Ngày 7 tháng 9 năm 1926, quân Bắc phạt công chiếm Hán Khẩu, ngày 8 tháng 11 công chiếm Nam Xương, ngày 11 tháng 11, Chính phủ Quốc dân tại Quảng Châu quyết định dời về phía bắc đến Vũ Hán, Tưởng Giới Thạch thì chủ trương thiên đô đến Nam Xương đang do ông khống chế. Tháng 3 năm 1927, quân Bắc phạt chiếm xong Thượng Hải và Nam Kinh, song giữa thế lực chống cộng do Tưởng Giới Thạch đứng đầu và thế lực dung cộng do Uông Tinh Vệ đứng đầu phát sinh phân liệt. Tưởng Giới Thạch sau thời gian ở Liên Xô đã trở nên căm ghét chủ nghĩa cộng sản. Ông hủy bỏ chính sách Liên Nga của Tôn Trung Sơn. Mâu thuẫn giữa Liên Xô và Trung Hoa Dân Quốc gia tăng tới mức vào tháng 4/1927, Stalin gửi thư cho Đảng Cộng sản Trung Quốc kêu gọi nổi dậy vũ trang. Ngày 6/4/1927, Stalin tuyên bố Quân đội Quốc Dân Đảng là kẻ thù và Tưởng phải bị tiêu diệt. Ngày 12 tháng 4 năm 1927, bùng phát sự kiện Tứ Nhất Nhị tại Thượng Hải khi Tưởng Giới Thạch phát động thanh lọc cộng sản, đến ngày 18 tháng 4 ông lập riêng Chính phủ Quốc dân tại Nam Kinh. Ngày 15 tháng 7, Uông Tinh Vệ tại Vũ Hán bắt đầu thanh lọc cộng sản, Quốc-Cộng hợp tác lần thứ nhất do đó kết thúc. Ngày 1 tháng 8 năm 1927, Đảng Cộng sản Trung Quốc phát động Khởi nghĩa Nam Xương, bắt đầu sử dụng vũ lực đoạt chính quyền, mở màn Quốc-Cộng nội chiến lần thứ nhất kéo dài 10 năm liên tục. Tháng 5 năm 1928, Quốc dân Cách mạng quân tại Tế Nam bị quân đội Nhật Bản đánh chặn gây ra Thảm án Ngũ Tam, phải đi đường vòng để Bắc phạt. Tháng 6 năm 1928, quân Bắc phạt chiếm được Bắc Kinh. Ngày 29 tháng 12 cùng năm, lãnh đạo Phụng hệ là Trương Học Lương đánh điện đến Nam Kinh, tuyên bố tiếp nhận Chính phủ Quốc dân cai quản, đánh dấu thắng lợi của Chính phủ Quốc dân trong Bắc phạt, thống nhất Trung Quốc trên danh nghĩa. Tuy nhiên, không lâu sau giữa trung ương và quân phiệt địa phương bùng phát Trung Nguyên đại chiến, còn xung đột Quốc-Cộng tiếp tục tiến hành.