101と、Gタンパク質106と、Gタンパク質連動型カリウムイオンチャネルKir3.1のうち、137番目のフェニルアラニンをセリンに改変させたイオンチャネル110とを株化細胞に発現させる。カリウムイオンチャンネルを通じた細胞内へのカリウムイオン流入による、イオン電流の変化を測定することにより、標的となる化学物質103を高感度で高精度に検出することができる。本発明は、高感度で化学物質を検出することが可能である細胞、脂質二重膜の産生方法に関する。高感度でかつ特異性の高い化学物質センサを作成するためには、生体に存在する化学物質受容体を利用するのが効率的な方法である。生体由来の受容体を利用した化学物質センサ作成方法としては、目的の受容体と関連して動作する膜タンパク質を分子生物学的手法によって細胞に発現させ、受容体と膜タンパク質との間に発生する内因性シグナルパスウエーを利用して、化学物質を検出するというものがあった(例えば、特許文献1、特許文献2参照)。図1に示すように、生体の細胞膜には、(1)化学物質受容体(レセプター)101、(2)化学物質受容体101に保持され、細胞内側(図1では細胞膜105の下側)に存在する3つのサブユニットGα(符号106)、Gβ(符号107)、Gγ(符号108)からなるGタンパク質、(3)細胞膜105を貫通するカリウムイオンチャンネル102が存在する。神経伝達物質などの化学物質103が、化学物質受容体101の細胞外側(図1では細胞膜105の上側)に結合すると、Gタンパク質は、Gβ(符号107)およびGγ(符号108)の2つのサブユニットを放出する。これら2つのサブユニットは分解せず、保持された状態で細胞内を移動し、カリウムイオンチャネル102に到達する。【0004】Gβ(符号107)およびGγ(符号108)の2つのサブユニットがカリウムイオンチャネル102に到達すると、カリウムイオンチャネル102が開き、細胞外の体液に含まれるカリウムイオン104(K+)を細胞内へと移動させる。通常、細胞外のカリウムイオンの濃度は、細胞内のカリウムイオン濃度よりも高いので、カリウムイオンチャネル102が開かれると、イオン濃度勾配等により、細胞内のカリウムイオン濃度が上昇する。【0005】Gタンパク質連動型カリウムイオンチャネル(GIRK)としては、GIRK1〜4の4種類が知られている。ここで、Gタンパク質連動型カリウムイオンチャネル(GIRK)は、内向き整流性カリウムチャネル(Kir)の1種でKirの方が一般的であるから、本明細書ではGIRK1をKir3.1として表記する。非特許文献2には、Kir3.1の137番目のフェニルアラニン(F)をセリン(S)に置換したGタンパク質連動型カリウムイオンチャネル(=Kir3.1(F137S))またはKir3.4の143番目のセリン(S)をスレオニン(T)に置換したGタンパク質連動型カリウムイオンチャネル(=Kir3.4(S143T))、アセチルコリン受容体、および天然Gタンパク質を脂質二重膜上に分散させ、アセチルコリンが受容体と結合することによる脂質二重膜内外のカリウムイオン濃度の変化を電気的に測定することが開示されている。特許文献1や特許文献2に開示されている化学物質の検出方法は、内因性シグナルパスウエーを発生させるために必要な膜タンパク質が複数存在し、受容体と膜タンパクを同時に細胞膜上に発現させることが困難であるという課題を有している。非特許文献2に開示されている方法で得られるアセチルコリン受容体、Gタンパク質連動型カリウムイオンチャネル、およびGタンパク質を分散させた脂質二重膜も、化学物質に対する検出感度は充分とは言えない。本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、化学物質を検出するために必要最小限の膜タンパクを細胞膜上に同時に発現させることにより、従来よりも効率よく化学物質を検出することを可能とする方法、そのような方法に使用する細胞、およびそのような方法に使用する脂質二重膜の産生方法を提供することを目的とする。本発明者らは、化学物質受容体と、Gタンパク質連動型カリウムイオンチャネルKir3.1の137番目のフェニルアラニンをセリンに改変した改変型カリウムイオンチャネル(Kir3.1(F137S))と、Gタンパク質を発現させるプラスミドと、を株化細胞の脂質二重膜に共発現させ、この脂質二重膜内外のイオン電流を測定することにより、特定の化学物質を感度よく検知可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。