発明の概要4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する新規な方法を提供する。本方法は、(1)4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に転換し、(2)4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に転換することを含む。特許請求の範囲[請求項1]4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する方法であって、(1)4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換し、(2)4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換することを含む方法。[請求項2]前記(1)の変換が、配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を用いて行われる、請求項1に記載の方法。[請求項3]前記(1)の変換が、前記第1の酵素を発現するよう改変された第1の宿主細胞を用いて行われる、請求項2に記載の方法。[請求項4]前記第1の宿主細胞が微生物である、請求項3に記載の方法。[請求項5]前記微生物が細菌である、請求項4に記載の方法。[請求項6]前記(1)の変換が、前記第1の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、請求項5に記載の方法。[請求項7]前記(2)の変換が、配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を用いて行われる、請求項1~6の何れか一項に記載の方法。[請求項8]前記(2)の変換が、前記第2の酵素を発現する第2の宿主細胞を用いて行われる、請求項7に記載の方法。[請求項9]前記第2の宿主細胞が、前記第2の酵素を発現するよう改変された宿主細胞である、請求項8に記載の方法。[請求項10]前記第2の宿主細胞が微生物である、請求項8又は9に記載の方法。[請求項11]前記微生物が細菌である、請求項10に記載の方法。[請求項12]前記(2)の変換が、前記第2の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、請求項11に記載の方法。固定化菌体からなる群から選択される、請求項6又は12に記載の方法。[請求項14]前記(2)の変換がpH8~9で行われる、請求項7~13の何れか一項に記載の方法。[請求項15]グルコースから4-アミノ桂皮酸を製造する方法であって、(a)グルコースからフェニルアラニンを産生し、(b)前記(a)で得られたフェニルアラニンをニトロ化して4-ニトロフェニルアラニンに変換し、(c)請求項1~14の何れか一項に記載の方法により、前記(b)で得られた4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造することを含む方法。[請求項16]フェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する方法であって、(b)フェニルアラニンをニトロ化して4-ニトロフェニルアラニンに変換し、(c)請求項1~14の何れか一項に記載の方法により、前記(b)で得られた4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造することを含む方法。[請求項17]4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を用いることを含む方法。[請求項18]4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を用いることを含む方法。[請求項19]配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素をコードする核酸を担持するベクター。[請求項20]配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素をコードする核酸を担持するベクター。[請求項21]配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。[0001]本発明は、バイオマス由来の芳香族ポリマーの原料モノマーとして有用な4-アミノ桂皮酸を製造するための新規な方法、並びに、斯かる方法に用いられる新規なベクター及び宿主細胞に関する。より、再生可能な資源であるバイオマスを利用して燃料・化成品等を生産するシステムの重要性が高まっている。バイオマス由来のポリマーとしては、脂肪族系ポリマーと芳香族ポリマーとが挙げられるが、現在のところ研究・開発が進んでいるのは、主にポリ乳酸を始めとする脂肪族系ポリマーである。ポリ乳酸は耐熱性・耐久性が低いという課題があったが、結晶化度の向上等によりこれらの課題は改善されつつある。芳香族ポリマーは熱安定性や力学強度等の点で優れた物質特性を示すことが多く、エンジニアリングプラスチックの原料等としての利用が期待される。[0003]バイオマス由来の芳香族ポリマーの原料モノマーとして特に注目されるのは、4-アミノ桂皮酸である。特許文献1及び非特許文献1には、4-アミノ桂皮酸を原料として高耐熱性の優れた芳香族ポリマーを合成する方法が報告されている。よって、斯かる高耐熱ポリマーの原料のモノマーとして、バイオマスから4-アミノ桂皮酸を高効率で合成することが求められている。[0004]本発明者等は、バイオマスのグルコースから4-アミノ桂皮酸を合成する方法として、微生物由来の酵素を用い、まずグルコースからコリスミ酸及び4-アミノフェニルピルビン酸を経て4-アミノフェニルアラニンを合成し(特許文献2)、次いでこの4-アミノフェニルアラニンを4-アミノ桂皮酸に変換する(特許文献3)という経路を開発している。[0008]本発明者等による前述の4-アミノ桂皮酸の合成法は、優れた方法ではあるものの、反応速度や反応効率等の点でまだ改善の余地があった。[0009]本発明の目的は、4-アミノ桂皮酸を合成する新規な方法の提供にある。[0010]本発明者等は鋭意検討の結果、グルコースからの合成経路が知られている4-ニトロフェニルアラニンを用いて、これをまず4-ニトロ桂皮酸に変換し、次いで4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換することにより、グルコースから4-アミノ桂皮酸を合成する新規な経路を確立できることに想到した。