おいて幅広い応用が期待されます3.発表概要:近年、細胞内ゲノムDNA中の特定の狙った配列を自在に編集することができるゲノム編集技術が急速に発展しており、農業、医療分野を含めた生物学分野全体に大きな変革をもたらしつつあります。これまでに、CRISPR–Cas9というゲノム編集ツールや、DNA配列を編集する塩基編集ツールが開発されてきました。A→Gの異種塩基置換(注1)を同時に達成できる新たな塩基編集ツール「Target-ACEmax」の開発に成功しました。発生における細胞系譜の追跡など、さまざまな分野において幅広い応用が期待されます。4.発表内容:生命の設計図であるゲノムはA、T、G、Cの4文字からなるDNA塩基配列で構成されています(ヒトの場合は一細胞あたり60億文字)。近年、細胞内ゲノムDNA中の特定の狙った配列を自在に編集できるゲノム編集技術が急速に発展しており、農業、医療分野を含めた生物学分野全体に大きな変革をもたらしつつあります。CRISPR–Cas9ゲノム編集は、ガイドRNAというRNA分子がそれと相補的な配列を持つターゲットDNAにDNA切断活性を持つCas9タンパク質を運び、ターゲットDNAの二本鎖切断を引き起こすことができます。これが簡便に特定の遺伝子の破壊や、切断部位に別の外来DNAを挿入できるゲノム編集ツールとして広くその応用が進んできましたが、二本鎖DNA切断による細胞毒性や、編集の正確性が課題となっていました。このようななかで、この数年はDNA切断活性のない変異型のCas9に脱アミノ化酵素を融合した塩基編集ツールが開発されてきました(図1)。塩基編集ではDNAを切断せずに脱アミノ化反応を介してターゲットDNAのCをTに、あるいはAをGに高効率で変換できるため、作物の品種改良や遺伝子治療をはじめとした領域において優れたゲノム編集ツールとして期待が高まっています。これまでの塩基編集ツールで可能な塩基置換パターンはC→TまたはA→Gの二種類に限られていました。A→Gの異種塩基編集を同時に達成できる新たな塩基編集ツールTarget-ACEmaxの開発に成功しました(図2)。Target-ACEmaxはニッカーゼ型のCas9(nCas9)のN末端側にシチジン脱アミノ化酵素(注2)であるPmCDA1(C→T置換を引き起こす)を、C末端側にRNAアデノシン脱アミノ化酵素(注3)であるTadAとその変異体の二量体(A→G置換を引き起こす)が配されている他、コドン最適化(注4)および核局在シグナル(注5)の追加などによって構成されています。本研究では、はじめに、これまでの塩基編集ツール、それらの組み合わせ、Target-ACEmaxを含め新たに開発されたいくつかの異種塩基同時編集ツールを用いて、ヒト培養細胞におけるゲノム上の47ヶ所のターゲット領域のゲノム編集を行い、これらの塩基置換パターンを超並列DNAシークエンシング(注6)によって観察しました。あることが分かりました(図3)。ゲノム編集技術一般において問題視されている意図しないゲノム領域の編集(DNAオフターゲット効果、注7)や塩基編集技術で懸念されている意図しない細胞内RNA分子の編集(RNAオフターゲット効果、注8)についてエキソーム解析(注9)およびトランスクリプトーム解析(注10)を行い、Target-ACEmaxが既存の塩基編集ツールと比較していたずらにこれらのオフターゲット効果を引き上げないことも示しました(図4)。超並列DNAシークエンシングによって得られた膨大な塩基編集パターン評価データを元に、任意のターゲット配列の塩基編集パターンを予測する機械学習モデルの開発にも成功しました(図5)。この機械学習モデルを用いて、Target-ACEmaxがタンパク質をコードする遺伝子群について、標的塩基群以外の不要な塩基編集を抑えて、多様なアミノ酸置換を正確に誘導できること、ヒトに観察される多様な疾患遺伝子変異の複数を同時に高効率に修復できる可能性を示唆しました。含めた生物学、医学分野における次世代のゲノム編集ツールとして幅広い応用が期待されます。研究グループでは細胞のふるまいや、細胞内分子のふるまいを経時的に細胞内の人工的なDNAのテープに記録していくような人工遺伝子回路の開発が進んでいます。この「DNAイベントレコーディング」と呼ばれる次世代の研究分野は、動物個体のそれぞれの細胞の時系列状態変化を全て記録して、後で記録された過去の状態ヒストリー情報をその個体からまるごと取り出せるような革新的技術を生み出す可能性があります。2情報記録メディアとしての人工DNA導入技術、3センサーから得た情報を人工DNAに記録する書込み技術、4人工DNAに記録された情報の読出し技術の4種類の技術コアが重要となりますが、今回開発されたDNA情報を多様に書き換えることのできるTarget-ACEmaxは3人工DNAへの情報書込み技術としても期待の高いものです。Biotechnology」オンライン版に掲載されます。佐藤、塩澤7.用語解説:(注1)異種塩基置換:DNAの異なる種類の塩基を同時に変換することの意。(注2)シチジン脱アミノ化酵素:DNAのシチジン(C)からアミノ基を除き、ウリジン(U)に変換するタンパク質。UはDNA複製時にTに変換される。(注3)RNAアデノシン脱アミノ化酵素:RNAのアデノシン(A)からアミノ基を除き、イノシン(I)に変換するタンパク質。本研究ではDNAのAをIに変換するこれの改変体タンパク質が用いられた。IはDNA複製時にGに変換される。(注4)コドン最適化:対象とするタンパク質が対象とする細胞内で効率良く発現するように遺伝子暗号コードを最適化することの意。(注5)核局在シグナル:核内へ局在が誘導されるタンパク質ドメイン。これを付加することで効率良く染色体を格納する核内へゲノム編集ツールなどを導入することができる。(注6)超並列DNAシークエンシング:次世代DNAシークエンシング。超並列に数千万~数十億分子の短いDNA配列を同時に解読できる。(注7)DNAオフターゲット効果:ゲノム編集が意図しないDNA領域を編集してしまう効果。(注8)RNAオフターゲット効果:ゲノム編集が細胞中の意図しないRNA分子を編集してしまう効果。(注9)エキソーム解析:ゲノム中のタンパク質コード領域のDNA変異を一斉に超並列DNAシークエンシングで一斉に計測する技術。(注10)トランスクリプトーム解析:細胞内のRNA分子配列を一斉に計測する技術。ニッカーゼ型Cas9がシチジンまたはアデニン脱アミノ化酵素を持っており、それぞれC→T置換あるいはA→G置換を誘導できる。Target-ACEmax。PmCDA1シチジン脱アミノ化酵素およびTadAアデニン脱アミノ化酵素の両方を持ち、DNAのターゲット配列にC→T置換およびA→G置換を同時に誘導できる。さまざまな塩基編集ツールのRNAオフターゲット効果によって引き起こされるヒト細胞内RNA分子のC→U変異。観測されたRNA変異総数と各RNA変異の頻度。Target-ACEmaxのRNAオフターゲット効果は低い。条件付き確率モデルによる異なる塩基編集ツールによる任意のターゲットDNA配列のさまざまな塩基編集パターン頻度の予測。さまざまな塩基編集ツールについてゲノム編集結果の予測が実測値と概ね似たものになる。