一つの態様において、本発明の蛍光検出方法はフルオロフォアを含む。ローダミン-110を含む。一つの態様において、本明細書において記載されたような蛍光検出法は基質をさらに含む。幾つかの態様において、蛍光検出法は酵素を含む。幾つかの態様において、本明細書において記載されたような蛍光検出法の酵素はプロテアーゼである。幾つかの態様において、蛍光検出法のプロテアーゼは、基質がリン酸化されていない場合に、基質を消化することができる。一つの態様において、蛍光検出法はフルオロフォアと会合した基質を含む。幾つかの態様において、蛍光検出法は、フルオロフォアが基質と会合している時に、基質との会合がないフルオロフォアと比較した場合に蛍光の減少があるように、フルオロフォアと会合した2つの基質を含む。環状ヌクレオチドがPKAの調節サブユニットに結合している時に、触媒サブユニットはコグネート基質をリン酸化することができる。蛍光検出法の基質は、基質に結合した時にフルオロフォアが蛍光の減少を示すようにフルオロフォアに連結されている。本明細書において記載されたようなプロテアーゼは、リン酸化の時点まで基質を消化する。したがって、試料中の環状ヌクレオチド濃度が増加する場合、より多くの基質がリン酸化されると考えられ、および蛍光は低いままであると考えられる。逆に、試料中の環状ヌクレオチド濃度が低い場合、より少ない基質がリン酸化されると考えられ、非リン酸化基質のプロテアーゼ消化が完結し、その結果フルオロフォアが放出され、かつ蛍光が増加すると考えられる。蛍光出力(相対蛍光単位)を検出し、および対照の蛍光の変化と比べた試料の蛍光の変化を決定する。一つの態様において、本発明は、試料中の環状ヌクレオチド濃度を決定し、および環状ヌクレオチド濃度を試料中のシクラーゼ活性と関連付けることを提供する。一つの態様において、検出される環状ヌクレオチドはcAMPまたはcGMPである。細胞ライセートを含むが、これらに限定されない。幾つかの態様において、試料はライセートを含む。幾つかの態様において、試料ライセートは、細菌、酵母、または哺乳動物細胞に由来する。幾つかの態様において、試料は形質膜、細胞膜、および/またはオルガネラ膜を含む。幾つかの態様において、本発明のシクラーゼは、アデニリルシクラーゼおよびグアニリルシクラーゼからなる群より選択される。一つの態様において、本発明のシクラーゼはアデニリルシクラーゼである。幾つかの態様において、本発明を用いてアデニリルシクラーゼ活性に対する影響を有する物質を発見する。本発明の方法を用いて、アデニリルシクラーゼ活性を刺激する(例えば増加させる)かまたは抑制する(例えば減少させる)かのいずれかである物質を発見する。アデニリルシクラーゼ活性を刺激する物質の例として、フォルスコリン、ならびに7-デアセチル-フォルスコリン、6-アセチル-7-デアセチル-フォルスコリン、および7-デアセチル-7-O-ヘミスクシニル-フォルスコリンなどのフォルスコリン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。3'-四リン酸などの非競合的抑制剤;シス-N-(2-フェニルシクロペンチル)アザシクロトリデカ-1-エン-2-アミン、9-(2-ジホスホリルホスホニルメトキシエチル)アデニン、およびポリアデニリルなどのその他の抑制剤が含まれるが、これらに限定されない。一つの態様において、アデニリルシクラーゼ活性に対する物質の影響を決定するために、本発明の方法は、タンパク質キナーゼ、基質、およびATPを含む。幾つかの態様において、本方法は、環状ヌクレオチドがキナーゼの調節サブユニットに結合し、およびセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質をリン酸化する際にATPを利用することができる活性触媒サブユニットを放出するようなcAMP依存性タンパク質キナーゼ(PKA)を含む。幾つかの態様において、本方法は、PKAの遊離の触媒サブユニットに対する親和性の増加を示すセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質を含む。1)を含む基質を含む。アデニリルシクラーゼは、ATPからcAMPを生成させ、それゆえにアデニリルシクラーゼ活性に影響を及ぼす物質は試料中のcAMPの濃度に影響を与える。検出法は先の態様において記載されており、かつそれらの検出法はここで同等に適用可能である。物質が試料中のアデニリルシクラーゼの活性に影響を及ぼす時に、cAMP濃度が増加または減少すると考えられ、それがPKAによる基質リン酸化の増加または減少をもたらすと考えられる。先に記載されたような検出法出力を用いて、対照のアデニリルシクラーゼ活性の増加または減少と比べた試料のアデニリルシクラーゼ活性の増加または減少と関連付けられるcAMP濃度の増加または減少を決定する。したがって、アデニリルシクラーゼのアゴニストが試料中に存在し、それによってアデニリルシクラーゼ活性が刺激される時、使用する検出法の出力に反映されるcAMP産生の増加がある。逆に、アデニリルシクラーゼのアンタゴニストが試料中に存在し、それによってアデニリルシクラーゼ活性が抑制される場合、使用する検出法の出力に反映される、cAMP産生の減少がある。一つの態様において、本発明は、試料中の環状ヌクレオチドの濃度を決定し、および環状ヌクレオチド濃度とホスホジエステラーゼ活性を関連付ける。幾つかの態様において、検出される環状ヌクレオチドはcAMPまたはcGMPである。幾つかの態様において、cGMPが検出に用いられる環状ヌクレオチドである場合、試料はcAMPと比べて過剰のcGMPを有する。幾つかの態様において、cGMPが検出に用いられる環状ヌクレオチドである時、ホスホジエステラーゼIV(cAMP特異的ホスホジエステラーゼ)が試料中に存在する。