ツール、特に、細胞ライセートなどの試料中の環状ヌクレオチド濃度を検出または決定するための方法を提供する。試料中のアデニリルシクラーゼなどの酵素の活性を決定するための方法及びそのためのキットを提供する。【解決手段】アデニリルシクラーゼなどお酵素を含み試料を、環状ヌクレオチドによって、活性化され得る不活性酵素及び活性化された酵素の活性を検出しかつ検出可能なシグナルを生成させることができる検出系と混合し、シグナルに基づいて該試料中に存在するアデニリルシクラーゼ活性などを決定する。本出願は、完全な形で本明細書に組み入れられる、2005年12月6日に申請された米国特許仮出願第60/742,922号に対する優先権を主張する。アポトーシス、および細胞死を含む多様な細胞機能の重要な細胞内メディエーターである。cAMPの産生は、アデノシン三リン酸(ATP)をcAMPおよび無機ピロリン酸(PPi)に変換する、アデニリルシクラーゼファミリーの酵素によって制御される。アデニリルシクラーゼは、膜結合Gタンパク質共役型受容体(GPCR)α-サブユニットとの直接的な相互作用によって活性化または抑制される。Gαsと呼ばれる、促進性GPCRのα-サブユニットが活性化された場合、アデニリルシクラーゼはATPをcAMPおよびPPiに変換する。逆に、Gαiと呼ばれる、抑制性GPCRのα-サブユニットが活性化された場合、アデニリルシクラーゼに対する抑制的効果が発揮され、ならびにATPのcAMPおよびPPiへの変換は実現しない。痛みの調整などの多種多様な生物学的過程において顕著な役割を果たす。新しい医学的に有用な化合物を開発する際のそれらの重要性は十分に理解され;そのようなものとして、それらは創薬研究において大いに標的にされている。【0003】cAMPの細胞内濃度は、cAMPのAMPへのおよび環状cGMPのGMPへの加水分解を触媒する、別の群の酵素である、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(PDE)によっても影響を受ける。ホスホジエステラーゼは、アデニリルシクラーゼおよびグアニル酸シクラーゼと協同して機能し、cAMPおよびcGMPによって仲介される細胞シグナリング機構の大きさおよび持続時間を調節する。したがって、ホスホジエステラーゼは、ホルモン、光、および神経伝達物質などの一次メッセンジャーに対する幅広い範囲の重要な生物学的応答を調節する。PDEは十分には特徴付けされておらず、および下等な真核生物でしか見出されていない。調節、視覚の光伝達、およびT細胞応答性の調整が含まれる。ロリプラム、テオフィリン、およびシルデナフィルを含む、数多くの臨床的に重要な化合物は、ホスホジエステラーゼを抑制することが公知である。したがって、ホスホジエステラーゼの抑制剤は、創薬における重要な標的でもある。二次メッセンジャーcAMPはcAMP依存性タンパク質キナーゼ(PKA)を活性化することが公知である。哺乳動物のホロPKAは、2つの調節サブユニットおよび2つの触媒サブユニットから構成される、四量体である。cAMPは調節サブユニットに結合し、それによってホロPKAをその触媒サブユニットおよび調節サブユニットに解離させる。ひとたび放出されると、遊離の触媒サブユニットは、多数の細胞タンパク質をリン酸化し、それによって筋収縮、細胞周期の活性化、転写活性の活性化、およびDNAプロセッシングなどの細胞機能の変化をもたらすことができる。【0005】GPCRの活性化または抑制およびその後のアデニリルシクラーゼの活性化または抑制は、細胞内cAMPの増加または減少を結果的にもたらすので、それらの活性に影響を及ぼす薬剤は創薬のための重要な標的である。Gタンパク質共役型受容体に関連する非常に多くの種類の生物学的過程のために、GPCRを標的する薬物は、世界中で販売されている医薬の多くを占めている。GPCRに影響する薬物の例として、アレルギー症状を緩和するのに用いられるClaritin(登録商標)およびAlavert(登録商標)(ロラタジン)、うつ病の緩和用のPaxil(登録商標)(パロキセチンHCl)、ならびに高血圧の緩和用のVasotec(登録商標)(マレイン酸エナラプリル)が含まれる。