Mとなる重量のTrisを電子天秤で薬包紙に取る(Trisの分子量は121.14)。mLビーカーに移す(薬包紙に残るTrisは洗ビンの純水を吹きかけて、ビーカーへ落とすこと)。mLを超えないように純水を加え、ガラス棒で攪拌して溶解する。6.86と9.18の標準緩衝液で行う)。マグネチックスターラーで攪拌しながら、溶液のpHを測定する(塩基性を示す)。HCl(取り扱い注意)を数滴ずつ駒込ピペットで加え、pHを7.5に合わせる。mLメスフラスコに移す。mLにメスアップし、栓をして攪拌する。内容物を三角フラスコに移し、密封して、冷蔵庫に保管する。(共役塩基)が共存することで緩衝作用を示す。Mとなる重量のリン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4、式量119.98)を電子天秤で薬包紙に取る。mLを超えないように純水を加え、ガラス棒で攪拌して溶解する。6.86と9.18の標準緩衝液で行う)。マグネチックスターラーで攪拌しながら、溶液のpHを測定する(酸性を示す)。NaOH(取り扱い注意)を数滴ずつ駒込ピペットで加え、pHを7.0に合わせる。mLメスフラスコに移す。mLにメスアップし、栓をして攪拌する。内容物を三角フラスコに移し、密封して、冷蔵庫に保管する。塩酸または水酸化ナトリウム溶液を滴下し、pHの変化を観察する。ブランクテストとして、純水に対しても同様の操作を行い、結果を比較する。mLにメスアップする)。mLをメスシリンダーでビーカーへ量り取る。pHメーターの校正を行う。マグネチックスターラーで攪拌しながら、pHを測定する(希釈前とあまり変わらないことを確認せよ)。mL以上加えてしまった場合は、加えた体積を記録しておく)。mLを加えるまで、(e)の操作を繰り返す。NaOHを加える測定を行う((a)から(f)の操作を繰り返す)。縦軸にpH、横軸に加えたHClまたはNaOHの体積を取ったグラフを作成する(図5)。mLについても行いコントロール実験とする。※緩衝作用が有効なpHの範囲は緩衝成分によって異なっている。従って、目的とするpHに応じて緩衝成分を選択する必要がある。8.5~9.5※緩衝液を希釈してもpHはあまり変化しないが、緩衝成分の濃度が高いほど緩衝能力は大きい。Tris-HClよりも緩衝能はずっと大きい。※生物学や生化学の実験では、緩衝液に他に成分を追加して用いることが多い。以下に例を挙げる(組成やpHは実験者によって多少異なるのが実情なので注意が必要である)。7.4)リン酸二水素イオンを弱酸、リン酸水素イオンを共役塩基とした緩衝液で、イオン強度(浸透圧)を生理的条件に近づけるため、NaClを加えている。細胞を洗浄したり、回収したりする際に用いられる。EDTADNAの溶媒として良く用いられる。EDTAはDNA分解酵素から二価金属イオンを奪って失活させる働きを持ち、DNAの分解を防ぐ。6.2×10-8である。これらの値から、それぞれの緩衝液が最も高い緩衝能を示すpHを求め、各自が作成した滴定曲線上に示せ。生体成分を定量する方法は各種存在するが、比色法は簡便なため、広く用いられている。ここでは、タンパク質の比色定量法であるビウレット法並びにLowry法を実施し、基本操作を習得する。溶液が光を吸収する度合いを表す尺度を吸光度と呼び、以下の式で表される。透過度(T)これをランベルト-ベールの法則という。この法則は、吸光度が濃度に比例することを意味している。濃度のわかっている幾つかの標準溶液について吸光度を測定し、eを求めておけば、濃度の不明な試料の濃度を吸光度から求められることを示している。特定の波長の光について、吸光度を実測する装置が分光光度計である。ビウレット法はタンパク質の定量に広く用いられている。ペプチド結合に関わる窒素原子が強塩基性条件下でCu2+に配位結合し、赤紫色の色素を形成することを利用したものであり、アミノ酸数が3以上のペプチドまたはタンパク質であれば、その種類によらず一定の発色率を示すのが特長である。mg/ml程度のタンパク質濃度を測定するのに適しているが、より希薄なタンパク質溶液の濃度測定には、Lowry法が用いられる。Lowry法においては、ビウレット法と同様な原理による発色に加え、フェノール試薬中に含まれるリンモリブデン酸(リン酸とモリブデン酸の複合体)やリンタングステン酸が、タンパク質に含まれるチロシン、トリプトファン、システイン等の還元性を持ったアミノ酸によって還元され、青藍色の色素を形成することを利用している。感度はビウレット法の数十倍高いが、還元性アミノ酸の含有率はタンパク質によって異なるため、発色率がタンパク質の種類によって異なる点に注意が必要である。mlのビーカーへ移す。薬包紙に付着した固体は洗ビンの純水でビーカーへ洗い落とす。mLとし、ガラス棒で攪拌して溶解する。gの水酸化ナトリウム(潮解性・取り扱い注意)を加えて、攪拌・溶解する。mLの純水に溶解する。(c)で調製した溶液を(b)のビーカーへ加えて攪拌する((c)のビーカーは少量の純水で洗浄して、洗液はすべて(b)のビーカーへ移すこと)。mLにメスアップする。※試薬の溶解の順序を守らないと、溶解しにくかったり、不溶化が起こったりして失敗します。mLにメスアップする。正確な濃度を計算しておく)。M溶液をメスフラスコで希釈して調製する)を加える(それぞれの試験管は、ブランクテスト、標準液の5、2.5、1.667、1倍希釈液となる)。mLのビウレット試薬をメスピペットで加え(安全ピペッターを使用すること)、直ちに良く振り混ぜる。室温で30分以上放置する。分光光度計を準備する(540nmに波長設定、0および100%透過度の校正)。発色の弱いものから順に、ガラスセルに移して吸光度を測定する(試料を変える時は、共洗いを行う)。取ったグラフ(検量線;図7)を作成し、直線の傾きを算出する(0.05程度になるはず)。※この検量線を作成しておけば、未知試料のタンパク質濃度を求めることができる。7.5)を用いた測定も行い、検量線がどのように異なるか比較せよ。mg/mlとなるようウシ血清アルブミンを溶解した標準溶液を調製する(ビウレット法で作成した標準溶液を、メスフラスコを使用して、緩衝液で10倍希釈するとよい)。