斯かる休止菌体反応については後述する。[0042]また、第一の酵素を発現する宿主細胞として細菌を用い、その培養液を用いて4-ニトロフェニルアラニンと共存させ、培養液に含まれる第一の酵素を4-ニトロフェニルアラニンに作用させて4-ニトロ桂皮酸へと変換させる手法を取ることもできる。[0043]前記第一の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例えば水性溶媒中であれば、そのpHは特に制限はされないが、通常7.5以上、中でも8以上が好ましく、また、通常9.5以下、更には9以下が好ましい。反応を行う温度は特に制限はされないが、通常27°C以上、中でも30°C以上、更には32°C以上、また、通常42°C以下、中でも37°C以下で反応を行うことが好ましく例示できる。本発明の第一の方法では、次に工程(2)として、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸へと変換する。手法を用いることができる。中でも、本発明では4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸へと変換する酵素(ニトロレダクターゼ:以下適宜「第二の酵素」という。)を用いて、工程(2)を実施することが好ましい。coli)由来の酵素であるnfsA及びnfsB等が挙げられる。scFrm2タンパク質のアミノ酸配列を配列番号7に、これをコードするscFrm2遺伝子の塩基配列の例を配列番号8にそれぞれ示す。scHbn1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号9に、これをコードするscHbn1遺伝子の塩基配列の例を配列番号10にそれぞれ示す。cdFLDZタンパク質のアミノ酸配列を配列番号11に、これをコードするcdFLDZ遺伝子の塩基配列の例を配列番号12にそれぞれ示す。nfsAタンパク質のアミノ酸配列を配列番号13に、これをコードするnfsA遺伝子の塩基配列の例を配列番号14にそれぞれ示す。nfsBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号15に、これをコードするnfsB遺伝子の塩基配列の例を配列番号16にそれぞれ示す。reductase)の中から、本発明者等が探索して得られた酵素である。これらの酵素は、予想外にも、後述の実施例に示すように、4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への優れた変換活性を有し、本発明において好適に使用することができる。[0047]なお、前述のようにscFrm2、scHbn1、cdFLDZ、nfsA及びnfsBはニトロレダクターゼ又はエン酸レダクターゼとして公知の酵素であり、そのアミノ酸配列も公知であるが、これらが4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換活性を有し、ニトロレダクターゼとしても使用できることはこれまで知られておらず、本発明者等が初めて見出した知見である。[0048]前記第二の酵素の例としては、これらの酵素自体のみならず、それらの酵素の類似体であって、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸へと変換する活性を維持するポリペプチドも挙げられる。前記の類似体としては、例えばそのホモログ(オルソログ及びパラログを含む)、又はそのフラグメントが挙げられる。[0049]具体的に、前記第二の酵素は、配列番号7、9、11、13又は15のアミノ酸配列と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、又は少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%の配列相同性を有することが望ましい。第二の酵素は、配列番号7、9、11、13又は15のアミノ酸配列と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、又は少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、特に好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%の配列同一性を有することが望ましい。2つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」については、先に説明したとおりである。[0050]また、前記第二の酵素は、配列番号7、9、11、13又は15のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。本明細書において「アミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、先に説明したとおりである。[0051]また、前記第二の酵素は、配列番号7、9、11、13又は15のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチドであってもよい。本明細書において「ストリンジェントな(stringent)条件」とは、先に説明したとおりである。[0052]前記第二の酵素を調製する方法は制限されない。