Một trong những mối quan tâm hàng đầu của Elizabeth I khi bắt đầu trị vì là các vấn đề tôn giáo. Nhận biết thần dân muốn Nữ vương khước từ quyền lực của Giáo hoàng và ảnh hưởng của Tây Ban Nha, điều này phù hợp với ước nguyện của bà và những quyết sách được đề nghị bởi Sir William Cecil. Elizabeth cũng biết Giáo hoàng sẽ không chịu công nhận bà là con hợp pháp của Henry VIII và là quân vương của nước Anh. Vì vậy, Nữ vương quyết định thành lập một giáo hội Kháng Cách phù hợp với nguyện vọng người dân Anh. Năm 1559, Quốc hội làm luật thành lập giáo hội theo mô hình của Edward VI, với nhà vua là người đứng đầu giáo hội. Dự luật nhận được sự ủng hộ mạnh mẽ tại Viện Thứ dân, nhưng gặp chống đối tại Viện Quý tộc, đặc biệt là từ các Giám mục. Tuy nhiên, may mắn cho Elizabeth, nhiều vị trí Giám mục đang khuyết, kể cả chức vụ Tổng Giám mục thành Canterbury. Điều này giúp các thành viên Viện Quý tộc ủng hộ Kháng Cách chiếm đa số phiếu khi biểu quyết. Đạo luật Đồng nhất (Act of Uniformity) được Nữ vương phê chuẩn năm 1559, quy định việc sử dụng Sách Cầu nguyện chung theo đức tin Kháng Cách trong các nhà thờ. Bí tích Thánh thể của Giáo hội Công giáo bị bác bỏ. Nữ vương nhận danh hiệu "Thống đốc Tối cao của Giáo hội Anh" thay vì "Đầu của Giáo hội".