Sekwencje DNA klonu cDNA i makrojądrowego fragmentu genomowego odpowiadającego funkcjonalnej kopii genu antygenu powierzchniowego SerH3 Tetrahymena thermophila. Tetrahymena thermophila zostały określone. Testy wydłużania starterów i ochrony przed nukleazą pokazują, że jednostka transkrypcyjna SerH3 ma długość 1,425 nukleotydów i nie zawiera intronów. i nie zawiera intronów. Przewidywany polipeptyd kodowany przez gen SerH3 ma masę cząsteczkową 44 415 daltonów; jedna trzecia z 439 reszt to cysteiny, seryny lub treoniny. Środkowa połowa polipeptydu składa się z trzech homologicznych domen w układzie tandemowym; w tych domenach cysteiny, proliny i tryptofanu występują w bardzo regularnych wzorach. --- Synteza antygenu powierzchniowego serotypu H3 (SerH3) jest zależna od temperatury i reaguje w ciągu 1 godziny na zmianę warunków inkubacji (G.A. Bannon, R. Perkins-Dameron i A. Allen-Nash, Mol. Cell. Biol. 6:3240-3245, 1986). Ostatnio, klon cDNA Tetrahymena thermophila (pC6; D.W. Martindale i P.J. Bruns, Mol. Cell. Biol. 3: 1857-1865, 1983) wykazano, że jest homologiczny do mRNA SerH3 (F.P. Doerder i R.L. Hallberg, komunikacja osobista) i wykazano, że komunikacja) i wykazano, że poziomy komórkowe tego RNA gwałtownie zmniejszyły się, gdy komórki zostały przesunięte z 30 do 41 stopni C (R.L. Hallberg, K.W. Kraus i R.C. Findly, Mol. Cell. Biol. 4:2170-2179, 1984). Te obserwacje wskazują, że synteza białka SerH3 jest wysoce regulowana w odpowiedzi na temperaturę i doprowadziły nas do rozpoczęcia badań w celu określenia mechanizmu (mechanizmów) przez który kontroluje ekspresję genu SerH3. Używając pC6 jako sondy hybrydyzacyjnej dla mRNA SerH3, ustaliliśmy, że (i) poziom syntezy białka SerH3 jest bezpośrednio skorelowany z ilością wiadomości SerH3 dostępnej do translacji (ii) istnieje co najwyżej dwukrotna różnica między względnymi szybkościami transkrypcji genów SerH3. transkrypcji genów SerH3 w 30 i 40 stopniach C; (iii) okres półtrwania SerH3 mRNA w komórkach inkubowanych w 30 stopniach C jest dłuższy niż 1 h, podczas gdy okres półtrwania w komórkach inkubowanych w 30 stopniach C jest dłuższy niż 1 h. w komórkach inkubowanych w temperaturze 40 stopni C wynosi tylko około 3 min. Te wyniki pokazują, że ekspresja białka powierzchniowego Tetrahymena SerH3 jest regulowana przez obfitość mRNA. Co więcej, głównym mechanizmem kontrolującym jest dramatyczna, zależna od temperatury zmiana stabilności mRNA SerH3. --- U Tetrahymena thermophila ekspresja specyficznego dla temperatury białka powierzchniowego znanego jako SerH3 jest kontrolowana głównie przez zależną od temperatury zmianę w stabilności mRNA kodującego to białko. W temperaturze 30 stopni C mRNA SerH3 wykazuje okres półtrwania wynoszący 60 minut, podczas gdy w 40 stopniach C zmniejsza się do zaledwie 3 minut. Użyliśmy zmutowanej linii komórkowej Tetrahymena (rseB) wadliwą w ekspresji SerH3 w 30 stopniach C, aby zbadać mechanizmy związane ze stabilnością mRNA zależną od temperatury. Wyniki testów in in vitro oraz analizy Northern i slot blot cytoplazmatycznego i jądrowego RNA pokazują, że locus rseB koduje produkt wrażliwy na temperaturę. produkt, który nie ma wpływu na transkrypcję genu SerH3 ani na poziomy poziomy jądrowego RNA SerH3. Jednak produkt tego locus ma dramatyczny wpływ na dramatyczny wpływ na cytoplazmatyczne poziomy mRNA SerH3 w 30 stopniach C, wskazując, że ekspresja genu SerH3 jest zaburzona potranskrypcyjnie w cytoplazmie. cytoplazmie. Aby zbadać możliwość, że locus rseB kontroluje stabilność mRNA SerH3 mRNA, opracowaliśmy test rozpadu mRNA in vitro. Test ten z powodzeniem powiela zróżnicowany rozpad mRNA SerH3 obserwowany w komórkach typu w komórkach typu dzikiego hodowanych w różnych temperaturach. Pozorny okres półtrwania SerH3 w ekstraktach cytoplazmatycznych pochodzących z komórek hodowanych w temperaturze 30 stopni C wynosi około 45 minut, podczas gdy w ekstraktach cytoplazmatycznych pochodzących z komórek hodowanych w temperaturze 40 stopni C wynosi tylko 6 minut. Gdy podobne eksperymenty są wykonywane przy użyciu ekstraktów przygotowanych z linii komórkowej Tetrahymena rseB, stwierdzamy, że SerH3 jest stabilny tylko w ekstrakcie przygotowanym z komórek hodowanych w warunkach w których mRNA gromadzi się do wykrywalnych poziomów w cytoplazmie. Te Wyniki te wskazują, że produkt locus rseB jest transaktywującym czynnikiem cytoplazmatycznym. czynnikiem cytoplazmatycznym, który wywiera wpływ na ekspresję genu SerH3 poprzez