ウイルスタンパク質リザート(総体積5mLで1mg/mL)を前文M2アフィニティビーズに添加する。リシスバッファを使用して総体積を調整します。反応を3時間インキュベートし、4°Cで回転させる。μg)のアリコートを保存します。ポストIPリサートのタンパク質濃度を測定します。バッファを追加します。95°Cで10分間沸騰させ、-20°CでポストIPサンプルを保存します。μLのリシスバッファーでM2ビーズをすすいで、4°Cの回転子でビーズを5分間洗い、M2ビーズを820xgで5分間洗い、上清を捨てます。5.7の手順を繰り返し、4°Cの回転子でさらに2回の洗浄を5分間行います。3回目の洗浄後、長いゲルローディングチップを使用してM2ビーズ/co-IP複合体からリシスバッファーの痕跡を取り除きます。注:リシスバッファーの微量を除去する前に、ゲルローディング先端の端を平らなピンセットでつまみます。これにより、M2ビーズの破壊と取り込みが防止されます。サンプルを95°Cで10分間沸騰させます。2つの別々のSDS-PAGEゲル(1つのゲルは西洋免疫ブロッティング用、もう1つのゲルはクーマッシー染色用)に溶出します。mLチューブに以下の試薬を混合して15%SDS-アクリルアミド溶解ゲルを2個投動(最終容積40mL、4ゲル分):4.16mL、アクリルアミド15mL:ビサクリアミド(29:1)、10mLの1.5ML(8.M.8)。50mLチューブを数回反転して溶出ゲルを混ぜます。溶像ゲル混合物を、あらかじめ洗浄された西洋ゲル装置(4つのゲル-西洋免疫ブロッティング用3個、クーマッシー/銀染色用1個)にピペットする。ゲル混合物の最上層をカバーするのに十分な水を穏やかにピペット。溶解ゲルを重合させる。余分な水を吸収するために、繊細なタスクワイパー(材料の表を参照)を使用して、溶解ゲルから水層を注ぎます。mLチューブを数回反転して積み重ねゲルを混ぜます。溶像ゲルの上の積み重ねゲル混合物を装置の上部にピペットする。適切な数のレーンを含むゲルカセット櫛を積み重ねゲルに入します。繊細なタスクワイパーを使用してゲル混合物のオーバーフローを吸収します(材料の表を参照)。積み重ねゲルが完全に重合することを許可します。EDTA)でウェスタンゲル装置をフラッディングします。積み重ねゲルからゲルカセット櫛をそっと引っ張ります。1x西部のランニングバッファが荷重ウェルを埋めることを許可します。サンプルをロードする前に注射器を使用して、1xウェスタンランニングバッファで各ウェルをフラッシュします。ウェスタン免疫ブロットサンプルを各対応ゲル(入力サンプル、共免疫沈殿サンプル、およびポストIPサンプル)にロードします。西洋ゲルタンパク質マーカーをロードします。クーマッシー/銀染色用の共免疫沈殿サンプルを別のゲルにロードします。西洋ゲルタンパク質マーカーをロードします。ランニングゲル装置を電源に接続し、ローディング色素が溶出ゲルに達するまでゲルを100Vで動かします。荷重色素が溶出ゲルの底に達するまで電圧を140Vに上げる。西洋ゲル装置を分解する。積み重ねゲルをスライスして捨て、溶解ゲルをそのまま残します。mMトリス、194mMグリシン、0.005%SDS、20%メタノール)で満たされたきれいなトレイにそっと移し、15分間浸します。ゲル転写装置を以下のように組み立てる。PVDF転写膜3枚とフィルターペーパー6枚(材料表参照)を溶出ゲルの大きさに切ります。PVDF膜をメタノールに5分間浸し、5分間水に水を入れ、使用する準備ができるまでPVDF膜を西部転写バッファーに入れます。ゲルホルダーカセットを、西側の転送バッファーで部分的に充填されたガラスベーキングトレイに入れ、下部に黒い面を置きます。ゲルホルダーカセットの黒い側面に対して西洋の転送バッファで浸した泡パッドを置きます。西洋の転送バッファにフィルターペーパーを濡らし、泡パッドの上に置きます。溶解ゲルをフィルターペーパーの上に置きます。注:PVDF膜に転送する正しいローディング方向に溶溶解ゲルを配置します。溶解ゲルの上に1つのPVDF転写膜を置きます。西洋の転写バッファーでフィルターペーパーを濡らし、PVDF転写膜の上に置きます。フィルターペーパーの上に西洋の転送バッファを浸した別の泡パッドを置きます。