here.AbstractIntroduction生体組織の組織学的検査は、彼らの自然な文脈で分子/細胞の性質を理解する上での基本的なアプローチです。理想的には、臓器全体の高分解能イメージングが最も有益で所望である。光は1散乱に起因する限定された浸透深さを有しているので、固定された器官は、高解像度の顕微鏡イメージングを実行するために切断されなければならない。したがって、組織学的研究のほとんどは、器官のごく一部を表す少数の組織切片上で行われる。脳または脊髄におけるニューロンの接続をトレースすることを目指したものが、標的臓器からのすべての組織切片を回収し、3次元再構成のために画像化した。個々のセクションの組織切片およびその後の画像は、さまざまな制限があります。これらは機械的な歪みに起因する時間がかかり、組織の不完全な3次元再構成につながる、という困難が含まれる得られる画像の位置合わせIES。最近では、クリアとイメージングそのまま透明器官はこの欠点2,3への重要なソリューションとして開発されました。種々の研究グループは、異なる目的のために、目的の画像それらの組織にできるようにする新たな組織のクリアプロトコルを開発した。これらは、有機溶媒に2-5、8クリアプロトコルをベース水6,7および電気泳動を含む。これらの中でも、溶媒の3次元イメージングは​​、臓器をクリアまたは3DISCOは、中枢神経系(CNS)の器官、免疫器官および固形腫瘍を含む種々の生物学的サンプルに容易に適用するプロトコルである。ADDIT中イオンは、このような光学シート蛍光顕微鏡(LSFM)、多光子共焦点レーザー走査顕微鏡などの異なる顕微鏡技術と組み合わせることができる。3DISCOは、テトラヒドロフラン(THF)及びジベンジルエーテル(DBE)4として容易に入手可能で安価な試薬を用いてクリアすることに基づいています。プロトコル全体で3〜4時間程度の短い取ることができます。このように、3DISCOは9を完了するのに数週間から数ヶ月かかる場合があり、伝統的な組織学的方法に比べて、堅牢で高速な手法である。)の規制に従って行われた。著者は、競合する経済的利益を宣言していません。動物灌流および組織標本タイミング:マウス+後固定あたり30〜60分(数時間から一晩)。g体重IP)を用いて麻酔。完全有効にするには麻酔のための数分待ちます。動物が完全に麻酔されていることを確認するために、動物のつま先と尾をつまん。Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で室温で最初の動物を灌流。PBS)中の4%PFAを灌流を継続/分3ミリリットルの速度で30〜40分間、4%PFAで。PBSで満たしたペトリ皿に臓器(結合組織、髄膜または硬膜)の周囲の余分な組織を除去する。数時間または一晩、4°Cで4%PFA中で臓器をポスト修正PFAは、信号を消光又は特に(赤と遠赤色チャネルにおいてより少ない問題である)、GFPチャネルに対してautofluorecense残業10を増やす可能性があるため、長い後固定は避けてください。清算手続きを開始する前に臓器を室温でPBSで2〜3倍を洗ってください。組織のクリアタイミング:大規模な臓器の小器官や1〜4日2-3時間。注:導入遺伝子発現による組織の蛍光標識、ウイルストランスフェクション、染料のトレースや抗ボディラベリングはクリアする前に完了する必要があります。全ての組織のクリアステップはRTで行う。(ニトリル手袋を使用)クリアソリューションTHF、DBE、BABB(1部のベンジルアルコールおよび2パート安息香酸ベンジル)およびジクロロメタンは毒性吸入(換気ドラフト内行動実験)であり、皮膚との直接接触は避けるべきである。THF及びガラス瓶中の蒸留水25mlを混合50mlのより大きい。静かに1〜2分間ボトルを振ることにより溶液を混合。ガラス瓶にラベルを付けます。瓶を閉じ、暗いキャビネットに使用液を保持します。最良の結果を得るには、長い1〜2週間以上同じ作業のソリューションを使用しないでください。したがって、新鮮なストック試薬を使用できるようにするために、最小のボリュームとして清算ソリューションを注文。ml)を充填、50%THF、およびクリアを開始するためにガラスバイアル中にPBSから臓器を転送する。ホイール攪拌機)を使用します。暗闇の中でガラスバイアルをカバーし、維持するためにアルミ箔を使用してください。表1)のためのガラスバイアル内のサンプルを攪拌する回転装置を起動します。表1の時間が終了したとき、プロトコルの次の1を追加します。フード内に保持されたガラスの廃棄物容器にクリア廃棄物を収集します。最後まで、プロトコルの各決済ソリューションの前の手順を繰り返します。DBEをTHFからの変更)新しいパスツールピペットを使用してください。