NY)によって供された。Germany)によって製造された。Germany)から得た。(UK)から供給された。7403-7406に記載の方法によって製造された。化合物1は、次いで、トリエチルアミン及びジメチルアミノピリジンの存在下、ドデシルホスホン酸ジクロライドでリン酸化し、テトラ−O−ベンジル−ミオ−イノシトール−1,2−シクロ−ドデシルホスホン酸(以下、化合物2)を得た。10%パラジウム炭で接触水素化することによって、化合物2を脱ベンジル化し、ミオ−イノシトール−1,2−シクロ−ドデシルホスホン酸(以下、化合物3、又はGPI−2350)をジアステレオマーの混合物として得た。化合物2(図1)の合成のために、1g(1.8mmol)の化合物1を、メチレンクロリド60ml及びトリエチルアミン1mlに溶解し、ジメチルアミノピリジン200mg及びドデシルホスホン酸ジクロライド1g(10mmol)を加えた。この反応溶液を45分間室温で放置した。酢酸エチル50mlを加え、混合物をシリカゲルで濾過した。溶媒を濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(n−ヘプタン:酢酸エチル=1:1、v/v)で精製した。TLC:n−ヘプタン/酢酸エチル(1/1、v/v)、Rf=0.7。MS:(M+Li)+=761.4、計算値C60H59O7P、M=754.9。化合物3(図1)の合成のために、505mg(0.67mmol)の化合物2を酢酸エチル5mlとメタノール15mlの混合物に溶解した。パラジウム(10%)炭700mgを加えた後、反応混合物を水素添加(6時間、1気圧H2)した。パラジウムをシリカゲルで濾過し、メタノール100mlで洗浄した。溶媒を濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(メチレンクロリド/メタノール、5/1、v/v)によって精製した。TLC:メチレンクロリド/メタノール(5/1、v/v)、Rf=0.15。MS:(M+Li)+=401.2、計算値C18H35O7P、M=394.4。化合物3は、塩基性溶媒よりも酸性溶媒下の方が不安定である。メタノール中では何日も安定であり、乾燥非晶質固体は4°Cで何年も安定である。記載されたようにして調製した)の存在下又は非存在下で、37°Cにて振とう水浴中で、5%CO2/95%O2で一定でバブリングしながら、インキュベーション容積1ml当たりパックした細胞容積100μlの最終力価(少量の一定量(アリコート)を毛細管ヘマトクリットチューブに吸引し、脂肪細胞による懸濁液の分画占有を定量するためにマイクロヘマトクリット遠心機で60秒遠心して決定する;10%サイトクリットは約1.5×106細胞/mlに相当する)で、指定された期間インキュベートした。infranatant)から調製した。原形質膜を脱脂したポストニュークレアー・インフラネイタントの分画遠心法によって得、前に記載した(48、53)ようにしてショ糖及びパーコールクッションを通して2回逐次遠心によって精製し、最後に25mMトリス/HCl(pH7.4)、0.25Mショ糖、1mM・EDTAに2mgタンパク質/mlで懸濁した。報告されたようにして界面活性剤法及び不連続ショ糖勾配遠心分離によって得た。15〜22%(画分4〜5)及び28〜35%(画分8〜9)ショ糖インターフェースの光散乱乳白色バンドを、屈折率を用いた濃度測定で、それぞれ、hcDIG及びlcDIGとして集めた。記載されているように適切なマーカーの豊富な部分/乏しい部分により特徴づけ(免疫ブロット法、酵素アッセイ法)、或いはトライトンX−114分画法(下記を参照)にかけた。カベオリンの免疫沈降のために、DIGを10mMトリス/HCl(pH7.4)、150mM・NaCl、1%トライトンX−100、60mMβ−オクチルグルコシド、0.3%デオキシコール酸、5mM・EDTA、0.5mM・EGTA、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、50mM・NaF、1μMミクロシスチン及びプロテアーゼ阻害剤の溶液に可溶化し(1時間、4°C)、遠心分離した(50,000×g、30分間)。