here.Abstract胎児の腸内のほとんどの形態形成のプロセスは、発達段階的な変化のスナップショットを提供し、固定した組織の薄い部分から推論されてきた。薄連続切片から三次元情報が原因完全連続切片を再構築し、連続切片上の組織の適切な向きを維持することの難しさを解釈するために挑戦することができます。グロッセらによる最近の知見。2011腸1の現像絨毛の形態形成を理解する上で三次元情報の重要性を強調している。単独でラベルされた腸細胞の三次元再構成は、腸管上皮細胞の大部分が頂端および基底表面の両方に接触することを実証した。上皮の頂端表面でのアクチン細胞骨格の三次元再構成は、腸管腔が連続しており、二次管腔は、複数のアーチファクトであることが示されectioning。これら2点は、腸管上皮におけるinterkinetic核移動の実証とともに、以前に1思った層別化多列上皮としないように開発する腸上皮を定義しました。上皮三次元的に観察する能力は、この点を実証し、胎児の腸上皮形態形成を再定義する精液だった。多光子イメージング技術と三次元再構築ソフトウェアの進化により、無傷の、現像器官を視覚化する能力が急速に向上している。二光子励起は、高解像度の組織への損傷が少ない深い浸透を可能にする。二光子イメージングとウォルトンら全体の胎児のマウスの腸の3D再構成は、2012年には絨毛伸長2のパターンを定義することができました。vivoで開発を可能にする全器官培養系を記述する腸を三次元的にその開発中に撮像される。よって承認されたプロトコルを使用し、動物の使用およびケアに関する研究委員会のガイドラインに従って取り扱った。組織培養フードでは、ストックボトルからBGJbメディアの5ミリリットルを除去し、ペニシリン/ストレプトマイシンを5ml加える。mlのアスコルビン酸の1ミリリットルを加えることで、50ミリリットルコニカルチューブ内のメディアの作業ストックを準備します。トランスウェルのそれぞれの下に1ミリリットルを追加することによって、6ウェル培養プレートを準備します。注記:すべての6トランスウェルを使用しない場合は、後で使用するために、新鮮な無菌6ウェルプレートに余分なトランスウェル移動します。10センチメートル無菌ペトリ皿のそれぞれに作業BGJbメディアの3ミリリットルを追加します。解剖の準備70%のETHAに解剖ツールを浸すとNOL作業中にきれいな道具を保管してください。大きな氷​​のバケツに解剖エリアを設定し、氷上でBGJbメディアを6ウェル培養プレートから10cmペトリ皿を置きます。解剖と文化のための腸の準備中に、できるだけ多くの氷の上で作業。胎児の腸の収穫のために頸椎脱臼により安楽死の前にイソフルラン(100μL)をチャンバー内での成体雌マウスを麻酔。母親から胎児を収穫した後、タイラーステージングチャート13に従って慎重にそれぞれの胎児を上演。日常的に、単一のゴミ内で観察された発生段階で最大24時間の変動などの各胎児の年齢を決定するために、後の性交日に依存しないでください。前腸の除去に断頭によって胎児を安楽死させる。1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で各腸を分析した後、ナンプラーBGJbメディアを作業した10センチメートルペトリ皿にそれをCE。慎重に胃および上部十二指腸から胃や膵臓から脾臓を除去します。静かに腸がまっすぐにさせることが可能とだけ十分な接続を分離する限り添付大網を残すように注意しながら大網を分離。注:E14.5より古い腸以上24時間未満培養されたもののために、静かに管腔内容が腸を通って流れるようにし、切断端から排出されるために可能にするために3等分腸を分離する。培養はE13.5前に始まっただし、漿膜が正常に腸の長さにわたって成長を可能にするために、腸の3つのセグメントを分離する前に、培養24時間後まで待ちます。培養プレート(1.1.2)のトランスウェル上に腸の部分を転送するために口のピペットを使用してください。