FavoritesSummaryここでは、質量分析のためのHIV-1複製の存在下でのRev免疫沈殿について説明する。記載された方法は、HIV-1感染サイクルに関与するヌクレオラー因子の同定に使用することができ、研究中の経路の特徴付けのための他の疾患モデルに適用可能である。here.AbstractHIV-1感染サイクルは、ウイルスの複製、包装、および放出を容易にするために、宿主因子とのウイルスタンパク質相互作用を必要とする。RNAを用いたウイルス/宿主タンパク質複合体の形成を必要とする。mRNAの核輸出を達成する。核色の局在シグナル(NoLS)は、Revアルギニン豊富なモチーフ(ARM)のCOOH終位内に存在し、核内のRev/RRE複合体の蓄積を可能にする。核因子因子は、mRNAに依存しない核輸出およびスプライシングを媒介することに加えて、様々な他の機能を通じてHIV-1感染サイクルをサポートすると推測される。質量分析のためのHIV-1複製の存在下で、Revヌクレオラー変異(欠失および単一点Rev-NoLS変異)と比較して、野生型(WT)Revの免疫沈殿法について述べるとよ。ヌクレオ細胞性輸送に関与するヌクレオロール因子(ヌクレオホスミンB23およびヌクレオリンC23)ならびに細胞スプライシング因子は、Rev-NoLS変異の存在下でRevとの相互作用を失う。C/Dボックス58のような様々な他の核因子は、Rev変異との相互作用を失うことが同定されるが、HIV-1複製サイクルにおけるその機能は未知のままである。ここで提示された結果は、HIV-1感染サイクルを維持するウイルス/宿主ヌクレオロール因子の同定にこのアプローチを使用することを示す。このアプローチで使用される概念は、研究中の経路の特性を必要とする他のウイルスおよび疾患モデルに適用可能である。Introduction核は、ウイルス複製に必要な様々な細胞宿主およびウイルス因子の相互作用場として仮定される。核は3つの異なったコンパートメントに細分される複雑な構造である:フィブリラコンパートメント、密な線維のコンパートメントおよび粒状コンパートメント。Revタンパク質は、粒状コンパートメント内で特異的に局所化します。パターンの理由は不明です。1と比較して効率が低下した。.すべての単一点突然変異は、HIV-1NL4-3感染サイクルを維持することができません。NoLS配列内の複数の単一点突然変異(Rev-NoLS突然変異2および9)の存在下で、Revは核および細胞質全体に分散することが観察され、HIV-1HXB2複製1を救出することができませんでした。このプロテオミクス研究の目的は、Rev媒介性HIV-1感染経路に関与するヌクレオラーおよび非ヌクレオロール細胞因子を解読することです。Rev免疫沈殿条件は、ヌクレオラーB23リンタンパク質との相互作用を通じて最適化され、以前にヌクレオラー変異の存在下でRevとの相互作用を失うことが示されている。Rev細胞因子は、過去に広範囲に研究されています。これはウイルス病因の不在で行われている。HIV-1複製中のRev相互作用を介して本研究で特徴付けられた1つのタンパク質は、両生類2、3、両生類におけるヌクレオホスミン(NPM)、ヌマトリン、またはNO38とも呼ばれるヌクレオホスミンB23である。核核ホスミン/核オプラスミン核シャペロンファミリー5、6の全メンバー。17、18およびp5319の安定化に関与し、発生因子および腫瘍抑制剤としての二重の役割を明らかにする。NPM1は、ゲノム安定性、セントロソーム複製、転写の細胞活動に関与する。NPM1は、細胞周期間相中のヌクレオリ、有人化時の染色体周辺、および有分裂の終わりに核前核体(PNB)に見出される。NPM2およびNPM3は、悪性腫瘍20の間に発現レベルの変化を受けるNPM1ほどよく研究されていない。9、21を介した様々な核/核系タンパク質の核細胞質シャトルに記載されており、HIV-1タットおよびRevタンパク質の核輸入を促進することが以前に報告されている。B23-結合ドメイン-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質の存在下で、タットは細胞質内で誤局在化し、トランス活性化活性を失う。これはB232のためのタットの強い親和性を示す。別の研究は、RRE含有mRNAの不在でRev/B23安定複合体を確立した。RREに結合し、B2322の変位を引き起こす。mRNAに対するB23のタットトランス活性化およびRev交換プロセスがどこで起こるかは不明である。両方のタンパク質は、B23相互作用を介して同時に核に入ると仮定される。HIV核経路における他の宿主細胞タンパク質の関与が期待される。このプロテオミクス調査に記載されている方法は、HIV-1病因の間に関与する宿主細胞因子との核の相互作用を解明するのに役立つ。NoLS単点変異(M4、M5、およびM6)および複数のアルギニン置換(M2およびM9)の発現を通じて開始された。RevおよびRevヌクレオラー変異でトランスフェクトする。Rev(M4、M5、およびM6)1ほど効率的に起こらないことを可能にする。細胞リサートは、Rev発現の存在下でウイルス増殖後48時間後に収集され、Rev/B23相互作用用に最適化されたリシスバッファーを用いて免疫沈殿を行った。Revのタンパク質溶出方法を銀染色またはクマシー染色SDS-PAGEゲルで比較・分析する。Rev、M2、M6、およびM9からの放出サンプルの直接分析を含む。Rev、M4、M5、およびM6の溶出をゲル抽出プロセスを受けた第2のアプローチを、第1のアプローチと比較する。Revと比較してRev-NoLS変異に対するペプチド親和性を分析し、タンパク質同定確率を表示する。mRNA輸送およびHIV-1複製中のRevとのスプライシングに関与する潜在的な因子(ヌクレオールおよび非ヌクレオラー)を明らかにする。全体的に、記載された細胞溶解、IP、および溶出条件は、感染経路を活性化および調節する宿主細胞因子の理解のために目的とするウイルスタンパク質に適用可能である。これは、様々な疾患モデルの持続性に必要な細胞宿主因子の研究にも適用可能である。mRNA結合に関与するヌクレオロール因子を解明するためにB23相互作用用に最適化されています。目的の主要タンパク質に欠乏している感染症モデルを安定的に発現する細胞株は、HLfB細胞株と同様に、目的とする感染経路を研究するために開発することができる。L-グルタミン、および1mMのピルビン酸ナトリウムを組織培養処理100mmプレート内で補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でHLfBを維持する。°Cで細胞培養物を保つ。mLで細胞を穏やかにすすいですすいで下します。PBSを取り外して破棄します。単層をコーティングし、加湿室内で37°Cでインキュベートする皿を5分間ロックします。手のひらで皿の側面をしっかりとタップし、細胞を取り外します。切り離された細胞を8mLの新鮮培養培養培養に再停止させる。gで5分間回転させます。細胞ペレットを破壊することなく培養培養培養を廃棄する。細胞ペレットを10mLの新鮮培養培養培養に再ステープルする。mLを用いた濃縮細胞のサブ培養1mL。HLfBまたはHeLa培養プレートは、ウェスタンブロット分析および質量分析に十分なタンパク質リザートを得ます。正のコントロールと負のコントロール用に余分なプレートを追加します。サブ培養細胞量は、異なる細胞タイプを使用して最適化を必要とします。106細胞/mLの細胞密度に増殖させる。100mmプレート毎にリン酸カルシウム-DNA懸濁液を以下のように4mLずつ調製する。7.12])をチューブ1に追加します。