Přesný mechanismus účinku není jasně stanoven, ale pravděpodobné je potlačení zvýšené syntézy cyklické AMP způsobené endogenní beta- adrenergní stimulací.
Ofschoon het exacte werkingsmechanisme van timolol nog niet vaststaat, lijkt remming van de toename van de cyclisch AMP-synthese, die wordt veroorzaakt door endogene bèta-adrenerge stimulatie, waarschijnlijk.