Intracelulárně je metabolizován pomocí nukleosid kinázy na aktivní difosfát (dFdCDP) a trifosfát (dFdCTP) nukleosid.
Gemsitabiinin sytotoksinen vaikutus johtuu siitä, että dFdCDP ja cFcCTP estävät DNA- synteesiä kahdella eri mekanismilla. dFdCDP estää ribonukleotidi - reduktaasia, ainoata entsyymiä, joka katalysoi DNA- synteesissä tarvittavia deoksinukleosiditrifosfaatteja (dCTP) tuottavia reaktioita.