2012年5月3日にオンラインで公開。最初に公開されたこの記事のバージョンでは、「試薬のセットアップ」セクションで説明したNSTバッファーのNaCl濃度の単位が正しくありませんでした。正しい単位はmMです。この記事のHTMLおよびPDFバージョンでエラーが修正されました。マウス赤血球におけるゲノム不安定性のマーカーである小核の形成を定量化するための高感度で堅牢なハイスループットな方法について説明します。小核は、核から分離された染色体全体または染色体セグメントです。他の検出方法は、労働集約的な顕微鏡ベースの技術に依存しています。ここでは、フローサイトメトリーの経験豊富な研究技術者が実行するのに十分簡単な、小核スコアリングの2次元、96ウェルプレートベースのフローサイトメトリー法について説明します。このアッセイは、25μlの血液を使用した古典的な表現型検査では容易に特定できない低レベルのゲノム不安定性を検出します。000を超える血液サンプルをスクリーニングし、脊椎動物のゲノム維持に寄与する新規遺伝子、ならびに新規疾患モデルおよびゲノム不安定性障害のメカニズムを発見しました。統計的検出力の計算などの実験設計の考慮事項について説明し、トラブルシューティングのヒントを提供し、小核赤血球数の偽陽性増加と実験的変動に寄与する要因について説明します。結果として生じる可能性のあるクロマチンの核外セグメントです。基質活性スクリーニング(SAS)は、新規基質の迅速な開発と、CysおよびSerプロテアーゼの非ペプチド阻害剤への変換のためのフラグメントベースの方法です。この方法は3つのステップで構成されます。アシルアミノクマリンのライブラリーをスクリーニングし、単純な蛍光ベースのアッセイを使用してプロテアーゼ基質を特定します。アシルアミノクマリン基質は、迅速なアナログ合成および評価により最適化されます。(iii)アミノクマリンを既知のメカニズムに基づいたファーマコフォアで直接置き換えることにより、最適化された基質が阻害剤に変換されます。アシルアミノクマリン基質のライブラリーの固相合成のための一般的な手順と、弱い結合基質を識別するためのスクリーニング手順を説明しています。呼ばれる最初の基質ベースのフラグメント同定法を開発しました。この方法は、フラグメントベースのスクリーニングにおける2つの重要な課題に対処します。このプロトコルは、ウシ副腎の副腎髄質からの酵素消化によって得られた個々のクロム親和性細胞の一次培養について説明しています。研究するための有用なモデルシステムを提供してきました。プロトコルは、細胞の分離(4〜6時間)、生細胞数の測定(約30分)、および培養中の成長(3〜7日)の3段階に分けることができます。代替手順は、PC12などの連続クロム親和性(褐色細胞腫)細胞株で研究を行うことですが、そのような形質転換細胞は通常、初代細胞ほど高度に分化しません。000万個の細胞が得られ、その後の3〜7日間のいくつかの実験に適しています。エキソサイトーシス放出、分泌または転写に向けた刺激結合(シグナル伝達)、または超微細構造を含む形態が含まれます。副腎採取から機能実験までの合計時間は、通常4〜8日です。クロマフィン細胞は、一般的な神経内分泌細胞およびノルアドレナリン作動性ニューロンのモデルとして広く使用されています。実際、分泌装置の構成要素の構造と機能は、クロム親和性細胞とニューロンで非常に類似しているようです。2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロン(PQS)や2-ヘプチル-4-キノロン(HHQ)などの2-アルキル-4-キノロン(AHQ)は、クォーラムセンシングシグナル分子です。AHQバイオセンサー株を採用するAHQ検出、暫定的な同定および定量化の方法について説明します。このプロトコルでは、薄層クロマトグラフィー(TLC)とマイクロタイタープレートアッセイの両方について説明します。これらのアッセイでは、生物発光または緑色のピオシアニンを検出終点として使用します。細菌細胞の有機溶媒抽出物または無細胞培養上清をTLCプレートでクロマトグラフィー処理し、乾燥させてAHQバイオセンサーで覆います。AHQは、発光スポットと緑色のスポットの両方として表示されます。マイクロタイターアッセイでは、使用済みの細菌培養上清または抽出物をAHQバイオセンサーを含む増殖培地に添加します。光出力は、サンプルのAHQ含有量に比例します。記載されているアッセイは、完了するのに約2日かかり、実行が簡単で、高度な機器を必要とせず、多数の細菌サンプルのスクリーニングに非常に適しています。PQSおよびHHQを除いて、決定的なAHQ同定には追加のMSおよびNMR分析が必要になります。