Choroba Hirschsprunga (HSCR, aganglionic megacolon) jest częstą wrodzoną wadą rozwojową uznawaną za wielogenową neurokriopatię. wadą rozwojową uważaną za wielogenową neurokrystopatię. Trzy geny podatności podatności zostały niedawno zidentyfikowane w HSCR, a mianowicie protoonkogen RET, receptor gen receptora endoteliny B (EDNRB) i gen endoteliny 3 (EDN3). Mutacje genu RET stwierdzono w znacznym odsetku rodzinnych (50%) i sporadycznych (15-20%) HSCR, podczas gdy homozygotyczność dla mutacji EDNRB lub EDN3 stanowiła przyczynę rzadki związek HSCR z zespołem Waardenburga (WS). Ostatnio, heterozygotyczne EDNRB i EDN3 zostały zgłoszone u izolowanych pacjentów z HSCR. Niektóre z tych wyników uzyskano po zidentyfikowaniu genów myszy których naturalne lub ukierunkowane mutacje powodowały megakolon i plamistość koloru sierści. plamistość sierści. Istnieją również niezbite dowody na udział innych niezależnych loci w HSCR. niezależnych loci w HSCR. W szczególności, niedawna identyfikacja czynników neurotroficznych działających jako ligandy RET (GDNF i Neurturin) dostarcza dodatkowe geny kandydujące dla HSCR. Rozcięcie genetycznej etiologii choroby HSCR może stanowić wyjątkową okazję do rozróżnienia między chorobą poligeniczną i genetycznie heterogenną chorobą, pomagając w ten sposób zrozumieć innych złożonych zaburzeń i wrodzonych wad rozwojowych dotychczas uważanych za wieloczynnikowe. Wreszcie, badanie molekularnych podstaw HSCR jest również krokiem w kierunku zrozumienia również krokiem w kierunku zrozumienia genetyki rozwojowej jelitowego układu nerwowego. układu nerwowego, wspierając rolę kinazy tyrozynowej i szlaków sygnałowych w rozwoju neuronów jelitowych pochodzących z grzebienia nerwowego u ludzi. neuronów jelitowych u ludzi. --- Choroba Hirschsprunga (HSCR, aganglionic megacolon) jest częstą wrodzoną wadą rozwojową uznawaną za wielogenową neurokriopatię. wadą rozwojową uważaną za wielogenową neurokrystopatię. Trzy geny podatności podatności zostały niedawno zidentyfikowane w HSCR, a mianowicie protoonkogen RET, receptor gen receptora endoteliny B (EDNRB) i gen endoteliny 3 (EDN3). Mutacje genu RET stwierdzono w znacznym odsetku rodzinnych (50%) i sporadycznych (15-20%) HSCR, podczas gdy homozygotyczność dla mutacji EDNRB lub EDN3 stanowiła przyczynę rzadki związek HSCR z zespołem Waardenburga (WS). Ostatnio, heterozygotyczne EDNRB i EDN3 zostały zgłoszone u izolowanych pacjentów z HSCR. Niektóre z tych wyników uzyskano po zidentyfikowaniu genów myszy których naturalne lub ukierunkowane mutacje powodowały megakolon i plamistość koloru sierści. plamistość sierści. Istnieją również niezbite dowody na udział innych niezależnych loci w HSCR. niezależnych loci w HSCR. W szczególności, niedawna identyfikacja czynników neurotroficznych działających jako ligandy RET (GDNF i Neurturin) dostarcza dodatkowe geny kandydujące dla HSCR. Rozcięcie genetycznej etiologii choroby HSCR może stanowić wyjątkową okazję do rozróżnienia między chorobą poligeniczną i genetycznie heterogenną chorobą, pomagając w ten sposób zrozumieć innych złożonych zaburzeń i wrodzonych wad rozwojowych dotychczas uważanych za wieloczynnikowe. Wreszcie, badanie molekularnych podstaw HSCR jest również krokiem w kierunku zrozumienia również krokiem w kierunku zrozumienia genetyki rozwojowej jelitowego układu nerwowego. układu nerwowego, wspierając rolę kinazy tyrozynowej i szlaków sygnałowych w rozwoju neuronów jelitowych pochodzących z grzebienia nerwowego u ludzi. neuronów