Флуоресцентные свойства тиофлавина Т при его встраивании в нативные и денатурированные белки
Во введении дан краткий обзор работ, посвященных спектральным свойствам флуоресцентного зонда тиофлавина Т (ThT). Основное внимание обращено на объяснение причин значительного увеличения (на три порядка) квантового выхода флуоресценции зонда при встраивании в упорядоченные белковые агрегаты - амилоидные фибриллы. Также рассмотрены нерешенные проблемы, одной из которых является влияние белков плазмы крови (сывороточного альбумина человека (САЧ) и сывороточного альбумина быка (САБ)) на интенсивность и длительность затухания флуоресценции ThT. Основное содержание работы составляют результаты исследований спектров и кинетики затухания флуоресценции водных растворов ThT при добавлении нативных и денатурированных белков. Показано, что увеличение содержания белков в растворе приводит к возрастанию интенсивности в ~10 раз. Кинетика затухания флуоресценции в этом случае является неэкспоненциальной и характеризуется двухмодальным распределением. Увеличение агрегации белков путем добавления в раствор ионов Cs +, а также инкубации раствора при 63 °С приводит к дальнейшему возрастанию интенсивности свечения зонда и увеличению вклада моды затухания, характеризующейся большей длительностью. На основе анализа полученных данных сделано предположение о том, что изменение спектральных характеристик зонда является следствием его встраивания в белки. Две моды в кинетике затухания флуоресценции соответствуют двум типам встраивания ThT в белки, причем мода, соответствующая большей длительности затухания флуоресценции, образована свечением тех молекул зонда, которые встраиваются в белковые агрегаты. Вторая мода затухания, имеющая меньшие длительности, есть свечение молекул зонда, встроенных в мономерные или агрегированные макромолекулы вдали от мест их ассоциации. Полученные данные показывают, что присутствие в растворе белков в нативном, денатурированном или частично агрегированном состоянии приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции ThT. Наблюдаемое изменение на один-два порядка ниже, чем при наличии в растворе амилоидных фибрилл, однако при проведении количественных анализов содержания фибрилл in vitro необходимо контролировать содержание белков в биологическом материале. Зависимость квантового выхода и длительности затухания флуоресценции от степени агрегированности белков позволяет сделать вывод о том, что ThT является чувствительным зондом для исследования процессов агрегации белков плазмы крови.