here.Abstract嫌気性細菌は、これまで、このような腸、口、膣などの多くのヒトのニッチで好気性菌数を上回ります。嫌気性感染は一般的であり、しばしば先住民起源のものです。ヒトの細胞に侵入するためにいくつかの嫌気性病原体の能力は、彼らに先天性免疫を逃れるためだけでなく、宿主細胞の挙動を調節するために、適応策を提供します。嫌気性細菌は、イベントの実験的調査中に生きていることを確保することが課題を提起することができる。グラム陰性嫌気性菌は、真核生物の非食細胞の多様な侵入が可能です。この記事では、成功した文化とは、Pの能力を評価する方法について説明ジンジバリスは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を浸潤します。宿主細胞と相互作用する細菌を可視化するために成功裏に侵入し、宿主内で生存することができる細菌を測定するためのものを、その他:2つのプロトコルが開発されました。robic室最適な成長のための嫌気性環境でジンジバリス。第一のプロトコルは、主に細菌に​​よる宿主細胞の浸潤を研究するために使用される抗生物質保護アッセイに基づいています。抗生物質保護アッセイは限られています。抗生物質処置および宿主細胞の溶解後に培養可能である唯一の細胞内細菌が測定されます。病原体相互作用を調べるために、蛍光顕微鏡を使用するプロトコルを開発しました。カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル(BCECF-AM)で標識し、嫌気性条件下で真核細胞を感染させるために使用されます。0.2%トリトンX-100で透過処理し、パラホルムアルデヒドで固定した後、宿主細胞は、それぞれ、細胞骨格と細胞核を標識するためのTRITCファロイジンおよびDAPIで標識されます。複数のIMA異なる焦点(Zスタック)で撮影されたGESは、細菌の時空間視覚化のために得られます。任意の真核細胞型に適用することができます。Introduction嫌気性細菌は、人間の体のほぼすべての面にコロニーを形成します。1上に高レベルで存在します。嫌気性細菌は、内因性感染症の一般的な原因であり、病気のサイトから頻繁に分離されています。その気難しい性質上、嫌気性菌が分離し、培養することは困難です。それらが存在する宿主細胞とのダイナミックな関係と共進化を開発しました。ほとんどの嫌気性菌はinfectiに到達する前に宿主免疫応答による殺傷に影響されやすいです組織単位(OU)レベル。いくつかの病原性細菌から逃れるか、宿主の免疫応答を破壊するメカニズムを開発しました。両方の経口に関与し、グラム陰性嫌気性菌。ホスト5-7の病原性の変化を引き起こすことができる非常に適合細菌性病原体の一例です。歯と歯肉粘膜組織との間に形成された深い裂け目に計上バイオフィルムプラークのポケットには、大気中の酸素8から保護されている嫌気性細菌を抱くことができます。P.ジンジバリス改造が可能であるキーストン病原体であります歯周病10の発症と進行を促進する方法で、口腔微生物のコミュニティをる。これは、宿主タンパク質の広いスペクトルに対して活性である毒性因子を大量に生成し、宿主防御の回避11ためのメカニズムを提供します。歯根膜細胞に侵入することが可能です。効果的に宿主細胞に侵入することにより、P。ジンジバリスは、宿主の免疫を逃れることができます。宿主細胞の効果的な侵入だけでなく、細菌が宿主防御をエスケープすることを可能にするだけでなく、将来の再感染するためのリザーバとして働くだけでなく、宿主細胞を変化させます。宿主細胞が細菌の接着および内在化に関与する分子機構の研究が必要とされています。Pの内部に関連する分子事象を理解することに焦点を当てています宿主細胞によってジンジバリス同様に抑制し、免疫応答をハイジャックし、敵対的な宿主防御機構を生き残るために使用されるメカニズムとして。宿主細胞に侵入することができる病原体を同定し、特徴付けることが可能な多くのアッセイがあります。これは、酸素の不存在下でかさばる器具に依存して研究を行うことが困難であるためしかし、嫌気性病原体によるインビトロ研究は、主に研究者のために多くの実験的な問題を引き起こします。