B.t.殺虫性遺伝子(複数可)を含む細胞宿主は、DNA構築物が選択有利性を提供し、細胞の実質的に全てまたは全てがB.t.遺伝子を保持するように選択培地を提供する、任意の便利な栄養培地で増殖させることができる。法に従って収穫することができる。収穫する前に細胞を処理することができる。0053本発明の毒素を生成するB.t.細胞は、標準技術の培地および発酵技術を用いて培養することができる。発酵サイクルが終了すると、最初に当技術分野で周知である手段によってB.t.胞子および結晶を発酵培養液から分離することによって細菌を収穫することができる。他の製剤に製剤化することができる。これらの製剤および施用手法は、全て当技術分野で周知である。誘引剤ならびにB.t.分離株の胞子、結晶および毒素、または本明細書で開示されるB.t.分離株から入手できる遺伝子を含む組換え体微生物を含む製剤化された餌粒剤は、土壌に施用することができる。製剤化された製品は、種子コーティングまたは作物サイクルの後期段階で根部処理もしくは植物全体処理として施用することもできる。リン酸塩など)または植物材料(粉末状の穂軸、籾殻、クルミ殻など)と混合することによって、水和剤、粒剤または粉剤として使用することができる。殺虫性添加剤または界面活性剤を含むことができる。製剤は水性または非水性であってよく、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤などとして使用することができる。ポリマーが含まれてよい。0055当分野の技術者によって認識されるように、特定の製剤の性質、特にそれが濃厚剤であるか直接的に用いられるものであるかによって、殺虫剤濃度は広く変動する。殺虫剤は少なくとも1重量%で存在し、100重量%であってもよい。乾燥製剤は約1〜95重量%の殺虫剤を有するが、液体製剤は一般に液相中に約1〜60重量%の固形分である。製剤は、1mgにつき約102から約104細胞を一般に有する。これらの製剤は、1ヘクタールにつき約50mg(液体または乾燥物)から1kg以上で投与される。0057植物の形質転換。術分野で周知である様々な技術を用いて植物細胞に挿入することができる。ベクターには、例えば、とりわけpBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184が含まれる。したがって、Bt毒素タンパク質をコードする配列を有するDNA断片は、適する制限部位でベクターに挿入することができる。coli)への形質転換のために用いられる。coli)細胞は適する栄養培地で培養され、次に収穫され、溶解される。分析方法として一般に実行される。各操作の後、用いたDNA配列を切断して次のDNA配列に連結することができる。各プラスミド配列は、同じか他のプラスミドにクローニングすることができる。植物への所望の遺伝子の挿入の方法によっては他のDNA配列が必要なこともある。植物細胞の形質転換のためにTiまたはRiプラスミドが用いられるならば、TiまたはRiプラスミドT−DNAの少なくともライトボーダーが、しかし多くの場合はライトボーダーとレフトボーダーとが、挿入される遺伝子の隣接領域として連結されなければならない。(1985)で十分に記載され、当技術分野でよく確立されている。0058挿入されたDNAが植物ゲノムに組み込まれると、それは比較的安定である。形質転換ベクターは、形質転換された植物細胞に、とりわけビアラホス、カナマイシン、G418、ブレオマイシンまたはハイグロマイシンなどの生物致死剤または抗生物質への抵抗性を付与する選択マーカーを通常含む。したがって、個々に使用されるマーカーは、挿入されたDNAを含まない細胞ではなく形質転換された細胞の選択を可能にするはずである。0059DNAを植物宿主細胞に挿入するために、多数の技術を利用できる。(微小粒子ボンバードメント)、またはエレクトロポレーションならびに他の可能な方法が含まれる。型ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされなければならない。中間型ベクターは、T−DNAの配列に相同性である配列のため、相同組み換えによってTiまたはRiプラスミドに組み込むことができる。TiまたはRiプラスミドは、T−DNAの移入のために必要なvir領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウム菌ではそれ自身を複製することができない。tumefaciens)に移動させることができる(コンジュゲーション)。