本発明の目的は、インビトロにおいて、糸球体ポドサイトを誘導する方法を提供することである。具体的には、選択的なポドサイトの誘導を行うことによりポドサイトの構成比率が高い細胞集団を得ることができるポドサイドの製造方法を提供することである。本発明により、以下の工程:工程A:ネフロン前駆細胞又はその集団を、Wntアゴニスト及びROCK阻害物質を含む培地で培養する工程、工程B:工程Aで得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程、及び、工程C:工程Bで得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程(ここで、工程B又は工程Cにおける培地の少なくとも一つは、TGFβシグナル経路阻害物質を含む)、を含むポドサイトを分化誘導する方法が提供された。工程C:工程Bで得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程、を含む方法、ここで、工程B又は工程Cにおける培地の少なくとも一つは、TGFβシグナル経路阻害物質を含む。[請求項2]工程Aで用いる培地のWntアゴニストの濃度が、1μMより多くかつ10μMより少ない、請求項1に記載の方法。[請求項3]前記工程B及び工程Cにおける培地が、さらに約1μM以下の濃度のWntアゴニストを含む請求項1又は2に記載の方法。[請求項4]前記工程Aにおける培養が、12時間~48時間であり、かつ前記工程Bにおける培養が12時間~48時間である、請求項1~3のいずれか一つに記載の方法。[請求項5]前記工程Cにおける培養が、2~30日である、請求項4に記載の方法。[請求項6]前記WntアゴニストがCHIR99021であり、前記TGFβシグナル経路阻害物質がSB431542である、請求項1~5のいずれか一つに記載の方法。[請求項7]前記ネフロン前駆細胞が哺乳動物由来のiPS細胞から誘導されたネフロン前駆細胞である、請求項1~6のいずれか一つに記載の方法。[請求項8]前記iPS細胞が、ヒト由来のiPS細胞である請求項7に記載の方法。[請求項9]前記工程B及び/又は工程Cにおける培地が、さらに、Wntシグナル阻害物質を含む、請求項7又は8に記載の方法。[請求項10]前記工程B及び/又は工程Cにおける培地が、さらに、レチノイン酸(RA)又はRAアナログを含む、請求項7~9のいずれか一つに記載の方法。[請求項11]前記ネフロン前駆細胞が、以下の工程:(a)ヒトiPS細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、(b)前記胚様体を、Bmp、アクチビン、レチノイン酸、及び中濃度(濃度B)のWntアゴニスト、を含有する培地で培養する工程、及び(c)前記胚様体を、Fgf、及び低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、をその順で含む分化誘導工程(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)、によりヒトiPS細胞から誘導される、請求項7~10のいずれか一つに記載の方法。[請求項12]前記工程(a)、(b)及び(c)におけるWntアゴニストがCHIR99021であって、前記濃度A及び濃度Cが、それぞれ、7.5μM~15μM、0.5μM~2.0μMであり、かつ、前記工程(b)におけるBmpがBmp4であって、培地における濃度が1ng/ml~10ng/mlであり、かつ、前記工程(b)の培地におけるアクチビンの濃度が、2.5~40ng/mLの濃度である、請求項11に記載の方法。以下に記載のそれぞれの成分を含む3つの容器を含む培地キット、(1)Wntアゴニスト及びROCK阻害物質を含む第一の容器、(2)TGFβシグナル経路阻害物質、Wntシグナル阻害物質、レチノイン酸(RA)又はRAアナログ、及びFgfを含む第二の容器、及び(3)TGFβシグナル経路阻害物質、Wntシグナル阻害物質、レチノイン酸(RA)又はRAアナログ、及びFgfを含む第三の容器。[請求項14]前記容器(2)及び(3)が、さらに、Wntアゴニスト、を含む請求項13に記載の培地キット。[請求項15]ポドサイトの細胞集団を製造する方法であって、以下の工程:(i)哺乳動物由来のiPS細胞又はその集団からネフロン前駆細胞又はその集団を分化誘導する工程、(ii)工程(i)で得られたネフロン前駆細胞又はその集団を、Wntアゴニスト及びROCK阻害物質、を含む培地で培養する工程、(iii)工程(ii)で得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程、及び、(iv)工程(iii)で得られた細胞又はその集団を、Fgfを含む培地で培養する工程、を含む方法、ここで、工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはTGFβシグナル経路阻害物質含み、工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはWntシグナル阻害物質を含み、かつ工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはレチノイン酸(RA)又はRAアナログを含む。[請求項16]前記工程(ii)で用いる培地のWntアゴニストの濃度が、1μMより多くかつ10μMより少ない、請求項15に記載の方法。[請求項17]前記工程(iii)及び(iv)における培地が、さらに約1μM以下の濃度のWntアゴニストを含む請求項15又は16に記載の方法。[請求項18]前記iPS細胞が、ヒト由来のiPS細胞である請求項15~17のいずれか一つに記載の方法。[請求項19]前記工程(ii)における培養が、12時間~48時間であり、かつ前記工程(iii)における培養が12時間~48時間である、請求項15~18のいずれか一つに記載の方法。[請求項20]前記工程(iv)における培養が、2~30日である、請求項17に記載の方法。[請求項21]前記WntアゴニストがCHIR99021であり、前記TGFβシグナル経路阻害物質がSB431542であり、前記Wntシグナル阻害物質がIWR-1である、請求項15~18のいずれか一つに記載の方法。[請求項22]前記工程(i)が、以下の工程:(a)ヒトiPS細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、(b)前記胚様体を、Bmp、アクチビン、レチノイン酸、及び中濃度(濃度B)のWntアゴニスト、を含有する培地で培養する工程、及び(c)前記胚様体を、Fgf、及び低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、をその順で含む分化誘導工程(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)、である、請求項15~21のいずれか一つに記載の方法。[請求項23]前記工程(a)、(b)及び(c)におけるWntアゴニストがCHIR99021であって、前記濃度A及び濃度Cが、それぞれ、7.5μM~15μM、0.5μM~2.0μMであり、かつ、前記工程(b)におけるBmpがBmp4であって、培地における濃度が1ng/ml~10ng/mlであり、かつ、前記工程(b)の培地におけるアクチビンの濃度が、2.5ng/mL~40ng/mLの濃度である、請求項20に記載の方法。アルブミン取り込み能、アルブミンろ過能、オートファジー活性及び細胞内伝達シグナルからなる群から選ばれる少なくとも一つの項目を測定し、該試験物質のポドサイトに対する影響を評価することを含む方法。[請求項25]ポドサイト障害を治療又は回復させる物質をスクリーニングする方法であって、(x)請求項1~12、15~23のいずれか一つに記載の方法で作製したポドサイトの細胞集団を、ポドサイト障害性を示す薬剤及び試験物質の存在下で培養する工程と、(y)ポドサイト細胞の生存、増殖、障害の軽減、タンパク質発現量の変化、及び遺伝子発現量の変化からなる群から選ばれる少なくとも一つの項目を測定する工程、とを含むポドサイト障害を治療又は回復させる候補物質をスクリーニングする方法、ここで、工程(x)におけるポドサイト細胞集団の培養は、以下のいずれでもよい:(x-1)ポドサイト障害性を示す薬剤及び試験物質が同時に存在する環境下でポドサイト細胞集団を培養する、又は(x-1)ポドサイト障害性を示す薬剤の存在下でポドサイト細胞集団を培養し、次いで、試験物質の存在下で該障害ポドサイト細胞集団を培養する。