プレートをパラフィルムによって覆って、25±1°Cの暗所で維持した。培養室に移す前に、プレートを層流のフード内で開いたままにして、過剰量の液体を蒸発させた。6〜8週間後、推定の形質転換体が出現した。g/lアガー/アガーによって固化したNTC培地、オートクレーヴ後加えた)に移した。プレートをパラフィルムによって覆って、25±1°Cの暗所で維持した。推定の形質転換体は、死んだ非形質転換細胞のバックグラウンドにおいて小さいカルス集団として出現した。これらのカルスをNTCB5培地に移して、数週間増殖させた。各推定の形質転換体の一部をELISA分析のために選択した。ELISAを少なくとも2回行った後、最高の抗原レベルを示す株を選択した。各選択株のそれぞれのカルス材料の量を、プレート培養および時に液体培養において増幅させた。蠕動性ポンプおよびシリコンチューブを用いて、細胞を発酵器の採取口から採取した。μmスペクトロメッシュを含む円錐形の濾過装置にポンプで加えて、真空によって細胞を濾過して湿細胞ケークを形成した。mlの比で懸濁させた。細胞のスラリーを処理するまで5°Cで維持した。rpmで5〜10分間ホモジナイズすることができる。PSIに設定して、相互作用チャンバー、入り口、および出力ラインを氷で覆った。ml/分でマイクロフルイダイザーの中を通過させて、溶解細胞懸濁液を氷中で回収した。処理した溶液を、4°C、2800×gで15分間遠心することによって細胞塊を除去した。放出されたHN、HA、LTまたはVP2タンパク質を含む上清を細胞破片の沈降物から分離して、-80°Cで保存した。2800×gの沈降物を2倍量の新鮮な溶解緩衝液において再懸濁させて、5°Cで16時間インキュベートして、細胞破片に会合したままであるHNタンパク質を抽出した。細胞破片を、スィングバケットローターにおいて2800×g、4°Cで15分間沈降させた。上清をデカントして−80°Cで保存した。μmスペクトラメッシュによって濾過した。Centramate接線流システムを用いて濃縮することができる。入り口および保持ラインを産物容器に向けて、産物プールを10〜20倍濃縮する。濾液を産物の漏出に関して試験する。mlを一気に流し、この洗浄液を最終の濃縮プールに加えた。濃縮物を4°Cまたは−80°Cで保存する。超音波処理の場合、HN、HA、またはゼロ対照のいずれかを発現する全湿潤NT-1細胞を細胞培養物から直接回収して、スペクトラメッシュ30フィルターをブフナー漏斗に入れて、細胞および培地をわずかな真空を用いて濾紙に注ぐことによって過剰量の培地を濾過して除去した。mlに加えて氷中で15〜20秒間超音波処理した。450超音波装置を用いて様々な時間行った。超音波処理物を使用するまで氷中に入れた。gの場合、超音波処理は8〜10分間に増加されるであろう)。非洗浄剤処置が形質転換NT-1細胞からELISAシグナルを放出して、生物活性を保持できるか否かを調べるために、洗浄剤を含まない処置、および様々なレベルの超音波または微少溶液操作の処置の比較を含む一連の処置を設定した。結果は、抽出緩衝液における20秒より長い超音波時間がNT-1細胞株を有するpCHNからのHNの赤血球凝集活性を完全に破壊するが、ELISAシグナルは破壊しないという点において顕著であった。対称的に、DPBSにおいて20秒のみの超音波処理を行うと、ELISAシグナルによって検出可能な抗原を放出したのみならず、可溶性タンパク質抽出物は優れた赤血球凝集活性を示した(表1を参照されたい)。強い洗浄剤または高濃度の洗浄剤を用いずに抽出された植物由来HNを、赤血球凝集阻害アッセイにおける抗原として用いて、天然のウイルスに対して産生されたポリクローナル抗体が植物由来HNによるRBCの凝集を認識して阻害できるか否かを決定した。結果は、天然の抗体が、天然のウイルスと同様に、植物由来HNの赤血球凝集エピトープを認識するであろうことを示している(表2)。表2からのデータはまた、対照NT-1細胞または非赤血球凝集タンパク質を発現するNT-1細胞が赤血球を凝集せず、NDV特異的血清によっても影響を受けないことを示している。HA(赤血球凝集)単位まで希釈した後、NDV特異的ポリクローナル抗血清によって処置した。HA単位は、血清の滴定のために用いられる標準的なウイルス量である。上記のデータは、強い洗浄剤を利用せずに、細胞破壊量を減少させる抽出法を用いることによって、HNまたはHAを発現する形質転換NT-1細胞株の赤血球凝集活性を保持する細胞外分画が産生されることを示している。非洗浄剤抽出NT-1細胞からのHNタンパク質が、ワクチン有効性に関連する可能性があるさらなる生物活性を有するか否かを調べるために、HN抽出物をニワトリ細胞受容体に対する結合能に関して調べた。免疫蛍光染色では、天然のウイルスまたはpCHN-18抽出物によって処置したニワトリ胚線維芽細胞(CEF)を区別できないことが示された。このように、植物由来HNは、標的細胞表面上の受容体に対するウイルス様結合能を保持する。表1および2のデータを、先に記述した赤血球凝集および免疫蛍光アッセイと複合すると、本発明のトランスジェニックNT-1細胞に由来するHNタンパク質が免疫および生物学的特徴の双方を保持することを示唆している。同様に、タンパク質および免疫保護粒子は、洗浄剤の非存在下で有効かつ天然型で植物細胞から放出されうる。先に提供した最も重要なデータは、天然のウイルスに対する抗血清が、HAI試験において植物由来HNを認識するであろう点である。赤血球凝集阻害(HAI)活性がバックグラウンドより少なくとも4倍高い力価を含むニワトリはほぼ常に、毒性ウイルスからのチャレンジに対して確実に保護される。【0087】HNの収量が他の機械的破壊手段によって増加しうるか否かを決定するために、細胞を上記の微少溶液操作に曝露した。様々な圧力を用いて、破壊の作用およびHNタンパク質の生物活性を調べた。表3は試験の結果を示す。データは、HNタンパク質の単位質量あたりの赤血球凝集活性の量が、この破壊法を用いた場合10倍より大きく変化しうるが、タンパク質濃度は約20%増加するに過ぎないことを示唆している。これらのデータから、超音波処理によってごく部分的に放出されたに過ぎないより大きい粒子径にHNタンパク質が組み入れられ、生物活性を保持するより小さい粒子径が存在しうることが示唆される。均一な抽出物を生じる破壊法を用いると、さらなる活性ポリペプチドの回収することができる。μl/ウェルを用いてコーティングした。プレートを5°Cで一晩インキュベートした。μl/ウェルPBS-T(0.05%Tween20を含む1×PBS、Sigmaカタログ番号P-1379)によって3回洗浄した。μlと共に37°Cで1時間インキュベートした。μl/ウェルで3回洗浄した。VP2となるように希釈した。試料をブロッキング緩衝液によって予め希釈した。μlを加えることによってプレートに加えた。μl/ウェルを混合して移動させることによって連続2倍希釈を行って、参照または試料につき希釈液6個を作製した。μlをウェルに加えて、37°Cで1時間インキュベートした。プレートをPBS-Tによって3回洗浄した。μl/ウェルで加えて、プレートを37°Cで1時間インキュベートした。μlを各プレートに加えて、室温で約5分間インキュベートした。nmでの吸光度を測定した。Magellanソフトウェアを用いてデータを転送して表示した。