本明細書において示した用量範囲は、いずれにせよ本発明の範囲を制限すると解釈されず、熟練した医師の一般的指針として示される。本明細書において、トリは、典型的に翼に変化した前足、鱗状の脚、嘴を有し、硬い殻に包まれた卵を産む、鳥綱の任意の温血脊椎動物として定義される。本明細書の目的に関して、好ましいトリの群は、家畜用ニワトリ、七面鳥、ダチョウ、アヒル、ガチョウ、およびコーニッシュ種の闘鶏である。好ましい群は、家畜用ニワトリおよび七面鳥である。本発明の目的に関して最も好ましいトリは、ブロイラーおよび産卵鳥(家禽)を含む家畜用ニワトリである。本発明の方法および組成物は、ヒトを含む動物、好ましくはトリ(家禽)、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、およびラマのような家畜用動物、最も好ましくはトリを免疫および保護することに向けられる。これらの動物種の特定のものは、多数の胃を有し、植物を分解するために特異的な消化酵素を有しえて、そうでなければ、他のタイプの経口ワクチンを容易に不活化する可能性がある。本発明を制限することを意味しないが、トランスジェニック植物細胞およびそれに由来する組成物を摂取することによって、扁桃を含む口腔粘膜部位で動物の免疫が起こりうる。本発明の目的に関して、膜配列という用語は、当業者がその用語を理解する意味であることを企図する。膜固定配列には、膜貫通タンパク質配列が含まれ、天然に存在する多くのタンパク質において認められる。そのような膜固定配列は大きさが多様であるが、常に、膜内の疎水性環境に都合がよい親油性または脂肪族側鎖を有する一連のアミノ酸を含む。RNAの翻訳および翻訳後プロセシングの際に、固定配列が組み入れられ、細胞膜に埋もれて、細胞膜成分にタンパク質を固定または緩く結合させるように機能し、細胞内外の水性環境にタンパク質の親水性部分を露出させて、それらと相互作用させる。本明細書における貯蔵封入体または貯蔵タンパク質は、窒素源として植物が利用するタンパク質であると定義され、これらのタンパク質は、植物のライフサイクルの非生産相(例えば静止期)のあいだに貯蔵され、細胞が活動的増殖へと誘導された場合に、エネルギーおよび窒素源として急速に利用される。形質転換された植物細胞もしくはプロトプラストに由来するその子孫であると定義され、形質転換植物のゲノムは、実験技術によって導入され、同じ種の天然の非トランスジェニック植物細胞には通常存在しない外来DNAを含む。「トランスジェニック植物」および「形質転換植物」という用語は時に、そのDNAが外因性DNA分子を含む植物を定義するための同義語として当技術分野において用いられている。Sons、ニューヨーク、ニューヨーク州に開示される方法のような、周知の方法を利用して容易に行われる。本発明にはまた、それらが発現時に開示の作用を有することができるように、免疫保護抗原をコードする開示の配列と実質的な配列相同性を有するDNA配列が含まれる。本出願において用いられるように、「実質的な配列相同性」という用語は、ヌクレオチド配列(DNAまたはRNAの場合)またはアミノ酸配列(タンパク質またはポリペプチドの場合)が、もう一つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列と実質的、機能的、または構造的同等性を示すことを示すために用いられる。実質的な配列相同性を有する配列間の任意の機能的または構造的な差は小さいであろう;すなわち、それらは本出願において示されるように機能する配列の能力に影響を及ぼさないであろう。本明細書に開示の配列と実質的な配列相同性を有する配列は通常、変異のような、開示の配列の変種であるが、合成配列であってもよい。【0042】ほとんどの場合、本明細書において特に開示された配列と95%相同性を有する配列は、同等物として機能して、多くの場合かなり低い相同性、例えば75%または80%が許容されるであろう。重要でないこれらの配列の部分を特定することは時間がかかるが、普通のことであり、十分に当業者の範囲内である。用いることが含まれる。Amplifications」Erlich(編)(1989)を参照されたい。他の宿主ベクター系は、再生された培養環境に置いた場合に再利用することができるタンパク質貯蔵を確立しない。大腸菌に関して記述される封入体、またはバキュロウイルス、グラニュローシスウイルス、もしくはバシラス・スリンギエンシスの結晶タンパク質は、様々な生物学的目的のために宿主系によって貯蔵される。