2023.03.02目次はじめに前知識のおさらいFSCとSSCの原理ダブレット除去の原理シングルセルが通過した時ダブレットが通過した時ダブレット除去のやり方ゲーティングの例まとめはじめにダブレットとは2個の細胞凝集塊のことを言います。フローサイトメトリー(FCM)ではシングルセルレベルで解析を行うため、解析時に必ずダブレット除去を行います。ダブレット除去を行わずに解析をしてしまうと、再現性が取れなかったり、誤った結論を導いてしまったりする可能性があります。今回はどんなFCMの解析にも必須なダブレット除去の原理やゲーティングの基礎知識について詳しく解説していきます!※フローサイトメトリー(FCM)の詳しい原理の解説は以下の記事で行なっています。合わせてご覧ください。FCM)という技術について、できるだけわかりやすく解説します。moreeasy-bio-blog.com2023.02.23※コンペンセーション(蛍光補正)については以下の記事で解説しています。フローサイトメトリーの解析に必須の知識!コンペンセーションの原理・やり方を詳しく解説!はじめにフローサイトメトリー(FCM)では複数の蛍光色素を用いて、マルチカラー解析を行うことができます。細胞にレーザーを照射すると、前方散乱光(FSC)と側方散乱光(SSC)が検出されます。FSCはレーザーと同じ光軸上に散乱した光で、SSCはレーザーの光軸対して90度に散乱した光のことを言います(図1)。細胞のサイズが大きいほどFSCは大きくなり、細胞内構造が複雑なほどSSCが大きくなります。FSCは細胞の大きさを、SSCは細胞内構造の複雑さを反映しています。詳しくは後述しますが、ダブレット除去には散乱光(FSCとSSC)を用います。tube)という検出器で検出します。PMTは散乱光や蛍光を電流に変換するため、PMTからは電圧パルスが発生します(図2)。細胞にレーザーが当たり始めると、電圧パルスは検出され始めます(図21、2)。細胞はレーザーの中心を通過した時に最も強い光を発するので、電圧パルスはこの時がピークになります(図23)。細胞がレーザーから離れ始めると電圧パルスは弱まり(図24)、完全にレーザーを通過すると電圧パルスは検出されなくなります(図25)。このようにして、1個の細胞がレーザーを通過した時は図2のような電圧パルスが発生します。電圧パルスは幅(Width)、面積(Area)、高さ(Hight)の3つの要素で構成されており、Widthは細胞がレーザーを通過する時間、Hightは細胞がレーザーを通過する際に発した一番大きな明るさ、Areaは電圧パルスの面積を表しています(図2)。続いてダブレット(=2個の細胞凝集塊)がレーザーを通過した時の電圧パルスを見てみましょう。ダブレットの場合、Hightはシングルセルの場合とほとんど変わりませんが、2個の細胞が連なっているためにレーザーを通過する時間が長くなっていることがわかります(図32~4)。光の総量もシングルセルの時と比較して多くなるため、Areaも大きくなっていることがわかります(図34)。FSC-Wプロットで黒く囲んだところ)。FSC-Wプロットで赤く囲んだところ)。トリプレット(3個の細胞凝集塊)やそれ以上の細胞凝集塊も同様の原理で解析対象から排除(=ゲートアウト)します。ダブレット除去のやり方これまでみてきたように、ダブレットは電圧パルスのWidthおよびAreaが大きいことを利用して解析対象からゲートアウトします。ここではダブレット除去のやり方を実際の解析の手順に沿って解説していきます。FSC-Wプロットに展開します。前項で解説したように、同程度のHightの中でもWidthが小さい集団をゲーティングします(図4)。この分画を「P1」と呼ぶことにします。(「P1」のPはpopulation(集団)の頭文字です。)また、散乱光が低い場所には死細胞や細胞片、ゴミ(=debris)の集団があることが多く、ダブレット除去と同時にdebrisの分画もゲートアウトします(図4左)。1種類の培養細胞だけを使ったシンプルな解析の場合、このように散乱光の違いのみで死細胞やデブリをゲートアウトできることが多いです。組織片など、様々な種類の細胞が混じっている時の解析では、デブリと細胞集団を区別できない時が多いので、死細胞染色試薬や蛍光色素を用いて目的の細胞以外の集団をゲートアウトしていきます。SSC-Wプロットで展開し、FSCと同様にSSCでもシングルセルをゲーティングします。この分画を「P2」とします。これでダブレット除去完了です。SSC-Aを用いてシングルセルをゲーティングします(図5)。先ほど解説した通り、ダブレットは光の総量がシングルセルの時と比較して多くなるため、Areaも大きくなります。したがって、同程度のHightの中でもAreaが大きい集団がダブレットの分画になります(図5)。この場合もFSCとSSCの両方光の散乱光を使ってダブレット除去をします。最後に私が実際によく行っているゲーティングの例を紹介します(図6)。SSC-A)を用いてダブレット除去をします。SSC-Aに展開します。SSC-Aプロットのどこにあるかを確認するためです。SSC-Aプロットのどこの位置あるか確認しておくことは重要です。SSC-Aプロットで顆粒球、単球、リンパ球を分離することでき、解析しない細胞集団をゲートアウトすることができます(図7)。SSC-Aプロットの次は死細胞染色試薬(DAPI、PI、7-AADなど)を使って死細胞をゲートアウトします。死細胞染色試薬は死細胞を染色するので、染色されてない死細胞染色試薬ネガティブ分画(=生細胞の分画)をゲーティングします。このようにダブレットや死細胞をゲートアウト除去をした細胞集団(図5のP4の細胞集団)のみを解析に使います。まとめ特定の細胞集団を解析から除くことをゲートアウトという。細胞がレーザーを通過すると電圧パルスが発生する。電圧パルスは幅(Width)、面積(Area)、高さ(Hight)の3つの要素で構成されており、Widthは細胞がレーザーを通過する時間、Hightは細胞がレーザーを通過する際に発した一番大きな明るさ、Areaは電圧パルスの面積を表す。ダブレットはレーザーを通過する時間が長く、光の総量も多くなる(=Width、Areaが大きい)。SSC-A)」で行う。本ブログは「にほんブログ村」のランキングに参加しています。FCM)という技術について、できるだけわかりやすく解説します。FCMは細胞のサイズ、細胞内構造の複雑さ、細胞表面及び細胞内分子の発現をシングルセルレベルで解析する技術です。自然免疫と獲得免疫の仕組み・相互作用ついて詳しく解説!はじめに今回は自然免疫と獲得免疫について詳しく解説していきます!免疫反応の本質を理解していただくために、詳細な情報はできるだけ省略していますが、重要な部分はしっかりと解説しています。免疫反応は体のどこで起きているのか?血液、リンパ液、リンパ球、抗原の循環について詳しく解説!はじめに本記事では血液、リンパ液、リンパ球、抗原が体の中でどのように循環していて、どこで免疫反応が起きているかについて解説しています。moreフローサイトメトリーフローサイトメトリーの解析に必須の知識!コンペンセーションの原理・やり方を詳しく解説!はじめにフローサイトメトリー(FCM)では複数の蛍光色素を用いて、マルチカラー解析を行うことができます。一般的な医学知識から、最新論文の知見をわかりやすく解説しています。defined.")}))})();タイトルとURLをコピーしました。