生化学的な修飾には、非共有結合的に連結した多量体構造(例えばウイルスのヌクレオカプシド)が解離するような条件(例えば、反応性の側鎖の基を活性化するための酸化的条件)が必要である。加えてそのような条件は問題となっている蛋白質分子の立体構造も変化させる可能性があり、その結果としてその免疫原性に、そして最終的にはワクチンの効力に影響を与える。架橋の手段は調製に必要とされる工程の数と、抗原の損失の両者を増加させる。このワクチンにおいて、ウイロソーム膜とウイルス粒子の間の静電相互作用に起因し、インフルエンザのウイロソームを調製した後にのみ、抗原は外部表層と連結している。感染疾患の予防と治療のためのアプローチの可能性と限界について、HBVを例として本願明細書において下記で議論する。生命を脅かす後期合併症のために、HBV感染は地球規模の大きな健康問題となっている。世界保健機関(WHO)は、現在約4億人が慢性的なHBVキャリアであると推定している。慢性的なHBV感染に罹患している患者は広範囲の症状を示し、臨床的に現れないものから重篤な肝疾患まであるが、それでも長期的な肝疾患の危険性は全ての慢性的なHBVキャリアにおいて劇的に増加する(感染後20から30年以内に25%の発生率)。全ての慢性的な患者に共通することとして、多量の抗原が慢性の感染の間に循環しているという事実に関わらず、原因物質であるHBV、特にHBVコア蛋白質に対する免疫応答が貧しい。対照的に、自然発症的な又は治療による慢性B型肝炎の治癒のみならず、急性B型肝炎の治癒は、HBV抗原に対する広範かつ活発な免疫応答と密接に連関している。インターフェロン又は抗ウイルス薬による治療により慢性肝炎をコントロ−ルするなど、従来の治療のアプローチは部分的にしか成功していないが、それでも費用がかかり、顕著な副作用を伴う。そこでHBV関連の慢性肝炎を有する患者は、この持続的なウイルス感染を制御できる治療ワクチンから大きな利益を受けるであろう。現在におけるHBV発病機序と免疫学の理解によると、ワクチン接種治療の成功の鍵は、慢性のキャリアにはHBV特異的な免疫学的な応答性がないことを克服することである。この目的を達成するために、存在している無効なTh2型(体液性)免疫が、強力かつ持続的なTh1型(細胞性)の反応に変わり、同時に、Th2型反応を高める(ブースト)するような方法で、関連抗原(HBcとHBs)が患者の免疫機構に提示されなければならない。免疫回避変異体のウイルスを防ぐために、関連抗原に対する免疫反応は広範であり、かつ、同時に多くの異なったエピトープに対して向けられていなければならない。そのような変異体は単一エピトープに対して向けられた選択的な圧力の下で発達することが示されている。ワクチンの抗原として全長の蛋白質を使用することは、抗原のプロセシングとMHC遺伝子型依存的なエピトープ選択に関する患者の多様性を考慮に入れる。4626-4649)にあるように、過去においてHBVの治療用ワクチンの開発に多くの努力がなされてきた。多くの臨床試験において、従来のHBsに基づいた予防用ワクチンが慢性のHBV患者に使用されてきたが、持続的であって前向きである効果はこれまで観察されていない。このアプローチは前臨床研究において期待をもてる結果を収めたが、ヒトにおけるものではなかった。【0020】これらのアプローチは主として、免疫システムの体液性応答を目的としている。進んだアプローチでは、HBVに対する細胞性応答(Th1型)は治療上の免疫付与の成功における鍵となる要素である、という概念に従っている。【0021】HBV抗原、特にHBcに対するTh-1型の免疫応答を誘導することは、治療用のHBVワクチンの最終的なゴールである。HBsは単独でTh1応答をある程度引き起こすことができるが、HBc単独ではできない。そこでこれらの抗原は単独では、治療効果に必用とされる適切な免疫応答を誘導することができない。これは、HBV抗原をTh-1支持アジュバント又はキャリアシステムと組み合わせることのみにより達成することができる。対照的に、現在ヒトのワクチンにおけるアジュバントとして最も広く使用されているアルミニウム塩は、Th1応答を止めてTh2応答を支持することがよく知られている。アルミニウム塩のこのような性質により、それは高いタイターの保護抗体の誘導を第一の目的とする予防用ワクチンのための非常に魅力的なアジュバントとなる。治療の場面において持続的なTh1応答は決定的な役割を果すが、Th1エフェクター細胞はウイルス複製の制御とウイルスに感染した細胞の除去を仲介するからである。細胞応答を主として促進することが知られているDNAワクチン(HBVコア又はS遺伝子をコードするプラスミドDNA)を作る試みがなされている。DNAワクチンがマウスのモデルにおいて非常によく働くという事実に関わらず、HBVの分野のみならず、多くの臨床上の試みはヒトにおける原理の証拠を提供することができない。同様に、細胞性応答の促進を目的としたHBV抗原を発現しているウイルスベクター(例えばワクチニア)を使用しても、ヒトにおいて顕著で持続的な応答を誘導することはできなかった。