前記の第二の酵素を産出する生物から目的の酵素を抽出して用いてもよい。当業者に公知の公的機関のデータベースに登録された前記第二の酵素の遺伝子の塩基配列や、本明細書に開示する配列番号8、10、12、14及び16の遺伝子の塩基配列を用いて、当業者に公知の各種の手法、例えば化学合成法や遺伝子工学的手法を用いて調製することができる。その具体的な手法、特に遺伝子工学的な手法については、先に詳述したとおりである。[0053]前記第二の酵素を用いて工程(2)を実施する手法は特に制限されない。第二の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で、工程(1)で得られた4-ニトロ桂皮酸に作用させ、4-アミノ桂皮酸へと変換させればよい。工程(1)で得られた4-ニトロ桂皮酸としては、4-ニトロ桂皮酸を含む工程(1)の反応生成物との組成物を精製せずそのまま用いてもよいが、斯かる反応生成物から当業者に公知の各種の手法で4-ニトロ桂皮酸を精製して用いてもよい。[0054]前記第二の酵素を4-ニトロ桂皮酸に作用させる手法の例としては、上記手順により調製された第二の酵素(scFrm2、scHbn1、cdFLDZ、nfsA若しくはnfsB又はその類似体)を単離・精製して用いてもよいが、前述の手順により第二の酵素を発現するように宿主微生物を改変して得られた遺伝子組換細胞(以下適宜「第二の細胞」という。)をそのまま用いてもよい。後者の場合、特に宿主として細菌を用い、その休止菌体を用いて4-ニトロ桂皮酸と共存させ、休止菌体に含まれる第二の酵素を4-ニトロ桂皮酸に作用させて4-アミノ桂皮酸へと変換させる手法(休止菌体反応)が好ましい。斯かる休止菌体反応については後述する。宿主細胞として細菌を用い、その培養液を用いて4-ニトロ桂皮酸と共存させ、培養液に含まれる第一の酵素を4-ニトロ桂皮酸に作用させて4-アミノ桂皮酸へと変換させる手法も好ましい。この場合、前記の細菌としては大腸菌が好ましい。[0055]なお、前記第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例としては以下が挙げられる。水性溶媒中であれば、そのpHは特に制限はされないが、通常6.5以上、中でも7.0以上が好ましく、また、通常8.5以下、更には8.0以下が好ましい。反応を行う温度は特に制限はされないが、通常27°C以上、中でも30°C以上、更には32°C以上、また、通常42°C以下、中でも37°C以下で反応を行うことが好ましく例示できる。第一の方法では、前記第一の酵素を用いて工程(1)を実施する際、及び/又は、前記第二の酵素を用いて工程(2)を実施する際に、前記の第一及び/又は第二の酵素を発現する第一及び/又は第二の細胞として細菌の休止菌体を用いた反応(休止菌体反応)を用いることが好ましい(なお、第一の酵素を発現する細菌を以下「第一の細菌」といい、第二の酵素を発現する細菌を以下「第二の細菌」という)。[0057]ここで、細菌の「休止菌体」とは、斯かる細菌の増殖を伴わない菌体を意味する。休止菌体の例としては、細菌を培養して得られた培養菌体や、斯かる培養菌体を凍結乾燥やスプレードライによって粉末にした粉末菌体、斯かる培養菌体を担体に固定化した固定化菌体等が挙げられる。これらの二種以上を組み合わせて使用してもよい。休止菌体の具体例としては、細菌を培養して得られる培養液を遠心分離によって培養上清と菌体とに分け、得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、所望の菌体濁度(例えば600nmでの吸光度が40)となるように滅菌精製水に懸濁した休止菌体懸濁液を用いることができる。斯かる休止菌体懸濁液を凍結乾燥やスプレードライによって粉末にした粉末菌体や、斯かる培養菌体懸濁液中の培養菌体を担体に固定化した固定化菌体等も用いることができる。)と、第一又は第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件下で共存させることにより、第一又は第二の細菌の休止菌体に含まれる第一又は第二の酵素を対応する基質に作用させる。第一又は第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例えばpHが通常6.5以上、中でも7以上、また、通常9.5以下、更には9以下の水性溶媒中、通常27°C以上、中でも30°C以上、更には32°C以上、また、通常42°C以下、中でも37°C以下の温度で反応を行うことが好ましく例示できる。[0059]なお、本発明の第一の方法では、工程(2)において4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸へと変換する手法として、化学的手法を用いることもできる。化学的手法としては、特に限定されることはなく、既知の方法を用いることができる。具体例としては、ニトロ基をアミノ基に変換する化学反応を用いて、4-ニトロ桂皮酸のニトロ基を還元すればよい。公知の方法を用いることができる。4-ニトロ桂皮酸としては、前記工程(1)で得られた4-ニトロ桂皮酸をそのまま用いてもよいが、公知の方法で適宜精製してから用いてもよい。