それらの重要性のために、主にcAMPレベルの増加または減少についてアッセイすることによって、これらの系構成要素に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果を決定するために、様々なGPCRアッセイが開発されている。これらの方法の限界には、複数の調合工程、長いインキュベーション時間、および高価な器具の必要性を必要とするノン-ホモジニアスアッセイが含まれる。【0006】したがって、必要とされるものは、現在利用可能な技術よりも少ない操作(例えば、2工程またはそれより少ない工程)を必要とするアッセイ、より短いインキュベーション時間(例えば、1時間未満)を提供するアッセイ、および高スループット系(HTS)能力を維持する一方で低価格の器具(例えば、発光に基づく器具)を利用するアッセイである。そのような合理化および費用有効性は、創薬のための標的のより速くかつより容易な評価を可能にする。発光に基づくアッセイは蛍光からの干渉を受ける傾向がなく;そのことは、次の潜在的な薬物を発見するための化学物質の大きなライブラリーをスクリーニングする際に有用である。本発明は、一般に細胞解析ツールに関し、特に試料中の環状ヌクレオチド濃度を検出または決定するための方法を提供する。【0008】cAMPおよびcGMPなどの、環状ヌクレオチドは、細胞タンパク質と相互作用する多様な物質に応答して増加または減少する。本明細書において記載された方法は、そのような変化の検出を提供する。一つの態様において、本明細書において記載された方法は、環状ヌクレオチドを検出しおよび細胞タンパク質に対する刺激の効果と関連付けることを可能にする。【図1】Gタンパク質共役型受容体シグナリング経路を示す。Gタンパク質共役型受容体サブユニットGαsはアデニリルシクラーゼを刺激し、およびcAMPはATPから生成される。PKAの基質をリン酸化する触媒サブユニットを放出する。逆に、抑制性GPCRサブユニットGαiはアデニリルシクラーゼを抑制し、それによってPKA基質のリン酸化が遮断される。ホスホジエステラーゼは、cAMPを、PKA調節サブユニットに結合しない、AMPに加水分解し、およびcGMPを、PKA調節サブユニットに結合しない、GMPに加水分解することによって、PKA基質リン酸化に影響を及ぼす。【図2】cAMP濃度が増加する時に対応する試料発光の減少があるということを示すグラフである。【図3】アデニリルシクラーゼの直接的刺激剤である、フォルスコリンの濃度が増加する時に試料発光の減少があるということを示すグラフである。【図4】(A)アゴニストがD293細胞で発現したドーパミン受容体Dl(Gαs−タンパク質共役型受容体)を誘導する時に発光の減少があるということを示すグラフ、および(B)アゴニストの存在下での、ドーパミン受容体Dl発現D293細胞へのアンタゴニストの添加が発光の増加をもたらすということを示すグラフである。発光の増加があるということを示す。【図6】環状ヌクレオチドがcAMPであるかcGMPであるかに関わらず、環状ヌクレオチド濃度が増加する時に発光は増加するが、親和性は異なるということを示す。【図7】(A)cGMPの存在下でホスホジエステラーゼV濃度が増加する時に発光の増加があるということを示すグラフ、および(B)cGMPの存在下でホスホジエステラーゼVの抑制剤、ザプリナストが増加する時に発光の減少があるということを示すグラフである。【図8】異なる哺乳動物細胞;A)ヒト胎児腎臓(HEK)293細胞およびB)チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞由来の形質膜調製物におけるcAMP産生を示す。【図9】1μgのDRD1-D293形質膜調製物を用いたフォルスコリンについてのEC50を示す。【図10】ドーパミンの添加による活性化後の形質膜調製物におけるDl受容体活性化を示す。cAMP産生を測定することによってドーパミン受容体の活性化を評価した。uMフォルスコリンの存在下でのD2ドーパミンD2受容体アンタゴニスト、ラクロプライドの例示的な滴定を示す。一つの態様において、本明細書において記載された方法は、酵素を活性化するのに環状ヌクレオチド結合に依存する酵素(例えば、cAMP依存性タンパク質キナーゼ、またはPKA)への環状ヌクレオチドの結合をモニターする。