脳科学辞典Cre/loxPシステム提供:脳科学辞典(Cre-loxシステムから転送)これは、このページの承認済み版であり、最新版でもあります。)Cre/loxPシステムとはloxP配列と呼ばれるDNA配列に対しDNA組換え酵素Creが働くことにより生じる部位特異的組換え反応を利用した遺伝子組換え実験系である。分野で主にloxP配列間に存在する遺伝子をCre発現により欠失させるために使用される[1]。参考文献Cre/loxPシステムとはCre/loxPシステムとはloxP配列と呼ばれるDNA配列に対しDNA組換え酵素Creが働くことにより生じる部位特異的組換え反応を利用した遺伝子組換え実験系である。遺伝子発現実験などにも利用されている。Sauerにより酵母を用いた実験系で報告された[2]が、現在では多くの動物種で使用されている。図1.loxP配列が同方向の場合のCreによる組換え図2.loxP配列が異なる方向の場合のCreによる組換えCreレコンビナーゼバクテリオファージP1に由来し、TypeIトポイソメラーゼに分類される約38kDaのDNA組換え酵素でloxP配列とよばれる塩基配列を認識し組換えを起こす。loxP配列バクテリオファージP1ゲノムに由来する34bpのDNA配列で両末端に存在するCre結合部位13bpは対称に、中心部は非対称な配列になっている。5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'CreとloxP配列の反応2つのloxP配列が同方向に位置している場合、CreによりloxP配列間の遺伝子は切り出され環状化する(図1)。この反応は平衡反応であるが切り出され環状化した遺伝子断片が元の状態に戻ることは極めて稀である。2つのloxP配列が異なる方向に位置しているときはCreによりloxP間の遺伝子は反転する(図2)。バリエーションCreのバリエーションCreと変異エストロゲン受容体の融合タンパク質であるCre-ERタンパク質は通常細胞質に存在するが、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンと結合することにより核内に移行し、loxP配列に対して組換えを起こす。これを利用してCre-loxPシステムの働く時期をタモキシフェン依存的に調節することが可能である(図3)[3]。5'-taccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'(小文字はloxP配列と異なる塩基)などが存在する。[6]5'-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3'もCre-loxPシステムと同様の目的で頻用される。rouxii)由来の組換え酵素RとRS配列[7]、バクテリオファージMu由来の組換え酵素Ginとgix配列[8]も例は少ないものの使用されている。(コンディショナルノックアウト)特定の遺伝子の機能をマウスなど動物個体で解析することを目的として、その遺伝子を欠損させた遺伝子ノックアウト動物が用いられる。対象とする遺伝子の欠損により致死となるため目的の解析が出来ないことがある。そのような場合はある特定の組織だけで遺伝子を欠損することでこの問題を回避できる。欠損させたい遺伝子の両端にloxP配列をジーンターゲティング法により挿入した遺伝子改変動物を作製し、さらに組織特異的プロモーターの制御下でCreを発現するトランスジェニック動物を交配する。得られた動物個体内では組織特異的プロモーターが働く部位のみ遺伝子が欠損する。Creを発現するためのプロモーターを選択することにより、組織特異的な遺伝子ノックアウトだけではなく時期特異的な遺伝子ノックアウトも可能である(図4)。ある遺伝子を細胞あるいは動物個体の組織で高発現させるためには組織特異的プロモーターの下流に目的の遺伝子をつなげた外来遺伝子を構築し導入する方法が用いられる。そのプロモーターによる発現量が低かった場合には以下の方法を用いることでプロモーターの組織特性を保ちながら目的遺伝子の高発現が期待できる。組織特異的プロモーターの下流にCre遺伝子をつけた外来遺伝子およびサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターなどの高発現が期待できるプロモーター下流に2つのloxP配列に挟まれたpolyA付加シグナルなどの転写停止配列、さらにその下流に目的の遺伝子をつなげた外来遺伝子をそれぞれ構築する。プロモーターが働かない部位では転写停止配列が存在するため目的の遺伝子は発現しない(図5)。培養細胞に外来遺伝子を導入する際、細胞の遺伝子が導入された細胞を選択をするためにネオマイシン耐性遺伝子など薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして用いる。目的の細胞が得られた後にはこれらの選択マーカー遺伝子を発現するためのプロモーターが内在性のプロモーターに干渉する例があるために、選択後は除くことが望ましい。この場合にもCre/loxPシステムが利用される。細胞に導入する外来遺伝子の選択マーカーは2つのloxP配列で挟まれた形にしておく。この選択マーカーを除くためにCreとともにピューロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドpCrePacを一過性に導入し、ピューロマイシン存在下で培養するとCreにより選択マーカーが除去された細胞のみが生存する(図6)[9]。国際のライセンスで利用できます。脳科学辞典について免責事項モバイルビュ。