彼らはtranswel渡って真っ直ぐになるように、必要に応じて静かに腸の位置を変更lである。注:腸管を通って管腔内容物を移動させ始めると、腸がねじれは、腸へのバックアップや損傷の原因となります。文化と治療トランスウェルの下に(追加された組換えタンパク質または薬理学的阻害剤と作動媒体)、トランスウェルの下から培地を除去処理培地700μlのを追加します。腸の上に処理媒体の滴ずつ300μlのを追加し、それがトランスウェルを通して浸すことができます。必要に応じて腸の位置を変更。処理媒体は、少なくとも一日一回またはより頻繁に治療試薬の半減期に応じて変化する。彼らの貯蔵容器にアガロースビーズを再懸濁し、1.5mlマイクロチューブにアガロースビーズを100μlを移す。無菌1×pHのチューブの残りの容量を埋めるosphate-緩衝生理食塩水(PBS)と、それらを洗浄するためにビーズを混ぜて。ビーズが底に沈殿した後、ビーズの上から、PBSをオフにピペッティングすることを可能にするために数分間ラックにマイクロチューブを置きます。無菌1×PBSでマイクロチューブを補充し、さらに2回の洗浄工程を繰り返します。2回の治療のために所望の濃度で目的のタンパク質を準備します。2倍のタンパク質原液5μlの水で洗浄したアガロースビーズを5μlを混合し、静かに、タンパク質中のビーズを攪拌する。静かに10〜15分毎に混合、1時間チューブを氷上に置きます。腸にビーズを配置する前に、滅菌1×PBS中で簡単にビーズをすすぐ。静かに引っ張らキャピラリー針で口のピペットを用いて腸の上にアガロースビーズを配置します。乱暴な取り扱いが腸を損傷し、損傷した領域に絨毛の発達を防ぐことができますように細心の注意を払ってビーズを配置します。腸蠕動運動や培養時間にわたる腸のオフにロールバックされます置かれたビーズの約半分を受けるので、分析に必要とされる2倍のビーズを配置します。慎重にトランスウェルの下から処理媒体を除去し、3分間空気乾燥腸を可能にします。その後定着時間の残りのための固定液2mlで腸の上部をカバーする、2分間のトランスウェルの下の固定液1ミリリットルを追加します。Nで固定してください。DPBS100μlのスライド上で(内因性蛍光を含む)全体の腸を置きます。優しく腸を配置する鉗子を使用してください。組織MOを作るために慎重に70%グリセロール100μlのDPBSを削除し、すぐに追加するには、実験室の組織を使用して、透明な再およびイメージングの可能性の深さを増加させる。注:腸のさらなる浸透が望まれる場合、代わりに70%グリセロール中に腸を取り付ける、10〜30分間、フォーカスクリア溶液の数滴で腸を浸す。ピペットでフォーカスクリアソリューションオフとマウント解除と腸をマウントします。粘土にカバースリップの四隅を浸し、腸を平坦からカバースリップを保つために、スライドとカバーガラスの間にスペーサーとして使用するために、粘土の少量を拾う。綿棒で塗布溶融しVALAPでスライド上にカバーガラスを密封。詳細については、議論を参照してください。小さなプラスチック金型7%アガロース(10×10×15ミリメートル)に埋め込む腸とにアガロースブ​​ロックを許可する冷却して凝固。瞬間接着剤でビブラコレクションステージにプラスチック金型及びグルーアガロースブ​​ロックからアガロースブ​​ロックを削除します。DPBSで収集段階を埋める。100〜150ミクロンの間の厚さでセクションをカット。厚い部分は、断面が深く可視化すること(セクション2.1.2で説明します)決済ソリューションを使用してください。4°Cでの保存のために6ウェルプレートのウェル内に収集段階からビブラトーム切片を注ぐ。DPBSで24ウェルプレートにウェル当たり5-12ビブラトームのセクションを配置します。DPBSを削除し、ウェルあたり透過処理溶液500μlを加える。静かに、室温で25分間サンプルを揺する。透過処理した後、1×PBSでサンプルを3回洗浄する。