より定量的なケミルミネッセンス(化学発光)・ウェスタンブロッティングとは？ - 適切な露光時間
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より定量的なケミルミネッセンス(化学発光)・ウェスタンブロッティングとは？
～適切な露光時間の設定～
露光時間を伸ばしているのにデータの見た目が変わらない、何故だろう？
実はImageQuant LAS 4000シリーズのようなCCDカメラで撮影したデジタルイメージは、実際のシグナル値と見た目が必ずしもイコールではないのです。
露光とは
「露光」とは、フィルムやCCD等の感光材料・素子に対し、光を当てることです。光がフィルムやCCDに当たると、銀の現像核や電子の形でシグナルを記録することができます。このシグナルの強度は、サンプルの発光強度と露光時間、また集光に用いたレンズの明るさや感光材料・素子の感度によって変化します。ケミルミネッセンス（化学発光）のシグナル強度に影響するパラメーターのうち、レンズの明るさやCCDの感度に関しては前回、前々回でお伝えしましたので、今回は適切な露光時間について考えてみたいと思います。
ヒストグラム、見てますか？
下図とヒストグラム（A、B、C）は同じ発光サンプルを露光時間を3回変えて撮影したものです。この3つのヒストグラムのうち、適した露光時間で撮影されたものはどれでしょう？
A. 10秒露光
撮影した画像とヒストグラム
B. 70秒露光
撮影した画像とヒストグラム
C. 130秒露光
撮影した画像とヒストグラム
ImageQuant LAS 4000シリーズのコントロールソフトウェアで撮影直後に見られるイメージは、コントラスト調整が行われています（※1）。コントロールソフトウェア左下に表示されるヒストグラムを見ると、どのようにコントラスト調整を行っているか、また画像のシグナル強度がどれくらいか、を確認できます。ヒストグラムは横軸に画像内に含まれるピクセルのシグナル強度（グレー階調）を、縦軸にピクセルの数を示したグラフです。
※1：コントラスト調整は露出タイプがPrecisionの場合は自動で行われます。Increment撮影時には、コントラスト調整を自動で行うかを選択可能です。
ImageQuant LAS 4000シリーズは16 bitグレー階調のイメージ（*.gelファイル）を撮影しています。16 bitグレー階調とは白から黒までを0から65,535の216段階にわけている、という意味です。
一方、パソコンのモニターは一般的に256色のグレー階調を表示しますから、16 bitグレー階調をそのままの状態で表示させることはできません。
ここで、上記のヒストグラムの中の2本表示されている、緑色の縦線を見てください。左側の縦線の位置は、パソコンのモニター上で白として表示されるシグナルの強度を、右側の縦線の位置は黒で表されるシグナルの強度を表します。16 bitグレー階調の画像は、この白と黒のシグナル強度の間に、256色のグレー階調を振り分けて表示されます。
コントラスト調整とは、この2本の縦線の幅を狭くしてシグナルを見やすくする、という操作です。特にウェスタンブロッティングのサンプルを撮影した画像は、発光していないバックグラウンド（数字が小さい階調）領域と、発光しているバンド（数字が大きい階調）の領域から構成されるので、バンドの領域をくっきりと見やすくするために、コントラスト調整が必要となります。
露光時間を変えて撮影したイメージなのに、あまり見た目が変わらないことがあるのは、画像それぞれに対しコントラスト調整が行われているから、ということになります。
では、より定量的な撮影ができているのは？
より定量性が高い画像を撮影するためには、ダイナミックレンジを広く使う必要があります。ヒストグラム中のバンド部分のピクセルの強度や、モニター上で黒で表示されているシグナル強度を示す右上の数字を見れば、ダイナミックレンジを広く使って撮影されているかどうか分かります。
ヒストグラムAの右上の数字は8703と小さく、コントラスト調整の幅が狭いので、薄いシグナルを強いコントラスト調整で見せています。バンドのボリューム測定をすると、ボリューム差が少ないため、定量性が低く、安定しません。定量性以外にも、バンドを見やすくするために、極端なコントラスト調整を行っているので、ノイズが多く見えることがあります。
Bは右上の数字が32767と大きく、コントラスト調整の幅が広くなっています。また、バンド部分のピクセル強度も十分に伸びていることから、ダイナミックレンジを広く使って撮影されていますので、定量的な画像です。
Cもダイナミックレンジを広く使って撮影されていますが、バンド部分のピクセル強度が65,535に到達しており、シグナルが飽和しています。飽和したシグナルは、それ以上の強さのシグナルの差を検出できないので、定量性がありません。
つまり、ダイナミックレンジを広く活用し、かつ飽和したピクセルがないBのようなヒストグラムの画像が、適切な露光時間で撮影された画像と言えます。適切な露光の目安は、ヒストグラムでの目的のバンド部分のシグナル強度が30,000を超えることです。
ImageQuant LAS 4000シリーズのコントロールソフトウェアでには撮影時に画像のヒストグラムを表示すると同時に、CCDが飽和している部分を赤く表示させる機能（※2）があります。ヒストグラムの情報とあわせてお使いいただくと、適切な露光時間での撮影がぐっと容易になります。
※2：Control softwareのViewメニューより、Paint saturated data redを選択してください。
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