Katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy (CPVT) jest dziedziczną chorobą charakteryzującą się chorobą charakteryzującą się polimorficznym częstoskurczem komorowym częstoskurcz komorowy prowadzący do omdleń i nagłej śmierci sercowej. Autosomalna dominująca CPVT jest spowodowana mutacjami w genie RyR2 kodującym izoformę sercową izoformę sercowego receptora ryanodyny. Charakterystyka funkcjonalna in vitro zmutowanych kanałów RyR2 wykazała zmienione zachowanie podczas stymulacji adrenergicznej i kofeiny ze zwiększonym uwalnianiem wapnia z retikulum sarkoplazmatycznego. retikulum sarkoplazmatycznego. Na dzień dzisiejszy nie są dostępne żadne dowody eksperymentalne wykazujące, że mutacje mutacje RyR2 mogą reprodukować arytmie obserwowane u pacjentów z CPVT. My opracowany warunkowy mysi model knock-in będący nosicielem mutacji R4496C, mysiego odpowiednika mutacji R4497. mysiego odpowiednika mutacji R4497C zidentyfikowanej w rodzinach CPVT, aby ocenić, czy u zwierząt rozwinie się fenotyp CPVT i czy beta-blokery zapobiegłyby arytmii. Dwadzieścia sześć myszy (12 typu dzikiego (WT) i 14RyR(R4496C)) poddano testom wysiłkowym, a następnie podano adrenalinę: u żadnej z myszy WT nie rozwinął się częstoskurcz komorowy (VT) w porównaniu do 5/14 myszy RyR(R4496C) (P=0.02). Dwadzieścia jeden myszy (8 WT, 8 RyR(R4496C) i 5 RyR(R4496C) poddanych działaniu beta-blokerów) otrzymało epinefrynę. z beta-blokerami) otrzymało adrenalinę i kofeinę: 4/8 (50%) myszy RyR(R4496C) myszy, ale żadna z WT nie rozwinęła VT (P = 0,02); 4/5 myszy RyR(R4496C) leczonych propranololem z propranololem rozwinęły VT (P=0,56 nieistotne w porównaniu z myszami RyR(R4496C)). Dane te stanowią pierwszą eksperymentalną demonstrację, że mutacja R4496C RyR2 predysponuje serce myszy do VT i VF w odpowiedzi na kofeinę i / lub stymulację adrenergiczną. stymulację adrenergiczną. Co więcej, wyniki pokazują, że analogicznie do tego, co obserwowana u pacjentów, stymulacja beta-adrenergiczna wydaje się nieskuteczna w zapobieganie zagrażającym życiu arytmiom. --- UZASADNIENIE: Mutacje w sercowym receptorze ryanodynowym typu 2 (RyR2) zostały związane z katecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym (CPVT). Mutacje RyR2 związane z CPVT powodują śmiertelne arytmie komorowe u młodych osób podczas osób podczas stymulacji β-adrenergicznej. CEL: Niniejsze badanie miało na celu określenie skutków nowej mutacji RyR2-G230C i czy ta mutacja oraz RyR2-P2328S zmieniają wrażliwość kanału na wapń w świetle kanału na wapń w świetle (Ca(2+)). METODY I WYNIKI: Charakterystyka funkcjonalna rekombinowanych ludzkich kanałów RyR2-G230C przeprowadzono w warunkach naśladujących stres. Ludzkie zmutowane kanały RyR2 zostały wygenerowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce i heterologicznie wyrażane w komórkach HEK293 wraz z kalstabiną2. Kanały RyR2 zostały zmierzone w celu zbadania regulacji kanałów przez cytozol w porównaniu z luminalem sarkoplazmatycznego retikulum Ca (2+). 