cytokin i czynników transkrypcyjnych, regulując w ten sposób ekspresję tych mRNA na poziomie posttranskrypcyjnym. poziomie potranskrypcyjnym. Testy transfekcji z konstruktem reporterowym CAT wykazały zmniejszoną ekspresję reportera, co sugeruje, że HuR może być zaangażowany w dostrajanie ekspresji genu NF1. --- Ważnym paradygmatem regulacji posttranskrypcyjnej jest kontrola stabilności cytoplazmatycznego mRNA. cytoplazmatycznej stabilności mRNA, w której pośredniczą elementy bogate w AU (ARE) w 3' regionie transkryptów kodujących onkoproteiny, cytokiny i czynniki transkrypcyjne. czynniki transkrypcyjne. Chociaż wykazano, że wiele białek wiążących RNA wiąże się z ARE do ARE in vitro, ani konsekwencje funkcjonalne, ani znaczenie fizjologiczne ich interakcji nie są znane. znaczenie ich interakcji nie są znane. Tutaj wykazujemy rolę dla białka wiążącego RNA HuR w obrocie mRNA in vivo. in vivo. Rodzina białek wiążących RNA ELAV jest wysoce konserwatywna u kręgowców. kręgowców. U ludzi występuje czterech członków; HuR ulega ekspresji we wszystkich proliferujących komórkach proliferujących komórkach, podczas gdy Hel-N1, HuC i HuD ulegają ekspresji w terminalnie zróżnicowanych neuronach. Pokazujemy, że podwyższenie cytoplazmatycznych poziomów HuR hamuje rozpad RNA za pośrednictwem c-fos ARE, ale ma niewielki wpływ na szybki rozpad kierowany przez c-jun ARE. Wydaje się, że HuR ma niewielki wpływ na deadenylację ale opóźnia początek rozpadu ciała RNA i spowalnia jego późniejszy rozpad. Pokazujemy również, że HuR może być indukowany do redystrybucji z jądra do cytoplazmy i że ta redystrybucja cytoplazmy i że ta redystrybucja jest związana ze zmienioną funkcją. Modulacja szlaku rozpadu, w którym pośredniczy ARE, poprzez kontrolowanie dystrybucji białek białek ELAV między jądrem a cytoplazmą może być mechanizmem, za pomocą którego regulowany jest wzrost i różnicowanie komórek. regulowany jest wzrost i różnicowanie komórek. --- Białka są transportowane do i z jądra komórkowego za pośrednictwem określonych sygnałów. W dwóch najlepiej zbadanych procesach transportu jądrowego pośredniczą klasyczne sygnały lokalizacji jądrowej lub sygnały eksportu jądrowego. Istnieją również sekwencje wahadłowe, które kierują dwukierunkowym transportem białek wiążących RNA białek wiążących RNA. Dwa przykłady to sekwencja M9 w heterogennej rybonukleoproteinie jądrowej w heterogennej rybonukleoproteinie jądrowej A1 i sekwencja wahadłowa w heterogennej rybonukleoproteinie jądrowej K (KNS) w heterogenicznej rybonukleoproteinie jądrowej K, z których obie które wydają się znacząco przyczyniać do eksportu mRNA do cytoplazmy. HuR jest białkiem wiążącym RNA, które może stabilizować labilne mRNA zawierające elementy bogate w AU elementy w ich regionach nieulegających translacji 3 ' i wykazano, że przemieszczają się między jądrem i cytoplazmą (18, 19). Zidentyfikowaliśmy w HuR sekwencję wahadłową sekwencję, która również posiada zależny od transkrypcji sygnał lokalizacji jądrowej aktywność. Proponujemy, aby HuR najpierw mógł wiązać mRNA zawierające elementy bogate w AU w jądrze w jądrze, a następnie eskortować je przez pory jądrowe, zapewniając ochronę podczas i po eksporcie do przedziału cytoplazmatycznego. --- Białko wiążące RNA, HuR, wiąże się z mRNA HuR, ale konsekwencje tej interakcji są nieznane. tej interakcji są nieznane. Tutaj używamy ludzkich diploidalnych fibroblastów (HDF) i komórek raka szyjki macicy do badania tego paradygmatu regulacyjnego. Ektopowa