提供:脳科学辞典(FRETから転送)これは、このページの承認済み版であり、最新版でもあります。fluorescentes二つの蛍光分子がごく近接して存在する場合、一つの蛍光分子からもう一つの蛍光分子へエネルギーが移行する。これをFörster共鳴エネルギー移動(FRET)という[1]。FRETの効率は2つの蛍光分子のスペクトルの重なりの大きさ、距離と角度により左右されるため、FRETを測定する事により蛍光分子間の空間配置を間接的に測定する事が可能である。細胞内シグナル伝達を可視化する事が出来るようになった。ドナーとアクセプターの励起、蛍光スペクトルドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルに重なりがあるときに、FRETが起きる。黒破線で囲まれたスペクトルは、励起スペクトルを示す。緑色のタンパク質がドナー、赤色タンパク質がアクセプターを示す。二つの蛍光分子がごく近接して存在する場合、一つの蛍光分子からもう一つの蛍光分子へ、エネルギーが移行する事が知られている(図1)。transferと呼ぶ事がIUPACにより推奨されている。生細胞にてFRETを検出するのは、非常に煩雑であった。プローブとなるタンパク質を精製、化学的に蛍光色素でラベルし、細胞に導入するという操作が必要であり、生物学分野での応用はきわめて限定されたものであった。GFPとその変異体、類縁タンパク質の発見により今日においては様々な分野において、多くの蛍光タンパク質を基にした、完全に遺伝子によってコードされるFRETプローブが使用されている。蛍光分子のうち、エネルギーを受け渡す方をドナー、受け取る方をアクセプターと呼ぶ。FRETの効率はドナーとアクセプター間の次のような因子によって影響される。Jドナーの発光双極子モーメントとアクセプターの吸収双極子モーメントとの相対分子配向κドナーとアクセプター蛍光分子が決定されるとJは次のように計算される。εA(λ)はアクセプターのモル吸光係数、λは波長である。Jを用い特定のドナーとアクセプターの間にFörster距離R0が以下のように定義される。これはエネルギー移動効率が50%となるドナーとアクセプターの距離である。^{2}\,J}κはドナーとアクセプターの相互分子配向である。この値は、両方の色素が自由に回転しており、励起状態の間は等方的に配向していると考えられる場合に得られる。°Cの場合、1.3342)、NAはアボガドロ数である。R0を用いると、FRET効率Eは次のように表す事が出来る。{1}{1+(r/R_{0})^{6}}}\!}Förster距離R0が大きいドナーとアクセプターの組み合わせの方が、FRET効率Eが良い。R0を大きくするためには蛍光量子収率Q0がよいドナー、モル吸光係数εA(λ)が良いアクセプター、またいずれも長波長域にあるドナーとアクセプターの組み合わせを選択する。ドナーとアクセプターの蛍光スペクトルが変化しない状態では、ドナーとアクセプター間の距離rと配向κの変化をFRETの効率の変化として読み取る事が出来る。これを利用して、様々な細胞現象に対するプローブをデザインする事が可能である。FRETの画像検出FRETが起こるとドナーの蛍光強度の減少、アクセプターの蛍光の増加、ドナー蛍光寿命の減少が観察される。液体サンプルであれば蛍光分光光度計を用いる事で検出する事が可能であるが、画像として取得する場合には観察したい対象の特性を考慮しつつ、方法を選択していく。蛍光強度比イメージングドナーおよびアクセプターの蛍光を取得し、ピクセルごとの蛍光強度比を計算する。FRETが起きると、ドナーの蛍光強度が減少し、アクセプターの蛍光強度が増加する。現在、最も広く使用されている手法である。タイムラプス解析も行える。ドナー蛍光強度とFRET効率Eとは次のような関係に有る。{D}}}\!}ただし、F'D、FDはそれぞれ、アクセプターがある場合と無い場合でのドナー蛍光強度である。FRET効率が良い程、F'D小さくなる、つまり画像が暗くなる。一方で、FRETによりアクセプター画像は明るくなるので、ドナー画像とアクセプター画像の比を計算する事で、FRETを検出する事が出来る。データを取得、解釈する際に注意しなければいけないポイントがある。ドナーの蛍光のアクセプターチャネルへの漏れ込みであり、信号/雑音比の減少の原因となる。漏れ込みを極力抑えるには、適切なバンドパスフィルターを用いる。光量を犠牲にしても、ドナー蛍光が漏れ込まない波長を選ぶ方がFRETは特異的に検出できる。蛍光画像に背景雑音がある事があるが、それがFRET変化に影響を与える。