ゲノム組織を探索できる先駆的な方法論です。このスケールでのゲノムの折りたたみを理解することは、エンハンサーやインシュレーターなどの分散した調節要素が遺伝子調節に関与している哺乳類では特に重要です。3Cテクノロジーでは、細胞のホルムアルデヒド固定に続いて、選択されたDNAフラグメントのペアが細胞集団で架橋される頻度のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの分析が行われます。架橋頻度の正確な測定には、最高の定量化技術が必要です。PCR技術を3Cアッセイの分析に適合させ、ゲル電気泳動によって分離された臭化エチジウム染色PCR産物の強度の測定に依存する現在の半定量3C戦略よりも架橋周波数をより正確に決定する方法をもたらしました。ここでは、3C-qPCRと名付けたこのメソッドの詳細なプロトコルを提供します。予備的な制御と最適化が実行されると、手順全体(3Cアッセイと定量分析)を7〜9日で完了できます。哺乳類の遺伝子調節を理解するには、ゲノム構成に対する洞察が重要です。卵と精子のクロマチンから、それぞれ無細胞抽出物とDNAテンプレートを生成する方法を詳しく説明しています。ここで詳述するように、このシステムを走査電子顕微鏡(SEM)で使用して、真核生物の核膜(NE)と核膜孔複合体(NPC)の生合成の生化学的要件と構造経路を分析しました。このプロトコルは、卵を産むように誘導される女性のカエル、および精子クロマチンの調製のために殺される男性のカエルへのアクセスを必要とします。卵抽出物は1日で調製し、-80°Cで何ヶ月も保存できます。膜分離された精子クロマチンは、調製に約2〜3時間しかかからず、-80°Cでほぼ無期限に保存できます。構造的および機能的に適格な核の構築に必要な時間は、無細胞抽出物の品質に大きく依存するため、各抽出物の調製について決定する必要があります。単一細胞ゲノミクスは、環境微生物の遺伝的構造を調査するための強力なツールです。環境微生物の大部分は、不可能ではないにしても、現在のアプローチでは培養することが困難です。ここでは、FACSによる高スループットの単一細胞分離を介して、培養されていない環境微生物からゲノムを取得するための包括的なプロトコルを示します。rRNAベースの同定が行われます。説明されている手順は、標準的な分子生物学機器とFACSマシンで実行できます。4日間で12時間未満のベンチタイムを要し、個々の微生物細胞から最大1μgのゲノムDNAを生成します。これは、PCR増幅やショットガンシーケンスなどのダウンストリームアプリケーションに適しています。回収されたゲノムの完全性はさまざまで、平均で約50%です。見解を大きく歪めています。これは、従来の全ゲノム配列決定に必要なステップです。コラーゲン誘発関節炎(CIA)マウスモデルは、関節リウマチの最も一般的に研究されている自己免疫モデルです。自己免疫性関節炎は、フロイントの完全アジュバントとII型コラーゲン(CII)のエマルジョンによる免疫化により、このモデルで誘発されます。このプロトコルでは、CIIの取得、処理、準備に必要な手順、マウス系統の選択、適切な免疫技術、関節炎の発生率と重症度の評価について説明します。通常、関節炎の最初の兆候は、予防接種の21〜28日後にこのモデルに現れ、関節炎の手足の特定は難しくありません。記載されているプロトコルを使用して、研究者は、遺伝的に影響を受けやすいマウスのさまざまな系統でCIAの高い発生率を再現可能に誘発し、病気の病理を批判的に評価する方法を学ぶことができるはずです。試薬の調製と10匹のマウスの免疫化の合計時間は約1.5時間です。自己免疫性関節炎の動物モデルは、この疾患の病原メカニズムの研究および新しい治療法の試験のための貴重な研究ツールであることが証明されています。人間の脳の発達には、モデル生物での研究が困難であることが証明されている、複雑さの増加やニューロン出力の拡大など、いくつかのユニークな側面が見られます。アプローチは、研究の激しい分野です。ここでは、内因性の発達プログラムによく似た、いわゆる脳オルガノイドと呼ばれる3D脳組織を生成するために最近確立されたプロトコルについて説明します。網膜のアイデンティティを発達させることができます。この簡単なプロトコルは、発達研究だけでなく、さまざまな人間の脳疾患の研究にも適用できます。オルガノイドは長期培養で1年以上維持できるため、ニューロンの成熟や生存などの後のイベントをモデル化する可​​能性もあります。発生イベントをより正確に再現するため、オルガノイドプロトコルはこれらの技術の最前線に立っています。