本明細書全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。本発明者らは、異種ウイルス抗原エピトープが搭載された組み換えロタウイルス複合抗原を一つの発現ベクターシステムを用いて発現させることができるベクターシステム及び、これを用いて上記組み換えロタウイルス複合抗原を含有するロタウイルスのウイルス類似粒子を生産する方法を開発するために鋭意研究した。その結果、A型肝炎ウイルス抗原エピトープ及びロタウイルス抗原を同時に発現させることができるバキュロウイルス発現ベクターシステムを構築し、これを宿主細胞に形質転換してウイルス複合抗原を成功的に発現させて免疫原性を確認した。上記複合抗原と追加的なウイルス構造タンパク質とを共同発現させることにより、上記複合抗原を持つロタウイルスのウイルス類似粒子を成功的に生産し、この類似粒子の免疫原性も確認し、本発明を完成した。【0008】したがって、本発明の目的は、異種ウイルス抗原が含まれたロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトを提供することにある。本発明の他の目的は、上記ロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトで形質転換された宿主細胞を提供することにある。本発明のまた他の目的は、上記ロタウイルス複合抗原を含むワクチン組成物を提供することにある。本発明のまた他の目的は、上記ロタウイルス複合抗原の生産方法を提供することにある。本発明のまた他の目的は、A型肝炎ウイルス抗原及びロタウイルス抗原の複合抗原タンパク質を持つロタウイルスのウイルス類似粒子を提供することにある。本発明のまた他の目的は、上記ロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物を提供することにある。本発明のまた他の目的は、上記ロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物を生産する方法を提供することにある。本発明の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってさらに明確になる。本発明の一様態によると、本発明は、(a)異種ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結された複合抗原をコーディングするヌクレオチド配列;及び(b)上記複合抗原をコーディングする配列に作動的に連結されたプロモーターを含むロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトを提供する。本明細書において使用される用語「複合抗原」は、二つ以上の異なる抗原またはエピトープを同時に含むキメラ(chimeric)抗原を意味する。本発明の最大の技術的特徴の一つは、ロタウイルス抗原に異種ウイルスの抗原エピトープが連結され、異種ウイルス抗原エピトープが搭載されたロタウイルス複合抗原を発現させることができる発現コンストラクトシステムを確立した点にある。本明細書において使用される用語「発現コンストラクト」は、発現目的のヌクレオチド配列及びこの配列の発現を誘導する配列(例えば、プロモーター)を含む、発現のための最小限のエレメント(element)を意味する。当該発現コンストラクトは、好ましくは、転写調節配列-発現目的のヌクレオチド配列-ポリアデニル化配列を含む。本明細書において使用される用語「プロモーター」は、真核細胞において目的遺伝子の転写(transcription)を誘導することができる転写調節配列を意味する。LTRプロモーター、HIVのLTRプロモーター、β-アクチンプロモーター、EF1アルファプロモーター、ヒトIL-2遺伝子のプロモーター、ヒトIFN遺伝子のプロモーター、ヒトIL-4遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター及びヒトGM-CSF遺伝子のプロモーター、また、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはヒトメタロチオネイン由来のプロモーターがあるが、これに限定されるものではない。アレイ)と核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって上記調節配列は上記他の配列の転写及び/またはトランスレーションを調節するようになる。15:4783-4790(1995))を含むが、これに限定されるものではない。