バイオフィルムとは何か?”正確にはバイオフィルム(生物膜)としてよく知られているが、スライム(ねと)シティは水があるところならどこでも、台所でも、コンタクトレンズでも、動物の腸管ライニングにも、はびこっていく。そのシティが郊外へどんどん伸びていけば.バイオフィルは肉眼で見ることができるようになり、水道管の内部をコーティングしたり、あるいは鉛管設備からつるつるして緑色にぶら下がってくる。1996)簡単にいえば、バイオフィルムとは微生物が排泄するスライムで囲まれた微生物の集合体であり、自動力のない表面または生きた表面に付着している。あなたはすでにいくつかのバイオフィルムを知っている:歯の上に付いたプラーク、川の石の上のぬるぬるしたスライム、花を1週間いけておいた花瓶の内部のゲル上の薄膜などである。すべての細菌の99%以上はバイオフィルム社会に住んでいる。汚水処理プラントは水から汚染物を除去するためにバイオフィルムに依存している。バイオフィルムはパイプを腐食させたり、水フィルターを詰まらせたり、医療インプラントの拒絶を起こしたり、そして飲料水を汚染させる細菌を保持したりすることによって問題も起こす。このページのTOPへなぜバイオフィルムについて学ぶのか?”微生物学者は伝統的に実験室内の培地に発育する浮遊細菌に焦点を当ててきた;しかし、彼らは最近になって自然界では多くの細菌はバイオフィルムとして凝集していることを認識するようになってきた。細菌は非常に異なった振舞いをする形態である。その結果として、バイオフィルムは今では微生物学における最もホットなトピックスの一つである。1996)あらゆる給水システムにおけるように、自動給水システムにおける細菌の99%は内部表面にくっついたバイオフィルムの中にいそうである。バイオフィルムは飲水中の浮遊細菌の多くの源泉であり、それらの細菌の中には実験動物に感染や病気を起こすものがある。一つの一般的なバイオフィルム細菌である緑膿菌は免疫系の抑制された動物に感染する二次病原菌である。動物の健康に影響する細菌の保有体であるばかりでなく、バイオフィルムはステンレススチールの配管システムに腐食も起こす。我々の顧客が要求する細菌学的品質を届ける自動給水システムを設計し操作するために、我々はバイオフィルムがどのようにできてくるか、バイオフィルムが起こす問題、そしてどうしたらそれを制御できるかを知らなければならない。バイオフィルムの中の細菌を理解することは今後に備える第一ステップである。供給し、フラッシングと消毒で水質を維持することによって、顧客の多くが要求する細菌学的水質基準の多くを満足してきている。1996参照)しかし、動物の飲水に塩素の使用が禁止されたらどうするか?あるいは、新しい特殊な動物の使用にともない水質基準がもっと厳しくなったらどうするか?もちろん、みなさんがバイオフィルムについて知りたいと思い、細菌がその環境に適応し我々が除去しようとする試みを回避する能力を知って驚嘆するかもしれない。このページのTOPへバイオフィルムができるまでバイオフィルムができるステップ清浄なパイプが水で満たされたとたんに、バイオフィルムが形成されはじめる。バイオフィルムは以下のステップでできてくる。表面のコンディショニング表面に付く最初の物質は細菌ではなくて微量の有機物である。これらの有機物は過剰の表面荷電と表面自由エネルギーを中和する“コンディショニング層”といわれている。過剰の表面荷電と表面自由エネルギーは細菌細胞が付着しはじめるのに十分近くまで接近するのを防いでいる。吸着された有機分子は細菌の栄養源として働くことが多い。図1.有機分子のコンディショニングフィルムから清浄表面への吸着。流水しているパイプの中では、浮遊微生物はパイプ壁に近づき、境界層すなわち流速がゼロに落ちているパイプ壁における静止ゾーンに取り込まれる。これらの細胞の中には、一定時間、表面にぶつかり吸着されてから放出されるものがある。これは可逆的吸着と呼ばれる。この最初の付着は静電引力と物理的な力に基づいており、化学的付着ではない。可逆的に吸着した細胞の中には、細胞を永久に表面に吸着させる構造を形成することによって、長い滞在の準備を始めるものがある。これらの細胞は不可逆的に吸着される。