いずれも、再培養の際または休止期もしくは静止期から新たな増殖の活性化の際の窒素源として植物が利用することができる貯蔵区画にタンパク質を入れることは示されていない。【0044】NT-1増殖の静止期の後期段階で細胞における貯蔵区画または安定な部位にタンパク質を入れることは、インビトロで培養したトランスジェニック植物細胞におけるタンパク質発現の予想された特徴ではなかった。電子顕微鏡から、白色体に暗い中心部があること、そして細胞壁および膜に隣接する細胞質区画にタンパク質に対する免疫金標識結合が存在することが示されている(実施例16を参照されたい)。NT-1系が、発現されたタンパク質のタイプまたは用いられる転写プロモーター系によらず、安定な区画にタンパク質を貯蔵できることは、これまでに例のない知見である。首尾よく発現されているタンパク質には、いくつかの異なるクラスのタンパク質が含まれる:1)酵素ADPリボシルトランスフェラーゼ、大腸菌のLTエンテロトキシンのLTA区画;2)大腸菌に由来するLTAおよびLTBサブユニットの双方を含む十分に形成されたおよび機能的LTホロトキシン;3)伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)の構造タンパク質;4)トリインフルエンザウイルス(AIV)の1型ウイルス糖タンパク質赤血球凝集素(HA);および5)ニューカッスル病ウイルスの2型ウイルス糖タンパク質。それぞれの場合において、発現されたタンパク質の生物活性は、それぞれの病原体に由来する天然のタンパク質ほど強力ではないものの強力であることが判明した。各タンパク質に関連した有効性は、外来タンパク質の発現のために用いられる単一のタイプの宿主細胞に関する予想外の特徴である。保存された外来タンパク質のもう一つの予想外の特徴は、それが安定であることであり、先に記述したように、タンパク質を容易に単離できることである(例えば、機械的破壊によって)。ホモジナイズ、または微少溶液操作することができる。本発明のタンパク質および粒子を液体型で2〜7°Cで長期保存すると、長い半減期を示す;如何なる安定化剤も加えなくても、単純な機械的攪拌によって産生された抽出物から、NDVのHNタンパク質に関して予測半減期1〜2年、および大腸菌のLTに関して13〜15ヶ月の調製物が得られた。本発明に従って産生されたタンパク質は、極めて強健であり、免疫応答を増強することができる様々なタイプの製剤にすることができる。他の剪断型の方法、高剪断ローター/ステーター法、フレンチプレスまたは他の加圧法、およびホモジナイゼーション法が含まれるがこれらに限定されない。初期の研究開発活動によって、回収された細胞からHNタンパク質を免疫保護粒子の形で抽出するためには高圧破壊エネルギーが必要であることが示された。Lを超える場合には、HN免疫保護粒子を回収するために超音波破壊はそれほど有効でなく(>35%)、規模を拡大することができないことが示されている。用いる力量滴定試験から、破壊圧はNT1-CHN-18細胞から回収されるHN免疫保護粒子の収量と比例することが示された。psigである機器の最高圧の設定で得られた。最高圧であっても、総HNタンパク質の40%を超える量が廃棄された細胞破片分画に存在した。この後者の実験の圧力滴定曲線から、より高い溶解圧が、廃棄される細胞破片分画におけるHNタンパク質の量を有意に減少させる可能性があることが示唆される。【0047】Microfludics社の製品ラインは、一定の細胞破壊技術において「第二世代」であると見なされている。mmの乱流(「Y」外形)開口部に、懸濁細胞を通過させることによって細胞破壊を行う。ラムが上に上がると逆止め弁が開き、次のサイクルのためにリザーバーを満たす。L*/時間の規模で同等性を主張する。細胞の分解は、(1)開口部(内破)による加速、(2)細胞破壊を引き起こす開口部先端と噴出室とのあいだの圧力の差、および/または(3)噴出室標的への減速、の結果であると考えられている。細胞の超微細構造(すなわち、細胞壁)、細胞濃度、破壊エネルギー(psig)、および分解緩衝液の組成は、溶解効率に影響を及ぼす最も重要な変数であると見なされる。Inc.によって連続的フレンチプレスセルとして産生された。これらは、開口部の直径と水圧を手動で制御することを除いて、Microfludics社の機器と類似である。ml未満の研究開発活動に用いられる。psigまで)、圧力の変動を減少させるための二重の試料室、および真空下で操作される試料放出室のような改善が含まれた。これらの改善は、第一および第二世代の機器と比較して改善された分解効率を有すると報告された。