[0001]本発明は、ネフロン前駆体細胞から糸球体ポドサイトを選択的に誘導する方法に関する。本発明はまた、該誘導方法を用いて多能性幹細胞から糸球体ポドサイトを製造する方法に関する。[0002]腎臓の糸球体に存在するポドサイトは、血液の濾過において重要な役割を担っている。ポドサイトが障害されると蛋白尿を呈し、やがて末期腎不全へと進行し透析治療を要することから、ポドサイト研究は医療経済学的にも重要な研究テーマである。[0003]ポドサイト研究において、インビトロ解析にはヒトポドサイトの不死化細胞株が用いられてきた(非特許文献1)。この細胞株はポドサイトに特徴的な遺伝子や蛋白の発現レベルが極めて低く、研究の遂行にあたって不十分な素材であることが問題であった(非特許文献2)。過去にヒトiPS細胞から選択的にポドサイトを誘導したとする報告があるが、ポドサイト特異的な遺伝子であるはずのNPHS1の発現レベルは誘導前のヒトiPS細胞に比べて1/5から1/10ほどの極めて低い発現に留まっている(非特許文献3~5;特許文献1)。よって、これらの報告で誘導された細胞は、ポドサイトと称するのには不十分な品質であると考えられる。[0004]本発明者らによる報告を含め、近年、ヒトiPS細胞からネフロン前駆細胞を誘導し、ポドサイトや尿細管細胞を含有する腎オルガノイドを試験管内で作成する研究が複数報告されている(非特許文献6~9;特許文献2)。腎オルガノイドは多数の細胞種を含む集団であるが、ポドサイト障害モデル実験や尿蛋白を軽減するための治療薬開発のための薬剤スクリーニングのためには、より純化したポドサイトを用いた細胞自律的な(cell-autonomous)な効果の検証が必要とされている。そこで、効率的に高純度のポドサイトからなる細胞集団を分化誘導又は製造する方法が求められている。[0007]本発明は、糸球体ポドサイトを誘導する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、選択的なポドサイトの誘導を行うことによりポドサイトの構成比率が高い細胞集団を得ることができるポドサイトの製造方法を提供することを目的とする。(3)ネフロン分画形成期(以下、ポドサイト形成期という場合もある)という3つの段階に分け、ポドサイトへの誘導に必要なシグナルを検討した結果、特定のシグナルの時期特異的な調整が重要であることを明らかにし、本発明を完成した。本発明は、以下の態様を含むものである。aggregate:PV)」と称する。vesicle:RV)」と称する。工程C:工程Bで得られた細胞又はその集団を、Fgf(好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9)を含む培地で培養する工程(ここで得られる細胞又は細胞集団を「ポドサイト(podocyte)」と称する。)、を含む方法、ここで、工程B又は工程Cにおける培地の少なくとも一つは、TGFβシグナル経路阻害物質(好ましくは、SB431542)を含む。[2]工程Aで用いる培地のWntアゴニストの濃度が、1μMより多くかつ10μMより少ない(好ましくは、約2μM~約8μM、より好ましくは、約3μM~約5μMである)、上記[1]に記載の方法。[3]前記工程B及びCにおける培地が、さらに約1μM以下(好ましくは約0.5μM)の濃度のWntアゴニスト(好ましくは、GSK-3β阻害物質、より好ましくはCHIR99021)を含む上記[1]又は[2]に記載の方法。[4]前記工程Aにおける培養が、12時間~48時間(好ましくは18時間~30時間、より好ましくは21~27時間、さらに好ましくは約24時間)であり、かつ前記工程Bにおける培養が12時間~48時間(好ましくは18時間~30時間、より好ましくは21~27時間、さらに好ましくは約24時間)である、上記[1]~[3]のいずれか一つに記載の方法。[5]前記工程Cにおける培養が、2~30日(好ましくは約3~約15日、より好ましくは4日~10日)である、上記[4]に記載の方法。[6]前記WntアゴニストがCHIR99021であり、前記TGFβシグナル経路阻害物質がSB431542である、上記[1]~[5]のいずれか一つに記載の方法。[7]前記ネフロン前駆細胞が哺乳動物由来のiPS細胞から誘導されたネフロン前駆細胞である、上記[1]~[6]のいずれか一つに記載の方法。[8]前記iPS細胞が、ヒト由来のiPS細胞である上記[7]に記載の方法。[9]前記工程B及び/又は工程Cにおける培地が、さらに、Wntシグナル阻害物質(好ましくはIWR-1)を含む、上記[7]又は[8]に記載の方法。[10]前記工程B及び/又は工程Cにおける培地が、さらに、レチノイン酸(RA)又はRAアナログを含む、上記[7]~[9]のいずれか一つに記載の方法。[11]前記ネフロン前駆細胞が、以下の工程:(a)ヒトiPS細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニスト(好ましくは、CHIR99021)を含有する培地で培養する工程、(b)前記胚様体を、Bmp(好ましくは、Bmp2、Bmp4又はBmp7、より好ましくはBmp4)、アクチビン、レチノイン酸、及び中濃度(濃度B)のWntアゴニスト、を含有する培地で培養する工程、及び(c)前記胚様体を、Fgf(好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9)、及び低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、をその順で含む分化誘導工程(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)、によりヒトiPS細胞から誘導される、上記[7]~[10]のいずれか一つに記載の方法。[12]前記工程(a)、(b)及び(c)におけるWntアゴニストがCHIR99021であって、前記濃度A及び濃度Cが、それぞれ、7.5μM~15μM、0.5μM~2.0μMであり、かつ、前記工程(b)におけるBmpがBmp4であって、培地における濃度が1ng/mL~10ng/mLであり、かつ、前記工程(b)の培地におけるアクチビンの濃度が、2.5ng/mL~40ng/mLの濃度である、上記[11]に記載の方法。以下に記載のそれぞれの成分を含む3つの容器を含む培地キット、(1)Wntアゴニスト(好ましくは、GSK-3β阻害物質、より好ましくはCHIR99021)及びROCK阻害物質(好ましくはY27632)を含む第一の容器、(2)TGFβシグナル経路阻害物質(好ましくは、SB431542)、Wntシグナル阻害物質(好ましくはIWR-1)、レチノイン酸(RA)又はRAアナログ、及びFgf(好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9)を含む第二の容器、及び(3)TGFβシグナル経路阻害物質(好ましくは、SB431542)、Wntシグナル阻害物質(好ましくはIWR-1)、レチノイン酸(RA)又はRAアナログ、及びFgf(好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9)を含む第三の容器。[14]前記容器(2)及び(3)が、さらに、Wntアゴニスト(好ましくは、GSK-3β阻害物質、より好ましくはCHIR99021)、を含む、上記[13]に記載の培地キット。aggregate:PA)」と称する。vesicle:RV)」と称する。)、及び、(iv)工程(iii)で得られた細胞又はその集団を、Fgf(好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9)を含む培地で培養する工程(ここで得られる細胞又は細胞集団を、「ポドサイト(podocyte)」と称する。)、を含む方法、ここで、工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはTGFβシグナル経路阻害物質(好ましくは、SB431542)含み、工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはWntシグナル阻害物質(好ましくはIWR-1)を含み、かつ工程(iii)又は工程(iv)における培地の少なくとも一つはレチノイン酸(RA)又はRAアナログを含む。