jelitowych u ludzi. --- Ligandy rodziny czynników neurotroficznych pochodzących z linii komórek glejowych (GDNF) (GFL) (GDNF, neurturyna, artemina i persefina) są krytycznymi regulatorami neurorozwoju i wspierają przeżycie neuronów dopaminergicznych śródmózgowia i neuronów ruchowych rdzenia kręgowego neurony ruchowe in vitro oraz w zwierzęcych modelach chorobowych, co czyni je atrakcyjnymi kandydatami terapeutycznymi w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych. GFL sygnalizują poprzez wieloskładnikowy kompleks receptorowy składający się z komponentu wiążącego o wysokim powinowactwie składnika wiążącego o wysokim powinowactwie (składnik alfa receptora rodziny GDNF (GFRalpha1-GFRalpha4)) i receptorowej kinazy tyrozynowej RET. Aby rozpocząć charakterystykę receptora GFL specyficzności na poziomie molekularnym, przeprowadziliśmy kompleksową mutagenezę skanowania homologów GDNF, prototypowego członka GFL. Zastąpienie krótkich segmentów GDNF homologicznymi segmentami persefiny (PSPN) (który nie może wiązać ani aktywować GFRalpha1.RET lub GFRalpha2.RET) zidentyfikował miejsca wzdłuż drugiego palca GDNF krytyczne dla aktywacji GFRalpha1.RET i kompleksów receptorów GFRalpha2.RET. Ponadto, wprowadzenie tych regionów z GDNF, neurturyny lub arteminy do PSPN wykazało, że są one wystarczające do aktywacji GFRalpha1. RET, ale dodatkowe determinanty są wymagane do interakcji z innymi GFRalfami. Ta różnica w molekularnych podstawach GFL-GFRalfa pozwoliła na produkcję GFRalfa1. agonistów specyficznych dla RET agonistów i stanowi podstawę do zrozumienia sygnalizacji GFL-GFRalpha.RET na poziomie molekularnym. --- Choroba Hirschsprunga (HSCR) jest wrodzonym zaburzeniem charakteryzującym się niedrożnością jelit spowodowaną z powodu braku zwojów śródściennych na różnych odcinkach jelita. jelita. RET jest głównym genem zaangażowanym w HSCR. Mutacje w genie GDNF i kodujące jeden z ligandów RET, samodzielnie lub w połączeniu z mutacjami RET, również mogą powodować HSCR. RET, mogą również powodować HSCR, podobnie jak mutacje w czterech innych genach (EDN3, EDNRB, ECE1 i SOX10). Jednak rzadkie mutacje w czterech ostatnich genach, są jednak mniej lub bardziej ograniczone do HSCR związanego z określonymi fenotypami. Opracowaliśmy opracowaliśmy nowy kompleksowy system wykrywania mutacji do analizy wszystkich oprócz trzech amplikonów genów RET i GDNF, w oparciu o elektroforezę w gradiencie denaturującym. elektroforezę. Korzystamy z dwóch gradientów mocznikowo-formamidowych nałożonych na siebie umożliwiając wykrywanie mutacji w szerokim zakresie temperatur topnienia. Dla trzech pozostałych (bogatych w GC) fragmentów PCR używamy kombinacji DGGE i stałej elektroforezy w żelu denaturującym (CDGE). Te dwa systemy podwójnego żelu znacznie ułatwiają skanowanie mutacji RET i GDNF, a także mogą służyć jako model do opracowania systemów wykrywania mutacji dla innych genów chorobowych. W badaniu przesiewowym przesiewowym 95 pacjentów z HSCR, mutacje RET znaleziono w dziewięciu z 17 przypadków rodzinnych (53%), wszystkie z długim segmentem HSCR. W 11 z 78 sporadycznych przypadków (14%), żaden nie miał długiego segmentu HSCR. Znaleziono tylko jedną mutację GDNF w sporadycznym przypadku. sporadycznym przypadku. --- Protoonkogen c-ret, RET, koduje receptorową kinazę tyrozynową. RET jest aktywowany przez członków rodziny ligandów czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF). które obejmują GDNF, neurturynę, arteminę i persefinę. Ligandy