Năm 1886, Tòa án Tối cao nhận thấy rằng liên bang không hề có đủ thẩm quyền điều chỉnh một số vấn đề xảy ra ở cùng lúc nhiều tiểu bang, dẫn đến Đạo luật Thương mại Liên bang ra đời năm 1887 nhằm tạo ra một cơ quan thực thi pháp luật có đủ thẩm quyền trong việc giải quyết các vụ việc mang tính chất cấp Liên bang. Tuy nhiên Bộ Tư pháp lại tỏ ra chậm chạp trong việc phân phối nguồn nhân lực cho Cục, dẫn đến Tổng Chưởng lý Charles Joseph Bonaparte phải nhờ đến các cơ quan khác, có cả Cơ quan Mật vụ để hỗ trợ điều tra. Tuy nhiên, Quốc hội đã thông qua bộ luật nghiêm cấm Bộ Tư pháp sử dụng nhân lực từ Bộ Ngân khố, do đó Tổng Chưởng lý phải tổ chức và thành lập Cục Điều tra một cách hoàn chỉnh với nhân sự là các đặc vụ riêng của Cục. Cơ quan Mật vụ đã hỗ trợ Bộ Tư pháp 12 đặc vụ và những đặc vụ này đã trở thành những đặc vụ đầu tiên của Cục Điều tra mới thành lập. Những đặc vụ đầu tiên của FBI hóa ra lại là những đặc vụ của Cơ quan Mật vụ, từ đó Cục chính thức có đầy đủ thẩm quyền theo Đạo luật Thương mại Liên bang năm 1887. FBI phát triển rất mạnh với một lượng đặc vụ rất dày đặc vào tháng 7 năm 1908 trong thời kì của Tổng thống Theodore Roosevelt, nhiệm vụ chính thức đầu tiên của Cục là thâm nhập và khảo sát về các nhà chứa để chuẩn bị thực thi pháp luật theo Đạo luật ‘’Buôn bán nô lệ da trắng’’ hay còn gọi là ‘’Đạo luật Mann’’ được ban hành vào 25 tháng 6 năm 1910. Năm 1932, Cục đổi tên là Cục Điều tra Hoa Kỳ. Năm sau đó, Cục kết hợp với Cục Kiểm soát Rượu và chất có cồn và được đặt tên lại là Đơn vị Điều tra trước khi tách ra và trở thành một Cục hoàn chỉnh trực thuộc Bộ Tư pháp vào năm 1935. Trong cùng năm đó, Cục chính thức đổi tên Đơn vị Điều tra thành Cục Điều tra Liên bang và được sử dụng cho đến ngày nay, viết tắt là FBI.