Achievements植物の成長は遺伝的プログラムと外部環境により制御されている。転写因子複合体は内外の様々な刺激に応じて構成要素や修飾状態をダイナミックに変動させながら、遺伝子発現のパターンを決定する。本研究では光などの外部情報とジベレリン(GA)などの内部情報が、いかにして転写複合体の再構成・修飾により遺伝子発現を制御するのかを解明する。GAと環境刺激の信号伝達のクロストークの分子的実体を、転写因子複合体の再構成・修飾と捉え、転写サイクルにおける複合体の機能と動態の解析を目的とする。GA信号伝達の負の制御因子として同定されたDELLAは、複数の信号伝達経路のノードである。DELLAの生化学的な機能は不明であった。我々はDELLAが転写因子のコアクティベーターとして機能することを明らかにし、さらにDELLAの結合因子として新たに転写因子GAF1を同定した。これまでGAの信号伝達は全てDELLAの分解を介すると考えられていた。これを検証するためにシロイヌナズナのDELLA遺伝子をすべて欠損する五重変異体を用いて、次世代シーケンサーによるmRNAの3’タグプロファイリングを行った。SPYはGA信号伝達の抑制因子であり、DELLAの機能を促進することが示唆されていた。SPYはGlcNAc化酵素であると予想されたが、その証明は無く標的タンパク質も不明であった。翻訳系によるSPYの発現・精製を試みた。詳細な条件検討の結果、これまで困難であったSPYの発現に成功した。planned.Reasonこれまで大腸菌において活性のあるSPYを発現させることは困難であった。翻訳系を導入することによりSPYの発現・精製に成功した。転写因子RSGをリン酸化し14-3-3との結合を促進するカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素NtCDPK1は基質であるRSGだけでなく14-3-3とも直接結合することが示された。14-3-3とNtCDPK1の結合の維持にはリン酸化が必要でなく、14-3-3とリン酸化RSGとの結合に比べ弱い。この結果はNtCDPK1がRSGキナーゼとしての機能に加え、結合していた14-3-3をリン酸化RSGへ受け渡すシャペロンとしての役割をもっていることを示唆している。14-3-3とNtCDPK1の結合様式は、その成立にはNtCDPK1のリン酸化が必要であるが維持にはリン酸化を必要としないというこれまでに知られていないものであり興味深い。全体としての達成度はほぼ順調と考えられる。ActivityGAによる遺伝子発現制御が全てDELLAを介するのか、それとも未知の情報伝達経路が存在するのかを厳密に調べるためDELLA欠損五重変異体をGA合成阻害剤処理した個体とさらにGA処理した個体の遺伝子発現のパターンを、次世代シークエンサーを用いたmRNAの3’タグプロファイリングにより調べる。vitro翻訳系を用いてSPYを発現・精製に成功した。させ、SPYによるGlcNAc修飾活性の検出に成功した。次年度はこの実験系を用いてSPYのGlcNAc修飾活性の検出系を確立し、その標的タンパク質を同定する。RSGをリン酸化しRSGと14-3-3との結合を促進するキナーゼNtCDPK1はCa2+により活性化されると自己リン酸化される。NtCDPK1はRSGをリン酸化するだけでなく自身が結合していた14-3-3をRSGに受け渡す可能性が示された。次年度はNtCDPK1の自己リン酸化部位を決定し、非リン酸化変異型NtCDPK1を作製して、NtCDPK1の自己リン酸化が14-3-3との結合に果たす役割・生理的意義を調べる。