直線回帰および定量分析は、マイクロソフトオフィスエクセル2003を用いて行った。μg/ウェルによってコーティングした。プレートを室温で一晩インキュベートした。20を含む1×、Sigma、ロット番号120K0248)。μlと共に37°Cで1時間インキュベートした。μl/ウェルによって3回洗浄した。ng/mlに希釈した。試料をブロッキング緩衝液において予め希釈した。μlを加えることによってプレートに加えた。μl/ウェルを混合して移動させることによって連続2倍希釈を行った。μlをウェルに加えて、37°Cで1時間インキュベートした。μlを加えて、37°Cで1時間インキュベートした。μlを各プレートに加えた。基質を添加した20分後にTMB停止溶液を加えた。nmでの吸光度を測定した。Magellanソフトウェアを用いてデータを転送して表示した。SR-1を用いて行った。HNHNに関する定量的ELISAを、アッセイを行う前日にプレートをコーティングすることによって行うことができる。μl/ウェルを平底96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加える。プレートの蓋をして、2°C〜7°Cで一晩(12〜18時間)インキュベートする。μl/ウェルで3回洗浄する。μl/ウェルを加えることによって、非特異的反応を防止するためにプレート全体をブロックする。プレートを37°C±2°Cで2時間(+10分)インキュベートした(プレートの蓋または同等物で覆う)。HA/mlの濃度になるように加える;実験抗原を1%ブロッカーによって希釈する。μl/ウェルを列Gまで移し、次に移す前にピペットによって4〜5回混合することによって試料をプレートの下段方向に連続希釈する。プレートの蓋をして、37°C±2°Cで1時間インキュベート(+10分)する;ELISAプレートをPBS-Tによって3回洗浄する。4A腹水の50%グリセロール溶液(1:2000倍希釈)50を3%ブロッカーにおいて各ウェルに加えて、プレートの蓋をして37°C±2°Cで1時間インキュベート(+10分)する。μlを各ウェルに加える;プレートに蓋をして37°C±2°Cで1時間(+10分)インキュベートする。μlを各ウェルに加える。プレートの蓋をしてRTの暗所で15〜20分間インキュベートする。nm参照フィルターによって)で読み取る。ODの範囲内となるはずであり、これをELISAの陽性対照とする。HAHAの定量的ELISAに関して、アッセイを行う前日にプレートをコーティングする。μl/ウェルを平底96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加える。プレートの蓋をして、2°C〜7°Cで一晩(12〜18時間)インキュベートする。μl/ウェルで3回洗浄した。μl/ウェルを加えることによって非特異的反応を防止するためにプレート全体をブロックする。プレートを37°C±2°Cで2時間(+10分)インキュベートする(プレートの蓋または同等物によって覆う)。HA/mlの濃度で加える;実験抗原を1%ブロッカーにおいて希釈する。μl/ウェルを列B〜列Gまで移動させて、各移動の前にピペットによって4〜5回混合することによって、試料をプレートの下段方向に連続希釈する。プレートに蓋をして37°C±2°Cで1時間(+10分)インキュベートする;ELISAプレートをPBS-Tによって3回洗浄する。μlを3%ブロッカーにおいて各ウェルに加えて、プレートの蓋をして37°C±2°Cで1時間(+10分)インキュベートする。μlを各ウェルに加える;プレートに蓋をして37°C±2°Cで1時間(+10分)インキュベートする。μlを各ウェルに加える。プレートに蓋をしてRTの暗所で15〜20分間インキュベートする。nm参照フィルターによる)で読み取った。ODの範囲内となるはずであり、これをELISAの陽性対照とする。μg/ウェルによってコーティングした。プレートを室温で一晩インキュベートした。プレートをPBS-Tによって3回洗浄した。μlと共に37°Cで1時間インキュベートした。μl/ウェルによって3回洗浄した。参照抗原および試料抗原をプレートに加える前にPBS-Tによって1:1に混合した。ng/mlに希釈した。μlを加えることによってプレートに加えた。μl/ウェルを混合して移動させることによって連続2倍希釈を行った。μlをウェルに加えて、37°Cで1時間インキュベートした。μlを加えて、37°Cで1時間インキュベートした。μlを各プレートに加えて、基質を加えた20分後にTMB停止溶液を加えた。nmでの吸光度を測定した。Magellanソフトウェアを用いてデータを転送して表示した。SR-1を用いて行った。LT血液を断頭(生後0〜7日齢のトリ)または翼の羽板もしくは頚静脈での静脈穿刺によって採取した。トリを断頭によって、または断頭前にCO2に1〜5分間曝露することによって安楽死させた。血液を動物施設から実験室に運び、2〜7°Cで45分放置して、凝血を進行させて濃縮させた。rpmで20分間遠心した。mlの少量にして凍結用チューブ(Nunc)に入れ、使用するまで−18°Cで保存した。μg/mlを利用して2〜7°Cで一晩インキュベートした。プレートをPBS-Tによって3回洗浄した後、3%スキムミルクPBSと共に37°Cで1時間ブロックした。μlをウェルあたり加えて、37°Cで1時間インキュベートした。μlを残りの列に加えた。明記していなければ血清の開始希釈液は、ブロッキング緩衝液において1:10倍であった。血清試料を連続2倍希釈した後、プレートを37°Cで1時間インキュベートした後PBS-Tにおいて3回洗浄した。ヤギ抗ニワトリ結合体をHRPによって標識して、これを加え、37°Cで1時間インキュベートした。Sunriseプレートリーダーを用いて、陽性対照が405/492の2波長での吸光度0.7〜1.0を示すまでインキュベートした。Magellanソフトウェアを用いてデータを転送して表示した。SR-1を用いて行った。SR-1を用いて、各治療群の血清の幾何平均力価(GMT)を決定した。これらの計算に関して、バックグラウンドELISA力価<10に値1を与えた。処置したトリの最小二乗平均値の対照との差を、最小二乗分析を用いて決定した。処置は、非ワクチン接種非チャレンジ対照群と処置群とのあいだに有意差があれば有効であるとした。μl/ウェル)によってプレートをコーティングする。プレートを2〜7°Cで一晩インキュベートする;蓋をして室温で約20〜30分間プレートを平衡にする。M96プレートウォッシャーまたは同等物によって3回洗浄する。μl/ウェル)によってブロックして、37°Cで2時間インキュベートする。M96プレートウォッシャーまたは同等物によって1回洗浄する。NDV尿膜腔液をブロッキング緩衝液において1:200倍希釈する。μl/ウェルでプレートに加えて、プレートを37°Cで1時間インキュベートする。M96プレートウォッシャーまたは同等物によって洗浄する。試験ニワトリ血清試料を希釈する(1:50倍)。陰性対照血清(1:50倍)(陰性対照27NOV00)を希釈する。陽性対照血清(1:10,000または1:20,000)(SPAFASニワトリα-NDV血清)を希釈する。血清試料は全てブロッキング緩衝液において希釈する。μgl/ウェルを列Aの適当なカラムに加える。