ジェルホルダーカセットの白い側面を、浸した泡パッドの上に慎重に折りたたみます。カセットをしっかりとロックします。ゲルホルダーカセットを転写装置電極アセンブリに入れておきます。転送装置タンクをウェスタン転送バッファで充填します。攪拌棒を装置タンクに入れます。装置タンクを攪拌プレートの上に置きます。攪拌の設定を5-6に調整し、攪拌バーが立ち往生したり、ゲルホルダーカセットに当たっていないことを確認します。ゲル転写装置を電源に接続し、100Vで1時間4°Cでゲルを移します。免疫ブロッティングゲルホルダーカセットを取り外し、黒い側面をきれいなガラスベーキングトレイに当てはめます。カセットを開き、泡パッドとフィルターペーパーを慎重に捨てます。PVDF膜の角にマークを付け、正しい荷重方向を特定します。膜を濡らしておいてください。注:PVDF膜は空気乾燥され、きれいな密閉容器に貯えることができる。ステップ7.3.2を繰り返すことによって膜を水分補給する。TBS、および0.1%のツイエン20)に入れます。室温(18~20°C)で1時間の緩やかな揺れで膜を遮断します。kDaタンパク質マーカーの上の膜を横切って切断します。1(1:500希釈)を含む遮断溶液中に配置する。一晩ブロックし、4°Cで揺れる。膜の底部を、25kDaより小さいタンパク質バンドを含む、M2マウスモノクローナルIgG1を含む遮断溶液中に置く(1:1,000希釈、材料の表を参照)。一晩ブロックし、4°Cで揺れる。TBS、0.1%ツイエン20)の25mLで10分間膜3xを10分間洗浄します。1-HRP(1:5,000希釈)で膜を内温で1時間のブロッキング溶液で定熱します。mLで10分間膜3xを洗浄します。化学発光ウエスタンブロッティング基板を調作する。p1000マイクロピペットを使用して、基板を膜に追加します。化学発光ウエスタンブロッティング基板で各膜を5分間開発し、基板から膜を取り除きます。繊細なタスクワイパーを使用して余分な基板を吸収します(材料の表を参照)。カセットの内側にテープで留めたクリーンシートプロテクターに膜を置きます。暗い部屋にカセットを取り、カセットにフィルムの1枚を置きます。カセットを所定の位置にロックし、5~15分間インキュベートします。西洋ゲル装置を分解する。積み重ねゲルをスライスして捨て、溶解ゲルをそのまま残します。溶真量ゲルを25mLの超純水で満たされたきれいなトレイにゆっくりと移します。ロッキングプラットフォーム上でゲルを15分間インキュベートし、穏やかな揺れでゲルが壊れないようにします。超純水を捨て、洗浄工程を2倍以上繰り返します。注:SDS気泡が洗浄工程後に残っている場合、ゲルは一晩超純水で洗浄することができます。残留SDSは、ゲルの高いバックグラウンド染色を引き起こす可能性があります。ボトルを反転してクーマッシー染色試薬を混ぜます(材料の表を参照)。mLのクーマッシー染色試薬を置き、溶解ゲルを覆い、1時間のロッキングプラットフォーム上でゲルをインキュベートし、クーマッシー染色試薬を捨て、15分間ロッキングプラットフォーム上の脱イオン水でゲルを洗います。洗浄工程を2倍以上繰り返します。タンパク質バンドの所望の分解能が観察されるまでゲルを洗浄し続けます。西洋ゲル装置を分解する。積み重ねゲルをスライスして捨て、溶解ゲルをそのまま残します。溶真量ゲルを25mLの超純水で満たされたきれいなトレイにゆっくりと移します。ロッキングプラットフォーム上でゲルを15分間インキュベートし、穏やかな揺れでゲルが壊れないようにします。超純水を捨て、洗浄工程を2倍以上繰り返します。注:SDS気泡が洗浄工程後に残っている場合、ゲルは一晩超純水で洗浄することができます。残留SDSは、ゲルの高いバックグラウンド染色を引き起こす可能性があります。30%エタノール:10%酢酸溶液(6:3:1水:エタノール:酢酸)で一晩室温でゲルを固定します。10%エタノール溶液で10%のエタノール溶液で5分間室温で洗浄します。エタノール溶液を交換し、さらに5分間洗浄します。ピアスシルバーステインキットから500部の超純水(50μLの超純水で50μLの感作剤)を混合して、ピアスシルバーステインキットから感作剤加工液を調製します。