K+チャネルのC末にCFPとYFPをつけてFRETただし、黎明期プローブは膜上に移行しづらく使いにくいという問題があり、使いづらかった。GEVI開発の難しい点は以下の通り(St-Pierreによるレビューを参照):細胞質ではなく膜上にセンサー分子が局在する必要があるため、センサーのTraffickingが良く無ければいけない膜状にしか存在できないため、利用可能なセンサー分子の数が少ない。暗いし、SN比の要求が高い上の問題に付随して、照射強度を強くする必要があるため、褪色が速いSN比、Kinetics。Kineticsは、活動電位の変化を正確に反映できるくらいの速さであるか脱分極に対して蛍光が増えるか減るか。ベースラインが明るいとSN比が下がるし褪色も速くなる二光子励起ができるか。ロドプシン系例のGEVIは二光子励起では使えない。どんな色か?特にチャネルロドプシンなどと併用することができるか電位変化に対してリニアに蛍光が変化するか。活動電位だけではなく過分極なども正確に追うことができるか細胞毒性があるか?例えばプローブが光依存的なイオンポンプ活性等を有していたら問題2005年に岡村先生が報告したホヤ(Ci)由来の電位依存ホスファターゼ(VSP)の電位感受ドメイン(VSD)は、Traffickingが良く、これを用いたプローブが2007年から出てきた。2011年にはロドプシンが電位依存的に蛍光を変化させるタンパク質として使えることが報告された。2023年現在では、この2つの電位センシングモチーフが主に使われている。このメモでは、次の方針で現行プローブを整理する。方針その2:state-of-the-art的プローブの各世代については、改良の狙い、変異アミノ酸(タンパク質のどういう機能に関連する位置か)も紹介する。蛍光を生じる原理の違いは3つ。cpGFPをリンカー領域に挟むというタイプ。VSDの末端に2つの蛍光タンパク質をつけてFRETするタイプ最初期に出てきたもの。