なる生菌数測定装置であって、特にその噴霧機に特定のチャンバーと給液具が設けられている装置。給液具により試薬の飛び散りが防止でき、滞留時間が短く、微量、適量の噴霧が迅速にできる。吸引減圧されたチャンバーにより液微粒子を効率良く的確簡便に噴霧できる。それらの働きにより高価な試薬を微量的確に使用でき、しかも迅速簡便で高感度に生菌数の測定ができるようになった。【産業上の利用分野】本発明は、検体中の生菌数を迅速に測定する装置に関する。詳しくは該装置中の試薬噴霧機の改善とそれに用いられる試薬添加用給液具に関するものである。分野に於いては製造工程中もしくは製品中の生菌数の測定が極めて重要である。開発され、利用されている。【0003】すなわち、その方法は本出願人が発明し先に出願した(特願平3−40615号、PCT/JP92/00145、及び特願平5−328995号等)親水性メンブレンフィルターで検体を濾過し、生菌を補捉した後、抽出剤、次いで発光試薬を噴霧し、高感度の発光量測定システムにより生菌数を測定する方法である。出現によって、従来に比べ大巾に生菌数の測定が簡便、迅速、正確になった。【0004】さらに本出願人は、湿潤剤で処理された疎水性膜が特定の条件下で使用すると極めて優れていることを見出した。噴霧して菌体に接触させることにより、検出感度を著しく高め、細菌を濾過補捉後培養することなしに明瞭な輝点として直ちに検出する方法を考案した(特願平5−44397号)。【0005】この方法では抽出試薬及び発光試薬を微量噴霧すると、表面張力によりそれらの試薬が超微粒子状のまま生菌の付着点に付着し、さらに抽出された発光成分が拡散しないで超微粒子状で保持され発光させることができる。この場合、これらの試薬は直径20μm以下の超微粒子で、且つ超微量噴霧であることが極めて重要になる。それ故さらなる改良がその試薬噴霧化部に求められていたのである。個以下/膜)等ではより精密な微量噴霧が必要であり、又、使用する発光試薬が高価なので、できるだけ微量の噴霧で測定効果が得られるような噴霧方法と噴霧機の開発が希求されていたのである。に於て用いられる試薬の噴霧装置の改善と、さらにその噴霧装置の試薬添加方法をより優れたものにすることを課題としてなされたものである。4−150968号公報)がその試薬添加方法に改良を加えれば課題の解決のために最も好適な噴霧装置になることを見出し、本発明を完成した。なる生菌数測定装置を提供するものであり、且つ特に該装置中で用いる噴霧機が優れた効果を発揮するチャンバー及び/又は給液具を具備しているところに大きな特徴がある発明である。【0010】以下に本発明を詳述する。(システム)の全体の構成について説明する。本発明の生菌数迅速検出システムは大別すると三つの工程からなっている。その第1工程はメンブレンフィルターで検体を濾過し、生菌をフィルター上に補捉する)工程である。ここで用いられるメンブレンフィルターとしては従来より使用されている微生物分析用メンブレンフィルター、又は図5に示す疎水性区画壁4−2で囲まれた多数の親水性区画4−1を有するフレーム4−3付メンブレンフィルター4(特開平3−40615号、PCT/JP92/00145)、又は湿潤性剤で処理された疎水性膜等が用いられる。これらのメンブレンフィルターは検体中の生菌を効率的に濃縮補捉することができ、且つ該生菌の均一分散ができる他、次工程でのATPの拡散稀釈も防止できるという効果がある。【0011】第2工程は上記工程でメンブレンフィルター上に補捉した生菌中のATPを抽出するための抽出剤を該フィルター上に添加し、次いでそれに発光試薬を添加して発光せしめる工程である。この工程で用いるATP抽出剤は本発明者等が先に発明し出願した(特開平5−328995号)沸点が120°C以下の揮発性抽出剤、特にメタノール又はエタノールが好ましく、発光試薬は市販のルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬が用いられる。このルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬はマグネシウムイオン及び酵素の存在下でATPと接触するとルシフェリンの酸化により発光するので、その発光輝点数を測定することにより生菌数が検出されるのである。【0012】本工程のATP抽出及び発光に於ては、上記した抽出剤及び発光試薬を、できるだけ微量で、的確に、しかも時間をかけずに簡便に添加する必要がある。ATP抽出液が必要以上に添加されると抽出されたATPが稀釈されたり、又近傍に拡散、或いは流出して、発光点がぼやけるという問題が生じる他、残存した抽出剤によって発光が阻害されたり、それを防ぐため抽出剤の揮散に時間と手間がかかるので避けなければならないのである。そのため噴霧機等で注意深く適量を噴霧添加したり、既存の超音波式噴霧機で手間をかけて適量噴霧するよう努力していたが、両者とも散布量の調節が難しく、且つ散布ムラが大きく、また個人差が生じるので熟練を要する割りには充分効果的な噴霧を得ることができなかった。この点は発光試薬の添加に於ても同様であり、特に本発明で用いる発光試薬の場合は高価でもあるため、工業的には出来る限り少量で効果的な添加が必要であり、それを実現する噴霧添加方法の開発が望まれていたのである。【0013】前述の如く本発明は、第1にこの要望にこたえて本発明の生菌数の迅速検出方法に最適の噴霧装置を発明したところにある。その噴霧装置は特開平4−150968号公報に開示されている超音波霧化装置を改良したものである。該特開の装置は圧電振動子に舌片状の振動板が固定された構造を有する超音波振動器によって発生させられる弾性振動を利用して液体を霧化する装置であって、その振動板に多数の穴が設けられており、そこに液体が滴下されると、液はその穴を通って振動板の上に出てきて微粒状で均一に霧化されるようになっている。【0014】この超音波霧化装置は、振動部の多数の穴の働きによって、霧の粒子が微小で均一になるという効果があり、又霧化が効率的で低電力消費で行うことができ、装置も小型になるという効果をもっている。本発明の生菌数迅速検出システムに於いて該霧化装置を採用したのも、それらの効果、特にその噴霧粒子が微粒状且つ均一で、しかも効率的噴霧ができ、その装置全体が小型になるという点が今迄の噴霧装置に比べ本発明の生菌数検出システムで用いる噴霧装置に要求される性能により合致していることを確認したからである。【0015】しかし、上記した特開の超音波霧化装置はもともと本発明の生菌数の迅速検出装置で用いる噴霧機として開発されたものではなく、ネブライザー或いは加湿器等の従来通りの噴霧機用途もしくは超音波カラーオルガンといった特殊な用途を対象としていたため、本発明の装置システムに適合せしめるためにはいくつかの改良が必要であった。【0016】その1つは、抽出剤の噴霧にあっては生菌を補捉したフィルター上に的確で且つ微量で適量の噴霧が必要であり、そのための工夫が必要とされたことである。抽出剤の噴霧は検出精度をあげるためには生菌中のATPを抽出できるだけの必要最小限の量が必要である反面、多すぎるとそのATPの希釈や拡散或いは流出等が起こったり、発光点の輪郭がぼやけたりして検出感度が低下するので避けねばならない。発光試薬の噴霧においても同様であるばかりでなく、該試薬が高価で、できるだけ微量で効率良く噴霧する必要があるので、的確、且つ微量で適量の噴霧の必要性はより高いといえる。【0017】次にその2として、測定の精度を向上させるためにはできるだけ生菌補捉後の抽出および発光の工程を短くする必要があるが、そのために、噴霧液(抽出剤、発光試薬)の噴霧前の滞留時間(リードタイム)を少なくし、且つ試薬液の飛び散りを防止し、均一な噴霧を実現するための給液具の発明が必要であったのである。該給液具は効率的で均一、微粒状の噴霧をするために振動板との接面の均一性、密着性も向上させねばならず、残液量もできるだけ少ない構造のものでなけねばならない。【0018】上記した2つの改善を行うため、本発明者らはまず図1及び図2の2に示すチャンバーを考案した。