エラープローンPCR。スパイクが出るHEKでスクリーニング。CheRiffと共にmEOS4aという光照射で緑から赤に変わる蛍光たんぱく質を共発現させ、良いvariantをマーキングしてFACSで釣る。見つかった変異を併せてみたが、3次元的に近いアミノ酸同士の両方に変異を入れると、膜移行に壊滅的な影響が出る事が多かった。そこで、タンパク質構造の情報を用いて遠く離れている箇所の変異を選んできた。(A238Sの代わりにR237I)が取れた。QuasAr6aはkineticsに優れ、QuasAr6bは明るい。3-ER2に変更した。Sliceで見たところ、aとbはArchonに比べて数10%速くて数10%明るい。vivoでもQuasAr6の方がArchonよりSNRとkineticsが優れているというデータ。QuasAr3で入れていた点変異は消えた。オプシン型のものは2光子では励起できないという問題がある。Archベースのプローブは頭うちになっている感。Archとかより他のロドプシンを探した方が良いか。近年見つかったヘリオロドプシンなどもセンサー様の動きを示すらしい。ロドプシンC末に蛍光タンパク質/色素を融合してFRETするタイプロドプシンのC末端に蛍光たんぱく質をつけて励起。電位依存的な構造変化が起こって、蛍光たんぱく質がロドプシンに近づいた時にFRETが起こり、暗くなる。ロドプシンが電位センサーかつFRETアクセプターとして働く。ロドプシンより励起に必要なレーザー強度が少なくて済み(1/50~1/100程度)、ロドプシン単体のものほどではないがキネティクスが速い(ASAP系よりも速い)。2014)などが報告されていたが、Ace2N-mNeonが一番良く知られている。Aceは吸光スペクトルがブルーシフトしたロドプシンで、FRETパートナーとして他のロドプシンよりより優れている。あとキネティクスがMacの6倍速い。mNeonGreenは緑色蛍光たんぱく質の一種で、明るくて褪色が遅い。(Ace2N)っていうポンプ活性を弱めた変異体を作成。Ace2NとmNeonGreenを結合。detectionのfidelityが高い。培養ニューロンで見た際はAce2NはArcLightやASAPよりSN比が3倍近く高く、圧倒的に速い。膜移行性は低く、vivoではそのまま使えない。リンカーを4アミノ酸にすると発現量が上がり、vivoでも使えるように(Ace2N-4aa-mNeon)。4アミノ酸で繋ぐとロドプシンと蛍光たんぱく質の距離が離れるのでFRET効率は下がる。AceとmRuby3のFRETで、赤色のものを作るのが目的。mNeonを単純にmRuby3に代えただけだとFRET効率が悪い。pocketのエンジニアリング)による解決を狙う。288種類のリンカー変異体をスクリーニングした結果、N側にWRの2残基を挿入した変異体Ace-WR-mRuby3でコントロールの約1.4倍反応性が上昇。N81Sで約2倍感度が上昇。N81Sとホモロガスな変異は他のロドプシンで吸光スペクトルをレッドシフトすることが知られている。培養ニューロンでAce2N-mNeonと同じくらいのパフォーマンスを示すものが得られて、スライスでもシグナルが取れた。それぞれの感度を上げるのが目的。(non-pumpingにするために最初に入れた変異、DTDモチーフの一つ)。G231IがVARNAM2。VARNAM作るときに入れた2個のリンカーWRがどっちもはずれて、SGのリンカーのうちGがIになった。HEKでの比較では全世代から約3倍、2倍程度の感度。vivoで使えている。ここまでのFRETでは脱分極に応じて暗くなるタイプだが、明るくなるものを作成。mutagenesisから。この残基はDTDモチーフの、細胞質側プロトンドナーに相当。D92Nにしたときに反応方向の正負が逆転。mutagenesis。S81Dにしたらそれなりに早いし一番大きいが電位感受性が得られた(つまりプロトンポンプ活性を阻害するためにAce-mNeonでNにしたD81(プロトンアクセプター)がAce-mNeon2でSに変わり、Dに戻っている)。後述のVoltronをPositronにした時の変異と同じ。helix(DTDモチーフのD81とD92を含むhelixで、MかNの中間体構造をstabilizeするのに重要な残基を多く含むらしい)に変異を入れた。pAceR以外はサブミリ秒のkineticsを維持しており、アクションポテンシャルを十分レポート可能。239においてはASAP4と同程度。