0065このバッチの平均直径は、6.0μmである。数百ナノメートルから数ミリメートルの範囲の平均直径を有する粒子がほんのわずかな改変によって作製され得る。この粒子が不規則な表面形状を伴う高度な多孔性であることを示した。粒子は、0.4g/cm3未満のタップ密度を有した。空気力学的に軽いPLAL-Lys粒子PLAL-Lys粒子を、0.5mlジメチルスルホキシド中に50mgのグラフトコポリマーを溶解し、次いで1.5mlジクロロメタンを滴下で添加することによって調製した。w/vポリビニルアルコール溶液(平均分子量25kDa、88%加水分解)中に乳化した。得られた分散液をマグネチックスターラーを用いて1時間撹拌した。NaOH溶液の添加によって7.0〜7.2の間にした。ジクロロメタンが完全にエバポレートされ、そして粒子が硬化するまで、撹拌をさらに2時間続けた。上清を捨て、そして各回4000rpmで10分間の遠心分離によって沈殿物を蒸留水で3回洗浄した。粒子サイジングをCoulterカウンターを用いて行った。平均的粒子の平均直径は、100nmから14μmの間であり、これは、ホモジナイゼーションの速度および時間のような処理パラメーターに依存する。全ての粒子は、0.4g/cm3未満のタップ密度を示した。これらが不規則な表面を伴う高度な多孔性であることを示した。0067空気力学的に軽いPLAL-Ala-Lys粒子100mgのPLAL-Ala-Lys粒子を0.4mlトリフルオロエタノール中に完全に溶解し、次いで1.0ml塩化メチレンを滴下で添加した。w/vポリビニルアルコール溶液(平均分子量25kDa、88%加水分解)中に乳化した。2mlの1%PVA溶液を混合物に添加し、そしてこれを最高速度で30秒間ボルテックスした。混合物を100mlの0.3%PVA溶液を含むビーカーに素早く注ぎ、そして3時間撹拌して塩化メチレンをエバポレーションを可能にした。これらが高度に不規則な表面を有することを示した。0068空気力学的に軽いコポリマー粒子PLAL-LysおよびPLGA-PEGのブレンドからなるポリマー性の空気学的に軽い粒子を作製した。50mgのPLGA-PEGポリマー(PEGの分子量:20KDa、PEG:PLGAの重量比1:2、ラクチド:グリコリド75:25)を、1mlジクロロメタン中に完全に溶解した。3mgのポリ(ラクチド-co-リジン)-ポリリジングラフトコポリマーを0.1mlジメチルスルホキシド中に溶解し、そして第1のポリマー溶液と混合した。VO-250)によって、ポリマー溶液中に乳化した。この第1乳液に2mlの蒸留水を添加し、4000rpmで60秒間ボルテックスミキサーを用いて混合した。塩化メチレンが完全にエバポレートされ、そしてマイクロスフェアが形成されるまで、得られた分散液を3時間マグネチックスターラーを用いることによって撹拌した。このスフェアを5000rpmで30分間の遠心分離によって単離した。上清を捨て、沈殿物を蒸留水で3回洗浄し、そして5mlの水中に再懸濁した。分散液を液体窒素中で凍結させ、そして48時間凍結乾燥した。0069走査電子顕微鏡(SEM)によって、PLAL-Lys-PLGA-PEG粒子は、表面が高度に粗でかつ多孔性であった。粒子は7μmの平均粒子サイズを有した。PLAL-Lysとポリ(乳酸)(PLA)および/またはPLGA-PEGコポリマーとのブレンドが、粒子多孔性およびサイズを調整するために調整され得る。粒子の表面形状および多孔性を変えるように操作され得る変因は、以下を含む:ポリマー濃度、ポリマー分子量、イソプロピルアルコール(または別の混和性溶媒)による塩化メチレン抽出の速度、添加するイソプロピルアルコールの量、内部水相の含有、内部水相の量、内部水相中における塩または他の高度に水溶性の分子の含有(これらは、浸透圧によって硬化スフェアから漏洩し、それらの濃度に比例してチャネル(または孔)の形成を引き起こす)、ならびに界面活性剤のタイプおよび濃度。0071さらに、ホモジナイズの速度および時間のような処理パラメーターが調整され得る。これらの技術によって調製される場合、PLAL、PLA、およびPLGA-PEGのどれも単独では空気力学的に軽い構造物を形成しない。空気力学的に軽い50:50PLGA粒子を、以下の手順に従って、粒子内にカプセル化されるテストステロンと共にスプレー乾燥することによって調製した。MO)を、室温で、100mLのジクロロメタン中に完全に溶解した。