これによって、プレートあたり試料4個を試料あたり希釈液8個で行うことができる。μl/ウェルを加える;陽性対照血清および試験血清試料をプレートの下段に向かって連続2倍希釈する。μl/ウェルを捨てる。M96プレートウォッシャーまたは同等物によって3回洗浄する。ヤギαニワトリIgG(H&L)-HRP(1:3000倍)をブロッキング緩衝液において希釈する。μl/ウェルを各プレートに加える;結合体をプレートに加えた後、RTの暗所でABTS基質を平衡にする。M96プレートウォッシャーまたは同等物によってPBS-Tによって3回洗浄する。μl/ウェルを各プレートに加える。プレート間を2〜3分間離す。Mホウ酸緩衝液において希釈した(1:1000倍)ウサギα-HAプール抗血清によってプレートをコーティングして、蓋をして2〜7°Cで一晩プレートをインキュベートした。M96プレートウォッシャーまたは同等物によって3回洗浄した。μl/ウェル)、プレートを37°Cで1時間インキュベートした。M96プレートウォッシャーまたは同等物によって1回洗浄する。μl/ウェルをプレートに加えた;プレートを37°Cで1時間インキュベートする。M96プレートウォッシャーまたは同等物を用いてプレートを洗浄する。試験ニワトリ血清試料(1:50倍)を希釈する;陰性対照血清(1:50倍)を希釈する;陽性対照血清(1:25600倍)(USDA/SEPRLニワトリα-AIV(T/W/68抗血清))をブロッキング緩衝液において希釈する。μl/ウェルを残りの全てのウェルに加える。μl/ウェルを捨てて、プレートを37°Cで1時間インキュベートする。M96プレートウォッシャーまたは同等物を用いてプレートを3回洗浄する。μl/ウェルを各プレートに加える。結合体をプレートに加えた後、ABTS基質をRTの暗所で平衡にする。M96プレートウォッシャーまたは同等物を用いてプレートを3回洗浄する。μl/ウェルで加える;プレート間に2〜3分の間隔を空ける。IBDV-VP2血液および血清の採取は、LTに関する血清ELISAに関して先に記述した通りに行った。Mホウ酸緩衝液において2〜7°Cで一晩インキュベートしてプレートに吸着させた。プレートをPBS-Tによって3回洗浄した後、3%スキムミルクPBS-T溶液によって37°Cで1時間ブロックした。μlを残りの列に加える。明記していない限り、血清の開始希釈液はブロッキング緩衝液において1:10倍であった。血清試料を連続2倍希釈した後、プレートを37°Cで1時間インキュベートして、PBS-Tによって3回洗浄した。HRPによって標識したヤギ抗ニワトリ結合体を加えて、37°Cで1時間インキュベートした。nmで読み取った場合に0.7〜1.0に達するまでインキュベートする。Magellanソフトウェアを用いてデータを転送して表示した。ml遠心管に移して、250×gで10分間遠心した。JRH)に再懸濁させることによって2回洗浄して、250×gで10分間遠心した。沈降物をDPBSにおいて1%(v/v)に再懸濁させた。mlに移して、激しく混合することによって細胞を溶解した。OD540は0.4〜0.5のあいだであった。1%溶液は使用するまで2〜7°Cで保存した。Guard(商標)を噴霧して、ペーパータオルにしみこませた。μlを96ウェルディッシュの各ウェルに加えた。希釈したウイルスを第一の列に加えて、ウイルス試料あたりの望ましい回数の希釈液を得るまで連続2倍希釈した。rpmで20秒間混合した。プレートを湿ったペーパータオルの上に置いて、対照ウェルにおけるCRBC(DPBSおよびCRBSが1:1比)がプレートの底に沈降するまで、または2〜7°Cで少なくとも1時間インキュベートした。終点は、100%凝集を提供するシリーズにおける最後のウェルの希釈であった。μl(本明細書に記述のウイルスの力価測定に基づく)を得た。μlを縦列1および3のウェルに加えた。縦列3における血清を10ウェルを通して連続希釈した。rpmで20秒間混合した;プレートを室温で1時間±15分インキュベートした。rpmで20秒間混合して、湿潤室においてAIVに関して2〜7°Cで一晩、およびNDVに関して2〜7°Cで1〜2時間インキュベートした。血清の力価は赤血球凝集を100%阻害する連続希釈液の最後のウェルである。上記のように、非洗浄剤緩衝液において抽出された免疫保護粒子における植物由来タンパク質が動物種において抗体を産生するか否かを調べるために、HAおよびHNタンパク質の双方を調製して、ウサギに接種した。3ヶ月齢のニュージーランドホワイトウサギに、表4に示す投与スケジュールに従って植物由来HA-AIVまたはHV-NDVを接種した。初回接種の場合、抗原をフロイントの完全アジュバント(CFA)と混合して、追加接種の場合には全てフロイントの不完全アジュバントを用いた。双方のタンパク質によって誘導された抗体力価を表5に示す。哺乳類において、天然のタンパク質を認識することができる抗体を誘導することを示している。データから、植物由来HNおよびHAが天然に由来するHNおよびHAタンパク質と共有する特徴を有することが示唆される。植物由来AIV-HA接種ウサギの力価は、NDV-HN植物由来タンパク質によって誘導された力価より高かった。このことは、AIV-HAタンパク質の単位あたりのAIV/HAタンパク質の全般的生物活性(赤血球凝集)がNDV-HNより低かったことから、重要であるかも知れない(表4、縦欄4)。植物由来HNタンパク質の有効性を調べるために、2日齢および10日齢のトリを用いて二つの異なる試験においてHNタンパク質を接種した。これらの試験に用いられる試験#16の用量濃度を表6に示す。全てのワクチン接種物をシェーカーフラスコにおいて25°Cで15〜20日増殖させたNT-1細胞の可溶性分画から調製した。双方の試験において用いられるアジュバントは、Corixa、Inc.のMPL-TDMであった。鼻腔内群には、MPL単独をアジュバントとして投与した。【0101】2日齢のSPFニワトリに様々な経路によって、NT-1由来生物活性(赤血球凝集陽性)NDV-HNタンパク質を表6に示す接種あたりのHNタンパク質の量で用いて接種した。この試験の血清およびチャレンジの結果を表7に示す。対照群は全て予想どおりに反応した。μgを投与した対照のトリは100%生存した。植物由来HN抗原群を用いた実験処置において、#3群において75%保護(アジュバントと共にSQ接種)および#4群において80%保護(アジュバントと共にSQ接種)を認めた。INおよび経口経路によって接種した残りの治療群は100%死亡率を示した。6群ではトリ2羽に死亡の遅れを認め、これらのトリがワクチン接種に対して感作されている可能性があること(例えば、表10、列14を参照されたい)、およびこの経路によって投与する場合には有効性を増強するために異なる製剤を必要とすることを示している。その後の試験(#18)において、10日齢のSPFトリに表8のスケジュールに記述した用量を接種した。対照群1群(#3)、非ワクチン接種非チャレンジ処置を用いて、ケージおよび施設がニワトリの全般的な健康に有害な作用を及ぼさないことを示した。この試験における対照群も、予想どおりに反応した。双方の試験からのトリを同じ施設でチャレンジすることから、処置群#2を試験16(表7)および18(表9)の双方の陽性対照とした。