2009年FRETでなく一つの蛍光タンパク質をC末につけるだけでも蛍光変化が出る。cpmApple(FlicR)をC末に入れている。VSDの細胞外ループにcpGFPを挿入するタイプ予備知識:GFPが光るしくみ:Ser65–Tyr66–Gly67が自己触媒反応(特にArg96とGlu222に依る)を経て蛍光団HBIを形成し、チロシン由来フェノール基が脱プロトン化されてphenolateになると励起可能になる。Glu222はHBIを脱プロトン化のために適切な位置に置くことに寄与している(GFP変異体の構造論文)。permutation)では、N末・C末をリンカーで繋ぎ、144番目の残基と145番目の残基新しくC末・N末としているものが主流。GFPのHis148はcpGFPではHis4となる。A206Vという変異を入れたのがsuperfolderGFP。S205T)が入ったのがsfGFP-OPT。普通のcpGFPと同じく144-145番目の残基で円循環変異。St-Pierreが筆頭。VSDベースでキネティクスが良いモノを作るのが目標。円循環変異を施したGFPを入れている。脱分極すると暗くなるタイプのプローブ。CiVSDはcpGFPをこの位置に入れると膜移行が悪くなるらしく、チキン由来のVSDを利用(GgVSD。細胞外ループが11残基でCiVSDの15より短い。ちなみにWTのVSDではなく、電位依存性のレンジをシフトさせるR153Qや、発現量を上げるために開始コドンの後に1コドンを挿入するといった改変アリ)。cpsfGFP-OPTの4種を検討し、cpsfGFP-OPTだとうまくいく。等の特徴があるGFP変異体。Hzまで行ける、とか。ちなみに検討の過程で、SN比は悪いがpositiveな変化を示すvariantが取れている。St-Pierreがラストオーサーの仕事。sensingしそうな部位(helix1と4)に置換変異。心筋細胞で見た時は2倍くらい、ArcLightの1.5倍くらい。キネティクスはASAP1より数10%程度遅くなるが、それでもArcLightより3倍くらい速い。ニューロンで見た時は、ASAP1より50-60%程度感度が良い。St-Pierreは2nd。photonイメージング。ASAP1からkineticsは変わらないまま、感度が20%前後上がっている。過分極への感度がより強く上がる。linkerアミノ酸のナンバリングがASAP1から1個ずれている(SDLS<削除><cpsfGFP-OPT>TDQMPQの最初のSが143ではなく144番目に。ASAP1のA147とA148がASAP2fのA146とA147に相当)が、これは、ASAP1論文のナンバリングはWTのVSDに準拠しており、ASAP2f論文のナンバリングではメチオニンの後に入ったコドンをカウントしているためと思われる。2fと2sの変異を両方取り入れつつ、2fで改変の対象としたリンカー近傍について、変異を入れる範囲を広げている。146から151まで。147まではCiVSP由来の配列だが、それ以降はcpGFP由来配列。ASAP3の148-151番目の残基はcpGFPの1-4番目の残基に相当(4番目のHistidineはGFPでは蛍光の発生に必須の残基。