Germany)を用いて、5mL/分の流速で0.5mmノズルを通してスプレー乾燥した。加圧気体の流速は、700nl/時であった。流入温度を30°Cに設定し、そして流出温度を25°Cに設定した。アスピレーターを−20〜−25バールの真空を達成するように設定した。収率は51%であり、そして平均粒子サイズは約5μmであった。粒子は、0.4g/cm3以下のタップ密度によって決定されたように、空気力学的に軽かった。低くすること、および他の変因を変えることによって達成され得る。多孔性および表面粗度は、他の要因の中でも流入および流出の温度を変動させることによって増大され得る。0074異なる溶媒中にポリマーおよび薬物を含有する空気力学的に軽い粒子モデル親水性薬物(デキストラン)を有する空気力学的に軽いPLA粒子を、以下の手順を用いて、スプレー乾燥により調製した。Branson)により乳化した。乳濁液を、続いて、700nl/時間の空気流速(入口温度=30°C、出口温度=21°C、−20mbar減圧)を伴って、5mL/分の流速でスプレー乾燥した。収量は、56%である。g/cm3未満のタップ密度)。空気力学的に軽いリゾチーム粒子を、以下の手順を用いてスプレー乾燥により調製した。w/v溶液)中に溶解し、そして0.5mmノズルおよびBuchi研究室スプレー乾燥機を用いてスプレー乾燥した。圧縮空気の流速は、725nl/時間であった。リゾチーム溶液の流速を、97〜100°Cの設定入口温度で、出口温度が55〜57°Cであるように設定した。アスピレーターを、−30mbarの減圧を達成するように設定した。g/cm3未満のタップ密度)の収量は66%であった。軽いデキストラン粒子を、以下の手順を用いてスプレー乾燥により調製した。w/v溶液)し、そして0.5mmノズルおよびBuchi研究室スプレー乾燥機を用いてスプレー乾燥した。圧縮空気の流速は、750nl/時間であった。DEAE-デキストラン溶液の流速を、155°Cの設定入口温度で、出口温度が80°Cとなるように設定した。アスピレーターを、−20mbarの減圧を達成するように設定した。g/cm3未満のタップ密度)の収量は66%であり、そしてサイズ範囲は1〜15μmの範囲であった。軽いトレハロース粒子を、以下の手順を用いてスプレー乾燥により調製した。w/v溶液)し、そして0.5mmノズルおよびBuchi研究室スプレー乾燥機を用いてスプレー乾燥した。圧縮空気の流速は、650nl/時間であった。トレハロース溶液の流速を、100°Cの設定入口温度で、出口温度が60°Cとなるように設定した。アスピレーターを、−30mbarの減圧を達成するように設定した。g/cm3未満のタップ密度)の収量は36%であり、そしてサイズ範囲は1〜15μmの範囲であった。ポリエチレングリコール(PEG)は、水溶性高分子である。これは、水溶液からスプレー乾燥し得ない。これは、水をエバポレートするために必要とされるよりも低い、室温で溶解するからである。PEGを、低沸点有機溶媒であるジクロロメタンの溶液から低温でスプレー乾燥した。空気力学的に軽いPEG粒子を、以下の手順を用いてスプレー乾燥により調製した。w/v溶液)し、そして0.5mmノズルおよびBuchi研究室スプレー乾燥機を用いてスプレー乾燥した。圧縮空気の流速は、750nl/時間であった。PEG溶液の流速を、45°Cの設定入口温度で、出口温度が34〜35°Cとなるように設定した。アスピレーターを、−22mbarの減圧を達成するように設定した。g/cm3未満のタップ密度)の収量は67%であり、そしてサイズ範囲は1〜15μmの範囲であった。空気力学的に軽い粒子を、コントロール粒子(本明細書中では、「軽くない」粒子という)と比較した。同様の平均直径(6〜7μm)およびサイズ分布(3〜4μmの標準偏差)を有する、空気力学的に軽い(PLAL-Lys)粒子およびコントロールの軽くない(PLAL)粒子の表面上のリジンアミン基を、ローダミンイソチオシアネートを用いて標識した。0080ローダミン標識粒子を、共焦点顕微鏡法により特徴付けた。固体粒子の表面上の制限された数のリジン官能性は、蛍光画像により証明されたように、ローダミンイソチオシアネートと反応し得た。空気力学的に軽い粒子において、グラフトコポリマーおよび多孔性粒子構造におけるより高いリジン含量は、より高いレベルのローダミン結合をもたらし、ローダミン結合は、多孔構造の間隙の至る所に散在する。