ひとたびcAMPがPKAに結合すると、PKAはアデノシン三リン酸(ATP)から好適なPKA基質(例えば、ケンプチド(Kemptide))へリン酸を転移する。リン酸化事象を様々な公知の方法によって検出し、および各検出法の出力を試料中に存在する環状ヌクレオチドの量と関連付ける。好適な検出法として、発光、放射能、および蛍光に基づく方法が含まれるが、これらに限定されない。一つの態様において、試料中のアデニリルシクラーゼ活性を決定するための方法が提供される。該方法は、検出され得、測定され得、およびその後アデニリルシクラーゼ活性と関連付けられ得る活性を提供するためにPKAの活性化を利用する。アデニリルシクラーゼが刺激された場合、PKAを活性化するcAMPが産生され、その活性が検出されおよびアデニリルシクラーゼ活性と関連付けられる。別の態様において、試料中のホスホジエステラーゼ活性を決定するための方法が提供される。該方法は、検出され得、測定され得、およびその後ホスホジエステラーゼ活性と関連付けられ得る活性を提供するために、PKAの活性化を利用する。ホスホジエステラーゼが抑制された場合、cAMPがAMPに変換されずまたはcGMPがcGMPに変換されず、それゆえにcAMPおよびcGMPは、PKAを活性化することができ、その活性が検出されおよびホスホジエステラーゼ活性と関連付けられる。【0013】さらなる態様において、アゴニストによるGタンパク質共役型受容体(GPCR)の活性化、またはアンタゴニストによるその抑制をモニターするための方法が提供される。GPCRを含む試料へのアゴニストまたはアンタゴニストの添加によって見出されるcAMPのレベルをPKAの活性化を通じて検出および測定する。そのような活性(またはその欠如)を、cAMPのレベルまたは量と関連付けられる測定可能な出力によって検出する。一つの態様において、本明細書において記載されたような方法を実施する際に用いられる試料はライセートを含む。幾つかの態様において、試料ライセートは、細菌、酵母、または哺乳動物細胞などの原核生物または真核生物に由来する。幾つかの態様において、試料は形質膜、細胞膜、および/またはオルガネラ膜を含む。本明細書において記載されたような膜調製物は、膜調製物が膜と関連するプロセス、タンパク質、および受容体の完全性および機能性を維持するような予期せぬ結果を与えた(実施例9〜11)。これにより、通常の細胞ライセート中に見出される細胞ライセート構成要素を伴わずに、本明細書において記載されたような方法を用いて行なわれる標的膜機能アッセイが可能となる。エネルギー転移、および免疫アッセイ)の形態にあってもよい。一つの態様において、測定可能な出力は生物発光の形態にある。鞘翅目(ホタル)ルシフェラーゼ酵素は、ATPおよびその他の因子を利用して、甲虫ルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、反応の副産物が光である。ひとたびPKAが活性化されると、PKA活性化の量は存在するcAMPの量に依存し、PKAはATPからのリン酸を利用して受容基質をリン酸化し、それによってATPの濃度を試料中で減少させ、それによって発光、または光出力の減少をもたらす。そのように、試料中のcAMP濃度が増加するにつれ、初期試料中に存在するcAMP、アデニリルシクラーゼ、および/またはGPCR活性の量と関連付けられる発光に逆の減少が見られる。一つの態様において、本発明は、環状ヌクレオチドによって活性化され得る不活性酵素を試料に添加する工程、活性化された酵素の活性を検出しおよび検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびにシグナルに基づいて試料中に存在する環状ヌクレオチドの量を決定する工程を含む環状ヌクレオチドを含み得る試料を含む試料中の環状ヌクレオチドの量を決定するための方法を提供する。幾つかの態様において、試料はライセートを含む。幾つかの態様において、試料ライセートは、細菌、酵母、または哺乳動物細胞に由来する。/またはオルガネラ膜を含む。幾つかの態様において、環状ヌクレオチドはcAMPまたはcGMPである。幾つかの態様において、不活性酵素は、cAMP依存性タンパク質キナーゼまたはcGMP依存性タンパク質キナーゼである。