粘着性ポリマーを排泄する。これによってバイオフィルムを結合しそれをパイプ壁に接着する。これらのポリマー鎖は微量栄養素を捕捉し細菌を殺菌剤から保護する。Mittelman(1985)によれば、“付着は細菌細胞壁から外部に伸びる細胞外ポリマーによって仲介される(クモの巣の構造によく似ている)。この高分子物質すなわちグリコカリックスは、付着を容易にするばかりでなく微量栄養素を上層の水から捕捉し濃縮する作用もする荷電したポリサッカライドと中性のポリサッカライドからできている。グリコカリックスは付着細胞のために殺菌剤や他の有毒物質の影響を軽減する保護膜としても作用する。図3.野育ちの細菌は、表面に付着する細胞外ポリマーを持つ“毛だらけの”細胞である。(Mittelman1985)栄養素が蓄積するにつれて、パイオニア細胞は増殖しはじめる。娘細胞は自身のグリコカリックスを産生し、イオン交換表面のボリュームを大きく増加させる。細菌の発育コロニーができる。1992)図4.バイオフィルムは微生物と細胞外ポリマーの“蜘蛛の巣”からできている。成熟バイオフィルムにおいては、ボリュームの多くは細菌細胞(5~25%)よりもゆるく組織されたグリコカリックスのマトリックス(75~95%)で占められる(Geesey1994)。グリコカリックスのマトリックスは大量の水を保持しているので、バイオフィルムで覆われた表面はゼラチン状でつるつるしている。捕捉するだけでなく、グリコカリックスのネットは物理的抑制と静電相互作用を通じて他のタイブの微生物細胞も取り込む。これらの二次コロニー形成微生物は一次コロニー形成微生物の排泄物を代謝すると同時に、自分自身の排泄物を産生し、この排泄物を他の細胞が順に利用する。Borenstein(1994)によれば、これらの“他の細菌および真菌はパイオニア種によるコロニー形成の後にほぼ数日で表面にくっつく。完全に機能するバイオフィルム:種の協同的“債権者会”成熟した、完全に機能しているバイオフィルムはパイプ表面上の生きた組織のようである。それは、それぞれがカスタムメイドのミクロな生態的地位に活きる異なる微生物種から構成されている複雑で、代謝的に協同的な社会である。バイオフィルムは原始的な循環システムを持つとさえ考えられている。City’’に書かれている。“異なる種がスライム・シティの中で親密に生活し、お互いに助け合って、隣人らしい交互作用を通じて食糧供給を利用し抗生物質に抵抗している。ある種が産生する毒性のある排泄物はその隣人ががつがつと食べてしまう。公共のスライム・シティを建設するために生化学的資源をプールすることによって、数種の細菌は、それぞれ異なる酵素で武装して、単一の種だけでは消化できない食糧供給を消化する。ミクロゾーン間の化学物質とイオンの勾配によってバイオフイルムの周囲の物質を入れ替える力が生まわる。1996)バイオフィルムは発育し広がるバイオフィルムは通常の細胞分裂によって独自の速度で広がることができ、また定期的に新しい‘パイオニア’細胞を放出し配管の下流部分にコロニーを作る。バイオフィルムが発育して、境界層を通って流速が速く流れの強いゾーンにまで達する厚さになるにつれて、細胞の中には抜け落ちるものが出てくる。Mayette(1992)によれば、“これらの後のパイオニア細胞はその上流の先輩細胞よりもいくぶん得をする。親フィルムは排泄物を流れの中に放出し、それが下流のコロニーのできていないパイプ部分に最初の有機質コーティングとなるか、あるいは他のタイブの細胞の栄養物質になるからである。”図5.細菌および他の微生物はバイオフィルムの中に協同的コロニーすなわち”組合”をつくる。嫌気性バイオフィルムは好気性の層の下に発育する。バイオフィルムの厚さは、流水が荒れ狂う流れにまで広がってきた細胞を剥がすので平衡に達する。1994)バイオフィルムが発育する速度Mittelman(1985)によれば、成熟バイオフィルムの発育はそのシステムによって数時間から数週間と異なる。緑膿菌は一般的な‘パイオニア’細菌であり、多くのバイオフィルム研究で用いられる。1990)、研究者は緑膿菌細胞がステンレススチールに、電気研磨した表面にさえ、30秒以内の暴露で付着することを発見した。