その全てにNT1細胞に由来するHNをSQ接種した残りの群では、群#7において100%生存、群5および6のそれぞれにおいて80%生存を認め、そして4群において60%生存を認めた(表9を参照されたい)。タンパク質(HA)をワクチン接種した。CHN-18に関して記述したベクター系を用いてNT1細胞に形質転換した。HA-AIVタンパク質のトランスジェニック植物細胞産生のためのNT1株の命名はCHA-13であった。ニワトリをふ化後3日齢で得て、トリ10羽を各治療群に関してケージに無作為に入れた。各治療群の用量を表11に示す。トリを試験の0、14、および28日目に3回投与して、血液試料を0日、21日、35、および45日に採取した。Laboratoryに輸送して、そこでトリに毒性AIV(ニワトリ/ペンシルバニア/1370/1983)をチャレンジした。μg用量によって、ワクチン調製物の2回投与後であってもHAI陽性力価への血清変換が得られたことが示される。チャレンジすると、ワクチン接種群は全て、AIVに対して保護を示した:50またはそれ以上のチャレンジスコアは疾患または臨床病態を示している。製剤によらず、全ての群は、チャレンジ時に天然のAIVに対して非常に類似の力価を示し、このことは植物由来タンパク質によって誘導される天然のウイルスに対するメモリー反応を示している(縦欄4、表11)。上記の試験は、本発明に従うトランスジェニック植物細胞に由来する二つのタイプの糖タンパク質が、それらが毒性チャレンジから標的種を保護できるという点において非常に有効であることを示している。さらなる試験において、IBDVからの非グリコシル化構造タンパク質VP2を、CHN-18およびCHA-13の場合と類似のベクターおよびプロモーター構築物によってNT-1細胞に形質転換した。本明細書に記述の得られたトランスフェクト細胞をCVP2-002と命名した。K+Vをワクチン接種した。L発酵器において増殖させて、継代6代目のCVP2-002細胞をシェーカーフラスコにおいて増殖させた。L微小溶液装置の中に通過させることによって溶解した。得られた細胞溶解物を2000×gでの遠心によって透明にした。透明にした上清を凍結乾燥によって濃縮した。ワクチンをアジュバントと共に調製して、各ワクチンのVP2濃度をワクチン接種前にELISAによって決定した。ワクチン接種日でのVP2濃度を記述する。血液試料をふ化後21、35、および42日目に採取して、血清ELISAにおいて抗体反応に関して、およびIBDV血清中和(SN)アッセイにおいて中和抗体力価に関して試験した。EID50胚由来STC株を両側の点眼によってチャレンジした。トリをチャレンジ後10日目に安楽死させた。ファブリキウス嚢対体重(BBW)および脾臓対体重(SBW)比を各トリに関して決定した。各トリからのファブリキウス嚢組織をホルマリンによって固定して、嚢胞枯渇によって示されるIBDV関連病変に関して採点した。BBW比、SBW比、および嚢病変スコアを非チャレンジ対照トリと比較した。非チャレンジおよび対照のあいだでBBWに統計学的有意差がなければトリは、チャレンジから保護されたと採点された。表13は、各ワクチン群に関する血清学およびチャレンジ結果を要約し、これは、植物由来VP2抗原が通常の死菌IBDワクチンより実際に大きい(ELISAによって)血清反応を生じることを示している。BBWによって測定したチャレンジに対する保護は、植物由来VP2が通常の死菌IBDワクチンと共に保護することを示している(表13の列4〜列10を比較)。【0104】Y1副腎細胞における熱不安定性毒素の細胞障害性マウスのY1副腎細胞をATCC(CCL-79、L#1353400)から購入した。cm2T-フラスコ(Corning)に入れた。細胞を5%CO2において37°Cでインキュベートした。細胞を、各継代時にこの増殖培地で、LTおよびCT細胞障害性アッセイのために維持した。アッセイするために、細胞を96ウェル細胞培養プレート(Nunc)に播種して80%コンフルエンスに達するまで増殖させた。μg/mlに希釈した。μlを加えることによって、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて2倍連続希釈によってさらに希釈した。μlに移すことによって2倍連続希釈を行った。試料の各希釈液を、試料または細胞の利用率に応じてY1副腎細胞の1〜4ウェルに移した。LT毒素の終点力価は、50%細胞障害性(細胞死)を得るために必要なタンパク質の量(EC50)である(Guidryら、1997;Dontaら、1974)。20:293〜500)。植物において産生されたLT変異体濃度を、Y1副腎アッセイ(表14を参照されたい)において大腸菌からのLT野生型毒素と比較したところ、結果は、植物由来毒素によって、大腸菌に由来する同じ変異体に関して認められる類似のレベルの感受性が得られることを示している。65:4943〜4950)。強力な免疫保護材料であるか否かを決定するために、接種のために均一な乳剤を作製するために微少溶液操作によって調製した製剤を用いて、眼および鼻腔粘膜表面に抗原を直接接種することによってトリの試験を行った。μg/トリの抗原を接種した(表15を参照されたい)。トリにワクチンの3用量を0、14、および21日目に投与して、トリは試験終了時42日齢であった。抗原にはCHN-18トランスジェニック植物細胞に由来するHN、CHA-13トランスジェニック植物細胞に由来するHA、および感染ニワトリ胚の尿膜腔液に由来する不活化トリインフルエンザウイルスが含まれた。抗原調製物は、先の実施例3に記述したように調製した。様々な製剤において異なるアジュバント5個を用いて、免疫応答を、赤血球凝集阻害および血清ELISAに関して血清学によって決定した(表15を参照されたい)。試験の結果を表16に示す。一つの製剤を除く三つの用量によって全て、CHN-18からの植物由来HNを接種したトリでは血清変換が起こった。製剤の一つによって、CHA-13からのHAを接種したトリでは血清変換が起こり、二つの製剤によって、不活化AIV抗原を接種したトリの血清変換が起こった。結果から、植物由来の非複製抗原が、粘膜表面への接種によってトリにいて血清学的反応を提供したことが示される。Lバイオリアクターまたはシェーカーフラスコにおいて増殖させたトランスジェニック細胞培養物から発現されたrDNAを図15〜18に示す。実施例2において先に記述した培地にCHN-18、CHA-13、SLT102、またはCVP2-002トランスジェニック細胞を産生するNT-1トランスジェニック細胞培養物を、培養12日後に回収した(静止期)。Brunswick)に無菌的に移した。L/分で通気しながら25°Cで行う;細胞の産生は9〜15日間行う。mlを加えて、2000×gで10分間遠心することによって、細胞沈降容積(PCV)を決定し、細胞容積を測定して、接種日から10日目までの細胞増殖、または静止期培養を追跡するパラメータとして評価した。データは、約3日間の遅滞の後、培養物の指数増殖期が3日〜7日までのあいだに起こり、その後培養物は、挿入された遺伝子および用いたプロモーター系によらず、分析した各トランスジェニック細胞株に関して静止期に達し始めた。CHN-18の場合、測定可能なHNタンパク質の量を毎日追跡した。ELISAシグナルを認め、これは培養12日でシェーカーフラスコから採取した接種物に存在するHNの量を表す。