以上の手順により、(1)4-ニトロフェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する工程、及び(2)4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する工程を実施することにより、4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造することができる。工程(2)の終了後、当業者に公知の各種の手法で反応生成物から4-アミノ桂皮酸を単離・精製してもよい。[0061]なお、以上の説明はあくまでも本発明の第一の方法の実施の一態様に過ぎない。当業者であれば容易に理解するように、上述の態様に適宜変更を加えて、本発明の第一の方法を実施することが可能である。[0062]例えば、本発明の第一の方法では、前記工程(1)と前記工程(2)を適宜組み合わせて実施することができる。その組合せは限定されるものではないが、通常は、前記工程(1)において前記第一の酵素を用いた酵素反応を実施し、前記工程(2)において前記第二の酵素を用いた酵素反応又は前記の化学的手法を実施する。このうち前記工程(1)では、前記第一の細菌の共存下で酵素反応を行う方法、又は、第一の細菌の休止菌体反応を行うことが好ましい。[0063]なお、前記工程(1)で第一の細菌の共存下で酵素反応を行う場合は、前記工程(2)では前記第二の細菌の共存下で酵素反応を行うか、又は化学的手法で行うことが好ましい。中でも、前記第二の細菌の共存下で酵素反応を行えば、一貫で双方の酵素反応を行うことができ、効率面でより好ましい。この場合には第二の細菌として大腸菌を用いることが、コスト低減の観点で更に好ましい。[0064]一方、前記工程(1)で第一の細菌の休止菌体を行う場合には、前記工程(2)では前記第二の細菌の休止菌体反応を行うか、又は化学的手法を行うことが好ましい。2削減等の点でより好ましい。[0065]また、以上の説明では工程(1)の実施後に工程(2)を実施する態様を説明したが、工程(1)と工程(2)とを同時に実施することも可能である。この場合、第一及び第二の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で4-ニトロフェニルアラニンに作用させ、第一の酵素による4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換と、第二の酵素による4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換とを並行して実施すればよい。この場合、単離・精製した第一及び第二の酵素を併用してもよく、第一及び第二の酵素をそれぞれ発現する第一及び第二の細胞を併用してもよく、更には、第一及び第二の酵素を共に発現する単一の遺伝子組換細胞を用いてもよい(これを以下「第三の細胞」という)。第一及び第二の酵素を共に発現する第三の細胞は、第一及び第二の酵素をコードする遺伝子、或いはこれらの遺伝子をそれぞれ担持する第一及び第二のベクターを、単一の宿主細胞に導入し、第一及び第二の酵素を共に発現するように宿主細胞を改変して得ることができる。[0066][II.グルコースから4-アミノ桂皮酸を製造する方法]本発明の第二の要旨は、グルコースから4-アミノ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第二の方法」と略称する。本発明の第二の方法は、少なくとも(a)グルコースからフェニルアラニンを産生する工程、(b)前記(a)で得られたフェニルアラニンをニトロ化して4-ニトロフェニルアラニンに変換する工程、及び、(c)本発明の第一の方法により、前記(b)で得られた4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する工程を含む。[0067]工程(a)における、グルコースからフェニルアラニンを合成する方法としては、例えば前記の文献Aに記載の方法を用いることができる。[0068]工程(b)における、フェニルアラニンから4-ニトロフェニルアラニンを合成する方法としては、例えば前記の文献Bに記載の方法を用いることができる。[0069]工程(c)における、4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を合成する方法としては、前述した本発明の第一の方法を用いることができる。[0070][III.フェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する方法]本発明の第三の要旨は、フェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第三の方法」と略称する。本発明の第三の方法は、少なくとも(b)フェニルアラニンをニトロ化して4-ニトロフェニルアラニンに変換する工程、及び、(c)本発明の第一の方法により、前記(b)で得られた4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を製造する工程を含む。[0071]工程(b)における、フェニルアラニンから4-ニトロフェニルアラニンを合成する方法については、本発明の第二の方法について前述したとおりである。[0072]工程(c)における、4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を合成する方法としては、前述した本発明の第一の方法を用いることができる。