感性作動液中の溶剤を1分間インキュベートし、ゲルを超純水で1分間洗浄し、水を交換し、再度1分間洗浄します。μL)と一部の銀染色エンハンサーを混合して汚れ作業液を調製します。染色作業液中のゲルを30分間インキュベートします。μL)を混合して、開発者の作業ソリューションを準備します。停止溶液として5%酢酸溶液を調出す。ゲルを超純水で1分間洗い、水を交換し、さらに1分間ゲルを洗います。水を開発者の作業溶液に置き換え、所望のタンパク質バンド強度が解決されるまでインキュベートします(5分)。開発者の作業ソリューションをストップソリューションに置き換え、10分間インキュベートします。インゲル還元、アルキル化、クマシー染色ゲルバンドの消化きれいなかみそり刃を使用してゲルバンドをカットします。mLマイクロ遠心管に入れます。ゲル片を1:1アセトニトリルで100mMの重炭酸アンモニウムで覆って汚し、室温で15分間水を下します。この手順を繰り返します。ゲル片を真空遠心分離機で5分間乾燥させます。乾燥したゲル片を10mMのジチオスレイトールで10mMの重炭酸アンモニウムで覆い、56°Cで1時間インキュベートしてタンパク質を減らします。上清を切り落とすピペット。100mMのヨウドアセタミドでゲル片を水で覆い、暗闇の中で室温で1時間インキュベートしてタンパク質をアルキル化します。上清を取り除き、アセトニトリルで覆い、室温で15分間ゆっくりと振ってゲル片を細かくし、重炭酸アンモニウムで覆って振ることでゲル片を再膨大にする。室温で15分間ゆっくりとお待ちください。ゲル片を真空遠心分離機で5分間乾燥させます。ゲル片を50ng/μLシーケンシンググレードで覆い、重炭酸アンモニウム100mでリプシン(材料の表を参照)を変更します。ゲルが5分間膨るのを許可します。その後、残りの溶液をピペットオフします。ゲル片を100mMの重炭酸アンモニウムで覆い、完全に再膨大にし、ゲル片が完全に覆われているように100mMの重炭酸アンモニウムを追加します。ゲル片を37°Cで一晩インキュベートします。水に10%ギ酸の体積の1/10を加えて反応を停止します。各チューブから上清を収集します。60%のアセトニトリルで1%のギ酸で覆い、穏やかな振りで15分間インキュベートすることによってゲル片を抽出します。真空遠心分離機で結合した上清の体積を20μL未満に減らし、上清を完全に乾燥させないように注意してください。1%のギ酸を加えて総体積を20μLに戻します。注:サンプルは、超HPLC、ナノスプレー源、およびカラムを備えた質量分析計を用いて分析した(材料の表を参照)。溶媒AとBは、それぞれ水中のギ酸とアセトニトリルで0.1%である。消化されたタンパク質を高回収ポリプロピレンオートサンプラーバイアルにロードします。バイアルをUPLCシステムのサンプルマネージャにロードします。μL/minで1.5分間ロードし、99%溶媒A/1%溶媒Bを使用します。ペプチドを30分間にわたって溶媒Bの3%から35%の線形勾配で質量分析計に溶出し、次いで溶媒Bの35%から50%、溶媒Bの50%から90%を1分間にわたって3分間維持する。正イオンプロファイル質量スペックデータを解像度(20,000解像度)モードで取得します。Daのデータを取得し、衝突エネルギーのないスキャンと高い衝突エネルギーでスキャンすることで、MSEモードでデータを取得します。1]-フィブリノペプチドBの+2イオンを使用して、30秒ごとにロックマススキャンを取得します。溶媒Aのブランク注入を用いてデータファイルを取得し、各サンプルのペア間で同じ取得方法を使用して持ち越しを制御する。質量分析結果ファイルを、定量的および定性的なプロテオミクス研究プラットフォーム(ProteinLynxグローバルサーバ)を実行しているコンピュータにコピーします。集中的に使用するため、別の高性能データ分析コンピュータで実行する必要があります。データの新しいプロジェクトを作成します。オートサンプラープレートを表す新しいマイクロティタープレートを作成します。サンプルをマイクロティタープレート内の同じ位置にオートサンプラー内の位置に割り当てます。各サンプル処理パラメータを割り当てます。使用するパラメータは、自動クロマトグラフィーピーク幅とMSTOF解像度です。