このチャンバー2は該図に示すように噴霧装置の振動子等の霧化部を出し入れする窓2−1が上部に設けられた円筒体であり、その底部の開口部がその円筒内に生菌を補捉したメンブレンフィルター上に設置できるように取り付けられている。好ましくは該底面下方より減圧ポンプ等により該チャンバー内の空気は吸引され、減圧されている。このときの減圧の度合は5〜50mmHg、好ましくは10〜30mmHgがよい。【0019】このチャンバーの設置と下方からの吸引によって振動板で微粒状に霧化された抽出剤又は発光試薬はメンブレンフィルター上の生菌に効率良く降り注ぎ、微量且つ適量で夫々の機能を発揮することができるのであり、チャンバーがないと霧は拡散し薬液量が増大し、且つ効率的散布が不可能になる。振動板上に液体を供給する方法としては、流量調整バルブと供給チューブを用い液量をコントロールしつつ液体を滴下する方法(特開平4−150968号公報)、スポンジ等の保液材によって液体を吸い上げ振動板の下面に供給する方法(特開平4−322290号公報)、角柱状プラスチックケースにスポンジ等の保液材を入れ、その下部は液体に浸して、吸い上げた液体を上端の上の振動板に補給する方法(特開平5−305257号公報)等が該超音波霧化装置の開発者らにより考案され公開されている。【0021】しかし、これらの方法では本発明が要求する少量で適量の薬液の的確な噴霧は困難であり、又、該薬液の滞留時間が短く、飛び散る等のトラブルがないという効果を得ることはできなかった。そこで本発明者らは薬液の供給口の改善を検討した結果、試薬ビンからニードルにより供給された薬液を振動子の振動板上に滴下する際に、直接液滴を滴下するのではなく、一旦吸液材シート1−1に吸収させ、そこから平均化して振動子3に液を供給することによって目的とする効果が得られることを見出した。その吸液材は当初スポンジの小円柱体を用いていたが、これでは滞留時間及び残液の点で問題が残るので、さらにそれを改善した結果図4に示す本発明の抽出剤や発光試薬の薬液を振動子3の霧発生部に好適に供給するための給液具1を発明した。【0022】この給液具1は振動子3の霧発生部の形状にあわせた断面形状を有する両端が開口した筒状支持体1−2の底部に吸液材シート1−1を種々の方法で接着した構造を有する。筒状支持体1−2の材質は薬液に侵されないプラスチック又は金属等が用いられる。その外径は4〜30mm、好ましくは6〜12mmであり、高さは4〜30mm、好ましくは6〜12mmである。筒状支持体の壁には空隙が設けられていてもよく籠状のものでもよい。【0023】底部に貼り着けられているシート1−1のシートの表面は振動板に均等に接して供液を均一に行えるようできるだけ平面的なものが好ましい。このシートは本発明で用いる抽出剤及び発光試薬を素早く吸収し、且つそれを保持できる吸液性に優れたシートが適している。したがって、該シートとしては濾紙等に用いられるセルロース系又は吸水性を有する合成又は半合成繊維のシートや不織布或いは吸液性を有する天然もしくは合成のスポンジシート等が用いられる。具体的な例としては日本ミリポア社製のセルロース系フィルター,AP−10等が用いられる。このシートの厚さは0.3〜3mm、好ましくは0.5〜1mmである。その平面形状は筒状支持体の断面形状にあわせた形状にする必要があるが、円筒支持体の場合には直径は4〜30mmφ、好ましくは6〜12mmφのものが用いられる。【0024】本発明の給液具1を用いると、直接振動子上に薬液を滴下する場合に比べて、液の飛び散りがほとんどなく、振動子の霧発生部全体にほぼ均一に液が供給され、且つその液が的確に霧化できるので残液がなく、微量で適量の噴霧が可能になる。シートへの液の浸出入が早いのでリードタイムもほとんどなく、測定操作に合わせて迅速な測定ができるようになった。【0025】以上に説明した本発明の噴霧機の要部を図1及び図2に示す。図中1が給液具、2がチャンバーである。