含む濾過、ならびに全ての形のカラムおよびHPLC法を含むクロマトグラフィー技術が含まれるがこれらに限定されない任意の分離技術が含まれる。本発明の構築物を調製する場合、適切な方向、および適当であれば適切な読み取り枠でDNA配列を提供するために、様々なDNA断片を操作してもよい。DNA断片を結合するためにアダプターもしくはリンカーを用いてもよく、または都合のよい制限部位、過剰なDNAの除去、制限部位の除去等を提供する他の手段を含んでもよい。様々な段階を行う場合、所望の宿主細胞にその後導入するために、プロモーター/対象遺伝子を含むベクターを増幅するためにクローニングを用いる。広範なクローニングベクターが市販されており、クローニングベクターには、大腸菌において機能的な複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーが含まれる。例としてのベクターには、pBR322、pUCシリーズ、pACYC184、Bluescriptシリーズ(Stratagene)等が含まれる。このように、配列を適当な制限部位でベクターに挿入してもよく、得られたプラスミドを用いて大腸菌宿主(例えば、大腸菌株HB101、JM101、およびDH5α)を形質転換してもよく、適当な栄養培地において大腸菌を増殖させて、細胞を回収して溶解し、プラスミドを回収してもよい。おいて用いられるDNA配列を制限して次の配列に結合させて、部分的構築物のそれぞれを同じまたは異なるプラスミドにおいてクローニングしてもよい。【0052】ベクターは市販されている、または植物細胞の形質転換のために容易に調製することができる。一般的に、プラスミドまたはウイルスベクターは、所定の宿主における異種DNA配列の維持および発現にとって必要な全てのDNA制御配列を含むべきである。UTRシグナルをコードするDNA配列が含まれる。任意の特定の種において発現を最適にする適当なエレメントの選択は、本開示の教示を利用して当業者の問題である。最後に、ベクターは望ましくは、ベクターを含む宿主細胞の同定を可能にする表現型特性を提供することができるマーカー遺伝子を有しなければならない。植物細胞に挿入された外来コード配列の活性は、インサートに隣接する内因性植物DNAの影響に依存する。一般的に、異種遺伝子の挿入は、如何なる形質転換技術を用いても無作為であるように思われる。植物細胞へのDNAの部位特異的組換えによって植物を産生する技術は現在存在する(国際公開公報第91/09957号を参照されたい)。プロモーターの制御下で所望の配列または配列の発現が得られる任意の方法または方法の組み合わせが許容される。本発明は、植物細胞を形質転換する任意の特定の方法に限定されない。植物細胞にDNAを導入する技術は、当業者に周知である。外来DNAを植物細胞に輸送する四つの基本的な方法が記述されている。USA、89(13):6099〜6103、1992)。電気穿孔によって植物細胞にDNAを導入することは、当業者に周知である。レシピエント細胞を無処置細胞と比較して電気穿孔による形質転換に対する感受性を高めるために用いられる。カルス、未成熟胚、または他の構築組織のような脆弱な組織を直接用いてもよい。一般的に、ペクチン分解酵素または制御された方法での機械的損傷によって標的植物材料の細胞壁を部分的に分解する必要がある。そのような処置植物材料は、電気穿孔によって外来DNAを受け入れる準備が整っている。植物細胞に外来形質転換DNAを輸送するもう一つの方法は、微小弾丸衝突である。この方法において、微粒子を外来DNAによってコーティングして噴射力によって細胞に輸送する。そのような微粒子は典型的に、タングステン、金、プラチナ、および類似の金属製である。Physiol.、87:671〜674)もアグロバクテリウム感染に対する感受性も必要ない点である。加速によってトウモロコシ細胞にDNAを輸送する方法の例としての態様は、バイオリスティック粒子輸送系であり、これは懸濁培養トウモロコシ細胞で覆われたフィルター表面上にスクリーンを通してDNAをコーティングした粒子または細胞を噴射するために用いることができる。スクリーンは、分子が大きい凝集物でレシピエント細胞に輸送されないように粒子を分散させる。衝突の場合、好ましくは懸濁細胞をフィルターまたは固体培養培地において濃縮する。未成熟胚または他の標的細胞を固体培養培地上で整列させてもよい。衝突させる細胞を、マクロ弾丸停止板の下で適当な距離で配置する。衝突形質転換において、最大数の安定な形質転換体が得られるように衝突前の培養条件および衝突パラメータを最適にしてもよい。