Fermi rời Italia năm 1938 để tránh bộ luật mới ảnh hưởng tới những người Do Thái, trong đó có vợ ông Laura, và định cư tại Hoa Kỳ. Tại đây ông tham gia vào dự án Manhattan trong thời gian chiến tranh thế giới lần hai. Fermi đứng đầu một đội các kỹ sư thiết kế và xây dựng lò phản ứng Chicago Pile-1. Vào ngày 2 tháng 12 năm 1942, lần đầu tiên họ đã khởi động lò nhân tạo bằng phản ứng hạt nhân dây chuyền tự duy trì khi nhiên liệu hạt nhân đạt khối lượng tới hạn. Ông đã chuyển đến làm việc tại Lò graphit X-10 tại Oak Ridge, Tennessee và đưa nó vào hoạt động năm 1943, cũng như lò B tại Khu Hanford đi vào hoạt động năm 1944. Ở Phòng thí nghiệm Quốc gia Los Alamos ông lãnh đạo Phân viện F, nơi thực hiện các thí nghiệm nhiệt hạt nhân. Fermi cũng có mặt tại Vụ thử bom nguyên tử đầu tiên trên thế giới Trinity ngày 16 tháng 7 năm 1945, tại đây ông thể hiện khả năng tính toán các vấn đề phức tạp như ước lượng sức nổ của quả bom chỉ bằng những thí nghiệm đơn giản và viết công thức sau phong bì.