【0141】HBs及びHBc抗原の定量HBウイロソームに組込まれたHBs及びHBc抗原の量は定量的Elisa測定法により決定した。抗原に対する最大限の接触をもたらすために、基準抗原とHBウイロソーム試料を最初の希釈時にPBS-OEGに溶解し、次に連続する希釈はPBSにて行った。Behring)を使用して行い、同じ測定法にて測定する精製したHBs抗原の希釈系列が、HBsウイロソーム試料中の抗原の量の決定を可能にした。入ったHBcに対するモノクローナル抗体(mAb)(クローン7E6、Biogenesis、希釈率1:1000)によってコートした。(v/v)入りのPBS(洗浄バッファー)で洗浄した。試料(0.1ml)を載せ、室温で1時間インキュベートした。BSA入りのPBS(希釈バッファー)中で1:1000に希釈し、プレートに加え(1ウェルあたり0.1ml)、室温で1時間インキュベートした。4回の洗浄の後、プレートをストレプトアビジン(希釈バッファー中で1:5000)の存在下で室温で1時間インキュベートした。H2SO4(1ウェルあたり75μl)で停止し、450nmにおける光学密度を測定した。【0142】HAの定量HBウイロソームのHAの量は標準的な一元免疫拡散(SRD)法を使用して決定した。departmentによって行われた。gel(Invitrogen)上で分離し、製造者の使用説明書に従いニトロセルロースメンブレンに転写した。20入りのPBS)でブロックし、抗原特異的な抗体の1:1000の希釈液中で室温で1時間インキュベートした。メンブレンを洗浄し、その後ペルオキシダーゼ標識の抗ウサギ又は抗ヒツジ免疫グロブリンの1:10000の希釈液中で1時間インキュベートした。N.J.)を用いて可視化した。ゲルの銀染色は製造者の使用説明書(Invitrogen)に従って行った。統計的粒度分布を光子相関法又は動的光散乱によって決定した。この方法は、光散乱の時間変動として測定される、ブラウン運動の粒度依存的な速度に基づいている。UK)をこの目的に使用した。試料を測定のためにPBS中に十分に希釈し、1mlの希釈液を25°Cの標準条件下で分析した。個々の成分の異なる密度に基づいて、HBウイロソーム構造への抗原の組込みを推定するための分析的方法として、不連続ショ糖勾配を通した超遠心を行った。(w/v)不連続ショ糖勾配の上に載せ、4°Cで24時間100000gで遠心した。次に回収した分画を密度と蛋白質量に関して分析し、また異なる抗原の存在に関してウェスタンブロットを用いて分析した。【0146】トリプシン処理HBウイロソーム粒子の抗原の組込み及び最後の皮膜化を部分トリプシン処理によって調査した。断片又は保護された全長蛋白質に関して、ウェスタンブロットによって分析した。X-100入りのPBS(ウイロソーム構造の破壊=変性条件)のいずれかで希釈した。蛋白質)を用いて、室温で0、2、5、及び10時間行った。トリプシン処理に対する個々の成分の効率的な接触可能性のコントロールとして、同濃度の異なる抗原の混合物を同じ条件下で処理した。反応は4×SDS-PAGEサンプルバッファーを加えることにより停止した。95°Cでの10分間の変性の後、試料をSDS-PAGE電気泳動、及びHBsとHBcに対する免疫ブロット分析にかけた。免疫共沈降法HBウイロソーム構造中でのHA、HBs、HBc抗原の物理的結合は、(トリプシン処理に関して説明したような)天然及び変性条件下におけるそれぞれの抗原に対する別々の(個別の)免疫共沈降法、及びそれに続くウェスタンブロット分析による免疫共沈降された抗原の同定によって証明した。HBウイロソーム調合の免疫共沈降法は、HA、HBc、HBsに対する特異的抗体の存在下に、同時平行の実験で行われた。次に免疫複合体をプロテインGセファロースビーズ(Promega)と共に4時間インキュベーションし、遠心した。結果として生じる沈殿をPBSで5回洗浄した。免疫沈降された蛋白質をサンプルバッファー中で10分間煮沸することにより再懸濁し、SDS-PAGEとウェスタンブロットによって分析した。それぞれの抗原の存在はそれぞれの特異的抗体と共にインキュベーションすることにより調査した。【0148】ウイロソームの調製物:マウスモデルにおける免疫原性HBウイロソームの免疫原性に関してはこの時点で予備的なデータのみが利用可能である。