細胞ライセートが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、試料はライセートを含む。幾つかの態様において、試料ライセートは細菌、酵母、または哺乳動物細胞に由来する。幾つかの態様において、試料は形質膜、細胞膜、および/またはオルガネラ膜を含む。一つの態様において、ホスホジエステラーゼは環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼである。幾つかの態様において、PKAのcAMP活性化を検出する時に、決定される環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性は、ホスホジエステラーゼII、ホスホジエステラーゼIII、およびホスホジエステラーゼIVからなる群由来である。幾つかの態様において、PKAのcGMP活性化を検出する時に、決定される環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性は、ホスホジエステラーゼII、ホスホジエステラーゼIII、ならびにホスホジエステラーゼIVおよびホスホジエステラーゼVからなる群由来である。幾つかの態様において、本発明の方法を用いて、ホスホジエステラーゼ活性に対する影響を有する物質を発見する。幾つかの態様において、本発明の方法を用いて、ホスホジエステラーゼ活性を刺激する(例えば増加させる)かまたは抑制する(例えば減少させる)かのいずれかである物質を発見する。ホスホジエステラーゼII活性を抑制する物質の例として、エリスロ-9-(2-ヒドロキシ-3-ノニル)アデニンが含まれるが、これに限定されない。hydrochloride)が含まれるが、これらに限定されない。ホスホジエステラーゼIV活性を抑制する物質の例として、4-[3-(シクロペンチルオキシ)-4-メトキシフェニル]-2-ピロリジノン、4-(3-ブトキシ-4-メトキシベンジル)イミダゾリジン-2-オン、および1-エチル-4-[91-メチルエチリデン-ヒドラジノ]1H-ピラゾロ[3,4-b]ピリジン-5-カルボン酸エチルエステルヒドロクロライドが含まれるが、これらに限定されない。ホスホジエステラーゼV活性を抑制する物質の例として、1,4-ジヒドロ-5-(2-プロポキシフェニル)-7H-1,2,3-トリアゾロ(4,5-d-ピリミジン-7-オン(ザプリナスト)、ジピリダモル、および1-[4-エトキシ-3-(6,7-ジヒドロ-1-メチル-7-オキソ-3-プロピル-1H-ピラゾロ[4,3-d]ピリミジン-5-イル-フェニルスルフォリル]-4-メチルピペラジンシトレートが含まれるが、これらに限定されない。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの非選択的抑制剤である物質の例は、3-イソブチル-1-メチルキサンチンである。一つの態様において、ホスホジエステラーゼ活性に対する物質の影響を決定するために、本発明は、環状ヌクレオチド、タンパク質キナーゼ、基質、およびATPを含む。幾つかの態様において、本発明は、cAMPまたはcGMPのいずれかの、環状ヌクレオチドが、放出されおよびセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質をリン酸化する際にATPを利用することができるようになるキナーゼの調節サブユニットに結合するようなPKAを含む。幾つかの態様において、本発明は、cAMP依存性タンパク質キナーゼに対する親和性の増加を示すセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質を含む。1)を含む基質を含む。【0046】ホスホジエステラーゼは、環状ヌクレオチドである、cAMPをAMPに、およびcGMPをGMPに加水分解する。検出法は、先の態様において記載されており、およびそれらの検出法はここで同等に適用可能である。物質が試料中のホスホジエステラーゼの活性を調整する際、環状ヌクレオチド濃度は増加または減少し、それによってPKAによる基質リン酸化の増加または減少がもたらされる。本明細書において記載されたような検出法出力を用いて、対照のホスホジエステラーゼ活性の減少または増加と比べた試料のホスホジエステラーゼ活性の減少または増加と関連付けられる環状ヌクレオチド濃度の増加または減少を決定する。したがって、ホスホジエステラーゼのアゴニストが試料中に存在し、それによってホスホジエステラーゼ活性が刺激される時、使用する検出法の出力に反映される、cAMPのAMPへのまたはcGMPのGMPへの加水分解の増加がある。逆に、ホスホジエステラーゼのアンタゴニストが試料中に存在し、それによってホスホジエステラーゼ活性が抑制される場合、使用する検出法の出力に反映される、cAMPのAMPへのまたはcGMPのGMPへの加水分解の減少がある。一つの態様において、本明細書に記載されたような方法は、試料中の環状ヌクレオチドの濃度を決定し、および環状ヌクレオチド濃度とGタンパク質共役型受容体(GPCR)活性を関連付ける。幾つかの態様において、検出される環状ヌクレオチドは、cAMPまたはcGMPである。細胞ライセートを含むが、これらに限定されない。幾つかの態様において、試料はライセートを含む。幾つかの態様において、試料ライセートは、細菌、酵母、または哺乳動物細胞に由来する。幾つかの態様において、試料は形質膜、細胞膜、および/またはオルガネラ膜を含む。幾つかの態様において、本発明を用いてGPCR活性に対する影響を有する物質を発見する。幾つかの態様において、本発明の方法を用いて、GPCR活性を刺激する(例えば増加させる)かまたは抑制する(例えば減少させる)かのいずれかである物質を発見する。99:25-44の中にGタンパク質共役型受容体の代表的なリストを見出すことができる。