NJ)で回収した表面プラズモン共鳴(SPR)データから得られた。Inc.)上で固定化した。製造業者によって提供されるアミンカップリングキットを使用して、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中の25μg/ml(プロテインA)又は50μg/ml(Fab)の濃度で固定化を行った。3000RUを固定化した。全ての例において、流量40μl/分で、150mMのNaCl、3mMのEDTA及び0.005%のP20を含む10mMのHEPES(pH7.4)中、25°Cで分析を行い、表面を洗浄緩衝液で洗浄することにより再生させた。リフォールディングタンパク質の結合活性を測定するために、10μg/mlの濃度、85°Cで20分間インキュベートすることによって、VH又はVHHを変性させた。それから、リフォールディングするためにタンパク質サンプルを30分間室温まで冷却し、その後室温で5分間14000rpmでマイクロフュージで遠心分離して、任意のタンパク質沈殿物を除去した。上清を回収し、上記のようにSPRによって結合活性について分析した。Inc.)を同時に使用して、フォールディングしたタンパク質及びリフォールディングタンパク質両方に関するデータを1:1の相互作用モデルに適合させ、その後KDを求めた。【0056】(式中、KDnは天然タンパク質のKDであり、KDrefはリフォールディングタンパク質のKDである)から求めた。Canada)3μlを100mMのTris−HCl緩衝液(pH7.8)中のVH60μgに加えた。Canada)5μlを加えることにより停止させた。Canada)を使用して残りを脱塩し、50:50のメタノール:水の1%酢酸で溶離して、MALDI質量分析によってVHの質量を求めた。37°Cでのタンパク質安定性研究37°Cで17日間PBS緩衝液において0.32〜3.2mg/mlの濃度での単一ドメイン抗体(sdAb)をインキュベートした。インキュベートの後、視覚的に凝集体の形成が全く見られなくても、5分間最大速度でミクロフュージにおいてタンパク質サンプルを沈降させた。Healthcare)に適用させ、プロテインAに対するSPR分析における単量体のピークを回収した。プロテインA500RU又は基準Fabを固定化したこと、及び50μg/mlの濃度で固定化を行ったことを除いて、上記のようにSPR分析を行った。NMR実験NMR分析におけるVHサンプルを10mMのリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA及び0.02%のNaN3(pH7.0)中に溶解した。タンパク質濃度は40μM〜1.0mMであった。Avance−500NMRスペクトロメータにおいて298Kで行った。NMRスペクトルを16384個のデータ点で記録し、スペクトル幅はそれぞれ、500MHzで8992.81Hz及び800MHzで17605.63Hzであった。Avance−800NMRスペクトロメータにおいて得られた。1993)を使用して水抑制を達成した。XWINNMRソフトウェアパッケージを使用して分析した。1995)によって、全てのPFG−NMR拡散測定を行った。Xwinnmrソフトウェアパッケージを使用して分析した。全ての所与のPFG強度で均一に全てのNMRシグナルが弱まった場合に、メチル及びメチレンプロトン領域(2.3ppm〜−0.3ppm)におけるNMRスペクトルを統合することにより、NMRシグナル強度を得た。ヒトVLファージディスプレイライブラリ構築及びパンニングヒトVHに関して上記のように、cDNAをヒト脾臓mRNAから合成した。1998)を使用して、反応体積50μlでVL遺伝子を増幅させた。I制限部位をフランキングさせた。これらの縮重の程度に反映された比で共にフォワードプライマーがプールされた。プールされたVλフォワードプライマー及び11個の個々のVλバックプライマーを使用して、11個の別々の反応でVλ遺伝子をPCRした。同様に、プールされたVκフォワードプライマー及び6個の個々のVλバックプライマーを使用して、6個の別々の反応でVλ遺伝子を増幅させた。I制限エンドヌクレアーゼで消化した。ヒトVHに関して上記のように、ライブラリを構築した。Canada)に対するパンニング及び選択されたVLの生殖細胞系の配列帰属を行った。ゲルろ過クロマトグラフィを行った。VL遺伝子を増幅させた。