3μMのCHIR99021での24時間処理が、ポドサイト誘導において最も効率が良いことが判った。+)を形成することが確認できた。PAからRVへの分化過程において、マウスの場合と同様に、SB431542処理はポドサイトの割合を上昇させた。2(工程B)におけるWntシグナル阻害剤(IWR1)及びRAの添加もポドサイトの割合を増加させた。これらの3つの試薬の組合せは、近位RV細胞の数を著しく増加させ、そして最終的なポドサイトの誘導効率を70%以上にまで上昇させた。3(工程C)においては、SB、IWR1、RAのいずれも単独での投与でポドサイトの誘導効率を上昇させる効果がみられた。SBとIWR1を組み合わせることによって、ポドサイトの誘導効率はさらに上昇し、90%以上に達した(図17)。上記のように、STEP毎に必要な培養条件を検討し、それを最適化することによって、hiPSCs由来のNPCsからのポドサイトの選択的誘導を達成した。工程の概略は、図1bに示してある。この誘導法は、遺伝子編集を行っていないhiPSセルライン(201B7)においても適応できることも明らかとなった。ポドサイト自体の収量も、10,000個のhiPSCsから300,000個のポドサイトが誘導できることになり、通常の腎オルガノイドの約3倍の数であった(図18)。培養開始9日目を超えても培養継続可能であり、培養開始後15日目の時点でも細胞は生存していた。誘導ポドサイトを、ヒト成体腎臓由来ポドサイト及びヒト不死化ポドサイト細胞株との間で遺伝子発現プロファイルの比較を行った。SYNPOの高い発現レベルを示し、これらの発現レベルは、ヒト成人ポドサイトに匹敵するものであった(図19)。細胞株では、ヒト成体ポドサイトおよび誘導ポドサイトに比べ、SYNPOの発現は比較的維持されていたが、NPHS1及びNPHS2の発現レベルは極めて低かった。図20に示されるように、誘導ポドサイトでは、核においてWT1が発現し、細胞境界上においてNEPHERINが発現していることが確認された。結果、ポドサイトの基底側に足突起の存在も確認された(図21)。抗ネフリン抗体による染色で、これらの足突起がネフリン蛋白を発現していることも確認できた(図22)。スリット膜様の構造も、隣り合うポドサイト間に存在するフィラメント状の架橋として確認された(図21)。[0091]誘導ポドサイトにおけるタンパク発現をウエスタンブロットにより確認し、hiPSCs、ヒト不死化ポドサイト細胞株、hiPSC由来腎オルガノイドと比較した。NEPH1,及びPODOCINを多量に発現していた。膜性腎症の内在性抗原であるPLA2Rも発現しており、これらはhiPSCや細胞株に比べて多かった。これらの結果は、誘導ポドサイトが、足突起に関連するタンパクを十分な量で発現していることを示唆している。[0092]本発明の方法により作製した誘導ポドサイトが、インビトロで、ポドサイトの損傷や毒性試験に利用できるかを以下のように確認した。aminonucleoside:PAN)で48時間処理した。PANは、インビトロ及びインビボで、ポドサイト障害モデルにおいて用いられている薬剤である。誘導ポドサイトをPANで処理すると、ポドサイトの生存率の低下が確認できた(図24)。このことは、誘導ポドサイトが、細胞毒性試験へ応用できることを示している。蛋白レベルにおける検討では、NEPHRIN、p-NEPHRIN、及びNEPH1といった膜表面に発現しているスリット膜関連蛋白が、PAN処理によって有意に減少していた(図25)。これらスリット膜関連蛋白を障害前後で定量することは、これまでの細胞株や他のプロトコルで誘導したポドサイト様細胞では実現できないことである。これらの結果は、本発明の方法で作製したポドサイトが、ポドサイトとしての機能特性の一部を有しており、ポドサイト損傷のモデルとして、障害モデル実験や治療薬開発のスクリーニング、腎細胞における毒性試験に有用であることを示唆している。腎臓病において、ポドサイトに対し保護的に作用する薬剤の開発が待たれている。本発明の誘導法で作製されたポドサイトは、非常に多くのポドサイト関連蛋白を発現しており、障害を受けた際にポドサイトに保護的に作用する薬剤の開発にあたってのスクリーニング、すなわち腎臓病領域の創薬において有用であると考えられる。腎障害を与える可能性がある薬剤の毒性を検証する際に、誘導ポドサイトを細胞毒性試験の素材として応用することもできる。ポドサイトに関連する疾患である先天性ネフローゼ症候群の患者より入手したiPS細胞から患者由来のポドサイトを誘導することで、希少疾患の病態解明や治療法の開発にも応用が可能である。加えて、CRISPR/CAS9やTALENなどの技術を用いてiPS細胞の遺伝子編集も可能となったことから、特定の遺伝子を除去もしくは過剰発現させた細胞株を樹立し、そのような細胞株に本発明の誘導法を適用することにより、その遺伝子がヒトポドサイトにおいてどのような役割をもつのか検討するような実験系への応用も可能である。[0094]上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。[0095]本発明の誘導法により、効率良くポドサイトを誘導することができる。本発明の方法により誘導されたポドサイトは、多くのポドサイト関連蛋白を発現しており、ポドサイトのミミック(mimic)として有用である。ライセンスをご希望の方、特許の内容に興味を持たれた方は、下記「問合せ先」まで直接ご連絡ください。同じキーワードでJ-STORE内を検索することが出来ます。