ligandy wiążą RET przez receptor alfa z rodziny GDNF, określany jako GFRalpha1-4. Pomimo znaczenie sygnalizacji RET w rozwoju jelitowego układu nerwowego i nerek, zróżnicowane mechanizmy sygnalizacji między ligandami RET są słabo poznane. słabo poznane. Sugeruje się, że specyficzność sygnału jest osiągana poprzez wiązanie ligandu z preferowanym GFRalfa. Aby porównać profile sygnalizacyjne GDNF i neurturyny, zidentyfikowaliśmy linię komórkową, NG108-15, która endogennie wyraża RET i GFRalpha1, ale nie GFRalpha2-4. Dane immunoblot wykazały, że GDNF powodował przejściową aktywację, podczas gdy neurturyna spowodowała trwałą aktywację zarówno kinaz p44/p42 MAP, jak i PLCgamma. W warunkach głodu surowicy komórki NG108-15 różnicują się i tworzą neuryty. neuryty. Neurturyna, ale nie GDNF, stymulowała wzrost neurytów, który mógł być blokowany przez selektywny inhibitor PLC U73122. Z drugiej strony, GDNF, ale nie neurturyna promowała przeżycie komórek, co mogło być blokowane przez inhibitor kinazy p44/p42 MAP PD98059. Nasze odkrycia nie tylko pokazują zróżnicowaną sygnalizację GDNF i neurturyny, ale także sugerują, że można to osiągnąć poprzez wiązanie do tego samego podtypu GFRalfa, co prowadzi do różnych odpowiedzi biologicznych. --- Czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF) i neurturyna (NTN) to dwa strukturalnie spokrewnione, silne czynniki przeżycia dla neuronów współczulnych, czuciowych i neuronów ośrodkowego układu nerwowego. GDNF pośredniczy w swoich działaniach poprzez wieloskładnikowy system receptorów składający się z wiążącego ligand białko związane z glikozylo-fosfatydyloinozytolem (GPI) (oznaczone jako GDNFR-alfa) i przezbłonowej białkowej kinazy tyrozynowej Ret. W przeciwieństwie do tego, mechanizm w którym przekazywany jest sygnał NTN nie jest dobrze poznany. Tutaj opisujemy identyfikację i dystrybucję tkankową białka związanego z GPI (oznaczonego jako NTNR-alfa), które jest strukturalnie związane z GDNFR-alfa. Ponadto wykazujemy że NTNR-alfa wiąże NTN (K[d] około 10 pM), ale nie GDNF z wysokim powinowactwem; że GDNFR-alfa wiąże NTN (K[d] około 10 pM), ale nie GDNF. powinowactwo; że GDNFR-alfa wiąże się z GDNF, ale nie NTN z wysokim powinowactwem; i że odpowiedzi komórkowe na NTN wymagają obecności NTNR-alfa. Wreszcie wykazać, że NTN, w obecności NTNR-alfa, indukuje fosforylację tyrozyny Ret i że NTN, NTNR-alfa i Ret tworzą fizyczny kompleks na powierzchni komórki. powierzchni. Odkrycia te identyfikują Ret i NTNR-alfa jako elementy sygnalizacyjne i receptora dla NTN i definiują nową rodzinę receptorów dla neurotransmiterów. nową rodzinę receptorów dla czynników neurotroficznych i różnicujących składających się z ze wspólnej przezbłonowej białkowej kinazy tyrozynowej i specyficznego liganda białka związanego z ligandem GPI. --- Receptory rodziny czynników neurotroficznych pochodzących z komórek glejowych (GDNF) alfa (GFRalfa) są glikoproteinami związanymi z powierzchnią komórki, które pośredniczą w interakcjach rodziny ligandów GDNF z receptorem RET. GDNF z receptorem RET. Interakcje te mają kluczowe znaczenie dla rozwoju nerek i niektórych linii nerwów obwodowych. U ludzi, mutacje RET lub ligandów RET są związane z wrodzoną nieprawidłowością Choroba Hirschsprunga (HSCR), w której nerwy i zwoje tylnego jelita są nieobecne. nieobecne. Ponieważ rodzina GFRalfa jest wymagana do normalnej aktywacji receptora RET są również kandydatami do roli w HSCR. Gen GFRA2, który jest wymagany do rozwoju splotu nerwu