細菌の表面への付着とバイオフィルムの発育は生存メカニズムとしてみることができる。細菌は栄養を獲得し殺菌剤から保護されることによってベネフィットを得る。飲料水、とくに高純度の水道水は栄養の乏しい環境であるが、低すぎて測定できないほどの栄養濃度でも、細菌が発育し増殖するのに十分である。栄養の乏しい環境で発育できる細菌および他の微生物は低栄養微生物と呼ばれる。細菌は栄養素に遭遇する機会を増やすために、表面を発見し付着する手段を発達させてきた。運動性の細菌は化学的濃度勾配に沿って栄養濃度の高い方へ泳ぐことができる。化学的(栄養)勾配に反応して微生物が運動することを走化性と呼ぶ。緑膿菌は鞭毛を用いてパイプ壁の高い栄養濃度の方へ動く運動性の細菌である。緑膿菌がステンレススチール表面に付着することに関する実験において(Stanley1983)、研究者達は鞭毛を除去するために細胞をプレンダーの中に入れた。くの微生物は精製水システムで遭遇する飢餓状態に直面すると、表面への親和性を高めるために細胞壁の構造を変化さえることによって応答する。外膜のタンバクと脂質の構成を変化させることによって、荷電と疎水性を変化させることができる。細胞壁は疎水性になる。“このような疎水性の細胞は水コラムからの出口を見つけること以外に何も要求しない。境界層(流速がゼロに下がっているパイプ壁のデッドゾーン)にはいると、細胞はパイプ表面に引きつけられる(Mayette1992)。細胞外ポリマー産生いったん表面に達すると、細菌壁はその粘着性のポリマーで表面に自身を据え付ける。単純なフラツシングではもはやこれらの細胞を除去するには適切でない。“いったん微生物が付着したら、それらは通常の消毒プロセスに耐えることができなければならない。バイオフィルム細菌は殺菌剤に対する抵抗性を発揮する。これはすごいことである(LeChevallier1988)”この研究者はバイオフィルムを伴った細菌は浮遊細菌よりも遊離塩素に対して150~3000倍、モノクロラミンに対して2~100倍抵抗性が高いことを証明した。別の研究者の仕事(Anderson1990、下記要旨参照)は、緑膿菌はその攻撃物をかわす賢明な手段を持っていることを示唆している:緑膿菌はパイプ内部にたまる粘着性のスライムを分泌する。給水システムの中をフラッシュされる殺菌剤は浮遊微生物を殺すが、粘着性のバイオフィルムに埋没された細菌には触れることができない。その共同研究者達はプラスチック製パイプに2株の緑膿菌で汚染された水を充填した。緑膿菌を8週間培養した後に、細菌が増殖した水を捨て、パイプに塩素を含む殺菌剤を7日間かけた。その後に、パイプに蒸留水を再充填し、“クリーンな”水を定期的にサンプリングした。両株は化学処理したパイプの中で生き続け、そこで再びコロニーを作った。細菌がバイオフィルムの中にいるとき、細菌は殺菌剤に非常に抵抗性である。守るために微生物は多くの細胞外ポリマーを産生することが多い(Borenstein1994)。”どのようにしてバイオフィルムは消毒薬から保護されるか?保護シールドバイオフィルムを形成する細胞を破壊するためには、消毒薬は先ず周囲のポリサッカライドネットワークと反応しなければならない。細胞自身は実際的に抵抗性ではなく、どちらかというと自分自身を保護シールドで囲んでいる。消毒薬の酸化カは細胞に到達する前に使い果たされている。細胞がパイプ壁に付着するとき、消毒薬のデリバリーは、境界層を横切りバイオフィルムを通過するその化合物の拡散率によって制限を受ける。消毒薬がバイオフィルム中の細菌細胞に到達するには、浮遊微生物よりも、長い接触時間にわたる高濃度が必要である。Engineeringによる最近の研究は細菌とバイオフィルムに関する初期の仮説を駆逐した。プログラムによって設立された。その任務はバイオフィルムのできるプロセスを理解し、コントロールし、そして利用するための基礎知識と教育を進めることである。過去において、微生物学者はバイオフィルムは特定の構造またはパターンなしに位置している細菌の無秩序な固まりを含んでいると仮定していた。ゲル上の構造を破壊せずにバイオフィルムを拡大してみせる新しい技術によって研究者達は、あたかも衛星から都市を見るかのように、複雑なバイオフィルムの構造を発見することができた。