:2019.12.25一般に、固定液は生物とその環境にとって何らかの有害性をもっています。化学物質の取扱いには専門知識と安全な設備が必要です。このページは利用者が化学物質の管理能力を有する前提で記述されています。酸化/自己反応性(この表示は(社)日本試薬協会の旧選定基準を参考にしています。)酸化性:可燃物と接触することによって燃焼や爆発する自己反応性:単独で分解したり大きな反応熱を発生する可燃性:点火源があると、空気等の酸化性物質と接触し燃焼する※このページでは、容量(体積)は慣用単位で示しています。固定液の処方には様々なバリエーションがあります。ここではその一例を示しているに過ぎません。切除には鋭利な刃物を用い、切除端に圧挫を生じさせないこと。試料は自己融解のない新鮮な状態で直ちに固定し、決して組織を乾燥させないこと。脂質の検出にアルコール系固定液が不適であるように、目的に応じて適切な固定液を選択すること。過剰な血液や粘液、固い被膜で覆われた組織は固定液の浸透性が悪くなるので注意すること。固定液は液体であるので浸透圧による障害や可溶性物質の溶出に注意すること。3倍量)を用いること。組織は、固定液中の形状のまま固定されるので、組織の変形が起こらないように固定すること。固定時間が過度に長期にならないように注意すること。(「過剰固定」とは固定時間の延長を言う)固定により組織は硬化し弾力性を失うので、口の狭い容器中などでは固定しないこと。固定により酵素活性や抗原性は影響を受けやすいことに留意すること。一般に固定液には生物や環境に対して何らかの有害性があるものとして取扱いに注意すること。Aldehyde系固定液ホルムアルデヒド/パラホルムアルデヒド(PFA)/グルタールアルデヒド(GA)などアルデヒド基(-CHO)をもつ化学物質は蛋白間に架橋を形成して変性凝固させる性質があるので、特にホルムアルデヒドの水溶液であるホルマリンなどは昔から組織固定液あるいは防腐剤として使用されてきた。免疫組織化学や酵素化学においては、架橋形成によって抗原性がマスクされたり、酵素活性が阻害されやすいという欠点がある。多くの場合は低濃度の水溶液として使用されるため、固定が完了するまでの間に糖質や低分子量の可溶性物質が組織中から失われることもある。蒸気も含め毒性が強いので注意が必要。(化審法):2-482、LD50:800mg/kg(rat経口)、融点:-92°C、沸点:-19.5°C、比重:0.815、MW:30.03ホルムアルデヒドFormaldehyde(HCHO)は刺激臭のある無色の気体。水に易溶性で、その水溶液をホルマリンFormalinという。蛋白凝固作用があり、古くから防腐剤・消毒剤として利用されてきた。embeding:FFPE標本)を作製するのが本邦ではスタンダードな方法となっている。いわゆる「ホルマリン」として入手できる薬品には3種類あり、試薬ホルマリンはホルムアルデヒドの含有量が37%以上あるが、局方ホルマリンは35〜37%でメタノールを10%程度含有している。消毒用ホルマリン(いわゆる「ホルマリン水」)は1%前後しか含有していないので固定液には適さない。免疫組織化学に用いる場合のホルマリンはメタノール残留量の少ない特級試薬が望ましい。※ホルマリンは、工業的にはメタノール(CH3OH)を酸化して合成するので引火性物質であるメタノールが少量でも残留している。メタノールの影響が気になる場合は後述するPFAが用いられる。(※時に「37〜40%ホルマリン」などと書かれてある文献を見かけるが、これは誤解のもとになる。正確には「37〜40%のホルムアルデヒドを含有したホルマリン原液」と言うべきであり、試薬ホルマリンを37%に希釈したものを基にさらに10%に希釈すると消毒用のホルマリン水並みになってしまう。0.00001%)が作業環境の管理限界と定められている。acid(HCOOH)に変化する。酸化は光線により促進されるので長期保存は褐色瓶で暗所保管とする。廃棄に際しては市販の処理液を用いるのが一般的であるが、簡便な方法として水酸化ナトリウムを加えてpHを上げてから水酸化カルシウムを加えて自然に縮合させる方法も用いられている。