Giám đốc của Cục Điều tra J. Edgar Hoover trở thành giám đốc đầu tiên của Cục mới thành lập là Cục Điều tra Liên bang, nếu tính luôn thời gian lãnh đạo từ khi Cục là Cục Điều tra, rồi sang Đơn vị Điều tra và Cục Điều tra Liên bang, ông đã phục vụ 48 năm. Sau cái chết của Hoover, luật đã giới hạn lại thời gian nắm quyền của các giám đốc về sau chỉ tối đa 10 năm. Hoover có nhiều ảnh hưởng đáng kể trong hầu hết mọi kế hoạch và công việc của FBI trong nhiệm kì của mình, Phòng Thí nghiệm Khoa học Điều tra Tội phạm hay còn gọi là Phòng Thí nghiệm FBI ra đời năm 1932, ý tưởng chủ yếu là của Hoover.