Методика ВЭЖХ для определения полисорбата 80 в препаратах рекомбинантных терапевтических белков
Цели. Определение полисорбата 80 в препаратах терапевтических рекомбинантных белков всегда являлось трудной задачей, ввиду низкого содержания, гетерогенной природы, присутствия белка в препарате, а также отсутствия хромофорных групп у данного аналита. Целью данной работы являлась разработка экспрессной и экономичной методики определения полисорбата 80 в препаратах рекомбинантных моноклональных антител с использованием гидролиза с последующим определением высвобожденной олеиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детектированием.Методы. В качестве модельных образцов выбраны пять терапевтических рекомбинантных белков. Использован щелочной гидролиз без удаления белка и с его удалением различными способами осаждения для выделения свободных жирных кислот. Полученный гидролизат проанализирован методом ВЭЖХ.Результаты. Для субстанций моноклональных антител, ввиду высокого содержания белка, требовалось его удаление. В качестве наиболее простого способа удаления выбрана денатурация и последующая преципитация белка, что достигалось путем осаждения антитела органическим растворителем. Был выбран универсальный осадитель (смесь этанола и изопропанола в объемном соотношении 1:1), использование которого позволяло эффективно удалять моноклональное антитело, но в то же время не допускать потерь полисорбата 80. Была разработана экспрессная методика определения полисорбата 80 для субстанций моноклональных антител. Методика определения полисорбата 80 валидирована согласно требованиям International Council for Harmonisation, United States Pharmacopeia и Государственной фармакопеи Российской Федерации.Выводы. Были проведены испытания условий пробоподготовки для моноклональных антител. Впервые было внедрено осаждение белка этанолом или смесью этанол-изопропанол перед проведением гидролиза и анализом полисорбата 80. Это позволило значительно уменьшить требуемое количество образца для анализа - до 35 мкл, при концентрации полисорбата 80 - 0.05 мг/мл или еще меньше при его большем содержании. Ускоренный гидролиз полисорбата 80 в течение 90 мин является более предпочтительным при проведении анализа в сравнении с продолжительным гидролизом в течение 4-18 ч, описанным в литературе. Впервые была проведена валидация методики пробоподготовки и анализа для моноклональных антител адалимумаб, экулизумаб и инфликсимаб. Высокая прецизионность методики (среднеквадратичное отклонение ≤6.0%), специфичность и удовлетворительные значения правильности (фактор отклика от 96 до 109%), говорят о пригодности методики для определения полисорбата 80 в лекарственных средствах на основе рекомбинантных моноклональных антител.