幾つかの態様において、検出系は、PKAまたはPKGによってリン酸化されることができる基質を含む。幾つかの態様において、検出系は、ATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含み、酵素はルシフェラーゼである。1をさらに含む放射性標識ビオチン化基質を含む。幾つかの態様において、検出系は、ストレプトアビジンをコーティングした結合表面をさらに含む。1をさらに含む蛍光標識基質を含み、蛍光標識は好ましくはローダミンである。幾つかの態様において、本発明の方法は、1つもしくは複数のホスホジエステラーゼの抑制剤の添加、および/または試料中の環状ヌクレオチドの量に影響を及ぼすことができるアゴニストもしくはアンタゴニストの添加をさらに含む。幾つかの態様において、アゴニストまたはアンタゴニストは、アデニリルシクラーゼ活性および/またはGPCR活性および/またはPDE活性を調整する。一つの態様において、本発明は、cAMPによって活性化され得る不活性酵素を試料に添加する工程、活性化された酵素の活性を検出しおよび検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびにシグナルに基づいて試料中に存在するアデニリルシクラーゼ活性を決定する工程を含む、アデニリルシクラーゼを含み得る試料を含む試料中のアデニリルシクラーゼ活性を決定するための方法を提供する。幾つかの態様において、試料はライセートを含む。幾つかの態様において、試料ライセートは、細菌、酵母、または哺乳動物細胞に由来する。/またはオルガネラ膜を含む。幾つかの態様において、不活性酵素はcAMP依存性タンパク質キナーゼである。幾つかの態様において、検出系は、PKAによってリン酸化されることができる基質を含む。幾つかの態様において、検出系は、ATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含むことができ、酵素はルシフェラーゼである。1をさらに含む放射性標識ビオチン化基質を含む。幾つかの態様において、検出系はストレプトアビジンをコーティングした結合表面を含む。1をさらに含む蛍光標識基質を含み、蛍光標識は好ましくはローダミンである。幾つかの態様において、本発明の方法は、1つもしくは複数のホスホジエステラーゼの抑制剤の添加、および/またはアデニリルシクラーゼ活性に影響を及ぼすことができるアゴニストもしくはアンタゴニストの添加をさらに含む。一つの態様において、本発明は、cAMPによって活性化され得る不活性酵素を試料に添加する工程、活性化された酵素の活性を検出しおよび検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびにシグナルに基づいて試料中に存在するホスホジエステラーゼ活性を決定する工程を含む、ホスホジエステラーゼを含み得る試料を含む試料中のホスホジエステラーゼ活性を決定するための方法を提供する。幾つかの態様において、試料はライセートを含む。幾つかの態様において、試料ライセートは、細菌、酵母、または哺乳動物細胞に由来する。/またはオルガネラ膜を含む。幾つかの態様において、ホスホジエステラーゼは環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼである。幾つかの態様において、環状ヌクレオチドはcAMPまたはcGMPである。幾つかの態様において、不活性酵素はcAMP依存性タンパク質キナーゼまたはcGMP依存性タンパク質キナーゼである。幾つかの態様において、検出系は、PKAまたはPKGによってリン酸化されることができる基質を含む。幾つかの態様において、検出系は、ATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含むことができ、酵素はルシフェラーゼである。1をさらに含む放射性標識ビオチン化基質を含む。幾つかの態様において、検出系はストレプトアビジンをコーティングした結合表面を含む。1をさらに含む蛍光標識基質を含み、蛍光標識は好ましくはローダミンである。幾つかの態様において、本発明の方法は、1つまたは複数のホスホジエステラーゼ活性の抑制剤の添加をさらに含む。