含んでも良く、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン(G418)、ネオマイシンまたはテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。vector)システムに作製されることができる。virus)、バキュロウイルス(baculovirus)などのベクターシステムに適用されることができるが、これに限定されない。本発明の最も好ましい実現例によれば、上記発現コンストラクトはバキュロウイルス転移ベクターに作製されることができる。本発明の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス複合抗原の発現コンストラクトにおいて上記異種ウイルスはA型肝炎ウイルスである。好ましくは、上記A型肝炎ウイルス抗原のドメイン2(D2)とドメイン3(D3)は、それぞれ配列表における第2配列と第3配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス抗原はVP7タンパク質部位である。好ましくは、上記ロタウイルス抗原VP7タンパク質部位は、配列表における第1配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。linker)によって連結される。linker)はLeu-Glu-Pro-GlyまたはLys-Asp-Glu-Leuである。reticulum)に組み換えタンパク質の残留(retention)を促進することによりMHCクラスIによる抗原提示効果を向上する。本発明の具体的な一実施例によれば、上記本発明のロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトは、図1に示されるDNA構成要素を含む。本発明の他の一様態によれば、本発明は、上記ロタウイルス複合抗原発現用コンストラクトで形質転換された宿主細胞を提供する。あり、最も好ましくは昆虫細胞株である。Invitrogen)などを用いることができるが、これに限定されない。5791(1991))などが挙げられるが、これに限定されない。本発明の他の一様態によれば、本発明は、A型肝炎ウイルス抗原とロタウイルス抗原とが相互連結された組み換えロタウイルス複合抗原を提供する。本発明のまた他の一様態によれば、上記組み換えロタウイルス複合抗原を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記ロタウイルス抗原VP7タンパク質部位は、配列表における第1配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記A型肝炎ウイルスの抗原エピトープのD2とD3はそれぞれ、配列表における第2配列と第3配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。linker)はLeu-Glu-Pro-GlyまたはLys-Asp-Glu-Leuである。本発明の組み換えロタウイルス複合抗原タンパク質は、下記実施例において立証されるように、ロタウイルスに対する抗体誘導能のみならず、A型肝炎ウイルスに対する抗体誘導能を保有する。本発明のワクチン組成物は、(a)A型肝炎ウイルス抗原を含む組み換えロタウイルス複合抗原タンパク質の薬剤学的有効量;及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む。本発明のワクチン組成物は、A型肝炎ウイルス及びロタウイルス感染によって誘発される多様な疾患の予防に用いられることができる。上記疾患に対する予防効果を達成するのに十分な量を意味する。本発明のワクチン組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などを含むが、これに限定されるものではない。局所投与を用いて投与することができる。反応感応性のような要因によって様々であり、普通に熟練された医者は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明のワクチン組成物は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を用いて製剤化されることで、単位用量形態で製造されかまたは多用量容器内に入れて製造されることができる。カプセル剤の形態であっても良く、分散剤または安定化剤をさらに含んでも良い。(i)A型肝炎ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結された複合抗原をコーディングするヌクレオチド配列;及び(ii)上記複合抗原をコーディングする配列に作動的に連結されたプロモーターを含むロタウイルス複合抗原発現用組み換えバキュロウイルスで形質転換された宿主細胞を培養するステップ:及び(b)上記ステップ(a)で培養された培養物から組み換えロタウイルス複合抗原タンパク質を分離及び精製するステップ。