実験的な試作品の調製の段階で、無修正のHBsとHBc抗原の物理的な組込み及び結合はそれぞれ大きな技術的障壁となっており、産業的なcGMP規模では更に難しかった。前記の障壁は本発明によって克服されている。大腸菌)で別々に産生され精製され、これらの精製された抗原はそれら自身で特徴的な粒子を形成する。ウイロソームが産生されるように界面活性剤又はレシチンを除去する;という工程を含むウイロソームの産生方法を提供する。本発明の文脈中において「濃度を低下させ」という言葉は、前記の界面活性剤が入っていない溶液を加えること、又は前記の界面活性剤の濃度が工程(a)において取得した溶液に比べて低い溶液を加えることを含むと理解される。本発明の文脈中において、「界面活性剤を除去する」という言葉は透析、膜分離、又はクロマトグラフィー等の過程を含むと理解される。界面活性剤が基質(例えばビーズ、レシン等)への吸着によって除去される、後者のクロマトグラフィーが好適である。本発明のウイロソームの調整工程は、苦も無くGMP産生の方法に適合させることが出来る。HBウイロソームの例で説明しているように、HBc蛋白質(図2)を含む新しい多成分の粒子構造の均一で効率的な調製を得るためには、生化学及び量的関係の条件に関する調整が必要であり、本明細書の教唆に基づいて過度の負担なしに行うことが出来る。本発明の方法の根底にある概念は、ウイルスの複製過程の間の細胞内のウイルス組立で起こるような、ウイルス包膜蛋白質と対応するヌクレオカプシド又はヌクレオカプシド様粒子の間の特異的な相互作用を利用した、ウイロソームの完全に人工的な組立である。例においてはHBsとHBcはそれぞれ典型的で好適な包膜蛋白質とヌクレオカプシド複合体であるが、本発明はそれらに限定したものではなく任意の包膜ウイルスに適用出来ることを理解するべきである。一般的な原則として、人工的な調製において選択する生化学的な条件は、包膜蛋白質(env)とヌクレオカプシド(nc)成分の相互作用を可能にするものでなければならない。pH値、浸透圧、及びキレート剤、特定の塩、緩衝分子の存在を含む。最初の材料(ビリオン又はVLPの包膜)及び脂質成分を溶解するために、界面活性剤の存在が必要である。界面活性剤の種類及び濃度の範囲は本明細書において下記で説明している。mEq)に近づけるのが好適である。mEqであることが好適である。調合の効率に同様に影響する。添付した実施例で説明しているプロトコルでは、生理的な塩組成を模倣し、NaCl及びリン酸塩という生理的な緩衝システムを備えるリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用している。他の包膜ウイルスの調合には修正した緩衝システム(例えばTrisに基づいた緩衝液又は炭酸塩に基づいた緩衝液)をNaCl、MgCl、KCl、及びCaCl塩と組み合わせて使用することが必要になる可能性がある。本発明の好適な実施例においては、望ましくない酵素活性を不活化するために、キレート剤(例えばEDTA、EGTA)を含むことを想定してもよい。成功した調合物とは、個々の最初の材料(精製されたウイルス又はVLP)のそれぞれと粒度、内容、又は生化学的性質において全く異なるウイルス様粒子の単一かつ均一な集団として最もよく説明される。spectroscopy、PCS)によって簡単に検出することが出来る。解析方法は実施例4(p33)で説明している。【0079】ヌクレオカプシドが(HBcでそうであるように)単一の組換え蛋白質のサブユニットで構成されているのか、又は核酸に結合している複数の異なるウイルス蛋白質を含むのかは、方法の原理に関しては重要でない。HBs等のウイルス包膜蛋白質成分は、それ自身では膜構造と効率的な相互作用又は結合をしないヌクレオカプシド粒子(例えばHBc)と、再構成されたウイロソーム膜との間の架橋として働く。効率的なHBsとHBcの相互作用を可能にするために、根本的には異なるものの、人工的な調整工程はある程度HBV感染細胞の内部の条件を模倣しなければならない。今回の人工的な方法では、巨大分子的な細胞構造のない条件で、組立が界面活性剤の除去の間に起こる。対照的に、HBVの複製の間は、HBVヌクレオカプシドと相互作用しながら、HBs分子は細胞膜に固定されている。驚くべきことに、根本的に異なる条件にも関わらず、ウイルス組立、つまりウイルス包膜中へのヌクレオカプシド粒子の被包は我々の調整工程において高い効率で起こった。HBc粒子が膜に固定されたHBsと効率的に結合しなければならない。従って、効率的なHBウイロソーム組立は、最適化された生化学的条件と個々の成分の正しい量的関係の下でのみ起こり得る。同じことがインフルエンザウイルスとHBV以外のウイルスからの蛋白質を備えるウイロソームの組立に関しても言える。