前記Gタンパク質と、を共発現させた脂質二重膜の産生方法に関する。化学物質受容体と、Gタンパク質連動型カリウムイオンチャネルKir3.1の137番目のフェニルアラニンをセリンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、Gタンパク質と、を株化細胞の脂質二重膜に共発現させ、カリウムイオンの株化細胞内への流入によって発生する電流変化を測定することにより、前記化学物質を検知可能とする方法に関する。前記改変型カリウムイオンチャネルは、放出されたGタンパク質のサブユニットと結合したときに、細胞外のカリウムイオンを細胞内へと輸送する、細胞に関する。Gタンパク質のサブユニットを放出させ、前記放出されたGタンパク質のサブユニットが前記改変型カリウムイオンチャネルに結合することによって前記脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する工程、を有する、方法に関する。前記カリウムイオンの濃度の変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程を有する、方法に関する。前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラGタンパク質であることが好ましい。本発明によれば、目的の化学物質を高感度、かつ、高精度に検出することができる。本発明によれば、目的とする化学物質を検知するための脂質二重膜を容易に産生することができる。【図1】細胞表面の脂質二重膜における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。【図2】本発明の実施の形態1における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。【図3】本発明の実施の形態2における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。カリウムイオンチャンネル、およびキメラGタンパク質を株化細胞に共発現させる方法の基本原理を説明する概念図である。【図5】実施例および比較例のHEK293細胞について、カリウムチャネルに流れる電流を比較したグラフである。【図6】実施例および比較例のHEK293細胞について、イソプロテレノールによるイオン電流の変化を示すグラフである。以下本発明の実施の形態について、適宜図面を参照しながら説明する。【0021】(実施の形態1)図2は、本発明の実施の形態1における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。図1との相違点は、カリウムイオンチャンネルが、Gタンパク質連動型カリウムイオンチャネルKir3.1のうち、137番目のフェニルアラニンをセリンに改変したカリウムイオンチャネル110(Kir3.1(F137S))であることである。通常、カリウムチャネルは2種類のタンパク質から構成されるヘテロマーであり、従来技術(非特許文献1)ではヘテロマーをカリウムイオンチャネルとして使用している。改変型カリウムイオンチャネル110では、1種類のタンパク質によって有効なイオンチャネルが構成されている。【0023】また、図2において、改変型カリウムイオンチャネル110は、化学物質受容体101とGタンパク質106と有機的に関連してシグナルパスウエーを構成している。目的となる化学物質103が化学物質受容体101に結合すると、Gタンパク質106が活性化されてGDP107をGTPに置換し、改変型カリウムイオンチャネル110のチャネル部を開口させて、カリウムイオン104が細胞内に流入する。カリウムイオン104の流入によって発生する電流変化を測定すれば、化学物質103の有無を検出することが可能となる。【0024】カリウムイオンチャンネルとして改変型カリウムイオンチャンネル110を用いることにすれば、細胞表面(脂質二重膜)に発現させる膜タンパク質が3種類しか必要でないため、効率よく細胞膜上に発現させることができる。【0025】(実施の形態2)図3は、本発明の実施の形態2における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。図2との相違点は、Gタンパク質が化学物質受容体101と改変型カリウムイオンチャネル110それぞれと高親和性を持つように設計されたキメラGタンパク質411であることである。412)が存在するため、より協調されたシグナルパスウエーが期待できるため、効率のよい検出を行うことが可能となる。