して使うだけなら別に水道水で希釈しても良いし、濃度も10%〜20%まで適当でかまわないが、ホルマリン濃度の高い液に長期間浸漬したままにしておくと組織は収縮したり染色性が低下する。組織中の鉄などの金属を検出する際には水道水の使用は避けること。組織固定用にはホルマリンは通常10%〜15%程度の濃度で用いられることが多く、この範囲なら多少アバウトでも大きな問題はない。高濃度だから固定が早いというものではなく、むしろ固定液が組織内部に浸透する前に組織表面が凝固収縮して硬化し内部浸透を妨げることになる。(天ぷらの油の温度が高ければ良いわけではないのと同じ理屈)「ホルマリン」と「ホルムアルデヒド」は混同されやすいが、「10%ホルマリン」という場合には含有されるホルムアルデヒドの最終濃度を示すのではなく、単に試薬ホルマリン原液の10倍希釈液という軽い意味なので変に細かい計算は必要ない。3.7〜4%となり、「4%PFA」とほぼ近似値となる。UN2209に指定されているのは25%以上の「ホルムアルデヒド水溶液」なので、10%ホルマリンはこの国連指定の危険物には該当しない。(国内で陸送する場合には当然国内法が適用されるが、1tもしくは1m3もの10%ホルマリンを一度に輸送するようなことは稀で、UN2209表示のイェローカードが常に必要なわけではない。中性ホルマリン固定液[参考]緩衝ホルマリンとしばしば混同されるが、「中性ホルマリン」とは要するに10%ホルマリン液を褐色瓶に入れた中に充分量の沈降炭酸カルシウムまたは炭酸マグネシウムなどを加え、一晩以上放置して沈殿させた上澄み液。水で10倍希釈しただけではおよそpH4くらいになるので、pHを上げただけものである。最近はリン酸緩衝ホルマリンが一般的で、これは現在ではほとんど使われていない。8.5〜9g[参考]ホルマリン固定液は成分比率として殆どが水であるため、塩化ナトリウムや塩化カルシウムなどを少し加えて等張にしたもの。浸透圧による組織障害を防ぐ必要のある場合に用いる。それなら最初からホルマリンを生理食塩水で希釈すれば良いわけで、実際にそういう固定液(10%ホルマリン・生理食塩水液)が使われることもある。ホルマリン色素顆粒が析出しやすくなる。10ml免疫組織化学の普及とともに、今日一般に用いられている組織用固定液。Formalin:NBF)と呼ばれることもある。したがって燐酸緩衝液のモル数にはあまり厳密こだわる意味はないし、リン酸水素ナトリウムの量も含水量によって変わる。(上記はLillieの処方)免疫組織化学に用いる場合、Formaldehydeによる固定は抗原性を損なうのでpHを調整したものでも高濃度、長期間の固定は好ましくない。その他の添加物入りホルマリン固定液ホルマリン固定液は基本的な組織固定液として長い間使われてきた為、多くの人によって様々な改良・工夫がされてきた。基本的にそれらはホルマリンの希釈液をアルコール等に換えたり、または塩類など添加物を加えることであった。後者の幾つかを紹介すると、酢酸ナトリウムや臭化アンモニウム、塩化カルシウム、硫酸亜鉛(後述)などがある。acetate、酢酸のアルカリ塩のひとつ。:2-692、MW82.03。100ml酢酸を少し加えてやると固定効果が良くなることは知られている。肉眼資料として臓器などを長期保存する場合にも使われる。bromide、白色の結晶性粉末、MW97.94、吸湿性、水・アルコール可溶性、化審法:1-106。100ml脳などの神経組織で鍍銀などを行う場合に良いとされている固定液。MW110.98(2水和物で約147)、化審法:1-176。脂質の染色に良いとされている固定液で、Baker(ベーカー)固定液とも呼ばれる。教科書的には無水塩化カルシウムを使うが、2水和物を使っても問題ない。1〜2%程度ならアバウトで良いということだろう。塩カルは吸湿(潮解)性が強いので湿度計付の除湿庫で保管すること。変異原性の疑いもあり、実際上使用できない。4.1(可燃性固体)、化審法:9-1941、白色固体、常温で水に難溶、アルコールに可溶、LD50:800mg/kg(rat経口)、融点:121°C、引火点:70°C、発火点:300°C。