/μLの濃度で加える。注:希釈液量は、再懸濁計算機18のようなオンラインツールを使用して容易に決定することができる。マイクロインジェクションセッション中は各アリコートを氷上に保ち、その後は廃棄します(注入ミックスを再フリーズしないでください)。注:マウスでは、腹部と陰嚢の2つのタイプの凝固術が一般的に行われます。後者侵襲性が低く、以前に記載されている15。すべてのステンレス製手術器具をオートクレーブする。kg)を腹腔内(腹腔内)注射して雄を麻酔する。つま先のピンチ反射の喪失を監視し、マウスが鎮静されたら、それを加熱パッドの上に置きます。クロルヘキシジンや70%エタノールなどの局所消毒剤を交互に入れて睾丸周囲の皮膚を消毒する。deferensを鉗子でつかみ、それを保持し、鉗子の両側を焼灼して、3mmの血管を除去する。2番目の精巣でも同じ手順を実行します。皮膚切開部を創傷クリップで閉め、十分に回復するまでマウスを近づけてください。6.過剰排卵(卵母細胞ドナー)および時間交配(偽妊娠雌)注:適切な数の受精卵母細胞を作製し、再移植のために雌を栓をした技術は、他の場所で説明されている15。1日目の午後12時頃に、妊娠牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG;100μL中)5IUを雌10匹に腹腔内注射する。IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG;100μL中)を雌に腹腔内注射する。一晩飼育された雄と一晩直ちに交尾させる。頸部脱臼により過剰排卵したマウスを摘出し、腹部を露出させ、卵巣および卵管にアクセスする。複合体(COC)を採取し収穫する15。伝統的な方法15に従って、アミノ酸(KSOMaa)を補充した一滴のカリウム一重最適化培地にそれらを入れる。2インキュベーターに30秒〜1分間置いて卵母細胞を精製する。アスピレーターマウスピースを使用してKSOMaa培地4新滴で卵母細胞を洗浄し、鉱油(約2mL)で覆われたKSOMaa培地の最終液滴に移す。2インキュベーターに皿を置きます。前核注入(ランダム統合)。立体顕微鏡下で卵を視覚化し、約50個の卵を注入チャンバに移す(drop培地(ミネラルオイルを重層したM2培地)に吸引した。インジェクションチャンバーを倒立顕微鏡に移し、受精卵の数ピコリットル(前核を標的とすることができます)を注入して、受精卵母細胞(2つの目に見える前核)を注入します。前核の腫脹を観察することによって、成功した注射を視覚化する。細胞質注入(遺伝子ターゲティング)。2インキュベーターで5分間インキュベートする。マウスピースを使用して卵を注射室に移す。2インキュベーターに入れ、妊娠している雌の卵管に再移植するまで負荷する。8.再移植すべてのステンレス製手術器具をオートクレーブする。kg)を腹腔内(腹腔内)注射して雌を麻酔する。つま先のピンチ反射の喪失を監視し、マウスが鎮静されたら、それを加熱パッドの上に置きます。雌マウスの背中正中線の周りの毛皮の広い領域を切り取ります。クロルヘキシジンや70%エタノールなどの局所消毒剤を交互に使用して曝露した皮膚を消毒する。伝統的な方法15に従って生殖管を露出させる。背中正中線に平行に1cmの長さの皮膚切開を行い、筋肉を切断して脂肪パッドを掴むその卵管と子宮がはっきりと見えるまで静かに卵巣を引き抜く。脂肪クランプで血管を固定する。立体顕微鏡下で卵管を視覚化し、一対のマイクロはさみを使用して、膨大部の数ミリメートル上流の卵管の壁に切開を作る。立体顕微鏡下で、マウスピースに接続されたガラスキャピラリーに25マイクロインジェクション卵をロードする(キャピラリーの内径は約120μmであるべきである)。卵管にガラス毛細管を導入し、泡の中に気泡が見えるようになるまで押し出す。静かにガラスの毛細管を取り外し、生殖路を腹部に戻します。縫合し、創傷クリップで閉じる。フル回復までマウスを注意深く監視してください。9.ジェノタイピング戦略/シークエンシング注:ゲノムを単離する関連する動物倫理規定に従って、2mmの尾または耳の生検からのDNA。高速ゲノムDNA抽出(ランダム統合)。12)中で95°Cで1時間、組織サンプル(約2mm)を溶解する。gおよび4°Cで5分間遠心分離する。