ブロッキング溶液500μlに、少なくとも30分間のサンプルをブロックします。BrdU)のではうまく機能しない核抗原回復を必要とする抗体、あまりにビブラトーム切片上でうまく動作します。翌日、ブロッキング溶液で15分間、試料を毎回3回洗浄する。洗浄後、ブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を500μlを適用します。光から蛍光団を保護し、室温で2時間に45分のためのサンプルを揺するようにアルミホイルで24ウェルプレートを包みます。15分ごとに1×PBSでサンプルを3回洗浄し、2.4節で説明したようにスライド上のビブラトーム切片をマウントします。取付ビブラトーム切片ビブラトームダブルSTIの薄切りを切断して取り付けるためのスライドを準備するCKテープとスライドの長辺に沿ってそれらを配置する。慎重に1×100μlのPBSの低下をスライド上に両面テープの間に5-10ビブラトームセクションを配置。すべてのセクションを展開するとスライド全体で単一層にそれらを広げた。フラットに座ってからカバースリップを妨げる余分なアガロースまたは不均一なビットを削除します。PBSを吸収するために実験室組織を使用しています。ビブラトーム切片の上部に水性封入剤のドロップを追加し、その後カバースリップ。綿棒で塗布溶融しVALAPでスライド上にカバーグラスを密封。いずれかでビブラトーム切片。イメージングシステムの選択についての詳細は、説明を参照してください。ライブイメージング腸fetuseから収穫E12.5後のsは、そのままに接続された大網で、成功した上記のシステムを用いて、培養中の絨毛を開発しています。したがって、このエキソビボシステムは、経時的な形態形成の三次元ビューを再構成することができる現像腸の生のz断面画像の捕捉を可能にする。細かいメッシュのスクリーンに個別のポリカーボネート膜を接着する瞬間接着剤を使用してください。これは直立共焦点顕微鏡の浸漬レンズ下の場所に腸を保持するための支持足場を提供します。ライブイメージング顕微鏡の選択についての詳細については、議論のセクションを参照してください。中央ウェルの培養プレートにメッシュスクリーンを配置します。ポリカーボネート膜上に解剖し、腸を置き、両端に瞬間接着剤を一滴加える。腸に固定するだけの十分な接着剤を使用してくださいではなく、コート、それ!ポリカーボネート以下のフェノールレッドを含まない培養培地を追加します。培養プレートの中央ウェル中の膜。湿度を提供するために、培養プレートの外縁に水を加える。イメージングしながら、腸の動きを制御するために、メディアの3ミリリットルの1×PBS中のキシラジンの5溶液:胎児の腸は、培養中の収縮の蠕動様の波を起こしているので、1を100μlを追加。この投与量は、絨毛の発達を損なうことなく、約8〜10時間、腸の動きを制御します。腸の横断ビューの場合は3〜4%アガロース溶液中でのライブ腸を埋め込み、ビブラトーム上の厚い部分(150〜500μm)をカット。切断された腸の剛性とアガロースの剛性を合わせて、経験的に発達段階を決定した。一般的に、3%アガロース溶液はE14.5よりも若い腸に適していますし、4%溶液腸E15-E16に適しています。(3.1.1項のように)メッシュスクリーンに貼付されたポリカーボネート膜にビブラトーム切片を接着し、セクション3.1.2-3.1.6で説明したように文化。nmの励起レーザー)を使用したライブイメージングを実施する。GFPシグナルのための最高の解像度と深い浸透を提供するから900nmに同調二光子レーザー。イメージングながら、組織への損傷を低減します。可能な限り低い発光レーザのパワーを設定する組織損傷を減少させる。典型的には、二光子レーザーに12%の電力を使用して、GFPの良好な励起を得る。Resultsこのシステムは、薬理学的試薬または組換えタンパク質とシグナル伝達の操作を可能として、胎児腸の全体の外植片の培養は、腸の開発を調整シグナル伝達分子の位置、分布、および期間の分析が可能になります。