古田貴寛講師らの共同研究グループは、全脳スケールからシナプススケールまで神経回路の構造をズームインしながら観察する手法の開発に成功しました。神経回路を構成する神経線維には、ヒトでは最長で1メートルを超す軸索があり、マウスのような小さな動物でもその長さは数センチメートルに及ぶものがあります。このような大規模な回路構造の解析には、光学顕微鏡による観察が適しています。回路結合のエッセンスであるシナプスはナノメートルスケールの構造であり、電子顕微鏡[1]を用いないと観察することができません。融合により、全脳構造からシナプス構造までのシームレスな観察を実現し、脳の機能基盤である神経回路構造の網羅的な解析に貢献します。本論文はiScience誌のオンライン版に2021年12月27日付で公開されました。脳は、膨大な数のニューロン(神経細胞)が互いに連絡しあって複雑な神経回路を形成することにより機能しています。脳の動作原理を解明するためには、神経回路の「配線図」を明らかにすることが必要不可欠であり、その取り組みは世界各国で盛んに行われています。脳は全体として大きなサイズを持つ一方、神経細胞間の連絡がなされるシナプスはとても小さく電子顕微鏡でなければ見ることができません。神経回路の構造解析にはこの「大きいのに細かい」という問題を解決する必要があります。近年、開発の進む組織透明化技術は、光学顕微鏡を用いて大きいままで大規模に標本を観察することを可能としました。シナプス観察には電子顕微鏡が必要となります。そこで本研究では、組織透明化技術によって大規模構造データを取得した標本において、標的構造にズームインして電子顕微鏡解析を行うことのできる技術を開発し、広い視野と高い解像度の両立を目指しました。本研究では、透明化処理を行った脳組織について電子顕微鏡で観察することにより、全脳観察から目的のシナプスにズームインする組織構造解析技術を開発しました(図1)。実験技術の開発には、様々な実験手法の開発と独自の工夫の積み重ねが必要でした。図1:本研究で開発した全脳からシナプススケールへのズームイン技術マウスもしくはマーモセットの脳内にアデノ随伴ウイルスベクター[4]を注入して、光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察できるように神経細胞を標識する。本イメージング技術は、以下の4段階から構成される。1)全脳構造を観察(マクロスケール)、2)透明化処理した脳スライス標本(1mm厚)を観察(メゾスケール)、3)50μm厚に切った切片を高精細に観察(ミクロスケール)、4)電子顕微鏡でシナプスなどの微細構造を観察(ナノスケール)。最初に、組織透明化に必要不可欠なステップ以外を削ぎ落とすことにより、超微細構造へのダメージを最小にすることを試みました。この新しい透明化法によって処理された標本は、組織の膨張や収縮を引き起こすことなく、従来の透明化法と同等の透明度を示しました。そこで研究グループは、改良した組織透明化技術がグルタールアルデヒド(GA)[5]により固定した脳組織も透明にするかを調べました。改良した透明化法は、組織の膨張や収縮をほとんど伴わずに、GAを用いて固定した脳組織を透明にすることができました。GAを用いて固定した脳組織を、改良した透明化法により透明化したところ、従来の透明化法と比較してシナプスなどの超微細構造が格段に保持されていることがわかりました。次に光学顕微鏡と電子顕微鏡との両方で目的構造を標識することができる遺伝子発現システムを開発しました。この標識法は、光学顕微鏡データにて目的領域に狙いをつけ、その領域を電子顕微鏡で観察する際に必要不可欠となります。研究グループは、アデノ随伴ウイルスベクターを利用して、感染した細胞内で緑色蛍光タンパク(GFP)とアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX2)[6]の融合タンパクを高発現するシステムの構築に成功しました。このシステムでは、GFPで標識された感染細胞は光学顕微鏡(蛍光顕微鏡)で観察することができ(メゾスケール・ミクロスケール)、その後にAPEX2の反応によってジアミノベンジジン(DAB)という色素をその細胞に沈着させることにより、標識細胞の超微細構造を電子顕微鏡を用いて観察することが可能(ナノスケール)となります。これらの技術を組み合わせることで研究グループは、全脳構造からシナプス構造までの神経回路構造をズームインしながらシームレスに観察できる技術の開発に成功しました。上記アデノ随伴ウイルスベクターの脳内注入により作製した脳組織標本に対して、本研究で開発した新しい透明化法を施すことで、光学顕微鏡による脳構造の大規模構造データを取得しました。標識された神経細胞は細胞体だけでなく、その入力部位である樹状突起や、出力部位である長い軸索までもがGFPにより可視化されていました。した神経突起(樹状突起や軸索)に狙いをつけて、DABを沈着させた後に電子顕微鏡により観察しました。細胞体から遠く離れた場所にある神経突起の超微細構造はきちんと保存され、かつDABにより標識されており、シナプスレベルの構造解析が可能であることが確認されました。これらの実験はマウスとマーモセットの両方で実現しており、研究グループが開発した手法が様々な動物種に広く適用可能であることを示しています。本研究において研究グループが開発した組織構造解析技術は、様々な脳部位や動物種で適用可能であり、さらには狙った神経回路の配線図を迅速に手にすることを可能とします。これらの特徴により、これまで解き明かされていなかった神経回路の配線図が次々と解明されることが期待されます。今回、開発した組織構造観察技術は、疾患の病態解明に大きく貢献すると期待されます。疾患モデル動物を用いた研究において、ある特定の異常領域を大規模構造データの中から見い出し、そこに狙いをつけズームインして超微細構造の解析まで繋げることにより、これまで見つけることができなかった病態の発症機序や薬理作用を明らかにすることができると考えられます。走査型電子顕微鏡がよく用いられる。光が散乱することが多いため不透明となる。溶液処理によって標本の光散乱を低減させることで透明度を向上化させる手法が、組織透明化技術である。細胞膜や微小管など、光学顕微鏡では観察できない小さい構造物の総称である。シナプスは特徴的な膜構造を呈するため、光学顕微鏡ではなく電子顕微鏡観察によって同定される。非増殖性かつ毒性のないウイルスベクター(目的の遺伝子情報を組み込んだウイルスを細胞に感染させ、その感染細胞に目的遺伝子を発現させる方法)。最近では基礎研究分野での利用だけでなく、遺伝子治療への応用開発が進められている。[5]グルタールアルデヒドホルムアルデヒドが固定剤として一般的に用いられる。グルタールアルデヒドを固定液に添加することで微細構造がよく保持されるため、電子微鏡観察用の試料作製際に用いられる。2021年12月27日(米国東部時間)発行の「iScience」誌に掲載されました。本研究は下記の共同研究グループのメンバーで実施しました。FAX:03-6870-2243E-mail:brain-m“AT”amed.go.jp※E-mailは上記アドレス“AT”の部分を@に変えてください。