Белковая инженерия практически значимых ферментов
Большинство природных ферментов непригодны для практического применения. Развитие методов геномного секвенирования и различных подходов белковой инженерии позволяет найти и оптимизировать свойства определенного фермента для конкретного процесса. В данном обзоре рассмотрены результаты по созданию новых биокатализаторов на основе биоинформационного поиска и рационального дизайна. Были клонированы новые гены формиатдегидрогеназ (ФДГ) из бактерий Staphylococcus aureus (SauFDH), термотолератных дрожжей Ogataea parapolymorpha (OpaFDH), пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (SceFDH) и мха Physcomitrella patens (PpaFDH). Новые ФДГ были получены в активной форме и охарактеризованы. Показано, что SauFDH имеет как минимум вдвое бoльшую каталитическую константу по сравнению со всеми описанными ФДГ. OpaFDH имеет такие же хорошие каталитические параметры, как мутанты ФДГ из сои, и превосходит последние по термостабильности. Получены кристаллы апои холо-форм SauFDH. Замена двух остатков Cys в ФДГ из бактерии Pseudomonas sp. 101 (PseFDH) позволила получить препараты фермента с улучшенными кинетическими параметрами и повышенной температурной и химической стабильностью. Получены препараты PseFDH нового поколения с измененной коферментной специфичностью от NAD+ к NADP+. Исследовано влияние ионных жидкостей на каталитические свойства и термостабильность шести рекомбинантных ФДГ дикого типа, а также ряда мутантов. В случае оксидазы D-аминокислот (DAAO) проведено объединение единичных положительных мутаций в многоточечные мутанты. Показано, что введение аминокислотных замен вызывает аддитивный эффект, улучшая кинетические параметры и повышая температурную и химическую стабильность. Клонированы гены DAAO из дрожжей Hansenula polymorpha. Ген гидролазы эфиров ?-аминокислот (AEH) был клонирован и экспрессирован в клетках E. coli в активной форме. Проведено моделирование структуры фермента и исследована эффективность при синтезе аминобеталактамов. Смоделирована структура одноцепочечной формы пенициллинацилазы из бактерий Alcaligenes faecalis (scAfPA) и с помощью PCR получен ген scAfPA. Два варианта scAfPA были экспрессированы в клетках E. coli, выделены и охарактеризованы. Каталитические свойства scAfPA оказались несколько выше, чем у природного гетеродимера.