[16]前記工程(ii)で用いる培地のWntアゴニストの濃度が、1μMより多くかつ10μMより少ない(好ましくは、約2μM~約8μM、より好ましくは、約3μM~約5μMである)、上記[15]に記載の方法。[17]前記工程(iii)及び(iv)における培地が、さらに約1μM以下(好ましくは約0.5μM)の濃度のWntアゴニスト(好ましくは、GSK-3β阻害物質、より好ましくはCHIR99021)を含む上記[15]又は[16]に記載の方法。[18]前記iPS細胞が、ヒト由来のiPS細胞である上記[15]~[17]のいずれか一つに記載の方法。[19]前記工程(ii)における培養が、12時間~48時間(好ましくは18時間~30時間、より好ましくは21~27時間、さらに好ましくは約24時間)であり、かつ前記工程(ii)における培養が12時間~48時間(好ましくは18時間~30時間、より好ましくは21~27時間、さらに好ましくは約24時間)である、上記[15]~[18]のいずれか一つに記載の方法。[20]前記工程(iv)における培養が、2~30日(好ましくは約3~約15日、より好ましくは4日~9日)である、上記[17]に記載の方法。[21]前記WntアゴニストがCHIR99021であり、前記TGFβシグナル経路阻害物質がSB431542であり、前記Wntシグナル阻害物質がIWR-1である、上記[15]~[18]のいずれか一つに記載の方法。[22]前記工程(i)が、以下の工程:(a)ヒトiPS細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニスト(好ましくは、CHIR99021)を含有する培地で培養する工程、(b)前記胚様体を、Bmp(好ましくは、Bmp2、Bmp4又はBmp7、より好ましくはBmp4)、アクチビン、レチノイン酸、及び中濃度(濃度B)のWntアゴニスト、を含有する培地で培養する工程、及び(c)前記胚様体を、Fgf(好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9)、及び低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、をその順で含む分化誘導工程(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)、である、上記[15]~[21]のいずれか一つに記載の方法。[23]前記工程(a)、(b)及び(c)におけるWntアゴニストがCHIR99021であって、前記濃度A及び濃度Cが、それぞれ、7.5μM~15μM、0.5μM~2.0μMであり、かつ、前記工程(b)におけるBmpがBmp4であって、培地における濃度が1ng/mL~10ng/mLであり、かつ、前記工程(b)の培地におけるアクチビンの濃度が、2.5ng/mL~40ng/mLの濃度である、上記[20]に記載の方法。アルブミン取り込み能、アルブミンろ過能、オートファジー活性及び細胞内伝達シグナルからなる群から選ばれる少なくとも一つの項目を測定し、該試験物質のポドサイトに対する影響を評価することを含む方法。[25]ポドサイト障害を治療又は回復させる物質をスクリーニングする方法であって、(x)上記[1]~[12]、[15]~[23]のいずれか一つに記載の方法で作製したポドサイトの細胞集団を、ポドサイト障害性を示す薬剤及び試験物質の存在下で培養する工程と、(y)ポドサイト細胞の生存、増殖又は障害の軽減、タンパク質発現量の変化、及び遺伝子発現量の変化からなる群から選ばれる少なくとも一つの項目を測定する工程、とを含むポドサイト障害を治療又は回復させる候補物質をスクリーニングする方法、ここで、工程(x)におけるポドサイト細胞集団の培養は、以下のいずれでもよい:(x-1)ポドサイト障害性を示す薬剤及び試験物質が同時に存在する環境下でポドサイト細胞集団を培養する、又は(x-1)ポドサイト障害性を示す薬剤の存在下でポドサイト細胞集団を培養し、次いで、試験物質の存在下で該障害ポドサイト細胞集団を培養する。[26]前記ポドサイト障害性を示す薬剤が、ピューロマイシンアミノヌクレオシド、ドキソルビシン、アンジオテンシンII、及び抗ポドサイト抗体からなる群より選ばれる少なくとも一つの薬剤である上記[25]に記載のスクリーニング方法。[0012][27]腎臓及び/又は糸球体の疾患を治療又は予防する方法であって、(I)上記[1]~[12]、[15]~[23]のいずれか一つに記載の方法で作製したポドサイトの細胞集団を、該疾患に罹患する対象の腎臓組織の一部に移植すること(ここで、該ポドサイトの細胞集団は、場合により、間質細胞及び/又は血管内皮細胞及び/又は細胞の足場とともに移植される)、及び(II)該移植したポドサイトの細胞集団中の少なくとも一部の細胞が、該腎組織の少なくとも一部の糸球体内へと移動してそこにとどまり、それにより、腎臓組織を再生して腎臓及び/又は糸球体の疾患を治療すること、を含む方法。それらの組合せ、或いはそれらの疾患の合併症である上記[27]に記載の方法。[29]前記ポドサイトの細胞集団が、ヒトiPS細胞又はその集団から分化誘導された腎オルガノイドの一部として移植される、上記[27]又は[28]に記載の方法。[0013]本発明により、効率良く、ネフロン前駆細胞から糸球体ポドサイトを誘導することができる。本発明のポドサイトの誘導のプロトコルの概略の一例を示した図である。上図(a)は、マウスのネフロン前駆細胞を用いてポドサイトを誘導する方法の一例を、下図(b)は、ヒトiPS細胞から誘導したネフロン前駆細胞を用いてポドサイトを誘導する方法の一例を示している。CHIR:CHIR99021;Y:Y27632;SB:SB431542;F:Fgf9;RA:レチノイン酸。Six2-GFP陰性細胞、Six2-GFP陽性ネフロン前駆細胞(NPCs)、及び抗体で選別したネフロン前駆細胞(NPCs)のそれぞれの細胞の遺伝子発現を示した図である。実施例1で調製したネフロン前駆細胞(NPCs)を用いて、Wntアゴニスト(CHIR99021)の影響を確認する実験の概要を示した図である。実施例1で調製したネフロン前駆細胞(NPCs)を用いたポドサイトの誘導において、それぞれの濃度及び時間にて、Wntアゴニスト(CHIR99021)を処理した結果を示した図である。6日目における顕微鏡写真である。ネフロン前駆細胞(NPCs)を用いたポドサイトの誘導において、3μM又は5μMの濃度にて24時間又は48時間CHIR99021処理した場合のMafB-GFP陽性のポドサイトの存在を6日目に確認した結果である。上図は、可視光及び蛍光での観察結果を示す。下図は、その結果をグラフにしたものである。ネフロン前駆細胞を24時間CHIR99021処理した場合に、ネフロン前駆細胞(NPC)が腎上皮前駆凝集体(PA)、及び腎小体(RV)へと分化していることを、時系列(0時間、24時間、48時間)で確認した結果である。Cdh1の遺伝子発現を確認した結果を示す。腎上皮前駆凝集体(PA)から腎小体(RV)への分化誘導過程における、成長因子又は阻害剤の影響を、顕微鏡観察で確認した結果である。A、RA及びBMS493である。上段は可視光による細胞の成長を観察した結果、下段は、蛍光によりMafB-GFP陽性細胞を観察した結果である。腎上皮前駆凝集体(PA)から腎小体(RV)への分化誘導過程における、成長因子又は阻害剤の影響を確認した結果である。MafB-GFP陽性細胞の割合(a)及びポドサイトの数(b)を示す。腎小体(RV)ステージ(48時間)における、SB431542処理による遺伝子発現を検討した結果である。SB431542処理によるWt1陽性近位腎小体(RV)細胞の比率と数を確認した結果である。近位化腎小体(RV)誘導後のSTEP3における、ポドサイト系譜への分化に対する各因子(CHIR99021(2μM)、IWR-1、アクチビン、SB431542、レチノイン酸(RA)、及びBMS493の影響を確認した結果である。a:上段は可視光による細胞の成長を観察した結果、下段は、蛍光によりMafB-GFP陽性細胞を観察した結果である。b:細胞集団におけるMafB-GFP陽性細胞(ポドサイト)の割合を示す。近位化腎小体(RV)誘導後のSTEP3における、各ネフロン(ポドサイト、PT、及びDT)の細胞数に対するSB431542の効果を確認した結果である。