FRETの計算の際に背景雑音を引き算しなければならないが、蛍光シグナルが暗いと、少しの背景雑音のぶれがシグナルを左右する。細胞の周辺は暗いので背景雑音の引き算により偽陽性が出やすいので注意を要する。2分子間FRETのイメージングでは、ドナーとアクセプターの局在の違いは偽陽性を生じる。リンカーで連結し1分子にするか、局在しているアクセプターの蛍光強度を補正することで避けることが可能である。適切な波長の光によって、アクセプターを褪色させることでFRETを解消することができる。F'Dがアクセプターの褪色によりFDと等しくなる事により、E=0となる。その為、褪色前後の画像を比較する事によりEが検出可能である。この手法は不可逆的であるために経時的変化を追うことは困難である。緑の太い線がFRETが起きていない時のドナー蛍光の減衰曲線。FRETを起こしたドナー蛍光の速度が加わることにより速度定数が大きくなり細い緑の線のように減衰曲線の傾斜が大きくなる。イメージング蛍光体が励起されると、図2に示すような減衰曲線に従って蛍光を発する。蛍光寿命は、kは励起状態にある電子が基底状態に戻る速度定数kの逆数である。蛍光として基底状態に戻る際の速度定数、熱を発して基底状態に戻るなどの無放射遷移の速度定数の和として表される。FRETを起こしている時の速度定数kfは、以下の式で規定される。^{5}n^{4}N_{A}}}\right)J}ここで、kDはドナーの蛍光の速度定数である。ドナー蛍光の速度定数とFRET効率Eとは次のような関係に有る。{D}}}\!}ここでτ'DとτDはそれぞれ、アクセプターが存在する場合と存在しない場合でのドナー蛍光寿命である。FRETが起きると、蛍光寿命が短縮する(図3)。比べて、蛍光の漏れ込み、ドナーとアクセプターの局在の違いなどによって生じる疑陽性を回避できる。蛍光寿命の変化を測定する方法は2つある。海馬スライスCA1錐体細胞に発現させたGFPの蛍光寿命イメージおよび減衰曲線(横軸は時間、縦軸は光子数)。実際には、20秒で数千個オーダーの光子を取得する。これらの光子の発生確率分布が減衰曲線を形成し、近似曲線をフィッティングさせることで蛍光寿命を取得する。時間ドメイン励起光によって発生した一つ一つの光子が検出器まで届くまでの時間(数nsec)を計測することで時定数τを計算する。時間を横軸としてヒストグラムを作製することができる。通常蛍光寿命は指数関数に従い減衰していく(図3)。FRETを起こしている分子と起こしていない分子が共存する時には二重指数関数になるため、二重指数関数にフィッティングすることによって、FRETの起きている分子の割合が算出できる。得られる光子の数が少ない時には二重指数関数フィッティングは不正確になりやすい為、単に平均蛍光寿命を計算するだけで済ませる場合も有る。単一指数関数の場合は、平均蛍光寿命はτに等しくなる。time)などがあり全ての光子を取得する事は出来ない。秒単位の経時変化を追うためには、低解像度で画像取得されているのが現状で有り、多数のピクセルから蛍光寿命を取得するためには、処理速度の速いハードウェアが必要となる。光源にはパルスレーザーを用いる。神経系の研究によく用いられる二光子顕微鏡に後付けする事も可能である。光源の強度を高周波で変調させるのと同時に、検出器も高周波で変調させる。その時に光源の周波数(fex)と検出器の周波数(fs)をずらし、そこから蛍光寿命を計算により求める。周波数ドメイン光源の強度を高周波で変調させるのと同時に、検出器も高周波で変調させる。その時に光源と検出器の周波数をずらしておく(heterodyning)(図4)。多数のサイクルを繰り返す事により、間接的に蛍光寿命を計算していく。画像の取得にかかる時間が時間ドメインと比較して短いのが特徴である。時間ドメインと同様に光源にはパルスレーザーや光量が高頻度にて変調できるレーザーなどが用いられる。一つの蛍光団のストークスシフトが小さい場合、励起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりが大きいような蛍光団では、同一の蛍光団同士で、Homo-FRETが生じる。Homo-FRETは、蛍光強度および蛍光寿命は変化しないが、異方性が変わる。この原理を用いて分子同士のクラスターの度合いなどに応用されている。様々なフレットプローブの類型GFPとその変異体、類縁タンパク質の発見により今日においては様々な細胞生物学の分野において、多くの蛍光タンパク質を基にしたFRETプローブが使用されている。これらのプローブを分類すると、以下のように分類される(表1、図5)。