理学的特性を有する珍しい単量体のヒトVHを効率的に捕捉する鍵となるという事実を明確に示していた。(可溶性、高い発現及び/又は安定性(熱変性後の高いリフォールディング、化学変性剤に対する高い耐性、及びプロテアーゼ、特にトリプシン等の胃腸プロテアーゼに対する高い耐性等)を含む)が改良されたポリペプチド、特に抗体フラグメントを同定するハイスループットスクリーニング方法を提供することである。本発明の第2の目的は、単量体のヒトVH及びヒトVLを同定するハイスループットスクリーニング方法を提供することである。本発明の第3の目的は、単量体のヒトVH及びヒトVLを同定、単離及び特徴付けすることである。本発明の第4の目的は、抗体フラグメント、特に単量体のヒトVH及びヒトVLの多量体を構築及び特徴付けることである。本発明の第5の目的は、ポリペプチド、特に抗体フラグメント及び最も特定的には単量体のヒトVH及びヒトVLからディスプレイライブラリを構築することである。本発明の第6の目的は、ポリペプチド、特に抗体フラグメント及び最も特定的には生物物理的な特性が改良された単量体のヒトVH及びヒトVLを生成するDNAシャッフリング法を提供することである。)を有するヒトVH及びヒトVLを単離する方法が提供される。この方法は、様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得る工程、ライブラリファージによる細菌層の感染を可能にする工程、及び細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定する工程を包含する。それからファージを単離し、シークエンシングか、又はそうでなければポリペプチド配列を特定するこれらの工程を用いる。本発明は、上記の方法で同定されるポリペプチド、特に単量体のヒトVH及びヒトVLも提供し、これは免疫療法に及び/又は診断用薬剤もしくは検出用薬剤として有用であり得る。他の多量体を形成してもよく、これは免疫療法に及び/又は診断用薬剤もしくは検出用薬剤として有用であり得る。ヒト起源等の改良された生物物理学的特性のために選択するDNAシャッフリング等の方法によって操作することができる。上記の方法によって同定されたポリペプチド(ヒトVH及びヒトVLを含む)は、さらにディスプレイライブラリを生成するのにも使用することがあり、これを同様に使用して、上記の方法によってさらにポリペプチドを単離することができる。第1の態様において、本発明は、標的ポリペプチドを同定する方法であって、a)様々なポリペプチド配列を発現することができるファージディスプレイライブラリを得ること、b)ライブラリファージによって、細菌層の感染を可能にすること、c)細菌層上の平均よりも大きいプラークを形成するファージを同定することを含む、方法を提供する。第2の態様において、本発明は、配列番号8〜配列番号54から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。第3の態様において、本発明は、配列番号8〜配列番号22から成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸配列を含むVH抗体フラグメントを提供する。第4の態様において、本発明は、配列番号23〜配列番号54から成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸配列を含むVL抗体フラグメントを提供する。第5の態様において、本発明は、望ましい生物物理学的特性を有するポリペプチドを生成する方法であって、a)請求項41、42、44、45、47、48、59若しくは70に記載の抗体フラグメントをコードするか、又は請求項24、27、37若しくは39に記載のポリペプチド配列をコードし、且つ第1の望ましい特性を有する少なくとも1個の第1の核酸配列を提供する工程と、b)第2の望ましい特性を有する抗体フラグメントをコードする少なくとも1個の第2の核酸配列を提供する工程と、c)少なくとも1個の第1の核酸配列及び少なくとも1個の第2の核酸配列をランダムなフラグメントに切断する工程と、d)ランダムなフラグメントを再び集合化させる工程と、e)ランダムなフラグメントを発現する工程と、f)発現されたランダムなフラグメントを第1の望ましい特性及び前記第2の望ましい特性に関してスクリーニングする工程とを含む、方法を提供する。