高品質のゲノムDNA抽出(遺伝子標的)。mLプロテイナーゼK、新たに添加)を加える。55°Cで一晩インキュベートする。反転させて5分間混合する(ボルテックスしない)。250μLの飽和NaCl(6M)を加え、反転させて5分間混合する(ボルテックスしない)。xgおよび4°Cで5〜10分間スピンし、上清を新しいチューブに注ぎます。500μLのイソプロパノールを加え、反転させる(ボルテックスしない)ように5分間混合する。xgで室温で10分間スピンします。上清を傾瀉する(ペレットは目に見えず、チューブに付着する)。1mLの70%エタノールで洗浄する。xgおよび室温で5〜10分間スピンします。白いペレットはもはや粘着性でなく、失われる可能性があるので、上清を注意して除去する。約1時間空気乾燥させる。DNAを55〜60°Cで2時間溶解する。bpのプライマーを設計します。bpの明確な断片を生成するはずです。遺伝子ターゲッティングのために、プライマーがゲノムDNAとハイブリダイズするようにプライマーを設計し、異なるf切断された場所の周りに数百BPを襲います。大きな挿入のためには、プライマーは導入遺伝子上に置くことができるが、その後、標的化された組み込みの確認は、プライマーウォーキングまたは類似の技術を用いて行われるべきである。各ゲノム改変について、新しいPCRプロトコールを設計し、それを実験的に試験する。生成されたフラグメントの長さおよび各対のプライマーの融解温度(Tm)を考慮する。遺伝子ターゲッティングのために、PCR産物をSanger配列決定サービスプロバイダに送付する。図1:遺伝的に改変されたマウスの典型的なワークフローランダム組み込みのために、精製されたトランスジーンは、卵管がプラグインされた雌の雌に移入される前に、受精卵母細胞の前核に注入される。後代の分析は、迅速なゲノムDNA抽出の後にPCRによって行う。この戦略は、その後のPCRに基づいて子孫を分析するために使用され、高度に精製されたgエノムDNA。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。卵母細胞のマイクロインジェクションおよびこれらの注入された卵の再移植は技術的スキルとトレーニングを必要とする2つの主要な制限段階であるが、遺伝子組み換えマウスを首尾よく生成するためには注入混合物の品質が最も重要である。)の品質は、分析アガロースゲルで系統的に評価する必要があります。吸収の異なる値は、溶液の純度に直接依存するため、分光光度計で濃度を測定する場合は、ミックスの潜在的な汚染もチェックする必要があります(手順1.2.3,2.2.3.5、および2.2.5.3を参照)。)の両方について、マイクロインジェクションセッションの典型的な読み出しを説明しています。DNA抽出プロトコールは、実験の種類によっても異なる。その後のPCRは、導入遺伝子またはゲノムDNAのいずれかにそれぞれハイブリダイズするプライマーに依存する。ここに示した戦略は、遺伝子組み換えマウスの作製に必要な各ステップの簡単なトラブルシューティングと合理化を可能にします。(生まれた子15人のうち4人が26.6%)に示されているように、このやや「低い」効率は、マウスゲノムを編集するCRISPRコンポーネントの信頼できる能力とは対照的です。CRISPRを使用して編集したときに正常にホモ接合である子孫全体を得ることは珍しいことではありません。)プラスミドをPvuIおよびNotIで1時間消化する。bp)を分析ゲル(1)でチェックする。分取ゲル(2)からのいくつかの消化産物の抽出は、導入遺伝子の濃度を増加させる。UVへの長期間の曝露は避け、UVトランスイルミネーターの代わりに青色光を使用することを推奨します。(B)ジェノタイピング戦略(1):プライマーは導入遺伝子上に置かれ、200〜800bpの断片を生成するように設計されるべきである。WTマウスのゲノムDNA)を含めることが推奨されます。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。RNAを各ガイドについて平行して実行することによって評価される。RNAのサイズはDNAよりわずかに大きい。スミアバンドなし)、濃度が測定される。)