(+)[図6]本発明の疎水性ナノゲルの一例を示す。nm)、p:自己組織化。[図7A]本発明の疎水性ナノゲルの一例を示す。1:コレステロール、2:アミノ基、3:プルラン、4:cCHPナノゲル(カチオン性ナノゲル)、p:自己会合。[図7B]本発明の疎水性ナノゲルの一例を示す。[図7C]本発明の複合体の一例を示す。1:カチオン性ナノゲル、2:エキソソーム、3:カチオン性ナノゲル/エキソソーム複合体、4:エンドソーム、5:核、6:細胞質、p:内水相への薬物の導入(例えば、モデル薬物として蛍光色素。)、q:静電相互作用による複合化、r:カチオン性ナノゲルによる細胞内導入、s:エキソソームの細胞内取り込みを促進、t:エキソソームの膜融合。[図8]CHP-NH2ナノゲル/エキソソーム複合体の細胞内導入。1:エキソソーム(Exosome)(例えば、K562由来。)、2:CFSE-Exosome(CFSE標識エキソソーム)、3:CHP-NH2ナノゲル、4:CFSE標識エキソソーム/CFSE-Exosome(CHP-NH2ナノゲル/CFSE標識エキソソーム複合体)、5:細胞(例えば、HeLa、RAW264.7。488)の蛍光強度を示し、siRNAの導入量を表す。縦軸は、siRNAが導入された細胞数を示す。横軸において、siRNA導入量(蛍光強度)が左側に向かって少なく、右側に向かって多いことを示す。縦軸において、細胞数が下側に向かって少なく、上側に向かって多いことを示す。発明を実施するための形態[0038]1つの実施形態において、本発明は、疎水化多糖ナノゲルとエキソソームから構成される複合体を提供するものである。[0039]本発明におけるエキソソームとは、細胞から放出される小胞を広く含む。エキソソームの直径は30~200nm程度、好ましくは30~100nm程度であり、リン脂質、コレステロ-ルなどの脂質、タンパク質等を含む。エキソソームはそれを産生する限り、いかなる動物種または植物種由来のものであってもよい。動物種は、例えば、脊椎動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ハムスタ-、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、サケ、マグロ等)が挙げられるが、好ましくは、薬物、核酸などの生理活性物質を導入する標的細胞と同種の動物由来であり、標的細胞が生体内の細胞である場合には、標的細胞と同じ動物に由来する小胞が好ましい。iPS細胞等の様々な種類の細胞を挙げることができる。エキソソームは種々の体液、例えば、血液、尿、腹水などから調製することもできる。[0040]本発明で使用する疎水化多糖ナノゲルは公知であり、例えば特許文献1に開示されている。[0041]疎水化多糖ナノゲルは、多糖部分と疎水性部分を有しており、これらが直接或いは適当なリンカー基を介して連結されている。多糖部分は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースなどの1種または2種以上の単糖分子が、2分子以上結合したものであればよい。多糖部分は、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、カルボキシメチルなどの修飾基を有していてもよい。多糖部分の具体例としては、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカン、水溶性セルロースなどが挙げられる。中でも、α-グルコースからなるホモ多糖であるプルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストランなどが好ましく、プルランが特に好ましい。多糖部分は、1種単独の多糖であってもよく、2種以上の多糖の組み合わせであってもよい。[0042]疎水性部分としては、炭素数8~50(炭素数12~50であってもよい。)の炭化水素基またはステリル基が挙げられ、ステリル基が好ましく、特にコレステリル基が好ましい。リンカー基としては、エステル結合(-COO-または-O-CO-)、エ-テル基(-O-)、アミド基(-CONH-または-NHCO-)、ウレタン結合(-NHCOO-または-OCONH-)が挙げられ、これらが1個または複数個組み合わせられ、必要に応じて炭素数1~10のアルキレン基、アリ-レン基、アラルキレン基(ベンジレン基、フェネチレン基など)がさらに組み合わせられてもよい。[0043]疎水性部分は、重量比で多糖部分の0.1~20%程度、好ましくは0.3~15%程度、より好ましくは0.5~10%程度、特に1~5%程度である。