決定するための方法を提供する。幾つかの態様において、試料はライセート、より好ましくは哺乳動物細胞に由来するライセートを含む。幾つかの態様において、試料は形質膜を含む。幾つかの態様において、不活性酵素はcAMP依存性タンパク質キナーゼである。幾つかの態様において、検出系は、PKAによってリン酸化されることができる基質を含む。幾つかの態様において、検出系は、ATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含むことができ、酵素はルシフェラーゼである。1をさらに含む放射性標識ビオチン化基質を含む。幾つかの態様において、検出系はストレプトアビジンをコーティングした結合表面を含む。1をさらに含む蛍光標識基質を含み、蛍光標識は好ましくはローダミンである。幾つかの態様において、本発明の方法は、1つもしくは複数のホスホジエステラーゼ活性の抑制剤の添加および/またはGPCRのアゴニストもしくはアンタゴニストの添加をさらに含む。一つの態様において、本発明は、環状ヌクレオチド、タンパク質キナーゼ、ATP、タンパク質キナーゼ基質、およびタンパク質キナーゼ基質を含む試料中で、環状ヌクレオチドの濃度を決定するためのキット、ならびにタンパク質キナーゼ基質の濃度を決定する際にキットを用いるための取扱説明書を提供する。幾つかの態様において、キットは発光検出系をさらに含む。幾つかの態様において、キットは蛍光検出系をさらに含む。幾つかの態様において、キットは放射性検出系をさらに含む。一つの態様において、本発明は、cAMPおよびcGMPのための基質、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ基質、および環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性を決定する際にキットを用いるための取扱説明書を含む試料中の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性を決定するためのキットを提供する。幾つかの態様において、キットは発光検出系をさらに含む。幾つかの態様において、キットは蛍光検出系をさらに含む。幾つかの態様において、キットは放射性検出系をさらに含む。本明細書において使用される場合、「試料」という用語は、その最も幅広い意味で使用される。ある意味において、生物学的試料および環境試料だけでなく、任意の供給源から得られる標本または培養物も含むことが意味される。生物学的試料には、血液産物、細胞ライセート、および細胞ライセートの構成要素が含まれる。工業試料などの環境材料が含まれる。試料は、環状ヌクレオチド濃度を調整する物質を含んでもよく、または含まなくてもよい。そのような例は、本発明に適用できる試料の種類を限定するものとして解されるべきではない。本明細書において使用される場合、「アゴニスト」という用語は、受容体、酵素、またはその他のタンパク質の活性を刺激し得る任意の物質を指す。本明細書において使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、受容体、酵素、またはその他のタンパク質の活性を抑制し得る任意の物質を指す。本明細書において使用される場合、「基質」という用語は、酵素またはその他のタンパク質によって作用される任意のポリペプチドを指す。本明細書において使用される場合、「抑制剤」という用語は、酵素活性または生化学的反応を抑制する任意の化合物を指す。本明細書において使用される場合、「検出」という用語は、試料内の物質の存在または非存在を定性的または定量的に決定することを指す。本明細書に記載されたような検出の方法として、発光、放射能、および蛍光が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、「ライセート」という用語は、その最も幅広い意味において、細胞膜がばらばらに破壊されるか、または溶解された時に細胞から放出される細胞破片および細胞液を指す。本明細書において記載されたように、本発明における有用性を見出すライセートには、細菌などの原核細胞由来のライセート、ならびに酵母、植物、および哺乳動物細胞ライセートなどの真核細胞由来のライセートが含まれるが、これらに限定されない。