FavoritesSummary電気生理学用に設計されたマイクロインジェクストローデシステムと、オプションの薬物注入による実験プローブ(ナノセンサ、マイクロ電極)の送達を支援します。広く利用可能なマイクロ流体成分は、プローブを含むカニューレに結合される。マイクロインジェクストロード構築のためのステップバイステッププロトコルが含まれており、マカク皮質におけるムスシモール注入中の結果が含まれています。マイクロ電極やナノセンサーなどの実験プローブの送達と検索のために設計されており、覚醒中の繰り返し使用に最適化され、動物を振る舞います。マイクロインジェクストローデシステムは、複数の目的のために構成することができます:(1)それ以外の場合は、デュラマターを貫通するにはあまりにも脆弱であろう実験プローブの配置のためのカニューレの簡単な配置、(2)薬物のマイクロ流体注入、いずれかの実験プローブを含むカニューレ(すなわち、マイクロ電極、ナノセンサ)に独立または結合する。このプロトコルでは、マイクロインジェクドの段階的な構築、マイクロ流体成分への結合、および生体内でのシステム使用のためのプロトコルを説明する。このシステムのマイクロ流体部品は、最小限の浸透ダメージで、ナノリットルスケールでボリュームの配信を可能にします。薬物注入は、目覚めのマイクロ電極やナノセンサーなどの実験プローブと独立して、または同時に行うことができ、動物を振る舞う。このシステムの応用は、皮質の電気的活動および行動に対する薬物の影響の測定から、プローブまたはナノセンサー測定に基づく行動性能の文脈における皮質の特定の領域の機能の理解に至る。このシステムの機能の一部を実証するために、作業メモリタスク中に黄腸マカクにおける前眼場(FEF)の可逆的不活性化のためのムスシモール注入の例を提示する。げっ歯類や霊長類で.過去30年間にわたり、初期の注射モデルの改良は、より正確で侵襲性の低い技術を可能にし、特定の脳部位1、2、3で同時記録および薬物注入を可能にした。霊長類の場合、高度な訓練を受けた動物を必要とする高度な認知機能の研究にこの技術を使用する場合、組織損傷を最小限に抑えて少量を正確に送り出す能力が重要です。最近の進歩は、移植されたプローブ4を用いた刺激と組み合わせた慢性電気生理学的および化学的測定を含み、そして、結合された記録およびマイクロ流体薬物送達は、最近げっ歯類5で試験的に試験されている。正確な薬物送達を可能にし、それはすでに複数の霊長類実験室6、7、8で正常に実施されている。ナノセンサ9、10などの繊細で特殊なセンサの利用可能性の向上は、脆弱なナノスケールデバイスやマイクロ電極チップを損なうことなく、デュラマターを介してプローブを得るための信頼性の高い方法を必要とします。ような脆弱な実験プローブを配置する機能の2つの主要な機能を容易にするマイクロインジェクストローデシステムを設計しました。マイクロ電極またはナノセンサは、デュラマターおよび神経組織を介して、任意の損傷から保護される。この機能により、カニューレを神経組織を通るガイドとして使用して送達される標的の場所に実験プローブを配置することができる。マイクロ電極を用いて電気生理学的記録と電気刺激と薬物注入を組み合わせた実験を行う能力。当社のシステムは、薬物送達(マイクロインフュージョン用のシステムを使用する場合)の両方を機能し、マイクロ電極またはナノセンサ(デュラを通過する場合と、両方を通過する場合)の追加保護を提供するカニューレと一緒に、duraを貫通するガイドチューブを使用しています神経組織)。このシステムは、安価で見つけやすい広く市販されているコンポーネントで簡単に構築することができます。小径カニューレ(外径OD=235μm、内径ID=108μm)を使用することで浸透ダメージを最小限に抑えます。ここでは、マイクロインジェドロードの構築とマイクロ流体システムの構成に関するステップバイステップの手順を紹介します。マイクロインジェクドロードの使用に必要なステップについて、薬物注入用のマイクロ流体システムに独立して、または結合して説明します。同様のアプローチは、ナノセンサ9、10などの任意の脆弱な実験プローブで適用することができる。プローブは、カニューレに前面または背面にロードすることができ(設計に応じて)、硬孔および神経組織を貫通する際の損傷から保護される。ヒト以外の霊長類を用いた生体内実験のサンプルデータを提供し、タングステンマイクロ電極を用いて電気刺激を行い、その後前眼科(FEF)にムシモールを注入し、動物が記憶誘導サッカデ(MGS)タスクを行った。刺激と記録のためのマイクロインジェクドの構築(図1a)カニューレとプローブの長さを測定します(この例ではナノセンサー)。プローブは、カニューレ先端から突出する長さ(プローブ設計に応じて)に約2cmを加えた長さによってカニューレよりも長くなければなりません。拡大鏡または顕微鏡(約10倍倍)の下で、カニューレにプローブをロードします。可能であれば、プローブの先端を保護するためにバックローディングが望ましいです。