Hai diễn viên nam chính, Johnny Trí Nguyễn và Dustin Nguyễn, đều có căn bản về võ thuật. Là người lập nghiệp ở ngành đóng thế tại Hollywood, Johnny Trí Nguyễn "không xa lạ" và "không bị trái ngược với lối suy nghĩ" của nhân vật Lê Văn Cường vì xuất thân là một người Mỹ gốc Việt, mang nhiều ảnh hưởng từ văn hóa Tây Phương. Vai diễn mật thám Sỹ trong Dòng máu anh hùng giúp Dustin Nguyễn trở về quê nhà lần đầu tiên từ khi sang Mỹ năm 1975. Anh mô tả đây là "một vai phản diện thú vị" và thừa nhận mình gặp nhiều khó khăn về ngôn ngữ khi nhập vai, "Dù khi ở Mỹ mình vẫn nói chuyện với gia đình, với ba mẹ bằng tiếng Việt nhưng ngôn ngữ của mình khi tham gia Dòng máu anh hùng còn rất yếu, rất hạn chế." Ca sĩ hải ngoại Nguyễn Thắng và giám đốc điều hành Nguyễn Chánh Tín cũng tham gia bộ phim.Ban đầu, vai Võ Thanh Thúy dự định giao cho vận động viên Nguyễn Thúy Hiền, người đã gặp gỡ và gây ấn tượng với Johnny Trí Nguyễn trong một cuộc thi wushu quốc tế; dù vậy, cô không thể tham gia vì mới sinh con. Nguyễn Chánh Tín giới thiệu diễn viên Ngô Thanh Vân làm người thay thế cho vai diễn này, sau khi tiếp xúc với cô trong nhiều chương trình ca nhạc, gọi cô là người "rất dễ thương, cầu tiến". Lúc này, cô vừa trải qua 6 tháng tham gia phim hành động Rough tại Singapore và "hi vọng sẽ được tham gia các tác phẩm điện ảnh thể loại này ở Việt Nam." Cô là người cuối cùng đến thử vai và gây ấn tượng với Charlie Nguyễn. Cô nhận vai vào tháng 11 năm 2005.Dù khâm phục các nhân vật nữ trong phim, Ngô Thanh Vân chia sẻ bản thân phải hòa nhập vào nhân vật một cách khó khăn: "Em với cô gái trong phim là hai người sống cách nhau gần cả trăm năm. Cái suy nghĩ, tư tưởng và hành động khác rất là xa." Đạo diễn Charlie Nguyễn giúp đỡ cô bằng cách cung cấp nhiều hình ảnh nghĩa quân bị đàn áp thời Pháp thuộc và dành nhiều thời gian để phân tích tâm lý nhân vật. Để hỗ trợ vai diễn, cô cùng 11 diễn viên cascadeur phải luyện võ trong 2 tháng (tháng 11–12 năm 2005), dưới sự chỉ đạo của Johnny Trí Nguyễn. Trong thời gian này, cô phải tập 6 tiếng mỗi ngày và tập đá đến 400–500 cái. Ngoài Ngô Thanh Vân, đoàn còn có một diễn viên đóng thế chỉ định cho nhân vật Thúy. Sau khi tập luyện, cô bất ngờ tự mình thực hiện được hết các chiêu thức, còn người đóng thế xin nghỉ vì quá sức.
Hai diễn viên nam chính, Johnny Trí Nguyễn và Dustin Nguyễn, đều có căn bản về võ thuật. Là người lập nghiệp ở ngành đóng thế tại Hollywood, Johnny Trí Nguyễn "không xa lạ" và "không bị trái ngược với lối suy nghĩ" của nhân vật Lê Văn Cường vì xuất thân là một người Mỹ gốc Việt, mang nhiều ảnh hưởng từ văn hóa Tây Phương.