ownerカラムクロマトグラフィーによるタンパク質の分離法を解説ツイートシェアはてブLINEPocketタンパク質の分離として使われるクカラムロマトグラフィーですが、いくつかの手法が開発されています。今回はクロマトグラフィーの原理と、具体的な手法としてイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィ二ティークロマトグラフィーの3種類を解説していきます。アフィニティークロマトグラフィークロマトグラフィーの原理1903年、ロシアの植物学者ミハイル・ツヴェットは炭酸カルシウムを敷き詰めたガラス管に植物色素を石油エーテルとともに流し込むことで色素成分を分離することに成功しました。このように、移動相と固定相というものを使って混合物中の物質を分離する方法をクロマトグラフィーと呼びます。混合試料を液体または気体の移動相に溶かして固定相に通します。移動相と固定相の間にに試料の分配平衡が成立しているとすると、固定層への分配が大きいほど試料が固定相に留まってなかなか移動しません。一方で移動相への分配が大きいほど試料は移動相に溶けたままなので移動相とともに流れていきます。したがって、分配平衡の異なる物質を分離することができます。固定層を含めた流し込む容器のことをカラムと呼びます。理論段数クロマトグラフィーの分離能は理論段数と呼ばれるもので評価され、値が大きいほど分離能が良いです。1種類の試料をカラムに流したとしましょう。カラム内を流れるにしたがって下図にように試料分布が変化します。分離能が良いとピーク幅は広がりづらく、ピーク自体は正規分布に近づきます。イオン交換クロマトグラフィーイオン交換の仕組みイオン交換クロマトグラフィーでは、混合試料を電荷の違いにより分離することができます。アミノ酸が1個しか違わないようなタンパク質でさえ分離できるため非常に強力です。陽イオン交換体またはインイオン交換体と呼ばれる小粒子のどちらかが固定相として使われています。混合試料を流し込むと陽イオン交換体の場合は負の電荷を持っているため正電荷の物質と結合します。陰イオン交換体であれば正の電荷を持っているため負電荷の物質と結合します。この時点で正電荷と負電荷の物質を分離することができます。吸着した物質を流すためには、塩濃度またはpHを変化させながら緩衝液を流せば良いです。このように吸着した物質を交換体から洗い流す溶液を溶出液と呼びます。溶出による分離法まず適切なイオン交換体を選んでカラムに敷き詰めます。次にNaClなどのイオン溶液を含んだ緩衝液を流して交換体を平衡化し、最後にNaCl不含有緩衝液を流して洗浄します。これでクロマトグラフィーの準備ができました。ここでは陰イオン交換体を用いて正の電荷を持つ物質の混合試料を分離することを考えてみましょう。混合試料を流すと2種類の分子が陰イオン交換体に結合して対イオンは流し出されます。溶出液を流すと2種類の試料のうち1つだけが溶出されます。別の溶出液を流すともう一方の試料が溶出されます。上図のように2種類以上の分子が交換体に吸着してしまう場合は緩衝液にpHやイオン強度を変化させながら流すことで溶出することができます。溶出液のpHを変化させるとある時点で吸着した分子の電荷がゼロ(等電点)になってしまい、交換体から離れて洗い流されます。低イオン強度の緩衝液を流しても試料分子は交換体に結合していられますが、イオン強度が高くなると溶出液のイオンが代わって交換体に結合してしまい、結合が切れた試料分子は洗い流されます。等電点やイオン含有溶出液に拮抗する電荷の強さは物質によって異なるため高い精度で分離・回収することができるのです。試料がどのようなものかわかっていると、上図のよう場合であれば2段階の溶出で試料を分離することができます。生体から取ってきたサンプルは未知試料の混合物なので、その場合にはpHやイオン強度を連続的に変化させながら溶出液を流し溶出液を別々に回収していけば分離することができます。ゲル濾過クロマトグラフィーゲル濾過クロマトグラフィーは分子のサイズと形によって試料を分離することができます。カラムには多孔質の小粒子が敷き詰められており、これが固定相になります。上図のように上から混合試料を流すと大分子はビーズの中に入ることができないため早く流れます。小分子はビーズの中に入ることができるためなかなか流れることができません。この差を利用して試料を分離します。アフィニティークロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィーは酵素の基質特異性を利用します。取り出してきたい酵素に特異的に結合する基質(リガンド)を不活性の多孔質ビーズに共有結合させたものを固定相とします。短いDNA鎖をビーズに固定してDNA特異的結合タンパクをトラップすることも可能です。遠心分離の原理と実験方法を解説|沈降係数と密度勾配遠心分離RECOMMENDこちらの記事も人気です。