Aby ocenić funkcje trzech ludzkich enzymów typu MutT, MTH1, MTH2 i NUDT5, indukcja mutacji przez utlenioną formę dGTP, 8-hydroksy-2'-deoksyguanozyny 5'-trifosforanu (8-OH-dGTP; 7,8-dihydro-8-okso-2'-deoksyguanozyny 5'-trifosforan), zbadano przy użyciu ludzkich komórek 293T traktowanych ich specyficznymi siRNA. Wahadłowy plazmid DNA zawierający gen gen supF został najpierw transfekowany do komórek, a następnie 8-OH-dGTP został za pomocą ciśnienia osmotycznego. Komórki Escherichia coli były transformowane z DNA replikowanym w leczonych komórkach. Znokautowanie białek MTH1, MTH2, i NUDT5 zwiększyło mutacje substytucji A:T --> C:G indukowane przez 8-OH-dGTP. Ponadto, wzrost częstotliwości indukowanych mutacji był bardziej bardziej widoczny w komórkach potrójnie znokautowanych. Wyniki te wskazują, że wszystkie trzy ludzkie białka MTH1, MTH2 i NUDT5 działają jako obrona przed mutagenezie indukowanej przez utleniony dGTP. --- Większość białek niosących 23-pozostałościową sekwencję związaną z MutT jest w stanie hydrolizowania związków o ogólnej strukturze difosforanu nukleozydu połączonej z inną cząsteczką X i są nazywane hydrolazami Nudix. Wśród 22 ludzkich białek Nudix (zidentyfikowanych na podstawie sygnatury sekwencji), niektóre pozostają niescharakteryzowane jako enzymy bez zdefiniowanego substratu. Tutaj ujawniamy, że białko NUDT18, którego substrat był nieznany, może degradować 8-okso-7,8-dihydroguaniny (8-okso-Gua) zawierających difosforany nukleozydów do monofosforanów. monofosforanów. Ponieważ enzym ten jest blisko spokrewniony z MTH1 (NUDT1) i MTH2 (NUDT15), proponujemy nadać mu nazwę MTH3. Chociaż te trzy ludzkie białka przypominają się nawzajem w swoich sekwencjach, ich specyficzność substratowa znacznie się różnią. MTH1 rozszczepia 8-okso-dGTP, ale nie 8-okso-dGDP, podczas gdy MTH2 może degradować zarówno 8-okso-dGTP, jak i 8-okso-dGDP, chociaż wewnętrzna aktywność enzymatyczna MTH2 jest znacznie niższa. aktywność enzymatyczna MTH2 jest znacznie niższa niż MTH1. Z drugiej strony, MTH3 jest specyficznie aktywny wobec 8-okso-dGDP i prawie nie rozszczepia 8-okso-dGTP. Inne typy utlenionych difosforanów nukleozydów, 2-hydroksy-dADP i 8-hydroksy-dADP, były również hydrolizowane przez MTH3. Inną godną uwagi cechą enzymu MTH3 jest jego działanie w kierunku odpowiednika rybonukleotydu. MTH3 może degradować 8-okso-GDP tak samo wydajnie jak 8-okso-dGDP, co kontrastuje z odkryciem, że że MTH1 i MTH2 wykazują ograniczoną aktywność wobec odpowiednika rybonukleotydowego, 8-okso-GDP. odpowiednika rybonukleotydu, 8-okso-GTP. Te trzy enzymy mogą funkcjonować razem, aby pomóc utrzymać wysoką wierność replikacji i transkrypcji DNA w warunkach stresu oksydacyjnego. stresie oksydacyjnym. --- Uszkodzenia oksydacyjne mogą być indukowane przez wiele stresorów środowiskowych. 