衝突のための物理的および生物学的パラメータの両者がこの技術において重要である。物理的要因は、DNA/微小弾丸沈殿物の操作に伴う要因、または微小弾丸の飛行および速度に影響を及ぼす要因である。生物学的要因には、衝突前および直後の細胞の操作に伴う全ての段階、衝突に関連した外傷を軽減するために役立つ標的細胞の浸透圧調節、ならびに直線状DNAまたは無傷のスーパーコイルプラスミドのような形質転換DNAの特性が含まれる。【0057】アグロバクテリウムによる移入は、プロトプラストから無傷の植物を再生する必要がなく、DNAを植物全体の組織に導入することができることから、植物細胞に外来DNAを導入するために広く適用されている系である。植物細胞にDNAを導入するためにアグロバクテリウム媒介植物組み込みベクターを用いることは、当技術分野において周知である。Enzymol.、153:253〜277に記述される方法を参照されたい。Ti-DNAの組み込みは、比較的正確なプロセスであり、再配列はほとんどない。Genet.、207:471に記述されるように、植物ゲノムに挿入される。現代のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、アグロバクテリウムのみならず大腸菌において複製することができ、簡便に操作することができる。その上、アグロバクテリウム媒介遺伝子移入に関するベクターの最近の技術の進歩によって、様々なタンパク質またはポリペプチドを発現することができるベクターの構築を促進するために、ベクターにおける遺伝子の整列および制限部位が改善された。挿入されたポリペプチドコード遺伝子を直接発現させるためのプロモーターおよびポリアデニル部位に隣接する簡便な多重リンカー領域は、本発明の目的にとって適している。アームを有するおよびアームを有しないTi遺伝子を含むアグロバクテリウムは、形質転換に用いることができる。Genet.、199:183;Marcotteら、Nature、335:454、1988)。これらのシステムを異なる植物種に適用することは、プロトプラストから特定の種の再生能に依存する。植物細胞を形質転換、選択、および抗原の発現に関してチェックした後、場合によっては、稔性の植物全体を再生することが可能である。これは選択した植物種に大きく依存するであろう。多数の植物種を再生する方法は、文献に報告されており、当業者に周知である。本発明を実践する場合、一般的に長い再生段階を回避することによって、培養して急速に規模を拡大することができる植物細胞を形質転換することが好ましい。植物細胞培養を用いることによって、農地で産生する必要がなく、遺伝子の逸出および食物の混入の機会が大きく減少する。79、568〜570)のようなタバコ懸濁細胞培養物は、これらの株が培養での取り扱いが特に容易であること、容易に形質転換されること、安定な組み込み事象を生じること、および凍結保存できることから好ましい。【0061】タバコ懸濁細胞株NT-1は、本発明の実践にとって適している。NT-1細胞株は広く用いられ、容易に入手可能である;しかしながら、如何なるタバコ懸濁細胞株も本発明の実践にとって適合する。NT-1細胞株のが起源は不明であることは注目に値する。その上、細胞株は多様であるように思われ、培養条件に反応して変化する傾向がある。74840として入手可能である。同様に、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,140,075号を参照されたい。実験室規模のシェーカーから何千リットルものバイオリアクター容器に至るまで、多くの植物細胞培養技術および系が記述されており、植物細胞培養の技術分野において周知である。望ましい量まで培養した後、それらを回収して、軽く洗浄して、破壊するために適切な緩衝液に入れる。異なる多くの緩衝液が本発明に適合性である。一般的に、緩衝液は、膜を可溶化するために用いることができる強い洗浄剤を含まない、中性pHまたは中性pH付近の等張緩衝塩水溶液である。EDTAを含むPBSが含まれる。一つの態様において、細胞を超音波によって破壊することができる。gm/mlの範囲(洗浄湿重量細胞/緩衝液の容量)の緩衝液に入れる。市販の多くの超音波装置は、本発明に適合性であり、超音波処置時間は約5〜約20秒、好ましくは約15〜約20秒である。得られた大きさは数ミクロンから数百ミクロンの範囲となる可能性があり、免疫保護タンパク質または他の生物活性タンパク質を露出してもよい。