Wstęp: Spektrometria mas stała się potężnym narzędziem do analizy dużej liczby białek w złożonych próbkach. dużej liczby białek w złożonych próbkach, umożliwiając znaczną część proteomiki. Ze względu na z powodu różnych wyzwań analitycznych, jak dotąd żaden proteom nie został zsekwencjonowany w całości. O'Shea, Weissman i współpracownicy niedawno określili liczbę kopii białek drożdży. białek drożdży, czyniąc ten proteom doskonałym systemem modelowym do badania czynników wpływających na pokrycie. WYNIKI: Aby dogłębnie zbadać proteom drożdży i określić czynniki obecnie uniemożliwiających pełną analizę, wyhodowaliśmy komórki drożdży, wyekstrahowaliśmy białka i rozdzieliliśmy je za pomocą jednowymiarowej elektroforezy żelowej. Peptydy powstałe w wyniku trawienia trypsyną analizowano za pomocą spektrometrii masowej chromatografii cieczowej na urządzeniu liniowym spektrometrze mas z pułapką jonową i transformacją Fouriera z bardzo wysoką dokładnością masy i szybkością sekwencjonowania. Osiągnęliśmy jednoznaczną identyfikację ponad 2000 białek, w tym białek o bardzo niskiej białek, w tym białek o bardzo niskiej obfitości. Efektywny zakres dynamiczny był ograniczony do do około 1000, a efektywna czułość do około 500 femtomoli, co jest dalekie od możliwej czułości od czułości subfemtomolowej możliwej dla pojedynczych białek. Użyliśmy SILAC (stabilne (stabilne znakowanie izotopowe aminokwasów w hodowli komórkowej) do generowania par jeden do jednego prawdziwych sygnałów peptydowych i zbadaliśmy, czy czułość, szybkość sekwencjonowania lub zakres dynamiczny zakres dynamiczny ograniczały analizę. WNIOSEK: Zaawansowane metody spektrometrii mas mogą jednoznacznie zidentyfikować więcej niż 2000 białek w hodowli komórkowej. ponad 2000 białek w pojedynczym proteomie. Analiza złożonej mieszaniny nie jest ograniczona przez czułość, ale przez kombinację zakresu dynamicznego (peptydy o wysokiej obfitości peptydów uniemożliwiających sekwencjonowanie peptydów o niskiej liczebności) i efektywną szybkością sekwencjonowania. szybkość sekwencjonowania. Znacznie zwiększone pokrycie proteomu drożdży wydaje się możliwe dzięki dalszemu rozwojowi oprogramowania i oprzyrządowania. --- Doświadczenie z różnych dziedzin nauk przyrodniczych sugeruje, że dostępne, kompletne mapy referencyjne komponentów badanego systemu są bardzo korzystnymi narzędziami badawczymi. korzystne narzędzia badawcze. Przykłady takich map obejmują biblioteki spektroskopowych cząsteczek lub bazy danych struktur leków w chemii analitycznej lub kryminalistycznej. w chemii analitycznej lub kryminalistycznej. Takie mapy i metody nawigacji po nich, stanowią wiarygodne testy do badania dowolnej próbki pod kątem obecności i ilości cząsteczek zawartych w mapie. cząsteczek zawartych w mapie. Jak dotąd, próby wygenerowania takich map dla dowolnego proteomu proteomu nie udało się osiągnąć pełnego pokrycia proteomu. Tutaj używamy strategii opartą na wysokoprzepustowej syntezie peptydów i spektrometrii mas, aby wygenerować prawie kompletnej mapy referencyjnej (97% białek przewidywanych przez genom) dla Saccharomyces cerevisiae. Wygenerowaliśmy dwie wersje tej masowo-spektrometryczną, jedną wspierającą odkrycia (shotgun), a drugą wspierającą hipotezy (shotgun). wspierającą pomiary proteomiczne oparte na hipotezach (ukierunkowane). Razem dwie wersje mapy stanowią kompletny zestaw testów proteomicznych wspierających większość badań wykonywanych przy użyciu współczesnych technologii proteomicznych. Aby pokazać użyteczność map, zastosowaliśmy je do analizy białkowych cech ilościowych (QTL) która wymaga precyzyjnego pomiaru tego samego zestawu peptydów w dużej liczbie próbek. dużej liczbie próbek. Pomiary białek w 78 szczepach S. cerevisiae ujawniły złożony związek między niezależnymi loci genetycznymi, wpływając na poziomy powiązanych białek. Nasze wyniki sugerują, że selektywna presja sprzyja nabywaniu zestawów polimorfizmów, które dostosowują poziomy białek, ale także ale także utrzymują stechiometrię funkcjonalnie powiązanych członków szlaku. --- N-mirystoilacja jest nieodwracalną modyfikacją, która wpływa na właściwości wiązania właściwości wiązania kluczowych białek cytoplazmatycznych z kaskad transdukcji sygnału sygnałowych. Scharakteryzowaliśmy dwie domniemane N-mirystoilotransferazy z Arabidopsis thaliana jako sposób na zbadanie całego proteomu N-myristoilacji proteomu (N-myristoylome) u wyższych eukariontów. AtNMT1 