対する耐性、リフォールディング性、高発現性、及びDNAレベルでの易操作性があり、ライブラリ構築及び三次元構造決定に理想的であるポリペプチド、特に抗体フラグメントを同定することが望ましい。このような抗体フラグメントは、多種の免疫療法への適用、並びに診断用薬剤及び検出用薬剤としても有用である。ヒトの単量体のVH抗体及びVL抗体は上記の特性の多くを有しているとされるので、特に興味深い。上記の特性を有するポリペプチドは、様々なポリペプチド配列を発現することができるライブラリのハイスループットスクリーニングによって同定することができる。ファージディスプレイライブラリ(好ましくは、M13又はfd等の繊維状ファージ)は、ファージの影響を受けやすい細菌の領域(細菌層)をファージで感染させ、それからプラークとして知られるはっきりした無菌領域を探すことにより、どのファージが細菌を首尾よく溶解させるかを決定することによりスクリーニングすることができる。単量体のラマ化VH及びVLが、凝集傾向のある完全なヒトVHを示すファージよりも大きいプラークを細菌層上に形成する。したがって、ヒトVHレパートリから珍しく自然発生的な単量体のVH及びVLを同定する手段として、プラークサイズを使用することができる。おける機能性の維持、並びに血流中等のヒトの体内の機能性の維持を含むが、これらに限定されない)が含まれる)、及び様々な起源の高発現性のタンパク質を同定するのにも有用であり、これらのタンパク質としては、1.VH、VL、Fab、scFv及びより詳細にはヒト抗体であるIgG等の全抗体、2.非抗体スカフォールドの一本鎖T細胞受容体、T細胞受容体ドメイン、トランスフェリン、リポカリン、kunitzドメイン、アンキリン反復、及び細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA−4)に基づくタンパク質変異体(ヒトのものを含む)、3.ウイルス性及び細菌性のタンパク質ワクチン等のワクチン、4.治療用タンパク質(例えば、インスリン、成長ホルモン、エリスロポエチン)5.タンパク質性の診断用試薬及び生化学試薬(例えば、プロテインA、プロテインG)が挙げられる。【0027】ポリペプチドをこの方法で同定されれば、このポリペプチドを使用して、さらなるライブラリを構築することができる。VHの核酸配列を選択することによって、これを行うことができる。ランダムなコドンを有するオリゴヌクレオチドを作り、VH配列に組み込む。このようにして、それぞれの特殊なオリゴヌクレオチドをVH遺伝子に組み込み、修飾されたVH遺伝子によってわずかに変異のある配列のライブラリが構成される。一般的に、VHのCDR又はループをランダム化させるように、オリゴヌクレオチドを設計する。CDRをランダム化させることができる。それから、使用するライブラリの種類に応じて、VHライブラリを適切なベクターにクローニングさせ、核酸配列をポリペプチドとして発現させる。一般的にパンニング(panning)によって、ライブラリポリペプチドと結合する分子に関してライブラリをスクリーニングする。ライブラリはファージディスプレイライブラリ、又はリボソームディスプレイ及び酵母ディスプレイ等の他のディスプレイライブラリであり得る。他の多量体を形成し、免疫療法に使用することができる。このことにより、抗原分子におけるより良好な親和性及び幾つかの抗原におけるより緩やかな拡散速度がもたらされ得る。別の可能性のある手法は、ポリペプチドを様々な機能を有する種々の分子と結合又は融合させることである。トキシン、ペプチド、タンパク質、酵素、リポソーム、脂質、T細胞超抗原又はウイルスと結合することができる。ヒト起源又は高発現性等の改良された生物物理学的特性に関して選択することができる。vitro組み換え技法で、これを達成することができる。DNAシャッフリングは、抗体フラグメント等の第1のポリペプチド(ドナー)及び第2のポリペプチド(アクセプタ)の核酸配列をランダムなフラグメントに切断し、PCR様反応によりランダムなフラグメントを再び集合化させることを含む。それから、再集合化されたフラグメントをスクリーニングし、所望の特性に関して選択する。高い安定性のある1つ又は複数のVH(ドナー)を十分な安定性を欠いている1つ又は複数のVH(アクセプタ)と混合し、DNAシャッフリングにかけることができる。