遺伝子の構築:NDV株「Lasota」のHN遺伝子(Genbankアクセッション番号AF077761号)、AIV株ATurkey/Wisconsin/68のHA遺伝子、IBDV株E19のVP2遺伝子(Genbankアクセッション番号X00493)、および大腸菌のLT遺伝子のコード配列を、コドンの使用、ならびに偽性mRNAプロセシングおよび不安定性またはゲノムDNAのメチル化を媒介しうる望ましくない配列モチーフの存在に関して分析した。21:1131〜1145を参照されたい。268:714〜716)。HNの設計された配列を図1に示す。合成HN遺伝子は市販の供給元(Retrogen)によって構築され、pCR-Bluntにクローニングされた遺伝子の5'(p4187-4203-1)または3'(p42111-4235-1c-1)半分のいずれかを含む二つの異なるプラスミドとして受領した。【0065】プラスミドの構築:アグロバクテリウム媒介植物形質転換のためのバイナリベクターは、図2に示すベクターpBBV-PHAS-iaaHに基づいて構築され、これは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,879,903号、第5,637,489号、第5,276,268号および第5,273,894号に記述され、国際公開公報第97/48819号に記述される構成的カッサバ葉脈モザイクウイルス(CsVMV)プロモーターによって促進される、植物選択マーカーホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)を用いる。本発明者らは、最初にpBBV-PHAS-iaaHのPacIによる消化によってiaaH遺伝子およびファセオリンプロモーター配列を欠失して、再ライゲーションしてpCVMV-PATを形成した。次に本発明者らは、一つのHindIII部位をクレノウ酵素で塞ぐことによってこれを欠失させ、再ライゲーションしてpCP!Hを形成した。本発明者らは、鋳型pCP!H上でプライマーを用いて、PCRによってCsVMVプロモーターを末端に配置して、EcoRV-消化、T-テールpBluescriptKSにおいて産物をクローニングしてpKS-CVM7を作製した。pCP!Hのマップを図3に示す。1995)によってベクターpKS-CVM7/NcoI-EcoRIをライゲーションすることによって、HN発現カセットpKS-CHNを構築した。次に、バイナリT-DNAベクターpCHNを、ベクターpCP!H/AscI-EcoRIとpKS-CHNのAscI-EcoRI断片とのライゲーションによって構築した。pCHNのマップを図4に示す。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,824,798号に記述される顆粒結合デンプンシンターゼ(GBSS)プロモーターを用いて他のベクターを作製した。L.cv.「Desiree」)のゲノムDNAから増幅したプロモーター断片を用いて作製した。bpのPCR産物をT-テールpBluescriptKSにおいてクローニングして、pKS-GBNを作製して、シークエンシングした。PCR産物をT-テールpBluescriptKSにおいてクローニングして、pKS-GBXを作製し、シークエンシングした。GBSSプロモーターに置換して、pTH252Aを作製した。268:714〜716を参照されたい。3'半分をライゲーションすることによって、HN遺伝子をpTH252A/NcoI-KpnIに挿入して、pHN252Aを作製した。NsiIおよびEcoRIによって消化したベクターpGLTB(図11に示す)と、pHN252A/NsiI-KpnIおよびpTH210/KpnI-EcoRIの断片とのライゲーションによって、バイナリT-DNAベクターpgHNを作製した。pgHNのマップを図5に示す。UTRに置換して、pTH251Aを作製する。バイナリT-DNAベクターpgHN151は、ベクターpCLT105(図12に示す)を断片pTH251A/HindIII-NcoIおよびpHN252A/NcoI-KpnIとライゲーションすることによって作製した。pgHN151のマップを図6に示す。5'UTRを含むGBSSプロモーター発現カセットを構築した。DNAポリメラーゼによって平滑末端にし、再度ライゲーションして、KpnI部位が除去されたpCP!HKを作製した。DNAポリメラーゼによって平滑末端にした後、PacIによって消化した。DNAポリメラーゼによって平滑末端にして、PacIによって消化してpgHN153を作製した。pgHN153のマップを図7に示す。