krezkowego, jest doskonałym genem kandydującym do genem kandydującym dla HSCR. W tym badaniu sklonowaliśmy ludzki locus GFRA2, scharakteryzowaliśmy strukturę genu i porównaliśmy go z innymi członkami rodziny GFRA członkami rodziny GFRA. Następnie zbadaliśmy gen GFRA2 pod kątem mutacji w panelu pacjentów z HSCR pacjentów z HSCR. GFRA2 ma dziewięć kodujących eksonów, które są podobne pod względem wielkości i organizacji do innych genów z rodziny GFRA. Zidentyfikowaliśmy sześć wariantów sekwencji GFRA2, z których cztery nie miały wpływu na sekwencję aminokwasową białka GFRalpha-2 białka. Dwie kolejne zmiany, które spowodowały substytucje aminokwasów, zostały znaleziono w eksonie 9 i przewidywano, że leżą one w sekwencji aminokwasowej kodującej sygnał wiązania glikozylofosfatydyloinozytolu GFRalpha-2. Nie było różnicy w częstości występowania któregokolwiek z wariantów sekwencji między populacjami kontrolnymi i HSCR populacjami. Nasze dane wskazują, że członkowie rodziny genów GFRA są ściśle blisko spokrewnieni pod względem struktury intronów/eksonów i sekwencji. Nie wykryliśmy żadnej korelacji między wariantami sekwencji GFRA2 a fenotypem HSCR. --- Protoonkogen RET koduje dwie izoformy receptorowej kinazy tyrozynowej, która odgrywa rolę w rozwoju grzebienia nerwowego i nerek. Ligandy Ret zostały niedawno zidentyfikowane jako czynnik przeżycia neuronów GDNF (Glial-Derived czynnik neurotroficzny) i neurturynę. Somatyczne rearanżacje RET, określane jako RET/PTC, są często wykrywane w raku brodawkowatym tarczycy. Ponadto Ponadto, różne mutacje linii zarodkowej genu RET zostały powiązane z dziedzicznymi zespołami nowotworowymi MEN (Multiple Endocrine Neoplasia) 2A, 2B i FMTC (Familial Medullar Thyroid Carcinomas), jak również z wrodzonym megacolon lub chorobą Hirschsprunga, podkreślając w ten sposób znaczącą rolę tego genu receptora w różnych stanach patologicznych u ludzi. W tym badaniu, wykonując klasyczne eksperymenty hamowania przy użyciu syntetycznych fosfopeptydów i przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce domniemanego miejsca dokowania, ustaliliśmy, że dla Grb2 to ostatnie jest dostarczane przez tyrozynę 620 długiej izoformy Ret/ptc2 (odpowiadająca Tyr 1096 na proto-Ret). Jednak w nienaruszonych komórkach interakcja Grb2 z dwiema krótkimi i długimi izoformami Ret wyrażonymi oddzielnie ma podobną siłę, co sugeruje, że krótka izoforma Ret Ret z Grb2 może być pośredniczona nie tylko przez Shc, ale także przez cząsteczkę która wiąże się preferencyjnie z tą izoformą. Ta możliwość jest wspierana przez dowody na to, że zmutowana długa izoforma Ret/ptc2Y620F wykazuje słabą koimmunoprecypitację z Grb2 i że ten mutant, pozbawiony miejsca dokowania dla Grb2, ale dzięki wszystkim innym fosfotyrozynom, zaskakująco wykazuje zmniejszoną aktywność transformującą w porównaniu do dwóch onkogenów WT. W ten sposób że w nienaruszonych komórkach obie izoformy Ret wiążą się z Grb2, chociaż w różny sposób. różnymi modalnościami. Ponadto, obecne wyniki są zgodne z możliwością że różne szlaki transdukcji sygnału są związane z dwoma izoformami Ret. dwie izoformy Ret. --- CEL: Mutacje w protoonkogenie RET występują w około jednej trzeciej sporadycznych raków rdzeniastych tarczycy (MTC), głównie w kodonie 918. Glejowy czynnik neurotropowy pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF) i jego związany z błoną receptor rodziny GDNF receptor alfa (GFRalfa-1), a także neurturynę (NTN) i jej związany z błoną receptor GFRalfa-2. receptor