この噴霧機及び給液具を用いて噴霧すると前記のメンブレンフィルター上に補捉された生菌の上に粒径が1〜60μm、好ましくは5〜20μmの微粒状のATP抽出剤及び/又はルシフェリンルシフェラーゼ系発光試薬が前者の場合0.04〜0.08ml程度、後者の場合0.02〜0.04ml程度、的確且つ迅速に噴霧することができる。えば浜松ホトニック(株)社製ARGUSー50/CL、又は日本ミリポア(株)社製RMDS〕にかけ、その輝点を撮像し、生菌数を測定する。この生物発光画像解析システムは、従来の測定装置に比べ、微弱な発光を高感度で処理することができ、データの処理及び解析も早いのでこれを採用することにより本発明のフィルター及び試薬の改良された噴霧機の効果と相乗して、極めて優れた生菌測定法を実現することができた。【0027】そのシステムの概要は図6に示す通りである。この図6に示すシステムは上記の抽出試薬及び発光試薬で処理した後のフィルター4を支持するためのフィルターホルダー11、遮光ハウジング16、フィルターにできるだけ接近させて配置された発光を2次元的に検出するテーパーファイバー17、光増幅部及び撮像管からなる超高感度テレビカメラ18、カメラコントローラー19、イメージプロセッサ20、データ解析装置21、テレビモニター22から構成されている。【0028】測定は、発光処理した前記フィルター4(生菌を保持したフィルター)を保持したフィルターホルダー11をテーパーファイバー面に密着させて置き、超高感度テレビカメラ、カメラコントローラー及びイメージプロセッサーを用いて2次元的に光子を30〜180秒間、例えば120秒間蓄積し、菌体からの発光を撮像し、データ解析装置により画像処理を行い微細な発光ノイズを消去して生菌由来の強い発光のみを残してテレビモニターに表示する。この処理によって菌体以外の発光がノイズとして消去されるので測定された輝点数は生菌数と略一致する。13898)を接種し、37°C、1夜培養した後、ヘペス緩衝液(pH7.75)で約100個/mlになるように希釈し、その0.2mlを検体液とした。疎水性のPVDF膜(HVHP.47mmφ、日本ミリポア(株)製)を濾過器に装着した後、少量のメタノール浸漬して親水化しさらに水で充分洗浄してから、この上に10mlのヘペス緩衝液(シグマ社製)を加え、さらに上記検体液0.2mlを加えてから吸引濾過した。同緩衝液15mlで3回洗浄した後、濾過器からメンブレンフィルターを取り外す。【0031】次に、図1及び図2に示す噴霧装置に上記のメンブレンフィルターをセットし、以下に示すようにしてATP抽出試薬(日本ミリポア(株)製)及び発光試薬(日本ミリポア(株)製))を噴霧する。抽出試薬及び発光試薬は試薬ビン5に夫々充填されており、マニホールド7に取り付けられる。このセットが抽出試薬と発光試薬の二系列設けられている。マニホールド7には、上下にニードル8がついており、一方は試薬滴下用8−aで、他方は試薬導入用8−b及びガス圧にて送液のためのガスの取り込み用ニードル8−cである。【0032】このマニホールド7全体は上下が逆転する機能を有しているので、試薬ビンの取り付けの場合は8−b,8−cのニードルを下側にした状況で行うことができる。マニホールド7にはさらに電磁バルブ6が取付けてあり、制御機構からの制御によりバルブが開閉し、送液用ガス(チッ素ガス等)がコントロールされ試薬が定量的に送液される。【0033】試薬ビン5の取付けが終わると試薬ビンが上方になるようにマニホールドを回転させ、次に給液具1を振動子(ミクニ製3T−UVA)3上に設置する。振動子3には、給液具1が所定の位置に設置、保持されるようなガイド3−1が設けてある。【0034】本発明の給液具1はポリカーボネートでできた円筒支持体1−2aの底面に厚さ1mmで直径が7.5mmセルロース系のフィルター1−1が熔着されている。支持体1−2の高さは8mmである。【0035】次いで本発明のチャンバー2をチャンバーホルダー9に取付ける。チャンバーホルダー9はチャンバー取付け時には大きく左右に開けることができ、チャンバーを適切な強さで保持している。