In vitro- forsøg har vist, at pemetrexed fungerer som et bredspektret anti- folat ved at hæmme thymidylatsyntase (TS), dihydrofolatreduktase (DHFR) og glycinamidribonucleotidformyltransferase (GARFT), som er folatafhængige nøgleenzymer i forbindelse med de novo- biosyntesen af thymidin og purinnukleotider.
In vitro uuringutest on selgunud, et pemetrekseed käitub mitmesuunalise toimega antifolaadina, inhibeerides tümidülaatsüntaasi (TS), dihüdrofolaadi reduktaasi (DHFR) ja glütsiinamiid - ribonukleotiidi formüültransferaasi (GARFT), mis on tümidiin - ja puriin- nukleotiidide uuestisünteesi folaatidest sõltuvad võtmeensüümid.