GFRalpha-2 tworzą kompleks z produktem RET, receptorową kinazą tyrozynową kinazą tyrozynową receptora, co skutkuje sygnalizacją do jądra. PROJEKT: Aby wyjaśnić rolę tych ligandów RET w nowotworzeniu MTC, ich ekspresja została określona w 15 próbkach MTC. określono w 15 próbkach MTC, jednym brodawkowatym raku tarczycy (PTC) i trzech prawidłowych próbkach tkanki tarczycy. METODY: Ekspresję mRNA RET, GDNF, GFRalfa-1, NTN i GFRalfa-2 zbadano metodą mRNA in situ zbadana metodą hybrydyzacji mRNA in situ i potwierdzona analizą odwrotnej analizę odwrotnej transkrypcji-PCR. WYNIKI: Żaden z pięciu genów nie ulegał ekspresji w prawidłowych tarczycach ani w PTC. PTC. Wszystkie MTC wykazywały ekspresję RET, 13 wyrażało GDNF, 12 wyrażało GFRalfa-1, a 9 wyrażało NTN i GFRalfa-2. W 7 guzach ekspresja RET, GDNF i GFRalfa-1 ulegały ekspresji na wysokim poziomie, a w pięciu z tych siedmiu guzów geny NTN i GFRalfa-2 również ulegały ekspresji na wysokim poziomie. Wysoki poziom ekspresji ekspresji był preferencyjnie obserwowany w komórkach nowotworowych sąsiadujących ze zrębem i tkanką łączną. tkanki łącznej. Wszystkie MTC bez ekspresji ligandów RET posiadały mutację kodonu RET w kodonie 918. WNIOSKI: Wyniki sugerują, że ten szlak sygnałowy jest ważny dla rozwoju MTC rozwoju MTC i że może być aktywowany przez ekspresję kompleksów ligandów RET przez same komórki nowotworowe. --- TŁO / CEL: W 1996 r. zidentyfikowano czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF) został zidentyfikowany jako jeden z ligandów receptora transmembranowego RET. W tym samym roku stwierdzono mutacje GDNF w połączeniu z mutacjami protoonkogenu RET mutacjami protoonkogenu RET u pacjentów z Hirschsprunga. Mutacje w GDNF per se nie są nie są ani konieczne, ani wystarczające do wywołania choroby Hirschsprunga (HD). Do tej pory nasza grupa badawcza zidentyfikowała mutacje GDNF tylko w 2 z 98 przypadków przypadków dysganglionozy jelitowej. Celem naszego badania było zbadanie możliwego deficytu ekspresji GDNF w jelitowym układzie nerwowym pacjentów z Hirschsprunga pacjentów bez mutacji genu GDNF. METODY: Użyliśmy króliczych przeciwciał poliklonalnych podniesionych przeciwko peptydowi odpowiadający aminokwasom 186-205 mapującym w domenie karboksy-końcowej ludzkiego GDNF. Ekspresję GDNF badano immunohistochemicznie w próbkach chirurgicznych z 30 przypadków HD (27 klasycznych form i 3 ultradługie formy) oraz z 10 dopasowanych wiekowo grup kontrolnych. Skrawki z tych samych próbek o pełnej grubości zostały zbadane za pomocą następujących technik histochemicznych i immunohistochemicznych acetylocholinoesterazy, dehydrogenazy mleczanowej, dehydrogenazy bursztynowej, alfa-naftyloesteraza, białko kwasu fibrylarnego gleju, białko S-100 i enolaza specyficzna dla neuronów. enolazę specyficzną dla neuronów. WYNIKI: Wysoki poziom ekspresji GDNF stwierdzono w normalnym jelicie oraz w zwoju Hirschsprunga. Hirschsprunga. Elementy satelitarne zwojów krezkowych wykazywały silną immunoreaktywność wobec GDNF. I odwrotnie, segment zwojowy wykazywał hiperinerwację cholinergiczną i przerostowe pnie włókien nerwowych w śródmięśniówce z mięśniowym z całkowitym brakiem ekspresji GDNF. Małe zwoje segmentu hipoganglionicznego wykazywały zmniejszoną immunoreaktywność GDNF. WNIOSKI: GDNF, daleko spokrewniony członek nadrodziny transformującego czynnika wzrostu nadrodziny transformującego czynnika wzrostu beta, jest silnym czynnikiem neurotroficznym i czynnikiem przeżycia dla neuronów i komórek zwojowych