本発明の方法を用いて作製したポドサイトにおける、ポドサイト特異的タンパク質の発現と、その他の尿細管マーカーの発現を確認した結果である。マウスNPCsで確立した3段階の段階的なポドサイト分化誘導方法をヒトiPS細胞(hiPS)に適用した場合の一例の概略図である。ヒトiPS細胞(hiPS)から誘導したネフロン前駆細胞(NPCs)を用いたポドサイトの誘導において、STEP1におけるWntアゴニスト(CHIR99021)の影響を確認した結果を示した図である。ヒトiPS細胞(hiPS)から誘導したネフロン前駆細胞(NPCs)を用いたポドサイトの誘導において、STEP2における各種因子の添加の影響を確認した結果を示した図である。ヒトiPS細胞(hiPS)から誘導したネフロン前駆細胞(NPCs)を用いたポドサイトの誘導において、STEP3における各種因子の添加の影響を確認した結果を示した図である。本発明の方法を用いて誘導したポドサイトと、腎オルガノイドのポドサイトを、比較した結果である。左図は割合を、右図はポドサイト数を比較した図である。誘導ポドサイト、ヒト成体腎臓由来ポドサイト、ヒトiPS細胞、及び不死化ポドサイト細胞株における、ポドサイト特異的遺伝子の発現を比較した図である。誘導ポドサイトにおける、WT1、NEPHERIN、NEPH1、及びPODOCINの発現部位を示す図である。誘導ポドサイトを透過型電子顕微鏡で観察した写真である。左図の矢印は、基底外側領域に存在する足突起を示している。右図の矢印は、ポドサイト間に存在するスリット膜様構造(フィラメント状の架橋)を示している。誘導ポドサイトを透過型電子顕微鏡で観察した他の写真である。矢印は、NEPHRIN分子を示している。誘導ポドサイトのタンパク質発現をウエスタンブロットで解析した結果である。誘導ポドサイトをピューロマイシンアミノヌクレオシド(PAN)で処理した場合の生存率を示している。誘導ポドサイトをピューロマイシンアミノヌクレオシド(PAN)で処理した場合のタンパク質発現をウエスタンブロットで解析した結果である。[0015]以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明するが、本発明は以下に記載の態様に限定されるものではない。文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。[0016]本明細書中で、「X~Y」という表現を用いた場合は、下限としてXを上限としてYを含む意味で、或いは上限としてXを下限としてYを含む意味で用いる。本明細書において「及び/又は」は、いずれか一方、あるいは、両方を包含する意味で使用される。本明細書において「約」とは、±10%を許容する意味で用いる。[0017]腎臓は、糸球体ポドサイト及び尿細管の前駆体であるネフロン前駆細胞(NPCs)、集合管および尿管の前駆体である尿管芽、および間質細胞の3者による相互作用により発生する。ネフロン前駆細胞は、間葉上皮転換(MET)を経て、ポドサイト、近位尿細管(PT)、及び遠位尿細管(DT)を含む上皮ネフロン構造へと発達する。ネフロン前駆細胞は、尿管芽からのWntシグナルによって、腎前駆凝集体(PA)を形成し、その後近位遠位の極性を持った腎小体(RV)へと分化する。腎小体(RV)は、近位遠位軸に沿って伸長し、S字体を経て、ネフロン上皮へと分化する。ポドサイトの前駆細胞は、腎小体(RV)のWT1陽性近位ドメイン、およびS字体のWt1陽性近位端ドメインに存在し、最終的にはMafB陽性/Nephrin陽性の成熟したポドサイトへと分化する。おいて、Wnt及びNotchシグナルが何らかの役割を果たしていることは示唆されていたが、ネフロン分画形成、特にポドサイトの分化にどのようなシグナルが関わっているかは不明であった。[0018]本発明者らは、ポドサイトの誘導に関する従来の報告における誘導法では、ネフロン全分画への分化能を有するネフロン前駆細胞を経由しておらず、またネフロン前駆細胞からポドサイトへの分化過程に沿った段階的な検討ができていないことに着目した。重要なことは、これらの誘導法によって作られた細胞は、どの程度本物のポドサイトに近いものなのかという検証がなされておらず、誘導法の妥当性や正当性が保証されていないことにあった。vesicle(RV)形成期、(3)ネフロン分画形成期という3つの段階に分けて、ポドサイトへの誘導に必要なシグナルを検討し、CHIR99021、SB431542、IWR-1、レチノイン酸、Fgf9の時期特異的な調整が重要であることを明らかにした。5倍の高さでNPHS1(Nephrin)を発現しており、その他のポドサイト関連蛋白においてもiPS細胞や不死化細胞株と比べて極めて高い発現レベルを示していた。発明者らは、ヒト成体腎臓からポドサイトを分取し、誘導ポドサイトと本物のポドサイトを比較した検証を行い、誘導ポドサイトが、NPHS1やNPHS2(Podocin)といったポドサイト関連蛋白を生体内のポドサイトとほぼ同程度のレベルで発現していることを確認した。本発明による誘導ポドサイトは、遺伝子発現レベルにおいて生体内の本物のポドサイトとほぼ同程度の品質を示しており、このことは本発明の誘導法の妥当性を証明している。[0020]本発明の一つ態様は、ネフロン前駆細胞からポドサイトを誘導する方法であって、3つの工程、すなわち、ネフロン前駆細胞から腎上皮前駆凝集体(PA)への誘導、PAから腎小体(RV)への誘導、RVからポドサイトへの誘導を含む方法である。本発明の別の一つの態様は、上記3つの工程を用いて、ネフロン前駆細胞から糸球体ポドサイトを選択的に誘導する方法である。本発明の他の一つの態様は、上記3つの工程を用いて、ネフロン前駆細胞から糸球体ポドサイトを製造する方法である。本発明の他の別の一つの態様は、哺乳動物由来のiPS細胞(好ましくは、ヒトiPS細胞)からポドサイトを製造する方法であって、iPS細胞からネフロン前駆細胞を誘導する工程と、上記3つの工程を含むネフロン前駆細胞からポドサイトを誘導する工程を組み合わせてなるポドサイトの製造方法である。本発明の一つの態様は、ネフロン前駆細胞からポドサイトを分化誘導するための培地キットであって、上記3つの工程において用いる各種物質をそれぞれ含んだ容器、及び培地を含むキットである。別の本発明の一つの態様は、上記の何れかの方法により誘導したポドサイトを用いた、ポドサイトの実験モデルの提供である。別の本発明の一つの態様は、上記の何れかの方法により誘導したポドサイトを用いた、ポドサイトに対する細胞毒性を有する物質の評価方法である。他の本発明の一つの態様は、上記の何れかの方法により誘導したポドサイトを用いた、ポドサイト障害又はそれに関連する疾患を改善又は治療する物質のスクリーニング方法である。別の他の本発明の一つの態様は、上記の何れかの方法によって誘導されたポドサイトを腎臓及び/又は糸球体の疾患に罹患する対象に移植することを含む、腎臓及び/又は糸球体の疾患の治療又は予防方法である。[0021]以下、本発明の詳細を説明する。図1に、本発明のネフロン前駆細胞(NPCs)からの糸球体ポドサイトの誘導のプロトコルの概略を示してある。上図はマウス由来のNPCsからの誘導を、下図はヒト由来のNPCsからの誘導を示している。いずれにおいても、3段階の工程を経て、NPCsからポドサイトが誘導される。本発明の方法で用いるネフロン前駆細胞は、生体から調製したもの、多能性幹細胞から誘導したもののいずれを用いることもできるが、好ましくは、多能性幹細胞から誘導したものである。好ましくは、多能性幹細胞であるiPS細胞から誘導したネフロン前駆細胞である。本発明で用いるネフロン前駆細胞は、iPS細胞から誘導したネフロン前駆細胞を特定の条件で形質を維持しながら培養したもの或いは冷凍保存したものであってもよい。多能性幹細胞からのネフロン前駆細胞の誘導は、公知の方法を参考にして行うことができる。本発明者らによる報告(非特許文献6;特許文献2)を参考にして調製できる。これらの文献は、引用することにより本明細書の一部である。これに限定されないが、例えば、以下の工程をあげることができる。