このことにより、ドナーVHから安定性残基を組み込んだアクセプタVHの突然変異型が発生する。本明細書に記載の方法によって、又はリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ及びファージディスプレイ等の他の発展的なタンパク質スクリーニングシステムによって、新たな安定性のある突然変異型を同定することができる。高発現性等の望ましい特質を形質転換することができる。【0031】ドナーVH及びアクセプタVHが望ましい特性を有する場合に、この技法を使用して両方の特性を有するVHを生成することができる。重要な治療用リガンド又は診断用リガンドと結合する不安定なドナーVHを安定性のあるアクセプタVHでシャッフルすることができる。新たに生成した安定性のあるVHもリガンドと結合する能力があることを確実にするために、スクリーニングシステムは、リガンド結合工程を伴い得る。高発現性等の望ましい特性を有するヒトVH及びヒトVLをドナーとして使用することができる。良好な安定性のある1つ又は複数のヒトVH(ドナー)を1つ又は複数の治療用の非ヒトVH(アクセプタ)と混合し、DNAシャッフリングにかけることができる。これにより、安定性があり、且つヒト化されたアクセプタVHの突然変異型が発生する。本明細書に記載の方法によって、又はリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ及びファージディスプレイ等の他の発展的なタンパク質スクリーニングシステムによって、新たに発生したヒト化され、且つ安定性がある変異型を同定することができる。さらなる実施例では、アクセプタVHは治療用VHH(ラクダ科の重鎖抗体の可変ドメイン)であり得る。【0033】さらに、この技法はVH及びVL以外のポリペプチドの望ましい特性を選択するのにも有用である。上記で示されるように、ドナーポリペプチド及びアクセプタポリペプチドは、両方ともヒトであり得るか、又はドナーがヒトであり、アセプタが非ヒトであり得る。安定性をVH及びVLに与える可能性のある手法は、アクセプタVH及びVL上の相補性決定領域(CDR)をグラフト化することによるものであり得る。CDRは、単一ドメイン抗体の可溶性及び安定性、及びそれに応じた本明細書中に記載の方法で単離したVH及びVL由来のCDR等のこれらの領域のグラフト化を伴うことが知られているので、可溶性及び/又は安定性をアクセプタVH及びVLに与えることができる。ヒトの単量体のVH及びVL異なる生殖細胞及び全配列を有する幾つかの単量体のヒトVHが、ファージプラークサイズに基づくこの選択方法によって、ナイーブヒトVHファージディスプレイライブラリから同定された(図1及び配列番号8〜配列番号22を参照のこと)。VHは、37°Cでのトリプシン処理、37°Cでの数週間のインキュベート、又は4°Cでの数ヶ月の保存後でも機能性及び単量体を維持し、熱リフォールディング効率が高く、大腸菌において良好な収率で生成され、プロテインA結合活性を有する。【0035】さらに、幾つかの単量体のヒトVLが同定された(図6及び配列番号23〜配列番号54を参照のこと)。VLも大腸菌において良好な収率で生成され、プロテインL結合活性を有する。【0036】また、スカフォールドとして上記のVHを利用する合成ライブラリからのVHによって、このような特性が明らかになる。したがって、このようなライブラリによって、生理学的温度での良好な有効性、長い保存期間、及び費用効率が高い生産を有する治療用VH又は診断用VHが得られ得る。高温リフォールディング効率の特徴によって、VH結合因子が一時的に高温に曝された後に、その活性を維持するように要求される場合に対するこれらのライブラリの生物工学的適用をさらに拡大させる。的特性により、体内適用に非常に適しているはずである。プロテインA結合特性は、診断試験におけるVH精製及びVH検出、免疫ブロット法及び免疫細胞化学を単純化し、ライブラリから非機能性のVHを取り除くことによって、ライブラリ性能を高めるために利用することができる。同様に、スカフォールドとしてVLを利用するライブラリによって、同様に望ましい特性を有する治療用のVLS又は診断用のVLSが得られる。VLがプロテインLと結合するので、このプロテインL結合特性を利用することにより、VL精製及びVL検出が単純化される。