これはまた、標的化分子が、肺の中の特定のレセプター部位との相互作用のために、粒子表面への適切な標的化剤の化学的結合を介して、空気力学的に軽い粒子と結合し得ることを実証する。空気力学的に軽い大きな粒子が、(口、咽頭、および吸入器)沈着を回避し得、そして同様のサイズの非多孔性粒子(本明細書中では、軽くないまたはコントロールの粒子という)よりもより効率的に気道および腺房に進入するか否かを決定するために、空気力学的に軽いPLAL-Lys粒子(平均直径6.3μm)およびコントロールの軽くないPLAL(平均直径6.9μm)粒子のエアロゾル化および沈着を、インビトロで、カスケードインパクター系を用いて比較した。Lilly)中に入れ、このカプセルを、Spinhaler乾燥粉末吸入器(DPI)(Fisons)に充填し、そしてDPIを作動させた。l/分の流速で、30秒間、エアロゾル化した。80で予めコートした。N)でリンスすることにより、各段階のインパクター系から別々のメスフラスコ中に収集した。37°Cにて12時間のインキュベーション後、各溶液の蛍光を測定した(554nmの励起波長、574nmの放出波長)。4.7μm以下)であると決定した。図1は、DPIから出る軽くない(PLAL)粒子の10%未満が呼吸可能であることを示す。これは、サイズの大きい微粒子およびそれらの標準的な質量密度と一致する。2つの粒子の型の幾何学的寸法がほぼ同一である場合でさえ、55%を越える空気力学的に軽い(PLAL-Lys)粒子は、呼吸可能である。空気力学的に軽い(PLAL-Lys)微粒子のより低いタップ密度は、以下でさらに議論するように、この粒子浸透の改善の原因である。空気力学的に軽い(PLAL-Lys)粒子は、ずっとより効率的なエアロゾル化を示した(空気力学的に軽い粒子のおよそ80%が、代表的にはエアロゾル化の間にDPIを出た)。0085効率的なエアロゾル化とエアロゾル化粒子質量の高い呼吸可能画分との組合せ効果は、軽くない粒子粉末の画分よりも、空気力学的に軽い粒子粉末のずっと大きな画分が、肺に沈着するようであることを意味する。空気力学的に軽いおよび軽くないポリマーPLAL-LysおよびPLAL微粒子の肺への浸透を、生存ラットの気道中への微粒子のエアロゾル化を含むインビボ実験において評価した。Dawleyラット(150〜200g)をケタミン(90mg/kg)/キシラジン(10mg/kg)を用いて麻酔した。麻酔したラットを、生理学的温度を維持するために温度制御パッドを提供しながら、手術台上に仰向けに配置した。動物に、Harvardベンチレーターに接続した気管内チューブを用いて、竜骨より上でカニューレ挿入した。動物を、300ml/分で20分間、強制的に通気した。50mgの空気力学的に軽い(PLAL-Lys)または軽くない(PLA)微粒子を、気管内チューブに導入した。用いて別々に洗浄した。気管カニューレを挿入し、適所で結び、そして気道を10mlのHBSS水溶液で洗浄した。洗浄手順を、計30mlの容量が収集されるまで繰り返した。NY)(HBSS)2mlに再懸濁した。100mlを、血球計算板を用いる粒子計数のために取り出した。37°Cで12時間のインキュベーション後、各溶液の蛍光を測定した(554nmの励起波長、574nmの放出波長)。図2は、強制的換気の間の気管内エアロゾル化の後にラットの肺および上気道における気管および竜骨の後ろ(肺)内に沈着した総粒子質量を示している棒グラフである。PLAL-Lysの空気力学的に軽い粒子は、6.9μmの平均直径を有した。軽くないPLAL粒子は、6.7μmの平均直径を有した。気道での空気力学的に軽い粒子の沈着%は54.5であり、そして軽くない粒子の沈着は77.0であった。肺における空気力学的に軽い粒子の沈着%は46.8であり、そして軽くない粒子の沈着は23.0であった。図20089軽くない(PLAL)粒子が主に気管に沈着した(気管に進入した総粒子質量の約79%)。この結果は、軽くない微粒子のインビトロ性能と同様であり、そして軽くない粒子の相対的に大きなサイズと一致した。空気力学的に軽い(PLAL−Lys)粒子質量の約54%が気管で沈着した。したがって、気管に進入する空気力学的に軽い粒子の質量の約半分が、気管を通って、ラット肺の気道および細葉へ縦走する。空気力学的に軽い粒子の肺への効果的な貫通が立証された。ラット肺に残存する粒子を、個々の肺葉の注意深い切開により得た。この肺葉を、5mlのHBSSを含む別々のペトリ皿に置いた。各肺葉を60メッシュの網目に通して細く裂いて組織を分離し、次いで、綿ガーゼに通して濾過して組織残渣および結合組織を除去した。