(a)多能性幹細胞から誘導された胚様体を、高濃度(濃度A)のWntアゴニスト(好ましくは、CHIR99021)を含有する培地で培養する工程、(b)前記胚様体を、Bmp(好ましくは、Bmp2、Bmp4又はBmp7、より好ましくはBmp4)、アクチビン、レチノイン酸、及び中濃度(濃度B)のWntアゴニスト、を含有する培地で培養する工程、及び(c)前記胚様体を、Fgf(好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9)、及び低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、をその順で含む分化誘導工程(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)により、ネフロン前駆細胞を作製できる。上記工程(a)に用いる胚様体は、多能性幹細胞(例えば、ES細胞やiPS細胞)を、任意の培地、好ましくは無血清培地で培養することにより調製できる。ヒト多能性幹細胞を用いる場合は、これに限定されないが、好ましくはヒトiPS細胞を、Bmp4およびRock阻害剤(Y27632)で(必要に応じてさらにFgfを加えて)処理した細胞を用いて胚様体が調製され、さらに好ましくは、次いで、アクチビンおよびFgfで処理された胚様体が用いられる。培地中のBmp4の濃度は、例えば、0.3~5ng/mL、好ましくは0.5~2ng/mLをあげることができ、培地中のRock阻害剤(Y27632)の濃度は、例えば、1~100ng/mL、好ましくは5~20ng/mLをあげることができ、培地中のFgfの濃度は、例えば、0~20ng/mL、をあげることができ、培地中のアクチビンの濃度は、例えば、0.1~5ng/mL、好ましくは0.5~1ng/mLをあげることができる。Bmp4およびRock阻害剤(Y27632)、Fgfでの処理は、例えば、1~2日、好ましくは1日行い、アクチビンおよびFgfの処理は、例えば、1~4日、好ましくは2日行うことができる。(2008);WO2007/069666)。再プログラム化因子は、ES細胞で特異的に発現される遺伝子、その遺伝子産物若しくはその非コードRNA、ES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物若しくはその非コードRNA、又は低分子量化合物で構成されてもよい。再プログラム化因子に含まれる遺伝子の例としては、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-MYC、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等が挙げられる。これらの再プログラム化因子は、単独で、あるいは組み合わせて使用してもよい。再プログラミング因子としてc-MYCの遺伝子を体細胞に導入して用いる場合は、iPS細胞の作成後に、導入したc-MYC遺伝子が標的細胞の染色体に組み込まれる可能性が低い導入方法を用いるのが好ましく、例えば、これに限定されないが、センダイウイルスベクターやエピゾーマルベクターを用いた導入をあげることができる。[0025]上記工程(a)、(b)及び(c)において、それぞれの工程において用いる培地が含有するWntアゴニストの濃度A、B及びCが、特定の関係にあることが重要である。各工程で用いる培地のWntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cでありかつ濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍であるが、好ましくは、濃度Aは濃度Bの少なくとも2倍でありかつ濃度Bは濃度Cの少なくとも2倍であり、さらに好ましくは、濃度Aは濃度Bの少なくとも3倍であり、かつ濃度Bは濃度Cの少なくとも3倍である。工程(c)におけるWntアゴニストの濃度Cは、分化誘導が起こる限り特に制限がなく、また、用いるWntアゴニストによって適宜選択されるが、例えばCHIR99021を用いた場合、0.1~3.0μM、好ましくは、0.5~2.0μMをあげることができる。CHIR99021を用いた場合、これに限定されないが、工程(a)、(b)及び(c)におけるWntアゴニストの濃度A、BおよびCの組み合わせとして、濃度Aは、6~20μM、好ましくは7.5~15μM、より好ましくは約10μMから選ばれ、濃度Bは、2~6μM、好ましくは2~4.5μM、より好ましくは約3μMから選ばれ、濃度Cは、0.5~2μM、好ましくは0.7~1.5μM、より好ましくは約1μMから選ばれる組合せをあげることができる。用いるWntアゴニストは、下記で説明する本発明の方法において用いることができるWntアゴニスを用いることができる。[0026]工程(b)において用いるBmpは、上記したBmpのいずれを用いることもでき、各Bmp化合物の使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できる。Bmp4を用いる場合は、いずれの起源のBmp4を用いることができるが好ましくはヒトBmp4であり、培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、0.1~30ng/mL、好ましくは1~10ng/mLをあげることができる。他のBmp化合物を用いる場合は、Bmp4を用いた場合に得られる効果と同様の効果を発揮できる濃度を適宜選択することができる。[0027]工程(b)において用いるアクチビンは、いずれの起源のアクチビンを用いることができるが好ましくはヒトアクチビンAである。培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、2.5~40ng/mL、好ましくは7.5~15ng/mLをあげることができる。工程(b)において用いるレチノイン酸の培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、0.001~1μM、好ましくは0.01~0.3μMをあげることができる。[0028]工程(c)において用いるFgfは、上記したFgfのいずれを用いることもでき、各Fgf化合物の使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できる。Fgf9を用いる場合は、いずれの起源のFgf9を用いることができるが好ましくはヒトFgf9である。培地中の濃度は、分化誘導の効果が得られる限り特に制限がないが、例えば、1~25ng/mL、好ましくは2.5~10ng/mLをあげることができる。他のFgf化合物を用いる場合は、Fgf9を用いた場合に得られる効果と同様の効果を発揮できる濃度を適宜選択することができる。[0029]上記行程(a)~(c)における好ましい組合せは、Wntアゴニストは、CHIR99021であって、前記濃度A及び濃度Cが、それぞれ、7.5μM~15μM、0.5μM~2.0μMであり、かつ、前記工程(b)におけるBmpがBmp4であって培地における濃度が、1ng/mL~10ng/mLであり、かつ、前記工程(b)の培地におけるアクチビンの濃度が、2.5~40ng/mLの濃度である、ネフロン前駆細胞の誘導方法である。[0030]誘導多能性幹(iPS)細胞は、哺乳類動物由来であればよく、哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル又はヒト等をあげることができ、好ましくは、マウス又はヒトである。[0031]生体から調製した又は哺乳類の多能性幹細胞から誘導したネフロン前駆細胞は、場合により、さらに細胞の選別工程に付すこともできる。これに限定されないが、例えば、ITGA8、ROBO2、PDGFRa、PDGFRb、CXCR4、NGFRからなる群より選ばれるマーカーの少なくとも一つ又はそれらの任意の組合せによりセルソーターを用いて選別を行うことができる。本発明のネフロン前駆細胞からのポドサイトの誘導は、3つの工程A~Cからなる。aggregate:PV)」と称する。vesicle:RV)」と称する。工程C:工程Bで得られた細胞又はその集団を、TGFβシグナル経路阻害物質(好ましくは、SB431542)及びFgf(好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9)を含む培地で培養する工程(ここで得られる細胞又は細胞集団を「ポドサイト(podocyte)」と称する。