【0027】なお、化学物質受容体101は、ホルモン受容体であっても良い。味覚受容体であっても良い。【0028】[実施例]次に、本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。カリウムイオンチャンネル(Kir3.1(F137S))、およびキメラGタンパク質を株化細胞の表面(脂質二重膜)に共発現させる方法の基本原理を、図4に示す。図4では、化学物質受容体としてβ1アドレナリン受容体を発現させている。【0030】それぞれの膜タンパク質をコードするcDNAを増幅し、それをクローニングする。それぞれの膜タンパク質をコードするcDNAを組み込んだ発現プラスミドを調製する。次に、3種類の発現プラスミドをベクターとして株化細胞(HEK293)内へ導入することにより、株化細胞表面の脂質二重膜に、3種類の膜タンパク質を共発現させる。カリウムイオンチャンネル、およびキメラGタンパク質を共発現させた。【0032】<1.改変型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)の発現プラスミド作成>改変型カリウムイオンチャンネルKir3.1(F137S)は、マウス内向き整流性カリウムチャネルKir3.1(mKir3.1)を部分的に変異させて構築した。マウス脳由来のRNAを逆転写して得られたcDNAを、PCR法を用いて2断片に分けて増幅した。プライマーはそれぞれmKir3.1-F3R(配列番号1)とmKir3.1-R948R(配列番号2)、mKir3.1-F684R(配列番号3)とmKir3.1-R1660R(配列番号4)を用いた。得られた断片は、クローニングベクターにサブクローニングした。得られた2つのベクターを鋳型にして、さらにPCR反応を行った。プライマーはそれぞれmKir3.1-5’_NheI(配列番号5)とmKir3.1-R828_ClaI(配列番号6)、mKir3.1-F817_ClaI(配列番号7)とmKir3.1-3’_NotI(配列番号8)を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。それらクローニングベクターを、それぞれNheIとClaI、ClaIとNotIで処理し、あらかじめNheIとNotIで処理した発現ベクターにライゲーションし、発現プラスミドplasmid(mKir3.1)得た。次に、発現プラスミドplasmid(mKir3.1)を鋳型として、mKir3.1-F137S(-)(配列番号9)とmKir3.1-F137S(+)(配列番号10)を用いたオーバーラップ・エクステンション法により変異を導入した。して得られた断片は、クローニングベクターにサブクローニングした。それらクローニングベクターを、それぞれNheIとEcoRI、EcoRIとXhoIで処理し、あらかじめNheIとXhoIで処理した発現ベクターにライゲーションし、発現プラスミドplasmid(mKir3.1(F137S))を構築した。【0035】<2.β1アドレナリン受容体(rβ1R)の発現プラスミド作成>ラット心臓由来のRNAを逆転写して得られたcDNAを、PCR法を用いて2断片に分けて増幅した。プライマーはそれぞれrat-beta1(+)1(配列番号19)とrat-beta1(-)1050(配列番号20)、rat-beta1(+)941(配列番号21)とrat-beta1(-)1401(配列番号22)を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。得られた2つのベクターを鋳型にして、さらにPCR反応を行った。プライマーはそれぞれEcoRI-Kz-rat-beta1(+)1(配列番号23)とrat-beta1(-)1050(配列番号20)、rat-beta1(+)941(配列番号21)とrat-beta1(-)term-Sal(配列番号24)を用いた。得られた2つの断片は、クローニングベクターにサブクローニングした。それらクローニングベクターを、それぞれEcoRIとHindIII、HindIIIとSalIで処理し、あらかじめEcoRIとSalIで処理した発現ベクターにライゲーションし、β1アドレナリン受容体発現プラスミドplasmid(rβ1R)を得た。【0037】<3.キメラGタンパク質の発現プラスミド作成>改変型カリウムイオンチャネルKir3.1(F137S)とβ1アドレナリン受容体(rβ1R)の両方に高親和性を持つように変異を導入したキメラGタンパク質を発現させるプラスミドを作成した。