coli)およびアグロバクテリウム菌の両方でそれ自身を複製することができる。それらバイナリーベクターは選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含み、これらは左右のT−DNAボーダー領域によってフレーム決めされる。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウム菌は、vir領域を運ぶプラスミドを含むものとする。vir領域は、植物細胞へのT−DNAの移入のために必要である。さらなるT−DNAが含まれてもよい。換のために用いられる。rhizogenes)と都合よく培養することができる。体植物を再生させることができる。そのように得られる植物は次いで、挿入されたDNAの存在について試験することができる。注射およびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに特別に要求されるものはない。通常のプラスミド、例えばpUC派生体を用いることができる。0060形質転換細胞は、植物内で通常の方法で増殖する。それらは胚細胞を形成することができ、形質転換された形質(複数可)を後代植物へ伝えることができる。そのような植物は通常の方法で生育させること、および同じ形質転換遺伝因子または他の遺伝因子を有する植物と交配することができる。生じる雑種個体は、対応する表現型特性を有する。0061本発明の好ましい実施形態では、植物は、コドン使用頻度が植物のために最適化されている遺伝子で形質転換される。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,380,831号を参照。部」であるC末端半分を有することは、Bt技術の分野では周知である。当な「尾部」を、本発明のトランケーションされた/コア毒素と共に用いることができる。米国特許第6,218,188号および米国特許第6,673,990号を参照。可能なCry1Daタンパク質コード遺伝子を含み、さらに第二の、植物にて発現可能なCry1Beタンパク質コード遺伝子を含む稔性のメイズ植物である。0062近交系メイズ系統へのCry1DaおよびCry1Be決定形質(複数可)の移入(または遺伝子移入)は、回帰性の選抜育種、例えば戻し交配によって達成することができる。この場合には、所望の反復親が、Cry1DおよびCry1Be決定形質のための適当な遺伝子(複数可)を運ぶドナーの近交系(一回親)と先ず交配される。この交配の後代は、次に反復親と戻し交配され、続いて生じる後代において、一回親から移入される所望の形質(複数可)について選択される。360-376を参照)。0063昆虫抵抗性対応(IRM)戦略。性トランスジェニック作物の対応のための2毒素戦略を概説している。1777-1786)。bt_corn_refuge_2006.htm)で、標的有害生物に対して活性である単一のBtタンパク質を生成するトランスジェニック作物で用いるための非トランスジェニック(すなわち、非B.t.)緩衝帯(非Bt作物/トウモロコシの区域)を提供するための以下の要件を公表する。Associationも、そのウェブサイト:(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)で、緩衝帯要件に関して類似した指針を提供する。al.(例えば、1780頁および1784頁の右欄)によって述べられているように、標的有害生物に各々有効で、ほとんど又は全く交差抵抗性のない2つの異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小さな緩衝帯の使用を可能にする。成功したスタックは、緩衝帯10%未満の緩衝帯サイズが、単一(非ピラミッド化)形質のための約50%の緩衝帯と同等の抵抗性対応を提供することができることをRoushは示唆する。護庁は単一形質製品(一般に20%)についてよりもかなり低く(一般に5%)構造化された非Btトウモロコシの緩衝帯を設けることを要求している。al.(前掲)および米国特許第6,551,962号によってさらに論じられているように、圃場での様々な幾何学的栽植様式(上記のような)および袋入種子混合物を含む、緩衝帯のIRM効果を提供する様々な方法がある。0068上記の百分率または類似した緩衝帯比率は、対象の二重または三重のスタックまたはピラミッドのために用いることができる。単一の標的有害生物に対して3つの作用部位を有する三重スタックについては、目標は緩衝帯がゼロ(または、例えば5%未満の緩衝帯)である。