本発明において形質転換された宿主細胞の培養は、当業界で公知された通常の動物細胞の培養方法を用いることができる。含めば、天然培地または合成培地を使用することができる。使用できる炭素原は、グルコース、フルクトース、スクロースのような炭水化物;澱粉、澱粉の加水分解物;酢酸及びプロピオン酸のような有機酸;メタノール、エタノール、プロパンのようなアルコールなどを含む。extract)、酵母エキス、とうもろこし浸漬液、カゼイン加水分解物、大豆エキス、大豆加水分解物;多様な醗酵した細胞及びこれらの分解物などを含む。無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを含む。14:11(1978))などが用いられる。Yorkに詳細に記載されており、この文献は本明細書に参照として組み込まれる。培養は、通常、振とう培養または回転機の回転といった好気的条件下で行う。培養温度は、好ましくは15ないし40°Cで行い、培養時間は一般的に5時間ないし7日間行う。培地のpHは、培養中に好ましくは3.0ないし9.0の範囲を維持する。培地のpHは無機または有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどで調節することができる。培養中には必要な場合、アンピシリン及びテトラサイクリンのような抗生物質を添加することができる。上記培養された形質転換細胞から発現された複合抗原タンパク質を分離する方法は、当業界で通常用いられる分離及び精製方法を採用して実施することができる。fractionation)、分子量による限外ろ過分離、様々なクロマトグラフィー(大きさ、電荷、疎水性または親和性による分離のために作製されたもの)による分離など、多様な方法が用いられ、通常は、上記方法の組合わせを用いて分離及び精製する。本発明の一様態によれば、本発明は、(a)ロタウイルスのVP2、VP4及びVP6のポリペプチド、及び(b)異種ウイルス抗原エピトープ及びロタウイルス抗原VP7の融合タンパク質を含むロタウイルスのウイルス類似粒子を提供する。本発明の好ましい実現例によれば、上記異種ウイルスはA型肝炎ウイルスである。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記融合タンパク質はA型肝炎ウイルス抗原D2及びロタウイルス抗原VP7の融合タンパク質D2-VP7である。本発明の好ましい実現例によれば、上記VP2ポリペプチドは配列表における第4配列を含み、上記VP4ポリペプチドは配列表における第5配列のアミノ酸配列を含み、上記VP6ポリペプチドは配列表における第6配列のアミノ酸配列を含み、上記D2ポリペプチドは配列表における第2配列のアミノ酸配列を含み、上記VP7ポリペプチドは配列表における第1配列のアミノ酸配列を含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記融合タンパク質D2-VP7はD2ポリペプチドとVP7ポリペプチドとがペプチドリンカーLeu-Glu-Pro-GlyまたはLys-Asp-Glu-Leuによって連結される。本発明のまた他の一様態によれば、本発明は、(a)ロタウイルスのVP2、VP4及びVP6のポリペプチド、及び(b)A型肝炎ウイルス抗原エピトープD2及びロタウイルス抗原VP7の融合タンパク質であるD2-VP7を含むロタウイルスのウイルス類似粒子を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。本発明においてロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物に関する説明は、上記ロタウイルス複合抗原において説明したものと同様であるため、重複記載はしない。本発明のまた他の一様態によれば、本発明は、次のステップを含むA型肝炎ウイルス抗原を含むロタウイルスのウイルス類似粒子の生産方法を提供する:(a)(i)プロモーターに作動的に連結されたVP2コーディングヌクレオチド配列を含む第1の組み換えバキュロウイルス;(ii)プロモーターに作動的に連結されたVP4コーディングヌクレオチド配列を含む第2の組み換えバキュロウイルス;(iii)プロモーターに作動的に連結されたVP6コーディングヌクレオチド配列を含む第3の組み換えバキュロウイルス;及び(iv)プロモーターに作動的に連結された融合タンパク質D2-VP7コーディングヌクレオチド配列を含む第4の組み換えバキュロウイルスで形質転換された宿主細胞を培養するステップ;(b)上記宿主細胞の培養物からロタウイルスのウイルス類似粒子を分離及び精製するステップ。