【0038】マウス脾臓由来のRNAを逆転写して得られたcDNAを、PCR法を用いて2断片に分けて増幅した。クローニングしてきたGiタンパク質のcDNAに変異を導入した。Giタンパク質のクローニングの際のプライマーは、それぞれmGi(+)111(配列番号11)とmGi(-)994(配列番号12)、mGi(+)685(配列番号13)とmGi(-)1445(配列番号14)を用いた。得られた2つの断片は、クローニングベクターにサブクローニングした。得られた2つのベクターを鋳型とし、さらにPCR反応により変異導入を行った。プライマーは、それぞれEco-Kz-mGi(+)1(配列番号15)とmGi(-)cDNA640(配列番号17)、mGi(+)cDNA628(配列番号16)とmGi-Gs13(-)term(配列番号18)を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。それらクローニングベクターを、それぞれEcoRIとBamHI、BamHIとEcoRIで処理し、あらかじめEcoRIで処理した発現ベクターにライゲーションし、発現プラスミドplasmid(Gi/s13)を得た。【0040】なお、表1に実験1で使用したプライマーの塩基配列を示す。【0042】<4.HEK293細胞への発現プラスミド導入>10%FBS(インビトロジェン)、30units/mLペニシリン(明治製菓)、30mg/mL硫酸スプレプトマイシン(明治製菓)を含むDMEM培地(インビトロジェン)中で培養したHEK293細胞に、上述した改変型カリウムチャネル発現プラスミドplasmid(mKir3.1(F137S))、β1アドレナリン受容体発現プラスミドplasmid(rβ1R)、およびキメラGタンパク質発現プラスミドplasmid(Gi/s13)を同時に導入した。3種類の発現プラスミド導入の24〜48時間後に、後述するカリウムイオンの株化細胞内への流入によって発生する電流変化を測定した。【0043】[比較例]実施例で作成した3種類の膜タンパク質を共発現させた細胞表面の脂質二重膜との比較のため、非特許文献1に示されている方法に従って、改変型カリウムイオンチャネルの代わりに天然カリウムイオンチャネルをHEK293細胞へ導入した。天然カリウムチャネルは2種類のタンパク質のヘテロマーであるため、マウス内向き整流性カリウムチャネルKir3.1とKir3.2Aを用いて発現させた。それ以外は実施例と同様にして、β1アドレナリン受容体(rβ1R)、およびキメラGタンパク質とを共発現させた。【0044】<天然カリウムイオンチャネルKir3.1(mKir3.1)またはKir3.2A(mKir3.2A)発現プラスミドの作製>非特許文献1に示されている内向き整流性カリウムチャネルは、2種類のカリウムチャネルKir3.1とKir3.2Aより構成されている。マウス内向き整流性カリウムチャネルKir3.1(mKir3.1)を作成する発現プラスミドplasmid(mKir3.1)は、実施例と同様の方法で作製した。マウス脳由来のRNAを逆転写して得られたcDNAを、PCR法を用いて2断片に分けて増幅した。プライマーは、それぞれmKir3.2A-F417R(配列番号25)とmKir3.2A-R1317R(配列番号26)、mKir3.2A-F1079R(配列番号27)とmKir3.2A-R1843R(配列番号28)を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。得られた2つのベクターを鋳型にして、さらにPCR反応を行った。プライマーは、それぞれmKir3.2A-5’_XhoI(配列番号29)とmKir3.2A-R698_EcoRI(配列番号30)、mKir3.2A-F687_EcoRI(配列番号31)とmKir3.2A-3’_NotI(配列番号32)を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。それらクローニングベクターを、それぞれXhoIとEcoRI、EcoRIとNotIで処理し、あらかじめNheIとNotIで処理した発現ベクターにライゲーションし、発現プラスミドplasmid(mKir3.2A)を得た。【0047】なお、表2に比較例で使用したプライマーの配列を示す。電流の測定には、EPC9パッチクランプ増幅器およびパルスソフトウエア(ヘカ社製)を用いた。電流のパッチピペット電極の内部抵抗は2〜4MΩで、次の細胞内溶液を満たした。7.2)よりなる溶液である。