ミトコンドリアの形態が細胞機能と密接な関係があることから、ミトコンドリアのクリステ注1)を生きたまま可視化できるイメージング技術が求められていた。Yellowを開発し、超解像STEDイメージング注2)により、細胞が生きたままの状態でクリステ構造を鮮明に捉えることに成功した。クリステの経時的な構造変化をリアルタイムで観察することが可能になった。ミトコンドリア障害が関与する神経変性疾患の診断技術や治療薬開発ツールとしての応用が期待される。Yellow(マイトピービー・イエロー)」を開発し、ミトコンドリアの内膜構造を超解像STED顕微鏡によって、生きたまま鮮明に可視化することに成功しました。繰り返しの撮影でも褪色しないことから、経時的な内膜の形態変化を追跡することも可能です。ミトコンドリアは、内膜と外膜に囲まれた二重膜構造になっています。内膜は「クリステ」と呼ばれ、内側に折り畳まれたひだ状の構造をとることによって細胞に必要なエネルギー産生の効率を高めています。3)を用いる手法が最も一般的ですが、生きた細胞には適用できません。これに対し、光の回折限界注4)を超える分解能で微細構造を可視化する「超解像顕微鏡」を用いると、細胞が生きたままの状態で細胞小器官を観察することができます。超解像顕微鏡でミトコンドリアのクリステ構造を可視化するには、従来のミトコンドリア標識剤注5)では内膜のみを染色できないことが問題でした。加えて、光照射によって蛍光色素が著しく褪色してしまうため、クリステの構造変化をつぶさに観察し続けることができませんでした。Yellow」の開発に成功しました。Yellowは、ミトコンドリア内膜に存在するタンパク質と結合し、強く発光するという性質をもっています。STED顕微鏡技術とあわせることにより、細胞が生きたままの状態でクリステ動態を鮮明に捉えることに成功しました。ミトコンドリアの形態は、細胞のエネルギー代謝のみならず、パーキンソン病やミトコンドリア病などの神経変性疾患とも深く関連することから、診断薬としての応用や治療薬開発ツールとしての利用が期待されます。オンライン版に掲載されます。トランスフォーマティブ生命分子研究所(WPI-ITbM)の支援のもとで行われたものです。本成果の一部は以下の事業による支援を受けて行われました。康志)<研究の背景と経緯>ミトコンドリアは生命活動に必要なエネルギーを作り出す細胞小器官で、内膜と外膜と呼ばれる二種類の脂質膜に囲まれた構造になっています。内膜にはエネルギー産生に必要な酵素が多数あり、「クリステ」と呼ばれるひだ状の折りたたみ構造をとることによって表面積を多くし、エネルギー産生効率を上げています(図1)。クリステの形態変化は非常に動的で、細胞機能と深く関連しており、その膜構造と生理機能を解明することは生命の本質を理解する上で重要です。クリステの形態制御異常はミトコンドリア病注6)に代表される神経変性疾患にも関与することから、その構造を簡便かつありのままに見るための技術が必要とされています。ミトコンドリアの構造は従来の光学顕微鏡でも簡単に観察することができますが、クリステが形成している層構造は、光の回折限界のため検出することができません。そのため、クリステの微細構造を見るためには古くから透過型電子顕微鏡(TEM)が使われてきました。これに対して、近年目覚ましい発展を遂げている超解像顕微鏡は、光の回折限界を超えた分解能で微細構造を可視化する技術であり、細胞が生きたままの状態で観察できるという利点があります。顕微鏡は、蛍光分子を励起するためのレーザーと、脱励起注7)して蛍光放出を抑制するSTEDレーザーの二種類を使用します。STED顕微鏡は高い時空間分解能で観察できることが特長ですが、強いレーザー光照射のため、蛍光色素の褪色が促進されてしまうことが欠点でした。10374)を開発し、これが極めて高い耐光性をもつことを見いだしています。Yellowを開発しました(図2)。Yellowは、色素近傍に存在するタンパク質のシステイン残基と共有結合可能な官能基をもっています。色素の周辺環境に依存した蛍光応答を示し、極性環境下では、ほとんど蛍光を示しませんが、脂質膜などの低極性環境下にある場合には強く発光するという性質ももっています。