トランスフェクション(遺伝子導入)は、分子生物学において欠かせない実験手法です。最近では、脂質ベースのトランスフェクション試薬が数多く市販されていますが、効率的かつ安価な方法として、DNAとりん酸カルシウムの共沈させて細胞へトランスフェクションするりん酸カルシウム法があります。りん酸カルシウムを用いたトランスフェクションは、接着性および非接着性細胞株に広く使用されており、(Jordanら、1996年)タンパク質の一過性発現株と安定発現株の作製どちらにも使用されます。トランスフェクションの効率は、使用する細胞株にもよりますが、100%近く導入できることも珍しくありません。Transfection.負に帯電しているプラスミドDNAと正に帯電しているりん酸カルシウムで形成された共沈物は、エンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれます。取り込まれたプラスミドDNAは、エンドソームから脱出するか、リソソームで分解されます。エンドソームから逃れたプラスミドDNAは細胞で発現します。plasmidを導入する例を記載しています。任意の細胞とプラスミドに置き換えてください。りん酸水素二ナトリウム塩酸でpHを7.0に調整し、フィルター滅菌します。塩化カルシウム(フィルター滅菌済み)滅菌水で100μlのフィルアップし、ピペッティングで緩やかに混合します。dish)プロトコル(Protocol)10%FBSを添加したE-MEMでHEK293細胞を培養します。dishに播種します。トランスフェクションは細胞が60-70%コンフルエントの状態になったときを推奨します。細胞によって適切な細胞密度は異なります。トランスフェクションの3時間前に培地交換をします。100μlのSolution-Bを100μlのSolution-Aにゆっくり加え、ピペッティングに穏やかにかつ均一にしっかり混合します。混合物が入ったチューブを20-30分間室温で静置します。DNA-りん酸カルシウムの共沈物が形成されている間、溶液に濁りが生じます。チューブを軽くタッピングします。混合物を細胞を培養したディッシュへ、培地液面にチップ先端を触れさせながらゆっくり添加します。ディッシュを数回傾け、DNA-りん酸カルシウムの沈殿物が培地中に均一にいきわたるようにします。トランスフェクションは完了です。CO2)で24時間培養します。上記プロトコルとはやや異なりますが、以下の動画でトランスフェクションの操作がわかります。コメントをキャンセルメールアドレスが公開されることはありません。※サイト次回のコメントで使用するためブラウザーに自分の名前、メールアドレス、サイトを保存する。上に表示された文字を入力してください。date*日本語が含まれない投稿は無視されますのでご注意ください。細胞培養イルミナがバイオインフォマティクス企業BlueBeeを買収【イルミナの売上は?】ブラッドフォード試薬の原理・作り方[組成]・プロトコルRECOMMENDこちらの記事も人気です。