免疫ブロット法のために、DIGを2倍のLaemmli試料バッファーに可溶化し遠心分離した(10,000×5、5分間)。従って、200mMトリス/マレイン酸(pH7.0)及び1%NonidetP−40溶液100μl中のヒト胎盤aP溶液(10mM・Hepes/NaOH、pH7.0、150mM・NaCl中100単位/ml)10μlと10分間、37°Cにてインキュベーションし、次いで0.4mlの氷冷停止バッファー(10mM・Hepes/NaOH、pH7.0、150mM・NaCl、0.1mM・MgCl2及び0.01mM酢酸亜鉛)を添加して反応を停止することによってアッセイした。記載のようにして、50mMトリス/HCl(pH8.0)、0.25%Nonidet/P−40及び5mM・EDTA溶液50μl中のひと胎盤aP溶液(上記を参照)5μlと、30分間、37°Cにてインキュベーションし、次いで停止バッファー0.45mlを添加して反応を停止することによってアッセイした。PI−PLC(B.cereus)及び脂肪細胞GPI−PLC(5〜25μg原形質膜又はhc/lcDIG)を、20mM・Hepes/KOH(pH7.8)、144mM・NaCl、0.1%TX−100、0.2mM・MgCl2溶液100μl中のウシ赤血球アセチルコリンエステラーゼ(AChE)溶液10μl(10mMトリス/HCl、pH7.4、144mM・NaCl、0.1%TX−100中12単位/ml)と1時間、25°Cにてインキュベーションし、次いで氷酢酸5μl及び次いで10mMトリス/HCl(pH7.4)、144mM・NaCl、0.4mlを加えて反応を停止することによってアッセイした。各反応混合物を、TX−114分配にかけた(以下を参照)。GPI−PLC/D活性は、TX−114消耗相中で測定された親水性aP又はAChEの活性と分配前に測定された総活性の比率から計算され、そして(G)PI−PLC/Dを欠いたブランクのインキュベーションで現れたTX−114消耗相(総活性の10〜20%の割合を占める)中の非酵素バックグランドに対して補正された。記載されたようにして、放射能標識トリオレイン液滴エマルジョンを使用して測定された。記録pHスタット(1,000rpm、25°Cで撹拌)を用いてpHを6.5に調節しつつ、同じバッファー中のブタPL及びコリパーゼとインキュベーションすることによって定量した。PC−PLCは、10mMジパルミトイルレシチン0.2ml、10mM・SDC0.1ml及び0.03M・CaCl20.1mlをバクテリアPC−PLC(50mMトリス/HCl、pH7.5、0.1%BSA)と、10分間、37°Cにてインキュベーションすることでアッセイした。反応は、50%TCAを0.1ml、次いでクロロホルム/メタノール(66/33/1、容量比)を2.5ml加えることによって停止した。遠心分離(1,500×g、15分)後、メタノール/水相(約1.33ml)の上部0.2ml部を除き、60%HCIO40.5mlを補充し、次に170°Cで1時間加熱して、最終的に無機リン酸塩を分析した。哺乳類PI−PLCは、10mM・PI0.1ml、0.8%デオキシコール酸ナトリウム0.1ml、0.1%BSA、100mMホウ酸ナトリウム(pH7.5)0.2ml、及びラット肝PI−PLCを20分間、37°Cでインキュベーションすることによって測定した。反応を停止し、PC−PLCで記載したようにして更に処理した。PLDを40mM・Hepes/KOH(pH6.0)、4mMCaCl2及びキャベツPLD溶液250μl中1.6mM(U−14C)ホスファチジルコリン(約2,000−4,000dpm/nmol)でアッセイした。30分間、37°Cにてインキュベーションの後、反応を、キャリアーホスファチジン酸含有クロロホルム/メタノール(2/1、v/v)5mlを加えて停止した。