nadekspresja HuR silnie zwiększała translację i poziomy cytoplazmatyczne endogennego HuR, ale nie wpływała na poziom mRNA HuR. Zahamowanie funkcji CRM1 przez Lemptomycynę B lub przez knockdown CRM1 znacznie zmniejszyło poziom cytoplazmatyczne poziomy endogennego mRNA HuR, a tym samym blokowało indukcję endogennego HuR przez egzogenny HuR. Dalsze badania wykazały, że HuR oddziaływał z 3'-nietranslowanym regionem (UTR) HuR i że nadekspresja HuR zwiększała cytoplazmatyczne poziomy cytoplazmatyczne poziomy chimerycznego transkryptu reporterowego lucyferazy-HuR 3'-UTR, jak również aktywność lucyferazy; odwrotnie, knockdown HuR zmniejszył oba parametry. Co więcej, utracie HuR w starzejących się HDF w późnym stadium towarzyszyła zmniejszona cytoplazmatyczna obecność endogennego mRNA HuR, ektopowego transkryptu reporterowego Luc-HuR-3'UTR i aktywności lucyferazy w stosunku do tego, co zaobserwowano zaobserwowano w młodych, wczesnych komórkach. Nasze wyniki ujawniają pozytywne sprzężenie zwrotne dla regulacji HuR, który może odgrywać ważną rolę w regulacji HuR podczas replikacji. regulacji HuR podczas starzenia replikacyjnego. --- Rozwój płuc jest kontrolowany przez sieci regulacyjne interakcje mezenchymalno-nabłonkowe. Czynniki transkrypcyjne i cząsteczki transkrypcyjne i cząsteczki sygnalizacyjne uczestniczą w tym procesie, ale niewiele wiadomo na temat potranskrypcyjnej regulacji tych sieci. Tutaj pokazujemy, że białko wiążące RNA (RBP) HuR jest istotnym regulatorem odpowiedzi mezenchymalnych podczas rozgałęziania płuc. odpowiedzi podczas rozgałęziania płuc. Jego delecja indukowana epiblastem zablokowała morfogenezę dystalnych gałęzi oskrzeli na początku stadium pseudogruczołowego. stadium pseudogruczołowego. Fenotyp ten wynikał z wadliwych odpowiedzi mezenchymalnych, ponieważ warunkowe ograniczenie mezenchymalnych, ponieważ warunkowe ograniczenie delecji HuR w progenitorach nabłonkowych nie wpłynęło na dystalne rozgałęzienia lub zakończenie dojrzewania płuc. dojrzewania płuc. Utrata HuR spowodowała redukcję kluczowego induktora wzrostu pąków i endodermy. i rozgałęziania endodermy, FGF10 i jednego z jego domniemanych regulatorów transkrypcji, Tbx4. Co więcej, egzogenny FGF10 może uratować defekt defekt rozgałęziania dotkniętych pąków płucnych. Stwierdzono, że HuR wiąże i kontroluje mRNA Fgf10 i Tbx4; w rezultacie jego delecja zniosła ich indukowalną potranskrypcyjną regulację przez mezenchymalny regulator FGF9. Nasze dane ujawniają HuR jako pierwszy zidentyfikowany RBP, który odgrywa dominującą rolę w rozwoju płuc rozwoju płuc i jako kluczowy posttranskrypcyjny regulator sieci kierujących przebudowy tkanek podczas morfogenezy rozgałęzień. --- Ekspresja głównego substratu kinazy białkowej C MARCKS (myristoylated bogatego w alaninę substratu kinazy C) jest kontrolowana przez stabilność jego mRNA. Podczas gdy mRNA MARCKS jest długo żyjący w spoczynkowych fibroblastach (t1/2 = 14 h), jego okres półtrwania jest drastycznie wydłużony. czas półtrwania jest drastycznie zmniejszony (t1/2 = 2 h) w komórkach poddanych działaniu estrów forbolu w celu aktywacji kinazy białkowej C (PKC) lub poddanych działaniu czynników wzrostu. W pierwszym kroku w celu zbadania mechanizmu leżącego u jego podstaw zidentyfikowaliśmy zarówno element cis na MARCKS mRNA i odpowiadające mu czynniki trans-aktywujące. Fuzja kompletnego 3'-UTR lub określonych regionów 3'-UTR genu MARCKS do genu reporterowego lucyferazy powodowało drastyczny spadek ekspresji lucyferazy do poziomu 5-10% kontroli. 