G針を有するローダミン6Gソリューションを描きます。誤って容器の壁をタッチすると、注入が困難になる可能性がある、破損の原因となります。G針をフラッシュし、空気の泡が注射器や針に残っていないことを確認してください。注射のための100μlのローダミン6Gのソリューションをしてください。図3D)の注入を行います針ホルダと90°の角度に針の3ミリメートルの先端。血小板を標識するために、右頸静脈にローダミン6G液を注入します。injection.Af中に別の手でグレーフェの鉗子で片手での注射器と針を保持し、注射器を安定させた位置に針を維持するために、ター注入、出血を避けるためにグレーフェの鉗子で注射部位をクランプします。止血剤の顎を開き、注射部位の血管壁をクランプするグレーフェ鉗子の下でそれを挿入し、6-0縫合糸で注射部位を連結。注:ステップ2.1.15の代替として、出血を停止します2分間指で注射部位に圧力を加えます。この方法は、さらに、原因注射部位における凝血塊が誤って削除された場合、出血の危険性を有しています。図3E)に向かって腺を引きます。図3Eの青い矢印)の中央下に6-0絹縫合糸(約15センチ)で針を渡し、一緒に縫合糸の両端を入れて、10時の位置に向かって横方向に縫合糸を引っ張ります。注:この手順は、胸鎖乳突筋の外側に配置されている左頸静脈の損傷を避けるために慎重に行われるべきです。​​または肩甲舌骨筋を分離します。必要に応じて胸骨舌骨筋および/または肩甲舌骨筋をカット。注:CAは、迷走神経を伴っている、に見られる白い構造図3Fにある黄色の点線間)肩甲舌骨筋の下にあります。迷走神経およびCAを回避しながら、CAの周りに横方向の筋膜を拾うために先端の細いピンセットを使用してCAと迷走神経の間の筋膜に穴をパンチするために、別の先端の細いピンセットを使用してください。穴からフックをパスし、優しくCAを持ち上げ、その後、CAの下に先端の細い鉗子を置きます外膜軟部組織を除去するためにCAに沿って反対方向にフック鉗子を移動します。)の無料少なくとも〜5ミリメートルの長さ。)でCAを持ち上げながら、CAの下に置きます。CAを乾燥避けるために、生理食塩水の2-3滴を適用リアルタイム録画ビデオ顕微鏡ステージに一緒にマウスとプレート蓋を移し、10×水レンズの下で適切な位置に配置します。10Xレンズと生理食塩水とCAとの間の空間を満たします。デジタルビデオ録画ソフトウェアアプリケーションを起動し、新しいファイルを起動し、それに応じて名前を付けます。正常な血管の画像を記録し、録画が停止されたときにフレーム番号を書き留めます。注:記録のために、コンピュータにビデオ録画ソフトウェアを参照します。我々は、デジタルビデオ記録ソフトウェアを使用して、以下の説明は、本出願に基づいています。3損傷に対する血管壁への外科的損傷がないことを確認する必要があります。​​存在しないことを確認することも必要です。それは簡単に後からの経過時間に従ってビデオを分析することになりますレコードのフレーム番号を書き留めます。10Xレンズのうち、プレートのふたでマウスを移動します。薄くて微細なチップを作り、慎重にCAの周囲に生理食塩水(CAには手を触れないでください)​​ならびに外科的分野の他の場所でブロットするためにそれを使用するためにペーパータオルの角を折ります。3溶液の希釈を回避することが重要です。3溶液で飽和フィルター紙をピックアップし、CA上で直接それを置き、1分間のサイトにそれを維持します。近位のサイトで短いセグメントを残します相(下記参照)。ろ紙を取り外します(この時点を「損傷後」の開始として定義される)および食塩水(少なくとも2ミリリットル)でCAをすすぎます。バック10Xレンズへのプレートのふたでマウスを置きます。血管を観察したビデオ画像を記録し始めます。記録の最初の分の終わりにビデオフレーム番号を書き留めます。注:血栓形成は、コンピュータ画面上または顕微鏡下でリアルタイムビデオ画像で観察される蛍光性血小板の蓄積によって識別されます。録画ビデオ画像すぐに戻って顕微鏡下でマウスを入れました。Fを除去した後に最初の分の最後に記録を保管してくださいILTER紙。