Elizabeth có một đối thủ nguy hiểm là một người em họ, một giáo dân Công giáo, Mary Stuart, Nữ vương Scotland và là vợ của Vua nước Pháp, François II. Năm 1559, với sự ủng hộ của nước Pháp, Mary tuyên bố là Nữ vương Anh. Chính sách ban đầu của Elizabeth đối với Scotland là chống lại sự hiện diện của người Pháp ở đây do lo ngại âm mưu của người Pháp xâm lăng nước Anh và đặt Mary, Nữ vương Scotland lên ngai báu Anh Quốc. Elizabeth gởi quân đến Scotland hỗ trợ những người Kháng Cách chống đối. Tháng 7 năm 1560, Hiệp ước Edinburgh được ký kết giúp giải tỏa mối đe dọa của người Pháp từ phía bắc. Năm 1561, khi Mary quay trở lại Scotland để cầm quyền thì giáo hội Kháng Cách đã có vị trí vững chắc ở đây, và đất nước được cai trị bởi một hội đồng các nhà quý tộc Kháng Cách được Elizabeth hậu thuẫn. Mary từ chối phê chuẩn hiệp ước.