5-10% kontroli. Ta obniżona regulacja była wynikiem destabilizacji chimerycznego transkryptu chimerycznego transkryptu, jak wykazały testy RNA i Northern blot. Przez Eksperymenty RNase/EMSA i sieciowania UV, zidentyfikowaliśmy odcinek 52 nukleotydów [(CUUU)11(U)8] w 3'-UTR mRNA MARCKS specyficznie rozpoznawany przez dwa białka wiążące RNA, HuD i HuR. Te czynniki transaktywujące są członkami rodziny genów ELAV i wiążą sekwencję bogatą w CU MARCKS z wysokim powinowactwem. Nadekspresja HuD i HuR w mysich fibroblastach spowodowała uderzającą stabilizację uderzającą stabilizację endogennego mRNA MARCKS nawet w warunkach, w których mRNA MARCKS jest normalnie aktywnie degradowane, tj. po potraktowaniu komórek estrem forbolu. Dane te sugerują, że zidentyfikowany bogaty w CU cis-element 3'-UTR MARCKS MARCKS 3'-UTR jest zaangażowany w nadawanie niestabilności mRNA i że członkowie rodziny genów rodziny genów ELAV przeciwstawiają się temu efektowi. W oparciu o jego strukturalne i funkcjonalne właściwości, opisaną tutaj sekwencję (CUUU)11(U)8 można pogrupować w klasę III elementów bogatych w AU. --- Posttranskrypcyjne sieci regulacyjne są zależne od współdziałania wielu białek wiążących RNA. Białka wiążące RNA odgrywają główną rolę w procesach przetwarzania mRNA u ssaków. Byliśmy zainteresowani skoordynowanym działaniem dwóch białek wiążących RNA hnRNP A1 i HuR, obu stabilnych składników immunoselekcjonowanych kompleksów hnRNP i mające główną lokalizację jądrową. W szczególności przedstawiamy tutaj zastosowanie technologii RNA-immunoprecypitacji (RIP) -Chip w celu identyfikacji populacja transkryptów jądrowych związanych z hnRNP A1-RNP, wyizolowanych z ekstraktu jądrowego HuR WT lub HuR zubożonego (KO) mysiego zarodkowego komórek mysich zarodkowych fibroblastów (MEF). Wynikiem tej analizy była lista genów docelowych regulowanych przez HuR dla ich powiązania (zwiększonego lub zmniejszonego) z jądrowymi kompleksami hnRNP A1-RNP. Analiza PCR w czasie rzeczywistym została zastosowana do walidacji wybranej liczby jądrowych transkryptów mRNA, a także do identyfikacji transkryptów pre-spliced transkrypty (oprócz ich dojrzałego odpowiednika mRNA) w izolowanych jądrowych hnRNP A1-RNP. Stwierdzono, że różnicowo wzbogacone mRNA należą do GO istotnych dla procesów biologicznych przewidywanych dla hnRNP A1 i HuR (takich jak transport, transkrypcja, translacja, apoptoza i cykl komórkowy) wskazując na ich wspólną funkcję w metabolizmie mRNA. --- Białko wiążące RNA HuR reguluje stabilność wielu docelowych mRNA. Tutaj, donosimy, że HuR związany z nieulegającym translacji regionem 3 'mRNA kodującego długowieczność i białko SIRT1 reagujące na stres, stabilizowało SIRT1 mRNA i zwiększał poziom ekspresji SIRT1. Nieoczekiwanie stres oksydacyjny wywołał dysocjację kompleksu [HuR-SIRT1 mRNA], z kolei promując SIRT1 mRNA, zmniejszając obfitość SIRT1 i obniżając przeżywalność komórek. Kinaza punktu kontrolnego kinaza punktu kontrolnego cyklu komórkowego Chk2 była aktywowana przez H(2)O(2), wchodziła w interakcję z HuR i fosforyluje HuR przy resztach S88, S100 i T118. Mutacja tych reszt ujawniła złożony wzór wiązania HuR, przy czym S100 wydaje się być ważne dla dysocjacji [HuR-SIRT1 mRNA] po H (2) O (2). Nasze odkrycia pokazują, że HuR reguluje ekspresję SIRT1, podkreśla funkcjonalne powiązania między dwoma białkami reagującymi na stres i wskazują na udział Chk2 w tych procesach. --- Uważa się, że trwała aktywacja fibroblastów