Technologia sekwencjonowania nowej generacji może teraz dostarczyć biologom populacyjnym i filogeografom filogeografów informacji w skali genomowej; jednak na wiele istotnych pytań z zakresu genetyki populacji i filogeografii pytań z zakresu genetyki populacji i filogeografii można jednak skutecznie odpowiedzieć na wiele istotnych pytań z zakresu genetyki populacyjnej i filogeografii. Przez ostatnie dwie dekady większość badań na poziomie populacji brakowało danych sekwencji jądrowego DNA (nDNA) z powodu komplikacji i kosztów amplifikacji i sekwencjonowania diploidalnych loci. Jednakże, jednak pirosekwencjonowanie emulsyjnych reakcji PCR, amplifikujących tylko jedną cząsteczkę na raz może generować megabajty klonalnie amplifikowanych loci przy wysokim pokryciu, co znacznie upraszcza określanie sekwencji allelicznej. Tutaj przedstawiamy krok po kroku metodologię wykorzystania pirosekwencjonowania 454 GS FLX Titanium do jednoczesnego sekwencjonowania 16 populacji (po 20 osobników na populacji) w 10 różnych loci nDNA (łącznie 3200 loci) na jednej płytce do sekwencjonowania za mniej niż koszt tradycyjnego sekwencjonowania metodą Sangera. --- Ze względu na trudności w głębokim sekwencjonowaniu, sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości starożytnego DNA zostało ograniczone do wyjątkowo dobrze zachowanych starożytnych materiałów. Podstawowym czynnikiem jest atak drobnoustrojów powszechnie obserwowany w zakopanych materiałach. i powoduje drastyczny wzrost względnego stosunku mikrobiologicznego DNA w wyekstrahowanym DNA. wyekstrahowanym DNA. Przedstawiamy ujednoliconą strategię, w której emulsyjny PCR jest w połączeniu z wzbogacaniem docelowym, a następnie sekwencjonowaniem nowej generacji. Metoda ta Metoda ta umożliwiła wydajne uzyskanie nieduplikowanych odczytów mapowanych na docelowych sekwencji będących przedmiotem zainteresowania, a to może osiągnąć głębokie i niezawodne sekwencjonowanie starożytnego DNA z typowych materiałów, nawet jeśli są one słabo zachowane. --- Motywacją tych badań jest ustanowienie systemu wychwytywania i wzbogacania docelowego genomowego DNA i wzbogacania, który mógłby zostać wykorzystany do głębokiego sekwencjonowania regionów docelowych z sekwencjonowaniem nowej generacji. Aby zaprojektować sondy wychwytujące 120 bp (przynęty) i przygotować odczynniki SureSelect, 2,414,977 bp ludzkiej sekwencji genomowej z 11,824 eksonów w 1250 genach została przesłana na platformę Agilent eArray i wyprodukowana przez Agilent. wyprodukowane przez firmę Agilent. Wykorzystano dwie próbki ludzkiego genomowego DNA i przeprowadzono kolejne eksperymenty do budowy biblioteki sekwencjonowania: ścinanie fragmentacja przez sonikację, tępienie i fosforylacja, ligacja adaptera, selekcja wielkości fragmentów 150-200 bp, a następnie hybrydyzacja z przynętami, hybrydyzacja z kulkami magnetycznymi i amplifikacja PCR. Przed reakcją sekwencjonowania SOLiD biblioteki były amplifikowane za pomocą emulsyjnego PCR i wzbogacane kulkami wzbogacającymi za pomocą kulek wzbogacających P2. Próbki biblioteki zostały załadowane do sekwencjonowania Chip do analizy przepływu pracy (WFA) lub sekwencjonowania z domyślnymi parametrami. Wyniki Wyniki pokazały, że 46 509 przynęt zostało zaprojektowanych i zsyntetyzowanych dla 11 147 regionów genów. regionów genowych i przygotowano regent sondy wychwytującej SureSelect. PCR w czasie rzeczywistym wykazała skuteczność wzbogacania celu do 2(9) razy z systemem SureSelect system. WFA wykazało, że biblioteki były odpowiednie do sekwencjonowania SOLiD. Dane Dane sekwencjonowania ujawniły, że 70% unikalnych zmapowanych znaczników sekwencji