低エネルギー閾値、100カウント。パラメータを割り当てます。使用するパラメータは、データベース、連結人間のSwissProtとHIV、逆のシーケンスです。M;偽の発見率、100。サンプルを選択し、[最新の生データを処理]を選択します。スキャフォールドを開き、新しいファイルを作成し、前駆体イオン定量を使用して新しいバイオサンプルとしてプロテオミクスプラットフォームからエクスポートされた各ファイルをインポートします。すべてのファイルがインポートされた場合は、[データの読み込みと分析]画面に進みます。スコアリングと標準的な実験全体のタンパク質グループ化を使用して、検索データとインポートデータに使用するのと同じデータベースを選択します。表示オプションをタンパク質同定確率、タンパク質閾値を20%、ペプチドの最小数を1に、ペプチド閾値を分析中に0%に設定します。cDNA-flagと比較して細胞宿主因子と相互作用する能力において検討された。ベクターはHLfB培養において発現した。タンパク質複合体を全細胞リサートから処理し、銀染色試薬で染色した。NaCl)を含むリシスバッファーでは検出不能であった。M1-3'フラグ、およびpcDNA-フラグベクターがHLfB培養で発現した。NaCl)から調製した全細胞座から処理した。M2マウスモノクローナルIgG1は、細胞リサテからのRev-3'フラグ発現の検出に用いられた。M1-3'フラグとの親和性が失われました。NaClを含むリシスバッファー中の塩濃度が高いほど減少した。IPにおける非特異的免疫検出を得られなかった。用に最適化されました。Rev-3'フラグおよびpcDNA-フラグベクターは、HLfB培養において発現した。kDa)を根絶するために3つの異なる条件を使用して、3つの異なる条件を使用して、15分間37°Cの2xサンプルローディングバッファ、95°Cでの2xサンプルロードバッファを3分間、3倍フラグペプチドで照水した。kDa)は、2倍のサンプル負荷バッファーで沸騰を通じて溶出した後に最も検出可能であった。3分間の2xサンプルローディングバッファで37°Cインキュベーション、2xサンプル読み込みバッファーで95°Cインキュベーションを3分間行った。M2(局在化における核/核核、HIV-1HXB2産生における非機能)、M6(パターン中の核胞、HIV-1HXB2産生における機能性)、およびM9(細胞質/核に分散し、ウイルス産生における非機能的)HLfB文化で表現されます。タンパク質錯誤物を全細胞液質から処理し、2xサンプル負荷バッファーで95°Cインキュベーションを通して3分間再生し、銀染色試薬で分解した(図4)。Revは、IPフラグ反応後に検出可能であった。kDaで検出可能であった。B23タンパク質に対応するバンドは37kDaマーカーで観察された。Rev、M2、M6、M9、およびpcDNA陰性制御のIP反応に対応する各レーンでさらに観察された。タンパク質のライサットは、αフラグRevおよびB23に対する免疫検出により分析した。M2およびM9は、20μgのタンパク質リサート入力から高度に発現しなかったが、5mgのタンパク質リサートからフラグIP後の低強度で検出可能であった。IPにおける非特異的免疫検出を生じなかった。RevとのB23親和性は、IPフラグ反応後に観察された(B23共IP)。B23親和性は、M2(2つの単一点突然変異R48,50G)およびM6(単一点突然変異R50G)でわずかに観察された。B23アフィニティは、Rev-NoLS内のM9(R46,48,50G)の3つの単一点変異の存在下で失われました。RevおよびRev-NoLS-3'フラグ変異(4、5、6、および8)からの総リサテを処理し、クマシー試薬で染色し、BSAシリアル希釈(右パネル)と比較して可視化した。cDNA-flagを、クマシー試薬で染色したSDS-PAGEゲルで可視化した(図7)。Rev(WT1およびWT2)は、18kDaでのIPフラグ反応後に検出可能であった。Rev-NoLS変異は、HLfBおよびIPフラグ反応における発現後にわずかに検出可能であった。pcDNA陰性対照は18kDaで非特異的背景を得られなかった。cDNA-flag(図4に示す)をタンデム質量分析により分析した。