jelit. Mutacje genu GDNF lub deficyt ekspresji GDNF przerywają wierną sygnalizację GDNF przez Ret, przyczyniając się do patogenezy HD. do patogenezy HD. --- Aby wyjaśnić rolę składników sygnalizacyjnych Ret w rozwoju jelitowego układu nerwowego (ENS) oceniliśmy anatomię ENS i kurczliwość jelit u myszy heterozygotycznych dla Ret, GFRalpha1 i ligandów Ret. Analizy te wykazały, że czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF) i neurturyna są ważne dla różnych aspektów rozwoju ENS. dla różnych aspektów rozwoju ENS. Neurturyna jest niezbędna do utrzymania wielkości dojrzałych neuronów jelitowych i zakresu projekcji neuronalnych, ale nie wpływa na liczbę neuronów jelitowych. Dostępność GDNF określa liczbę neuronów jelitowych liczbę neuronów jelitowych poprzez kontrolowanie proliferacji prekursorów ENS. Jednak nie byliśmy nie byliśmy w stanie znaleźć dowodów na zaprogramowaną śmierć komórki w ENS typu dzikiego przez immunohistochemii dla aktywowanej kaspazy 3. Ponadto liczba neuronów jelitowych jest normalna u myszy Bax (-/-) i Bid (-/-), co sugeruje, że w przeciwieństwie do większości reszta układu nerwowego, zaprogramowana śmierć komórki nie jest ważna dla określania liczby neuronów jelitowych. Tylko łagodne zmniejszenie wielkości neuronów i liczby włókien neuronalnych występuje u myszy Ret(+/-) i Gfra1(+/-). Wszystkie te heterozygotyczne myszy mają jednak uderzające problemy z kurczliwością jelit i uwalnianiem neuroprzekaźników, wykazując, że sygnalizacja Ret jest krytyczna dla zarówno dla struktury, jak i funkcji ENS. --- Czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych (GDNF), ligand kinazy tyrozynowej RET kinazy tyrozynowej RET i jego ligandy rodzinne promują przeżycie i różnicowanie różnych neuronów. Badania ablacji genów ujawniły, że system receptorów GDNF-RET jest niezbędny do rozwoju neuronów nerkowych i obwodowych, w tym współczulnych, obwodowych i nerwowych. neuronów, w tym współczulnych, przywspółczulnych i jelitowych. RET może aktywować różne szlaki sygnałowe, takie jak RAS / regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym kinaza (ERK), 3-kinaza fosfatydyloinozytolu (PI3K)/AKT, p38 kinaza białkowa aktywowana mitogenem (MAPK). kinaza białkowa (MAPK) i c-Jun N-końcowa kinaza (JNK). Te szlaki sygnałowe są aktywowane poprzez wiązanie białek adaptorowych do wewnątrzkomórkowych reszt tyrozynowych RET fosforylowanych przez jego własną kinazę aktywność. RET jest głęboko zaangażowany w rozwój kilku ludzkich chorób neuroendokrynnych. chorób neuroendokrynnych. Konstytutywna aktywacja RET przez somatyczną rearanżację somatyczną rearanżację z innymi genami partnerskimi lub mutacjami linii zarodkowej powoduje znaczną populację ludzkich brodawkowatych raków tarczycy lub mnogiej gruczołów dokrewnych (MEN) odpowiednio typu 2A i 2B, podczas gdy dysfunkcja RET przez mutacje typu missense i/lub nonsensowne powoduje chorobę Hirschsprunga. chorobę Hirschsprunga. Właściwości biologiczne zmutowanego białka RET determinują fenotyp choroby. fenotyp choroby. Na przykład mutacja MEN 2B zmienia specyficzność substratową kinazy tyrozynowej kinazy tyrozynowej RET, a RET niosący mutację MEN 2B indukuje inny zestaw genów niż ten niosący mutację MEN 2B. inny zestaw genów niż mutacja MEN 2A. W tym przeglądzie, opisujemy aktualną wiedzę na temat molekularnego mechanizmu aktywacji RET w ludzkich nowotworach neuroendokrynnych, jak również roli fizjologicznej i i transdukcji sygnału kinazy tyrozynowej RET. --- Czynnik