複雑なヌクレオカプシド構造の完全性が、膜に固定された包膜蛋白質との相互作用にとっての必須条件である。本実施例においては、異なる供給源からの3つの異なる生物学的粒子構造が、最初の構造いずれとも明らかに異なり自然には存在しない、1つの新しい種類の合成ウイルス様粒子に人工的に変形される。本発明の方法の上記の実施例において述べた脂質が、少なくとも1つのリン脂質を備えることが好適である。前記のリン脂質がフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリンを備えると更に好適である。本発明の方法において、前記の包膜蛋白質が第1と第2の包膜ウイルスの包膜蛋白質でありヌクレオカプシド粒子が前記の第2の包膜ウイルスのヌクレオカプシド粒子であると好適である。本発明の更に好適な実施例では、前記の第1の包膜ウイルスはインフルエンザウイルスである。前記の包膜蛋白質がヘマグルチニン(HA)及び/又はノイラミニダーゼ(NA)であると更に好適である。本発明の方法において、前記の第2の包膜ウイルスがB型肝炎ウイルス(HBV)であると更に好適である。ヌクレオカプシド粒子がHBc蛋白質を備えると更に好適である。包膜蛋白質がHBs蛋白質であると同様に好適である。本発明の方法に従って、工程(a)における可溶化の段階の前に、包膜蛋白質の溶液を遠心し、取得した沈殿を脂質の存在下で界面活性剤又はレシチン溶液に可溶化することが好適である。本発明の方法において使用する可能性のある脂質は本明細書において上記で更に詳細に定義してある。工程(a)が遠心の前に溶液の超音波処理を含むと更に好適である。遠心を100000g、4°Cで少なくとも2時間行い、及び/又は超音波処理を37°Cのウォーターバス中で少なくとも2分間行うと更に好適である。本発明の方法の1つの変法において、前記の方法は更に工程(b)に続いて段階工程(b’)を行うことを含むことが出来る:(b’)工程(b)で得られた希釈液の無菌濾過。溶液の無菌濾過の手段と方法は当技術分野において公知である。無菌濾過は添付した実施例で説明するように例えば0.22μmのフィルターを通して段階工程(b)で取得した溶液を濾過することを含むことが出来る。SM-2を溶液から除去することによって達成することが出来る。SM-2を使用して少なくとも1回、好ましくは少なくとも2回は繰り返すことが好適である。工程(i)と工程(ii)を室温で行うことが同様に好適である。工程(i)でのインキュベーションが少なくとも30分間であると同様に好適である。工程(d)で得られた希釈液の無菌濾過。本明細書において上記で述べた界面活性剤が非イオン性界面活性剤であることが好適である。20/80、及びレシチン等の界面活性剤を含む。(v/v)の濃度の範囲で使用することが出来る。界面活性剤の性質により、好適な濃度は一般的に(v/v)で与えられる。OEGは粉末の形状で取得し、それ故その濃度はmM単位で与えられることが好ましい。(v/v)のOEGの濃度に相当する。非イオン性界面活性剤がオクタエチレングリコールモノ(N-ドデシル)エーテル(OEG)であると特に好適である。本発明の方法においてOEGが20mMから100mMまでの濃度の範囲で工程(b)に適用されることが同様に好適である。OEG(v/v))であると最も好適である。本発明の方法の好適な実施例においては、適用される脂質:蛋白質比が1:10から20:1の間の範囲である。前記の脂質:蛋白質比が約5:1であると更に好適である。本発明の方法においてフォスファチジルコリンのウイロソームにおける割合が22%であると好適である。本発明の方法においてHA:ウイルス包膜蛋白質:ウイルスカプシド蛋白質の比が1:1:1であると同様に好適である。本発明の方法が工程(d)においてウイロソームを産生する前にアジュバントを加えることを含むと好適である。代替的な本発明の実施例は、本発明のウイロソーム又は本発明の方法によって産生されたウイロソームの、ワクチン産生のための使用に関係している。代替的な本発明の態様は、本発明のウイロソーム又は本発明の方法によって産生されたウイロソームの、HBV感染の予防、緩和、又は治療のためのワクチン産生のための使用に関係している。本発明は同様に、本発明のウイロソーム又は本発明の方法によって産生されたウイロソームの、それを必要としている対象者への投与を含む、対象者への接種の方法に関係している。本明細書において上記で薬学的組成物について一般的に説明したように、ウイロソームを投与することが出来る。本発明の更なる態様は本発明のウイロソーム又は本発明の方法によって産生されたウイロソームの、それを必要としている対象者への投与を含む、HBV感染の予防、緩和、又は治療のための対象者への接種の方法に関係している。随意に、ウイロソームは薬学的に適切な担体又は希釈剤及び/又はアジュバントと組み合わせて投与することが出来る。