Bắt đầu vào thập niên năm 1940 và tiếp tục vào thập niên 1970, Cục tiến hành điều tra các hoạt động gián điệp chống lại nước Mỹ và đồng minh. Cục đã bắt được 8 điệp viên theo Phát xít đang lên kế hoạch phá hoại nước Mỹ và xử tử 6 trong số 8 tên. Trong thời gian này, một liên minh giữa Hoa Kỳ và Anh quốc nỗ lực phá mã ‘’Venona’’(mã liên lạc tình báo và ngoại giao của Liên Xô) – mà FBI là cơ quan chủ đạo – đã hỗ trợ nhà cầm quyền đọc được thông tin liên lạc của Liên Xô. Nhờ những nỗ lực trên mà họ có thể xác định được có những người Mỹ làm việc cho tình báo Liên Xô. Hoover là người chỉ đạo trực tiếp chiến dịch này nhưng đã không thông báo cho Cơ quan Tình báo Trung ương (CIA) mãi cho đến năm 1952. Điểm nổi bật trong sự việc này là vụ bắt giữ Rudolf Abel năm 1957. Việc phát hiện ra điệp viên Xô Viết tại Hoa Kỳ đã thôi thúc nỗi ám ảnh từ lâu của Hoover về mối hiểm họa tiềm tàng mà ông nhận thấy được từ những Người Mỹ bị bỏ rơi, xuất xứ từ công đoàn của Đảng Cộng sản Hoa Kỳ cho đến những người thuộc phe Tự do.