HBウイロソームに加え、付加的なアジュバントRC529(Corixa)がある条件と無い条件で、マウスにおける実験を行った。マウスは異なる量のHBウイロソームの筋内注射によって免疫化され、全ての3つの抗原に対する高い抗体力価が検出された(図8)。3回目の増強の後、免疫化動物から脾臓細胞を精製し、それぞれの抗体を用いた試験管内での再刺激の後、インターフェロンγに対するELISPOTによって細胞反応を決定した(図9)。注目すべきはこの方法はCD4型とCD8型反応を区別しないことである。それに加え、免疫化動物からの脾細胞をFACSによって分析した(図10)。新しい脾細胞はHBc特異的5量体によって抗CD8抗体と共に直接染色された。別個に、脾細胞はCD8特異的ペプチド又は全蛋白質によって刺激され、次に細胞内インターフェロンγに対して抗CD4と抗CD8抗体のいずれかと共に染色された。異なるウイルス蛋白質間の相互作用はビリオンの組立に重要であり、全てのウイルスに見られる一般原則である。包膜ウイルス粒子は組立に関して細胞膜構造に依存している。核酸と蛋白質の複合体であるヌクレオカプシドは、成熟したウイルス構造を形成するために、膜に結合したウイルス蛋白質と結合する。我々はB型肝炎ウイルスに関して、インビトロで、細胞膜構造のない条件で、異なる組換え供給源からのウイルス蛋白質を利用して、この過程が模倣できることを示した。ウイルス抗原の組換え供給源が量と質に関して好適であるが、インフルエンザHAに関して本明細書で適用したように、ウイルス蛋白質は同様に元のウイルスに由来してもよい。インビトロの調製物の柔軟性は異なる供給源からの多数の抗原の包含を可能にする。ワクチンの防御範囲を改善する可能性がある。条件をそれぞれの病原体に合わせ、必要な成分が十分な量で利用可能ならば、任意の他の包膜ウイルスに対して同じ原理が適用出来ることが想定される。インビトロの調製物の原則が適用でき、また魅力的で切迫したワクチンの標的である、多数の候補を下記に列挙してある。そのような憶測上のウイルス様粒子によって誘導された免疫反応が防御的、又は更に治療的な効果までを持つかどうかは、予測することが出来ない。C型肝炎ウイルスC型肝炎を引き起こす原因としてのHCVは世界的な健康問題となっている。%がこのウイルスに感染していると推定されている。予防的又は治療的用途のための、HCVに対するワクチンは現在存在しない。HBVのように、核蛋白質の1量体が結合して膜に結合した包膜蛋白質(E1、E2)と相互作用する20面体のヌクレオカプシドとなる。他のフラビウイルスHCVとは別に、多数の重要なヒト病原体がフラビウイルス科ファミリーに含まれる(ウェストナイルウイルス、クンジンウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、黄熱ウイルス、及びダニ媒介脳炎ウイルス)。HCV(及びHBV)との構造レベルでの類似性は高く、それ故ウイルス様粒子のインビトロの再組み立ては可能だと思われる。HIVHIVはレトロウイルス科ファミリーの中で最も著名なメンバーである。繰り返すが、切迫した医療需要があるにも関わらず、効果的なワクチンは存在しない。これらのウイルスは更に複雑なヌクレオカプシドを形成するが、同じ原理に基づいた多抗原ワクチンのインビトロの調製は可能だと思われる。【図1】個々の成分と結果として生じるHBウイロソームの構造を描いた概略図が図1に示してある。【図2】調製過程のフローチャートが図2に示してある。【図3】図3はHBウイロソームのSDS-PAGE分析の結果を示している。SDS-PAGE分析に基づくHBウイロソーム及び最初の材料(インフルエンザ、HBs、及びHBc)の蛋白質組成が図3に示してある。【図4】図4は個々の成分の粒度と比較したHBウイロソームの粒度の分析の結果を示している。【図5】図5はHBウイロソームの勾配分画分析の結果を示している。【図6】図6はHBウイロソームのSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析の結果を示している。【図7】図7はHBウイロソームのSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析の結果を示している。【図8】図8はマウス免疫化の後のHBウイロソームに対する抗体免疫反応の試験の結果を示している。