注1)の患者さんからiPS細胞技術を利用して骨格筋細胞を作製し、DUX4という遺伝子がFSHDの骨格筋細胞では発現量が多いことを確かめた。酸化ストレスがDUX4の発現を増加させていることを発見し、ゲノム編集によってそのDUX4発現の増加を抑えることに成功した。酸化ストレスがDUX4を増加させる過程で、DNA損傷応答シグナル注2)が介在していることを突き止めた。ジストロフィー(FSHD)は遺伝性の進行性筋ジストロフィーですが、骨格筋に毒性をもたらすDUX4という遺伝子の異常発現が原因と考えられています。注3)のクロマチン構造注4)の変化という細胞内の異常で発現しますが、細胞外の要因でDUX4の発現が変わり得るのかは分かっていませんでした。准教授(京都大学CiRA同部門)らの研究グループは、FSHDの患者さん由来iPS細胞から作製した骨格筋細胞を用いて、酸化ストレスがDUX4の発現を増加させていることを確かめました。由来骨格筋細胞にCRISPR/Cas9注5)を使ったゲノム編集を行い、酸化ストレス状況下においてDUX4を抑制させることに成功しました。酸化ストレスからDUX4の発現までの機構にDNA損傷応答シグナルが介在していることを突き止めました。これらの結果は、過運動、筋損傷や炎症などがもたらす酸化ストレスが、FSHDの進行を促進させる外的リスクファクターの1つであることを示唆します。Genetics」でオンライン公開されました。(FSHD)は進行的に筋肉の変性やそれに伴う筋力低下をもたらす遺伝性の病気です。FSHDのタイプには2種類あり、"FSHD1"は第4番染色体のテロメア(4q35)のゲノム配列(D4Z4)の反復の短縮(10復以下)を起因とし、"FSHD2"はFSHD1以外の複合因子を起因とします(D4Z4反復配列数は健常の範囲だが比較的短いのに複合してSMCHD1などのクロマチン制御因子注6)の変異が伴う場合など)。健常のD4Z4反復配列ではDNAが高度にメチル化注7)されていますが、FSHD1やFSHD2ではそれぞれのゲノム異常によってDNA低メチル化を伴うクロマチン構造の変化が起こり、DUX4の転写が活性化されます(図1)。これまでの臨床研究や遺伝学研究により、このDUX4の発現がFSHDの原因であると考えられていましたが、細胞内のクロマチン構造の変化のみならず、細胞外の要因によりDUX4の発現が促進されるのかは分かっていませんでした。酸化ストレスはこれまで骨格筋機能に影響を及ぼすストレスの一つとして注目されており、臨床学的研究によりFSHDに何らかの形で寄与していることは示唆されていましたが、酸化ストレスとDUX4の発現を結びつける研究は行われていませんでした。図1:第4番染色体のテロメア(4q35)のゲノム配列の比較(健常の場合とFSHDの場合)健常アレルのD4Z4反復配列ではDNAが高度にメチル化されているが、FSHD1やFSHD2のFSHDアレルでは、それぞれのゲノム異常によってDNA低メチル化を伴うクロマチン構造の変化が起こり、DUX4の転写が活性化される。結果として骨格筋の変性が起こりFSHDの発症となる。骨格筋細胞を作製し、DUX4という遺伝子がFSHDの骨格筋細胞では発現量が多いことを確かめました。本研究では、まず、FSHD1患者さんとFSHD2患者さん、そして健常者の体細胞からiPS細胞を作製し、それぞれを骨格筋細胞へ分化させました(図2A)。図2:健常者(HC)とFSHD患者さん(F1とF2)から作製した骨格筋細胞(A)健常者(HC)とFSHD患者さん(FSHD1患者さん:F1、FSHD2患者さん:F2)のiPS細胞から作製した骨格筋細胞の免疫蛍光染色画像(MyHCは筋繊維を示す)。どちらも同程度の骨格筋分化状態を示している。スケールバーは500μm。(B)HC、F1、F2におけるDUX4の発現量の比較。骨格筋細胞への分化前が青色バー(Day0)、分化後が赤色バー(Day8)。2)酸化ストレスがDUX4を増加させていることが分かりました。ゲノム編集により酸化ストレス状況下においてDUX4増加を抑えることに成功しました。次に、健常者とFSHD患者さん由来の骨格筋細胞に酸化ストレスを付加するとDUX4の発現に影響があるか調べるため、酸化ストレスとして過酸化水素(H2O2)を用いて刺激を加えました。それぞれの骨格筋細胞を過酸化水素100μMの下で24時間培養すると、DUX4の発現量がFSHD患者さん由来細胞において明らかに増加することが分かりました(図3A)。酸化ストレスによるDUX4の発現量の増加が、FSHDの原因遺伝子の一つであるSMCHD1の変異によるものなのか調べるため、FSHD2患者さん由来骨格筋細胞のSMCHD1をCRISPR/Cas9を用いてゲノム編集し、変異を修復しました。ゲノム編集した細胞に過酸化水素の刺激を加えると、ゲノム編集する前の細胞に比べ、DUX4の発現量が抑制されていることが確認できました(図3B)。