水可溶性物質を除去した後、最後の洗浄低クロロホルム相中に含有される脂質を、加熱活性化したシリカゲルプレートに転送し、第1次元方向にクロロホルム/メタノール/アンモニア(65/35/4、体積比)を使用し、第2次元方向にクロロホルム/アセトン/メタノール/酢酸/水(50/20/10/10/5、体積比)で2次元的に分離した。放射性ホスファチジン酸を蛍光イメージングにより検出した。使用してフィットさせた。Scientific)。【0079】カベオリンの免疫沈降:可溶性DIG(上記を参照、5〜20μgタンパク質)は、プロテインA/G−セファロースでインキュベーションし、次いで遠心分離(10,000×g、5分間)することにより事前に確かめた。上清を、10mMトリス/HCl(pH7.4)、150mM・NaCl、1%TX−100の1ml中で、プロテインA/G−セファロースに前もって吸着させた抗カベオリン1抗体と4°Cにて1時間インキュベートした。免疫複合体を、同じバッファーで2回、次いでTX−100不含のバッファーで2回洗浄し、最後にβ−メルカプトエタノールなしで行うSDS−PAGEにかけた。免疫沈降カベオリンの回収は、膜の細片化に次いで、同じブロットの抗カベオリン抗体による均一免疫ブロッティングを行うことによって正常化された。4553-4567”に記載されたように半乾燥法を用いてポリビニリデンジフルオライド膜に移した。洗浄した膜を抗カベオリン1抗体(1:2,000)、抗pp59Lyn抗体(1:1,250)、抗aP抗体(1:500)、抗5’−Nuc抗体(1:750)および抗IRS−1抗体(1:2,000)を15°Cにて4時間インキュベートした。洗浄した膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した、ヤギ抗マウスIgG2次抗体(1:2,000)又はヤギ抗ウサギIgG2次抗体(1:4,000)とインキュベートした。標識したタンパク質を増強したケミルミネセンスによって可視化した。記載された、TX−114が豊富な相とTX−114が枯渇した相との間の分配を使用して、両親媒性タンパク質及び親水性タンパク質に分離した。氷上で1時間インキュベーションした後、混合物を氷上で0.25Mショ糖及び25mMトリス/HCl(pH7.4)溶液0.4mlのクッション上に重層した。相分離を37°Cに暖め、次いで遠心分離(10,000×g、1分間)することによって誘導した。下のTX−114が豊富な相の再抽出後、集めた上のTX−114が枯渇した相の一定量を5’−Nuc、aP及びAChE活性について測定するか、又は、SDS−PAGE分析用に沈殿(15%ポリエチレングリコール4,000)させた。記載されたようにして定量した。4708-4723"に記載されたようにして実施した。記載されたようにして、前もって標識され、イソプロテレノール刺激をされた脂肪細胞からの、グリセロール又は蛍光NBD−FAの放出として測定した。hc/lcDIG(10〜50μgタンパク質)を8−N3−[32P]cAMPで光標識化し、次いで蛍光イメージングすることによって検出した。293-302"に従って測定した。IL)のBCAタンパク質測定キット、及び較正基準としてBSAを使用して測定した。CA;10%Bis−Tris分離ゲル、モルホリノプロパンスルホン酸−SDSランニングバッファー)を使用して実施された。Diagnostics)を使用したルミイメージャーで評価した。Germany)を使用して処理し定量化した。CA)を使用して構築した。【0084】GPI−2350は、高力価及び選択性を有する種々の起源の(G)PI−PLC/Dを阻害する:(精製した、又は、未精製の)B.cereusPI−PLC、T.bruceiGPI−PLC及びラット血清GPI−PLDに対するGPI−2350の効果を、適切な条件下(低又は高界面活性剤濃度)で、GPI−2350の濃度を増加しつつ、部分的に精製した可溶化GPIタンパク質と共にそれらをインキュベーションすることによって観察した。総GPIタンパク質に対する、消化混合物中に脂肪分解的に切断されたGPIアンカーを内蔵する親水性GPIタンパク質の比率を、TX−114分配で界面活性剤が枯渇している相、及び分配前の総消化混合物、それぞれにおける酵素活性の測定によって定量した(図2)。