感度および得られるデータの質はサンプルの純度に大きく依存します。塩、バッファー、界面活性剤の量を最小限に抑えた場合に最善の結果が得られます。表1.3に、各種夾雑物質に対するおよその許容レベルを示します。mM)を超える濃度で存在する場合は、問題を引き起こす可能性があります。一般的な夾雑物に対するMALDIの許容性。マトリックスの種類、スポッティング手法、および夾雑物組み合わせ効果により正確な許容性は異なります(参考文献14の表16.2.1)。(IEF)ステップは、低分子量のイオン性不純物の影響を特に大きく受けます。mM)、分離速度を低下させるか、明瞭なフォーカシングを妨害するか、二次元ゲル電気泳動の結果の質を低下させる障害を引き起こすことがあります。サンプルに含まれるその他の非タンパク質不純物も分離を妨害し、その後、二次元展開の分析の結果の可視化を妨げることがあります。塩は電気泳動プロセスを妨害するため、除去するか、できる限り低濃度に維持しなければなりません。固定pH勾配(IPG)ストリップに塩が含まれると、ストリップの電気伝導度が高くなります。イオンがストリップ端に達するまでタンパク質がフォーカスされないため、IEFに要する時間が長くなります。水の移動が起こることもあり、その場合、ストリップの一端が乾燥し他端が膨潤します。IPGストリップに塩が含まれると、IPGストリップのいずれか一端に、タンパク質がフォーカスされない広い領域が生じます(最終結果に横すじが現れるか、空白の領域が生じます)。mM未満とする必要があります。mMの塩濃度に耐えられます。サンプルアプライ時点でタンパク質が塩濃度の低い環境に急激に移動することから、タンパク質が沈殿することがあります。内因性の小型イオン性分子はどの細胞溶解液にも含まれています。このような物質は負電荷を帯びていることが多く、陽極方向のフォーカシングが妨げられることがあります。タンパク質抽出にはしばしばイオン性界面活性剤(一般にSDS)が使用されますが、この物質はIEFに強く干渉することがあります。SDSはタンパク質と複合体を形成し、その結果生じる負電荷を帯びた複合体はSDSを除去または隔離しない限りフォーカスされません。核酸はサンプルの粘性を高め、バックグラウンドスメアを発生させます。高分子量の核酸は静電相互作用を通してタンパク質と結合し、フォーカシングを妨害することがあります。サンプルから分離されたタンパク質を銀染色で可視化すると、ゲル中に存在する核酸も染色され、二次元ゲル上にバックグラウンドスメアが生じます。多糖はゲルの孔を詰まらせて沈殿を引き起こすかフォーカシング時間を延長し、その結果、横すじを発生させることがあります。一部の多糖は負電荷を帯びており、静電相互作用によりタンパク質と複合体を形成することがあります。多くのタンパク質、特に膜タンパク質は脂質と複合体を形成しています。複合体形成はタンパク質の溶解性を低下させ、またpIと分子量の両方に影響を及ぼします。脂質は界面活性剤と複合体を形成し、可溶化の効率を低下させます。脂質に富んだ組織の抽出液を遠心分離するとしばしば脂質層が生じ、除去が困難な場合があります。フェノール化合物は多くの植物組織に存在しており、酵素が触媒する酸化反応を介してタンパク質を修飾することがあります。サンプル中の不溶性物質はゲルの孔を詰まらせ、フォーカシングを妨げます。サンプルカップを使用してサンプルをアプライする場合、不溶性物質がIPGストリップへのタンパク質の移行を妨げる可能性があるため、特に問題となります。一次元SDS-PAGE一般に、明瞭で歪みがなく幅が一定したバンドを得るには、各サンプルに同じバッファーを使用し同じイオン組成を持たせなければなりません。8、最適操作温度37°Cのセリンプロテアーゼです。トリプシンは主としてリジンおよびアルギニンのカルボキシル末端(C末端)側でタンパク質を切断します。これらのアミノ酸の次にプロリンが存在する場合を除きます。アミノ酸配列分析グレードのトリプシンは、大規模な自己触媒反応を防ぐために、一般にリジン残基がメチル化されています。Mの尿素または最大10%のアセトニトリルの存在下で切断時間が短縮し完全性が高まる一方、還元剤はトリプシンを不活化します。クロマトグラフィーどのようなクロマトグラフィー担体でも夾雑物で孔が詰まる可能性があります。夾雑物が異なれば、影響を受けるクロマトグラフィー担体の種類も様式も異なり、これはクロマトグラフィーの分離機構によって決まります。塩はIEXに干渉し、界面活性剤と脂質はHICによる効率的な分離を妨げることがあります。カラムを使用する場合には、孔の詰まりを防ぐために目に見える微粒子をサンプルから除去する必要があります。サイズに基づいて分子を分離するGFでは、この操作が重要です。μmのフィルターに通します(第4章で説明します。タンパク質吸着性が低いフィルターを使用してください)。タンパク質分析手法の分析能タンパク質の網羅的分析は複雑かつ困難な作業です。この理由は主として、化学的特性の不均一性が高く、核酸増幅に用いられているポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と同等の一般的な増幅手法が存在しないことによります。タンパク質分析に使用できる手法として、網羅的手法と標的手法がともに多数存在するのも事実です。前述したように、このハンドブックでは電気泳動とMSに基づいた手法に焦点を当てています。この2通りの手法は、特定タンパク質非依存的分析にも(二次元ゲル電気泳動および網羅的MS)、タンパク質標的分析にも(ウエスタンブロッティングおよび標的MS)使用できます。タンパク質の発現分析に関係する分析能のおよその比較(大規模サンプル調製を利用しない場合)を表1.5に示します。参考までに、最先端のアフィニティーベースの分析法(例:ビーズベースのタンパク質アッセイ、プロキシミティライゲーションアッセイなど)に関するデータを補足しています。カテゴリーに分類したタンパク質分析手法の分析能の指標。正確な値は使用する機器、プロトコールおよびサンプルによって大きく異なります。1種類のタンパク質を分析した場合のダイナミックレンジを示します。抗体の濃度調整等によってダイナミックレンジや、感度の下限が変わることがあります。略号と用語、記号解説お問合せフォーム※よくあるお問合せとご回答(FAQ)は「こちらで»」ご覧いただけます。※ファイルを添付してのお問合せは、お手数ですが「Tech-JP@ge.comまでメールにて」お問合せください。関する情報の収集・分析及び提供、新製品・新サービスの研究開発等並びに市場調査のために利用します。当社は個人情報を業務委託先に預ける場合がありますが、個人情報の取扱いに関する法令、国が定める指針その他の規範に従い、委託先に対する必要かつ適切な監督を行います。9:00〜12:00、13:00〜17:30)にて承ります。