Tại FIFA World Cup 2022 ở Qatar, Messi đã thực hiện thành công quả phạt đền trong trận ra quân của Argentina, thất bại 2–1 trước Ả Rập Xê Út, trước khi anh lập công từ một cú sút xa 20 mét và có pha kiến tạo cho Enzo Fernández ghi bàn trong trận thắng 2–0 trước Mexico. Trong trận đấu thuộc vòng 16 đội gặp Australia, Messi đã ghi bàn mở tỷ số trong chiến thắng 2–1 của Argentina tại trận đấu thứ 1000 trong sự nghiệp của mình, trở thành nam cầu thủ bóng đá Nam Mỹ (thành viên CONMEBOL) có nhiều trận ra sân nhất mọi thời đại, phá vỡ kỷ lục trước đó do Iván Hurtado của Ecuador thiết lập, cùng với việc vượt qua và san bằng một số kỷ lục khác liên quan đến FIFA World Cup và cấp độ đội tuyển quốc gia. Trong trận tứ kết với Hà Lan, Messi đã có pha kiến tạo bằng một đường chuyền chọc khe  cho Nahuel Molina mở tỷ số và sau đó chính anh ghi bàn từ chấm phạt đền giúp Argentina nhân đôi cách biệt, hai đội hòa nhau 2–2 sau hiệp phụ. Argentina thắng 4–3 trong loạt sút luân lưu, với Messi là người thực hiện quả phạt đền đầu tiên. Trong trận bán kết với Croatia, Messi đã có trận đấu thứ 25 tại World Cup, ngang bằng kỷ lục với Lothar Matthäus của Đức, anh ghi bàn mở tỷ số bằng một quả phạt đền trước khi kiến tạo bàn thắng thứ ba cho Julián Álvarez lập công trong chiến thắng 3–0 của Argentina. Argentina tiến vào trận tranh ngôi vô địch với Pháp, Messi nói rằng đây sẽ là lần cuối cùng anh tham dự World Cup.Trong trận chung kết FIFA World Cup 2022 vào ngày 18 tháng 12, Messi đã lập kỷ lục có 26 lần ra sân ở vòng chung kết World Cup tại Sân vận động Lusail. Messi mở tỷ số trên chấm phạt đền cho Argentina, qua đó anh trở thành cầu thủ đầu tiên kể từ khi vòng 16 đội được giới thiệu vào năm 1986 ghi bàn ở tất cả các giai đoạn ở World Cup. Sau khi Argentina vươn lên dẫn 2-0, tiền đạo Kylian Mbappé của Pháp đã ghi liên tiếp 2 bàn thắng chỉ trong 2 phút để đưa trận đấu về vạch xuất phát, Messi tiếp tục ghi bàn trong hiệp phụ để khôi phục lại thế dẫn trước cho Argentina, trước khi Mbappé một lần nữa gỡ hòa cho Pháp. Hòa 3–3 sau hiệp phụ, trận đấu phải bước vào loạt sút luân lưu. Messi thực hiện thành công lượt sút đầu tiên cho Argentina, Argentina giành chiến thắng chung cuộc 4–2, chấm dứt 36 năm mòn mỏi chờ đợi chiếc cúp vàng của quốc gia này. Messi nhận Quả bóng vàng cho cầu thủ xuất sắc nhất giải đấu, trở thành cầu thủ đầu tiên hai lần giành được giải thưởng này. Anh về nhì trong cuộc đua Chiếc giày vàng với 7 bàn sau 7 trận, kém Mbappé một bàn. Với sự góp mặt và hai bàn thắng trong trận chung kết, Messi đã lần lượt vượt qua Matthaüs để trở thành cầu thủ có nhiều lần ra sân nhất tại World Cup (26), và Pelé để trở thành cầu thủ có nhiều đóng góp trực tiếp vào bàn thắng nhất tại World Cup (21 – 13 bàn và 8 kiến tạo). Đây được ca ngợi là một trong những trận đấu hay nhất mọi thời đại, với việc giới truyền thông tập trung rất nhiều vào cuộc đấu tay đôi giữa Messi và Mbappé. Sau trận đấu, Messi khẳng định rằng bản thân không có kế hoạch từ giã đội tuyển quốc gia, anh nói: "Tôi muốn tiếp tục thi đấu với tư cách nhà vô địch."
Tại FIFA World Cup 2022 ở Qatar, Messi đã thực hiện thành công quả phạt đền trong trận ra quân của Argentina, thất bại 2–1 trước Ả Rập Xê Út, trước khi anh lập công từ một cú sút xa 20 mét và có pha kiến tạo cho Enzo Fernández ghi bàn trong trận thắng 2–0 trước Mexico. Sau khi Argentina vươn lên dẫn 2-0, tiền đạo Kylian Mbappé của Pháp đã ghi liên tiếp 2 bàn thắng chỉ trong 2 phút để đưa trận đấu về vạch xuất phát, Messi tiếp tục ghi bàn trong hiệp phụ để khôi phục lại thế dẫn trước cho Argentina, trước khi Mbappé một lần nữa gỡ hòa cho Pháp.