[0044]疎水化多糖ナノゲルは、例えば特許文献1に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、炭素数8~50(または、炭素数12~50。ステロールと、OCN-R1-NCO(式中、R1は炭素数1~50の炭化水素基である。多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数8~50の炭化水素基またはステリル基を含有するを製造する第2反応工程を含む方法が挙げられる。(疎水性多糖ナノゲル)の製造することができる。(以下、「方法A」と記載する場合がある。)[0045]疎水化多糖ナノゲルは、カチオン性を有するのが好ましい。これはカチオン性疎水化多糖が、アニオン性を元々有するエキソソームと疎水性相互作用に加えて静電的相互作用に基づき結合するためである。疎水化多糖ナノゲルをカチオン性にするためには、カチオン性のアミノ酸(Lys,Arg,His)あるいはこれらのポリマ-を多糖部分に連結させてもよく、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、イミノ基、アンモニウム基、グアニジノ基、アミジノ基、などのカチオン性基を疎水化多糖ナノゲルに導入させてもよい。カチオン性基の導入は、例えば炭素数1~10のアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基(ベンジレン基、フェネチレン基など)、あるいはこれらと上記で例示したようなリンカー基を介してカチオン性基を含む適当な官能基を多糖部分に導入することで行うことができる。ポリエチレンイミンなどの他のカチオン性の官能基を導入してもよい。[0046]好適な疎水化多糖ナノゲルは、複数のカチオン性基(好ましくはアミノ基)を有するコレステリル化プルラン(CHP-NH2、プルランの100単糖あたりコレステリル基が1~10個、好ましくは1~数個導入され、カチオン性基(好ましくはアミノ基)が1~50個、好ましくは5~30個導入されたもの)である。コレステリル基は、リンカー基(好ましくは、ウレタン結合)を介してプルランに導入されている。[0047]ナノゲルへのカチオン性基(好ましくはアミノ基)の導入方法としては、以下のような手法(以下、「方法B」と記載する場合がある。)が好適に挙げられる。(2008)に記載されている。4-ニトロフェニルクロロギ酸/(DMSO/ピリジン(v:v=1:1)混合溶媒)をゆっくり添加し、4時間攪拌する。これを、エタノール/ジエチルエーテル(v:v=1:1)混合溶媒を用いて再沈する。mlの28.5%エチレンジアミン/(DMSO/ピリジン(v:v=1:1)混合溶媒)にゆっくりと滴下し、4日間攪拌する。これを、エタノール/ジエチルエーテル(v:v=1:1)混合溶媒を用いて再沈する。沈殿物を減圧乾燥し、200mlのDMSOに溶解し、蒸留水により透析する。NaOH水溶液により透析し、これをHClにより中和し、さらに蒸留水により透析する。これを凍結乾燥し、乳白色の固体を得る。アミノ基の具体例としてはNH2が好適に挙げられる。導入する置換基の数は適宜変えることができ、導入する置換基の数を変えることにより正電荷の大きさを制御し、複合体の細胞への取り込み効率を制御することが可能である。エチレンジアミンに代えてカチオン性基を有する他の化合物を使用することにより、種々のカチオン性基を導入することができる。[0049]疎水化多糖ナノゲルの性状は、多糖のサイズや導入される疎水性部分の疎水性の程度により、コレステロールなどの疎水性置換量を変え変更可能である。疎水性をコントロールするためには、炭素数10~30、好ましくは炭素数12~20程度のアルキル基をコレステリル基に代えて或いはコレステリル基とともに導入することも好適である。本発明で使用するナノゲルは、平均粒径(直径)5~200nm、好ましくは10~40nm、より好ましくは20~30nmである。ナノゲルは既に広く市販されており、本発明では、これら市販品を広く利用可能である。scattering)により測定をすることができる。[0051]疎水化多糖ナノゲルとエキソソームの粒子間の比率は、10:1~1:2程度である。疎水化多糖ナノゲルとエキソソームは、例えば図7に示すように、これらの粒子が適当な比率で結合して複合体を形成する。[0052]本発明の複合体は、薬物、siRNAなどの生理活性物質を含ませることができる。[0053]siRNAは化学合成により製造することができるので、天然型のsiRNAの他に、細胞内での安定性(化学的および/または対酵素)や比活性(標的RNAとの親和性)を向上させるために、種々の化学修飾を施したsiRNAを含むことができる。