Vào ngày 18 tháng 6 năm 2016, trong trận tứ kết Copa América với Venezuela, Messi là cầu thủ xuất sắc nhất trận đấu, kiến tạo hai bàn và ghi một bàn trong chiến thắng 4–1, giúp anh sánh ngang với kỷ lục ghi 54 bàn trong các trận đấu quốc tế chính thức của Gabriel Batistuta. Kỷ lục này tiếp tục bị phá vỡ ba ngày sau đó khi Messi đá phạt thành bàn trong trận bán kết thắng 4–0 trước chủ nhà Hoa Kỳ; anh cũng đã kiến tạo hai bàn thắng trong trận đấu đó đưa Argentina vào trận chung kết năm thứ hai liên tiếp, và được bầu là cầu thủ xuất sắc nhất trận đấu một lần nữa.Trong trận chung kết diễn ra vào ngày 26 tháng 6, Argentina một lần nữa để thua Chile trên chấm luân lưu sau khi hòa nhau 0–0 ở 120 phút, dẫn đến thất bại thứ ba liên tiếp của Messi trong một trận chung kết giải đấu lớn với Argentina và là trận thứ tư của riêng cá nhân anh. Sau trận đấu, Messi, người đã sút hỏng quả phạt đền trong loạt luân lưu, tuyên bố từ giã sự nghiệp thi đấu quốc tế. Anh nói, "Tôi đã cố gắng hết sức. Đội tuyển đã thất bại vì tôi, một quyết định được đưa ra." Huấn luyện viên của Chile Juan Antonio Pizzi phát biểu sau trận đấu, "Thế hệ của tôi không thể so sánh anh ấy với Maradona, bởi vì những gì Maradona đã làm cho bóng đá Argentina. Nhưng tôi nghĩ đó là cầu thủ xuất sắc nhất hiện tại từng có mặt ở Hoa Kỳ." Messi kết thúc giải với tư cách là cầu thủ ghi bàn nhiều thứ hai, sau Eduardo Vargas, với 5 bàn thắng và là cầu thủ kiến tạo nhiều nhất với 4 pha kiến tạo, đồng thời giành được nhiều giải Cầu thủ xuất sắc nhất trận hơn bất kỳ cầu thủ nào khác tại giải đấu (3); anh được xếp vào đội hình xuất sắc giải đấu vì những màn trình diễn của mình, nhưng đã để mất giải thưởng Quả bóng vàng cho cầu thủ xuất sắc nhất vào tay Alexis Sánchez.
Vào ngày 18 tháng 6 năm 2016, trong trận tứ kết Copa América với Venezuela, Messi là cầu thủ xuất sắc nhất trận đấu, kiến tạo hai bàn và ghi một bàn trong chiến thắng 4–1, giúp anh sánh ngang với kỷ lục ghi 54 bàn trong các trận đấu quốc tế chính thức của Gabriel Batistuta. Nhưng tôi nghĩ đó là cầu thủ xuất sắc nhất hiện tại từng có mặt ở Hoa Kỳ."