Laktulosa bekerja dengan meningkatkan tekanan osmotik pada lumen saluran pencernaan, sehingga meningkatkan kadar cairan dalam usus dan membuat feses lebih lunak. Laktulosa juga meningkatkan peristaltik usus. Bakteri dalam kolon (usus besar) akan memecah laktulosa menjadi asam laktat, asam asetat, dan asam format, sehingga kadar asam di dalam kolon meningkat. Kondisi kolon yang lebih asam akan menyebabkan difusi amonia (NH3) dari darah ke dalam usus dan diubah menjadi ion amonia (NH4+). Laktulosa menyebabkan ion amonia menetap dalam kolon dan tidak diabsorpsi kembali ke dalam darah. Pada penyakit hati, peningkatan amonia dalam darah dapat dikurangi melalui mekanisme ini. Suasana asam di dalam usus besar juga berperan untuk mengeluarkan bakteri yang memproduksi urease yang berperan dalam pembentukan amonia.