このような迅速な抽出方法は、プライマーが導入遺伝子とハイブリダイズするように設計されているため、潜在的な創始者を同定するのに十分である(しばしば、複数のコピーとしてated)。逆に、遺伝子標的化は、PCR産物が改変されたゲノム領域を包含するので、高度に精製されたゲノムDNAを必要とする。遺伝子ノックアウトのために、単一のsgRNAを注入する伝統的な方法は、小さな欠失(indels)または挿入を生成し、最終的に目的の遺伝子をノックアウトする。これらの小さな改変は同定が困難であり、これらの突然変異の性質を確認するために時間がかかるリガーゼ非依存性クローニングおよび配列決定をしばしば必要とする。このプロトコールでは、目的の遺伝子の開始コドンを含む2つのsgRNAの系統的同時注入を開発するために、CRISPR多重化を利用した。これは、遺伝子ノックアウトの可能性を高めるばかりでなく、所定のサイズ(100〜300bp)のゲノムDNAの塊を切除して、簡単なPCRによって創始者を容易に同定することを可能にする。注目すべきは、期待されるゲノムeを保有していない子犬1つのsgRNAのみが活性であると証明されたとき、小さなフレームシフト突然変異についてxcisionを分析することができる。優先的に2つの鎖39のうちの1つを使用するので、反対方向の2つの重複するsgRNAの体系的同時注入はHDRの効率を増加させるはずである。将来のアプリケーション現在のプロトコールは、ヒト発生条件の様々な洗練されたマウスモデルを生成するプロセスを単純化し合理化するために、マウス発生学および遺伝子標的化40の最新の進歩を利用する。これらのモデルは、最終的に治療戦略の開発を支援する、病理機構の理解を深めるのに役立ちます。遺伝子標的化またはランダム組込みに必要とされる試薬の最適化および合理化は、広くかつ容易に適用可能であるラット、ウサギのような他の哺乳動物種、さらにはウシのような大きな動物にさえも投与することができる。Centerを介して、マウスで学術的トランスジェニックサービスを提供しています。Acknowledgments著者らは、継続的な支援のために動物施設(BRC)のスタッフに感謝しています。とオーストラリア研究評議会によって資金提供された。gdpr@jove.com.。