GPI−2350は、細菌、トリパノソーマ及び血清(G)PI−PLC/Dを、それぞれ10、2及び1μMのIC50で、明らかに阻害した。GPI−2350は、又、酵素源として可溶化原形質膜、lcDIG又はhcDIGを、及び基質としてAChEを使用すると、ラット脂肪細胞GPI−PLCを0.2〜0.5μMのIC50で遮断した。脂肪細胞GPI−PLCの切断特異性を明らかにするため、本発明者らは、ミオ−[14C]−イノシトールで代謝的に標識されたサッカロマイセスセレヴィシエスフェロブラストから調製したGPIタンパク質、Gce1を使用した。hcDIGとのインキュベーションで、親水性及び14C標識されたGce1が生成され、それはcIPに対して生じる抗CRD抗体と濃度及び時間依存的に免疫沈降した(データは示さない)。脂肪酸アシル鎖を欠きcIPを内蔵するGPIタンパク質の、hcDIG依存的な生成により、ラット脂肪細胞の原形質膜にGPI−PLCの発現が確認された。次に、GPI−2350の選択性を試験した。種々の起源からのいくつかの天然リパーゼ(HSL、PL、LPL)及び異なった特異性(A2、C、D)のPC/PI特異的ホスホリパーゼそしてウシAChE(これらは全ていわゆる触媒三点セットを経て作動することが知られている)は、細菌、トリパノソーマ、血清及びラット脂肪細胞GPI−PLC/Dを60から95%遮断する濃度(50μM)下では有意な影響は受けなかった(図3)。cIPの代わりにオープン(open)を内蔵するGPI−2350の二つの誘導体2−デオキシ−2−フルオロ−scyllo−イノシトール−1−O−ドデシル−ホスホン酸(GPI−1793)及びミオ−イノシトール−1−O−ドデシル−ホスホン酸メチルエステル(GPI−2349)は、試験した最高濃度で脂肪細胞GPI−PLCに対して、それぞれ温和から非常に温和な効果を有するだけであったが、しかし、細菌及びトリパノソーマ(G)PI−PLCを同程度の力価で阻害した(表1)。これらの知見は、安定した又は一過性の1,2−環状リン酸結合の生成を含む触媒機構における類似性を示しているが、しかしながら、細菌、トリパノソーマ及び脂肪細胞(G)PI−PLCの間の基質認識における幾分かの相異も示している。後者がcIP中間体を経由して作動、予備的な動態試験に基づいていると仮定すると、GPI−2350は拮抗阻害剤(Ki=3〜20μM)として作用することを仮定しなければならない。このことは、中性リパーゼ及び哺乳類PC/PI特異的ホスホリパーゼはGPI構造を認識しないので、その顕著な選択性を説明できるであろう。拮抗的作用機構に一致して、GPI−2350による細菌及びトリパノソーマ(G)PI−PLCの半値阻害は、過剰の新鮮なGPIタンパク質基質との反応混合物の10倍希釈において完全に逆転した。対照的に、再単離及び充分な洗浄に先立って50μMGPI−2350で処理した脂肪細胞hcDIGは、GPI−2350非存在下でインキュベーションすると、精製した可溶化AChEに対しては、低い脂肪分解的切断のみを呈した(データは示さない)。このことは、両親媒性GPI−2350のhcDIGとの相互作用により説明することができるであろう。GPI−2350は、遷移状態類似体として作用し、脂肪細胞GPI−PLCの活性部位への(一過性の)共有結合を受けるのであろう。GPI−2350の環状リン酸結合が(G)PI−PLC/Dによって開環されるかどうかを知ることは、興味あることであろう。【0086】GPI−2350は、単離されたDIG及び無処置の脂肪細胞においてGPIタンパク質のインスリン誘導及びグリメピリド誘導切断をブロックする:GPI−2350及びGPI−PLCの両者が別々の複合体(それぞれ、界面活性剤ミセル及びDIG)で存在するとき、インビトロにおける脂肪細胞原形質膜GPI−PLCによるGPIタンパク質の切断に対するGPI−2350の介入の観察に基づいて、次に、基質としての内因性又は外因性GPIタンパク質の無処置の脂肪細胞及び単離されたDIGにおける基本的及び促進されたGPI−PLC活性に対するGPI−2350の効果について試験した(図4)。