[0073][IV.4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸を製造する方法]本発明の第四の要旨は、フェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第四の方法」と略称する。本発明の第四の方法は、少なくとも前述の第一の酵素を用いて、フェニルアラニンを4-ニトロ桂皮酸に変換する工程を含む。斯かる工程の詳細については、本発明の第一の方法の工程(1)として先に詳述したとおりである。[0074][V.4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸を製造する方法]本発明の第五の要旨は、4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第五の方法」と略称する。本発明の第五の方法は、少なくとも前述の第二の酵素を用いて、4-ニトロ桂皮酸を4-アミノ桂皮酸に変換する工程を含む。斯かる工程の詳細については、本発明の第一の方法の工程(2)として先に詳述したとおりである。[0075][VI.ベクター]本発明の第六の要旨は、前述の第一及び/又は第二の酵素をコードする遺伝子を担持するベクター(なお、第一の酵素をコードする遺伝子を担持するベクターを以下「第一のベクター」といい、第二の酵素をコードする遺伝子を担持するベクターを以下「第二のベクター」といい、第一の酵素をコードする遺伝子及び第二の酵素をコードする遺伝子を共に担持するベクターを以下「第三のベクター」という。[0076]第一~第三のベクターは、前述の第一及び/又は第二の酵素をコードする遺伝子を担持すると共に、これらの遺伝子を宿主細胞内に導入し、発現可能な状態とすることが可能であれば、その種類は限定されない。宿主細胞のゲノム内に組み込まれるベクターでも、宿主細胞の細胞質内に取り込まれつつ、宿主細胞のゲノムとは独立に共存し、宿主細胞の細胞分裂に従って自律的に複製するベクターであってもよい。線状ベクターでも環状ベクターでもよく、一本鎖ベクターでも二本鎖ベクターでもよく、DNAベクターでもRNAベクターでもよい。プラスミドベクターでも、コスミドベクターでも、フォスミドベクターでも、ウイルスベクターでも、人工染色体ベクターでも、アグロバクテリウム等の細菌ベクターでも、更にはこれら複数の組合せによるバイナリーベクターでもよい。斯かるベクターの種類や構成、構築法等は当業者には周知であり、遺伝子や宿主微生物細胞等の条件に応じて適宜選択すればよい。[0077]第一~第三のベクターは、前述の第一及び/又は第二の酵素をコードする遺伝子に加えて、宿主細胞中で前記遺伝子の発現を調節する調節配列を更に含むことが好ましい。第一~第三のベクターにおいては、これらの調節配列が、前述の第一及び/又は第二の酵素をコードする遺伝子と作動可能に連結されることにより、宿主細胞中で前記遺伝子を自律的に発現することが可能な発現カセットとして構築されることが好ましい。斯かる調節配列の種類や構成、構築法等は当業者には周知であり、遺伝子や宿主細胞等の条件に応じて適宜選択すればよい。[0078][VII.細胞]本発明の第七の要旨は、前述の第一及び/又は第二の酵素を発現するよう宿主細胞を改変して得られる細胞(なお、前述のように、第一の酵素を発現する細胞を「第一の細胞」といい、第二の酵素を発現する細胞を「第二の細胞」といい、第一及び第二の酵素を共に発現する細胞を「第三の細胞」という。[0079]第一~第三の細胞の元となる宿主細胞の種類は制限されず、原核細胞でも真核細胞でもよく、原核細胞の場合は真正細菌でも古細菌でもよく、真核細胞の場合は植物細胞でも動物細胞でも真菌細胞でも原生生物細胞でもよい。前述の休止菌体反応を行う場合には、宿主細胞としては細菌を用いることが好ましい。[0080]これらの宿主細胞に第一及び/又は第二の酵素をコードする遺伝子を導入することにより、第一及び/又は第二の酵素を発現する第一~第三の細胞を得ることができる。導入する遺伝子としては、前述の第一及び/又は第二の酵素をコードする遺伝子をそのまま用いてもよく、或いはこれらの遺伝子を担持する前記の第一~第三のベクターを用いてもよい。遺伝子導入の手法としては、宿主細胞にベクターを感染させる方法や、エレクトロポレーション法、パーティクルガン(ボンバードメント)法、バキュームインフィルトレーション法等の物理的手法、更にはCRISPR/Cas9等のゲノム編集法等を用いることができる。[0081]こうして得られた第一~第三の細胞は、第一及び/又は第二の酵素を一過的に発現するものであってもよく、恒常的に発現するものであってもよい。多細胞真核生物の細胞の場合は、これらの遺伝子を発生の全ての段階で発現するものであってもよく、特定の段階のみで発現するものであってもよい。これらの遺伝子を全ての組織・器官で発現するものであってもよく、特定の組織・器官のみで発現するものであってもよい。制御は、例えば調節配列を適切に選択することにより行うことができる。[0082]なお、本発明における第一~第三の細胞には、第一及び/又は第二の酵素を発現するよう改変された第一世代の細胞のみならず、斯かる細胞が分裂して得られた次代以降の細胞や、更には斯かる細胞を含む当初個体の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫(クローンを含む)の細胞も含まれることとする。