注:手動で実行するこの手順は困難です。実際の実験プローブを試す前に、虫眼鏡の下でマイクロ電極を使用して練習することをお勧めします。カニューレ(プローブを含む)を上部フェルール、T接合、および底面フェルールに通します。プローブがアタッチメントのない単一のワイヤである場合は、それをカウラにバックロードし、アセンブリを下部フェルールからTジャンクションに挿入します。カニューレの上部(フラットエンド側)は、Tジャンクションの中央に配置する必要がありますが、上部フェルール内には配置しないでください。実験プローブまたはバイオセンサーは、トップフェルールの上部に突出する必要があります。注:カスタムメイドのフェルールは、マイクロドリルビットを使用してフェルールプラグに穴を開け、カニューレをT接合部に締め付けるために必要な直径に基づいて穴の大きさを作ることもできます。フェルールレンチを使用して、Tジャンクションの上部と下部のフェルールを締めます。締め過ぎないでください。小さなチューブを追加して、トップフェルール内の電極支持体を強化することができます。プローブの仕様に従って、各プローブ端子(信号、グラウンドなど)に金色のピンをはんだ付けします。プローブとカニューレの相対位置を調整します。プローブがカニューレから突出している距離を倍率で測定し、上端から手動で調整します(プローブはフェルール内で自由にスライドできます)。金ピンとトップフェルールの間にエポキシ接着剤を加えて、プローブをフェルールに取り付けます。上部のフェルールを外して、カニューレ内のプローブを引き込みます。プローブが拡大の下でカニューレ内に完全に入っていることを視覚的に確認します。インジェクトローデをマイクロドライブに取り付けます。(図1b)フェルールを使用して、カニューレの「ノンベブル」またはフラットエンドをT接合部の底部に取り付けます。フェルールレンチを使用して、フェルールを締めます。標準のフェルールを通してT接合部の上部に小さな毛細管チューブ(〜1.5cm)を取り付けます。フェルールレンチで締めます。毛細管、T接合、カニューレおよび対応するフェルールを通してマイクロ電極をバックロードします。電極のバックエンドがキャピラリーチューブの背面から1cm未満に突出し、電極の先端が底面の所望の距離でカニューレから突出していることを確認します。電極位置は上端から手動で調節することができる。マイクロ電極端子に金ピンはんだ付けする。金ピンとトップフェルールの間にエポキシ接着剤を加えて、マイクロ電極をフェルールに取り付けます。上部のフェルールを外して、カニューレ内のプローブを引き込みます。マイクロ電極がカニューレに完全に引き込まれたことを視覚的に確認します。マイクロ流体回路の構築(図2)安定した表面にブレッドボードを置きます。ネジを使用して、バルブをブレッドボードに固定します。バルブの横に定規を配置します(キャピラリーチューブ内の流体の動きを測定および追跡します)。1:1の低粘度オイルと食品着色(マーカー)の混合物をガスタイトシリンジにロードし、マーカーポンプに入れます。キャピラリーチューブを1つカットし、標準のフェルールとルアーロックコネクタを使用して、入力バルブのポートの1つにシリンジを接続します。これが「マーカーライン」です。「定規線」の毛細管の短い部分をカットします。標準のフェルールを使用して、バルブの前面ポートに締め付けます。2つの長いキャピラリーチューブをカットして、出力バルブをマイクロインジェロードに接続し、ドラッグポンプを入力バルブに接続します(標準フェルールを使用)。注:これらの2つの線の長さは、実験的なセットアップに依存し、1つは注入装置から動物に到達するのに十分な長さでなければならない、もう1つはドラッグポンプから入力バルブに到達する必要があります。切断石を使用して毛細管チューブをカットします。3)取り付け前に、マイクロ電極/実験プローブがカニューレに引き込まれていることを確認してください。注:ガイドチューブはマイクロドライブの位置にある必要があります。カスタムメイドのアダプターをマイクロインジェロードに取り付けます。マイクロインジェクドをガイドチューブに通してトップロードし、ネジを使用してアダプターに固定します。マイクロインジェクドがガイドチューブから突出するマイクロドライブ位置(深さ)を測定し、約1cm後退して挿入の準備をします。マイクロインフュージョン実験では、「脳線」をマイクロインジェクストローデの未使用のT接合開口部に接続します。標準的なフェルールを使用し、フェルールレンチで締めます。マイクロ流体システムのフラッシングと調製マイクロインジェクトローデを廃棄物ビーカーの上に置きます。g/Lで溶解)を1mLのガス密注射器に入れ、ドラッグポンプに入れます。液体がバルブを通ってバルブラインに向かい、「脳ライン」を出すようにバルブの流れ方向を回します。低流量(50~200°L/分)を使用してクロルヘキシジンで回路を10分間フラッシュし、手順5.2~5.3を滅菌生理食塩水と空気で繰り返します。