Reporter,1995,vol.13(1),p.26-30)の方法を改変し行った。この方法では、すりつぶした試料にDNA抽出溶液を加え、保温・冷却処理したのち、遠心して得た上清にイソプロパノールなどの溶媒を加えてDNAを沈殿させ、必要に応じて遠心してDNAを分離する。TEとリボヌクレアーゼ溶液を加えてRNAを分解する。このRNase処理後の溶液にDEAEセファデックス混液を添加し、再度遠心して得た固形物に溶出バッファーを加えてDNAを溶出させ、これを常法により精製する。遺伝子とイントロン部分を含む領域を標的としてPCR法を行う。DNA、dNTPsにプライマー対を加えたものを用いる。反応工程は、常法に従い約90~96°Cの高温処理過程(変性)、約30~75°Cのプライマー・DNA結合過程(アニーリング)、約70~75°CのDNA複製過程(伸長)の3過程を1サイクルとする反応を30~40サイクル行ってDNAを増幅する。次に、増幅DNAの電気泳動を行う。これにより、増幅産物のうち品種間の識別性が現れる塩基配列であることを示すバンドを検出する。PCR法により増幅された産物を特定の制限酵素で処理した後、アガロースゲル等で分離すると、DNAがアガロース等のゲル中を直流電荷に引かれて移動する際に、DNAの分子量の差により分離され、臭化エチジウムブロマイド等により染色されてバンドとして増幅DNAの相違が検出されるのである。システム(プロメガ社)等を用いてクローニングを行う。DNAをプラスミドに組み込み、大腸菌に導入する。大腸菌を増殖させた後、プラスミドを取り出して精製し、DNAシーケンサーを用いてクローンの塩基配列を決定する。イチゴ各品種からのプラスミドの解析結果や公開されている配列情報を比較することによって、標的とした塩基配列中に品種間で特異的に変異しており、かつその差を制限酵素処理と電気泳動により検出できる部位が存在するかを調べ、品種識別用マーカーとする。(配列表の配列番号15)がある。これらは、挿入配列の有無、特定の制限酵素認識部位の有無により特徴付けられる。【0015】イチゴ品種は、これらの対立遺伝子の組み合わせが異なることから、識別が可能である。IIの認識部位の有無により識別される。I(配列表の配列番号23)の中から選ばれた少なくとも1種を識別用DNAマーカーとして用いることによって、イチゴ品種の識別をすることができる。本発明では、イチゴ品種として「とよのか」、「女峰」、「とちおとめ」、「章姫」、「さちのか」、「アイベリー」、「レッドパール」、「濃姫」、「サンチーゴ」、「ピーストロ」、「アイストロ」、「べにほっぺ」、「けいきわせ」、「セセナ」の14種類を供試したが、これらに限定されず、その他の品種であっても、本発明の方法により識別することが可能である。本発明を実施例などにより詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。DNA配列(AF158652)を選択し、このDNA配列情報を参考にして、フォワードプライマー(APXFP)(配列表の配列番号1)とリバースプライマー(APXRV)(配列表の配列番号2)を設計した。IH3号」の2品種、1系統の新葉からDNAを抽出した。塩化ナトリウム、0.5%ポリビニルピロリドン(MW40000)、1.4%ドデシル硫酸ナトリウム、pH5.5)1mlを加え、65°Cで10分間保温した後、遠心(15000rpm、10分間)して固形物を分離した。酢酸カリウム250μlを加えて氷中で10~30分間保冷後、遠心(15000rpm、10分間)した。次に、この上清約700μlを新しい遠心管に移し、同量のイソプロパノールを添加し、DNAを沈殿させた。EDTA、pH8.0)+リボヌクレアーゼ(RNase、終濃度0.1mg/ml)溶液200μlを添加し、55°Cで30分間保温してRNAを分解した。EDTA、塩化ナトリウム0.4M)で平衡化したDEAEセファデックス混液200μlを上記RNase処理後の溶液に添加し、10分程度ゆっくり混ぜた。この溶液を遠心した後、上清を捨て、洗浄バッファー500μlを添加してセファデックスを洗浄した。この洗浄操作を2回繰り返した。EDTA、塩化ナトリウム2.0M)を加え、DNAをDEAEセファデックスから溶出バッファー中に溶出させた。DNAを含む溶出バッファーを新しい遠心管に移し、イソプロパノールを添加した。10分間保冷(-80°C)後、遠心してDNAを集め、70%エタノールで洗浄した。得られたDNAを乾燥して1/10に希釈したTEバッファーに溶解した。【0020】このようにして抽出したDNA10~100ngを鋳型に、APX遺伝子及びイントロン部分を含む領域を標的にしたPCR反応を行った。100ng、dNTPs(100μM)5μlを混合し、上記のAPXFPとAPXRVをそれぞれ50pmolを加え、滅菌水を加えて合計の反応量を50μlとした。9700を使用し、94°C5分後、94°C30秒、55°C60秒、72°C60秒の反応を35サイクル行い、72°C5分間の伸長反応を補足した。増幅DNAの電気泳動は、コスモバイオ(株)製、ミューピッドIIを使用し、1.5%アガロースゲルで30分間泳動し、臭化エチジウムブロマイド染色後の紫外線照射によりバンドを検出した。QIAEX(キアゲン社)を用いてDNAを回収した。システム(プロメガ社)を用いてプラスミドに組み込み、大腸菌に導入した。用いて塩基配列を決定した。(配列表の配列番号10)等の複対立遺伝子を見出した。公開されているクローンAF158652と塩基配列を比較したところ、高い相同性があったものの、一部に異なる配列を有していた。Iの認識部位であった。Iの認識部位も存在しなかった。これらのことから、イチゴ品種は、これらの複対立遺伝子を組み合わせて持っていることが明らかとなった(表1)。配列表の配列番号3)とリバースプライマー(CHIRV、配列表の配列番号4)を設計した。CHI遺伝子及びイントロン部分を含む領域を増幅させた。塩基配列(前者が配列表の配列番号11、後者が配列番号12)を決定した。この配列は、公開されているAYO17486、AYO17478と高い相同性を有していた。複数の部位でDNA配列の異なる断片があった。認識部位を有していなかった。II認識部位の有無が異なる対立遺伝子が存在することが明らかとなった。配列表の配列番号7)を設計した。F3H遺伝子及びイントロン部分を含む領域を増幅させた。用いてクローニングし、複数のクローンについて塩基配列を決定した。得られたクローンF3HCesena1、F3HCesena2、F3HCesena3は、公開されているAOY17482、AOY17479と高い相同性を有していたが、複数の部位でDNA配列が異なっていた。