単離されたラット脂肪細胞において、GPI−PLC活性(内因性5’−Nuc、Gce1及びaPの切断として、それらの両親媒性から親水性への変換の観察が伴う)は、グリメピリド及びインスリンの両者によって(それぞれ、5倍及び3倍まで)促進された(パネルE、G)。促進は、これらの前処置した脂肪細胞から調製されたhcDIGにおいて部分的に保存されていた(パネルC)(それぞれ、3倍及び1.7倍)。GPI−PLCは、グリメピリドで処理されなかった脂肪細胞から調製されたhcDIGの直接インキュベーションにより際だって活性化されたが、インスリンではそうでなかった(パネルA)。GPI−2350は、基本よりも低く、そして単離されたhcDIG及び未処理の脂肪細胞の両者において同じようなレベルで、濃度依存的に基本のGPI−PLC活性を減少させ、同様にグリメピリド及びインスリン誘導GPI−PLC活性を減少させた(図4、全てのパネル)。阻害剤がインスリン又はグリメピリドとのインキュベーションより前に、及びインキュベーションの間に存在していたので、明らかにGPI−2350は、GPI−PLCの活性を妨害しない(パネルC、E)。未処理の脂肪細胞でアッセイする場合、GPI−PLCの阻害のIC50は(5〜10μM、パネルF)は、単離された未処理のhcDIGに比較してより高く(1μM、パネルB、D)、同様に可溶化hcDIG及び原形質膜(0.2〜0.5μM、図2)に比較して、より高かった。このことは、単離されたDIGと比較して未処理の脂肪細胞の原形質膜においてDIGの中に埋め込まれた場合、GPI−2350に対してGPI−PLCの触媒部位の接近し易さが損傷されたことを反映しているのであろう。GPI−PLCの主要な基質、GPI脂質及びタンパク質アンカーは原形質膜の外小葉に局在化しており、そしてGPI−2350はGPI−PLCの触媒部位の(拮抗)阻害剤として作用しているようであるので(上記を参照)、その両親媒性を基本として、むしろ高いと予測されている、GPI−2350の細胞透過性の必要性は、多分除外することができる。DIGの液体定序ドメインよりもむしろ非DIG領域の無秩序ドメインへ選択的に分配される界面活性剤に類似している脂肪細胞原形質膜(総細胞表面の80〜90%を含む)の非DIG領域に、GPI−2350はそのドデシル鎖を経て自然に分配されることが考えられる。【0087】DIG及び原形質膜の単離に使用された実験的条件下で、単離された総原形質膜中のGPI−PLC活性の65〜85%(外因性AChEの切断として測定)が、脂肪細胞の処理に関係なくDIG(即ち、hcDIGプラスlcDIG)により回復した。同様の回復が、典型的なDIGマーカータンパク質、カベオリン1(70〜90%)(免疫ブロット法により定量した)、及びDIG常在性タンパク質、p115(55〜75%)(合成PIGの結合により定量した)について観察された。区別を付けて処理した脂肪細胞からDIG(hcDIGプラスlcDIG)で回復したaP、5’−Nuc及びGce1の総量(両親媒性プラス親水性のもの)は、おおよそ一定(基準を100%と設定して90〜140%)であって、このことは種々の条件下でDIGの単離手順の再現性を明示している。単離されたhcDIGは、lcDIG及び非DIG領域よりも比較的低いタンパク質含量により特徴づけられているので、GPI−PLCは、残りの原形質膜に対してhcDIGが非常に豊富であり、GPIタンパク質基質の局在化と一致している。DIG内でGPIアンカーされた及びアシル化されたシグナル伝達タンパク質の局在及び刺激依存性再分配に影響するかどうかを研究した。このために、グリメピリドで処理する前にGPI−2350の非存在下又は存在下でインキュベートした脂肪細胞からhc/lcDIGを調製し、次いでいくつかのGPIアンカーされた又はアシル化されたシグナル伝達タンパク質の存在につき分析した(図5)。