本研究は、クロマチン構造を形成したDNA上での相同組換え反応の解明を目指して、特に相同鎖検索機構の過程を中心に研究を推進している。ゲノムDNAの二重鎖切断損傷の修復や減数分裂期の遺伝的組換えにおいて、相同組換えは必須の機構である。RAD52は、ゲノムの損傷領域において単鎖DNAと複合体を形成する。本年度は、相同組換え反応に重要なRAD52と単鎖DNAとの複合体のX線結晶構造解析を行い、立体構造の解明に成功した。RAD52と単鎖DNAとの複合体には、2種類のDNA結合様式が存在することを立体構造レベルで明らかにし、相同組換え反応の際の相同鎖検索機構の1つである、単鎖DNA間でのアニーリング反応のメカニズムのモデルを提唱した。え系によって解析を行った。比較対象として、ヒトおよびイネのRAD51およびDMC1の精製も行い、シロイヌナズナのRAD51およびDMC1の相同組換え活性との比較研究を行った。その結果、シロイヌナズナのDMC1およびRAD51の相同的対合活性は、植物間で非常に近接しており、ヒトのRAD51およびDMC1とは、その活性の強度において異なっていることが明らかになった。これらのサンプルは、RAD51およびDMC1とヌクレオソームとの複合体の立体構造解析の試料として有用であり、現在行っている、RAD51-ヌクレオソーム複合体のクライオ電子顕微鏡解析に使用する予定である。ヒトRAD51-単鎖DNA-ヌクレオソーム複合体の調製方法の確立に成功し、現在、クライオ電子顕微鏡によって初期データの取得を開始している。本研究では、生化学的および構造生物学的手法を中心に、クロマチン上での相同組換え機構の解明を目指している。本年度は、相同組換えの中心の反応である相同的対合反応を担うRAD51およびDMC1に加えて、相同的対合反応を直接もしくは間接的に触媒するRAD52に着目して研究を進めた。RAD52と単鎖DNAとの複合体のX線結晶構造解析による立体構造解析に成功し、2種類のDNA結合領域において単鎖DNAが結合した複合体の立体構造情報を得た。それらの解析を通して、相同組換え反応の際に起こる単鎖DNA間でのアニーリングの反応モデルを提案することができた。この成果は、当初の計画を大きく上回るものであった。RAD51およびDMC1による相同的対合反応の解析対象を、遺伝学的解析が容易なシロイヌナズナまで広げ、シロイヌナズナのRAD51およびDMC1を精製する系を確立した。これらの研究成果は、2報の学術論文として報告した。これらのことから、本年度の研究は当初の計画以上に進展したと言える。今後は、ヌクレオソーム上におけるRAD51およびRAD52による相同鎖検索機構を、立体構造レベルで明らかにするために、RAD51-単鎖DNA-ヌクレオソーム複合体およびRAD52-ヌクレオソーム複合体の立体構造解析を、クライオ電子顕微鏡解析を中心に推進する。それによって、これまでボトルネックとなっていた結晶化を回避し、立体構造情報が得られると考えられる。Arctica(200kV)の装置を中心に用いることで推進する。並行して、RAD51-単鎖DNA-ヌクレオソーム複合体およびRAD52-ヌクレオソーム複合体の結晶化についても、結晶化ロボットを用いた大規模スクリーニングを行なう。Factoryにて回折実験を行い、データセットを取得する。RAD51-単鎖DNA-ヌクレオソーム複合体およびRAD52-ヌクレオソーム複合体の立体構造を明らかにすることで、ヌクレオソーム上での相同鎖検索機構を明らかにする。