これらの特性によって、ミトコンドリア内膜だけを可視化できることがわかりました。Yellowは細胞膜透過性をもっていることから、培地に色素を添加するだけで蛍光標識することができます。Yellowは超耐光性に加えミトコンドリア内膜に対する高選択性を兼ね備えているので、STED顕微鏡によってクリステを観察することができます。共焦点画像ではクリステは全く見えませんが、STED顕微鏡画像ではクリステの層構造を明瞭に可視化できることがわかりました(図3a)。nmであり、一つ一つのクリステ構造を容易に区別することができます。この技術を用いることにより、細胞を飢餓状態で培養した際に、ミトコンドリアのクリステ密度が高くなる様子(図3b)や、ミトコンドリアDNAの複製阻害によってクリステが同心円状に重なっている様子(図3c)も観測されました。超耐光性色素の最大の利点は、強いレーザー光照射下でも同一エリアを繰り返して撮像できることです。STED顕微鏡によるタイムラプス観察注8)を行ったところ、ミトコンドリアの融合や膨潤時におけるクリステの動的な形態変化をリアルタイムで捉えることができました。Yellowの有用性を強く示すものです。Yellowと超解像STED顕微鏡の組み合わせにより、固定した細胞ではなく、生きた細胞のミトコンドリア内膜構造を精微に捉えることができました。ミトコンドリアの機能は多岐にわたり、クリステ構造との関連性を解明する上で、本成果は強力な技術になります。基礎医学分野や創薬分野においても、ミトコンドリアが関連する疾患研究への応用が期待されます。ミトコンドリアの構造ミトコンドリアは内膜と外膜で囲まれた構造をもち、内膜は折り畳まれた「クリステ」と呼ばれる膜構造を形成している。超耐光性ミトコンドリア内膜蛍光標識剤の化学構造リンと炭素原子によって構造強化された蛍光色素骨格は極めて高い耐光性をもつ。環境応答性により、膜構造に局在した色素のみが強い蛍光を示す。図中の置換基Rに導入したトリフェニルホスホニウム注9)の効果によってミトコンドリアに集積し、R’のエポキシド注10)が膜タンパク質と反応して共有結合が形成される。Yellowで標識したミトコンドリアの共焦点画像とSTED顕微鏡画像の比較。細胞をHBSS飢餓状態注11)で培養するとミトコンドリアが細長くなり、クリステの密度が経時的に増えていく。ミトコンドリアDNAの複製阻害剤で細胞を処理すると、同心円状に重なったクリステの構造が観察される。共焦点画像では検出することができない。<用語解説>注1)クリステ:ミトコンドリアの内膜のうち、内側に折り畳まれてできたひだ状の構造体。注2)超解像STEDイメージング:光学顕微鏡がもつ空間分解能の理論上の限界を超えて観察できる顕微鏡を総称して超解像顕微鏡という。depletion)を利用した顕微鏡技術が超解像STEDイメージングである。誘導放出とは、励起状態にある分子に対して、外部から光子を加えると、入射光と同じ波長と位相をもった光を放出しながら基底状態に移る現象であり、レーザーの発信などに応用されている。注3)透過型電子顕微鏡:電子顕微鏡の一種であり、観察対象に電子線を当てて、透過した電子線の強度から画像化する。注4)光の回折限界:光は波としての性質をもつため、レンズで光を集光しても、焦点では点にならずに広がりをもつ。点の大きさの限界は光の波長とレンズの開口数によって決定される。注5)ミトコンドリア標識剤:ミトコンドリアを蛍光顕微鏡によって観察するための蛍光標識試薬。機能が低下する難治性疾患である。注7)脱励起:誘導放出によって、励起状態を強制的に基底状態に戻す現象。注8)タイムラプス観察:一定間隔で静止画を連続撮影し、変化を経時的に観察する手法。注9)トリフェニルホスホニウム:–P+Ph3で表される脂溶性の陽イオン。注10)エポキシド:大きな環ひずみをもつ3員環のエーテルであり、システインのチオール残基など求核性の高い官能基と反応して共有結合を形成することができる。Solution:ハンクス平衡塩溶液)中で培養すると細胞が栄養飢餓状態になる。〒113-0033東京都文京区本郷7-3-1お問い合わせアクセスカウンター373755累計アクセス数:320本日のアクセス数:海外からの皆様へ教職員向け情報(英語のみ)。