これらの結果から、DUX4の発現量は酸化ストレスの増加量に依存し、FSHD2においては疾患原因の一つであるSMCHD1の変異とも関連があることが分かりました。酸化ストレス付加後のHC、F1、F2の骨格筋細胞におけるDUX4の発現量の比較。#1、#2はそれぞれの骨格筋細胞のクローンを示す。F2骨格筋細胞とIC骨格筋細胞のDUX4発現量の比較。酸化ストレスがDUX4を増加させる過程で、DNA損傷応答シグナルが介在していることを突き止めました。過酸化水素の刺激はDNAの損傷も含めて細胞にさまざまな影響を与えます。最後に、DNA損傷応答シグナルが酸化ストレスからDUX4の増加の間に関わっているのか調べました。先の実験で、DUX4の発現の増加は酸化水素の刺激から12時間後ごろに始まり、6時間後の時点ではまだDUX4の増加が始まらないことが分かっています。DUX4の増加が始まる前の過酸化水素の刺激から6時間後のFSHD骨格筋細胞において、DNA損傷応答シグナルの指標であるγ-H2AXの発現量が増加されていることが確認されました。過酸化水素の量にも依存していることが分かりました(図4)。これらの結果から、DUX4の発現量が増加する前にDNA損傷応答シグナルが発せられていることが分かり、酸化ストレスがDUX4を増加させる過程でDNA損傷応答シグナルが介在していることを突き止めました。突き詰めると、DNA損傷応答シグナルを伝達する中心的な役割を持つ物質ATMが関わっていることが分かりました(図5)。図4:過酸化水素の量の変化におけるFSHD骨格筋細胞(FSHD1患者さん由来)のDNA損傷応答シグナル(DUX4発現が増加する前)DUX4の増加が始まる前の過酸化水素の刺激から6時間後のFSHD骨格筋細胞において、DNA損傷応答シグナルの指標であるγ-H2AXの発現量が過酸化水素の量に伴い増加されていることが確認できる。図5:ATMを阻害した場合のFSHD骨格筋細胞(FSHD1患者さん由来)におけるDUX4発現量の比較グラフ。赤色バーは酸化ストレス付加後を示す。点線より右側がATMを阻害した場合(5、10、20μMの阻害薬)を示す(p値は酸化ストレス付加後阻害薬無しとの比較を示す:*p<0.05)。ATMを阻害すると、阻害する前と比べDUX4の発現が抑制されていることが分かる。本研究の意義と今後の展望FSHDは遺伝性の病気ですが、患者さんによって症状の進行具合にばらつきがあることから、何らかの外的要因があることが提唱されていました。今回の研究は、初めて、疾患特異的iPS細胞を用いてFSHDの原因遺伝子DUX4が外的刺激:酸化ストレスによって増加されることを示しました。酸化ストレスがDUX4を増加させる過程で、DNA損傷応答シグナルが介在していることが分かりました。これらの結果から、FSHD患者さんにとって、活性酸素を産む生活習慣や食生活、またDNAを損傷させ得るさまざまなストレスがFSHD発症の外的リスクファクターとなることを示唆します。本研究で用いた疾患特異的iPS細胞を用いたFSHDモデルは今後、さらなるFSHD疾患に対する創薬開発などの研究において有用であると考えられます。ジストロフィー(FSHD)は、比較的遅い発症年齢であること(一般的に10代の時期)、筋力低下に左右差が見られること、患者さんによって症状の進行具合にばらつきがあることから他の筋ジストロフィーに比べ特殊な疾患であるとされている。FSHDは主として第4番染色体のテロメア(4q35領域)近傍にあるゲノム反復配列の短縮を伴うことが知られている。ゲノム反復配列の短縮等の結果ゲノム構造に変化を来し、本来の骨格筋細胞では発現していないDUX4という遺伝子が異常に発現されて細胞に悪影響をもたらすと考えられている(下図)。注2)DNA損傷応答シグナルDNA損傷を受けた時に細胞が発するシグナル。DNA損傷が発生した場合、DNAが損傷を抱えたまま複製や細胞分裂が行われないよう、細胞はDNA損傷応答シグナルを発して増殖を一時的に停止してDNA損傷の修復を行う。Mutated)はDNA損傷応答シグナルを伝達する中心的な役割を持つ物質である。注3)テロメア染色体の末端部の構造。繰り返し配列を持つDNAとさまざまなタンパク質から構成される。注4)クロマチン構造DNAとタンパク質から成る複合体の構造。構造の変化に伴い遺伝子の活性化、不活性化に関与するので、塩基配列の変化に依らない遺伝子発現の機構(エピジェネティクス)制御の基盤となる。Repeat)という塩基配列とCas9というDNA切断酵素と、切断させたい場所へとCas9を誘導するガイドRNAを使うことで、任意の場所のDNAを切断することができる。ゲノム編集技術の一つ。注6)クロマチン制御因子クロマチン構造を制御する役割を持つ因子。哺乳類の場合、DNAのシトシン塩基の5位末端の水素(-H)がメチル基(-CH3)に置き換わることをいう。遺伝子の発現が活発になることが知られている。iPS細胞研究基金お問い合わせ。