w procesie naprawy rany jest kluczowym a transformujący czynnik wzrostu (TGF)β jest uważany za jeden z kluczowych mediatorów odpowiedzi fibrogennej. jednym z kluczowych mediatorów odpowiedzi fibrogennej, przy czym szczegółowy mechanizm w dużej mierze nieznany. Tutaj odkryliśmy, że leczenie TGFβ1 może indukować znaczny wzrost wzrost ekspresji endogennego TGFβ1 poprzez zwiększenie stabilności mRNA w fibroblastach serca. fibroblastach serca. Dalsze badania wykazały, że leczenie TGFβ1 spowodowało translokację jądrowego HuR do cytoplazmy, który z kolei wiązał ARE w 3'UTR TGFβ1 i zwiększał mRNA. TGFβ1 i zwiększało stabilność mRNA, jak wynika z RNA-IP i testu reporterowego i testu reporterowego. Knockdown HuR zmniejszył endogenną ekspresję TGFβ1 pod wpływem egzogennego leczenia TGFβ1. egzogennego leczenia TGFβ1, jednocześnie ze spadkiem ekspresji Col1a, Col3a i ekspresji fibronektyny. Nasze badanie ustanowiło obwód sprzężenia zwrotnego TGFβ1/HuR regulujący odpowiedź fibrogenną w fibroblastach, a celowanie w to sprzężenie zwrotne ma ogromny potencjał w kontrolowaniu zwłóknienia. --- Ludzkie białko wiążące RNA HuR, nukleocytoplazmatyczne białko wahadłowe, jest wszechobecnie wyrażanym członkiem rodziny białek Hu. wszechobecnie wyrażanym członkiem rodziny białek Hu, które składają się z dwóch N-końcowych motywów rozpoznających RNA (RRM1 i RRM2), regionu zawiasowego i C-końcowego RRM (RRM3). Chociaż eksperymenty in vitro wykazały bezkrytyczne wiązanie białek Hu syntetyzowanych w systemach bakteryjnych do wielu różnych elementów elementy bogate w AU (ARE), badania in vivo wskazały na cytoplazmatyczną rolę białka HuR w antagonizowaniu szybkiego rozpadu niektórych specyficznych mRNA zawierających ARE mRNA, w zależności od sytuacji fizjologicznych. Poprzez ektopową nadekspresję HuR i jego zmutowanych pochodnych w komórkach NIH 3T3 w celu naśladowania regulacji HuR w górę specyficznych mRNA zawierających ARE w innych systemach, zbadaliśmy in vivo specyficzność wiązania ARE przez HuR i przeanalizowaliśmy jego funkcjonalnie krytyczne domeny. Pokazujemy, że w komórkach NIH 3T3, HuR stabilizuje przekazy reporterowe zawierające tylko c-fos ARE, a nie inne ARE. Zidentyfikowano dwa różne miejsca wiązania w obrębie c-fos ARE, domenę zawierającą 5' AUUUA i domenę zawierającą 3' domena zawierająca odcinek U. Te działania HuR znacznie różnią się od innego białka wiążącego ARE, hnRNP D (określanego również jako AUF1), które in vivo rozpoznaje powtórzenia AUUUA występujące w cytokinach ARE i może wywierać zarówno stabilizujące i destabilizujące. Dalsze eksperymenty wykazały, że dowolna kombinacja dwóch z trzech domen RRM HuR jest wystarczająca do silnego wiązania z ARE c-fos ARE in vitro i wywierania efektu stabilizacji RNA in vivo porównywalnego do do nienaruszonego HuR i że region zawiasowy zawierający sygnały nukleocytoplazmatyczne jest zbędny dla efektu stabilizacji HuR. Nasze dane sugerują, że specyficzność wiązania ARE HuR in vivo jest modulowana w celu interakcji a tym samym regulować określone ARE w sposób zależny od typu komórki i stanu fizjologicznego. sposób zależny od typu komórki i stanu fizjologicznego. --- Cytoplazmatyczny eksport białka wiążącego RNA HuR, proces, który krytycznie reguluje jego funkcję, został niedawno wykazany jako hamowany przez aktywowaną AMP kinazę białkową (AMPK). W niniejszym badaniu, leczenie ludzkich fibroblastów fibroblastów z aktywatorami AMPK, takimi jak 5-amino-imidazolo-4-karboksyamid rybozyd, antymycyna