HNは急速に分解し、細胞が静止期に達した培養約6日後まで検出されず、細胞が静止期を通過した後も細胞に蓄積され続ける。HN発現は異なる二つの測定によって追跡し、黒三角は定量的ELISAによって測定したHNタンパク質を表し、黒四角は赤血球凝集を表す。定量的ELISAは、HNタンパク質産生に対してより感受性が高く、単量体または重合化HNタンパク質の双方を測定するが、赤血球凝集は、赤血球を凝集することができる二量体または重合化タンパク質のみを測定し、より多くのタンパク質が蓄積して初めて、このように赤血球凝集活性を測定することができる(図15)。タンパク質の増殖後期産生の現象は、発現されるタンパク質(大腸菌のホロトキシンLT、トリインフルエンザウイルスの赤血球凝集素タンパク質(HA)、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2構造タンパク質、またはニューカッスル病ウイルスの赤血球凝集素-ノイラミニダーゼタンパク質(HN))によらず認められる(図16、17、および18を参照されたい)。【0107】CHA-13およびCVP2-002の産生および増殖曲線をそれぞれ、図16および17に示す。CHA-13に関して、増殖(PCV)は、接種後2日目に始まり、接種後10日目で静止期に入る。ショ糖は接種後2日まで消費され、デキストロースは接種後6日まで消費される。HAの蓄積は、接種後6日目に始まり(中期対数増殖期)14日まで増加する。細胞増殖は接種後2日目に始まり、接種後9または10日目で静止期に入る。ショ糖は接種後2日まで消費され、デキストロースは接種後5日まで消費される。VP2蓄積は接種後7日目に始まり(中期対数増殖期)、14日まで増加する。(LT)に関するK63変異体を発現するSLT102トランスジェニックNT-1細胞株を図18に示す。LT毒素は5日および6日のあいだに蓄積し始め、沈降細胞容積はこの実験では示されないが、他のNT-1トランスジェニック細胞株の容積と類似である。組換え型または天然起源から抽出したタンパク質はしばしば、プロテアーゼ、グリコシラーゼ、リパーゼ、またはタンパク質および細胞成分と共に精製された他の酵素のために不安定である。NT-1細胞から単離されたタンパク質および免疫保護粒子は、固有に安定であり、多くの異なるタイプの下流のプロセシング活性に対して強健である。L発酵器から採取して、濾過し、遠心によって透明にして、実施例3に記載の方法に従って1回微少溶液化した。上清を0.2または0.45ミクロンのフィルターに通過させて、濾過または微少溶液化による操作の際に導入された可能性がある如何なる細菌物質も除去し、安定化剤をこれらの懸濁液に加えなかったが、安定性は、これらのトランスジェニック細胞に由来するタンパク質に対して固有である。次に、材料を2〜7°C、25°Cで保存するか、または−80°Cで凍結した;材料は全ての温度で安定であることが判明したが、最も興味深いことに25°C(外界温度)で維持すると、単離タンパク質は、安定であることが判明した(図19に示す)。月毎にシグナルの変動を認めたが、単離されたタンパク質の量は、数ヶ月後顕著な安定性を示し、これらのデータから計算することができる半減期は、予測半減期8ヶ月(0.45ミクロン試料)および0.2ミクロン濾過試料では1年より長いことを示している。共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)共焦点レーザー走査顕微鏡を形質転換MHN-41およびCHN-18においてHN抗原を局在するために行った。ELISAにおける検出Ab)であった。gで5分間遠心して、3.7%ホルムアルデヒドにおいて15分間固定した。細胞をPBSによって各洗浄について5分間2回洗浄した。gで2分間(毎回)遠心して、0.5%TritonX-100および1%ペクトリアーゼによって15分間処置した。H2Oによる洗浄を行って、H2Oをメタノール(−20°C)に置換した;異なるウェルを有するコーティングしたスライドガラスに、ピペットによって細胞を載せて、空気乾燥させた(フード内で20〜30分間)。PBSによって洗浄した後、3%BSA/PBSによって30分間ブロックした。一次抗体(1%BSA-PBS-T(0.05%Tween-20を含むPBSを37°Cで1時間、またはRTで1.5〜2時間)インキュベートする)。PBS-Tによって3回洗浄する。Cy5/Cy2(1:100倍)によって標識した二次抗体をRTで1時間インキュベートして、スライドガラスをPBS-Tによって3回洗浄して封入した。4Aによって染色を認めなかった。双方のHN特異的抗体によって、静止期細胞の細胞質全体に明るい染色(核には認めない)をMHC-41細胞株全体に認めた。(図20および21を参照されたい)。されたタンパク質が蓄積されている場所を確立するために、トランスジェニック植物細胞を培養10日後に回収して、以下のように薄切片および免疫金標識のために調製した。免疫金標識は、10日齢の感染ニワトリ卵胚から採取した尿膜腔液のニューカッスル病ウイルス調製物から精製したHNタンパク質によって免疫したウサギからの精製IgGを用いて行った。6.8)において3時間固定した。次に、それらをリン酸緩衝液において、緩衝液を4回交換して1時間洗浄した。細胞を2%四酸化オスミウムのリン酸緩衝溶液において1時間後固定した。濃度を増加させたエタノール(25%、50%、75%、95%、および100%、各段階15分)およびプロピレンオキサイドにおいて細胞を脱水した。812において抱埋し、60°Cで2日間重合化した。kVで操作して調べた。Mグリシンを加える)洗浄後、エタノールの濃度を増加させて脱水した。White樹脂に一晩浸潤させて、最終的に抱埋し、50°Cで24時間重合化した。7.4のPBS緩衝液において20分間インキュベートして、非特異的部位をブロックした。次に、細胞を一次抗体(PBSにおいて1:150倍希釈)と共に室温で2時間インキュベートした。nm)と共に室温で2時間インキュベートした。細胞をPBSにおいて5分間の洗浄を4回行った後、水によって1分の洗浄を2回行った後、グリッドを酢酸ウラニルによって5分間染色した。EM画像によって、対照細胞と、HNタンパク質を発現するトランスジェニック細胞とのあいだに二つの主要な差が示され、最初の色素体/白色体は、トランスジェニック細胞において蓄積するが正常細胞には蓄積しない暗い顆粒を示し(図22)、第二に、免疫金染色顆粒は、トランスジェニック細胞の細胞壁近傍で蓄積することが認められうるが、対照細胞は認めることができない(図23)。典型的に、宿主細胞において発現される遺伝子産物は、細胞の指数増殖期に起こり、一般的に小胞体、ゴルジ体、および細胞における他のタンパク質合成小構造において染色されうる。図19および20に示す共焦点画像と共に、データは、電子顕微鏡によって、タンパク質が細胞膜および細胞壁において産生され、沈着されるが、核、葉緑体、ミトコンドリア、小胞体、およびゴルジ体には蓄積を認めないことを示している。電子顕微鏡から、後期静止相の細胞が肥大した液胞および圧縮された細胞質および核を有することが示される。共焦点画像は、タンパク質が、細胞全体の細胞質細胞壁および膜に対して圧縮されていることを示唆している。細胞におけるタンパク質産生および蓄積が、細胞がもはや活性な代謝状態ではない後期指数増殖期および静止期まで明白でないことは珍しい。