治療用のHBVワクチンについて種々のアプローチが試みられたが、これらのいずれも有意義な治療用のワクチンへ至ることはなかった。【0024】2つの主要な構造的なHBV蛋白質であるHBsとHBcは、いくつかの異種のシステム:大腸菌、酵母、及び哺乳動物細胞株の中で、個々に発現させることができる。両者の抗原は典型的なウイルス様粒子構造(それぞれ、HBs粒子とHBc粒子)を形成するが、それらは感染性であって、包膜を有し、ヌクレオカプシドを含有しているHBVビリオンとは明らかに異なっている。組み換えB型肝炎コア抗原(HBc)は、この蛋白質は糖化されていないために、細菌又は酵母に基づいた発現システムの中で生成することができる。HBVコアモノマーは約30nmの直径を有するウイルス様の粒子へと自己会合し、プロデューサー細胞からこの型で精製できる。真性のHBVヌクレオカプシドと非常に類似して、HBc粒子は180または240モノマーコア分子のいずれかより構成され、粒子構造へ自己会合する。HBc粒子は脂質を含まない。HBVコアモノマーは183から185アミノ酸残基から構成される(長さは単離物に依存している)。C末端30アミノ酸は核酸結合領域であることを特徴とし、精製されたHBc粒子の調製物中には、好ましくない混入である、かなりの量の核酸が存在する(主としてHBVゲノムの非存在下で発現している細胞からもたらされたRNA)という結果となる。HBcはC末端において切断されて144アミノ酸でとなることができ、それは粒子構造を保ちながら核酸の含量を99%減少させる。組み換えHBc粒子の生成は多くの変異体において述べられている。このアプローチにおいて、外来性のアミノ酸配列が蛋白鎖のその領域(アミノ酸70−90)の中に挿入され、それは多量体粒子からみて外部表層へ露出している。遺伝子工学的に挿入される外来性抗原の配列の大きさは非常に限定されており、それは、モノマーが粒子へと自己会合する能力を保持する必要性からである。動物モデルにおけるワクチンとして使用されたとき、HBc粒子は単独で明らかなホルモン性応答を誘導するが、治療効果に必須であると考えられているHBc特異的なCD8型の細胞性応答を産生する能力を欠いている。00/32635(ビオゲン)には、免疫原、エピトープを備え、多価のB型肝炎コア粒子を生じる可能性を有しているB型肝炎コア粒子が述べられている。p686-6870)。真性のHBV包膜蛋白質(HBs)は、ずれた3つの翻訳開始部位から発現している、L(大)、M(中)、S(小)の3つの型で存在している。多量体の型の3つの型は全てHBVビリオンの包膜中に存在している。C末端のプレS1(大)およびS2(中)領域は、感染の間にHBVが細胞へ結合することに関連し、プレS1領域に対する抗体はHBVを中和できる。発現コンストラクトに依存し、組み換え粒子はS単独を含むか、またはC末端のプレS1および/またはプレS2領域を含むかのいずれかである。現在のHBVに対する予防的なワクチンは全て、アルミニウム塩と共に調製された組み換えHBV包膜(HBs)蛋白質に基づいている。多くの産物は酵母の発現に基づいている。最近の産物である所謂第三世代のHBVワクチンは、哺乳細胞からもたらされる。これらのワクチンはプレS領域を含み、それに加えて、真性の哺乳類の糖化パターンと哺乳類の脂質組成の両者は、免疫反応のために有用であると考えられている。99/39736(Yissum)中にクレームされているが、そのシステムは単量体抗原に限定されており、それによってHBc粒子又は他のヌクレオカプシド型の構造と共に調製することが除外される。加えて前記システムは、キャリア粒子のインビトロでの破壊と再会合の進行を予測するものではない。416-422)には、HBsとHBc両者の抗原のための発現プラスミドで同時トランスフェクションを行った哺乳細胞から、HBsとHBcの両者を含んでいるHBV粒子を生成し、分泌することが記載されている。HBsとHBc両者の抗原を含んでいる包膜粒子をインビトロで再構成することに関する報告はない。米国特許6,020,167(Medeva)は、プレS1又はHBVコア由来の一つまたはそれ以上のT細胞活性化エピトープ、及びそのポリペプチドを提示することが可能なキャリアを備える組成物を投与することによるB型肝炎の治療方法をクレームする。その発明におけるキャリアはHBs抗原粒子でもよい。【0034】ウイルス様粒子の特定の型として、ウイロソームは臨床的な実績があるワクチンの担体/アジュバントのシステムであり、ヒトにおいて優れた安全性と許容性のプロファイルを有する。ウイロソームの担体が、外在性および内在性の経路の両者を介して抗原のプロセシングを仲介する能力により、このシステムは治療用ワクチンの良い候補となる。【0035】ウイロソームの基本的な概念はインビトロでの空のウイルス包膜の、あるいはより一般的には、球状の脂質二重層中へ組み込まれたウイルスの、包膜蛋白質の再構成を備える。