BABBまたはDBEとの最終決済ステップでは、インキュベーション時間を延長またはSHことができますサンプルは、可視光(またはそれが脳のような非常に大規模な組織であれば、黄色がかった/透明)で完全に透明になるまでortened。イメージング手順など、常に最終的な決済ソリューションでクリア臓器を保管してください。イメージングのためにクリア臓器の準備タイミング:5月15日分。注意:画像をクリア臓器とすぐに完全な清算が達成されるように。超顕微法)または共焦点/多光子顕微鏡イメージングのためのサンプルを準備するため、次の手順に従います。抗体の標識は、より耐性があり、さらに長いインキュベーションとのより良い結果を与える場合があります)。イメージングのために、種々の蛍光顕微鏡技術は、クレア臓器を適切に処理する限り使用することができるリング溶液が達成される。適切にサンプルを配置したり、マウントします。手動で試料ホルダー4のネジを回してクリア臓器を固定します。最終の決済段階で使用した方BABBまたはDBE、充填されているthelightシート顕微鏡(好ましくはガラス製の)撮像チャンバー内に試料を浸し。油や水に浸漬目標を使用したマルチフォトンや共焦点顕微鏡と画像を可能にするには、最終的なイメージングソリューションとイメージングスライド(またはイメージング室)にサンプルをマウントします。組織の周囲に境界線を作るために歯科用セメントを使用しています。歯科用セメントが完全に剛体を取得する直前にBABBまたはDBEとプールを埋める。注意:歯科用セメントはすぐに凝固する。実際のサンプルを試す前に、それに慣れるために数回の練習。場所プールの中央にクリアサンプルカバーガラスでそれをカバーしています。プレスカバーガラスが完全に共焦点/多光子顕微鏡により最大撮像深度に到達できるようになりクリア器官の表面に歯科用セメントおよびタッチによって密封されるまで。注:これはクリアリングソリューションは、撮影中にこぼれないことを保証します。DBEに耐性があるか、保護カバーを持っていない限り、レンズに害を与えることができるソリューションを、クリアに直接結像レンズを浸漬することは避けてください。イメージングは​​、臓器をクリアタイミング:15〜45分。顕微鏡が提供できる最高の解像度で(使用しているレンズは許可されている場合)全体をクリアした組織をカバーするZ-スキャンを収集します。高解像度の画像を収集するために関心領域を拡大します。画像セリエをロードResolveRTモジュールとソフトウェアアミラ秒。「画像読取パラメータ」ウィンドウ、[OK]を押して、正しいボクセルサイズを入力してください。「マルチプレーナービュー」サブアプリケーションを選択します。2次元および3次元の値を調整し、グレー値のための最適なしきい値を選択する「厚さ」スライダを使用します。異なる2D向きでスライスを閲覧し、3Dビューで作物コーナーモジュールを用いて試料を可視化。4に記載されています。Results神経細胞は、高度に非常に長い形態を有する細胞を分極されている。それらの機能は、互いに間および他の組織との形成の接続に依存します。このため、神経細胞の構造組織をマッピングすることは、彼らが健康と病気にどのように機能するか理解するために極めて重要である。11を通じてこのような巨大な神経結合をトレースする-まだ神経科学の最も困難な課題の一つである。そのためには、EUの12、米国13の両方が人間の脳をマッピングするために大規模なプロジェクトを開始した。3DISCOは様々な臓器に用いることができるが、それは脊髄および脳内の長い神経結合をトレースするために特に有用であった。大きなクリア脊髄セグメントの超顕微法スキャンを用いて、軸索の接続が齧歯類脊髄(センチメートルにわたって追跡することができる図2)。図3b)は、脳におけるニューロン接続を追跡する画像化することができる。共焦点又は多光子顕微鏡をクリア器官で使用される場合、撮像分解能が著しく、特に、z次元において、向上させることができる。図4a)からクリア脊髄の多光子イメージングは、脊髄の全体の深さ(〜1.5〜2ミリメートル)の全体にわたってシームレスな画像を達成する。図4BおよびC)に改良された解像度を提供します。図5)を含むニューロンの構造の細部を視覚化するために、非常に高い解像度の画像を提供します。3DISCOのための試料は、VIR、導入遺伝子の発現を含む様々な方法で標識することができるアルトランスフェクション、染料トレースおよび抗体標識。図6c及びd)の全体の血管系を標識することが可能である)健康と病気における。ミクログリアおよびアストロサイトの両方が非常にアルツハイマー病や外傷14,15を含む神経変性の病態に関与している。図7)または脳におけるそれらの濃度および分布を研究することができる。非神経組織はまた、画像化することができる。図8)で切片化することなく、画像化した。