2)(米国特許第5,389,543号)およびβ-2-アドレナリン作動性受容体およびプロスタグランジンE1受容体が含まれるが、これらに限定されない。82958)が含まれるが、これらに限定されない。その他のドーパミン受容体として、D2、D3、D4、およびD5受容体が含まれるが、これらに限定されない。β-2-アドレナリン作動性受容体の活性を増加させる物質の例として、イソプロテレノールが含まれるが、これに限定されない。プロスタグランジンE2受容体の活性を増加させる物質の例として、CP-533,536が含まれるが、これに限定されない。その他のプロスタグランジン受容体として、EP1、EP3、およびEP4が含まれるが、これらに限定されない。一つの態様において、GPCR活性に対する物質の影響を決定するために、本発明の方法は、環状ヌクレオチド、タンパク質キナーゼ、基質、およびATPを含む。幾つかの態様において、本発明は、環状ヌクレオチドがキナーゼの調節サブユニットに結合し、および活性触媒サブユニットがセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質をリン酸化する際にATPを利用することができるようなPKAを含む。幾つかの態様において、本発明は、そのサブユニットへの環状ヌクレオチドの結合によって、触媒サブユニットのキナーゼ活性が生み出され、およびセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質をリン酸化するのにATPを利用するPKAを含む。幾つかの態様において、本発明は、その調節サブユニットへの環状ヌクレオチドの結合によって、触媒サブユニットのキナーゼ活性が生み出され、およびセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質をリン酸化するのにATPを利用する、PKAを含む。【0049】Gタンパク質共役型受容体は、細胞の外側から内側へのシグナリングに関与する膜内在性タンパク質である。GPCR機能不全によって引き起こされる多くの疾患があり、したがって本発明の方法が、物質がGPCR活性に対する影響を有するかどうかを明確にすることができることは、学問的および臨床的の両方で重要である。物質がGタンパク質共役型受容体を刺激するかまたは抑制するかのいずれかである場合、会合したアデニリルシクラーゼが影響を及ぼされ、その活性はそれぞれ、増加または減少すると考えられる。アデニリルシクラーゼ活性がGPCRを介した刺激または抑制によって調整される時に、cAMPに変換されるATPの量は影響を及ぼされ、それによってPKAの調節サブユニットと会合するのに利用可能であるcAMPの量が制御され、それによって今度は試料中で生じる基質リン酸化の量が制御される。検出法は、先の態様において記載されており、かつそれらの検出法はここで同等に適用可能である。物質が試料中のGPCRの活性に影響を及ぼす際、環状ヌクレオチド濃度がそれに従って変化し、それによってPKAによる基質リン酸化の増加または減少がもたらされる。検出法出力を用いて、対照のGPCR活性の増加または減少と比べた試料のGPCR活性の増加または減少と関連付けられるcAMP濃度の増加または減少を決定する。したがって、Gαsに共役しているGPCRのアゴニストが試料中に存在する場合、アデニリルシクラーゼ活性は刺激され、使用される検出法の出力に反映される、cAMP生成の増加をもたらす。逆に、Gαsに共役しているGPCRのアンタゴニストが試料中に存在する場合、アデニリルシクラーゼ活性は抑制され、および使用される検出法の出力に反映されるcAMP生成の減少がある。Gαiに共役したGPCRのアゴニストが試料中に存在する場合、アデニリルシクラーゼ活性は抑制され、使用される検出法の出力に反映されるcAMP生成の減少をもたらす。Gαiに共役したGPCRのアンタゴニストが試料中に存在する場合、アデニリルシクラーゼ活性は抑制されず、したがってcAMP生成の増加が実現される可能性があり、および使用される検出法の出力に反映される。一つの態様において、本発明は、本明細書において記載されたような任意の方法を実行するための1つまたは複数の試薬を含むキットを提供する。幾つかの態様において、試薬は本明細書において記載されたような方法を実行するのに十分である。データ解析用のソフトウェア、本明細書において記載されたような検出法を実施するための器具、本明細書において記載されたような方法を実施するための1つまたは複数の試薬を含む1つまたは複数の容器、および組織培養細胞が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、キットはcAMPまたはcGMPなどの、環状ヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、キットはPKAおよびPKGなどの酵素を含む。幾つかの態様において、キットは細胞溶解緩衝剤または細胞溶解溶液を含む。幾つかの態様において、キットは反応緩衝剤を含む。幾つかの態様において、キットは、凍結乾燥されているかまたは溶液中にあるかのいずれかの、タンパク質キナーゼ基質を含む。放射性検出系に適した緩衝剤および試薬を含む。本明細書において利用される術語は、説明の目的のためのものであり、および限定的であるとみなされるべきではない。本明細書において記載されたような態様は、本キット、方法、および組成物を用いることによって実施されることの例示的なものである。それらは、限定的であるよう意図されず、および当業者はその中に具体化される同等物を正しく理解すると考えられる。以下の実施例は、本発明のある種の好ましい態様および局面を示しおよびさらに例証するために提供され、ならびにその範囲を限定するものと解されるべきではない。D293(ヒト胎児腎臓)を全ての細胞培養関連実験について以下のやり方で培養した。Multiwell(商標)プレート)の中に5〜10,000細胞/ウェルの密度で細胞を播種した。