transkrypcyjny AP-1 c-Jun jest głównym regulatorem odpowiedzi aksonalnej w neuronach. c-Jun działa również jako negatywny regulator mielinizacji w komórkach Schwanna (SCs) i jest silnie reaktywowany w SCs po uszkodzeniu aksonów. Schwanna (SCs) i jest silnie reaktywowany w SCs po uszkodzeniu aksonów. My wykazać, że po urazie brak c-Jun specyficznie w SCs spowodował upośledzoną regenerację aksonów i znacznie zwiększoną śmierć komórek neuronalnych. Niedobór c-Jun skutkował zmniejszoną ekspresją kilku czynników neurotroficznych, GDNF i ArtNF. czynników neurotroficznych, a GDNF i Artemin, z których oba kodują ligandy dla receptora Ret kinazy tyrozynowej Ret, zostały zidentyfikowane jako nowe bezpośrednie geny docelowe c-Jun. Genetyczna inaktywacja Ret specyficznie w neuronach spowodowała defekty regeneracji bez wpływu na przeżycie motoneuronów i odwrotnie, podawanie rekombinowanego GDNF i białka Artemin znacznie złagodziło zaburzenia regenerację spowodowaną niedoborem c-Jun. Wyniki te ujawniają nieoczekiwaną funkcję c-Jun w SCs w odpowiedzi na uszkodzenie aksonów i identyfikują parakrynną sygnalizację Ret jako ważnego mediatora funkcji c-Jun w SCs podczas regeneracji. regeneracji. --- Protoonkogen ret koduje receptorową kinazę tyrozynową, której ligandy należą do rodziny białek do rodziny białek czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF). Jego mutacje germinalne są odpowiedzialne za rozwój mnogich nowotworów endokrynnych (MEN) typu 2A i 2B oraz choroby Hirschsprunga (HSCR). Mutacje MEN2A i MEN2B powodują konstytutywną aktywację Ret przez różne mechanizmy molekularne. mechanizmy molekularne. Mutacje MEN2A obejmują reszty cysteinowe obecne w zewnątrzkomórkowej domenie Ret w domenie zewnątrzkomórkowej i indukują dimeryzację Ret na powierzchni komórki. powierzchni komórki. Mutacje MEN2B zidentyfikowano w metioninie 918 w domenie kinazy tyrozynowej. kinazy i aktywują Ret bez dimeryzacji, prawdopodobnie z powodu prawdopodobnie z powodu zmiany konformacyjnej jego katalitycznego regionu rdzenia. W przeciwieństwie do mutacji MEN2 mutacje HSCR reprezentują mutacje utraty funkcji. Stwierdziliśmy, że że większość mutacji HSCR wykrytych w domenie zewnątrzkomórkowej upośledza ekspresję powierzchniową Ret. ekspresję powierzchniową Ret. Co ciekawsze, mutacje Ret w cysteinach 618 i 620 zostały zgłoszone w kilku rodzinach, w których rozwinęły się zarówno MEN2A, jak i HSCR. To było zasugerowano, że mutacje te mogą mieć dwa biologiczne skutki dla funkcji Ret prowadząc do rozwoju różnych fenotypów klinicznych u tych samych pacjentów. u tych samych pacjentów. --- Choroba Hirschsprunga (HSCR) jest częstą neurokrystopatią charakteryzującą się brakiem splotów podśluzówkowych i mięśniowych na zmiennej długości przewodu pokarmowego. przewodu pokarmowego. Rodowody i analizy segregacji sugerowały zaangażowanie jednego lub kilku dominujących genów o niskiej penetracji w HSCR. Biorąc pod uwagę, że mutacje RET i czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF) mutacje zostały zgłoszone w chorobie, uznaliśmy inny ligand RET, neurturynę (NTN), jako atrakcyjny gen kandydujący, zwłaszcza że wykazuje on dużą homologię z GDNF. homologie z GDNF. Tutaj donosimy o znalezieniu heterozygotycznej mutacji missense mutacji NTN w dużej niekrewniaczej rodzinie obejmującej czworo dzieci dotkniętych ciężkim fenotypem aganglionozy sięgającym jelita cienkiego. jelita cienkiego. Co ciekawe, wydaje się, że opisana tutaj mutacja NTN nie jest wystarczająca do