工程Bにおける培地がTGFβシグナル経路阻害物質を含む場合は工程Cにおける培地はTGFβシグナル経路阻害物質を含まなくてもよく、また、工程Cにおける培地がTGFβシグナル経路阻害物質を含む場合は工程Bにおける培地はTGFβシグナル経路阻害物質を含まなくてもよい。工程Aは、ネフロン前駆細胞又はその集団を、Wntアゴニスト及びROCK阻害物質(好ましくはY27632)を含む培地で培養する工程である。aggregate:PA)」と称する。Wntアゴニストは、細胞中でTCF/LEF介在性の転写を活性化する薬剤として定義される。従ってWntアゴニストは、Wntファミリータンパク質のありとあらゆるものを含むFrizzled受容体ファミリーメンバーに結合し、活性化する真のWntアゴニスト、細胞内β-カテニン分解の阻害剤およびTCF/LEFの活性化物質から選択される。GSK-3β阻害物質、Dkk1アンタゴニスト等も含む。Kinase(GSK)-3βタンパク質のキナーゼ活性(例えば、βカテニンに対するリン酸化能)を阻害する物質として定義され、例えば、CHIR99021(CAS番号:252917-06-9)、BIO(CAS番号:667463-62-9)、SB216763(CAS番号:280744-09-4)、R-Spondin1など、既に多数のものが知られている。2002、Wnt3、Wnt3a、Wnt9bであり、より好ましくはCHIR99021、又はSB216763であり、さらに好ましくはCHIR99021である。[0034]工程AにおいてWntアゴニストとしてCHIR99021を用いる場合、培地中のCHIR99021の濃度は、用いる細胞の起源によっても異なるが、通常1μMより多く10μMより小さい濃度であり、下限は、好ましくは約2μM、より好ましくは約3μM、上限は、好ましくは約8μM、より好ましくは約6μM、さらに好ましくは約5μMである。上限下限の組合せは、好ましくは約2μM~約8μM、より好ましくは約2μM~約6μMであり、さらに好ましくは約3μM~約5μMである。工程Aにおける、CHIR99021の濃度をこの範囲にすることにより、効率良く、NPCsをPAへと分化させることができる。工程Aにおいて、CHIR99021の代わりに他のWntアゴニストを用いる場合は、CHIR99021を参照として同等の効果を示す濃度を設定することができる。hydrochloride、より好ましくは、Y27632を用いることができる。Y27632を用いる場合は、濃度は、1μM~1000μM、好ましくは1μM~200μM、より好ましくは1μM~100μM、さらに好ましくは約10μMである。工程Aにおいて、Y27632の代わりに他のRock阻害剤を用いる場合は、Y27632を参照として同等の効果を示す濃度を設定することができる。[0036]工程Aの培養時間は、用いる細胞の起源によっても異なるが、通常、約12時間~約48時間、好ましくは約18時間~約30時間、より好ましくは約21時間~約27時間、さらに好ましくは約24時間である。工程Aにおける培養時間をこの範囲にすることにより、効率良く、NPCsをPAへと分化させることができる。工程Bは、PA細胞又はその集団を、Fgf及び場合によりTGFβシグナル経路阻害物質を含む培地で培養する工程である。vesicle)」と称する。工程B又は工程Cの少なくともいずれかに含まれるTGFβシグナル経路阻害物質とは、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質として定義され、例えば、TGFβの受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、ALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質などの多数の物質が報告されている。本発明の工程Bにおいて用いられるTGFβシグナル経路阻害物質としては、所望の細胞への誘導効果が得られる限り特に限定されるものではないが、ALK阻害物質である、SB431542(CAS番号:301836-41-9)又はA83-01(CAS番号:909910-43-6)、D4476、GW788388、LY364947、R268712、RepSox、SB505124、SB525334、又はSD208をあげることができ、SB431542又はA83-01が好ましく、SB431542がより好ましい。工程BにおいてTGFβシグナル経路阻害物質としてSB431542を用いる場合、工程Bの培地中のSB431542の濃度は、用いる細胞の由来などによっても異なるが、通常、1μM~500μM、好ましくは、2μM~100μM、より好ましくは3μM~50μMであり、工程Aにおいてマウス由来のネフロン前駆細胞を用いた場合には、約25μMが特に好ましく、工程Aにおいてヒト多能性幹細胞由来のネフロン前駆細胞を用いた場合には、約5μMが特に好ましい。工程Bにおいて、上記濃度のSB431542を添加することにより、効率良く、PAを近位極性を有するRVへと分化させることができる。工程Bにおいて、SB431542の代わりに他の成分を用いる場合は、SB431542を参照として同等の効果を示す濃度を設定することができる。Systemsなどから組換えヒトFgfタンパク質を購入したものを用いることもできる。用いるFgfは、Fgf2,Fgf9又はFgf20が好ましく、Fgf9又はFgf20がより好ましく、Fgf9がさらに好ましい。培地中のFgf9の濃度は、培養条件などによっても異なるが、例えば、1ng~500ng/mL、好ましくは2ng~200ng/mL、より好ましくは5ng~100ng/mL、さらに好ましくは約10ng/mLである。Fgf9に代わりに他のFgfを用いる場合は、Fgf9を参照として同等の効果を示す濃度を設定することができる。[0039]工程Bの培地は、さらに約1μM以下の濃度のWntアゴニストを含んでもよい。用いることができるWntアゴニストは、工程Aにおいて記載したWntアゴニストと同様であるが、好ましくはGSK-3β阻害物質、より好ましくはCHIR99021である。工程BにおいてWntアゴニストとしてCHIR99021を用いる場合、培地中のCHIR99021の濃度は、用いる細胞の起源によっても異なるが、約1μM以下、好ましくは約0.7μM以下、より好ましくは約0.5μMである。CHIR99021に代わりに他のWntアゴニストを用いる場合は、CHIR99021を参照として同等の効果を示す濃度を設定することができる。[0040]ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞から工程Aにより誘導したPAを用いる場合は、工程B又は工程Cのいずれかにおいて培地にWntシグナル阻害物質を添加してもよく、それによりポドサイトの誘導効率を向上させることができるが、工程B及び工程Cの両者の培地にWntシグナル阻害物質を添加することがより好ましい。Wntシグナル阻害物質としては、これに限定されないが、例えば、IWR-1又はIWP-2、IWP-3、IWP-4、XAV939、FH535、C59、VS-507、CCT031374をあげることができり、好ましくはIWR-1、IWP-2、又はXAV939である。[0041]工程BにおいてWntシグナル阻害物質としてIWR-1を用いる場合、工程Bの培地中のIWR-1の濃度は、用いる細胞の由来などによっても異なるが、通常、0.1μM~50μM、好ましくは、0.2μM~10μM、より好ましくは0.5μM~5μM、さらに好ましくは約1μM~約2μMである。IWR-1に代わりに他のWntシグナル阻害物質を用いる場合は、IWR-1を参照として同等の効果を示す濃度を設定することができる。[0042]ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞から工程Aにより誘導したPAを用いる場合はまた、工程Bの培地にレチノイン酸(RA)又はRAアナログを添加することが好ましい。工程Bにおいて用いることのできるレチノイン酸としては、全トランスレチノイン酸(ATRA)が例示され、Sigma-Aldrichなどから購入することができる。天然のレチノイン酸が有する機能を保持しながら人工的に修飾されたレチノイン酸も使用され得る。工程Bにおいてレチノイン酸としてATRAを用いる場合、培地中のATRAの濃度は、培養条件などによっても異なり、所望の細胞が得られる限り特に限定されるものではないが、通常、1nM~100μM、好ましくは、10nM~50μM、より好ましくは100nM~20μM、さらに好ましくは約1μM~約10μMである。