96-wellの低細胞接着性U底プレートにて、所定の濃度のCHIR99021、及びY27632(10μM)を添加した分化培地(150μL)に対し、100,000個のNPCsを播種した。2インキュベーター中で、37°Cで培養した。最初のCHIR99021による誘導の後、凝集した細胞を、Fgf9(10μg/mL)を添加した無血清分化培地で満たしたトランスウェルインサート上に移し、以下の成長因子又は阻害剤とともに培養した:CHIR99021(2μM)、IWR-1(2μM)、アクチビンA(10ng/mL)、SB431542(25μM)、レチノイン酸(10μM)、BMS493(10μM)。培地を2日毎に交換し、6日目に、誘導された組織を分析した。(v/v)のペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEM/F12培地を用いた。silk上で維持した。2で培養し、6-7日毎に継代した。培地は、2、4、5、及び/又は6日で交換した。2016)に従って作製し、同様に維持した。Universityから購入した。2で増殖させ、4-5日で継代した。2で14日間培養により行った。太口らの報告(非特許文献6及び非特許文献9)従い、hiPSCからNPCを含んだスフェロイドを誘導した。誘導したスフェロイドを、Accumaxを用いて、37°Cにて8分間インキュベートして単一細胞に解離させた。-集団として選別した。96-wellの低細胞接着性U底プレートにて、CHIR99021(3μM)及びY27632(10μM)を添加した無血清分化培地(150μL)に対し、50,000~100,000個のNPCsを播種した。2インキュベーター中で、37°Cで培養した。2因子(上記工程B因子)を添加した培地で培養した。3因子(上記工程C因子)を添加した培地に移した。培地を3日毎に交換した。Day9-12日目に、誘導したポドサイトを回収し分析した。[0072]フローサイトメトリー解析マウス又はヒトNPCsから誘導した組織を、0.25%トリプシン-EDTAで8分間処理して解離させた。3を含む1×HBSS緩衝液中で、30分間で染色を行い、次いで2次抗体で10分間染色を行った。FACSを用いて染色された細胞を解析した。用いた抗体の情報を以下の表に示す。倫理委員会の承認に従い、インフォームドコンセントを得た上で、3人の腎癌患者から摘出された腎組織のうち、正常部位からヒト成体腎組織を得た。患者は、49歳女性、69歳男性及び80歳男性である。全ての患者が、正常な腎機能及び正常な尿所見を示した。患者から摘出された腎組織の正常部位は、摘出後すぐに、氷上で、10%FBSを含有する高グルコースDMEMに浸漬した。糸球体を単離し、酵素混合液(コラゲナーゼXI:1mg/mL、ディスパーゼ:2.4U/mL)を用いて消化し、次いで、0.25%トリプシン-EDTAで消化した。細胞の解離処理後に、RBC溶解緩衝液を用いて、赤血球を破壊した。+集団として単離した。Technology)を用いて逆転写反応を行った。Mix(Toyobo)を用いて定量的PCRを実行した。用いたプライマー(フォワードプライマー及びリバースプライマー)は、以下の遺伝子に対応するものである。マウス:b-Act、Six2、Pax2、Sall1、Cited1、Robo2、Lhx1、Pax8、Cdh1、WT1、MafB、Foxc2、Pou3f3、Dkk1、Sox9、Nphs1、Nphs2、Cldn1、Lrp2、Slc34a1、Cdh6;ヒト:B-ACT、NPHS1、NPHS2、WT1、SYNPO。全てのサンプルについて、β-アクチン発現により標準化した。サンプルを10%ホルマリンで固定し、パラフィン包埋して、6mm厚切片を得た。pH6.0のクエン酸緩衝液で抗原回復を行った。切片を1%BSA含有PBSでブロックし、1次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした。633又は647とコンジュゲートした2次抗体で染色した。核は、DAPIで染色した。共焦点顕微鏡で蛍光イメージを撮像した。用いた抗体情報を以下に示す。抗体として、NephrinのN-末端ドメインに対する抗体を用いた。調製した切片を抗体と一晩インキュベートした後、12nmの金粒子と結合した2次抗体とインキュベートした。免疫染色後切片を固定し、JEM1230透過型電子顕微鏡(JEOL)を用いて撮像した。[0079](結果)実施例1:マウス胚腎臓からのネフロン前駆細胞の精製NPCsからポドサイトへの分化に必要なシグナルを分析するために、マウス胚腎臓から精製したNPCsからネフロン上皮及びポドサイトへの分化を検出できる培養系を確立した。従来の報告によると、NPCsは、Robo2を発現し、Pdgfrbは陰性である。NPCsであることを確認した。NPCsを高純度で単離する方法を確立した。ポドサイト誘導を定量評価するため、分化したポドサイトのみでGFP発現を示すMafB-GFPノックインマウス(MafB-GFPマウス)を用いた。細胞と同等レベルで発現しており、NPCsを高純度で単離できていることを確認した。