他のウイルス(例えば、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはA型肝炎ウイルス)は、培養組成物および培地条件に関わらず、不十分に増殖されることが知られている(ProvostおよびHillemann、Proc.Soc.Exp.Bio.Med.,160:213−221(1979);ならびにRolleおよびMayr(前出))。【0014】ウイルスの増殖後、これは通常、培養物から単離される。Enzymology、第182巻、1990)。従って、本発明の根底にあるこの問題は、より大きいウイルス増殖および単純化された多量の回収を可能にする、細胞培養物中のウイルス増殖のための方法を提供することからなる。本発明は、例えば、以下を提供する:(項目1)細胞培養におけるウイルスの増殖のための方法であって、該方法は、以下の工程:(a)細胞をウイルスに感染させる工程;(b)感染後に、該ウイルスの増殖を可能にし、かつ同時に、さらに少なくとも2倍の該細胞の増殖を目的とした条件下で、該細胞を細胞培養において培養する工程、を包含する、方法。(項目2)感染後に、少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍の前記細胞の増殖を引き起こす条件下で、該細胞が培養される、項目1に記載の方法。間、細胞培養において前記細胞が培養される、項目2に記載の方法。分が少なくとも1回添加されるか、あるいは該ウイルスおよび細胞の少なくとも一部分が、新鮮な培地、培地濃縮物または培地成分を含む培養容器に移される、項目1〜3のいずれか1項に記載の方法。培地成分の添加、または前記細胞およびウイルスの、別の培養容器への移転が少なくとも1回繰り返される、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。培地成分の添加、または前記細胞およびウイルスの、別の培養容器への移転が少なくとも数回繰り返される、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。(項目7)前記培地が、前記ウイルスおよび細胞の増殖の間に取り除かれる、項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。培地濃縮物または培地成分が添加される、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。(項目9)前記細胞がMDCK細胞である、項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。(項目10)感染前に、前記細胞が、接着培養されるか、または懸濁培養物として培養される、項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。(項目11)感染後に、前記細胞が、接着培養されるか、または懸濁培養物として培養される、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。(項目12)前記MDCK細胞が、細胞株MDCK33016に由来する、項目1〜11のいずれか1項に記載の方法。(項目13)前記ウイルスが、ssDNAウイルス、dsDNAウイルス、RNA(+)ウイルス、RNA(−)ウイルスまたはdsRNAウイルスである、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。(項目14)前記ウイルスが、アデノウイルス、オルトミクソウイルスもしくはパラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスから選択される、項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。(項目15)アデノウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルスおよび関連東部(ロシアまたは他の)形態、デングウイルス、黄熱病ウイルス、C型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、ラブドウイルス、肺炎ウイルス、レオウイルス、1型ヘルペス単純ウイルスまたは2型ヘルペス単純ウイルス、サイトメガロウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、イヌアデノウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、およびウシヘルペスウイルスもしくはブタヘルペスウイルス、BHV−1様ウイルス、または仮性狂犬病ウイルスが、前記細胞の感染のために使用され、ここで、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはA型肝炎ウイルスが特に好ましい、項目14に記載の方法。(項目16)ウイルスゲノムが少なくとも10kdのサイズの異種機能性タンパク質をコードする配列を有する、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。