カルス、プロトプラスト等)から作出される子孫(クローンを含む)の細胞も含まれることとする。[0083]以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。(DE3)]を使用した。大腸菌の培養には以下の組成のLB培地(pH7.0)、又はこれに別記の成分を添加した培地を、オートクレーブを用いて121°C、15分間滅菌してから用いた。よる酵素活性の評価条件を以下に記す。sinensis)由来の酵素であるCamPALを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成し、引き続き制限酵素NdeI及びEcoRIにより制限処理した。Ver.2(東洋紡社製)を用いて連結し、pET28a-CamPALを作製した。得られたpET28a-CamPALを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたCamPAL産生大腸菌株を培養してCamPALを発現させた。erythrorhizon)由来の酵素であるLiePALを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成した。得られたLiePALを、前記CamPALの制限処理に用いたものと同じ制限酵素を用いて制限処理した。以下、制限処理したLiePALを用いた以外は、前記のpET28a-CamPALの作製手順と同様の方法で前記制限処理pET28aと連結し、pET28a-LiePALを作製した。以下、上記同様の方法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたLiePAL産生大腸菌株を培養してLiePALを発現させた。glutinis)JN-1由来の酵素であるRgPALを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成した。得られたRgPALを、前記CamPALの制限処理に用いたものと同じ制限酵素により制限処理した。以下、制限処理したRgPALを用いた以外は、前記のpET28a-CamPALの作製手順と同様の方法で、前記制限処理pET28aと連結し、pET28a-RgPALを作製した。得られたpET28a-RgPALを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたRgPAL産生大腸菌株を培養してRgPALを発現させた。前記のCamPAL、LiePAL、及びRgPAL産生大腸菌株をそれぞれ、30mg/Lカナマイシン硫酸塩を含むLB培地5mLに植菌し、28°Cで16時間培養した(以下、前培養ということがある)。β-D-1-thiogalactopyranoside:IPTG)を終濃度0.5mMとなるように添加し、さらに30°Cにおいて20時間培養した。これらの培養の際の回転数は120rpmとした。培養した菌体を集菌し、0.5MNaClを含む20mMTris-HClバッファー(pH=7.5)に懸濁し、超音波破砕を行なった。引き続き遠心分離の後に、その上清をHis-Trapカラムを用いて精製し、得られた酵素を活性測定に用いた。[0093]酵素活性は、吸光光度計を用いて反応生成物の吸収波長の吸光度を10分間測定することによって測定し定量した。Tris-HClバッファー(pH=8.6)に前記の各酵素を2mg/mL加えて反応させ、桂皮酸の生成に由来する305nmの波長の吸光度の変化を10分間測定した。Tris-HClバッファー(pH=8.6)に前記の各酵素を2mg/mL加えて反応させ、4-ニトロ桂皮酸の生成に由来する380nmの波長の吸光度を10分間測定して定量した。catを示す表である。CamPAL、LiePAL、及びRgPALの何れも、4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換活性を有することが分かる。前記のCamPAL、LiePAL、及びRgPAL産生大腸菌株をそれぞれ、40mg/Lカナマイシン硫酸塩を含む3mLのLB培地を用い、300rpmの撹拌、28°Cの条件において16時間前培養した。この前培養液1mLを40mg/Lのカナマイシン硫酸塩を含む100mLのLB培地に植菌し、120rpmで振盪しながら30°Cで4時間培養した後、0.5mMのIPTGを添加して、更に20時間培養した。得られた菌体を反応バッファー(100mMTris-HClバッファー、pH8.5)で2回洗浄した。[0096]得られた休止菌体を、反応バッファーに懸濁し、300rpmで振盪しながら28°Cで反応させた。24時間毎に培地に20mMの4-ニトロフェニルアラニンを追加し、連続して反応させた。定期的に反応上清を採取し、4-ニトロフェニルアラニン及び4-ニトロ桂皮酸の定量を行った。[0097]上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて反応生成物を定量した。対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。[0098]図2は、CamPAL、LiePAL、及びRgPAL産生大腸菌株の休止菌体反応による24時間後の反応上清中の4-ニトロ桂皮酸量を示すグラフである。