これは、例えば10エーカー以上の商業用の土地に特にあてはまる。刊行物は、それらがこの明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、参照により全体が組み込まれる。0070具体的に示されるか含意されない限り、本明細書で用いられるように、用語「a」、「an」および「the」は「少なくとも1つ」を示す。0071以下は、本発明を実施するための手法を例示する実施例である。定するものと解釈されるべきでない。特記されない限り全ての百分率は重量によるものであり、全ての溶媒混合割合は容量によるものである。全ての温度は、摂氏温度である。0072Cryタンパク質の125I標識Cry毒素のヨウ素化。Iodo−BeadまたはIodo−gen(Pierce)を用いて、精製したトランケーション化Cry毒素をヨウ素化した。NaCl、pH7.5)で2回洗浄し、鉛シールドの裏で1.5ml遠心管に入れた。これに、100μlのPBSを加えた。フード内で、および適切な放射能取扱い技術を用いることにより、0.5mCiNa125I(17.4Ci/mg、Lot0114、Amersham)をIodo−BeadのPBS溶液に加えた。構成成分を室温で5分間反応させ、次に高度に純粋なトランケーション化Cryタンパク質の2〜25μgをその溶液に加え、さらなる3〜5分間反応させた。Iodo−Beadから溶液を取り出し、それをPBSで平衡させた0.5mlの脱塩Zebaスピンカラム(InVitrogen)に加えることによって、反応を停止した。洗浄し、洗浄溶液も脱塩カラムに加えた。放射性溶液を1,000×gで2分間の遠心によって脱塩カラムを通して溶出した。行うためにlodo−gen法を用いた。この手法を用いて、100mMリン酸緩衝液(pH8)中のCry毒素を小さな0.5mlポリミキシンカラムに複数回通すことによって、リポポリサッカライド(LPS)を先ず除いた。Chem.Co.)に20μgの無LPSのCry1Da毒素を加え、次に0.5mCiのNa125Iを加えた。反応混合液を25°Cで15分間振盪させた。溶液をチューブから取り出し、50μlの0.2Mの非放射性標識NaIを加えて反応をクエンチした。緩衝液を3回交換してタンパク質をPBSに対して透析し、未結合の125Iを除去した。0073ヨウ素化されたCryタンパク質の放射純度を、SDS−PAGE、蛍光画像化およびガンマ計数によって測定した。説明書に従ってBioRadゲル乾燥装置を用いてゲルを乾燥させた。Dynamics保存蛍光スクリーン(35cm×43cm)の下でそれらを1時間露光させることによって、乾燥ゲルを画像化した。Storm820蛍光造影装置を用いてプレートを現像し、その画像をImageQuant(商標)ソフトウェアを用いて分析した。放射性バンドと一緒にバンドの直ぐ上下の領域をかみそりの刃を用いてゲルから切断し、ガンマ計数器で計数した。放射能は、Cryタンパク質バンドおよびバンドの下の領域で検出されただけであった。放射能はバンドより上で検出されず、全ての放射性汚染物質がトランケーション化Cryタンパク質よりも小さなタンパク質構成成分からなることを示した。0074BBMV調製プロトコル可溶性BBMVの調製および分画。zea)幼虫を一晩絶食させ、次いで、翌朝、氷の上で15分間冷やしたのちに解剖した。中腸組織を体腔から取り出し、外皮に接着した後腸を残した。pH7.5)に入れた。15ストロークのガラス組織ホモジナイザーで組織をホモジナイズした。Wolfersberger(1993)のMgCl2沈殿法によってBBMVを調製した。MgCl2溶液を中腸ホモジネートと混合し、5分間撹拌し、氷上で15分間静置させた。間、2,500×gで溶液を遠心分離した。上清を保存し、元の容量の0.5倍希釈のホモジナイゼーション緩衝液にペレットを懸濁して再び遠心分離した。2つの上清を合わせ、4°Cで30分間、27,000×gで遠心分離してBBMV分画を形成した。ペレットを10mlホモジナイゼーション緩衝液に懸濁し、プロテアーゼ阻害剤を追加し、4°Cで30分間、27,000×gで再び遠心分離してBBMVを洗浄した。KCl、10%グリセロール、pH7.4)に懸濁して、約3mg/mlタンパク質の濃度にした。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン(BSA)を用いてBradford法(1976)を用いることによって測定した。試料を凍結させる前にアルカリ性ホスファターゼの測定を行った。