ペトリ皿およびガーゼを、さらなる15mlのHBSSで洗浄して微粒子の回収を最大にした。肺に残存する粒子数を図3に示す。肺葉番号は、1)左肺、2)前、3)内側、4)後、5)下大静脈に対応する。2つのタイプの粒子の幾何学的大きさが基本的に同じであっても、軽くないPLAL粒子より、かなり多くの数の空気力学的に軽いPLAL−Lys粒子が、すべての肺葉に進入する。これらの結果は、空気力学的に軽い粒子のエアロゾル化の効率、および、この空気力学的に軽い粒子がカリーナすなわち第一分岐部の前での沈着を避ける性向の両方を反映する。図30091実施例7:インスリンを含むPLGA多孔性および非多孔性粒子のインビボでのエアロゾル化インスリンを、多孔性および非多孔性のポリマー粒子中にカプセル化して、大きなサイズの粒子が全身性バイオアベイラビリティーを増加させ得るかどうかを試験した。2つの粒子の密度および平均直径を、それらがそれぞれ、深肺での沈着に適切な空気力学的直径(約2μm)を有するように設計した。多孔性粒子の平均直径は>5μmであり、非多孔性粒子の平均直径は5μm未満である(図4〜6を参照)。同一質量の多孔性または非多孔性粒子を、吸入エアロゾルまたは皮下注射(コントロール)としてラットに投与した。図4図5図60092以前に記載されたように、ラットを麻酔しそしてカニューレを挿入した。動物を、300ml/分にて10〜20分の間強制的換気した。2つのタイプのエアロゾルを、気管内チューブを介して動物に送達した。強制的換気の後、動物の頸部を縫合した。動物は、1〜2時間以内に意識を回復した。血液サンプル(300μl)を、2〜6日間の間、周期的に、尾静脈から採取した。CA)を使用して、(内因性および外因性の)インスリンまたはテストステロンの存在について検査した。グルコースを、呈色アッセイ(Sigma)を使用して測定した。コントロール研究には、吸入されたのと同じ量の粉末の皮下注射が含まれた。粒子を首筋に注射した。0093血清インスリン濃度を、吸入または注射後の時間の関数としてモニターした。多孔性(図4)および非多孔性(図5)の両方の粒子について、血液のインスリンレベルは、吸入後最初の1時間以内に高値に達する。大きな多孔性粒子の場合においてのみ、血液のインスリンレベルは、4時間を超えて上昇したままであり(p<0.05)、比較的安定なインスリン放出が少なくとも96時間続く(0.04<p<0.2)。図4図50094これらの結果は、血清グルコース値によって確認される。血清グルコース値は、図6に示されるように、多孔性インスリン粒子の吸入後最初の10時間には、グルコースレベルの低下を、続いて、96時間のうちの残りの時間には、比較的安定な低グルコースレベルを示す。小さな非多孔性インスリン粒子の場合、最初は抑制されたグルコース値が、24時間後に上昇する。713(1991))。大きな多孔性粒子に関しては、皮下注射に対するインスリンのバイオアベイラビリティーは、87.5%であり、一方、小さな非多孔性粒子は、吸入後12%の相対的バイオアベイラビリティーを生じる。764(1992))。863(1994))。0096インスリンの短い全身性半減期(11分)、ならびに12〜24時間の時間スケールの中心気道および上気道からの粒子クリアランスを仮定すれば、吸入の数日後に血流中に外因性インスリンが出現することは、大きな多孔性粒子が、深肺に投与された場合、長く、貪食されない寿命を達成することを示すようである。この仮説を試験するために、ラットの肺を、多孔性および非多孔性のインスリン粒子の吸入直後、および吸入の48時間後の両方で洗浄した。0097非多孔性粒子の場合、吸入直後に、貪食細胞の30%±3%が、粒子を含んでおり、そして吸入の48時間後には、39%±5%が粒子を含んでいた。対照的に、吸入直後には、わずかに貪食細胞の8%±2%が大きな多孔性粒子を含んでおり、そして吸入の48時間後には、12.5%±3.5%が粒子を含んでいた。17.5%±1.5%が、3以上の粒子を含んでいた。これに対して、大きな非多孔性粒子の場合には4%±1%であった。小さな非多孔性粒子の場合、炎症性応答もまた上昇した。小さな非多孔性粒子の吸入の48時間後、好中球は、貪食細胞集団の34%±12%を示した。これに対して、大きな多孔性粒子の場合、8.5%±3.5%であった(吸入直後には、肺胞マクロファージは、貪食細胞の100%を示した)。