本発明のVH及びVLで構成されたディスプレイライブラリは、診断用薬剤及び検出用薬剤の有用な供給源でもあり得る。この研究における単量体のヒトVHが、DP−47を含む6個の異なる生殖細胞系配列から起因しているという見解によって、安定性のあるVHは生殖細胞系遺伝子の利用に関して限定されないことが実証される。事実、本発明者らがファミリーの単量体のVHを単離し、本明細書で記載するものとは異なる生殖細胞系起源は、プロテインA結合活性のあるVH3ファミリーのVHのサブセットに対する本発明者らの選択を制限させない可能性が非常に高い。VHにおいて複数の突然変異が発生すること、及びCDR3はsdAbの生物物理学的プロファイルの形成にも関与することが知られているという事実により、本発明のVHの観察された生物物理学な挙動に関与するアミノ酸突然変異(第1表)を特定することは不可能である。sdAb安定性及び可溶性に重要であることが知られている位置(例えば、HVHP423及びHVHP44BにおけるV37F)での突然変異又は同じ位置(例えば、9個のVHにおけるL5V/Q及びV5Q)で複数回起こる突然変異は、VHの生物物理学的特性を決定するのに役立つ。ライブラリ構築に関して、ライブラリ安定性を危うくすることなくCDRランダム化が行われるように、本発明のVHの単量体性は、CDR、特にCDR3には依存しないことが望ましい。これに関して、安定性に関してCDR3への依存性が小さいので、より小さいCDR3を有するVH(例えばHVHB82)が好ましいスカフォールドであり得る。全体の配列及びCDR3の長さに関する本発明のVH及びVLの多様性によって、より良好な性能のライブラリの構築が可能になる。合成VHライブラリが単一スカフォールドで構築されている。vivoでの「手法」とはかなり異なっている。本明細書中に報告されている配列に基づいて、多様な組のVH及びVLの可用性を利用し、複数のVH及びVLのスカフォールドに基づくライブラリを作ることができる。vivoでのレパートリのより良好な模倣であり、したがってより最適な複雑性を有する。sdAbにおける3個のCDRの中で、CDR3は一般的に最も有意にレパートリの多様性に寄与し、この理由から一般的にCDR3の長さを同時に変えることによって、VH及びVLのスカフォールドにおけるCDR3ランダム化が達成される。この有意性がライブラリの複雑性を改良するが、親スカフォールドCDR3の長さを壊すことによって、ライブラリの安定性をも危うくする可能性がある。CDR3の長さに関して本明細書中で開示されるVH及びVLの不均一性によって、良好な複雑性、良好な安定性及び良好な生物物理学的な特徴の両方を有するライブラリの形成を可能にする。このようなライブラリは、好ましくはサブライブラリから成り、それぞれのサブライブラリは、親CDR3の長さを壊すことなく、単一のVH、及びVLスカフォールド上のCDR3のランダム化(及び必要に応じてCDR1及び/又はCDR2のランダム化)によって作られる。治療標的に特異的なVHH、VH及びVLをヒト化することに関して、最適なVH及びVLフレームワークを選択するといった点でも、本発明のVH及びVLの多用途性は有益である。合成VHHライブラリから治療標的に対する親和性の高いラクダ科のVHHを得て、その後ヒト化(CDRグラフト化、再サーフェイシング(resurfacing)、脱免疫化)を行い、可能性のあるVHH免疫原性を除去することができる。それにより、治療用VHの生成に対するヒトVHライブラリの手法の代替方法を提供する。vitroの親和性突然変異を要求することが度々あり得る。合成VHライブラリから治療標的に対する非ヒトVHを得て、その後ヒト化(CDRグラフト化、再サーフェイシング、脱免疫化)を行い、非ヒトVH免疫原性を除去することができる。それにより、治療用VHの生成に対するヒトVHライブラリの手法の代替方法を提供する。合成VHHライブラリから治療標的に対する非ヒトVLを得て、その後ヒト化(CDRグラフト化、再サーフェイシング、脱免疫化)を行い、VHH免疫原性を除去することができる。それにより、治療用VLの生成に対するヒトVLライブラリの手法の代替方法を提供する。一般的に確実にライブラリ集合から不安定又は安定性の低い変異型よりも安定性のある変異型を優先的に選択するために、安定性圧力が必要とされる。