これは、真核細胞が増殖するために酸素を必要とし、従って、組織培養インキュベーター中で別途用意しなければならないという事実によって悪化します。このような障害物を回避する一つの方法は、大気中の酸素の下で研究を行うことであろうが、それは、嫌気性細菌の増殖を不可能にするであろう。別の方法は、感染して宿主細胞の相互作用を研究するために加熱殺菌細菌を使用することであろう。違いは、ホスト病原体interactiの関連性を低下させる熱殺菌し、生菌の間に存在します16に。これは、宿主細胞との相互作用変更のない表現で生菌を研究するために中央です。Pを培養するため、方法嫌気性環境におけるジンジバリスが与えられます。2つの簡単なコスト効率の高いプロトコルがPの能力を評価するための実証されヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)によって内在するジンジバリス。最初のプロトコルは、人気のある抗生物質保護アッセイに基づいています。アッセイは簡単であるが、嫌気性微生物を用いた検討事項が挙げられます。第二プロトコルは、相互作用可視化する蛍光顕微鏡の使用を必要とし、Pを内在化ジンジバリス。各アッセイは、制限および嫌気性細菌の侵襲性を研究するための研究者に概要を提供するために説明される利点を有します。研究しているがジンジバリス及びHUVECを、これらのプロトコルは、他の多くの嫌気性細菌のために使用することができます宿主細胞の他のタイプのように。;しかしながら、これらのプロトコルは、嫌気性病原体の数のために使用することができます。HUVECを用いているが、このプロトコルは、免疫および非免疫の両方の他の真核細胞のために使用することができます。1.嫌気性チャンバーを使用するとメンテナンス注意:ポルフィロモナス・ジンジバリスは、周囲の空気中に遭遇酸素の正常なレベルに敏感嫌気性菌です。制御嫌気性環境は、Pの栽培のために不可欠ですジンジバリス。図1A)内の混合嫌気性ガスとして指定された人工的な雰囲気を維持します。図1B)を使用します。図1C)を使用します。Oを除去し、汚染の拡大を促進するエアロゾルを回避するために、チャンバ内の除湿器を置きます。注:硫化水素は、多くの嫌気性細菌の天然の代謝副産物であり、その蓄積は細菌に有毒であり、電子機器に損傷を与えると、触媒の寿命を低下させることができます。図1D)中の酸素を除去し、パラジウム触媒、を介してチャンバの雰囲気を循環させるためにファンボックスを使用してください。注:再循環の大気(HEPA)フィルターは0.22ミクロン以上の大きさで空気中の汚染物質を除去します。チャンバー内で作業するときは、標準的な無菌技術を使用してください。図1.嫌気性ビニル室およびその構成要素(A)大気中の酸素から完全に密封されたビニール嫌気性チャンバーは、一度に(32×78でに)二人の個人のためのワークスペースを提供します。これは、(バック中央)37°Cに設定したインキュベーターが含まれています。(B)は、嫌気性チャンバーエアロックのラボ環境からのアイテムの転送に使用されます。写真は自動的に嫌気性環境を作成するために必要な真空及びパージ手順を実行するようにプログラムすることができるコントローラを介して操作する自動エアロックです。(C)硫化水素除去カラムは、望ましくない硫化水素のメンテナンスフリーの高容量の除去を提供します。(D)2つの触媒ファンボックスであります水素の存在下で、酸素を除去し、パラジウム触媒を介してチャンバの雰囲気を循環を助けるために嫌気性チャンバー全体に置きました。嫌気性チャンバーは、製造元の指示に従って設定されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。ジンジバリスは耐気で、好気的条件で保存することができますが、それは6%17,18よりも高いレベルで酸素の存在下で成長しません。19を使用する前に必要とされます。嫌気コンディットにすべての液体培地、プレートを平衡化残留酸素を除去するために、実験前に少なくとも12時間のイオン。