肝臓の発生:肝内胆管と神経ネットワーク肝臓は小葉構造の集合体といえる。結合組織で束ねた三つ組み構造)を配し、中心に静脈を通す構造である。肝細胞は、胆管とヘリング管細胞を介して連結し、中心静脈まで索状に連なっている。隣り合う肝細胞のアピカル面に毛細胆管が形成され、毛細胆管に排泄された胆汁は中心静脈周囲からヘリング管を介して胆管に運ばれる。このような組織構造は新生仔期にはほぼ完成している。胎生後期においては造血幹細胞も存在し、小葉構造は十分に形成されていない。我々は、胎生後期から新生仔期にかけて、肝組織構築がどのように行われているか、胆管形成と神経の関係を中心に研究を行っている。用いた研究が盛んに行われ、その発生機序の詳細が明らかになりつつある。(FGF)により前腸腹壁内胚葉に肝臓予定領域が誘導され、肝臓原基となる。diverticulum)と呼ばれる。(BMP)を分泌する。肝憩室は頭部・尾部の2部に分かれ、頭部肝憩室を構成する内胚葉細胞が隣接する間充織には臍腸間静脈が通っており、肝芽の上皮直下の間充織には毛細血管が出現し、その内皮細胞が肝芽細胞(Hepatoblasts)を横中隔内部へと誘導し肝組織が形成される(E9.0~9.5)。その後造血幹細胞が移入し、造血器官となるため胎仔肝臓の組織構築は非常に複雑なものとなる。ductおよびGallbladder(胆嚢)]は肝憩室尾部から発生する。中皮細胞の分泌するPleiotrophin/midkineにより増殖し間充織中に浸入する。(OSM)により肝細胞に分化する。この時期、肝臓には肝内胆管は発生していない(図1)。胆管は、肝臓内の肝内胆管と肝臓外の肝外胆管が肝門部で接続する。肝外胆管は、E9.5の時点で既に肝臓本体を形成する部分とは別に発生が進む。肝内胆管を構成する胆管上皮細胞は、E8頃に前腸腹側内胚葉に認められるHex(+)Sox17(-)Pdx1(-)細胞由来の肝芽細胞から胎生中期に分化する。肝外胆管は、腹側膵臓と共にHex(-)Sox17(+)Pdx1(+)細胞から発生する(図2)。endoderm)からの肝内及び肝外胆管の発生マウスでは、E13.5に門脈周囲の肝芽細胞が胆管上皮細胞へと運命決定されることによって肝内胆管の発生が始まる。門脈近傍の肝芽細胞では、Jagged-1陽性の線維芽細胞との接触により肝芽細胞のNotchシグナルが活性化される。血管内皮細胞及び線維芽細胞が分泌するTGFβの刺激を受けて胆管上皮細胞へと分化する。その後、胆管上皮細胞がJagged-1を発現して隣接する肝芽細胞のNotchシグナルを活性化する、というように段階的にシグナル活性化が起こり、胆管上皮細胞の分化が進む(図3)。ducts)を持つ胆管が認められる。管腔構造の門脈側にはCytokeratin(+)Sox9(+)HNF4α(-)でラミニンを含む基底膜に支持された胆管上皮細胞が存在し、その対面にはCytokeratin(-)Sox9(-)HNF4α(+)の肝芽細胞が存在している。胎仔期の未熟な胆管構造をラベルし、その後の運命をたどると、1胆管、2ヘリング管、3門脈周囲の肝細胞、の3種類の細胞へと分化することがわかっている。(基底膜の構成タンパク質)とHNF1β(胆管上皮細胞のマーカー)に対する抗体による染色像。ノックアウトの肝臓では、lumenの一部が胆管上皮細胞に囲まれた“非対称な構造(asymmetric)”の割合が多くなっていることから、胆管の形成が遅延していると考えられる。vitroの3次元培養を用いた解析をおこなうことができる(1)。111を含むゲル中で3次元的に培養すると、胆管上皮細胞と同様の細胞極性を獲得し、中央に管腔構造を伴ったCystを形成する(3)。HPPLはLaminin521を発現しており、管腔を形成したCystはLaminin521を含む細胞外マトリックスの層に囲まれている。miceの肝臓では、残存するα1鎖を含むLaminin111の存在によって胆管上皮細胞の分化などに異常はないが、胆管構造形成の遅延が見られる(図4)(4)。HPPLが形成するCyst構造は成体由来の胆管上皮細胞が形成するものと比較すると管腔が小さく未熟である。遺伝子を同定することができる。(Grhl2)が管腔を大きく発達させ、細胞間バリア機能を亢進させることが分かった(図5)(5)。Rab25がClaudin4のタイト結合への局在を促進し、バリア機能を亢進させていると考えられる。転写因子Grhl2の導入による管腔構造の発達Grhl2は、管状構造を形成する胆管上皮細胞に特異的に発現している。HPPLにGrhl2を導入すると、管腔が大きく発達する。成体肝臓からEpCAM陽性細胞として分離した胆管上皮細胞も、3次元培養において管腔構造が発達したCystを形成する。μm胆管は、樹枝状の構造を肝組織内に張り巡らせている。これまでは切片を用いた解析であったので、3次元的な構造を詳細に解析することが難しかった。肝門部から抹消に向かって樹枝状に発達する。我々は、透明化した肝臓に肝外胆管からインクを注入し、肝内胆管の形成過程を可視化することにより詳細に検討した(図6)(6)。network)を呈する。太い細胆管は門脈に沿って発達し、細い小葉間胆管は門脈を網目状に取り囲むように発達している。networkは完成する。管腔が連続した胆管構造が形成されていた。E17からE18の間に、管腔サイズが小さく均一な管腔ネットワークから、小葉間胆管と細胆管から構成される階層性を持つ管腔ネットワークに変化する。