トランスジーンのランダム組込み)およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。here.Abstract遺伝子改変マウスの使用は、生理学的および病理学的インビボプロセスの両方に関する研究に有意に寄与している。受精卵母細胞へのDNA発現構築物の前核注入は、過剰発現のためのトランスジェニックマウスを生成するために最も一般的に使用される技術のままである。遺伝子標的化のためのCRISPR技術の導入により、受精した卵母細胞への前核注入は、ノックアウトマウスとノックインマウスの両方に拡大されている。この研究は、注射用DNAの調製と、遺伝子ターゲッティングのためのCRISPRガイドの作成について記述しており、特に品質管理を重視しています。潜在的な創始者の同定に必要な遺伝子型決定手順は重要である。本明細書では、CRISPRの「多重化」能力を利用する革新的な遺伝子型決定戦略を提示する。手術手順も概説されている。その他を含む多数の研究分野のためのマウスコロニーのその後の確立のために使用される。Introduction脊椎動物および無脊椎動物の両方における動物モデルは、アルツハイマー病1,2などのヒト状態の病態生理学を調べるのに役立っている。彼らはまた、疾患修飾物質を探索し、最終的に治癒のために新しい治療戦略を開発するための貴重なツールです。各モデルには固有の制限がありますが、全身モデルとしての動物の使用は生物医学研究にとって不可欠です。これは、代謝および複雑な生理学的環境を組織培養において完全にシミュレートすることができないためである。今日まで、マウスは遺伝的操作のために使用される最も一般的な哺乳動物種のままであるが、それはいくつかの利点を有するからである。疾患に関連する生理学的プロセスおよび遺伝子は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている。マウスはヒトゲノムの1年前に完全ゲノム配列決定された最初の哺乳動物であった(2002)私(2003)。この豊富な遺伝情報とは別に、マウスは良好な育種能力、迅速な開発サイクル(受精から離乳までの6週間)、および合理的なサイズを有する。これらすべての利点は、異なるコート色(交差戦略に必要)などの生理学的指標と組み合わせて、マウスを遺伝子操作の魅力的なモデルにしました。現代の遺伝学の非常に早い年齢で、グレゴールメンデルは植物に移動する前にマウスで作業を始めました3。遺伝子移入技術は、ウイルスの送達を用いて最初に作製された30年前の4年にわたる最初のトランスジェニックマウスの作製をもたらした4。研究者はすぐに、マウスの遺伝子導入の主な課題の1つは、外因性DNAの運命を制御することができないことに気付いた。マウス卵母細胞へのトランスジーンのウイルス送達により、ゲノムに無作為に組み込まれた複数のコピーが得られたため、その後のトランスジェニック系統の樹立は限られていた。マイクロインジェクション5,6で最初のトランスジェニックマウス系統を作製した。これは組換えDNA技術の時代を迎え、マイクロインジェクションセッションの成果に影響を及ぼすパラメータは広く研究されています7。トランスジーンの複数のコピーのアレイ、ゲノムインテグレーションの前に直列にリンクされている。この特徴は、関心のある遺伝子を過剰発現する何千ものトランスジェニックマウス系を確立するために長年にわたって用いられてきた。それ以来、遺伝子組み換えは、生物のゲノムの人工改変は、疾患の発生における単一の遺伝子の役割を同定するために広く用いられてきた。Capecchiが成功裏にマウスの単一の遺伝子を破壊し、遺伝子ターゲティングの時代を切り開いたときに、マウスゲノムを操作する上でのさらなる成果が達成されました8。マウスを得るために最小12〜18ヶ月)を含む、ES細胞に基づく遺伝子標的化から急速に大きな欠点が浮かび上がった。これらのエンドヌクレアーゼは、マイクロインジェクションによってマウス卵母細胞に容易に注射することができ、わずか6週間で遺伝子標的マウスを作製することができる。ゲノム編集11のためのCRISPRの使用に関する最初の報告以来、この細菌適応免疫系は、合成の容易さおよび複数の座を一度に標的とする能力を含む多くの利点のために、ZFNおよびTALENに取って代わられた(「多重化")。CRISPRは、マウス12の遺伝子標的化に初めて使用され、以来、植物からヒトへの無数の種に適用されている13,14。現在までに、CRISPRゲノム編集に耐性のある単一種の報告はない。