本発明の好ましい実現例によれば、上記VP2ポリペプチドは配列表における第4配列のアミノ酸配列を含み、上記VP4ポリペプチドは配列表における第5配列のアミノ酸配列を含み、上記VP6ポリペプチドは配列表における第6配列のアミノ酸配列を含み、上記D2ポリペプチドは配列表における第2配列のアミノ酸配列を含み、上記VP7ポリペブチドは配列表における第1配列のアミノ酸配列を含む。本発明の他の好ましい実現例によれば、上記融合タンパク質D2-VP7はD2とVP7とがペプチドリンカーLeu-Glu-Pro-GlyまたはLys-Asp-Glu-Leuによって連結される。本発明においてロタウイルスのウイルス類似粒子を生産する方法は、上記ロタウイルス複合抗原タンパク質を生産する方法において説明したものと同様であるため、重複記載はしない。本発明は、異種ウイルス抗原エピトープが搭載されたロタウイルス複合抗原発現用コンストラクト、上記ロタウイルス複合抗原を含むワクチン組成物、ロタウイルス複合抗原を含むロタウイルスのウイルス類似粒子、及びロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物に関する。本発明によれば、ロタウイルスの抗原とともにロタウイルスと異なる異種ウイルスのエピトープを同時に含む複合抗原と、該複合抗原を含むロタウイルスのウイルス類似粒子を安価で大量生産することができ、ロタウイルス及び異種ウイルスに対する新規複合ワクチンの研究及び開発に応用することができる。【図1】本発明者らが構築したA型肝炎ウイルス抗原及びロタウイルス抗原を含む組み換え複合抗原を同時に発現するバキュロウイルス発現ベクターシステムの具体的な構成を示す。【図2a】本発明の組み換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞株Sf9において組み換え複合抗原タンパク質が正常に発現される結果を示す。図2aは、SDS-PAGEによる総タンパク質分析結果である。レーン(lane)1は非感染(unifected)であり、レーン2はD2/VP7複合抗原、レーン3はD3/VP7複合抗原をそれぞれ発現する結果である。【図2b】本発明の組み換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞株Sf9において組み換え複合抗原タンパク質が正常に発現される結果を示す。図2bは、抗V5抗体を用いたウエスタンブロット分析結果を示す。レーンNは非感染(unifected)であり、レーン1はD2/VP7複合抗原、レーン2はD3/VP7複合抗原をそれぞれ発現する結果である。【図3】昆虫細胞株Sf9において本発明の組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7の発現様相を示す。cell)であり、レーン1〜10はそれぞれウイルス感染後1ないし10日後の結果である。【図4a】本発明の組み換え複合抗原タンパク質がA型肝炎ウイルス及びロタウイルス特異的抗体によって認知されて免疫原性を持つことを示すウエスタンブロット結果である。図4aは、ロタウイルスWa株に特異的な抗体を含む抗ロタウイルスウサギ血清を用いて測定した結果である。レーン1は非感染sf9細胞であり、レーン2はD2/VP7複合抗原、レーン3はD3/VP7複合抗原を測定した結果である。【図4b】本発明の組み換え複合抗原タンパク質がA型肝炎ウイルス及びロタウイルス特異的抗体によって認知されて免疫原性を持つことを示すウエスタンブロット結果である。図4bは、A型肝炎ウイルス特異的抗体を含むA型肝炎ウイルス感染患者の血清を用いて測定した結果である。レーン1は非感染sf9細胞であり、レーン2はD2/VP7複合抗原を測定した結果である。【図5a】組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7の免疫原性をELISAによって測定した結果を示す。組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7をウサギに注射して免疫化させた後、兔疫血清を分離してこれを抗体価測定に使用した。図5aは、ロタウイルスWa抗原に対して上記製造したウサギ兔疫血清の抗体価を測定した結果である。【0069】は組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7のウサギ兔疫血清の抗体価である。value)は左側に表示し、希釈倍数は下側に表示した。