肝細胞の毛細胆管構造は、胎生後期に急速に発達する(図7)。(UDPGT)の発現が増加する。毛細胆管網が形成されるE16からE18にかけて、ビリルビンの毛細胆管への排泄を担うトランスポーター(MRP2)阻害剤であるBenzbromaroneを投与して毛細胆管網の形成を阻害すると、胆管のリモデリングが阻害された(図8)。この結果は、毛細胆管から流れ込む胆汁流量の変化が、胆管のリモデリングを促していることを示唆する。miceを用いた研究から、発生後期の管腔構造形成にもNotchシグナルが重要な働きをしていることが分かっている。我々は、生後2~6日の間にγ-secretase阻害剤であるDAPTを腹腔注射すると、肝内胆管の管腔構造形成が抑制されることを見いだした(6)。胆管上皮細胞の上皮細胞極性に異常はみられないが、末梢部では胆管上皮細胞の数が少なく、断裂した小胆管が繋がらずに残っている。この結果は、Notchシグナルが肝内胆管網形成に必要な胆管上皮細胞の供給に重要な役割を果たしていることを示唆している。肝内胆管形成に関与する遺伝子とシグナル胆管発生に関与する遺伝子及びシグナルについて図10に示した。おいて、自律神経が重要な働きをしていることはよく知られている。再生への関与が知られている。ヒトやモルモットでは実質領域にも神経線維が分布しているが、ラットではグリソン鞘内に限局して分布している。齧歯動物の実質領域では、肝細胞間にギャップ結合がよく発達しており、神経に代わって迅速な情報伝達を担っていると考えられている。肝臓の発生過程で、肝内神経網がどのように構築されるのかは分かっていなかった。我々はマウスの発生過程における肝内の神経分布の変化を調べた。(Tubb3)を用いた。(OPN)陽性の胆管上皮細胞と肝動脈(HA)に隣接して発達している(黄矢頭)が、肝実質内には見られない。胎仔期(E17)から新生仔期(P1)までは、肝内に神経線維は見られず、肝外胆管・胆嚢に限局していた。生後1週になると、神経線維が肝門部のグリソン鞘内に認められるが、肝辺縁部では確認できない。マウス肝臓における神経の発達。中心静脈3次元的に神経線維の分布を解析すると図2で示すように、成体では大きな肝内胆管に沿って太い神経線維が走っており、辺縁部においても小葉間胆管に沿って神経線維が発達している。生後1週目までは、成体と同様に大きな胆管や肝動脈に沿って神経は存在しているが細い線維からできている。この時期、まだ辺縁部まで神経線維は発達していない。肝臓発生における神経ネットワークの形成。神経線維が辺縁部まで発達するのは生後3週目以降である(図3)。肝内胆管の発達に沿って神経ネットワークが形成されていることから、胆管上皮細胞が神経誘因因子を発現していることが推測された。(Ngf)の発現が上昇することが分かった(図4)。(Ntrk1)が神経線維に認められた。NGFの発現は、胆管上皮細胞ばかりではなくThy1陽性間葉系細胞にも認められることから、肝内神経ネットワーク形成はグリソン鞘内の胆管上皮細胞と間葉系細胞が分泌するNGFによって誘導されることが予想された。factorとその受容体の発現NGFが肝内の神経伸長を誘導する活性を持つことを検証するために、肝細胞にNGFを発現させてその影響を調べた。HTVi法によりNgf遺伝子を肝細胞に強制的に発現させると、小葉内に神経線維が伸長したことから、Ngfは肝内神経線維の伸長を誘導する因子であることが示された(図5)。以上の事から、マウスにおいては、出生後に胆管でのNGF発現が上昇し、それに伴ってグリソン鞘に沿って神経線維が肝内組織に侵入することが明らかになった。(DAPM)をマウスに投与して肝内胆管障害を誘導した。総胆管から逆行性に黒インクを注入した後、肝臓を透明化すると、肝内胆管の全体像を観察することができる。この手法を用いて胆管を可視化したところ、図6Aで示すように、DAPM投与後2日目ではインクが胆管から滲み出ており、小葉間胆管が障害されていることが分かる。組織学的には、小葉間胆管の消失と大きな肝内胆管の拡張が起こっていたが、小葉間胆管はDAPM投与後12日までには再生された。DAPM投与による肝内胆管障害における神経再生。(A)胆管から逆行性に黒インクを注入した後、肝臓の透明化を行い肝内胆管を可視化した。肝辺縁の小葉間胆管近傍の神経線維は、DAPM投与後2,4日目ではほぼ消失していた。肝門部に近い太い門脈があるところでは胆管構造が残存しており、神経線維の消失率も軽度であった。μm)があるところでは胆管および神経線維が消失していた。胆管障害と神経線維の消失は、ともに肝門部より辺縁部で強く起こっていることが分かる。受傷後2日目に胆管上皮細胞は活発に増殖し、胆管上皮細胞と間葉系細胞、加えて血管内皮細胞にNgf遺伝子の発現上昇が見られた。GNF5837)を投与し、DAPM投与による胆管障害後の神経再生を調べると、胆管障害および神経消失が著しい辺縁部での再生が強く阻害されることが分かった。DAPM投与による胆管障害後の神経再生この結果をまとめると、図8で示すように、胆管障害起こるとNGFの分泌が減り、神経の退縮が起こる。その後、胆管再生に伴って分泌されるNGFにより神経再生が起こると考えられる。自律神経の活性が、部分肝切除後の肝再生に関与していることが知られており、Acetylcholineがマクロファージに作用してIL6発現を活性化することが報告されている。慢性的な肝疾患やその後の組織再生過程における自律神経の役割については不明であり、さらなる解析が必要である。