(項目17)前記培地が、血清を含まない、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。(項目18)前記培地が、化学的に規定された培地である、項目1〜17のいずれかに一項に記載の方法。(項目19)前記培地が、タンパク質を含まない、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。(項目20)前記ウイルスの増殖が、灌流システムにおいて行なわれる、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。(項目21)前記ウイルスの増殖が、バッチシステムにおいて行なわれる、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。(項目22)前記MDCK細胞が、前記ウイルスの増殖のために30°Cと40°Cとの間の温度で培養される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。養される、項目1〜22のいずれか1項に記載の方法。(項目24)前記培地のpH値が、前記ウイルスの増殖のためにpH6.8とpH7.8との間である、項目1〜23に記載の方法。(項目25)前記ウイルスが、10−8と10との間のMOI値での感染によって前記MDCK細胞に導入される、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。収された細胞から単離される、項目1〜25のいずれか1項に記載の方法。記MDCK細胞の少なくとも一部分から分離される、項目26に記載の方法。(項目28)前記分離が、ディープベッドフィルタまたは分離器によって起こる、項目27に記載の方法。(項目29)精製が、前記ウイルスの濃縮のための超遠心分離法を包含する、項目26〜28のいずれか1項に記載の方法。(項目30)前記精製が、クロマトグラフィーを包含する、項目26〜29のいずれか1項に記載の方法。(項目31)前記ウイルスが精製の間、不活性である、項目26〜30のいずれか1項に記載の方法。(項目32)項目1〜32のいずれか1項に記載の方法を含む、薬物または診断剤の製造方法。薬物キャリアと混合される、項目33に記載の薬物または診断剤の製造方法。【0019】ここで、この問題は、ウイルス増殖のための方法によって解決されており、この方法において;(a)細胞をウイルスに感染させ;(b)感染後に、該ウイルスの増殖を可能にし、かつ同時に、さらに少なくとも2倍の該細胞の増殖を目的とした条件下で、該細胞を細胞培養において培養する。驚くべきことに、細胞培養物中でのウイルス増殖のための、有意に改善された方法は、この方法の過程が根本的に変更される(すなわち、細胞増殖がまた、ウイルスの増殖の間にも可能となる)場合に、得られる。このことは、有意により多くのウイルスがより短い時間で得られ得るという利点を有する。細胞培養用の設備の産出量もまた、改善される。本発明に従って、細胞培養は、感染後に細胞が、少なくとも2倍または5倍、好ましくは、少なくとも10倍増加するように、行われる。間にわたって細胞培養物中で増殖される。鮮な培地、培地濃縮物もしくは培養成分を含む培養容器に加えることが、有利であり得る。ウイルスおよび細胞の増殖の間に少なくとも1回、新鮮な培地、培地濃縮物もしくは培養成分を加えることが、好ましい。【0024】この培地、培地濃縮物または培養成分の添加は、好ましくは、少なくとも1回または少なくとも数回、繰り返される。新鮮な培養培地に置き換えられるか、またはその培養容量は、新鮮な培養培地を加えることによって増加される。分(アミノ酸、ビタミン、脂質画分、リン酸および他の物質など)によって生じ得る。これらの工程はまた、細胞培養の間、繰返し行われ得る。数の増加もまた可能にする。この系の収率は有意に改善されるので、対応する多重回収は、本発明に従う方法の有意な利点を表わす。本発明の方法において、MDCK細胞は、好ましくは、ウイルス増殖のために使用される。本発明に従う方法において使用される細胞において、懸濁培養物中で増殖する特性を有する細胞が含まれる。有意な利点を有することによって示される。33016に由来し得る。養物として増殖する特性の両方を有する細胞が、使用される。系、従って研究室規模から工業的製造までの細胞の発育のための培地が使用され得るという特別な利点を有する。対応する系は、医薬品登録を有意に単純化する。【0030】ウイルスは、一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)、二本鎖デオキシリボ核酸(dsDNA)、二本鎖リボ核酸(dsRNA)または一本鎖リボ核酸由来のゲノムを有し得る。この時、この一本鎖リボ核酸分子は、メッセンジャーRNAの極性(RNA(+))、または反対の極性(RNA(−))を有し得る。【0031】ウイルスは、先行技術で公知の任意のウイルスであり得る。Culture)のような種々の収集物から得られ得る。統が、一般に用いられる。1つの実施形態に従って、この方法において使用されるウイルスは、以下からなる群より選択される:アデノウイルス、オルトミクソウイルスおよびパラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス。病ウイルスが使用され、ここで、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはA型肝炎ウイルスが、特に好ましい。本発明の別の実施形態によると、ウイルスのゲノムは、少なくとも10kdのサイズを有する、異種の機能性タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。Therapy,1995年11月、6:1403〜1416)。本発明の状況において、ウイルス性ゲノムが、配列の付加または置換によって改変された結果、このゲノムが、少なくとも10kdのサイズを有する異種の機能性タンパク質(すなわち、ウイルスに元来属さない)をコードするそれらのウイルスの増殖のための方法がまた、含まれる。酵素またはサイトカインとしての作用)を有し得る。本発明による方法において使用されるウイルスはまた、ウイルス性ゲノムにおける個々の遺伝子の欠失を有し得る。病原性因子をコードするワクチンとして使用されるウイルスの遺伝子は、故意に欠失され得る。対応する欠失は、好ましくは、多くても500個または多くても1000個のヌクレオチドを含む。本来、本発明に従う方法によって使用されるウイルスはまた、完全ウイルス性ゲノムを含み得る。発明の方法によって生じ得る。学的使用の登録をかなり簡易化するので、特別な利点は、血清の不在によって得られる。工程がまた、避けられる。産物の品質に対する改善が、それゆえにまた、達成され、そしてコストはこの理由で避けられる。培地は、本発明の状況において、人または動物起源の血清に由来する添加物が全くない、無血清培地として参照される。培養およびその後の使用への干渉効果を有さない特定のタンパク質が、対応する培養に対して規定された量で添加され得る。この型の培養培地は、化学的に規定された培地として参照される。マイトジェンペプチド、インシュリン、トランスフェリンまたはリポタンパク質のような選択されたタンパク質が、この培地に添加され、これらは、当業者に公知の異なるプロデューサーから得られ得る。(例えば、大豆タンパク質加水分解物または他の有用な植物のタンパク質由来の溶解産物)を意味すると理解される。【0039】しかし、特定の好ましい実施形態によると、培地は、タンパク質を全く含まない。物および非血清タンパク質を排除して生じる培養を意味すると理解される。養において増殖する細胞は、本来的に、タンパク質自身を含む。Bioscience)が挙げられる。一般的な血清含有培地としては、以下が挙げられる:イーグル基礎培地(BME)または最小必須培地(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))あるいはダルベッコ改変イーグル培地(DMEMまたはEDM)(これらは、10%までの胎児ウシ血清または類似の添加物とともに、一般的に使用される)。質による汚染が排除され得るという特別な利点を有する。本発明による方法は、灌流システムまたはバッチシステムにおいて実施され得る。培地が連続的に供給および排出される培養システムは、灌流システムとして参照される。これに代わるようなものとして、細胞はまた、システムが、接種から回収までの培地を供給しないほぼ閉鎖されたシステムとして運転されるバッチシステムにおいて培養され得る。用の要件に適合され得る。以下の情報は、それゆえに、単にガイドラインを示すに過ぎない。感染前の細胞の増殖は、遠心分離またはろ過のような従来の支持方法を使用する灌流システムにおいて、種培養または小培養管から開始して実施され得る。このようなシステムにおける細胞の初期培養の間に、培養培地を、発酵槽充填物を1日あたり3回までの割合で交換することが有利であると証明されている。細胞は、2×107の細胞密度までこれらの条件下で増殖され得る。密度は、37°Cの温度および20〜30時間の生成時間で達成され得る。【0046】さらに、細胞は、感染の前に、供給バッチシステムにおいて、本発明に従って増殖され得る。本発明の状況において、培養システムは、細胞が、バッチシステムにおいて初期に培養され、そして培地中の栄養分(または栄養分の一部)の枯渇が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補われる供給バッチシステムとして参照される。供給バッチシステムにおいて、細胞は、約1×106〜10×106の細胞密度まで増殖され得る。感染前の細胞の増殖の間に、培地のpH値を、pH6.6〜pH7.8の間の値、そして特にpH7.2〜pH7.3の間の値に調節することが有利である点がまた証明されている。感染前の細胞の培養は、好ましくは、30°Cと40°Cの間の温度、そして特に33°Cと37°Cの間の温度で行われる。感染前の培養の間、酸素分圧は、好ましくは、25%と95%との間の値、そして特に35%と60%の間の値に調節される。本発明の状況において記載される酸素分圧についての値は、空気中の飽和量に基づく。細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約8×105〜25×105細胞/mLの細胞密度で行うか、または灌流システムにおいては、好ましくは、約5×106〜20×106細胞/mLの細胞密度で行うことが、本発明に従う方法に関して有利であると証明されている。