Rev(表1)で起こるタンパク質相互作用の比較のために表示される。Rev.これらのヌクレオラールの直接的/間接的結合パートナーとして同定された。要因は、M2(2つの単一点突然変異R48,50G)、M6(単一点突然変異R50G)、およびM9(3つの単一点突然変異R46,48,50G)に対する結合親和性を失い、pcDNA陰性対照と同様である。図6のクマシー染色ゲルの各レーンは、アンデム質量分析のために処理された(表2)。Rev-NoLS変異に対するペプチド親和性を分析し、タンパク質同定確率(パーセンテージ)を用いて表示した。Revの直接的/間接的タンパク質結合因子として同定された。バインドするように識別されます。輸送因子ARHGEF1(rhoグアニンヌクレオチド交換因子1)およびTBC1D24(TCB1ドメインファミリー、メンバー24)は、Rev-NoLS変異の存在下で親和性が失われた。Revに結合するためにさらに観察された。mM、および300mM)で最適化されました。NaClはRev免疫沈殿およびB23結合に最適な塩濃度であった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。mMおよび200mM)で最適化されました。NaClはRev免疫沈殿およびB23結合に最適な塩濃度であった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。3:HIV-1産生時のRev-3'フラグ共IP溶出の最適化、銀染色により可視化。Rev-3'フラグおよびpcDNA-フラグIP中に調製した全細胞凝算物から処理した。37°Cでの2xサンプルローディングバッファーを15分間、95°Cで2xサンプルローディングバッファを3分間、30分間4°Cで3倍フラグペプチドを試験した。Revの最適な溶出条件は、37°Cの2xサンプル読み込みバッファーで15分インキュベーション期間後、および95°Cの2xサンプル読み込みバッファーで3分インキュベーション期間後に発生した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。HIV-1産生中のRev-3'フラグ変異2、6、および9の免疫沈殿。Rev、M2(R48,50G)、M6(R50G)、M9(R46,48,50G)、およびHIV-1複製の存在下で陰性コントロールpcDNA-フラグと直接的/間接的に結合したタンパク質複合体は、銀染色されたSDS-PAGEゲルに示されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。5:HIV-1産生中のB23免疫検出に対する変異2、6、および9のRev-3'フラグ共IP。Rev、M2、M6、M9、および陰性対照pcDNA-flagから調製したタンパク質は、αフラグRevおよびB23に対する免疫検出によりさらに分析した。Revおよび変異発現は、B23ヌクレオ細胞質タンパク質との相互作用と同様に、観察される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。Revおよびヌクレオラー局所化M4(R46G)、M5(R48G)、M6(R50G)、M8(ΔRQ)、および陰性対照pcDNA-flagを発現するHLfBからのIP反応は、BSAシリアル希釈を用いてタンパク質濃度について測定した。各サンプルについて12.5~25μgのタンパク質濃度が観察された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。HIV-1産生中のヌクレオラー局所的Rev-NoLS変異4、5、および6の免疫沈殿。Rev(1および2)、M4、M5、およびM6の免疫沈殿タンパク質複合体を含むクマシー染色SDS-PAGEゲルが示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。Rev、M2、M6、およびM9から調製したタンパク質溶出タンパク質を、タンデム質量分析により直接分析した。0表2:HIV-1産生中にヌクレオラー局所変異4、5、および6と複合体化した細胞宿主因子の同定。図6のクマシー染色SDS-PAGEゲルを、アンデム質量分析用に処理した。