【0070】キメラ構成的プロモーター(4OCS△MAS、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,001,060号、第5,573,932号、および第5,290,924号)を用いて、HNに関するもう一つの発現ベクターを構築した。プラスミドpAGM149をEcoRVによって消化して、BamHIによって部分消化した。この断片をPmeI/PstIによって消化したpCHNと、pKS-CHNのBamHI/PstIによる消化によって得られた合成HN遺伝子の5'半分とにライゲーションした。得られたpMHNを図8に示す。Suarez(SEPRL、アテンズ、ジョージア州)から得た(図10)。3'末端を有するベクターpIBT210.1(Haqら、1995)に挿入した。1992;20:1195〜7)に転移させて、pIBT-HAOを作製した。pIBT-HAOからのHA遺伝子/vspB3'末端断片は、NcoIおよびEcoRI(部分的)による消化によって、pKS-CVM7に挿入して、pKS-CHAを作製した。CsVMVプロモーター、HA遺伝子、およびvspB3'末端を含むカセットを、AscIおよびEcoRI(部分的)による消化によってpKS-CHAから得て、これをpCP!Hにライゲーションして図9に示されるpCHAを作製した。16:1336〜1343)。60/113,507号として提出された国際公開公報第00/37609号に記述された。国際公開公報第00/37609号は、実施例2におけるタバコNT-1細胞のアグロバクテリウム・ツメファシエンスによる植物細胞の形質転換のために用いられる三つのバイナリT-DNAベクター(pSLT102、pSLT105、pSLT107)の構築を記述している。得られた形質転換NT-1細胞株(SLT102、SLT105、およびSLT107)は、LT-Bおよび改変型LT-Aサブユニットからなる完全に構築されたLTおよびLT類似体を発現して蓄積した。図12は、Ala72をArg72に置換する改変LT-A遺伝子を含むpSLT107を図示する。SLT102およびSLT105発現産物は、それらがLT-A遺伝子において異なる変化(pSLT102ではSer63がLys63に、pSLT105ではArg192がGly192に)を含むことを除き、同一であった。これらの株は、核染色体DNAに安定に組み入れられたプラスミドのT-DNA領域の未確認数のコピーを含む。トランスジェニックNT1細胞は、ガングリオシド結合五量体に構築されるLT-Bサブユニットを、ガングリオシド依存的ELISAによって決定した場合に、総可溶性タンパク質の0.4%までのレベルで蓄積した。トランスジェニックNT1細胞はまた、改変LT-Aサブユニットも蓄積し、そのいくつかは、LT-A特異的抗体を用いるガングリオシド依存的ELISAによって決定した場合に、LT-B五量体を構築した。【0073】アグロバクテリウムによる植物細胞形質転換のバイナリベクターは、VP2および選択マーカー発現カセットを付加するために、AgeIリンカーによって唯一のBamHI部位で改変された基本バイナリベクター(pBBV)から構築した。94/07902号および国際公開公報第97/27207号)およびCsVMVプロモーターに隣接する。UTRによって調節され、得られたプラスミドpDAB2423を図13に示す。2002、76(11):5637)を用いて、株UK661(Genbankアクセッション番号NC_004178号)からのアミノ酸番号454〜456位と共に、報告されたVP2アミノ酸配列(Genbankアクセッション番号AB024076号)に基づいて、VP2植物最適化ヌクレオチド配列を産生した(VP2配列に関しては図14を参照されたい)。mlに加えることによって新鮮な培地で培養した。mg/lスペクチノマイシンを含むLB培地のプレートにグリセロール保存液から画線培養した。細菌培養物を30°Cの暗所で24〜48時間インキュベートした。rpmのインキュベーター内で30°Cの暗所で、OD600が0.5〜0.6となるまでインキュベートした。これには約24時間を要した。BRL;カタログ番号10090-011)。mlに加えた、アセトシリンゴン保存液は形質転換日にエタノールにおいて作製した。NT-1細胞に損傷を与えて形質転換効率を増加させた。ml滅菌ピペットの中を繰り返し(20回)上下させて損傷を与えた。mmペトリ皿のそれぞれに移した。プレート1枚を非形質転換対象として用いるために除いておいた。μlを残りの9枚のプレートのそれぞれに加えた。rpmのシェーカーにおいて25±1°Cで3日間インキュベートした。rpmで10分間遠心した。