50-letni biały mężczyzna z powtarzającymi się epizodami omdleń po wysiłku po wysiłku miał zatrzymanie akcji serca i był nosicielem mutacji RyR2-G230C. Fosforylowane przez kinazę białkową zależną od cAMP kanały RyR2-G230C wykazywały znacznie wyższe prawdopodobieństwo otwarcia przy rozkurczowych stężeniach Ca(2+) związane z niedoborem kalstabiny2. Światłowodowa wrażliwość Ca(2+) kanałów RyR2-G230C i RyR2-P2328S były podobne do WT. WNIOSKI: Mutant RyR2-G230C wykazuje podobne defekty biofizyczne w porównaniu z wcześniej scharakteryzowanymi mutacjami CPVT: zmniejszone wiązanie podjednostki stabilizującej podjednostki stabilizującej calstabin2 i przesunięcie w lewo w zależności od Ca(2+) dla aktywacji w warunkach symulujących wysiłek fizyczny, co jest zgodne z "nieszczelnym" kanał. Oba kanały RyR2-G230C i RyR2-P2328S wykazują normalną luminalną aktywację Ca(2+) aktywację. Zatem rozkurczowy wyciek Ca(2+) z retikulum sarkoplazmatycznego spowodowany zmniejszonym wiązaniem kalstabiny wiązanie kalstabin2 i przesunięcie w lewo zależności Ca (2+) dla aktywacji przez rozkurczowe poziomy cytozolowego Ca(2+) jest powszechnym mechanizmem leżącym u podstaw CPVT. --- Kanał uwalniający Ca2+ receptor ryanodynowy 2 (RyR2) jest wymagany do sprzężenia pobudzenie-skurcz w sercu i jest również obecny w mózgu. Mutacje w RyR2 zostały powiązane z nagłą śmiercią sercową wywołaną wysiłkiem fizycznym (katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy [CPVT]). Związane z CPVT mutacje RyR2 skutkują "nieszczelnymi" kanałami RyR2 z powodu zmniejszonego wiązania podjednostki kalstabin2 (FKBP12.6), która stabilizuje stan zamknięty kanału. kanału. Odkryliśmy, że myszy heterozygotyczne dla mutacji R2474S w Ryr2 (myszy Ryr2-R2474S) wykazywały spontaniczne uogólnione napady toniczno-kloniczne (które występowały przy braku arytmii serca), arytmie komorowe wywołane wysiłkiem fizycznym arytmie komorowe i nagłą śmierć sercową. Leczenie nowym związkiem RyR2 (S107), który zwiększa wiązanie kalstabiny2 z mutantem Ryr2-R2474. Zmutowany kanał Ryr2-R2474S hamował wyciek kanału i zapobiegał arytmii serca arytmii serca i podniósł próg drgawkowy. Zatem zmutowane nieszczelne kanały Ryr2-R2474S związane z CPVT Ryr2-R2474S w mózgu może powodować drgawki u myszy, niezależnie od arytmii serca. arytmii serca. Na podstawie tych danych proponujemy, że CPVT jest połączonym zaburzeniem zaburzeniem neurokardiologicznym, w którym nieszczelne kanały RyR2 w mózgu powodują padaczkę, a te same nieszczelne kanały w sercu powodują nagłą śmierć sercową wywołaną wysiłkiem fizycznym. nagłą śmierć sercową. --- Mutacje dwóch cząsteczek sygnalizujących wapń w mięśniu sercowym, receptora ryanodyny 2 (RYR2) i kalsekwestryny 2 (CASQ2) mogą powodować katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy (CPVT), ciężką dziedziczną chorobę arytmiczną. katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy (CPVT), ciężką dziedziczną chorobę arytmiczną objawiającą się salwami indukowanych wysiłkiem dwukierunkowych i polimorficznych częstoskurczów i polimorficznych. Przebadaliśmy 12 fińskich probantów CPVT pod kątem mutacji w tych genach i zidentyfikowaliśmy trzy nowe mutacje RYR2 (V2306I, P4902L, R4959Q), które były nie występowały u osób zdrowych i kontrolnych. Chociaż nie zidentyfikowano oczywistych mutacji powodujących chorobę zidentyfikowano w genie CASQ2, badanie molekularne molekularne ujawniły dwa nowe polimorfizmy aminokwasowe (T66A i V76M). Częstotliwości częstości występowania tych polimorfizmów u 185 niespokrewnionych probantów z zespołem długiego QT i u 280 zdrowych dawców krwi nie różniły się znacząco. Te dane, w połączeniu z naszymi wcześniejszymi ustaleniami, pokazują, że mutacje RYR2 są obecne w co najmniej 6/16 (38%) rodzin katecholaminergicznych