Revを比較した質量分析は、ウイルス複製サイクルに関与するヌクレオロール因子を理解するために評価された。これは、ウイルス感染に必要なヌクレオラー成分を同定するであろう。mRNA22のヌクレオ細胞局在化における機能を有する。単一または複数のアルギニン置換を含むRev-NoLS変異を有するB23の親和性は、ウイルス産生中のRev-3'フラグの免疫沈殿を通じて評価された(図2;WTおよび突然変異M2、M6、およびM9)。単一点Rev-NoLS変異M4、M5、およびM6に対するB23親和性は、HIV-1複製の存在下で以前に調べられた。前の研究では、M4、M5、およびM6のIP溶出剤を、RevおよびB23親和性1に対するαフラグに特異的な抗体を用いてウェスタン免疫ブロッティングを行った。Revシングルポイント変異の背景には、B23結合親和性が有意に減少した。Revとの親和性を維持した。mRNA結合および輸送を促進する他の細胞宿主因子との結合親和性を減少させる期待された。mRNA輸送の中断を示した。ヌクレオロール因子(ヌクレオリンC23およびヌクレオソーム組立タンパク質1)、輸送因子(ARHGEF1およびTCB1D24)、およびスプライシング因子(hnRNPCおよびPNN)がRevタンパク質複合体との相互作用を通じてHIV-1感染サイクルに関与している可能性が高い。C/Dボックス58、snoRNAに関与する処理は、ヌクレオールスへのsnoRNA輸送、およびリボソームRNAの2'-O-メチル化−HIV-1複製サイクルにおけるこのタンパク質の機能が未だ不明のままである。HIV-1感染サイクルにおけるこれらの細胞因子の特定の役割は、現在調査中である。ここで提示された結果は、HIV-1感染サイクルを維持するウイルス/宿主ヌクレオロール因子の同定にこのアプローチを使用することを示す。他の疾患モデルに関与するウイルス/宿主ヌクレオラー因子は、このアプローチを用いて同定することができる。1つの核因子が様々な疾患モデルにおいて多機能的な役割を果たしている可能性が高い。B23は、他のウイルス感染モデルにおけるヌクレオラーウイルスタンパク質の輸送、ウイルスアセンブリ、封入、複製、および遅延に関与している。B23は、ヌクレオサイトプラズム輸送のための細胞因子のNoLSとの相互作用において特徴付け-p120増殖因子(アミノ酸40〜57)23およびC23前rRNAプロセッサ(アミノ酸540〜628)24。Rev(アミノ酸37-47)26と相互作用することが文書化されている。日本脳炎ウイルス(JEV)ゲノムはヌクレオール局所タンパク質をコードし、アミノ酸Gly42およびPro43はJEV感染時にB23のN末端領域と相互作用し、ウイルスコアタンパク質/B23を中に輸送する。核27.B型肝炎ウイルス(HBV)の一本鎖RNAゲノムは、核コアタンパク質をコードする二本鎖DNAの一部で構成されています。HBVコアタンパク質は、核内の核オルオリンおよびB23と関連する28;B23は、コアタンパク質N末端ドメインとの相互作用を通じてHBVアセンブリで実証された。具体的には、B23アミノ酸259-294は、ウイルス封入29を可能にするHBVコアタンパク質のN末端ドメインに結合する。ネガティブセンス、一本鎖RNA型肝炎ウイルス(HDV)は、2つのアイソフォームでHDVAg抗原を発現する。RNA複製における小さなアイソフォーム補助具、および大きなアイソフォームはウイルスの組み立てを容易にする。RNA複製は核内で行われ、HDVAg30,31とのB23相互作用を必要とする。HDV感染はB23のアップレギュレーションを引き起こし、これは主に小さなHDVAgアイソフォームと相互作用し、大きなHDVAgアイソフォームとより少ない。NLSドメインを介して行われます。HdV結合部位をB23に削除すると、RNA複製が損なわれた。HDVAgは、核内のB23およびヌクレオリンと共局所化することが示された。ヌクレオリンは、リプレッサ32として転写特性を有することが発見され、HDV複製の調節のためのコンパートメントとして核を明らかにした。B23はまた、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)ゲノムの待ち時間にも関与している。