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基(ホスフェート)を、例えば、ホスホロチオエート(PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。各ヌクレオチドの糖(リボース)の2'位の水酸基を、-OR(Rは、例えばCH3(2'-O-Me)、CH2CH2OCH3(2'-O-MOE)、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す)に置換してもよい。塩基部分(ピリミジン、プリン)に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。[0054]siRNAとは、標的遺伝子のmRNAもしくは初期転写産物のヌクレオチド配列又はその部分配列(好ましくはコード領域内)(初期転写産物の場合はイントロン部分を含む)に相同なヌクレオチド配列とその相補鎖からなる二本鎖オリゴRNAである。siRNAに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相同な部分の長さは、通常、約18塩基以上、例えば約20塩基前後(代表的には約21~23塩基長)の長さであるが、RNA干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。siRNAの全長も、通常、約18塩基以上、例えば約20塩基前後(代表的には約21~23塩基長)の長さであるが、RNA干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。[0055]標的ヌクレオチド配列と、siRNAに含まれるそれに相同な配列との関係については、100%一致していてもよいし、塩基の変異があってもよい(少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%、最も好ましくは95%以上の同一性の範囲内であり得る)。[0056]siRNAは、5’又は3’末端に5塩基以下、好ましくは2塩基からなる、塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いるとsiRNAの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’等の配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。[0057]siRNAは任意の標的遺伝子に対するものであってよいが、本発明の核酸導入剤を疾患の予防・治療剤として用いる場合には、エキソソーム中に封入されるsiRNAは、その発現亢進が対象疾患の発症および/または増悪に関与する遺伝子を標的とするものであることが好ましく、より具体的には、その遺伝子に対するアンチセンス核酸が、臨床もしくは前臨床段階に進んでいる遺伝子や新たに知られた遺伝子を標的とするもの等が挙げられる。[0058]siRNAは、1種のみで使用してもよく、2種以上を組み合わせて使用してもよい。[0059]本発明の複合体に含まれる薬物としては、特に限定されず、抗腫瘍剤が好ましく例示される。コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、BCGワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドK、プロコダゾール)、細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤(例えば、トラスツズマブ(ハーセプチン(商標);抗HER2抗体)、ZD1839(イレッサ)、グリーベック(GLEEVEC)などの抗体医薬)が挙げられる。[0060]これらの薬剤は、1種単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。ナノゲルで被覆することで、エキソソームに強い細胞親和性を付与することができる。細胞親和性分子はその用途に応じて選択することができ、カチオン性分子を導入したナノゲルを用いた場合、細胞の種類によらず、細胞膜表面との静電的相互作用によるエキソソーム-細胞相互作用の促進を行うことができる。ペプチドやタンパク質フラグメント、抗体等をナノゲルに導入することで、目的細胞特異的に相互作用するエキソソームを調製することも可能である。先に述べた細胞接着シグナルとして知られているRGDペプチドを導入したRGD置換ナノゲルがある。この手法では、基本的にエキソソームとナノゲルの混和操作により、エキソソームの由来に関わらずナノゲルの複合化および細胞との相互作用機能の付与を短時間で行うことができる。