;感染時における細胞あたりのウイルスユニットの数に対応する)で感染され得る。感染後の細胞の培養はまた、灌流システム、バッチシステムまたは供給バッチシステムにおいて行い得る。前記で使用された培養条件と同じ培養条件が、使用され得る(30°Cと40°Cの間の温度、5%と100%との間の酸素分圧、pH6.6とpH7.8との間の培地のpH値)。【0051】ウイルスまたはそれによって生成されたタンパク質の回収および単離を包含する方法はまた、本発明に従って利用可能となる。ウイルスまたはタンパク質の単離の間に、細胞は、分離、ろ過または限外ろ過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。ウイルスまたはタンパク質は、勾配遠心分離、ろ過、沈殿、クロマトグラフィーなどのような当業者に周知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。本発明に従って、ウイルスは、精製中または精製後に不活性化されることが好ましい。ウイルスの不活性化は、例えば、精製プロセス中の任意の時点で、β−プロピオラクトンまたはホルムアルデヒドによって行われ得る。本発明に従う方法は、薬物の生成に特に適しており、特に、ワクチン薬および診断薬の生成に適している。/または薬物キャリアとの混合を包含し得る。本発明の状況におけるアジュバントは、免疫応答を増強させる物質を意味すると理解される。これらは、種々の金属の水酸化物(例えば、水酸化アルミニウム)、細菌細胞壁の成分、オイルまたはサポニンを含む。防処置または治療処置に特に適している。免疫原性および/または対応するワクチンの効能は、感染を負荷を伴う防御実験または中和に必要な抗体力価の決定のような、当業者に公知の方法によって決定され得る。型の抗体決定またはタンパク質決定のような、当業者に周知の標準的な方法に従って、抗原の力価または量の決定によって行われ得る。本発明に従う方法はまた、診断用組成物の生成に適している。組成物は、本発明の方法から得られるウイルスまたは本発明の方法によって産生されるタンパク質を含み得る。行技術において一般的な添加物および検出剤との組み合わせにおいて、これらの組成物は、ウイルス抗体またはアンチウイルス抗体の検出に適した診断試験として使用され得る。Verlag,pp.22〜23を参照のこと)。養物を、100μL量のウイルス希釈液でマイクロタイタープレートにおいて感染させ、ここで、10−1〜10−8のウイルス物質の希釈を使用した。ウイルス力価測定の評価を、試験培養物としての細胞変性効果によって顕微鏡的に、またはウイルス特異的抗体を使用する免疫学的検出のいずれかによって行った。ウイルス特異的抗体の結合は、フルオレセイン標識された抗体を用いた免疫蛍光として可視化されるか、またはビオチン標識された二次的抗体およびストレプトアビジン/ビオチン/ペルオキシダーゼ増幅複合体、ならびに沈殿可能な色素(Gregersenら、Med.Microbiol.Immunol.,177:91〜100)を使用して可視化される。養感染投与量50%(CID50)である。種々の型のウイルスに対して使用されるウイルス特異的検出細胞および、適用可能であるならば、免疫学的検出法が、ウイルス特異的な例において言及される。CHO、BioWhittaker、標準培地)を用いて、一般に約1:100で希釈した。間)によって新鮮な培養培地中にとり、そして攪拌培養ビン(100mLの作業容積、BellcoまたはTechne)中に注いだ。これらの培養物ロットを、磁気スターラーを50〜60rpmで用いて37°Cでインキュベートした。細胞増殖を、細胞数をチェックすることによってモニタリングした。1.6×106細胞/mLの最大について、8×105細胞/mLの細胞数に達したところで、この培養物を、新鮮な標準培地での細胞の希釈によって移し、そして100〜1000mLの作業容積の新たな攪拌培養ビンに播種し、そして最大の細胞密度または所望の細胞密度が上記のような攪拌の間に到達されるまで、インキュベートした。これらの細胞継代において、最大の細胞数が、必要に応じて、3〜5日間以内に達成されるように、1:4〜1:10の範囲で、対応する培養物の希釈を細胞増殖の型に適合させた。この型の細胞培養を、培地への補充物の添加なしに試行し、そして少なくとも10継代にわたって、問題なく維持し得た。【0058】(実施例2:接着性培養物としての、細胞培養物系の取り扱い)確立された懸濁培養物(実施例1を参照のこと)を、細胞数が約1×105細胞/mLになるように、異なる培地で希釈し、次いで、種々の細胞培養容器に注いだ(表1を参照のこと)。この細胞培養物容積を、対応する培養容器についての通常量(すなわち、播種表面にわたって約4mmの培養培地、または培養物表面2.5cm2について約1mLの培地)に対応させた。これらの培養物を、一般に、ほとんどの細胞培養物について一般的な37°Cの温度でインキュベートしたが、インキュベーション温度の有意な偏差もまた、顕著な損失なしに可能であった(表1を参照のこと)。系が、種々の培地および培養物系において、ほぼ同じに、そして確実に挙動することを示す。他のウイルス学的な標準方法もしくは免疫学的な標準方法のために、使用した。