City”(Coghlan1996)に書かれている:“多くの場合に、バイオフィルムの底は厚さが5-10ミクロンの緻密で不透明なスライムの床である。それは、ポリサッカライド、他の高分子物質および水、細菌が産生するあらゆるものの粘着性の混合物である。100~200ミクロン上にまいあがっているのはマッシュルームか松かさのような形をした細菌のコロニーである。酸素が行き来している。”図6.共焦顕微鏡を用いた直接観察に基づく単一種バイオフィルムの構造の概念図。単純な円錐形構造をしているミクロコロニーもあれば、マッシュルームのような形をしているものもある。水流(矢印)がコロニーの間のチャンネルを流れ栄養や排泄物を運ぶ。(Costerton1995)注:定期的にフラッシングされている自動給水システムでは、バイオフィルムの厚さは200ミクロン以下でなければならない。バイオフィルムの厚さと流速の項参照。過去の研究者は、バイオフィルム細菌は単独で浮遊している微生物のように行動すると考えていた、現在、バイオフィルム細菌は、自由に動きまわるいとこ細菌と全く同じ遺伝構造を持っていることは確かだけれども、その生化学は、それらが異なるセットの遺伝子を用いるようにスイッチしているので非常に異なることを発見している。Engineeringは緑膿菌がどのようにバイオフィルムを形成するかを研究した。菌がガラスにつくやいなや、菌はアルギン酸塩(通常、スライムの粘着性の形態)の合成に関与するある遺伝子にスイッチし、いったん細菌がアルギン酸塩に取り込まれるとそのスイッチを切る。現在、研究者達は、細菌細胞壁に存在するタンパクの30~40%もが固着菌と浮遊菌(‘都会生活者’と‘フリー浮浪者’とCoghlanによって呼ばれている、1996)とで異なっていると推定している。抗生物質の標的の中にはもうそこにはいないものがあるので、細菌を殺すことが難しくなる。これが主としてヒトおよび動物の内部のバイオフィルムの問題である。化学的シグナル研究者達は、細菌にバイオフィルム中での生活に会うように生化学を変化させるようにシグナルを送る化学物質(シグマ因子と呼ばれる)を研究している。バイオフィルム細菌を浮遊菌に変化させる“逆シグマ因子”を発見できれば、バイオフィルムを“排泄シグナル”を送ることによって(Coghlan1996)溶解することが可能になる。消毒の意味するところ伝統的な消毒試験は単一種の浮遊実験室内培地を用いて行われてきた。ある消毒薬のCT定数は特定の細菌を殺すのに必要な(濃度)・(時間)で求められる。CT値はバイオフィルム中の細菌に外挿するべきではない。これは、自動給水システムにおいて何を意味するか?一つには、水が低濃度の塩素を含んでいるときでも、どのようにして菌数を数えるかを説明する。この量の塩素は、浮遊細菌を殺すことがわかっているが、バイオフィルム細菌を殺すには不十分である。抜け落ちたバイオフィルムの断片はプレートカウントで現れる生菌を含む。これは重要なスライム産生菌で塩素耐性の強い緑膿菌では特別な問題である。ppmの塩素が必要であると決めた。表面の材料はバイオフィルムの発育にほとんどまたは全く影響しない。ステンレススチールはプラスチック製パイプと同じく感受性である。Mayette(1992)によれば、“微生物が付着することができない配管材料はまだ発見されていない”。研究によれば、微生物はステンレススチール、テフロン、PVCおよびPVDF(Kynar)にほば等しい情熱を持って付着することがわかっている。ある文献は、バイオフィルムの付着を遅らせるあるいは減らすために抗菌性添加物をプラスチックに入れることについて述べている(Hamilton1988)。彼らが用いた化学物質は飲料水供給には安全ではない。あるイオン交換樹脂を銀コーティングして微生物の発育を防いだ。銀耐性の細菌集団が発育する可能性がある(Flemming&Geesey)。飲料水には毒性のある表面コーティングの実際例はない。表面におけるバイオフィルムの発育を比較した。日後、表面に発育する微生物の数を比較した。表面における細胞の量には差がなかった。倍の微生物がついていた。