[0043]工程Bにおいては、レチノイン酸の代わりにレチノイン酸アナログを用いることができる。261066,AC55649,Isotretinoinをあげることができ、特にAGN193109が好ましい。工程Bにおいて、RAの代わりにRAアナログを用いる場合は、RAを参照として同等の効果を示す濃度を設定することができる。[0044]工程Bの培養時間は、用いる細胞の起源によっても異なるが、通常、約12時間~約48時間、好ましくは約18時間~約30時間、より好ましくは約21~約27時間、さらに好ましくは約24時間である。工程Cは、RV細胞又はその集団を、Fgf及び場合によりTGFβシグナル経路阻害物質を含む培地で培養してポドサイトを誘導する工程である。工程Cにおいて用いることができるTGFβシグナル経路阻害物質は、工程Bにおいて記載したTGFβシグナル経路阻害物質と同様であるが、好ましくはSB431542又はA83-01、より好ましくはSB431542である。工程CにおけるTGFβシグナル経路阻害物質の培地中の濃度は、工程Bにおいて記載した内容と同様の濃度を用いることができる。[0046]工程Cにおいて用いることができるFgfは、工程Bにおいて記載したFgfと同様であるが、好ましくは、Fgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくは、Fgf9である。工程CにおけるFgfの培地中の濃度は、工程Bにおいて記載した内容と同様の濃度を用いることができる[0047]工程Cの培地は、さらに約1μM以下の濃度のWntアゴニストを含んでもよい。用いることができるWntアゴニストは、工程Aにおいて記載したWntアゴニストと同様であるが、好ましくはGSK-3β阻害物質、より好ましくはCHIR99021である。工程CにおいてWntアゴニストとしてCHIR99021を用いる場合、培地中のCHIR99021の濃度は、用いる細胞の起源によっても異なるが、約1μM以下、好ましくは約0.7μM以下、より好ましくは約0.5μMである。CHIR99021に代わりに他のWntアゴニストを用いる場合は、CHIR99021を参照として同等の効果を示す濃度を設定することができる。[0048]ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞から工程Aにより誘導したPAを用いてポドサイトを誘導する場合は、工程B又は工程Cのいずれかにおいて培地にWntシグナル阻害物質を添加してもよいが、工程B及び工程Cの両者の培地にWntシグナル阻害物質を添加することが好ましい。工程Cにおいて用いるWntシグナル阻害物質は、工程Bにおいて記載したWntシグナル阻害物質と同様であるが、好ましくは、IWR-1である。工程Cにおいて培地にWntシグナル阻害物質を添加する場合は、その濃度は、工程Bにおいて記載したものと同様である。[0049]ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞から工程A及び工程Bにより誘導したRVを用いる場合は、工程Cの培地にレチノイン酸(RA)又はRAアナログを添加してもよい。工程Cにおいて用いるRA又はRAアナログは、工程Bにおいて記載したRA又はRAアナログと同様であり、また工程Cにおいて培地にRA又はRAアナログを添加する場合は、その濃度は、工程Bにおいて記載したものと同様である。[0050]工程Cの培養時間は、用いる細胞の起源によっても異なるが、通常、約2日~約9日間、好ましくは約3日~約8日間である。工程Cの培養時間は、マウスの細胞を用いる場合は、通常、約2日~約10日間、好ましくは約3日~約7日間、より好ましくは約4日間であり、ヒトの細胞を用いる場合は、通常、約5日~約30日間、好ましくは約5日~約20日間、より好ましくは6日~15日間、さらに好ましくは約7日~約10日間である。工程Bにおける培地がRA又はRAアナログを含む場合は工程Cにおける培地はRA又はRAアナログを含まなくてもよい、を含む、ポドサイトを分化誘導する方法でもある。[0052]本発明において用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。α改変型)など、及びこれらの混合物が挙げられる。[0053]本発明において用いる培地は、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。Scientific)、2-メルカプトエタノール、1-チオグリセロール、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、アスコルビン酸、ペニシリン・ストレプトマイシンを含む抗生物質などの少なくとも1以上の培地添加物も含有し得る。[0054]培地キット本発明の一つの態様は、ネフロン前駆細胞からポドサイトを誘導するための培地キットである。下記(1)~(3)のそれぞれの成分を含む3つの培地からなる。(1)Wntアゴニスト及びROCK阻害物質、(2)TGFβシグナル経路阻害物質及びFgf、及び(3)TGFβシグナル経路阻害物質及びFgf。上記(2)はさらに、Wntシグナル阻害物質、及び、レチノイン酸(RA)又はRAアナログを含んでもよく、上記(3)はさらに、Wntシグナル阻害物質、及び、レチノイン酸(RA)又はRAアナログを含んでもよいが、ネフロン前駆細胞が、ヒトiPS由来の場合は、これらの成分を含むことが好ましい。上記(1)から(3)の成分は、それぞれ別の容器に保存されるのが好ましい。上記(1)~(3)のそれぞれの成分を含む3つの容器、からなるキットを含む。[0055]本発明の培地キットにおいて用いられるWntアゴニスト、ROCK阻害剤、TGFβシグナル経路阻害物質、Fgf、Wntシグナル阻害物質、及び、レチノイン酸(RA)又はRAアナログは、本発明のポドサイトの誘導方法において記載されたものと同様の成分である。Wntアゴニストは、好ましくはGSK-3β阻害物質、より好ましくはCHIR99021であり、ROCK阻害剤は、好ましくはY27632であり、TGFβシグナル経路阻害物質は、好ましくはSB431542であり、Fgfは、好ましくはFgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくはFgf9であり、Wntシグナル阻害物質は好ましくはIWR-1である。上記各成分であるWntアゴニスト、ROCK阻害剤、TGFβシグナル経路阻害物質、Fgf、Wntシグナル阻害物質、及び、レチノイン酸(RA)又はRAアナログは、本発明のポドサイトの誘導方法において用いられる濃度になるように培地に添加し使用することができる。[0056]上記各成分は、成分のみがそれぞれの容器に保存された状態で提供されてもよく、また、それらの成分を含む液体培地又は粉末培地がそれぞれの容器に保存された状態で提供さてもよい。本発明の上記培地キットはさらに、多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導するための培地又はそのキットと組み合わせてもよく、そのようなキットの組合せも本発明の一部である。本発明の一つの態様は、上記の3段階の誘導工程を含む哺乳動物由来のiPS細胞からのポドサイトの細胞集団の製造方法である。よって、本発明は以下の態様を含むものである。工程(iii)における培地がRA又はRAアナログを含む場合は工程(iv)における培地はRA又はRAアナログを含まなくてもよい、を含む、iPS細胞からのポドサイトの細胞集団を製造する方法である。[0058]上記製造方法において用いられるWntアゴニスト、ROCK阻害物質、TGFβシグナル経路阻害物質、Wntシグナル阻害物質、Fgf、及びレチノイン酸(RA)又はRAアナログは、本発明のポドサイトの誘導方法において記載されたものと同様である。Wntアゴニストは、好ましくはGSK-3β阻害物質、より好ましくはCHIR99021であり、ROCK阻害物質は、好ましくはY27632であり、Fgfは、好ましくはFgf2、Fgf9又はFgf20、より好ましくFgf9であり、TGFβシグナル経路阻害物質は、好ましくはSB431542であり、Wntシグナル阻害物質は好ましくはIWR-1である。