増殖フラスコまたは発酵器における細胞の接種時に発現されたタンパク質シグナル(24時間)が急激に減少したこと(実施例15を参照されたい)は、窒素源としてタンパク質を用いること、そして細胞が活性な増殖を終了した場合には窒素源(タンパク質)の貯蔵が起こりうることを示している。この現象は、上記の実施例において記述される植物細胞培養において産生されたトランスジェニックタンパク質に対して独自の特徴である。細胞壁および膜近傍にタンパク質が存在することは、機械的破壊によって予想外に容易にタンパク質を単離できることを説明するために役立つ。各タンパク質のクラスが安定かつ有効な形で容易に単離されうることもまた、予想外である。如何なる単一のタンパク質もしばしば、組換え型DNA発現を調べるために選択された任意の外来宿主系において合成されうるが、多くのタンパク質、特に膜貫通結合糖タンパク質はしばしば、低レベルで産生されるが、一つの宿主系は同じ方法で二つの糖タンパク質を発現しない。本明細書に記述する細胞培養トランスジェニック系において、少なくとも五つのクラスのタンパク質(酵素、1型ウイルス糖タンパク質、2型ウイルス糖タンパク質、LT毒素、および構造的非グリコシル化タンパク質VP2)が、同じ宿主系において首尾よく類似のレベルで発現されている。タンパク質は、タンパク質のクラスによらず、後期静止期において蓄積し、転写カセットまたはプロモーター系は同じ物理的または機械的破壊法を用いて細胞から容易に除去することができる。これらのトランスジェニック細胞によって発現されるタンパク質のクラスによらず、各タンパク質は、生物学的に活性である安定な形での単離に成功している。(1979)、32:593)。完全長のRNA1がポリタンパク質に翻訳され、これがペプチドVP2、VP3、およびVP4にプロセシングされる。silico)逆転写を行って、天然のRNAのタンパク質コード能に対応するDNA配列を得ることができる。VP2タンパク質をコードするIBDVのEhime91(E/91)株の誘導DNA配列の1359塩基対(bp)は、Genbankアクセッション番号AB024076号として利用できる。この配列の分析によって、最適な植物遺伝子発現と共に、最適でないコドン組成にとって有害であると考えられるいくつかの配列モチーフが存在することが判明した(例えば、米国特許第5,380,831号を参照されたい)。NO:11)を作製した。Virol(2001)、75:10815)の報告に基づいて含めたが、彼らの報告はVP2カプシドアセンブリの最適なVP2プロセシング部位が、451位(Leu対Ile)を除いてE/91の配列と同一であるIBD株UK661(Genbankアクセッション番号NC_004178)VP2配列によってコードされる453位ではなくて最後のアミノ酸であるアミノ酸456位で起こることを示している。このように、アミノ酸454、455、および456位(Ile、Ala、Val)は、VP2遺伝子のアミノ酸456位を操作するためにUK661株に由来した。天然のE/91配列によってコードされるVP2タンパク質、および植物最適化コード領域によってコードされるVP2タンパク質は、99.3%同一であり、アミノ酸454、455、および456位が異なるに過ぎない。VP2コード領域の誘導DNAおよび植物最適化DNAは80.3%同一であるに過ぎない。外来遺伝子を植物の染色体に無作為に組み入れると、如何なる特定の組み込み部位も、組み込み部位に隣接する遺伝子制御エレメントおよびオープンリーディングフレームから新しい異常なタンパク質の偶発的な産生を行う部位となる可能性が存在する。NO:13に開示する「万能ターミネーター」)。その後のクローニング段階を可能にするために、これらの制限酵素の認識部位を含む塩基をこの有用な配列に含める。NO:11)の植物最適化ヌクレオチド配列を含む双子葉植物発現ベクターを構築した。基本バイナリベクター(BBV)骨格(図24)を用いて、AgeIリンカーを付加することによって唯一のBamHI部位で改変を行った。新しいバイナリベクター(pDAB2407、図25)によって、T-DNA境界配列のあいだでVP2と選択マーカー発現カセットとのAge1/AgeIライゲーションを行うことができる(pDAB2423、図31)。P60C2からの合成VP2配列(図26、PICOSCRIPT、ハウストン、テキサス州)をBbsIおよびSacI制限酵素によって切除することによって構築した。UTRをコードするpDAB2406(図27)をNcoIおよびSacIによって切断した。pDAB2406骨格およびVP2インサート断片を、pDAB2406のNcoIおよびSacI部位でライゲーションして、pDAB2415(図28)を得た。ライゲーションしたDNAを大腸菌DH5αコンピテント細胞(Invitrogen)に形質転換して、陽性クローンに関してスクリーニングを行った。HindIII×MluI酵素を用いて陽性クローンを制限分析によって同定し、インサート/ベクター接合部を超えたシークエンシングによって確認した。【0120】pDAB2415サブクローンを確認した後、プラスミドをNotIによって切断して、CsVMV/VP2/ORF24断片を単離した。1983、2:335;Genbankアクセッション番号X00493)をコードするpDAB2418(図29)をNotIによって直線にした。pDAB2418骨格およびpDAB2415インサート断片を、ゲルにおいて単離して、精製し、NotI部位でライゲーションすると、pDAB2416(図30)が得られた。ライゲーションしたDNAを大腸菌に形質転換して、コロニーをBglIIおよびSacIによる制限酵素消化物によってスクリーニングした。陽性サブクローンのさらなる確認は、NotI接合部を超えるシークエンシングによって確認した。次に、pDAB2416プラスミドをAgeIによって切断して、ベクター骨格からMAR/CsVMV/VP2/ORF24/Ubi10/PAT/ORF1発現カセットを除去した。pDAB2407も同様に、AgeIによって切断して、バイナリベクターを直線にして、適当な断片をライゲーションしてpDAB2423を形成した。ライゲーションしたDNAを形質転換した後、コロニーをHindIIIおよびXhoI消化物を用いてスクリーニングした。採取したコロニー30個のうち、12個が陽性であった。陽性クローンを、NcoI、PmeI、およびPstI酵素を用いて制限消化物によってさらに分析した。最終確認のため、クローンをT-DNA境界配列のあいだで十分にシークエンシングした。【0121】(表1)植物由来HNの赤血球凝集活性に及ぼす抽出法の比較1天然のNDVを2分間超音波処理した。7.2;DPBS−ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液;sonic−超音波処理;F/T−凍結融解;nd−本試験では実施していない【0122】(表2)植物由来HNおよび天然のウイルスの赤血球凝集阻害(HAI)活性の比較1保存ウイルスは4HA単位であり、保存ウイルスの1:4倍希釈に等しい。HA単位を妨害する終点希釈抗体が、抗体調製物のHAI力価であると考えられる。【0124】(表4)ウサギに接種するための用量レベル1全てのNT-1試料を非凍結乾燥材料から提供した。