4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換、及び、4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換の双方を、生物由来の適切な酵素を用いて実現できることを見出し、本発明を完成させた。[0011]即ち、本発明の要旨は以下に存する。[1]4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する方法であって、(1)4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換し、(2)4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換することを含む方法。[2]前記(1)の変換が、配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を用いて行われる、[1]の方法。[3]前記(1)の変換が、前記第1の酵素を発現するよう改変された第1の宿主細胞を用いて行われる、[2]の方法。[4]前記第1の宿主細胞が微生物である、[3]の方法。[5]前記微生物が細菌である、[4]の方法。[6]前記(1)の変換が、前記第1の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、[5]の方法。[7]前記(2)の変換が、配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を用いて行われる、[1]~[6]の方法。[8]前記(2)の変換が、前記第2の酵素を発現する第2の宿主細胞を用いて行われる、[7]の方法。[9]前記第2の宿主細胞が、前記第2の酵素を発現するよう改変された宿主細胞である、[8]に記載の方法。[10]前記第2の宿主細胞が微生物である、[8]又は[9]の方法。[11]前記微生物が細菌である、[10]の方法。[12]前記(2)の変換が、前記第2の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、[11]の方法。固定化菌体からなる群から選択される、[6]又は[12]の方法。[14]前記(2)の変換がpH8~9で行われる、[7]~[13]の方法。[15]グルコースから4-アミノ桂皮酸を製造する方法であって、(a)グルコースからフェニルアラニンを産生し、(b)前記(a)で得られたフェニルアラニンをニトロ化して4-ニトロフェニルアラニンに変換し、(c)[1]~[14]の方法により、前記(b)で得られた4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造することを含む方法。[16]フェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する方法であって、(b)フェニルアラニンをニトロ化して4-ニトロフェニルアラニンに変換し、(c)[1]~[14]の方法により、前記(b)で得られた4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造することを含む方法。[17]4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を用いることを含む方法。[18]4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を用いることを含む方法。[19]配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素をコードする核酸を担持するベクター。[20]配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素をコードする核酸を担持するベクター。[21]配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。[22]配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。[0012]本発明によれば、グルコースから4-アミノ桂皮酸を合成する新規な方法が提供される。図1は、大腸菌での組換産生後に精製したCamPAL、LiePAL、及びRgPALのフェニルアラニン(Phe)及び4-ニトロフェニルアラニン(n-Phe)に対する脱アンモニア酵素活性を示す表である。図2は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したCamPAL、LiePAL、及びRgPALによる4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。図3は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したCamPALによる4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換反応の結果を経時的に示すグラフである。図4は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したscFrm2、scHbn1、及びcdFLDZによる4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。図5は、各菌体量及び各基質量における4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換活性を示す表である。図6は、CamPAL産生大腸菌を1.2L培養後に反応器内での変換反応による4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換反応の結果を経時的に示したグラフである。図7は、精製した4-ニトロ桂皮酸のHPLC分析の結果を示すグラフである。図8は、CamPAL産生大腸菌の培養液にグルコース、フルクトース及びグルセロールを添加して4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸(4ACA)への変換を行った際の結果を示すグラフである。図9は、CamPAL産生大腸菌による4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。図10は、精製した4ACA塩酸塩と4ACA(標品)のHPLC分析の結果を示すグラフである。[0014]以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。[0015]なお、本明細書において「核酸」には、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又は何れの核酸の修飾体も含まれる。