このチャンバー2の大きさは直径40mm、高さ200mmであって、ポリカーボネート樹脂でできており、フィルターの大きさによって直径や高さを変えることができる。このチャンバーホルダー9はチャンバーホルダーマウント10と一体構造となっており、チャンバーホルダーマウントは空気圧(又はモーター駆動)で上下に約5〜20mm程度動くような機構となっている。【0036】前工程で処理をしたメンブレンフィルター4は、フィルター取付用リング及びフィルターホルダーから構成されている耐蝕性金属(又はプラスチック)のフィルターホルダー11に取付けられている。このフィルターホルダー11をベースプレート12上に設置する。ベースプレート12には1個以上の吸引孔13が設けられており、10〜30mmHgの圧力で吸引されている。このプレートにはフィルター送り用テフロンのレール14が設置されており、このレール上にメンブレンフィルターをのせることにより所定の位置まで移動させることができる。【0037】レール14上に置かれたメンブレンフィルター4が装着されたフィルターホルダー11をチャンバー2の下に送る。チャンバー2はフィルターホルダー11がチャンバーの真下にくるように上方に持ち上げることができフィルター4がチャンバー2の真下に来ると、チャンバー2を元の位置まで下げることができる。【0038】次に電磁バルブ6が開き試薬ビン5内にチッ素ガスを供給しATP抽出試薬であるメタノールが0.08cc給液具1中に滴下される。設けて自動化、連続化も可能である。給液具1の給液材シート(セルロース系フィルター)1−1が直ちに試薬を吸収し、一方、電磁バルブ6が開くと同時に振動子3が作動を始め該給液具1の給液材シート1−1に均等に保持された試薬を直ちに霧状に霧化し下方に噴霧する。チャンバー内は吸引孔13から吸引減されて20mmHgの負圧となっているので霧状となった抽出試薬はチャンバーの壁面にもほとんど付着せずメンブレンフィルター4の表面に微量均等に噴霧される。システムは図6に示し、前に説明した通りのものであって、日本ミリポア製のRMDSを用いた。測定の結果、18〜22個の生菌(輝点)が測定された。個/mlとなるように希釈して得られた試験液の0.5mlを検体液とした。多数の疎水性隔壁で囲まれた区画を有する図5に示す親水性PVDFメンブレンフィルター(HVWP.47mmφ、日本ミリポア(株)製)を濾過器に装着、濾過集菌したメンブレンフィルターに、実施例1と同様にして、抽出薬試薬0.08cc、発光試薬0.04ccの噴霧を行い、実施例1と同一のRMDSで測定したところ、45〜60個の輝点が測定された。13898)をヘペス緩衝液(pH7.75)で約100個/mlになるように希釈し、その0.2mlをポリカーボネートメンブレンフィルター(商品名アイソポア0.4μm、47mmφ、日本ミリポア(株)製)を用いて濾過した後、SCD寒天(日本製薬製)平板にのせ、37°C、6hr培養した。その後メンブレンフィルターを取り外し、実施例1と同一の装置及び方法により、抽出試薬0.04cc、発光試薬0.02ccの噴霧を行い、実施例1と同様にRMDSで測定したところ、17〜21個の輝点が測定された。【発明の効果】弾性振動により液体を霧化する超音波霧化装置に噴霧すべき液体を供給する際、本発明の給液具を用いると、該液体(ATP抽出剤、発光試薬)の飛び散りによるトラブルやロスが防止できる上に、液の滞留時間が短く、振動板上の霧化発生部に均等に液が供給できるため微量、適量の噴霧が迅速にできるという効果が得られる。チャンバーを設置し、さらに下方から吸引減圧することにより、噴霧された液微粒子が効率良く且つ的確にメンブレンフィルター上の生菌に添加することが容易に且つ個人差なく可能になったという効果が得られた。※以下のタグをホームページ中に張り付けると便利です。収集に関しては慎重に行っておりますが、もし掲載内容に関し異議がございましたらお問い合わせください、速やかに情報を削除させていただきます。