このような培養物は、プラーク精製または希釈によって、純粋なウイルス株を回収するために、特に適切であった。最後に、接着性培養物をまた、小規模および大規模(ローラービンでは、好ましくはより多い量)でのウイルス増殖のために使用した。CHO補充#:調節した値;+2°Cおよび−3°Cの偏差を有する、実際に測定した値*:製造業者:Bio−Whittaker(実施例3:ウイルスの単離、回収、および種ウイルス調製物の生成)初代単離体(ウイルス含有器官、組織または組織流体サンプル、咽喉スワブまたは便サンプルなど)を、標準的な培地(任意の他の培地またはリン酸緩衝液も同様に可能である)中で、氷浴中にて懸濁し、抗生物質(PSN:100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、50μg/mLのネオマイシン)を添加し、必要に応じてホモジェナイズした(乳鉢、外科用メスの刃、あるいはいわゆるDouncerホモジェナイザーまたはPotterホモジェナイザーで微細に破砕した)。得られた懸濁物を、0.45μm(より小さい被覆を有さないウイルスの単離については、0.2μmも)の細孔サイズを有する通常の実験室シリンジフィルタアダプタを用いて濾過した。濾液を、新鮮な培養培地を含む小さい培養フラスコ(25cm2、実施例2を参照のこと)中に接種した。収率を増大させるために、100μL〜1mLの接種材料と共に提供し、次いで37°Cでインキュベートした。上部気道からのウイルスの単離のために、33°Cのより低いインキュベーション温度にて、さらなる培養物を調製することが推奨される。明に従う培養物系における直接的な感染のために使用した。材料量を、一般に使用した。0.1および0.01のMOI(感染多重度)が、本発明に従う培養物系におけるこのような第一の感染のために好んだ;10のファクターだけ減少させる工程における10から0.0001までのMOIを用いた感染を、結果が不満足の場合に、反復した。感染培養物をウイルス関連細胞損傷(CPE、細胞変性効果)について顕微鏡で毎日試験し、そしてコントロール培養物と比較した。CPEを引き起こさないウイルスにおける代替として、この培養物を、特定のウイルス抗原またはその遺伝子の存在について試験した(例えば、ウイルスの型に依存する特定のHA試験;ELISA、PCR)。着性培養物のトリプシン処理および引き続く個々の細胞の希釈)、そしてさらにインキュベートして新たな培養物へと分配した。これは、1:4〜1:20の培養物の希釈まで、ほとんどの培地において一致して、培養物の数の対数増殖を回避したので、第二のこのような培養物継代の後に、少なくとも可能な培養物の一部だけを、さらに維持した。3〜4継代後、ウイルス単離体を、適切なウイルス含有出発物質から、首尾よく単離および検出し得た。いくつかのウイルスは、非常にゆっくりと増殖するか、またはCPEを示さず、従って、延長した継代およびインキュベーション時間または特定の試験(必要な方法は、特定のウイルス実施例の下に列挙する)によって、検出されるはずである。特別な検出系もまた必要とする、ゆっくりとした増殖を有する、CPEを有さないウイルスについての例として、A型肝炎ウイルスの特定の例が言及される。清が使用される場合に、他のウイルス、特に、特定のCPEを有さないウイルスの検出に適切な、記載された検出試験もまた存在する。希釈技術による、純粋な単離体の調製の後にのみ、使用されるべきである。Press、Oxford、1985を参照のこと)。攪拌培養物の感染のために使用する。一の感染は、10〜0.00001、好ましくは0.1〜0.0001のMOIを有する100mLの培養培地を用いた、小さい攪拌培養物で、最初に推奨される。迅速かつより高いウイルス値または収率を達成するために最も好ましい条件(特に、MOIおよび回収時間に関して)を、規定された生成規模および生成試行の数に従って、さらなるウイルス継代において、必要なサイズの培養物系で種ウイルスを生成するために、選択した。達成されるウイルス収率および規定された生成時間に依存して、この種ウイルス継代についての規模は、いくつかの攪拌培養物〜1000mLの規模〜小さい発酵槽〜ほぼ10L以上の容積までであり得る。回収したウイルスを、濾過または遠心分離によって、任意の細胞残留物を除去し、そして生成および可能な場合−70°C未満の温度での保存のために適切な少量へと、分割した。【0067】(実施例4:生成目的のための、接着性マイクロキャリア培養物としての系の取り扱い)接着性MDCK細胞の培養を、実施例2、表1に従って、BME+3%胎仔ウシ血清(FCS)を用いて、ローラービン中で実施した。この系における培養後、細胞を、ローラービンの表面から分離した。これは、当業者に公知の通常の方法を用いて、適切なトリプシン溶液を用いて、酵素的に実施した。拌培養物中で培養し、そしてマイクロキャリアを被覆するために直接使用した。3型のマイクロキャリア(Pharmacia)で満たした。このマイクロキャリア(単位体積当たりの重量5g/L)をオートクレーブし、そして栄養培地で馴化した。この方法は、マイクロキャリアの表面への細胞の接着を保証した。細胞は、マイクロキャリアに接着し、そしてコンフルエンスになるまで、または3×106細胞/mLの細胞密度に達するまで、培養した。