そのため、従来は、細胞の選択から遺伝子改変、エキソソームの機能解析まで、細胞への相互作用促進を確認するまでに数ヶ月の時間を要していた操作時間が飛躍的に短縮できるだけでなく、遺伝子改変そのものが必要無くなるケースも考えられる。[0062]本発明の複合体は、エキソソームと疎水化多糖ナノゲルを水中で混合することにより得ることができる。得られた複合体は、遠心分離などにより分離回収することができる。エキソソームと疎水化多糖ナノゲルは、エキソソームの表面の一部又は全部が疎水化多糖ナノゲルで被覆されるような割合で混合され、疎水化多糖ナノゲルがカチオン性である場合には、複合体の電荷がアニオン性/カチオン性となるように両者の比率を調整する。[0063]複合体が薬物またはsiRNA又は当該薬物またはsiRNAの前駆体を有する場合、薬物またはsiRNA又はその前駆体が導入されたエキソソームと疎水化多糖ナノゲルとを混合することで、本発明の複合体を形成することができる。薬物またはsiRNA又はその前駆体が導入されたエキソソーム(すなわち、薬物またはsiRNA又はその前駆体が封入されたエキソソーム。)は、例えば1つの態様においては、エキソソームを生産する細胞内に薬物またはsiRNA若しくはその前駆体を導入後、これらが封入されたエキソソームを生産させて得ることができる。薬物またはsiRNA又はその前駆体は、エキソソームを生産する細胞が、自らその細胞内に導入(例えば、合成、細胞外からの取込、など。)するものであってもよい。別の態様では、エキソソームに対し、エレクトロポレ-ションなどの適当な方法で薬物またはsiRNA又はその前駆体を導入して、エキソソームを得ることもできる。複合体を形成した後で薬物またはsiRNA又はその前駆体を導入することもできる。[0064]本発明の複合体は、物質を細胞へ導入するための担体として好適に使用することができる。本発明の複合体が、薬物、siRNAなどの生理活性物質を含む場合は、本発明の複合体は、薬物、siRNAなどの導入剤として好適に使用することができる。[0065]薬物、siRNAなどが導入される対象は、細胞であっても生体であってもよい。対象となる細胞としては、ヒト由来若しくはマウスなどの非ヒト動物由来の細胞、特に培養細胞が挙げられる。対象となる生体としては、ヒト;サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの哺乳類、ニワトリなど鳥類、魚類等の非ヒト動物が挙げられる。[0066]薬物、siRNAなどが導入される対象が細胞である場合、本発明の複合体を培地中に適量含ませることで、物質を細胞へ導入するための担体としてまたは導入剤として用いることができる。剤形で用いることが好ましい。この場合、本発明の導入剤は、医薬組成物として好適に提供され、通常用いられる適切な担体を用いて各種剤形の導入剤を得ることができる。mg程度の範囲から選択することができる。[0068]本発明はまた、本発明の複合体を用いた薬物、siRNAなどの生理活性物質を細胞へ導入するをも提供する。実施例[0069]以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことはいうまでもない。本実験では直鎖状水溶性多糖であるプルランに、コレステロールを100単糖当り1.2個、アミノ基を100単糖当り15個導入したカチオン性疎水化プルラン(CHP-NH2)をPBSに溶解させプローブ型超音波照射器により処理し、CHP-NH2ナノゲル溶液を調製して用いた。上記方法Aにより疎水化プルランを製造し、上記方法Bにより疎水化プルランにアミノ基の導入をしてカチオン性疎水化プルラン(CHP-NH2)を得た。4°Cで30分間遠心した。4°Cで2時間遠心した。4°Cで2時間遠心した。遠心後、上清を捨てPBSで沈殿を再懸濁しK562由来エキソソーム懸濁液を得た。g、4°Cで15分間遠心した。g、4°Cで2時間遠心した。g、4°Cで2時間遠心した。μlのPBSに再懸濁しRAW264.7由来エキソソーム懸濁液を得た。エキソソーム懸濁液は使用するまで4°Cで保存した。Kitを用いて定量した。mg分を採取し、3000g、4°C、20分間の遠心分離後に上清を除去した。(MES)緩衝液に懸濁した。mg/mlの濃度に調製した。μgのRAW264.7由来エキソソーム懸濁液を徐々に添加した。撹拌しながら室温で15分間反応させた。mlになるようにMES緩衝液を加えたのち、撹拌しながら室温で2時間反応させた。μlを添加して反応を停止し、さらに30分間撹拌した。3000g、4°Cで20分間遠心分離してビーズを沈殿させて上清を除去した。2%FCS(エキソソーム不含)を加えたPBSにビーズを懸濁した。