ファージディスプレイを含む発展的な選択の手法の例としては、従来のファージディスプレイ、選択的感染ファージ及びタンパク質分解の手法が挙げられる。最初の2個の手法において、安定性のあるタンパク質が不安定なものよりもそのリガンドに対してより良好な結合特性を有するという仮定に基づき、親和性の選択を使用して、ライブラリから安定性のある種を選択する。合工程が要求されることによって、既知のリガンドを有するタンパク質に対するこれらの手法の適用性も制限される。第3のタンパク質分解の手法は、不安定なタンパク質がプロテアーゼに対して耐性がないのに対して、安定性のあるタンパク質は一般的に小さく、したがってプロテアーゼに対して耐性があるという事実に基づいている。ファージディスプレイフォーマットは、表示されたタンパク質のプロテアーゼ安定性が、ファージ感染性に変換されるように操作される。このように、変異型のファージディスプレイライブラリをプロテアーゼで処理する場合、安定性のあるタンパク質を表示するファージのみがこれらの感染性を維持し、その後、大腸菌宿主を感染させることにより選択することができる。この手法はリガンド結合と独立しているので、一般的に有用である。【0044】これに対して、本発明の発展的な手法において、優れた生物物理学的特性を有するタンパク質は肉眼で簡単に判別される。この手法は、リガンド結合工程、タンパク質分解工程又は脱安定化工程を要求せず、したがって報告された選択的手法において直面する可能性のある複雑性が回避される。結合工程に対する要求がないことは、この手法が一般的に有用であることも意味する。オプションとして、結合工程は選択されたタンパク質が機能的であることを確実にすることが含まれてもよい。本発明の手法の(プラーク視覚化のための)プレート培養に対する依存性によって、操作することができ、小さいライブラリに対する適用を制限し得るプレートの数に関して、可能性のある運搬上の制限が導入される。それにもかかわらず、ライブラリを最初に取り扱いが可能な大きさに縮小する場合、現在の手法の有用性は大きなライブラリにまで拡大することが可能である。本明細書中において、この手法を使用して、非常に不安定なVH及びVLのバックグラウンドにおいて良好な生物物理学的特性を有するVH及びVLを選択した。適度に良好な安定性を有するタンパク質で集合化された突然変異型のライブラリから「最良の」種を選択することはより困難であり得る。criteria)に基づいて、主要な変異型を同定することができる。本発明の選択手法は、プロテインL、プロテインA又は任意のリガンドを伴う結合工程の選択システムにおける任意選択の包含を有するscFv及びFab等の安定性があり、且つ十分フォールディングした抗体フラグメント、並びに安定性のある非抗体スカフォールド及びこれらの突然変異型の同定にまで拡大することができる。ファージプラークサイズとVH発現収率との間に見られる相関関係は、本発明の手法を利用しなければ変異型のファージディスプレイライブラリから不完全であるか、又は不十分な発現を有するタンパク質の高発現性がある変形を得るために本発明の手法を利用することができることを意味する。ブースト化タンパク質の発現がタンパク質の生産コストを有意に埋め合わせる治療用タンパク質又は高価で不完全な発現性のタンパク質試薬の場合、この適用は特に魅力的である。五量体の結合分析VL及びVHの両方が五量体化の影響を受けやすく、五量体化を使用して、親和性の低いVL又はVHの単量体を親和性の高いVL又はVHの五量体に迅速に変換することができる。このような五量体は貴重な診断用薬剤及び検出用薬剤である。このような用途において、VL又はVHの五量体のその標的との結合は、酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性のホスファターゼ)等のレポーター分子又は五量体と結合する蛍光分子で検出することができる。代替的に、五量体の結合は、レポーター分子と結合する二次分子で検出することができる。二次分子は、五量体自体又は6Hisタグ若しくはc−Mycタグ等のタグに特異的であり得る。一般的な二次分子はイムノグロブリンである。【0046】プロテインAを有するVHとプロテインLを有するVLとの間の相互作用は、これらの標的抗原を有するVHとVLとの間の相互作用とは基本的に異なっている。