CamPAL、LiePAL、及びRgPAL産生大腸菌株の何れの休止菌体を用いた場合でも、対照の大腸菌と比べて反応上清中の4-ニトロ桂皮酸量が顕著に上昇しており、CamPAL、LiePAL、及びRgPALによる4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。[0099]図3は、CamPAL産生大腸菌株の休止菌体反応による反応上清中の4-ニトロフェニルアラニン量及び4-ニトロ桂皮酸量の経時変化を示すグラフである。反応上清中の4-ニトロフェニルアラニン量は24時間毎に添加に伴い増加するものの、その後は次回添加まで徐々に減少すると共に、反応上清中の4-ニトロ桂皮酸は継続的に増加していることが分かる。ここから、CamPALによる4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換が継続的に進行したことが分かる。cerevisiae)由来の酵素であるscFrm2(アミノ酸配列を配列番号7、塩基配列の例を配列番号8にそれぞれ示す。Ver.2(東洋紡社製)を用いて連結し、pRSFDuet-1-scFrm2を作製した。得られたpRSFDuet-1-scFrm2を、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたscFrm2産生大腸菌株を培養してscFrm2を発現させた。cerevisiae)由来の酵素であるscHbn1(アミノ酸配列を配列番号9、塩基配列の例を配列番号10にそれぞれ示す。cerevisiae)のゲノムライブラリーから、プライマー5’-AACGGATCCGATGTCTGCTGTTGCAAC-3’(配列番号19)及び5’-GCCAAGCTTAATTGAAGATTTCAACATCG-3’(配列番号20)を用いてPCRにより増幅した後、前記scFrm2の制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、pRSFDuet-1-scHbn1を作製した。得られたpRSFDuet-1-scHbn1を、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたscHbn1産生大腸菌株を培養してscHbn1を発現させた。difficile)由来の酵素であるcdFLDZ(アミノ酸配列を配列番号11、塩基配列の例を配列番号12にそれぞれ示す。difficile)のゲノムライブラリーから、プライマー5’-CCGGGATCCAATGAAGATTAGTTCTATG-3’(配列番号21)及び5’-CCGGAATTCTTATATATTTAATGCTAC-3’(配列番号22)を用いてPCRにより増幅した後、前記scFrm2の制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、pRSFDuet-1-cdFLDZを作製した。得られたpRSFDuet-1-cdFLDZを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたcdFLDZ産生大腸菌株を培養してcdFLDZを発現させた。前記のscFrm2、scHbn1、及びcdFLDZ産生大腸菌株をそれぞれ、30mg/Lカナマイシン硫酸塩を含む3mLのLB培地を用い、300rpmで振盪しながら28°Cで16時間前培養した。この前培養液1mLを30mg/Lカナマイシン硫酸塩を含む100mLのLB培地に植菌し、120rpmで振盪しながら30°Cで4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に20°Cで12時間培養した。4)、0.5mM塩化チアミン、pH7.0)で2回洗浄した。採取し、4-アミノ桂皮酸の定量を行った。上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、前記HPLCを用いて反応生成物を定量した。対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。[0105]図4は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したscFrm2、scHbn1、及びcdFLDZによる4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフを図4に示す。scFrm2、scHbn1、及びcdFLDZ産生大腸菌株の何れの休止菌体を用いた場合でも、対照の大腸菌と比べて培地上清中の4-アミノ桂皮酸量が顕著に上昇しており、scFrm2、scHbn1、及びcdFLDZによる4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。対照の大腸菌は4-アミノ桂皮酸を生産していた。この結果より、大腸菌は4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への還元反応を生じさせる能力を有していることが証明された。実施例1に記載のCamPAL産生大腸菌株を、40mg/Lカナマイシン硫酸塩を含む5mLのLB培地を用い、攪拌速度300rpmの撹拌、28°Cの条件において16時間前培養した。