基本の脂肪細胞に比べてhcDIGの量の70から90%の損失に相当する、lcDIGの量の3から5倍の増加に見られるように、グリメピリドに反応したhcDIGからlcDIGへのpp59Lyn、Gce1及び5’−Nucのしっかりした再分配は、GPI−2350の最大有効濃度の存在下で殆んど完全に止められた。対照的に、lcDIGに対してhcDIGにおいて、hcDIG常駐タンパク質であるカベオリン1及びIRβが比較的豊富であること、並びにhcDIG及びlcDIGにおいてグルコース輸送体イソ型4(Glut4)が同様に多量であることの両者は、グリメピリドに影響されず、GPI−2350の存在下で顕著には変化しなかった(図5)。このことはGPI−PLCの強力な阻害は、DIGの構造における一般的且つ非特異的変化をもたらすよりはむしろhcDIGからlcDIGへの、Gce1及びpp59Lynのような、ある種の脂質修飾シグナル伝達タンパク質の刺激依存性転移を、特異的に妨げることを明らかにしている。次に、GPI−PLCの作用とGPIタンパク質の再分配の間の推定因果関係、即ち脂肪分解的切断及び/又は非切断GPIタンパク質は、刺激された単離ラット脂肪細胞において、実際にlcDIGに転移するのか否か、の根底にあるメカニズムを研究した。このために、ラット脂肪細胞をGPI−2350と共に、又は、無しにインキュベートし、インスリン又はグリメピリドを作用させた。総原形質膜、hcDIG及びlcDIGから回収されたGPIタンパク質、即ち5’−Nuc、aP及びGce1の親水性型及び両親媒性型の量は、TX−114分配によって定量された(表2)。インスリン及びより強力なグリメピリドでの処理は、GPI−2350によって完全にブロックされた原形質膜の親水性GPIタンパク質の増加をもたらし、効率的なGPI−PLC阻害を示している。インスリン及びグリメピリドの両者に応じて、親水性GPIタンパク質の量の増加が、もっぱらhcDIGにおいてのみ検出され、同じ位置での両親媒性型の減少を伴っていた。これらの変化は、GPI−2350の存在下で更に低い基本値に逆転し、この両親媒性から親水性への変換という脂肪分解性を示していた。それ故、hcDIGでのインスリン/グリメピリド促進GPI−PLCによって生成する親水性GPIタンパク質は、GPIアンカーによらない分子機構を経てhcDIGに関連して残る(表2)。興味深いことに、hcDIGからlcDIGへの5’−Nuc、Gce1及びaPのグリメピリド誘導再分配(図5参照)は非切断型に限定され、両親媒性においては3から4倍上昇したレベルであるが、lcDIGで回復した親水性GPIタンパク質では変らない低レベルであることを反映していたが、それにもかかわらず、GPI−2350によって完全に除去されていた(表2)。対照的に、親水性5’−Nuc、Gce1及びaPのインスリン誘導生成は、lcDIGで両親媒性の対応物の非常にゆるやかな増加(有意差の限界)を伴ったのみであったが、それは再びGPI−2350の存在で排除された。両親媒性型の再分配との間に相関性を示した(表2)。総合すると、hcDIGで脂肪分解的に切断されたGPIタンパク質の生成及び蓄積のためのGPI−PLC活性化が必要である(グリメピリド)。【0090】GPI−PLCの阻害は、GPIアンカー型及びアシル化シグナル伝達タンパク質のカベオリンからの解離を妨げる:ラット脂肪細胞におけるhcDIGからlcDIGへのシグナル伝達タンパク質の再分配は、最近、カベオリン1からの解離と活性化を伴うことが示されている。間の推定因果関係、及び、それに続いて、Gce1とpp59Lynのカベオリン1との相互関係、及び後者のキナーゼ活性の解析が研究された(図6)。単離及び可溶化されたhcDIGから調製されたカベオリン1免疫沈降物からのpp59Lyn及びGce1の両者のインスリン誘発最大損失(35〜45%)及びグリメピリド誘発最大損失(75〜85%)最大損失は、5〜10μMのIC50(図6、パネルB)を有するGPI−2350(50μM:図6、パネルA)によって完全に妨げられた。