VH又はVLの抗原結合は、抗体ドメインの結合部位を形成する3個の抗原結合ループを伴う。プロテインA結合活性を有するVH及びプロテインL結合活性を有するVLのプロテインA結合は、抗体結合部位とは全体的に異なる抗体ドメイン上に結合部位及び残基を伴う。このように、プロテインA結合活性を有するVHは、同時にプロテインA及びその標的抗原と結合することができ、プロテインL結合活性を有するVLは、同時にプロテインL及びその標的抗原と結合することができる。本発明のVHとVLはそれぞれ、プロテインA及びプロテインLに対する親和性を有するので、上記の検出用途及び診断用途のための二次分子として、プロテインA及びプロテインLを使用することができる。ヒトVH及びヒトVLの五量体は治療のためにも使用することができる。五量体による病原体検出VHのプロテインA結合活性及びVLのプロテインL結合活性を使用して、表面上にプロテインA及び/又はプロテインLを有する細菌を検出することができる。プロテインAは、病原菌である黄色ブドウ球菌の表面上に存在する。このように、本明細書に記載のもの等のプロテインA結合活性を有するVHを使用して、黄色ブドウ球菌を検出することができる。合活性を有するVL単量体及びVL五量体を使用することができる。2001)の発症の毒性因子に関連する。膣炎において、プロテインLは、架橋表面結合性のIgEによりその効果を発揮すると考えられる。プロテインL結合活性を有するVL単量体及び/又はVL五量体がプロテインLのIgE架橋作用を阻害する可能性があるので、これらは治療剤として潜在性がある。2004)の発症の毒性因子に関連する。その毒性は、抗体と結合することを含む宿主成分と相互作用する能力に起因している。プロテインA結合活性を有するVH単量体及び/又はVH五量体が宿主成分を有するプロテインAの相互作用を阻害する可能性があるので、これらは治療剤として潜在性がある。完全なヒトVHライブラリ及びラマ化したヒトVHライブラリの構築の間に、単量体のラマ化したVHを表示するファージが、凝集傾向のある完全なヒトVHを表示するファージよりも細菌層上でより大きいプラークを形成したことを確認した。このように、ヒトVHレパートリから珍しく自然発生的な単量体のVHを同定する手段として、プラークサイズを使用した(図1)。この目的で、サイズが6×108であるヒトVHを示すファージライブラリを構築し、寒天プレート上でプラークとして増殖させた。タイタープレート上で、ライブラリは本質的に、幾つかの大きいプラークが散在する小さいプラークから成る。20個のクローンにおけるPCRによって、小さいプラークがVH表示ファージに対応し、一方で大きいプラークは野性型のファージ(すなわち、VH配列挿入を欠くファージ)を表すことが示された。VH表示ファージは、大きいプラーク形態では見出されなかった。このことは、ヒトのレパートリ及び大きいサイズのライブラリにおける単量体のVHの不足により予想外のことではなかった。単量体のVHの同定を容易にするために、VH3ファミリー由来のヒトVHのサブセットと結合するプロテインAに対してライブラリをパンニングすることにより、ライブラリを取り扱いが可能な大きさまで縮小し、プラークサイズ形態が大きくなるのを阻害する野性型のファージを取り除くことを決めた。数回のパンニングの後、ライブラリはファージを生成する大きいプラークに関して富化され、110個を超えるこのようなプラークのPCR及びシークエンシングにより、全てがVHオープンリーディングフレームを完成させたことを示した。分析のために選択された大きいプラークのサイズは図1で示す。シークエンシングによって、VH3ファミリーに属する15個の異なるVHが示され、DP−38、DP−47、V3−49、V3−53、YAC−5又は8−1Bの生殖細胞系Vセグメントを利用した(第1表、図2)。DP−38及びDP−47の生殖細胞系配列は、これまではプロテインA結合に関係していた。それらのプロテインA結合活性と一致して、全てのVHは、57位でThr残基を有していた(図2)。頻繁に利用された生殖細胞系Vセグメントは、VHの50%を越えて発生するDP−47であったが、最も高頻度なクローン(すなわち、HVHP428、相対頻度46%)はV3−49生殖細胞系Vセグメントを利用した。DP−47生殖細胞系配列を有するHVHP429は相対頻度が21%である2番目に豊富なVHであった(図2)。