(1)エキソン1の開始コドンを包含する2つのガイド(反対方向)の設計。プライマーは、2つのガイドによって最終的に切除される領域の外側のゲノムDNAとハイブリダイズするように選択される。典型的には、この戦略は、PCR(2)を用いて異型接合(#5および#9)およびホモ接合(#3)KO創始者を直接同定することを可能にする。ホモ接合動物のPCR産物は、WTバンドを示さない。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。CRISPR設計ツールを用いて同定されたN20)および発現ベクターに相補的な配列(gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc)である。試験管内で転写(IVT):DNA鋳型の濃度に依存して、ヌクレアーゼを含まない水で最終体積を20μLに調整する必要があります。librarian.Discussionプロトコル内の重要なステップ遺伝子組み換えマウスの作製は技術的に困難であることが知られている。ここで提示されたプロトコルは、記録的な時間に技術をマスターし、トラブルシューティングを行うことを可能にする、最適化され単純化された方法である。この技法をうまく完了するためには、2つのステップが必要である。)なしで達成することができる。2を系統的に添加することが強く推奨される。ターゲティングされたゲノム配列がドナー鋳型のどの部分にも存在しないことが重要である(標的化された組み込みの場合)。しないと、Cas9ヌクレアーゼが切断してHDRの発生を防止する。変更トラブルシューティング遺伝子組み換えマウスを作製するためのこのプロトコールは、長年にわたって最適化され、合理化されてきたが、マイクロインジェクションのための良質の卵母細胞の収率および養子の目詰まり率に関するいくつかの考慮事項がある。バックグラウンド株の選択は、マイクロインジェクションセッションに起因する生存仔の数に関して重要である。6は、マウスモデルの疾患の最も一般的に用いられる背景である。それはまた、マイクロインジェクション20に対する抵抗の点で、効率の低いバックグラウンドの1つです。雌の年齢はまた、多数の卵母細胞を産生するために重要である。これは、ホルモン刺激21に対する応答の最も好ましくない期間であるため、背景にかかわらず、マウスを5〜8週齢で避けることが推奨される21。6マウスは女性1匹当たり20〜30卵を確実に産生する。大事です新しい技術(超超排卵と呼ばれる)が女性1匹につき100卵まで生産し、最近はマイクロインジェクション22のための卵母細胞を生成するために使用されていることに注意してください。インビトロ受精)必要性によって妨げられる。再移植に適した詰まった雌を得るために、雌マウスを精管切除した雄と交配させる(これらのマウスのバックグラウンドは重要ではない)。詰まらせた受診者の数を増やすには、発情段階と適切な女性の選択を注意深く検討することができます23。女性の周期の同期化はまた、交配の2日前に女性を精管切除された男性に曝露することによって誘導することができる(いわゆる「Whitten効果」)。点突然変異のような非常に小さなゲノム改変は、生成するのが比較的容易であるが、それらを同定することは困難である。遺伝子型決定が行われる場合、PCR産物はサンガー配列決定によって直接配列決定される。Cas9がかなりの時間活性を維持し、異なるゲノム改変が卵母細胞の最初の分裂後に起こり得るので、マウス卵母細胞へのCRISPR成分の直接的マイクロインジェクションは、モザイク動物を生成することが多い。この交絡作用は、様々な対立遺伝子間の離散変異の同定を複雑にし、次世代シークエンシング(NGS)は挑戦的な読み出しに役立ちます。25は、シーケンシングによって創始者の同定後にコロニーを遺伝子型決定することにも役立つ。逆に、標的とされた様式でDNAの大きな断片を挿入することは困難なままである。外来性DNAが大きければ大きいほど、HDRの効率は低くなる。26またはHDR非依存性の標的化された組み込み27のような新しい戦略が現在開発されている。導入遺伝子またはCRISPR成分の調製、マイクロインジェクション、再移植および遺伝子タイピング)が我々の研究室で最適化され、試験され、検証されているため、トランスジーンのランダムな組込みは、2つの主な理由で過剰発現研究に広く使用されている。