注:この段階でリークをチェックすることが重要です。ジャンクションで糸くずのないワイプを穏やかに塗布し、フェルールを通して液体の漏れを明らかにするのに役立ちます。500°Lのガスタイトな注射器に薬物をロードし、空気を圧縮し、ドラッグポンプに入れます。マイクロインジェクストローデから数滴が流れるまで50μL/分で流れます。ガイドチューブをクロルヘキシジン(20g/Lで溶解)に15分間浸します。出力バルブの方向を「フラッシングライン」に向けます。ルーラーラインに色と油の明確なエッジが観察されるまでマーカーポンプを進めます。2つの水溶性材料を混合し、それらの間の鋭いエッジを失わないように、薬物と色の間に常に油があることを確認してください。このオイル/染料ラインの開始位置をマークします(テープまたはマーカーを使用)。出力バルブの方向を脳線に向けます。注:動物の取り扱い手順は、実験や実験によって異なります。以下のステップは、必要な外科的セットアップと硬を露出させるための準備が行われた後に行われる。実験に続いて、必要なすべての術後のステップは、制度的に承認されたプロトコルに従って実行されなければなりません。マイクロドライブを記録室に取り付けます。ガイドチューブを下げてデュラを貫通します。注:ガイドチューブは、皮質を損傷しないように、デュラ以上に浸透してはいけません。マイクロインジェクドを脳内の記録/注射のために部位の約2mm上に下げる。上部フェルール(突出マイクロ電極/バイオセンサー)を締め、金ピンを記録システムに接続します。マイクロインジェクストローデを標的部位に進め続ける。注:マイクロ電極がカニューレを超えて延びる距離を計算に含めるのを忘れないでください。nL/分)移動させます。目的のボリュームが注入されたら、出力バルブをフラッシュラインに向かって切り替えます。注:注入される体積は、標的とするモデル種および脳領域に基づいて変化する。流量が速いと神経組織に損傷を与える可能性があります。実験が完了したら、ガイドチューブ内にマイクロインジェクトを引き込みます(プローブを突き出したままにします)。次に、フラッシュするマイクロドライブを取り外します。5.1~5.5の説明に従ってマイクロ流体システムをフラッシュします。クリックして再利用の準備をします。質は注入の機能より速く落ちる。Results前眼球場(FEF)の可逆的不活性化のためのGABAaアゴニスト(ムスシモール)の注射を行い、動物は記憶誘導サッカデタスク11を行った。このタスクでは、動物が固定し、周辺の視覚ターゲットが提示される。動物は、目標の位置を記憶しながら固定を維持し、固定ポイントが消えると、報酬を受け取るために記憶された場所にサッカディック目の動きを実行します。マイクロインジェロードは、図1bの指示に従って構築されました。実験例の注入量は850nLであった。ムシモール注入に対する様々な場所および時間におけるメモリ誘導サッカデ(MGS)タスクの動作性能を図4に示す。最大のパフォーマンス欠損は、2~3時間の注入後に観察された。図1:マイクロインジェクストローデの段階的な製造。(a)マイクロ流体システムに依存しない使用のための構成。カニューレおよびプローブは、プローブの先端が所望の長さ(例えば、150μm)で突出できることを確認するために測定される。プローブはカニューレに前面にロードされます。カニューレはTジャンクションを通過し、下側に取り付けられ、Tジャンクションの中央に平らな端点が付いています。プローブのバックエンドは、トップフェルールを通って継続します。マイクロインジェクストローデは、各プローブ端子の金色のピンをはんだ付けし、それらの間に接着剤を追加して安定性を高めます。集録システムへの接続は、プローブの設計によって異なります。この例では、プローブは3つのリードを持つナノセンサです。(b)マイクロ流体システムで使用するための構成。マイクロインジェクストローデをマイクロ流体系に結合するために、T接合部の上部には毛細管チューブが使用される。プローブは、前面または背面にロードできます。マイクロ流体ラインは、3番目のTジャンクション開口部に差し込されます。この例では、マイクロ電極を使用しました。上部のフェルールを締めてマイクロ電極が突出したカニューレの先端のズーム画像を参照してください。建設で使用される品目のリストについては、材料表を参照してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。図2:マイクロ流体システム2バルブ構成により、マイクロインジェロードに向かう流れ方向、またはトラブルシューティング用のフラッシングラインに向かう流れ方向を制御できます。この回路は、キャピラリーチューブと標準フェルールを使用して接続された2つの3ポートバルブに依存しています。ガスタイトな注射器は、注入薬とマーカーを運び、注入するために使用されます。プログラム可能な注射器ポンプはシステムの自動フラッシュおよび薬物の負荷を可能にする。