細胞培地は、10%胎仔ウシ血清(FBS)、1Uペニシリン、および1mg/mlストレプトマイシンを補充したダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)からなった。ドーパミン受容体D1を安定に発現する細胞株については、選択および維持目的のために500μg/mlのネオマイシンを培養培地に添加した。CO2でおよそ24時間増殖させた。実施例2−cAMP濃度の決定この実験は、本発明を用いて試料中のcAMP濃度を決定することができるということ、および試料のcAMP濃度を決定する際に多様な検出技術と共に本発明を用いることができるということを示すために実行された。【0057】ポリ-D-リジンをコーティングした、白い、透明な底の96ウェルプレート中で反応を行なったが、添加される試薬の量を比例的に減少させることによって、反応を384ウェルプレート中で行なうこともできる。添加物容量をそれ相当にスケールダウンすることによって、1536ウェルプレートなどの、より高い密度のプレートを場合によっては用いることもできる。201724)中の25μMから始めたcAMPの3倍連続希釈を作製し、および10μlの各希釈を96ウェルプレートの別々のウェルに移した。MgCl2)を添加した。CA)を用いてcAMP濃度に対してプロットした。図2で見ることができるように、cAMP濃度が増加する時に発光は減少する。WI)の両方を用いた場合、同じ逆の応答が見られた。したがって、本発明および標準曲線を用いて、未知試料中でcAMP濃度を推定することができる。同様に、この標準曲線を用いて、アゴニストまたはアンタゴニストで処置した細胞の細胞抽出物中のcAMPの濃度を推定することができる。実施例3−フォルスコリンの存在下でのアデニリルシクラーゼ活性化のモニタリングポリ-D-リジンをコーティングした、白い、透明な底の96ウェルプレート中で反応を行なったが、添加される試薬の量を比例的に減少させることによって、反応を384ウェルプレート中で行なうこともできる。添加物容量をそれ相当にスケールダウンすることによって、1536ウェルプレートなどの、より高い密度のプレートを場合によっては用いることもできる。【0061】2×誘導緩衝剤中の250μMフォルスコリンの2倍連続希釈を作製した。D293細胞を実施例1で記載されたようなコンフルエンシーまで増殖させた。培地を培養細胞から除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、および10μlの各フォルスコリン希釈を96ウェルD293細胞培養プレートのウェルに添加した。数個のD293細胞のウェルにフォルスコリンなしの10μlの2×誘導緩衝剤を添加することによって、対照を含んだ。rATP(TPCKを最後に添加し、TPCKを添加する前に緩衝剤をボルテックスして沈殿を避けおよび溶解緩衝剤を氷上で保持する)を添加した。細胞を4°Cで15〜30分間溶解させ、および完全な溶解を顕微鏡評価によって確かめた。溶解後、60μlのPKA/基質試薬を各ウェルに添加し、および反応物をさらに20分間室温でインキュベートし、その後80μlのKinase-Glo(商標)試薬を添加した。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてフォルスコリン濃度に対してプロットした。図3で示されるように、フォルスコリン濃度が増加する時に発光は減少し、それによって本発明を用いてアデニリルシクラーゼ活性の増加を検出することができるということが示された。フォルスコリンがアデニリルシクラーゼを直接刺激し、ATPからcAMPを生成させる時に、cAMPが今度はPKAの調節サブユニットに結合し、それによって活性PKA触媒サブユニットが放出され、それが今度はATPを用いてケンプチド基質をリン酸化する。ケンプチドのリン酸化が増加する時に、Kinase-Glo(商標)試薬中のルシフェラーゼ酵素によって用いられる利用可能なATPがより少なくなり、発光の減少がもたらされる。アデニリルシクラーゼに対するフォルスコリンのこの効果は図3で見られ、フォルスコリン濃度が増加する時に発光の減少と関連付けられるアデニリルシクラーゼ活性が増加する。したがって、本発明は、cAMPを利用して刺激剤によるアデニリルシクラーゼの誘導をモニターすることができる。実施例4−アゴニストおよびアンタゴニストに応答したドーパミン受容体D1活性のモニタリング実験は、本発明が、哺乳動物細胞における、Gαs共役型受容体である、GPCRドーパミン受容体D1(DRD1)に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果を決定することができることを示すために実行された。標準的な分子生物学的技術を用いて、DRD1を安定に発現するD293細胞株を創出した。TM044)に従ってpTarget(商標)哺乳動物発現ベクターにクローニングした。細胞を実施例1と同様に増殖させ、および播種24時間後に細胞にpTarget-DRD1をトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、細胞をトリプシン処理しおよび様々な希釈で再びプレーティングし、ならびに500μg/mlの選択薬物ネオマイシンを含む新鮮な培地を適用した。薬物耐性クローンが創出されたことが明白であるまで培地を2〜3日毎に変えた。数個のネオマイシン耐性クローンをさらなる特徴解析のために選択し、およびドーパミン受容体D1応答について検討した。高い応答を示すクローンを拡大し、および凍結ストックを創出した。クローニングした細胞株のうちの1つをその後の検討に用いた。82958の3倍希釈を2×誘導緩衝剤中で希釈した。38393を含む2×誘導緩衝剤中で作製した。