イメージングのために(通常は損傷領域の中心である)傷害に関する情報を取得するために、遠位から近位のサイトに容器全体を観察し、その後、関心のある領域に焦点を当てます。3時05分に午前2時55分)した後、10秒ごとに他の分毎分のレコードビデオ画像。各記録が停止されたときにフレーム番号を書き留めます。30秒間停止したとき。2)閉塞は損傷後30分で見られていない場合。この場合には、統計分析のために30分を使用します。初めに10ミリ秒のようにビデオ記録の露光時間を設定するので、血栓の上の血流を観察することが容易になります。血栓が​​大きくなると蛍光は、カメラのセンサーを飽和させる場合には、血栓上の血流を特定することが困難になります。図3I、緑の矢印)にNTER。近位の非損傷部位に着目すると血流がより鮮明に観察することができるように、我々はまた、15または20ミリ秒に公開する時間を増やします。血流が停止する場合には、多数のより大きな細胞(白血球)は、血栓の近位の部位で血管壁に転が​​り始めます。フローは通常2以内に停止します。それが変更された場合、記録用紙に時間を公開書き留めます。正常な野生型C57BL6マウスを使用した場合には、通常、麻酔から実験の最後に約30分を要します。注意注記:正確なデータを与えることはありません、それは露光時間によって影響され、血流停止の印として白集約血小板血栓を使用しないでください。白い血塊は血管内腔を覆っ血流が(代表ビデオ1を参照)を中止したという意味ではありません。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。腹腔内に腸の蠕動運動を抑制するためにパパベリン溶液(合計0.4ミリグラム/マウス)を注入します。動物電気バリカンで首と腹部に毛皮を削除してください。脱毛クリームは必要ありません。15cmの組織培養プレートの蓋の上仰臥位でマウスを固定します。すべての足を確保するために、小さなテープ(2センチメートル×0.5センチ)の4個を使用してください。図2)を維持するために蓋に縫合糸の両端をテープで固定します。-2.1.15ラベル血小板へローダミン6Gの注入のための頸静脈を露出させます。図4A)を使用して、腹部下に皮膚を通して正中切開を行います。右側臥位にマウスを再固定します。図4C)でゲルの上に広げました。)のための第二の枝を使用してください。注:腸を体外に出すのを助けるために止血鉗子やマイクロAdson鉗子を使用してください。傷つけないでください腸や血管。顕微鏡のステージに一緒にプレートの蓋でマウスを移し、10×ドライレンズの下の適切な位置に配置します。注:空回腸膜は生理食塩水を保持することはできませんので、ドライレンズを使用してください。静脈の周囲に生理食塩水を吸い取ります。図4D)のための腸間膜動脈と静脈の上に直接に配置する先端の細いピンセットを使用します。ろ紙を削除し、生理食塩水で負傷した腸間膜動脈と静脈をすすぎ(少なくとも2ミリリットル)(この時点は、「傷害後」の開始として定義されます)。10X乾燥レンズの下背板のふたでマウスを置きます。血管を観察し、RECを開始ORD映像2.2で述べたように)。30秒間停止したとき。2)閉塞が損傷後30分では見られない場合は、この場合、統計分析のために30分を使用します。実験の最後に、息と心臓の鼓動が確認されていない後に頸椎脱臼に続いて過剰摂取ケタミン/キシラジン(20分の200ミリグラム/キログラム)を使用して、マウスを安楽死させます。3を使用することをお勧めします。オンラインビデオ1を参照してください)顕微鏡下で識別されます。C57BL6マウスにおいて観察されます。血栓は3からすると拡大し始めます。図5Aおよびオンラインビデオ1)に使用されています。3濃度の増加の両方が抗血栓マウス株およびWTマウス6の違いを減少させることを実証しました。3と頸動脈の治療は、我々の目的のすべてを満たすのに十分です。ノックアウトマウスを7,8,16,19,21を使用して、特定の遺伝子のテスト機能に加えて、以下では、このモデルを使用して、4つの代表的な実験です。組織型プラスミノーゲン活性化因子(tPA)は、米国22における血栓溶解治療のためのFDA承認薬の一つです。