Kolèksi paling tuwa kang ana ing perpustakaan ya iku dokumen kang asalé saka abad kapisan. Perpustakaan Vatikan mulané diadegaké dadi perpustakaan manuskrip. Saiki perpustakaan nyimpen cacahé 75.000 manuskrip lan luwih saka 1,1 yuta buku cithak, lan 8500 "inacubula" (buku kang dicithak ing Éropa sadurungé taun 1501). Arsip rahasia kang kasimpen ing Vatikan dipisah saka perpustakaan wiwit abad 17. Salah sijining kolèksi perpustakaan kang paling misuwur ya iku "Codex Vaticanus", ya iku manuskrip kitab suci kang pepak lan kalebu manuskrip paling tuwa. Sajarah Rahasia Procopius uga ditemokaké ing njero perpustakaan lan dibabar ing taun 1623. Perpustakaan Vatikan uga nyimpen 330.000 koin lan medali Yunani, Romawi, lan kepausan.