pasowało do regionów docelowych. regionom docelowym, a średnie pokrycie regionów docelowych było powyżej 200-krotne. Wszystko to wykazało wykonalność ustalonego systemu do sekwencjonowania DNA nowej generacji. --- Przygotowanie próbek do sekwencjonowania Roche/454, ABI/SOLiD i Life Technologies/Ion Torrent opiera się na amplifikacji fragmentów biblioteki na powierzchni kulek przed sekwencjonowaniem. kulek przed sekwencjonowaniem. Zazwyczaj biblioteki są kodowane paskowo i łączone, aby zmaksymalizować wydajność sekwencjonowania każdego przebiegu sekwencjonowania. Tutaj opisujemy nowe podejście podejście do normalizacji multipleksowych bibliotek sekwencjonowania następnej generacji po emulsyjnym PCR. W skrócie, amplifikowane biblioteki zawierające unikalne kody kreskowe są przygotowywane przez fluorescencyjne znakowanie komplementarnych sekwencji, a następnie rozdzielane przez szybkie sortowanie cytometryczne znakowanych kulek emulsyjnych PCR. Protokół jest prosty i zapewnia równomierny rozkład sekwencji bibliotek multipleksowych podczas sekwencjonowania kulek sortowanych przepływowo. Ponadto, ponieważ wiele pustych i mieszanych kulek Ponadto, ponieważ wiele pustych i mieszanych kulek emulsji PCR jest usuwanych, podejście to prowadzi do znacznego wzrostu jakości sekwencji i średniej długości odczytu, w porównaniu do tej uzyskanej przez standardowe protokoły wzbogacania. protokołów wzbogacania. --- Sekwencjonowanie Sangera zaburzeń wielogenowych może być technicznie trudne, czasochłonne i czasochłonne i zbyt kosztowne. Sekwencjonowanie nowej generacji o wysokiej przepustowości sekwencjonowanie (NGS) może zapewnić opłacalną metodę sekwencjonowania ukierunkowanych genów związanych z zaburzeniami wielogenowymi. Opracowaliśmy kliniczny test NGS dla genomu mitochondrialnego i 108 wybranych genów jądrowych związanych z zaburzeniami mitochondrialnymi. genów jądrowych związanych z zaburzeniami mitochondrialnymi. Zaburzenia mitochondrialne mają częstość występowania 1 na 5000 żywych urodzeń, obejmują szeroki zakres fenotypów i są przypisywane fenotypów i są przypisywane mutacjom w genomach mitochondrialnych i jądrowych. genomach mitochondrialnych i jądrowych. Około 20% zaburzeń mitochondrialnych wynika z mutacji w mtDNA. mtDNA, a pozostałe 80% występuje w genach jądrowych, które wpływają na poziomy mtDNA lub białka mitochondrialnego. W naszym podejściu NGS, 16,569-bp mtDNA jest wzbogacony przez PCR dalekiego zasięgu i 108 genów jądrowych (które reprezentują 1301 amplikonów i 680 kb) jest wzbogacanych przez emulsyjną reakcję PCR RainDance. Sekwencjonowanie jest przeprowadzane na platformach Illumina HiSeq 2000 lub MiSeq, a analiza bioinformatyczna jest przeprowadzana przy użyciu komercyjnych i opracowanych we własnym zakresie potoków bioinformatycznych. A Łącznie zbadano 16 próbek walidacyjnych i 13 próbek klinicznych. Wszystkie wcześniej warianty związane z zaburzeniami mitochondrialnymi zostały znalezione w próbkach w próbkach walidacyjnych, a w 5 z 13 próbek klinicznych znaleziono mutacje związane z zaburzeniami mitochondrialnymi w genomie mitochondrialnym lub 108 genach jądrowych. genomie mitochondrialnym lub 108 genach jądrowych. Wszystkie warianty zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie Sangera Sangera. --- Ludzkie antygeny leukocytarne (HLA) klasy I i klasy II są najbardziej polimorficznymi genami w ludzkim genomie. polimorficzne geny w ludzkim genomie; rozróżnienie tysięcy alleli HLA jest wyzwaniem. Sekwencjonowanie następnej generacji egzonicznych amplikonów za pomocą sekwencji genomowej 454 genome sequence (GS) FLX System i oprogramowaniem Conexio Assign ATF 