【図5b】組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7の免疫原性をELISAによって測定した結果を示す。組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7をウサギに注射して免疫化させた後、兔疫血清を分離してこれを抗体価測定に使用した。図5bは、A型肝炎ウイルスHM175抗原に対して上記製造したウサギ兔疫血清の抗体価を測定した結果である。【0075】は組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7のウサギ兔疫血清の抗体価である。希釈倍数は下側に表示した。【図6a】組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7をウサギに接種して得た兔疫血清とウイルスとの反応度を共焦点顕微鏡で測定した結果を示す。図6aのパネルAはロタウイルスWa株で感染させたMA104細胞と免疫化させていない正常ウサギ血清との反応度を測定した結果であり、パネルBはロタウイルスWa株で感染させたMA104細胞と組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7に対するウサギ兔疫血清との反応度を測定した結果である。【図6b】組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7をウサギに接種して得た兔疫血清とウイルスとの反応度を共焦点顕微鏡で測定した結果を示す。図6bのパネルAはA型肝炎ウイルスHM175で感染させたFRhK-4細胞と免疫化させていない正常ウサギ血清との反応度を測定した結果であり、パネルBはA型肝炎ウイルスHM175株で感染させたFRhK-4細胞と組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7に対するウサギ兔疫血清との反応度を測定した結果である。【図7a】組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7をウサギに接種して得た血清が、ロタウイルス及びA型肝炎ウイルスに対する中和抗体を形成することを示す結果である。図7aのパネルAはロタウイルスWa株で感染させたMA104細胞であり(陽性対照群)、パネルBはロタウイルスWa株で感染させたMA104細胞に正常ウサギ血清を加えた結果であり(陰性対象群)、パネルCはロタウイルスWa株で感染させたMA104細胞に組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7に対するウサギ抗血清(320倍希釈)を加えた結果である。【図7b】組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7をウサギに接種して得た血清が、ロタウイルス及びA型肝炎ウイルスに対する中和抗体を形成することを示す結果である。図7bのパネルAはA型肝炎ウイルスHM175株で感染させたFRhK-4細胞であり(陽性対照群)、パネルBはA型肝炎ウイルスHM175株で感染させたFRhK-4細胞に正常ウサギ血清を加えた結果であり(陰性対照群)、パネルCはA型肝炎ウイルスHM175株で感染させたFRhK-4細胞に組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7に対するウサギ抗血清(160倍希釈)を加えた結果である。【図8】A型肝炎ウイルス抗原を含有するロタウイルスのウイルス類似粒子(VLP)を観察した結果である。particle)である。【図9】本発明のロタウイルスのウイルス類似粒子(VLP)がウサギから生産されたロタウイルスVP2、VP4、VP6タンパク質に対する特異抗体によって認知されて免疫原性を持つことを示すウエスタンブロットの結果である。【図10a】ロタウイルスのウイルス類似粒子(VLP)の免疫原性をELISAによって測定した結果である。組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7を含むロタウイルスのVLPをマウスに注射して免疫化させた後、得た兔疫血清を分離してこれを抗体価の測定に用いた。図10aは、ロタウイルスWa抗原に対して、上記製造したロタウイルスVLPのマウス兔疫血清の抗体価を測定した結果である。【0081】はロタウイルスVLPのマウス兔疫血清の抗体価である。value)は左側に表示し、希釈倍数は下側に表示した。【図10b】ロタウイルスのウイルス類似粒子(VLP)の免疫原性をELISAによって測定した結果である。