オルガネラ膜、細胞膜、およびそれらと同様のものが含まれるが、これらに限定されない。一つの態様において、本発明の方法は、環状ヌクレオチドによる活性化によるタンパク質キナーゼの活性の変化をモニターすることによって、細胞タンパク質の調整をモニターすることを提供する。環状ヌクレオチドの細胞レベルは、シクラーゼと環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性の間のバランスを反映する(図1)。環状AMPは四量体PKAの調節サブユニットに結合する。環状GMPはcGMP依存性タンパク質キナーゼ、またはPKGの調節サブユニットに結合する。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は本発明を実施するために必要ではない。いえ、cAMPがII型PKAの調節サブユニットに結合するだけでなく、cGMPもII型PKAの調節サブユニットに結合するということが見出された。したがって、ひとたびcAMPまたはcGMPがPKAの調節サブユニットに結合すると、PKA活性触媒サブユニットは、ATPから基質リン酸化部位へのリン酸の転移によってセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質をリン酸化することができる。そのように、PKA活性は、試料中に存在するcAMPまたはcGMPの量の指標としての役割を果たす。先に述べたように、シクラーゼおよびホスホジエステラーゼは試料中に存在する環状ヌクレオチドの量に直接影響する。アデニリルシクラーゼの活性化剤または抑制剤が存在する場合、cAMP濃度はそれぞれ増加または減少し、それによってPKA活性の増加または減少がもたらされると考えられる。グアニリルシクラーゼの活性化剤または抑制剤について、同じことが見出される。アデニリルシクラーゼはGPCRと関連するシグナリング経路の一部である。GPCRのアゴニストまたはアンタゴニストはアデニリルシクラーゼの活性、およびそれゆえにPKA活性に影響を及ぼすと考えられる。逆に、ホスホジエステラーゼはcAMPをAMPにおよびcGMPをGMPに加水分解し、そのためにこの酵素のアゴニストまたはアンタゴニストが試料中に存在する時に、環状ヌクレオチド濃度は、それぞれ減少または増加し、それによってPKA活性の減少または増加がもたらされると考えられる。そのように、本明細書において記載されたような方法は、cAMP、アデニリルシクラーゼ、cGMP、ホスホジエステラーゼ、およびGPCRの調整をモニターすることを提供する。II型ホロ酵素である(例えば、PKA調節サブユニットおよび触媒サブユニットが会合している)べきである。II型ホロ酵素は、会合していない活性触媒サブユニットを実質的に含まない。PKAホロ酵素の純度は、対照と比較した場合のシクラーゼおよびGPCRの調整のモニタリングを可能にするのに十分であるべきである。同様に、PKGが本明細書に記載されたように用いられる場合、それは同様に会合していない活性触媒サブユニットを実質的に含まないべきである。本明細書において記載されたような方法を最大限に活かすために、本方法のために用いられるPKAホロ酵素は、<10%(>90%純粋)、好ましくは<5%(>95%純粋)、より好ましくは<1%(>99%純粋)、および最も好ましくは<0.1%(>99.9%純粋)の会合していない活性触媒サブユニットを含むべきである。会合していない活性触媒サブユニットのパーセンテージについて検討するためのアッセイは、例えば、PKAホロ酵素の被検試料の活性を不活化されたホロ酵素を含む対照試料の活性と比較するアッセイである。本発明の一つの態様は、試料中の環状ヌクレオチドの濃度を決定することを提供する。幾つかの態様において、本方法を用いて試料中のcAMPまたはcGMPの量を決定してもよい。細胞ライセートを含むが、これらに限定されない。幾つかの態様において、試料はライセートを含む。幾つかの態様において、試料ライセートは細菌、酵母、または哺乳動物細胞に由来する。幾つかの態様において、試料は形質膜、細胞膜、および/またはオルガネラ膜を含む。