wywołania HSCR, a ta rodzina multipleksowa segreguje również mutację RET mutację RET. Ta kaskada niezależnych i addytywnych zdarzeń genetycznych dobrze pasuje do wielogenowy wzorzec dziedziczenia oczekiwany w HSCR i dodatkowo wspierać rolę ligandów RET w rozwoju jelitowego układu nerwowego. --- Choroba Hirschsprunga (HSCR) jest złożonym zaburzeniem charakteryzującym się zanikiem dystalnych odcinków przewodu pokarmowego. Najwyższy odsetek zarówno rodzinnych sporadycznych przypadków wynika z mutacji protoonkogenu RET. Pięć mutacji germinalnych mutacji w genie czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF), jednego z ligandów RET. ligandów RET, wykryto u pacjentów z HSCR. Analiza rodowodów i zaobserwowano związek między tymi zmianami GDNF i wariantami RET u tych samych pacjentów. pacjentów zrodziło pytanie, czy gen GDNF odgrywa jakąkolwiek przyczynową / predysponującą rolę w patogenezie HSCR. W niniejszej pracy badaliśmy zdolność białek GDNF, z których każde miało jedną z opisanych mutacji mutacji, do aktywacji RET poprzez wykonanie testu funkcjonalnego w hodowanych komórkach neuroblastoma. komórkach neuroblastoma. Zgodnie z brakiem korelacji genotyp/fenotyp u ludzi, nasze wyniki korelacji genotyp/fenotyp u ludzi, nasze wyniki wskazują na brak wykrywalnych zmian w aktywacji RET indukowanej przez zmutowany GDNF. --- Kinaza RET stała się obiecującym celem w terapii raka rdzeniastego tarczycy (MTC) i podgrupy raka brodawkowatego tarczycy. raka tarczycy (MTC) i podgrupy brodawkowatych raków tarczycy. NVP-AST487, N,N'-difenylomocznik o IC(50) 0,88 mumol/l na kinazie RET, hamował autofosforylację RET i aktywację RET autofosforylację i aktywację dalszych efektorów oraz silnie hamował wzrost ludzkich linii komórkowych raka tarczycy z aktywującymi mutacjami RET, ale nie linii bez mutacji RET. NVP-AST487 indukował zależne od dawki hamowanie wzrostu ksenograftów komórek NIH3T3 wyrażających RET i linii komórkowej MTC TT u nagich myszy. Komórki MTC wydzielają kalcytoninę, użyteczny wskaźnik obciążenia nowotworem. Poziomy kalcytoniny w ludzkim osoczu pochodzące z ksenograftów komórek TT zostały zahamowane wkrótce po leczeniu, gdy objętość guza pozostawała niezmieniona, co wskazuje, że wpływ hamowania kinazy RET na wydzielanie kalcytoniny były czasowo oddzielone od jej właściwości hamujących nowotwór. właściwości hamujące nowotwór. W związku z tym NVP-AST487 hamował ekspresję genu kalcytoniny ekspresję genu kalcytoniny in vitro w komórkach TT, częściowo poprzez zmniejszenie transkrypcji genu. Dane te wskazują na nieznaną wcześniej fizjologiczną rolę sygnalizacji RET w ekspresji genów kalcytoniny. ekspresji genu kalcytoniny. Rzeczywiście, ligandy RET persefina i GDNF silnie stymulowały mRNA kalcytoniny, co było blokowane przez wstępne traktowanie NVP-AST487. Antagoniści aktywności kinazy RET u pacjentów z MTC mogą powodować wpływ na kalcytoniny w osoczu, które są nieproporcjonalne lub oddzielone od wpływ na obciążenie nowotworem, ponieważ kinaza RET pośredniczy w fizjologicznym szlaku kontrolującą wydzielanie kalcytoniny. Rola tradycyjnych biomarkerów nowotworowych może może wymagać ponownej oceny, ponieważ terapie celowane zaprojektowane przeciwko onkoproteinom o kluczowej roli w patogenezie kluczowe role w patogenezie.
Które białka zostały zidentyfikowane jako ligandy RET?
RET jest aktywowany przez członków rodziny ligandów czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF), które obejmują GDNF, neurturynę, arteminę i persefinę.