A i azydek sodu hamowały wzrost komórek i obniżały ekspresję genów proliferacyjnych. ekspresję genów proliferacyjnych. Zgodnie z przewidywaniami, aktywacja AMPK zmniejszyła zarówno cytoplazmatyczne poziomy HuR, jak i powiązanie HuR z docelowymi znakowanymi radioaktywnie transkryptami kodującymi takie geny proliferacyjne. Funkcja HuR była wcześniej wykazano, że jest zaangażowana w utrzymanie fenotypu "młodej komórki" w modelach replikacyjnego starzenia się komórek. Postulowaliśmy zatem, że aktywacja AMPK w ludzkich fibroblastach może przyczyniać się do wdrożenia fenotypu starzenia poprzez mechanizmy fenotypu starzenia poprzez mechanizmy obejmujące zmniejszenie obecności cytoplazmatycznej HuR w cytoplazmie. Rzeczywiście, stosunek AMP:ATP był 2-3-krotnie wyższy w starzejących się fibroblastach w porównaniu z młodymi fibroblastami. fibroblastach w porównaniu z młodymi fibroblastami. Odpowiednio, starzeniu in vitro towarzyszył znaczny wzrost aktywności AMPK. Dowody na to, że zwiększona aktywność AMPK bezpośrednio przyczyniła się do wdrożenia fenotypu starzenia fenotypu uzyskano za pomocą dwóch podejść eksperymentalnych. Po pierwsze, zastosowanie aktywatorów AMPK aktywatorów AMPK wywołało cechy starzenia w fibroblastach, takie jak nabycie aktywności beta-galaktozydazy (beta-gal) związanej ze starzeniem się i zwiększona ekspresja p16INK4a. Po drugie, zakażenie komórek wektorem adenowirusowym wektorem adenowirusowym, który wyraża aktywny AMPK, zwiększyło związaną ze starzeniem aktywność beta-gal aktywność, podczas gdy infekcja adenowirusem, który wyraża dominująco-ujemny AMPK zmniejszała aktywność beta-gal związaną ze starzeniem się. Razem, nasze wyniki wskazują, że aktywacja AMPK może powodować przedwczesne starzenie się fibroblastów poprzez mechanizmy, które prawdopodobnie obejmują zmniejszoną funkcję HuR.
Jakie są główne funkcje ludzkiego białka HuR (ELAVL1) w fibroblastach?
HuR jest białkiem wiążącym RNA, które może stabilizować labilne mRNA zawierające elementy bogate w AU w ich 3' regionach nieulegających translacji i wykazano, że przemieszcza się między jądrem a cytoplazmą. Wcześniej wykazano, że funkcja HuR jest związana z utrzymaniem fenotypu "młodej komórki" w modelach replikacyjnego starzenia się komórek. Utrata HuR jest związana ze zmniejszoną ekspresją genów proliferacyjnych podczas starzenia replikacyjnego. Co ważne, nadekspresja HuR w starzejących się komórkach przywróciła "młodszy" fenotyp, podczas gdy zmniejszenie ekspresji HuR zaakcentowało starzejący się fenotyp. HuR wiązał się z 3' nieulegającym translacji regionem mRNA kodującym białko SIRT1 odpowiadające na długowieczność i stres, stabilizował mRNA SIRT1 i zwiększał poziom ekspresji SIRT1. W komórkach mezenchymalnych HuR odgrywa dominującą rolę w rozwoju płuc i jako kluczowy potranskrypcyjny regulator sieci kierujących przebudową tkanek podczas morfogenezy rozgałęzień. W fibroblastach knockdown HuR zmniejszył endogenną ekspresję TGFβ1 pod wpływem egzogennego TGFβ1, jednocześnie ze spadkiem ekspresji Col1a, Col3a i fibronektyny.  HuR (ludzki antygen R), hamuje translację mRNA ARF, utrzymując w ten sposób replikacyjną żywotność mysich fibroblastów embrionalnych (MEF). HuR jest uważany za globalny regulator progresji cyklu komórkowego i nowotworzenia. Poprzez swój posttranskrypcyjny wpływ na określone docelowe mRNA, HuR może zmieniać odpowiedź komórkową na bodźce proliferacyjne, stresowe, apoptotyczne, różnicujące, starzenia, zapalne i immunologiczne.