表面の粗さにおける違いについては2つの理由が提案されている。1)粗い表面は表面積が広い2)粗い表面ははぎ取る力(流れ)からの保護が大きい。純水システムにおけるバイオフィルムの発育に影響する一つの重大なファクターは表面積である。工業用水システムは、多くの自然環境(湖や河)と異なり、付着するための驚くほどの量の表面積を提供する。RO樹脂、DI樹脂、貯蔵タンク、カートリッジフィルター、および配管システムの全ては細菌の付着と発育に適した表面を提供する(Mittelman1985)。表面の滑らかさ滑らかな表面は付着細菌の最初の増強を遅らせるけれども、滑らかさは表面に付着するバイオフィルムのトータルの量には有意に影響しないように思われる。Meltzer(1993)によれば、”生物汚染を免れる表面は見つかっていない。表面構造は汚染の速さに影響するようであるが、暴露の最初の数時間に限られているようである。滑らかな表面は粗い表面よりも最初の汚染速度は遅いが、数日を経過した後のバイオフィルム形成は避けられない。“この結論はステンレススチールに対する緑膿菌の付着に関する研究に基づいている(下記実験要旨参照)。ステンレススチールに対する緑膿菌の付着率を比較した。1)平方センチあたりに付着する最大菌数はステンレススチールのタイプすなわち表面の粗さに関係なかった。3)疎水性細胞壁を持つ株は実験した表面の粗さに関係なく同じ速度で付着する。表面により速く付着し、電気研磨した表面に最小の付着をした。純水中では細菌は疎水性になるように細胞壁を変化させることを銘記のこと。速い水流速度は、バイオフィルムの発育を変化させるが、細菌のパイプ表面への付着を防止しない。この結論はMittelman(1985)、Patterson(1991)およびMeltzer(1994)によって支持されている。速い流速は、以下の理由により細菌の付着を防止しないか、既存のバイオフィルムを除去しない:境界層における遅い流れ水流速度に関係なく、パイプ表面に隣接する層において最も遅く流れる。パイプ中央における水流が荒れ狂っているときでも、水流はパイプ壁ではゼロに落ちている。流速が乱れていないパイプ壁からの距離は境界層あるいはラミナー亜層と呼ばれる。ラミナー亜層の厚さはPittner(1988)によっていろいろな流速と5つのサイズのパイプについて計算された(下表参照)。Pittnerはラミナー亜層内のかきとる力は細菌細胞を除去するのに必要なよりも低い。34*流れはこれらの条件では乱れていたり乱れていなかったりする。持続的な速い流れの水システムでは、バイオフィルムに集積する細菌は、とくにフィラメントによる付着に適したフィラメント状変種(緑膿菌のような)になる傾向がある。細菌はその‘粘着性の’細胞外ポリマーで表面に錨をおろす。速い流速は細菌がパイプ表面に付着するのを防止しないけれども、バイオフィルム構造に以下の影響を持つ。密なバイオフィルムMittelman(1985)によれば、速い流速では、より密で、ややよりしっかりしたバイオフィルムが形成される。その結果として、触ってもぬるぬるしていないので、汚染物から離れることが多い。限られたバイオフィルムの厚さバイオフィルムの最大の厚さはラミナーフロー層の厚さであると考えられる(表1参照)。一定速度のシステムでは、“水流や栄養に関係のない平衡の厚さに達する。ラミナー層を越えてバイオフィルムが発育する結果、浮遊性‘パイオニア’細胞が遊離し、これが、条件が許せば、パイプの別のセクションにバイオフィルムを形成する。”(Patterson1991)定期的にフラッシングされている自動給水システムのような、水の流れが変動するシステムでは、細菌はフラッシング中に抜け落ちる。この結果として、細菌のランダムな‘微細シャワー’となり、これによって総菌数に見られる毎日の変動を説明することができる。他の生物と同じように、細菌は発育と増殖のためにある栄養を必要とする。これらの栄養を制限すると、細菌の発育が制限を受けるが、“高純度のシステムにおける栄養レベルは細菌を厄介なほどに発育させ増殖させるのに明らかに十分である(Husted1994)。”表2は純水システムにおける栄養源のいくつかをリストしている。