トランスジェニックマウスの作製の2つの主要な制限段階は、卵母細胞の注入および再移植これらの卵母細胞を疑似妊娠した雌に分けた。15およびその他16によって記載されているが、マウス発生学および遺伝子導入技術における最近の技術的改良は、遺伝子組み換えマウスの作製プロセスに革命をもたらした。これらの改良についてはここで説明する。図2Aおよびその凡例参照)。エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)(TEA)アガロースゲルを流します。注記:EtBrを使用するときは注意してください。それは強力な変異原である。適切な個人保護具を使用してください(物質安全性データシートを参照)。1kbの分子量マーカーをロードする。導入遺伝子および骨格)をロードする。電気泳動を100Vで45分間行う。図2A参照)の正しいサイズを確認するために、紫外線(UV)トランスイルミネーター上でゲルを視覚化する。分取アガロースゲル電気泳動。低毒性ゲル染色で染色した1%TAEアガロースゲルをキャスティングする。線状化したトランスジーンを分子量マーカーなしで8つのアリコート(各1μg)にロードし、電気泳動を100Vで45分間行う。直線化された導入遺伝子に対応する8つのバンド全てを切除するためにメスを使用する。)に従ってDNAを抽出する。mLチューブで50°Cで少なくとも15分間溶解する。イソプロパノールで沈殿させた後、結合緩衝液を添加する。EDTA)に溶出する。gで60秒間遠心分離します。分光光度計を使用してDNAの濃度と品質を測定する。有機溶媒による汚染なし)であることを確認してください。/μLまで希釈し、-20°Cで凍結します。)を1μg/μLの濃度に希釈する。-80°Cで保存する。単一ガイドRNA(SgRNA)。潜在的なオフターゲット活動を最小限に抑える計算設計ツールを使用して、目的の2標的ゲノム配列(ガイド)を同定する。遺伝子ノックアウトのために、反対方向に数百塩基対(bp)離れて位置する2つのガイドを系統的に選択し、目的の遺伝子の開始コドンを含む。相同性直接修復のために、2つの重複するガイドを(可能な場合はいつでも)反対方向に選択する。3'表1に記載されているプラ​​イマーセットを注文する。線状DNA鋳型を合成する。/μLまでのプラスミドを含む。表1に示すように、マスターミックスを準備します。ポリメラーゼを最後に加え、マスターミックスを氷上に保ちます。これを8本のPCRチューブ(19μL/チューブ)に混合し、分割する。72°Cで5分間の最終伸長。)、マニホールド、および真空源(より迅速な処理のため)を使用してPCR産物を精製する。mbar)をかけます。1容量のPCRサンプルに5倍量(100μL)の結合バッファーを添加し、混合する。mLのコレクションチューブに(付属の)シリカメンブレンスピンカラムを配置するか、または真空プロセス用のマニホールドing。xgで60秒間真空または遠心分離します。洗浄するために、洗浄緩衝液(緩衝液PE)0.75mLをカラムに加え、12,000×gで60秒間真空または遠心分離する。xgで60秒間遠心分離して残留エタノールを除去する。カラムを清潔な1.5mLマイクロ遠心チューブに入れます。DNAを溶出するには、メンブレンの中央に30μLのヌクレアーゼフリー水を加え、カラムを1分間放置し、12,000gで60秒間遠心する。分光光度計を用いて濃度を測定する。/μL以上でなければならない。有機溶媒による汚染なし)であることを確認してください。RNA合成キットを用いたインビトロ転写。準備する表1に示すようにマスターミックスを添加し、サーモサイクラーで37°Cで3時間インキュベートする。Iを添加し、サーモサイクラーで37°Cでさらに15分間インキュベートする。スピンカラムを用いたRNA精製。提供されたスピンカラムに含まれている粉末を、ヌクレアーゼフリーのマイクロインジェクションバッファー650μLに溶解し、すべての気泡を慎重に除去する。チューブをキャップし、室温で5〜15分間水和する。mLのチューブに入れます。750×gおよび室温で2分間遠心分離する。mLチューブにカラムを置き、カラム壁に触れることなく50μLのRNA溶液を中央に滴下してください。gで2分間回転させます。分光光度計を使用してRNA濃度を測定します(1回の反応の典型的な収量は30〜50μgです)。有機溶媒による汚染なし)である。使用まで-80°CでsgRNAを保存する。DNA電気泳動に日常的に使用される1%TAEゲルを使用してRNAの品質を評価する。ngのDNAテンプレートと対応するsgRNAを並行して実行します。