【0050】コントロールとなるカリウムイオンチャンネル「閉状態」の場合に流れるイオン電流は、上述した細胞内溶液を満たしたパッチ電極を用い、膜電位を-100mVに固定した状態で測定した。あるGTPγS(シグマ)を500μMの濃度で上述した細胞内溶液に添加し、GTPγS含有細胞内溶液を満たしたパッチ電極を用い、膜電位を-100mVに固定した状態で測定した。図5は、実施例および比較例の3種類の膜タンパク質を共発現させたHEK293細胞について、発現させたカリウムチャネルに流れる電流を比較したグラフである。白い棒グラフは、カリウムイオンチャンネルの「開状態(コントロール)」、黒い棒グラフはカリウムイオンチャンネルの「閉状態(GTPγSを含む場合)」における電流を示している。開状態でのイオン電流値は、比較例の天然型カリウムイオンチャネルでは2.30±0.43nAであるのに対し、実施例の改変型カリウムイオンチャネルでは5.52±1.00nAであった。以上のことから、改変型イオンチャネルを用いれば従来型イオンチャネルを用いた場合よりも大きな電流を検出することが可能であることが確認された。【0052】(アドレナリン作用薬によるカリウムイオン電流の変化)次に、膜電位を-50mVに固定した状態で、カリウムイオンチャンネルに流れる電流をモニターしながら、アドレナリン作用薬の1つであるイソプロテレノール(シグマ)のカリウムイオン電流に対する影響を調べた。イソプロテレノールが含まれない細胞外溶液を還流している状態で測定した電流をベースラインとし、その後30nMイソプロテレノールを含む細胞外溶液に置換した時の電流変化を測定した。図6は、実施例および比較例の3種類の膜タンパク質を共発現させたHEK293細胞について、イソプロテレノールによるイオン電流の変化を示すグラフである。比較例の場合、イソプロテレノールが含まれていない細胞外溶液を還流した場合では0.63±0.42nA(平均±標準誤差)の電流が流れているのに対し、イソプロテレノール30nMを含んだ細胞外溶液に置換すると0.90±0.57nAへの増加が見られた。実施例の場合では、イソプロテレノールによって1.40±0.69nAから3.38±0.79nAへと大きくイオン電流が増加する現象が見られた。イソプロテレノールの有無での比率をオン・オフ比として計算すると、比較例では1.4倍の変化であるに対し、実施例では2.4倍となった。以上より、実施例で作製された細胞(脂質二重膜)は、比較例で作製された細胞(脂質二重膜)と比較して、同じ濃度の化学物質に対して大きな電流値の変化を検出することが可能であり、また、オン・オフ比も増大することから、検出感度も顕著に高いことが示された。本発明によれば、標的となる化学物質を高精度、かつ、高感度で検出しうる化学物質センサを実現することが可能である。化学物質受容体と、Gタンパク質連動型カリウムイオンチャネルKir3.1の137番目のフェニルアラニンをセリンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、Gタンパク質と、を株化細胞の脂質二重膜に共発現させ、カリウムイオンの株化細胞内への流入によって発生する電流変化を測定することにより、前記化学物質を検知可能とする方法。前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラGタンパク質である、請求項3に記載の化学物質を検知可能とする方法。前記改変型カリウムイオンチャネルは、放出されたGタンパク質のサブユニットと結合したときに、細胞外のカリウムイオンを細胞内へと輸送する、細胞。前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラGタンパク質である、請求項5に記載の細胞。Gタンパク質のサブユニットを放出させ、前記放出されたGタンパク質のサブユニットが前記改変型カリウムイオンチャネルに結合することによって前記脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する工程、を有する、方法。前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラGタンパク質である、請求項7に記載の方法。前記カリウムイオンの濃度の変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程を有する、方法。前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラGタンパク質である、請求項9に記載の方法。ekouhou.net。