[Dynabeads使用時のpre-clear]バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。たこ哺乳類細胞でFLAGタグ付のタンパク質を強制発現させ、IPすることで、そのタンパク質に結合するタンパク質を共沈させようと考えています。共沈したタンパク質の同定は、SDS-PAGE後にMSで同定する予定です。予定ではDynabeadsに抗FLAGタグ抗体を結合させてIPし、FLAGペプチドで溶出後にSDS-PAGEを行うことを考えております。ひとつ悩んでいることは、pre-clearをするかどうかです。Dynabeadsは非特異的吸着が少ないようですし、仮にDynabeadsおよび抗FLAGタグ抗体に非特異的に結合するタンパク質があっても、FLAGペプチドで溶出するので、SDS-PAGEへの持ち込みも無いのではと考えています。研究室の予算を考えると、Dynabeadsは高価なので、ケチれるにこしたことはありません。リア充やって悪い事はたぶんないし、できればやった方がいいのかもしれない。自分の経験の範囲からの正直な感想をいうと、「面倒だし別にしなくてもいいじゃね」、という感じです。駄目なときはしっかりプレクリアしてもしなくても駄目だし、上手くいくときもまた、してもしなくても上手くいく。非特異的なバックが高いならそれはビーズ自体の性質、試料や試料溶解液、抗体に起因すると考えるし、もっと根本的なところを再検討すべきと思う。すくなくともプレクリアすることで結果が目に見えて改善することはあんまり期待出来ないようにおもう。たこお返事遅くなりました。pre-clearなしで一度やってみようと思います。ネガティブコントロールとしては、FLAG融合タンパク質を強制発現させていない細胞を用いて同様の操作を行ったものを使用する予定です。モモプレクリアーはしなくても大丈夫な場合も多いですが。TS必ずPre-clearしなければダメ、ということではないでしょう。IPでも、基本的にPre-clearする方法をとる場合が多いですが、問題とならないアッセイ系、サンプルならば、省略しても良いと思います。やってみて大丈夫なら大丈夫、ということではないかと思います。たこ哺乳類細胞でFLAGタグ付のタンパク質を強制発現させ、IPすることで、そのタンパク質に結合するタンパク質を共沈させようと考えています。共沈したタンパク質の同定は、SDS-PAGE後にMSで同定する予定です。予定ではDynabeadsに抗FLAGタグ抗体を結合させてIPし、FLAGペプチドで溶出後にSDS-PAGEを行うことを考えております。ひとつ悩んでいることは、pre-clearをするかどうかです。Dynabeadsは非特異的吸着が少ないようですし、仮にDynabeadsおよび抗FLAGタグ抗体に非特異的に結合するタンパク質があっても、FLAGペプチドで溶出するので、SDS-PAGEへの持ち込みも無いのではと考えています。研究室の予算を考えると、Dynabeadsは高価なので、ケチれるにこしたことはありません。半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。