加熱または水に溶解させるとホルムアルデヒドに分解する。最終100mlPFAは室温で溶解しにくく液は白濁する。少なめのbuffer中で60°Cくらいで加温溶解(蒸気は有毒なので注意)させ、1時間程度(※)で透明になってから再度bufferを加えて全量を100mlに調整する。NaOHを僅かに滴下すると早い(最終的にpHを調整する)。4°Cで1〜2週間程度保存可。糖蛋白系の抗原(例えばCEAなど)用の固定液。糖鎖を過ヨウ素酸で酸化しアルデヒド基にするので糖鎖抗原やレクチンを対象とする場合には適さない。pH7.4で全量を100mにする。4°Cで1週間ほど保存可。4°Cで2週間程度保存可。(pH6.2)となる。MW:100.12、融点:-14°C、沸点:188°C、引火点:71-72°C、船舶法・航空法:毒物。加熱すると重合、酸化によってグルタル酸に変化。生物蓄積しないが、気道、皮膚に刺激性。Glutaraldehyde固定液グルタールアルデヒド(GA)はアルデヒド基を2つ有しており固定力が強い。微細構造の形態保持に優れているほか多糖類の保存性が良く、1〜5%水溶液が電顕用の前固定液として用いられる。組織内浸透力が弱く、通常組織試料は1mm角ほどの大きさまでとし、約1〜2時間冷温(4°C)固定される。21mlGAは固定力は強いが浸透力が弱いので、この点を補うためにホルムアルデヒドと混合して用いられる。この混合固定液はKarnovsky固定液と呼ばれる。Karnovsky液」などと呼ばれることもある。酸には強い蛋白凝固作用があるが、組織障害性も強い。(トリクロロ酢酸:TCA)、クロム酸などやその塩がアルデヒド系固定液と混合または併用されて補完的に使用されることがあるが、単独で固定に用いられることは少ない。acid、2,4,6-トリニトロフェノール。1.1D(爆発性)、融点:122°C、沸点:325°C、MW:229.1。黄色針状結晶で水・アルコールに可溶。引火点:150°C、発火点:300°C。熱、衝撃により爆発的に分解することがある。(特に乾燥させると危険であり、通常10%以上水を含む状態で保存)金属容器を用いず直射日光を避け冷所に保存。組織浸透力の強いピクリン酸を加えた固定液。アルデヒド系固定液で抗原性は安定しているが分子量が小さいため移動、流失が起こりやすいポリペプチドホルモンの検出などに適している。標準的な固定条件は4°C6〜12時間(腎や睾丸生検などでは1〜2時間)程度。浸透力の強い分、過剰固定により組織が硬化しやすいので室温下では短めに。固定後の組織は黄色に着色するので、水洗せずに70%アルコールに浸漬して色を落とす。5ml15:5:1の割合(1551)と覚えると良いが厳密でなくてもよい。睾丸生検などで用いられていたこの処方ではホルマリン濃度が20%を超えるので、濃度を下げたい場合は代わりに酢酸の量を増やす。飽和ピクリン酸水溶液は、褐色瓶に充分量(完全に溶解してしまわないように)のピクリン酸を入れた上に蒸留水を加えて攪拌、放置、沈殿させ、上澄み液を使用する。上澄みを採取する際には沈殿したピクリン酸が混ざらないように注意。上澄みを採取した分、蒸留水を補充すれば沈殿したピクリン酸がなくなるまで長期に渡って利用できる。(ザンボニ)固定液ホルマリンに替えPFAを用いたブアン固定液の改良版。標準的な固定条件は4°C6〜12時間。Bouin固定と同様に固定後は水洗せず70%アルコールへ。最終100mlPFAはそのままではなかなか溶解しない。60°Cくらいで加温し、攪拌しながら2.52%NaOH水溶液を滴下すると早く溶解する。PFAが完全に溶解してからbufferを加えて全量を100mlに調整する。bufferは別に0.15Mに厳密にこだわらなくてもよい。加水分解で多価フェノールを生じる収斂性の植物成分の総称で、皮革をなめすための「鞣皮剤」として昔から使われてきた。タンニン酸はタンニンの加水分解によって生じる有機酸で、多数のヒドロキシ基を持つ複雑な芳香族化合物で分子量の大きさに幅がある。蛋白と強固に結合するので、アルデヒド系固定液と混ぜて可溶性蛋白やポリペプチドの固定に使用されることがある。