組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7を含むロタウイルスのVLPをマウスに注射して免疫化させた後、得た兔疫血清を分離してこれを抗体価の測定に用いた。図10bは、A型肝塩ウイルスHM175抗原に対して、上記製造したロタウイルスVLPのマウス兔疫血清の抗体価を測定した結果である。【0087】はロタウイルスVLPのマウス兔疫血清の抗体価である。value)は左側に表示し、希釈倍数は下側に表示した。以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。Korea)から確保し、バキュロウイルス生成のために使用した。exclusion)を基盤に血球計算器(hemocytometer)を用いて細胞数及び細胞生存率を測定した。血清型G1P[8]Waロタウイルス株とHM175A型肝炎ウイルス株ゲノムから抗原エピトープ遺伝子を確保し、組み換えバキュロウイルス製造のためにBac-N-Blueバキュロウイルス発現ベクターシステム(Invitrogen)を用いた。Biolabsから購入した。vector)pBlueBac4.5/V5-Hisとバキュロウイルス発現システムBac-N-BlueTMはInvitrogenから購入した。kit)はBioneerから購買して使用した。A型肝炎ウイルスの人体感染患者からの抗血清及びWaロタウイルス株に対するウサギ血清を免疫原性分析のために使用した。femaleウサギを動物実験のために使用し、実験前の2週間、順応させた。【0091】3.ロタウイルス及びA型肝炎ウイルスのエピトープ含有組み換えバキュロウイルスの同時発現システムの構築ロタウイルス(HRV)のカプシド(capsid)構成成分であるVP7遺伝子は、Wa(G1P[8])ロタウイルスズRNAからRT-PCRによって合成したcDNAに基づいて合成した。1456)遺伝子は、HM175A型肝炎ウイルス株RNAからRT-PCRによって合成したcDNAに基づいて合成した。VP7(D3/VP7)。これら組み換え遺伝子をPCRによって増幅した後、バキュロウイルス転移ベクターpBlueBac4.5(Invitrogen)内にクローニングして組み換えバキュロウイルス転移ベクターを作った。製造した組み換え転移ベクターは塩基配列分析をして正確なクローニング可否を確認した。60mm-plates)を添加した。assay)によって組み換えバキュロウイルスを確認した。R-250(Bio-Rad)染色法を用いて確認した。membrane(Bio-Rad)に移した後、このメンブレイン(memebrane)を5%脱脂乳を用いてブロッキング(blocking)した。Invitrogen)を2次抗体として使用して反応させた。発現タンパク質はECL(electrochemiluminescence)技法を用いてX線フィルム(Kodak)に露出した後、確認した。adjuvant)とともにブースティング(boosting)した。血清を分離した後、抗体形成有無をELISA技法を用いて確認した。plate)に4°Cで一晩中コーティングした。Tween20)200μlで3回洗浄した後、5%(w/v)脱脂乳を使用してブロッキングした。ウサギから収集した兔疫血清を段階別に希釈した後、37°Cで1時間反応させた。5%脱脂乳含有)をウェル当たり100μlずつ添加した後、37°Cで1時間反応させた。50μlを各ウェルに添加して反応を中止させた。reader(NanoQuant)を用いて492nmで吸光度を測定することにより、抗体濃度を定量した。effect)が出現する時点まで反応させた。7.2)で3回洗浄し、1次抗体としてウサギから得た組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7兔疫血清をPBSで50倍希釈して100μl入れて37°Cで1時間反応させた。Sigma)を添加して反応を終了した。Zeiss)下で観察し、ウサギから得た抗体がロタウイルスに対して特異性を示すのかを確認した。effect)が出現する時点まで反応させた。培養した培地を除去し、80%アセトンを添加して10分間反応させて細胞を固定した。7.2)で3回洗浄し、1次抗体としてウサギから得た組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7兔疫血清をPBSで50倍希釈し100μl入れて、37°Cで1時間反応させた。Sigma)を入れて反応を終了した。Zeiss)下で観察して、ウサギから得た抗体がA型肝炎ウイルスに対して特異性を示すのかを確認した。【0097】8.