polimorficznych częstoskurczów komorowych. katecholaminergicznych polimorficznych częstoskurczów komorowych, podczas gdy mutacje CASQ2 muszą być rzadką przyczyną CPVT. --- UZASADNIENIE: Większość mutacji sercowego receptora ryanodynowego (RyR2) związanych z katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy (CPVT) są postulowane, aby powodują charakterystyczną formę dysfunkcji uwalniania Ca(2+). Biorąc pod uwagę rozpowszechnienie mutacji CPVT, postawiliśmy hipotezę, że dysfunkcyjna heterogenność również była możliwa. CEL: Określenie molekularnych i komórkowych mechanizmów, za pomocą których nowa mutacja mutacja RyR2-V2475F związana z CPVT u ludzi wywołuje zależne od Ca(2+) w całych sercach i u nienaruszonych myszy. METODY I WYNIKI: Rekombinowane kanały zawierające mutacje RyR2 związane z CPVT zostały scharakteryzowane funkcjonalnie przy użyciu wiązania trytytowanej ryanodyny i zapisy jednokanałowe. Homologiczna rekombinacja została wykorzystana do wygenerowania knock-in myszy z mutacją RyR2-V2475F. Miocyty komorowe od myszy heterozygotycznych dla mutacji (RyR2-V2475F(+/-)) i ich miotów typu dzikiego były obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w warunkach naśladujących stres. Skłonność myszy typu dzikiego i RyR2-V2475F(+/-) do rozwoju arytmii była testowana w całym arytmii badano na poziomie całego serca i u nieuszkodzonych zwierząt. Rekombinowane kanały RyR2-V2475F wykazywały zwiększoną aktywację cytozolowego Ca(2+) aktywację, nieprawidłową fosforylację kinazy białkowej A i zwiększoną aktywację przez Ca(2+) w świetle. Mutacja RyR2-V2475F wydaje się embrionalnie letalna u myszy myszy homozygotycznych, ale myszy heterozygotyczne nie wykazują żadnych zmian na poziomie wyjściowym. Spontaniczne zdarzenia uwalniania Ca(2+) były częstsze i miały krótsze opóźnienie w kardiomiocytach stymulowanych izoproterenolem z serc RyR2-V2475F(+/-), ale ich próg próg był niezmieniony w odniesieniu do typu dzikiego. Adrenergicznie wyzwalane tachyarytmie były częstsze u myszy RyR2-V2475F(+/-). WNIOSKI: Mutacja RyR2-V2475F jest fenotypowo silna wśród innych mutacji CPVT i powoduje heterogenne mechanizmy dysfunkcji RyR2. U żyjących myszy mutacja ta wydaje się zbyt poważna, aby mogła być obecna we wszystkich kanałach RyR2, ale pozostaje niewykryta w warunkach podstawowych, jeśli ulega ekspresji na stosunkowo niskim poziomie. Stymulacja β-adrenergiczna zaburza delikatną równowagę Ca(2+) w kanale RyR2-V2475F(+/-) i wywołuje zagrażające życiu arytmie. --- Uwalnianie Ca2+ z retikulum sarkoplazmatycznego za pośrednictwem sercowego receptora ryanodyny (RyR2) jest fundamentalnym wydarzeniem w skurczu mięśnia sercowego. Mutacje RyR2 mutacje sugerujące wadliwą funkcję kanału Ca2+ zostały ostatnio w katecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczu komorowym (CPVT) i arytmogennej prawej komorze serca. arytmogennej dysplazji prawej komory (ARVD). My zgłaszamy ekspresję trzech związanych z CPVT ludzkich mutacji RyR2 (hRyR2) (S2246L, N4104K i R4497C) w kardiomiocytach HL-1 wykazujących prawidłowe ukierunkowanie na retikulum endoplazmatycznego. N4104K zlokalizowano również w aparacie Golgiego. Charakterystyka fenotypowa w tym wewnątrzkomórkowa obsługa Ca2+, proliferacja, żywotność, RyR2:interakcja FKBP12.6 i częstość rytmu w spoczynkowych komórkach HL-1 wyrażających zmutowane hRyR2 były nie do odróżnienia od hRyR2 typu