この力価は、未処理の脂肪細胞におけるGPI−2350によるGPI−PLC阻害に類似している(図3)。非受容体チロシンキナーゼのようなシグナル伝達タンパク質のカベオリン結合ドメイン(CBD)へのカベオリン1の足場(scaffolding)ドメイン(CSD)の結合、及び、逆に、CBDへの結合からのCSDの除去は、全ての場合ではないが多くの場合、インビトロアッセイにおけるシグナル伝達タンパク質の不活化及び活性化のそれぞれの引き金を引くことが示された。このことは、原形質膜DIGで作動しているシグナル伝達における、CSD−CBD相互関係の調節機能を暗示している。【0091】ラット脂肪細胞におけるGPI−PLCの阻害は、グリメピリドの代謝活性をダウンレギュレートするがインスリンはされない:次いで、インスリン及びグリメピリドに反応したIRS−1チロシンリン酸化におけるGPI−PLC阻害の差動効果が、インスリン標的細胞における代謝活性に反映するか否かを研究した。このために、単離したラット脂肪細胞を、どちらかの刺激で作用させる前にGPI−2350で前処理し、次いでグルコース輸送及びイソプロテレノール誘導脂肪分解についてアッセイした(図8)。(IC50=2〜5μM)で対照値(50μMで)よりも低く損なわれた。従って、グリメピリド濃度−反応曲線は右に移動し、阻害剤がない場合と比較してGPI−2350(5μM)によるGPI−PLCの最大半量阻害の途中で平坦になった。対照的に、グルコース輸送のインスリンによる促進及びイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害は、グリメピリドに比較して2から3倍、より顕著であるが、50μMで、GPI−2350のみによってそれぞれ最大25及び33%減少した(図8)。前もって標識したラット脂肪細胞からのグリセロールに代わってNBD−FAの放出として測定した場合、グリメピリド及びインスリンによるイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害に対するGPI−2350の効果の分析によって確認された(図9)。グリメピリド(IC50=3μM)の濃度増加に反応してイソプロテレノール誘導脂肪細胞から放出された酸化分解産物を包含するNBD−FAの量の減少は、50μMグリメピリドの存在で完全に消失された(パネルA、B)。対照的に、NBD−FA(及び分解産物)放出のインスリン阻害は、インスリンに対する見かけのIC50の少しの増加(0.1対0.3μM)を伴うGPI−2350(50μM)のみによって、最大25〜30%損なわれた。GPI−PLC阻害に対するこれらGPI−2350媒介効果の特異性は、ラット肝PI−PLC及びハチ毒PLA2の阻害剤の損傷によって、基本的な及びグリメピリド調節グルコース輸送及び脂肪分解に顕著に影響を与えることで確認された(図8)。最後に、DIG内でGPIタンパク質の再分配に依存性であるか、無関係であるかのいずれかである、グリメピリド以外のインスリン模倣刺激のシグナル伝達におけるGPI−PLCの関与について調べた。ラット脂肪細胞において、m−β−CDを用いたコレステロール枯渇によるhcDIGの崩壊、トリプシン/塩/NEM処理によるPIG受容体p115の不活化又は合成リガンドPIG41でのp115の占拠は、lcDIGでの5’−Nucの顕著な増加及びグルコース輸送活性化を導いた(表3)。対照的に、オルトバナジウム酸ナトリウム及び合成CBDPはlcDIGへの5’−Nuc転位の同時誘導なしにグルコース輸送を促進した。このことは、よく知られている、チロシンホスファターゼ阻害剤、バナジウム酸塩によるインスリン受容体及びIRS−1脱リン酸化、及びCBDPによるpp59Lyn及びIRS−1チロシンリン酸化の直接促進といった作用機序に一致している。これらの刺激によるIRS−1チロシンリン酸化でもなくグルコース輸送でもない促進(表3)は、GPI−2350の存在下で顕著に影響され、それらは全てGPI−PLCの下流の点でグルコース輸送システムにクロストークしていることを暗示している。表1:(G)PI−PLC阻害剤の特徴。