【0066】ポリ-D-リジンをコーティングした、白い、透明な底の96ウェルプレート中で反応を行なったが、添加される試薬の量を比例的に減少させることによって、反応を384ウェルプレート中で行なうこともできる。添加物容量をそれ相当にスケールダウンすることによって、1536ウェルプレートなどの、より高い密度のプレートを場合によっては用いることもできる。【0067】DRD1を発現するD293安定細胞を実施例1で記載されたように播種した。翌日、細胞をPBSで3回洗浄し、および10μlの各アゴニスト希釈を特定のウェルに添加した。対照反応用に、アゴニストなしの10μlの2×誘導緩衝剤を用いた。誘導を室温で30分間進行させ、その時点で10μlの2×溶解緩衝剤を各ウェルに添加した。溶解にはおよそ20〜30分かかり、および完全な溶解を顕微鏡評価によって確かめた。ひとたび細胞が完全に溶解すると、60μlのPKA/基質試薬を添加し、および反応物を室温でさらに20分間インキュベートした。インキュベーション後、80μlのKinase-Glo(商標)試薬を添加し、および室温で10分のインキュベーション後に発光を読み取った。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてアゴニスト濃度に対してプロットした。図4Aは、アゴニスト濃度が増加する時に発光シグナルが減少し、それによってDRD1を含む細胞のアデニリルシクラーゼに対する各アゴニストの誘導効果が示されるということを示す。様々なアゴニストについての異なるEC50値によって図4Aで示されたように、各アゴニストはDRD1活性に対して異なる効果を有する。23390希釈と共にDRD1を発現するD293安定細胞をインキュベートした。PKA/基質試薬およびKinase-Glo(商標)試薬の添加ならびにその後のインキュベーションおよび読み取りを上記のように実行した。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてアゴニスト濃度に対してプロットした。図4Bは、アンタゴニスト濃度が増加する時に発光シグナルが同様に減少するということを示す。23390の拮抗的影響によるアデニリルシクラーゼの抑制による。したがって、本発明は、Gαs経路に共役したGPCRのアデニリルシクラーゼ構成要素に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果をモニタリングする際の利用を見出す。実験は、PKAが環状ヌクレオチドおよびコグネート環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの存在下でcAMPおよびcGMP濃度の変化をモニターすることができることを示すために実行された。実験はまた、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性化剤または抑制剤の存在下でPDE活性の変化をモニターするために実行された。白い96ウェルプレート中で反応を行なったが、添加される試薬の量を比例的に減少させることによって、反応を384ウェルプレート中で行なうこともできる。添加物容量をそれ相当にスケールダウンすることによって、1536ウェルプレートなどの、より高い密度のプレートを場合によっては用いることもできる。II)の連続希釈を創出した。cAMPを含む12.5μlの溶液に各希釈の12.5μlアリコートを添加し、25μlの全容量が96ウェルの白いプレート中にあった。ATP)の添加によって反応を終結させた。IBMX溶液の添加後、25μlのPKA/基質試薬を添加し、反応物をさらに20分間インキュベートし、および50μlのKinase-Glo(商標)試薬を添加した。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてPDE濃度に対してプロットした。IIによってcAMPがAMPに加水分解される時に、cAMP濃度は減少し、それによって発光の増加がもたらされる。【0073】cGMPがPKAを活性化することができることを示すために、本アッセイ系を用いてcAMPおよびcGMPの並列滴定を行なった。ATPを補充した停止緩衝剤中で作製した。BSAを含む25μlのPKA/基質試薬を添加した。反応物を室温で20分間インキュベートさせ、および50μlのKinase-Glo(商標)試薬を添加し、その後さらに10分のインキュベーションを行なった。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いて環状ヌクレオチド(cNMP)濃度に対してプロットした。図6で示されるように、環状ヌクレオチド濃度が増加する時に相対光単位は減少する。図6は、cAMPの親和性よりも低い親和性でではあるが、cGMPがPKAの調節サブユニットに結合することができ、それによって活性触媒サブユニットが放出されることを示す。Vの連続希釈を創出した。酵素反応を室温で60分間進行させ、その後12.5μlの停止緩衝剤を添加した。MgCl2を含む25μlのPKA/基質試薬を反応ウェルに添加し、その後室温で20分のインキュベーションを行なった。V濃度に対してプロットした。V濃度が増加する時に試料の相対発光は増加する。図7Aは、本アッセイがcAMP加水分解に特異的なホスホジエステラーゼだけでなく、cGMPの加水分解に特異的なホスホジエステラーゼもモニターすることができることを示す。V選択的抑制剤ザプリナスト(Sigma)の滴定を行なった。cGMPを補充した停止緩衝剤中で作製した。Vを含む酵素溶液も作製した。各希釈のアリコート(12.5μl)を反応ウェルに添加し、および反応を開始させるために等量のホスホジエステラーゼPDEV酵素溶液を添加した。ATPを補充した12.5μlの停止緩衝剤を添加した。