細胞培養期の後、存在する栄養培地を、新たな栄養培地で置換した。この目的のために、タンパク質を含まない栄養培地を使用した。2回の洗浄サイクルを行った。培地の添加、およびマイクロキャリアの再懸濁からなった。洗浄工程の後、細胞培養物を、トリプシン(2.5mg/L)と混合した。種ウイルスを用いた細胞培養物の感染を、次いで実施した。この種ウイルスを、実施例3に従って獲得および使用した。MOIは、ウイルス特異的であり、そして0.1と0.000001との間、好ましくは0.01と0.001との間にのぼった。感染期の終了後、その時間は、特定のウイルス(特定の実施例を参照のこと)によって決定され、そして他方、選択されたMOIによっても決定され、攪拌器を停止させ、そしてマイクロキャリアを堆積させた。適切な分離方法によって精製した。細胞分離のために、当業者に公知の通常の遠心分離または分離器、フィルタおよびクロスフロー濾過単位を、使用した。Co.)を用いて実施した(実施例1を参照のこと)。攪拌器中の細胞密度は、1×105細胞/mLであった。これらの細胞を、バッチプロセスで培養し、そして1:10の比で新鮮な培地に単に希釈することによって、1×106細胞/mLの細胞密度で移した。CHO、BioWhittaker)を細胞培養のための培地として使用した。制御(細胞培養物について制御温度37°C)、pH値(制御範囲7.1〜7.3)、および酸素分圧(45%〜55%のpO2)を使用した(技術的詳細は表2中)。ratio)に従って、10L、100L、1000Lであった。発酵器が1×106細胞/mLの最終細胞密度に、1×105細胞/mLの開始細胞密度にて、3〜4日の時間で到達した。流加培養(fed−batch)を、細胞密度を3×106細胞/mLまで増大させるために、グルコース溶液(100〜200g/L)を用いてさらに実施した。胞収率を、表2に比較して示す。他方、化学的に規定された培地(ProCHO4CDM)を、細胞培養のための代替として使用した。この培地中での適合のために、3〜5継代を実施することが有利であることを証明した。達成された細胞収率を、表2において比較する。Technologies)を、細胞培養のための培地として使用した。代を行うことが有利であることを証明した。達成された細胞収率を、表2において比較する。【0076】(実施例8:無血清培地での発現期における系操作)実施例5に従って、発現スケールまで懸濁培地を培養した後、細胞を、等容積の3つの発酵槽(3×1000L)に分配し、新鮮な培地で満たした。各発酵槽は、1/3容積の前培養液および2/3容積の新鮮な培地を受容した。培養期と同じ培地を使用した(UltraCHO,BioWhittaker)。充填の後、細胞培養液を、10mg/Lのトリプシンと混合した。酵条件下であるが、33°Cで96時間を超えて、インキュベーションした。含有上清を取り除き、次いで、細胞を、分離機で分離した。さらなる濾過工程を、0.45μmの孔径のカートリッジフィルタを通して生じ、さらに微小な粒子を分離した。接着性MDCK細胞におけるウイルス滴定によって、ウイルス含量について試験した。定されたHA含量は、1024Uであり、ウイルス力価は、108.2CID50/mlであった。【0078】(実施例9:化学的に規定された培地での発現期における系の操作)発現細胞の調製を、実施例8に記載されるように生じた。2.5mg/Lのトリプシンと混合した。実施例8に記載されるように実施した。測定されたHA含量は、1024Uであり、ウイルス力価は、107.5CID50/mlであった。【0080】(実施例10:無タンパク質培地での発現期における系の操作)発現細胞の調製は、実施例8に記載されるように生じた。2.5mg/Lのトリプシンと混合した。続いての感染を、実施例8に記載されるように実施した。測定されたHA含量は、1024Uであり、ウイルス力価は、107.9CID50/mlであった。【0082】(実施例11:化学的に規定された培地での培養および感染)細胞の培養を、実施例6に記載されるように生じ、感染を実施例9に記載されるように生じた。従って、培養から感染の採取への全細胞培養物は、化学的に規定された培地中で生じた。【0083】(実施例12:化学的に規定された培地での培養および無タンパク質培地中での感染)細胞の培養は、実施例6に記載されるように化学的に規定された培地中で生じ、感染は、実施例10に記載されるように無タンパク質培地中で生じた。【0084】(実施例13:無タンパク質培地中での培養および感染)細胞の培養は、実施例7に記載されるように生じ、感染は、実施例10に記載されるように生じた。培養から感染の採取までの全細胞培養物は、無タンパク質培地中で生じた。採取を0.45または0.5μmの孔径を有するディープベッドフィルタ(Tiefenfilters)を通して濾過し、細胞および細胞フラグメントを分離した。代替として、この分離を、分離機を用いて実施した。浄化された採取物に含まれるウイルスを、濃縮し、必要に応じて限外濾過によって精製し、ここで、50,000と1,000,000との間(好ましくは、100,000〜500,000)の排除限界を有する膜を使用した。Sulfate,Millipore)を充填したクロマトグラフィーカラム上にロードした。