KSHV潜伏タンパク質-v-サイクリン−宿主CDK6キナーゼを有し、Thr199でB23をリン酸化し、遅延関連核抗原33とのB23相互作用を促進する。遅延関連核抗原は、ウイルス溶解複製を防ぐために作用する。B23の枯渇はKSHV再活性化につながり、KSHV遅延のレギュレータとしてB23を明らかにする。HIV-1複製サイクルにおけるB23機能は、タットおよびRevのヌクレオ細胞質輸送活性において特徴付けられており、B23がHIV感染中に遅延を誘発できるかどうかは不明である。HIV-1の複製、カプセル化、および組み立てにおけるB23の関与は現在知られていない。この方法を他の疾患モデルに適応させるには、適切な細胞株で発現されるタンパク質欠損感染性バックボーンの生成に多大な労力と時間が必要となる。このRev欠損HIV-1HXB2バックボーンの利点は、完全なウイルスバックボーン、ウイルス感染因子、およびHIV-1複製サイクルに関与する宿主因子の存在下でRev-NoLS変異を調べる能力である。他の研究は、完全なHIV-1感染系の不在でRevヌクレオラー機能を調べました.感染症および疾患経路の徹底的な特徴付けは、疾患の進行の自然な経過をサポートする代表的な環境を含める必要があります。2種類の分析を行い、核因子を同定する能力を比較した。Revに結合したままであった因子を示す。Revのいくつかの既知の因子を生み出したこの直接的な方法は、SDS-PAGEゲル内で分離されたタンパク質の抽出およびそのようなタンパク質の質量分析分析を含む別のプロセスと比較した。4Bは、リボソームタンパク質L22、小ヌクレオールRNAC/Dボックス58B、及び11を含有する亜鉛フィンガーCCHCドメインである。最終的に、このプロトコルで質量分析分析に選択された優れた方法は、SDS-PAGEゲルからのペプチドの抽出を伴った。最初の直接方法は、ブロモフェノールブルーを含まない溶出液中の2xサンプルバッファを含んでいました。2xサンプルバッファーの残りの成分は、完全なトリプシン処理を妨げる可能性があり、質量分析分析のために不完全に処理されたペプチドを生成する可能性があります。第2の間接法は、SDS-PAGEの潜在的な汚染物質からトリプシン処理ペプチドを精製することができた。ここで説明する質量分析調製法は、標的化を通じてHIV-1感染を根絶するための治療的介入の同定に利用することができる。支配的な否定的な活動とRev関数の逮捕に利用される。関数停止に対する関心の主な負の特性は次のとおりです。mRNA輸送およびスプライシングに関与する主要な細胞因子との親和性の喪失。RevとRev-NoLS突然変異の共発現を伴うRev多量化を調べることができた。Revで多量化し、核および細胞質に向かってヌクレオラーパターンをシフトし、Rev機能停止につながると予想される。mRNAスプライシングおよび輸送に関与する主要な細胞因子の損失を同定するために使用することができる。Revとの欠損相互作用の同定は、HIV-1病因におけるヌクレオラー特異的経路の関与を明らかにするであろう。Rev-NoLS変異の背景で生成されたウイルスHIV-1NL4-3粒子は、すべての包装された細胞因子について調べることができる。ウイルス粒子内に包装された細胞およびウイルス因子は、質量分析を通じてさらに同定され得る。これは、ウイルス粒子内のヌクレオロール因子の存在とウイルス感染における同定されたヌクレオロール因子の役割を明らかにするであろう。記載された方法は、研究対象経路の同定および特徴付けのための他のウイルスおよび疾患モデルに適用可能である。これは、限られた治療が利用可能な疾患に対する治療介入の開発を可能にします。librarian.Disclosures著者は何も開示していない。Acknowledgments著者らは、国立衛生研究所(NIH)エイズ研究・参照試薬プログラム、エイズ部門、国立アレルギー・感染症研究所が提供するHLfB付着培養のためのバーバラ・K・フェルバー博士とジョージ・N・パヴラキス博士を認めます。NIH.著者らはまた、NIH、助成金AI042552とAI029329によって提供される財政源を認めます。gdpr@jove.com.。