そこで我々は、頸動脈血栓症モデルでのtPA媒介血栓溶解を観察しました。kg体重)を5分間形成させ、頚静脈カテーテル(22GA)を介して灌流しました。図5(b)とオンラインビデオ2に示すように、血栓が継続的に拡大し、損傷後の内腔5分の約50%を占めていました。血栓はTPAは、血小板活性化および凝集に影響を及ぼさないことを示唆したtPA灌流後に拡大し続けました。血栓溶解は、約4分のtPA注入後に開始しました。形成された血栓を、30分間の観察期間中に繰り返し寸法変化を受けることが見出され、いかなる血管閉塞は、この場合には起こりませんでした。阻害することができないことを示しました。3を誘導動脈血栓症モデルを用いた将来の実験は顕著PREVを有することができ、血栓溶解及び他の補助的療法を評価するために利用され得ることを想定します血栓形成にentative効果。​​細胞外ドメイン23のタンパク質分解切断によって活性化し、続いて血小板活性化のステップにつながる血小板上のGタンパク質共役受容体(GPCR)です。ニーマンラボは、ヤギポリクローナルPAR4抗体PAR4のアニオンクラスターを対象とし、それによってPAR4媒介血小板活性化24のための重要なステップに影響を与え、PAR4切断を遅らせる(CAN12)を生成しました。図5Cおよびオンラインビデオ3)に血栓形成を閉塞性することがわかりました。3を誘発性血栓症モデルCことを実証しています抗血小板剤の効果を評価し、潜在的な治療戦略を特徴付けるために利用されます。再確立するための迅速な血餅除去は、虚血性脳卒中および心筋梗塞などの閉塞性血管疾患の治療に重要です。tPAのような血栓溶解薬の全身送達は、形成された血栓を溶解することができ、上記示したが、完全に血小板活性化および再凝集/閉塞を防ぐことはできません。このようなセリンプロテアーゼ薬剤の全身直接送達は、出血を含む主要な副作用につながる、無差別オフターゲットアクションにつながることができます。そこで我々は、これらのナノ粒子ができるかどうかを調べ動脈における積極的に形成する血栓に特異的に結合します。tPAの灌流のための実験で述べたように、カテーテルを頸静脈に挿入し、均一な流速でナノ粒子を注入するための注入ポンプに接続しました。この実験では、何の蛍光色素は、血小板を標識するために、マウスに注入しませんでした。したがって、それらは、生体顕微鏡下で観察することができました。3処置で開始しました。WTマウスでは、血栓のかなりの量を損傷後5分を形成することが見出されたので、我々は、ナノ粒子が活発に形成する血栓を効率的に結合するかどうかを検出するためにナノ粒子を注入するため、この時点を選択しました。図5Dおよびオンラインビデオ4に示すように、蛍光ナノ粒子の注入後、我々は山型を同定することができました次第に蛍光粒子で覆われてしまった血栓。3誘発性血栓症モデルの有用性を実証します。血栓形成における血小板以外の赤血球の役割。3を誘発さ血栓症モデル28において重要な役割を果たし、それらが損傷した血管壁29,30に第一接着性の血液成分であることを示唆しています。'、3'-テトラメチル過塩素酸塩(ディル、10μMの最終濃度)で赤血球を標識しました。DiI標識赤血球をPBSで2回洗浄し、35%のヘマトクリットを有する生理食塩水に再懸濁しました。DiI標識したRBC懸濁液(マウスあたり100μl)を注入しました致死量の5日間、実験19の前に照射された血小板減少症のマウスにエド。これらの血小板減少症のマウスは、彼らが行う場合には、血管壁にRBCの期待の機会を増やすであろう、血小板を大幅な減少しています。5)の後に血管壁に見られませんでした。図6A)の形状を示して血栓内に蓄積し始めました。図6BおよびC)内に捕捉されている間、血管壁に付着した主要な細胞は、血小板(ポジティブCD41、緑)であることを実証しました。3誘発性血栓症モデルは、血栓形成における細胞および分子成分及び時空間イベントに機械的洞察を得るに利用することができます。-誘発性から容器を防止することができる、お勧めしますけが7。このモデルは、静脈血栓症の研究に適しています。3溶液で飽和した濾紙を適用した後、しかし、血栓形成を劇的に腸間膜動脈に遅延されます。