454 zapewnia wysoką rozdzielczość, wysoką przepustowość genotypowania HLA dla ośmiu loci klasy I i klasy II loci. Typowanie HLA potencjalnych dawców dla niespokrewnionych rejestrów dawców szpiku kostnego zazwyczaj wykorzystuje podzbiór tych loci przy wysokiej przepustowości próbki i niskim koszcie za próbkę. próbkę. System Fluidigm Access Array umożliwia włączenie 48 różnych identyfikatorów multipleksowych (MID). różnych identyfikatorów multipleksowych (MID) odpowiadających 48 próbkom genomowego DNA z maksymalnie 48 różnymi parami starterów w urządzeniu mikroprzepływowym generującym 2304 równoległe reakcje łańcuchowe polimerazy (PCR). Używane są minimalne ilości odczynników. odczynników. Podczas genomowej reakcji PCR, w tym 4-primerowym systemie, zewnętrzny zestaw starterów zawierający MID i sekwencje adaptorowe 454 są włączane do amplikon generowany przez wewnętrzne startery specyficzne dla celu HLA, z których każdy zawiera zawierający wspólny znacznik sekwencji na końcu 5' starterów do przodu i do tyłu. Pule Powstałe amplikony są wykorzystywane do emulsyjnego PCR i sekwencjonowania klonalnego w systemie 454 Life Sciences GS FLX System, a następnie genotypowania za pomocą oprogramowania Conexio. Przeprowadziliśmy genotypowanie 192 próbek ze 100% zgodnością ze znanymi genotypami przy użyciu 8 par starterów (obejmujących eksony 2 i 3 HLA-A, B i C oraz ekson 2 DRB1, 3/4/5 i DQB1) i 96 MID w pojedynczym przebiegu GS FLX. Uzyskano średnio 166 odczytów na amplikon. Przeprowadziliśmy również genotypowanie 96 próbek w wysokiej rozdzielczości (14 par starterów obejmujących eksony 2, 3 i 4 loci klasy I oraz eksony 2 DRB1, 3/4/5, DQA1, DQB1, DPB1 i ekson 3 DQB1), uzyskując średnio 173 odczyty sekwencji na amplikon. odczytów sekwencji na amplikon. --- System 454 Genome Sequencer (GS) FLX jest jednym z systemów sekwencjonowania nowej generacji sekwencjonowania charakteryzujący się długimi odczytami, wysoką dokładnością i bardzo wysoką przepustowością. przepustowość. W oparciu o mechanizm emulsyjnej reakcji PCR, unikalna matryca DNA wygenerować unikalny odczyt sekwencji po amplifikacji i sekwencjonowaniu w GS FLX. Jednak w procesie emulsyjnego PCR może wystąpić tendencyjna amplifikacja szablonów DNA, co skutkuje emulsyjnego PCR, co skutkuje produkcją sztucznych zduplikowanych odczytów. Pod warunkiem, że każda matryca DNA jest unikalna w stosunku do innej, 3,49%-18,14% odczytów w danych sekwencjonowania GS FLX okazało się być sztucznymi zduplikowanymi odczytami. odczyty. Te zduplikowane odczyty mogą prowadzić do błędnego zrozumienia danych sekwencjonowania i należy zwrócić szczególną uwagę na potencjalne odchylenia, które wprowadzają do danych. danych. --- TŁO: Aortopatie to grupa zaburzeń charakteryzujących się tętniakami, tętniakami, poszerzeniem i krętością aorty. Ze względu na nakładanie się fenotypów i heterogenność genetyczną chorób charakteryzujących się aortopatią, testy molekularne są często często wymagane do terminowej i prawidłowej diagnozy osób dotkniętych chorobą. W tym sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) oferuje kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami molekularnymi. tradycyjnymi technikami molekularnymi. METODY: Celem naszego badania było porównanie metod wzbogacania NGS dla testu klinicznego klinicznego testu ukierunkowanego na dziewięć genów, o których wiadomo, że są związane z aortopatią. Metody wzbogacania wychwytywania hybrydyzacji RNA za pomocą emulsji RainDance PCR i SureSelect zostały bezpośrednio porównane poprzez wzbogacenie DNA z ośmiu próbek. Wzbogacone próbki zostały oznaczone kodem kreskowym, połączone i zsekwencjonowane