上記の対象者が人間であると特に好適である。図1:個々の成分と結果として生じるHBウイロソームの構造を描いた概略図が図1に示してある。分析的データは提案された構造と一致している。図2:調製過程のフローチャートが図2に示してある。HBウイロソームの詳細な調合プロトコルは添付した実施例に記述してある。図3:図3はHBウイロソームのSDS-PAGE分析の結果を示している。SDS-PAGE分析に基づくHBウイロソーム及び最初の材料(インフルエンザ、HBs、及びHBc)の蛋白質組成が図3に示してある。HBウイロソームの予測される物理的構造は以下の分析データによって確認されている(図4−7)。図4:図4は個々の成分の粒度と比較したHBウイロソームの粒度の分析の結果を示している。HBウイロソームは個々の成分とは全く異なる単一種類の粒子から構成され、光子相関分析の粒子の粒度の分布において1つの狭いピークを形成している。図5:図5はHBウイロソームの勾配分画分析の結果を示している。ショ糖勾配中でHBウイロソームを超遠心した後、全ての抗原が同一の勾配分画で見え、それらの物理的な結合を示唆している。図6:図6はHBウイロソームのSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析の結果を示している。抗HA又は抗HBs抗体のいずれかを使用したHBウイロソームの免疫沈降では、両方の場合で全ての抗原(HBs、HBc、及びHA)の共沈降が起こった。界面活性剤の添加によってHBウイロソーム構造が破壊されると、抗体によって直接認識される抗原しか沈降されない(それぞれHA又はHBs)。この所見は全ての抗原が1粒子中で結合していることを確かめている。図7:図7はHBウイロソームのSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析の結果を示している。HBウイロソームがトリプシン処理に晒された場合、両方のHBV抗原が部分的に保護された(ウェスタンブロットによれば50%)。トリプシン中でインキュベーションする前に界面活性剤の添加によってウイロソーム構造が破壊されると、HBV抗原は短時間のうちに完全に分解された。図8:図8はマウス免疫化の後のHBウイロソームに対する抗体免疫反応の試験の結果を示している。この時点ではHBウイロソームの免疫原性に関して予備的なデータのみ利用可能である。付加的なアジュバント無しのHBウイロソームを用いてマウスで実験を行った。マウスは異なる量のHBウイロソームの筋内注射によって免疫化され、高い抗体力価が異なる3つの抗原に対して検出された。図9:図9はマウス免疫化の後のHBウイロソームに対する細胞免疫反応の試験の結果を示している。3回目の増強の後、免疫化された動物より胸腺細胞が精製され、それぞれの抗原を用いた試験管内での再刺激の後、インターフェロンγに対するELISPOTによって細胞反応を決定した。注目すべきはこの方法はCD4型とCD8型反応を区別しないことである。図10:要約表はHBウイロソームによる免疫化の後これまでに取得した免疫学的データを示している。免疫化した動物においてHBs及びHBcの両方に対する体液性と細胞性の応答が検出可能であった。【0116】これより本発明は以下の例を参照することによって説明され、この例は単に例証であり本発明の範囲の制限と解釈されるべきではない。ゲル濾過クロマトグラフィー、及び最終産物の液体の濾過滅菌という段階を含む。最終産物の品質は、Lowry法、SDS/PAGE法、ウェスタンブロット分析、又はAUSZYME等の種々の生化学的分析により確認している。クロマトグラフィー、ゲル濾過、及び最終産物の液体の濾過滅菌という段階を含む。最終産物の品質は、Lowry法、SDS/PAGE法、又はウェスタンブロット分析等の種々の生化学的分析により確認している。vaccines【0124】インフルエンザウイロソームは、リン脂質と、孵化鶏卵と細胞培地のいずれかで培養されたインフルエンザウイルスから産生される。ウイルスを回収し、精製し、一回又はそれ以上の遠心段階で濃縮し、次にベータプロピオラクトン(BPL)で処理することにより不活化した。不活化されたウイルスを超遠心により沈殿にし、界面活性剤(100mMのOEGを含むPBS)に再懸濁し、それによってウイルスの外殻、つまりウイルス包膜を溶解するが、ウイルスの内部、つまりヌクレオカプシドは蛋白質と残存核酸の複合体として残る。同時に、脂質(レシチン他)を同じ界面活性剤(100mMのOEGを含むPBS)に溶解する。その後脂質と溶解したインフルエンザウイルスを混合し、随意に完全に分離するために超音波パルスで処理する。次に、混合物中の全ての不溶性物質を沈殿させ除去するために、超遠心を行う。この不溶性物質の大部分はウイルスヌクレオカプシド複合体を含む。