dzikiego (WT). Jednakże, uwalnianie Ca2+ było zwiększone w komórkach wyrażających zmutowany hRyR2 po aktywacji RyR (kofeina i 4-chloro-m-krezol) lub stymulacji beta-adrenergicznej (izoproterenol). Interakcja RyR2:FKBP12.6 pozostała nienaruszona po aktywacji kofeiną lub 4-CMC, ale została dramatycznie zakłócona przez izoproterenol lub forskolinę, aktywator aktywator cyklazy adenylanowej. Izoproterenol i forskolina podniosły cykliczny-AMP do podobnej we wszystkich komórkach i były związane z równoważną hiperfosforylacją zmutowanego i WT hRyR2. Związane z CPVT mutacje w hRyR2 nie zmieniały fenotypu spoczynkowego fenotypu kardiomiocytów, ale pośredniczyły w zwiększonym uwalnianiu Ca2+ przy stymulacji RyR-agonistą lub beta-AR. Ponadto, równoważna interakcja między zmutowanymi i WT hRyR2 i FKBP12.6. --- Mutacje w genie receptora ryanodyny 2 (RYR2) mogą powodować katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy (CPVT). katecholaminergiczny częstoskurcz komorowy (CPVT). Nowa mutacja RYR2-S4153R została została uznana za przyczynę CPVT i migotania przedsionków. Mutacja została została funkcjonalnie scharakteryzowana poprzez uwalnianie Ca(2+) indukowane przeciążeniem magazynu (SOICR) i testy wiązania ryanodyny znakowanej trytem ([(3)H]ryanodyna). Mutacja Mutacja S4153R zwiększała skłonność do spontanicznego uwalniania Ca(2+) i zmniejszała SOICR, ale nie zmieniała aktywacji Ca(2+) wiązania [(3)H]ryanodyny, wspólna cecha innych mutacji RYR2 CPVT o wzmocnionej funkcji. Wnioskujemy, że mutacja S4153R jest mutacją RYR2 typu gain-of-function związaną z fenotypem klinicznym fenotypem klinicznym charakteryzującym się zarówno CPVT, jak i migotaniem przedsionków. --- CPVT (katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy) jest dziedzicznym zagrażającym życiu zaburzeniem arytmogennym. CPVT jest spowodowany przez DAD (opóźnione po depolaryzacji), które są indukowane przez spontaniczne uwalnianie Ca2+ podczas SR (retikulum sarkoplazmatyczne) Ca2+, proces znany również jako SOICR (uwalnianie Ca2+ indukowane przeciążeniem magazynu). Szereg mutacji w sercowym receptorze serca RyR2 są powiązane z CPVT. Wiele z tych związanych z CPVT mutacji RyR2 zwiększa skłonność do SOICR i DAD poprzez uwrażliwienie RyR2 na luminalną lub luminalną/cytozolową aktywację Ca2+. Niedawno odkryto nową mutację CPVT RyR2 G230C, która zwiększa wrażliwość cytozolową, ale nie luminalną, Ca2+. pojedynczych kanałów RyR2 w dwuwarstwach lipidowych. Ta obserwacja doprowadziła do do sugestii niezależnego od SOICR mechanizmu chorobowego dla mutacji G230C. Jednak komórkowy wpływ tej mutacji na SOICR nie został jeszcze określony. W tym celu wygenerowaliśmy stabilne indukowalne linie komórkowe HEK (ludzka nerka embrionalna)-293 wyrażające RyR2 WT (typ dziki) i mutanta G230C. Używając obrazowania pojedynczej komórki Ca2+, stwierdziliśmy, że mutacja G230C znacznie zwiększyła skłonność do do SOICR i obniżyła próg SOICR. Ponadto mutacja G230C zwiększała wrażliwość pojedynczych kanałów RyR2 na aktywację zarówno luminalną, jak i cytozolową Ca2+ oraz zależną od Ca2+ aktywację wiązania [3H]ryanodyny. Ponadto Ponadto mutacja G230C zmniejszyła stabilność termiczną N-końcowego regionu regionu (aminokwasy 1-547) RyR2. Dane te sugerują, że mutacja G230C zwiększa skłonność do SOICR poprzez uwrażliwienie kanału na luminalną i i cytozolową aktywację Ca2+ oraz że G230C ma