緩衝液での洗浄による夾雑物の除去後、このウイルスを、0.3〜3MのNaCl溶液で溶出した。溶出物を、限外濾過で脱塩し、さらに濃縮した。クロマトグラフィー精製の代替として、またはクロマトグラフィー精製と組み合わせて、さらなる精製効果を、限外濾過によって達成し得た。配中の超遠心分離によるこれらの浮遊密度に従って精製し得、続いて、この勾配によって分画した。ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンでウイルス不活性化を、精製プロセス内の任意の点で実施し得るが、好ましくは、濃縮または精製後に使用する。この容積は、不活性化され、次いで、既に実質的に減少されるからである。細は、実施例22を参照のこと)で異なる培地中で培養した。去し、0.45μmの孔径を有するフィルタを用いて濾過した。安全性のために、濾過後に、1:2000または1:2500の希釈度でβ−プロピオラクトンを添加し、そして2〜8°Cで24時間インキュベーションすることによって、この物質を、既に不活性化した。37°Cでの不活性化剤の加水分解の2時間後の不活性化された調製物の細胞培養試験は、0.03感染単位/mL未満の検出限界まで活性なウイルスが存在しないことを示した。acid)]アッセイ(Pierce)を、使用して総タンパク質含量を決定した。38:141−149)、内部ポリクローナル抗血清を、ウサギから精製されたウイルスに対して産生した。不活性化された開始物質に対する値を、参照値(100%に対応)として使用した。(15〜60%スクロース)によって精製した。勾配を分画し、画分のサンプルにおける、280nmの吸光度を決定し、ウイルスのピークを同定した。吸光度の急激な上昇を、30%と40%との間のスクロース濃度の領域に見出し、そして、最大値は、34%および35%であった。この領域から、特定のウイルスタンパク質の最大含量および最大純度(ウイルスタンパク質の全タンパク質に対する比として決定される)をまた、測定した。全体的に、開始物質中に測定された50%より多くの特定の抗原含量が、これらのピーク画分に回収された。【0090】(クロマトグラフィー精製:)不活性化されたウイルス調製物(上記を参照のこと)を、あらかじめ、5カラム容量の50mMリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した、CSカラムに適用した。このカラムを、結合しない材料を除去するために、10カラム容積のリン酸緩衝液で洗浄した。NaClを添加した漸増量の同じ緩衝液と混合された、同じリン酸緩衝液で溶出した。3.2%と3.9%との間の特定の抗原および79〜83%の全タンパク質を、ウイルス物質の適用の間、流れ中に分析的に回収した。洗浄緩衝液において、6〜11%の全タンパク質および0〜2.3%の抗原を見出した。従って、95%を超える抗原を、カラム物質に結合する。NaClの溶出の間達成した。NaClまでのより高い塩濃度は、さらに、少量(<15%)のより小さい比純度を有する抗原を溶出した。【0091】(クロマトグラフィーと超遠心との組み合わせによる精製:)0.6および1.2MのNaClの溶出後の合わせた溶出物を、上記のようにクロマトグラフィー精製から80,000Gで2.5時間、超遠心分離に供した。リン酸緩衝液(pH7.5)に再懸濁し、そして分析した。この調製物の全タンパク質濃度を、初期含量の0.7%まで減少し、純度を、この工程によって10倍増加した。【0092】このウイルス調製物を、上記のように勾配精製に供した。勾配精製の後に達成されるように、分画後、非常に類似した勾配プロフィールを見出した。ウイルスピークの先端は、わずかにシフトし、ここでそれは、37%スクロースであった。地中に懸濁し、そして0.45μmの孔径を有するフィルタを使用して濾過した。濾過物を、標準培地中の接着性MDCK33016細胞で、25cm2の培養表面を有する培養フラスコ中に播種し、37°Cで培養した。養物の全上清を取り、−70°C未満で凍結した。4日後に取られたサンプルを、1:10に希釈し、次いで、10μg/mLトリプシンを含む標準培地中の10の工程において;100μLのこれらの希釈物を、標準培地中のMDCK33016細胞に導入した。37°Cでのインキュベーションの13日後、CPEを、第1の希釈工程のわずかな培養物中に見出した。これらの培養物の上清を採取し、再度希釈し、そして新規の培養液に播種した。6〜9日後、漸増的な、より異なるCPEを、代表的なヘルペスウイルスプラークとして、この第3ウイルス継代の種々の希釈工程において見出した。175cm2の培養表面での同じ開始物質と平行の直接感染培養物はまた、排他的に同じ代表的なプラークを示した。ウイルスのさらなるクローニングのために、希釈プロセスを繰り返し、ここで、最後のポジティブな希釈物の細胞培養物中の上清を使用した。製品番号17−088)を用いて、標準的な方法に従って、免疫蛍光調査に供した。プラークの近傍の細胞のみが免疫蛍光を有することを見出した。この実証および特定のPCRの実証によって、単離物は、単純疱疹ウイルスIとして明確に同定した。【0094】クローン化したウイルスを、さらに、懸濁培養物中の標準培地中で増加し、実施例3に記載されるような十分なウイルス力価(>106感染単位/mL)で、種ウイルス産生に使用した。