核酸には、一本鎖又は二本鎖の何れも含まれる。本発明に係る核酸(遺伝子)は、当業者に公知の公的機関のデータベース又は本明細書に開示する塩基配列に基づき作製したプライマー又はプローブ等を用いて、当業者に公知の任意の方法で調製することができる。各種のPCRその他の当業者に公知のDNA増幅技術を用いることにより、該遺伝子のcDNAとして容易に得ることができる。当業者であれば、本明細書中に開示する配列情報に基づいて、適宜既存技術を用いて、核酸を合成することができる。核酸(遺伝子)は、タンパク質又はポリペプチドをコードするものである。ここで、「コードする」とは、本発明に係るタンパク質又はポリペプチドをその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。「コードする」とは、本発明に係るタンパク質を連続する構造配列(エクソン)としてコードすることと、該タンパク質を適当な介在配列(イントロン)を介してコードすることの両者を含む。本発明の第一の要旨は、4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第一の方法」と略称する。本発明の第一の方法は、少なくとも(1)4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する工程、及び(2)4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する工程を含む。17[3]:109-113:以下文献B、参照)は、何れも公知である。[0018]そこで本発明者等は、出発原料として4-ニトロフェニルアラニンに着目し、まずこれを4-ニトロ桂皮酸に変換し、次いでこれを4-アミノ桂皮酸に変換することで、グルコースからフェニルアラニン→4-ニトロフェニルアラニン→4-ニトロ桂皮酸を介して4-アミノ桂皮酸を合成する新規な合成経路を確立できることに想到した。各種の方法を用いることができる。[0021]また、本発明者等は、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する方法の検討に際し、生物由来の広範な酵素を対象として、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する酵素(フェニルアラニンアンモニアリアーゼ)を探索した。glutinis)JN-1由来の酵素であるRgPALを選抜した。[0022]また、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する方法としては、公知の化学的方法によるニトロ基の還元反応を用いることができるが、本発明者等は更に、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する変換酵素(ニトロレダクターゼ)を探索した。coli)由来の酵素であるnfsA及びnfsBを選抜した。[0023]更に本発明者等は、これらの酵素を発現する宿主細胞を用いて、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に、次いで4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換することに成功し、本発明の第一の方法を完成させた。[0024]本発明の第一の方法を、前述した公知の方法である、グルコースの発酵によるフェニルアラニンの合成方法(前記文献A参照)、及び、フェニルアラニンのニトロ化による4-ニトロフェニルアラニンの合成方法(前記文献B参照)と組み合わせれば、グルコースからフェニルアラニン→4-ニトロフェニルアラニン→4-ニトロ桂皮酸を介する新規な合成経路により、4-アミノ桂皮酸を製造することが可能となる。後述の実施例に示すように、本発明の第一の方法を介するグルコースからの4-アミノ桂皮酸の合成は、本発明者等による従来法(特許文献2及び3)と比較して、反応速度や反応効率等の面で優れており、有利であると言える。[0025]以下、本発明の第一の方法について、詳細に説明する。[0026]2.出発物質:4-ニトロフェニルアラニン本発明の第一の方法では、出発原料として4-ニトロフェニルアラニンを用いる。4-ニトロフェニルアラニンの種類は制限されず、天然のものでも合成されたものでもよい。4-ニトロフェニルアラニンを合成する種々の手法については後述する。本発明の第一の方法では、まず工程(1)として、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸へと変換する。手法を用いることができる。中でも、本発明では4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸へと変換する酵素(ニトロフェニルアラニンアンモニアリアーゼ:以下適宜「第一の酵素」という。)を用いて、工程(1)を実施することが好ましい。glutinis)JN-1由来の酵素であるRgPALが挙げられる。CamPALタンパク質のアミノ酸配列を配列番号1に、これをコードするCamPAL遺伝子の塩基配列の例(大腸菌での発現用にコドンを補正したもの)を配列番号2にそれぞれ示す。LiePALタンパク質のアミノ酸配列を配列番号3に、これをコードするLiePAL遺伝子の塩基配列の例(大腸菌での発現用にコドンを補正したもの)を配列番号4にそれぞれ示す。RgPALタンパク質のアミノ酸配列を配列番号5に、これをコードするRgPAL遺伝子の塩基配列の例(大腸菌での発現用にコドンを補正したもの)を配列番号6にそれぞれ示す。lyase:PAL)の中から、本発明者等が探索して得られた酵素である。PALはフェニルアラニンを基質とし、これを脱アンモニアして桂皮酸を産生する酵素である。PALによるフェニルアラニンの脱アンモニアにより桂皮酸を産生する反応と、ここで目的とする4-ニトロフェニルアラニンの脱アンモニアにより4-ニトロ桂皮酸を産生する反応とは、類似するものの、後者では基質のベンゼン環の4位にあるニトロ基が存在する点で異なる。予想外にも、CamPAL、LiePAL、及びRgPALは、後述の実施例に示すように、優れた4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換活性を有し、本発明において好適に使用することができる。[0030]なお、前述のようにCamPAL、LiePAL、及びRgPALは公知の酵素であり、そのアミノ酸配列も公知であるが、これらがニトロ化合物を基質として利用でき、4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換活性を有とすることは、これまで知られておらず、本発明者等が初めて見出した知見である。