すべての染色を、5%FBS及び2%BSAを含有するPBS中の0.2%トリトンX-100で行い、リンスは、PBS中の0.2%トリトンX-100であった。抗CC10による染色は、約6時間にわたって徹底的な洗浄に続いて4°Cで72時間加熱した。アレクサフルーア-594二次抗体を用いて達成された。翌日、染色された葉は50%、70%、およびDBE中で30分間、続いて、DCM中で20分間、続いて100%THF三30分間の洗浄、続いて30分ごとに、80%のTHFを介してクリアされた。100μm単位でのスケールバー。膵臓の3DISCOは。プロトコルで上記のようにマウスの灌流後、膵臓を解剖し、短いプロトコルでクリア。tdTomato再結合に由来している。矢頭は、島での蛍光標識α細胞の一部をマーク。500μm単位のスケールバー。様々な組織のためのプロトコルをクリア表1。異なる組織のための組織クリアリングプロトコルの例。クリアリング性能を向上させるために必要な各ステップのクリア時間を短縮または延長することができることに留意されたい。mgおよび脳は〜300〜500ミリグラムである。">この表の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。Discussion組織決済方法はクリア器官において異なる組織層の屈折率を一致させることにより、撮像光の散乱を低減することを目指し。これにより、撮像光が深部組織に浸透し、標識された細胞/分子を刺激することができる。17をクリアする組織のこの古い概念はDodtと同僚2による完全なマウスの脳での技術の最初の高度なアプリケーションの後に成長して注目を集めている。3,4,7,18-20など、新しい決済方式の急速に成長しているリストがあります。基本的に、彼らはすべての蛍光標識を保存することによって深部組織イメージングのための透過的な臓器をレンダリングすることを目指しています。その中でも、3DISCOは最も簡単で再現性のある方法の一つとして際立っている。これは、比較的速い他の清算上記の方法(1-5日対成人の脳のための2〜3週間のそれぞれ)21と比較される。乳腺3,4,9などの異なる器官に適用される。独立した研究グループによっていくつかの出版物は、既に撮像結果22,23を取得するには、このメソッドを使用していました。それにもかかわらず、異なる組織のクリア手順は、さまざまな条件のために有利である可能性があります。EとSeeDBは胚組織6,7で最高適用可能である例えば、彼らは、撮影時の取り扱いが容易になる可能性があり、水ベースのクリア方法、である。対照的に、CLARITYは、複雑で高価な決済方法である。3DISCOから最高の撮像結果を得るために最も重要なステップは、組織のクリアの前に実施される組織のラベルです。これは、可能な最も強い蛍光シグナルで開始することが必須である。これができるBeは、合成染料、ウイルストランスフェクションまたは抗体標識によってトレースを、蛍光タンパク質の遺伝子組換え発現を含む様々な方法で達成した。これは、任意の決済手続きが組織の蛍光シグナルが減少していることに留意すべきである。-それはクリアされた組織のクリアイメージングの前に容易に検出可能ではない、つまり悪い結果をお届けします。改善を待っている方法をクリアするいくつかの制限があります。重要な制限は、クリアな試薬がクリア臓器の構造を変化させるので、それらは生きている組織上で使用することができないことである。24と同様の実験を固定し、クリアする前に行われるべきです。クリア時には、明るく光安定タンパク質からの蛍光シグナルの超解像が可能となる。クリアリングプロトコルが減少するので、蛍光タンパク質の強度、クリア臓器を長期間保存することができません。これは、いくつかの臓器をクリアするのが困難であることに留意することが重要である。脾臓、肝臓)を多量に保持する場合は特に、それらがクリアされ、画像が比較的困難である。このような成人の齧歯類の脳の大きさの組織のための完全な消去を達成することも比較的困難である。このような組織は、他の一方で、蛍光シグナルを減少させる可能性がある、より長いインキュベーション時間を必要とすることができる。高解像度で一度にすることができる画像大きい透明な器官顕微鏡検査法の開発は、対処すべき待機中の必要があることである。技術の他の重要な制限は、組織の標識である。遺伝やウイルス発現により強い蛍光シグナルが理想的ですが、必ずしもすべての細胞または分子は、遺伝子またはウイルス標識することができる。厚い組織の抗体の標識は、直接的な手順またはさらにPOはありませんほとんどの場合、ssible。それは、(数週間に数日)の特別透過化プロトコルと長いインキュベーション時間が必要になる場合があります3。それは、組織による脱水、脱脂主にクリアした後に(脊髄組織を測定)、各次元で約20%に縮小していることを心に留めておくことも重要です。この収縮は、レシオメトリック発生し、定量化ステップで修正する必要があります。提示された結果で観察されたように、蛍光標識した構造がクリアされた組織中のタンパク質の完全性の指標である、そのまま残ります。Focusclear-するCLARITY-80%グリセロールで使用されるため、最終的にクリア組織の疎水性の性質のために、さらに抗体で染色することができない、または水を含有する溶液に包埋した。最後に、撮像データの圧倒的な大きさを分析することが課題である。神経細胞やグリアネットワーク)および自動化された方法で、異なる試料の上に比較する。研究者は、新しい決済方法を見つけることを目的としながら、要約すると、(多様な組織をクリアすることの難しさ、広い面積を高解像度で画像化し、複雑なデータ分析)上記の様々な課題を並行して改善されるべきである。結論として、3DISCO含む最近開発された組織のクリア技術は、エレガントに無傷の器官の高解像度の3D画像が現在可能であることを実証している。これらの方法を使用して、科学者たちは、無傷の器官において細胞および分子の解剖学的情報を得ることができます。透明な器官でこれらの先駆的な3Dイメージング研究は、複雑な解剖学的およびヒースおよび疾患における組織/器官の分子組織を解読する研究者が増えて鼓舞。Disclosures開示することは何もありません。Solloway(ジェネンテックに感謝)膵臓イメージングで使用したマウスについて。Sanes(セントルイスのワシントン大学)とR·リットマン(NYU)によるCX3CR1-GFPマウスによって作成されました。gdpr@jove.com.。