nieodłączny wpływ strukturalny na N-końcowe domeny RyR2. --- UZASADNIENIE: Migotanie przedsionków (AF) jest najczęstszą arytmią serca, jednak mechanizmy powodujące migotanie przedsionków pozostają słabo poznane, a terapia jest nieoptymalna. Receptor ryanodynowy (RyR2) jest głównym kanałem uwalniania wapnia (Ca2+) w sarkoplazmie mięśnia sercowego. na retikulum sarkoplazmatycznym (SR) wymaganym do sprzężenia pobudzenie-skurcz w mięśniu sercowym. w mięśniu sercowym. CEL: W niniejszym badaniu staraliśmy się ustalić, czy wewnątrzkomórkowy wewnątrzkomórkowy rozkurczowy wyciek SR Ca2+ przez RyR2 odgrywa rolę w wyzwalaniu AF i czy hamowanie tego wycieku może zapobiegać AF. METODY I WYNIKI: Wygenerowaliśmy 3 myszy knock-in z mutacjami wprowadzonymi do RyR2. RyR2, które skutkują nieszczelnymi kanałami i powodują indukowany wysiłkiem polimorficzny polimorficzny częstoskurcz komorowy u ludzi [katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy (CPVT)]. Zbadaliśmy podatność na AF w tych trzech mysich modelach CPVT z mutacją RyR2, aby zbadać rolę rozkurczowego wycieku SR Ca2+ w AF. AF. Migotanie przedsionków stymulowano za pomocą protokołu stymulacji wewnątrzprzełykowej w 3 modelach myszy CPVT (RyR2-R2474S+/-, 70%; RyR2-N2386I+/-, 60%; RyR2-L433P+/-, 35,71%), ale nie u myszy typu dzikiego (WT) (P<0,05). Zgodnie z tymi wynikami in vivo wyniki, wystąpił znaczący rozkurczowy wyciek SR Ca2+ w miocytach przedsionków wyizolowanych z mysich modeli CPVT. Calstabin2 (FKBP12.6) jest podjednostką RyR2 która stabilizuje zamknięty stan RyR2 i zapobiega wyciekowi Ca2+ przez kanał. kanał. Przedsionkowe RyR2 od myszy RyR2-R2474S+/- zostały utlenione, a kompleks makromolekularny RyR2 został pozbawiony kalstabiny2. Lek Rycal S107 stabilizuje stan zamknięty RyR2 poprzez hamowanie utleniania / fosforylacji indukowaną dysocjacją kalstabiny2 z kanału. S107 zmniejszał rozkurczowy SR Ca2+ w miocytach przedsionków i zmniejszał migotanie przedsionków wywołane stymulacją in vivo. S107 nie zmniejszał zwiększonej częstości występowania migotania przedsionków indukowanego stymulacją burst myszy z niedoborem kalstabiny2, potwierdzając, że kalstabina2 jest wymagana dla mechanizmu działania leku. mechanizm działania leku. WNIOSKI: Niniejsze badanie pokazuje, że pośredniczony przez RyR2 rozkurczowy SR Ca2+ w miocytach przedsionków jest związany z migotaniem przedsionków u myszy z CPVT. Co więcej, Rycal S107 hamował rozkurczowy wyciek SR Ca2+ przez RyR2 i AF indukowany stymulacją związane z mutacjami CPVT.
Które mutacje w sercowej izoformie receptora ryanodynowego (RyR2) są związane z CPVT?
Niedawno stwierdzono, że nowa mutacja CPVT RyR2, G230C, zwiększa cytozolową, ale nie luminalną, wrażliwość na Ca2+ pojedynczych kanałów RyR2 w dwuwarstwach lipidowych. Nowa mutacja RYR2-S4153R została uznana za przyczynę CPVT i migotania przedsionków. Nowa mutacja RyR2-V2475F jest związana z CPVT u ludzi. 3 mysie modele CPVT to: RyR2-R2474S+/-, RyR2-N2386I+/- i RyR2-L433P+/-. Mutacja E189D RyR2 jest przyczyną CPVT. Mysi model knock-in będący nosicielem mutacji R4496C jest mysim odpowiednikiem mutacji R4497C zidentyfikowanej w rodzinach CPVT. Skanowanie 12 fińskich probantów CPVT zidentyfikowało trzy nowe mutacje RYR2 (V2306I, P4902L, R4959Q), które były nieobecne u osób niezakażonych i kontrolnych. Trzy ludzkie mutacje RyR2 (hRyR2) związane z CPVT to: S2246L, N4104K i R4497C.