8-hydroksydeoksyguanozyna (8-OHdG) została wykorzystana jako biomarker oksydacyjnego uszkodzenia DNA zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo. zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo. W niniejszym badaniu szczury rasy Wistar były narażone na działanie radonu w stężeniu 100 000 Bq/m(3) przez 12 h/d przez 30, 60 i 120 dni, co odpowiada dawkom skumulowanym wynoszącym odpowiednio 60, 120 i 240 miesięcy roboczych (WLM). roboczych (WLM), odpowiednio. Zmiany w poziomach 8-OHdG, reaktywnych form tlenu reaktywnych form tlenu (ROS) i całkowitego przeciwutleniacza (T-AOC), a także ekspresji niektórych enzymów naprawy DNA, takich jak 8-oksyda DNA, takich jak glikozylaza DNA 8-oksoguaniny (OGG1) i homolog MutT 1 (utleniona trifosfataza nukleozydów purynowych, MTH1), oznaczono w moczu szczurów, limfocytach krwi obwodowej i płucach po ekspozycji na radon. Wyniki ujawniły wzrost poziomów 8-OHdG i ROS, spadek poziomów T-AOC oraz obniżone poziomy ekspresji OGG1 i MTH1. Podwyższona ilość 8-OHdG w moczu lub limfocytach była dodatnio skorelowana ze skumulowaną dawką ekspozycji, podczas gdy poziomy ekspresji OGG1 i MHT1 w płucach były odwrotnie skorelowane z łączną dawką narażenia. skumulowaną dawką ekspozycji. Wyniki te wskazują, że uszkodzenia oksydacyjne indukowane przez radon mogą być zaangażowane w kancerogenezę indukowaną radonem. --- Szereg czynników środowiskowych, takich jak tytoń i alkohol, zostało poprzez oksydacyjne uszkodzenie DNA, w rozwoju raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (SCCHN). raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (SCCHN). Kilka szlaków jest zaangażowanych w naprawy uszkodzeń DNA spowodowanych stresem oksydacyjnym, takich jak system naprawy (BER), który naprawia mutacje obejmujące 8-oksoguaninę i obejmuje geny MUTYH, OGG1 i MTH1. Przeanalizowaliśmy 29 pacjentów, oceniając germinalne polimorfizmy polimorfizmów lub mutacji w tych genach poprzez pełne sekwencjonowanie genomów eksonów i sąsiadujących regionów intronowych. Trzydziestu zdrowych dawców krwi służyło jako zdrowych dawców krwi. Nie zidentyfikowano żadnych patogennych mutacji germinalnych. Znaleźliśmy powszechne i i rzadkie nowe warianty w regionach kodujących i sąsiadujących regionach intronowych. Podsumowując, nasze dane nie potwierdzają istotnej roli wariantów MUTYH, OGG1 i MTH1 w etiologii etiologii sporadycznych płaskonabłonkowych raków jamy ustnej i gardła. Nie wyklucza to wyklucza zaangażowania tych trzech genów BER w nowotworzenie SCCHN poprzez inne mechanizmy, takie jak hipermetylacja promotora, rearanżacje genomowe lub mutacje rearanżacje genomowe lub mutacje obejmujące sekwencje regulatorowe. --- Wychwyt glukozy, pierwszy, ograniczający szybkość etap jej wykorzystania, jest ułatwiony przez transportery glukozy. przez transportery glukozy. Ekspresja kilku genów transportera glukozy (HXT) w drożdżach jest tłumiona przez represor Rgt1, który rekrutuje transkrypcję reagujący na glukozę czynnik transkrypcyjny Mth1 i ogólny kompleks korepresorowy Ssn6-Tup1 pod nieobecność glukozy; jednak jest on tłumiony, gdy Mth1 jest inaktywowany przez glukozę. Tutaj pokazujemy, że Ssn6-Tup1 zakłóca zdolność wiązania DNA zdolność wiązania DNA Rgt1 pod nieobecność Mth1 i że funkcja Rgt1 zniesiona przez nadekspresję Ssn6 jest przywracana przez ko-overekspresję Mth1. Zatem Mth1 prawdopodobnie reguluje funkcję Rgt1 nie poprzez modulowanie jego aktywności wiązania DNA bezpośrednio, ale poprzez funkcjonalne antagonizowanie Ssn6-Tup1. Mth1 robi to, działając jako białko podobne do rusztowania, aby rekrutować Ssn6-Tup1 do Rgt1. Dowody potwierdzające pokazują że Mth1 blokuje zależną od kinazy białkowej A fosforylację Rgt1, która upośledza zdolność Rgt1 do interakcji z Ssn6-Tup1. Warto zauważyć, że Rgt1 