ウォルトンらから再生される。E18.5にE10の胚から採取された腸をトランスウェル上で培養中で生き残るためには、運動の蠕動様波を受ける。腸は、約10日間、またはおよそ陰窩形成が最初に観察され、P3、マウス発生段階に生き残るE13.5から文化に始まった。初期段階の腸が培養で生存しているが、腸が前に収穫漿膜は完全にその時までに、腸をカバーするために成長していないため、E12.5は、確実に可能性絨毛をemergeしないでください。かかわらず、培養開始(E12.5-E14.5)で、腸のステージの、腸は常に24時間のおおよその遅延が表示されます。strong>は、ウォルトンらから再生。この画像は、ライカLAS-AFソフトウェアによって縫合された視野の54分野のzスタックで構成されています。腸内の各スポットは、PDGFRα遺伝子座14から発現される核タグ付きGFPにより可視化した間葉系クラスタです。画像の高解像度は、視聴者がズーム·インするために特定の領域に詳細を調べることができ、まだ深くビューまたは低電力倍率の単一のフィールドから収集することができない空間的な関係を提供しています。ムービー1は、ステッチのzをステップ実行するシリーズです3Dである-stackイメージは、図2に再建。個別の光学切片は、クラスター内の単一の細胞のような細部のさらなる可視化を可能にします。腸の血管のこの三次元図は、完全に薄片の準備には理解できない血管系の複雑なネットワークを明らかにしている。動画2、図3の再構成画像の回転3次元投影は、どのようにのさらなる理解が可能になる構造的パターニングの理解を向上させることができ設けられた3次元再構成することによって情報を増加させた。ビブラトーム切片は、横断バンテージから腸の立体視が可能になります。+印)(の関係が観察される。1:1,000希釈)。この全体の器官培養系はまた、胎児の腸を発症する二光子イメージングを可能にするように拡張することができる。図6)に接着されている。共焦点顕微鏡レンズを内部に十分に腸に接触するように培養プレートのウェルより大きなサイズが可能になる。トランスウェル培養系全体の胎児腸の開発。(A)トランスウェルMEM上に置かれた胎児の腸BGJbメディアとの6ウェル培養プレート中ブレーン。(B)ウシ血清アルブミン浸したアガロースビーズ(明るい青)トランスウェル培養系で十二指腸に置いた。暗い青色の染色は、間葉系クラスター16。+用のX-gal染色である。0(E)、E-カドヘリン(緑)およびDAPI(青色)で染色した十二指腸組織。2日)は、わずかに遅れたものの、絨毛は、培養中に発症することを示している。パネル(CF)はウォルトンらから転載している。スケールバーは50μmである。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。nmでの二光子レーザー励起で立っている。ライカLAS-AFソフトウェアは、画像全体を形成するためにZ-スタックをステッチ。スケールバーは1mmである。"/>E14の十二指腸における腸血管系のホールマウント抗PECAM免疫蛍光を示す光学セクションの図3三次元再構成。7.6.1ソフトウェアを用いて再構成。スケールバーは200μmである。ビブラトーム切片E15.5PDGFRαEGFPの図4。Rosa26遺伝子mTmGから膜トマト)。strong>のスケールバーは、上のパネルが50μmと下のパネルにおいて25μmである。染色された抗体免疫蛍光だったE15.5のビブラトーム切片腸からの共焦点画像を図5の三次元再構成。スケールバーは50μmである。2光子ライブイメージングのためのトランスウェル培養系の6適応図。(A)画面が培養皿に配置されるメッシュ。(B)ポリカーボネート膜はメッシュスクリーンに接着される。(C)腸のポリカーボネート膜に接着及びフェノールを含まないDMEM培地で培養する。+腸の全体のZスタックをステップ実行する。