29遺伝子座などの「安全な港」の遺伝子座におけるCRISPRを用いた導入遺伝子の標的統合は依然として挑戦的である。これまでランダムな統合がより効率的であることが証明されている。異なるレベルの発現を有する同じ導入遺伝子を過剰発現する複数のトランスジェニック系統の生成は、表現型30を逆転させる治療戦略を含む研究において重要である。アドホックな制限酵素を用いて、クローニングの手段によってプラスミドに基づく導入遺伝子を生成する。mRNA発現を安定化させるためのPolyAテイル31。組み立てられると、トランスジーンは細菌複製エレメントを含むプラスミドに挿入され、形質転換後に培養物中で増殖する(典型的には熱ショックに基づく)。マイクロインジェクションのためのトランスジーンの精製方法は重要である。この研究は、(従来のクリスタルバイオレットと比較して)ゲル上の関心フラグメントのより正確な視覚化および低い変異原性暴露(臭化エチジウムと比較して)のための新世代(低毒性)DNA染色の使用を記載する。本明細書に記載される遺伝子標的化のための非クローニング法は非常に速く、わずか5〜6時間でいくつかのsgRNAの合成を可能にする。ターゲット配列の同定、T7プロモーターおよび選択された標的配列を含む線状DNA鋳型の合成、インビトロ転写(IVT)によるsgRNA、およびスピンカラムを用いたsgRNAの精製が含まれる。CRISPRマウスゲノム編集の初期段階では、マウス胚では非常に限られていることが示されていたが、選択されたマウスが唯一の育種スキームの手段によって容易に希釈され得るが、潜在的なオフターゲット効果が系統的に評価された所望のゲノム改変。異なるガイドを使用し、より活性なものを選択した12。いくつかの理由から、このプラクティスはあまり一般的ではありません。最初に、CRISPRをコードするプラスミドで不死化マウス細胞株(典型的にはN2aまたはNIH3T3)のトランスフェクションを使用して、標的とする活性を評価する。RNA成分の注入とは異なる方法である。インビトロで見出された結果は、必ずしも均等に翻訳されるわけではない卵母細胞にさらに、ハイスループット実験は、ほとんどのガイドが活性であることを示した33。その結果、標的上の活性は評価されず、これまでマウス卵母細胞において活性を示さないガイドの証拠はなかった。ここに示したsgRNAを合成する非クローニング法と合わせて、ワークフローを大幅に簡素化し合理化し、複数のアクティブなガイドを1日でシームレスに合成することができます。CRISPRは、技術が実行される方法を変えるイノベーションである「破壊的な技術」と考えられています。達成可能ではあるが、細胞質の遺伝子導入はほとんど非効率的であることを示した7。結果的に、前核マイクロインジェクションは、マウスで標的とするCRISPR遺伝子の成功の最初の実証まで、ほぼ30年間、唯一の一般的なプラクティスであった。この研究は、細胞質マイクロインジェクション前核の送達と比較して同様の、または優れた結果を生み出すことができる12。明らかに、CRISPR成分は典型的にRNAで作られているので、細胞質が標的にされていることは明らかである。細胞質に注入された場合でも、ドナーテンプレートはHDRを首尾よく誘導することができる。テンプレートの高い細胞質濃度は、それらの核への拡散を可能にする。ピエゾ駆動細胞質マイクロインジェクション16の使用は要件ではない。サイトカイン阻害剤(例えば、サイトカラシンB)との卵母細胞の短いインキュベーションは、卵母細胞34,35の生存を増加させ、ピエゾインパクト駆動システムなしで細胞質注入を行うのに十分である。1細胞または2細胞(一晩培養した場合)の胚を卵管に移すことができる。従来の処置は、卵巣を保護する嚢を引き裂く必要があるので、非常に侵襲的である。ガラス毛細管を腔内に挿入する必要があるため、技術的にも挑戦的である15。ここに示した方法は、習得がはるかに容易であり、潜在的な出血を誘発せず、卵巣の完全性を保持する。熊本大学で開発された研究に基づいています37。潜在的な創始者を特定するためには、遺伝子タイピング戦略と配列決定技術が不可欠です。