上記各成分であるWntアゴニスト、ROCK阻害物質、TGFβシグナル経路阻害物質、Fgf、Wntシグナル阻害物質、及び、レチノイン酸(RA)又はRAアナログの培地中の濃度、及びそれらの成分が含む培地での培養期間は、本発明のポドサイトの誘導方法における記載をそのまま適用できる。上記製造方法における工程(i)は、本発明のポドサイトの誘導方法に関連して記載された、iPS細胞からのネフロン前駆細胞の誘導に関する記載がそのまま適用できる。[0059]本発明のポドサイトの製造方法を用いて製造されたポドサイトの細胞集団は、実質的にポドサイトである細胞から構成される細胞集団を意味し、具体的には、細胞集団を構成する全細胞の、約40%以上、好ましくは約50%以上、より好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、よりさらに好ましくは約80%以上、最も好ましくは約90%以上がポドサイトから構成される細胞集団をいう。細胞集団中の細胞がポドサイトであるか否か及びその割合は、ポドサイトの細胞マーカーを用いて公知の方法により確認できる。細胞マーカーとしては、これに限定されないが、例えば、NPHS1、NPHS2、WT1、MAFB、又はSYNPOをあげることができる。構成割合の検出は、例えば、セルソーターや免疫染色を用いて測定できる。[0060]本発明のポドサイトの製造方法を用いて製造されたポドサイトは、真正のポドサイト(ヒト成人由来のポドサイト)に比べ、NPHS1、NPHS2、WT1、MAFB及びSYNPOの発現に関して同様の発現を有するという特徴をもつ。「NPHS1、NPHS2、WT1、MAFB及びSYNPOの発現に関して同様の発現」とは、これらの5つの遺伝子の、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは4つ、さらに好ましくは全てについて、遺伝子及び/又はタンパク質の発現に関して同等に発現していることを意味する。同等に発現とは、ヒト成人由来ポドサイトの遺伝子及び/又はタンパク質の発現と比べ、約40%以上、好ましくは約50%以上、より好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、よりさらに好ましくは約80%以上、最も好ましくは約90%以上の発現を示すことをいう。本発明の一つの態様は、上記のポドサイトの誘導方法又は製造方法を用いて製造したポドサイトを用いた評価又はスクリーニングのための細胞モデルであり、また、そのような細胞モデルを用いた評価又はスクリーニング方法である。本発明の評価方法は、上記のポドサイトの誘導方法又は製造方法を用いて製造したポドサイト又はその細胞集団を、目的とする試験物質とともに培養し、ポドサイト細胞への影響を確認することを含む方法である。アルブミン取り込み能、アルブミンろ過能、オートファジー活性又は細胞内伝達シグナルからなる群から選ばれる少なくとも一つ以上の項目を測定することにより評価でできる。これにより、目的の物質のポドサイト細胞への毒性評価が可能となる。アミノ酸、ペプチド、タンパク質、天然抽出物をあげることができる。上記評価項目の測定は、公知の方法を適宜参照して行うことができる。それらの評価項目の測定のための試薬やキットも市販されており、それらを制限なく使用することができる。本発明の評価方法を用いることにより、これに限定されないが、例えば、腎障害を与える可能性がある薬剤の毒性を評価することができる。[0062]本発明のスクリーニング方法としては、ポドサイト障害を治療又は回復させる物質をスクリーニングする方法をあげあることができる。上記のポドサイトの誘導方法又は製造方法を用いて製造したポドサイト又はその細胞集団を用いて、以下の工程を行うことにより候補物質をスクリーニングできる。(x)ポドサイト障害性を示す薬剤及び試験物質の存在下で培養する工程、及び(y)ポドサイト細胞の生存又は増殖を測定する工程。前記工程(x)におけるポドサイト細胞集団の培養は、(x-1)ポドサイト障害性を示す薬剤及び試験物質が同時に存在する環境下でポドサイト細胞集団を培養してもよく、また、(x-1)ポドサイト障害性を示す薬剤の存在下でポドサイト細胞集団を培養し、次いで、試験物質の存在下で障害ポドサイト細胞集団を培養してもよい。後者の場合は、ポドサイト障害性を示す薬剤を除去した後に試験物質を添加しても、又は、除去せずに試験物質を添加してもよい。ポドサイト障害性を示す薬剤としては、これに限定されないが、例えば、ピューロマイシンアミノヌクレオシド、ドキソルビシン、アンジオテンシンII、抗ネフリン抗体をはじめとする抗ポドサイト抗体をあげることができ、好ましくはピューロマイシンアミノヌクレオシド、又はドキソルビシンである。アミノ酸、ペプチド、タンパク質、天然抽出物をあげることができる。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、これに限定されないが、例えば、ポドサイトに対し保護的に作用する薬剤の探索が可能となる。[0063]また、本発明のポドサイトの誘導方法又は製造方法を用い、ポドサイトに関連する疾患を有する患者由来のiPS細胞からポドサイトの細胞集団を作製することもできる。このようにして作製したポドサイトの細胞集団を用いることにより、ポドサイトに関連する疾患を治療するための薬剤の評価やスクリーニングが可能である。このような評価方法又はスクリーニング方法も本発明の一部である。本発明の一つの態様は、上記のポドサイトの誘導方法又は製造方法を用いて製造したポドサイトを用いた、腎臓及び/又は糸球体の疾患を治療又は予防する方法である。よって本発明は、(I)上記のポドサイトの誘導方法又は製造方法で作製したポドサイトの細胞集団を、疾患に罹患する対象の腎臓組織の一部に移植すること及び(II)移植したポドサイトの細胞集団中の少なくとも一部の細胞が、腎組織の少なくとも一部の糸球体内へと移動してそこにとどまり、それにより、腎臓組織を再生して腎臓及び/又は糸球体の疾患を治療すること、を含む方法でもある。[0065]疾患に罹患した対象は、哺乳動物であれば特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル又はヒト等をあげることができ、好ましくはヒトである。上記(I)におけるポドサイトの腎臓組織の一部への移植は、ポドサイト細胞集団は、ポドサイト移植を補助する他の細胞や細胞の足場とともに移植することもできる。他の細胞としては、これに限定されないが、例えば、間質細胞や血管内皮細胞をあげあることができる。細胞の足場としては、公知の又は市販のものを適宜利用できるが、例えば、生体適合性の物質(バイオマテリアルともいう)で構成された足場をあげることができる。バイオマテリアルとしては、これに限定されないが、例えば、絹フィブロイン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、キチン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、PHA、コラーゲン、キトサン、アルギン酸塩、及び他の生体適合性のポリマーをあげることができる。[0066]本発明により誘導したポドサイトは、腎オルガノイドとともに又はオルガノイドの一部として移植することもできる。共に、分化したネフロン同士を互いに接続する集合管の樹状分岐構造を有する、高次構造をもつ腎臓様組織である。それらの組合せ、或いはそれらの疾患の合併症をあげることができ、好ましくは、ポドサイト障害を伴う病態である。[0068]以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。(材料及び方法)マウスMafB-GFPノックインマウス及びSix2-GFP-Creトランスジェニックマウスは、筑波大学の高橋智博士及び南カルフォルニア大学のアンドリュー・マクマホン博士より供与を受けた。マウスは、12時間の光サイクルで、CE-2放射線滅菌飼料を与え、プラスチックケージ内で飼育した。全ての解析は最低限3匹の同腹子を用いて行った。胚性期の解析は、交配した雌に腟栓が確認された日の正午を胎生期(E)0.5日とみなした。承認を得たプロトコルに従って行った。[0069]マウスネフロン前駆細胞(NPCs)からのポドサイト誘導E15.5のMafB-GFP胚から後腎を単離し、鉗子を用い、PBS中で細かく刻み、0.25%トリプシン-EDTA中で、37°C、8分間インキュベートして解離させた。