中和抗体の形成ウサギから得た組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7兔疫血清を56°Cで30分間反応させて補体を不活性化させた後、TCID50でWaロタウイルスとHM175A型肝炎ウイルス溶液の力価を測定した。rotavirusは1:640でEagle's培地で希釈)を含有した各ウイルス溶液50μlを混ぜた後、ウサギから収集した血清を10倍希釈した後に段階別に2倍ずつ希釈して、各ウェル当たり50μlを入れて、均一に混ぜた後、37°Cで1時間反応させた。細胞が培養されたプレートに各ウイルス-兔疫血清混合液を50μlずつ入れて、保持培地(HAVはEagle's培地と2%のウシ血清、rotavirusはEagle's培地とトリプシン1mg/ml)を50μl加えた後、5日間培養した。25)によって兔疫血清の中和抗体の形成有無と抗体価を測定した。F-68を含有したTNM-FH培地250mlで約3×106cells/ml程度に培養したSf9細胞を遠心濃縮し、VP2、VP4、VP6及びD2-VP7をコーディングするポリヌクレオチドを含む計4種の組み換えバキュロウイルスを、5pfu/cellのMOIをもって混合して同時に感染させた。3〜4時間くらい遠心チューブでウイルスを吸着させた後、細胞感染液を遠心分離して、上澄み液培地を新鮮な培地に取り替えた。insect培地を使用した。その後、27°Cで5〜7日間培養した。細胞培養上澄み液を得た。Coulter)を用いて25,000rpmで90分間遠心分離することにより、VLP沈殿物を得た。Coulter)を用いて35,000rpmで18時間遠心分離を行った。Coulter)を用いて35,000rpmで120分間遠心分離を行った。通じてVLPの存在を確認した。adjuvant)とともにブースティング(boosting)した。60日後、静脈から血液を採取して血清を分離した後、抗体形成有無をELISA技法を用いて確認した。図1は、本発明で作製したA型肝炎ウイルス(HAV)とロタウイルス(HRV)との組み換え複合抗原タンパク質同時発現システムの模式図である。図1に示されるように、D2/VP7とD3/VP7と名づけられた計2種のロタウイルスとA型肝炎ウイルスエピトープとを同時に含有する組み換え複合抗原タンパク質の発現システムを構築した。vector)であるpBlueBac4.5(Invitrogen)に挿入した。fusion)されたことを確認した。9)に取り入れ、発現有無を総細胞タンパク質分析を通じて確認した。その結果、予想された大きさの2種の組み換え複合抗原タンパク質産物がそれぞれの昆虫細胞株において発現されることを確認した(図2a参照)。これらタンパク質の存在を確認するためにV5-抗体を用いて確認したところ、該当産物の大きさに該当する特異的なタンパク質産物を確認することができた(図2b参照)。この結果は、本発明において構築されたロタウイルス抗原とA型肝炎ウイルス抗原とを同時に含有する組み換え複合抗原タンパク質発現システムによって組み換え複合抗原タンパク質が安定的に発現されたことを示す。昆虫細胞株Sf9において組み換え複合抗原タンパク質の経時的な発現様相を調べるために、D2/VP7を発現する組み換えバキュロウイルスを細胞当たり5pfuで初期感染させて10日間観察したところ、感染後2日目に最高発現量を示し、その後漸進的に減少して10日目に最小量を示した(図3参照)。これは組み換えバキュロウイルスの感染後、10日を周期に正常な細胞溶解が誘導されたことを示す。発現された2種のロタウイルス及びA型肝炎ウイルスの抗原を含有する組み換え複合抗原タンパク質が免疫原性を持つかを調べた。strain)を使用して2種の組み換え複合抗原タンパク質に対してウエスタンブロットを行った。図4aに示されるように、発現された2種の組み換え複合抗原タンパク質は、いずれもロタウイルス特異抗体に陽性反応を示した。3人の人体感染患者から得たA型肝炎ウイルス抗血清を使用してウエスタンブロットした場合、D2/VP7においてのみ陽性反応を確認することができた(表1参照)。図4bに示される結果のように、組み換え複合抗原D2/VP7が3人の人体感染患者から得たA型肝炎ウイルス抗血清によって認知されることを確認した。上記結果は、構築された2種の組み換え複合抗原タンパク質のうちD2/VP7が、ロタウイルスとA型肝炎ウイルスに対していずれも免疫原性を保有していることを示す。【0106】D2/VP7組み換え複合抗原タンパク質の免疫原性を再度確認するために、該当抗原をウサギに免疫接種して抗原特異的な抗体が形成されるのかを調べた。図5a及び図5bの結果から分かるように、D2/VP7組み換え複合抗原タンパク質は、ロタウイルスWa株及びA型肝炎ウイルス抗原に対する特異的な抗体形成を誘導した。