Культивирование клеток эпителия слизистой губы человека для аутологичной трансплантации при двустороннем синдроме лимбальной недостаточности роговицы
Цель. Постановка методики культивирования эксплантов и апробация упрощенной рецептуры культуральных сред для получения устойчивой популяции эпителия слизистой губы человека без фидерных клеток. Материалы и методы. Образцы слизистой губы были получены от 6 пациентов в условиях операционной после подписания информированного добровольного согласия. Экспланты для культивирования выделяли с помощью микрохирургической техники, отделяя подслизистую часть перед слоем эпителия. Культивирование проводили в базовых средах DMEM/F12 (1:1) (1,05 мМ кальция) и EpiLife (0,06 мМ кальция) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотика-антимикотика, инсулина 5 мкг/мл, гидрокортизона 5 мкг/мл и эпидермального фактора роста 10 нг/мл. Клетки нулевого пассажа окрашивали на маркеры стволовости и пролиферации (p63), промежуточных филаментов (виментин) и белка плотных межклеточных контактов тип 1 (ZO-1). Анализ изображений проводили в программе Fiji (ImageJ). Результаты. Первичная культура клеток эпителия слизистой губы была получена от всех доноров в обоих группах. Морфология клеток в культурах соответствовала классическому, по типу «булыжной мостовой». При культивировании в среде с 1,05 мМ кальция определялось 34,7% клеток (медиана, n = 3), экспрессирующих маркер p63, а длина участков экспрессии белка ZO-1 составила 17,05 мкм на клетку по медиане (n = 3). В культуре клеток в среде с 0,06 мМ кальция положительная экспрессия маркера p63 составила 39,2% (медиана, n = 3), а длина участков экспрессии белка ZO-1 была определена как 5,18 мкм на клетку по медиане (n = 3). Заключение. В настоящей работе представлен подробный протокол получения культуры клеток эпителия слизистой губы человека с высокой пролиферативной активностью из малого биоптата без фидерного слоя. Рецептура среды с 1,05 мМ кальция активирует образование плотных межклеточных контактов, и может быть использована при моделирования дифференцировки эпителия in vitro. Рецептура среды с 0,06 мМ кальция, напротив, поддерживает сниженный уровень созревающих клеток в культуре. Таким образом, рецептура культуральных сред, источник и способ культивирования клеток, описанные в данном исследовании, могут являться основой для трансплантации аутологичного клеточного конструкта клеток эпителия слизистой губы у пациентов с двусторонним синдромом лимбальной недостаточности.