BSAを含む等容量のPKA/基質試薬を反応ウェルに添加し、プレートをさらに20分間インキュベートし、ならびに50μlのKinase-Glo(商標)試薬を添加した。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてザプリナスト濃度に対してプロットした。V抑制剤ザプリナストの量が増加する時に相対光単位は減少する。Vの潜在的抑制剤を決定する際の本アッセイの有用性が示されている。1998)で見出されるザプリナストについてのIC50と比較した本実験で算出されるザプリナストについてのIC50をさらに示し、コグネートcGMPホスホジエステラーゼの活性の変化をモニターするための本アッセイの有用性を再び示している。したがって、本発明は、抑制剤の存在下および非存在下でcAMP濃度およびそのコグネートホスホジエステラーゼの活性を測定するだけでなく、抑制剤の存在下および非存在下でcGMP濃度およびそのコグネートホスホジエステラーゼの活性をモニターする際にも有用性を見出す。IVなどのcAMP選択的ホスホジエステラーゼを添加し、および室温で30分間のさらなるインキュベーションを行なわなければならなかった。WI)を添加することができた。Kinase-Glo(商標)試薬の添加10分後、発光を測定し、ならびに出力を記録し(RLU)および異なる試料容量に対してプロットした。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版などのグラフ描写プログラムを用い、および試料発光出力をcGMP標準曲線の発光出力と比較することによって、試料中のcGMP量を決定することができた。生物学的試料中のcAMPまたはcGMPホスホジエステラーゼの活性を測定するために、例えば、500Daカットオフを持つ透析膜で、試料を透析し、内在性のcAMPおよびcGMPを除去しなければならなかった。透析膜の中に残る試料をその後の実験で用いた。試料を先の実施例で記載されたような基質および試薬とインキュベートした。それゆえに、cAMPまたはcGMPホスホジエステラーゼ用に、それぞれ、基質であるcAMPまたはcGMPを用いた。検出法を先に記載されたように用いることができ、および検出出力を対照の検出出力と比較することによってホスホジエステラーゼの活性を決定することができた。実施例9−形質膜におけるcAMPの検出この実験は、低張溶解法または窒素空洞化溶解法を用いて形質膜調製物を調製するための例示的方法を提供する。低張溶解のために、3×107細胞を500×gで5分間の遠心分離で回収しおよびPBS中で2回洗浄した。EDTA、0.2mMロイペプチン、および40μg/mlアプロチニン)の中で細胞ペレットを再懸濁し、ならびにPyrex(登録商標)ダウンスホモジナイザーを用いて細胞懸濁をホモジナイズした(20往復)。場合によって、細胞懸濁を3回ホモジナイズして低張細胞溶解を開始した。細胞懸濁中の低張性を整えるために、細胞懸濁のうちの幾つかで、それぞれ、25mMおよび10%の最終濃度までHEPESおよびグリセロールを添加した。EDTA、0.5Mスクロース、0.4mMロイペプチン、および80μg/mlアプロチニン)を添加した。全ての懸濁をさらなる17往復によってホモジナイズした。窒素空洞化溶解のために、3×108細胞を500×gで5分間の遠心分離で回収しおよびPBS中で2回洗浄した。EDTA、0.2mMロイペプチン、および40μg/mlアプロチニン)の中で細胞ペレットを再懸濁した。IL)の中で20分間350Psiで細胞懸濁を予め平衡化し、圧力をゆっくりと放出し、および細胞ライセートを回収した。両溶解法のために、形質膜画分を以下の手順で回収した。細胞ライセートを10分間の低速遠心分離(1000×g)に供して細胞破片を除去した。上清を回収しおよび30分間の高速遠心分離(50,000×g)に供して、形質膜を回収した。EDTA、0.2mMロイペプチン、および40μg/mlアプロチニン)、または10%の最終濃度のグリセロールを含む緩衝剤Bのいずれかの中で形質膜画分を再懸濁した。膜完全性を維持しおよび、最も重要なことには、受容体-Gタンパク質-アデニリルシクラーゼ複合体が無傷のままであるのを可能にする最適な方法を決定するために、異なる調製方法を評価した。図8は、異なる細胞型に対して異なる溶解法および緩衝剤を用いた異なる膜調製物の検討からのデータを示す。膜調製物はcAMP産生の誘導を示したが、低張溶解でのみ溶解されおよび緩衝剤B中で再懸濁された膜は、グリセロールを含む緩衝剤Bまたはスクロースを含む緩衝剤A中で溶解された膜よりも低い応答を示した。グリセロールを含む緩衝剤Bまたはスクロースを含む緩衝剤A中で再懸濁された膜調製物の間に差は見られなかった。実施例10−形質膜におけるフォルスコリン刺激型アデニリルシクラーゼ活性の検出ポリ-D-リジンをコーティングした、白い、透明な底の96ウェルプレート中で反応を行なったが、添加される試薬の量を比例的に減少させることによって、反応を384ウェルプレート中で行なうこともできる。添加物容量をそれ相当にスケールダウンすることによって、1536ウェルプレートなどの、より高い密度のプレートを場合によっては用いることもできる。Tween-20)中の250μMフォルスコリンの2倍連続希釈を作製した。実施例9で記載されたような方法に従って、実施例4で記載されたようなDRD1を安定に発現するHEK293細胞から形質膜調製物を調製した。GDPを96ウェルプレートのウェルに添加しならびに室温で10分間インキュベートした。15マイクロリットルの各フォルスコリン希釈を形質膜調製物に添加した。インキュベートした形質膜調製物を含む数個のウェルにフォルスコリンなしの15μlの刺激緩衝剤を添加することによって対照を含んだ。フォルスコリンありまたはフォルスコリンなしの形質膜調製物を室温で15分間インキュベートした。