CDR3の長さは、HVHB82における4個のアミノ酸からHVHP430における16個のアミノ酸の範囲であり、HVHP430はCDR3において一対のCys残基を有していた。親の生殖細胞系Vセグメント(残基1〜94)及びFR4(残基103〜113)配列に対するアミノ酸突然変異は全てのVHで見られ、HVHP44(L5V及びQ105R)及びHVHB82(E1Q及びL5Q)に対する2個の突然変異からHVHP426に対する16個の突然変異までの範囲であった(第1表)。変異はVセグメントに集中し、105位及び108位の2個の突然変異のみが15個のFR4全てで検出された。HVHP44及びHVHB82は、その両方がGlnの代わりに105位で正に荷電したアミノ酸を有するという点で他のVHとは異なっていた(第1表、図2)。HVHP44において正に荷電したアミノ酸が突然変異によって得られたが、HVHB82における正に荷電したアミノ酸は生殖細胞系でコードされていた。HVHP423及びHVHP44Bを除いて、残りのVHは鍵となる可溶性位置で生殖細胞系残基を有していた:37V/44G/45L/47W又は37F/44G/45L/47W(HVHP428)、HVHP423及びHVHP44BはV37F突然変異を有していた。VH可溶性に重要であることが示されるか、又は仮定される他の位置での突然変異には、7個のE6Q、3個のS35T/H、1個のR83G及び1個のK83R、1個のA84P及び1個のT84A及び1個のM108Lが包含されていた。11個のE1Q、8個のL5V/Q及び1個のV5Q突然変異を包含した高頻度の突然変異も1位及び5位で観察された。クロマトグラフィ(IMAC)によって、ペリプラズム抽出物から均一に精製した。発現収率は、振盪フラスコ内で細菌培養液1L当たりで精製タンパク質1.8〜62.1mgの範囲であり、VHのほとんどは数mgの収率があった(第2表)。HVHP423及びHVHP430の例において、「明らかに」同じ発現条件下での別の試験によって、62.1及び23.7mgに対してそれぞれ、2.4及び6.4mgの収率が得られた。このことは、本明細書中に記載の多くのVHに対して、大した努力をせずに最適な発現条件を達成でき、それにより第2表で報告された値より有意に高い発現収率がもたらされることを意味している。予想通り、全てのVHは表面プラズモン共鳴(SPR)分析(KDは0.2〜3μMである)においてプロテインAと結合していて、範囲及び規模はプロテインA結合活性を有するラマVHH変異型についてこれまでに報告されていた範囲及び規模に匹敵していた。VHはFab基準面と結合しなかった。【0051】ゲルろ過クロマトグラフィ及びNMRによるオリゴマー化状態に関して、ヒトVHの凝集傾向を評価した(第2表)。全てのVHをSuperdex75ゲルろ過クロマトグラフィにかけた。ラマVHH(すなわち、H11C7)と同様に、全てのVHにおいて、単量体で期待される溶離量で対称な単一のピークが与えられ、凝集体は実質的に全く存在しなかった(図3AのHVHP428における例を参照のこと)。これに対して、一般的なヒトVH(すなわち、BT32/A6)はかなりの量の凝集体を形成した。3個のVHに関しては、VH二量体で期待される移動度を有する微小ピークも観察された。value)が与えられた。二量体のピークは、ラマVHH(H11C7)の場合にも観察された。高濃度のVHのフォールディング状態及びオリゴマー化状態をさらにNMR分析で研究した。表IIに示すように、全てのVHタンパク質の研究によって、比較的可溶性であると考えられ、十分にフォールディングされた三次元構造が推測された。VHフラグメントの一次元NMRスペクトル(図3B)によって、VHドメインの構造フォールディング特徴が示された。HVHP414フラグメント及びHVHP414の2個のイソ型(c−Myc配列を有する及び有さないVH14及びVH14−cMyc−)に対するPFG−NMR拡散実験の使用によっても、タンパク質の凝集状態を評価した。N132E突然変異を有し、且つさらにN末端にメチオニン残基を有するHVHP414の改変バージョンである。簡単に述べると、PFG−NMRデータ(示されず)によって、全てのタンパク質サンプルが、NMR実験に使用した比較的高いタンパク質濃度であっても予想される単量体の分子量を有することが示された。