この前培養液1mLを、以下の組成を有する100mLのTB培地に、80mg/Lカナマイシン硫酸塩を加えた後に植菌し、120rpmで振盪しながら30°Cで4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に20時間培養した。遠心分離によって培養液から菌体を回収した後、-80°Cで保存した。得られた凍結菌体を10g/L、20g/L及び30g/Lに計量した。基質である4-ニトロフェニルアラニンを4.2g/L、21g/L、42g/Lを計量した。Tris-HClバッファー、pH8.5)に懸濁し、300rpmの撹拌、37°Cの条件において休止菌体反応させた。24時間反応後の反応液を採取し、4-ニトロフェニルアラニン及び4-ニトロ桂皮酸の定量を行った。それぞれの反応生成物の定量は、得られた(菌体)反応液の上清を遠心管に移し、遠心分離によって回収し、前記HPLCを用いて反応生成物を定量した。[0109]図5は、それぞれの菌体量と基質量を反応バッファーに懸濁し、24時間反応させた結果を示した。この結果から、菌体量20g/L及び30g/L、且つ、基質量21g/Lの場合に、収率が60%以上と高い4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換効率を示した。[0110]2.4-ニトロフェニルアラニンの4-ニトロ桂皮酸への変換反応2Lジャーファーメンター(丸菱バイオエンジ社製:BNR-C-2LS)を反応器とし、実施例1に記載のCamPAL産生大腸菌株(菌体量20g/L~30g/L)を用いて、基質である4-ニトロフェニルアラニン(基質量21g/L)を4-ニトロ桂皮酸へと変換する反応を行った。[0111]具体的には、前記CamPAL産生大腸菌株を、15mLのLB培地に40mg/Lカナマイシン硫酸塩を添加して用い、300rpmで撹拌しながら、28°Cで16時間前培養した。この前培養液12mLを、80mg/Lカナマイシン硫酸塩を加えた1.2LのTB培地を含む2Lジャーファーメンターに植菌し、通気量3.5L/分、撹拌速度500rpm、30°Cの条件において4時間培養した。引き続き、この培養液に0.1mMのIPTGを添加して、更に20時間培養した。培養液のO.D600の値から菌体量を計算したところ、30g/Lであった。NaOH水溶液を用いてpH8.5に調整した。通気をすることなくこの培養液を500rpmの撹拌、37°Cの条件において24時間反応させた。反応中の反応液を採取し、以下の方法で4-ニトロフェニルアラニン及び4-ニトロ桂皮酸を定量した。反応液を遠心管に移し、遠心分離によって上清を回収し、前記条件のHPLCを用いて反応生成物を定量した。[0113]図6は、24時間反応させた後の反応液の分析結果を示すグラフである。この結果から、21g/Lの4-ニトロフェニルアラニンから18g/Lの4-ニトロ桂皮酸へと、高い変換効率で変換されたことが示された。通気量を0.04L/分に変更して同様の反応を24時間行った結果、21g/Lの4-ニトロフェニルアラニンから12g/Lの4-ニトロ桂皮酸へと、高い変換効率で変換されたことが示された。[0114]CamPAL産生大腸菌の1.2L反応液から4-ニトロ桂皮酸の精製を行った。HClを加えてpH5に調整することで析出物を得た。析出物を濾過にて回収後、アセトンで洗浄して乾燥させた。乾燥後に回収した固体生成物を、前記条件のHPLC分析に供した。[0115]図7は、得られた生成物のHPLC分析結果を示すグラフである。この結果によれば、生成物は4-ニトロ桂皮酸であり、4-ニトロフェニルアラニンから4-ニトロ桂皮酸への変換反応が生じたことが示された。得られた4-ニトロ桂皮酸の純度は97%、収率は93%と、極めて高純度且つ高収率であることが分かった。得られた4-ニトロ桂皮酸の純度は、化学的な還元の手法によって4-アミノ桂皮酸に変換するのに十分な純度である。大腸菌はニトロレダクターゼ(nfsA及びnfsB)を有していることが知られている。そこで、大腸菌を用いて4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への還元反応を行った。[0117]まず、実施例1に記載のCamPAL産生大腸菌株を、実施例2と同様の方法によって16時間前培養した。この前培養液1mLを、80mg/Lカナマイシン硫酸塩を加えた100mLのTB培地に植菌し、120rpmの攪拌、30°Cの条件において4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に16時間培養した。NaOHを用いてpH8に調整後、炭素源としてグルコース、フルクトース及びグリセロールを終濃度10%となるように添加して、300rpmの撹拌、37°Cの条件において培養し、24時間反応させた。[0118]反応中の反応液を採取し、4-アミノ桂皮酸の定量を行った。反応液を遠心管に移し、遠心分離によって上清を回収し、前記HPLCを用いて反応生成物を定量した。[0119]図8は、CamPAL産生大腸菌の培養液にグルコース、フルクトース及びグルセロールを終濃度10%添加した際の4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換反応を示すグラフである。この結果より、グルセロールを添加した場合に最も多くの4-アミノ桂皮酸が得られることが示された。