BCAタンパク質アッセイキットの主成分;TSP−総可溶性タンパク質。CHN-7およびCHN-18はNDVからのHNタンパク質を発現する二つの異なるトランスジェニック細胞株であり、CHA-13およびCHA-47はAIVのHAタンパク質を発現する二つの異なるトランスジェニック細胞株である。EID50(卵感染用量)を接種した。トリには最後のワクチン接種後24日目にチャレンジした。太字のトリの数は、遅れて死亡を認めた。;na−適用されない。EID50(卵感染用量)を接種した。トリは最後のワクチン接種後31日目にチャレンジした。赤血球凝集阻害(HAI)力価は、3回の実験の平均力価として報告する。【0130】(表10)試験#16および#18に関するチャレンジ後の死亡日(NDVチャレンジ)*5群のトリ1羽はこの日付で記録しなかった。【0131】(表11)CHA-13に関する血清学およびチャレンジ結果(AIVチャレンジ)1赤血球凝集阻害(HIA)力価は2回の実験の50%終点として報告し、値1は、バックグラウンドを示す。2チャレンジスコアは、結膜炎=1;抑うつ=2;運動失調=3;麻痺/斜頚=4;死亡/安楽死=5の複合評定によって決定した。【0133】(表13)CVP2-002家禽試験の血清学およびチャレンジ結果(IBDVチャレンジ)1血清中和(SN)力価の範囲は、処置あたりのトリの群に関して血清力価の最低値から最高値までである。2血清ELISA力価の範囲は、処置あたりのトリの群に関して血清力価の最低値から最高値までである。3処置群において各トリに関してファブリキウス嚢対体重(BBW)を測定して、各チャレンジ群を非チャレンジ群(#1)と比較し、p値を提供する統計学的有意差が得られる;0.05より大きいp値は保護的であると考えられる。1実施例6に記載のようにガングリオシド定量捕獲ELISAを用いて各抗原をアッセイする。2LT濃度は、LTA特異的抗体を用いてガングリオシドによって捕獲されたLTBに結合するLTAタンパク質の量を表す。3LTB特異的抗体を用いて毒素のLTB定量に基づく濃度。LT−熱不安定毒素;LTA−熱不安定毒素のAサブユニット;LTB−熱不安定毒素のBサブユニット。L発酵器から採取した日付を指し、バッチ番号を示す。mlを滴下することによって点眼経路および鼻腔内INによって投与した。saponaria)からのサポニンである;LT−大腸菌からの熱不安定毒素;chol−コレステロール;oil−ドラケオール鉱油。3投与した用量レベルは、ワクチンをアジュバントと共に混合する前に、バルク抗原に関する定量的ELISAから採取した抗原の希釈液または組み合わせを用いて決定した。4陽性対照試料はSQ−皮下接種によって投与した。【0136】(表16)植物由来抗原および天然の抗原の粘膜輸送ワクチン輸送(鼻腔内および点眼);処置群あたり投与した用量1,2情報に関しては表15を参照されたい。3赤血球凝集阻害(HAI)血清力価は、いずれもニワトリ胚の尿膜腔液に由来する不活化AIVおよびNDV抗原を用いて決定した。双方の抗原を各処置の対照として用い、報告された血清力価は、その処置に関する抗原に対する特異的反応であった。本特許のファイルは、カラーで印刷される少なくとも一つの図面を含む。カラーの図面を有する本特許または特許出願の出版物のコピーは、要請に応じて、必要な料金を支払えば特許商標庁から提供されるであろう。NO:1および2)NDV株「Lasota」のHN遺伝子の植物最適化コード配列およびタンパク質配列を示す。3'(マンノピンシンターゼ)エレメントによって終止する植物選択マーカーPAT(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)を含むpBBV-PHAS-iaaHのマップを示す。DNAの境界を定めるアグロバクテリウムのLBおよびRB(左右T-DNA境界配列)エレメントが植物ゲノムに組み入れられている。【図3】免疫保護抗原を発現するための多様な植物発現ベクターの開始プラスミドとして用いられる「鋳型ベクター」であるpC!Hのマップを示す。HNタンパク質のpCHN発現ベクターのマップを示す。3'エレメントによって終止する。HNタンパク質のpgHN発現ベクターのマップを示す。3'エレメントによって終止する。HNタンパク質のpgHN151発現ベクターのマップを示す。3'エレメントによって終止する。3'エレメントによって終止する植物選択マーカーPATを含むpBBV-PHAS-iaaHに由来する。DNAの境界を示すLBおよびRB、すなわち左右T-DNA境界配列エレメントが植物ゲノムに組み入れられている。HNタンパク質のpgHN153発現ベクターのマップを示す。UTRおよびイントロンと共に塊茎特異的GBSSプロモーターによって促進され、マメファセオリン3'エレメントによって終止する。3'エレメントによって終止する植物選択マーカーPATを含むpBBV-PHAS-iaaHに由来する。DNAの境界を示すLBおよびRB、すなわち左右T-DNA境界配列エレメントが植物ゲノムに組み入れられている。HNタンパク質のpMHN発現ベクターのマップを示す。3'エレメントによって終止する。3'エレメントによって終止する植物選択マーカーPATを含むpBBV-PHAS-iaaHに由来する。DNAの境界を示すLBおよびRB、すなわち左右T-DNA境界配列エレメントが植物ゲノムに組み入れられている。A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)のHA遺伝子のpCHA発現ベクターのマップを示す。A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)のHA遺伝子のDNAおよびタンパク質配列を示す。【図11】pGLTB中間ベクターのマップを示す。【図12】pCLT105中間ベクターのマップを示す。【図13】pDAB2423を示す。VP2をコードするバイナリベクターを示す。【図15】CHN-18、CHA-13、SLT102、およびCVP2-002に関する発現されたタンパク質の産生、増殖、および蓄積を示す。L発酵器におけるCHA-13の増殖の結果を示す。NT-1トランスジェニック細胞の増殖。L発酵器あたり)の蓄積。黒菱形は、実施例8に記述の赤血球凝集力価の蓄積であり、1日目に認められた赤血球凝集力価は、13日振とう培養物からの接種物である。【図16】CHN-18、CHA-13、SLT102、およびCVP2-002に関する発現されたタンパク質の産生、増殖、および蓄積を示す。L発酵器におけるCHA-13の増殖の結果を示す。NT-1トランスジェニック細胞の増殖である。白三角は、ショ糖濃度を示し、ショ糖は、炭素源として用いられ、これはデキストロース(白四角)に急速に変換されて、培養物への接種後48時間ではもはや検出できない。NT-1の細胞抽出物からの黒三角によって示される。【図17】CHN-18、CHA-13、SLT102、およびCVP2-002に関する発現されたタンパク質の産生、増殖、および蓄積を示す。L発酵器におけるCVP2-002の増殖の結果を示す。NT-1トランスジェニック細胞の増殖を示す。白三角は、ショ糖濃度を示し、ショ糖は、炭素源として用いられ、これはデキストロース(*)に急速に変換されて、培養物への接種後48時間ではもはや検出できない。