一つの態様において、試料中の環状ヌクレオチドの濃度を決定するために、本発明は、タンパク質キナーゼ、基質、およびATPを含む。幾つかの態様において、本発明は、環状ヌクレオチドがキナーゼの調節サブユニットに結合する時に、活性触媒サブユニットが基質をリン酸化する際にATPを利用することができるように、PKAまたはPKGを含む。幾つかの態様において、本発明は、PKAまたはPKGに対する親和性の増加を示すセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質を含む。1)を含む基質を含む。異なる蛍光技術に基づく差次的な出力の使用が含まれるが、これらに限定されない。一つの態様において、本明細書において記載された方法でキナーゼ活性を測定し、および任意の好適なキナーゼアッセイを用いることができる。WI)などの放射能アッセイが含まれるが、これらに限定されない。異なる発光検出法は、PKA活性に関して異なる発光出力のパターンを示すということが企図される。一つの態様において、発光検出法は、キナーゼ活性を検出する方法である。幾つかの態様において、本明細書に記載されたような発光検出法は、酵素、基質、および適切な緩衝剤を含む。幾つかの態様において、本発明は、生物発光によってcAMP濃度の変化を検出する。幾つかの態様において、本発明は、ルシフェラーゼを利用することによってcAMP濃度の変化を検出する。幾つかの態様において、本発明は、鞘翅目のルシフェラーゼを利用することによってcAMP濃度の変化を検出する。環状ヌクレオチドがPKAの調節サブユニットに結合する際、触媒サブユニットは基質リン酸化のためにATPを利用することができ、およびATPは枯渇する。鞘翅目のルシフェラーゼ酵素は、ATPおよびその他の補因子を利用して、そのコグネート(cognate)基質であるルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、反応の副産物が発光、または光である。試料中のATPが減少するにつれ、ルシフェラーゼがあまり利用できなくなり、および発光の減少が見られる。発光出力(相対光単位またはRLU)を用いて対照の発光の変化と比べた試料の発光の変化を検出する。その他の発光検出法は、PKA活性に関して差次的な光出力を示してもよい。一つの態様において、本発明は、試料中の環状ヌクレオチド濃度を放射性手段によって決定する検出系を提供する。異なる放射性検出法は、PKA活性に関して異なる放射性出力のパターンを示してもよい。幾つかの態様において、放射性検出法はキナーゼ活性を検出するための方法である。幾つかの態様において、本明細書において記載されたような放射性検出法は、修飾基質、好適な緩衝剤、および修飾基質を捕捉することができる表面を含む。幾つかの態様において、放射性検出方法は放射性ATPを含む。幾つかの態様において、放射性検出法は、γ32P-ATPまたはγ33P-ATPを含む。一つの態様において、放射性検出法は、PKAによってリン酸化されることができる基質をさらに含む。幾つかの態様において、放射性検出法は、リガンドと会合したPKAによってリン酸化されることができる基質をさらに含む。1)を含むビオチン化基質を含む。幾つかの態様において、本明細書に記載されたような検出法は、基質/リガンドを捕捉する化合物が存在する表面をさらに含む。表面は、ストレプトアビジンでコーティングされている膜である。環状ヌクレオチドがPKAの調節サブユニットに結合する際、触媒サブユニットは放射性標識されたATPを利用しおよび放射性リン酸を基質に転移し、それによって基質が放射性であるようにする。放射性リガンドが連結された基質は、リガンドを捕捉すると考えられる化合物(例えば、ストレプトアビジン)が存在する表面で捕捉される。幾つかの態様において、余分な放射能がないよう表面を洗浄し、および捕捉表面に捕捉された放射能を測定する。放射性出力(単位時間当たりのカウント)を用いて対照の放射能の変化と比べた試料の放射能の変化を検出する。一つの態様において、本発明は、試料中の環状ヌクレオチド濃度を蛍光手段によって決定する検出系を提供する。異なる蛍光検出法はPKA活性に関して異なる蛍光出力のパターンを示してもよい。一つの態様において、蛍光検出法はキナーゼ活性を検出するための方法である。