regulację stabilności mRNA stabilność mRNA SerH3. --- U orzęsków tylko jedna z alternatywnych form immunodominującej glikoproteiny błonowej glikoproteiny zwykle pokrywa zewnętrzną powierzchnię komórki. Takie wzajemne jest regulowane na poziomie przedtranslacyjnym przez mechanizmy, które powodują w ekspresji pojedynczego genu białka. U holotrich Tetrahymena thermophila pięć alternatywnych białek unieruchamiających powierzchnię komórki (i-antygeny) ulegają ekspresji w różnych warunkach temperatury (L, H, T) i podłoża hodowlanego (I, S). hodowli (I, S). Stosując poliklonalne i monoklonalne przeciwciała przeciwko tym białkom oraz sondę cDNA pochodzącą z cDNA pochodzącego z genu SerH3, ponownie zbadaliśmy ekspresję i-antygenów w pożywce uzupełnionej 0,2 M NaCl. Stwierdziliśmy, że oprócz S, antygeny H i L są również obecne na powierzchni komórek. Podczas gdy wszystkie trzy i-antygeny mogą być jednocześnie obecne na powierzchni komórek, kombinacje S/L i S/H są częstsze. W porównaniu do komórek wyrażających H i L pojedynczo, poziom mRNA poziom mRNA H3 jest zmniejszony, a podzbiór rodziny polipeptydów L ulega zmiennej ekspresji. jest zmiennie wyrażany. Ekspresja S rozpoczyna się w ciągu 30 minut po przeniesieniu do pożywki NaCl, podczas gdy ekspresja L rozpoczyna się od trzech dni do kilku tygodni po transferze. tygodni po przeniesieniu. Kiedy komórki są przenoszone z pożywki uzupełnionej NaCl pożywki, S jest wyłączane w ciągu 24 godzin, a L jest wyrażane przez co najmniej 1 tydzień przed do powrotu pełnej ekspresji H. Chociaż te różnice w kinetyce sugerują różnice w mechanizmach kontroli, brak I i T na powierzchni komórek powierzchni komórek hodowanych w NaCl sugeruje, że istnieje również wspólne powiązanie regulacyjne między H, S i L.(ABSTRAKT SKRÓCONY DO 250 SŁÓW) --- Locus SerH u Tetrahymena thermophila jest jednym z kilku paralogicznych loci z genami genów kodujących warianty głównego białka powierzchniowego komórki znanego jako antygen unieruchamiający (i-ag). Locus jest wysoce polimorficzny, co budzi pytania dotyczące równoważności funkcjonalnej i sił selektywnych działających na jego wiele alleli. Tutaj porównujemy sekwencje i ekspresję SerH1, SerH3, SerH4, SerH5 i SerH6. Prekursorowe i-agi są bardzo podobne. Są bogate w alaninę, serynę, treoninę i cysteinę i mają prawie identyczne sygnały translokacji ER i sygnały dodawania GPI. Lokalizacje 39 cystein są wysoce konserwowane, szczególnie w 3,5 centralnych, niedoskonałych powtórzeniach tandemowych, w których 8 okresowych cystein w których 8 okresowych cystein przerywa naprzemiennie krótkie i długie odcinki aminokwasów. Wzorce hydrofobowości są również zachowane. Niemniej jednak, identyczność sekwencji aminokwasów identyczność sekwencji aminokwasów jest niska i wynosi od 60,7 do 82,9%. Na poziomie nukleotydów od 9,7 do 26,7% miejsc nukleotydowych jest polimorficznych w porównaniach parami. porównaniach parami. Ekspresja każdego allelu jest regulowana przez wrażliwą na temperaturę stabilność mRNA. stabilność mRNA. H mRNA są stabilne w temperaturze <36 stopni, ale niestabilne w temperaturze >36 stopni. MRNA H5, na który temperatura ma mniejszy wpływ, ma inny układ przypuszczalnego motywu destabilizacji mRNA AUUUA. Analiza statystyczna Analiza statystyczna genów SerH wskazuje, że allele wielokrotne są neutralne. Znacząco niskie stosunki szybkości nonsynonimicznych do synonimicznych substytucji aminokwasów sugerują, że allele wielokrotne podlegają oczyszczającej (negatywnej) selekcji wymuszającej ograniczenia struktury. --- Ekspresja białek powierzchniowych Tetrahymena o serotypie H3 (SerH3) i serotypie T (SerT) podlega regulacji środowiskowej. SerH3 ulega ekspresji, gdy komórki są inkubowane między temperaturami 20 i 35 stopni C, podczas gdy SerT jest ekspresji, gdy komórki są hodowane w temperaturach powyżej 35 stopni C. Użycie klonu cDNA SerH3 cDNA jako sondy hybrydyzacyjnej, ustaliliśmy, że (i) gen SerH3 jest członkiem rodziny członkiem rodziny wielogenowej; (ii) większość członków tej rodziny wielogenowej jest zmiennie rearanżowana podczas rozwoju makrojądrowego; oraz (iii) gen, który produkuje mRNA SerH3 jest odtwarzalnie rearanżowany podczas rozwoju makrojądrowego. rozwoju makrojądrowego.
Jak można regulować ekspresję antygenu unieruchamiającego SerH3?
Ekspresja białek powierzchniowych Tetrahymena o serotypie H3 (SerH3) podlega regulacji temperaturowej. SerH3 ulega ekspresji, gdy komórki są inkubowane w temperaturach od 20 do 35 stopni C.