表2:hcDIG、lcDIG及び総原形質膜における脂肪分解的切断及び非切断GPIタンパク質の局在化に対する、インスリン、グリメピリド及びGPI−2350の効果。表3:ラット脂肪細胞における種々のインスリン模倣刺激によって誘導される5’−Nuc転位及びグルコース輸送に対するGPI−2350の効果。表1:ラット脂肪細胞由来のhcDIGのGPI−PLC、T.brucei由来GPI−PLC及びB.cereus由来PI−PLCを、適切な条件下で指示した阻害剤の増加する濃度(0.05μM〜1mM)のない場合とある場合における、可溶化した及び部分精製ウシ赤血球AChE又はヒト胎盤aPとインキュベートした(材料と方法を参照)。切断率は、親水性AChEの量及びTX−114分配の際TX−114枯渇相で回復したaP活性から計算した。少なくとも3回の独立したインキュベーションと分配/4回の酵素アッセイ、から得られた平均+SDを記した。表2:単離したラット脂肪細胞を、GPI−2350(50μM)なし又はありで処理し(5分間、37°C)、次いで指示したように、グリメピリド(20μM)又はインスリン(10nM)の非存在下又は存在下にインキュベートした(120分間、37°C)。総原形質膜(PM)、hcDIG及びlcDIGを調製し、次いでTX−114分配にかけた。TX−114豊富相及び枯渇相を5’−Nuc及びaP(活性測定)及びGce1(光親和性標識)についてアッセイした。両親媒性及び親水性GPIタンパク質の量は、GPI−2350の非存在下に基本の脂肪細胞から調製した、総原形質膜及びhcDIGの両親媒性型のそれぞれに対して計算した(各100arb.単位に設定した)。hcDIGプラスlcDIGからの親水性及び両親媒性GPIタンパク質の回収は、種々のインキュベーション条件下で同程度であった。少なくとも3回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ活性測定及びゲル・ランを2回行って、平均±SDを得た。表3:単離したラット脂肪細胞を、メチル−β−シクロデキストリン(m−β−CD、10mM、50分間)、CBDP(300μM、電気穿孔法、次いで、洗浄及びそれに続く30分間のインキュベーション)、PIG41(10μM、15分間)、オルトバナジウム酸ナトリウム(1mM、15分間)、トリプシン(10μg/ml、15分間、次いで0.5M・NaCl処理及びそれに続く洗浄)及びN−エチルマレイミド(1mM、5分間、次いでDTTの添加)の存在下でインキュベートした。脂肪細胞懸濁液の半分にGPI−2350(最終濃度50μM)を加え、更にインキュベーション(60分間、37°C)の後、細胞の一部分を、単離したlcDIG中の5’−Nuc活性についてアッセイした。基本的なインキュベーション中の5’−Nucの増加を100arb.単位に設定した。細胞の別の部分は(15分間のインキュベーション後)、基本のインキュベーションについて100arb.単位に設定したグルコース輸送につきアッセイした。少なくとも3回独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ3回ずつ活性を測定して、平均+SDを得た。合物、全てのその立体異性体の形態、及び全ての比率のそれらの混合物並びに生理的に許容されるその塩。【請求項2】R1、R2、R3及びR4のいずれか2つが互いに独立してFである、請求項1に記載の式Iの化合物。【請求項3】R1、R2、R3及びR4がOHである、請求項1に記載の式Iの化合物。【請求項4】R5がC12−アルキルである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の式Iの化合物。糖尿病の治療のために使用される薬剤の副作用を変えるか又はそれを治療するための医薬の製造における、請求項1〜4のいずれか1項に記載の式Iの化合物及び/又は生理的に許容されるその塩及び/又はそのプロドラッグの使用。薬剤がグリメピリドである、請求項7に記載の式Iの化合物の使用。ekouhou.net。