może wiązać DNA pod nieobecność Ssn6-Tup1, ale nie hamuje transkrypcji, sugerując że dysocjacja Rgt1 z Ssn6-Tup1, ale nie z DNA, jest konieczna i wystarczające do ekspresji genów docelowych. Podsumowując, te odkrycia pokazują, że Mth1 jest transkrypcyjnym korepresorem, który ułatwia rekrutację Ssn6-Tup1. rekrutację Ssn6-Tup1 przez Rgt1. --- Odwracalna natura fosforylacji białek dyktuje, że każda aktywność kinazy białkowej kinaza musi być równoważona przez aktywność fosfatazy białkowej. Jak fosfatazy celują w specyficzne substraty fosfoproteinowe i odwracają działanie kinaz. kinaz jest jednak słabo poznane w kontekście biologicznym. Odpowiadamy na to pytanie poprzez wyjaśnienie nowej funkcji konserwatywnej fosfatazy z rodziny PP4 Pph3-Psy2, drożdżowego odpowiednika ssaczego kompleksu PP4c-R3, w szlaku sygnalizacji glukozy szlaku sygnalizacji glukozy. Nasze badania pokazują, że Pph3-Psy2 specyficznie celuje w białko przekaźnika sygnału glukozy Mth1 poprzez bezpośrednie wiązanie domeny EVH1 podjednostki regulatorowej Psy2 do motywu poliprolinowego Mth1. Ta aktywność jest wymagana do terminowej defosforylacji represora transkrypcji represora Rgt1 po odstawieniu glukozy, co jest krytycznym wydarzeniem w represji genów genów HXT, które kodują transportery glukozy. Pph3-Psy2 defosforyluje Mth1, korepresor związany z Rgt1, ale nie fosforyluje Rgt1 w miejscach związanych z inaktywacją, in vitro. Pokazujemy, że fosfataza Pph3-Psy2 antagonizuje fosforylację Mth1 przez kinazę białkową A (PKA), główną kinazę białkową aktywowaną w odpowiedzi na glukozę. kinazę aktywowaną w odpowiedzi na glukozę, in vitro i reguluje funkcję Mth1 poprzez domniemane miejsca fosforylacji PKA in vivo. Wnioskujemy, że fosfataza Pph3-Psy2 moduluje aktywność Mth1, aby ułatwić precyzyjną regulację ekspresji genu HXT przez glukozę. przez glukozę. --- Białko MTH1 katalizuje hydrolizę oksydacyjnie uszkodzonych nukleotydów purynowych w tym 8-hydroksy-DGTP do monofosforanów. Białko MTH1 wydaje się działać jako ważny system obronny przed mutagenezą, rakotwórczością i śmiercią komórek indukowaną przez utlenione nukleotydy purynowe. Wcześniej informowaliśmy, że grupy funkcyjne w pozycjach 2- i 6 pierścienia purynowego wpływają na rozpoznawanie przez ludzkie białko MTH1. 8-hydroksy-dGTP i 8-hydroksy-dATP są substratami substratami MTH1 i oba mają strukturę "7,8-dihydro-8-okso". W tym zbadano trzy analogi nukleotydów zawierające ten motyw. Syntetyczny purynowy zawierający strukturę 7,8-dihydro-8-okso i funkcję 2-amino (dJTP) był hydrolizowany do monofosforanu z wysoką wydajnością przez MTH1. Z drugiej strony, dwa analogi, które nie mają dwupierścieniowego układu swoich zasad [formamidopirymidyna-dGTP (FAPY-dGTP) i 2-OH-dYTP] były słabymi substratami. FAPY-dGTP jest mieszaniną konformerów i był hydrolizowany ponad dziesięciokrotnie mniej wydajniej niż 8-hydroksy-dGTP. Wyniki te wyjaśniają wpływ grupy 2-aminowej i dwupierścieniowego układu zasady purynowej na rozpoznawanie przez ludzkie białko MTH1. --- 8-Oxo-7,8-dihydroguanina (8-oxoGua) jest generowana w kwasach nukleinowych, jak również w ich prekursorach w wyniku działania rodników tlenowych wytwarzanych przez normalny metabolizm komórkowy. Ponieważ utleniona guanina może łączyć się zarówno z cytozyną, jak i adeniną, powoduje