この4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換反応の際に添加する炭素源としては、グリセロールが適していることが分かった。[0120]2.4-ニトロフェニルアラニンの4-アミノ桂皮酸の変換1Lジャーファーメンター(Biott社製:BMJ-01)を用いて、上記のグリセロールを添加した条件下で、4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸への変換を行った。実施例2の前培養液5mLを、80mg/Lカナマイシン硫酸塩を加えた0.5LのTB培地を含む1Lジャーファーメンターに植菌し、通気量を0.7L/分、645rpmの撹拌、30°Cの条件において4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に20時間培養した。NaOHを用いてpH8.5に調整した。0.02L/分の通気量、645rpmの撹拌及び37°Cの条件において36時間反応させた。反応中の反応液を採取し、4-ニトロフェニルアラニン、4-ニトロ桂皮酸及び4-アミノ桂皮酸の定量を行った。[0122]図9は、CamPAL産生大腸菌による4-ニトロフェニルアラニンの4-アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。この結果より、7g/Lの4-ニトロフェニルアラニンを原料として4.7g/Lの4-アミノ桂皮酸を生産できることが示された。[0123]0.5Lの反応液から4-アミノ桂皮酸の精製を行った。HClを加えてpH3に調整し、600mLの反応液上清に強酸性陽イオン交換樹脂(三菱ケミカル社製:ダイヤイオンPK212LH)を700g添加して、1時間撹拌した。樹脂を回収して、樹脂量の2倍量の蒸留水で洗浄し、さらに樹脂量の2倍量のエタノールで洗浄した。樹脂量の1.5倍量の7.5%アンモニア水を加えて4-アミノ桂皮酸を溶出させた。0.5倍量の7.5%アンモニア水を加えて樹脂をリンス後、4-アミノ桂皮酸を含む溶出液を得た。HClを用いてpH3に調整した。その後、等量の酢酸エチルを添加して1時間撹拌させ、遠心分離によって酢酸エチル層を回収した。エバポレータ-を用いて酢酸エチルを除去し、4-アミノ桂皮酸の粗精製物を回収した。HClを加えて4-アミノ桂皮酸の塩酸塩を析出させた。これを濾過にて回収後、アセトンを用いて洗浄・乾燥させて固体乾燥物を得た。乾燥後に回収した固体生成物を、前記条件のHPLC分析に供した。[0125]図10は、得られた生成物及び4-アミノ桂皮酸(標品)のHPLC分析の結果を示すグラフである。この結果によれば、生成物は4-アミノ桂皮酸であり、大腸菌のニトロレダクターゼ(還元反応)を利用した4-ニトロフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸への変換反応が生じたことが示された。得られた4-アミノ桂皮酸の純度は98%と、極めて高純度であることが分かった。4-アミノ桂皮酸の回収率は60%であった。coli)由来の酵素であるnfsA(アミノ酸配列を配列番号13、塩基配列の例を配列番号14にそれぞれ示す。Duet-1-nfsAを作製した。Duet-1-nfsAを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたnfsA産生大腸菌株を培養してnfsAを発現させた。coli)由来の酵素であるnfsB(アミノ酸配列を配列番号15、塩基配列の例を配列番号16にそれぞれ示す。Duet-1-nfsAを作製した。Duet-1-nfsBを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたnfsB産生大腸菌株を培養してnfsBを発現させた。前記のnfsA及びnfsB産生大腸菌株をそれぞれ、40mg/Lのストレプトマイシン硫酸塩を含む5mLのLB培地を用い、300rpmで振盪しながら28°Cで16時間前培養した。この前培養液1mLを、80mg/Lストレプトマイシン硫酸塩を含む100mLのTB培地に植菌し、120rpmで振盪しながら30°Cで4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に30°Cで18時間培養した。採取し、4-アミノ桂皮酸の定量を行った。上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、前記HPLCを用いて反応生成物を定量した。対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。[0130]結果より、nfsA産生大腸菌株は0.26g/Lの4-アミノ桂皮酸に変換し、nfsB産生大腸菌株は0.76g/Lの4-アミノ桂皮酸に変換し、対照の大腸菌株は0.32g/Lの4-アミノ桂皮酸に変換した。nfsA及びnfsBによる4-ニトロ桂皮酸から4-アミノ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。[0131]本発明は、バイオマス等のグルコースからの4-アミノ桂皮酸の合成が求められる分野において広く利用でき、産業上の有用性は高い。ライセンスをご希望の方、特許の内容に興味を持たれた方は、問合せボタンを押してください。同じキーワードでJ-STORE内を検索することが出来ます。