【0107】さらに、D2/VP7組み換え複合抗原に特異的な抗体がロタウイルスとA型肝炎ウイルスに特異的に反応するかを確認するために、各ウイルスで感染させた培養された細胞とD2/VP7組み換え複合抗原の接種によって誘導された兔疫血清とを反応させた。図6a及び図6bに示される結果のように、D2/VP7組み換え複合抗原の接種によって得たウサギ兔疫血清が各ウイルスに特異的に反応することを確認した。かかる結果は、D2/VP7組み換え複合抗原が、A型肝炎ウイルスとロタウイルスに特異的な抗体の生成を誘導するということを証明するものである。【0108】4.組み換え複合抗原タンパク質の中和抗体形成能D2/VP7組み換え複合抗原に特異的な抗体がロタウイルスとA型肝炎ウイルスに対して中和力を持つかを確認するために、各ウイルスを細胞に感染させて培養した後、これをD2/VP7組み換え複合抗原に対する抗血清と反応させた。effect)の出現が、ロタウイルスの場合、希釈倍数320倍、A型肝炎ウイルスの場合、希釈倍数160倍まで減少して、抗血清が各ウイルスを抑制する中和力があることを確認することができた(図7a及び図7b参照)。下記表2は、ウサギに接種して得た組み換え複合抗原タンパク質D2/VP7の抗血清のTCID50を測定した結果を示す。記載の方法によって合成したロタウイルスのウイルス類似粒子を電子顕微鏡で観察した。その結果、D2/VP7組み換え複合抗原を含有するロタウイルスのウイルス類似粒子が正常に形成されていることが確認できた(図8参照)。製造したロタウイルスのウイルス類似粒子に対する免疫原性有無を調べるために、10%SDS-PAGE上で分離し、ウサギから生産されたロタウイルス特異抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果、該当産物の大きさに該当する特異的なタンパク質産物を確認した(図9参照)。ロタウイルスのウイルス類似粒子の免疫原性を再確認するために、上記製造したウイルス類似粒子をマウスに免疫接種して抗原特異的な抗体形成の有無を調べた。その結果、陰性対照群と比べてウイルス特異的な抗体が誘導されることを確認した(図10参照)。D4)とロタウイルスエピトープ(VP2及びVP7)とを組み合わせた計2種の組み換え複合抗原タンパク質D2-VP7及びD3-VP7を発現することができるバキュロウイルス発現ベクターシステムを構築し、これら複合抗原タンパク質を昆虫細胞であるSf9細胞株において発現した。これら発現された組み換え複合抗原タンパク質に対する免疫原性を、ウサギ及び人体感染患者の血清を用いたウエスタンブロット分析法を通じて確認した。免疫原性が確認された候補の組み換え複合抗原タンパク質をウサギに直接投与して血清を得て、この血清に対してELISA分析を行ってウイルス特異抗体が形成されたことを証明することで免疫原性を再確認した。ウサギ免疫接種で形成された抗血清が、A型肝炎ウイルスとロタウイルスの活性をいずれも抑制する中和抗体能力を持っていることを確認した。作製したロタウイルス-A型肝炎ウイルスの組み換え複合抗原を含有するロタウイルスのウイルス類似粒子をマウスに免疫接種した結果、A型肝炎ウイルスとロタウイルスの両方に対して特異的な抗体が形成された。本発明の複合抗原タンパク質発現システムは、A型肝炎ウイルス及びロタウイルス由来の抗原タンパク質の同時及び大量発現、キメラウイルス類似粒子の合成、A型肝炎ウイルス及びロタウイルスに対する複合免疫ワクチンの開発と多様なウイルス抗原を含有する複合ウイルス類似粒子ワクチンの開発に適用することができる。以上のように本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。請求項1ないし5のいずれか一項に記載の組み換え型のロタウイルス複合抗原を含むワクチン組成物。【請求項7】(i)異種ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結された複合抗原をコードするヌクレオチド配列と、(ii)前記複合抗原をコードする配列に動作可能に連結されたプロモーターとを含む請求項1に記載のロタウイルス複合抗原発現用コンストラクト。請求項10のロタウイルスのウイルス類似粒子を含むワクチン組成物。前記ロタウイルス複合抗原は、異種ウイルスの抗原及びロタウイルスの抗原が連結されたものである、請求項10に記載のロタウイルスのウイルス類似粒子の発現用コンストラクト。【請求項13】(a)請求項12に記載のコンストラクトで形質転換された宿主細胞を培養する工程と、(b)前記工程(a)で培養された細胞からロタウイルスのウイルス類似粒子を分離及び精製する工程とを含む請求項10に記載のロタウイルスのウイルス類似粒子を生産方法。ekouhou.net。