一貫して37°Cでのトリプシンに対する耐性に関して、VHの安定性をさらに研究し、その後37°Cで長期的にインキュベートを行った。トリプシンは、C末端のArg又はLys残基でポリペプチドのアミド骨格を切断する。ヒトVHにおいて9〜13個のArg及びLys残基が存在する(図2)。トリプシンによる消化の影響を受けやすいC末端のc−MycタグにおいてさらなるLys残基も存在する。図4aは、トリプシン消化の間のHVHP414のSDS−PAGE分析である。1時間以内に、元のバンドは、c−Myc−His5タグを有しないVHで期待される移動度があった単一の生成物に完全に変換された。トリプシンによる1時間のインキュベート後に12個の他のVHにおいて、同じ結果が得られた。Lysを有するVHに対応していたことが確認された。HVHM41において、消化時の残りよりも有意に短いフラグメントが与えられ、この場合質量分析実験によって、CDR3におけるArg99に対する切断部位がマッピングされた(データ図示せず)。【0053】0.32mg/ml(HVHP428)〜3.2mg/ml(HVHP420)の濃度に及ぶ11個のVHを37°Cで17日間インキュベートした。その後、オリゴマー化状態及びプロテインA結合に関して、これらの安定性を決定した。ゲルろ過クロマトグラフィによって示されるように、37°CでのVHの処理は凝集体形成を全く誘導しなかった:全てのVHは、未処理のVHのものと実質的に同一であったクロマトグラムプロファイルを与え、本質的に単量体として存在していた(HVHP420についての例、図4cを参照のこと)。VHが37°Cでの処理後の自然のフォールディングを維持したことを確実するために、2個のVH(すなわち、HVHP414(1.2mg/ml)及びHVHP420(3.2mg/ml))をランダムに選択し、SPRによってプロテインAと結合するこれらのKDを求め(HVHP420に関して示されるデータ、図4cの挿入図)、未処理のVHに対して得られたKDと比較した(第2表)。熱処理したVHに関して算出したKDは1.4μMであり、HVHP414及びHVHP420に関して算出したKDはそれぞれ1.0μMであった。fold)に影響を与えなかったことを示している。VHが37°Cのインキュベート期間で余り小さくなく、且つ非天然であり、ゲルろ過実験及びSPR実験の間室温まで戻した時にこれらの天然のフォールディングを再開する可能性は、十分にフォールディングした天然のタンパク質に一般的に関連する特性であるVHが37°Cでトリプシンに対して耐性があった(上記を参照のこと)という事実を鑑みて疑わしい。VH分画が熱処理によって不活性化される場合、このパラメータはフォールディングした、すなわち活性のある抗体フラグメントの濃度に基づいているので、測定KDは高くなる。このように、KDnとKDrefとの比によって、VHREの測定値が与えられる。図5は、幾つかの選択されたVH濃度での天然状態(太線)及びリフォールディング状態(細線)における固定化されたプロテインAとのHVHP423の結合に対するセンサーグラムを比較している。示され得るように、リフォールディングしたVHのプロテインAとの結合は全ての例でより小さく、これにより非フォールディングは完全に可逆ではないことが示される。14個のVHそれぞれにおいて、天然状態及びリフォールディング状態におけるプロテインAの結合を幾つかの濃度で測定し、KD及びその後のREを求めた(第2表、KDref値は示されていない)。2個の抗イディオタイプのラマVHH(H11F9及びH11B2)のKD及びREも求め、これらは参照として使用された。4個のVHは、H11F9及びH11B2のそれぞれの、95%及び100%のREと同程度の92%〜95%の範囲のREであった。別の5個のVHは、84%〜88%の範囲のREであり、3個は70%を超えていた。2個のVHだけが有意に低いREであった:HVHP413(52%)及びHVHP421(14%)。Canada)を使用して、ヒト脾臓mRNAからcDNAを合成した。1999)を使用した9個の別々の反応におけるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、CH配列をフランキングしたVH遺伝子を増幅した。1999)を使用して、VH遺伝子を構築した。