スライスで見た時にASAP2sよりSN比が50%くらい高くて、Kineticsはriseが2sより若干はやくなり、decayは大差ない。vivoでマウスの脳活動が見える。Linラボ、bioRxivプレプリント。positiveな変化を示すことが目標。Serineが変異の候補。ベースに、150と151の全ての組み合わせ、400変異体をテスト。かけて正の方向への変化。ダイナミックレンジがASAP3の2倍。電位変化カーブのレンジが生理的な電位変化レンジと合っておらず、right-shiftしている。そこで、これをleft-shiftさせる変異を探した。(GFPのThr203)をmutagenesis。電位変化カーブがleft-shiftして生理的な電位変化のレンジで蛍光変化がおさまるようになった(ASAP4.1)。mVにおける蛍光も上がってSN比が下がった。そこで、150,151と相互作用しそう、かつVSDの動きをcpGFPの構造変化に繋げるのに重要そうな148と149の残基についての変異400通りを全部試したところ、F148PとN149Vが-70mVでの蛍光を下げた(ASAP4.2)。Helix4のF413に変異を入れて-70mVでの蛍光を下げることを狙った。imagingをした際にASAP3と遜色ない程度のSN比で、かつ反応方向が逆なものができた。1光子イメージング時に性能改良に寄与する変異が2光子イメージング時では性能改良に寄与しないこともあることに着目し、最初から2光子を使ってスクリーニング。ASAP1と2sベース。mutagenesis。ASAP3と似たような発想で、リンカーの147番目の残基から、発色団とinteractionするhistidineまで(さっきは151だったがASAP2sベースなので152)を変異。発色団の脱プロトン化に関わるもう一つの残基に相当するT207も変異(cpGFPのT203)。加えて、これまでにASAPシリーズでターゲットにされていたhelix3とcpGFPのリンカーだけでなく、helix4とcpGFPのリンカーも変異。ちなみに392までがsfcpGFP-OPT由来で、393からがVSD由来。WTのVSDのR153Qに相当。進化的に保存されている残基を狙ったとのこと。152と207は上述の通り発色団とinteractionする場所で、391と397がこれまでいじられてこなかったリンカー部位(ASAP1で有益と思われていたR397QがHに変わっている)。124と406はVSDでこれまでいじられてこなかったところ、そして2sで入れたR415Qが元に戻っている。ASAP3より1.5倍明るく、ΔF/Fも2.5倍程度。vivoでマウスの脳活動が見えることを示している。ちなみに、二光子で見た時、ASAP3の感度や明るさはASAP2と殆ど変わらないらしい。positiveな変化を示すことが目標。1電位感受性ドメインの細胞外ループとcpGFPの接合部(と著者らは言っているが、cpGFPの残基で発色団とinteractionする位置のはず。mutagenesis。goingが強くなる(これがSpikeyGi)、2cpGFPのV170をIに置換したというもの(これがSpikeyGi2)。これによって感度が上昇。F/F0がASAP3と同等かそれ以上、kineticsはASAP3とriseは同等でdecayがちょっと遅い程度のパフォーマンスを、逆方向の変化で示す変異体ができた。行っている(最新の、ドキシサイクリンでKirのエクスプレッションを制御するやつ&CheRiffを発現させたやつ、では無い)。