Colour?Liquid?Detergent或OMO_Total中洗涤1小时3或10次。(正面和反面)。XVII中显示。0.25%Colour?Detergent溶液的pH为7.9,0.25%OMO_Total溶????????液为8.4。ALKO?4237的纯化20K-和50K-纤维素酶(实施例9)。0.25%Colour?Detergent溶液的pH为7.9。(PD,Difco,USA)培养基中42°C,250rpm生长3天。1:17-20(1985)分离染色体DNA。:异戊醇(24:1?v/v)的混合物提取DNA。用RNA酶消化RNA。1(429-32)来自N-端肽#429的氨基酸#8-14(图17),引物2(fr28-16)设计成肽fr28的氨基酸#2-8的反义链(图17)。Dynazyme?DNA聚合酶(Finnzymes?Ltd,Finland)。10μl反应混合物,检测到相应于大约600bp长的单条带。XL-Blue细胞(Stratagene,USA)。pALK549的MelanocarpusDNA。pALK549中的插入片段(594bp)编码大多数20K-纤维素酶产生的肽(图17)。PCR扩增的DNA(除引物外)相应于图19的核苷酸175-716。按实施例18所述分离Myriococcum种类ALKO?4124的染色体DNA。在LB+0.2%麦芽糖+10mM?MgSO4中生长大肠杆菌XL1-BlueMRA(P2)-细胞(Stratagene,USA)并稀释成OD600=0.5。用Melanocarpus?albomyces?ALKO?4237基因组文库(实施例18)37°C感染细胞15分钟并用NZY顶级琼脂糖涂布在NZY平板上。平板在37°C培养过夜。(Hybond,Amersham,UK)上。PCR片段(实施例19)。在68°C进行杂交。DNA分析噬菌体DNA,用PCR探针杂交消化的DNA。pBluescript?II?Sk+载体(Stratagene,USA)中,分别产生质粒pALK1221,pALK1222和pALK1223(图18)。按实施例19所述测序pALK1221中的Melanocorpus?albomycesDNA。(图17、肽#429)。45家族(Henrissat和Bairoch,生化杂志,293:781-788(1993))。Helsinki,第8卷,109;Saloheimo等,1994,分子微生物学,13,219)。1(507-128)来自肽#507的氨基酸#5-10,引物2(509-rev)设计成肽509的氨基酸#4-9的反应链(表IX)。Dynazyme?DNA聚合酶(Finnzymes?Ltd_Finland)。XL-Blue细胞(Stratagene,USA)。pALK1064。按实施例19所述测序pALK1064中的插入片段(161bp),且发现含有一个ORF,预期它是与Hunicola?grisea葡聚糖内切酶I(DDBJ:D63516)同源的肽。该ORF也编码来自纯化的50K-纤维素酶的肽#612(表IX)。PCR扩增的DNA(除引物外)相应于图21中的核苷酸404-530。Melanocarpus?albomycws?ALKO4237的基因库。PCR片段(实施例21)。杂交在68°C进行。pBluescriptII?SK+载体(Stratagene,USA)中,分别产生质粒pALK1234,pALK1233,pALK1226和pALK1227(图20)。46.8kDa且信号肽裂解后为44.8kDa。),引物2(534-rev)设计为肽#534的氨基酸#3-8(表X)的反义链。XL-Blue细胞(Stratagene,USA)。pALK1224。50K-纤维素酶B的全肽#636(表X)的ORF。ORF预期为与Humicola?grisea纤维素生物水解酶I(DDBJ:D63515)同源的肽。PCR扩增的DNA(除引物外)相应于图23中的核苷酸371-1023。50K纤维素酶B基因的pALK?1224纯化的PCR片段(实施例23)。在68°C进行杂交。按照Sambrook等,在分子克?。DNA来分析噬菌体DNA,用50K-纤维素酶B特异性PCR探针杂交消化的DNA。pBluescriptII?SK+载体(Stratagene,USA)中,产生质粒pALK1229(图22)。pBluescriptII?SK+载体(Stratagene,USA)中,产生质粒pALK1236(图22)。1734bp的ORF。1.5kb片段来分离携带Trichoderma?reesei?egl2特异性DNA的DNA片段。cbh1基因的克隆在Teeri等,生物/技术1:696-699(1983)中描述且该DNA序列在Shoemaker等,生物/技术1:691-696(1983)中描述。gel2(最初称为“egl3”)基因在Saloheimo等,基因63:11-21(1988)中描述。cbh1探针在68°C并用egl2探针在60°C进行杂交。20K-纤维素酶特异性PCR片段(实施例19)杂交。pALK1230(图26)。??赏贫夕?3也携带50K-纤维素酶B基因。在:TIWC96会议录,1996,Vol.1(2),pp.197中)。以重组DNA方法生产该制品在US?5,298,405或Suominen等(1993)。用来自质粒pALK1231或pALK1235的表达盒(图28和29)转化亲本Trichoderma?reesei菌株ALKO3620。241:515)。/技术1.691)。T.reesei(2)cbh1启动子的最后15个核苷酸(SacII位点下面划线)是CCGCGGACTGCATC(Shoemaker等,1983)。DNA整合进cbh1基因座。ATG-密码子开始的0.9kb片段。amdS基因的1007bp的启动子区域,1897bp的编码区(包括内含子)和183bp的终止子区域。241:523)。13:227)。cbh1基因座。B抗性转化Trichoderma?reesei,普通遗传学,25:567)。(pkil)的鉴定,基因,130:271)。B抗性转化Trichoderma?reesei。普通遗传学,25:567)且来自质粒pRLMex?30。Trichodermaviridae中的纤维素酶,细菌学杂志,73:269)。DNA整合进egl1基因座中。*egl1?3'-片段:与5'-片段一样,从T.reesei?QM6a中分离1.6kb?egl13'-片段(ScaI-XhoI)。ABI(应用生物系统,USA)381ADNA合成仪合成。DNA测序按实施例19所述进行。T.reesei?ALKO3620。200:643)的EGI及Proto?Blot?Western印迹AP系统(Promega,USA)根据厂家建议检测CBHI。T.reesei菌株ALKO?3620/pALK1231/14,ALKO3620/pALK1231/16,ALKO?3620/pALK?1231/20和ALKO?3620/pALK?1231/59不含cbh1基因。Southern杂交中证实cbh1基因的取代。T.reesei菌株ALKO?3620/pALK?1235/40和ALKO?3620/pALK?1235/49不含egl1基因。ble基因(Mattern等,1988,Drocount等,1990)取代)。使用Promega’s?ProtoBlot_AP系统。20K-纤维素酶(泳道6)的大小相同。XX中提供。用来自质粒pALK?1238或pALK?1240(图31和32)的表达盒转化亲本Trichoderma?reesei菌株ALKO?3620。山西快乐10分钟的玩法。