PKA/基質試薬を各ウェルに添加し、および反応物を室温でさらに20分間インキュベートさせ、その後80μlのKinase-Glo(商標)試薬を添加した。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてフォルスコリン濃度に対してプロットした。図9で見られるように、フォルスコリン濃度が増加する時に発光は減少し、それによって本発明が形質膜調製物におけるフォルスコリン刺激型アデニリルシクラーゼ活性を検出する際の有用性を見出すということが示される。したがって、本発明は、刺激剤によるアデニリルシクラーゼの誘導による形質膜調製物におけるcAMP生成を検出することができる。実施例11−形質膜におけるアゴニストに応答したドーパミン受容体D1活性のモニタリング実験は、本発明が、形質膜調製物におけるGPCRドーパミン受容体D1(DRD1)上のアデニリルシクラーゼ活性に対するアゴニストの影響を決定することができることを示すために実行された。GTPを含む刺激緩衝剤中で希釈した。10μMストック濃度のDRD1の非特異的リガンド、クインピロール、の2倍希釈も作製した。【0088】ポリ-D-リジンをコーティングした、白い、透明な底の96ウェルプレート中で反応を行なったが、添加される試薬の量を比例的に減少させることによって、反応を384ウェルプレート中で行なうこともできる。添加物容量をそれ相当にスケールダウンすることによって、1536ウェルプレートなどの、より高い密度のプレートを場合によっては用いることもできる。実施例7で記載されたような方法に従って、実施例4で記載されたようなDRD1を安定に発現するHEK293細胞から形質膜調製物を調製した。GDPを96ウェルプレートのウェルに添加しならびに室温で10分間インキュベートした。20マイクロリットルの各化合物希釈を特定のウェルに添加した。誘導を室温で15分間実行し、その後40μlのPKA/基質試薬を添加した。反応物を室温でさらに20分間インキュベートさせ、その後80μlのKinase-Glo(商標)試薬を添加した。Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてフォルスコリン濃度に対してプロットした。図10は、アゴニスト濃度が増加する時に、発光シグナルは、公知の特異的DRD1アゴニスト(ドーパミンおよびSKF38393)の場合には減少するが、DRD1受容体の非特異的リガンド、クインピロールの場合には減少せず、それによってDRD1受容体の活性化を膜調製物中で検出することができることが示されるということを示す。したがって、本発明は、cAMP濃度の変化を測定することによって形質膜調製物におけるアゴニスト/アンタゴニスト誘導型のGPCR受容体活性化をモニターする際の使用を見出す。実施例4で見出されるのと同様の様式で、DRD1のアンタゴニストを用いる実験を行なうことができる。23390希釈を添加し、および反応物を室温で30分間インキュベートする。PKA/基質試薬およびKinase-Glo(商標)試薬の添加ならびにその後のインキュベーションおよび読み取りを上記のように実行することができる。実施例12−アゴニストおよびアンタゴニストに応答したドーパミン受容体D2(DRD2)活性のモニタリング実験は、本発明が、Gαiタンパク質共役型受容体である、GPCRドーパミン受容体D2(DRD2)に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果を決定することができることを示すために実行された。【0093】DRD1について実施例4で記載されたような標準的な分子生物学的技術を用いて、DRD2を安定に発現するD293細胞株を創出した。Ro-20-1724)中で10uMフォルスコリンの存在下で様々な濃度のD2受容体アゴニストと共に20μl(96ウェルプレート)または7.5μl(384ウェルプレート)中でインキュベートした。室温での15分のインキュベーションの後、20μl(96ウェルプレート)または7.5μl(384ウェルプレート)の溶解緩衝剤を用いて、細胞を溶解した。RTで15分間のインキュベーションの後、PKA(96ウェル中に40μlおよび384ウェルプレート中に15μl)を含む40μl反応緩衝剤を用いてキナーゼ反応を行ない、ならびにキナーゼ反応を室温で20分間実行した。キナーゼ反応の最後に、等容量のKinase-Glo(商標)試薬を添加しおよび室温で10分間インキュベートし、ならびにルミノメーターを用いてプレートを読み取った。Ringer緩衝剤中で10μMフォルスコリンおよびEC80濃度のD2受容体のアゴニストと共に細胞をインキュベートし、ならびに先に記載したようにアッセイを進行させた。図11Aで示されるように、文献で報告されたEC50と同様であるクインピロールについての0.5nMというEC50が得られた。ラクロプライドと共に細胞をインキュベートすることを除いて、同様の実験設計を用いて、アンタゴニストを検討した。図11Bで示されるように、文献で報告されたIC50値と同様であるラクロプライドについての0.8nMというIC50値が得られた。ドーパミンD2受容体はGαiタンパク質共役型受容体である。したがって、このアッセイは、Gαsタンパク質共役型受容体の調整だけでなく、Gαiタンパク質共役型受容体の調整もモニターすることができ、それによって両方のクラスの受容体のモジュレーターを探索するHTSスクリーニングプログラムのための本アッセイの有用性が示されている。本出願で言及された全ての刊行物および特許は参照により本明細書に組み入れられる。記載された本発明の方法および組成物の様々な変更および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明白であると考えられる。本発明は特定の好ましい態様と一緒に記載されたが、主張されたような本発明がそのような特定の態様に過度に限定されるべきではないということが理解されるべきである。