生命現象に必要不可欠な細胞内cGMP動態を可視化解析できる、赤色蛍光タンパク質センサーの開発に成功しました。本研究で開発した蛍光タンパク質センサーは、cGMPに応答して蛍光輝度が約6.7倍に上昇します。別の細胞内分子を可視化するセンサーと併用することで、2色イメージングが可能です。protein)[用語3]の開発に成功しました。Biology(オンライン版)に掲載されました。PDE5α)のcGMP結合ドメインを挿入した構造をもつ、蛍光タンパク質センサー[用語4]です。mAppleとPDE5αの間のリンカーアミノ酸配列[用語5]を最適化することで、cGMPに対する蛍光応答を調節しました。cGullはcGMPに応答して蛍光輝度が約6.7倍上昇します。cGullをヒトやマウスのさまざまな臓器由来の細胞に発現させ、蛍光顕微鏡によるイメージング[用語6]を行うことで、細胞内のcGMP動態をリアルタイムで可視化解析することに成功しました。Ca2+特異的な緑色蛍光色素や、青色光活性型タンパク質と同時に使用することで、2色イメージングや光遺伝学ツール[用語7]との併用が可能であることを示しました。介して小腸内分泌細胞[用語8]のcGMP産生を促すことを明らかにしました。背景と問題点cGMPは、平滑筋の弛緩、視覚情報の伝達、アポトーシスなど、生体内のさまざまな生命現象に関与することが知られているセカンドメッセンジャーの一種です。これまでに、cGMP動態を可視化する緑色蛍光タンパク質センサーが、本研究グループが開発したものも含め、複数発表されています。現在普及している多くの蛍光タンパク質センサーは、緑色蛍光タンパク質を基盤としています。細胞内のシグナル分子や代謝物の階層的な反応を理解するためには、同一細胞内でCa2+やcAMPなどの他の細胞内セカンドメッセンジャーと同時に多色イメージングすることが有効な手段の1つです。cGullの開発に成功しました。cGullは、赤色蛍光タンパク質mAppleを二分割し、その間にcGMP結合ドメインPDE5αを挿入した構造をしています(図1A)。cGullにcGMPが結合すると、立体構造が変化し、mAppleの蛍光輝度が上昇することを期待しています(図1B)。cGullの蛍光輝度の変化として捉えることが可能となります。cGullは、cGMPにより最大で約6.7倍の蛍光輝度上昇を示し(図1C)、その応答は濃度依存的です(図1D)。赤色蛍光タンパク質mAppleを分割し、cGMP結合ドメインPDE5αの配列を挿入した。cGullの構造模式図。cGullの立体構造が変化しmAppleの蛍光輝度が上昇する。cGullにcGMPを投与すると、蛍光輝度が約6.7倍変化する。cGullの輝度変化は、cGMP濃度依存的である。cAMP(環状アデノシン一リン酸)には応答しない。緑色Ca2+感受性蛍光指示薬Fluo4と併用することで、細胞内cGMPと細胞内Ca2+の2色イメージングも可能です(図2C)。SNAを投与した際の蛍光輝度変化率(%)と細胞の様子。8-Br-cGMPを投与した際の蛍光輝度変化率(%)と細胞の様子。μMSNAPを投与した際の蛍光輝度変化率(%)と細胞の様子。挿入画像中の時間は、刺激投与からの経過時間を示す。cGullが光遺伝学ツールと併用できることも示されました(図3)。cGullの輝度変化率(%)。挿入画像下の時間は、青色光を照射してからの経過時間を示す。GLP-1)を分泌します。これまでに、Ca2+やcAMPなどのセカンドメッセンジャーが、小腸内分泌細胞からのGLP-1分泌に関与することが報告されてきましたが、cGMPの役割については不明でした。cGullを発現させた小腸内分泌細胞株STC-1細胞でcGMPイメージングを行い、L-アルギニン投与によって細胞内cGMP濃度が上昇し、GLP-1分泌が促進されることを見出しました(図4A)。介する反応であることが示唆されました(図4B)。一酸化窒素によって活性化される可溶性グアニル酸シクラーゼの阻害剤(LY-83583)を添加しても、L-アルギニン投与によって起こるGLP-1分泌は、抑制されませんでした(図4C)。cGullの蛍光輝度変化率(%)。cGullの最大蛍光輝度(%)。L-アルギニン単独または、グアニル酸シクラーゼ阻害剤LY-83583を共投与した際の活性型GLP-1分泌量の相対値。2022より一部改変)以上の結果から、L-アルギニンが小腸内分泌細胞においてcGMPの産生を引き起こし、消化管ホルモンであるGLP-1分泌を引き起こすことが明らかになりました。GLP-1分泌を促進する分子機構についてはさらなる検証が必要です。cGullは、赤色蛍光タンパク質を基盤とした世界初の蛍光タンパク質型cGMPセンサーです。細胞内のシグナル伝達や代謝反応を理解するために、これまでさまざまな分子を対象とした蛍光タンパク質センサーが開発されてきました。cGullは多くの緑色蛍光タンパク質センサーや光遺伝学ツールとの併用が可能です。確立に寄与できる可能性があります。細胞表面で受け取ったシグナルを細胞内へと中継する分子やイオンのことで、Ca2+やイノシトール三リン酸とジアシルグリセロール、そして環状ヌクレオチドであるcAMPやcGMPなどが該当する。細胞内セカンドメッセンジャーの一種。グアニル酸シクラーゼによってGTPから生成される。平滑筋の弛緩、視覚情報の伝達、アポトーシスなどに関与する。2017)、鳥類であるカモメ(seagull)から命名。特定の波長の光によって励起され、励起する際に用いた光の波長よりも長波長の蛍光を発する蛍光タンパク質と、ある分子特異的に結合する結合ドメインを組み合わせた構造をもつ。ある分子を特異的に受容すると立体構造が変化し、蛍光輝度が変化する。タンパク質同士をつなぐアミノ酸配列で、数個から数十個のアミノ酸からなる。細胞や組織中の分子を可視化解析すること。光遺伝学とは、光によって活性化されるタンパク分子を遺伝学的手法によって特定の細胞に発現させ、その機能を光で操作する技術。活性化に用いられる光活性化タンパク質には、緑藻類クラミドモナスから同定されたチャネルロドプシンや鞭毛虫の一群であるユーグレナから同定された光活性化アデニル酸シクラーゼなどがある。東工大の教育に関連するWebサイトの構成です。