Năm 1565, Mary kết hôn với Huân tước Darnley, người tuyên bố quyền kế thừa ngai vàng nước Anh. Tuy vậy, cuộc hôn nhân là điểm khởi đầu một chuỗi những sai lầm khiến Mary mất quyền kiểm soát vào tay những người Kháng Cách Scotland và Elizabeth. Darnley bị mất lòng dân và mang tiếng xấu khi xử lý vụ án mạng David Rizzio, một thư ký người Ý của Mary. Tháng 2 năm 1567, Darnley bị James Hepburn, Bá tước xứ Bothwell giết chết. Tháng 5 năm 1657, Mary kết hôn với Bothwell, dấy lên những nghi ngờ cho rằng Nữ vương đồng mưu giết chồng.