owner遺伝子クローニングの方法|プラスミドやファージを用いたゲノムライブラリーの作成ツイートシェアはてブLINEPocket遺伝子クローンとは同一のDNA断片を持つプラスミドやファージ粒子のことです。ヒトゲノムDNAを細切りにしてそれらをファージベクターに挿入すればヒトゲノムのライブラリーを作成することができます。mRNAから逆転写酵素を用いて二本鎖DNAを再構成してベクターに挿入すればmRNAのライブラリーを作成して遺伝子発現の解析を行うことができます。ライブラリーの良い点は、1度作ってしまえばベクターを大腸菌に遺伝子導入することでライブラリー化したDNAを大量増幅できるところです。今回は遺伝子ライブラリーを作成するクローニング方法を解説します。vitroパッケージングすることでライブラリー化します。染色体を丸ごとクローニングしてライブラリー化するため手法は簡便ですが、その分目的とするDNAを探し出す必要があります。染色体DNAを制限酵素のSau3AIで切断します。切断されたDNA断片どうしの連結を防ぐためにアルカリホスファターゼで5’末端を脱リン酸化します。λファージDNAをBamHIで切断して交換可能領域をDNA断片に交換してDNAリガーゼで連結します。vitroパッケージングによってλファージ粒子を再構成します。してλファージベクターを用いたゲノムライブラリーが完成しました。DNA)を合成し、プラスミドなどに挿入します。RNAはDNAよりも不安定であるため手法が高度なものになります。mRNAを適切に選ぶことで目的遺伝子のDNAを濃縮して大量に生成することができるのが特徴です。プロセッシング前の前駆体mRNAもクローニングすることができるため、イントロンを含む遺伝子にも応用することができます。mRNAのポリA尾部にあらかじめ化学合成したオリゴdTをアニーリングさせます。アニーリングとは一本鎖DNAに相補的なDNAを結合することです。オリゴdTはポリヌクレオチドキナーゼによって5’末端がリン酸化してあります。アニーリング後は逆転写酵素とdNTPを加えてオリゴdTからcDNAを新規合成していきます。RNaseを加えてmRNAを分解します。すると残ったcDNAの3’末端側がヘアピンループを形成するので、RNAポリメラーゼとdNTPを加えてcDNAの相補鎖を新規合成します。最後にS1ヌクレアーゼを加えてヘアピンループの部分を切断して平滑末端化と5’末端のリン酸化をします。あとはベクターに挿入するだけです。PCR産物のクローニングPCRする前に目的DNAに制限酵素サイトを付加しておくことで同じ制限酵素部位を持つベクターに挿入することができます。PCRによって増幅するためあらかじめ必要なDNAが微量で済むのが特徴ですが、例えば目的DNAにEcoRIの制限酵素認識部位をつなげておきます。PCRによって大量増幅します。あとは同じ制限酵素認識部位を持つpUC18プラスミドなどをEcoRIで切断して5’末端をアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化します。最後に目的DNAとベクターをDNAリガーゼで連結して完成です。生化学ツイートシェアはてブLINEPocketfeedlyハイブリダイゼーション解析ファージベクターとその利用法RECOMMENDこちらの記事も人気です。