Geesey(1990)によればイエスである。パイプおよびポリアミドパイプから滲出してくるパイプセメントと成型材は細菌の有機炭素源になりうる。膜も栄養源になりうる。水に水素添加しなければならない理由である。細菌はステンレススチールや他の金属成分から金属栄養を取り込む。完全な発育条件下では、細菌細胞は20分ごとに2つの娘細胞に分裂する(Harfst1992)。これは、一つの細胞とその子孫が8時間で200万以上の細胞に、あるいは24時間で4,000,000ボンドの細菌になる勘定であることを意味する。この発育速度は、スペースと利用できる栄養に限界があるために、(とくに清浄な飲水中では)実際は決して達成されない。細菌は“餓死”しうるか、あるいは、少なくとも有機質栄養と酸素を取り上げることによって発育を抑制することができるか?あいにく、微量の有機質でも多くの細菌を養うことができる。これは、Pittnerによる以下の例で説明される。mlのサンプル中に存在する。”すなわち1ppb有機質一9,500個の細菌/ml現在利用できるテクノロジーでは栄養レベルを完全に減らすことができないので、細菌の完全なコントロールは単に栄養をコントロールすることによっては達成できない。同様に、“非常に少量の酸素が、たとえ細菌が嫌気性呼吸に変異しないとしても(多くの細菌はこの能力を持っている)、贅沢な細菌発育を支えるのに十分である。これらの理由のため、発育中の細菌集団は高純度の給水システムの中でも生存することができる。1988)栄養の乏しい環境は実際には細菌の表面への付着を促進する。そこは微量有機質が集積しバイオフィルム中の細胞外ポリマーが微量栄養を捕捉するところであるからである。細菌を完全に飢餓にすることはできないけれども、栄養に乏しい逆浸透水が通常の飲料水供給よりもバイオフィルムを少なくする。このページのTOPへ細菌細胞の大きさ、割合、そして給水システムこれまで、この論文はバイオフィルム層がいかに給水パイプの内部に発育するか、そしてこの層がいかにして流速と栄養レベルに依存しながら平衡の厚さになるかを述べてきた。表面の滑らかさがバイオフィルム付着に影響する重要な要因でないことも考察した。ミクロンに制限されれば、これは何個の数の細菌の厚さか?それは、パイプ壁に、あるいはパイプ表面の溝の中に嫌気性菌のゾーンがあると見なすのに十分な厚さか?バイオフィルムの厚さを1/2”ステンレススチールパイプの内部直径とどのように比較するのか?このセクションでは、個々の細菌細胞の大きさと割合を、表面の粗さ、バイオフィルムの厚さそしてパイプ直径とどのように比較するかを示す。定義される酪農基準であった。線の数を表す:数が多いほど仕上げが滑らかである。コーディングを使用しているが、表面の粗さをもっと正確に測定できるシステムに動いている。表面の粗さはプロファイルメーターで測定できる。これは表面プロファイルを横切ってトレースするために用いられる鉄筆装置である。RMS(中心線からの隔たりの自乗平均)のいずれかで表される。値はミクロン(またはミクロインチで表される。RMSは特定表面でRAの数よりも約11%高い。l.11=RMS]製薬用の水のためのステンレススチール配管の仕上げMeltzer(1993)によれば、”ステンレススチールの表面仕上げに普遍的に受け入れられる基準はない。仕上げのものが一般的である。後に電気研磨を行っていた。表面に仕上げたパイプを流れている。パイプは電気研磨したステンレススチールと同じ滑らかさである。細菌細胞の大きさの幅における重大な不規則性はない。ミクロインチの滑らかさを指定することができる。室内配管およびマニフォールドに用いられているステンレススチール管材料には溶接した合わせ目があるが、定められた内部表面の滑らかさを持っていない。滑らかに見えるかぶせ仕上げであるが、かぶせ中に平らな金属によって作られる裂け目がある。320これらの値は多くの試験の平均データである。これらのデータを出すには多くの変数があるので±5%の備差が考えられる。Finishersから。測定した粗さを知り、表面のおおよそのプロファイルを引くことができる。(図7参照)バイオフィルム細菌細胞の典型的な大きさ非常に一般的なバイオフィルム細菌は緑膿菌である。