手動マイクロシリンジポンプは制御された注入および視覚化を可能にする。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。図3:注入能力の有無にかかわらず、油圧マイクロドライブへのマイクロインジェクドの取り付けステップ4.1:カスタムメイドのアダプタは、マイクロインジェクドをマイクロドライブに取り付けることを可能にします。本のネジでアダプタをマイクロドライブに取り付けます。2本のねじはアダプターにマイクロインジェクサンドを固定する。上部フェルールは、マイクロドライブのガイドチューブにマイクロインジェクトロードをロードする際にマイクロ電極/実験プローブの先端を保護するために、少なくとも2ターンはねじで外す必要があります。ステップ4.3:上からガイドチューブにマイクロインジェクトロードを挿入します。ステップ4.4:マイクロインフュージョンを行う場合は、プラスチックフェルールを使用して第3のT接合開口部に薬物ラインを差し込みます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。図4:FEFにおけるムシモール注入中のメモリ誘導サッカデタスク(a)マイクロインジェロードを右半球、FEF領域に配置した。タスク中の動作パフォーマンス。MGSタスクの4ブロックを、注射前後3回で実行しました。極プロットは、固定点(極プロット上の角度)に対して異なる位置のパフォーマンス(偏心)を各時間(色)で示します。射出後の左視覚ヘミフィールド2時間で性能が明らかに低下した(青い痕跡、極プロットの左半分)。(c)FEFにおける8つの周辺記憶位置(左)およびムシモール注射後(右、1および3時間のポスト注入)に対するサッカデトレース。左視覚ヘミフィールド(極プロットの左半分)のサッカデ精度は、ムシモール注射後に減少した。度単位でスケールします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。電気生理学を行うために利用可能です。当社のシステムは、独立して、または薬物注入と組み合わせて記録に使用する柔軟性を有し、ナノセンサーやマイクロ電極などの脆弱な実験プローブを、デュラ・マターおよび神経組織を介して損傷から保護する能力を有することを目的としています。小さい直径12の圧力注入のためのより専門的なシステムがある。これらのシステムでは複数の記録サイトが可能ですが、システムの制御に必要なソフトウェアとハードウェアの複雑なセットアップは、各コンポーネントのコストが高く、まだ大規模に製品化されていない実験プローブとのインタフェースの柔軟性が低くなります。当社の注入は慢性インプラントを必要とせず、化学的および電気生理学的信号を測定するバイオセンサーと互換性があり、これらの応答に対する局所的な薬物注入の効果を測定する可能性を有する薬物を注入することができるという大きな柔軟性を提供します。この設計により、プローブの構造の損傷を避けるために、試験的なプローブをデュラ浸透後に突出させることができます。この特徴は、装置の多機能性を可能にし、ナノメートルスケールナノセンサ10などの任意の実験プローブの損傷を危険にさらすことなく硬部に浸透することを可能にする。突出し可能な長さの制限があり、フェルールの回転数によって制限され、標準フェルールに対して〜1mmに制限される。小さなカニューレの直径(228μm)による組織損傷は最小限です。我々が示した実験では、このシステムは、FEFの可逆的な不活性化のためのムシモールの制御された送達を行うために使用され、同時に電気刺激または細胞外記録(単一ニューロン、局所電位)を用いて電極。FEFのこの実験は、不活性化の前にサッカデベクターを確認するためにFEFの微小刺激を必要とし、可逆的なFEF不活性化中にワーキングメモリを研究するために薬物が注入された。同じ単離された単一ニューロンからの記録が薬物注射の前後に維持される可能性は低い;しかし、注入前後の局所的な電位を記録することができました。組み合わせた実験を示す。セットアップされると、この方法は非常に信頼性が高く、堅牢です。小さなチューブやポート内の小分子(例えば塩)の沈殿により、マイクロ流体を障害物や漏れのない状態に保つために、各実験の後に徹底的なフラッシングが必要です。回路全体のシンプルさにより、各コンポーネントを個別に交換してトラブルシューティングを容易にします。いくつかの組み合わせが望まれる他の脳領域に適用することができる。Disclosuresなし。資金提供によって支えられたユタ州の、ヘンリー・サミュエリ工科大学とカリフォルニア大学アーバイン校電気工学科がR.E.に提供したスタートアップ資金。この方法は、ヌドゥースト&ムーア2011、神経科学メソッドのジャーナルに掲載されたティリン・ムーア博士の研究室で開発された同様の方法の以前のレポートに基づいています。著者たちは、原稿に関する彼女のコメントにケルシー・クラーク博士に感謝します。gdpr@jove.com.。