na platformie Illumina HiSeq2000. Oceniono głębokość pokrycia, spójność pokrycia w różnych próbkach i nakładanie się zidentyfikowanych wariantów. zidentyfikowanych wariantów. Dane te porównano również z danymi z sekwencjonowania whole-exome dane z sekwencjonowania całego eksomu od dziesięciu osób. WYNIKI: Głębokość odczytu była większa i mniej zmienna wśród próbek, które zostały wzbogaconych przy użyciu metody hybrydyzacji RNA-przynęta. Ponadto Ponadto, próbki wzbogacone metodą hybrydyzacji miały mniej eksonów o średnim pokryciu poniżej 10 mniej niż 10, zmniejszając potrzebę dalszego sekwencjonowania Sangera. Uzyskane zestawy wariantów były w 77% zgodne, przy czym obie techniki dawały podobną liczbę niezgodnych wariantów. WNIOSKI: Porównując elastyczność projektowania, wydajność i koszt metod z sekwencjonowaniem całego eksomu, hybrydyzacja RNA-przynęta panel genów wzbogacających wychwytywanie hybrydyzacji RNA oferuje lepsze rozwiązanie dla do badania genów aortopatii w warunkach laboratorium klinicznego. --- CEL: Wykrycie patogennych mutacji w zespole Marfana (MFS) przy użyciu urządzenia Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) i zweryfikowanie wyników ukierunkowanego sekwencjonowania półprzewodnikowego sekwencjonowania półprzewodnikowego nowej generacji w diagnostyce zaburzeń genetycznych. METODY: Próbki krwi obwodowej pobrano od trzech pacjentów z MFS i od osoby normalnej kontroli za świadomą zgodą. Genomowe DNA wyizolowano standardową metodą a następnie poddano ukierunkowanemu sekwencjonowaniu przy użyciu Ion Ampliseq(TM) Inherited Disease Panel. Przeprowadzono trzy multipleksowe reakcje PCR w celu amplifikacji eksonów kodujących 328 genów, w tym FBN1, TGFBR1 i TGFBR2. DNA z różnych próbek ligowano z kodowanymi paskowo adapterami do sekwencjonowania. Przygotowanie szablonu i emulsyjny PCR oraz wzbogacanie cząstek Ion Sphere Particles zostały przeprowadzono przy użyciu systemu Ion One Touch. Cząsteczki sfery jonowej zostały sekwencjonowane na chipie 318 przy użyciu platformy PGM. Dane z przebiegów PGM zostały przetwarzane przy użyciu oprogramowania Ion Torrent Suite 3.2 w celu wygenerowania odczytów sekwencji. Po wyrównaniu sekwencji i ekstrakcji SNP i indeli, wszystkie warianty zostały przefiltrowane względem dbSNP137. Sekwencje DNA zostały zwizualizowane za pomocą programu Integrated Genomics Viewer. Najbardziej prawdopodobne warianty chorobotwórcze analizowano za pomocą sekwencjonowania Sangera. Sangera. WYNIKI: Sekwencjonowanie PGM dało wynik 855,80 Mb, z medianą głębokości sekwencjonowania > 100 × medianą głębokości sekwencjonowania i pokryciem > 98% dla regionów docelowych we wszystkich we wszystkich czterech próbkach. Po analizie danych i filtrowaniu bazy danych, jedna znana mutacja missense mutacja (p.E1811K) i dwie nowe mutacje przedwczesnego zakończenia (p.E2264X i p.L871FfsX23) w genie FBN1 zostały zidentyfikowane u trzech pacjentów z MFS. Wszystkie mutacje zostały zweryfikowane przez konwencjonalne sekwencjonowanie Sangera. WNIOSEK: Patogenne mutacje FBN1 zostały zidentyfikowane u wszystkich pacjentów z MFS. MFS, wskazując, że ukierunkowane sekwencjonowanie następnej generacji na sekwenatorach PGM może być stosowane do dokładnego i wysokowydajnego testowania zaburzeń genetycznych. zaburzeń genetycznych.
Jakie jest zastosowanie emulsyjnego PCR w sekwencjonowaniu nowej generacji?
Przed reakcjami sekwencjonowania nowej generacji tworzone są biblioteki DNA, amplifikowane za pomocą emulsyjnego PCR i wzbogacane przy użyciu kulek wzbogacających. Próbki biblioteczne są następnie ładowane do układu sekwencjonowania i analizowane na platformie NGS.