kompensował defekt nmt1 w drożdżach, podczas gdy AtNMT2 i chimery tych dwóch genów nie. Tylko AtNMT1 modyfikował znane N-myrystoylowane białka in vitro. AtNMT1 jest zatem odpowiedzialny za N-myristoylom A. thaliana, podczas gdy AtNMT2 nie wydaje się mieć ma zwykłej aktywności mirystoilacyjnej. Zaczęliśmy od całego zestawu N-myrystoylowanych białek G w proteomie A. thaliana. Następnie zastosowaliśmy powtarzalne podejście, oparte na N-myrystoylacji in vitro ponad 60 różnych polipeptydów, aby określić specyficzność substratową AtNMT1. Stwierdziliśmy stwierdziliśmy, że dodatni ładunek na reszcie 7 substratu był szczególnie ważny w rozpoznawaniu substratu. N-myristoylom A. thaliana składa się z 437 białek, co stanowi 1,7% całego proteomu. Wykazaliśmy, że N-myrystoylację kilku nieoczekiwanych rodzin białek, w tym wrodzonych białek białek odporności wrodzonej, tioredoksyn, składników szlaku degradacji białek, czynników transkrypcyjnych i kluczowego enzymu regulującego glikolizę. Rola N-myrystoylacji jest omawiana w każdym przypadku; w szczególności proces ten może może leżeć u podstaw hipotezy "strażnika" odporności wrodzonej. --- Znakowanie izotopowe białek jest ważne dla postępu w dziedzinie proteomiki strukturalnej. proteomiki strukturalnej. Umożliwia ono wykorzystanie mocy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) do charakterystyki białek. spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w celu scharakteryzowania trójwymiarowych struktur i odpowiadających im cech dynamicznych białek. trójwymiarowych struktur i odpowiadających im dynamicznych cech białek. Zwykłe podejście do uzyskiwania izotopowo znakowanych cząsteczek białek polega na ekspresję odpowiedniego genu w bakteryjnych lub drożdżowych organizmach gospodarzy, które które rosną na pożywkach wzbogaconych w izotopy. Metoda ta ma kilka wad. Tutaj pokazujemy, że możliwe jest pełne oznakowanie rośliny izotopami (15)N. Zaleta Zaletą znakowania in vivo organizmów wyższych jest to, że wszystkie tworzące je białka są znakowane i stają się dostępne. białka są znakowane i stają się dostępne jako funkcjonalne, potranslacyjnie zmodyfikowane, prawidłowo sfałdowane białka. Do stworzenia pierwszego przykładu równomiernie pierwszego przykładu jednolicie znakowanego (15)N (> 98%) gatunku rośliny, ziemniaka (Solanum tuberosum L., cv. Elkana). Dwie rośliny były uprawiane przy niskich kosztach przy użyciu azotanu potasu-[(15)N] jako jedynego źródła azotu. W czasie zbiorów zebrano łącznie 3,6 kg bulw ziemniaka i 1,6 kg liści, rozłogów i korzeni. z których wszystkie były w pełni znakowane (15)N. Gramowe ilości rozpuszczalnych (15)N-znakowanych białek (składających się głównie z patatyny glikoproteinowej i inhibitorów proteazy typu inhibitorów proteazy typu Kunitz) zostały wyizolowane z bulw. Wyniki NMR na kompletnego proteomu soku ziemniaczanego i wyizolowanego inhibitora proteazy ilustrują sukces procedury znakowania. Przedstawiona metoda znakowania izotopowego izotopów można łatwo zmodyfikować do znakowania innych roślin. Jej przewidywany wpływ na proteomikę strukturalną roślin. --- Chociaż spektrometria mas stała się potężnym narzędziem do funkcjonalnej analizy systemów biologicznych, nie można jeszcze osiągnąć pełnej charakterystyki proteomu. osiągnąć. Zamiast tego, sama złożoność żywych organizmów wymaga frakcjonowania ekstraktów komórkowych, aby umożliwić bardziej ukierunkowane analizy. Tutaj wprowadzamy koncepcję "fluorous proteomics", w ramach której określone podzbiory peptydów z próbek pochodzenia biologicznego są znakowane cząsteczkami perfluorowanymi i a następnie wzbogacane przez ekstrakcję do fazy stałej przez fluorową fazę stacjonarną. fluorową fazą stacjonarną. Podejście to jest niezwykle selektywne, ale może być łatwo dostosowane do wzbogacania różnych podzbiorów peptydów. Dodatkowo, ta metodologia pokonuje wiele ograniczeń tradycyjnych strategii wzbogacania opartych na powinowactwie biologicznym strategie, jednocześnie umożliwiając nowe schematy wzbogacania powinowactwa niemożliwe do za pomocą odczynników powinowactwa biologicznego. Potencjał tej metodologii jest zademonstrowany przez łatwe wzbogacanie peptydów o określonych łańcuchach bocznych funkcjonalne lub modyfikacje potranslacyjne z tryptycznych trawień pojedynczych białek, jak również lizatów całych komórek.
Czy możliwe jest określenie kompletnego proteomu drożdży?
Tak, ponieważ znany jest kompletny genom drożdży.