プローブの分解に伴うFRETの変化を検出するプローブこの原理は、FRETプローブの最も初期に導入されたデザインである(図5A)。プロテアーゼによって分解される配列の両端にドナーとアクセプターを連結する。プロテアーゼによって、この配列が分解されるとドナーとアクセプターの間に起きていたFRETが解消されることによって、プロテアーゼの活性を評価する。利用したFRETプローブ興味のあるタンパク質同士の相互作用を測定する際に、この原理が用いられる。一方にドナー、他方にアクセプターを連結する。タンパク質同士が結合していないときにはFRETは起きていないが、結合することによってFRETを生じる(図5B)。距離のファクターを生かせるために、比較的大きなシグナルが得られる一方、内在性のタンパク質が反応に関与するために、その分FRET応答が減少する。ドナーとアクセプターの発現量の差によるFRETの応答の変化も問題になる。アクセプターと結合しないドナーが多量に存在するとFRET応答が小さくなる。一般にアクセプターが多い系が、使用に適している。タンパク質相互作用を測定する事により間接的にシグナル伝達系の活性化も測定する事が可能である。低分子量Gタンパク質が活性化に伴い、エフェクタータンパク質と相互作用が起こる事を利用し、低分子量Gタンパク質活性を測定する事が可能である。タンパク質相互作用はポリマーでも良い。これを利用してアクチンの重合状態の測定にも用いられた[9](図5C)。一分子内FRETプローブ一分子内にドナーとアクセプターを連結し、これらの配向および距離の変化を利用する。2分子間FRETに生じるような発現量の違いやドナーとアクセプターの局在の変化によって生じる疑似陽性を考慮する必要がない。活性に伴うタンパク質の構造変化などを利用するために、比較的容易に応答するプローブが作製できるが、ドナーとアクセプターを適切な位置に配置するなどの検討が必要である。興味のあるタンパク質が、活性化の際に構造変化を誘起することが知られている場合には構造変化を利用することができる(図5D)。タンパク質のC末およびN末にドナーおよびアクセプターを連結する。構造変化が起こすドメインの方が、FRETは起こりやすい可能性もある。[13]、膜電位測定[14]、などに用いられている。リガンド結合に伴う構造変化ある種のタンパク質はリガンドに結合する事に活性が調節される。リガンド結合を検出するようにFRET構築を工夫する(図5E)。カルシウムFRETプローブ、カメレオンはこの原理を利用している[15]。この場合、ドナー、カルモジュリン、カルモジュリン結合配列であるM13ペプチド、アクセプターを1つの分子に融合する。カルモジュリンがCa2+と結合すると、M13ペプチドと結合し、蛍光強度が変化する。低分子量Gタンパク質の活性化プローブは、低分子量Gタンパク質、シグナル伝達下流の結合タンパク質の結合ドメインをドナーとアクセプターで挟んだ形状をしている(図5E)。低分子Gタンパク質がGDPからGTP結合型になり活性化すると、結合ドメインと相互作用によりFRETが生じる[16]。共有結合修飾によって生じる構造変化このプローブは、ドナー、アクセプター、共有結合修飾を受けるドメイン、これを認識するドメインからなる。プローブが共有結合修飾を受けると、認識するドメインが結合し、ドナーとアクセプターの距離が縮まりFRETが起きる(図5F)。この場合、キナーゼの基質となるタンパク質に14-3-3タンパク質のようなリン酸化タンパク質を認識するドメインを融合し、その結合に伴うタンパク質構造変化を、両端に結合させたドナーとアクセプター間のFRETで測定する。生体膜上の小分子このプローブは、主に、脂質分子に応用されてきた(図5G)。ドナー、脂質結合ドメイン、アクセプターがヘリックス構造で連結され、グリシン-グリシン配列をその途中に導入することで、そこを中心に一方の蛍光タンパク質が回転することができる。膜結合ドメインを用いて、プローブを結合させる。脂質分子が増えた際に、脂質結合ドメインが脂質分子を認識し、構造変化が起き、ドナーとアクセプターの距離が縮まりFRETが生じる。[21]を測定するために用いられている。[111][112]プローブデザインA-Gは図4に対応している。現在多くの場合GFPあるいはその関連タンパク質が用いられている。蛍光強度比イメージングの場合は、GFPの色彩変異体であるシアン色蛍光タンパク質CFPと黄色蛍光タンパク質YFPのFRETペアがよく用いられている。CFPの中でも、Ceruleanが明るい蛍光を示すためこれを用いるべきである。YFPの変異体の中では、Venus、Ypetがよい。