JavaScriptを有効にして再度、お越しください。Abstractフォーミーウイルス(FV)は、レトロウイルス科・スプーマウイルス属に分類され、これまでにネコの他、ウシ、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、ヒヒ、アフリカミドリザル、アザラシ、ハムスターなど多くの動物種に、その存在が報告されている。ネコフォーミーウイルス(FFV)は、1969年に喉咽頭癌のネコリンパ節初代培養細胞から初めて分離され、それ以来世界各国で分離報告がなされた。一般的な感染経路は、唾液や咬傷による個体間の水平感染と、胎盤を介した母子間での垂直感染である。ネコに対する病原性や他の病原因子との相互作用等は、これまでのところ報告されていない。FVに近縁のヒト内在性レトロウイルスの存在も報告されているが、ネコに存在するかは不明である。泡状化(これが「フォーミー(泡)」の由来)など、細胞変性効果(CPE)を誘導するが、そのCPEから生き残る細胞も出現し、持続感染状態になる。vivoでは免疫系から終生排除されないにも関わらず病原性が見られないことは、FVの研究により、レトロウイルスの病原性発現機構を解明する上で、大きな手掛かりが得られると思われる。近年、FV研究は分子レベルで急速に進みつつあり、レトロウイルス属に分類される他の科と多くの点で違うことが明らかになってきた。レトロウイルス科のウイルスは通常、感染性ウイルス粒子中にRNAのゲノムを持つが、FVはRNAゲノムではなく逆転写後のDNAゲノムをも持つ。FVはレトロウイルス属の中で、ゲノムサイズが一番大きく、構造遺伝子の他にいくつかの調節遺伝子をもち、非分裂細胞にも感染するという特徴も持つ。一般に病原性が無く、非分裂細胞にも感染するという特徴は、FVが新しいレトロウイルスベクターの候補として、卓越した安全性と利便性を備えていることを示している。本研究では、FFVの持続感染機構の解明とFFVを骨格とした新しいレトロウイルスベクターシステムを構築することを目指して、転写機構の解析および感染性遺伝子クローンの作製を行った。FFVは、生体内で持続感染しており、感染したネコからは終生ウイルスが分離できる。vitroにおいては、FFV持続感染細胞株が樹立可能である。Sammy-1)のFFVを用いて検討を行った。これら3株をCRFK細胞に感染させ、生残細胞からそれぞれの株の持続感染細胞株を樹立した。Butyrate、脱メチル化剤である5-Azacytidineでそれぞれ薬剤処理したところ、TA処理によって3種類のFFV株の持続感染細胞のうち、Coleman株持続感染細胞においてCPEの誘導と、培養上清中へのウイルス産生量の濃度依存的増大が示された。Butyrateで処理した場合には、いずれのウイルス株にも目立ったウイルス産生の上昇は見られなかった。ヒトフォーミーウイルス(HFV)を持続感染させたハムスター腎臓由来細胞株(BHK-21)に対しては、いずれの薬剤も効果を表さなかった。したがって、Coleman株の再活性化には、TA特異的なヒストンのアセチル化が影響することが確認された。3株の内部プロモーター(IP)領域には大きな違いは認められなかったが、LTRのU3領域内にあるプロモーター領域(nt.615-641)では、Coleman株と比較して、S7801株やSammy-1株に17塩基対の欠損が見つかった。TAによるColeman株LTRの特異的活性化はβ?Galアッセイでも確認され、TA特異的なColeman株のウイルス産生増強作用には、この領域の関与が示唆された。以上の結果から、FFV持続感染細胞からウイルスの再活性化には、少なくともヒストンのアセチル化とU3プロモーターの配列が影響していることが推察された。TAによる再活性化状態での各遺伝子の発現パターンを比較した。2001)では、急性感染でLTRプロモーターおよびIPの両ウイルスプロモーターが活性化されているのに対し、持続感染では高いIP活性を保持したままLTRプロモーター活性だけが下がると考えられていた。これは、異なる細胞株を用いてプロモーター活性を比較した結果であるため、同じ細胞株(CRFK)で急性感染細胞と持続感染細胞を作製し、転写産物の発現パターンを調べたところ、以前の報告とは異なる結果が得られた。LTRプロモーターに由来する10.5、8.9、7.6および5.6kbのmRNAは、いずれの感染細胞でも強く発現していたが、IPに由来する2.6、2.2および2.0kbのmRNAは、持続感染細胞での発現が抑えられていることが分かった。これは、持続感染ではIP活性が抑制されていることを意味している。TAによる持続感染細胞からのウイルス発現の増強は、IPの活性化を特徴とした急性感染状態への移行ではなく、持続感染のRNA発現パターンを維持したままゲノムに挿入されたLTRプロモーターを直接活性化することによると考えられた。持続感染細胞では、IPに由来する遺伝子翻訳産物の発現も減少しており、このことからもIP活性の抑制が確認された。mRNAの発現パターンにも、急性感染と持続感染で違いが見られたことから、FFVの急性感染と持続感染では複製システムに違いがある可能性が示唆された。vivoにおけるFFVの急性感染と、それに続く持続感染の複製システムの違いを表していると考えられる。FFV複製システムの解明と、ウイルスベクターへの応用を目指して、感染性FFV遺伝子クローンの作製と塩基配列の決定を行った。LTRおよび全長をコードする3種類の遺伝子をクローニングした(pSKY1.0、pSKY2.0およびpSKY3.0)。S7801株全長をコードするプラスミドも同様に作製し(pSKY5.0)、全塩基配列を決定した。FUV株と比較したところ、約82?97および83?97%と高い相同性を示し、HFV-N株とは約18?60および34?60%であった。各プラスミドはCRFK細胞に導入後、TA処理を行うことで感染性ウイルスクローンを効率良く回収でき、pSKY1.0とpSKY2.0を同時に導入した場合、導入後4日目に103TCID50/mlのウイルスクローンが回収された。全長をコードするpSKY3.0またはpSKY5.0を用いた場合には、導入後3日目に、>106、>103TCID50/mlの高力価のウイルスをそれぞれ回収することが出来た。pSKY3.0のenvおよびbel-1の5'側一部を含む領域をHFVの相同遺伝子と組換えたプラスミド(pSKY4.0)を作製し、BHK-21細胞でのウイルス発現を調べたところ、105TCID50/mlのウイルスを回収できた。ウイルス発現は、培養細胞におけるCPEの他、PCR、ウエスタンブロッティングによっても確認した。vitroでの感染性は広い宿主域にわたることが示された。SPFネコに接種後30日で、血清中にGagに対する抗体価と、末梢血リンパ球からgag、env、bel-1に対する特異的遺伝子が検出された。vivoにおいても複製可能であることが示唆された。Coleman株持続感染細胞からのウイルス発現を増加させることが示された。FFVの急性感染システムおよび持続感染システムの違いは、FFVゲノムに存在する2種類のプロモーター(LTRとIP)の活性化パターンに大きく表れていたが、TAをFFV持続感染細胞に作用させた場合に、急性感染の複製システムへ復帰しないことが示された。DNAクローンから効果的に感染性ウイルス粒子を回収することが可能となり、今後FFV転写システムの解明を行う上で有用なツールになると思われる。近年、FVによる遺伝子導入用ベクターの高い潜在能力が報告されており、本研究がレトロウイルスベクターの安全性と利便性の向上にも大きく貢献できるものと考えている。