Achievements発生過程における腺組織の原基は、細胞外マトリックスからなるゲル状の結合組織中に存在し、さらにラミニンとIV型コラーゲンを主成分とした基底膜と呼ばれる薄いシート状の細胞外マトリックスに周囲をおおわれている。腺組織原基を構成する上皮細胞は、これらの細胞外マトリックスを動的に認識・分泌・分解しながら成熟した器官を形成している。本研究計画では腺組織原基の発生・分化に適した細胞外環境の基質特性を解明する。vivoでの培養と発生を可能とする人工ラミニン(ラミニン由来活性ペプチド-キトサンハイドロゲル)の開発を目的としている。発生過程の腺組織では、特有の基底膜タンパク質が特異的な割合で混在している状況が考えられる。これらの混在は動的な環境下で生じるために、混在の意義や割合などに関しての知見は少ない。そこで、インテグリンα6β1と結合するA2G10ペプチドとインテグリンαvβ3やインテグリンα5β1と結合するRGD含有ペプチドを様々な割合で混合し、混在が細胞接着活性に与える影響を検討した。細胞接着可能な混合ペプチドの基盤には、これまで我々が開発してきたペプチド-キトサンマトリックスを用いた。様々な混合比で二種類のペプチドをキトサンマトリックスに固定化し、その細胞接着活性を評価したところA2G10:RGD=2:8-4:6の混合比のときだけ細胞接着活性が2-3倍に促進されることがわかってきた。この特異的な混合比による細胞接着活性の増加や混合による活性変化が、腺組織形成の制御に与える影響は大きいと考えられる。H30年度は本研究成果に関して学会発表と論文報告をおこなった。delayed.Reason研究計画初年度であるH30年度は、受容体特異的なラミニン由来活性ペプチドを固定化した混合ペプチドキトサンマトリックスを用いて、細胞接着活性に影響を及ぼす混合ペプチドの組み合わせの検証と、キトサンゲルの開発を行った。線維芽細胞を用いた基底膜主要タンパク質として中心的な役割を担っているIV型コラーゲンとラミニンの認識に重要な細胞表面受容体(インテグリンα6β1とαvβ3)に着目し、これらと特異的に結合するペプチドを固定化した混合ペプチド-キトサンマトリックスを中心に細胞接着活性を測定した。その結果、特異的な混合比のときに細胞接着活性が混合していないときに比べて2-3倍上昇することがわかった。上昇が初期クレバス形成の発生または伸展に関与している可能性が予想される。R元年、およびR2年度の課題とした、ペプチド-キトサンマトリックスの応用に向けたキトサンハイドロゲルの開発に着手した。キトサンゲルの開発に関しては、ジカルボン酸をpH調整用の有機酸かつリンカーとして用いるシンプルな架橋系の開発に成功した。現在は、ジカルボン酸に加えてアミノ酸を用いたハイドロゲルの作製と、ジカルボン酸を用いたペプチド-キトサンハイドロゲル上での唾液腺細胞培養に着手している。昨年度は研究代表者の所属機関が本計画の採択と同時に変わったため、研究の進捗、論文発表および学会発表とも計画より若干遅延している。今年度からは予定通りの研究進捗を目指す。Activity今後の研究推進方針としては、研究計画のなかで実施予定としている6つの異なる活性ペプチドグループから抽出した混合ペプチドの組み合わせと混合比の最適化を引き続き行う。昨年度の検証では基底膜主要タンパク質として中心的な役割を担っているIV型コラーゲンとラミニンとの結合に重要な細胞表面受容体(インテグリンα6β1とαvβ3)に着目し、その混合による活性の促進を検証・報告した。今年度以降は、上記以外の組み合わせや、想定される二種類以上の組み合わせに関しても検証を開始する。腺組織の発生には腺組織本体となる上皮細胞と、これを取り巻く環境を形成する線維芽細胞の二種類の細胞が重要な役割を果たしている。H30年度は異なる活性ペプチドの混合組み合わせによる細胞接着活性変化の評価に線維芽細胞のみを用いた系で試験したが、今年度以降は上皮細胞(唾液腺上皮細胞)を加えることで線維芽細胞と並行した評価を開始する。ジカルボン酸で架橋化したキトサンハイドロゲルの開発についてはめどが立ってきていることから、実際に上皮細胞を用いた評価系の構築を始める。これと並行して、キトサンハイドロゲルの最適化をめざし、アミノ酸を混合したキトサンハイドロゲルの作製や、ペプチドを混合したキトサンハイドロゲルの作製も開始する。アミノ酸を混合したキトサンハイドロゲルの作成に関しては、すでに検証を開始しており、アミノ酸の中でもアスパラギン酸が特に有効であることがわかりつつある。以上の研究推進方策のもと、他の細胞や架橋剤なども流用しながらフレキシブルに対応することで、本計画の遂行に向けて研究を進めていく。