超遠心の後の上清は、別々に加えたウイルス包膜蛋白質及び脂質とリン脂質といった、将来のウイロソームの全ての成分を含む。Bio-Beadsを用いたバッチクロマトグラフィーによって上清から界面活性剤を取り除く。この連続的な界面活性剤の除去が、厳密な組成と脂質:蛋白質比に依存して平均直径が100から200nmとなる、ウイロソームベシクルの均一な集団の自発的な形成をもたらす。実施例4:HBウイロソームの調製及び分析論HBウイロソームへのHBs及びHBc成分の定量的な組込みを達成するために、インフルエンザウイロソームに関して確立された調製過程は大幅に修正され、多数の変数に関して最適化された。標準的なインフルエンザウイロソームのプロトコルを用いると、HBV抗原の組込み率及び過程の再現性が不満足なものとなるとことが分かった。図3-11に示しているようなHBウイロソームの詳細かつ基本的な調合プロトコル共にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入った、2mgのHAを含む不活化されたインフルエンザウイルス(シンガポールA型)及び2mgの精製された組換えHBs抗原を混合し、100000g、4°Cで2時間遠心した。PBS-OEGを含むPBS中に可溶化した。PBS-OEG中に溶解した。【0129】その後リン脂質とHA-HBs抗原溶液を混合し、完全に溶解するために37°Cのウォーターバス中で2分間超音波処理した。不溶性の残存物質は100000g、4°Cで2時間遠心することにより除去した。結果として生じる上清(2ml)を回収し、PBSで最終容量が3.5mlとなるように希釈した。【0130】HBc抗原を4mg/mlとなるようにPBSで希釈し、希釈液の0.5mlをPBS-OEG中にHA、HBs抗原、及びリン脂質を含む溶液に加え、結果的に最終OEG濃度が50mMとなった。SM-2(BioRad)に加え、回転させながら室温で30分インキュベーションした。次に、懸濁液を0.8gの新しいBio-Beadsに移し同じ条件下で30分インキュベーションし、その後0.8gの新しいBio-Beadsと同じ条件下で3回目のインキュベーションを行った。結果として生じるHBウイロソームをその後濾過滅菌(0.22マイクロメートル)し、使用までガラスアンプル中に4°Cで保存した。HBV核粒子)、又は変異体(HBV核の全長又は短縮型)からのHBV抗原を含むHBウイロソームを同様の方法で調製した。上記で説明した再構成HBVウイロソームの製剤は、粒度と抗原組込み率に関しての重要な変数を同定するために行った一連の調製の結果であり、最終濾過滅菌に適した均一な粒度の粒子への抗原の良好な組込みを可能にした。異なるリン脂質組成(異なる比率のフォスファチジルエタノールアミンとフォスファチジルコリン)による調合は、粒度とフォスファチジルエタノールアミン量の間の逆相関の関係を示した。蛋白質に対する脂質の比(2.5、5、6、7.5)の粒度と抗原組込みに対する影響は一連の調製の中で調べている。異なる抗原の相対量が組込みに影響することが示されており、調合において(HBc抗原無しで)HAの濃度を増やすことがHBs抗原の組込みの増加につながり、1対1の比率の80%まで届いた。我々の手では最適な脂質:蛋白質比は5:1であったが、リン脂質を使用するなら抗原組込みが最大となるのは20:1から1:10の範囲であることは考えられる。他の脂質(合成脂質、ステロイド型脂質)又は異なる脂質の組み合わせを使用するなら、脂質:蛋白質比は更に異なる可能性がある。【0134】リン脂質組成(PC、PE、他の脂質)PCのみのHBウイロソームを産生することはでき、我々の手では粒度と均一性に関してPEが22%であることが最適であった。一度言うが、他の脂質を使用するならば、これらの比は大幅に異なる可能性がある。抗原間の比率(HA:HBs:HBc)我々の手では1:1:1という比が最適であると分かった。修正した脂質組成と脂質:蛋白質比では、抗原組込みが最大となる最適量は変わる可能性が高い。それに加え、HAの一切無い調製物も同様に所望の粒子構造を作り出した。した界面活性剤は50mMの濃度のOEGである。組成や比率を修正する時には20から100mMの範囲が適切である可能性がある。他の非イオン性、イオン性、又は双極性の性質の界面活性剤をOEGの代わりに調製過程で使用してもよい。ウイロソーム調製物の分析論HBウイロソームの徹底した物理化学的な分析は、調製過程の最適化と将来の製品の品質管理に必須の要素である。それ故、HBウイロソームの内容と構造を調べる測定法の開発に莫大な努力が費やされた。アジュバント効果(MHC-1提示)がHBウイロソームの物理的構造に直接依存するため、ワクチンのHBV成分をウイロソーム担体に物理的に結合させる単一の粒子型の証明に特に重点を置いた。