6194)により得られる組換えレンチウイルス液は、通常濃縮することなく直接標的細胞への感染に使用できる。Y30010)を用いて培養したヒトiPS細胞に組換えレンチウイルス液で遺伝子導入し、iPS細胞クローンを効率良く選択した結果を示す。Y30010)の標準プロトコールで前培養し、培地に馴らした後、実験に供した。632180)にコトランスフェクションして、培養上清中にAcGFP1発現レンチウイルスベクターを産生した。μmフィルターで濾過して細胞屑を除いたものをウイルス液として、小分け分注後、凍結保存した。IFU/mL以上の高力価ウイルス液を取得できる。DEF-CS培地(GF-1、2、3添加)の条件で播種した。各々の細胞について2プレート準備し、一晩培養した。μg/mlとなるようにポリブレン溶液を添加後、各ウイルス液量を細胞に添加した(表1参照)。CO2インキュベーターに静置した。ml/well)、培養を続けた。ml/well)、培養を継続した。4]感染開始から72時間後の細胞を回収し、フローサイトメーターでAcGFP1発現細胞を計測した(図1)。シングルセルクローニングAcGFP1発現ユニットを染色体に1コピー持つiPS細胞株の樹立のため、以下のクローニング作業を実施した。Puromycinによる導入細胞の薬剤選択をおこなった。cells/wellで播種した。ChiPSC12株)に高効率でAcGFP1遺伝子を導入できた。遠心処理を追加することで感染効率は27倍以上向上した。ヒトiPS細胞への遺伝子導入と細胞クローニング(A)実験概要を示す。AcGFP1陽性率が20%以下の感染条件(遠心処理無し、1:100~1:2700)で得られた細胞をPuromycinで薬剤選択することで主に1コピーが挿入された細胞集団を作製後、6ウェルプレートにウェルあたり100個の細胞を播種し、翌日から細胞観察を実施、クローン候補を選択した。(B)選択クローンが、シングルセルから増殖していく様子を継時的に示す。Systemを用いてシングルセル継代したiPS細胞は、レンチウイルスベクターにより高効率で遺伝子導入可能なことがわかりました。導入細胞を希釈倍率を上げて分散することで、独立した1細胞から遺伝子導入クローンを容易に樹立することができました。