zmiany w ekspresji fenotypowej, gdy jest obecna w RNA. w RNA. Aby temu zapobiec, organizmy muszą posiadać mechanizm eliminacji utlenionych nukleotydów guaninowych z RNA i jego prekursorów. W ssaków, białka MTH1 i NUDT5 degradują 8-oksoGTP i 8-oksoGDP do 8-oksoGMP, który jest formą nieprzydatną do syntezy RNA. W poszukiwaniu białek funkcjonujących na poziomie RNA, białko fosforylazy polinukleotydowej (PNP) zostało zostało zasugerowane jako dobry kandydat do takiej roli. Ludzkie białko PNP ma zdolność do specyficznego wiązania się z RNA zawierającym 8-oksoGua. Kiedy ludzkie komórki są narażone na czynniki wywołujące stres oksydacyjny, takie jak nadtlenek wodoru i menadion, ilość białka PNP gwałtownie spada, podczas gdy ilość innych białek w komórkach nie zmienia się. białka w komórkach nie zmieniają się po takich zabiegach. Nie zaobserwowano specyficznego spadku w poziomie białka PNP obserwuje się, gdy komórki są traktowane ACNU i cykloheksymidem w dawkach wystarczających do zapewnienia tego samego stopnia supresji wzrostu. zahamowanie wzrostu. Wyniki te sugerują, że białko PNP może zatem odgrywać rolę w wykluczając utlenione formy RNA z mechanizmu translacji. --- Białka związane z MutT, w tym Escherichia coli MutT i ludzkie MTH1 (NUDT1), degradują trifosforan 8-okso-7,8-dihydrodeoksyguanozyny (8-okso-dGTP) do 8-okso-dGMP, a tym samym zapobiegają mutacjom spowodowanym błędną inkorporacją 8-oksoguaniny do DNA. Ludzka NUDT5, która ma wewnętrzną aktywność do rozszczepia cukry ADP do AMP i fosforanu cukru, posiada zdolność do degradacji 8-okso-dGDP do monofosforanu. Ponieważ 8-okso-dGDP i 8-okso-dGTP są konwertowalne przez enzymy komórkowe, NUDT5 może potencjalnie zapobiegać błędom podczas replikacji DNA. Dwie aktywności związane z NUDT5 wykazują różne zależności od pH; optymalne dla rozszczepienia rybozy ADP jest pH 7-9, podczas gdy dla 8-okso-dGDPazy wynosi około pH 10. Parametry kinetyczne dla dwóch typów reakcji wskazują, że ryboza ADP jest lepszym substratem dla NUDT5 w porównaniu z utlenionymi nukleotydami guaninowymi. Rozszczepienie 8-okso-dGDP było konkurencyjnie hamowane przez rybozę ADP i jej produkt reakcji, AMP, oraz w odwrotnie, rozszczepienie rybozy ADP było hamowane przez 8-okso-dGDP. Wyniki te sugerują, że te dwa typy substratów mogą dzielić to samo miejsce wiązania dla katalizy. --- MTH1 hydrolizuje utlenione trifosforany nukleotydów, zapobiegając w ten sposób ich włączeniu do DNA. Przedstawiamy tutaj struktury ludzkiego MTH1 (1,9Å) i jego kompleksu z produktem 8-okso-dGMP (1.8Å). Nieoczekiwanie MTH1 wiąże nukleotyd nukleotyd w konformacji anty, bez bezpośredniej interakcji między grupą 8-okso a białkiem. Sugerujemy, że specyficzność zależy od stabilizacji tautomerów enolowych formy 8-okso dGTP. Wiązanie produktu nie wywołuje większych zmian strukturalnych. Struktury ujawniają sposób wiązania nukleotydów w MTH1 i dostarczają strukturalnych podstaw do projektowania inhibitorów. projektowania.
Jaka jest funkcja enzymu MTH1 w komórkach nowotworowych?
Białko MTH1 katalizuje hydrolizę oksydacyjnie uszkodzonych nukleotydów purynowych, w tym 8-hydroksy-DGTP, do monofosforanów. Białko MTH1 wydaje się działać jako ważny system obronny przed mutagenezą, kancerogenezą i śmiercią komórek indukowaną przez utlenione nukleotydy purynowe.