Mối liên kết giữa hai chị em không kéo dài. Mary quyết tâm đàn áp đức tin Kháng Cách mà Elizabeth tiếp nhận từ khi còn bé, và buộc mọi người phải dự lễ Misa. Elizabeth không có sự lựa chọn nào khác phải tỏ ra phục tùng Nữ vương. Song uy tín của Mary sút giảm khi dân chúng biết dự định kết hôn với Hoàng tử Felipe của Tây Ban Nha (về sau là vua Felipe II của Tây Ban Nha) nhằm tìm kiếm sự hậu thuẫn cho phe Công giáo bên trong nước Anh. Sau cuộc nổi dậy của Wyatt năm 1554 tìm cách ngăn cản cuộc hôn nhân giữa Mary và Felipe nhưng thất bại, Elizabeth bị cầm giữ trong Tháp Luân Đôn vì bị cho là có dính líu đến cuộc nổi dậy. Có những sự đòi hỏi xử tử hình Elizabeth, nhưng đa số dân Anh không muốn nhìn thấy một thành viên thuộc dòng họ Tudor rất được lòng dân bị sát hại. Quan Chưởng ấn Stephen Gardiner muốn rút tên Elizabeth khỏi danh sách kế vị, nhưng cả Mary lẫn Quốc hội đều không đồng ý. Sau hai tháng bị giam giữ, Elizabeth được trả tự do vào đúng ngày mẹ cô bị hành quyết mười tám năm trước. Ngày 22 tháng 5, khi Elizabeth được đưa đến Woodstock để bị quản thúc tại gia dưới sự giám sát của Sir Henry Bedingfield, dân chúng đứng hai bên đường hoan hô cô.