NT-1の細胞抽出物からの黒三角によって示される。【図18】CHN-18、CHA-13、SLT102、およびCVP2-002に関する発現されたタンパク質の産生、増殖、および蓄積を示す。シェーカーフラスコ培養におけるLTの蓄積、濃度は実施例7におけるLT定量的ELISAによって決定した。NT-1細胞のPCVは、図15〜17におけるNT-1トランスジェニック細胞株に関して認められた場合と同じ増殖および産生を示す。【図19】トランスジェニック細胞株CHN-18からのタンパク質の安定な産生。NT-1から調製した試料の定量的ELISAシグナルの安定性。L発酵器から細胞を回収することによって単離した。細胞を破壊するために、1回微少溶液操作した後、試料を0.45ミクロンまたは0.2ミクロンのフィルターによって濾過して、25°Cで保存した。MHN-41染色細胞を示す。緑色:Rb抗HNポリクローナル抗体に関して標識したCy2色素によって染色した細胞(左上)。青色:4A腹水に関して標識したCy5色素によって染色した細胞(右下)。赤色:ヨウ化プロピジウム染色核(右上)。水色/赤:緑、青、および赤色の画像のデジタル融合画像。細胞の核には、いずれの抗体による染色も認めない。細胞壁全体および細胞内細胞質の膜に沿って強く染色された領域のために、液胞は区別できない。対照NT-1細胞の染色、左のパネルはRb抗HNポリクローナル抗体または4A腹水のいずれかによって染色した細胞である:右のパネルはヨウ化プロピジウム染色NT-1細胞である。【図22】トランスジーンによって産生されたポリペプチドの局在を示す電子顕微鏡写真を示す。フレームの倍率を示し、対照細胞は倍率16,000倍、CHN-18は50,000倍、およびMHN-41は26,000倍である。【図23】トランスジーンによって産生されたポリペプチドの局在を示す電子顕微鏡写真を示す。NT-1対照細胞、CHN-18トランスジェニック細胞、およびMN-41トランスジェニック細胞の電子顕微鏡の免疫金染色。【図24】バイナリ、中間および発現ベクターのマップを示す。基本バイナリベクター(BBV)のマップを示す。【図25】バイナリ、中間および発現ベクターのマップを示す。中間pDAB2407のマップを示す。【図26】バイナリ、中間および発現ベクターのマップを示す。PICOSCRIPT(ハウストン、テキサス州)によって提供されたBluescriptベクターにおける合成されたVP2を示す。【図27】バイナリ、中間および発現ベクターのマップを示す。中間ベクターpDAB2406のマップを示す。【図28】バイナリ、中間および発現ベクターのマップを示す。中間ベクターpDAB2415のマップを示す。【図29】バイナリ、中間および発現ベクターのマップを示す。中間ベクターpDBA2418のマップを示す。【図30】バイナリ、中間および発現ベクターのマップを示す。中間ベクターpDAB2416のマップを示す。【図31】バイナリ、中間および発現ベクターのマップを示す。UTRによって終止するVP2を示す双子葉植物発現ベクターpDAB2423のマップを示す。UTRによって調節される。溶解緩衝液に再懸濁させる段階;e)該再懸濁細胞を、免疫保護粒子または生物活性タンパク質粒子が形成されるように物理的または機械的に破壊する段階;ならびにf)該免疫保護粒子または該生物活性タンパク質粒子から細胞の破片を分離する段階。双子葉植物細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。タバコ細胞株培養物である、請求項2記載の方法。後期指数増殖期および増殖静止期に由来する、請求項1記載の方法。ローター/ステーター法、フレンチプレスもしくは他の加圧法、またはホモジナイゼーションによって行われる、請求項1記載の方法。物理的または機械的破壊が20秒間までの超音波処理によって行われる、請求項5記載の方法。方法の段階が、細胞を破壊する強い洗浄剤または他の化学物質の非存在下で行われる、請求項1記載の方法。免疫保護抗原がトリウイルスからのタンパク質である、請求項1記載の方法。免疫保護抗原が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)の赤血球凝集素/ノイラミニダーゼタンパク質、トリインフルエンザウイルス(AIV)の赤血球凝集素タンパク質、および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。NO:12からなる群より選択される、請求項1記載の方法。植物細胞が、NT-1、BY-2、CHN-18、CHA-13、CVP2、およびMHN-41からなる群より選択される、請求項1記載の方法。【請求項12】ポリヌクレオチドがサブユニットワクチンをコードする、請求項1記載の方法。リガンド、シグナル伝達物質、サイトカインからなる群より選択される、請求項1記載の方法。細胞破片から分離されている免疫保護粒子または生物活性タンパク質粒子を含む上清を回収する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。免疫保護粒子または生物活性タンパク質粒子から、可溶性の安定な生物活性タンパク質を単離する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。上清から可溶性の安定な生物活性タンパク質または免疫保護タンパク質を単離する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16のいずれか一項記載の方法によって産生された単離免疫保護粒子または生物活性タンパク質粒子。一つまたはそれ以上の薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、担体、または賦形剤と混合して請求項17記載の免疫保護粒子または生物活性タンパク質粒子を含む組成物。免疫保護粒子が少なくとも一つの免疫保護抗原を含む、請求項18記載の組成物。免疫保護抗原が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)の赤血球凝集素/ノイラミニダーゼタンパク質、トリインフルエンザウイルス(AIV)の赤血球凝集素タンパク質、および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質からなる群より選択される、請求項19記載の組成物。NO:12からなる群より選択される、請求項20記載の組成物。【請求項22】ワクチン接種するため、免疫するため、免疫応答を刺激するため、特異的抗体の産生を刺激するため、または細胞性免疫応答を刺激するために十分な量の請求項18記載の組成物の用量を、動物またはヒトに投与する段階を含む、動物をワクチン接種または免疫する方法。組成物が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)の赤血球凝集素/ノイラミニダーゼタンパク質、トリインフルエンザウイルス(AIV)の赤血球凝集素タンパク質、および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質からなる群より選択される免疫保護抗原を提供する、請求項22記載の方法。皮下投与される、請求項22記載の方法。ekouhou.net。