蛍光タンパク質をベースにしたFRETセンサーは褪色が速いので、代わりに褪色に強い蛍光色素を使おうという発想。mNeonの代わりにHalo-tagを入れて、Halo-tagがJaneliaが作ったJF-dyeに結合する。リンカーの最適化(junctionのアミノ酸を5個削る)を行うと一番良いSN比が得られる。Ace2NとJF525ないしJF549でFRET、これをVoltronと呼ぶ。培養ニューロンで比較したところ、Ace2N-mNeonより3-4倍明るくて、褪色にかかる時間は約7倍。これも1光子のみでしか使えず、二光子では使えない。脱分極に伴って明るくなるvoltronを作るのが目的。pAceやpAceRよりも先。Ace2Nでは細胞外側にあってプロトンアクセプターとして働くD81がNになってポンプ活性が止まっている。電位感受性はレチナールが結合するシッフ塩基と細胞質側にあるプロトンドナーとなるD92との相互作用により起こっている。そこで、細胞内側のプロトンドナーとの相互作用を止め、細胞外のプロトンアクセプター側と相互作用させれば、膜電位の変化に対して逆の反応を起こせるのではないかと考案。blockできたし、反応性が逆になった。キネティクスが遅くなった。そこで、Ace2Nで入れていたプロトンアクセプターのD81NをDに戻した。すると、活動電位を追うのに十分なキネティクスが得られた。微妙にphotocurrentが出る。SN比がvoltronの40%程度だったので、プロトンを細胞外側に運ぶ経路(189と199番目の残基)をエンジニアリングしたところ、E199Vにしたときに2倍近いダイナミックレンジが得られた。これによりSN比はvoltronとほぼ変わらず、静止膜電位の時は暗くて脱分極に応じて明るくなる変異体、positronが得られた。比較は主にHEKか培養ニューロンで行い、zebrafishで使えることまで示している。Voltronより更に褪色しづらくなり、他のロドプシンにも応用可能であることを示している。脂溶性だが電荷のある蛍光色素DPAが、電位に応じて細胞外側(過分極時)細胞内側(脱分極時)によるかという性質を利用するプローブ。膜にアンカリングしたGFPを細胞内側に出しておくと、脱分極の時にDPAが近づいてきて、DPAはGFPの蛍光をabsorbするのでFRETが起こる。Yuste達がside-by-sideで比較した論文が2019年に出ている。培養ニューロンでのSN比はAce2NとかQuasAr系が良い。ArcLightとかASAP系はどっこい。ASAP系は40Hzが見えるか見えないかという感じで、ArcLightは10Hzでギリ見えるかという感じ。褪色はAce2Nが速い。photonでは、オプシン系は暗すぎて見えないので検討から外れる。1光子で応答が見えたのはArcLightMTだけで、2光子だと程度は若干弱まるけどASAP系もOK。ChenのCRACK。とそれを読んだNR回。抑制性シナプスのクラスタリングを見たもの。Multiplexing単純な仕組みとはいえ、<10nsの時間解像度でシグナルを処理するFPGAの設計は結構トリッキーらしい(Kaspar談)。delayではcross-talkないのでは...と言っていますが、これは光子数が1/eになる時間なので、e^3~=20から、ざっくり全蛍光の5~10%くらいは漏れ込んでもおかしくないことになります。SeeCoherentの可変波長レーザーDenoisingパートSelf-supervisingの説明を簡略化のためにDeepCADを例に用いて行いましたが、DeepVIDではspatialなinterpolationも行われています。pixelsのみに対して行うことで、spatialな情報も利用するようになると考えられます。correlationが高いことが多いので、ノイズだけが主に消えることになると考えられます。Notes:タンパク質構造予測でドッキングシミュレーションとかまでできるようになってきたみたいですが、構造のデータに基づいて、rationalに、センサーのリンカーはどのくらいの長さでどの配列が良いのか、とか、どこにどういう変異を入れるとどういう性能が上がるか...みたいなのは予測できたりするんでしょうか。Tianのは配列データだけで構造の情報はあんまり使えて無さそうだし。それはさておきQuasAr4,5をご存知の方はこっそり教えてください笑(脇)VoltronシリーズのEricがオプシンベースのやつも2p励起で動くとか最近のオプティカで言ってたらしい。potential.”より。Themegraphy。