遠心分離と懸濁の操作を3回繰り返してビーズを洗浄した後、エキソームに発現する膜タンパク質に対する抗体で染色を行い、FCM解析した。μLと混合し、4°Cで30分間静置して複合化し、動的光散乱計(DLS)により粒径測定を行った。mLをガラス底ディッシュに播種し、24時間の前培養を行った。μL添加し、37°Cで4時間静置した。μLと混合し、4°Cで30分間複合化させた。μL添加し、さらに1時間後、培地で細胞を2回洗い、共焦点レーザー顕微鏡で観察を行った。図8に、実験手法を模式的に示す。488修飾)、型番:1027292)を加えた。gapキュベットに添加してNEPA21(ネッパジーン社製)でエレクトロポレーションすることで、RAW264.7由来エキソソームにsiRNAを導入した。極性+/-にて行った。siRNA導入エキソソームは100000g、4°C、2時間の遠心分離を行い沈降後、PBSに懸濁した。μlのPBSに懸濁した。μg/ml)を加え、4°Cで30分間複合化させた。その後、複合化液100μlを150μlの細胞液(1×104個のCT26マウス大腸癌細胞株、CMS5マウス繊維肉腫細胞株、4T1マウス乳癌細胞株、K562ヒト白血病細胞株、または2×104個のRAW264.7マウスマクロファージ様細胞株を含む)に添加し、4時間後のAF488標識siRNAの細胞内への取り込みをFCM解析により検討した。concentration」、0~1.0mg/mL)のCHP-NH2ナノゲル(粒径38nm)とK562由来エキソソーム(粒径145nm)を混合し、得られたCHP-NH2ナノゲル/エキソソーム複合体の粒径をDLSにより測定した結果、CHP-NH2ナノゲル濃度が0.05mg/mL以上で粒径が180nm前後のCHP-NH2ナノゲル/エキソソーム複合体を形成することが確認された(図1)。[0079]前述の結果をもとに調製したCHP-NH2ナノゲル/CFSE標識エキソソーム複合体をHeLa細胞培養系に添加し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果、CFSE標識エキソソームのみの条件では、細胞内に取り込まれたエキソソームはほとんど確認されなかった(図2(a),CFSE)。CHP-NH2ナノゲル/CFSE標識エキソソーム複合体を添加した条件では、ほぼ全ての細胞内にCFSE標識エキソソームに由来する緑色蛍光が観察された(図2(b),CFSE)。細胞内局在を検討したところ、黄色蛍光を示すエンドソーム内に存在するエキソソームが確認されたが、取り込まれたエキソソームの多くは細胞質部分に存在していることが確認され、エンドサイトーシスにより取り込まれたエキソソームがエンドソームから細胞質へと移行することが示された。これらの結果より、CHP-NH2ナノゲルとの複合化によりエキソソームの細胞内取り込みが促進されることが明らかとなった。次に、細胞種の異なるRAW264.7細胞においてエキソソームの取り込みを検討したところ、エキソソーム単体でも細胞に取り込まれている様子が観察され、CHP-NH2ナノゲルとの複合化による差は確認されなかった。これは、RAW264.7細胞がマクロファージ様細胞であり、貪食作用が強く細胞外物質を取り込みやすいためであると考えられる(図3(a),エキソソームのみ;(b)CHP-NH2ナノゲル/CFSE標識エキソソーム複合体)。K562細胞に添加し、各細胞への4時間後のsiRNAの取り込みをFCM解析により検討した。これら全ての細胞において、CHP-NH2ナノゲル/エキソソームを用いて添加したsiRNAは、エキソソーム単体を用いて添加したsiRNAに比べて、遥かに高率に細胞に取り込まれた(図4)。RAW264.7細胞では、CHP-NH2ナノゲル/エキソソームを用いて添加したsiRNAと、エキソソーム単体を用いて添加したsiRNAとで細胞への取込みに違いは見られなかった(図5)。これは、RAW264.7細胞がマクロファージ様細胞であり、貪食作用が強く細胞外物質を取り込みやすいためであると考えられた。以上の結果から、多くの細胞種、特に貪食作用が低い細胞において、CHP-NH2ナノゲルと複合体化したエキソソームはsiRNAを効率的に細胞に送達することが確認された。産業上の利用可能性[0081]本発明の複合体は、薬物、核酸などの生理活性物質を細胞内に導入することができるので、ドラッグデリバリ-システム(DDS)として利用可能である。標識物質を複合体に導入することで、バイオイメ-ジングに応用することができる。抗原を複合体に導入することで、ワクチンとして利用することもできる。ライセンスをご希望の方、特許の内容に興味を持たれた方は、下記までご連絡ください。同じキーワードでJ-STORE内を検索することが出来ます。