[0031]前記第一の酵素の例としては、CamPAL、LiePAL、及びRgPALのみならず、それらの類似体であって、4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸へと変換する活性を維持するポリペプチドも挙げられる。CamPAL、LiePAL、又はRgPALの類似体としては、例えばそのホモログ(オルソログ及びパラログを含む)、又はそのフラグメントが挙げられる。[0032]具体的に、第一の酵素は、配列番号1、3、又は5のアミノ酸配列と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、又は少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%の配列相同性を有することが望ましい。第一の酵素は、配列番号1、3、又は5のアミノ酸配列と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、又は少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%の配列同一性を有することが望ましい。[0033]ここで、2つのアミノ酸配列の「相同性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一又は類似のアミノ酸残基が現れる比率であり、2つのアミノ酸配列の「同一性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。215(3):403-10)等を用いて求めることが可能である。[0034]また、前記第一の酵素は、配列番号1、3、又は5のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。本明細書において「アミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸が、そのポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく改変していることを指す。「数個」とは、通常2~50個、好ましくは2~20個、より好ましくは2~10個、更に好ましくは2~5個の変異(欠失、置換又は付加)が存在することを指す。[0035]また、前記第一の酵素は、配列番号1、3、又は5のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチドであってもよい。本明細書において「ストリンジェントな(stringent)条件」とは、核酸同士の選択的且つ検出可能な特異的結合を可能とする条件であり、塩濃度、溶媒(例えばホルムアミド等の有機溶媒)、温度、その他の公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。Laboratory等を参照のこと。具体的な「ストリンジェントな条件」の例としては、約40~45°C、最適には約42°Cで、5×SSPE、0.3%のSDS、200μg/mLの剪断変性サケ精子DNA中で、且つ、極めて低度及び低度のストリンジェンシーの場合は25%のホルムアミド、培地及び中度~高度のストリンジェンシーの場合は35%のホルムアミド、高度及び極めて高度のストリンジェンシーの場合は50%のホルムアミド中で、標準的なサザンブロッティング法に従って12~24時間のハイブリダイゼーションを行う。その後、最終的には担体材料を2×SSC、0.2%のSDS中で、45°C(極めて低度のストリンジェンシー)、50°C(低度のストリンジェンシー)、55°C(中度のストリンジェンシー)、60°C(中度~高度のストリンジェンシー)、65°C(高度のストリンジェンシー)、又は70°C(極めて高度のストリンジェンシー)で、15分間ずつ三回洗浄する。ハイブリダイゼーションは、当業界で公知の方法やそれに準じる方法に従って行なうことができる。市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。[0036]前記第一の酵素を調製する方法は制限されない。前記の第一の酵素を産出する生物から目的の酵素を抽出して用いてもよい。当業者に公知の公的機関のデータベースに登録されたCamPAL、LiePAL、又はRgPAL遺伝子の塩基配列や、本明細書に開示するCamPAL、LiePAL、又はRgPAL遺伝子の塩基配列(それぞれ配列番号2、4、及び6)を用いて、当業者に公知の各種の手法、例えば化学合成法や遺伝子工学的手法を用いて調製することができる。reaction:PCR)等の核酸増幅技術を用いることにより、CamPAL、LiePAL、又はRgPAL遺伝子をコードする核酸を調製した上で、これらを当業者に公知の手法でプラスミドやウイルス等の各種のベクターに組み込み、適切な宿主細胞に遺伝子組換えにより導入して発現させることにより、CamPAL、LiePAL、又はRgPALを調製することが可能である。宿主細胞としては、原核細胞でも真核細胞でもよく、原核細胞の場合は真正細菌でも古細菌でもよく、真核細胞の場合は植物細胞でも動物細胞でも真菌細胞でも原生生物細胞でもよい。手法等を用いて変異を導入することにより、CamPAL、LiePAL、又はRgPALの類似体をコードする核酸を調製する。特定の位置に特定の変異を導入できることから有用である。して得られたCamPAL、LiePAL、又はRgPALの類似体をコードする核酸を、前述と同様に当業者に公知の手法でプラスミドやウイルス等の各種のベクターに組み込み、適切な宿主細胞に遺伝子組換えにより導入して発現させることにより、CamPAL、LiePAL、又はRgPALの類似体を調製することが可能である。1989等の記載を参照することができる。[0040]前記第一の酵素を用いて工程(1)を実施する手法は特に制限されない。第一の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で、4-ニトロフェニルアラニンに作用させ、4-ニトロ桂皮酸へと変換させればよい。4-ニトロフェニルアラニンとしては、4-ニトロフェニルアラニンを含む天然生成物や合成生成物等の組成物を精製せずそのまま用いてもよいが、斯かる組成物から当業者に公知の各種の手法で4-ニトロフェニルアラニンを精製して用いてもよい。[0041]前記第一の酵素を4-ニトロフェニルアラニンに作用させる手法の例としては、上記手順により調製された第一の酵素を単離・精製して用いてもよいが、前述の手順により第一の酵素を発現するように宿主細胞を改変して得られた遺伝子組換細胞(以下適宜「第一の細胞」という。)をそのまま用いてもよい。