【図9】図9はマウス免疫化の後のHBウイロソームに対する細胞免疫反応の試験の結果を示している。【図10】要約表はHBウイロソームによる免疫化の後これまでに取得した免疫学的データを示している。【請求項1】(a)少なくとも一つの脂質、及びインフルエンザウイルスとB型肝炎ウイルス(HBV)の包膜蛋白質を備えるウイロソーム膜;及び(b)ウイロソームの内側及び外側に位置し、前記包膜蛋白質に付着したHBVのHBc蛋白質を備えるヌクレオカプシド粒子、を備えるウイロソーム。前記少なくとも一つの脂質が少なくとも一つのリン脂質を備える請求項1記載のウイロソーム。前記リン脂質がホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンである請求項2記載のウイロソーム。【請求項4】インフルエンザウイルスの前記包膜蛋白質が、ヘマグルチニン(HA)及び/又はニューロミニダーゼ(NA)である請求項1から請求項3のいずれか1項記載のウイロソーム。前記HBVの包膜蛋白質がHBs蛋白質である請求項1から請求項4のいずれか1項記載のウイロソーム。請求項1から請求項5のいずれか1項記載のウイロソーム、及び必要に応じて、薬学的に許容される担体又は希釈剤及び/又はアジュバントを備えるワクチン。前記アジュバントがRC529(Corixa)である請求項6記載のワクチン。前記脂質は少なくとも一つのリン脂質を備える請求項8記載の方法。前記リン脂質がホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンである請求項9記載の方法。【請求項11】インフルエンザウイルスの前記包膜蛋白質が、ヘマグルチニン(HA)及び/又はニューロミニダーゼ(NA)である請求項8から請求項10のいずれか1項記載の方法。前記HBVの包膜蛋白質がHBs蛋白質である請求項8から請求項11のいずれか1項記載の方法。工程(b)に続いて行われる以下の工程(b’):(b’)工程(b)で得られた希釈液の無菌濾過、を更に備える請求項8から請求項12のいずれか1項記載の方法。以下の工程(e):(e)工程(d)で得られた希釈液の無菌濾過、を更に備える請求項8から請求項13のいずれか1項記載の方法。前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項8から請求項14のいずれか1項記載の方法。前記非イオン性界面活性剤がオクタエチレングリコールモノ(N-ドデシル)エーテル(OEG)である請求項15記載の方法。工程(b)において、前記非イオン性界面活性剤を20mMから100mMの範囲内の濃度とする請求項15又は請求項16記載の方法。脂質:蛋白質の比が1:1と10:1の範囲内にある請求項8から請求項17のいずれか1項記載の方法。脂質:蛋白質の比が約5:1である請求項18記載の方法。【請求項20】ウイロソーム中のホスファチジルコリンの割合が22%である請求項10から請求項19のいずれか1項記載の方法。【請求項21】HA:ウイルス包膜蛋白質:ウイルスカプシド蛋白質の比が1:1:1である請求項11から請求項20のいずれか1項記載の方法。工程(d)におけるウイロソームの生成の前にアジュバントを添加することを含む請求項8から請求項21のいずれか1項記載の方法。請求項1から請求項5のいずれか1項記載のウイロソーム、又は請求項8から請求項22のいずれか1項記載の方法により得られたウイロソームを、ワクチンの調製のために使用する方法。請求項1から請求項5のいずれか1項記載のウイロソーム、又は請求項8から請求項22のいずれか1項記載の方法により得られたウイロソームを、HBV感染の予防、緩和又は治療用のワクチンの調製のために使用する方法。請求項1から請求項5のいずれか1項記載のウイロソーム、又は請求項8から請求項22のいずれか1項記載の方法により得られたウイロソームを投与する工程を備える、被験者にワクチンを接種する方法。必要に応じて薬学的に許容される担体又は希釈剤及び/又はアジュバントと組合わせて、請求項1から請求項5のいずれか1項記載のウイロソーム、又は請求項8から請求項22のいずれか1項記載の方法により得られたウイロソームを投与する工程を備える、HBV感染の予防、緩和又は治療のために被験者にワクチンを接種する方法。ekouhou.net。