図2にE14の十二指腸におけるPECAM染色血管系の光学切片の3次元再構成を示すムービー2回転ムービー。librarian.Discussion動的な性質と途上腸の複雑な組織の相互作用は、これらの形態形成イベントの完全な理解を持つように3次元可視化を必要とします。イメージング技術の進化により、能力が/開発の改善とそれに、器官形成時の空間的なコミュニケーションと相互作用の理解が大幅に強化されている詳細に絨毛の形態形成を調べた。全体腸を培養するための別の方法も試験されているが、トランスウェルシステムは、より長い培養時間のために、通常のクラスタと絨毛パターニングを維持するための最も信頼性の高いままです。若い腸(E12.5-E15.5)の三次元培養システム(マトリゲルまたはコラーゲン)短い培養期間の井戸(未満24時間)動作しますが、腸蠕動様運動を受けているし、酵素や廃棄物を分泌始めたら内腔に、三次元の基板がうまくホールドアップしないでください。液体培養における腸sはまた、しかし、浮遊培養でのオリエンテーションのためのサポートや参照の欠如を開発するクラスターおよび絨毛の正常なパターンを変更するために表示されます。したがって、トランスウェルシステムは、クラスタパターニングおよび絨毛出現と成長を調べることが好ましい。厳密なセットを上にして、ホールマウントライブイメージングのための別の方法は、35×10ミリメートルプレートの底面に7%アガロースの薄層に胎児の腸を固定するminutienピンを使用することです。この方法はセットアップが容易ですが、マトリゲルは腸の分泌物まで保持しないので、その使用が若い段階(E12.5-E15.5)またはより短い培養時間のために制限されていることに注意してください。培養プレートを調製するためには、わずか35×10ミリメートルプレートの底をカバーするのに十分な溶融7%のアガロースを注ぐ。それがまだ可鍛性である間、アガロースの中央にガラス毛細管を配置します。アガロースが固化した後、ガラス管を取り外すとtを配置毛細管によって作成された仲だ胎児の腸。腸を囲むとマトリゲルセットまで37°Cで培養皿を配置するマトリゲルとよくキャピラリーを埋める。慎重にフェノールレッドを含まないDMEM培養培地を追加します。60×15mmのプレートの内側35×10ミリメートルプレートを置き、加湿チャンバーを作成するために水で60ミリメートルプレートを埋める。ライブイメージングのための実装方法の選択(ホールマウントまたはビブラトーム)が可視化されるべき領域の所望の向きに基づいている。上皮細胞の形状の変化を表示するには、wholemounted腸を通じてのzスタックは、頂端および基底面のビューを提供します。上皮シート内の上皮細胞の核移行をinterkinetic表示するには、ビブラトームのセクションでは、(横)ビュー上の端が頂端および基底表面を観察することができます。サンプルの調製は、最高の撮像結果を得るために重要である。分解能をクリア試薬なしで75μmの深さまで実現することができる。現在、生きたサンプルについてのクリアリング試薬は、イメージングの深さが制限されるので、同定されていない。固定したサンプルについては、クリアリング試薬の使用が大幅イメージングの深さを改善することができる。最良の形態及び解像度を提供することが見出さクリアリング試薬は、フォーカス17をクリアした。明確な焦点でクリアするとクリアマウントに装着する30分後、胚の腸のすべての段階の全体の深さは、優れた解像度で画像化することができます。安価な透明代替は、70%のグリセロール、胚組織における浸透の深さが最大で150m、その後解像度と信号の強度が失われているである。一つの重要な注意点は、信号がほとんど染色が完了した同日に搭載され、画像化されているサンプルで定義されていることである。Technologies社P36930)などの信号を維持しますが、簡単にのみに役立ちません。明瞭な画像は常に試料を染色し、マウントした直後に得られる。gdpr@jove.com.。