La fosforilación a nivel de sustrato es una reacción química que se puede definir como la producción de ATP (o GTP) a partir de ADP (o GDP) combinada a una transformación enzimática de un sustrato, reacción en la que no está implicada la fosforilación oxidativa ni una ATP sintasa.[1]​ Lo que generalmente ocurre es que un sustrato de alta energía fosfatado, cede su fosfato de alta energía al ADP.[2]​[Nota 1]​