実際、関連分野の業者にとって明らかである本発明を実行するための記載された様式の様々な変更が、特許請求の範囲の範囲内にあるよう意図される。試料中のアデニリルシクラーゼ活性を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法:a)アデニリルシクラーゼを含み得る試料を提供する工程、b)cAMPによって活性化され得る不活性酵素を該試料に添加する工程、c)活性化された酵素の活性を検出しかつ検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびにd)該シグナルに基づいて該試料中に存在するアデニリルシクラーゼ活性を決定する工程。試料がライセートを含む、請求項1記載の方法。【請求項3】ライセートが真核細胞に由来する、請求項2記載の方法。試料が形質膜を含む、請求項1記載の方法。不活性酵素がcAMP依存性タンパク質キナーゼである、請求項1記載の方法。検出系がcAMP依存性タンパク質キナーゼによってリン酸化されることができる基質を含む、請求項1記載の方法。1を含む、請求項6記載の方法。検出系がATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含む、請求項6記載の方法。酵素がルシフェラーゼである、請求項8記載の方法。基質が放射性標識ビオチン化基質を含む、請求項6記載の方法。1をさらに含む、請求項10記載の方法。検出系がストレプトアビジン結合表面をさらに含む、請求項10記載の方法。基質が蛍光標識基質を含む、請求項6記載の方法。1をさらに含む、請求項13記載の方法。蛍光標識がローダミン部分である、請求項13記載の方法。【請求項16】ホスホジエステラーゼの1つまたは複数の抑制剤の添加をさらに含む、請求項1記載の方法。【請求項17】アデニリルシクラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの添加をさらに含む、請求項1記載の方法。試料中のホスホジエステラーゼ活性を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法:a)ホスホジエステラーゼを含み得る試料を提供する工程、b)cAMPによって活性化され得る不活性酵素を該試料に添加する工程、c)活性化された酵素の活性を検出しかつ検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびにd)該シグナルに基づいて該試料中に存在するホスホジエステラーゼ活性を決定する工程。【請求項19】ホスホジエステラーゼが環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼである、請求項18記載の方法。環状ヌクレオチドがcAMPまたはcGMPである、請求項19記載の方法。試料がライセートを含む、請求項18記載の方法。【請求項22】ライセートが真核細胞に由来する、請求項18記載の方法。試料が形質膜を含む、請求項18記載の方法。不活性酵素がcAMP依存性タンパク質キナーゼまたはcGMP依存性タンパク質キナーゼである、請求項18記載の方法。検出系がcAMP依存性タンパク質キナーゼまたはcGMP依存性タンパク質キナーゼによってリン酸化されることができる基質を含む、請求項18記載の方法。1を含む、請求項25記載の方法。検出系がATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含む、請求項25記載の方法。酵素がルシフェラーゼである、請求項27記載の方法。基質が放射性標識ビオチン化基質を含む、請求項25記載の方法。1をさらに含む、請求項29記載の方法。検出系がストレプトアビジン結合表面をさらに含む、請求項25記載の方法。基質が蛍光標識基質を含む、請求項25記載の方法。1をさらに含む、請求項32記載の方法。蛍光標識がローダミン部分である、請求項32記載の方法。【請求項35】ホスホジエステラーゼの1つまたは複数の抑制剤の添加をさらに含む、請求項18記載の方法。試料がライセートを含む、請求項36記載の方法。【請求項38】ライセートが真核細胞に由来する、請求項37記載の方法。試料が形質膜を含む、請求項36記載の方法。不活性酵素がcAMP依存性タンパク質キナーゼである、請求項36記載の方法。検出系がcAMP依存性タンパク質キナーゼによってリン酸化されることができる基質を含む、請求項36記載の方法。1を含む、請求項41記載の方法。検出系がATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含む、請求項41記載の方法。酵素がルシフェラーゼである、請求項43記載の方法。基質が放射性標識ビオチン化基質を含む、請求項41記載の方法。1をさらに含む、請求項45記載の方法。検出系がストレプトアビジン結合表面をさらに含む、請求項45記載の方法。基質が蛍光標識基質を含む、請求項45記載の方法。1をさらに含む、請求項48記載の方法。蛍光標識がローダミン部分である、請求項48記載の方法。【請求項51】ホスホジエステラーゼの1つまたは複数の抑制剤の添加をさらに含む、請求項36記載の方法。アゴニストまたはアンタゴニストの添加をさらに含む、請求項36記載の方法。試料中の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を決定するためのキットであって、以下を含むキット:a)cAMPおよびcGMPのための基質、b)タンパク質キナーゼ、c)タンパク質キナーゼ基質、d)ATP、およびe)試料中の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの濃度を決定するためのキットを用いるための取扱説明書。ekouhou.net。