263(1992))を支持する。第二のモデル薬物テストステロンを、2つの異なる平均幾何学的直径(10.1μmおよび20.4μm)の多孔性粒子にカプセル化して、増大したバイオアベイラビリティーが、多孔性粒子のサイズの増大と相関するかどうかをさらに決定した。同一質量の粉末を、吸入エアロゾルまたは皮下注射(コントロール)としてラットに投与した。血清テストステロン濃度を、吸入または注射後の時間の関数としてモニターした(図7および8)。テストステロンの全身性半減期が10〜20分の間であっても、血液のテストステロンレベルは、12時間〜24時間の間、バックグランドレベルを十分超えて維持する(p<0.05)。皮下注射に対するテストステロンのバイオアベイラビリティーは、20.4μm直径の粒子(図7)については177%、そして10.1μm直径の多孔性粒子(図8)については53%である。101(1992))より約10倍大きいと仮定すれば、多孔性粒子のサイズの増大に伴うテストステロンのバイオアベイラビリティーの増大は、特に注目すべきである。41(1994))、数時間のインビトロでの放出時間スケールに近い。0100高多孔度を有する粒子を製造することによって、比較的大きな粒子(すなわち、より小さな非多孔性粒子と同じ空気力学的直径を有する粒子)は、肺に進入し得る。肺におけるエアロゾル沈着の位置を左右するのは、粒子質量であるからである。大きな、軽い粒子の増大したエアロゾル化効率は、気道への粒子の進入前の沈着喪失の可能性を低下させる。このことによって、吸入された薬物の全身性バイオアベイラビリティーが増大する。impactor)の呼吸可能でない段階および呼吸可能段階で沈着した、空気力学的に軽い粒子と軽くないコントロール粒子との総粒子質量を比較するグラフである。図2は、空気力学的に軽いポリ(乳酸-co-リジン-graft-リジン)(PLAL-Lys)粒子とコントロールの軽くないポリ(L-乳酸)(PLA)粒子との、強制的換気の間の気管内エアロゾル化後の、ラット肺および上気道において、気管内および気管分岐部(肺)で沈着した総粒子質量を比較するグラフである。ラット肺での空気力学的に軽いPLAL-Lys粒子とコントロールPLA粒子との総粒子回収を比較するグラフである。図4は、多孔性のPLGA粒子の吸入または皮下注射による投与後の、経時的(時)な血清インスリンレベル(ng/ml)を表すグラフである。図5は、非多孔性のPLGA粒子の吸入または皮下注射による投与後の、経時的(時)な血清インスリンレベル(ng/ml)を表すグラフである。黒塗りのマルは、吸入による投与を表す。黒塗りの三角は、皮下注射での投与を表す。白抜きのダイアモンドは、未処置のコントロールを表す。図6は、多孔性のPLGA粒子の吸入による投与後の、血清グルコース濃度(mg/dl)を表すグラフである。黒塗りのマルは、吸入による投与を表す。黒塗りの三角は、未処置のコントロールを表す。図7は、直径20.4μmを有する多孔性のPLGA粒子の吸入または皮下注射による投与後の、経時的(時)な血清テストステロンレベル(ng/ml)を表すグラフである。黒塗りのマルは、吸入による投与を表す。黒塗りの三角は、皮下注射による投与を表す。図8は、直径10.1μmを有する多孔性のPLGA粒子の吸入または皮下注射による投与後の、経時的(時)な血清テストステロンレベル(ng/ml)を表すグラフである。黒塗りのマルは、吸入による投与を表す。黒塗りの三角は、皮下注射による投与を表す。図1図2図3図4図5図6図7図8ページトップへこの技術を出願した法人この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedInこの技術を発明した人物この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedInページトップへ関連する挑戦したい社会課題この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedIn農業用水が豊富な社会を実現する農業用水が豊富な社会を実現すると、今後の人口の増加に対応する食糧と水資源を確保できるかもしれません。地球上に存在する水のうち、淡水の占める割合はわずか2.5%と言われています。世界で...最終更新日:2018/06/20環境にやさしいエネルギーを実現する環境にやさしいエネルギーの実現は、経済成長と環境や健康面への配慮を両立させる社会につながります。