La hidrólisis de ATP es el proceso de reacción catabólica por el cual la energía química que se ha almacenado en los enlaces de fosfato de alta energía en el trifosfato de adenosina (ATP) se libera al dividir estos enlaces, por ejemplo en los músculos, al producir trabajo en forma de energía mecánica. El producto es adenosina difosfato (ADP) y un fosfato inorgánico, ortofosfato (Pi). El ADP puede hidrolizarse aún más para dar energía, monofosfato de adenosina (AMP) y otro ortofosfato (Pi).[1]​ La hidrólisis de ATP es el vínculo final entre la energía derivada de los alimentos o la luz solar y el trabajo útil, como la contracción muscular, el establecimiento de gradientes electroquímicos a través de las membranas y los procesos biosintéticos necesarios para mantener la vida. 
Los enlaces PO son bastante fuertes (~30 kJ/mol más fuertes que los enlaces CN)[2]​[3]​ y no son particularmente fáciles de romper. Como se indica a continuación, la hidrólisis de ATP libera energía. Sin embargo, cuando los enlaces PO se rompen, se requiere la entrada de energía. Es la formación de nuevos enlaces y fosfato inorgánico de baja energía con una liberación de una mayor cantidad de energía que reduce la energía total del sistema y lo hace más estable.[1]​ 
La hidrólisis de los grupos fosfato en el ATP es especialmente exergónica, porque el ion molecular del ortofosfato resultante se estabiliza en gran medida mediante múltiples estructuras de resonancia, lo que hace que los productos (ADP y Pi) tengan menos energía que el reactivo (ATP). La alta densidad de carga negativa asociada con las tres unidades de fosfato adyacentes de ATP también desestabiliza la molécula, haciéndola más alta en energía. La hidrólisis alivia algunas de estas repulsiones electrostáticas, liberando energía útil en el proceso al causar cambios conformacionales en la estructura de la enzima. 
En los humanos, aproximadamente el 60 por ciento de la energía liberada por la hidrólisis del ATP produce calor metabólico en lugar de alimentar las reacciones reales que tienen lugar.[4]​ Debido a las propiedades ácido-base de ATP, ADP y fosfato inorgánico, la hidrólisis de ATP tiene el efecto de disminuir el pH del medio de reacción. Bajo ciertas condiciones, los altos niveles de hidrólisis de ATP pueden contribuir a la acidosis láctica.