種ウイルス調製物は、107CID50/mLと108CID50/mLとの間のウイルス力価を規則的に含んだ。ウイルス力価の決定は、HEP−2またはVero細胞の当業者に公知である標準的な方法に従って生じたが、接着性MDCK細胞においてもまた生じ得、ここで、力価の評価は、代表的なプラークを参照して実施される。種ウイルス調製物を、−70°Cでアリコート化するか、またはそれ未満で凍結され、発現細胞の感染のために使用した。後の発現のために、同じMDCK細胞ならびに培地および添加物が同じ培養条件を使用する可能性は、重要な利点である。録の間の文書化の必要性が、有意に減少し、種ウイルスの受容性が改善されるからである。【0095】(実施例17:ヒトヘルペスウイルスの産生)実施例8〜13に従う単純疱疹ウイルス1(前記実施例に記載される単離物)を用いる発現細胞の感染について、0.1または0.01のMOIおよび採取後48〜96時間のインキュベーション時間を選択する。長いインキュベーション時間またはより短いインキュベーション時間に対応して、より低いMOIまたはより高いMOIがまた使用され得、ここで収率は、いくらか変化する。最適な採取時間は、いつも見いだされないからである。感染単位/mL(CID50/mL)未満には有意に見出されない。このこと以上に、この時間スキームは、正常な仕事のリズムに好ましく適合され得る。度に低いMOIおよび延ばされたインキュベーション時間は、ほとんどいつも、より低い収率をもたらし、従って、最適下限である。38:141−149)で感染した。以前の実施例から外れて、強く変化するMOIを感染のために使用した。物を有さない培地中に一部維持した。々のパラメーターが変化される場合でさえ、高い収率が、この系を用いて達成され得、さらに複数の採取が可能であることを示す。これらの変化は、表3に要約される。照して5日後に評価した。同じ培養物の繰り返しの採取が、培養培地の交換によって達成され、その結果、各採取の間、細胞に新規の培地を供給し、従って、さらに増殖されるという事実は、注目に値する。生存せずそして生産的のままではない。謝生産を補償しないので、さらなる培地の補充および培養物の増加が、感染時間の4または5日後に生じた。【表3】+(M+30)は、示された日の培養液体積の+30%の培地の補充を意味する。VR−1358)での感染のために培養した(実施例2を参照のこと)。7:303−305)。希釈ウイルスを、新たに調製された培養液に播種し、培養液を37°Cでインキュベートした。培養液を、3〜4日の交互回転中で、1:4のさらなる継代に供した。33016の懸濁培養物を、実施例1に従う標準培養液中で培養し、HM175を播種し、33°Cでインキュベートし、次いで、毎週1:10の継代に供した。培養液中の接着細胞を、感染後35日間までさらに維持した。titration、第93頁を参照のこと)に従って生じた。Co.)を、ビオチン標識を有する抗ヒトIgG抗体として使用した。微鏡において低倍率で容易に認識される茶色がかったピンク色の細胞が得られる。他方、ウイルス陰性細胞は、無色に見えるかまたはほんのわずかな色を有する。調製3週間後におけるウイルス滴定はまた、同じ検出法で評価され、この方法のために、ヒト二倍体細胞(MRC−5)を、培養系として使用した。上記の感染ロットの全てにおいて、そして使用される両方のウイルス単離物で、活性なHAV複製は、MDCK細胞において検出され得る。濁培養液中のHM175株で検出した。価は、105.4CID50/mLであった;この培養物を、毎週、単純な希釈によって1:10の継代に供し、7日後に得られた培養物において同様のウイルス力価を得た。養の最後および2回のさらなる細胞継代の後に、無細胞培地の1つのサンプル中のウイルス力価を決定した。全培養物のサンプルをまた取り、その中に含まれる細胞を、−20°Cでの2回の凍結によって破砕し、そして解凍した。細胞成分を、遠心分離によって除去し、その後、サンプルを滴定した。このロットから得られたウイルス収量は、表4に要約され、このウイルス収量は、特定の収量に対する有害な効果なしに、毎週10倍の培養物の増殖が可能であり、ここで、体積単位当たりの良好なウイルス力価が、かなりの量の増加に関わらず、回収され得る。従って、有意な割合のウイルスが上清中に見出され得、このことはまた、この強力な細胞結合ウイルスに対して驚くべきことである(表4を参照のこと)。【表4】n.d.決定されず(実施例20:ラブドウイルスの増殖)細胞培養フラスコにおいて、実施例1に従う標準培地中の懸濁培養物を、培地1mL当たり1×106細胞の細胞密度で播種した。培養物の増殖の後、2つの培養物を、0.01のMOIを有する狂犬病ウイルス(Pitman−Moore株、ワクチンウイルス株)で感染し、1つの培養物を、0.001のMOIを有する狂犬病ウイルスで感染した。これらの培養物を37°Cでインキュベートし、4日ごとまたは3日ごとにトリプシンを用いて解離し、そして1:10比(4日後)または1:8比(3日後)で継代に供し、この方法で18日間維持した(表5を参照のこと)。感染の成功を、各継代で追跡した。物に、3.5%のホルマリン溶液を提供し、この溶液中で、室温で3日間インキュベートし、ウイルスの不活性化を達成した。X100と共に、室温で25分間インキュベーションした。